JP2021533791A - ウイルスを生成する方法及び組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ワクチンとして使用するための所望の異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスを生成する方法であって、インビトロでの組換え反応において、末端タンパク質複合体化アデノウイルスゲノムＤＮＡ（ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡ）を、所望の遺伝子をコードし、アデノウイルスゲノムＤＮＡの挿入部位配列に相同な５’及び３’末端を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと組み換えることによって、所望の異種遺伝子をアデノウイルスゲノムに挿入するステップ、個々の容器中で増殖している細胞に、そのような個々の容器の多数が所望の異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスに感染している単一細胞を含有するように、（ｉ）からのインビトロでの組換え反応混合物の希釈物をトランスフェクトするステップ、並びに単一細胞が、所望の異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスに感染している、これらの個々の容器を同定するステップを含む方法に関する。適切には、前記ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡは、血清型が一致した末端タンパク質及びアデノウイルスゲノムを含み、前記所望の遺伝子は、単一のエピトープ、一連のエピトープ、抗原のセグメント、又は完全な抗原タンパク質をコードする。本発明はまた、これらの方法を使用して生成された組換えアデノウイルス及び組成物に関する。

Description

本発明は、感染性病原体抗原及びがんと関連する腫瘍抗原を含む異種抗原に対する免疫応答、適切には、防御免疫応答の誘導において使用するための組換えアデノウイルスの迅速な生成（generation）に関する。
ヒトセロタイプ５アデノウイルス（ＨＡｄＶ−Ｃ５）若しくはその他のヒトアデノウイルス又はサルアデノウイルスのいずれかに由来する複製不全アデノウイルスベクターが、複数の臨床試験において、感染性病原体抗原及びがん抗原を送達するためのワクチンベクターとして使用されている（Ewer et al. (2017) Hum Vaccin Immunother. 13(12):3020-3032;及びCappuccini et al. (2016) Cancer Immunol Immunother. 65(6):701-13.）。これらのベクターは、ワクチン開発に関して；ヒトにおいて複製不能であるため、複製ベクターより安全である；複製及び非複製細胞に感染する；幅広い組織親和性を有し、特に、強力な細胞性免疫を含む、高い免疫応答を誘発する；高力価まで容易に精製される（Morris et al. (2016) Future Virology 11(9), 649-659）という多数の利点を提供する。バクテリオファージλ Ｒｅｄ組換え（リコンビニアリング）技術と結びついた細菌人工染色体（ＢＡＣ、bacterial artificial chromosome）の出現によって、アデノウイルスゲノムのクローニング及び操作は容易となった（Ruzsics Z., Lemnitzer F., Thirion C. (2014) Engineering Adenovirus Genome by Bacterial Artificial Chromosome (BAC) Technology. In: Chillon M., Bosch A. (eds) Adenovirus. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 1089. Humana Press, Totowa, NJ）。発現カセットの迅速な挿入のための組換え技術と組み合わさったこの技術が、目下、アデノウイルスベクターの生成に使用されている。しかしながら、この手法及び伝統的な製造方法を使用すると、抗原同定から、臨床グレードのアデノウイルスベクターを得るまでにかかる時間は、平均で３３〜４４週間である（図１）。ワクチンとして使用するための組換えウイルスの調製には、まず組換えウイルスを許容細胞に感染させ、次いでレスキューした後、組換えウイルスのクローニングを必要とする、ｐｒｅ−ＧＭＰ（pre-Good Manufacturing Practice）の出発物質の生成が含まれる。これは、時間のかかる方法であり、クロラムフェニコール遺伝子（標準的なアデノウイルスゲノム操作法において細菌人工染色体（ＢＡＣ）選択のために使用される）のアデノウイルスゲノムへの挿入の潜在性、及びＢＡＣ由来アデノウイルスゲノムから産生されたウイルスベクターの不均一性を理由に、それぞれに５週間かかるクローニングを３回も必要とする。ＢＡＣを使用する場合、細菌における操作を通して導入された可能性があるいかなるアデノゲノム中の変異も、アデノウイルスに持ち越されることとなる。この問題は、アデノウイルスゲノムＤＮＡが、組換えアデノウイルスの生成を始める前に既にクローン化され、特徴付けされており、したがって正しいものであることがわかっている本発明の方法において対処される。その結果として、これまで特徴付けとして行ってきたアデノウイルスゲノムＤＮＡの配列決定は、必要でない。
Hillgenberg及び共同研究者ら（Journal of Virology 80(11) (2006) 5435-5450）、また、彼らとは別にＣｈｏｉ及び共同研究者ら（Journal of Biotechnology 162 (2012) 246-252）が、シャトルベクター構築、細菌形質転換、及び選択の必要性を除き、プラーク分離に必要な手間を減らしたリコンビニアリング手法を使用する、組換えアデノウイルスの迅速な大量生成方法を説明している。しかしながら、これらの著者らは、多数の様々な異種遺伝子を発現する組換えアデノウイルスの集団を生成することを試みており、ワクチンとしての使用のために、彼らの方法で単一の組換えウイルスの迅速で簡単なクローニングを実現することはできなかった。ＧＭＰ製造に関連した規制のもとでのアデノウイルスワクチンの臨床使用、及びそのようなワクチンの臨床使用のためには、単一のクローンが必要である。
さらに最近になって、Miciak及び共同研究者ら（PLoS ONE 13(6) (2018) e0199563）が、インビトロで、幾つかの断片からアデノウイルスゲノムをアセンブリーさせ、次いで細胞にトランスフェクトする方法を説明した。こちらの研究者らもまた、組換えウイルスの分離後に、クローン選択法の実施を必要としない、クローン化された単一の組換えウイルスを産する方法を作出することはできなかった。
Ewer et al. (2017) Hum Vaccin Immunother. 13(12):3020-3032 Cappuccini et al. (2016) Cancer Immunol Immunother. 65(6):701-13. Morris et al. (2016) Future Virology 11(9), 649-659 Ruzsics Z., Lemnitzer F., Thirion C. (2014) Engineering Adenovirus Genome by Bacterial Artificial Chromosome (BAC) Technology. In: Chillon M., Bosch A. (eds) Adenovirus. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 1089. Humana Press, Totowa, NJ Journal of Virology 80(11) (2006) 5435-5450 Journal of Biotechnology 162 (2012) 246-252 PLoS ONE 13(6) (2018) e0199563
このように、従来技術には、ワクチンとして使用するための組換えアデノウイルスの迅速な生成に適切である方法はない。本発明は、４週間未満で複製不全アデノウイルスベクターの小規模の臨床グレードバッチを生成する新規方法（図２）を提供することによって、この課題に対処し、克服し、従来技術の方法に伴う問題を克服しようとするものである。
アデノウイルスは、長さが２６〜４６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ゲノムを有する非エンベロープウイルスである。アデノウイルスゲノムＤＮＡは、裸のＤＮＡとして許容細胞にトランスフェクトさせると感染する。しかしながら、同じアデノウイルス由来の５５ｋＤａ末端タンパク質（ＴＰ；terminal protein）と複合体を形成しているヒトＡｄ−５（ＨＡｄＶ−Ｃ５）ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を許容細胞にトランスフェクトさせると、裸のＤＮＡと比較して１００〜１０００倍のウイルスプラークが産生されることが報告されている。このＴＰは、細胞のエキソヌクレアーゼによる消化からウイルスｇＤＮＡを保護し、ＤＮＡ複製開始のためのプライマーとして作用し、ＤＮＡポリメラーゼとヘテロ二量体を形成する。ＤＮＡポリメラーゼは、最初のｄＣＴＰをＨＡｄＶ−Ｃ５ ＴＰのＳｅｒ−５８０と共有結合させる。ヒトアデノウイルスＴＰは、タンパク質を含まない鋳型と比較して鋳型活性を２０倍以上高めることによってヒトアデノウイルス複製を増強する。これは、その他の複製因子の結合を可能にする、複製開始点におけるわずかな変化によるものである。ＴＰはまた、ＨＡｄＶ−Ｃ５ゲノムＤＮＡ−宿主核マトリックス会合を媒介することによって転写を促進する。
本発明者らは、現在好まれているサルアデノウイルスベクターに焦点を絞って、トランスフェクトされたＴＰＣ−アデノウイルスｇＤＮＡ（ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡ）がプラークを増産するという特性を、既存の組換え技術と組み合わせて利用して、臨床グレードのアデノウイルスワクチンベクターを生成することを試みた。
アデノウイルス生成及び製造に先だって、ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡを分離及び精製し、均一性を試験し、保存することが可能である。この手法では、細菌でアデノウイルスｇＤＮＡを増殖させる必要性が除かれているため、クロラムフェニコール遺伝子（ＢＡＣ選択のために使用される）のアデノウイルスゲノムへの挿入の潜在性、及び細菌宿主における複数回の増幅の後に生じ得るウイルスゲノムの不均一性の潜在性が回避される。細胞にＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡをトランスフェクトした後、生成プラーク数を増やすことによって、少数の組換えアデノウイルスゲノムしか生成されない場合の組換えウイルスのレスキューを成功させることが可能となり、さらに、得られた組換えアデノウイルスを、製造プロセスの非常に早い段階において迅速且つ容易にクローン化することが可能となる。本発明者らは、ウイルス生成及び製造プロセスを簡略化し、その結果、注目すべきことに、ワクチンとして使用するための組換えアデノウイルスをわずか２８日ほどで生成し、製造することを可能にした。このワクチン生成時間の短縮化は、ｉ）治療的免疫化による悪性腫瘍のより迅速な治療のための、個別化がんワクチンの迅速な生成が可能となること、ii）新規の流行に直面した際、突発的に発生した新規の病原体に対するワクチンをより迅速に生成して、より迅速により多量のワクチンの製造及び生成が可能となること、及びiii）高価なＧＭＰ（good manufacturing practice）製造設備においてかかる時間の著しい削減による、設備にかかる製造コストの削減など、多くの利点をもたらすることとなる。
第１の態様において、本発明は、ワクチンとして使用するための所望の異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスを生成する方法であって、（ｉ）インビトロでの組換え反応において、末端タンパク質複合体化アデノウイルスゲノムＤＮＡ（terminal protein complexed adenovirus genomic DNA；ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡ）を、所望の遺伝子をコードし、アデノウイルスゲノムＤＮＡの挿入部位配列に相同なその５’末端の少なくとも１５ｂｐ及びその３’末端の少なくとも１５ｂｐを有するヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡで組み換えることによって、所望の異種遺伝子をアデノウイルスゲノムに挿入するステップ、（ii）個々の容器中で増殖している細胞に、そのような個々の容器の多数が所望の異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスに感染している単一細胞を含有するように、（ｉ）からのインビトロでの組換え反応混合物の希釈物をトランスフェクトするステップ、並びに（iii）単一細胞が所望の異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスに感染している、これらの個々の容器を同定するステップを含む方法を提供する。
第１の態様の方法は、ワクチンとして使用するための組換えアデノウイルスを、約３３〜４４週間から、わずか２８日ほどに縮めた生成期間で生成するために、有利に使用され得る。
現行の方法を使用する場合、ウイルスストックは、検出することが難しい極めて低レベルのマイナーな種を多数含有する可能性があるバルクトランスフェクションを増幅することによって生成される。したがって、そのような方法を使用してクローンストックを生成することを確実にするためには、３回のクローニングが必要となる。本発明の方法は、特徴付けされたウイルスゲノムを用いて開始するため、組換え及びトランスフェクションの後は、組換え抗原配列だけが正しくない可能性がある。トランスフェクションは、各容器に１つずつの組換えウイルスゲノムをトランスフェクトするように行われ、したがって多数のマイナーな種を含む混合物はないはずである。きわめて珍しい事例においては、２つのウイルスゲノムが同じ細胞にトランスフェクトする場合があるが、２つのウイルスゲノムが組換え抗原コード配列において同一でなければ、それぞれのウイルス種が混合物の約５０％を占めることとなるため、コードＤＮＡ配列を配列決定することによって２つのウイルスゲノムは容易に区別され得、もはやマイナーな種を探す必要はない。正しい配列と正しくない配列との混合物を含有すると思われるいかなるウイルス試料も廃棄され、正しいウイルス試料のみがワクチンとして使用するために選択されることとなる。
所望の異種遺伝子をコードする合成ＤＮＡは、マイナーな種を含有することもあり、完全に正しいわけではない。本発明の方法は、トランスフェクションの後、直ちにウイルスクローンを産生させ、よって各クローンの遺伝子コード配列の配列を決定し、正しいクローンだけを選択することを可能にすることによって、この問題を解決する。このことは、組換えウイルスの混合物である可能性があるバルクウイルスストックを増幅させ、次いであとでクローニングを行うことよりも、有利である。
本発明の方法は、組換えアデノウイルスの即時クローニング及び迅速な増殖を提供することに加えて、ワクチンとして組換えウイルスを使用するために必須である厖大な量の品質管理（ＱＣ、quality control）試験を、いかなる特殊な組換えアデノウイルスについても、製造を開始する前の時点に再配置するという、重要な改良を提供する。そのようなＱＣ試験は大量の出発物質に対して行われ得るものであり、これによって、本方法を使用してワクチンとして使用するための組換えアデノウイルスを生成する場合に、相当時間の節約がもたらされる。
本新規方法の別の利点は、本方法が、本明細書において示したようなサルアデノウイルスベクターを生成するために、効果的に使用され得ることである。迅速なアデノウイルスベクターの生成に関するこれまでの研究のほとんどは、ヒトアデノウイルスの１つ又はきわめて少数のセロタイプだけ、特にヒトアデノウイルスセロタイプ５（Ａｄ−５）を使用している。サルアデノウイルスは、Ｍｅｒｃｋ ＨＩＶワクチンの大規模な「ＳＴＥＰ」試験においてＨＩＶ感染の増強に関し大きな安全性の信号及び懸念を伴った一般的なヒトアデノウイルスベクター（Ａｄ−５）（Cohen (2007) Science 318:28-29）とは対照的に、ｉ）自然で起こるヒトアデノウイルスへの曝露によってもたらされた既存の抗ベクター免疫により、負の影響を受けることがはるかに少なく、ii）何千例もの対象において安全性及び免疫原性が明らかにされている（Ewer at al.supra）という理由で、現在では免疫化用ベクターとして、ヒトアデノウイルスより好ましいものとなっている。
第２の態様において、本発明は、第１の態様方法において使用するための、アデノウイルスゲノムを含む組成物であって、アデノウイルスゲノムにおいて、Ｅ１遺伝子が、アデノウイルスゲノム中の他のどこにも存在しない特有の制限部位の第１の対にはさまれた蛍光マーカータンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットによって置換されている、組成物を提供する。
第２の態様の組成物は、所望の異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスの明確な同定を可能にするために、第１の態様の方法において有利に使用され得る。第１の態様の方法を使用することの明確な利点は、すべて、第２の態様の組成物においても認められ得る。
ここで、本発明を、例として添付図面を参照して以下に説明する。
現行の方法を使用する、ワクチンとして使用するための組換えアデノウイルスの迅速な生成について、時機を記した概略を示す図である。ＱＣ − 品質管理、Ａｍｐ − 増幅、ＧＭＰ − good manufacturing practice、ＭＶＳＳ − マスターウイルスシードストック（master virus seed stock）。 ワクチンとして使用するための組換えアデノウイルスコンストラクトを生成するために使用される本発明の方法について、時機を記した概略を示す図である。 本発明の方法において使用するための親ウイルス組成物を示す概略図である。この場合では、親ウイルスは、抗原又は発現カセットの挿入のための３つの特有の制限部位（PsiI、AsiSI、及びRsrII）を含むＣｈＡｄＯｘ１−Ｂｉ−ＧＭＰゲノムである。ＬＰＴＯＳ − 長いテトラサイクリン調節性ＣＭＶプロモーター。 ３Ｍ塩酸グアニジンで破壊したＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡの分析を示す図である。２００ｕｌアデノウイルス粒子（１．４ｅ１２ＶＰ／ｍｌ）を、氷上で４５分間、３Ｍ塩酸グアニジンによって破壊した。１０μｌの試料を、６５℃で４０分間、２μｇのプロテイナーゼＫを加えて（＋）又は加えず（−）インキュベートし、次いで０．７％アガロースによって分離した。Ｍ＝１ｋｂｐ Generulerラダー（Thermofisher社製）。 ３Ｍ塩酸グアニジンで破壊し、６８０００ｒｐｍで１８時間、２．８Ｍ ＣｓＣｌ勾配遠心分離した後の、ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡ分離、精製、脱塩、及び濾過を示す図である。ＤＮＡを分離し、ｐＨ７．８の１０ｍＭ Ｔｒｉｓで脱塩し、０．２μＭシリンジフィルターを通して濾過した。ＤＮＡのアリコートを、０．７％アガロースで分離した。Ｍ＝１ｋｂｐ Generuler（thermofisher社製）。 ２．８Ｍ ＣｓＣｌ勾配遠心分離の後、分離されたＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡのタンパク質分析を示す図である。ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡ５０ｎｇを含有する試料を、ＳＤＳ還元４〜１２％Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ NuPAGEミディゲルによって分離し、銀染色を使用して染色した。 ＣｈＡｄＯｘ１及びＣｈＡｄＯｘ２並びにＣｈＡｄ６３アデノウイルスゲノムにおけるｑＰＣＲプライマー及びプローブの結合位置を示す図である。 親アデノウイルスゲノムＤＮＡとしてＣｈＡｄＯｘ１−Ｂｉ−ＧＦＰを使用して組換えＣｈＡｄＯｘ１を作出するための、特許請求した方法のインビトロでの組換え反応スキームを示す図である。 様々な量のＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡ及びｍＣｈｅｒｒｙ ＯＲＦ ＰＣＲ生成物を含有する組換え反応物によるトランスフェクション後、トランスフェクションの３０時間後にｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰを発現している細胞（％）を示す図である。NEBuilderを使用して、６０、４０、及び２０ｎｇのPsiIで消化したＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡを、４０、２０、及び１０ｎｇのｍＣｈｅｒｒｙ ＯＲＦ ＰＣＲ生成物で組み換えた。トランスフェクションの前に、組換え反応物を、５０℃で４０分間、次いで２０℃で２分間、インキュベートした。９６ｗｐに播種されたＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞に、この組換え反応物を、１：５の比でリポフェクタミン２０００を使用してトランスフェクトした。テトラサイクリンを含有する培地を、トランスフェクションの５時間後に加えた。ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞の数を、感染の３０時間後に、ＦＡＣＳ分析によって決定した。 ワクチンとして使用するための組換えアデノウイルスの迅速な生成プロセスの概要を示す図である。
第１の態様において、本発明は、ワクチンとして使用するための所望の異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスを生成する方法であって、（ｉ）インビトロでの組換え反応において、末端タンパク質複合体化アデノウイルスゲノムＤＮＡ（ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡ）を、所望の遺伝子をコードし、アデノウイルスゲノムＤＮＡの挿入部位配列に相同であるその５’末端の少なくとも１５ｂｐ及びその３’末端の少なくとも１５ｂｐを有するヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡと組み換えることによって、所望の異種遺伝子をアデノウイルスゲノムに挿入するステップ、（ii）個々の容器中の増殖細胞に、そのような個々の容器の多数が所望の異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスに感染した単一細胞を含有するように、（ｉ）からのインビトロでの組換え反応混合物の希釈物をトランスフェクトするステップ、並びに（iii）単一細胞が所望の異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスに感染した、これらの個々の容器を同定するステップを含む、方法を提供する。
従来技術は、組換えアデノウイルスを生成する数多くの方法を提供しており、中でも、例えばHillgenberg et al.(2006)、Choi et al. (2012)、及びMiciak et al. (2018)は、それぞれ簡潔な方法を提供している。しかしながら、提供された方法のうち、ワクチンとして使用するための組換えクローンアデノウイルスを分離するために延々と続くクローニングプロセスの必要性に対処した方法はない。本発明の方法は、組換えアデノウイルスを生成する際のこの延々と続くクローニングプロセスを省く手段を有利に提供する。これによって、次いでは、組換えアデノウイルスベクターの生成における大幅な遅れが解消され、そのようなベクターを、ワクチンとしての使用に、特に、がん治療における個別化ワクチン又は突発的に発生した病原体に対して迅速に対応するワクチンとしての使用に、より容易に適合させることが可能となる。
本発明の好ましい実施形態において、ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡは、セロタイプが一致した末端タンパク質及びアデノウイルスゲノムを含む。セロタイプが一致したアデノウイルスゲノム及び末端タンパク質の使用によって、細胞の組換え及びトランスフェクション後の高効率のウイルスレスキューが可能となる。
本発明の具体的な実施形態において、所望の遺伝子は、１つのエピトープ、一連のエピトープ、抗原のセグメント、又は完全な抗原タンパク質をコードする。様々な所望の遺伝子を用意することによって、がん若しくは突発的に発生した疾患を含む幅広い種類の疾患を発症する又は患うリスクを有する患者を保護又は処置するための、改良ワクチンの開発が可能となる。
別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、合成ＤＮＡ分子、精製されたＤＮＡ制限断片、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、polymerase chain reaction）生成物である。本方法によって、組換えアデノウイルスの生成において使用されるべきＤＮＡの供給源を柔軟に選択することが可能となり、この結果、本方法がより迅速に完了することとなり、このことは、がん又は突発的に発生した疾患を含む幾つもの疾患を予防又は治療するために、ワクチンとして使用するための組換えアデノウイルスを生成する際、重要な意味を持つ。
さらに別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、アデノウイルスゲノムＤＮＡの挿入部位配列に相同なその５’末端の５〜５０ｂｐ及びその３’末端の５〜５０ｂｐを有し、又はポリヌクレオチドは、アデノウイルスゲノムＤＮＡの挿入部位配列に相同な、その５’末端の１０〜２０ｂｐ及びその３’末端の１０〜２０ｂｐを有し、又はポリヌクレオチドは、アデノウイルスゲノムＤＮＡの挿入部位配列に相同であるその５’末端の１５ｂｐ及びその３’末端の１５ｂｐを有する。適切な相同な末端を有するポリヌクレオチドを用意することによって、アデノウイルスゲノムＤＮＡとの効率的な組換えが可能となり、これによって、本方法を使用して、インビトロでの組換え反応における組換えアデノウイルスの信頼性の高い生成が可能となる。
好ましい実施形態において、アデノウイルスゲノムＤＮＡの挿入部位配列は、Ｅ１座位内に位置する。Ｅ１遺伝子の削除によって、組換えウイルス感染細胞における異種の発現カセットの挿入及び所望の抗原の信頼性のある高レベルの発現が可能となる。これによって、ワクチンとして使用するための組換えアデノウイルスに有利な特性が与えられる。
ある実施形態において、ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡは、その５’末端で所望の遺伝子の発現を促進する長いテトラサイクリン調節性ＣＭＶプロモーターと隣接し、その３’末端でウシ成長ホルモンポリアデニル化配列と隣接している、アデノウイルスゲノムＤＮＡのＥ１座位内の特有の制限部位で消化される。Ｅ１座位内の特有の制限部位でのアデノウイルスゲノムＤＮＡの消化によって、いかなる組換え反応物からもインタクトな親アデノウイルスＤＮＡが除去され、一方で、所望の抗原をコードするＤＮＡ配列での組換えに適切な末端配列が得られる。有利には、これによって、所望の抗原をコードするＤＮＡ配列でのより効率的な組換えが可能となり、本方法を使用して再生された親アデノウイルスの数も減少される。
具体的な実施形態において、インビトロでの組換え反応物は、４０ｎｇの消化されたＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡ並びに４４ｆｍｏｌの所望の遺伝子をコードする合成ＤＮＡの３’及び５’末端を含む。そのような量の反応物を用意することによって、所望の異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスの組換え及び生成の最適化が可能となる。有利には、これによって、本発明の方法を使用して、適切な細胞に、個々のクローンの生成を増大させる組換えアデノウイルスゲノムＤＮＡ量をトランスフェクトすることが可能となる。
さらに具体的な実施形態において、トランスフェクトされるべき細胞は、トランスフェクションの１日前に、３．７５×１０５細胞．ｍｌ−１の密度で個々の容器に播種される。この密度での細胞の播種によって、細胞における組換えアデノウイルスレスキューの効率が向上する。
さらに具体的な実施形態において、細胞は、個々の容器中で、約８０％コンフルエントで増殖する間にトランスフェクトされる。これによって、アデノウイルス初期遺伝子の発現が増加し、細胞における組換えアデノウイルスレスキューの効率が向上する。
さらに特定の実施形態において、細胞は、テトラサイクリンリプレッサーを安定して発現する。そのような細胞、例えばＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞の使用によって、トランスフェクション後のウイルスレスキューの間、所望の遺伝子の発現の抑制が可能となる。トランスフェクション後、細胞は脆弱となっており、異種遺伝子発現を抑制することによって、細胞死が最少化され、本方法のこの工程での効率的なウイルスレスキューが可能となる。
特定の実施形態において、トランスフェクトされている細胞は、テトラサイクリンリプレッサーを安定して発現する。組換えウイルスをレスキューするために使用されている細胞におけるテトラサイクリンリプレッサーの発現は、細胞に対して有毒である可能性がある所望の遺伝子の発現を妨げ、したがってウイルスレスキューを増進させる。
追加の具体的な実施形態において、インビトロでの組換え反応混合物は、トランスフェクション培地で希釈され、６０個の容器中で増殖する細胞にトランスフェクトするために、均等に分割される。有利には、各組換え反応物を６０個に等分しトランスフェクトすることによって、組換えアデノウイルスを、６０個の個々の容器に、全部ではないが均等に個々に届ける。これによって、使用者は、組換えアデノウイルスを含有しない陰性対照ウェルを含めつつ、多数の個別の組換えアデノウイルスを含有するウェルを同定することが可能となる。
好ましい実施形態において、トランスフェクトされた細胞は、細胞内ウイルスを放出するように凍結融解され、組換えアデノウイルスの存在は、トランスフェクトされた細胞の各ウェルからの細胞ライセート、並びにアデノウイルス末端逆位配列（ＩＴＲ、inverted terminal repeat）の下流且つ非翻訳領域中の所望の遺伝子の挿入部位の上流でゲノムの左端に結合するように設計されたプライマー及びプローブのセットを使用して、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ、quantitative PCR）によって同定される。この簡略化され加速された試料抽出及びスクリーニングプロセスによって、所望の組換えアデノウイルスの容易且つ迅速な同定が可能となり、試料中の親アデノウイルスの存在が排除される。
追加の好ましい実施形態において、アデノウイルスゲノムは、ヒトアデノウイルス又はサルアデノウイルスに由来し、好ましくは、ヒトアデノウイルスはセロタイプ５ヒトアデノウイルスではない。最も好ましい実施形態において、サルアデノウイルスは、ＣｈＡｄＯｘ１（Antrobus et al. (2014) Mol Ther.22(3):668-674）、ＣｈＡｄＯｘ２（Morris et al. (2016) Future Virol.11(9):649-659）、ＣｈＡｄ３、又はＣｈａｄ６３などのチンパンジーアデノウイルスである。ヒト又はサルアデノウイルスの使用によって、ヒト対象においてワクチンとして使用されるべき、本方法により生成された組換えアデノウイルスの使用が可能となる。サルアデノウイルスの使用、及び特にＣｈＡｄＯｘ１又はＣｈＡｄＯｘ２の使用によって、ヒト対象に投与される際、既存の抗アデノウイルス免疫の発生率がより低い、改良されたワクチンが実現される。
具体的な実施形態において、個々の容器は、マルチウェルプレート上の別個のウェルである。そのような少容量容器の使用によって、迅速、経済的、且つ効率的な、細胞のトランスフェクション及び得られた組換えアデノウイルスのスクリーニングが可能となる。マルチウェル型プレートの使用によって、本方法及びすべての関連プロセスの自動化もまた可能となる。
好ましい実施形態において、ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡは、必要な品質管理（ＱＣ）検定を受け合格しておりgood manufacturing practice（ＧＭＰ）バイオ製造における使用が可能であるＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡ物質のストックから用意される。物質のＱＣ制御されたストックからのＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡの使用によって、ワクチンとして使用するための組換えアデノウイルスを生成する方法の迅速性を高めることが可能となる。本方法を開始する前にＱＣ試験を実施することによって、ウイルス成分を事前に試験することが可能となり、さらには、アデノウイルス生成及び製造プロセス中の試験及び検定の負担を減らすことが可能となる。
ある実施形態において、本発明の第１の態様による方法によって生成された組換えアデノウイルスは、ヒト又は動物における疾患を予防及び／又は治療するために、ワクチンとして使用することができる。特に、本方法によって生成された組換えアデノウイルスは、がん治療のための個別化ワクチンの生成においてきわめて有用である。本発明は、ウイルスベクターを使用するそのような治療を提供することにおける大きな障害、すなわち、ウイルスベクターワクチンの生成及び開発に時間がかかることを克服する。本明細書において開示された新規の当該方法による組換えアデノウイルスの迅速な生成によって、患者の臨床評価、患者自身のがん特異的抗原の同定、及びその患者個人を治療するために適切な組換えアデノウイルスワクチンの生成のための、十分な時間的余裕が生まれる。このことは、本発明の第１の態様に記載の特許請求した方法の開発以前は、可能ではなかった。
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様の方法において使用される、アデノウイルスゲノムを含む組成物であって、アデノウイルスゲノムにおいて、Ｅ１遺伝子が、アデノウイルスゲノム中の他のどこにも存在しない特有の制限部位の第１の対にはさまれた蛍光マーカータンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットによって置換されている、組成物を提供する。
上記で論じたように、従来技術は、組換えアデノウイルスを生成する数多くの方法を提供している。しかしながら、これらの方法はいずれも、出発物質として未改変のアデノウイルスゲノムを使用することによって開始し、したがってインビトロでの組換え反応における使用に適切な消化されたアデノウイルスゲノムＤＮＡを生成するために、いずれの方法も、手の込んだ工程を実施しなければならなかった。本発明の本態様によって提供された組成物によって、この障害は克服され、一段階の制限消化反応で、適切な異種核酸分子での組換えのためのアデノウイルスＤＮＡを調製することが可能となる。この組成物の使用によって、アデノウイルスゲノムＤＮＡの調製プロセスが単純化されることに加え、無菌性、マイコプラズマを含んでいないこと、当該ウイルスの同一性及び遺伝的安定性が既に試験で確認されているアデノウイルスのストックから生成した消化されたゲノムＤＮＡのラージスケールの調製も可能となり、この調製物は、必要に応じた臨床使用に備え、ＧＭＰ遵守の方式で完成された組換えアデノウイルスの生成プロセスを能率化するために、前もって保存しておくことができる。
具体的な実施形態において、アデノウイルスゲノムは、ヒトアデノウイルス又はサルアデノウイルスに由来しており、好ましくは、ヒトアデノウイルスは、セロタイプ５ヒトアデノウイルスではない。より好ましい実施形態において、アデノウイルスゲノムはサルアデノウイルスに由来しており、最も好ましくは、サルアデノウイルスは、ＣｈＡｄＯｘ１（Antrobus et al. supra）、ＣｈＡｄＯｘ２（Morris et al. supra）、ＣｈＡｄ３、又はＣｈａｄ６３などのチンパンジーアデノウイルスである。ヒト又はサルアデノウイルスの使用によって、ヒト対象においてワクチンとして使用されるための、本方法によって生成された組換えアデノウイルスの使用が可能となる。サルアデノウイルスの使用、及び特にＣｈＡｄＯｘ１又はＣｈＡｄＯｘ２の使用によって、ヒト対象に投与される際、既存の抗アデノウイルス免疫の発生率がより低い、改良されたワクチンがもたらされる。
好ましい実施形態において、蛍光マーカータンパク質は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、green fluorescent protein）である。蛍光マーカータンパク質の存在によって、本態様の所望の遺伝子を発現するように組換えを受けていないインタクトなアデノウイルスが感染した細胞の迅速な検出が可能となり、ＧＦＰは、蛍光顕微鏡法によって直接的に又は例えば抗ＧＦＰ抗体を使用して間接的に容易に検出され得る、特に便利なマーカータンパク質である。
好ましい実施形態において、特有の制限部位の第１の対は、PsiI、AsiSi、又はRsrII部位から選択される。
ある実施形態において、発現カセットは、蛍光マーカータンパク質をコードするＤＮＡ配列に対して５’に位置する長いテトラサイクリン調節性ＣＭＶプロモーター、及び蛍光マーカータンパク質をコードするＤＮＡ配列に対して３’に位置するウシ成長ホルモンポリアデニル化配列をさらに含み、ここで、制限部位の第１の対が、長いテトラサイクリン調節性ＣＭＶプロモーターと蛍光マーカータンパク質をコードするＤＮＡ配列との間、及び蛍光マーカータンパク質をコードするＤＮＡ配列とウシ成長ホルモンポリアデニル化配列との間に位置する。有利には、親アデノウイルスゲノムＤＮＡにおけるＧＦＰコード配列の含有を有効な陰性対照として使用して、本発明の第１の態様の方法において、親アデノウイルスが再生している細胞をすべて同定することができる。単純なスクリーニングステップによって、ワクチンとして使用するための所望の異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスを探す際の検討対象から、ＧＦＰを発現するこれらのウイルスを排除することができる。さらに、ＧＦＰの存在は、第１の態様の方法において使用される親アデノウイルスゲノムＤＮＡのストックを生成する際の、有用なマーカーとなり得る。
好ましい実施形態において、発現カセットは、特有の制限部位の第１の対とは異なる、長いテトラサイクリン調節性ＣＭＶプロモーターに対して５’に位置し、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列に対して３’に位置する特有の制限部位の第２の対をさらに含む。有利には、特有の制限部位の第２の対を追加することによって、ＧＦＰ発現カセット全体の除去が可能となり、これによって、異なるプロモーターシステムを使用して発現されるべき所望の異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスの生成が可能となる。そのような場合には、望ましいプロモーター及びポリアデニル化配列を、所望の遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡの中に設計することが可能である。
さらに好ましい実施形態において、特有の制限部位の第２の対は、PsiI、AsiSi、又はRsrII部位から選択される。
追加の実施形態において、アデノウイルスゲノムは、Ｓ１５／Ｅ４座位に追加の特有の制限部位を含むようにさらに改変される。これによって、所望の遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む第２の合成ＤＮＡを、アデノウイルスゲノムＤＮＡ中へ組み換えることが可能となる。
さらなる追加の実施形態において、追加の特有の制限部位は、PsiI、AsiSi、又はRsrII部位から選択される。
具体的な実施形態において、アデノウイルスゲノムは、異種末端タンパク質又はセロタイプが一致していない末端タンパク質と複合体を形成しているが、好ましい実施形態において、アデノウイルスゲノムは、自己末端タンパク質又はセロタイプが一致した末端タンパク質と複合体を形成している。
さらに具体的な実施形態において、アデノウイルスゲノムは、Gateway組換え配列を欠いている。
好ましい実施形態において、組成物は、必要な品質管理（ＱＣ）検定を受け合格しており、good manufacturing practice（ＧＭＰ）バイオ製造における使用が可能である。物質のＱＣ制御されたストックからの物質の使用によって、ワクチンとして使用するための組換えアデノウイルスを生成する方法の迅速性を高めることが可能となる。この方法を開始する前にＱＣ試験を実施することによって、ウイルス成分を事前に試験することが可能となり、さらには、アデノウイルス生成及び製造プロセス中の試験及び検定の負担を減らすことが可能となる。
最終的な態様において、本発明は、哺乳動物において免疫応答を引き起こす病原体若しくは腫瘍エピトープ又は抗原を発現する本発明の第２の態様の組成物のいずれかを含む組換えアデノウイルスベクター免疫原を提供する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通して、「を含む（comprise）」及び「を含む（include）」という単語、並びに「を含む（comprises）」、「を含む（comprising）」、「を含む（includes）」、及び「を含む（including）」などの変形は、包括的に解釈されるべきである。すなわち、これらの単語は、文脈によっては、具体的に列挙されていないその他の要素又は完全体の可能な包含を伝えることを意図するものである。
［実施例］
塩化セシウム密度勾配超遠心分離による、アデノウイルスの末端タンパク質複合体化ウイルスｇＤＮＡ（ＴＢＣ−ｇＤＮＡ）の精製。
５５ｋＤａ末端タンパク質（ＴＰ）を、アデノウイルスゲノムＤＮＡの各鎖の５’末端に共有結合させて、末端タンパク質複合体化ウイルスｇＤＮＡ（ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡ）を生成した。セロタイプが一致した（「自己」）ＴＰ及びセロタイプが一致していない（「異種」）ＴＰの両方を、本発明において使用することができる。ＴＰは、細胞のエキソヌクレアーゼによる消化からウイルスｇＤＮＡを保護し、ＤＮＡ複製の開始のプライマーとして作用し、ＤＮＡポリメラーゼとヘテロ二量体を形成する。ＴＰは、その他の複製因子の結合を可能にする複製の開始点におけるわずかな変化により、タンパク質を含まない鋳型と比較して鋳型活性を２０倍以上高めることによって複製を増強する。ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡは、塩酸グアニジンを使用して破壊し精製したウイルス粒子から分離され、塩化セシウム密度勾配超遠心分離によって精製される。
１×１０１１〜１×１０１２の間のウイルス粒子（５００μｌ〜１ｍｌ）を含有する精製されたウイルス溶液を、１．５ｍｌ又は２ｍｌチューブに等分し、最終的な塩酸グアニジン（ＧｎｄＨＣｌ、Guanidine hydrochloride）濃度が３Ｍとなるように、ヌクレアーゼフリー水で調製した同量の濾過滅菌済み６Ｍ ＧｎｄＨＣｌを加えた。希釈したウイルス溶液を、穏やかに混合した後、氷上で４５〜６０分間、インキュベートした。
塩化セシウム（ＣｓＣｌ、caesium chloride）の２．８Ｍ溶液は、ヌクレアーゼフリー水で調製した２０ｍｌの濾過滅菌済み３Ｍ塩酸グアニジン（ＧｎｄＨＣｌ）に９．４２８１ｇのＣｓＣｌを加えることによって調製した。２ｍｌの２．８Ｍ ＣｓＣｌ溶液を、MSCIIフード中で適切な大きさの超遠心分離管に加え、ウイルス／ＧｎｄＨＣｌ溶液を、２．８Ｍ ＣｓＣｌの上部に静かに重ねた。次いで、このウイルス試料調製物を、卓上型Optima TLX超遠心分離機を使用して、Beckman TLA100.3ローター中で、２０℃で、６８，０００ｒｐｍで１８時間、ＣｓＣｌ溶液中で遠心分離した。
遠心分離が終わると、ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡを１００μｌアリコートで取り出し、マイクロチューブの中に移した。出発物質中に増量したウイルス物質が存在した場合、ＣｓＣｌ遠心分離工程の終わりにペレットがみられ、このペレットを、ヌクレアーゼフリー水で調製した１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．８に再懸濁した。ＣｓＣｌ遠心分離管から取り出したアリコート中の精製ＤＮＡの存在は、１ｕｌの各アリコートをパラフィルム上に載せ、１ｕｌの作業ストック（１：１０，０００）SYBR safeを加え、オレンジフィルターを使い青色光下で視覚化することによって、視覚的に確認した。
ＣｓＣｌ遠心分離工程から精製されたＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡを、次いで、ヌクレアーゼフリー水で調製した１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．８で平衡化したZebaカラムを使用して脱塩した。ＤＮＡ濃度を分光光度測定法によって決定し、ＤＮＡ純度をゲル電気泳動によって推定した（図４及び５）。ＴＰＤ−ｇＤＮＡ調製物中のタンパク質レベルを、還元４〜１２％勾配ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって定性的に調べた（図６）。次いで、ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡを、必要になるまで−８０℃で保存した。
特有の制限酵素での消化による、組換えのためのＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡの調製
親アデノウイルスゲノム、例えば図３に示したようなＣｈＡｄＯｘ１−Ｂｉ−ＧＦＰは、長いテトラサイクリン調節性ＣＭＶプロモーター（ＬＰＴＯＳ）とウシ成長ホルモン（ＢＧＨ、Bovine Growth Hormone）ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）とにはさまれたＥ１に、ＧＦＰコード配列を含む。ＧＦＰ ＯＲＦは、PsiI制限エンドヌクレアーゼによって認識される一対の特有の制限部位にはさまれており、PsiIを使用して切り取られ得、その結果、３つの断片：アデノウイルスゲノムの左アーム、ＧＦＰ ＯＲＦ、及びアデノウイルスゲノムの右アームが生成される。この親ウイルスをまたAsiSIで消化して、ＬＰＴＯＳ及びポリＡを含む完全なＧＦＰ発現カセットを切り取ることができる。この親ウイルスをまたRsrIIで消化して、Ｓ１４（Ｅ４）座位に発現カセットを挿入するためのｇＤＮＡを調製することができる。
ヌクレアーゼフリー水で３０μｌの最終反応液量に希釈された推奨反応緩衝液中で、１２０ｎｇのＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡを、１０Ｕ PsiIと共に３７℃のインキュベーターで、一晩インキュベートした。制限酵素を、６５Ｃで２０分間、インキュベートして不活性化し、次いで、ゲル電気泳動によって又は細胞にトランスフェクトしてウイルスが産生されていないことを確認することによって、消化を確認した後、消化されたＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡを、直接、組換え反応物に使用した。
アデノウイルスの迅速な生成：組換え及びトランスフェクション
所望の抗原配列又は発現カセットを、インビトロでの組換えによってＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡに導入し、次いで、組換え反応生成物を、ウイルスレスキューのための補完ＨＥＫ２９３細胞に直接トランスフェクトする。このトランスフェクションは、単一のウイルスクローンが得られるように実施する。
NEBuilder（NEB社製）及びIn-fusion（Takara社製）は、断片長又は末端適合性にかかわらず、複数のＤＮＡ断片のシームレスなアセンブリーを可能にする市販のシステムである。これらの製品を使用して、実施例２から適切に調製されたＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡに、抗原／発現カセットを挿入することができる。組換え反応混合物は、エキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼ酵素を含んでおり、NEBuilderの場合では、二本鎖ＤＮＡ分子を産生させるために共に作用するＤＮＡリガーゼを含む。エキソヌクレアーゼは、一方の末端で相補性を共有する断片のアニーリングを容易にする１本鎖の３’オーバーハング（オーバーラップ領域）を創出し、ポリメラーゼは、アニールされた各断片内のギャップを埋める。NEBuilder反応では、In-fusion反応のように宿主細胞ＤＮＡ修復機構に依存してニックＤＮＡを埋めるのではなく、ＤＮＡリガーゼが連結されたＤＮＡ中のニックを塞ぐことによって、完全に塞がったＤＮＡ分子が得られる。
４０ｎｇのPsiI消化ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡ（実施例２からの１０μｌの制限酵素反応物）を、ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡ挿入部位の５’及び３’に相補的な最低１５ｂｐの配列を含んで合成した４４ｆｍｏｌの所要の抗原配列の５’／３’末端と、薄壁ＰＣＲチューブ中で混合した。微量遠心機で短時間回転させることによって、チューブの内容物をチューブの底に集めた。次いで、組換え反応物に、NEBuilder反応混合物又はIn-fusion反応混合物の推奨量及びヌクレアーゼフリー水を加えることによって、３０μｌの最終量に調製した。この反応混合物を、５０℃で４０分間、続いて２０℃で２分間インキュベートした。組換え反応物は、補完細胞への即時的トランスフェクション及び組換えアデノウイルスのレスキューのための準備が整った。
アデノウイルスレスキューのためには、細胞は、Ｅ１タンパク質を発現しウイルス複製を支持するよう、分裂していることが必要であり、したがって目標は、トランスフェクションの当日に約８０％コンフルエントを達成することである。したがって、テトラサイクリンリプレッサーを安定して発現するＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、fetal calf serum）及びブラストサイジン（５μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ中３．７５×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。
予熱したOptimemを組換え反応物に加えて、反応チューブの最終量を１００μｌにした。組換え反応物のＤＮＡ １００ｎｇ当たり０．５μｌのリポフェクタミン２０００を、別のチューブ中の１００ｍｌのOptimemに加えた。両チューブとも、室温で５分間、インキュベートした。次いで、希釈した組換え反応物を希釈したリポフェクタミン２０００に加えた。さらに２０分の室温でのインキュベーションの前に、チューブを穏やかに混合し、その後、混合物をOptimemで３ｍｌの最終量まで希釈した。
９６ウェルプレートで増殖しているＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞から培地を除去し、希釈したリポフェクション反応物５０μｌを、６０ウェルの各ウェルに直接加えた。次いで、細胞を、８％ＣＯ２中３７℃で４〜６時間、インキュベートした。次いで、各ウェル中のトランスフェクション培地を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及びブラストサイジン（５μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ １００ｍｌで置き換え、細胞を８％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。
５日後、プレートを凍結／融解することを３回行って、細胞を破砕し、会合したウイルスを放出させた。個々のウェルから１０ｍｌの細胞ライセートを取り出し、ＤＮＡを、市販のDNAreleasy試薬を使用して細胞ライセートから分離し、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ、quantitative polymerase chain reaction）によって分析した。各ウェルからの細胞ライセートの残りを、２４時間前にＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞を１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及びブラストサイジンを含有するＤＭＥＭ中２．１×１０４細胞／ウェルで播種した９６ウェルプレートの、対応するウェルに加えた。ウェルにおいて完全な細胞変性効果が明らかとなった時点で（感染から４〜６日後の間）、組換えアデノウイルスを個々のウェルから採取した。
細胞ライセート又は精製されたウイルスからの、ＱＰＣＲによるアデノウイルスゲノムコピー数の定量化
ＨＥＫ２９３又はＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞ライセート中のＣｈＡｄＯｘ１、ＣｈＡｄＯｘ２、又はＣｈＡｄ６３ウイルスゲノムの定量化は、ＱＰＣＲによって測定した。ウイルスゲノムの数（ウイルス粒子に１：１ベースで関連させ得る）を、DNAReleasyで処理した細胞ライセートから、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって決定した。プライマー及びプローブのセットは、末端逆位配列（ＩＴＲ）の下流且つ非翻訳領域中の抗原挿入領域の上流でゲノムの左端に結合するように設計した（図７Ａ及び７Ｂを参照されたい）。これらのプライマー及びプローブ配列は、以下の通りである。
プライマー
ＣｈＡｄ フォワード 5’GTGGGAAAAGTGACGTCAAACGAG3’ （配列番号１）
ＣｈＡｄ リバース 5’TGCATCCGCCTAGAAACACCTCA3’ （配列番号２）
プローブ
ＣｈＡｄ ユニバーサルプローブ 5’GAGAGCGCGGGAAAATTGAGTATT3’ （配列番号３）
ＣｈＡｄＯｘ２では、リバースプライマーに１つのミスマッチがある。ＡｄＣｈ６３の当該領域の配列はＣｈＡｄＯｘ２の当該領域の配列に同一であるので、この方法はＡｄＣｈ６３でも成功し得る。ＡｄＨｕ５ベクターには当該配列は存在しない。
完全な細胞変性効果（ＣＰＥ、cytopathic effect）を示すフラスコから、細胞及び培地を採取した。細胞及び培地は、少量の場合は直接採取することができるが、大量の場合は、１５００ｇで５分間、遠心分離することによって細胞を回収し、１／１０培地容量のアデノウイルス溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）に再懸濁した。次いで、採取されるべき細胞を凍結及び融解することを３回行った。１０μｌのライセートを１５μｌのDNAReleasy試薬に加え、この試料を、サーモサイクラー中で、以下のサイクルを使用して処理した：６５℃で１５分間、９６℃で２分間、６５℃で４分間、９６℃で１分間、６５℃で１分間、９６℃で３０秒間、２０℃で維持。試料を全量１ｍｌに希釈し、ＱＰＣＲ反応１回当たり５μｌを使用した。
ＱＰＣＲ反応は、まず９５℃で１０分間のホットスタート活性化、続いて９５℃で１５秒間の変性を４５サイクル、続いて６０℃で１分間の変性及びアニーリングによって実行した。
４，１１８塩基対長のｐＴＯＰＯ−ＣｈＡｄＯｘ１ ＬＦ１プラスミドを使用して検量線を確立し、検量線から、表１に示したように決まった１ｎｇ ＤＮＡ当たりのゲノムコピー数が得られる。
ｍＣｈｅｒｒｙを発現する組換えＣｈＡｄＯｘ１の生成
ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を、ＣｈＡｄＯｘ１への挿入のモデル抗原として使用した。ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を、ＴＰＣ−ＡｄｇＤＮＡのPsiI挿入部位に対し１５ｂｐの相同性を含有するプライマーを使用して増幅させた。ＴＰＣ−ｇＤＮＡをPsiIで消化し、次いで、組換え前に、この酵素は熱失活させた。NEBuilder及びIn-fusionを使用して、様々なＴＰＣ−ｇＤＮＡ及びｍｃｈｅｒｒｙ ＯＲＦ濃度の組換え効率を試験した。反応物を、５０℃で４０分間、続いて２０℃で２分間インキュベートした後、直ちに、１：５の比でリポフェクタミン２０００を使用して、９６ウェルプレートに播種したＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３０時間後、ＧＦＰ（消化されていないＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡ由来）及びｍＣｈｅｒｒｙ細胞（組換え反応物由来）の数を、ＦＡＣＳによって決定した（図９）。
Figure 2021533791

Claims (39)

  1. ワクチンとして使用するための所望の異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスを生成する方法であって、
    （ｉ）インビトロでの組換え反応において、末端タンパク質複合体化アデノウイルスゲノムＤＮＡ（ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡ）を、前記所望の遺伝子をコードし、かつアデノウイルスゲノムＤＮＡの挿入部位配列に相同な５’及び３’末端を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと組み換えることによって、前記所望の異種遺伝子を前記アデノウイルスゲノムに挿入するステップ、
    （ii）個々の容器中で増殖している細胞に、そのような個々の容器の多数が前記所望の異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスに感染した単一細胞を含有するように、（ｉ）からの前記インビトロでの組換え反応混合物の希釈物をトランスフェクトするステップ、及び
    （iii）単一細胞が、前記所望の異種遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む前記組換えアデノウイルスに感染した、これらの個々の容器を同定するステップ
    を含む、前記方法。
  2. ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡが、セロタイプが一致した末端タンパク質及びアデノウイルスゲノムを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 所望の遺伝子が、１つのエピトープ、一連のエピトープ、抗原のセグメント、又は完全な抗原タンパク質をコードする、請求項１又は２に記載の方法。
  4. ポリヌクレオチドが、合成ＤＮＡ分子、精製されたＤＮＡ制限断片、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. ポリヌクレオチドが、その５’末端に５〜５０ｂｐ及びその３’末端に５〜５０ｂｐを有し、前記５〜５０ｂｐが、アデノウイルスゲノムＤＮＡの挿入部位配列に相同である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. ポリヌクレオチドが、その５’末端に１０〜２０ｂｐ及びその３’末端に１０〜２０ｂｐを有し、前記１０〜２０ｂｐが、アデノウイルスゲノムＤＮＡの挿入部位配列に相同である、請求項５に記載の方法。
  7. ポリヌクレオチドが、その５’末端に１５ｂｐ及びその３’末端に１５ｂｐを有し、前記１５ｂｐが、アデノウイルスゲノムＤＮＡの挿入部位配列に相同である、請求項６に記載の方法。
  8. アデノウイルスゲノムＤＮＡの挿入部位配列が、Ｅ１座位内に位置する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡが、アデノウイルスゲノムＤＮＡの挿入部位配列内のユニークな制限部位で消化され、前記アデノウイルスゲノムＤＮＡが、その５’末端で所望の遺伝子の発現を促進する長いテトラサイクリン調節性ＣＭＶプロモーターに隣接し、かつ、その３’末端でウシ成長ホルモンポリアデニル化配列に隣接している、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. インビトロでの組換え反応物が、４０ｎｇの、消化されたＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡと、４４ｆｍｏｌの、所望の遺伝子をコードする合成ＤＮＡの３’及び５’末端とを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. トランスフェクトされるべき細胞が、トランスフェクションの１日前に、３．７５×１０５細胞．ｍｌ−１の密度で個々の容器に播種される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
  12. 細胞が、個々の容器中で、約８０％コンフルエントで増殖している間にトランスフェクトされる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. トランスフェクトされている細胞が、テトラサイクリンリプレッサーを安定して発現する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
  14. インビトロでの組換え反応混合物が、トランスフェクション培地で希釈され、６０の個々の容器中で増殖している細胞にトランスフェクトされるように均等に分割される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. トランスフェクトされた細胞が、細胞内ウイルスを放出するように凍結融解され、組換えアデノウイルスの存在が、トランスフェクトされた細胞の各ウェルからの細胞ライセート、並びにアデノウイルス末端逆位配列（ＩＴＲ）の下流且つ非翻訳領域中の所望の遺伝子の挿入部位の上流でゲノムの左端に結合するように設計されたプライマー及びプローブのセットを使用して、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって確認される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. アデノウイルスゲノムが、サルアデノウイルスに由来する、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. サルアデノウイルスが、ＣｈＡｄＯｘ１若しくはＣｈＡｄＯｘ２又はＣｈＡｄ３若しくはＣｈＡｄ６３である、請求項１６に記載の方法。
  18. アデノウイルスゲノムが、ヒトアデノウイルスに由来する、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
  19. ヒトアデノウイルスが、セロタイプ５ヒトアデノウイルスではない、請求項１８に記載の方法。
  20. 個々の容器が、マルチウェルプレート上の別個のウェルである、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
  21. ＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡが、必要な品質管理検定を受け合格しておりgood manufacturing practice（ＧＭＰ）バイオ製造における使用が可能であるＴＰＣ−Ａｄ ｇＤＮＡ物質ストックから用意される、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
  22. 請求項１〜２１のいずれかに記載の方法によって生成された組換えアデノウイルス。
  23. 請求項１〜２１のいずれかに記載の方法において使用するための、アデノウイルスゲノムを含む組成物であって、前記アデノウイルスゲノムにおいて、Ｅ１遺伝子が、前記アデノウイルスゲノム中の他のどこにも存在しない特有の制限部位の第１の対にはさまれた蛍光マーカータンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットによって置換されている、前記組成物。
  24. アデノウイルスゲノムが、サルアデノウイルスに由来する、請求項２３に記載の組成物。
  25. サルアデノウイルスが、ＣｈＡｄＯｘ１若しくはＣｈＡｄＯｘ２又はＣｈＡｄ３若しくはＣｈＡｄ６３である、請求項２４に記載の組成物。
  26. アデノウイルスゲノムが、ヒトアデノウイルスに由来する、請求項２３に記載の組成物。
  27. ヒトアデノウイルスが、セロタイプ５ヒトアデノウイルスではない、請求項２６に記載の組成物。
  28. 蛍光マーカータンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項２３〜２７のいずれかに記載の組成物。
  29. 特有の制限部位の第１の対が、PsiI、AsiSi、又はRsrII部位から選択される、請求項２３〜２８のいずれかに記載の組成物。
  30. 発現カセットが、蛍光マーカータンパク質をコードするＤＮＡ配列に対して５’に位置する長いテトラサイクリン調節性ＣＭＶプロモーター、及び前記蛍光マーカータンパク質をコードするＤＮＡ配列に対して３’に位置するウシ成長ホルモンポリアデニル化配列をさらに含み、特有の制限部位の第１の対が、前記長いテトラサイクリン調節性ＣＭＶプロモーターと前記蛍光マーカータンパク質をコードするＤＮＡ配列との間、並びに前記蛍光マーカータンパク質をコードするＤＮＡ配列と前記ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列との間に位置する、請求項２３〜２９のいずれかに記載の組成物。
  31. 発現カセットが、特有の制限部位の第１の対とは異なる、長いテトラサイクリン調節性ＣＭＶプロモーターに対して５’に位置し、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列に対して３’に位置する特有の制限部位の第２の対をさらに含む、請求項３０に記載の組成物。
  32. 特有の制限部位の第２の対が、PsiI、AsiSi、又はRsrII部位から選択される、請求項３１に記載の組成物。
  33. アデノウイルスゲノムが、Ｓ１５／Ｅ４座位に追加の特有の制限部位を含むようにさらに改変される、請求項２３〜３２のいずれかに記載の組成物。
  34. 追加の特有の制限部位が、PsiI、AsiSi、又はRsrII部位から選択される、請求項３３に記載の組成物。
  35. アデノウイルスゲノムが自己末端タンパク質と複合体を形成している、請求項２３〜３４のいずれかに記載の組成物。
  36. アデノウイルスゲノムが異種末端タンパク質と複合体を形成している、請求項２３〜３４のいずれかに記載の組成物。
  37. アデノウイルスベクターがGateway組換え配列を欠く、請求項２３〜３６のいずれかに記載の組成物。
  38. 必要な品質管理検定を受け合格しており、ＧＭＰバイオ製造における使用が可能である、請求項２３〜３７のいずれかに記載の組成物。
  39. 哺乳動物において免疫応答を生じさせる病原体若しくは腫瘍エピトープ又は抗原を発現する、請求項２３〜３７に記載の組成物のいずれかを含む組換えアデノウイルスベクター免疫原。
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