KR20210052490A - 바이러스 생산을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (i) 시험관내 재조합 반응에서 말단 단백질 복합체화된 아데노바이러스 게놈 DNA (TPC-Ad gDNA)를 관심 유전자를 코딩하고 아데노바이러스 게놈 DNA의 삽입 부위 서열에 상동성인 5' 및 3' 단부를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 재조합함으로써 관심 이종 유전자를 아데노바이러스 게놈에 삽입하는 단계, (ii) 개별 용기에서 성장하는 세포를 (i)로부터의 시험관내 재조합 반응 혼합물의 희석물로 형질감염시켜 다수의 이러한 개별 용기가 관심 이종 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스에 의해 감염된 단일 세포를 함유하도록 하는 단계, 및 (iii) 단일 세포가 관심 이종 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스에 의해 감염된 것인 개별 용기를 확인하는 단계를 포함하는, 백신으로서 사용하기 위한 관심 이종 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 생성하는 방법에 관한 것이다. 적합하게는, 상기 TPC-Ad gDNA는 혈청형-매칭된 말단 단백질 및 아데노바이러스 게놈을 포함하고, 상기 관심 유전자는 단일 에피토프, 에피토프의 스트링, 항원의 세그먼트 또는 완전한 항원 단백질을 코딩한다. 본 발명은 또한 이들 방법을 이용하여 제조된 재조합 아데노바이러스 및 조성물에 관한 것이다.

Description

바이러스 생산을 위한 방법 및 조성물
본 발명은 감염성 병원체 항원 및 암과 관련된 종양 항원을 포함한 이종 항원에 대한 면역 반응, 적합하게는 보호 면역 반응의 유도에 사용하기 위한 재조합 아데노바이러스의 신속한 생성에 관한 것이다.
인간 혈청형 5 아데노바이러스 (HAdV-C5) 또는 다른 인간 아데노바이러스 또는 시미안 아데노바이러스로부터 유래된 복제 불능 아데노바이러스 벡터는 다수의 임상 시험에서 감염성 병원체 항원 및 암 항원을 전달하기 위한 백신 벡터로서 사용되어 왔다 (Ewer et al. (2017) Hum Vaccin Immunother. 13(12):3020-3032; and Cappuccini et al. (2016) Cancer Immunol Immunother. 65(6):701-13). 이들 벡터는 백신 개발에 다수의 이점을 제공하며; 이들은 인간에서 복제 불능이므로 복제하는 벡터보다 안전하고; 이들은 복제 및 비-복제 세포를 감염시키며; 이들은 광범위한 조직 친화성을 가지며, 이들은 특히 강력한 세포 면역을 포함한 높은 면역 반응을 이끌어내며; 이들은 고역가로 쉽게 정제된다 (Morris et al. (2016) Future Virology 11(9), 649-659). 박테리오파지 λ 레드 재조합 (재조합공학) 기술과 커플링된 박테리아 인공 염색체 (BAC)의 출현은 아데노바이러스 게놈의 클로닝 및 조작을 촉진하였다 (Ruzsics Z., Lemnitzer F., Thirion C. (2014) Engineering Adenovirus Genome by Bacterial Artificial Chromosome (BAC) Technology. In: Chillon M., Bosch A. (eds) Adenovirus. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 1089. Humana Press, Totowa, NJ). 발현 카세트의 신속한 삽입을 위한 재조합 기술과 커플링된 이 기술은 아데노바이러스 벡터의 생성에 현재 사용된다. 그러나, 이 접근법 및 종래의 제조 공정을 이용하는 경우, 항원 확인부터 임상 등급 아데노바이러스 벡터까지 걸리는 시간은 평균 33-44주이다 (도 1). 백신으로서 사용하기 위한 재조합 바이러스의 제조는 프리-GMP (프리-우수 제조 기준: pre-Good Manufacturing Practice) 출발 물질의 생성을 수반하며 이는 허용 세포의 초기 감염에 따라 구출된 후 재조합 바이러스의 클로닝을 필요로 한다. 이는 시간 소모적인 공정이며, 클로람페니콜 유전자 (표준 아데노바이러스 게놈 조작 공정에서 박테리아 인공 염색체 (BAC) 선택에 사용됨)가 아데노바이러스에 삽입될 가능성 및 BAC-유래된 아데노바이러스 게놈으로부터 생산되는 바이러스 벡터의 이질성으로 인해 각각 5주가 걸리는 최대 3회의 클로닝이 필요하다. BAC를 사용하는 경우, 박테리아에서의 조작 중에 도입되었을 수 있는 아데노 게놈에서의 임의의 돌연변이가 아데노바이러스로 전달될 것이다. 이 문제는 아데노바이러스 게놈 DNA가 재조합 아데노바이러스 생성을 시작하기 전에 이미 클로닝되고 특성화되어 정확하다고 알려진 본 발명의 방법에서 다루어진다. 결과적으로, 이전에 특성화되었던 아데노바이러스 게놈 DNA를 서열화할 필요가 없다.
힐겐버그(Hillgenberg)와 공동작업자들 (Journal of Virology 80 (11) (2006) 5435-5450) 및 독립적으로 초이(Choi)와 공동작업자들 (Journal of Biotechnology 162 (2012) 246-252)은 셔틀 벡터 구축, 박테리아 형질전환 및 선택에 대한 필요성을 제거하고 플라크 단리에 필요한 노력을 감소시킨 재조합공학 접근법을 이용하여 대량의 재조합 아데노바이러스를 생성하는 신속한 방법을 기술하였다. 그러나, 이들 저자들은 다수의 상이한 이종 유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스 집단을 생성하려고 하였으나 백신으로서 사용하기 위한 방법에서 단일 재조합 바이러스의 신속하고 단순한 클로닝을 제공하지 못하였다. 이러한 백신의 GMP 제조 및 임상적 사용과 관련된 규정에 따라 아데노바이러스 백신의 임상적 사용에는 단일 클론이 필요하다.
보다 최근에 미시악(Miciak)과 공동작업자들 (PLoS ONE 13 (6) (2018) e0199563)은, 이후 세포로 형질감염되는, 여러 단편으로부터의 시험관내 아데노바이러스 게놈 어셈블리 방법을 기술하였다. 이들 작업자들도 재조합 바이러스가 단리된 후 클론 선택 방법을 수행할 필요가 없는 클로닝된 단일 재조합 바이러스를 생성하는 방법을 만들지 못하였다.
따라서, 백신으로서 사용하기 위한 재조합 아데노바이러스의 신속한 생성에 적합한 선행 기술의 방법은 없다. 본 발명은 4주 이내에 복제 불능 아데노바이러스 벡터의 소규모 임상 등급 배치의 생성을 위한 새로운 방법을 제공함으로써 이 난제를 해결 및 극복하고 선행 기술의 방법과 관련된 문제(들)을 극복하고자 한다 (도 2).
아데노바이러스는 26-46 kb 길이의 선형 이중 가닥 DNA (dsDNA) 게놈을 갖는 비-외피 바이러스이다. 아데노바이러스 게놈 DNA는 네이키드 DNA로서 허용 세포로 형질감염될 때 감염된다. 그러나, 동일한 아데노바이러스로부터의 55kDa 말단 단백질 (TP)과 복합체화된 인간 Ad-5 (HAdV-C5) 게놈 DNA (gDNA)가 허용 세포로 형질감염되면 네이키드 DNA와 비교하여 100-1000배 더 많은 바이러스 플라크가 생산되는 것으로 보고되었다. TP는 세포 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 바이러스 gDNA를 보호하고, DNA 복제 개시를 위한 프라이머로서 역할을 하며, DNA 폴리머라제와 이종이량체를 형성한다. DNA 폴리머라제는 제1 dCTP를 HAdV-C5 TP의 Ser-580과 공유적으로 커플링한다. 인간 아데노바이러스 TP는 단백질-비함유 템플릿과 비교하여 템플릿 활성을 20배 이상 증가시킴으로써 인간 아데노바이러스 복제를 증대시킨다. 이는 다른 복제 인자의 결합을 허용하는 복제 기점의 미묘한 변화를 통해 이루어진다. TP는 또한 HAdV-C5 게놈 DNA-숙주 핵 기질 회합을 매개하여 전사를 촉진한다.
본 발명자들은 현재 선호되는 시미안 아데노바이러스 벡터에 초점을 맞추어 임상 등급 아데노바이러스 백신 벡터를 생성하기 위해 기존 재조합 기술과 조합하여 형질감염된 TPC-아데노바이러스 gDNA (TPC-Ad gDNA)로부터 증가된 플라크 생산 특성을 이용하고자 하였다.
TPC-Ad gDNA는 아데노바이러스 생산 및 제조에 앞서 단리 및 정제되고, 균질성이 시험되고, 저장될 수 있다. 이 접근법은 박테리아에서 아데노바이러스 gDNA의 증식에 대한 필요성을 제거하여 클로람페니콜 유전자 (BAC 선택에 사용됨)의 아데노바이러스 게놈으로의 삽입에 대한 가능성 및 박테리아 숙주에서 다수회 증폭 후 발생할 수 있는 바이러스 게놈의 이질성에 대한 가능성을 회피한다. TPC-Ad gDNA로 세포를 형질감염시킨 후 생성되는 플라크의 수가 증가하면 재조합 아데노바이러스 게놈이 소수만 생성될 때 재조합 바이러스를 성공적으로 구출할 수 있으며, 또한 생성된 재조합 아데노바이러스를 제조 공정의 매우 초기 단계에서 빠르고 쉽게 클로닝할 수 있다. 본 발명자들은 바이러스 생산 및 제조 공정을 단순화하였으며, 그 결과 놀랍게도 28일만에 백신으로서 사용하기 위한 재조합 아데노바이러스를 생성 및 제조하는 것을 가능하게 하였다. 이러한 백신 생산 시간의 단축은 하기를 포함하는 많은 이점을 가질 것이다: i) 치료 면역화에 의해 보다 신속하게 악성 종양을 치료하기 위한 맞춤형 암 백신을 신속하게 생성할 수 있게 함, ii) 새로운 전염병에 맞서 새로운 돌발 병원체에 대한 백신의 더 신속한 생성, 더 많은 양의 백신을 더 신속하게 제조하고 생성할 수 있게 함, 및 iii) 시설에서 현저한 시간 단축을 통해 값 비싼 GMP (우수 제조 기준) 제조 시설에서의 제조 비용 감소.
제1 측면에서, 본 발명은 (i) 시험관내 재조합 반응에서 말단 단백질 복합체화된 아데노바이러스 게놈 DNA (TPC-Ad gDNA)를 관심 유전자를 코딩하고 아데노바이러스 게놈 DNA의 삽입 부위 서열에 상동성인 5' 단부에서 적어도 15bp 및 3' 단부에서 적어도 15bp를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 DNA와 재조합함으로써 관심 이종 유전자를 아데노바이러스 게놈에 삽입하는 단계, (ii) 개별 용기에서 성장하는 세포를 (i)로부터의 시험관내 재조합 반응 혼합물의 희석물로 형질감염시켜 다수의 이러한 개별 용기가 관심 이종 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스에 의해 감염된 단일 세포를 함유하도록 하는 단계, 및 (iii) 단일 세포가 관심 이종 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스에 의해 감염된 것인 개별 용기를 확인하는 단계를 포함하는, 백신으로서 사용하기 위한 관심 이종 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 생성하는 방법을 제공한다.
제1 측면의 방법은 생산 시간이 대략 33-44주로부터 28일로 단축됨에 따라 백신으로서 사용하기 위한 재조합 아데노바이러스를 생산하는데 유리하게 이용될 수 있다.
바이러스 스톡은 현행 방법을 사용하여서는 검출하기 어려운 극히 낮은 수준의 많은 소수 종을 함유할 수 있는 벌크 형질감염물을 증폭시켜 생산된다. 따라서, 이러한 방법을 이용하여 클론 스톡이 생성되도록 하려면 3회의 클로닝이 필요하다. 본 발명의 방법은 특징규명된 바이러스 게놈으로 시작하므로 재조합 및 형질감염 후 재조합 항원 서열만 부정확할 수 있다. 형질감염은 하나의 재조합 바이러스 게놈만이 각각의 용기를 형질감염시키도록 수행되므로 많은 소수 종을 포함한 믹스가 있을 수 없다. 매우 드문 경우에 2개의 바이러스 게놈이 동일한 세포를 형질감염시킬 수 있지만, 이들이 재조합 항원 코딩 서열에서 동일하지 않은 경우, 각각의 바이러스 종은 혼합물의 대략 50%를 차지할 것이고 우리는 더 이상 소수 종을 찾지 않으므로, 이들은 코딩 DNA 서열을 시퀀싱함으로써 쉽게 구별될 수 있다. 정확한 서열과 부정확한 서열의 혼합물을 함유하는 것으로 보이는 임의의 바이러스 샘플은 폐기될 것이며 정확한 것들만 백신으로서 사용하기 위해 선택될 것이다.
관심 이종 유전자를 코딩하는 합성 DNA는 완전히 정확하지 않은 소수 종을 함유할 수 있다. 본 발명의 방법은 형질감염 직후 바이러스 클론을 생산하여 각각의 클론 내의 유전자 코딩 서열을 시퀀싱하고 정확한 클론만 선택되도록 함으로써 이 문제를 해결한다. 이는 잠재적으로 재조합 바이러스의 혼합물을 나타내는 벌크 바이러스 스톡을 증폭시킨 다음 나중에 클로닝하는 것보다 유리하다.
본 발명의 방법은, 재조합 아데노바이러스의 인스턴트 클로닝 및 신속 확장을 제공하는 것 외에도, 재조합 바이러스를 백신으로서 사용하는데 필요한 다량의 품질 관리 (QC) 시험을 임의의 특정한 재조합 아데노바이러스의 제조를 시작하기 전의 지점으로 재배치하는데 중요한 개선을 제공한다. 이러한 QC 시험은 벌크 출발 물질에 대해 수행될 수 있으며, 이 방법을 이용하여 백신으로서 사용하기 위한 재조합 아데노바이러스를 생성하는 경우에 상당한 시간 절약을 제공한다.
새로운 방법의 또 다른 이점은 본원에 제시된 바와 같이 시미안 아데노바이러스 벡터를 생성하는데 효율적으로 사용될 수 있다는 것이다. 신속한 아데노바이러스 벡터 생성에 대한 대부분의 이전 작업은 인간 아데노바이러스, 특히 인간 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad-5)의 단지 하나 또는 매우 소수의 혈청형을 사용하였다. 시미안 아데노바이러스는 i) 인간 아데노바이러스에 대한 자연 노출에 의해 야기되는 기존의 항-벡터 면역에 의해 훨씬 덜 부정적인 영향을 받고; ii) 이들은 머크(Merck) HIV 백신의 주요 "STEP" 시험에서 주요 안전 신호 및 증대된 HIV 감염에 대한 우려와 관련된 일반적인 인간 아데노바이러스 벡터 (Ad-5)와 대조적으로 (Cohen (2007) Science 318:28-29), 수천 명의 대상체에서 안전하고 면역원성이 있는 것으로 밝혀졌기 때문에 (Ewer et al., 상기 참조), 현재 인간 아데노바이러스보다 면역화를 위한 벡터로 선호된다.
제2 측면에서, 본 발명은 E1 유전자가 제1 측면의 방법에 사용하기 위한 아데노바이러스 게놈의 다른 어느 곳에도 존재하지 않는 제1 쌍의 고유한 제한 부위에 의해 플랭킹된 형광 마커 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트로 대체된 것인 아데노바이러스 게놈을 포함하는 조성물을 제공한다.
제2 측면의 조성물은 관심 이종 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스의 명확한 확인을 허용하도록 제1 측면의 방법에서 유리하게 사용될 수 있다. 제1 측면의 방법을 이용하는 모든 명확한 이점은 제2 측면의 조성물에서도 찾아질 수 있다.
본 발명은 이제 첨부된 도면을 참조하여 예로서 설명될 것이다.
도 1은 현행 방법을 이용하는 백신으로서 사용하기 위한 재조합 아데노바이러스의 신속한 생산을 대한 도식적 개요를 타이밍과 함께 제시한다. QC - 품질 관리; Amp - 증폭; GMP - 우수 제조 기준; MVSS - 마스터 바이러스 시드 스톡.
도 2는 백신으로서 사용하기 위한 재조합 아데노바이러스 구축물을 생산하는데 이용되는 본 발명의 방법에 대한 개략적 개요를 타이밍과 함께 제시한다.
도 3은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 모 바이러스 조성물의 개략적 예시를 제시한다. 이 경우에서, 모 바이러스는 항원 또는 발현 카세트의 삽입을 위한 3개의 고유한 제한 부위 (PsiI, AsiSI 및 RsrII)를 포함하는 ChAdOx1-Bi-GMP 게놈이다. LPTOS - 긴 테트라시클린-조절된 CMV 프로모터.
도 4는 3M 구아니딘 히드로클로라이드로 파괴된 TPC-Ad gDNA의 분석을 제시한다. 200ul 아데노바이러스 입자 (1.4e12VP/ml)를 얼음 상에서 45분 동안 3M 구아니딘 히드로클로라이드로 파괴하였다. 10μl 샘플을 65℃에서 40분 동안 2μg 프로테이나제 K와 함께 (+) 또는 없이 (-) 인큐베이션한 다음, 0.7% 아가로스를 통해 분해하였다. M=1kbp 게네룰러(Generuler) 사다리 (써모피셔(Thermofisher)).
도 5는 3M 구아니딘 히드로클로라이드에서 파괴 및 18시간 동안 68000 rpm로 2.8M CsCl 구배에서 원심분리한 후의 TPC-Ad gDNA 단리, 정제, 탈염 및 여과를 제시한다. DNA를 단리하고, 10mM 트리스 pH7.8로 탈염하고, 0.2μM 주사기 필터를 통해 여과하였다. DNA의 분취물을 0.7% 아가로스를 통해 분해하였다. M=1kbp 게네룰러 (써모피셔).
도 6은 2.8M CsCl 구배에서 원심분리한 후 단리된 TPC-Ad gDNA의 단백질 분석을 제시한다. 50ng TPC-Ad gDNA를 함유하는 샘플을 SDS 환원 4-12% 비스-트리스 NuPAGE 미디겔을 통해 분해하고, 은 염색을 이용하여 염색하였다.
도 7은 ChAdOx1 및 ChAdOx2 및 ChAd63 아데노바이러스 게놈에서 qPCR 프라이머 및 프로브의 결합 위치를 제시한다.
도 8은 모 아데노바이러스 게놈 DNA로서 ChAdOx1-Bi-GFP를 사용하여 재조합 ChAdOx1을 생산하기 위한 청구된 방법의 시험관내 재조합 반응 도식을 제시한다.
도 9는 다양한 양의 TPC-Ad gDNA 및 mCherry ORF PCR 산물을 함유하는 재조합 반응물로의 형질감염 후, 형질감염 30시간 후 mCherry 및 GFP를 발현하는 세포 %를 제시한다. 60, 40 및 20ng PsiI 분해된 TPC-Ad gDNA를 NE빌더(NEBuilder)를 사용하여 40, 20 및 10ng mCherry ORF PCR 산물과 재조합하였다. 재조합 반응물을 형질감염 전에 50℃에서 40분 동안에 이어 20℃에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 96wp에 시딩된 T-Rex-293 세포를 리포펙타민 2000을 1:5의 비율로 사용하여 재조합 반응물로 형질감염시켰다. 테트라시클린을 함유하는 배지를 형질감염 5시간 후에 첨가하였다. GFP 및 mCherry를 발현하는 세포의 수를 FACS 분석에 의해 감염 30시간 후에 결정하였다.
도 10은 백신으로서 사용하기 위한 재조합 아데노바이러스의 신속한 생성을 위한 공정의 개관을 제시한다.
제1 측면에서, 본 발명은 (i) 시험관내 재조합 반응에서 말단 단백질 복합체화된 아데노바이러스 게놈 DNA (TPC-Ad gDNA)를 관심 유전자를 코딩하고 아데노바이러스 게놈 DNA의 삽입 부위 서열에 상동성인 5' 단부에서 적어도 15bp 및 3' 단부에서 적어도 15bp를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 DNA와 재조합함으로써 관심 이종 유전자를 아데노바이러스 게놈에 삽입하는 단계, (ii) 개별 용기에서 성장하는 세포를 (i)로부터의 시험관내 재조합 반응 혼합물의 희석물로 형질감염시켜 다수의 이러한 개별 용기가 관심 이종 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스에 의해 감염된 단일 세포를 함유하도록 하는 단계, 및 (iii) 단일 세포가 관심 이종 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스에 의해 감염된 것인 개별 용기를 확인하는 단계를 포함하는, 백신으로서 사용하기 위한 관심 이종 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 생성하는 방법을 제공한다.
선행 기술은 재조합 아데노바이러스를 생산하는 다수의 방법을 제공하며, 특히, 예를 들어 문헌 (Hillgenberg et al. (2006)), 문헌 (Choi et al. (2012)) 및 문헌 (Miciak et al. (2018))은 각각 훌륭한 방법을 제공하였다. 그러나, 제공된 방법 중 어느 것도 백신으로서 사용하기 위한 재조합 클론 아데노바이러스를 단리하기 위한 장기간의 클로닝 공정에 대한 필요성을 다루지 않았다. 본 발명의 방법은 유리하게는 재조합 아데노바이러스 생성 시 장기간의 클로닝 공정을 제거하는 수단을 제공한다. 이는 다시 재조합 아데노바이러스 벡터 생성 시 큰 지연을 제거하여 이러한 벡터가 백신으로서, 특히 암 치료에서 맞춤형 백신 또는 돌발 병원체 대한 신속한 반응 백신으로서 사용하기 위해 보다 쉽게 적합화될 수 있도록 한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, TPC-Ad gDNA는 혈청형-매칭된 말단 단백질 및 아데노바이러스 게놈을 포함한다. 혈청형-매칭된 아데노바이러스 게놈 및 말단 단백질을 사용하면 재조합 및 세포의 형질감염 후 고효율 바이러스 구출이 가능하다.
본 발명의 구체적 실시양태에서, 관심 유전자는 단일 에피토프, 에피토프의 스트링, 항원의 세그먼트 또는 완전한 항원 단백질을 코딩한다. 다양한 관심 유전자를 제공함으로써 암 또는 돌발 질환을 포함한 다양한 질환에 걸리거나 앓을 위험이 있는 환자를 보호하거나 치료하기 위한 개선된 백신을 개발할 수 있다.
대안적 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 합성 DNA 분자, 정제된 DNA 제한 단편 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 산물이다. 방법은 재조합 아데노바이러스를 생산하는데 사용될 DNA의 공급원을 유연하게 선택할 수 있게 하며, 이는 암 또는 돌발 질환을 포함한 많은 질환을 예방 또는 치료하기 위한 백신으로서 사용하기 위한 재조합 아데노바이러스를 생산할 때 중요한 방법을 보다 신속하게 완료할 것이다.
추가의 대안적 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 아데노바이러스 게놈 DNA의 삽입 부위 서열에 상동성인 5' 단부에서 5 내지 50bp 및 3' 단부에서 5 내지 50bp를 갖거나, 또는 폴리뉴클레오티드는 아데노바이러스 게놈 DNA의 삽입 부위 서열에 상동성인 5' 단부에서 10 내지 20bp 및 3' 단부에서 10 내지 20bp를 갖거나, 또는 폴리뉴클레오티드는 아데노바이러스 게놈 DNA의 삽입 부위 서열에 상동성인 5' 단부에서 15bp 및 3' 단부에서 15bp를 갖는다. 적합한 상동성 단부를 갖는 폴리뉴클레오티드의 제공은 아데노바이러스 게놈 DNA와의 효율적인 재조합을 가능하게 하여 이 방법을 이용하는 시험관내 재조합 반응에서 재조합 아데노바이러스의 신뢰성 있는 생산을 가능하게 한다.
바람직한 실시양태에서, 아데노바이러스 게놈 DNA의 삽입 부위 서열은 E1 로커스 내에 위치된다. E1 유전자의 결실은 재조합 바이러스에 의해 감염된 세포에서 이종 발현 카세트를 삽입하고 관심 항원을 신뢰할 수 있는 고수준으로 발현할 수 있게 한다. 이는 백신으로서 사용하기 위한 재조합 아데노바이러스에 대해 유리한 특성을 제공한다.
특정 실시양태에서, TPC-Ad gDNA는 5' 단부에서 관심 유전자의 발현을 구동하는 긴 테트라시클린-조절된 CMV 프로모터에 의해 플랭킹되고 3' 단부에서 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열에 의해 플랭킹된 아데노바이러스 게놈 DNA의 E1 로커스 내의 고유한 제한 부위에서 분해된다. E1 로커스 내의 고유한 제한 부위에서 아데노바이러스 게놈 DNA의 분해는 관심 항원을 코딩하는 DNA 서열과의 재조합에 적합한 단부 서열을 제공하는 동시에 임의의 재조합 반응으로부터 무손상 모 아데노바이러스 DNA를 제거한다. 유리하게는, 이는 관심 항원을 코딩하는 DNA 서열과의 보다 효율적인 재조합을 가능하게 하고 또한 이 방법을 이용하여 재생되는 모 아데노바이러스의 수를 감소시킨다.
구체적 실시양태에서, 시험관내 재조합 반응은 분해된 TPC-Ad gDNA 40ng 및 관심 유전자를 코딩하는 합성 DNA의 3' 및 5' 단부 44fmol을 포함한다. 이러한 양의 반응물을 제공하면 관심 이종 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스의 최적화된 재조합 및 생성이 가능하다. 유리하게는, 이는 본 발명의 방법을 이용하여 개별 클론의 생성을 증가시키는 재조합 아데노바이러스 게놈 DNA의 양으로 적합한 세포의 형질감염을 가능하게 한다.
추가의 구체적 실시양태에서, 형질감염될 세포는 형질감염 1일 전에 3.75 x 105개 세포.ml-1의 밀도로 개별 용기에 시딩된다. 이 밀도로의 세포의 시딩은 세포에서 재조합 아데노바이러스 구출의 효율을 개선시킨다.
추가의 구체적 실시양태에서, 세포는 개별 용기에서 대략 80% 전면생장률로 성장하면서 형질감염된다. 이는 아데노바이러스 초기 유전자의 발현을 증가시키고 세포에서 재조합 아데노바이러스 구출의 효율을 개선시킨다.
추가의 구체적 실시양태에서, 세포는 테트라시클린 리프레서를 안정적으로 발현한다. 이러한 세포, 예를 들어 T-Rex-293 세포의 사용은 형질감염 후 바이러스 구출 동안 관심 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 세포는 형질감염 후 쉽게 영향을 받고, 이종 유전자 발현의 억제는 세포 사멸을 최소화하며, 이 방법의 이 단계에서 효율적인 바이러스 구출을 가능하게 한다.
특정한 실시양태에서, 형질감염되는 세포는 테트라시클린 리프레서를 안정적으로 발현한다. 재조합 바이러스를 구출하는데 사용되는 세포에서 테트라시클린 리프레서의 발현은 세포에 독성일 수 있는 관심 유전자의 발현을 방지하여 바이러스 구출을 증가시킨다.
추가의 구체적 실시양태에서, 시험관내 재조합 반응 혼합물은 형질감염 배지에 희석되고 균등하게 분할되어 60개의 개별 용기에서 성장하는 세포를 형질감염시킨다. 유리하게는, 각각의 재조합 반응물을 60개의 동일한 부분으로 분할하고 형질감염하면 개별 재조합 아데노바이러스가 60개의 개별 용기 모두는 아니지만 비율로 전달된다. 이를 통해 사용자는 재조합 아데노바이러스를 함유하지 않는 음성 대조군 웰을 포함하면서 다수의 개별 재조합 아데노바이러스 함유 웰을 확인할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 형질감염된 세포는 동결 및 해동되어 세포-회합된 바이러스를 방출하며, 재조합 아데노바이러스의 존재는 형질감염된 세포의 각각의 웰로부터의 세포 용해물, 및 아데노바이러스 역 말단 반복부 (ITR)의 하류 및 비-코딩 영역의 관심 유전자 삽입 부위의 상류의 게놈의 좌측 단부에 결합하도록 설계된 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 정량적 PCR (qPCR)로 확인된다. 이러한 단순화되고 가속화된 샘플 추출 및 스크리닝 공정을 통해 관심 재조합 아데노바이러스를 쉽고 신속하게 확인할 수 있으며 샘플에서 모 아데노바이러스의 존재를 배제시킬 수 있다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 아데노바이러스 게놈은 인간 아데노바이러스 또는 시미안 아데노바이러스로부터 유래되고, 바람직하게는 인간 아데노바이러스는 혈청형 5 인간 아데노바이러스가 아니다. 가장 바람직한 실시양태에서, 시미안 아데노바이러스는 ChAdOx1 (Antrobus et al. (2014) Mol Ther. 22(3):668-674), ChAdOx2 (Morris et al. (2016) Future Virol. 11(9):649-659), ChAd3 또는 Chad63과 같은 침팬지 아데노바이러스이다. 인간 또는 시미안 아데노바이러스를 사용하면 이용될 방법에 의해 생산되는 재조합 아데노바이러스를 인간 대상체에서 백신으로서 사용할 수 있다. 시미안 아데노바이러스의 사용, 특히 ChAdOx1 또는 ChAdOx2의 사용은 인간 대상체에게 투여될 때 기존의 항-아데노바이러스 면역 발생률이 낮은 개선된 백신을 제공한다.
구체적 실시양태에서, 개별 용기는 다중웰 플레이트 내의 별개의 웰이다. 이러한 작은 부피의 용기를 사용하면 세포의 신속하고 경제적이며 효율적인 형질감염 및 생성된 재조합 아데노바이러스의 스크리닝이 가능하다. 다중웰 포맷 플레이트를 사용하면 방법 및 모든 관련된 공정을 자동화할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, TPC-Ad gDNA는 우수 제조 기준 (GMP) 바이오제조에서의 사용을 허용하는 필수 품질 관리 (QC) 검정을 거쳐 통과한 TPC-Ad gDNA 물질의 스톡으로부터 제공된다. QC 제어된 물질의 스톡으로부터의 TPC-Ad gDNA의 사용은 백신으로서 사용하기 위한 재조합 아데노바이러스를 생산하는 방법의 속도를 증대시킬 수 있다. 이 방법을 시작하기 전에 QC 시험을 수행하면 바이러스 성분을 사전 시험할 수 있고 추가로 아데노바이러스 생산 및 제조 공정 동안 시험 및 검정 부담을 줄일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 방법에 의해 생산된 재조합 아데노바이러스는 인간 또는 동물의 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 백신으로서 사용될 수 있다. 특히, 이 방법으로 생산된 재조합 아데노바이러스는 암 치료를 위한 맞춤형 백신 생성에 매우 유용하다. 본 발명은 바이러스 벡터를 사용하여 이러한 치료를 제공하는데 있어서 주요 장애, 즉 바이러스 벡터 백신을 생성하고 개발하는 느린 시간 과정을 극복한다. 본원에 개시된 본 발명의 새로운 방법에 의한 재조합 아데노바이러스의 신속한 생성은 환자의 임상 평가, 환자 자신의 암-특이적 항원의 확인 및 개별 환자를 치료하기 위한 적절한 재조합 아데노바이러스 백신의 생성에 충분한 시간을 허용한다. 이는 본 발명의 제1 측면의 청구된 방법의 개발 이전에는 가능하지 않았다.
제2 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 제1 측면의 방법에 사용하기 위한, E1 유전자가 아데노바이러스 게놈의 다른 어느 곳에도 존재하지 않는 제1 쌍의 고유한 제한 부위에 의해 플랭킹된 형광 마커 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트로 대체된 것인 아데노바이러스 게놈을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기에서 논의된 바와 같이, 선행 기술은 재조합 아데노바이러스를 생산하는 다수의 방법을 제공한다. 그러나, 이들 방법 각각은 변형되지 않은 아데노바이러스 게놈을 출발 물질로서 사용하여 시작되었으며, 따라서 각각의 방법은 시험관내 재조합 반응에 사용하기에 적합한 분해된 아데노바이러스 게놈 DNA를 생산하기 위해 복잡한 단계를 수행해야 했다. 본 발명의 본 측면에 의해 제공되는 조성물은 이러한 장애를 극복하며, 적절한 이종 핵산 분자와의 재조합을 위한 아데노바이러스 DNA를 제조하기 위한 단일 단계 제한 분해 반응을 가능하게 한다. 이 조성물의 사용은, 아데노바이러스 게놈 DNA의 제조 공정을 단순화하는 것 외에도, 필요에 따라 임상적으로 사용할 수 있도록 완전히 GMP-준수 방식으로 생산되는 재조합 아데노바이러스의 생성 공정을 능률화하기 위해 사전에 저장될 수 있는, 멸균성, 미코플라스마 결여, 그 바이러스의 정체성 및 유전적 안전성을 확증하기 위해 이미 시험된 아데노바이러스 스톡으로부터 생산되는 분해된 게놈 DNA를 대규모로 제조할 수 있다.
구체적 실시양태에서, 아데노바이러스 게놈은 인간 아데노바이러스 또는 시미안 아데노바이러스로부터 유래되고, 바람직하게는 인간 아데노바이러스는 혈청형 5 인간 아데노바이러스가 아니다. 가장 바람직한 실시양태에서, 아데노바이러스 게놈은 시미안 아데노바이러스로부터 유래되고, 가장 바람직하게는 시미안 아데노바이러스는 ChAdOx1 (Antrobus et al., 상기 참조), ChAdOx2 (Morris et al., 상기 참조), ChAd3 또는 Chad63과 같은 침팬지 아데노바이러스이다. 인간 또는 시미안 아데노바이러스를 사용하면 이용될 방법에 의해 생산되는 재조합 아데노바이러스를 인간 대상체에서 백신으로서 사용할 수 있다. 시미안 아데노바이러스의 사용, 특히 ChAdOx1 또는 ChAdOx2의 사용은 인간 대상체에게 투여될 때 기존의 항-아데노바이러스 면역의 발생률이 낮은 개선된 백신을 제공한다.
바람직한 실시양태에서 형광 마커 단백질은 녹색 형광 단백질 (GFP)이다. 형광 마커 단백질의 존재는 이 측면의 관심 유전자를 발현하기 위해 재조합을 거치지 않은 무손상 아데노바이러스에 의해 감염된 세포의 신속한 검출을 가능하게 하며, GFP는 형광 현미경으로 직접적으로 또는 예를 들어 항-GFP 단백질을 사용하여 간접적으로 쉽게 검출될 수 있는 특히 편리한 마커 단백질이다.
바람직한 실시양태에서, 제1 쌍의 고유한 제한 부위는 PsiI, AsiSi 또는 RsrII 부위로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 발현 카세트는 형광 마커 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 대해 5'에 긴 테트라시클린-조절된 CMV 프로모터 및 형광 마커 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 대해 3'에 위치된 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함하며, 여기서 제1 쌍의 제한 부위는 긴 테트라시클린-조절된 CMV 프로모터와 형광 마커 단백질을 코딩하는 DNA 서열 사이 및 형광 마커 단백질을 코딩하는 DNA 서열과 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 사이에 위치된다. 유리하게는, 모 아데노바이러스 게놈 DNA에 GFP 코딩 서열을 포함시키는 것은 모 아데노바이러스가 본 발명의 제1 측면의 방법에서 재생되는 임의의 세포를 확인하기 위한 효과적인 음성 대조군로 사용될 수 있다. 간단한 스크리닝 단계는 백신으로서 사용하기 위해 관심 이종 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 찾을 때 GFP를 발현하는 바이러스를 고려로부터 제거할 수 있다. 추가로, GFP의 존재는 제1 측면의 방법에서 사용하기 위한 모 아데노바이러스 게놈 DNA의 스톡을 생성할 때 유용한 마커로 작용할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 발현 카세트는, 제1 쌍의 고유한 제한 부위와 상이하고 긴 테트라시클린-조절된 CMV 프로모터에 대해 5' 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열에 대해 3'에 위치된 제2 쌍의 고유한 제한 부위를 추가로 포함한다. 유리하게는, 제2 쌍의 고유한 제한 부위를 추가하면 전체 GFP 발현 카세트를 제거할 수 있고, 이는 상이한 프로모터 시스템을 사용하여 발현될 관심 이종 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 생성할 수 있다. 이러한 경우에서, 원하는 프로모터 및 폴리아데닐화 서열은 관심 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 DNA로 설계될 수 있다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 제2 쌍의 고유한 제한 부위는 PsiI, AsiSi 또는 RsrII 부위로부터 선택된다.
추가의 실시양태에서, 아데노바이러스 게놈은 S15/E4 로커스에 추가의 고유한 제한 부위를 포함하도록 추가로 조작된다. 이는 관심 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 합성 DNA의 아데노바이러스 게놈 DNA로의 재조합을 가능하게 한다.
또 다른 추가의 실시양태에서, 추가의 고유한 제한 부위는 PsiI, AsiSi 또는 RsrII 부위로부터 선택된다.
구체적 실시양태에서, 아데노바이러스 게놈은 이종 또는 비-혈청형-매칭된 말단 단백질과 복합체화되지만, 바람직한 실시양태에서 아데노바이러스 게놈은 자가 또는 혈청형-매칭된 단백질과 복합체화된다.
추가의 구체적 실시양태에서, 아데노바이러스 게놈은 게이트웨이(Gateway) 재조합 서열을 결여한다.
바람직한 실시양태에서, 조성물은 우수 제조 기준 (GMP) 바이오제조에서의 사용을 허용하는 필수 품질 관리 (QC) 검정을 거쳐 통과하였다. QC 제어된 물질의 스톡으로부터의 물질을 사용하면 백신으로서 사용하기 위한 재조합 아데노바이러스를 생산하는 방법의 속도를 증대시킬 수 있다. 이 방법을 시작하기 전에 QC 시험을 수행하면 바이러스 성분을 사전 시험할 수 있고 추가로 아데노바이러스 생산 및 제조 공정 동안 시험 및 검정 부담을 줄일 수 있다.
최종 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제2 측면의 임의의 조성물을 포함하고 포유동물에서 면역 반응이 생성되는 병원체 또는 종양 에피토프 또는 항원을 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터 면역원을 제공한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위 전체에 걸쳐, 단어 "포함하다", 및 "포함한다", "포함하는" 및 "포함한"과 같은 변형은 포괄적으로 해석되어야 한다. 즉, 이들 단어는 문맥이 허용하는 경우에 특별히 언급되지 않은 다른 요소 또는 정수의 포함 가능성을 전달하기 위한 것이다.
실시예
실시예 1 - 염화세슘 밀도 구배 초원심분리에 의한 아데노바이러스 말단 단백질 복합체 바이러스 gDNA (TBC-gDNA)의 정제.
55kDa 말단 단백질 (TP)은 아데노바이러스 게놈 DNA의 각각의 가닥의 5' 단부에 공유 결합되어 말단 단백질 복합체 바이러스 gDNA (TPC-Ad gDNA)를 생성한다. 혈청형 매칭된 ("자기") 및 미스-매칭된 ("이종") TP 둘 다가 본 발명에서 사용될 수 있다. TP는 바이러스 gDNA를 세포 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호하고, DNA 복제 개시를 위한 프라이머 역할을 하며, DNA 폴리머라제와 이종이량체를 형성한다. TP는 다른 복제 인자의 결합을 허용하는 복제 기점의 미묘한 변화를 통해 단백질-비함유 템플릿에 비해 템플릿 활성을 20배 이상 증가시켜 복제를 증대시킨다. TPC-Ad gDNA는 구아니딘 히드로클로라이드를 사용하여 파괴된 정제된 바이러스 입자로부터 단리되고, 염화세슘 밀도 구배 초원심분리에 의해 정제된다.
1 x 1011개 내지 1 x 1012개 바이러스 입자 (500μl-1ml)를 함유하는 정제된 바이러스 용액을 1.5ml 또는 2ml 튜브에 분취하고, 뉴클레아제 비함유 물에 제조된 동일한 부피의 필터 멸균된 6M 구아니딘 히드로클로라이드 (GndHCl)을 최종 GndHCl 농도가 3M이 되도록 첨가하였다. 부드럽게 혼합한 후, 희석된 바이러스 용액을 얼음 상에서 45-60분 동안 인큐베이션하였다.
2.8M 염화세슘 (CsCl) 용액을 9.4281g CsCl을 뉴클레아제 비함유 물에 제조된 20ml 필터 멸균된 3M 구아니딘 히드로클로라이드 (GndHCl)에 첨가하여 제조하였다. 2ml 2.8M CsCl 용액을 MSCII 후드에서 적절한 크기의 초원심분리기 튜브에 첨가하고, 바이러스/GndHCl 용액을 2.8M CsCl의 상단에 부드럽게 층화시켰다. 이어서, 바이러스 샘플 제제를 벤치 옵티마 TLX 초원심분리기를 사용하여 베크만 TLA100.3 로터에서 20℃에서 68,000 rpm에서 18시간 동안 CsCl 용액을 통해 원심분리하였다.
원심분리가 완료되면, TPC-Ad gDNA를 100μl 분취량으로 꺼내어 마이크로퓨지 튜브로 옮겼다. 증가된 양의 바이러스 물질이 출발 물질에 존재하는 경우, CsCl 원심분리 단계가 끝날 때 펠릿이 보였으며, 뉴클레아제 비함유 물에 제조된 100μl 10mM 트리스 HCl pH7.8에 재현탁하였다. CsCl 원심분리 튜브로부터 꺼낸 분취물에서의 정제된 DNA의 존재는, 1ul의 각각의 분취물을 파라필름에 놓고, 1ul 작업 스톡 (1:10,000) SYBR 세이프를 첨가하고, 오렌지색 필터를 갖는 청색 광 아래에서 시각화하여 시각적으로 확증하였다.
이어서, CsCl 원심분리 단계로부터 정제된 TPC-Ad gDNA를 뉴클레아제 비함유 물에 제조된 10mM 트리스 HCl pH7.8로 평형화된 제바(Zeba) 칼럼을 사용하여 탈염시켰다. DNA 농도를 분광광도법에 의해 결정하고, DNA 순도를 겔 전기영동으로 평가하였다 (도 4 및 5). TPD-gDNA 제제의 단백질 수준을 SDS-PAGE에 의해 환원 4-12% 구배 겔에서 정성적으로 조사하였다 (도 6). 이어서, TPC-Ad gDNA를 필요할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
실시예 2 - 고유한 제한 효소로의 분해에 의한 재조합을 위한 TPC-Ad gDNA의 제조
모 아데노바이러스 게놈, 예를 들어 도 3에 제시된 바와 같은 ChAdOx1-Bi-GFP는 긴 테트라시클린-조절된 CMV 프로모터 (LPTOS) 및 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 신호 (폴리 A)에 의해 플랭킹된 E1에 GFP 코딩 서열을 함유한다. GFP ORF는 PsiI 제한 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 한 쌍의 고유한 제한 부위에 의해 플랭킹되며, PsiI를 사용하여 절단되어 아데노바이러스 게놈의 좌측 아암, GFP ORF 및 아데노바이러스 게놈의 우측 아암의 3개 단편을 생성할 수 있다. 이 모 바이러스는 또한 AsiSI로 분해되어 LPTOS 및 폴리 A를 포함한 완전한 GFP 발현 카세트를 절단할 수 있다. 이 모 바이러스는 또한 RsrII로 분해되어 S14 (E4) 로커스에 발현 카세트의 삽입을 위한 gDNA를 제조할 수 있다.
120ng TPC-Ad gDNA를 뉴클레아제 비함유 물로 30μl의 최종 반응 부피로 희석된 권장 반응 버퍼에서 10U PsiI와 함께 37℃의 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 제한효소를 65℃에서 20분 동안 인큐베이션하여 비활성화시키고, 이어서 바이러스가 생산되지 않음을 확증하기 위해 겔 전기영동 또는 세포로의 형질감염으로 분해가 확증되면 분해된 TPC-Ad gDNA를 재조합 반응에 직접적으로 사용하였다.
실시예 3 - 아데노바이러스의 신속한 생성: 재조합 및 형질감염
관심 항원 서열 또는 발현 카세트는 시험관내 재조합에 의해 TPC-Ad gDNA에 도입되고, 이어서 재조합 반응 산물은 바이러스 구출을 위해 상보적 HEK293 세포로 직접적으로 형질감염된다. 형질감염은 단일 바이러스 클론이 수득되도록 수행된다.
NE빌더 (NEB) 및 인-퓨전(In-fusion) (타카라(Takara))은 단편 길이 또는 단부 호환성에 관계 없이 다중 DNA 단편의 심리스 어셈블리를 가능하게 하는 시판 시스템이다. 이들 제품은 실시예 2로부터 적절하게 제조된 TPC-Ad gDNA에 항원/발현 카세트를 삽입하는데 사용될 수 있다. 재조합 반응 믹스는 엑소뉴클레아제 및 폴리머라제 효소를 포함하고, NE빌더의 경우에 함께 작업하여 이중 가닥 DNA 분자를 생성하는 DNA 리가제를 포함한다. 엑소뉴클레아제는 한쪽 단부 (중첩 영역)에서 상보성을 공유하는 단편의 어닐링을 용이하게 하는 단일-가닥 3' 오버행을 생성하고 폴리머라제는 각각의 어닐링된 단편 내의 갭을 채운다. NE빌더 반응에서 DNA 리가제는 인-퓨전 반응에 대한 경우처럼 닉킹된 DNA를 채우기 위해 숙주 세포 DNA 복구 기구에 의존하지 않고 어셈블리된 DNA의 닉을 밀봉하여 완전히 밀봉된 DNA 분자를 생성한다.
PsiI 분해된 TPC-Ad gDNA 40ng (실시예 2로부터의 제한 반응물 10μl)를 얇은 벽 PCR 튜브에서 TPC-Ad gDNA 삽입 부위의 5' 및 3'에 상보적인 최소 15bp 서열을 갖는 합성된 필요한 항원 서열의 5'/3' 단부 44fmol과 혼합하였다. 튜브의 내용물을 마이크로퓨지에서 잠깐 회전시켜 튜브 바닥에 수집하였다. 이어서, 재조합 반응물을 NE빌더 반응 믹스 또는 인-퓨전 반응 믹스 및 뉴클레아제 비함유 물의 권장 부피를 추가하여 30μl의 최종 부피로 제조하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 40분 동안에 이어 20℃에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 재조합 반응물을 상보적 세포로의 즉각적인 형질감염 및 재조합 아데노바이러스의 구출에 대해 준비하였다.
아데노바이러스 구출을 위해, 세포는 E1 단백질을 발현하고 바이러스 복제를 지원하기 위해 분할되어야 하므로, 목표는 형질감염일에 대략 80% 전면생장률를 달성하는 것이다. 따라서, 테트라시클린 리프레서를 안정적으로 발현하는 T-Rex-293 세포를 10% 소 태아 혈청 (FCS) 및 블라스티시딘 (5μg/ml)을 함유하는 DMEM에 3.75 x 104개 세포/웰의 밀도로 형질감염 24시간 전에 96 웰 플레이트에 시딩하였다.
예열된 옵티멤(Optimem)을 재조합 반응물에 첨가하여 반응 튜브에서 100μl의 최종 부피를 달성하였다. 재조합 반응물에서 100ng DNA당 0.5μl 리포펙타민 2000을 별개의 튜브에서 100ml 옵티멤에 첨가하였다. 두 튜브를 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 희석된 재조합 반응물을 희석된 리포펙타민 2000에 첨가하였다. 튜브를 부드럽게 혼합한 다음, 실온에서 추가로 20분 동안 인큐베이션하고, 이후 혼합물을 옵티멤으로 3ml의 최종 부피로 희석하였다.
96 웰 플레이트에서 성장한 T-Rex-293 세포로부터 배지를 제거하고, 50μl의 희석된 리포펙션 반응물을 60 웰 각각에 직접적으로 첨가하였다. 이어서, 세포를 4 내지 6시간 동안 8% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 각각의 웰의 형질감염 배지를 10% 소 태아 혈청 (FCS) 및 블라스티시딘 (5μg/ml)을 함유하는 100ml DMEM으로 대체하였으며, 세포를 8% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션한다.
5일 후, 플레이트를 3회의 동결/해동 사이클에 적용하여 세포를 파괴하고 회합된 바이러스를 방출하였다. 각각의 개별 웰로부터 10ml의 세포 용해물을 꺼내고, 이로부터 시판되는 DNA릴리지(DNAreleasy) 시약 분석을 이용하여 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (QPCR)에 의해 DNA를 단리하였다. 각각의 웰로부터의 나머지 세포 용해물을 10% 소 태아 혈청 (FCS) 및 블라스티시딘을 함유하는 DMEM에서 2.1 x 104개 세포/웰로 T-Rex-293 세포로 24시간 전에 시딩된 96 웰 플레이트의 상응하는 웰에 첨가하였다. 재조합 아데노바이러스를 웰에서 완전한 세포병변 효과가 분명할 때 (감염 후 4일 내지 6일) 개별 웰로부터 수거하였다.
실시예 4 - 세포 용해물 또는 정제된 바이러스로부터 QPCR에 의한 아데노바이러스 게놈 카피 수의 정량화
HEK293 또는 T-Rex-293 세포 용해물에서의 ChAdOx1, ChAdOx2 또는 ChAd63 바이러스 게놈의 정량화는 QPCR에 의해 측정된다. 바이러스 게놈의 수 (1:1 기준으로 바이러스 입자와 관련될 수 있음)는 DNA릴리지로 처리된 세포 용해물의 정량적 PCR (qPCR)에 의해 결정된다. 역 말단 반복부 (ITR)의 하류 및 비-코딩 영역의 항원 삽입 영역의 상류의 게놈의 좌측 단부에 결합하는 프라이머 및 프로브 세트가 설계되었다 (도 7a 및 7b 참조). 이들 프라이머 및 프로브 서열은 하기와 같다:
프라이머
ChAd fwd 5'GTGGGAAAAGTGACGTCAAACGAG3' (서열식별번호: 1)
ChAd rev 5'TGCATCCGCCTAGAAACACCTCA3' (서열식별번호: 2)
프로브
ChAd 범용 프로브 5'GAGAGCGCGGGAAAATTGAGTATT3' (서열식별번호: 3)
ChAdOx2의 역방향 프라이머에는 단일 미스매치가 있고; AdCh63의 관련 영역의 서열은 ChAdOx2의 것과 동일하므로, 이 방법은 AdCh63에 대해서도 성공할 수 있다. 관련 서열은 AdHu5 벡터에 존재하지 않는다.
세포 및 배지를 완전한 세포병변 효과 (CPE)를 나타내는 플라스크로부터 수거되었다. 적은 부피의 경우에 세포 및 배지를 직접적으로 수거할 수 있지만, 더 큰 부피의 경우에 1500g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고, 1/10 배지 부피의 아데노바이러스 용해 버퍼 (50mM 트리스, 2mM MgCl2, pH9.0)에 재현탁하였다. 이어서, 수거될 세포를 3회 동결 및 해동한다. 10μl의 용해물을 15μl DNA릴리즈 시약에 첨가하고, 샘플을 써모사이클러에서 하기 사이클을 사용하여 처리하였다: 65℃에서 15분 동안, 96℃에서 2분 동안, 65℃에서 4분 동안, 96℃에서 1분 동안, 65℃에서 1분 동안, 96℃에서 30초 동안, 20℃ 유지. 샘플을 1ml의 총 부피로 희석하고, QPCR 반응당 5μl를 사용하였다.
QPCR 반응을 95℃에서 10분 동안의 초기 핫스타트 활성화에 이어 95℃에서 15초 동안의 45회의 변성 사이클에 이어 60℃에서 1분 동안의 변성 및 어닐링에 의해 수행하였다.
표준 곡선은 길이가 4,118개 염기 쌍인 pTOPO-ChAdOx1 LF1 플라스미드를 사용하여 설정되고, 표 1에 제시된 바와 같은 ng DNA당 결정된 게놈 카피 수를 제공한다.
실시예 5 - mCherry를 발현하는 재조합 ChAdOx1의 생성
mCherry 유전자는 ChAdOx1에 삽입하기 위한 모델 항원으로서 사용되었다. mCherry 유전자는 TPC-AdgDNA의 PsiI 삽입 부위에 15bp 상동성을 함유하는 프라이머를 사용하여 증폭되었다. TPC-gDNA를 PsiI로 분해한 다음, 재조합 전에 효소를 열 비활성화시켰다. NE빌더 및 인-퓨전을 사용하여 다양한 TPC-gDNA 및 mcherry ORF 농도의 재조합 효율을 시험하였다. 반응물을 50℃에서 40분 동안에 이어 20℃에서 2분 동안 인큐베이션한 다음, 1:5의 비율로 리포펙타민 2000을 사용하여 96 웰 플레이트에 시딩된 T-Rex-293 세포로 즉시 형질감염시켰다. 형질감염 30시간 후 GFP (비분해된 TPC-Ad gDNA로부터) 및 mCherry 세포 (재조합 반응물로부터)의 수를 FACS에 의해 결정하였다 (도 9).
표 1: 아데노바이러스 게놈 카피 수 표준물
Figure pct00001
SEQUENCE LISTING <110> Oxford University Innovation Limited <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR PRODUCING A VIRUS <130> |P10782WO| <140> PCT/EP2019/073181 <141> 2019-08-30 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gtgggaaaag tgacgtcaaa cgag 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 tgcatccgcc tagaaacacc tca 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/Probe <400> 3 gagagcgcgg gaaaattgag tatt 24

Claims (39)

  1. 하기 단계를 포함하는, 백신으로서 사용하기 위한 관심 이종 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 생성하는 방법:
    (i) 시험관내 재조합 반응에서 말단 단백질 복합체화된 아데노바이러스 게놈 DNA (TPC-Ad gDNA)를 관심 유전자를 코딩하고 아데노바이러스 게놈 DNA의 삽입 부위 서열에 상동성인 5' 및 3' 단부를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 재조합함으로써 관심 이종 유전자를 아데노바이러스 게놈에 삽입하는 단계,
    (ii) 개별 용기에서 성장하는 세포를 (i)로부터의 시험관내 재조합 반응 혼합물의 희석물로 형질감염시켜 다수의 이러한 개별 용기가 관심 이종 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스에 의해 감염된 단일 세포를 함유하도록 하는 단계, 및
    (iii) 단일 세포가 관심 이종 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스에 의해 감염된 것인 개별 용기를 확인하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, TPC-Ad gDNA가 혈청형-매칭된 말단 단백질 및 아데노바이러스 게놈을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 관심 유전자가 단일 에피토프, 에피토프의 스트링, 항원의 세그먼트 또는 완전한 항원 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 합성 DNA 분자, 정제된 DNA 제한 단편 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 산물인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 아데노바이러스 게놈 DNA의 삽입 부위 서열에 상동성인 5' 단부에서 5 내지 50bp 및 3' 단부에서 5 내지 50bp를 갖는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 아데노바이러스 게놈 DNA의 삽입 부위 서열에 상동성인 5' 단부에서 10 내지 20bp 및 3' 단부에서 10 내지 20bp를 갖는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 아데노바이러스 게놈 DNA의 삽입 부위 서열에 상동성인 5' 단부에서 15bp 및 3' 단부에서 15bp를 갖는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 게놈 DNA의 삽입 부위 서열이 E1 로커스 내에 위치되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, TPC-Ad gDNA가 5' 단부에서 관심 유전자의 발현을 구동하는 긴 테트라시클린-조절된 CMV 프로모터에 의해 플랭킹되고 3' 단부에서 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열에 의해 플랭킹된 아데노바이러스 게놈 DNA의 삽입 부위 서열 내의 고유한 제한 부위에서 분해되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 재조합 반응물이 분해된 TPC-Ad gDNA 40ng 및 관심 유전자를 코딩하는 합성 DNA의 3' 및 5' 단부 44fmol을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염될 세포가 형질감염 1일 전에 3.75 x 105개 세포.ml-1의 밀도로 개별 용기에 시딩되는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 개별 용기에서 대략 80% 전면생장률로 성장하면서 형질감염되는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염되는 세포가 테트라시클린 리프레서를 안정적으로 발현하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 재조합 반응 혼합물이 형질감염 배지에 희석되고, 60개의 개별 용기에서 성장하는 세포를 형질감염시키도록 균등하게 분할되는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염된 세포가 세포-회합된 바이러스를 방출하도록 동결 및 해동되고, 재조합 아데노바이러스의 존재가 형질감염된 세포의 각각의 웰로부터의 세포 용해물 및 아데노바이러스 역 말단 반복부 (ITR)의 하류 및 비-코딩 영역의 관심 유전자 삽입 부위의 상류의 게놈의 좌측 단부에 결합하도록 설계된 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 정량적 PCR (qPCR)에 의해 확인되는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 게놈이 시미안 아데노바이러스로부터 유래되는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 시미안 아데노바이러스가 ChAdOx1 또는 ChAdOx2 또는 ChAd3 또는 ChAd63인 방법.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 게놈이 인간 아데노바이러스로부터 유래되는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 인간 아데노바이러스가 혈청형 5 인간 아데노바이러스가 아닌 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 개별 용기가 다중웰 플레이트 내의 별개의 웰인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, TPC-Ad gDNA가 우수 제조 기준 (GMP) 바이오제조에서의 사용을 허용하는 필수 품질 관리 검정을 거쳐 통과한 TPC-Ad gDNA 물질의 스톡으로부터 제공되는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 재조합 아데노바이러스.
  23. E1 유전자가 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법에서 사용하기 위한 아데노바이러스 게놈의 다른 어느 곳에도 존재하지 않는 제1 쌍의 고유한 제한 부위에 의해 플랭킹된 형광 마커 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트로 대체된 것인 아데노바이러스 게놈을 포함하는 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 아데노바이러스 게놈이 시미안 아데노바이러스로부터 유래되는 것인 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 시미안 아데노바이러스가 ChAdOx1 또는 ChAdOx2 또는 ChAd3 또는 ChAd63인 조성물.
  26. 제23항에 있어서, 아데노바이러스 게놈이 인간 아데노바이러스로부터 유래되는 것인 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 인간 아데노바이러스가 혈청형 5 인간 아데노바이러스가 아닌 것인 조성물.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 마커 단백질이 녹색 형광 단백질 (GFP)인 조성물.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 쌍의 고유한 제한 부위가 PsiI, AsiSi 또는 RsrII 부위로부터 선택되는 것인 조성물.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트가 형광 마커 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 대해 5'에 긴 테트라시클린-조절된 CMV 프로모터 및 형광 마커 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 대해 3'에 위치된 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함하며, 여기서 제1 쌍의 고유한 제한 부위가 긴 테트라시클린-조절된 CMV 프로모터와 형광 마커 단백질을 코딩하는 DNA 서열 사이 및 형광 마커 단백질을 코딩하는 DNA 서열과 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 사이에 위치되는 것인 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 발현 카세트가, 제1 쌍의 고유한 제한 부위와 상이하고 긴 테트라시클린-조절된 CMV 프로모터에 대해 5' 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열에 대해 3'에 위치되는 제2 쌍의 고유한 제한 부위를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 제2 쌍의 고유한 제한 부위가 PsiI, AsiSi 또는 RsrII 부위로부터 선택되는 것인 조성물.
  33. 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 게놈이 S15/E4 로커스에 추가의 고유한 제한 부위를 포함하도록 추가로 조작되는 것인 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 추가의 고유한 제한 부위가 PsiI, AsiSi 또는 RsrII 부위로부터 선택되는 것인 조성물.
  35. 제23항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 게놈이 자가 말단 단백질과 복합체화되는 것인 조성물.
  36. 제23항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 게놈이 이종 말단 단백질과 복합체화되는 것인 조성물.
  37. 제23항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 게이트웨이 재조합 서열을 결여한 것인 조성물.
  38. 제23항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, GMP 바이오제조에서의 사용을 허용하는 필수 품질 관리 검정을 거쳐 통과한 것인 조성물.
  39. 포유동물에서 면역 반응이 생성되는 병원체 또는 종양 에피토프 또는 항원을 발현하는 제23항 내지 제37항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터 면역원.
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