CN114787345A - 基于辅助质粒的无肠腺病毒生产系统 - Google Patents

基于辅助质粒的无肠腺病毒生产系统 Download PDF

Info

Publication number
CN114787345A
CN114787345A CN202080058074.4A CN202080058074A CN114787345A CN 114787345 A CN114787345 A CN 114787345A CN 202080058074 A CN202080058074 A CN 202080058074A CN 114787345 A CN114787345 A CN 114787345A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enteroadenovirus
plasmid
restriction enzyme
free
present
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080058074.4A
Other languages
English (en)
Inventor
李东雨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genmai Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Genmai Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genmai Biotechnology Co ltd filed Critical Genmai Biotechnology Co ltd
Publication of CN114787345A publication Critical patent/CN114787345A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/10052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/50—Vectors for producing vectors

Abstract

本发明涉及基于辅助质粒的无肠腺病毒(gutless adenovirus，GLAd)生产系统、利用其的无肠腺病毒的生产方法、利用其生产的无肠腺病毒以及利用其生产的无肠腺病毒的用途。

Description

基于辅助质粒的无肠腺病毒生产系统
技术领域
本发明涉及基于辅助质粒的无肠腺病毒(gutless adenovirus，GLAd)生产系统、利用其的无肠腺病毒的生产方法、利用其生产的无肠腺病毒以及利用其生产的无肠腺病毒的用途。
背景技术
基因疗法(gene therapy)正在成为各种先天性遗传病的有效治疗选择。无肠腺病毒(gutless adenovirus；以下，GLAd)，又称为辅助病毒依赖性腺病毒(helper-dependentadenovirus；以下，HDAd)，具有广泛的细胞及组织亲和性(tropism)、高感染性(infectivity)、针对转基因(transgene)的高装载能力(cargo capacity)以及不插入宿主基因组的特性等作为对先天性遗传病实现基因疗法的基因传递载体而备受瞩目的特性。并且，由于GLAd是在从腺病毒中去除所有基因后制备的，因此，免疫原性(immunogenicity)被最小化，从而能够在宿主中长期表达转基因。
然而，由于在GLAd的生产中必须用作辅助物的高免疫原性腺病毒作为污染物残留的问题，GLAd在临床上长期未用于先天性遗传病的治疗。
通过用相应的正常基因代替缺陷基因来将该缺陷基因的功能恢复正常的方式的基因疗法正在成为包括莱伯氏先天性黑蒙(Leber's congenital amaurosis，LCA)及脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)在内的多种先天性遗传病的有效治疗选择。这种基因疗法需要用于将发挥正常功能的基因传递给目标组织或器官的称为载体的基因运载体。
用于治疗先天性遗传病的基因疗法可以考虑两种类型的基因传递，例如体外基因传递(ex vivo gene delivery)及体内基因传递(in vivo gene delivery)。体外基因传递是一种利用基因工程细胞的基于细胞治疗剂的接近法。在该接近法中，在将基因工程细胞移植到患者的体内之前，可以在单独的步骤中持续监测载体的安全性。相比之下，体内基因传递是一种将治疗用转基因(transgene)直接传递至作为最终传递位置的患者的组织或器官的方法。因此，在该接近法中，载体的安全性比什么都重要。尤其，在该接近法中，除了载体的安全性之外，还必须确保转基因的长期表达，以使所传递的转基因的治疗效果能够长期保持。
目前，在先天性遗传病的临床治疗中最广泛使用的体内基因传递载体为腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)。AAV的安全性已通过广泛的临床试验得到很好的证实。AAV对感染表现出广泛的细胞及组织亲和性(tropism)，并确保转基因在多种组织及器官中的长期表达。由于这些特性，AAV在多种先天性遗传病的治疗中作为体内基因传递载体而备受瞩目。尽管如此，AAV具有两种显著的缺点，一种是引起插入突变(insertionalmutagenesis)的可能性，另一种是针对转基因的低包装能力(packaging capacity)。AAV主要作为附加体(episome)存在于宿主细胞中，但可以随机插入宿主细胞的基因组中，尽管频率较低。由于这些特性，担忧会引起插入突变。AAV还具有较低的转基因装载能力(～4.5kb)，因此它无法传递诸如亨廷顿蛋白(huntingtin，9.4kb)或抗肌萎缩蛋白(dystrophin，11kb)等大基因，也无法以单个病毒的形式同时传递多个基因。AAV表现出的这些特性表明，理想的体内基因传递用载体需具有高安全性和转基因装载能力，且不应随机插入宿主基因组中，如果存在具有这些所有理想特性的载体，则表明该载体对体内基因传递提供更好的机会。
GLAd被认为是最后一代(last-generation)腺病毒。因为GLAd是通过从腺病毒中去除的所有基因来制成，所以完全不表达腺病毒蛋白。这种结构特性使宿主中的免疫反应最小化，并可以使转基因在宿主组织或器官中长期表达。并且，GLAd对感染具有广泛的细胞及组织亲和性，并且在转基因传递中具有高转导效率。实际上，GLAd在几个安全性方面与AAV非常相似。然而，就插入宿主基因组和转基因装载能力而言，GLAd反而显示出比AAV更好的优点。即，由于GLAd不会插入宿主基因组，因此无需担忧引起插入突变。并且，由于GLAd具有高转基因装载能力(高达36kb)，因此不仅可以传递大基因，还可以以单个病毒的形式同时传递多个基因。
然而，尽管有这些明显的优势，目前的GLAd在生产和使用中在生产方面存在一些问题。即，由于GLAd中的所有腺病毒基因都被缺失，为了制备重组GLAd，必须使用提供GLAd包装(packaging)所需的腺病毒蛋白的辅助腺病毒。现有GLAd的标准生产工艺(standardproduction process)中，辅助腺病毒在提供辅助功能的同时也积极复制，因此在最终的GLAd产品中以污染物残留。通过基于Cre-loxP工作原理去除Ψ包装信号序列(Ψpackagingsignal)，可以显著减少作为污染物的辅助腺病毒，但实际上完全去除它是非常困难的。尤其，辅助腺病毒还可以通过辅助腺病毒与包装细胞中存在的E1区之间的同源重组生成复制型腺病毒(replication-competent adenovirus，RCA)。作为完全不需要的污染物，这些辅助腺病毒及RCA会对宿主造成致命的急性或慢性毒性。并且，由于宿主对从这些污染物病毒表达的病毒蛋白的免疫反应会造成使用重组GLAd和污染物病毒共感染的细胞的凋亡，这导致由GLAd传递的治疗用转基因无法充分表达的结果。这些无法解决的问题引发了人们对GLAd安全性的担忧，尽管其具有独特的特性和显著的优点，但最终导致无法应用到临床的结果。因此，对于GLAd而言，构建不产生辅助腺病毒及RCA污染物的重组GLAd生产系统是一项极其重要的任务。
发明内容
技术问题
本发明涉及即使不使用辅助腺病毒也可以生产无肠腺病毒(gutlessadenovirus，GLAd)的基于辅助质粒的无肠腺病毒生产系统、利用其的无肠腺病毒的生产方法、利用其生产的无肠腺病毒以及利用其生产的无肠腺病毒的用途。
具体地，在本发明中，用于GLAd包装及进一步扩增的辅助功能由病毒包装所需的所有顺式作用元件(cis-acting elements)已被去除的辅助质粒提供。由于所有顺式作用元件已被去除的结构特性，上述辅助质粒不能转化为腺病毒。
本发明人利用上述辅助质粒成功地大量生产了完全没有腺病毒及RCA污染的重组GLAd。以这种方式生产的重组GLAd有效地传递了多种目标转基因，并且对如亨廷顿病(Huntingtons’s disease，HD)及假肥大性肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)等先天性遗传病显示出治疗潜力。因此，本发明的GLAd生产系统有望为将基于GLAd的基因疗法用于治疗多种类型先天性遗传病的临床应用开辟道路。
因此，本发明的目的在于，提供基于辅助质粒的无肠腺病毒(gutlessadenovirus，GLAd)生产系统。
本发明的再一目的在于，提供无肠腺病毒的生产方法。
本发明的另一目的在于，提供无肠腺病毒。
本发明的还有一目的在于，提供无肠腺病毒的用途。
解决问题的方案
本发明涉及基于辅助质粒的无肠腺病毒(gutless adenovirus，GLAd)生产系统、利用其的无肠腺病毒的生产方法、利用其生产的无肠腺病毒以及利用其生产的无肠腺病毒的用途。
以下，更详细的说明本发明。
本发明的一方面涉及无肠腺病毒(gutless adenovirus，GLAd)生产系统。
由线性双链DNA组成的腺病毒基因组，尤其5型腺病毒的基因组已被很好地表征。例如，腺病毒基因组的整体结构在E1、IX、E2、IVa2、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因的位置方面存在一般保守性。腺病毒基因组的每个末端部都包含公知为末端反向重复序列(inverted terminal repeat，ITR)的序列，这是病毒复制所必要的。在位于5’末端的5’ITR之后，有在腺病毒基因组的包装及衣壳化(encapsidation)中所需的作为顺式作用元件的Ψ包装信号序列(Ψpackaging signal)。
腺病毒基因组的结构是基于宿主细胞转导后病毒基因表达的顺序来描述的。更具体地，根据在DNA复制开始之前还是之后发生转录，病毒基因被称为早期(E)或晚期(L)基因。在感染的早期阶段，腺病毒在宿主细胞中通过表达E1、E2、E3及E4基因来诱导用于病毒复制的宿主细胞的转化。E1基因作为主开关，其用作转录激活剂，并在早期及晚期基因转录中都发挥关键作用。E2参与DNA复制，E3参与免疫调节，E4调节病毒mRNA代谢。
腺病毒的基本基因组结构如下：
5’末端反向重复序列(inverted terminal repeat，ITR)-Ψ包装信号序列-E1-其他基因–3’末端反向重复序列。
其中，一些元件，例如，5’ITR和/或Ψ包装信号序列先位于其他地方，随后会合并。若以这种方式合并，则可以重建如上所述的基本基因组结构。一些元件，例如，E1可能被转移到其他地方而不返回到腺病毒基因组。即，通过将E1部分转移到其他细胞株来使该细胞株表达E1蛋白，从而可将腺病毒用于细胞株的生产。一些元件，例如，E3对腺病毒的制备和/或生产没有任何影响，因此被完全消除。
在本发明中，无肠腺病毒生产系统可以包含辅助质粒、基因组质粒及病毒包装细胞株。
在本发明中，辅助质粒可以包含除E1及E3部分的基因之外的腺病毒的基因，但并不限定于此。即，E1部分的基因可以包含在病毒包装细胞株中，而E3部分的基因即使不存在也对病毒的制备没有任何影响，因此可能不包含E3部分的基因。辅助质粒提供腺病毒蛋白，以使包含要使用无肠腺病毒表达的转基因以及在转基因表达中所需的元件的最终基因组质粒可以被病毒化，即，GLAd化。
在本发明中，辅助质粒可以包含除病毒包装细胞株所表达的腺病毒基因之外的在GLAd生产中所需的最少腺病毒基因，但并不限定于此。
因此，本发明一实例中，辅助质粒可具有如下的结构特性：
不包含5’末端反向重复序列(inverted terminal repeat，ITR)、Ψ包装信号序列、E1及3’末端反向重复序列；
包含从紧接在E1之后的部分到紧接在E3之前的部分、以及从紧接在E3之后的部分到紧接在3’末端反向重复序列之前的部分；以及
可选地，可以包含E3，也可以不包含E3。
如上所述，辅助质粒具有不包含5’末端反向重复序列、Ψ包装信号序列、E1及3’末端反向重复序列的结构特性，因此，辅助质粒只能执行辅助功能，而无法转化为腺病毒。即，辅助质粒不包含在病毒生成中所需的顺式作用元件，因此，即使包含腺病毒的基因也无法转化为具有感染性的腺病毒颗粒。
在本发明中，辅助质粒可以不是具有感染性的病毒颗粒。
在本发明中，辅助质粒可以不转化为具有感染性的病毒颗粒。
在本发明中，辅助质粒可以不包含末端反向重复序列，但并不限定于此。
在本发明中，辅助质粒可以不包含末端反向重复序列及Ψ包装信号序列，但并不限定于此。
在本发明中，辅助质粒还可以包含抗生素抗性基，例如，可以包含卡那霉素(Kanamycin)抗性基因，但并不限定于此。
在本发明中，辅助质粒还可以包含Ori复制起点，但并不限定于此。
在本发明中，辅助质粒可由至少一个质粒，例如一个至五个质粒组成，但并不限定于此。
在本发明中，辅助质粒可以为pAdBest_dITR，但并不限定于此。
在本发明中，基因组质粒可以包含5’同源拉伸位点(homologous stretch)、3’同源拉伸位点(homologous stretch)及3’末端反向重复序列(inverted terminal repeat，ITR)。
在本发明中，基因组质粒还可以包含抗生素抗性基因，例如，可以包含卡那霉素(Kanamycin)抗性基因，但并不限定于此。
在本发明中，基因组质粒还可以包含Ori复制起点，但并不限定于此。
在本发明中，基因组质粒还可以包含填充DNA(stuffer DNA；sDNA)。
在本发明中，填充DNA还可以包含骨架/基质附着元件(scaffold/matrixattachment element，SMAR)，但并不限定于此。
在本发明中，基因组质粒可以包含包装在无肠腺病毒的衣壳内的无肠腺病毒基因组部分，但并不限定于此。
在本发明中，基因组质粒可以为包含要使用无肠腺病毒表达的转基因(transgene)以及在转基因表达中所需的元件的最终基因组质粒，但并不限定于此。
在本发明中，最终基因组质粒的要使用无肠腺病毒表达的转基因以及在转基因表达中所需的元件可能是从克隆穿梭质粒转移而来的，但并不限定于此。
因此，在本发明中，基因组质粒可以为在具有在GLAd生产中所需的所有顺式作用元件的同时还包含转基因以及在转基因表达中所需的最终基因组质粒，或者可以为不包含转基因以及在转基因表达中所需的元件的基因组质粒。
在本发明中，最终基因组质粒可以是不包含在GLAd基因组部分中的区域由限制酶进行线性化而成的，但并不限定于此。
在本发明中，最终基因组质粒可以包含5’末端反向重复序列(inverted terminalrepeat，ITR)、Ψ包装信号序列、启动子、内含子、转基因(transgene)、poly(A)信号序列、填充DNA(stuffer DNA；sDNA)及3’末端反向重复序列。
在本发明中，最终基因组质粒可以包含包装在无肠腺病毒的衣壳内的无肠腺病毒基因组部分，但并不限定于此。
在本发明中，转基因可以为至少一个，但并不限定于此。
在本发明中，转基因可以具有抑制特定基因产物的表达的功能，但并不限定于此。
在本发明中，转基因可以为选自由因子IX[factor IX，用于治疗B型血友病(hemophilia B)的R338L Padua突变体基因]、葡萄糖脑苷脂酶[glucocerebrosidase，GCR，用于治疗戈谢病(Gaucher’s disease)的基因]、氨基己糖苷酶A[hexosaminidase A，HEXA，用于治疗家族黑蒙性痴呆(Tay-Sachs)的基因]、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1[hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，HPRT1，用于治疗自毁容貌综合症(Lesch-Nyhan syndrome)的基因]、2-硫酸酯酶[iduronate-2-sulfatase，IDS，用于治疗亨特综合症(Hunter syndrome)的基因]、甲基化CpG结合蛋白2[methyl-CpG-binding protein 2，MECP2，用于治疗瑞特综合症(Rett syndrome)的基因]、运动神经元1存活因子[survivalof motor neuron 1，SMN1，用于治疗脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)的基因]及抗肌萎缩蛋白基因[dystrophin gene，用于治疗假肥大性肌营养不良(Duchennemuscular dystrophy，DMD)的基因]组成的组中的一种以上，但并不限定于此。
在本发明中，基因组质粒可以为pGLAd或pGLAd3，但并不限定于此。
在本发明中，系统还可以包含克隆穿梭质粒，但并不限定于此。
在本发明中，克隆穿梭质粒可以包含5’同源拉伸位点(homologous stretch)、5’末端反向重复序列(inverted terminal repeat，ITR)、Ψ包装信号序列、启动子、多克隆位点(multi-cloning site，MCS)、poly(A)信号序列及3’同源拉伸位点，但并不限定于此。
在本发明中，启动子可以为CMV启动子或鸡β-肌动蛋白(chickenβ-actin)启动子，但并不限定于此。
在本发明中，克隆穿梭质粒可以包含内含子，但并不限定于此。
在本发明中，内含子可以源自兔β-珠蛋白(rabbitβ-globin)基因，但并不限定于此。
在本发明中，poly(A)信号序列可以为SV40poly(A)信号序列，但并不限定于此。
在本发明中，克隆穿梭质粒还可以包含抗生素抗性基因，例如，可以包含卡那霉素(Kanamycin)抗性基因，但并不限定于此。
在本发明中，克隆穿梭质粒还可以包含Ori复制起点，但并不限定于此。
在本发明中，克隆穿梭质粒可以包含要使用无肠腺病毒表达的转基因以及在转基因表达中所需的元件，但并不限定于此。
在本发明中，转基因可以为至少一个，但并不限定于此。
在本发明中，转基因可以具有抑制特定基因产物的表达的功能，但并不限定于此。
在本发明中，转基因可克隆到多克隆位点，但并不限定于此。
在本发明中，转基因可以为选自由因子IX[factor IX，用于治疗B型血友病(hemophilia B)的R338L Padua突变体基因]、葡萄糖脑苷脂酶[glucocerebrosidase，GCR，用于治疗戈谢病(Gaucher’s disease)的基因]、氨基己糖苷酶A[hexosaminidase A，HEXA，用于治疗家族黑蒙性痴呆(Tay-Sachs)的基因]、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1[hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，HPRT1，用于治疗自毁容貌综合症(Lesch-Nyhan syndrome)的基因]、2-硫酸酯酶[iduronate-2-sulfatase，IDS，用于治疗亨特综合症(Hunter syndrome)的基因]、甲基化CpG结合蛋白2[methyl-CpG-binding protein 2，MECP2，用于治疗瑞特综合症(Rett syndrome)的基因]、运动神经元1存活因子[survivalof motor neuron 1，SMN1，用于治疗脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)的基因]及抗肌萎缩蛋白基因[dystrophin gene，用于治疗假肥大性肌营养不良(Duchennemuscular dystrophy，DMD)的基因]组成的组中的一种以上，但并不限定于此。
在本发明中，克隆穿梭质粒可以为pBest或pBest4，但并不限定于此。
在本发明中，病毒包装细胞株可以为表达属于腺病毒的E1区的蛋白质的细胞株，例如，可以为HEK293或HEK293T，但并不限定于此。
在本发明中，系统还可以包含pAd5pTP表达质粒，但并不限定于此。在还包含pAd5pTP表达质粒的情况下，具有显著提高GLAd的生产的效果。
在本发明中，pAd5pTP表达质粒可以包含序列76的碱基序列。
本发明另一方面涉及无肠腺病毒(gutless adenovirus，GLAd)的生产方法，包括：
将最终基因组质粒转染到病毒包装细胞株中的步骤；以及
将辅助质粒转染到病毒包装细胞株中的步骤。
在本发明中，上述方法的最终基因组质粒与上述相同，在此不再赘述。
在本发明中，最终基因组质粒可以由限制酶进行线性化而成，但并不限定于此。
在本发明中，上述方法的辅助质粒与上述相同，在此不再赘述。
在本发明中，可通过磷酸钙沉淀法(calcium phosphate precipitation method)进行转染，但并不限定于此。
在本发明中，上述生产方法还可以包括将pAd5pTP表达质粒转染到病毒包装细胞株中的步骤。在还包括上述步骤的情况下，具有显著提高GLAd的生产的效果。
在本发明中，pAd5pTP表达质粒可以包含序列76的碱基序列。
在本发明中，将最终基因组质粒转染到病毒包装细胞株中的步骤及将辅助质粒转染到病毒包装细胞株中的步骤可以以任何顺序进行，例如，可以同时进行，但并不限定于此。
在本发明中，通过上述制备方法制备的GLAd可以不包含污染物病毒种。
在本发明中，污染物病毒种可以为腺病毒或复制型腺病毒(replication-competent axdenovirus，RCA)，但并不限定于此。
本发明一实例中，本发明的生产方法可以如下进行：
包含转基因的克隆穿梭质粒中所包含的转基因表达盒(expression cassette)移动至基因组质粒而成为最终基因组质粒。将最终基因组质粒用限制酶进行线性化。然后，将线性化的最终基因组质粒及辅助质粒转染到病毒包装细胞株中。通过上述转染步骤生产GLAd。
本发明再一实例中，本发明的生产方法可以如下进行：
包含转基因的克隆穿梭质粒中所包含的转基因表达盒(expression cassette)移动至基因组质粒而成为最终基因组质粒。将最终基因组质粒用限制酶进行线性化。然后，将线性化最终基因组质粒、辅助质粒及pAd5pTP表达质粒转染到病毒包装细胞株中。通过上述转染步骤生产GLAd。
本发明另一实例中，本发明的生产方法可以如下进行：
将辅助质粒转染到病毒包装细胞株中。经过适当的时间后，将包含转基因表达盒的GLAd进一步感染到上述转染的细胞株中。经过适当的时间后就会产生GLAd。此时产生的GLAd可能呈现扩增形式。
本发明还有一实例中，本发明的生产方法可以如下进行：
将辅助质粒及pAd5pTP表达质粒转染到病毒包装细胞株中。经过适当的时间后，将包含转基因表达盒的GLAd进一步感染到上述转染的细胞株中。经过适当的时间后就会产生GLAd。此时产生的GLAd可能呈现扩增形式。
本发明再一例涉及克隆穿梭质粒的制备方法，包括：
以pGT2质粒作为模板并利用引物对来制备与Kanr～ColE1区对应的第一DNA片段的步骤；
使用限制酶切割第一DNA片段的步骤；
制备包含5’同源拉伸位点(homologous stretch)、5’末端反向重复序列(inverted terminal repeat，ITR)、Ψ5包装信号序列、CMV启动子、多克隆位点(multi-cloning site，MCS)、SV40poly(A)信号序列及3’同源拉伸位点的第二DNA片段的步骤；
使用限制酶切割第二DNA片段的步骤；以及
将使用限制酶切割的第一DNA片段与使用限制酶切割的第二DNA片段结合来制备pBest的步骤。
在本发明中，pGT2质粒可以包含序列63的碱基序列，例如，可以由序列63的碱基序列组成，但并不限定于此。
在本发明中，第一DNA片段的制备步骤的引物对可以为由序列1及2的碱基序列组成的引物对，但并不限定于此。
在本发明中，第一DNA片段的制备步骤可以通过PCR进行，但并不限定于此。
在本发明中，第一DNA片段可以包含限制酶位点，例如，可以包含SfiI限制酶位点及XcmI限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，第一DNA片段的SfiI限制酶位点可以位于3’末端，但并不限定于此。
在本发明中，第一DNA片段的XcmI限制酶位点可以位于5’末端，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割第一DNA片段的步骤可以通过XcmI及SfiI限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，第二DNA片段可以包含限制酶位点，例如，可以包含SfiI限制酶位点及XcmI限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，第二DNA片段的SfiI限制酶位点可以位于5’末端，但并不限定于此。
在本发明中，第二DNA片段的XcmI限制酶位点可以位于3’末端，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割第二DNA片段的步骤可以通过XcmI及SfiI限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，pBest的制备步骤可通过将使用限制酶切割的第一DNA片段与使用限制酶切割的第二DNA片段结合的方式来进行。
在本发明中，pBest可以包含序列64的碱基序列，例如，可以由序列64的碱基序列组成，但并不限定于此。
本发明另一例涉及包括如下步骤的辅助质粒的制备方法。
1.Ψ5-Left-Arm-2的制备
以pGT2质粒作为模板并利用引物对来制备Ψ5-Left-Arm-1的Kanr～ColE1区部分的步骤；
使用限制酶切割Ψ5-Left-Arm-1的Kanr～ColE1区部分的步骤；
制备与Ψ5基因组的BstZ17I～BamHI区对应的第三DNA片段的步骤；
将使用限制酶切割的Ψ5-Left-Arm-1的Kanr～ColE1区部分与使用限制酶切割的第三DNA片段结合来制备Ψ5-Left-Arm-1的步骤；
使用限制酶切割Ψ5-Left-Arm-1的步骤；
以Ψ5作为模板并利用引物对来制备第四DNA片段的步骤；
使用限制酶切割第四DNA片段的步骤；以及
将使用限制酶切割的Ψ5-Left-Arm-1与使用限制酶切割的第四DNA片段结合来制备Ψ5-Left-Arm-2的步骤。
在本发明中，Ψ5-Left-Arm-1的Kanr～ColE1区部分的制备步骤的引物对可以为由序列3及4的碱基序列组成的引物对，但并不限定于此。
在本发明中，Ψ5-Left-Arm-1的Kanr～ColE1区部分的制备步骤可以通过PCR进行，但并不限定于此。
在本发明中，Ψ5-Left-Arm-1的Kanr～ColE1区部分可以包含限制酶位点，例如，可以包含BamHI限制酶位点及BstZ17I限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，Ψ5-Left-Arm-1的Kanr～ColE1区部分的BamHI限制酶位点可以位于5’末端，但并不限定于此。
在本发明中，Ψ5-Left-Arm-1的Kanr～ColE1区部分的BstZ17I限制酶位点可以位于3’末端，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割Ψ5-Left-Arm-1的Kanr～ColE1区部分的步骤可以通过BamHI及BstZ17I限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，与Ψ5基因组的BstZ17I～BamHI区对应的第三DNA片段可以包含序列65的碱基序列，例如，可以由序列65的碱基序列组成，但并不限定于此。
在本发明中，第三DNA片段可以包含限制酶位点，例如，可以包含BamHI限制酶位点及BstZ17I限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，第三DNA片段的BamHI限制酶位点可以位于3’末端，但并不限定于此。
在本发明中，第三DNA片段的BstZ17I限制酶位点可以位于5’末端，但并不限定于此。
在本发明中，第三DNA片段的制备步骤可以通过BamHI及BstZ17I限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，Ψ5-Left-Arm-1的制备步骤可通过将使用限制酶切割的Ψ5-Left-Arm-1的Kanr～ColE1区部分与使用限制酶切割的第三DNA片段结合的方式来进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割Ψ5-Left-Arm-1的步骤可通过ClaI及BstZ17I限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，第四DNA片段可以为从‘*’(星号(asterisk))标记开始到BstZ17I限制酶位点为止的DNA片段(图7的b部分)。
在本发明中，第四DNA片段的制备步骤的引物对可以为由序列5及6的碱基序列组成的引物对，但并不限定于此。
在本发明中，第四DNA片段的制备步骤可以通过PCR进行，但并不限定于此。
在本发明中，第四DNA片段可以包含序列66的碱基序列，例如，序列66的碱基序列组成，但并不限定于此。
在本发明中，第四DNA片段可以包含限制酶位点，例如，可以包含ClaI限制酶位点及BstZ17I限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，第四DNA片段的ClaI限制酶位点可以位于5’末端，但并不限定于此。
在本发明中，第四DNA片段的BstZ17I限制酶位点可以位于3’末端，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割第四DNA片段的步骤可通过ClaI及BstZ17I限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，Ψ5-Left-Arm-2的制备步骤可通过将使用限制酶切割的Ψ5-Left-Arm-1与使用限制酶切割的第四DNA片段结合的方式来进行，但并不限定于此。
在本发明中，术语“Ψ5-Left-Arm-2”是指包含Ad5(5型腺病毒，GenBank AC_000008)的5’ITR及Ψ包装信号序列的部分被去除，具体是碱基序列的第1位至第3133位的碱基被去除。
2.Ψ5-Right-Arm-2的制备
以pGT2质粒、Ψ5-Left-Arm-1或Ψ5-Left-Arm-2作为模板并利用引物对来制备Ψ5-Right-Arm-1的Kanr～ColE1区部分的步骤；
使用限制酶切割Ψ5-Right-Arm-1的Kanr～ColE1区部分的步骤；
制备与Ψ5基因组的BamHI～3’ITR区对应的第五DNA片段的步骤；
将使用限制酶切割的Ψ5-Right-Arm-1的Kanr～ColE1区部分与使用限制酶切割的第五DNA片段结合来制备Ψ5-Right-Arm-1的步骤；
使用限制酶切割Ψ5-Right-Arm-1的步骤；
以Ψ5作为模板并利用引物对来制备第六DNA片段的步骤；
使用限制酶切割第六DNA片段的步骤；以及
将使用限制酶切割的第Ψ5-Right-Arm-1与使用限制酶切割的第六DNA片段结合来制备Ψ5-Right-Arm-2的步骤。
在本发明中，Ψ5-Right-Arm-1的Kanr～ColE1区部分的制备步骤的引物对可以为由序列7及8的碱基序列组成的引物对，但并不限定于此。
在本发明中，Ψ5-Right-Arm-1的Kanr～ColE1区部分的制备步骤可以通过PCR进行，但并不限定于此。
在本发明中，Ψ5-Right-Arm-1的Kanr～ColE1区部分可以包含限制酶位点，例如，可以包含PacI限制酶位点及BamHI限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，Ψ5-Right-Arm-1的Kanr～ColE1区部分的PacI限制酶位点可以位于5’末端，但并不限定于此。
在本发明中，Ψ5-Right-Arm-1的Kanr～ColE1区部分的BamHI限制酶位点可以位于3’末端，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割Ψ5-Right-Arm-1的Kanr～ColE1区部分的步骤可以通过BamHI限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，与Ψ5基因组的BamHI～3’ITR区对应的第五DNA片段可以包含序列67的碱基序列，例如，可以由序列67的碱基序列组成，但并不限定于此。
在本发明中，与Ψ5基因组的BamHI～3’ITR区对应的第五DNA片段的制备步骤可以通过使用BamHI限制酶切割Ψ5DNA来进行，但并不限定于此。
在本发明中，第五DNA片段的BamHI限制酶位点可以位于5’末端，但并不限定于此。
在本发明中，Ψ5-Right-Arm-1的制备步骤可通过将使用限制酶切割的Ψ5-Right-Arm-1的Kanr～ColE1区部分与使用限制酶切割的第五DNA片段结合的方式来进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割Ψ5-Right-Arm-1的步骤可以通过SpeI及NdeI限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，以Ψ5作为模板并利用引物对来制备第六DNA片段的制备步骤的引物对可以为由序列9至12的碱基序列组成的引物对，但并不限定于此。
在本发明中，第六DNA片段的制备步骤可以通过重叠PCR进行，但并不限定于此。
在本发明中，第六DNA片段可以包含序列68的碱基序列，例如，可以由序列68的碱基序列组成，但并不限定于此。
在本发明中，第六DNA片段可以包含限制酶位点，例如，可以包含SpeI限制酶位点及NdeI限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，第六DNA片段的SpeI限制酶位点可以位于5’末端，但并不限定于此。
在本发明中，第六DNA片段的NdeI限制酶位点可以位于3’末端，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割第六DNA片段的步骤可以通过SpeI及NdeI限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，Ψ5-Right-Arm-2的制备步骤可通过将使用限制酶切割的Ψ5-Right-Arm-1与使用限制酶切割的第六DNA片段结合的方式来进行，但并不限定于此。
在本发明中，术语“Ψ5-Right-Arm-2”是指由于Ad5(5型腺病毒，GenBank AC_000008)碱基序列的第27864位至第31000位的碱基被去除而使部分剩余的E3区(partiallyremaining E3region)完全缺失。
3.pAdBest的制备
使用限制酶切割Ψ5-Right-Arm-2的步骤；
使用限制酶切割Ψ5-Left-Arm-2来分离大片段的步骤；以及
将使用限制酶切割的Ψ5-Right-Arm-2与从使用限制酶切割的Ψ5-Left-Arm-2中分离的大片段结合来制备pAdBest的步骤。
在本发明中，使用限制酶切割Ψ5-Right-Arm-2的步骤可以通过ClaI及BamHI限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割Ψ5-Left-Arm-2来分离大片段的步骤可以通过ClaI及BamHI限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用ClaI及BamHI限制酶切割Ψ5-Left-Arm-2来分离的大片段的DNA可以包含序列69的碱基序列，例如，可以由序列69的碱基序列组成，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割Ψ5-Left-Arm-2来分离的上述大片段可以包含限制酶位点，例如，可以包含ClaI限制酶位点及BamHI限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割Ψ5-Left-Arm-2来分离的上述大片段的ClaI限制酶位点可以位于5’末端，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割Ψ5-Left-Arm-2来分离的上述大片段的BamHI限制酶位点可以位于3’末端，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBest的制备步骤可通过将使用限制酶切割的Ψ5-Right_Arm-2与使用限制酶Ψ5-Left_Arm-2来分离的上述大片段结合的方式来进行，但并不限定于此。
4.pAdBest_dITR的制备
使用限制酶切割pAdBest来分离小片段的步骤；
将使用限制酶切割pAdBest来分离的小片段与包含ClaI限制酶位点及EcoRI限制酶位点的接头结合来制备pAdBest_EcoR_Cla的步骤；
使用限制酶切割pAdBest_EcoR_Cla来分离大片段的步骤；
以pAdBest作为模板并利用引物对来制备第七DNA片段的步骤；
使用限制酶切割第七DNA片段的步骤；
将使用限制酶切割pAdBest_EcoR_Cla来分离的大片段与使用限制酶切割的第七DNA片段结合来制备pAdBest_EcoR_Cla_dITR的步骤；
使用限制酶切割pAdBest_EcoR_Cla_dITR的步骤；
使用限制酶切割pAdBest来分离大片段的步骤；以及
将使用限制酶切割的pAdBest_EcoR_Cla_dITR与使用限制酶切割pAdBest来分离的大片段结合来制备pAdBest_dITR的步骤。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBest来分离小片段的步骤可以通过ClaI及EcoRI限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBest来分离的上述小片段可以包含限制酶位点，例如，可以包含ClaI限制酶位点及EcoRI限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBest来分离的上述小片段的ClaI限制酶位点可以位于3’末端，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBest来分离的小片段的EcoRI限制酶位点可以位于5’末端，但并不限定于此。
在本发明中，包含ClaI限制酶位点及EcoRI限制酶位点的接头可以为由序列13及14的碱基序列组成的接头，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBest_EcoR_Cla的制备步骤可以通过将使用限制酶切割pAdBest来分离的小片段与上述接头结合的方式来进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBest_EcoR_Cla来分离大片段的步骤可以通过AvrII及RsrII限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBest_EcoR_Cla来分离的大片段可以包含限制酶位点，例如，可以包含AvrII限制酶位点及RsrII限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBest_EcoR_Cla来分离的大片段的AvrII限制酶位点可以位于3’末端，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBest_EcoR_Cla来分离的大片段的RsrII限制酶位点可以位于5’末端，但并不限定于此。
在本发明中，第七DNA片段的制备步骤的引物对可以为由序列15至18的碱基序列组成的引物对，但并不限定于此。
在本发明中，第七DNA片段的制备步骤可以通过重叠PCR进行，但并不限定于此。
在本发明中，第七DNA片段可以包含序列70的碱基序列，例如，可以由序列70的碱基序列组成，但并不限定于此。
在本发明中，第七DNA片段可以包含限制酶位点，例如，可以包含AvrII限制酶位点及RsrII限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割第七DNA片段的步骤可以通过AvrII及RsrII限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，第七DNA片段的AvrII限制酶位点可以位于5’末端，但并不限定于此。
在本发明中，第七DNA片段的RsrII限制酶位点可以位于3’末端，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBest_EcoR_Cla_dITR的制备步骤可以通过将使用限制酶切割pAdBest_EcoR_Cla来分离的大片段与使用限制酶切割的第七DNA片段结合的方式来进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBest_EcoR_Cla_dITR的步骤可以通过ClaI及EcoRI限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBest来分离大片段的步骤可以通过ClaI及EcoRI限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBest来分离的大片段可以包含限制酶位点，例如，可以包含ClaI限制酶位点及EcoRI限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBest来分离的大片段的ClaI限制酶位点可以位于5’末端，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBest来分离的大片段的EcoRI限制酶位点可以位于3’末端，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBest_ITR的制备步骤可通过将使用限制酶切割的pAdBest_EcoR_Cla_dITR与使用限制酶切割pAdBest来分离的大片段结合的方式来进行，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBest_dITR可以包含序列71的碱基序列，例如，可以由序列71的碱基序列组成，但并不限定于此。
本发明还有一例涉及基因组质粒的制备方法，包括：
以pAdBest质粒作为模板并利用引物对来制备第八DNA片段的步骤；
使用限制酶切割第八DNA片段的步骤；
将使用限制酶切割的第八DNA片段与接头结合来制备pAdBestGL1的步骤；
通过去除在pAdBestGL1中存在的限制酶位点来制备pAdBestGL1_dCla的步骤；
使用限制酶分别切割pAdBestGL1及pAdBestGL1_dCla的步骤；
将使用限制酶切割的pAdBestGL1及pAdBestGL1_dCla分别与接头结合来制备pAdBestGL2_wtCla及pAdBestGL2的步骤；
使用限制酶切割pAdBestGL2的步骤；
将使用限制酶切割的pAdBestGL2与使用限制酶切割的λ噬菌体DNA混合来制备pAdBestGL3的步骤；
使用限制酶切割pAdBestGL3的步骤；
将使用限制酶切割的pAdBestGL3与接头结合来制备pAdBestGL4_3H的步骤；
将使用限制酶切割的pAdBestGL3与接头结合来制备pAdBestGL4_5H的步骤；
通过去除在pAdBestGL4_3H中存在的限制酶位点来制备pAdBestGL4_3H_2dCla的步骤；
通过去除在pAdBestGL4_5H中存在的限制酶位点来制备pAdBestGL4_5H_dCla的步骤；
使用限制酶切割pAdBestGL4_3H_2dCla的步骤；
使用限制酶切割pAdBestGL4_5H_dCla来分离大片段的步骤；
将使用限制酶切割的pAdBestGL4_3H_2dCla与使用限制酶切割pAdBestGL4_5H_dCla来分离的大片段结合来制备pAdBestGL5的步骤；
使用限制酶切割pAdBestGL2_wtCla的步骤；
使用限制酶切割pAdBestGL5的步骤；
将使用限制酶切割的pAdBestGL2_wtCla与使用限制酶切割的pAdBestGL5混合来制备pAdBestGL的步骤；
使用限制酶切割pAdBestGL的步骤；
制备骨架/基质附着元件(scaffold/matrix attachment，SMAR element)的步骤；
使用限制酶切割骨架/基质附着元件的步骤；以及
将使用限制酶切割的pAdBestGL与使用限制酶切割的骨架/基质附着元件结合来制备pGLAd的步骤。
在本发明中，第八DNA片段的制备步骤的引物对可以为由序列19及20的碱基序列组成的引物对，但并不限定于此。
在本发明中，第八DNA片段的制备步骤可以通过PCR进行，但并不限定于此。
在本发明中，第八DNA片段可以包含序列72的碱基序列，例如，可以由序列72的碱基序列组成，但并不限定于此。
在本发明中，第八DNA片段可以包含限制酶位点，例如，可以包含SacI限制酶位点及AscI限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割第八DNA片段的步骤可以通过SacI及AscI限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，第八DNA片段的SacI限制酶位点可以位于3’末端，但并不限定于此。
在本发明中，第八DNA片段的AscI限制酶位点可以位于5’末端，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBestGL1的制备步骤的接头可以为由序列21及22的碱基序列组成的接头，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBestGL1的制备步骤可通过将使用限制酶切割的第八DNA片段与上述接头结合的方式来进行，但并不限定于此。
在本发明中，通过去除在pAdBestGL1中存在的限制酶位点来制备pAdBestGL1_dCla的步骤中去除的限制酶位点可以为ClaI限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBestGL1_dCla的制备步骤可以通过使用ClaI限制酶切割pAdBestGL1并使用Klenow填充间隙后自结合的方式来进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶分别切割pAdBestGL1及pAdBestGL1_dCla的步骤可以通过SacI及AvrII限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBestGL2_wtCla及pAdBestGL2的制备步骤的接头可以为由序列23及24的碱基序列组成的接头(图8的b部分)，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBestGL2_wtCla及pAdBestGL2的制备步骤可通过将使用限制酶切割的pAdBestGL1及pAdBestGL1_dCla分别与上述接头结合的方式来进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBestGL2的步骤可以通过HpaI限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割的λ噬菌体DNA可以为使用HindIII限制酶切割的λ噬菌体DNA，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBestGL3的制备步骤可通过将使用限制酶切割的pAdBestGL2与使用限制酶切割的λ噬菌体DNA混合并通过体外同源退火(in vitro homologous annealing，iHoA)进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBestGL3的步骤可以通过SacI及ApaI限制酶或ApaI及AvrII限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBestGL4_3H的制备步骤中使用限制酶切割的pAdBestGL3可以为使用SacI及ApaI限制酶切割的pAdBestGL3，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBestGL4_3H的制备步骤的接头可以为由序列25及26的碱基序列组成的接头(图8的d部分)，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBestGL4_3H的制备步骤可通过将使用限制酶切割的pAdBestGL3与上述接头结合的方式来进行，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBestGL4_5H的制备步骤中使用限制酶切割的pAdBestGL3可以为使用ApaI及AvrII限制酶切割的pAdBestGL3，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBestGL4_5H的制备步骤的接头可以为由序列27及28的碱基序列组成的接头(图8的e部分)，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBestGL4_5H的制备步骤可通过将使用限制酶切割的pAdBestGL3与上述接头结合的方式来进行，但并不限定于此。
在本发明中，通过去除在pAdBestGL4_3H中存在的限制酶位点来制备pAdBestGL4_3H_2dCla的步骤中去除的限制酶位点可以为ClaI限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBestGL4_3H_2dCla的制备步骤可以包括：将pAdBestGL4_3H用ClaI限制酶切割并使用Klenow填充间隙后进行自结合来转化为Dam-/-细菌细胞(Dam-/-bacterial cells)的步骤；使用ClaI限制酶再次切割产物pAdBestGL4_3H_dCla的步骤；使用Klenow填充间隙的步骤；以及进行自结合的步骤。
在本发明中，通过去除在pAdBestGL4_5H中存在的限制酶位点来制备pAdBestGL4_5H_dCla的步骤中去除的限制酶位点可以为ClaI限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBestGL4_5H_dCla的制备步骤可以通过使用ClaI限制酶切割pAdBestGL4_5H并使用Klenow填充间隙后自结合的方式来进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBestGL4_3H_2dCla的步骤可以通过SacI及ApaI限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBestGL4_5H_dCla来分离大片段的步骤可以通过SacI及ApaI限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBestGL4_5H_dCla来分离的上述大片段可以包含限制酶位点，例如，可以包含SacI限制酶位点及ApaI限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBestGL4_5H_dCla来分离的大片段的SacI限制酶位点可以位于5’末端，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBestGL4_5H_dCla来分离的大片段的ApaI限制酶位点可以位于3’末端，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBestGL5的制备步骤可通过将使用限制酶切割的pAdBestGL4_3H_2dCla与使用限制酶切割pAdBestGL4_5H_dCla来分离的大片段结合的方式来进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBestGL2_wtCla的步骤可以通过HpaI限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBestGL5的步骤可以通过SacI及AvrII限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，pAdBestGL的制备步骤可通过将使用限制酶切割的pAdBestGL2_wtCla与使用限制酶切割的pAdBestGL5混合并通过iHoA进行，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割pAdBestGL的步骤可以通过ApaI及NsiI限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，骨架/基质附着元件的制备步骤的引物对可以为由序列29及30的碱基序列组成的引物对，但并不限定于此。
在本发明中，骨架/基质附着元件的制备步骤可以通过PCR进行，但并不限定于此。
在本发明中，骨架/基质附着元件可以包含限制酶位点，例如，可以包含ApaI限制酶位点及NsiI限制酶位点，但并不限定于此。
在本发明中，使用限制酶切割骨架/基质附着元件的步骤可以通过ApaI及NsiI限制酶进行，但并不限定于此。
在本发明中，骨架/基质附着元件的ApaI限制酶位点可以位于5’末端，但并不限定于此。
在本发明中，骨架/基质附着元件的NsiI限制酶位点可以位于3’末端，但并不限定于此。
在本发明中，pGLAd的制备步骤可通过将使用限制酶切割的pAdBestGL与使用限制酶切割的骨架/基质片段结合的方式来进行，但并不限定于此。
在本发明中，pGLAd可以包含序列73的碱基序列，例如，可以由序列73的碱基序列组成，但并不限定于此。
本发明又一例涉及包括如下结构的无肠腺病毒：
5’末端反向重复序列(inverted terminal repeat，ITR)、Ψ包装信号序列、启动子、内含子、转基因(transgene)、poly(A)信号序列、填充DNA(stuffer DNA；sDNA)及3’末端反向重复序列。
在本发明中，启动子可以为CMV启动子或鸡β-肌动蛋白(chickenβ-actin)启动子，但并不限定于此。
在本发明中，内含子可以源自兔β-珠蛋白(rabbitβ-globin)基因，但并不限定于此。
在本发明中，poly(A)信号序列可以为SV40poly(A)信号序列，但并不限定于此。
在本发明中，填充DNA还可以包含骨架/基质附着元件(scaffold/matrixattachment element，SMAR)，但并不限定于此。
在本发明中，转基因可以为至少一个，但并不限定于此。
在本发明中，转基因可以具有抑制特定基因产物的表达的功能，但并不限定于此。
在本发明中，转基因可以为选自由因子IX[factor IX，用于治疗B型血友病(hemophilia B)的R338L Padua突变体基因]、葡萄糖脑苷脂酶[glucocerebrosidase，GCR，用于治疗戈谢病(Gaucher’s disease)的基因]、氨基己糖苷酶A[hexosaminidase A，HEXA，用于治疗家族黑蒙性痴呆(Tay-Sachs)的基因]、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1[hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，HPRT1，用于治疗自毁容貌综合症(Lesch-Nyhan syndrome)的基因]、2-硫酸酯酶[iduronate-2-sulfatase，IDS，用于治疗亨特综合症(Hunter syndrome)的基因]、甲基化CpG结合蛋白2[methyl-CpG-binding protein 2，MECP2，用于治疗瑞特综合症(Rett syndrome)的基因]、运动神经元1存活因子[survivalof motor neuron 1，SMN1，用于治疗脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)的基因]及抗肌萎缩蛋白基因[dystrophin gene，用于治疗假肥大性肌营养不良(Duchennemuscular dystrophy，DMD)的基因]组成的组中的一种以上，但并不限定于此。
在本发明中，上述无肠腺病毒可以利用如上所述的基于辅助质粒的无肠腺病毒生产系统制备，但并不限定于此。
在本发明中，上述无肠腺病毒可以利用如上所述的无肠腺病毒的生产方法制备，但并不限定于此。
发明的效果
本发明涉及基于辅助质粒的无肠腺病毒(gutless adenovirus，GLAd)生产系统、利用其的无肠腺病毒的生产方法、利用其生产的无肠腺病毒以及利用其生产的无肠腺病毒的用途。本发明的基于辅助质粒的GLAd生产系统仅生产重组GLAd，而不产生源自辅助质粒的腺病毒及复制型腺病毒(replication-competent adenovirus；RCA)，无论转基因的大小如何，通过上述生产系统制备的重组GLAd都能有效地传递这些基因，并且对如亨廷顿病(Huntington’s disease，HD)及假肥大性肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)等先天性遗传病显示出治疗潜力。因此，本发明表明基于辅助质粒的GLAd生产系统可以成为基于GLAd的基因疗法的新平台。
附图说明
图1为示出本发明一实施例的pAdBest_dITR辅助质粒及pGLAd基因组质粒的制备以及利用其的GLAd的生产的图。
图1的a部分示出最广泛使用的辅助腺病毒的结构特性。黑色箭头表示loxP位点。
图1的b部分示出Ad5基因组结构及转录单位。E及L分别表示早期基因(earlygene)及晚期基因(late gene)。箭头符号表示转录单位的方向。
图1的c部分示出Ad5、pAdBest_dITR辅助质粒、pGLAd基因组质粒及GLAd基因组结构的简要图的比较。SMAR表示骨架/基质附着元件(scaffold/matrix attachmentelement)。颜色表示DNA骨架(backbone)的起源。
图1的d部分示出生产GLAd的简要图。通过将pAdBest_dITR辅助质粒以及由PacI限制酶进行线性化而成的重组pGLAd_X基因组质粒共转染到HEK293T细胞中来生产重组GLAd.X病毒。
图1的e部分示出被GLAd.LacZ病毒感染的HEK293细胞的LacZ染色结果。用GLAd.LacZ病毒感染HEK293细胞，经过48小时后，对细胞进行LacZ染色。[上图：未处理对照组(白点为X-gal结晶，不是被染色的细胞)；中间图：10ml的病毒培养基中50μl用于感染；下图：1ml的病毒细胞裂解物中5μl用于感染。]
图2为示出本发明一实施例的作为新型基因组质粒的pGLAd3的制备及利用其的GLAd的生产的图。
图2的a部分示出pGLAd及pGLAd3基因组质粒和与其对应的GLAd的简要图的比较。颜色表示DNA骨架的起源。
图2的b部分示出在生产重组GLAd3.LacZ病毒的过程中观察到的CPE。将pAdBest_dITR辅助质粒及由PacI限制酶进行线性化而成的pGLAd3_LacZ基因组质粒共转染到HEK293T细胞中，经过48小时后，通过显微镜拍摄未处理对照组(左侧)及转染的细胞(右侧)。
图2的c部分示出被GLAd3.LacZ病毒感染的HEK293细胞的LacZ染色结果。用GLAd3.LacZ病毒感染HEK293细胞，经过48小时后，对细胞进行LacZ染色。左侧的数字表示从100mm的培养皿制备的1ml的病毒细胞裂解物中用于感染的体积(0μl、5μl或20μl)。
图2的d部分示出在辅助腺病毒、E1-表达包装细胞及pAdBest_dITR辅助质粒中确认到的同源性区部分。同源重组可在涂色的框区中发生。为了生成RCA，需在两个位置发生同源重组，只有这样才能使E1从包装细胞移动至辅助腺病毒。
图3示出本发明一实施例的用于大量生产GLAd的工艺流程图。
图3的a部分示出以往GLAd的标准生产程序的整个过程。pHDAd.LacZ为包含LacZ表达盒的GLAd基因组质粒。滴度(titer)表示在各扩增步骤中生成的总感染性GLAd颗粒(BFU取决于LacZ染色)。
图3的b部分示出种子GLAd(seed GLAd，P0)的获得(rescue)、连续扩增(P1至P3)及GLAd的大量生产(根据规模，P3、P4或P5)的整个过程(详细内容参照材料及实验方法)。在各扩增步骤中通过LacZ染色计算滴度(BFU)。
图4为示出本发明一实施例的在GLAd生产过程中生成的腺病毒及RCA污染物分析的图。
图4的a部分示出在100mm的培养皿中利用Ad.LacZ(阳性对照组)和在150mm的培养皿中利用P3GLAd3.LacZ(3×109BFU)(该生产参照图3)依次感染HEK293细胞的过程。在上述条件下，可以扩增腺病毒及RCA。在阳性对照组中，一个感染性病毒颗粒仅以少于两次的扩增步骤扩增为5×105的感染性病毒颗粒(1BFU->5×105BFU)。为了分解在P3GLAd3.LacZ的制备中持续利用的辅助质粒而使用核酸酶(Benzonase)(包装在衣壳内的病毒DNA对核酸酶具有抗性)。在各扩增步骤中，通过以适当方式收集细胞来从细胞中释放腺病毒及RCA。在扩增的最终步骤中，收集所有细胞及培养基并以适当方式处理后，分析腺病毒及RCA。
图4的b部分示出对图4的a的试样进行腺病毒及RCA的PCR分析的结果。对不存在于GLAd基因组或HEK293细胞中但在腺病毒及RCA中共同存在的fiber基因的N-末端DNA进行PCR来分析试样。在PCR中使用Ad5DNA(10pg)作为阳性对照组。Ad.LacZ试样在稀释100倍之前或之后进行PCR(若以这种方式稀释，则在试样中仅剩下500个病毒颗粒)。在存在或不存在额外添加的(spiked)Ad5DNA(10pg)的条件下，通过PCR进行扩增。箭头表示目标PCR产物(484bp)。M是指大小为100bp的标志物。
图4的c部分与图4的a同样示出为了扩增腺病毒及RCA而利用P4GLAd3.LacZ或P5GLAd3.LacZ感染HEK293细胞的过程。利用所制备的试样进行PCR，其结果在图4的d部分中示出。
图4的d部分示出对图4的c的试样进行腺病毒及RCA的PCR分析的结果。以与上述图4的b部分中的方式相同的方式对试样进行PCR。
图5为示出本发明一实施例的通过重组GLAd表达亨廷顿蛋白mshR、密码子优化的合成亨廷顿蛋白基因或这两种的图。
图5的a部分示出全长人类成熟亨廷顿蛋白mRNA(full-length human maturehuntingtin mRNA)的简要图及mshR的位置。数字1、2及3分别表示mshR1、mshR2及mshR3的目标位置。
图5的b部分示出mshR的模板序列(template)。21NTs表示长度为21的核苷酸的正义及反义序列。
图5的c部分示出需要表达mshR的表达质粒。利用BamHI及EcoRI限制酶位点在该质粒中克隆单个mshR(individual mshR，表21)。
图5的d部分示出通过mshR表达质粒抑制内源性亨廷顿蛋白的表达。HEK293T细胞未经处理或者用pGT2、pGT2-mshR1、pGT2-mshR2或pGT2-mshR3转染，经过48小时后，获得细胞并进行蛋白质印迹来分析内源性亨廷顿蛋白的表达。HTT是指亨廷顿蛋白。
图5的e部分示出全长人类成熟亨廷顿蛋白mRNA的简要图及mshR的位置。上面的黑色及下面的红色水平线分别表示天然(内源性)亨廷顿蛋白mRNA及密码子优化的亨廷顿蛋白mRNA。数字表示mshR1、mshR2及mshR3的目标位置。mshR1及mshR3表示氨基酸及相应的密码子。在天然(内源性)亨廷顿蛋白mRNA与密码子优化的亨廷顿蛋白mRNA之间用不同序列确认的核苷酸以灰色突出显示。
图5的f部分示出用于克隆mshR3及密码子优化的合成亨廷顿蛋白基因的pGLAd4基因组质粒[正方向(right orientation)或返(R)方向(reverse orientation)]。
图5的g部分示出同时传递亨廷顿蛋白mshR及密码子优化的合成亨廷顿蛋白基因的重组GLAd。GLAd4.coHTT.HTTmshR1/3传递正方向的密码子优化的亨廷顿蛋白基因。总长度(28.3kb)是指从5’ITR到3’ITR为止的长度。
图5的h部分示出在同时传递重组GLAd mshR1/3及密码子优化的合成亨廷顿蛋白基因的情况下，它们对亨廷顿蛋白的表达产生的影响。用GLAd4.coHTT.HTTmshR1/3或GLAd4.coHTT(R).HTTmshR1/3(返方向的密码子优化的亨廷顿蛋白基因)感染HEK293T细胞，经过48小时后，获得细胞并进行蛋白质印迹来分析亨廷顿蛋白的表达。HTT是指亨廷顿蛋白。
图5的i部分示出重组GLAd4.coHTT.HTTmshR1/3在亨廷顿病(HD)中的作用模型的简要图。wtHTT及mtHTT分别表示野生型(wild-type)亨廷顿蛋白mRNA及突变(mutant)亨廷顿蛋白mRNA。coHTT表示从密码子优化的合成亨廷顿蛋白基因转录的mRNA。重组GLAd4.coHTT.HTTmshR1/3向亨廷顿病的目标组织同时传递mshR及密码子优化的合成亨廷顿蛋白基因。
图6为示出本发明一实施例的重组GLAd向体内(in vivo)传递抗肌萎缩蛋白基因的图。
图6的a部分示出重组GLAd4.Dys的简要图。总长度(27.7kb)是指从5’ITR到3’ITR为止的长度。
图6的b部分示出动物实验的时间经过(time frame)。
图6的c部分示出在抗肌萎缩蛋白敲除MDX小鼠中检测抗肌萎缩蛋白的表达的结果。向MDX小鼠的局灶性腓肠肌(focal gastrocnemius muscle)注射PBS或50μl的GLAd4.Dys病毒(4×1010病毒颗粒)。4周后，作为野生型对照组，对注射PBS的MDX小鼠或者注射GLAd4.Dys病毒的MDX小鼠的肌肉组织进行活检，进行免疫荧光染色并使用共聚焦显微镜(confocal microscope)进行分析(倍率＝200倍；比例尺＝20μm)。
图7为示出本发明一实施例的制备pAdBest_dITR辅助质粒及pBest克隆穿梭质粒的图。
图7的a部分为作为Ad5的衍生物的Ψ5的简要图。E1及E3中的垂直虚线表示相应基因的实际缺失位置。还示出唯一存在的BamHI限制酶位点。
图7的b部分至e部分为示出pAdBest_dITR辅助质粒的制备过程的简要图。详细内容可在材料及实验方法中确认。
图7的f部分为示出pBest克隆穿梭质粒的结构的简要图。黑色及灰色框表示用于iHoA的5’及3’同源拉伸位点。
图8为示出本发明一实施例的构建pGLAd基因组质粒的图。详细内容可在材料及实验方法中确认。
图9为本发明一实施例的用于制备重组pGLAd_LacZ的iHoA的简要图。
图9的a部分中，黑色框表示PmeI限制酶位点，箭头表示PmeI限制酶位点的切割部分。将使用PmeI限制酶切割的pBest_LacZ与使用ClaI限制酶切割的pGLAd混合并进行iHoA。68bp及49bp分别表示pBest与pGLAd之间的5’及3’同源拉伸位点。
图9的b部分示出iHoA的中间产物。对齐的双链DNA(上部，图9的a部分)转变为单链DNA。通过此过程发生杂交退火，pBest_LacZ中的5’ITR、Ψ包装信号序列及LacZ表达盒移动至pGLAd基因组质粒。
图9的c部分为根据iHoA的完成得出的最终产物。退火的链在转化的细菌细胞内被完全修复。
图10为示出本发明一实施例的iHoA在重组pGLAd_X的制备中的效率的图。
图10的a部分示出在iHoA之后在琼脂平板上形成的细菌菌落。箭头符号表示包含具有正确潜在性的重组pGLAd_X质粒的小菌落。
图10的b部分为pGLAd_LacZ的限制酶图谱的简要图。E及B分别表示EcoRI限制酶及BamHI限制酶位点。数字表示相应限制酶位点的位置。
图10的c部分为菌落筛选结果。选择5个小菌落后，从每个菌落中纯化质粒。使用EcoRI限制酶切割每个质粒后在琼脂糖凝胶上进行分析。M为λHindIII大小标志物。
图10的d部分为进一步处理限制酶的结果。利用EcoRI限制酶及BamHI限制酶同时传递克隆体1及克隆体2。M为λHindIII大小标志物。
图11为示出本发明一实施例的对发生iHoA的同源拉伸位点进行序列验证的图。
图11的a部分示出iHoA的最终产物。涂色的箭头表示测序引物。黑色箭头表示当进行iHoA时用于pGLAd的线性化的ClaI限制酶位点(作为ClaI限制酶位点的5’-ATCGAT-3’在iHoA之后被破坏)的起始核苷酸。箭头符号表示用于iHoA的同源拉伸位点的末端。
图11的b部分及c部分为测序结果。方框表示与同源拉伸位点的连接点。箭头符号及箭头表示分别与图11的a部分中描述的内容对应的位置。
图12为示出本发明一实施例的制备作为新型基因组质粒的pGLAd3的图。
图12的a部分为小鼠E-钙粘着蛋白内含子2区(E-cadherin intron 2region)的简要图。垂直的黑色框表示E-钙粘着蛋白基因的外显子(exon)。水平线表示利用引物对(表20)获得的PCR产物。N、C及F1至F5为PCR产物的名称。水平线上的数字表示PCR产物的长度。
图12的b部分为pGLAd3的制备工艺的简要图。详细内容可在材料及实验方法中确认。
图12的c部分为pBest4克隆穿梭质粒的简要图。黑色及灰色框表示用于进行iHoA的5’及3’同源拉伸位点。MCS表示转基因的多克隆位点。
图13为示出本发明一实施例的在GLAd生产中使用的两种辅助物对腺病毒及RCA污染物的发生产生的影响的图。并示出在HEK293T或HEK293包装细胞中使用两种辅助物生产GLAd的简要图。同源重组可在涂色的框区中发生。RCA是指复制型腺病毒(replication-competent adenovirus)。
图14为示出本发明一实施例的从pGLAd3基因组质粒转变为pGLAd4基因组质粒的图。pGLAd3具有两个BssHII限制酶位点。使用BssHII限制酶切割pGLAd3并进行自结合。若此过程成功执行，则以星号标记的部分被删除，从而总长度从26597bp减少到16392bp。
具体实施方式
本发明涉及基于辅助质粒的无肠腺病毒(gutless adenovirus，GLAd)生产系统。
发明的实施方式
以下，通过下述实施例更详细地说明本发明。但是，这些实施例仅用于例示本发明，而本发明的范围并不限定于这些实施例。
材料及实验方法
试剂、试剂盒、实验用小鼠及常规的克隆技术
所有种类限制酶、Klenow片段(Klenow fragment)及使用HindIII限制酶切割的λ噬菌体DNA购自新英格兰生物实验室(New England Biolabs，马萨诸塞州，美国)。AnyFusion及Pfu聚合酶使用Genenmed(Genenmed，首尔，韩国)的产品。作为Ad5的一种的Ψ5之前已经报道过，因此使用了该产品。化学物质试剂购自西格玛(Sigma，密苏里州，美国)。杜贝克改良鹰培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)和胎牛血清(FetalBovine Serum，FBS)分别购自威健(Welgene，庆尚北道，韩国)和赛尔乐(CellSera，新南西州，澳大利亚)。作为化学感受态细胞(chemically competent)的XL-1Blue及DH10b从RBC(台北，中国台湾省)引进。人类抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因、密码子优化的(codon-optimized)人类亨廷顿蛋白(huntingtin)基因及mshRs在金斯瑞(GenScript，新泽西州，美国)合成。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)引物(primer)及合成寡核苷酸(synthetic oligo)购自Cosmogenetech(首尔，韩国)。核苷酸序列分析也在Cosmogenetech进行。T-blunt PCR克隆试剂盒(T-Blunt PCR cloning kit)和LaboPass Tissue GenomicDNA分离试剂盒分别购自SolGent(大田，韩国)和Cosmogenetech。用于柱层析的QSepharose XL及螯合Sepharose FF树脂(Chelating Sepharose FF resin)购自GE医疗(GEHealthcare，伊利诺伊州，美国)。Vivaspin Turbo超滤离心柱(Vivaspin Turboultrafiltration spin column，截留分子量(cut off)：100kDa)购自赛多利斯(Sartorius，哥廷根，德国)。核酸酶(Benzonase)购自默克(Merck，达姆施塔特，德国)。抗肌萎缩蛋白-敲除MDX(Dystrophin-knockout MDX，C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J)及野生型(wild-type)小鼠(C57BL/10J)购自杰克逊实验室(Jackson Laboratory，缅因州，美国)。抗肌萎缩蛋白抗体(ab15277)及亨廷顿蛋白抗体(sc-47757)分别从Abcam(剑桥，英国)及Santa CruzBiotechnology(加利福尼亚州，美国)引进。β-肌动蛋白抗体(Abc-2002)购自AbClon(首尔，韩国)。SuperSignal West Pico化学发光底物溶液(SuperSignal West PicoChemiluminescent Substrate solution)购自Fisher Scientific(新罕布什尔州，美国)。HEK293T及HEK293细胞购自ATCC(弗吉尼亚州，美国)。在DNA序列的克隆及操作中应用了通常所使用的通用DNA操作技术。
实施例1.pBest克隆穿梭质粒的制备
以pGT2质粒(序列63)作为模板并利用下列表的引物对，通过PCR获得与Kanr～ColE1区对应的DNA片段。
表1
序列 命名 序列表(5’->3’) 备注
1 KanColE1_1F GGGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGA
2 KanColE1_1R CTTGGCCGCAGCGGCCGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCA
在金斯瑞(GenScript)化学合成包含5’同源拉伸位点(homologous stretch)、5’末端反向重复序列(inverted terminal repeat，ITR)、Ψ5包装信号序列、CMV启动子、多克隆位点(multi-cloning site，MCS)、SV40poly(A)信号序列及3’同源拉伸位点的DNA片段(图7的f部分)。在该合成DNA的5’末端中包含SfiI限制酶位点，在3’末端中包含XcmI限制酶位点。利用SfiI及XcmI限制酶位点将上述PCR产物与合成DNA结合在一起来制备pBest质粒(序列64)。
实施例2.pAdBest_dITR辅助质粒的制备
利用下述引物对并通过与实施例1相同的方法获得PCR产物。
表2
序列 命名 序列表(5’->3’) 备注
3 KanColE1_2F CCCGGATCCGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGC
4 KanColE1_2R CCCGTATACATCGATTTAATTAAGAGCAAAAGGCCAGC
将PCR产物(Kan～ColE1区)用BamHI/BstZ17I限制酶切割后和与Ψ5基因组的BstZ17I～BamHI区对应的片段(序列65)结合来制备Ψ5-Left-Arm-1。接着，利用下述引物对并通过PCR制备从‘*’(星号(asterisk))标记开始到BstZ17I限制酶位点为止的DNA片段(序列66)(图7的a部分)后，将其与Ψ5-Left-Arm-1结合来制备Ψ5-Left-Arm-2。
表3
序列 命名 序列表(5’->3’) 备注
5 Cla_delE1_F GGGATCGATTTAAGGGTGGGAAAGAATATATAAG
6 BstZ_R CCCGTATACGGGGACACGGACAGCCTTTTCGTC
Ψ5-Left-Arm-2为与Ad5(5型腺病毒，GenBank AC_000008)的核苷酸的第1位至第3133位(包含5’ITR及Ψ包装信号序列的部分)对应的部位被去除的状态。
在Ψ5-Right-Arm-1(图7的c部分)制备中也使用下述引物对并通过PCR来准备与Kanr～ColE1区对应的DNA片段。
表4
序列 命名 序列表(5’->3’) 备注
7 KanColE1_3F TTAATTAAGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGC
8 KanColE1_3R CCCGGATCCATCGATTTAATTAAGAGCAAAAGGCCAGC
将PCR产物用BamHI限制酶切割后和与Ψ5基因组的BamHI～3’ITR区对应的DNA片段(序列67)结合。
为了减少腺病毒的基因组的大小，利用SpeI(27082)限制酶位点及NdeI(31089)限制酶位点以及下列表5的引物对并以AdΨ5作为模板，通过进行重叠PCR(overlapping PCR)来使在Ψ5基因组中部分剩余的E3区(partially remaining E3region)完全缺失。
表5
Figure GDA0003644711860000201
Figure GDA0003644711860000211
因此，在Ψ5-Right-Arm-2中与Ad5的核苷酸的第27864位至第31000位的部分被缺失。
然后，将与ClaI～BamHI区对应的DNA(序列69)从Ψ5-Left-Arm-2中分离并与Ψ5-Right-Arm-2结合来制备pAdBest(图7的d部分)。
通过如下步骤从pAdBest中去除3’ITR。
使用ClaI/EcoRI限制酶切割pAdBest后分离小片段，并将其与包含ClaI限制酶位点及EcoRI限制酶位点的下述接头缀合来制备pAdBest_EcoR_Cla。
表6
序列 命名 序列表(5’->3’) 备注
13 Cla_EcoR_S CGATCCGGAGGCCCTTG
14 Cla_EcoR_AS AATTCAAGGGCCTCCGGAT
接着，使用AvrII/RsrII限制酶切割pAdBest_EcoR_Cla来分离大片段。利用下述引物对并以pAdBest作为模板进行重叠PCR。
表7
序列 命名 序列表(5’->3’) 备注
15 Avr_F CTGCCTAGGCAAAATAGCACCC
16 Avr_dITR_R AACGATGTAAGTTTTAGGGCGGAGTAACTTGTATG
17 Avr_dITR_F GCCCTAAAACTTACATCGTTAATTAAGCAGTGGGC
18 Rsr_R TAGCGGTCCGCCACACCCAGCC
将PCR产物(序列70)用AvrII/RsrII限制酶切割后与使用AvrII/RsrII限制酶切割的pAdBest_EcoR_Cla的大片段结合。通过此过程制备将3’ITR完全从pAdBest中去除的pAdBest_EcoR_Cla_dITR。之后，将与pAdBest的ClaI～EcoRI区对应的大片段与pAdBest_EcoR_Cla_dITR的相应位点再次结合来制备pAdBest_dITR(序列71)(图7的e部分)。
实施例3.pGLAd基因组质粒的制备
利用下述引物对并以pAdBest作为模板进行重叠PCR。
表8
序列 命名 序列表(5’->3’) 备注
19 KanColE1_4F GGTTGGCGCGCCCTACGTCACCCGCCCCGTTCCCAC
20 KanColE1_4R CCCGAGCTCAAACTACATAAGACCCCCACCTTAT
将PCR产物(序列72)用SacI/AscI限制酶切割后与下述接头结合来制备pAdBestGL1(图8的a部分)。
表9
序列 命名 序列表(5’->3’) 备注
21 Sac_Pst_Avr_Asc_S CTTAACCTGCAGATCCTCCTAGGTTTTTGG
22 Sac_Pst_Avr_Asc_AS CGCGCCAAAAACCTAGGAGGATCTGCAGGTTAAGAGCT
使用ClaI限制酶切割pAdBestGL1并使用Klenow填充间隙后进行自结合，由此去除在pAdBestGL1中唯一存在的ClaI限制酶位点，通过此过程制备pAdBestGL1_dCla。将pAdBestGL1及pAdBestGL1_dCla分别用SacI/AvrII限制酶切割后与包含HpaI限制酶位点的下述接头(HpaI-site-containing adaptor，图8的b部分)结合来制备pAdBestGL2_wtCla及pAdBestGL2。
表10
Figure GDA0003644711860000221
接着，将HpaI使用限制酶切割的pAdBestGL2与使用HindIII限制酶切割的λ噬菌体DNA(箭头符号，图8的c部分)混合，并进行体外同源退火(in vitro homologousannealing，iHoA)来制备pAdBestGL3。将pAdBestGL3用SacI/ApaI限制酶或ApaI/AvrII限制酶切割后分别与下述SacI/ApaI接头(图8的d部分)或下述ApaI/AvrII接头(图8的e部分)结合来制备pAdBestGL4_3H及pAdBestGL4_5H。
表11
序列 命名 序列表(5’->3’) 备注
25 SacI/ApaI_S CATGGTTCCAAAATGCCCCTTAACCGGGTTGGGCC
26 SacI/ApaI_AS CAACCCGGTTAAGGGGCATTTTGGAACCATGAGCT
表12
序列 命名 序列表(5’->3’) 备注
27 ApaI/AvrII_S CATGGTTCCAAAATGCCCCTTAACCGGGTTC
28 ApaI/AvrII_AS CTAGGAACCCGGTTAAGGGGCATTTTGGAACCATGGGCC
通过连续去除在pAdBestGL4_3H中存在的ClaI限制酶位点来制备pAdBestGL4_3H_2dCla，具体地，将pAdBestGL4_3H用ClaI限制酶切割并使用Klenow填充间隙后进行自结合来转化为Dam-/-细菌细胞(Dam-/-bacterial cells)。使用ClaI限制酶切割作为产物的pAdBestGL4_3H_dCla并使用Klenow填充间隙后进行自结合来制备pAdBestGL4_3H_2dCla。通过类似的方式，使用ClaI限制酶切割pAdBestGL4_5H并使用Klenow填充间隙后进行自结合来制备pAdBestGL4_5H_dCla。接着，将与pAdBestGL4_5H_dCla的SacI～ApaI区对应的片段(5’半部)转移至使用SacI/ApaI限制酶切割的pAdBestGL4_3H_2dCla来制备pAdBestGL5(图8的f部分)。将pAdBestGL2_wtCla用HpaI限制酶切割后与使用SacI/AvrII限制酶切割的pAdBestGL5(图8的f部分)混合并进行iHoA来制备pAdBestGL(图8的g部分)。然后，将pAdBestGL用ApaI/NsiI限制酶切割后与骨架/基质附着元件(scaffold/matrixattachment，SMAR element)结合，最终制备pGLAd(序列73)，该骨架/基质附着元件是利用下述引物对并进行PCR制备而成(图8的h部分)。
表13
序列 命名 序列表(5’->3’) 备注
29 pGLAdSMAR_F TCTGGGCCCAAATAAACTTATAAATTGTGAGAG
30 pGLAdSMAR_R CCCATGCATATATTTAAAGAAAAAAAAATTGTA
实施例4.体外同源退火(in vitro homologous annealing，iHoA)
使用AnyFusion进行iHoA。将制造商的说明稍微修改后按该说明进行，整个过程为如下：在55℃的温度下培养10分钟，在室温下进一步培养20分钟。然后，将培养混合物转化到作为化学感受态细胞的XL-1Blue或DH10b细胞中，并铺展在包含抗生素的琼脂平板上。
实施例5.GLAd.LacZ及GLAd3.LacZ病毒的制备
使用PacI限制酶将pGLAd_LacZ或pGLAd3_LacZ质粒(10μg)线性化，将PacI活性热灭活(heat-inactivation)。利用磷酸钙沉淀法(calcium phosphate precipitationmethod)将该由PacI限制酶进行线性化而成的pGLAd_LacZ或pGLAd3_LacZ基因组质粒与30μg的pAdBest_dITR辅助质粒一起共转染到培养在100mm的培养皿中的HEK293T细胞中。培养6小时后，将培养基(10％的FBS)更换为新的培养基(5％的FBS)。48小时后，回收转染细胞及培养基(在此步骤中，培养基作为“病毒培养基”保管)，将细胞重悬于1ml的新的培养基(5％的FBS)中，重复3次冻结及解冻过程来粉碎(将透明的裂解物称为“病毒细胞裂解物”)。获得病毒细胞裂解物来感染HEK293细胞(仅使用GLAd病毒无法在HEK293细胞中扩增重组GLAd.LacZ及GLA3.LAZ病毒，因此无法在HEK293细胞内诱导裂解性细胞凋亡)。处理48小时后，为了表达LacZ，对细胞进行染色。
实施例6.LacZ染色
从HEK293细胞中去除培养基，在室温下用新鲜的固定液[包含2％的甲醛/甲醇(formaldehyde/methanol)及0.1％的戊二醛(glutaraldehyde)的PBS]固定细胞2分钟。用PBS小心洗涤细胞2次后，在37℃的温度下用染色溶液[包含1mg/ml的X-gal、2mM的氯化镁(magnesium chloride，MgCl2)、5mM的铁氰化钾(potassium ferri-cyanide)及5mM的亚铁氰化钾(potassium ferro-cyanide)的PBS]进行培养，直到LacZ染色足够。
实施例7.从小鼠尾部纯化基因组DNA
使用LaboPass组织基因组DNA分离试剂盒从C57BL/6J小鼠的尾部纯化基因组DNA。整个程序是将制造商的说明稍微修改后按该说明进行的。简而言之，将小鼠尾部组织(2×2mm的切片)在含有蛋白酶K(proteinase K)的裂解缓冲液中培养直至完全裂解。将以如此方式处理的试样与100％的乙醇混合并通过微型离心柱。吸附在柱滤器上的基因组DNA用两种洗涤缓冲液彻底洗涤并用蒸馏水洗脱。
实施例8.克隆小鼠E-钙粘着蛋白(E-cadherin)内含子2区(intron 2region)作为pGLAd3基因组骨架(genome backbone)
在PCR中将从小鼠尾部纯化的基因组DNA用作模板。引物对及序列记载在表20中。利用每个引物对及Pfu聚合酶(polymerase)进行45个循环的用于获得F1、F2、F3、F4或F5片段的PCR扩增(在95℃的温度下进行30秒钟，在60℃至65℃的温度下进行30秒钟，在72℃的温度下进行4分钟)。每个PCR产物被克隆到T-Blunt PCR克隆试剂盒的T-Blunt载体中。通过测序验证作为产物的T-F1、T-F2、T-F3、T-F4及T-F5(图12的b部分)是否正确制备。
实施例9.pGLAd3基因组质粒的制备
将从小鼠尾部纯化的基因组DNA用作PCR的模板，使用引物对N-F/N-R及C-F/C-R(表20)进行50个循环的重叠PCR(在95℃的温度下进行30秒钟，在62℃的温度下进行30秒钟，在72℃的温度下进行60秒钟)。通过在包含如BspEI、XhoI及NsiI等限制酶位点的NC片段PCR产物与使用SacI/AvrII限制酶切割的pGLAd(图12的b部分)之间进行iHoA来制备pGLAd_NC。然后，将pGLAd_NC用NsiI/XhoI限制酶切割后与退火的合成Nsi-Xho片段(表20)结合，从而制备将成为最终接受F12345片段的最终受体的pGLAd_NC_PU。与此同时，使用PacI限制酶切割，使用Klenow进行钝化(blunting)并进行自结合来制备T-F1_dPac，由此去除在T-F1中唯一存在的PacI限制酶位点。利用使用SfiI/SalI限制酶切割的T-F2和SM-F/SMAR-R引物(表20)并以pGLAd作为模板，与通过PCR制备的SMAR元件结合来制备T-F2_SMAR。然后，通过将使用NotI/RsrII限制酶切割的T-F1_dPac片段转移至使用NotI/RsrII限制酶切割的T-F2_SMAR中来制备T-F12。使用PvuI限制酶切割并使用Klenow进行钝化(blunting)来热灭活后，将进一步使用PciI限制酶切割的T-F4片段用SpeI限制酶切割并使用Klenow进行钝化来热灭活后，转移至进一步使用PciI限制酶切割的T-F3片段中，从而制备T-F34。通过将与T-F5的MluI～XbaI区对应的片段与使用SpeI/MluI限制酶切割的T-F34结合来制备T-F345(SpeI限制酶位点可与XbaI限制酶位点结合)。通过将与T-F12的SalI～RsrII区对应的片段转移至SalI/RsrII使用限制酶切割的T-F345中来制备T-F12345。最终，通过在使用PstI限制酶切割的pGLAd_NC_PU与使用XhoI限制酶切割的T-F12345之间进行iHoA来制备pGLAd3(序列74)。在制备程序的所有步骤中，通过测序验证各产物是否正确制备。
实施例10.pBest4克隆穿梭质粒的制备
该质粒的pCAG部分利用下述引物对并通过PCR制备后使用AseI限制酶及BsaI限制酶切割来准备。
表14
序列 命名 序列表(5’->3’) 备注
31 pCAG_F GTTATTAATAGTAATCAATTACG
32 pCAG_R CTTGGGTCTCCCTATCGCCCGCCGCGCGCTTCGCTTTTTATAGG
β-珠蛋白内含子区同样使用下述引物对并进行PCR制备后使用BsaI限制酶及HindIII限制酶切割来准备。
表15
序列 命名 序列表(5’->3’) 备注
33 bGint_F GGCGATAGGGAGACCCAAGCTGGTGAGTTTGGGGACCC
34 bGint_R GGGAAGCTTGGGTCCCCTGTAGGAAAAAGAAGAAGGCATGAAC
通过将使用AseI/HindIII限制酶切割的pBest与上述制备的这些PCR产物结合来制备pBest4(序列75)穿梭质粒。
实施例11.噬菌斑测定(Plaque assay)
对将Ad.LacZ病毒[作为第一代腺病毒(adenovirus，Ad)阳性对照组；1×103感染性病毒颗粒]、GLAd3.LacZ病毒[1.12×107至1.80×107blue-forming units(BFU)]或辅助质粒单独转染到在100mm的培养皿中培养的HEK293细胞[80％至90％的汇合度(confluency)]中后准备的HEK293T细胞裂解物(表18)进行处理。24小时后，去除培养基，用包含琼脂糖(0.3％)的12ml的灭菌培养基小心地覆盖后，在CO2培养箱中培养10天至15天。分取10ml的稀释的MTT溶液并加入琼脂糖层中，培养5小时。然后，在灯箱上计数病毒噬菌斑。
实施例12.pAd5pTP表达质粒的制备
以AdΨ5DNA作为模板并利用下述引物对，并进行PCR来获得5型腺病毒(Adenovirus type 5，Ad5)的pTP基因。
表16
Figure GDA0003644711860000241
序列21的序列表的粗体部分为HindIII限制酶位点。
序列22的序列表的粗体部分为EcoRI限制酶位点。
PCR进行40个循环(在95℃的温度下进行30秒钟，在60℃的温度下进行30秒钟，在72℃的温度下进行120秒钟)。通过将PCR产物用HindIII限制酶及EcoRI限制酶切割并将pLV_VSVG_XL用HindIII限制酶及EcoRI限制酶切割后克隆到准备的pLV_XL质粒中来制备pAd5pTP(序列76)表达质粒。
实施例13.重组GLAd的大量生产
在重组GLAd的大量生产中利用了应用于现有GLAd的生产并作为标准生产方法提出的连续扩增方法。具体地，使用磷酸钙沉淀法将10μg的pGLAd3_LacZ(用PacI限制酶进行线性化后进行热灭活)、30μg的pAdBest_dITR及2.5μg的pAd5pTP的混合物转染到培养在100mm的培养皿中的HEK293T细胞[50％至70％的汇合度(confluency)]中。培养6小时后，将培养基(10％的FBS)更换为新的培养基(5％的FBS)。48小时后，回收转染的细胞，重悬于1ml的新的培养基(5％的FBS)中后，循环重复3次的冻结及解冻来粉碎，获得(rescue)GLAd3.LacZ病毒(P0阶段GLAd)。在扩增第一阶段(P1)的情况下，利用磷酸钙沉淀法将45μg的pAdBest_dITR及3.75μg的pAd5pTP的混合物转染到培养在100mm的培养皿中的HEK293T细胞(50％至70％的汇合度)。培养6小时后，将培养基(10％的FBS)更换为包含P0阶段GLAd的新的培养基(5％的FBS)。48小时后，转染的细胞及培养基(在此步骤中，培养基作为“病毒培养基”保管)，将转染的细胞重悬于1ml的新的培养基(5％的FBS)中后，循环重复3次的冻结及解冻来粉碎(将透明的裂解物称为“病毒细胞裂解物”)。获得病毒细胞裂解物并与病毒培养基(共10ml)混合，并用于感染HEK293T细胞(在10×150mm的培养皿中培养)，以进行下一步扩增(P2)(参照图3)。GLAd的生产规模可通过额外的扩增(P3、P4、P5等)来扩大。每个扩增步骤的流程图、获得的病毒的滴度(titer)、所需的细胞培养皿数量、所需的辅助质粒及pAd5pTP质粒的量详见图3。
实施例14.在GLAd的生产中所生成的腺病毒及RCA污染物的扩增
与GLAd不同，腺病毒及RCA可以在HEK293细胞自我复制。因此，Ad.LacZ(阳性对照组)或GLAd3.LacZ(P3，3×109BFU；P4或P5，1×108BFU)感染HEK293细胞后，作为也可能存在于GLAd3.LacZ的潜在污染物的腺病毒及RCA被允许通过一步扩增(对于P4或P5)或三步扩增进行复制，或者阳性对照组被允许几乎通过两步扩增进行复制。由于GLAd3.LacZ的MOI(感染的多样性，multiplicity of infection)数值过高而使LacZ过表达，可以使感染的细胞凋亡，因此，在GLAd3.LacZ(P3，3×109BFU)的早期感染中使用两个150mm细胞培养皿。为了分解在P3、P4或P5GLAd3.LacZ的制备中持续使用的辅助质粒而使用核酸酶(Benzonase)(辅助质粒包含基于PCR的分析所需的目标基因。但是，包装在病毒衣壳内的病毒DNA不会被核酸酶分解)。为了确认核酸酶处理是否可能影响腺病毒及RCA的本身的感染性，对阳性对照组(Ad.LacZ)也处理核酸酶。在各扩增步骤中，将HEK293细胞用相应病毒感染后，72小时后获得。将这些细胞以1ml(对于100mm的培养皿)或2.5ml(对于150mm的培养皿)的体积进行重悬，循环重复3次的冻结及解冻来粉碎(将粉碎的裂解物称为“病毒细胞裂解物”)。将各病毒细胞裂解物用于进一步扩增，最终一起获得细胞裂解物及培养基。在这种扩增过程中，利用显微镜确认细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)(整个程序参照图4的a部分及c部分)。
实施例15.利用PCR分析污染物腺病毒及RCA
将利用HEK293细胞获得的连续扩增(图4的a部分及c部分)的产物作为试样，在95℃的温度下对该试样进行热处理后[若省略此步骤，则HEK293细胞的内源性(endogenous)脱氧核糖核酸酶(DNase)将分解为了分析而进一步包含于试样中的(spiked)Ad5DNA]，利用PCR方法对不存在于GLAd基因组或HEK293细胞中但在腺病毒及RCA中存在的fiber基因的N-末端DNA进行分析。使用Ad5DNA(10pg，AdΨ5DNA)作为PCR的阳性对照组。Ad.LacZ试样在稀释之前或稀释100倍后进行PCR，以仅包含500个病毒颗粒。在存在或不存在(spiked)Ad5DNA(10pg)的条件下，通过PCR进行扩增。利用Pfu聚合酶及下述引物对进行40个循环(在95℃的温度下进行30秒钟，在60℃的温度下进行30秒钟)的PCR，利用琼脂糖凝胶电泳(agarosegel electrophoresis)分析结果(图4的b部分及d部分)。
表17
序列 命名 序列表(5’->3’) 备注
37 Ad5Fiber_F CGCGCAAGACCGTCTGAAGATACC
38 Ad5Fiber_R GGCCTGATGTTTGCAGGGCTAGC
实施例16.pGLAd4基因组质粒的制备
pGLAd3具有两个BssHII限制酶位点(图14)。使用BssHII限制酶切割pGLAd3后进行自结合来制备pGLAd4(序列77)，这样长度就从26597bp(pGLAd3)减少到16392bp(pGLAd4)。完成后，通过BssHII限制酶位点测序验证产物是否正确制备。
实施例17.亨廷顿蛋白(huntingtin)mshR表达质粒的制备
之前在其他论文中描述了被确认为运行良好的mshR表达用模板。基于该模板的保守序列及结构特性，合成相应的DNA(表21)，利用BamHI限制酶位点及EcoRI限制酶位点克隆到pGT2质粒(序列63)中。
实施例18.通过mshR的内源性(endogenous)亨廷顿蛋白的表达的敲低(knockdown)
分别用15μg的pGT2、pGT2-mshR1、pGT2-mshR2或pGT2-mshR3转染培养在100mm的培养皿中的HEK293T细胞。48小时后，获得未处理对照组及转染细胞，对内源性亨廷顿蛋白的表达进行蛋白质印迹(Western blotting)分析。
实施例19.蛋白质印迹(Western blotting)
将利用RIPA裂解缓冲液制备的全细胞裂解物(whole-cell lysate)在SDS凝胶上根据分子量进行分离后转移至硝酸纤维素膜上。在室温下将该膜使用Blotto A溶液(TBST，5％的牛奶)封闭培养1小时，在4℃的温度下，装到包含第一抗体(1：500至1：1000)的BlottoB溶液(TBST，1％的牛奶)中培养过夜。用TBST[TBS，0.05％的Tween-20；TBS(Tris-bufferedsaline)：10mM的Tris-Cl(pH 8.0)，150mM的氯化钠(NaCl)]洗涤5分钟一次后，将硝酸纤维素膜装到包含HRP-偶联第二抗体的Blotto B溶液(1：5000至1：100000)中，在室温下培养2小时。用TBST洗涤两次，每次洗涤5分钟后，对膜处理SuperSignal West Pico化学发光底物溶液(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate solution)短时间，使用生物成像系统(Bio Imaging System)分析所生成的图像。
实施例20.pGLAd4_HTTmshR1/3的制备
利用合适的引物对(表22)并以pGT2-mshR1或pGT-mshR3作为模板进行PCR来准备包含pCMV、mshR及BGHpA部分的HTTmshR1及HTTmshR3(图5的d部分)。分别通过iHoA向使用Acc65I限制酶切割的pGLAd4中插入HTTmshR1并向使用PciI限制酶切割的pGLAd4中插入HTTmshR3来制备pGLAd4_HTTmshR1/3(图5的f部分)。然后，通过Acc65I及PciI限制酶位点的相邻区测序验证产物是否正确制备。
实施例21.pGLAd4_coHTT.HTTmshR1/3及pGLAd4_coHTT(R).HTTmshR1/3的制备
将包含Q22的全长(full-length)密码子优化的合成亨廷顿蛋白(huntingtin)基因(9.4kb)以各自不同排列方向克隆到pBest4穿梭质粒中。根据已经建立的标准程序，将使用PmeI限制酶切割的pBest4_coHTT或pBest4_coHTT(R)与使用ClaI限制酶切割的pGLAd4_HTTmshR1/3混合并进行iHoA。通过此iHoA过程制备pGLAd4_coHTT.HTTmshR1/3(序列78)或pGLAd4_coHTT(R).HTTmshR1/3。通过测序验证是否正确制备。
实施例22.重组GLAd4.coHTT.HTTmshR1/3及GLAd4.coHTT(R).HTTmshR1/3病毒的生产
应用与重组GLAd.LacZ及GLAd3.LacZ病毒的生产中所使用的程序相同的程序生产。
实施例23.重组GLAd4.Dys病毒的纯化
重组GLAd4.Dys病毒的生产如图3所示，尤其从P3纯化。利用两种基于色谱柱的色谱法并将先前报道过的方法稍微修改来进行纯化。简而言之，将病毒细胞裂解物和获得的培养基混合(P3)处理核酸酶后，过滤，进行作为纯化的第一步的Q Sepharose柱层析(QSepharose column chromatography)。洗涤后，将吸附的病毒洗脱，用缓冲液稀释，加载到层析柱(Zn-chelated chromatography column)中。充分洗涤柱后，将吸附的病毒洗脱，利用Vivaspin Turbo超滤离心柱(Vivaspin Turbo ultrafiltration spin column)同时进行变更为制剂缓冲液(formulation buffer)的缓冲液变更及病毒的浓缩。之前已经描述了制剂缓冲液。
实施例24.GLAd4.Dys病毒颗粒的测定
利用重组GLAd4.Dys病毒将病毒裂解缓冲液[virus lysis buffer，0.1％的SDS，10mM的Tris-Cl(pH 7.4)，1mM的EDTA]连续稀释所纯化的重组GLAd4.Dys病毒，轻轻摇动并在56℃的温度下培养10分钟。接着，测定OD260，利用下述数学式计算病毒颗粒的浓度：
[数学式]
病毒颗粒(VP/ml)＝OD260×病毒稀释因子(virus dilution factor)×(1.1×1012)
在此计算中，空白溶液(blank solution)由病毒裂解缓冲液和病毒制剂缓冲液(formulation buffer)混合而成。使用已确定的消光系数(extinction coefficient)：
[消光系数]
OD260 1单位＝1.1×1012VP/ml。
实施例25.动物实验
所有动物实验均按照由庆北大学(大邱，韩国)的实验动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准的程序(KNU2018-0134)进行。将8周龄雄性野生型对照组小鼠(C57BL/10J)及抗肌萎缩蛋白敲除MDX小鼠(dystrophin-knockout MDX mice，C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J)在12小时明暗循环(cycle)下饲养，根据庆北大学的大学动物设施规定，使动物自由摄取水。将PBS(n＝3)或50μl的重组GLAd4.Dys病毒(4×1010颗粒)(n＝3)对MDX小鼠的局灶性腓肠肌(focal gastrocnemiusmuscle)进行肌肉内注射，4周后，对肌肉组织试样进行活检和分析。
实施例26.免疫荧光染色(Immunofluorescence staining)
通过将先前报道过的方法稍微修改来对抗肌萎缩蛋白(dystrophin)进行免疫荧光染色。将采集的肌肉组织在4℃的温度下用包含4％的PFA的PBS固定过夜。接着，将组织在4℃的温度下用包含5％的蔗糖(sucrose)的PBS培养6小时，在4℃的温度下用包含20％的蔗糖的PBS培养过夜。将以如此方式处理的组织包埋在OCT混合物中，浸渍到用液氮冷却的异戊烷(isopentane)中并进行冻结后，在-70℃的温度下保管。将其切成4微米(micron)厚的切片后，在PBS中放置10分钟后，在室温下用PBST(包含0.1％的Triton X-100的PBS)洗涤三次，每次洗涤10分钟。将组织切片在4℃的温度下用包含10％的马血清的PBST封闭培养过夜，与抗肌萎缩蛋白抗体(与封闭培养缓冲液以1：100的比例稀释)一起在4℃的温度下养过夜后，在室温下用PBST洗涤三次，每次洗涤10分钟。最后，将组织切片在4℃的温度下与TRITC-偶联第二抗体(与封闭培养缓冲液以1：100的比例稀释)一起培养过夜，在室温下用PBST洗涤三次，每次洗涤10分钟。染色的组织切片用包含DAPI的封固剂(mounting medium)覆盖后，在共聚焦显微镜(confocal microscope)下进行分析。
结果
pAdBest_dITR辅助质粒及pGLAd基因组质粒的制备，以及它们在GLAd生产中的应用
目前最广泛使用的辅助腺病毒在Ψ包装信号序列的两侧包含loxP位点(图1的a部分)。由于其结构特性，该辅助腺病毒在表达同源重组酶Cre的包装细胞中在降低对腺病毒的污染的同时可有效生产重组GLAd。但是，在这种精巧的生产系统中也无法避免辅助腺病毒的污染。尤其，在该系统中没有对RCA进行细致的分析，但在该系统中，由于在辅助腺病毒与包装细胞之间共同存在的E1区中的同源重组，可以生成RCA。因此，本发明人假设通过去除参与同源重组的区域并将辅助腺病毒转化为辅助质粒来防止在GLAd的制备中产生腺病毒及RCA污染物。为了实现这种目的，本发明人尝试制备一种辅助质粒，该辅助质粒在提供GLAd包装所需的病毒蛋白的同时不转化为腺病毒颗粒，也不生成RCA。
在不需要辅助腺病毒的本发明人的重组GLAd生产系统中需要两个独立地质粒：一个为在GLAd包装中起到辅助作用的辅助质粒，另一个为起到GLAd基因组作用基因组质粒。
本发明人制备pAdBest_dITR(～31kb)作为pAdBest_dITR(～31kb)(图7)。考虑到由重叠转录单位(overlapping transcription units)及单个启动子形成的多个转录体(图1的b部分)等特性，该辅助质粒通过适当加工作为Ad5的衍生物(图7的a部分)的Ψ5基因组来制备。该辅助质粒不具有在腺病毒包装(packaging)中绝对必要的ITR和Ψ包装信号序列(图1的c部分)。因此，该辅助质粒仅起辅助作用，不可能转化为活性腺病毒颗粒。在该辅助质粒的制备过程中，5’ITR及Ψ包装信号序列被转移至作为用于转基因的克隆的穿梭质粒的pBest(图7的f部分)。
本发明人制备pGLAd作为GLAd基因组质粒(图1的c部分)。该pGLAd由源自λ噬菌体(lambda phage)的填充DNA(stuffer DNA，仅用于长度匹配的DNA)组成，其中仅包含两个Ad5的ITR中的3’ITR。添加骨架/基质附着元件(scaffold matrix attachment，SMAR)的目的在于，在提高细胞内转基因的表达的同时使GLAd基因组稳定(整个制备过程参照图8)。
通常，将转基因插入如pGLAd基因组质粒(～27kb)等大型质粒是一个耗时且难以成功的过程。为了使此过程快速简便进行，在制备pBest及pGLAd质粒的过程中将短的同源拉伸位点(homologous stretches)添加到这些质粒中。实际上，这些同源拉伸位点使转基因表达盒(cassette)从pBest快速移动至pGLAd。
作为此过程的一个例子，首先将LacZ基因克隆到pBest中，然后利用切割稀有位点的限制酶(rare-cutting enzyme)PmeI进行线性化(图9的a部分)。同时，pGLAd也在作为唯一限制酶位点的ClaI位点被切割而被线性化。混合线性化的这些pBest_LacZ及pGLAd，处理能够将双链(double-stranded)DNA转化为单链(single-stranded)DNA的核酸酶(nuclease)AnyFusion，从而能够在体外使线性化的同源区有效退火(将体外同源退火的整个过程称为“iHoA”)(图9的b部分)。由于在体外退火的同源拉伸位点的长度提供充分的稳定性，因此即使在这种未修复状态下转化细菌细胞也没有任何问题。作为这种程的产物制备的重组pGLAd_LacZ质粒恢复了所有ITR及Ψ包装信号序列，切割稀有位点的PacI限制酶位点(rare-cutting PacI restriction sites)位于ITR的外侧面(图9的c部分)。在此整个过程中将转基因表达盒快速有效移动至pGLAd基因组质粒。此外，在转化步骤中，观察到包含所期望的正确pGLAd_LacZ质粒的细菌细胞比包含不期望的种类的质粒的细菌细胞形成大小显著小的菌落(图10的a部分)。可以用肉眼确认的该特征使得可以非常快速地完成找到正确克隆(clone)所需的筛选过程(图10的b部分至d部分)。完成此整个过程后，在连接所制备的重组pGLAd_LacZ质粒的同源拉伸位点(homologous stretch)的连接处进行测序。核苷酸序列与同源拉伸位点完美匹配(图11)，表明iHoA按最初设计的方式进行。
完成pAdBest_dITR辅助质粒及重组pGLAd_LacZ基因组质粒的制备后，本发明人测试了基于这两种质粒的重组GLAd生产系统是否工作。HEK293T细胞使用pAdBest_dITR辅助质粒及通过PacI限制酶处理被线性化的pGLAd_LacZ基因组质粒共转染(图1的d部分及e部分)。共转染的HEK293T细胞成功地产生了重组GLAd.LacZ病毒(图1的e部分)，其结果证明了与重组GLAd产生有关的所有质粒及工艺都按照最初设计的方式完美进行。
新型基因组质粒pGLAd3的制备
有趣的是，据报道，用于GLAd的填充DNA的特性会对转基因的表达产生负面影响。尽管争议尚未完全解决，但已经表明特别是源自λ噬菌体的填充DNA具有这种特性。尽管如此，在本发明人开始本发明的初期，使用λDNA作为填充物，这因为有必要快速确认质粒制备过程的设计是否正确，并优先确认基于辅助质粒的GLAd生产系统是否也按设计工作。如上所示，现在已经清楚地证实GLAd生产系统按设计工作，因此本发明人准备了一种新的填充DNA，目的是解决λ填充DNA可能减少转基因表达的担忧。本发明人从小鼠E-钙粘着蛋白(E-cadherin)内含子2区中克隆了几个基因组片段(图12的a部分)，以制备pGLAd3作为新的GLAd基因组质粒(图2的a及图12的b部分)。本发明人还制备了另一种克隆穿梭质粒pBest4(图12的c部分)，其通过向新型pBest4添加强CAG启动子和内含子进一步提升了性能。与利用pBest和pGLAd的原始系统一样，用LacZ基因测试的基于pBest4及pGLAd3的新系统也表现出细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)(图2的b部分)，并有效生产重组GLAd3.LacZ病毒(表18，图2的b部分及c部分)，这些结果表明pCAG、内含子、iHoA及GLAd包装等元素以及与GLAd制备有关的所有程序均按照设计正常进行。与此形成鲜明对比的是，单独用pAdBest_dITR辅助质粒转染的HEK293T细胞不产生任何病毒颗粒(表18)。此外，通过本发明人的基于双质粒的(two-plasmid-based)系统生产的重组GLAd不含如腺病毒或RCA等任何其他病毒(表18)。因此，很明显，本发明人的辅助质粒仅为GLAd包装提供辅助功能，不能转化为活性病毒颗粒。进而，这种结果意味着本发明人的辅助质粒不会生成RCA(图13)，这是起因于其结构特征的(图2的d部分)。
GLAd的大量生产(large-scale production)
在GLAd大量生产中，已经建立和优化的标准生产方法伴随着一系列扩增过程(图3的a部分)。由于GLAd只能在辅助腺病毒存在的条件下进行扩增，因此在该标准生产方法中，必须当每次进行扩增步骤时添加新的辅助腺病毒。种子GLAd(seed GLAd)重复扩增4～6次，最后利用大量培养的细胞(～1×109细胞)进行扩增。通过整个扩增过程容易生产约～1×1012BFU[～1000BFU/cell；BFU是指通过LacZ染色确认的蓝色形成单位(blue-formingunits)]。能够以如此高的收率获得GLAd的原因是因为使用了一种提供充分量的GLAd包装及扩增所需的病毒蛋白的可自我复制的辅助腺病毒(replicable helper adenovirus)。
在利用辅助质粒大量生产GLAd的尝试中，本发明人应用了用于大量生产GLAd的现有标准扩增程序，即使辅助质粒无法在GLAd包装细胞内自我复制。本发明人已经表明了通过同时转染辅助质粒及由PacI限制酶进行线性化而成的GLAd基因组质粒来生产种子GLAd(～2×107BFU/100mm的培养皿)(表18)。该种子GLAd容易被辅助质粒扩增，虽然扩增效率没有被优化，但被扩增GLAd的量随扩增步骤成比例增加(未显示数据)。
其他研究人员先前的研究已经证实，在将如E1A、pTP及IVa2等腺病毒蛋白单独或组合来进一步表达的情况下，可增加腺病毒的生产。因此，为了提高GLAd生产中的扩增效率，本发明人将这些腺病毒蛋白单独测试或通过组合来进行测试。其中，只有末端蛋白前体(precursor terminal protein，pTP)在进一步表达时使GLAd生产量增加高达4倍(未显示数据)。并且，本发明人证实，与之前的实验相比，使用更高量的辅助质粒(在100mm的培养皿中使用45μg而不是30μg)可以在GLAd生产中获得更高的收率(虽然不是在P0，但在P1及之后的扩增中是这样；未显示数据)。
与利用辅助腺病毒的现有扩增程序相似，在每个扩增步骤中，将pAdBest_dITR辅助质粒及pTP-表达质粒共转染到HEK293T包装细胞中。通过优化，本发明成功建立了可利用辅助质粒大量生产GLAd的标准工艺(图3的b部分)。P3可轻松地生产约5×1010至1×1011BFU(50～100BFU/cell)，这相当于比使用可自我复制的辅助腺病毒的现有大量生产方法仅低约10～20倍的收率(即，利用可自我复制的辅助腺病毒的现有方法：利用辅助质粒的新型方法＝1×1011至2×1011BFU：1×1010BFU)。根据此计算预想到P5可从1×1011细胞生产约5×1012至1×1013BFU。
在GLAd生产过程中没有生成腺病毒及RCA污染物
在GLAd生产中预防腺病毒和RCA污染是考虑GLAd临床应用的一个非常重要的因素。本发明人已经表明可以通过用辅助质粒及由PacI限制酶进行线性化而成的GLAd基因组质粒的共转染来生产GLAd，并且三个独立的GLAd生产中没有一个包含腺病毒和/或RCA(表18)。尽管如此，本发明人在规模足够大以可能在未来临床使用的GLAd试样(P3、P4或P5)中(图3)再次更细致地分析了腺病毒和RCA。
用作阳性对照的腺病毒(Ad.LacZ)在HEK293细胞中被有效扩增(图4的a部分)。即使只有一种感染性病毒颗粒(1infectious viral particle，1BFU)，通过少于两次完整时间的扩增步骤也会生成～5×105BFU。由于这种强大的扩增活性，腺病毒引起用肉眼容易观察到的严重CPE。这些结果表明，在GLAd试样中仅存在一种感染性腺病毒(或者RCA)污染物颗粒，只需几次扩增步骤即可产生无数病毒颗粒。因此，本发明人分析了含有3×109BFU的P3GLAd3.LacZ(图3)(图4的a部分)。将GLAd3.LacZ感染到HEK293细胞中后，如果该试样中存在腺病毒和RCA，则将它们扩增3次以充分生成。由于该扩增条件足以使1BFU生成5×105BFU以上，因此第三个扩增步骤可能会导致HEK293细胞中的严重CPE。然而，在这种扩增过程中完全没有观察到CPE。同样，基于PCR的分析也无法检测到任何腺病毒种(腺病毒及RCA)(图4的b部分)。本发明人的这一系列实验结果表明，P3GLAd(包含至少3×109BFU)试样不包含腺病毒和/或RCA污染物。
此外，本发明人分析了在P4及P5GLAd3.LacZ试样(分别包含1×108BFU)中是否也存在腺病毒及RCA污染。首先，如前所述(图3)，分别利用P3及P4GLAd准备P4及P5GLAd。核酸酶(Benzonase)虽然有效去除辅助质粒但不能去除由衣壳保护的腺病毒或RCA，因此，首先将用核酸酶预处理的P4或P5GLAd(P4试样从P3扩增一次来准备，P5试样从P3扩增两次来准备)感染到HEK293细胞中，进一步扩增，从而可以使可能具有存在潜在性的腺病毒及RCA扩增(图4的c部分)。正如先前在P3GLAd中证实的那样，通过P4及P5中的PCR分析无法检测到腺病毒种(腺病毒及RCA)(图4的d部分)。总之，本发明人获得的结果清楚地表明，基于辅助质粒的GLAd生产系统不生成任何不需要的作为污染物的腺病毒和/或RCA。
作为有效体外(in vitro)及体内(in vivo)基因传递载体的新型GLAd
由于上述所有工作都成功，本发明人接下来测试了重组GLAd是否确实在体外(invitro)及体内(in vivo)进行了良好的基因转移。为此，本发明人选择亨廷顿蛋白(huntingtin，9.4kb)及抗肌萎缩蛋白(dystrophin，11kb)作为目标转基因，因为其他病毒载体很难传递这些长基因，并且基因疗法长期以来一直被视为与这些基因相关的疾病[亨廷顿病，Huntington disease(HD)及假肥大性肌营养不良，Duchenne muscular dystrophy(DMD)]的治疗选择。
为了良好地包装到病毒颗粒中，GLAd基因组大小应在27kb至37.8kb范围内，从5’ITR到3’ITR为止的长度相当于原始基因组大小的75％至105％。因此，本发明人首先将pGLAd3转化为pGLAd4以减少pGLAd3的长度，因为当长基因插入pGLAd3基因组质粒时，基因组长度接近病毒包装的上限(图14)。
显性遗传的亨廷顿病是一种致命的神经退行性疾病，由亨廷顿蛋白基因(huntingtin)中poly-CAG(指定谷氨酰胺的密码子)的重复扩增引起。亨廷顿病患者体内有一个这种突变基因的复制(copy)，因此当突变亨廷顿蛋白的表达被反义寡核苷酸或RNAi抑制时，病情可以得到改善。重要的是，虽然亨廷顿蛋白在成年神经细胞中发挥的正常功能仍然未知，但它对早期胚胎发育至关重要(亨廷顿蛋白敲除小鼠在胚胎阶段死亡)。并且，显示具有正常功能的野生型(wild-type)亨廷顿蛋白的过度表达可降低突变亨廷顿蛋白的细胞毒性。这些结果表明，在评估与亨廷顿病治疗相关的治疗效果时，相比于仅单独传递亨廷顿蛋白基因，RNAi及亨廷顿蛋白基因的同时传递可能是更合适的重组GLAd。
在RNAi的情况下，本发明人选择基于miRNA的shRNA(以下，mshR)代替常规shRNA来抑制亨廷顿蛋白的表达，因为在亨廷顿蛋白的敲低方面，mshR被证明比shRNA对个体更安全。本发明人选择了三个目标位点(图5的a部分)，它们在之前的其他研究中已经被证实确实地工作，并使用合成mshR(图5的b部分，表21)及pGT2质粒(图5的c部分)来制备mshR表达体。正如预期的那样，将这些每个表达体转染到HEK293T细胞中的结果，内源性(endogenous)亨廷顿蛋白的表达减少(图5的d部分)。因此，使用利用适当引物对(表22)的PCR，将能够表达mshR1和mshR3的两个mshR表达盒插入到pGLAd4基因组质粒中。在亨廷顿蛋白基因的情况下，必须考虑到poly-CAG重复是野生型与突变亨廷顿蛋白基因之间的唯一区别。因此，敲低接近法方法可以同时减少内源性野生型及突变亨廷顿蛋白的表达。因此，本发明人为了减轻对可能由内源性野生型亨廷顿蛋白的表达减少引起的任何不良毒性的担忧，以补偿内源性野生型亨廷顿蛋白的减少量，为了防止mshR影响其表达，使用了密码子优化的合成亨廷顿蛋白基因(图5的e部分)。本发明人利用iHoA成功地将密码子优化的合成基因表达盒以不同的排列方向插入到其中已经插入了mshR1及mshR3表达盒的pGLAd4基因组质粒中(图5的f部分)。接着，生产GLAd4.coHTT.HTTmshR1/3(图5的g部分)及GLAd4.coHTT(R).HTTmshR1/3病毒。
GLAd4.coHTT.HTTmshR1/3病毒过表达亨廷顿蛋白，而GLAd4.coHTT(R).HTTmshR1/3病毒抑制内源性亨廷顿蛋白的表达(图5的h部分)。本发明人的这项研究结果表明，重组GLAd成功地将mshR和密码子优化的合成亨廷顿蛋白基因(总长度为～13kb)同时传递到细胞中(图5的i部分)。该重组GLAd具有用作治疗亨廷顿病的基因疗法的潜在性，目前正在进行进一步的临床应用研究。
除了传递如亨廷顿蛋白基因等长基因的重组GLAd之外，本发明人还成功构建了用于长度短的转基因的重组GLAd，该转基因例如，因子IX[factor IX，用于治疗B型血友病(hemophilia B)的R338L Padua突变体基因]、葡萄糖脑苷脂酶[glucocerebrosidase，GCR，用于治疗戈谢病(Gaucher`s disease)的基因]、氨基己糖苷酶A[hexosaminidase A，HEXA，用于治疗家族黑蒙性痴呆(Tay-Sachs)的基因]、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1[hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，HPRT1，用于治疗自毁容貌综合症(Lesch-Nyhan syndrome)的基因]、2-硫酸酯酶[iduronate-2-sulfatase，IDS，用于治疗亨特综合症(Hunter syndrome)的基因]、甲基化CpG结合蛋白2[methyl-CpG-binding protein 2，MECP2，用于治疗瑞特综合症(Rett syndrome)的基因]及运动神经元1存活因子[survivalof motor neuron 1，SMN1，用于治疗脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)的基因]。这些每个重组GLAd已被证实在体外有效过表达转基因(未显示数据)，目前正在对其临床应用可能性进行验证。
体内研究是通过生产传递抗肌萎缩蛋白基因(dystrophin gene，～11kb)的重组GLAd进行的，该基因为假肥大性肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)的靶点。首先，将人类抗肌萎缩蛋白基因克隆到pBest4，通过iHoA制备重组pGLAd4_Dys质粒后，生产了重组GLAd4.Dys病毒(图6的a部分)。然后，将GLAd4.Dys病毒注射到抗肌萎缩蛋白敲除MDX小鼠(dystrophin-knockout MDX mice)的局灶性腓肠肌(focal gastrocnemius muscle)。4周后(图6的b部分)对注射部位的肌肉组织进行活检，并分析是否表达抗肌萎缩蛋白。由此可清楚地确认重组GLAd4.Dys病毒在目标组织中表达抗肌萎缩蛋白的这一事实。虽然无法确认对疾病状态的改善程度(与人类不同，MDX小鼠没有表现出任何疾病迹象)，但本发明人的这种结果表明GLAd4.Dys病毒在目标组织中维持抗肌萎缩蛋白的表达至少4周。
考察
建议用于基因疗法的理想体内(in vivo)基因传递载体具有如下的特性：不应随机插入宿主基因组中(消除对引起插入突变的担忧)、不应有病毒蛋白的表达[需要无肠(gutless)病毒基因组，尽可能减少宿主免疫反应]、具有广泛的细胞及组织亲和性(tropism)、对转基因传递表现高转导效率、以及可传递任何转基因的大装载能力等。目前，可利用的众多基因传递载体中，GLAd是实际具有所有这些建议特性的唯一载体。然而，非常令人惊讶的是，具有所有这些特性的GLAd仅用于动物研究，从未用于临床实践，因此不存在临床数据。这些与预期完全不同的结果被认为是由于与腺病毒相关的安全问题所致，腺病毒在现有GLad生产工艺中作为包装及后续扩增过程中必不可少的辅助物，但在生产结束时仍然以污染物残留。GLAd临床应用要克服的另一个障碍是在现有GLAd的生产过程或者在辅助腺病毒大量生产过程中生成的RCA污染。
广泛使用的复制缺陷型第一代(replication-incompetent first-generation)腺病毒具有高度免疫原性(highly immunogenic)，可以在宿主中引起细胞毒性。因此，该病毒已被广泛用作抗癌疗法的基因传递载体，其高免疫原性提供了免疫佐剂(adjuvant)的功能，从而在与由该病毒载体传递的抗癌基因配合时，可以更有效去除肿瘤组织。相比之下，腺病毒不适合在基因疗法中使用，特别是在需要长时间转基因表达的遗传疾病的治疗中，这是因为宿主对腺病毒的免疫反应可能会导致患者体内转基因表达的减少或者在短期内停止，并且也可能引起毒性。考虑到这些问题，即使在现有方式中技术最先进的基于辅助腺病毒的GLAd生产系统中，腺病毒污染的最佳结果也是0.01％，即，1×1010中的1×106颗粒是污染物腺病毒颗粒，这是非常值得注意的。
关于安全问题，RCA比复制缺陷型第一代腺病毒(用于生产GLAd的辅助腺病毒通常是第一代腺病毒)更危险。这是因为RCA是一种在感染后可以在任何细胞中自主复制的复制型腺病毒，不像第一代腺病毒缺少E1，只能在如HEK293及HEK293T细胞等E1-表达包装细胞中复制。尤其，当利用受RCA污染的基因治疗剂对处于免疫抑制(或者免疫功能低下)状态的患者进行基因疗法时，RCA很容易自我复制，从而对患者产生致命的毒性。并且，从RCA表达的E1蛋白可以通过补充由E1缺陷导致的复制缺陷型腺病毒的E1缺陷来支持复制缺陷型腺病毒的强有力的复制/扩增。因此，美国食品和药物管理局(Food and DrugAdministration，FDA)严格控制RCA并要求对临床实践中使用的每个腺病毒生产批次(batch)的RCA颗粒进行定量(同样的规则将适用于GLAd)，规定保持感染性RCA为每个3×1010腺病毒颗粒单剂量为一个以下。因此，当GLAd用于治疗目的时，可以通过用新的辅助物代替辅助腺病毒来减少对腺病毒及RCA污染物的担忧，正如在使用三种质粒的生产系统中所证明的那样，这是用于治疗目的的AAV生产标准程序，很明显，必须构建一个新的GLAd生产系统。
在本发明中，发明人首次报道了一种用于GLAd生产的新型辅助质粒。本发明人的辅助质粒不包含病毒包装所必需的ITR及Ψ包装信号序列。并且，与辅助腺病毒不同，关于可在如HEK293或HEK293T等GLAd包装细胞中发生的同源重组，本发明人的辅助质粒仅包含一个5型腺病毒(adenovirus type 5)的同源区域[核苷酸第3034位至第5015位(1482bp)，GenBank AC_000008]部分。这种结构特性不仅完全消除了辅助质粒转化为感染性病毒颗粒的可能性，而且从根本上阻断了GLAd生产过程中RCA的生成。实际上，本发明人不仅在大量生产的GLAd中而且在通过连续扩增生产的高通道(high-passage)GLAd中都不能检测到腺病毒或RCA污染物。本发明人获得的这些结果清楚地表明，本发明人完成的基于辅助质粒的新型GLAd生产系统仅生产目标重组GLAd，没有腺病毒及RCA污染，从而显着降低了对这些污染物病毒引起的安全问题的担忧。
尽管本发明人的辅助质粒不会在GLAd包装细胞中自我复制，但在提供在生产大量重组GLAd中所需的GLAd包装及进一步扩增所需的足够水平的辅助功能方面似乎没有任何问题。在GLAd的大量生产中，本发明人的系统确实比现有的基于辅助腺病毒的系统效率稍低。尽管如此，本发明人在使用本发明人的系统大量生产GLAd方面没有任何困难。在开发治疗用药物时，安全性通常远比生产收率重要。从这一点来看，本发明人的GLAd系统在生产收率方面所表现出的相当不利的缺点可以被本发明人的GLAd生产系统所具备的几个与安全相关的优点充分抵消。
本发明人的重组GLAd在体外及体内有效地传递了各种类型的转基因。实际上，本发明人的Glad有效传递长度长的基因，例如亨廷顿蛋白基因(9.4kb)、抗肌萎缩蛋白基因(11kb)、或包含亨廷顿蛋白基因和两个mshR的复合表达盒(总长度为～13kb)。尽管许多研究试图使用AAV作为基因传递载体传递抗肌萎缩蛋白基因传递，但这些研究并不是关注超过AAV的包装容量的全长抗肌萎缩蛋白基因，而是一致性地关注作为它们的小版本的小型肌营养不良蛋白或微型抗肌萎缩蛋白基因。利用GLAd成功传递包含亨廷顿蛋白基因及两个mshR的复合表达盒非常重要，因为它是第一个尝试作为可以治疗亨廷顿病的治疗方法的例子。这些例子证明了GLAd在基因传递中的固有特性，特别是与长度长的基因传递相关的多功能性(versatility)。
在体内(in vivo)尝试的基因疗法中使用病毒载体像是一把双刃剑。病毒载体可以更有效地传递转基因，但可以在宿主中引起毒性。如AAV及GLAd等无肠腺病毒载体比其他表达病毒蛋白的病毒载体更安全，因为它们的基因组骨架中不包含任何病毒基因。尽管如此，正如在AAV中所见，在高剂量下表现出严重的急性毒性，至于由这些载体的衣壳蛋白引起的毒性是无法预防的。然而，利用未受高免疫原性腺病毒物种污染的GLAd，或者使用如球囊闭塞导管介导的干预(balloon occlusion catheter mediated intervention)等安全递送技术，以通过GLAd载体在肝脏中表达转基因(GLAd-based liver-directedtransgene)，这样可以施用显著较低剂量的GLAd，因此有可能显著减少对由病毒的衣壳蛋白引发的毒性的担忧。这种球囊闭塞导管介导的干预显示出非常高的安全性，并成功实现了长达7年的转基因表达。考虑到这些，就首先建立与辅助腺病毒及RCA的污染相关的GLAd生产的新平台并揭示其作为体内基因递送用载体的卓越性而言(表19)，本发明人的成就是值得赞赏的。
总之，本发明人的研究结果表明，本发明人完成的基于辅助质粒的系统可以有效地生产不含腺病毒和RCA污染物的重组GLAd。直到最近，基因疗法才能够为治疗各种先天性遗传病的一直未满足需求提供解决方案。在这种试图通过将基因装载到传递载体上并向体内递递来治疗遗传病的基因疗法中，基因传递载体起着举足轻重的作用。希望本发明人完成的辅助质粒及GLAd生产系统能够成为未来基于GLAd的基因疗法成功开发的基石。
表18：GLAd的收率及在GLAd生产中产生的其他病毒
Figure GDA0003644711860000341
BFU：蓝色形成单位(blue-forming units)，N/A：无符合事项
a：由LacZ染色确定(BFU总数)
b：腺病毒和/或RCA
c：由噬菌斑测定(plaque assay)确定
d：转染到培养在100mm的培养皿中的HEK293T细胞中
e：用于噬菌斑测定的阳性对照组
表19：AAV、现有GLAd及新型GLAd相互之间的比较
Figure GDA0003644711860000342
Figure GDA0003644711860000351
N/A：无符合事项
a：相对活性
b：但是频率较低
表20：pGLAd3骨架(backbone)克隆中所使用的引物
Figure GDA0003644711860000352
表21：用于亨廷顿蛋白mshR表达的合成DNA
Figure GDA0003644711860000353
5’及3’部分的用粗体标记的核苷酸分别表示对BamHI限制酶及EcoRI限制酶位点的粘性末端。
表22：用于将亨廷顿蛋白mshR克隆到pGLAd3骨架中的PCR引物
Figure GDA0003644711860000361
用下划线标记的核苷酸序列为与pGLAd3基因组质粒具有同源性的部分。
产业上的可利用性
本发明涉及基于辅助质粒的无肠腺病毒(gutless adenovirus，GLAd)生产方法及系统。
序列表
<110> GENENMED CO., LTD.
<120> 基于辅助质粒的无肠腺病毒生产系统
<130> PP200038
<150> US 62/924,711
<151> 2019-10-23
<160> 82
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KanColE1_1F
<400> 1
gggccaagga tctgatggcg cagggga 27
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KanColE1_1R
<400> 2
cttggccgca gcggccgagc aaaaggccag caaaaggcca 40
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KanColE1_2F
<400> 3
cccggatccg cagtgggctt acatggcgat agc 33
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KanColE1_2R
<400> 4
cccgtataca tcgatttaat taagagcaaa aggccagc 38
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cla_delE1_F
<400> 5
gggatcgatt taagggtggg aaagaatata taag 34
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BstZ_R
<400> 6
cccgtatacg gggacacgga cagccttttc gtc 33
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KanColE1_3F
<400> 7
ttaattaagc agtgggctta catggcgata gc 32
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KanColE1_3R
<400> 8
cccggatcca tcgatttaat taagagcaaa aggccagc 38
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E3_Spe_F
<400> 9
gggactagtt tcgcgccctt tctcaaattt aagc 34
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> delE3_R
<400> 10
gcggatggac aggaacttat aacattcagt cgtag 35
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> delE3_F
<400> 11
ctacgactga atgttataag ttcctgtcca tccgc 35
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E3_Nde_R
<400> 12
gggcatatgg atacacgggg ttgaaggtat cttc 34
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cla_EcoR_S
<400> 13
cgatccggag gcccttg 17
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cla_EcoR_AS
<400> 14
aattcaaggg cctccggat 19
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Avr_F
<400> 15
ctgcctaggc aaaatagcac cc 22
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Avr_dITR_R
<400> 16
aacgatgtaa gttttagggc ggagtaactt gtatg 35
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Avr_dITR_F
<400> 17
gccctaaaac ttacatcgtt aattaagcag tgggc 35
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Rsr_R
<400> 18
tagcggtccg ccacacccag cc 22
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KanColE1_4F
<400> 19
ggttggcgcg ccctacgtca cccgccccgt tcccac 36
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KanColE1_4R
<400> 20
cccgagctca aactacataa gacccccacc ttat 34
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sac_Pst_Avr_Asc_S
<400> 21
cttaacctgc agatcctcct aggtttttgg 30
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sac_Pst_Avr_Asc_AS
<400> 22
cgcgccaaaa acctaggagg atctgcaggt taagagct 38
<210> 23
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sac_Hpa_Avr_S
<400> 23
cgggcggcga cctcgcgggt taaccgtcct ttaaaaaagt cgtttctgca agctc 55
<210> 24
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sac_Hpa_Avr_AS
<400> 24
ctaggagctt gcagaaacga cttttttaaa ggacggttaa cccgcgaggt cgccgcccga 60
gct 63
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SacI/ApaI_S
<400> 25
catggttcca aaatgcccct taaccgggtt gggcc 35
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SacI/ApaI_AS
<400> 26
caacccggtt aaggggcatt ttggaaccat gagct 35
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApaI/AvrII_S
<400> 27
catggttcca aaatgcccct taaccgggtt c 31
<210> 28
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApaI/AvrII_AS
<400> 28
ctaggaaccc ggttaagggg cattttggaa ccatgggcc 39
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGLAdSMAR_F
<400> 29
tctgggccca aataaactta taaattgtga gag 33
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGLAdSMAR_R
<400> 30
cccatgcata tatttaaaga aaaaaaaatt gta 33
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCAG_F
<400> 31
gttattaata gtaatcaatt acg 23
<210> 32
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCAG_R
<400> 32
cttgggtctc cctatcgccc gccgcgcgct tcgcttttta tagg 44
<210> 33
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> bGint_F
<400> 33
ggcgataggg agacccaagc tggtgagttt ggggaccc 38
<210> 34
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> bGint_R
<400> 34
gggaagcttg ggtcccctgt aggaaaaaga agaaggcatg aac 43
<210> 35
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ad5pTP_F
<400> 35
gggaagctta ccatggcctt gagcgtcaac gattgcgcgc gcctgacc 48
<210> 36
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ad5pTP_R
<400> 36
ggcgaattcc taaaagcggt gacgcgggcg agcc 34
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ad5Fiber_F
<400> 37
cgcgcaagac cgtctgaaga tacc 24
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ad5Fiber_R
<400> 38
ggcctgatgt ttgcagggct agc 23
<210> 39
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N-F
<400> 39
tcttatgtag tttgagctcg gctttggtta tttgatggat tgacc 45
<210> 40
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N-R
<400> 40
tccggagggg ctcgaggctg gcttaaaaca gtaactcaat atg 43
<210> 41
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C-F
<400> 41
ctcgagcccc tccggaggag tggccagggc gttctggagg tag 43
<210> 42
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C-R
<400> 42
cgccaaaaac ctaggtgggc ccaggaagac tcactggttg g 41
<210> 43
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nsi-Xho-S
<400> 43
tcgagctaga ctctggggct aaagctgcag tatccatcac actggcggcc gc 52
<210> 44
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nsi-Xho-AS
<400> 44
tcgagcggcc gccagtgtga tggatactgc agctttagcc ccagagtcta gctcgatgca 60
60
<210> 45
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F1-F
<400> 45
cctcctcgag ctagactctg gggctaaagc aatgag 36
<210> 46
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F1-R
<400> 46
cccacgcgtg cggccgcttg agaggcagag gcaaaggcaa gtg 43
<210> 47
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F2-F
<400> 47
tcaagcggcc gcgtgctgag actaaaggga tgtgctac 38
<210> 48
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F2-R
<400> 48
cccgtcgacc atcattctaa ggcctgcctg agcta 35
<210> 49
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F3-F
<400> 49
cccgtcgacg cactggcttt acaggggccg tctgc 35
<210> 50
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F3-R
<400> 50
gggcgatcgg gaaggaaacc tacctagcct acaag 35
<210> 51
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F4-F
<400> 51
gggcgatcgg tagactagga tagcctcaaa ctcct 35
<210> 52
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F4-R
<400> 52
gggacgcgtg ttaacatact atcagaatag tgata 35
<210> 53
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F5-F
<400> 53
gggacgcgtt gggtgcaatc ttaccagagc cttac 35
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F5-R
<400> 54
acggcagttc aaaatcaagt aatac 25
<210> 55
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SMAR-F
<400> 55
cggcctgggt ggccaaataa acttataaat tgtgagagaa a 41
<210> 56
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SMAR-R
<400> 56
caggtcgaca tatttaaaga aaaaaaaatt gtatc 35
<210> 57
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HTTmshR1_S
<400> 57
gatcctgctg ttgacagtga gcgagaccgt gtgaatcatt gtctatagtg aagccacaga 60
tgtatagaca atgattcaca cggtcgtgcc tactgcctcg gag 103
<210> 58
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HTTmshR1_AS
<400> 58
aattctccga ggcagtaggc acgaccgtgt gaatcattgt ctatacatct gtggcttcac 60
tatagacaat gattcacacg gtctcgctca ctgtcaacag cag 103
<210> 59
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HTTmshR2_S
<400> 59
gatcctgctg ttgacagtga gcgacagctt gtccaggttt atgaatagtg aagccacaga 60
tgtattcata aacctggaca agctggtgcc tactgcctcg gag 103
<210> 60
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HTTmshR2_AS
<400> 60
aattctccga ggcagtaggc accagcttgt ccaggtttat gaatacatct gtggcttcac 60
tattcataaa cctggacaag ctgtcgctca ctgtcaacag cag 103
<210> 61
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HTTmshR3_S
<400> 61
gatcctgctg ttgacagtga gcgaggatac ctgaaatcct gcttttagtg aagccacaga 60
tgtaaaagca ggatttcagg tatccgtgcc tactgcctcg gag 103
<210> 62
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HTTmshR3_AS
<400> 62
aattctccga ggcagtaggc acggatacct gaaatcctgc ttttacatct gtggcttcac 60
taaaagcagg atttcaggta tcctcgctca ctgtcaacag cag 103
<210> 63
<211> 2905
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGT2
<400> 63
gcgcgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 60
ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 120
gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 180
caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggactattt acggtaaact gcccacttgg 240
cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 300
ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 360
tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 420
gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 480
gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 540
tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctctggc 600
taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga 660
cccaagcttg gtaccgagct cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcca 720
gcacactggc ggccgctcga gcatgcatct agagggccct attctatagt gtcacctaaa 780
tgctagagct cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 840
cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 900
aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 960
ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 1020
gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac cagtggcggt aatacggtta tccacagaat 1080
caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 1140
aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 1200
atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 1260
cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 1320
ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 1380
gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 1440
accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 1500
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 1560
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 1620
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 1680
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 1740
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 1800
actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 1860
taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaacct gaggtcagaa 1920
gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta 1980
aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc 2040
caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga 2100
aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag 2160
atcctcgccg tcgggcatgc tcgccttgag cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc 2220
ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc 2280
tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg 2340
cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga 2400
caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac 2460
aacgtcgagc acagctgcgc aaggaacgcc cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc 2520
ctcgtcttgc agttcattca gggcaccgga caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg 2580
cccctgcgct gacagccgga acacggcggc atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca 2640
gtcatagccg aatagcctct ccacccaagc ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg 2700
ttcaatcatg cgaaacgatc ctcatcctgt ctcttgatca gagcttgatc ccctgcgcca 2760
tcagatcctt ggcggcaaga aagccatcca gtttactttg cagggcttcc caaccttacc 2820
agagggcgcc ccagctggca attccggttc gcttgctgtc cataaaaccg cccagtctag 2880
ctatcgccat gtaagcccac tgcaa 2905
<210> 64
<211> 3451
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pBest
<400> 64
ggccgctgcg gccgtttaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc 60
tggccttttg ctcttaatta aatcgcatca tcaataatat accttatttt ggattgaagc 120
caatatgata atgagggggt ggagtttgtg acgtggcgcg gggcgtggga acggggcggg 180
tgacgtagta gtgtggcgga agtgtgatgt tgcaagtgtg gcggaacaca tgtaagcgac 240
ggatgtggca aaagtgacgt ttttggtgtg cgccggtgta cacaggaagt gacaattttc 300
gcgcggtttt aggcggatgt tgtagtaaat ttgggcgtaa ccgagtaaga tttggccatt 360
ttcgcgggaa aactgaataa gaggaagtga aatctgaata attttgtgtt actcatagcg 420
cgtaatattt gtctagggcc gcggggactt tgaccgttta cgtggagact cgcccaggtg 480
tttttctcag gtgttttccg cgttccgggt caaagttggc gttttattat tatagtcagc 540
tgacgtgtag tgtcgagtgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta 600
cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg 660
gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 720
ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 780
ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca 840
atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta 900
cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 960
acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg 1020
acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca 1080
actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca 1140
gagctctctg gctaactaga gaacccactg cttactggct tatcgaaatt aatacgactc 1200
actataggga cccaagcttg gtaccgagct cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc 1260
tggaattctg cagatatcca tcacactggc ggccgctcga gcatgcatct agagggccct 1320
attcaattct ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac 1380
ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt 1440
tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct 1500
agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggatcat cgatccataa 1560
cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat ccagatctcg atttaagggt gggaaagaat 1620
atataaggtg ggggtcttat gtagtttaaa cgctagcagt gggcttacat ggcgatagct 1680
agactgggcg gttttatgga cagcaagcga accggaattg ccagctgggg cgccctctgg 1740
taaggttggg aagccctgca aagtaaactg gatggctttc ttgccgccaa ggatctgatg 1800
gcgcagggga tcaagctctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca 1860
agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg 1920
ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg 1980
cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aagacgaggc 2040
agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt 2100
cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc 2160
atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca 2220
tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc 2280
acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg 2340
gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgagc atgcccgacg gcgaggatct 2400
cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc 2460
tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc 2520
tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta 2580
cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt 2640
ctgacctcag gttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa 2700
aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 2760
tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 2820
tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 2880
ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 2940
ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 3000
gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 3060
aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 3120
ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 3180
agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 3240
aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 3300
aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 3360
ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 3420
cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct c 3451
<210> 65
<211> 15804
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第三DNA片段
<400> 65
gtatacagac ttgagaggcc tgtcctcgag cggtgttccg cggtcctcct cgtatagaaa 60
ctcggaccac tctgagacaa aggctcgcgt ccaggccagc acgaaggagg ctaagtggga 120
ggggtagcgg tcgttgtcca ctagggggtc cactcgctcc agggtgtgaa gacacatgtc 180
gccctcttcg gcatcaagga aggtgattgg tttgtaggtg taggccacgt gaccgggtgt 240
tcctgaaggg gggctataaa agggggtggg ggcgcgttcg tcctcactct cttccgcatc 300
gctgtctgcg agggccagct gttggggtga gtactccctc tgaaaagcgg gcatgacttc 360
tgcgctaaga ttgtcagttt ccaaaaacga ggaggatttg atattcacct ggcccgcggt 420
gatgcctttg agggtggccg catccatctg gtcagaaaag acaatctttt tgttgtcaag 480
cttggtggca aacgacccgt agagggcgtt ggacagcaac ttggcgatgg agcgcagggt 540
ttggtttttg tcgcgatcgg cgcgctcctt ggccgcgatg tttagctgca cgtattcgcg 600
cgcaacgcac cgccattcgg gaaagacggt ggtgcgctcg tcgggcacca ggtgcacgcg 660
ccaaccgcgg ttgtgcaggg tgacaaggtc aacgctggtg gctacctctc cgcgtaggcg 720
ctcgttggtc cagcagaggc ggccgccctt gcgcgagcag aatggcggta gggggtctag 780
ctgcgtctcg tccggggggt ctgcgtccac ggtaaagacc ccgggcagca ggcgcgcgtc 840
gaagtagtct atcttgcatc cttgcaagtc tagcgcctgc tgccatgcgc gggcggcaag 900
cgcgcgctcg tatgggttga gtgggggacc ccatggcatg gggtgggtga gcgcggaggc 960
gtacatgccg caaatgtcgt aaacgtagag gggctctctg agtattccaa gatatgtagg 1020
gtagcatctt ccaccgcgga tgctggcgcg cacgtaatcg tatagttcgt gcgagggagc 1080
gaggaggtcg ggaccgaggt tgctacgggc gggctgctct gctcggaaga ctatctgcct 1140
gaagatggca tgtgagttgg atgatatggt tggacgctgg aagacgttga agctggcgtc 1200
tgtgagacct accgcgtcac gcacgaagga ggcgtaggag tcgcgcagct tgttgaccag 1260
ctcggcggtg acctgcacgt ctagggcgca gtagtccagg gtttccttga tgatgtcata 1320
cttatcctgt cccttttttt tccacagctc gcggttgagg acaaactctt cgcggtcttt 1380
ccagtactct tggatcggaa acccgtcggc ctccgaacgg taagagccta gcatgtagaa 1440
ctggttgacg gcctggtagg cgcagcatcc cttttctacg ggtagcgcgt atgcctgcgc 1500
ggccttccgg agcgaggtgt gggtgagcgc aaaggtgtcc ctgaccatga ctttgaggta 1560
ctggtatttg aagtcagtgt cgtcgcatcc gccctgctcc cagagcaaaa agtccgtgcg 1620
ctttttggaa cgcggatttg gcagggcgaa ggtgacatcg ttgaagagta tctttcccgc 1680
gcgaggcata aagttgcgtg tgatgcggaa gggtcccggc acctcggaac ggttgttaat 1740
tacctgggcg gcgagcacga tctcgtcaaa gccgttgatg ttgtggccca caatgtaaag 1800
ttccaagaag cgcgggatgc ccttgatgga aggcaatttt ttaagttcct cgtaggtgag 1860
ctcttcaggg gagctgagcc cgtgctctga aagggcccag tctgcaagat gagggttgga 1920
agcgacgaat gagctccaca ggtcacgggc cattagcatt tgcaggtggt cgcgaaaggt 1980
cctaaactgg cgacctatgg ccattttttc tggggtgatg cagtagaagg taagcgggtc 2040
ttgttcccag cggtcccatc caaggttcgc ggctaggtct cgcgcggcag tcactagagg 2100
ctcatctccg ccgaacttca tgaccagcat gaagggcacg agctgcttcc caaaggcccc 2160
catccaagta taggtctcta catcgtaggt gacaaagaga cgctcggtgc gaggatgcga 2220
gccgatcggg aagaactgga tctcccgcca ccaattggag gagtggctat tgatgtggtg 2280
aaagtagaag tccctgcgac gggccgaaca ctcgtgctgg cttttgtaaa aacgtgcgca 2340
gtactggcag cggtgcacgg gctgtacatc ctgcacgagg ttgacctgac gaccgcgcac 2400
aaggaagcag agtgggaatt tgagcccctc gcctggcggg tttggctggt ggtcttctac 2460
ttcggctgct tgtccttgac cgtctggctg ctcgagggga gttacggtgg atcggaccac 2520
cacgccgcgc gagcccaaag tccagatgtc cgcgcgcggc ggtcggagct tgatgacaac 2580
atcgcgcaga tgggagctgt ccatggtctg gagctcccgc ggcgtcaggt caggcgggag 2640
ctcctgcagg tttacctcgc atagacgggt cagggcgcgg gctagatcca ggtgatacct 2700
aatttccagg ggctggttgg tggcggcgtc gatggcttgc aagaggccgc atccccgcgg 2760
cgcgactacg gtaccgcgcg gcgggcggtg ggccgcgggg gtgtccttgg atgatgcatc 2820
taaaagcggt gacgcgggcg agcccccgga ggtagggggg gctccggacc cgccgggaga 2880
gggggcaggg gcacgtcggc gccgcgcgcg ggcaggagct ggtgctgcgc gcgtaggttg 2940
ctggcgaacg cgacgacgcg gcggttgatc tcctgaatct ggcgcctctg cgtgaagacg 3000
acgggcccgg tgagcttgag cctgaaagag agttcgacag aatcaatttc ggtgtcgttg 3060
acggcggcct ggcgcaaaat ctcctgcacg tctcctgagt tgtcttgata ggcgatctcg 3120
gccatgaact gctcgatctc ttcctcctgg agatctccgc gtccggctcg ctccacggtg 3180
gcggcgaggt cgttggaaat gcgggccatg agctgcgaga aggcgttgag gcctccctcg 3240
ttccagacgc ggctgtagac cacgccccct tcggcatcgc gggcgcgcat gaccacctgc 3300
gcgagattga gctccacgtg ccgggcgaag acggcgtagt ttcgcaggcg ctgaaagagg 3360
tagttgaggg tggtggcggt gtgttctgcc acgaagaagt acataaccca gcgtcgcaac 3420
gtggattcgt tgatatcccc caaggcctca aggcgctcca tggcctcgta gaagtccacg 3480
gcgaagttga aaaactggga gttgcgcgcc gacacggtta actcctcctc cagaagacgg 3540
atgagctcgg cgacagtgtc gcgcacctcg cgctcaaagg ctacaggggc ctcttcttct 3600
tcttcaatct cctcttccat aagggcctcc ccttcttctt cttctggcgg cggtggggga 3660
ggggggacac ggcggcgacg acggcgcacc gggaggcggt cgacaaagcg ctcgatcatc 3720
tccccgcggc gacggcgcat ggtctcggtg acggcgcggc cgttctcgcg ggggcgcagt 3780
tggaagacgc cgcccgtcat gtcccggtta tgggttggcg gggggctgcc atgcggcagg 3840
gatacggcgc taacgatgca tctcaacaat tgttgtgtag gtactccgcc gccgagggac 3900
ctgagcgagt ccgcatcgac cggatcggaa aacctctcga gaaaggcgtc taaccagtca 3960
cagtcgcaag gtaggctgag caccgtggcg ggcggcagcg ggcggcggtc ggggttgttt 4020
ctggcggagg tgctgctgat gatgtaatta aagtaggcgg tcttgagacg gcggatggtc 4080
gacagaagca ccatgtcctt gggtccggcc tgctgaatgc gcaggcggtc ggccatgccc 4140
caggcttcgt tttgacatcg gcgcaggtct ttgtagtagt cttgcatgag cctttctacc 4200
ggcacttctt cttctccttc ctcttgtcct gcatctcttg catctatcgc tgcggcggcg 4260
gcggagtttg gccgtaggtg gcgccctctt cctcccatgc gtgtgacccc gaagcccctc 4320
atcggctgaa gcagggctag gtcggcgaca acgcgctcgg ctaatatggc ctgctgcacc 4380
tgcgtgaggg tagactggaa gtcatccatg tccacaaagc ggtggtatgc gcccgtgttg 4440
atggtgtaag tgcagttggc cataacggac cagttaacgg tctggtgacc cggctgcgag 4500
agctcggtgt acctgagacg cgagtaagcc ctcgagtcaa atacgtagtc gttgcaagtc 4560
cgcaccaggt actggtatcc caccaaaaag tgcggcggcg gctggcggta gaggggccag 4620
cgtagggtgg ccggggctcc gggggcgaga tcttccaaca taaggcgatg atatccgtag 4680
atgtacctgg acatccaggt gatgccggcg gcggtggtgg aggcgcgcgg aaagtcgcgg 4740
acgcggttcc agatgttgcg cagcggcaaa aagtgctcca tggtcgggac gctctggccg 4800
gtcaggcgcg cgcaatcgtt gacgctctag accgtgcaaa aggagagcct gtaagcgggc 4860
actcttccgt ggtctggtgg ataaattcgc aagggtatca tggcggacga ccggggttcg 4920
agccccgtat ccggccgtcc gccgtgatcc atgcggttac cgcccgcgtg tcgaacccag 4980
gtgtgcgacg tcagacaacg ggggagtgct ccttttggct tccttccagg cgcggcggct 5040
gctgcgctag cttttttggc cactggccgc gcgcagcgta agcggttagg ctggaaagcg 5100
aaagcattaa gtggctcgct ccctgtagcc ggagggttat tttccaaggg ttgagtcgcg 5160
ggacccccgg ttcgagtctc ggaccggccg gactgcggcg aacgggggtt tgcctccccg 5220
tcatgcaaga ccccgcttgc aaattcctcc ggaaacaggg acgagcccct tttttgcttt 5280
tcccagatgc atccggtgct gcggcagatg cgcccccctc ctcagcagcg gcaagagcaa 5340
gagcagcggc agacatgcag ggcaccctcc cctcctccta ccgcgtcagg aggggcgaca 5400
tccgcggttg acgcggcagc agatggtgat tacgaacccc cgcggcgccg ggcccggcac 5460
tacctggact tggaggaggg cgagggcctg gcgcggctag gagcgccctc tcctgagcgg 5520
tacccaaggg tgcagctgaa gcgtgatacg cgtgaggcgt acgtgccgcg gcagaacctg 5580
tttcgcgacc gcgagggaga ggagcccgag gagatgcggg atcgaaagtt ccacgcaggg 5640
cgcgagctgc ggcatggcct gaatcgcgag cggttgctgc gcgaggagga ctttgagccc 5700
gacgcgcgaa ccgggattag tcccgcgcgc gcacacgtgg cggccgccga cctggtaacc 5760
gcatacgagc agacggtgaa ccaggagatt aactttcaaa aaagctttaa caaccacgtg 5820
cgtacgcttg tggcgcgcga ggaggtggct ataggactga tgcatctgtg ggactttgta 5880
agcgcgctgg agcaaaaccc aaatagcaag ccgctcatgg cgcagctgtt ccttatagtg 5940
cagcacagca gggacaacga ggcattcagg gatgcgctgc taaacatagt agagcccgag 6000
ggccgctggc tgctcgattt gataaacatc ctgcagagca tagtggtgca ggagcgcagc 6060
ttgagcctgg ctgacaaggt ggccgccatc aactattcca tgcttagcct gggcaagttt 6120
tacgcccgca agatatacca taccccttac gttcccatag acaaggaggt aaagatcgag 6180
gggttctaca tgcgcatggc gctgaaggtg cttaccttga gcgacgacct gggcgtttat 6240
cgcaacgagc gcatccacaa ggccgtgagc gtgagccggc ggcgcgagct cagcgaccgc 6300
gagctgatgc acagcctgca aagggccctg gctggcacgg gcagcggcga tagagaggcc 6360
gagtcctact ttgacgcggg cgctgacctg cgctgggccc caagccgacg cgccctggag 6420
gcagctgggg ccggacctgg gctggcggtg gcacccgcgc gcgctggcaa cgtcggcggc 6480
gtggaggaat atgacgagga cgatgagtac gagccagagg acggcgagta ctaagcggtg 6540
atgtttctga tcagatgatg caagacgcaa cggacccggc ggtgcgggcg gcgctgcaga 6600
gccagccgtc cggccttaac tccacggacg actggcgcca ggtcatggac cgcatcatgt 6660
cgctgactgc gcgcaatcct gacgcgttcc ggcagcagcc gcaggccaac cggctctccg 6720
caattctgga agcggtggtc ccggcgcgcg caaaccccac gcacgagaag gtgctggcga 6780
tcgtaaacgc gctggccgaa aacagggcca tccggcccga cgaggccggc ctggtctacg 6840
acgcgctgct tcagcgcgtg gctcgttaca acagcggcaa cgtgcagacc aacctggacc 6900
ggctggtggg ggatgtgcgc gaggccgtgg cgcagcgtga gcgcgcgcag cagcagggca 6960
acctgggctc catggttgca ctaaacgcct tcctgagtac acagcccgcc aacgtgccgc 7020
ggggacagga ggactacacc aactttgtga gcgcactgcg gctaatggtg actgagacac 7080
cgcaaagtga ggtgtaccag tctgggccag actatttttt ccagaccagt agacaaggcc 7140
tgcagaccgt aaacctgagc caggctttca aaaacttgca ggggctgtgg ggggtgcggg 7200
ctcccacagg cgaccgcgcg accgtgtcta gcttgctgac gcccaactcg cgcctgttgc 7260
tgctgctaat agcgcccttc acggacagtg gcagcgtgtc ccgggacaca tacctaggtc 7320
acttgctgac actgtaccgc gaggccatag gtcaggcgca tgtggacgag catactttcc 7380
aggagattac aagtgtcagc cgcgcgctgg ggcaggagga cacgggcagc ctggaggcaa 7440
ccctaaacta cctgctgacc aaccggcggc agaagatccc ctcgttgcac agtttaaaca 7500
gcgaggagga gcgcattttg cgctacgtgc agcagagcgt gagccttaac ctgatgcgcg 7560
acggggtaac gcccagcgtg gcgctggaca tgaccgcgcg caacatggaa ccgggcatgt 7620
atgcctcaaa ccggccgttt atcaaccgcc taatggacta cttgcatcgc gcggccgccg 7680
tgaaccccga gtatttcacc aatgccatct tgaacccgca ctggctaccg ccccctggtt 7740
tctacaccgg gggattcgag gtgcccgagg gtaacgatgg attcctctgg gacgacatag 7800
acgacagcgt gttttccccg caaccgcaga ccctgctaga gttgcaacag cgcgagcagg 7860
cagaggcggc gctgcgaaag gaaagcttcc gcaggccaag cagcttgtcc gatctaggcg 7920
ctgcggcccc gcggtcagat gctagtagcc catttccaag cttgataggg tctcttacca 7980
gcactcgcac cacccgcccg cgcctgctgg gcgaggagga gtacctaaac aactcgctgc 8040
tgcagccgca gcgcgaaaaa aacctgcctc cggcatttcc caacaacggg atagagagcc 8100
tagtggacaa gatgagtaga tggaagacgt acgcgcagga gcacagggac gtgccaggcc 8160
cgcgcccgcc cacccgtcgt caaaggcacg accgtcagcg gggtctggtg tgggaggacg 8220
atgactcggc agacgacagc agcgtcctgg atttgggagg gagtggcaac ccgtttgcgc 8280
accttcgccc caggctgggg agaatgtttt aaaaaaaaaa aagcatgatg caaaataaaa 8340
aactcaccaa ggccatggca ccgagcgttg gttttcttgt attcccctta gtatgcggcg 8400
cgcggcgatg tatgaggaag gtcctcctcc ctcctacgag agtgtggtga gcgcggcgcc 8460
agtggcggcg gcgctgggtt ctcccttcga tgctcccctg gacccgccgt ttgtgcctcc 8520
gcggtacctg cggcctaccg gggggagaaa cagcatccgt tactctgagt tggcacccct 8580
attcgacacc acccgtgtgt acctggtgga caacaagtca acggatgtgg catccctgaa 8640
ctaccagaac gaccacagca actttctgac cacggtcatt caaaacaatg actacagccc 8700
gggggaggca agcacacaga ccatcaatct tgacgaccgg tcgcactggg gcggcgacct 8760
gaaaaccatc ctgcatacca acatgccaaa tgtgaacgag ttcatgttta ccaataagtt 8820
taaggcgcgg gtgatggtgt cgcgcttgcc tactaaggac aatcaggtgg agctgaaata 8880
cgagtgggtg gagttcacgc tgcccgaggg caactactcc gagaccatga ccatagacct 8940
tatgaacaac gcgatcgtgg agcactactt gaaagtgggc agacagaacg gggttctgga 9000
aagcgacatc ggggtaaagt ttgacacccg caacttcaga ctggggtttg accccgtcac 9060
tggtcttgtc atgcctgggg tatatacaaa cgaagccttc catccagaca tcattttgct 9120
gccaggatgc ggggtggact tcacccacag ccgcctgagc aacttgttgg gcatccgcaa 9180
gcggcaaccc ttccaggagg gctttaggat cacctacgat gatctggagg gtggtaacat 9240
tcccgcactg ttggatgtgg acgcctacca ggcgagcttg aaagatgaca ccgaacaggg 9300
cgggggtggc gcaggcggca gcaacagcag tggcagcggc gcggaagaga actccaacgc 9360
ggcagccgcg gcaatgcagc cggtggagga catgaacgat catgccattc gcggcgacac 9420
ctttgccaca cgggctgagg agaagcgcgc tgaggccgaa gcagcggccg aagctgccgc 9480
ccccgctgcg caacccgagg tcgagaagcc tcagaagaaa ccggtgatca aacccctgac 9540
agaggacagc aagaaacgca gttacaacct aataagcaat gacagcacct tcacccagta 9600
ccgcagctgg taccttgcat acaactacgg cgaccctcag accggaatcc gctcatggac 9660
cctgctttgc actcctgacg taacctgcgg ctcggagcag gtctactggt cgttgccaga 9720
catgatgcaa gaccccgtga ccttccgctc cacgcgccag atcagcaact ttccggtggt 9780
gggcgccgag ctgttgcccg tgcactccaa gagcttctac aacgaccagg ccgtctactc 9840
ccaactcatc cgccagttta cctctctgac ccacgtgttc aatcgctttc ccgagaacca 9900
gattttggcg cgcccgccag cccccaccat caccaccgtc agtgaaaacg ttcctgctct 9960
cacagatcac gggacgctac cgctgcgcaa cagcatcgga ggagtccagc gagtgaccat 10020
tactgacgcc agacgccgca cctgccccta cgtttacaag gccctgggca tagtctcgcc 10080
gcgcgtccta tcgagccgca ctttttgagc aagcatgtcc atccttatat cgcccagcaa 10140
taacacaggc tggggcctgc gcttcccaag caagatgttt ggcggggcca agaagcgctc 10200
cgaccaacac ccagtgcgcg tgcgcgggca ctaccgcgcg ccctggggcg cgcacaaacg 10260
cggccgcact gggcgcacca ccgtcgatga cgccatcgac gcggtggtgg aggaggcgcg 10320
caactacacg cccacgccgc caccagtgtc cacagtggac gcggccattc agaccgtggt 10380
gcgcggagcc cggcgctatg ctaaaatgaa gagacggcgg aggcgcgtag cacgtcgcca 10440
ccgccgccga cccggcactg ccgcccaacg cgcggcggcg gccctgctta accgcgcacg 10500
tcgcaccggc cgacgggcgg ccatgcgggc cgctcgaagg ctggccgcgg gtattgtcac 10560
tgtgcccccc aggtccaggc gacgagcggc cgccgcagca gccgcggcca ttagtgctat 10620
gactcagggt cgcaggggca acgtgtattg ggtgcgcgac tcggttagcg gcctgcgcgt 10680
gcccgtgcgc acccgccccc cgcgcaacta gattgcaaga aaaaactact tagactcgta 10740
ctgttgtatg tatccagcgg cggcggcgcg caacgaagct atgtccaagc gcaaaatcaa 10800
agaagagatg ctccaggtca tcgcgccgga gatctatggc cccccgaaga aggaagagca 10860
ggattacaag ccccgaaagc taaagcgggt caaaaagaaa aagaaagatg atgatgatga 10920
acttgacgac gaggtggaac tgctgcacgc taccgcgccc aggcgacggg tacagtggaa 10980
aggtcgacgc gtaaaacgtg ttttgcgacc cggcaccacc gtagtcttta cgcccggtga 11040
gcgctccacc cgcacctaca agcgcgtgta tgatgaggtg tacggcgacg aggacctgct 11100
tgagcaggcc aacgagcgcc tcggggagtt tgcctacgga aagcggcata aggacatgct 11160
ggcgttgccg ctggacgagg gcaacccaac acctagccta aagcccgtaa cactgcagca 11220
ggtgctgccc gcgcttgcac cgtccgaaga aaagcgcggc ctaaagcgcg agtctggtga 11280
cttggcaccc accgtgcagc tgatggtacc caagcgccag cgactggaag atgtcttgga 11340
aaaaatgacc gtggaacctg ggctggagcc cgaggtccgc gtgcggccaa tcaagcaggt 11400
ggcgccggga ctgggcgtgc agaccgtgga cgttcagata cccactacca gtagcaccag 11460
tattgccacc gccacagagg gcatggagac acaaacgtcc ccggttgcct cagcggtggc 11520
ggatgccgcg gtgcaggcgg tcgctgcggc cgcgtccaag acctctacgg aggtgcaaac 11580
ggacccgtgg atgtttcgcg tttcagcccc ccggcgcccg cgcggttcga ggaagtacgg 11640
cgccgccagc gcgctactgc ccgaatatgc cctacatcct tccattgcgc ctacccccgg 11700
ctatcgtggc tacacctacc gccccagaag acgagcaact acccgacgcc gaaccaccac 11760
tggaacccgc cgccgccgtc gccgtcgcca gcccgtgctg gccccgattt ccgtgcgcag 11820
ggtggctcgc gaaggaggca ggaccctggt gctgccaaca gcgcgctacc accccagcat 11880
cgtttaaaag ccggtctttg tggttcttgc agatatggcc ctcacctgcc gcctccgttt 11940
cccggtgccg ggattccgag gaagaatgca ccgtaggagg ggcatggccg gccacggcct 12000
gacgggcggc atgcgtcgtg cgcaccaccg gcggcggcgc gcgtcgcacc gtcgcatgcg 12060
cggcggtatc ctgcccctcc ttattccact gatcgccgcg gcgattggcg ccgtgcccgg 12120
aattgcatcc gtggccttgc aggcgcagag acactgatta aaaacaagtt gcatgtggaa 12180
aaatcaaaat aaaaagtctg gactctcacg ctcgcttggt cctgtaacta ttttgtagaa 12240
tggaagacat caactttgcg tctctggccc cgcgacacgg ctcgcgcccg ttcatgggaa 12300
actggcaaga tatcggcacc agcaatatga gcggtggcgc cttcagctgg ggctcgctgt 12360
ggagcggcat taaaaatttc ggttccaccg ttaagaacta tggcagcaag gcctggaaca 12420
gcagcacagg ccagatgctg agggataagt tgaaagagca aaatttccaa caaaaggtgg 12480
tagatggcct ggcctctggc attagcgggg tggtggacct ggccaaccag gcagtgcaaa 12540
ataagattaa cagtaagctt gatccccgcc ctcccgtaga ggagcctcca ccggccgtgg 12600
agacagtgtc tccagagggg cgtggcgaaa agcgtccgcg ccccgacagg gaagaaactc 12660
tggtgacgca aatagacgag cctccctcgt acgaggaggc actaaagcaa ggcctgccca 12720
ccacccgtcc catcgcgccc atggctaccg gagtgctggg ccagcacaca cccgtaacgc 12780
tggacctgcc tccccccgcc gacacccagc agaaacctgt gctgccaggc ccgaccgccg 12840
ttgttgtaac ccgtcctagc cgcgcgtccc tgcgccgcgc cgccagcggt ccgcgatcgt 12900
tgcggcccgt agccagtggc aactggcaaa gcacactgaa cagcatcgtg ggtctggggg 12960
tgcaatccct gaagcgccga cgatgcttct gaatagctaa cgtgtcgtat gtgtgtcatg 13020
tatgcgtcca tgtcgccgcc agaggagctg ctgagccgcc gcgcgcccgc tttccaagat 13080
ggctacccct tcgatgatgc cgcagtggtc ttacatgcac atctcgggcc aggacgcctc 13140
ggagtacctg agccccgggc tggtgcagtt tgcccgcgcc accgagacgt acttcagcct 13200
gaataacaag tttagaaacc ccacggtggc gcctacgcac gacgtgacca cagaccggtc 13260
ccagcgtttg acgctgcggt tcatccctgt ggaccgtgag gatactgcgt actcgtacaa 13320
ggcgcggttc accctagctg tgggtgataa ccgtgtgctg gacatggctt ccacgtactt 13380
tgacatccgc ggcgtgctgg acaggggccc tacttttaag ccctactctg gcactgccta 13440
caacgccctg gctcccaagg gtgccccaaa tccttgcgaa tgggatgaag ctgctactgc 13500
tcttgaaata aacctagaag aagaggacga tgacaacgaa gacgaagtag acgagcaagc 13560
tgagcagcaa aaaactcacg tatttgggca ggcgccttat tctggtataa atattacaaa 13620
ggagggtatt caaataggtg tcgaaggtca aacacctaaa tatgccgata aaacatttca 13680
acctgaacct caaataggag aatctcagtg gtacgaaact gaaattaatc atgcagctgg 13740
gagagtcctt aaaaagacta ccccaatgaa accatgttac ggttcatatg caaaacccac 13800
aaatgaaaat ggagggcaag gcattcttgt aaagcaacaa aatggaaagc tagaaagtca 13860
agtggaaatg caatttttct caactactga ggcgaccgca ggcaatggtg ataacttgac 13920
tcctaaagtg gtattgtaca gtgaagatgt agatatagaa accccagaca ctcatatttc 13980
ttacatgccc actattaagg aaggtaactc acgagaacta atgggccaac aatctatgcc 14040
caacaggcct aattacattg cttttaggga caattttatt ggtctaatgt attacaacag 14100
cacgggtaat atgggtgttc tggcgggcca agcatcgcag ttgaatgctg ttgtagattt 14160
gcaagacaga aacacagagc tttcatacca gcttttgctt gattccattg gtgatagaac 14220
caggtacttt tctatgtgga atcaggctgt tgacagctat gatccagatg ttagaattat 14280
tgaaaatcat ggaactgaag atgaacttcc aaattactgc tttccactgg gaggtgtgat 14340
taatacagag actcttacca aggtaaaacc taaaacaggt caggaaaatg gatgggaaaa 14400
agatgctaca gaattttcag ataaaaatga aataagagtt ggaaataatt ttgccatgga 14460
aatcaatcta aatgccaacc tgtggagaaa tttcctgtac tccaacatag cgctgtattt 14520
gcccgacaag ctaaagtaca gtccttccaa cgtaaaaatt tctgataacc caaacaccta 14580
cgactacatg aacaagcgag tggtggctcc cgggttagtg gactgctaca ttaaccttgg 14640
agcacgctgg tcccttgact atatggacaa cgtcaaccca tttaaccacc accgcaatgc 14700
tggcctgcgc taccgctcaa tgttgctggg caatggtcgc tatgtgccct tccacatcca 14760
ggtgcctcag aagttctttg ccattaaaaa cctccttctc ctgccgggct catacaccta 14820
cgagtggaac ttcaggaagg atgttaacat ggttctgcag agctccctag gaaatgacct 14880
aagggttgac ggagccagca ttaagtttga tagcatttgc ctttacgcca ccttcttccc 14940
catggcccac aacaccgcct ccacgcttga ggccatgctt agaaacgaca ccaacgacca 15000
gtcctttaac gactatctct ccgccgccaa catgctctac cctatacccg ccaacgctac 15060
caacgtgccc atatccatcc cctcccgcaa ctgggcggct ttccgcggct gggccttcac 15120
gcgccttaag actaaggaaa ccccatcact gggctcgggc tacgaccctt attacaccta 15180
ctctggctct ataccctacc tagatggaac cttttacctc aaccacacct ttaagaaggt 15240
ggccattacc tttgactctt ctgtcagctg gcctggcaat gaccgcctgc ttacccccaa 15300
cgagtttgaa attaagcgct cagttgacgg ggagggttac aacgttgccc agtgtaacat 15360
gaccaaagac tggttcctgg tacaaatgct agctaactac aacattggct accagggctt 15420
ctatatccca gagagctaca aggaccgcat gtactccttc tttagaaact tccagcccat 15480
gagccgtcag gtggtggatg atactaaata caaggactac caacaggtgg gcatcctaca 15540
ccaacacaac aactctggat ttgttggcta ccttgccccc accatgcgcg aaggacaggc 15600
ctaccctgct aacttcccct atccgcttat aggcaagacc gcagttgaca gcattaccca 15660
gaaaaagttt ctttgcgatc gcaccctttg gcgcatccca ttctccagta actttatgtc 15720
catgggcgca ctcacagacc tgggccaaaa ccttctctac gccaactccg cccacgcgct 15780
agacatgact tttgaggtgg atcc 15804
<210> 66
<211> 2248
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第四DNA片段
<400> 66
gggatcgatt taagggtggg aaagaatata taaggtgggg gtcttatgta gttttgtatc 60
tgttttgcag cagccgccgc cgccatgagc accaactcgt ttgatggaag cattgtgagc 120
tcatatttga caacgcgcat gcccccatgg gccggggtgc gtcagaatgt gatgggctcc 180
agcattgatg gtcgccccgt cctgcccgca aactctacta ccttgaccta cgagaccgtg 240
tctggaacgc cgttggagac tgcagcctcc gccgccgctt cagccgctgc agccaccgcc 300
cgcgggattg tgactgactt tgctttcctg agcccgcttg caagcagtgc agcttcccgt 360
tcatccgccc gcgatgacaa gttgacggct cttttggcac aattggattc tttgacccgg 420
gaacttaatg tcgtttctca gcagctgttg gatctgcgcc agcaggtttc tgccctgaag 480
gcttcctccc ctcccaatgc ggtttaaaac ataaataaaa aaccagactc tgtttggatt 540
tggatcaagc aagtgtcttg ctgtctttat ttaggggttt tgcgcgcgcg gtaggcccgg 600
gaccagcggt ctcggtcgtt gagggtcctg tgtatttttt ccaggacgtg gtaaaggtga 660
ctctggatgt tcagatacat gggcataagc ccgtctctgg ggtggaggta gcaccactgc 720
agagcttcat gctgcggggt ggtgttgtag atgatccagt cgtagcagga gcgctgggcg 780
tggtgcctaa aaatgtcttt cagtagcaag ctgattgcca ggggcaggcc cttggtgtaa 840
gtgtttacaa agcggttaag ctgggatggg tgcatacgtg gggatatgag atgcatcttg 900
gactgtattt ttaggttggc tatgttccca gccatatccc tccggggatt catgttgtgc 960
agaaccacca gcacagtgta tccggtgcac ttgggaaatt tgtcatgtag cttagaagga 1020
aatgcgtgga agaacttgga gacgcccttg tgacctccaa gattttccat gcattcgtcc 1080
ataatgatgg caatgggccc acgggcggcg gcctgggcga agatatttct gggatcacta 1140
acgtcatagt tgtgttccag gatgagatcg tcataggcca tttttacaaa gcgcgggcgg 1200
agggtgccag actgcggtat aatggttcca tccggcccag gggcgtagtt accctcacag 1260
atttgcattt cccacgcttt gagttcagat ggggggatca tgtctacctg cggggcgatg 1320
aagaaaacgg tttccggggt aggggagatc agctgggaag aaagcaggtt cctgagcagc 1380
tgcgacttac cgcagccggt gggcccgtaa atcacaccta ttaccgggtg caactggtag 1440
ttaagagagc tgcagctgcc gtcatccctg agcagggggg ccacttcgtt aagcatgtcc 1500
ctgactcgca tgttttccct gaccaaatcc gccagaaggc gctcgccgcc cagcgatagc 1560
agttcttgca aggaagcaaa gtttttcaac ggtttgagac cgtccgccgt aggcatgctt 1620
ttgagcgttt gaccaagcag ttccaggcgg tcccacagct cggtcacctg ctctacggca 1680
tctcgatcca gcatatctcc tcgtttcgcg ggttggggcg gctttcgctg tacggcagta 1740
gtcggtgctc gtccagacgg gccagggtca tgtctttcca cgggcgcagg gtcctcgtca 1800
gcgtagtctg ggtcacggtg aaggggtgcg ctccgggctg cgcgctggcc agggtgcgct 1860
tgaggctggt cctgctggtg ctgaagcgct gccggtcttc gccctgcgcg tcggccaggt 1920
agcatttgac catggtgtca tagtccagcc cctccgcggc gtggcccttg gcgcgcagct 1980
tgcccttgga ggaggcgccg cacgaggggc agtgcagact tttgagggcg tagagcttgg 2040
gcgcgagaaa taccgattcc ggggagtagg catccgcgcc gcaggccccg cagacggtct 2100
cgcattccac gagccaggtg agctctggcc gttcggggtc aaaaaccagg tttcccccat 2160
gctttttgat gcgtttctta cctctggttt ccatgagccg gtgtccacgc tcggtgacga 2220
aaaggctgtc cgtgtccccg tatacggg 2248
<210> 67
<211> 12506
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第五DNA片段
<400> 67
ggatcccatg gacgagccca cccttcttta tgttttgttt gaagtctttg acgtggtccg 60
tgtgcaccgg ccgcaccgcg gcgtcatcga aaccgtgtac ctgcgcacgc ccttctcggc 120
cggcaacgcc acaacataaa gaagcaagca acatcaacaa cagctgccgc catgggctcc 180
agtgagcagg aactgaaagc cattgtcaaa gatcttggtt gtgggccata ttttttgggc 240
acctatgaca agcgctttcc aggctttgtt tctccacaca agctcgcctg cgccatagtc 300
aatacggccg gtcgcgagac tgggggcgta cactggatgg cctttgcctg gaacccgcac 360
tcaaaaacat gctacctctt tgagcccttt ggcttttctg accagcgact caagcaggtt 420
taccagtttg agtacgagtc actcctgcgc cgtagcgcca ttgcttcttc ccccgaccgc 480
tgtataacgc tggaaaagtc cacccaaagc gtacaggggc ccaactcggc cgcctgtgga 540
ctattctgct gcatgtttct ccacgccttt gccaactggc cccaaactcc catggatcac 600
aaccccacca tgaaccttat taccggggta cccaactcca tgctcaacag tccccaggta 660
cagcccaccc tgcgtcgcaa ccaggaacag ctctacagct tcctggagcg ccactcgccc 720
tacttccgca gccacagtgc gcagattagg agcgccactt ctttttgtca cttgaaaaac 780
atgtaaaaat aatgtactag agacactttc aataaaggca aatgctttta tttgtacact 840
ctcgggtgat tatttacccc cacccttgcc gtctgcgccg tttaaaaatc aaaggggttc 900
tgccgcgcat cgctatgcgc cactggcagg gacacgttgc gatactggtg tttagtgctc 960
cacttaaact caggcacaac catccgcggc agctcggtga agttttcact ccacaggctg 1020
cgcaccatca ccaacgcgtt tagcaggtcg ggcgccgata tcttgaagtc gcagttgggg 1080
cctccgccct gcgcgcgcga gttgcgatac acagggttgc agcactggaa cactatcagc 1140
gccgggtggt gcacgctggc cagcacgctc ttgtcggaga tcagatccgc gtccaggtcc 1200
tccgcgttgc tcagggcgaa cggagtcaac tttggtagct gccttcccaa aaagggcgcg 1260
tgcccaggct ttgagttgca ctcgcaccgt agtggcatca aaaggtgacc gtgcccggtc 1320
tgggcgttag gatacagcgc ctgcataaaa gccttgatct gcttaaaagc cacctgagcc 1380
tttgcgcctt cagagaagaa catgccgcaa gacttgccgg aaaactgatt ggccggacag 1440
gccgcgtcgt gcacgcagca ccttgcgtcg gtgttggaga tctgcaccac atttcggccc 1500
caccggttct tcacgatctt ggccttgcta gactgctcct tcagcgcgcg ctgcccgttt 1560
tcgctcgtca catccatttc aatcacgtgc tccttattta tcataatgct tccgtgtaga 1620
cacttaagct cgccttcgat ctcagcgcag cggtgcagcc acaacgcgca gcccgtgggc 1680
tcgtgatgct tgtaggtcac ctctgcaaac gactgcaggt acgcctgcag gaatcgcccc 1740
atcatcgtca caaaggtctt gttgctggtg aaggtcagct gcaacccgcg gtgctcctcg 1800
ttcagccagg tcttgcatac ggccgccaga gcttccactt ggtcaggcag tagtttgaag 1860
ttcgccttta gatcgttatc cacgtggtac ttgtccatca gcgcgcgcgc agcctccatg 1920
cccttctccc acgcagacac gatcggcaca ctcagcgggt tcatcaccgt aatttcactt 1980
tccgcttcgc tgggctcttc ctcttcctct tgcgtccgca taccacgcgc cactgggtcg 2040
tcttcattca gccgccgcac tgtgcgctta cctcctttgc catgcttgat tagcaccggt 2100
gggttgctga aacccaccat ttgtagcgcc acatcttctc tttcttcctc gctgtccacg 2160
attacctctg gtgatggcgg gcgctcgggc ttgggagaag ggcgcttctt tttcttcttg 2220
ggcgcaatgg ccaaatccgc cgccgaggtc gatggccgcg ggctgggtgt gcgcggcacc 2280
agcgcgtctt gtgatgagtc ttcctcgtcc tcggactcga tacgccgcct catccgcttt 2340
tttgggggcg cccggggagg cggcggcgac ggggacgggg acgacacgtc ctccatggtt 2400
gggggacgtc gcgccgcacc gcgtccgcgc tcgggggtgg tttcgcgctg ctcctcttcc 2460
cgactggcca tttccttctc ctataggcag aaaaagatca tggagtcagt cgagaagaag 2520
gacagcctaa ccgccccctc tgagttcgcc accaccgcct ccaccgatgc cgccaacgcg 2580
cctaccacct tccccgtcga ggcacccccg cttgaggagg aggaagtgat tatcgagcag 2640
gacccaggtt ttgtaagcga agacgacgag gaccgctcag taccaacaga ggataaaaag 2700
caagaccagg acaacgcaga ggcaaacgag gaacaagtcg ggcgggggga cgaaaggcat 2760
ggcgactacc tagatgtggg agacgacgtg ctgttgaagc atctgcagcg ccagtgcgcc 2820
attatctgcg acgcgttgca agagcgcagc gatgtgcccc tcgccatagc ggatgtcagc 2880
cttgcctacg aacgccacct attctcaccg cgcgtacccc ccaaacgcca agaaaacggc 2940
acatgcgagc ccaacccgcg cctcaacttc taccccgtat ttgccgtgcc agaggtgctt 3000
gccacctatc acatcttttt ccaaaactgc aagatacccc tatcctgccg tgccaaccgc 3060
agccgagcgg acaagcagct ggccttgcgg cagggcgctg tcatacctga tatcgcctcg 3120
ctcaacgaag tgccaaaaat ctttgagggt cttggacgcg acgagaagcg cgcggcaaac 3180
gctctgcaac aggaaaacag cgaaaatgaa agtcactctg gagtgttggt ggaactcgag 3240
ggtgacaacg cgcgcctagc cgtactaaaa cgcagcatcg aggtcaccca ctttgcctac 3300
ccggcactta acctaccccc caaggtcatg agcacagtca tgagtgagct gatcgtgcgc 3360
cgtgcgcagc ccctggagag ggatgcaaat ttgcaagaac aaacagagga gggcctaccc 3420
gcagttggcg acgagcagct agcgcgctgg cttcaaacgc gcgagcctgc cgacttggag 3480
gagcgacgca aactaatgat ggccgcagtg ctcgttaccg tggagcttga gtgcatgcag 3540
cggttctttg ctgacccgga gatgcagcgc aagctagagg aaacattgca ctacaccttt 3600
cgacagggct acgtacgcca ggcctgcaag atctccaacg tggagctctg caacctggtc 3660
tcctaccttg gaattttgca cgaaaaccgc cttgggcaaa acgtgcttca ttccacgctc 3720
aagggcgagg cgcgccgcga ctacgtccgc gactgcgttt acttatttct atgctacacc 3780
tggcagacgg ccatgggcgt ttggcagcag tgcttggagg agtgcaacct caaggagctg 3840
cagaaactgc taaagcaaaa cttgaaggac ctatggacgg ccttcaacga gcgctccgtg 3900
gccgcgcacc tggcggacat cattttcccc gaacgcctgc ttaaaaccct gcaacagggt 3960
ctgccagact tcaccagtca aagcatgttg cagaacttta ggaactttat cctagagcgc 4020
tcaggaatct tgcccgccac ctgctgtgca cttcctagcg actttgtgcc cattaagtac 4080
cgcgaatgcc ctccgccgct ttggggccac tgctaccttc tgcagctagc caactacctt 4140
gcctaccact ctgacataat ggaagacgtg agcggtgacg gtctactgga gtgtcactgt 4200
cgctgcaacc tatgcacccc gcaccgctcc ctggtttgca attcgcagct gcttaacgaa 4260
agtcaaatta tcggtacctt tgagctgcag ggtccctcgc ctgacgaaaa gtccgcggct 4320
ccggggttga aactcactcc ggggctgtgg acgtcggctt accttcgcaa atttgtacct 4380
gaggactacc acgcccacga gattaggttc tacgaagacc aatcccgccc gccaaatgcg 4440
gagcttaccg cctgcgtcat tacccagggc cacattcttg gccaattgca agccatcaac 4500
aaagcccgcc aagagtttct gctacgaaag ggacgggggg tttacttgga cccccagtcc 4560
ggcgaggagc tcaacccaat ccccccgccg ccgcagccct atcagcagca gccgcgggcc 4620
cttgcttccc aggatggcac ccaaaaagaa gctgcagctg ccgccgccac ccacggacga 4680
ggaggaatac tgggacagtc aggcagagga ggttttggac gaggaggagg aggacatgat 4740
ggaagactgg gagagcctag acgaggaagc ttccgaggtc gaagaggtgt cagacgaaac 4800
accgtcaccc tcggtcgcat tcccctcgcc ggcgccccag aaatcggcaa ccggttccag 4860
catggctaca acctccgctc ctcaggcgcc gccggcactg cccgttcgcc gacccaaccg 4920
tagatgggac accactggaa ccagggccgg taagtccaag cagccgccgc cgttagccca 4980
agagcaacaa cagcgccaag gctaccgctc atggcgcggg cacaagaacg ccatagttgc 5040
ttgcttgcaa gactgtgggg gcaacatctc cttcgcccgc cgctttcttc tctaccatca 5100
cggcgtggcc ttcccccgta acatcctgca ttactaccgt catctctaca gcccatactg 5160
caccggcggc agcggcagcg gcagcaacag cagcggccac acagaagcaa aggcgaccgg 5220
atagcaagac tctgacaaag cccaagaaat ccacagcggc ggcagcagca ggaggaggag 5280
cgctgcgtct ggcgcccaac gaacccgtat cgacccgcga gcttagaaac aggatttttc 5340
ccactctgta tgctatattt caacagagca ggggccaaga acaagagctg aaaataaaaa 5400
acaggtctct gcgatccctc acccgcagct gcctgtatca caaaagcgaa gatcagcttc 5460
ggcgcacgct ggaagacgcg gaggctctct tcagtaaata ctgcgcgctg actcttaagg 5520
actagtttcg cgccctttct caaatttaag cgcgaaaact acgtcatctc cagcggccac 5580
acccggcgcc agcacctgtc gtcagcgcca ttatgagcaa ggaaattccc acgccctaca 5640
tgtggagtta ccagccacaa atgggacttg cggctggagc tgcccaagac tactcaaccc 5700
gaataaacta catgagcgcg ggaccccaca tgatatcccg ggtcaacgga atccgcgccc 5760
accgaaaccg aattctcttg gaacaggcgg ctattaccac cacacctcgt aataacctta 5820
atccccgtag ttggcccgct gccctggtgt accaggaaag tcccgctccc accactgtgg 5880
tacttcccag agacgcccag gccgaagttc agatgactaa ctcaggggcg cagcttgcgg 5940
gcggctttcg tcacagggtg cggtcgcccg ggcagggtat aactcacctg acaatcagag 6000
ggcgaggtat tcagctcaac gacgagtcgg tgagctcctc gcttggtctc cgtccggacg 6060
ggacatttca gatcggcggc gccggccgtc cttcattcac gcctcgtcag gcaatcctaa 6120
ctctgcagac ctcgtcctct gagccgcgct ctggaggcat tggaactctg caatttattg 6180
aggagtttgt gccatcggtc tactttaacc ccttctcggg acctcccggc cactatccgg 6240
atcaatttat tcctaacttt gacgcggtaa aggactcggc ggacggctac gactgaatgt 6300
taagtggaga ggcagagcaa ctgcgcctga aacacctggt ccactgtcgc cgccacaagt 6360
gctttgcccg cgactccggt gagttttgct actttgaatt gcccgaggat catatcgagg 6420
gcccggcgca cggcgtccgg cttaccgccc agggagagct tgcccgtagc ctgattcggg 6480
agtttaccca gcgccccctg ctagttgagc gggacagggg accctgtgtt ctcactgtga 6540
tttgcaactg tcctaacctt ggattacatc aagatctttg ttgccatctc tgtgctgagt 6600
ataataaata cagaaattaa aatatactgg ggctcctatc gccatcctgt aaacgccacc 6660
gtcttcaccc gcccaagcaa accaaggcga accttacctg gtacttttaa catctctccc 6720
tctgtgattt acaacagttt caacccagac ggagtgagtc tacgagagaa cctctccgag 6780
ctcagctact ccatcagaaa aaacaccacc ctccttacct gccgggaacg tacgagtgcg 6840
tcaccggccg ctgcaccaca cctaccgcct gaccgtaaac cagacttttt ccggacagac 6900
ctcaataact ctgtttacca gaacaggagg tgagcttaga aaacccttag ggtattaggc 6960
caaaggcgca gctactgtgg ggtttatgaa caattcaagc aactctacgg gctattctaa 7020
ttcaggtttc tctagaatct agaaatggac ggaattatta cagagcagcg cctgctagaa 7080
agacgcaggg cagcggccga gcaacagcgc atgaatcaag agctccaaga catggttaac 7140
ttgcaccagt gcaaaagggg tatcttttgt ctggtaaagc aggccaaagt cacctacgac 7200
agtaatacca ccggacaccg ccttagctac aagttgccaa ccaagcgtca gaaattggtg 7260
gtcatggtgg gagaaaagcc cattaccata actcagcact cggtagaaac cgaaggctgc 7320
attcactcac cttgtcaagg acctgaggat ctctgcaccc ttattaagac cctgtgcggt 7380
ctcaaagatc ttattccctt taactaataa aaaaaaataa taaagcatca cttacttaaa 7440
atcagttagc aaatttctgt ccagtttatt cagcagcacc tccttgccct cctcccagct 7500
ctggtattgc agcttcctcc tggctgcaaa ctttctccac aatctaaatg gaatgtcagt 7560
ttcctcctgt tcctgtccat ccgcacccac tatcttcatg ttgttgcaga tgaagcgcgc 7620
aagaccgtct gaagatacct tcaaccccgt gtatccatat gacacggaaa ccggtcctcc 7680
aactgtgcct tttcttactc ctccctttgt atcccccaat gggtttcaag agagtccccc 7740
tggggtactc tctttgcgcc tatccgaacc tctagttacc tccaatggca tgcttgcgct 7800
caaaatgggc aacggcctct ctctggacga ggccggcaac cttacctccc aaaatgtaac 7860
cactgtgagc ccacctctca aaaaaaccaa gtcaaacata aacctggaaa tatctgcacc 7920
cctcacagtt acctcagaag ccctaactgt ggctgccgcc gcacctctaa tggtcgcggg 7980
caacacactc accatgcaat cacaggcccc gctaaccgtg cacgactcca aacttagcat 8040
tgccacccaa ggacccctca cagtgtcaga aggaaagcta gccctgcaaa catcaggccc 8100
cctcaccacc accgatagca gtacccttac tatcactgcc tcaccccctc taactactgc 8160
cactggtagc ttgggcattg acttgaaaga gcccatttat acacaaaatg gaaaactagg 8220
actaaagtac ggggctcctt tgcatgtaac agacgaccta aacactttga ccgtagcaac 8280
tggtccaggt gtgactatta ataatacttc cttgcaaact aaagttactg gagccttggg 8340
ttttgattca caaggcaata tgcaacttaa tgtagcagga ggactaagga ttgattctca 8400
aaacagacgc cttatacttg atgttagtta tccgtttgat gctcaaaacc aactaaatct 8460
aagactagga cagggccctc tttttataaa ctcagcccac aacttggata ttaactacaa 8520
caaaggcctt tacttgttta cagcttcaaa caattccaaa aagcttgagg ttaacctaag 8580
cactgccaag gggttgatgt ttgacgctac agccatagcc attaatgcag gagatgggct 8640
tgaatttggt tcacctaatg caccaaacac aaatcccctc aaaacaaaaa ttggccatgg 8700
cctagaattt gattcaaaca aggctatggt tcctaaacta ggaactggcc ttagttttga 8760
cagcacaggt gccattacag taggaaacaa aaataatgat aagctaactt tgtggaccac 8820
accagctcca tctcctaact gtagactaaa tgcagagaaa gatgctaaac tcactttggt 8880
cttaacaaaa tgtggcagtc aaatacttgc tacagtttca gttttggctg ttaaaggcag 8940
tttggctcca atatctggaa cagttcaaag tgctcatctt attataagat ttgacgaaaa 9000
tggagtgcta ctaaacaatt ccttcctgga cccagaatat tggaacttta gaaatggaga 9060
tcttactgaa ggcacagcct atacaaacgc tgttggattt atgcctaacc tatcagctta 9120
tccaaaatct cacggtaaaa ctgccaaaag taacattgtc agtcaagttt acttaaacgg 9180
agacaaaact aaacctgtaa cactaaccat tacactaaac ggtacacagg aaacaggaga 9240
cacaactcca agtgcatact ctatgtcatt ttcatgggac tggtctggcc acaactacat 9300
taatgaaata tttgccacat cctcttacac tttttcatac attgcccaag aataaagaat 9360
cgtttgtgtt atgtttcaac gtgtttattt ttcaattgca gaaaatttca agtcattttt 9420
cattcagtag tatagcccca ccaccacata gcttatacag atcaccgtac cttaatcaaa 9480
ctcacagaac cctagtattc aacctgccac ctccctccca acacacagag tacacagtcc 9540
tttctccccg gctggcctta aaaagcatca tatcatgggt aacagacata ttcttaggtg 9600
ttatattcca cacggtttcc tgtcgagcca aacgctcatc agtgatatta ataaactccc 9660
cgggcagctc acttaagttc atgtcgctgt ccagctgctg agccacaggc tgctgtccaa 9720
cttgcggttg cttaacgggc ggcgaaggag aagtccacgc ctacatgggg gtagagtcat 9780
aatcgtgcat caggataggg cggtggtgct gcagcagcgc gcgaataaac tgctgccgcc 9840
gccgctccgt cctgcaggaa tacaacatgg cagtggtctc ctcagcgatg attcgcaccg 9900
cccgcagcat aaggcgcctt gtcctccggg cacagcagcg caccctgatc tcacttaaat 9960
cagcacagta actgcagcac agcaccacaa tattgttcaa aatcccacag tgcaaggcgc 10020
tgtatccaaa gctcatggcg gggaccacag aacccacgtg gccatcatac cacaagcgca 10080
ggtagattaa gtggcgaccc ctcataaaca cgctggacat aaacattacc tcttttggca 10140
tgttgtaatt caccacctcc cggtaccata taaacctctg attaaacatg gcgccatcca 10200
ccaccatcct aaaccagctg gccaaaacct gcccgccggc tatacactgc agggaaccgg 10260
gactggaaca atgacagtgg agagcccagg actcgtaacc atggatcatc atgctcgtca 10320
tgatatcaat gttggcacaa cacaggcaca cgtgcataca cttcctcagg attacaagct 10380
cctcccgcgt tagaaccata tcccagggaa caacccattc ctgaatcagc gtaaatccca 10440
cactgcaggg aagacctcgc acgtaactca cgttgtgcat tgtcaaagtg ttacattcgg 10500
gcagcagcgg atgatcctcc agtatggtag cgcgggtttc tgtctcaaaa ggaggtagac 10560
gatccctact gtacggagtg cgccgagaca accgagatcg tgttggtcgt agtgtcatgc 10620
caaatggaac gccggacgta gtcatatttc ctgaagcaaa accaggtgcg ggcgtgacaa 10680
acagatctgc gtctccggtc tcgccgctta gatcgctctg tgtagtagtt gtagtatatc 10740
cactctctca aagcatccag gcgccccctg gcttcgggtt ctatgtaaac tccttcatgc 10800
gccgctgccc tgataacatc caccaccgca gaataagcca cacccagcca acctacacat 10860
tcgttctgcg agtcacacac gggaggagcg ggaagagctg gaagaaccat gttttttttt 10920
ttattccaaa agattatcca aaacctcaaa atgaagatct attaagtgaa cgcgctcccc 10980
tccggtggcg tggtcaaact ctacagccaa agaacagata atggcatttg taagatgttg 11040
cacaatggct tccaaaaggc aaacggccct cacgtccaag tggacgtaaa ggctaaaccc 11100
ttcagggtga atctcctcta taaacattcc agcaccttca accatgccca aataattctc 11160
atctcgccac cttctcaata tatctctaag caaatcccga atattaagtc cggccattgt 11220
aaaaatctgc tccagagcgc cctccacctt cagcctcaag cagcgaatca tgattgcaaa 11280
aattcaggtt cctcacagac ctgtataaga ttcaaaagcg gaacattaac aaaaataccg 11340
cgatcccgta ggtcccttcg cagggccagc tgaacataat cgtgcaggtc tgcacggacc 11400
agcgcggcca cttccccgcc aggaaccatg acaaaagaac ccacactgat tatgacacgc 11460
atactcggag ctatgctaac cagcgtagcc ccgatgtaag cttgttgcat gggcggcgat 11520
ataaaatgca aggtgctgct caaaaaatca ggcaaagcct cgcgcaaaaa agaaagcaca 11580
tcgtagtcat gctcatgcag ataaaggcag gtaagctccg gaaccaccac agaaaaagac 11640
accatttttc tctcaaacat gtctgcgggt ttctgcataa acacaaaata aaataacaaa 11700
aaaacattta aacattagaa gcctgtctta caacaggaaa aacaaccctt ataagcataa 11760
gacggactac ggccatgccg gcgtgaccgt aaaaaaactg gtcaccgtga ttaaaaagca 11820
ccaccgacag ctcctcggtc atgtccggag tcataatgta agactcggta aacacatcag 11880
gttgattcac atcggtcagt gctaaaaagc gaccgaaata gcccggggga atacataccc 11940
gcaggcgtag agacaacatt acagccccca taggaggtat aacaaaatta ataggagaga 12000
aaaacacata aacacctgaa aaaccctcct gcctaggcaa aatagcaccc tcccgctcca 12060
gaacaacata cagcgcttcc acagcggcag ccataacagt cagccttacc agtaaaaaag 12120
aaaacctatt aaaaaaacac cactcgacac ggcaccagct caatcagtca cagtgtaaaa 12180
aagggccaag tgcagagcga gtatatatag gactaaaaaa tgacgtaacg gttaaagtcc 12240
acaaaaaaca cccagaaaac cgcacgcgaa cctacgccca gaaacgaaag ccaaaaaacc 12300
cacaacttcc tcaaatcgtc acttccgttt tcccacgtta cgtaacttcc cattttaaga 12360
aaactacaat tcccaacaca tacaagttac tccgccctaa aacctacgtc acccgccccg 12420
ttcccacgcc ccgcgccacg tcacaaactc caccccctca ttatcatatt ggcttcaatc 12480
caaaataagg tatattattg atgatg 12506
<210> 68
<211> 884
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第六DNA片段
<400> 68
gggactagtt tcgcgccctt tctcaaattt aagcgcgaaa actacgtcat ctccagcggc 60
cacacccggc gccagcacct gtcgtcagcg ccattatgag caaggaaatt cccacgccct 120
acatgtggag ttaccagcca caaatgggac ttgcggctgg agctgcccaa gactactcaa 180
cccgaataaa ctacatgagc gcgggacccc acatgatatc ccgggtcaac ggaatccgcg 240
cccaccgaaa ccgaattctc ttggaacagg cggctattac caccacacct cgtaataacc 300
ttaatccccg tagttggccc gctgccctgg tgtaccagga aagtcccgct cccaccactg 360
tggtacttcc cagagacgcc caggccgaag ttcagatgac taactcaggg gcgcagcttg 420
cgggcggctt tcgtcacagg gtgcggtcgc ccgggcaggg tataactcac ctgacaatca 480
gagggcgagg tattcagctc aacgacgagt cggtgagctc ctcgcttggt ctccgtccgg 540
acgggacatt tcagatcggc ggcgccggcc gtccttcatt cacgcctcgt caggcaatcc 600
taactctgca gacctcgtcc tctgagccgc gctctggagg cattggaact ctgcaattta 660
ttgaggagtt tgtgccatcg gtctacttta accccttctc gggacctccc ggccactatc 720
cggatcaatt tattcctaac tttgacgcgg taaaggactc ggcggacggc tacgactgaa 780
tgttataagt tcctgtccat ccgcacccac tatcttcatg ttgttgcaga tgaagcgcgc 840
aagaccgtct gaagatacct tcaaccccgt gtatccatat gccc 884
<210> 69
<211> 18040
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对应于Psi5-Left-Arm-2的ClaI-BamHI区的DNA
<400> 69
atcgatttaa gggtgggaaa gaatatataa ggtgggggtc ttatgtagtt ttgtatctgt 60
tttgcagcag ccgccgccgc catgagcacc aactcgtttg atggaagcat tgtgagctca 120
tatttgacaa cgcgcatgcc cccatgggcc ggggtgcgtc agaatgtgat gggctccagc 180
attgatggtc gccccgtcct gcccgcaaac tctactacct tgacctacga gaccgtgtct 240
ggaacgccgt tggagactgc agcctccgcc gccgcttcag ccgctgcagc caccgcccgc 300
gggattgtga ctgactttgc tttcctgagc ccgcttgcaa gcagtgcagc ttcccgttca 360
tccgcccgcg atgacaagtt gacggctctt ttggcacaat tggattcttt gacccgggaa 420
cttaatgtcg tttctcagca gctgttggat ctgcgccagc aggtttctgc cctgaaggct 480
tcctcccctc ccaatgcggt ttaaaacata aataaaaaac cagactctgt ttggatttgg 540
atcaagcaag tgtcttgctg tctttattta ggggttttgc gcgcgcggta ggcccgggac 600
cagcggtctc ggtcgttgag ggtcctgtgt attttttcca ggacgtggta aaggtgactc 660
tggatgttca gatacatggg cataagcccg tctctggggt ggaggtagca ccactgcaga 720
gcttcatgct gcggggtggt gttgtagatg atccagtcgt agcaggagcg ctgggcgtgg 780
tgcctaaaaa tgtctttcag tagcaagctg attgccaggg gcaggccctt ggtgtaagtg 840
tttacaaagc ggttaagctg ggatgggtgc atacgtgggg atatgagatg catcttggac 900
tgtattttta ggttggctat gttcccagcc atatccctcc ggggattcat gttgtgcaga 960
accaccagca cagtgtatcc ggtgcacttg ggaaatttgt catgtagctt agaaggaaat 1020
gcgtggaaga acttggagac gcccttgtga cctccaagat tttccatgca ttcgtccata 1080
atgatggcaa tgggcccacg ggcggcggcc tgggcgaaga tatttctggg atcactaacg 1140
tcatagttgt gttccaggat gagatcgtca taggccattt ttacaaagcg cgggcggagg 1200
gtgccagact gcggtataat ggttccatcc ggcccagggg cgtagttacc ctcacagatt 1260
tgcatttccc acgctttgag ttcagatggg gggatcatgt ctacctgcgg ggcgatgaag 1320
aaaacggttt ccggggtagg ggagatcagc tgggaagaaa gcaggttcct gagcagctgc 1380
gacttaccgc agccggtggg cccgtaaatc acacctatta ccgggtgcaa ctggtagtta 1440
agagagctgc agctgccgtc atccctgagc aggggggcca cttcgttaag catgtccctg 1500
actcgcatgt tttccctgac caaatccgcc agaaggcgct cgccgcccag cgatagcagt 1560
tcttgcaagg aagcaaagtt tttcaacggt ttgagaccgt ccgccgtagg catgcttttg 1620
agcgtttgac caagcagttc caggcggtcc cacagctcgg tcacctgctc tacggcatct 1680
cgatccagca tatctcctcg tttcgcgggt tggggcggct ttcgctgtac ggcagtagtc 1740
ggtgctcgtc cagacgggcc agggtcatgt ctttccacgg gcgcagggtc ctcgtcagcg 1800
tagtctgggt cacggtgaag gggtgcgctc cgggctgcgc gctggccagg gtgcgcttga 1860
ggctggtcct gctggtgctg aagcgctgcc ggtcttcgcc ctgcgcgtcg gccaggtagc 1920
atttgaccat ggtgtcatag tccagcccct ccgcggcgtg gcccttggcg cgcagcttgc 1980
ccttggagga ggcgccgcac gaggggcagt gcagactttt gagggcgtag agcttgggcg 2040
cgagaaatac cgattccggg gagtaggcat ccgcgccgca ggccccgcag acggtctcgc 2100
attccacgag ccaggtgagc tctggccgtt cggggtcaaa aaccaggttt cccccatgct 2160
ttttgatgcg tttcttacct ctggtttcca tgagccggtg tccacgctcg gtgacgaaaa 2220
ggctgtccgt gtccccgtat acagacttga gaggcctgtc ctcgagcggt gttccgcggt 2280
cctcctcgta tagaaactcg gaccactctg agacaaaggc tcgcgtccag gccagcacga 2340
aggaggctaa gtgggagggg tagcggtcgt tgtccactag ggggtccact cgctccaggg 2400
tgtgaagaca catgtcgccc tcttcggcat caaggaaggt gattggtttg taggtgtagg 2460
ccacgtgacc gggtgttcct gaaggggggc tataaaaggg ggtgggggcg cgttcgtcct 2520
cactctcttc cgcatcgctg tctgcgaggg ccagctgttg gggtgagtac tccctctgaa 2580
aagcgggcat gacttctgcg ctaagattgt cagtttccaa aaacgaggag gatttgatat 2640
tcacctggcc cgcggtgatg cctttgaggg tggccgcatc catctggtca gaaaagacaa 2700
tctttttgtt gtcaagcttg gtggcaaacg acccgtagag ggcgttggac agcaacttgg 2760
cgatggagcg cagggtttgg tttttgtcgc gatcggcgcg ctccttggcc gcgatgttta 2820
gctgcacgta ttcgcgcgca acgcaccgcc attcgggaaa gacggtggtg cgctcgtcgg 2880
gcaccaggtg cacgcgccaa ccgcggttgt gcagggtgac aaggtcaacg ctggtggcta 2940
cctctccgcg taggcgctcg ttggtccagc agaggcggcc gcccttgcgc gagcagaatg 3000
gcggtagggg gtctagctgc gtctcgtccg gggggtctgc gtccacggta aagaccccgg 3060
gcagcaggcg cgcgtcgaag tagtctatct tgcatccttg caagtctagc gcctgctgcc 3120
atgcgcgggc ggcaagcgcg cgctcgtatg ggttgagtgg gggaccccat ggcatggggt 3180
gggtgagcgc ggaggcgtac atgccgcaaa tgtcgtaaac gtagaggggc tctctgagta 3240
ttccaagata tgtagggtag catcttccac cgcggatgct ggcgcgcacg taatcgtata 3300
gttcgtgcga gggagcgagg aggtcgggac cgaggttgct acgggcgggc tgctctgctc 3360
ggaagactat ctgcctgaag atggcatgtg agttggatga tatggttgga cgctggaaga 3420
cgttgaagct ggcgtctgtg agacctaccg cgtcacgcac gaaggaggcg taggagtcgc 3480
gcagcttgtt gaccagctcg gcggtgacct gcacgtctag ggcgcagtag tccagggttt 3540
ccttgatgat gtcatactta tcctgtccct tttttttcca cagctcgcgg ttgaggacaa 3600
actcttcgcg gtctttccag tactcttgga tcggaaaccc gtcggcctcc gaacggtaag 3660
agcctagcat gtagaactgg ttgacggcct ggtaggcgca gcatcccttt tctacgggta 3720
gcgcgtatgc ctgcgcggcc ttccggagcg aggtgtgggt gagcgcaaag gtgtccctga 3780
ccatgacttt gaggtactgg tatttgaagt cagtgtcgtc gcatccgccc tgctcccaga 3840
gcaaaaagtc cgtgcgcttt ttggaacgcg gatttggcag ggcgaaggtg acatcgttga 3900
agagtatctt tcccgcgcga ggcataaagt tgcgtgtgat gcggaagggt cccggcacct 3960
cggaacggtt gttaattacc tgggcggcga gcacgatctc gtcaaagccg ttgatgttgt 4020
ggcccacaat gtaaagttcc aagaagcgcg ggatgccctt gatggaaggc aattttttaa 4080
gttcctcgta ggtgagctct tcaggggagc tgagcccgtg ctctgaaagg gcccagtctg 4140
caagatgagg gttggaagcg acgaatgagc tccacaggtc acgggccatt agcatttgca 4200
ggtggtcgcg aaaggtccta aactggcgac ctatggccat tttttctggg gtgatgcagt 4260
agaaggtaag cgggtcttgt tcccagcggt cccatccaag gttcgcggct aggtctcgcg 4320
cggcagtcac tagaggctca tctccgccga acttcatgac cagcatgaag ggcacgagct 4380
gcttcccaaa ggcccccatc caagtatagg tctctacatc gtaggtgaca aagagacgct 4440
cggtgcgagg atgcgagccg atcgggaaga actggatctc ccgccaccaa ttggaggagt 4500
ggctattgat gtggtgaaag tagaagtccc tgcgacgggc cgaacactcg tgctggcttt 4560
tgtaaaaacg tgcgcagtac tggcagcggt gcacgggctg tacatcctgc acgaggttga 4620
cctgacgacc gcgcacaagg aagcagagtg ggaatttgag cccctcgcct ggcgggtttg 4680
gctggtggtc ttctacttcg gctgcttgtc cttgaccgtc tggctgctcg aggggagtta 4740
cggtggatcg gaccaccacg ccgcgcgagc ccaaagtcca gatgtccgcg cgcggcggtc 4800
ggagcttgat gacaacatcg cgcagatggg agctgtccat ggtctggagc tcccgcggcg 4860
tcaggtcagg cgggagctcc tgcaggttta cctcgcatag acgggtcagg gcgcgggcta 4920
gatccaggtg atacctaatt tccaggggct ggttggtggc ggcgtcgatg gcttgcaaga 4980
ggccgcatcc ccgcggcgcg actacggtac cgcgcggcgg gcggtgggcc gcgggggtgt 5040
ccttggatga tgcatctaaa agcggtgacg cgggcgagcc cccggaggta gggggggctc 5100
cggacccgcc gggagagggg gcaggggcac gtcggcgccg cgcgcgggca ggagctggtg 5160
ctgcgcgcgt aggttgctgg cgaacgcgac gacgcggcgg ttgatctcct gaatctggcg 5220
cctctgcgtg aagacgacgg gcccggtgag cttgagcctg aaagagagtt cgacagaatc 5280
aatttcggtg tcgttgacgg cggcctggcg caaaatctcc tgcacgtctc ctgagttgtc 5340
ttgataggcg atctcggcca tgaactgctc gatctcttcc tcctggagat ctccgcgtcc 5400
ggctcgctcc acggtggcgg cgaggtcgtt ggaaatgcgg gccatgagct gcgagaaggc 5460
gttgaggcct ccctcgttcc agacgcggct gtagaccacg cccccttcgg catcgcgggc 5520
gcgcatgacc acctgcgcga gattgagctc cacgtgccgg gcgaagacgg cgtagtttcg 5580
caggcgctga aagaggtagt tgagggtggt ggcggtgtgt tctgccacga agaagtacat 5640
aacccagcgt cgcaacgtgg attcgttgat atcccccaag gcctcaaggc gctccatggc 5700
ctcgtagaag tccacggcga agttgaaaaa ctgggagttg cgcgccgaca cggttaactc 5760
ctcctccaga agacggatga gctcggcgac agtgtcgcgc acctcgcgct caaaggctac 5820
aggggcctct tcttcttctt caatctcctc ttccataagg gcctcccctt cttcttcttc 5880
tggcggcggt gggggagggg ggacacggcg gcgacgacgg cgcaccggga ggcggtcgac 5940
aaagcgctcg atcatctccc cgcggcgacg gcgcatggtc tcggtgacgg cgcggccgtt 6000
ctcgcggggg cgcagttgga agacgccgcc cgtcatgtcc cggttatggg ttggcggggg 6060
gctgccatgc ggcagggata cggcgctaac gatgcatctc aacaattgtt gtgtaggtac 6120
tccgccgccg agggacctga gcgagtccgc atcgaccgga tcggaaaacc tctcgagaaa 6180
ggcgtctaac cagtcacagt cgcaaggtag gctgagcacc gtggcgggcg gcagcgggcg 6240
gcggtcgggg ttgtttctgg cggaggtgct gctgatgatg taattaaagt aggcggtctt 6300
gagacggcgg atggtcgaca gaagcaccat gtccttgggt ccggcctgct gaatgcgcag 6360
gcggtcggcc atgccccagg cttcgttttg acatcggcgc aggtctttgt agtagtcttg 6420
catgagcctt tctaccggca cttcttcttc tccttcctct tgtcctgcat ctcttgcatc 6480
tatcgctgcg gcggcggcgg agtttggccg taggtggcgc cctcttcctc ccatgcgtgt 6540
gaccccgaag cccctcatcg gctgaagcag ggctaggtcg gcgacaacgc gctcggctaa 6600
tatggcctgc tgcacctgcg tgagggtaga ctggaagtca tccatgtcca caaagcggtg 6660
gtatgcgccc gtgttgatgg tgtaagtgca gttggccata acggaccagt taacggtctg 6720
gtgacccggc tgcgagagct cggtgtacct gagacgcgag taagccctcg agtcaaatac 6780
gtagtcgttg caagtccgca ccaggtactg gtatcccacc aaaaagtgcg gcggcggctg 6840
gcggtagagg ggccagcgta gggtggccgg ggctccgggg gcgagatctt ccaacataag 6900
gcgatgatat ccgtagatgt acctggacat ccaggtgatg ccggcggcgg tggtggaggc 6960
gcgcggaaag tcgcggacgc ggttccagat gttgcgcagc ggcaaaaagt gctccatggt 7020
cgggacgctc tggccggtca ggcgcgcgca atcgttgacg ctctagaccg tgcaaaagga 7080
gagcctgtaa gcgggcactc ttccgtggtc tggtggataa attcgcaagg gtatcatggc 7140
ggacgaccgg ggttcgagcc ccgtatccgg ccgtccgccg tgatccatgc ggttaccgcc 7200
cgcgtgtcga acccaggtgt gcgacgtcag acaacggggg agtgctcctt ttggcttcct 7260
tccaggcgcg gcggctgctg cgctagcttt tttggccact ggccgcgcgc agcgtaagcg 7320
gttaggctgg aaagcgaaag cattaagtgg ctcgctccct gtagccggag ggttattttc 7380
caagggttga gtcgcgggac ccccggttcg agtctcggac cggccggact gcggcgaacg 7440
ggggtttgcc tccccgtcat gcaagacccc gcttgcaaat tcctccggaa acagggacga 7500
gccccttttt tgcttttccc agatgcatcc ggtgctgcgg cagatgcgcc cccctcctca 7560
gcagcggcaa gagcaagagc agcggcagac atgcagggca ccctcccctc ctcctaccgc 7620
gtcaggaggg gcgacatccg cggttgacgc ggcagcagat ggtgattacg aacccccgcg 7680
gcgccgggcc cggcactacc tggacttgga ggagggcgag ggcctggcgc ggctaggagc 7740
gccctctcct gagcggtacc caagggtgca gctgaagcgt gatacgcgtg aggcgtacgt 7800
gccgcggcag aacctgtttc gcgaccgcga gggagaggag cccgaggaga tgcgggatcg 7860
aaagttccac gcagggcgcg agctgcggca tggcctgaat cgcgagcggt tgctgcgcga 7920
ggaggacttt gagcccgacg cgcgaaccgg gattagtccc gcgcgcgcac acgtggcggc 7980
cgccgacctg gtaaccgcat acgagcagac ggtgaaccag gagattaact ttcaaaaaag 8040
ctttaacaac cacgtgcgta cgcttgtggc gcgcgaggag gtggctatag gactgatgca 8100
tctgtgggac tttgtaagcg cgctggagca aaacccaaat agcaagccgc tcatggcgca 8160
gctgttcctt atagtgcagc acagcaggga caacgaggca ttcagggatg cgctgctaaa 8220
catagtagag cccgagggcc gctggctgct cgatttgata aacatcctgc agagcatagt 8280
ggtgcaggag cgcagcttga gcctggctga caaggtggcc gccatcaact attccatgct 8340
tagcctgggc aagttttacg cccgcaagat ataccatacc ccttacgttc ccatagacaa 8400
ggaggtaaag atcgaggggt tctacatgcg catggcgctg aaggtgctta ccttgagcga 8460
cgacctgggc gtttatcgca acgagcgcat ccacaaggcc gtgagcgtga gccggcggcg 8520
cgagctcagc gaccgcgagc tgatgcacag cctgcaaagg gccctggctg gcacgggcag 8580
cggcgataga gaggccgagt cctactttga cgcgggcgct gacctgcgct gggccccaag 8640
ccgacgcgcc ctggaggcag ctggggccgg acctgggctg gcggtggcac ccgcgcgcgc 8700
tggcaacgtc ggcggcgtgg aggaatatga cgaggacgat gagtacgagc cagaggacgg 8760
cgagtactaa gcggtgatgt ttctgatcag atgatgcaag acgcaacgga cccggcggtg 8820
cgggcggcgc tgcagagcca gccgtccggc cttaactcca cggacgactg gcgccaggtc 8880
atggaccgca tcatgtcgct gactgcgcgc aatcctgacg cgttccggca gcagccgcag 8940
gccaaccggc tctccgcaat tctggaagcg gtggtcccgg cgcgcgcaaa ccccacgcac 9000
gagaaggtgc tggcgatcgt aaacgcgctg gccgaaaaca gggccatccg gcccgacgag 9060
gccggcctgg tctacgacgc gctgcttcag cgcgtggctc gttacaacag cggcaacgtg 9120
cagaccaacc tggaccggct ggtgggggat gtgcgcgagg ccgtggcgca gcgtgagcgc 9180
gcgcagcagc agggcaacct gggctccatg gttgcactaa acgccttcct gagtacacag 9240
cccgccaacg tgccgcgggg acaggaggac tacaccaact ttgtgagcgc actgcggcta 9300
atggtgactg agacaccgca aagtgaggtg taccagtctg ggccagacta ttttttccag 9360
accagtagac aaggcctgca gaccgtaaac ctgagccagg ctttcaaaaa cttgcagggg 9420
ctgtgggggg tgcgggctcc cacaggcgac cgcgcgaccg tgtctagctt gctgacgccc 9480
aactcgcgcc tgttgctgct gctaatagcg cccttcacgg acagtggcag cgtgtcccgg 9540
gacacatacc taggtcactt gctgacactg taccgcgagg ccataggtca ggcgcatgtg 9600
gacgagcata ctttccagga gattacaagt gtcagccgcg cgctggggca ggaggacacg 9660
ggcagcctgg aggcaaccct aaactacctg ctgaccaacc ggcggcagaa gatcccctcg 9720
ttgcacagtt taaacagcga ggaggagcgc attttgcgct acgtgcagca gagcgtgagc 9780
cttaacctga tgcgcgacgg ggtaacgccc agcgtggcgc tggacatgac cgcgcgcaac 9840
atggaaccgg gcatgtatgc ctcaaaccgg ccgtttatca accgcctaat ggactacttg 9900
catcgcgcgg ccgccgtgaa ccccgagtat ttcaccaatg ccatcttgaa cccgcactgg 9960
ctaccgcccc ctggtttcta caccggggga ttcgaggtgc ccgagggtaa cgatggattc 10020
ctctgggacg acatagacga cagcgtgttt tccccgcaac cgcagaccct gctagagttg 10080
caacagcgcg agcaggcaga ggcggcgctg cgaaaggaaa gcttccgcag gccaagcagc 10140
ttgtccgatc taggcgctgc ggccccgcgg tcagatgcta gtagcccatt tccaagcttg 10200
atagggtctc ttaccagcac tcgcaccacc cgcccgcgcc tgctgggcga ggaggagtac 10260
ctaaacaact cgctgctgca gccgcagcgc gaaaaaaacc tgcctccggc atttcccaac 10320
aacgggatag agagcctagt ggacaagatg agtagatgga agacgtacgc gcaggagcac 10380
agggacgtgc caggcccgcg cccgcccacc cgtcgtcaaa ggcacgaccg tcagcggggt 10440
ctggtgtggg aggacgatga ctcggcagac gacagcagcg tcctggattt gggagggagt 10500
ggcaacccgt ttgcgcacct tcgccccagg ctggggagaa tgttttaaaa aaaaaaaagc 10560
atgatgcaaa ataaaaaact caccaaggcc atggcaccga gcgttggttt tcttgtattc 10620
cccttagtat gcggcgcgcg gcgatgtatg aggaaggtcc tcctccctcc tacgagagtg 10680
tggtgagcgc ggcgccagtg gcggcggcgc tgggttctcc cttcgatgct cccctggacc 10740
cgccgtttgt gcctccgcgg tacctgcggc ctaccggggg gagaaacagc atccgttact 10800
ctgagttggc acccctattc gacaccaccc gtgtgtacct ggtggacaac aagtcaacgg 10860
atgtggcatc cctgaactac cagaacgacc acagcaactt tctgaccacg gtcattcaaa 10920
acaatgacta cagcccgggg gaggcaagca cacagaccat caatcttgac gaccggtcgc 10980
actggggcgg cgacctgaaa accatcctgc ataccaacat gccaaatgtg aacgagttca 11040
tgtttaccaa taagtttaag gcgcgggtga tggtgtcgcg cttgcctact aaggacaatc 11100
aggtggagct gaaatacgag tgggtggagt tcacgctgcc cgagggcaac tactccgaga 11160
ccatgaccat agaccttatg aacaacgcga tcgtggagca ctacttgaaa gtgggcagac 11220
agaacggggt tctggaaagc gacatcgggg taaagtttga cacccgcaac ttcagactgg 11280
ggtttgaccc cgtcactggt cttgtcatgc ctggggtata tacaaacgaa gccttccatc 11340
cagacatcat tttgctgcca ggatgcgggg tggacttcac ccacagccgc ctgagcaact 11400
tgttgggcat ccgcaagcgg caacccttcc aggagggctt taggatcacc tacgatgatc 11460
tggagggtgg taacattccc gcactgttgg atgtggacgc ctaccaggcg agcttgaaag 11520
atgacaccga acagggcggg ggtggcgcag gcggcagcaa cagcagtggc agcggcgcgg 11580
aagagaactc caacgcggca gccgcggcaa tgcagccggt ggaggacatg aacgatcatg 11640
ccattcgcgg cgacaccttt gccacacggg ctgaggagaa gcgcgctgag gccgaagcag 11700
cggccgaagc tgccgccccc gctgcgcaac ccgaggtcga gaagcctcag aagaaaccgg 11760
tgatcaaacc cctgacagag gacagcaaga aacgcagtta caacctaata agcaatgaca 11820
gcaccttcac ccagtaccgc agctggtacc ttgcatacaa ctacggcgac cctcagaccg 11880
gaatccgctc atggaccctg ctttgcactc ctgacgtaac ctgcggctcg gagcaggtct 11940
actggtcgtt gccagacatg atgcaagacc ccgtgacctt ccgctccacg cgccagatca 12000
gcaactttcc ggtggtgggc gccgagctgt tgcccgtgca ctccaagagc ttctacaacg 12060
accaggccgt ctactcccaa ctcatccgcc agtttacctc tctgacccac gtgttcaatc 12120
gctttcccga gaaccagatt ttggcgcgcc cgccagcccc caccatcacc accgtcagtg 12180
aaaacgttcc tgctctcaca gatcacggga cgctaccgct gcgcaacagc atcggaggag 12240
tccagcgagt gaccattact gacgccagac gccgcacctg cccctacgtt tacaaggccc 12300
tgggcatagt ctcgccgcgc gtcctatcga gccgcacttt ttgagcaagc atgtccatcc 12360
ttatatcgcc cagcaataac acaggctggg gcctgcgctt cccaagcaag atgtttggcg 12420
gggccaagaa gcgctccgac caacacccag tgcgcgtgcg cgggcactac cgcgcgccct 12480
ggggcgcgca caaacgcggc cgcactgggc gcaccaccgt cgatgacgcc atcgacgcgg 12540
tggtggagga ggcgcgcaac tacacgccca cgccgccacc agtgtccaca gtggacgcgg 12600
ccattcagac cgtggtgcgc ggagcccggc gctatgctaa aatgaagaga cggcggaggc 12660
gcgtagcacg tcgccaccgc cgccgacccg gcactgccgc ccaacgcgcg gcggcggccc 12720
tgcttaaccg cgcacgtcgc accggccgac gggcggccat gcgggccgct cgaaggctgg 12780
ccgcgggtat tgtcactgtg ccccccaggt ccaggcgacg agcggccgcc gcagcagccg 12840
cggccattag tgctatgact cagggtcgca ggggcaacgt gtattgggtg cgcgactcgg 12900
ttagcggcct gcgcgtgccc gtgcgcaccc gccccccgcg caactagatt gcaagaaaaa 12960
actacttaga ctcgtactgt tgtatgtatc cagcggcggc ggcgcgcaac gaagctatgt 13020
ccaagcgcaa aatcaaagaa gagatgctcc aggtcatcgc gccggagatc tatggccccc 13080
cgaagaagga agagcaggat tacaagcccc gaaagctaaa gcgggtcaaa aagaaaaaga 13140
aagatgatga tgatgaactt gacgacgagg tggaactgct gcacgctacc gcgcccaggc 13200
gacgggtaca gtggaaaggt cgacgcgtaa aacgtgtttt gcgacccggc accaccgtag 13260
tctttacgcc cggtgagcgc tccacccgca cctacaagcg cgtgtatgat gaggtgtacg 13320
gcgacgagga cctgcttgag caggccaacg agcgcctcgg ggagtttgcc tacggaaagc 13380
ggcataagga catgctggcg ttgccgctgg acgagggcaa cccaacacct agcctaaagc 13440
ccgtaacact gcagcaggtg ctgcccgcgc ttgcaccgtc cgaagaaaag cgcggcctaa 13500
agcgcgagtc tggtgacttg gcacccaccg tgcagctgat ggtacccaag cgccagcgac 13560
tggaagatgt cttggaaaaa atgaccgtgg aacctgggct ggagcccgag gtccgcgtgc 13620
ggccaatcaa gcaggtggcg ccgggactgg gcgtgcagac cgtggacgtt cagataccca 13680
ctaccagtag caccagtatt gccaccgcca cagagggcat ggagacacaa acgtccccgg 13740
ttgcctcagc ggtggcggat gccgcggtgc aggcggtcgc tgcggccgcg tccaagacct 13800
ctacggaggt gcaaacggac ccgtggatgt ttcgcgtttc agccccccgg cgcccgcgcg 13860
gttcgaggaa gtacggcgcc gccagcgcgc tactgcccga atatgcccta catccttcca 13920
ttgcgcctac ccccggctat cgtggctaca cctaccgccc cagaagacga gcaactaccc 13980
gacgccgaac caccactgga acccgccgcc gccgtcgccg tcgccagccc gtgctggccc 14040
cgatttccgt gcgcagggtg gctcgcgaag gaggcaggac cctggtgctg ccaacagcgc 14100
gctaccaccc cagcatcgtt taaaagccgg tctttgtggt tcttgcagat atggccctca 14160
cctgccgcct ccgtttcccg gtgccgggat tccgaggaag aatgcaccgt aggaggggca 14220
tggccggcca cggcctgacg ggcggcatgc gtcgtgcgca ccaccggcgg cggcgcgcgt 14280
cgcaccgtcg catgcgcggc ggtatcctgc ccctccttat tccactgatc gccgcggcga 14340
ttggcgccgt gcccggaatt gcatccgtgg ccttgcaggc gcagagacac tgattaaaaa 14400
caagttgcat gtggaaaaat caaaataaaa agtctggact ctcacgctcg cttggtcctg 14460
taactatttt gtagaatgga agacatcaac tttgcgtctc tggccccgcg acacggctcg 14520
cgcccgttca tgggaaactg gcaagatatc ggcaccagca atatgagcgg tggcgccttc 14580
agctggggct cgctgtggag cggcattaaa aatttcggtt ccaccgttaa gaactatggc 14640
agcaaggcct ggaacagcag cacaggccag atgctgaggg ataagttgaa agagcaaaat 14700
ttccaacaaa aggtggtaga tggcctggcc tctggcatta gcggggtggt ggacctggcc 14760
aaccaggcag tgcaaaataa gattaacagt aagcttgatc cccgccctcc cgtagaggag 14820
cctccaccgg ccgtggagac agtgtctcca gaggggcgtg gcgaaaagcg tccgcgcccc 14880
gacagggaag aaactctggt gacgcaaata gacgagcctc cctcgtacga ggaggcacta 14940
aagcaaggcc tgcccaccac ccgtcccatc gcgcccatgg ctaccggagt gctgggccag 15000
cacacacccg taacgctgga cctgcctccc cccgccgaca cccagcagaa acctgtgctg 15060
ccaggcccga ccgccgttgt tgtaacccgt cctagccgcg cgtccctgcg ccgcgccgcc 15120
agcggtccgc gatcgttgcg gcccgtagcc agtggcaact ggcaaagcac actgaacagc 15180
atcgtgggtc tgggggtgca atccctgaag cgccgacgat gcttctgaat agctaacgtg 15240
tcgtatgtgt gtcatgtatg cgtccatgtc gccgccagag gagctgctga gccgccgcgc 15300
gcccgctttc caagatggct accccttcga tgatgccgca gtggtcttac atgcacatct 15360
cgggccagga cgcctcggag tacctgagcc ccgggctggt gcagtttgcc cgcgccaccg 15420
agacgtactt cagcctgaat aacaagttta gaaaccccac ggtggcgcct acgcacgacg 15480
tgaccacaga ccggtcccag cgtttgacgc tgcggttcat ccctgtggac cgtgaggata 15540
ctgcgtactc gtacaaggcg cggttcaccc tagctgtggg tgataaccgt gtgctggaca 15600
tggcttccac gtactttgac atccgcggcg tgctggacag gggccctact tttaagccct 15660
actctggcac tgcctacaac gccctggctc ccaagggtgc cccaaatcct tgcgaatggg 15720
atgaagctgc tactgctctt gaaataaacc tagaagaaga ggacgatgac aacgaagacg 15780
aagtagacga gcaagctgag cagcaaaaaa ctcacgtatt tgggcaggcg ccttattctg 15840
gtataaatat tacaaaggag ggtattcaaa taggtgtcga aggtcaaaca cctaaatatg 15900
ccgataaaac atttcaacct gaacctcaaa taggagaatc tcagtggtac gaaactgaaa 15960
ttaatcatgc agctgggaga gtccttaaaa agactacccc aatgaaacca tgttacggtt 16020
catatgcaaa acccacaaat gaaaatggag ggcaaggcat tcttgtaaag caacaaaatg 16080
gaaagctaga aagtcaagtg gaaatgcaat ttttctcaac tactgaggcg accgcaggca 16140
atggtgataa cttgactcct aaagtggtat tgtacagtga agatgtagat atagaaaccc 16200
cagacactca tatttcttac atgcccacta ttaaggaagg taactcacga gaactaatgg 16260
gccaacaatc tatgcccaac aggcctaatt acattgcttt tagggacaat tttattggtc 16320
taatgtatta caacagcacg ggtaatatgg gtgttctggc gggccaagca tcgcagttga 16380
atgctgttgt agatttgcaa gacagaaaca cagagctttc ataccagctt ttgcttgatt 16440
ccattggtga tagaaccagg tacttttcta tgtggaatca ggctgttgac agctatgatc 16500
cagatgttag aattattgaa aatcatggaa ctgaagatga acttccaaat tactgctttc 16560
cactgggagg tgtgattaat acagagactc ttaccaaggt aaaacctaaa acaggtcagg 16620
aaaatggatg ggaaaaagat gctacagaat tttcagataa aaatgaaata agagttggaa 16680
ataattttgc catggaaatc aatctaaatg ccaacctgtg gagaaatttc ctgtactcca 16740
acatagcgct gtatttgccc gacaagctaa agtacagtcc ttccaacgta aaaatttctg 16800
ataacccaaa cacctacgac tacatgaaca agcgagtggt ggctcccggg ttagtggact 16860
gctacattaa ccttggagca cgctggtccc ttgactatat ggacaacgtc aacccattta 16920
accaccaccg caatgctggc ctgcgctacc gctcaatgtt gctgggcaat ggtcgctatg 16980
tgcccttcca catccaggtg cctcagaagt tctttgccat taaaaacctc cttctcctgc 17040
cgggctcata cacctacgag tggaacttca ggaaggatgt taacatggtt ctgcagagct 17100
ccctaggaaa tgacctaagg gttgacggag ccagcattaa gtttgatagc atttgccttt 17160
acgccacctt cttccccatg gcccacaaca ccgcctccac gcttgaggcc atgcttagaa 17220
acgacaccaa cgaccagtcc tttaacgact atctctccgc cgccaacatg ctctacccta 17280
tacccgccaa cgctaccaac gtgcccatat ccatcccctc ccgcaactgg gcggctttcc 17340
gcggctgggc cttcacgcgc cttaagacta aggaaacccc atcactgggc tcgggctacg 17400
acccttatta cacctactct ggctctatac cctacctaga tggaaccttt tacctcaacc 17460
acacctttaa gaaggtggcc attacctttg actcttctgt cagctggcct ggcaatgacc 17520
gcctgcttac ccccaacgag tttgaaatta agcgctcagt tgacggggag ggttacaacg 17580
ttgcccagtg taacatgacc aaagactggt tcctggtaca aatgctagct aactacaaca 17640
ttggctacca gggcttctat atcccagaga gctacaagga ccgcatgtac tccttcttta 17700
gaaacttcca gcccatgagc cgtcaggtgg tggatgatac taaatacaag gactaccaac 17760
aggtgggcat cctacaccaa cacaacaact ctggatttgt tggctacctt gcccccacca 17820
tgcgcgaagg acaggcctac cctgctaact tcccctatcc gcttataggc aagaccgcag 17880
ttgacagcat tacccagaaa aagtttcttt gcgatcgcac cctttggcgc atcccattct 17940
ccagtaactt tatgtccatg ggcgcactca cagacctggg ccaaaacctt ctctacgcca 18000
actccgccca cgcgctagac atgacttttg aggtggatcc 18040
<210> 70
<211> 1238
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第七DNA片段
<400> 70
ctgcctaggc aaaatagcac cctcccgctc cagaacaaca tacagcgctt ccacagcggc 60
agccataaca gtcagcctta ccagtaaaaa agaaaaccta ttaaaaaaac accactcgac 120
acggcaccag ctcaatcagt cacagtgtaa aaaagggcca agtgcagagc gagtatatat 180
aggactaaaa aatgacgtaa cggttaaagt ccacaaaaaa cacccagaaa accgcacgcg 240
aacctacgcc cagaaacgaa agccaaaaaa cccacaactt cctcaaatcg tcacttccgt 300
tttcccacgt tacgtcactt cccattttaa gaaaactaca attcccaaca catacaagtt 360
actccgccct aaaacttaca tcgttaatta agcagtgggc ttacatggcg atagctagac 420
tgggcggttt tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag 480
gttgggaagc cctgcaaagt aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat ctgatggcgc 540
aggggatcaa gctctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat 600
ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca 660
caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg 720
gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg 780
cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact 840
gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct 900
caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg 960
cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt 1020
actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc 1080
gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc 1140
gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga 1200
ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgcta 1238
<210> 71
<211> 30991
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAdBest_dITR
<400> 71
ttaattaagc agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat ggacagcaag 60
cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct gcaaagtaaa 120
ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagct ctgatcaaga 180
gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc 240
cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga 300
tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct 360
gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaagacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac 420
gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct 480
attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt 540
atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt 600
cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt 660
cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag 720
gctcaaggcg agcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt 780
gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg 840
tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg 900
cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg 960
catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgacct caggttactc atatatactt 1020
tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 1080
aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 1140
gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 1200
acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 1260
tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 1320
ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 1380
atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 1440
agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 1500
cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 1560
agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 1620
acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 1680
gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 1740
ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 1800
gctcttaatt aaatcgattt aagggtggga aagaatatat aaggtggggg tcttatgtag 1860
ttttgtatct gttttgcagc agccgccgcc gccatgagca ccaactcgtt tgatggaagc 1920
attgtgagct catatttgac aacgcgcatg cccccatggg ccggggtgcg tcagaatgtg 1980
atgggctcca gcattgatgg tcgccccgtc ctgcccgcaa actctactac cttgacctac 2040
gagaccgtgt ctggaacgcc gttggagact gcagcctccg ccgccgcttc agccgctgca 2100
gccaccgccc gcgggattgt gactgacttt gctttcctga gcccgcttgc aagcagtgca 2160
gcttcccgtt catccgcccg cgatgacaag ttgacggctc ttttggcaca attggattct 2220
ttgacccggg aacttaatgt cgtttctcag cagctgttgg atctgcgcca gcaggtttct 2280
gccctgaagg cttcctcccc tcccaatgcg gtttaaaaca taaataaaaa accagactct 2340
gtttggattt ggatcaagca agtgtcttgc tgtctttatt taggggtttt gcgcgcgcgg 2400
taggcccggg accagcggtc tcggtcgttg agggtcctgt gtattttttc caggacgtgg 2460
taaaggtgac tctggatgtt cagatacatg ggcataagcc cgtctctggg gtggaggtag 2520
caccactgca gagcttcatg ctgcggggtg gtgttgtaga tgatccagtc gtagcaggag 2580
cgctgggcgt ggtgcctaaa aatgtctttc agtagcaagc tgattgccag gggcaggccc 2640
ttggtgtaag tgtttacaaa gcggttaagc tgggatgggt gcatacgtgg ggatatgaga 2700
tgcatcttgg actgtatttt taggttggct atgttcccag ccatatccct ccggggattc 2760
atgttgtgca gaaccaccag cacagtgtat ccggtgcact tgggaaattt gtcatgtagc 2820
ttagaaggaa atgcgtggaa gaacttggag acgcccttgt gacctccaag attttccatg 2880
cattcgtcca taatgatggc aatgggccca cgggcggcgg cctgggcgaa gatatttctg 2940
ggatcactaa cgtcatagtt gtgttccagg atgagatcgt cataggccat ttttacaaag 3000
cgcgggcgga gggtgccaga ctgcggtata atggttccat ccggcccagg ggcgtagtta 3060
ccctcacaga tttgcatttc ccacgctttg agttcagatg gggggatcat gtctacctgc 3120
ggggcgatga agaaaacggt ttccggggta ggggagatca gctgggaaga aagcaggttc 3180
ctgagcagct gcgacttacc gcagccggtg ggcccgtaaa tcacacctat taccgggtgc 3240
aactggtagt taagagagct gcagctgccg tcatccctga gcaggggggc cacttcgtta 3300
agcatgtccc tgactcgcat gttttccctg accaaatccg ccagaaggcg ctcgccgccc 3360
agcgatagca gttcttgcaa ggaagcaaag tttttcaacg gtttgagacc gtccgccgta 3420
ggcatgcttt tgagcgtttg accaagcagt tccaggcggt cccacagctc ggtcacctgc 3480
tctacggcat ctcgatccag catatctcct cgtttcgcgg gttggggcgg ctttcgctgt 3540
acggcagtag tcggtgctcg tccagacggg ccagggtcat gtctttccac gggcgcaggg 3600
tcctcgtcag cgtagtctgg gtcacggtga aggggtgcgc tccgggctgc gcgctggcca 3660
gggtgcgctt gaggctggtc ctgctggtgc tgaagcgctg ccggtcttcg ccctgcgcgt 3720
cggccaggta gcatttgacc atggtgtcat agtccagccc ctccgcggcg tggcccttgg 3780
cgcgcagctt gcccttggag gaggcgccgc acgaggggca gtgcagactt ttgagggcgt 3840
agagcttggg cgcgagaaat accgattccg gggagtaggc atccgcgccg caggccccgc 3900
agacggtctc gcattccacg agccaggtga gctctggccg ttcggggtca aaaaccaggt 3960
ttcccccatg ctttttgatg cgtttcttac ctctggtttc catgagccgg tgtccacgct 4020
cggtgacgaa aaggctgtcc gtgtccccgt atacagactt gagaggcctg tcctcgagcg 4080
gtgttccgcg gtcctcctcg tatagaaact cggaccactc tgagacaaag gctcgcgtcc 4140
aggccagcac gaaggaggct aagtgggagg ggtagcggtc gttgtccact agggggtcca 4200
ctcgctccag ggtgtgaaga cacatgtcgc cctcttcggc atcaaggaag gtgattggtt 4260
tgtaggtgta ggccacgtga ccgggtgttc ctgaaggggg gctataaaag ggggtggggg 4320
cgcgttcgtc ctcactctct tccgcatcgc tgtctgcgag ggccagctgt tggggtgagt 4380
actccctctg aaaagcgggc atgacttctg cgctaagatt gtcagtttcc aaaaacgagg 4440
aggatttgat attcacctgg cccgcggtga tgcctttgag ggtggccgca tccatctggt 4500
cagaaaagac aatctttttg ttgtcaagct tggtggcaaa cgacccgtag agggcgttgg 4560
acagcaactt ggcgatggag cgcagggttt ggtttttgtc gcgatcggcg cgctccttgg 4620
ccgcgatgtt tagctgcacg tattcgcgcg caacgcaccg ccattcggga aagacggtgg 4680
tgcgctcgtc gggcaccagg tgcacgcgcc aaccgcggtt gtgcagggtg acaaggtcaa 4740
cgctggtggc tacctctccg cgtaggcgct cgttggtcca gcagaggcgg ccgcccttgc 4800
gcgagcagaa tggcggtagg gggtctagct gcgtctcgtc cggggggtct gcgtccacgg 4860
taaagacccc gggcagcagg cgcgcgtcga agtagtctat cttgcatcct tgcaagtcta 4920
gcgcctgctg ccatgcgcgg gcggcaagcg cgcgctcgta tgggttgagt gggggacccc 4980
atggcatggg gtgggtgagc gcggaggcgt acatgccgca aatgtcgtaa acgtagaggg 5040
gctctctgag tattccaaga tatgtagggt agcatcttcc accgcggatg ctggcgcgca 5100
cgtaatcgta tagttcgtgc gagggagcga ggaggtcggg accgaggttg ctacgggcgg 5160
gctgctctgc tcggaagact atctgcctga agatggcatg tgagttggat gatatggttg 5220
gacgctggaa gacgttgaag ctggcgtctg tgagacctac cgcgtcacgc acgaaggagg 5280
cgtaggagtc gcgcagcttg ttgaccagct cggcggtgac ctgcacgtct agggcgcagt 5340
agtccagggt ttccttgatg atgtcatact tatcctgtcc cttttttttc cacagctcgc 5400
ggttgaggac aaactcttcg cggtctttcc agtactcttg gatcggaaac ccgtcggcct 5460
ccgaacggta agagcctagc atgtagaact ggttgacggc ctggtaggcg cagcatccct 5520
tttctacggg tagcgcgtat gcctgcgcgg ccttccggag cgaggtgtgg gtgagcgcaa 5580
aggtgtccct gaccatgact ttgaggtact ggtatttgaa gtcagtgtcg tcgcatccgc 5640
cctgctccca gagcaaaaag tccgtgcgct ttttggaacg cggatttggc agggcgaagg 5700
tgacatcgtt gaagagtatc tttcccgcgc gaggcataaa gttgcgtgtg atgcggaagg 5760
gtcccggcac ctcggaacgg ttgttaatta cctgggcggc gagcacgatc tcgtcaaagc 5820
cgttgatgtt gtggcccaca atgtaaagtt ccaagaagcg cgggatgccc ttgatggaag 5880
gcaatttttt aagttcctcg taggtgagct cttcagggga gctgagcccg tgctctgaaa 5940
gggcccagtc tgcaagatga gggttggaag cgacgaatga gctccacagg tcacgggcca 6000
ttagcatttg caggtggtcg cgaaaggtcc taaactggcg acctatggcc attttttctg 6060
gggtgatgca gtagaaggta agcgggtctt gttcccagcg gtcccatcca aggttcgcgg 6120
ctaggtctcg cgcggcagtc actagaggct catctccgcc gaacttcatg accagcatga 6180
agggcacgag ctgcttccca aaggccccca tccaagtata ggtctctaca tcgtaggtga 6240
caaagagacg ctcggtgcga ggatgcgagc cgatcgggaa gaactggatc tcccgccacc 6300
aattggagga gtggctattg atgtggtgaa agtagaagtc cctgcgacgg gccgaacact 6360
cgtgctggct tttgtaaaaa cgtgcgcagt actggcagcg gtgcacgggc tgtacatcct 6420
gcacgaggtt gacctgacga ccgcgcacaa ggaagcagag tgggaatttg agcccctcgc 6480
ctggcgggtt tggctggtgg tcttctactt cggctgcttg tccttgaccg tctggctgct 6540
cgaggggagt tacggtggat cggaccacca cgccgcgcga gcccaaagtc cagatgtccg 6600
cgcgcggcgg tcggagcttg atgacaacat cgcgcagatg ggagctgtcc atggtctgga 6660
gctcccgcgg cgtcaggtca ggcgggagct cctgcaggtt tacctcgcat agacgggtca 6720
gggcgcgggc tagatccagg tgatacctaa tttccagggg ctggttggtg gcggcgtcga 6780
tggcttgcaa gaggccgcat ccccgcggcg cgactacggt accgcgcggc gggcggtggg 6840
ccgcgggggt gtccttggat gatgcatcta aaagcggtga cgcgggcgag cccccggagg 6900
tagggggggc tccggacccg ccgggagagg gggcaggggc acgtcggcgc cgcgcgcggg 6960
caggagctgg tgctgcgcgc gtaggttgct ggcgaacgcg acgacgcggc ggttgatctc 7020
ctgaatctgg cgcctctgcg tgaagacgac gggcccggtg agcttgagcc tgaaagagag 7080
ttcgacagaa tcaatttcgg tgtcgttgac ggcggcctgg cgcaaaatct cctgcacgtc 7140
tcctgagttg tcttgatagg cgatctcggc catgaactgc tcgatctctt cctcctggag 7200
atctccgcgt ccggctcgct ccacggtggc ggcgaggtcg ttggaaatgc gggccatgag 7260
ctgcgagaag gcgttgaggc ctccctcgtt ccagacgcgg ctgtagacca cgcccccttc 7320
ggcatcgcgg gcgcgcatga ccacctgcgc gagattgagc tccacgtgcc gggcgaagac 7380
ggcgtagttt cgcaggcgct gaaagaggta gttgagggtg gtggcggtgt gttctgccac 7440
gaagaagtac ataacccagc gtcgcaacgt ggattcgttg atatccccca aggcctcaag 7500
gcgctccatg gcctcgtaga agtccacggc gaagttgaaa aactgggagt tgcgcgccga 7560
cacggttaac tcctcctcca gaagacggat gagctcggcg acagtgtcgc gcacctcgcg 7620
ctcaaaggct acaggggcct cttcttcttc ttcaatctcc tcttccataa gggcctcccc 7680
ttcttcttct tctggcggcg gtgggggagg ggggacacgg cggcgacgac ggcgcaccgg 7740
gaggcggtcg acaaagcgct cgatcatctc cccgcggcga cggcgcatgg tctcggtgac 7800
ggcgcggccg ttctcgcggg ggcgcagttg gaagacgccg cccgtcatgt cccggttatg 7860
ggttggcggg gggctgccat gcggcaggga tacggcgcta acgatgcatc tcaacaattg 7920
ttgtgtaggt actccgccgc cgagggacct gagcgagtcc gcatcgaccg gatcggaaaa 7980
cctctcgaga aaggcgtcta accagtcaca gtcgcaaggt aggctgagca ccgtggcggg 8040
cggcagcggg cggcggtcgg ggttgtttct ggcggaggtg ctgctgatga tgtaattaaa 8100
gtaggcggtc ttgagacggc ggatggtcga cagaagcacc atgtccttgg gtccggcctg 8160
ctgaatgcgc aggcggtcgg ccatgcccca ggcttcgttt tgacatcggc gcaggtcttt 8220
gtagtagtct tgcatgagcc tttctaccgg cacttcttct tctccttcct cttgtcctgc 8280
atctcttgca tctatcgctg cggcggcggc ggagtttggc cgtaggtggc gccctcttcc 8340
tcccatgcgt gtgaccccga agcccctcat cggctgaagc agggctaggt cggcgacaac 8400
gcgctcggct aatatggcct gctgcacctg cgtgagggta gactggaagt catccatgtc 8460
cacaaagcgg tggtatgcgc ccgtgttgat ggtgtaagtg cagttggcca taacggacca 8520
gttaacggtc tggtgacccg gctgcgagag ctcggtgtac ctgagacgcg agtaagccct 8580
cgagtcaaat acgtagtcgt tgcaagtccg caccaggtac tggtatccca ccaaaaagtg 8640
cggcggcggc tggcggtaga ggggccagcg tagggtggcc ggggctccgg gggcgagatc 8700
ttccaacata aggcgatgat atccgtagat gtacctggac atccaggtga tgccggcggc 8760
ggtggtggag gcgcgcggaa agtcgcggac gcggttccag atgttgcgca gcggcaaaaa 8820
gtgctccatg gtcgggacgc tctggccggt caggcgcgcg caatcgttga cgctctagac 8880
cgtgcaaaag gagagcctgt aagcgggcac tcttccgtgg tctggtggat aaattcgcaa 8940
gggtatcatg gcggacgacc ggggttcgag ccccgtatcc ggccgtccgc cgtgatccat 9000
gcggttaccg cccgcgtgtc gaacccaggt gtgcgacgtc agacaacggg ggagtgctcc 9060
ttttggcttc cttccaggcg cggcggctgc tgcgctagct tttttggcca ctggccgcgc 9120
gcagcgtaag cggttaggct ggaaagcgaa agcattaagt ggctcgctcc ctgtagccgg 9180
agggttattt tccaagggtt gagtcgcggg acccccggtt cgagtctcgg accggccgga 9240
ctgcggcgaa cgggggtttg cctccccgtc atgcaagacc ccgcttgcaa attcctccgg 9300
aaacagggac gagccccttt tttgcttttc ccagatgcat ccggtgctgc ggcagatgcg 9360
cccccctcct cagcagcggc aagagcaaga gcagcggcag acatgcaggg caccctcccc 9420
tcctcctacc gcgtcaggag gggcgacatc cgcggttgac gcggcagcag atggtgatta 9480
cgaacccccg cggcgccggg cccggcacta cctggacttg gaggagggcg agggcctggc 9540
gcggctagga gcgccctctc ctgagcggta cccaagggtg cagctgaagc gtgatacgcg 9600
tgaggcgtac gtgccgcggc agaacctgtt tcgcgaccgc gagggagagg agcccgagga 9660
gatgcgggat cgaaagttcc acgcagggcg cgagctgcgg catggcctga atcgcgagcg 9720
gttgctgcgc gaggaggact ttgagcccga cgcgcgaacc gggattagtc ccgcgcgcgc 9780
acacgtggcg gccgccgacc tggtaaccgc atacgagcag acggtgaacc aggagattaa 9840
ctttcaaaaa agctttaaca accacgtgcg tacgcttgtg gcgcgcgagg aggtggctat 9900
aggactgatg catctgtggg actttgtaag cgcgctggag caaaacccaa atagcaagcc 9960
gctcatggcg cagctgttcc ttatagtgca gcacagcagg gacaacgagg cattcaggga 10020
tgcgctgcta aacatagtag agcccgaggg ccgctggctg ctcgatttga taaacatcct 10080
gcagagcata gtggtgcagg agcgcagctt gagcctggct gacaaggtgg ccgccatcaa 10140
ctattccatg cttagcctgg gcaagtttta cgcccgcaag atataccata ccccttacgt 10200
tcccatagac aaggaggtaa agatcgaggg gttctacatg cgcatggcgc tgaaggtgct 10260
taccttgagc gacgacctgg gcgtttatcg caacgagcgc atccacaagg ccgtgagcgt 10320
gagccggcgg cgcgagctca gcgaccgcga gctgatgcac agcctgcaaa gggccctggc 10380
tggcacgggc agcggcgata gagaggccga gtcctacttt gacgcgggcg ctgacctgcg 10440
ctgggcccca agccgacgcg ccctggaggc agctggggcc ggacctgggc tggcggtggc 10500
acccgcgcgc gctggcaacg tcggcggcgt ggaggaatat gacgaggacg atgagtacga 10560
gccagaggac ggcgagtact aagcggtgat gtttctgatc agatgatgca agacgcaacg 10620
gacccggcgg tgcgggcggc gctgcagagc cagccgtccg gccttaactc cacggacgac 10680
tggcgccagg tcatggaccg catcatgtcg ctgactgcgc gcaatcctga cgcgttccgg 10740
cagcagccgc aggccaaccg gctctccgca attctggaag cggtggtccc ggcgcgcgca 10800
aaccccacgc acgagaaggt gctggcgatc gtaaacgcgc tggccgaaaa cagggccatc 10860
cggcccgacg aggccggcct ggtctacgac gcgctgcttc agcgcgtggc tcgttacaac 10920
agcggcaacg tgcagaccaa cctggaccgg ctggtggggg atgtgcgcga ggccgtggcg 10980
cagcgtgagc gcgcgcagca gcagggcaac ctgggctcca tggttgcact aaacgccttc 11040
ctgagtacac agcccgccaa cgtgccgcgg ggacaggagg actacaccaa ctttgtgagc 11100
gcactgcggc taatggtgac tgagacaccg caaagtgagg tgtaccagtc tgggccagac 11160
tattttttcc agaccagtag acaaggcctg cagaccgtaa acctgagcca ggctttcaaa 11220
aacttgcagg ggctgtgggg ggtgcgggct cccacaggcg accgcgcgac cgtgtctagc 11280
ttgctgacgc ccaactcgcg cctgttgctg ctgctaatag cgcccttcac ggacagtggc 11340
agcgtgtccc gggacacata cctaggtcac ttgctgacac tgtaccgcga ggccataggt 11400
caggcgcatg tggacgagca tactttccag gagattacaa gtgtcagccg cgcgctgggg 11460
caggaggaca cgggcagcct ggaggcaacc ctaaactacc tgctgaccaa ccggcggcag 11520
aagatcccct cgttgcacag tttaaacagc gaggaggagc gcattttgcg ctacgtgcag 11580
cagagcgtga gccttaacct gatgcgcgac ggggtaacgc ccagcgtggc gctggacatg 11640
accgcgcgca acatggaacc gggcatgtat gcctcaaacc ggccgtttat caaccgccta 11700
atggactact tgcatcgcgc ggccgccgtg aaccccgagt atttcaccaa tgccatcttg 11760
aacccgcact ggctaccgcc ccctggtttc tacaccgggg gattcgaggt gcccgagggt 11820
aacgatggat tcctctggga cgacatagac gacagcgtgt tttccccgca accgcagacc 11880
ctgctagagt tgcaacagcg cgagcaggca gaggcggcgc tgcgaaagga aagcttccgc 11940
aggccaagca gcttgtccga tctaggcgct gcggccccgc ggtcagatgc tagtagccca 12000
tttccaagct tgatagggtc tcttaccagc actcgcacca cccgcccgcg cctgctgggc 12060
gaggaggagt acctaaacaa ctcgctgctg cagccgcagc gcgaaaaaaa cctgcctccg 12120
gcatttccca acaacgggat agagagccta gtggacaaga tgagtagatg gaagacgtac 12180
gcgcaggagc acagggacgt gccaggcccg cgcccgccca cccgtcgtca aaggcacgac 12240
cgtcagcggg gtctggtgtg ggaggacgat gactcggcag acgacagcag cgtcctggat 12300
ttgggaggga gtggcaaccc gtttgcgcac cttcgcccca ggctggggag aatgttttaa 12360
aaaaaaaaaa gcatgatgca aaataaaaaa ctcaccaagg ccatggcacc gagcgttggt 12420
tttcttgtat tccccttagt atgcggcgcg cggcgatgta tgaggaaggt cctcctccct 12480
cctacgagag tgtggtgagc gcggcgccag tggcggcggc gctgggttct cccttcgatg 12540
ctcccctgga cccgccgttt gtgcctccgc ggtacctgcg gcctaccggg gggagaaaca 12600
gcatccgtta ctctgagttg gcacccctat tcgacaccac ccgtgtgtac ctggtggaca 12660
acaagtcaac ggatgtggca tccctgaact accagaacga ccacagcaac tttctgacca 12720
cggtcattca aaacaatgac tacagcccgg gggaggcaag cacacagacc atcaatcttg 12780
acgaccggtc gcactggggc ggcgacctga aaaccatcct gcataccaac atgccaaatg 12840
tgaacgagtt catgtttacc aataagttta aggcgcgggt gatggtgtcg cgcttgccta 12900
ctaaggacaa tcaggtggag ctgaaatacg agtgggtgga gttcacgctg cccgagggca 12960
actactccga gaccatgacc atagacctta tgaacaacgc gatcgtggag cactacttga 13020
aagtgggcag acagaacggg gttctggaaa gcgacatcgg ggtaaagttt gacacccgca 13080
acttcagact ggggtttgac cccgtcactg gtcttgtcat gcctggggta tatacaaacg 13140
aagccttcca tccagacatc attttgctgc caggatgcgg ggtggacttc acccacagcc 13200
gcctgagcaa cttgttgggc atccgcaagc ggcaaccctt ccaggagggc tttaggatca 13260
cctacgatga tctggagggt ggtaacattc ccgcactgtt ggatgtggac gcctaccagg 13320
cgagcttgaa agatgacacc gaacagggcg ggggtggcgc aggcggcagc aacagcagtg 13380
gcagcggcgc ggaagagaac tccaacgcgg cagccgcggc aatgcagccg gtggaggaca 13440
tgaacgatca tgccattcgc ggcgacacct ttgccacacg ggctgaggag aagcgcgctg 13500
aggccgaagc agcggccgaa gctgccgccc ccgctgcgca acccgaggtc gagaagcctc 13560
agaagaaacc ggtgatcaaa cccctgacag aggacagcaa gaaacgcagt tacaacctaa 13620
taagcaatga cagcaccttc acccagtacc gcagctggta ccttgcatac aactacggcg 13680
accctcagac cggaatccgc tcatggaccc tgctttgcac tcctgacgta acctgcggct 13740
cggagcaggt ctactggtcg ttgccagaca tgatgcaaga ccccgtgacc ttccgctcca 13800
cgcgccagat cagcaacttt ccggtggtgg gcgccgagct gttgcccgtg cactccaaga 13860
gcttctacaa cgaccaggcc gtctactccc aactcatccg ccagtttacc tctctgaccc 13920
acgtgttcaa tcgctttccc gagaaccaga ttttggcgcg cccgccagcc cccaccatca 13980
ccaccgtcag tgaaaacgtt cctgctctca cagatcacgg gacgctaccg ctgcgcaaca 14040
gcatcggagg agtccagcga gtgaccatta ctgacgccag acgccgcacc tgcccctacg 14100
tttacaaggc cctgggcata gtctcgccgc gcgtcctatc gagccgcact ttttgagcaa 14160
gcatgtccat ccttatatcg cccagcaata acacaggctg gggcctgcgc ttcccaagca 14220
agatgtttgg cggggccaag aagcgctccg accaacaccc agtgcgcgtg cgcgggcact 14280
accgcgcgcc ctggggcgcg cacaaacgcg gccgcactgg gcgcaccacc gtcgatgacg 14340
ccatcgacgc ggtggtggag gaggcgcgca actacacgcc cacgccgcca ccagtgtcca 14400
cagtggacgc ggccattcag accgtggtgc gcggagcccg gcgctatgct aaaatgaaga 14460
gacggcggag gcgcgtagca cgtcgccacc gccgccgacc cggcactgcc gcccaacgcg 14520
cggcggcggc cctgcttaac cgcgcacgtc gcaccggccg acgggcggcc atgcgggccg 14580
ctcgaaggct ggccgcgggt attgtcactg tgccccccag gtccaggcga cgagcggccg 14640
ccgcagcagc cgcggccatt agtgctatga ctcagggtcg caggggcaac gtgtattggg 14700
tgcgcgactc ggttagcggc ctgcgcgtgc ccgtgcgcac ccgccccccg cgcaactaga 14760
ttgcaagaaa aaactactta gactcgtact gttgtatgta tccagcggcg gcggcgcgca 14820
acgaagctat gtccaagcgc aaaatcaaag aagagatgct ccaggtcatc gcgccggaga 14880
tctatggccc cccgaagaag gaagagcagg attacaagcc ccgaaagcta aagcgggtca 14940
aaaagaaaaa gaaagatgat gatgatgaac ttgacgacga ggtggaactg ctgcacgcta 15000
ccgcgcccag gcgacgggta cagtggaaag gtcgacgcgt aaaacgtgtt ttgcgacccg 15060
gcaccaccgt agtctttacg cccggtgagc gctccacccg cacctacaag cgcgtgtatg 15120
atgaggtgta cggcgacgag gacctgcttg agcaggccaa cgagcgcctc ggggagtttg 15180
cctacggaaa gcggcataag gacatgctgg cgttgccgct ggacgagggc aacccaacac 15240
ctagcctaaa gcccgtaaca ctgcagcagg tgctgcccgc gcttgcaccg tccgaagaaa 15300
agcgcggcct aaagcgcgag tctggtgact tggcacccac cgtgcagctg atggtaccca 15360
agcgccagcg actggaagat gtcttggaaa aaatgaccgt ggaacctggg ctggagcccg 15420
aggtccgcgt gcggccaatc aagcaggtgg cgccgggact gggcgtgcag accgtggacg 15480
ttcagatacc cactaccagt agcaccagta ttgccaccgc cacagagggc atggagacac 15540
aaacgtcccc ggttgcctca gcggtggcgg atgccgcggt gcaggcggtc gctgcggccg 15600
cgtccaagac ctctacggag gtgcaaacgg acccgtggat gtttcgcgtt tcagcccccc 15660
ggcgcccgcg cggttcgagg aagtacggcg ccgccagcgc gctactgccc gaatatgccc 15720
tacatccttc cattgcgcct acccccggct atcgtggcta cacctaccgc cccagaagac 15780
gagcaactac ccgacgccga accaccactg gaacccgccg ccgccgtcgc cgtcgccagc 15840
ccgtgctggc cccgatttcc gtgcgcaggg tggctcgcga aggaggcagg accctggtgc 15900
tgccaacagc gcgctaccac cccagcatcg tttaaaagcc ggtctttgtg gttcttgcag 15960
atatggccct cacctgccgc ctccgtttcc cggtgccggg attccgagga agaatgcacc 16020
gtaggagggg catggccggc cacggcctga cgggcggcat gcgtcgtgcg caccaccggc 16080
ggcggcgcgc gtcgcaccgt cgcatgcgcg gcggtatcct gcccctcctt attccactga 16140
tcgccgcggc gattggcgcc gtgcccggaa ttgcatccgt ggccttgcag gcgcagagac 16200
actgattaaa aacaagttgc atgtggaaaa atcaaaataa aaagtctgga ctctcacgct 16260
cgcttggtcc tgtaactatt ttgtagaatg gaagacatca actttgcgtc tctggccccg 16320
cgacacggct cgcgcccgtt catgggaaac tggcaagata tcggcaccag caatatgagc 16380
ggtggcgcct tcagctgggg ctcgctgtgg agcggcatta aaaatttcgg ttccaccgtt 16440
aagaactatg gcagcaaggc ctggaacagc agcacaggcc agatgctgag ggataagttg 16500
aaagagcaaa atttccaaca aaaggtggta gatggcctgg cctctggcat tagcggggtg 16560
gtggacctgg ccaaccaggc agtgcaaaat aagattaaca gtaagcttga tccccgccct 16620
cccgtagagg agcctccacc ggccgtggag acagtgtctc cagaggggcg tggcgaaaag 16680
cgtccgcgcc ccgacaggga agaaactctg gtgacgcaaa tagacgagcc tccctcgtac 16740
gaggaggcac taaagcaagg cctgcccacc acccgtccca tcgcgcccat ggctaccgga 16800
gtgctgggcc agcacacacc cgtaacgctg gacctgcctc cccccgccga cacccagcag 16860
aaacctgtgc tgccaggccc gaccgccgtt gttgtaaccc gtcctagccg cgcgtccctg 16920
cgccgcgccg ccagcggtcc gcgatcgttg cggcccgtag ccagtggcaa ctggcaaagc 16980
acactgaaca gcatcgtggg tctgggggtg caatccctga agcgccgacg atgcttctga 17040
atagctaacg tgtcgtatgt gtgtcatgta tgcgtccatg tcgccgccag aggagctgct 17100
gagccgccgc gcgcccgctt tccaagatgg ctaccccttc gatgatgccg cagtggtctt 17160
acatgcacat ctcgggccag gacgcctcgg agtacctgag ccccgggctg gtgcagtttg 17220
cccgcgccac cgagacgtac ttcagcctga ataacaagtt tagaaacccc acggtggcgc 17280
ctacgcacga cgtgaccaca gaccggtccc agcgtttgac gctgcggttc atccctgtgg 17340
accgtgagga tactgcgtac tcgtacaagg cgcggttcac cctagctgtg ggtgataacc 17400
gtgtgctgga catggcttcc acgtactttg acatccgcgg cgtgctggac aggggcccta 17460
cttttaagcc ctactctggc actgcctaca acgccctggc tcccaagggt gccccaaatc 17520
cttgcgaatg ggatgaagct gctactgctc ttgaaataaa cctagaagaa gaggacgatg 17580
acaacgaaga cgaagtagac gagcaagctg agcagcaaaa aactcacgta tttgggcagg 17640
cgccttattc tggtataaat attacaaagg agggtattca aataggtgtc gaaggtcaaa 17700
cacctaaata tgccgataaa acatttcaac ctgaacctca aataggagaa tctcagtggt 17760
acgaaactga aattaatcat gcagctggga gagtccttaa aaagactacc ccaatgaaac 17820
catgttacgg ttcatatgca aaacccacaa atgaaaatgg agggcaaggc attcttgtaa 17880
agcaacaaaa tggaaagcta gaaagtcaag tggaaatgca atttttctca actactgagg 17940
cgaccgcagg caatggtgat aacttgactc ctaaagtggt attgtacagt gaagatgtag 18000
atatagaaac cccagacact catatttctt acatgcccac tattaaggaa ggtaactcac 18060
gagaactaat gggccaacaa tctatgccca acaggcctaa ttacattgct tttagggaca 18120
attttattgg tctaatgtat tacaacagca cgggtaatat gggtgttctg gcgggccaag 18180
catcgcagtt gaatgctgtt gtagatttgc aagacagaaa cacagagctt tcataccagc 18240
ttttgcttga ttccattggt gatagaacca ggtacttttc tatgtggaat caggctgttg 18300
acagctatga tccagatgtt agaattattg aaaatcatgg aactgaagat gaacttccaa 18360
attactgctt tccactggga ggtgtgatta atacagagac tcttaccaag gtaaaaccta 18420
aaacaggtca ggaaaatgga tgggaaaaag atgctacaga attttcagat aaaaatgaaa 18480
taagagttgg aaataatttt gccatggaaa tcaatctaaa tgccaacctg tggagaaatt 18540
tcctgtactc caacatagcg ctgtatttgc ccgacaagct aaagtacagt ccttccaacg 18600
taaaaatttc tgataaccca aacacctacg actacatgaa caagcgagtg gtggctcccg 18660
ggttagtgga ctgctacatt aaccttggag cacgctggtc ccttgactat atggacaacg 18720
tcaacccatt taaccaccac cgcaatgctg gcctgcgcta ccgctcaatg ttgctgggca 18780
atggtcgcta tgtgcccttc cacatccagg tgcctcagaa gttctttgcc attaaaaacc 18840
tccttctcct gccgggctca tacacctacg agtggaactt caggaaggat gttaacatgg 18900
ttctgcagag ctccctagga aatgacctaa gggttgacgg agccagcatt aagtttgata 18960
gcatttgcct ttacgccacc ttcttcccca tggcccacaa caccgcctcc acgcttgagg 19020
ccatgcttag aaacgacacc aacgaccagt cctttaacga ctatctctcc gccgccaaca 19080
tgctctaccc tatacccgcc aacgctacca acgtgcccat atccatcccc tcccgcaact 19140
gggcggcttt ccgcggctgg gccttcacgc gccttaagac taaggaaacc ccatcactgg 19200
gctcgggcta cgacccttat tacacctact ctggctctat accctaccta gatggaacct 19260
tttacctcaa ccacaccttt aagaaggtgg ccattacctt tgactcttct gtcagctggc 19320
ctggcaatga ccgcctgctt acccccaacg agtttgaaat taagcgctca gttgacgggg 19380
agggttacaa cgttgcccag tgtaacatga ccaaagactg gttcctggta caaatgctag 19440
ctaactacaa cattggctac cagggcttct atatcccaga gagctacaag gaccgcatgt 19500
actccttctt tagaaacttc cagcccatga gccgtcaggt ggtggatgat actaaataca 19560
aggactacca acaggtgggc atcctacacc aacacaacaa ctctggattt gttggctacc 19620
ttgcccccac catgcgcgaa ggacaggcct accctgctaa cttcccctat ccgcttatag 19680
gcaagaccgc agttgacagc attacccaga aaaagtttct ttgcgatcgc accctttggc 19740
gcatcccatt ctccagtaac tttatgtcca tgggcgcact cacagacctg ggccaaaacc 19800
ttctctacgc caactccgcc cacgcgctag acatgacttt tgaggtggat cccatggacg 19860
agcccaccct tctttatgtt ttgtttgaag tctttgacgt ggtccgtgtg caccggccgc 19920
accgcggcgt catcgaaacc gtgtacctgc gcacgccctt ctcggccggc aacgccacaa 19980
cataaagaag caagcaacat caacaacagc tgccgccatg ggctccagtg agcaggaact 20040
gaaagccatt gtcaaagatc ttggttgtgg gccatatttt ttgggcacct atgacaagcg 20100
ctttccaggc tttgtttctc cacacaagct cgcctgcgcc atagtcaata cggccggtcg 20160
cgagactggg ggcgtacact ggatggcctt tgcctggaac ccgcactcaa aaacatgcta 20220
cctctttgag ccctttggct tttctgacca gcgactcaag caggtttacc agtttgagta 20280
cgagtcactc ctgcgccgta gcgccattgc ttcttccccc gaccgctgta taacgctgga 20340
aaagtccacc caaagcgtac aggggcccaa ctcggccgcc tgtggactat tctgctgcat 20400
gtttctccac gcctttgcca actggcccca aactcccatg gatcacaacc ccaccatgaa 20460
ccttattacc ggggtaccca actccatgct caacagtccc caggtacagc ccaccctgcg 20520
tcgcaaccag gaacagctct acagcttcct ggagcgccac tcgccctact tccgcagcca 20580
cagtgcgcag attaggagcg ccacttcttt ttgtcacttg aaaaacatgt aaaaataatg 20640
tactagagac actttcaata aaggcaaatg cttttatttg tacactctcg ggtgattatt 20700
tacccccacc cttgccgtct gcgccgttta aaaatcaaag gggttctgcc gcgcatcgct 20760
atgcgccact ggcagggaca cgttgcgata ctggtgttta gtgctccact taaactcagg 20820
cacaaccatc cgcggcagct cggtgaagtt ttcactccac aggctgcgca ccatcaccaa 20880
cgcgtttagc aggtcgggcg ccgatatctt gaagtcgcag ttggggcctc cgccctgcgc 20940
gcgcgagttg cgatacacag ggttgcagca ctggaacact atcagcgccg ggtggtgcac 21000
gctggccagc acgctcttgt cggagatcag atccgcgtcc aggtcctccg cgttgctcag 21060
ggcgaacgga gtcaactttg gtagctgcct tcccaaaaag ggcgcgtgcc caggctttga 21120
gttgcactcg caccgtagtg gcatcaaaag gtgaccgtgc ccggtctggg cgttaggata 21180
cagcgcctgc ataaaagcct tgatctgctt aaaagccacc tgagcctttg cgccttcaga 21240
gaagaacatg ccgcaagact tgccggaaaa ctgattggcc ggacaggccg cgtcgtgcac 21300
gcagcacctt gcgtcggtgt tggagatctg caccacattt cggccccacc ggttcttcac 21360
gatcttggcc ttgctagact gctccttcag cgcgcgctgc ccgttttcgc tcgtcacatc 21420
catttcaatc acgtgctcct tatttatcat aatgcttccg tgtagacact taagctcgcc 21480
ttcgatctca gcgcagcggt gcagccacaa cgcgcagccc gtgggctcgt gatgcttgta 21540
ggtcacctct gcaaacgact gcaggtacgc ctgcaggaat cgccccatca tcgtcacaaa 21600
ggtcttgttg ctggtgaagg tcagctgcaa cccgcggtgc tcctcgttca gccaggtctt 21660
gcatacggcc gccagagctt ccacttggtc aggcagtagt ttgaagttcg cctttagatc 21720
gttatccacg tggtacttgt ccatcagcgc gcgcgcagcc tccatgccct tctcccacgc 21780
agacacgatc ggcacactca gcgggttcat caccgtaatt tcactttccg cttcgctggg 21840
ctcttcctct tcctcttgcg tccgcatacc acgcgccact gggtcgtctt cattcagccg 21900
ccgcactgtg cgcttacctc ctttgccatg cttgattagc accggtgggt tgctgaaacc 21960
caccatttgt agcgccacat cttctctttc ttcctcgctg tccacgatta cctctggtga 22020
tggcgggcgc tcgggcttgg gagaagggcg cttctttttc ttcttgggcg caatggccaa 22080
atccgccgcc gaggtcgatg gccgcgggct gggtgtgcgc ggcaccagcg cgtcttgtga 22140
tgagtcttcc tcgtcctcgg actcgatacg ccgcctcatc cgcttttttg ggggcgcccg 22200
gggaggcggc ggcgacgggg acggggacga cacgtcctcc atggttgggg gacgtcgcgc 22260
cgcaccgcgt ccgcgctcgg gggtggtttc gcgctgctcc tcttcccgac tggccatttc 22320
cttctcctat aggcagaaaa agatcatgga gtcagtcgag aagaaggaca gcctaaccgc 22380
cccctctgag ttcgccacca ccgcctccac cgatgccgcc aacgcgccta ccaccttccc 22440
cgtcgaggca cccccgcttg aggaggagga agtgattatc gagcaggacc caggttttgt 22500
aagcgaagac gacgaggacc gctcagtacc aacagaggat aaaaagcaag accaggacaa 22560
cgcagaggca aacgaggaac aagtcgggcg gggggacgaa aggcatggcg actacctaga 22620
tgtgggagac gacgtgctgt tgaagcatct gcagcgccag tgcgccatta tctgcgacgc 22680
gttgcaagag cgcagcgatg tgcccctcgc catagcggat gtcagccttg cctacgaacg 22740
ccacctattc tcaccgcgcg taccccccaa acgccaagaa aacggcacat gcgagcccaa 22800
cccgcgcctc aacttctacc ccgtatttgc cgtgccagag gtgcttgcca cctatcacat 22860
ctttttccaa aactgcaaga tacccctatc ctgccgtgcc aaccgcagcc gagcggacaa 22920
gcagctggcc ttgcggcagg gcgctgtcat acctgatatc gcctcgctca acgaagtgcc 22980
aaaaatcttt gagggtcttg gacgcgacga gaagcgcgcg gcaaacgctc tgcaacagga 23040
aaacagcgaa aatgaaagtc actctggagt gttggtggaa ctcgagggtg acaacgcgcg 23100
cctagccgta ctaaaacgca gcatcgaggt cacccacttt gcctacccgg cacttaacct 23160
accccccaag gtcatgagca cagtcatgag tgagctgatc gtgcgccgtg cgcagcccct 23220
ggagagggat gcaaatttgc aagaacaaac agaggagggc ctacccgcag ttggcgacga 23280
gcagctagcg cgctggcttc aaacgcgcga gcctgccgac ttggaggagc gacgcaaact 23340
aatgatggcc gcagtgctcg ttaccgtgga gcttgagtgc atgcagcggt tctttgctga 23400
cccggagatg cagcgcaagc tagaggaaac attgcactac acctttcgac agggctacgt 23460
acgccaggcc tgcaagatct ccaacgtgga gctctgcaac ctggtctcct accttggaat 23520
tttgcacgaa aaccgccttg ggcaaaacgt gcttcattcc acgctcaagg gcgaggcgcg 23580
ccgcgactac gtccgcgact gcgtttactt atttctatgc tacacctggc agacggccat 23640
gggcgtttgg cagcagtgct tggaggagtg caacctcaag gagctgcaga aactgctaaa 23700
gcaaaacttg aaggacctat ggacggcctt caacgagcgc tccgtggccg cgcacctggc 23760
ggacatcatt ttccccgaac gcctgcttaa aaccctgcaa cagggtctgc cagacttcac 23820
cagtcaaagc atgttgcaga actttaggaa ctttatccta gagcgctcag gaatcttgcc 23880
cgccacctgc tgtgcacttc ctagcgactt tgtgcccatt aagtaccgcg aatgccctcc 23940
gccgctttgg ggccactgct accttctgca gctagccaac taccttgcct accactctga 24000
cataatggaa gacgtgagcg gtgacggtct actggagtgt cactgtcgct gcaacctatg 24060
caccccgcac cgctccctgg tttgcaattc gcagctgctt aacgaaagtc aaattatcgg 24120
tacctttgag ctgcagggtc cctcgcctga cgaaaagtcc gcggctccgg ggttgaaact 24180
cactccgggg ctgtggacgt cggcttacct tcgcaaattt gtacctgagg actaccacgc 24240
ccacgagatt aggttctacg aagaccaatc ccgcccgcca aatgcggagc ttaccgcctg 24300
cgtcattacc cagggccaca ttcttggcca attgcaagcc atcaacaaag cccgccaaga 24360
gtttctgcta cgaaagggac ggggggttta cttggacccc cagtccggcg aggagctcaa 24420
cccaatcccc ccgccgccgc agccctatca gcagcagccg cgggcccttg cttcccagga 24480
tggcacccaa aaagaagctg cagctgccgc cgccacccac ggacgaggag gaatactggg 24540
acagtcaggc agaggaggtt ttggacgagg aggaggagga catgatggaa gactgggaga 24600
gcctagacga ggaagcttcc gaggtcgaag aggtgtcaga cgaaacaccg tcaccctcgg 24660
tcgcattccc ctcgccggcg ccccagaaat cggcaaccgg ttccagcatg gctacaacct 24720
ccgctcctca ggcgccgccg gcactgcccg ttcgccgacc caaccgtaga tgggacacca 24780
ctggaaccag ggccggtaag tccaagcagc cgccgccgtt agcccaagag caacaacagc 24840
gccaaggcta ccgctcatgg cgcgggcaca agaacgccat agttgcttgc ttgcaagact 24900
gtgggggcaa catctccttc gcccgccgct ttcttctcta ccatcacggc gtggccttcc 24960
cccgtaacat cctgcattac taccgtcatc tctacagccc atactgcacc ggcggcagcg 25020
gcagcggcag caacagcagc ggccacacag aagcaaaggc gaccggatag caagactctg 25080
acaaagccca agaaatccac agcggcggca gcagcaggag gaggagcgct gcgtctggcg 25140
cccaacgaac ccgtatcgac ccgcgagctt agaaacagga tttttcccac tctgtatgct 25200
atatttcaac agagcagggg ccaagaacaa gagctgaaaa taaaaaacag gtctctgcga 25260
tccctcaccc gcagctgcct gtatcacaaa agcgaagatc agcttcggcg cacgctggaa 25320
gacgcggagg ctctcttcag taaatactgc gcgctgactc ttaaggacta gtttcgcgcc 25380
ctttctcaaa tttaagcgcg aaaactacgt catctccagc ggccacaccc ggcgccagca 25440
cctgtcgtca gcgccattat gagcaaggaa attcccacgc cctacatgtg gagttaccag 25500
ccacaaatgg gacttgcggc tggagctgcc caagactact caacccgaat aaactacatg 25560
agcgcgggac cccacatgat atcccgggtc aacggaatcc gcgcccaccg aaaccgaatt 25620
ctcttggaac aggcggctat taccaccaca cctcgtaata accttaatcc ccgtagttgg 25680
cccgctgccc tggtgtacca ggaaagtccc gctcccacca ctgtggtact tcccagagac 25740
gcccaggccg aagttcagat gactaactca ggggcgcagc ttgcgggcgg ctttcgtcac 25800
agggtgcggt cgcccgggca gggtataact cacctgacaa tcagagggcg aggtattcag 25860
ctcaacgacg agtcggtgag ctcctcgctt ggtctccgtc cggacgggac atttcagatc 25920
ggcggcgccg gccgtccttc attcacgcct cgtcaggcaa tcctaactct gcagacctcg 25980
tcctctgagc cgcgctctgg aggcattgga actctgcaat ttattgagga gtttgtgcca 26040
tcggtctact ttaacccctt ctcgggacct cccggccact atccggatca atttattcct 26100
aactttgacg cggtaaagga ctcggcggac ggctacgact gaatgttagt tcctgtccat 26160
ccgcacccac tatcttcatg ttgttgcaga tgaagcgcgc aagaccgtct gaagatacct 26220
tcaaccccgt gtatccatat gacacggaaa ccggtcctcc aactgtgcct tttcttactc 26280
ctccctttgt atcccccaat gggtttcaag agagtccccc tggggtactc tctttgcgcc 26340
tatccgaacc tctagttacc tccaatggca tgcttgcgct caaaatgggc aacggcctct 26400
ctctggacga ggccggcaac cttacctccc aaaatgtaac cactgtgagc ccacctctca 26460
aaaaaaccaa gtcaaacata aacctggaaa tatctgcacc cctcacagtt acctcagaag 26520
ccctaactgt ggctgccgcc gcacctctaa tggtcgcggg caacacactc accatgcaat 26580
cacaggcccc gctaaccgtg cacgactcca aacttagcat tgccacccaa ggacccctca 26640
cagtgtcaga aggaaagcta gccctgcaaa catcaggccc cctcaccacc accgatagca 26700
gtacccttac tatcactgcc tcaccccctc taactactgc cactggtagc ttgggcattg 26760
acttgaaaga gcccatttat acacaaaatg gaaaactagg actaaagtac ggggctcctt 26820
tgcatgtaac agacgaccta aacactttga ccgtagcaac tggtccaggt gtgactatta 26880
ataatacttc cttgcaaact aaagttactg gagccttggg ttttgattca caaggcaata 26940
tgcaacttaa tgtagcagga ggactaagga ttgattctca aaacagacgc cttatacttg 27000
atgttagtta tccgtttgat gctcaaaacc aactaaatct aagactagga cagggccctc 27060
tttttataaa ctcagcccac aacttggata ttaactacaa caaaggcctt tacttgttta 27120
cagcttcaaa caattccaaa aagcttgagg ttaacctaag cactgccaag gggttgatgt 27180
ttgacgctac agccatagcc attaatgcag gagatgggct tgaatttggt tcacctaatg 27240
caccaaacac aaatcccctc aaaacaaaaa ttggccatgg cctagaattt gattcaaaca 27300
aggctatggt tcctaaacta ggaactggcc ttagttttga cagcacaggt gccattacag 27360
taggaaacaa aaataatgat aagctaactt tgtggaccac accagctcca tctcctaact 27420
gtagactaaa tgcagagaaa gatgctaaac tcactttggt cttaacaaaa tgtggcagtc 27480
aaatacttgc tacagtttca gttttggctg ttaaaggcag tttggctcca atatctggaa 27540
cagttcaaag tgctcatctt attataagat ttgacgaaaa tggagtgcta ctaaacaatt 27600
ccttcctgga cccagaatat tggaacttta gaaatggaga tcttactgaa ggcacagcct 27660
atacaaacgc tgttggattt atgcctaacc tatcagctta tccaaaatct cacggtaaaa 27720
ctgccaaaag taacattgtc agtcaagttt acttaaacgg agacaaaact aaacctgtaa 27780
cactaaccat tacactaaac ggtacacagg aaacaggaga cacaactcca agtgcatact 27840
ctatgtcatt ttcatgggac tggtctggcc acaactacat taatgaaata tttgccacat 27900
cctcttacac tttttcatac attgcccaag aataaagaat cgtttgtgtt atgtttcaac 27960
gtgtttattt ttcaattgca gaaaatttca agtcattttt cattcagtag tatagcccca 28020
ccaccacata gcttatacag atcaccgtac cttaatcaaa ctcacagaac cctagtattc 28080
aacctgccac ctccctccca acacacagag tacacagtcc tttctccccg gctggcctta 28140
aaaagcatca tatcatgggt aacagacata ttcttaggtg ttatattcca cacggtttcc 28200
tgtcgagcca aacgctcatc agtgatatta ataaactccc cgggcagctc acttaagttc 28260
atgtcgctgt ccagctgctg agccacaggc tgctgtccaa cttgcggttg cttaacgggc 28320
ggcgaaggag aagtccacgc ctacatgggg gtagagtcat aatcgtgcat caggataggg 28380
cggtggtgct gcagcagcgc gcgaataaac tgctgccgcc gccgctccgt cctgcaggaa 28440
tacaacatgg cagtggtctc ctcagcgatg attcgcaccg cccgcagcat aaggcgcctt 28500
gtcctccggg cacagcagcg caccctgatc tcacttaaat cagcacagta actgcagcac 28560
agcaccacaa tattgttcaa aatcccacag tgcaaggcgc tgtatccaaa gctcatggcg 28620
gggaccacag aacccacgtg gccatcatac cacaagcgca ggtagattaa gtggcgaccc 28680
ctcataaaca cgctggacat aaacattacc tcttttggca tgttgtaatt caccacctcc 28740
cggtaccata taaacctctg attaaacatg gcgccatcca ccaccatcct aaaccagctg 28800
gccaaaacct gcccgccggc tatacactgc agggaaccgg gactggaaca atgacagtgg 28860
agagcccagg actcgtaacc atggatcatc atgctcgtca tgatatcaat gttggcacaa 28920
cacaggcaca cgtgcataca cttcctcagg attacaagct cctcccgcgt tagaaccata 28980
tcccagggaa caacccattc ctgaatcagc gtaaatccca cactgcaggg aagacctcgc 29040
acgtaactca cgttgtgcat tgtcaaagtg ttacattcgg gcagcagcgg atgatcctcc 29100
agtatggtag cgcgggtttc tgtctcaaaa ggaggtagac gatccctact gtacggagtg 29160
cgccgagaca accgagatcg tgttggtcgt agtgtcatgc caaatggaac gccggacgta 29220
gtcatatttc ctgaagcaaa accaggtgcg ggcgtgacaa acagatctgc gtctccggtc 29280
tcgccgctta gatcgctctg tgtagtagtt gtagtatatc cactctctca aagcatccag 29340
gcgccccctg gcttcgggtt ctatgtaaac tccttcatgc gccgctgccc tgataacatc 29400
caccaccgca gaataagcca cacccagcca acctacacat tcgttctgcg agtcacacac 29460
gggaggagcg ggaagagctg gaagaaccat gttttttttt ttattccaaa agattatcca 29520
aaacctcaaa atgaagatct attaagtgaa cgcgctcccc tccggtggcg tggtcaaact 29580
ctacagccaa agaacagata atggcatttg taagatgttg cacaatggct tccaaaaggc 29640
aaacggccct cacgtccaag tggacgtaaa ggctaaaccc ttcagggtga atctcctcta 29700
taaacattcc agcaccttca accatgccca aataattctc atctcgccac cttctcaata 29760
tatctctaag caaatcccga atattaagtc cggccattgt aaaaatctgc tccagagcgc 29820
cctccacctt cagcctcaag cagcgaatca tgattgcaaa aattcaggtt cctcacagac 29880
ctgtataaga ttcaaaagcg gaacattaac aaaaataccg cgatcccgta ggtcccttcg 29940
cagggccagc tgaacataat cgtgcaggtc tgcacggacc agcgcggcca cttccccgcc 30000
aggaaccatg acaaaagaac ccacactgat tatgacacgc atactcggag ctatgctaac 30060
cagcgtagcc ccgatgtaag cttgttgcat gggcggcgat ataaaatgca aggtgctgct 30120
caaaaaatca ggcaaagcct cgcgcaaaaa agaaagcaca tcgtagtcat gctcatgcag 30180
ataaaggcag gtaagctccg gaaccaccac agaaaaagac accatttttc tctcaaacat 30240
gtctgcgggt ttctgcataa acacaaaata aaataacaaa aaaacattta aacattagaa 30300
gcctgtctta caacaggaaa aacaaccctt ataagcataa gacggactac ggccatgccg 30360
gcgtgaccgt aaaaaaactg gtcaccgtga ttaaaaagca ccaccgacag ctcctcggtc 30420
atgtccggag tcataatgta agactcggta aacacatcag gttgattcac atcggtcagt 30480
gctaaaaagc gaccgaaata gcccggggga atacataccc gcaggcgtag agacaacatt 30540
acagccccca taggaggtat aacaaaatta ataggagaga aaaacacata aacacctgaa 30600
aaaccctcct gcctaggcaa aatagcaccc tcccgctcca gaacaacata cagcgcttcc 30660
acagcggcag ccataacagt cagccttacc agtaaaaaag aaaacctatt aaaaaaacac 30720
cactcgacac ggcaccagct caatcagtca cagtgtaaaa aagggccaag tgcagagcga 30780
gtatatatag gactaaaaaa tgacgtaacg gttaaagtcc acaaaaaaca cccagaaaac 30840
cgcacgcgaa cctacgccca gaaacgaaag ccaaaaaacc cacaacttcc tcaaatcgtc 30900
acttccgttt tcccacgtta cgtaacttcc cattttaaga aaactacaat tcccaacaca 30960
tacaagttac tccgccctaa aacttacatc g 30991
<210> 72
<211> 1995
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第八DNA片段
<400> 72
ggttggcgcg ccctacgtca cccgccccgt tcccacgccc cgcgccacgt cacaaactcc 60
accccctcat tatcatattg gcttcaatcc aaaataaggt atattattga tgatgttaca 120
tcgttaatta agcagtgggc ttacatggcg atagctagac tgggcggttt tatggacagc 180
aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc cctgcaaagt 240
aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa gctctgatca 300
agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc 360
ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc 420
tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga 480
cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac 540
gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct 600
gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa 660
agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc 720
attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct 780
tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc 840
caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg 900
cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct 960
gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct 1020
tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca 1080
gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga cctcaggtta ctcatatata 1140
ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 1200
gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 1260
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 1320
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 1380
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 1440
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 1500
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 1560
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 1620
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 1680
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 1740
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 1800
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 1860
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 1920
tttgctctta attaaatcga tttaagggtg ggaaagaata tataaggtgg gggtcttatg 1980
tagtttgagc tcggg 1995
<210> 73
<211> 26877
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGLAd
<400> 73
ttaattaagc agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat ggacagcaag 60
cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct gcaaagtaaa 120
ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagct ctgatcaaga 180
gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc 240
cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga 300
tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct 360
gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaagacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac 420
gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct 480
attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt 540
atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt 600
cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt 660
cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag 720
gctcaaggcg agcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt 780
gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg 840
tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg 900
cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg 960
catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgacct caggttactc atatatactt 1020
tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 1080
aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 1140
gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 1200
acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 1260
tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 1320
ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 1380
atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 1440
agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 1500
cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 1560
agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 1620
acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 1680
gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 1740
ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 1800
gctcttaatt aaatcgattt aagggtggga aagaatatat aaggtggggg tcttatgtag 1860
tttgagctcg ggcggcgacc tcgcgggttt tcgctattta tgaaaatttt ccggtttaag 1920
gcgtttccgt tcttcttcgt cataacttaa tgtttttatt taaaataccc tctgaaaaga 1980
aaggaaacga caggtgctga aagcgaggct ttttggcctc tgtcgtttcc tttctctgtt 2040
tttgtccgtg gaatgaacaa tggaagtcaa caaaaagcag ctggctgaca ttttcggtgc 2100
gagtatccgt accattcaga actggcagga acagggaatg cccgttctgc gaggcggtgg 2160
caagggtaat gaggtgcttt atgactctgc cgccgtcata aaatggtatg ccgaaaggga 2220
tgctgaaatt gagaacgaaa agctgcgccg ggaggttgaa gaactgcggc aggccagcga 2280
ggcagatctc cagccaggaa ctattgagta cgaacgccat cgacttacgc gtgcgcaggc 2340
cgacgcacag gaactgaaga atgccagaga ctccgctgaa gtggtggaaa ccgcattctg 2400
tactttcgtg ctgtcgcgga tcgcaggtga aattgccagt attctcgacg ggctccccct 2460
gtcggtgcag cggcgttttc cggaactgga aaaccgacat gttgatttcc tgaaacggga 2520
tatcatcaaa gccatgaaca aagcagccgc gctggatgaa ctgataccgg ggttgctgag 2580
tgaatatatc gaacagtcag gttaacaggc tgcggcattt tgtccgcgcc gggcttcgct 2640
cactgttcag gccggagcca cagaccgccg ttgaatgggc ggatgctaat tactatctcc 2700
cgaaagaatc cgcataccag gaagggcgct gggaaacact gccctttcag cgggccatca 2760
tgaatgcgat gggcagcgac tacatccgtg aggtgaatgt ggtgaagtct gcccgtgtcg 2820
gttattccaa aatgctgctg ggtgtttatg cctactttat agagcataag cagcgcaaca 2880
cccttatctg gttgccgacg gatggtgatg ccgagaactt tatgaaaacc cacgttgagc 2940
cgactattcg tgatattccg tcgctgctgg cgctggcccc gtggtatggc aaaaagcacc 3000
gggataacac gctcaccatg aagcgtttca ctaatgggcg tggcttctgg tgcctgggcg 3060
gtaaagcggc aaaaaactac cgtgaaaagt cggtggatgt ggcgggttat gatgaacttg 3120
ctgcttttga tgatgatatt gaacaggaag gctctccgac gttcctgggt gacaagcgta 3180
ttgaaggctc ggtctggcca aagtccatcc gtggctccac gccaaaagtg agaggcacct 3240
gtcagattga gcgtgcagcc agtgaatccc cgcattttat gcgttttcat gttgcctgcc 3300
cgcattgcgg ggaggagcag tatcttaaat ttggcgacaa agagacgccg tttggcctca 3360
aatggacgcc ggatgacccc tccagcgtgt tttatctctg cgagcataat gcctgcgtca 3420
tccgccagca ggagctggac tttactgatg cccgttatat ctgcgaaaag accgggatct 3480
ggacccgtga tggcattctc tggttttcgt catccggtga agagattgag ccacctgaca 3540
gtgtgacctt tcacatctgg acagcgtaca gcccgttcac cacctgggtg cagattgtca 3600
aagactggat gaaaacgaaa ggggatacgg gaaaacgtaa aaccttcgta aacaccacgc 3660
tcggtgagac gtgggaggcg aaaattggcg aacgtccgga tgctgaagtg atggcagagc 3720
ggaaagagca ttattcagcg cccgttcctg accgtgtggc ttacctgacc gccggtatcg 3780
actcccagct ggaccgctac gaaatgcgcg tatggggatg ggggccgggt gaggaaagct 3840
ggctgattga ccggcagatt attatgggcc gccacgacga tgaacagacg ctgctgcgtg 3900
tggatgaggc catcaataaa acctataccc gccggaatgg tgcagaaatg tcgatatccc 3960
gtatctgctg ggatactggc gggattgacc cgaccattgt gtatgaacgc tcgaaaaaac 4020
atgggctgtt ccgggtgatc cccattaaag gggcatccgt ctacggaaag ccggtggcca 4080
gcatgccacg taagcgaaac aaaaacgggg tttaccttac cgaaatcggt acggataccg 4140
cgaaagagca gatttataac cgcttcacac tgacgccgga aggggatgaa ccgcttcccg 4200
gtgccgttca cttcccgaat aacccggata tttttgatct gaccgaagcg cagcagctga 4260
ctgctgaaga gcaggtcgaa aaatgggtgg atggcaggaa aaaaatactg tgggacagca 4320
aaaagcgacg caatgaggca ctcgactgct tcgtttatgc gctggcggcg ctgcgcatca 4380
gtatttcccg ctggcagctg gatctcagtg cgctgctggc gagcctgcag gaagaggatg 4440
gtgcagcaac caacaagaaa acactggcag attacgcccg tgccttatcc ggagaggatg 4500
aatgacgcga caggaagaac ttgccgctgc ccgtgcggca ctgcatgacc tgatgacagg 4560
taaacgggtg gcaacagtac agaaagacgg acgaagggtg gagtttacgg ccacttccgt 4620
gtctgacctg aaaaaatata ttgcagagct ggaagtgcag accggcatga cacagcgacg 4680
caggggacct gcaggatttt atgtatgaaa acgcccacca ttcccaccct tctggggccg 4740
gacggcatga catcgctgcg cgaatatgcc ggttatcacg gcggtggcag cggatttgga 4800
gggcagttgc ggtcgtggaa cccaccgagt gaaagtgtgg atgcagccct gttgcccaac 4860
tttacccgtg gcaatgcccg cgcagacgat ctggtacgca ataacggcta tgccgccaac 4920
gccatccagc tgcatcagga tcatatcgtc gggtcttttt tccggctcag tcatcgccca 4980
agctggcgct atctgggcat cggggaggaa gaagcccgtg ccttttcccg cgaggttgaa 5040
gcggcatgga aagagtttgc cgaggatgac tgctgctgca ttgacgttga gcgaaaacgc 5100
acgtttacca tgatgattcg ggaaggtgtg gccatgcacg cctttaacgg tgaactgttc 5160
gttcaggcca cctgggatac cagttcgtcg cggcttttcc ggacacagtt ccggatggtc 5220
agcccgaagc gcatcagcaa cccgaacaat accggcgaca gccggaactg ccgtgccggt 5280
gtgcagatta atgacagcgg tgcggcgctg ggatattacg tcagcgagga cgggtatcct 5340
ggctggatgc cgcagaaatg gacatggata ccccgtgagt tacccggcgg gcgcgcctcg 5400
ttcattcacg tttttgaacc cgtggaggac gggcagactc gcggtgcaaa tgtgttttac 5460
agcgtgatgg agcagatgaa gatgctcgac acgctgcaga acacgcagct gcagagcgcc 5520
attgtgaagg cgatgtatgc cgccaccatt gagagtgagc tggatacgca gtcagcgatg 5580
gattttattc tgggcgcgaa cagtcaggag cagcgggaaa ggctgaccgg ctggattggt 5640
gaaattgccg cgtattacgc cgcagcgccg gtccggctgg gaggcgcaaa agtaccgcac 5700
ctgatgccgg gtgactcact gaacctgcag acggctcagg atacggataa cggctactcc 5760
gtgtttgagc agtcactgct gcggtatatc gctgccgggc tgggtgtctc gtatgagcag 5820
ctttcccgga attacgccca gatgagctac tccacggcac gggccagtgc gaacgagtcg 5880
tgggcgtact ttatggggcg gcgaaaattc gtcgcatccc gtcaggcgag ccagatgttt 5940
ctgtgctggc tggaagaggc catcgttcgc cgcgtggtga cgttaccttc aaaagcgcgc 6000
ttcagttttc aggaagcccg cagtgcctgg gggaactgcg actggatagg ctccggtcgt 6060
atggccatcg cgatggtctg aaagaagttc aggaagcggt gatgctgata gaagccggac 6120
tgagtaccta cgagaaagag tgcgcaaaac gcggtgacga ctatcaggaa atttttgccc 6180
agcaggtccg tgaaacgatg gagcgccgtg cagccggtct taaaccgccc gcctgggcgg 6240
ctgcagcatt tgaatccggg ctgcgacaat caacagagga ggagaagagt gacagcagag 6300
ctgcgtaatc tcccgcatat tgccagcatg gcctttaatg agccgctgat gcttgaaccc 6360
gcctatgcgc gggttttctt ttgtgcgctt gcaggccagc ttgggatcag cagcctgacg 6420
gatgcggtgt ccggcgacag cctgactgcc caggaggcac tcgcgacgct ggcattatcc 6480
ggtgatgatg acggaccacg acaggcccgc agttatcagg tcatgaacgg catcgccgtg 6540
ctgccggtgt ccggcacgct ggtcagccgg acgcgggcgc tgcagccgta ctcggggatg 6600
accggttaca acggcattat cgcccgtctg caacaggctg ccagcgatcc gatggtggac 6660
ggcattctgc tcgatatgga cacgcccggc gggatggtgg cgggggcatt tgactgcgct 6720
gacatcatcg cccgtgtgcg tgacataaaa ccggtatggg cgcttgccaa cgacatgaac 6780
tgcagtgcag gtcagttgct tgccagtgcc gcctcccggc gtctggtcac gcagaccgcc 6840
cggacaggct ccatcggcgt catgatggct cacagtaatt acggtgctgc gctggagaaa 6900
cagggtgtgg aaatcacgct gatttacagc ggcagccata aggtggatgg caacccctac 6960
agccatcttc cggatgacgt ccgggagaca ctgcagtccc ggatggacgc aacccgccag 7020
atgtttgcgc agaaggtgtc ggcatatacc ggcctgtccg tgcaggttgt gctggatacc 7080
gaggctgcag tgtacagcgg tcaggaggcc attgatgccg gactggctga tgaacttgtt 7140
aacagcaccg atgcgatcac cgtcatgcgt gatgcactgg atgcacgtaa atcccgtctc 7200
tcaggagggc gaatgaccaa agagactcaa tcaacaactg tttcagccac tgcttcgcag 7260
gctgacgtta ctgacgtggt gccagcgacg gagggcgaga acgccagcgc ggcgcagccg 7320
gacgtgaacg cgcagatcac cgcagcggtt gcggcagaaa acagccgcat tatggggatc 7380
ctcaactgtg aggaggctca cggacgcgaa gaacaggcac gcgtgctggc agaaaccccc 7440
ggtatgaccg tgaaaacggc ccgccgcatt ctggccgcag caccacagag tgcacaggcg 7500
cgcagtgaca ctgcgctgga tcgtctgatg cagggggcac cggcaccgct ggctgcaggt 7560
aacccggcat ctgatgccgt taacgatttg ctgaacacac cagtgtaagg gatgtttatg 7620
acgagcaaag aaacctttac ccattaccag ccgcagggca acagtgaccc ggctcatacc 7680
gcaaccgcgc ccggcggatt gagtgcgaaa gcgcctgcaa tgaccccgct gatgctggac 7740
acctccagcc gtaagctggt tgcgtgggat ggcaccaccg acggtgctgc cgttggcatt 7800
cttgcggttg ctgctgacca gaccagcacc acgctgacgt tctacaagtc cggcacgttc 7860
cgttatgagg atgtgctctg gccggaggct gccagcgacg agacgaaaaa acggaccgcg 7920
tttgccggaa cggcaatcag catcgtttaa ctttaccctt catcactaaa ggccgcctgt 7980
gcggcttttt ttacgggatt tttttatgtc gatgtacaca accgcccaac tgctggcggc 8040
aaatgagcag aaatttaagt ttgatccgct gtttctgcgt ctctttttcc gtgagagcta 8100
tcccttcacc acggagaaag tctatctctc acaaattccg ggactggtaa acatggcgct 8160
gtacgtttcg ccgattgttt ccggtgaggt tatccgttcc cgtggcggct ccacctctga 8220
atttacgccg ggatatgtca agccgaagca tgaagtgaat ccgcagatga ccctgcgtcg 8280
cctgccggat gaagatccgc agaatctggc ggacccggct taccgccgcc gtcgcatcat 8340
catgcagaac atgcgtgacg aagagctggc cattgctcag gtcgaagaga tgcaggcagt 8400
ttctgccgtg cttaagggca aatacaccat gaccggtgaa gccttcgatc cggttgaggt 8460
ggatatgggc cgcagtgagg agaataacat cacgcagtcc ggcggcacgg agtggagcaa 8520
gcgtgacaag tccacgtatg acccgaccga cgatatcgaa gcctacgcgc tgaacgccag 8580
cggtgtggtg aatatcatcg tgttcgatcc gaaaggctgg gcgctgttcc gttccttcaa 8640
agccgtcaag gagaagctgg atacccgtcg tggctctaat tccgagctgg agacagcggt 8700
gaaagacctg ggcaaagcgg tgtcctataa ggggatgtat ggcgatgtgg ccatcgtcgt 8760
gtattccgga cagtacgtgg aaaacggcgt caaaaagaac ttcctgccgg acaacacgat 8820
ggtgctgggg aacactcagg cacgcggtct gcgcacctat ggctgcattc aggatgcgga 8880
cgcacagcgc gaaggcatta acgcctctgc ccgttacccg aaaaactggg tgaccaccgg 8940
cgatccggcg cgtgagttca ccatgattca gtcagcaccg ctgatgctgc tggctgaccc 9000
tgatgagttc gtgtccgtac aactggcgta atcatggccc ttcggggcca ttgtttctct 9060
gtggaggagt ccatgacgaa agatgaactg attgcccgtc tccgctcgct gggtgaacaa 9120
ctgaaccgtg atgtcagcct gacggggacg aaagaagaac tggcgctccg tgtggcagag 9180
ctgaaagagg agcttgatga cacggatgaa actgccggtc aggacacccc tctcagccgg 9240
gaaaatgtgc tgaccggaca tgaaaatgag gtgggatcag cgcagccgga taccgtgatt 9300
ctggatacgt ctgaactggt cacggtcgtg gcactggtga agctgcatac tgatgcactt 9360
cacgccacgc gggatgaacc tgtggcattt gtgctgccgg gaacggcgtt tcgtgtctct 9420
gccggtgtgg cagccgaaat gacagagcgc ggcctggcca gaatgcaata acgggaggcg 9480
ctgtggctga tttcgataac ctgttcgatg ctgccattgc ccgcgccgat gaaacgatac 9540
gcgggtacat gggaacgtca gccaccatta catccggtga gcagtcaggt gcggtgatac 9600
gtggtgtttt tgatgaccct gaaaatatca gctatgccgg acagggcgtg cgcgttgaag 9660
gctccagccc gtccctgttt gtccggactg atgaggtgcg gcagctgcgg cgtggagaca 9720
cgctgaccat cggtgaggaa aatttctggg tagatcgggt ttcgccggat gatggcggaa 9780
gttgtcatct ctggcttgga cggggcgtac cgcctgccgt taaccgtcgc cgctgaaagg 9840
gggatgtatg gccataaaag gtcttgagca ggccgttgaa aacctcagcc gtatcagcaa 9900
aacggcggtg cctggtgccg ccgcaatggc cattaaccgc gttgcttcat ccgcgatatc 9960
gcagtcggcg tcacaggttg cccgtgagac aaaggtacgc cggaaactgg taaaggaaag 10020
ggccaggctg aaaagggcca cggtcaaaaa tccgcaggcc agaatcaaag ttaaccgggg 10080
ggatttgccc gtaatcaagc tgggtaatgc gcgggttgtc ctttcgcgcc gcaggcgtcg 10140
taaaaagggg cagcgttcat ccctgaaagg tggcggcagc gtgcttgtgg tgggtaaccg 10200
tcgtattccc ggcgcgttta ttcagcaact gaaaaatggc cggtggcatg tcatgcagcg 10260
tgtggctggg aaaaaccgtt accccattga tgtggtgaaa atcccgatgg cggtgccgct 10320
gaccacggcg tttaaacaaa atattgagcg gatacggcgt gaacgtcttc cgaaagagct 10380
gggctatgcg ctgcagcatc aactgaggat ggtaataaag cgatgaaaca tactgaactc 10440
cgtgcagccg tactggatgc actggagaag catgacaccg gggcgacgtt ttttgatggt 10500
cgccccgctg tttttgatga ggcggatttt ccggcagttg ccgtttatct caccggcgct 10560
gaatacacgg gcgaagagct ggacagcgat acctggcagg cggagctgca tatcgaagtt 10620
ttcctgcctg ctcaggtgcc ggattcagag ctggatgcgt ggatggagtc ccggatttat 10680
ccggtgatga gcgatatccc ggcactgtca gatttgatca ccagtatggt ggccagcggc 10740
tatgactacc ggcgcgacga tgatgcgggc ttgtggagtt cagccgatct gacttatgtc 10800
attacctatg aaatgtgagg acgctatgcc tgtaccaaat cctacaatgc cggtgaaagg 10860
tgccgggacc accctgtggg tttataaggg gagcggtgac ccttacgcga atccgctttc 10920
agacgttgac tggtcgcgtc tggcaaaagt taaagacctg acgcccggcg aactgaccgc 10980
tgagtcctat gacgacagct atctcgatga tgaagatgca gactggactg cgaccgggca 11040
ggggcagaaa tctgccggag ataccagctt cacgctggcg tggatgcccg gagagcaggg 11100
gcagcaggcg ctgctggcgt ggtttaatga aggcgatacc cgtgcctata aaatccgctt 11160
cccgaacggc acggtcgatg tgttccgtgg ctgggtcagc agtatcggta aggcggtgac 11220
ggcgaaggaa gtgatcaccc gcacggtgaa agtcaccaat gtgggacgtc cgtcgatggc 11280
agaagatcgc agcacggtaa cagcggcaac cggcatgacc gtgacgcctg ccagcacctc 11340
ggtggtgaaa gggcagagca ccacgctgac cgtggccttc cagccggagg gcgtaaccga 11400
caagagcttt cgtgcggtgt ctgcggataa aacaaaagcc accgtgtcgg tcagtggtat 11460
gaccatcacc gtgaacggcg ttgctgcagg caaggtcaac attccggttg tatccggtaa 11520
tggtgagttt gctgcggttg cagaaattac cgtcaccgcc agttaatccg gagagtcagc 11580
gatgttcctg aaaaccgaat catttgaaca taacggtgtg accgtcacgc tttctgaact 11640
gtcagccctg cagcgcattg agcatctcgc cctgatgaaa cggcaggcag aacaggcgga 11700
gtcagacagc aaccggaagt ttactgtgga agacgccatc agaaccggcg cgtttctggt 11760
ggcgatgtcc ctgtggcata accatccgca gaagacgcag atgccgtcca tgaatgaagc 11820
cgttaaacag attgagcagg aagtgcttac cacctggccc acggaggcaa tttctcatgc 11880
tgaaaacgtg gtgtaccggc tgtctggtat gtatgagttt gtggtgaata atgcccctga 11940
acagacagag gacgccgggc ccaaataaac ttataaattg tgagagaaat taatgaatgt 12000
ctaagttaat gcagaaacgg agagacatac tatattcatg aactaaaaga cttaatattg 12060
tgaaggtata ctttctttcc acataaattt gtagtcaata tgttcacccc aaaaaagctg 12120
tttgttaact tgccaacctc attctaaaat gtatatagaa gcccaaaaga caataacaaa 12180
aatattcttg tagaacaaaa tgggaaagaa tgttccacta aatatcaaga tttagagcaa 12240
agcatgagat gtgtggggat agacagtgag gctgataaaa tagagtagag ctcagaaaca 12300
gacccattga tatatgtaag tgacctatga aaaaaatatg gcattttaca atgggaaaat 12360
gatgatcttt ttctttttta gaaaaacagg gaaatatatt tatatgtaaa aaataaaagg 12420
gaacccatat gtcataccat acacacaaaa aaattccagt gaattataag tctaaatgga 12480
gaaggcaaaa ctttaaatct tttagaaaat aatatagaag catgccatca tgacttcagt 12540
gtagagaaaa atttcttatg actcaaagtc ctaaccacaa agaaaagatt gttaattaga 12600
ttgcatgaat attaagactt atttttaaaa ttaaaaaacc attaagaaaa gtcaggccat 12660
agaatgacag aaaatatttg caacacccca gtaaagagaa ttgtaatatg cagattataa 12720
aaagaagtct tacaaatcag taaaaaataa aactagacaa aaatttgaac agatgaaaga 12780
gaaactctaa ataatcatta cacatgagaa actcaatctc agaaatcaga gaactatcat 12840
tgcatataca ctaaattaga gaaatattaa aaggctaagt aacatctgtg gcaatattga 12900
tggtatataa ccttgatatg atgtgatgag aacagtactt taccccatgg gcttcctccc 12960
caaaccctta ccccagtata aatcatgaca aatatacttt aaaaaccatt accctatatc 13020
taaccagtac tcctcaaaac tgtcaaggtc atcaaaaata agaaaagtct gaggaactgt 13080
caaaactaag aggaacccaa ggagacatga gaattatatg taatgtggca ttctgaatga 13140
gatcccagaa cagaaaaaga acagtagcta aaaaactaat gaaatataaa taaagtttga 13200
actttagttt tttttaaaaa agagtagcat taacacggca aagccatttt catatttttc 13260
ttgaacatta agtacaagtc tataattaaa aattttttaa atgtagtctg gaacattgcc 13320
agaaacagaa gtacaacagc tatctgtgct gtcgcctaac tatccatagc tgattggtct 13380
aaaatgagat acatcaacgc tcctccatgt tttttgtttt ctttttaaat gaaaaacttt 13440
attttttaag aggagtttca ggttcatagc aaaattgaga ggaaggtaca ttcaagctga 13500
ggaagttttc ctctattcct agtttactga gagattgcat catgaatggg tgttaaattt 13560
tgtcaaatgc tttttctgtg tctatcaata tgaccatgtg attttcttct ttaacctgtt 13620
gatgggacaa attacgttaa ttgattttca aacgttgaac cacccttaca tatctggaat 13680
aaattctact tggttgtggt gtatattttt tgatacattc ttggattctt tttgctaata 13740
ttttgttgaa aatgtttgta tctttgttca tgagagatat tggtctgttg ttttcttttc 13800
ttgtaatgtc attttctagt tccggtatta aggtaatgct ggcctagttg aatgatttag 13860
gaagtattcc ctctgcttct gtcttctgaa agagattgta gaaagttgat acaatttttt 13920
tttctttaaa tatatgcatc cgctggattt cagtctgctg aaccggcgcg aggctgacga 13980
agagcctgaa gatgatgtgc tgatgcagaa agcggcaggg cttgccggag gtgtccgctt 14040
tggcccggac gggaatgaag ttatccccgc ttccccggat gtggcggaca tgacggagga 14100
tgacgtaatg ctgatgacag tatcagaagg gatcgcagga ggagtccggt atggctgaac 14160
cggtaggcga tctggtcgtt gatttgagtc tggatgcggc cagatttgac gagcagatgg 14220
ccagagtcag gcgtcatttt tctggtacgg aaagtgatgc gaaaaaaaca gcggcagtcg 14280
ttgaacagtc gctgagccga caggcgctgg ctgcacagaa agcggggatt tccgtcgggc 14340
agtataaagc cgccatgcgt atgctgcctg cacagttcac cgacgtggcc acgcagcttg 14400
caggcgggca aagtccgtgg ctgatcctgc tgcaacaggg ggggcaggtg aaggactcct 14460
tcggcgggat gatccccatg ttcagggggc ttgccggtgc gatcaccctg ccgatggtgg 14520
gggccacctc gctggcggtg gcgaccggtg cgctggcgta tgcctggtat cagggcaact 14580
caaccctgtc cgatttcaac aaaacgctgg tcctttccgg caatcaggcg ggactgacgg 14640
cagatcgtat gctggtcctg tccagagccg ggcaggcggc agggctgacg tttaaccaga 14700
ccagcgagtc actcagcgca ctggttaagg cgggggtaag cggtgaggct cagattgcgt 14760
ccatcagcca gagtgtggcg cgtttctcct ctgcatccgg cgtggaggtg gacaaggtcg 14820
ctgaagcctt cgggaagctg accacagacc cgacgtcggg gctgacggcg atggctcgcc 14880
agttccataa cgtgtcggcg gagcagattg cgtatgttgc tcagttgcag cgttccggcg 14940
atgaagccgg ggcattgcag gcggcgaacg aggccgcaac gaaagggttt gatgaccaga 15000
cccgccgcct gaaagagaac atgggcacgc tggagacctg ggcagacagg actgcgcggg 15060
cattcaaatc catgtgggat gcggtgctgg atattggtcg tcctgatacc gcgcaggaga 15120
tgctgattaa ggcagaggct gcgtataaga aagcagacga catctggaat ctgcgcaagg 15180
atgattattt tgttaacgat gaagcgcggg cgcgttactg ggatgatcgt gaaaaggccc 15240
gtcttgcgct tgaagccgcc cgaaagaagg ctgagcagca gactcaacag gacaaaaatg 15300
cgcagcagca gagcgatacc gaagcgtcac ggctgaaata taccgaagag gcgcagaagg 15360
cttacgaacg gctgcagacg ccgctggaga aatataccgc ccgtcaggaa gaactgaaca 15420
aggcactgaa agacgggaaa atcctgcagg cggattacaa cacgctgatg gcggcggcga 15480
aaaaggatta tgaagcgacg ctgaaaaagc cgaaacagtc cagcgtgaag gtgtctgcgg 15540
gcgatcgtca ggaagacagt gctcatgctg ccctgctgac gcttcaggca gaactccgga 15600
cgctggagaa gcatgccgga gcaaatgaga aaatcagcca gcagcgccgg gatttgtgga 15660
aggcggagag tcagttcgcg gtactggagg aggcggcgca acgtcgccag ctgtctgcac 15720
aggagaaatc cctgctggcg cataaagatg agacgctgga gtacaaacgc cagctggctg 15780
cacttggcga caaggttacg tatcaggagc gcctgaacgc gctggcgcag caggcggata 15840
aattcgcaca gcagcaacgg gcaaaacggg ccgccattga tgcgaaaagc cgggggctga 15900
ctgaccggca ggcagaacgg gaagccacgg aacagcgcct gaaggaacag tatggcgata 15960
atccgctggc gctgaataac gtcatgtcag agcagaaaaa gacctgggcg gctgaagacc 16020
agcttcgcgg gaactggatg gcaggcctga agtccggctg gagtgagtgg gaagagagcg 16080
ccacggacag tatgtcgcag gtaaaaagtg cagccacgca gacctttgat ggtattgcac 16140
agaatatggc ggcgatgctg accggcagtg agcagaactg gcgcagcttc acccgttccg 16200
tgctgtccat gatgacagaa attctgctta agcaggcaat ggtggggatt gtcgggagta 16260
tcggcagcgc cattggcggg gctgttggtg gcggcgcatc cgcgtcaggc ggtacagcca 16320
ttcaggccgc tgcggcgaaa ttccattttg caaccggagg atttacggga accggcggca 16380
aatatgagcc agcggggatt gttcaccgtg gtgagtttgt cttcacgaag gaggcaacca 16440
gccggattgg cgtggggaat ctttaccggc tgatgcgcgg ctatgccacc ggcggttatg 16500
tcggtacacc gggcagcatg gcagacagcc ggtcgcaggc gtccgggacg tttgagcaga 16560
ataaccatgt ggtgattaac aacgacggca cgaacgggca gataggtccg gctgctctga 16620
aggcggtgta tgacatggcc cgcaagggtg cccgtgatga aattcagaca cagatgcgtg 16680
atggtggcct gttctccgga ggtggacgat gaagaccttc cgctggaaag tgaaacccgg 16740
tatggatgtg gcttcggtcc cttctgtaag aaaggtgcgc tttggtgatg gctattctca 16800
gcgagcgcct gccgggctga atgccaacct gaaaacgtac agcgtgacgc tttctgtccc 16860
ccgtgaggag gccacggtac tggagtcgtt tctggaagag cacgggggct ggaaatcctt 16920
tctgtggacg ccgccttatg agtggcggca gataaaggtg acctgcgcaa aatggtcgtc 16980
gcgggtcagt atgctgcgtg ttgagttcag cgcagagttt gaacaggtgg tgaactgatg 17040
caggatatcc ggcaggaaac actgaatgaa tgcacccgtg cggagcagtc ggccagcgtg 17100
gtgctctggg aaatcgacct gacagaggtc ggtggagaac gttatttttt ctgtaatgag 17160
cagaacgaaa aaggtgagcc ggtcacctgg caggggcgac agtatcagcc gtatcccatt 17220
caggggagcg gttttgaact gaatggcaaa ggcaccagta cgcgccccac gctgacggtt 17280
tctaacctgt acggtatggt caccgggatg gcggaagata tgcagagtct ggtcggcgga 17340
acggtggtcc ggcgtaaggt ttacgcccgt tttctggatg cggtgaactt cgtcaacgga 17400
aacagttacg ccgatccgga gcaggaggtg atcagccgct ggcgcattga gcagtgcagc 17460
gaactgagcg cggtgagtgc ctcctttgta ctgtccacgc cgacggaaac ggatggcgct 17520
gtttttccgg gacgtatcat gctggccaac acctgcacct ggacctatcg cggtgacgag 17580
tgcggttata gcggtccggc tgtcgcggat gaatatgacc agccaacgtc cgatatcacg 17640
aaggataaat gcagcaaatg cctgagcggt tgtaagttcc gcaataacgt cggcaacttt 17700
ggcggcttcc tttccattaa caaactttcg cagtaaatcc catgacacag acagaatcag 17760
cgattctggc gcacgcccgg cgatgtgcgc cagcggagtc gtgcggcttc gtggtaagca 17820
cgccggaggg ggaaagatat ttcccctgcg tgaatatctc cggtgagccg gaggctattt 17880
ccgtatgtcg ccggaagact ggctgcaggc agaaatgcag ggtgagattg tggcgctggt 17940
ccacagccac cccggtggtc tgccctggct gagtgaggcc gaccggcggc tgcaggtgca 18000
gagtgatttg ccgtggtggc tggtctgccg ggggacgatt cataagttcc gctgtgtgcc 18060
gcatctcacc gggcggcgct ttgagcacgg tgtgacggac tgttacacac tgttccggga 18120
tgcttatcat ctggcgggga ttgagatgcc ggactttcat cgtgaggatg actggtggcg 18180
taacggccag aatctctatc tggataatct ggaggcgacg gggctgtatc aggtgccgtt 18240
gtcagcggca cagccgggcg atgtgctgct gtgctgtttt ggttcatcag tgccgaatca 18300
cgccgcaatt tactgcggcg acggcgagct gctgcaccat attcctgaac aactgagcaa 18360
acgagagagg tacaccgaca aatggcagcg acgcacacac tccctctggc gtcaccgggc 18420
atggcgcgca tctgccttta cggggattta caacgatttg gtcgccgcat cgaccttcgt 18480
gtgaaaacgg gggctgaagc catccgggca ctggccacac agctcccggc gtttcgtcag 18540
aaactgagcg acggctggta tcaggtacgg attgccgggc gggacgtcag cacgtccggg 18600
ttaacggcgc agttacatga gactctgcct gatggcgctg taattcatat tgttcccaga 18660
gtcgccgggg ccaagtcagg tggcgtattc cagattgtcc tgggggctgc cgccattgcc 18720
ggatcattct ttaccgccgg agccaccctt gcagcatggg gggcagccat tggggccggt 18780
ggtatgaccg gcatcctgtt ttctctcggt gccagtatgg tgctcggtgg tgtggcgcag 18840
atgctggcac cgaaagccag aactccccgt atacagacaa cggataacgg taagcagaac 18900
acctatttct cctcactgga taacatggtt gcccagggca atgttctgcc tgttctgtac 18960
ggggaaatgc gcgtggggtc acgcgtggtt tctcaggaga tcagcacggc agacgaaggg 19020
gacggtggtc aggttgtggt gattggtcgc tgatgcaaaa tgttttatgt gaaaccgcct 19080
gcgggcggtt ttgtcattta tggagcgtga ggaatgggta aaggaagcag taaggggcat 19140
accccgcgcg aagcgaagga caacctgaag tccacgcagt tgctgagtgt gatcgcgatg 19200
ccatcagcga agggccgatt gaaggtccgg tggatggctt aaaaagcgtg ctgctgaaca 19260
gtacgccggt gctggacact gaggggaata ccaacatatc cggtgtcacg gtggtgttcc 19320
gggctggtga gcaggagcag actccgccgg agggatttga atcctccggc tccgagacgg 19380
tgctgggtac ggaagtgaaa tatgacacgc cgatcacccg caccattacg tctgcaaaca 19440
tcgaccgtct gcgctttacc ttcggtgtac aggcactggt ggaaaccacc tcaaagggtg 19500
acaggaatcc gtcggaagtc cgcctgctgg ttcagataca acgtaacggt ggctgggtga 19560
cggaaaaaga catcaccatt aagggcaaaa ccacctcgca gtatctggcc tcggtggtga 19620
tgggtaacct gccgccgcgc ccgtttaata tccggatgcg caggatgacg ccggacagca 19680
ccacagacca gctgcagaac aaaacgctct ggtcgtcata cactgaaatc atcgcgatgt 19740
gaaacagtgc tacccgaaca cggcactggt cggcgtgcag gtggactcgg agcagttcgg 19800
cagccagcag gtgagccgta attatcatct gcgcgggcgt attctgcagg tgccgtcgaa 19860
ctataacccg cagacgcggc aatacagcgg tatctgggac ggaacgttta aaccggcata 19920
cagcaacaac atggcctggt gtctgtggga tatgctgacc catccgcgct acggcatggg 19980
gaaacgtctt ggtgcggcgg atgtggataa atgggcgctg tatgtcatcg gccagtactg 20040
cgaccagtca gtgccggacg gctttggcgg cacggagccg cgcatcacct gtaatgcgta 20100
cctgaccaca cagcgtaagg cgtgggatgt gctcagcgat ttctgctcgg cgatgcgctg 20160
tatgccggta tggaacgggc agacgctgac gttcgtgcag gaccgaccgt cggataagac 20220
gtggacctat aaccgcagta atgtggtgat gccggatgat ggcgcgccgt tccgctacag 20280
cttcagcgcc ctgaaggacc gccataatgc cgttgaggtg aactggattg acccgaacaa 20340
cggctgggag acggcgacag agcttgttga agatacgcag gccattgccc gttacggtcg 20400
taatgttacg aagatggatg cctttggctg taccagccgg gggcaggcac accgcgccgg 20460
gctgtggctg attaaaacag aactgctgga aacgcagacc gtggatttca gcgtcggcgc 20520
agaagggctt cgccatgtac cgggcgatgt tattgaaatc tgcgatgatg actatgccgg 20580
tatcagcacc ggtggtcgtg tgctggcggt gaacagccag acccggacgc tgacgctcga 20640
ccgtgaaatc acgctgccat cctccggtac cgcgctgata agcctggttg acggaagtgg 20700
caatccggtc agcgtggagg ttcagtccgt caccgacggc gtgaaggtaa aagtgagccg 20760
tgttcctgac ggtgttgctg aatacagcgt atgggagctg aagctgccga cgctgcgcca 20820
gcgactgttc cgctgcgtga gtatccgtga gaacgacgac ggcacgtatg ccatcaccgc 20880
cgtgcagcat gtgccggaaa aagaggccat cgtggataac ggggcgcact ttgacggcga 20940
acagagtggc acggtgaatg gtgtcacgcc gccagcggtg cagcacctga ccgcagaagt 21000
cactgcagac agcggggaat atcaggtgct ggcgcgatgg gacacaccga aggtggtgaa 21060
gggcgtgagt ttcctgctcc gtctgaccgt aacagcggac gacggcagtg agcggctggt 21120
cagcacggcc cggacgacgg aaaccacata ccgcttcacg caactggcgc tggggaacta 21180
caggctgaca gtccgggcgg taaatgcgtg ggggcagcag ggcgatccgg cgtcggtatc 21240
gttccggatt gccgcaccgg cagcaccgtc gaggattgag ctgacgccgg gctattttca 21300
gataaccgcc acgccgcatc ttgccgttta tgacccgacg gtacagtttg agttctggtt 21360
ctcggaaaag cagattgcgg atatcagaca ggttgaaacc agcacgcgtt atcttggtac 21420
ggcgctgtac tggatagccg ccagtatcaa tatcaaaccg ggccatgatt attactttta 21480
tatccgcagt gtgaacaccg ttggcaaatc ggcattcgtg gaggccgtcg gtcgggcgag 21540
cgatgatgcg gaaggttacc tggatttttt caaaggcaag ataaccgaat cccatctcgg 21600
caaggagctg ctggaaaaag tcgagctgac ggaggataac gccagcagac tggaggagtt 21660
ttcgaaagag tggaaggatg ccagtgataa gtggaatgcc atgtgggctg tcaaaattga 21720
gcagaccaaa gacggcaaac attatgtcgc gggtattggc ctcagcatgg aggacacgga 21780
ggaaggcaaa ctgagccagt ttctggttgc cgccaatcgt atcgcattta ttgacccggc 21840
aaacgggaat gaaacgccga tgtttgtggc gcagggcaac cagatattca tgaacgacgt 21900
gttcctgaag cgcctgacgg cccccaccat taccagcggc ggcaatcctc cggccttttc 21960
cctgacaccg gacggaaagc tgaccgctaa aaatgcggat atcagtggca gtgtgaatgc 22020
gaactccggg acgctcagta atgtgacgat agctgaaaac tgtacgataa acggtacgct 22080
gagggcggaa aaaatcgtcg gggacattgt aaaggcggcg agcgcggctt ttccgcgcca 22140
gcgtgaaagc agtgtggact ggccgtcagg tacccgtact gtcaccgtga ccgatgacca 22200
tccttttgat cgccagatag tggtgcttcc gctgacgttt cgcggaagta agcgtactgt 22260
cagcggcagg acaacgtatt cgatgtgtta tctgaaagta ctgatgaacg gtgcggtgat 22320
ttatgatggc gcggcgaacg aggcggtaca ggtgttctcc cgtattgttg acatgccagc 22380
gggtcgggga aacgtgatcc tgacgttcac gcttacgtcc acacggcatt cggcagatat 22440
tccgccgtat acgtttgcca gcgatgtgca ggttatggtg attaagaaac aggcgctggg 22500
catcagcgtg gtctgagtgt gttacagagg ttcgtccggg aacgggcgtt ttattataaa 22560
acagtgagag gtgaacgatg cgtaatgtgt gtattgccgt tgctgtcttt gccgcacttg 22620
cggtgacagt cactccggcc cgtgcggaag gtggacatgg tacgtttacg gtgggctatt 22680
ttcaagtgaa accgggtaca ttgccgtcgt tgtcgggcgg ggataccggt gtgagtcatc 22740
tgaaagggat taacgtgaag taccgttatg agctgacgga cagtgtgggg gtgatggctt 22800
ccctggggtt cgccgcgtcg aaaaagagca gcacagtgat gaccggggag gatacgtttc 22860
actatgagag cctgcgtgga cgttatgtga gcgtgatggc cggaccggtt ttacaaatca 22920
gtaagcaggt cagtgcgtac gccatggccg gagtggctca cagtcggtgg tccggcagta 22980
caatggatta ccgtaagacg gaaatcactc ccgggtatat gaaagagacg accactgcca 23040
gggacgaaag tgcaatgcgg catacctcag tggcgtggag tgcaggtata cagattaatc 23100
cggcagcgtc cgtcgttgtt gatattgctt atgaaggctc cggcagtggc gactggcgta 23160
ctgacggatt catcgttggg gtcggttata aattctgatt agccaggtaa cacagtgtta 23220
tgacagcccg ccggaaccgg tgggcttttt tgtggggtga atatggcagt aaagatttca 23280
ggagtcctga aagacggcac aggaaaaccg gtacagaact gcaccattca gctgaaagcc 23340
agacgtaaca gcaccacggt ggtggtgaac acggtgggct cagagaatcc ggatgaagcc 23400
gggcgttaca gcatggatgt ggagtacggt cagtacagtg tcatcctgca ggttgacggt 23460
tttccaccat cgcacgccgg gaccatcacc gtgtatgaag attcacaacc ggggacgctg 23520
aatgattttc tctgtgccat gacggaggat gatgcccggc cggaggtgct gcgtcgtctt 23580
gaactgatgg tggaagaggt ggcgcgtaac gcgtccgtgg tggcacagag tacggcagac 23640
gcgaagaaat cagccggcga tgccagtgca tcagctgctc aggtcgcggc ccttgtgact 23700
gatgcaactg actcagcacg cgccgccagc acgtccgccg gacaggctgc atcgtcagct 23760
caggaagcgt cctccggcgc agaagcggca tcagcaaagg ccactgaagc ggaaaaaagt 23820
gccgcagccg cagagtcctc aaaaaacgcg gcggccacca gtgccggtgc ggcgaaaacg 23880
tcagaaacga atgctgcagc gtcacaacaa tcagccgcca cgtctgcctc caccgcggcc 23940
acgaaagcgt cagaggccgc cacttcagca cgagatgcgg tggcctcaaa agaggcagca 24000
aaatcatcag aaacgaacgc atcatcaagt gccggtcgtg cagcttcctc ggcaacggcg 24060
gcagaaaatt ctgccagggc ggcaaaaacg tccgagacga atgccaggtc atctgaaaca 24120
gcagcggaac ggagcgcctc tgccgcggca gacgcaaaaa cagcggcggc ggggagtgcg 24180
tcaacggcat ccacgaaggc gacagaggct gcgggaagtg cggtatcagc atcgcagagc 24240
aaaagtgcgg cagaagcggc ggcaatacgt gcaaaaaatt cggcaaaacg tgcagaagat 24300
atagcttcag ctgtcgcgct tgaggatgcg gacacaacga gaaaggggat agtgcagctc 24360
agcagtgcaa ccaacagcac gtctgaaacg cttgctgcaa cgccaaaggc ggttaaggtg 24420
gtaatggatg aaacgaacag aaaagcccac tggacagtcc ggcactgacc ggaacgccaa 24480
cagcaccaac cgcgctcagg ggaacaaaca atacccagat tgcgaacacc gcttttgtac 24540
tggccgcgat tgcagatgtt atcgacgcgt cacctgacgc actgaatacg ctgaatgaac 24600
tggccgcagc gctcgggaat gatccagatt ttgctaccac catgactaac gcgcttgcgg 24660
gtaaacaacc gaagaatgcg acactgacgg cgctggcagg gctttccacg gcgaaaaata 24720
aattaccgta ttttgcggaa aatgatgccg ccagcctgac tgaactgact caggttggca 24780
gggatattct ggcaaaaaat tccgttgcag atgttcttga ataccttggg gccggtgaga 24840
attcggcctt tccggcaggt gcgccgatcc cgtggccatc agatatcgtt ccgtctggct 24900
acgtcctgat gcaggggcag gcgtttgaca aatcagccta cccaaaactt gctgtcgcgt 24960
atccatcggg tgtgcttcct gatatgcgag gctggacaat caaggggaaa cccgccagcg 25020
gtcgtgctgt attgtctcag gaacaggatg gaattaagtc gcacacccac agtgccagtg 25080
catccggtac ggatttgggg acgaaaacca catcgtcgtt tgattacggg acgaaaacaa 25140
caggcagttt cgattacggc accaaatcga cgaataacac gggggctcat gctcacagtc 25200
tgagcggttc aacaggggcc gcgggtgctc atgcccacac aagtggttta aggatgaaca 25260
gttctggctg gagtcagtat ggaacagcaa ccattacagg aagtttatcc acagttaaag 25320
gaaccagcac acagggtatt gcttatttat cgaaaacgga cagtcagggc agccacagtc 25380
actcattgtc cggtacagcc gtgagtgccg gtgcacatgc gcatacagtt ggtattggtg 25440
cgcaccagca tccggttgtt atcggtgctc atgcccattc tttcagtatt ggttcacacg 25500
gacacaccat caccgttaac gctgcgggta acgcggaaaa caccgtcaaa aacattgcat 25560
ttaactatat tgtgaggctt gcataatggc attcagaatg agtgaacaac cacggaccat 25620
aaaaatttat aatctgctgg ccggaactaa tgaatttatt ggtgaaggtg acgcatatat 25680
tccgcctcat accggtctgc ctgcaaacag taccgatatt gcaccgccag atattccggc 25740
tggctttgtg gctgttttca acagtgatga ggcatcgtgg catctcgttg aagaccatcg 25800
gggtaaaacc gtctatgacg tggcttccgg cgacgcgtta tttatttctg aactcggtcc 25860
gttaccggaa aattttacct ggttatcgcc gggaggggaa tatcagaagt ggaacggcac 25920
agcctgggtg aaggatacgg aagcagaaaa actgttccgg atccgggagg cggaagaaac 25980
aaaaaaaagc ctgatgcagg tagccagtga gcatattgcg ccgcttcagg atgctgcaga 26040
tctggaaatt gcaacgaagg aagaaacctc gttgctggaa gcctggaaga agtatcgggt 26100
gttgctgaac cgtgttgata catcaactgc acctgatatt gagtggcctg ctgtccctgt 26160
tatggagtaa tcgttttgtg atatgccgca gaaacgttgt atgaaataac gttctgcggt 26220
tagttagtat attgtaaagc tgagtattgg tttatttggc gattattatc ttcaggagaa 26280
taatggaagt tctatgactc aattgttcat agtgtttaca tcaccgccaa ttgcttttaa 26340
gactgaacgc atgaaatatg gtttttcgtc atgttttgag tctgctgttg atatttctaa 26400
agtcggtttt ttttcttcgt tttctctaac tattttccat gaaatacatt tttgattatt 26460
atttgaatca attccaatta cctgaagtct ttcatctata attggcattg tatgtattgg 26520
tttattggag tagatgcttg cttttctgag ccatagctct gatatccaaa tgaagccata 26580
ggcatttgtt attttggctc tgtcagctgc ataacgccaa aaaatatatt tatctgcttg 26640
atcttcaaat gttgtattga ttaaatcaat tggatggaat tgtttatcat aaaaaattaa 26700
tgtttgaatg tgataaccgt cctttaaaaa agtcgtttct gcaagctcct aggtttttgg 26760
cgcgccctac gtcacccgcc ccgttcccac gccccgcgcc acgtcacaaa ctccaccccc 26820
tcattatcat attggcttca atccaaaata aggtatatta ttgatgatgt tacatcg 26877
<210> 74
<211> 26597
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGLAd3
<400> 74
ttaattaagc agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat ggacagcaag 60
cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct gcaaagtaaa 120
ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagct ctgatcaaga 180
gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc 240
cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga 300
tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct 360
gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaagacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac 420
gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct 480
attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt 540
atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt 600
cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt 660
cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag 720
gctcaaggcg agcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt 780
gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg 840
tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg 900
cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg 960
catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgacct caggttactc atatatactt 1020
tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 1080
aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 1140
gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 1200
acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 1260
tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 1320
ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 1380
atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 1440
agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 1500
cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 1560
agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 1620
acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 1680
gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 1740
ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 1800
gctcttaatt aaatcgattt aagggtggga aagaatatat aaggtggggg tcttatgtag 1860
tttgagctcg gctttggtta tttgatggat tgacctagtt ctcaggcagc cacctgtgtg 1920
gactaaatac acccatttct tctccattct gaaggatgtg ctgaaagccg ccttggacag 1980
tgagaaaagc aaacatggaa gcctgctgta ggatcacctt acaccatcag atacccactt 2040
cccacccccg gcttcctgaa ctttctgtaa ttactcatgc cagtgactag ggctcatgtg 2100
ggccatccca ggaaggagac tagtggctgc cattctgtcc tggtctttgt gtctcccgag 2160
gaggagtgta ggtggtgagg tcacaggcta agccaggcca tttaaggaaa gctgcctcag 2220
ctccagccca gccctctctg ccaggtggat atggaaatcc cggtttactc tctggggcct 2280
tttattggct gaaatgctca ccttggtatc tgttacacat tcccttccaa gagcagagct 2340
agataagcca ggtgtggaga caatcagctc ttgaaatctc ccagaagctg ccaaacccct 2400
aaaatcagca agagacaccc ctcatagtcc agactcagct gttttattct gcctctccct 2460
gatctctttt cagggcataa agttttccaa ggagaagaat gaaatcagta tagcaggtca 2520
ttgagaaagt atagaaaggc tcaggttgaa cttcagtgtc tgctaccaat gtgtcataaa 2580
taagtcattt tactactgtg agactcagtt tacccatttg ttgagtatga aaaaaaatca 2640
tatatatttg ttatgctata tgtatcaatg catcgagcta gactctgggg ctaaagcaat 2700
gagtaaaacg tatttggctg aacataaata tgggaggggg gtggaatgca tgaatgtaaa 2760
gaatgctggc ataagtagga ccagtgagtt gggtgtggca gtgcaccttg gagacagagc 2820
caggcggacc tctgagttca aggacagtca tcagggctcc acagagaaat cctgtccaaa 2880
aaaaaaaaaa aaaatcagtg gggaaaggca cctgccatcg aggctgaaga cctgaatttg 2940
gtccacagga tccacgtggt aggaaagaaa gaacttccaa gggttattct ctaacctcca 3000
tacttatatg tgagtgtaca cttaagtaat gtttgtttgt ttgttttgtt cctgttatgt 3060
tttgtttgtt tttaaagcca agtctggtgg ttcaggcatt taatcatagc acccagaagg 3120
cagagttcaa gggcagcctg gtctacatag gaaattgtag gcctatacag tgaaaccctg 3180
tttcaaagga agattaaagg aaaaaagtct tgcactcttc cacaccctga ccaaagtcct 3240
atagtgaaac tctggtcccc tccctcatca ctgctattgc caaactcagt ctccctctat 3300
gacccacatc atgatagcca gggctagacc gtttgtaaag ataaatcagc cttgtctgga 3360
taaataactc caggaaggag aaactgccgg ctgtaaagaa ccttagcagt cgtattcccc 3420
aaaaccacct atataagcct caagtgcccc tccacctttc acagacaccc ctcccctacg 3480
ggagagtatc tgtcctgcac tgtttgaaat aaacagtcct gtctgttgag gtcagtcttc 3540
agtctttttt tctgcttcca gtctcttaag ttgcttcaga aatttaccaa gaatcactaa 3600
ataaagccag ctgtgatggt ccacatctgt attccagtgc ttcgaaggct gaggcagagg 3660
gtctcaagtg tgaggctagc ctgggctgcc tgtggaaccc tgcctttttt tggggagcag 3720
gcttttaaaa aatatttatc acggtgaaat ataaggcagg aggattgtta gaagttcaat 3780
aaggacaatc tgattctgta gtggggttca ggctagctag ggctacatac taaacaaggt 3840
ctcaaccttg ttttagtaag aggaggagga ggaaacagaa ggaaaaaaaa gtaatttctt 3900
aggcacccag taggcctgca agtcttgttt tgaacaaatg aatggatgca tgaatcaatc 3960
tttgctacct ttcaggctct attctgtgtc cccagagcac ccccggccca ggaaagtgag 4020
cagggcacgg taggtctgct ggaatctctg attgtacttg tgagggctct gcctagcagt 4080
ctccctggaa gctgagcctg gccttagcct cttccttctc tctcagagct tctgaagcca 4140
cagaagggac gcatcaaact cggacctaga aatgaacgat tagtcttttt tagtgatttt 4200
ttttcttccg tctttatttt ttgacactca ctgggtagcc ttggctggcc cagagctccc 4260
taggttggtc agagatctgc ctgcctcctg cctgggtgtt gatatacagg gattcaccac 4320
tctatgctct tacgagctgg cttcgaactc atcaggctta gaatgtcggg tcgtctcact 4380
tatacctcct aagtgttgga ataaccagtg tgcaccaccc aagagcccct agctgggact 4440
cttgccaggc ctgtcttctc taagccttag tatccccatc tccaaaatgg gtataaccat 4500
atgcatacgt atcctaaggg catataccaa aagttcagtg aatacagtag agtatgtagg 4560
accccctgcg ggctagcagt agaagccttt ccctttccat tatacccttg gttctaaagt 4620
tggttgaaag ttcccctaag ctctctcccg cccagcaaac cagtcaaacc agtttcctca 4680
ttccccgggc ttctgtacta agcaaacact gctttgcaaa cggttgacca ggagcttgcc 4740
tttgttagag aaggaagtcc aatggtgttt tcttccttgc aatgccggga gtgggtttgc 4800
tgtgccttag aaagggttca aactgggctg gaagtagggc cccagagtag ctgggggttg 4860
gggattcagg atggcctcaa gtttgttgtt ccccaaaccc tcactttttc tagaactatt 4920
tcataataca catgcttaag gatacccatt tgttgaccca ttgcaaaatg ctctctgacc 4980
cagcttctga gactggttca ccccccatgg ataagaattg agtcatctgg tgccattcac 5040
aaatacagat taacctccct cccccaattt actgaacctc aaccaaaaaa agatccgcct 5100
gcctctgcct cccaagtgct aggattttaa agggccacgg taccacacgg atggacacaa 5160
cattcatttt cctgacagac caggagtcag gtcacaggtg tttgactagt aaacacccgg 5220
tgccaaccag ggtgtgggca tttggctatc taccctgagg cccaagatcc aagagcaccc 5280
gtggtccatg gtgctagggg acccggaaat gtagccagtg catcagagat ccagcctctg 5340
tcctcaggga agttcagaaa catctctgct tactgagact tctgcagggt atttgggaag 5400
aggggccagc acagcaggca tgatcagttt tacatgctgg gcctttgtaa gtaagaggat 5460
gtgtccaggc acagtaaagg aaagtctccc ccaggacctt gggccttttt atccactggt 5520
gaggcttttt ttctctttct gttcccccct ccccacctcc cgggctttcc agacagagtt 5580
tccctgtgta ttcattcctg gctgtcctgg aacttgctag gtagaccggg ctggcctcga 5640
actcagtatg aacaaatgtt tacttatggc tggcactgag acttcctctt caccctgact 5700
cctcacccag agcttcccct gaacagaatt ctcttggtta gccttctcaa gatcttctgt 5760
ggaaaaggca gagatagtca tggggtgtgg ctctgtggtc aggctaaacc taatgagtgt 5820
gaggccctga ctttgattcc tagcattgag gaaaagcaga aacaggaatc ttacccaatt 5880
ttcctctgcc tgttaccaga ctcaaggctg tcccgtggag cccattgccc ttcctgagaa 5940
acccacttcc tttcctgagg ctaggaaaga catccctcat ctctgtgcct caatctcatt 6000
gatttttgtg gtgttaaaat tcagttattt gtctttgaga gggctcccct cccccctttg 6060
cctttcacat cctttccctt ctttattgct atgcagagga ccctaactcc taggcaggcc 6120
ctctaccctt gagatacagc tccatcctct tgctttttaa aaacttataa ttcgagacag 6180
ggtctcactg ctacccaggc tggttttgag cttactctgc agcctcctgc atcagcccac 6240
cgccttgtac gtgagatggt gggcctgaga ctcagcctct tgaccttcac atacatctga 6300
tacgtgctat ctgaacaggc ctgtcttact cagttttctg ggtcctgttg gggggtgagg 6360
tggggagggg agatcttcgt tcaggcatgg agaggtggga aggaaaccag tccacacctc 6420
taacaagtga gttccaacta ggacttgctt agggcacata aggcagacag acgtgggaga 6480
tgtgagcggc ggggaagcga tgatgcttag atgctaccac gaggacctga tgtggtgtgc 6540
ctgaagatga acctgttccc catgagccag ctcataaatg gggaccagca ccggcccctg 6600
tgggataatt ggcctcgtcc tagataataa ttacttagct ttgtaattag gagagcttgt 6660
aagaagccga aagtgtttcg gatttatttt acctggacaa gttcaagact aaactaacac 6720
ctgttcctgt ggtttggcat gcagagccat ctgtttccaa aggaggtcct gcagcagctt 6780
tttttggggt tctcctccct gttccttccc ttctctcccc acatcgcctt ttctccgtcc 6840
agtggtcagt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gttaatgaga cagggtctca 6900
ttatgtagcc ttgggcctgg aactcactat gtagatgtgg ctggcttcaa actcagagag 6960
gcatatctat ccacttgcct ttgcctctgc ctctcaagcg gccgcgtgct gagactaaag 7020
ggatgtgcta ctactcctgg ccagagtgat aagtactcat cctgtttaaa gttgcctggg 7080
attccctgtt tgacactgaa taaaaatcct gcccatgact tccaaggctc tgggtccctc 7140
cttcccccgc agcccatggc ttgggccttc attttaaccc cactccccac atgtgcttcg 7200
ttcagatgct ttgcttcctg attgtactca gaataccatg gcagctcggg ctgaggctgg 7260
ttttgaactc ttaatactcc tgtccgggag tagtagcatc tcaggtgtgt ccaatcacac 7320
tctatgtatt ccttgtttgt gatgtctgta tcactcaccc gtgcccttca aagctttgct 7380
aagatgttgc ctgggcaatg aggaccttct ctttttgctt tatttttctg tagcccccca 7440
cctccccgtt ttttgggtgg ttttggtagg gatgagacat taagatgttg cctgggcaat 7500
gaggaccttc tctttttgct ttatttttct gtagcccccc acctccccgt tttttgggtg 7560
gttttggtag ggatgagaca acagggcctt atgcaggtta tgcaagtacc ctattgctga 7620
tccacatccc agcctttctg gtattttcca ccattgaacc tgtcatgtgg tttgtgtatt 7680
tcctcagttc atagtcttct tccataaaaa cataaatgtg gccggacgtg gtggcgcatg 7740
cctttaatcc cagcactcgg gaggcagagg caggtggatt tctgagttcg aggccagcct 7800
ggtctacaaa gtgagttcca ggacagccag ggctatagag aaaccctgtc tcaaaaccaa 7860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaccaaa accataaatg tgaggaggtc agggtgttct 7920
gtgtttgttg gttcttgagc tgtacttcag gccgtaacaa gttcttagac ctcatctgtt 7980
gaatgagtga acggaggagt gagaggtcca gaaggtaaat atggcgctgt acagttcttt 8040
ttagaagctg tgctgtgggt tttgtttttt ctaagataaa atggggtcca gtgacatggc 8100
tcagagtaaa tgtaaatgtt gtaccttttg gcatcctggg ttttattttt ccagaaccca 8160
tttatcctgt gacttccaga tgcgcaccat accccctgta aacccccccc cccccaacac 8220
acacacacac caaactagca aacagataca gggctgtcag cgtgtgagca catgaggaag 8280
ggatgctatg ttctcaggcc ctgtgtttct tcttggcacc ccctggtttc tctgagccct 8340
gcacagctac agtgtaacct tacctaattg tcttgttaca aagaagtttg ctgcccagag 8400
tctaaaggtc agatgagtca cttgggcctc acacttctgg gtgtatggaa gcaccagatg 8460
gaagtctcaa ggtacacccg acaccggctg cctttccgtc gtcaggcagc acattcctga 8520
agcaggctct ctcagctgtg ccctctcaac cttcatcctg cagcccatta attgttcaag 8580
gccttctagt tcttggcagg tctgagcatc ttggaaggag ctagaagaga gatgtagaaa 8640
gctcaaagac aaaaatgcaa agctaccccc atcagatacc agctcttggg tctattgacc 8700
agccaatatc cattgatagt ggagttctac atccatatgg aagatacacc attctctttc 8760
atggacagga gtgccaaatc agaatacagg acattacatc tttttgagac aaggtcttac 8820
catgtagcct ttgtagacca gctatgtaga ccatgctgcc ctggaaccca cagagatttg 8880
ctagcttctg cctcccaagt gctaagatta gtgacacaca cctccactta cacagtacac 8940
acccaggaaa aaagtaaaac ataaataaaa agcaaaaaat tgttgtgaaa tagctcagta 9000
ttagagtcct tgtctaagat atatgggctc caggcttgcc catccatcta ttttctgaga 9060
ctggattttt ctgtgtagcc ctggctgtcc tgggtcttac tttgtagacc aggctgacct 9120
tgaactcaga gatccacctg cctctgcctc tggagctctg gggttaaagg tagaccccac 9180
cagccatggg cttaagccca gtatgggttt aaaaacatgg aaccgattgg actttgcata 9240
aagttagatt ggatcctgtg ggtgctgacc tcccatgctt tcaagcactt attggtagca 9300
ttcactgaac aagcctgagg gcgggaacag ccctggcatc tttcaaaggg tatccggttc 9360
aaaccagaat cgaatgctct tttcctagcc accccacctc ttggcttgtt gcctaaggaa 9420
aatggctcta gcctggttct ccagtgttct catggcagtc tggagagatt gtccatttgt 9480
atcacaacct tttgggcgct gcccttggtg acccgctgct gatgtggaca ccagcaagac 9540
ttgagactgc agacctcctc ccccacagat ttctcacaat gcccgtgtgg gagtgtttga 9600
aaagggaaca agctgaccaa cctgtttgtg ggaaagtcgt ggctttccta tcagaaaacg 9660
tcacactctg agtcaggagt gggacatacc tgggtacttt aacaggtggg gcagggtcct 9720
gagtcataga gaggtctcac ctgggaaggt ttctctttca aagagtgaat caaccatgac 9780
atcacccatc tggatctaca ccctttcaag ccgtctctct ccttagcaaa caggaatcta 9840
aaagaggaat aataaggtga aagcaaactg gaaataggac agaacagaca agggaaaaag 9900
ttaaagagaa agcttaagag acgcagacac agacgtttac atgcaaacag ggggtccata 9960
aaaacaaaac cggaagccgt aatatatgta catggcctgt aagattagaa acaaatgtcc 10020
tggcacaaca ttatgggaca acttcccaag ctgctgttga gtttgttttg tgttggccgg 10080
catgggccct taaactgagt ggtgtgtttc tctcttagag aatttttcat gaactagttt 10140
ttcatttgca agtggttagt agtttgagat agcttctagg ttaggggtgg ggccgtgtgt 10200
ccactttact cagctctaat gtcccccgtt tggtgcagac ccctgcagac cctatgcgtc 10260
ctgccacagt ctctgagttc atgcctgcat tgttcaaatt gtgtttcctt gatgtcctcc 10320
aatctcctct ttgctgggct ccctggggcc cccaaggtga gggatttggc agaggtattc 10380
attccattta gggttgattg ttccaaggtc cctcactgta cgtgttattt gtcccttctc 10440
cctggcttcc tgctcaggag ttctgcagac atggctggtg tttagtagct tcttggtgaa 10500
gttcaggtag ccagtttcat gaccacccag ctctcaggcc tgactaagcc cgtggagaaa 10560
gcccataaaa taaagggggt gaacttctaa tctacatctg aaaggagaac ccctgtctac 10620
atctacctgt taccctagcc atcggggaga ctgaggcaga aggatctagc ctggaaattt 10680
agggtgagtc tgggcagcat taggagacta tttcacagtg aagaaggaag gaactcactc 10740
acacccttgg tgcacctcac aggtctctgg gctcagattg gagtctttgg ttttgaaatt 10800
tcctcatcat cggccgcctc agctggtttt tcttctggag tctgttacgc cttctcccct 10860
ttcccccctt ctcttgctaa tcctttcgct tgaacaatag gagtccttaa aacctgggag 10920
ggaagtaaat acctttcaga tgagaccctg tcttaagagg gggaaaaaaa aaacaaaaaa 10980
accctaggga ccgggtcacc aagtgtcagg ttaatcagca gatgtcaaga tgactcctga 11040
gtgcttgctc tttcttcagc tggtgaaatt acagcggcaa catagaatga cagtcagcag 11100
ggagggagga gagggcctgg gtggccaaat aaacttataa attgtgagag aaattaatga 11160
atgtctaagt taatgcagaa acggagagac atactatatt catgaactaa aagacttaat 11220
attgtgaagg tatactttct ttccacataa atttgtagtc aatatgttca ccccaaaaaa 11280
gctgtttgtt aacttgccaa cctcattcta aaatgtatat agaagcccaa aagacaataa 11340
caaaaatatt cttgtagaac aaaatgggaa agaatgttcc actaaatatc aagatttaga 11400
gcaaagcatg agatgtgtgg ggatagacag tgaggctgat aaaatagagt agagctcaga 11460
aacagaccca ttgatatatg taagtgacct atgaaaaaaa tatggcattt tacaatggga 11520
aaatgatgat ctttttcttt tttagaaaaa cagggaaata tatttatatg taaaaaataa 11580
aagggaaccc atatgtcata ccatacacac aaaaaaattc cagtgaatta taagtctaaa 11640
tggagaaggc aaaactttaa atcttttaga aaataatata gaagcatgcc atcatgactt 11700
cagtgtagag aaaaatttct tatgactcaa agtcctaacc acaaagaaaa gattgttaat 11760
tagattgcat gaatattaag acttattttt aaaattaaaa aaccattaag aaaagtcagg 11820
ccatagaatg acagaaaata tttgcaacac cccagtaaag agaattgtaa tatgcagatt 11880
ataaaaagaa gtcttacaaa tcagtaaaaa ataaaactag acaaaaattt gaacagatga 11940
aagagaaact ctaaataatc attacacatg agaaactcaa tctcagaaat cagagaacta 12000
tcattgcata tacactaaat tagagaaata ttaaaaggct aagtaacatc tgtggcaata 12060
ttgatggtat ataaccttga tatgatgtga tgagaacagt actttacccc atgggcttcc 12120
tccccaaacc cttaccccag tataaatcat gacaaatata ctttaaaaac cattacccta 12180
tatctaacca gtactcctca aaactgtcaa ggtcatcaaa aataagaaaa gtctgaggaa 12240
ctgtcaaaac taagaggaac ccaaggagac atgagaatta tatgtaatgt ggcattctga 12300
atgagatccc agaacagaaa aagaacagta gctaaaaaac taatgaaata taaataaagt 12360
ttgaacttta gtttttttta aaaaagagta gcattaacac ggcaaagcca ttttcatatt 12420
tttcttgaac attaagtaca agtctataat taaaaatttt ttaaatgtag tctggaacat 12480
tgccagaaac agaagtacaa cagctatctg tgctgtcgcc taactatcca tagctgattg 12540
gtctaaaatg agatacatca acgctcctcc atgttttttg ttttcttttt aaatgaaaaa 12600
ctttattttt taagaggagt ttcaggttca tagcaaaatt gagaggaagg tacattcaag 12660
ctgaggaagt tttcctctat tcctagttta ctgagagatt gcatcatgaa tgggtgttaa 12720
attttgtcaa atgctttttc tgtgtctatc aatatgacca tgtgattttc ttctttaacc 12780
tgttgatggg acaaattacg ttaattgatt ttcaaacgtt gaaccaccct tacatatctg 12840
gaataaattc tacttggttg tggtgtatat tttttgatac attcttggat tctttttgct 12900
aatattttgt tgaaaatgtt tgtatctttg ttcatgagag atattggtct gttgttttct 12960
tttcttgtaa tgtcattttc tagttccggt attaaggtaa tgctggccta gttgaatgat 13020
ttaggaagta ttccctctgc ttctgtcttc tgaaagagat tgtagaaagt tgatacaatt 13080
tttttttctt taaatatgtc gacgcactgg ctttacaggg gccgtctgct ttgtctgtag 13140
atatggtgat aggagtctga tttagaaact tccttgttct cctcttcccg aatccttcct 13200
cctgaacaat aggaatacct aagtgcacaa gtgcaggtgc ccaggaggcc ctgagacaac 13260
cccccctccc cagctgcgag ccttctccgg tggtgctggg aatcgaactg gagtcctctg 13320
caagaacagt atgtgctctt aaccactgca ccatctcttc agccccctct agttctttag 13380
tttgtacata aattagcaag ttcagggaat gcagaagaac tggccagggg tcagagccag 13440
actggaaaca tttttcacca aacaatagct acagtgttca tggcgtgcct ccattgaata 13500
ctaaactagc tgttgatgtg tgactttgat ttttaatctt tgcaccaact ttagttacta 13560
tatagataat tccatttcca aatgatatat agtggaagct tgtaaaagct gcttactatc 13620
ccagggtccc cagccgagat ctacatgata aagctactct caacccagcc tacattcccc 13680
ctccctgtgc tcagccctac ctggggttgt tcactttcaa gctcccagga aggaacctga 13740
gcgctccctg cccccatgca gtccatttct atctctggtc ctttgggtac ttggagcctc 13800
aagctcctga ctgctaatga agcctgtaac agaagggcat tacttactgc ccgccttgtg 13860
ctcccttgaa atctggtcac ctggaggtgg aagtgggcag tgcttccgtg cttccgtgct 13920
tccgctttct cccagctcct tttaatcact attttttttt tttcttttcc aaattactac 13980
ctaggagttt tctagtaatc actttggtgg gagtgggagg gggagtggag gcagttaact 14040
ctgtgagtgc caaggacagt tgttggacgg tggtagtgat ggaggggagg gtgttcacgg 14100
tgagggaact ctgtggagtt acgtagctgg caacaatggg gagagacgga gccgcaccac 14160
cacagacgct ttgcatgagc aactattttg ttttctgtag atgttttcca aaccttaaac 14220
tctgttaagt ctgaaactgg gaggggaacc tctccaccaa aatctaaata tggatcagag 14280
ataaggaaac ttccatagtc tccagctccc tccctgactc agtggcctct gtgaccaact 14340
ccacgtgact ctagtggaca ccttcctggt ggtttggctt tttttttttt tccccatttc 14400
atcttttaaa tggagttttc catgaataag aatataaaac tgcgggggct ggtgagatgg 14460
atcagcaggt aagagcacag aggtcctgag ttcaaatccc agcaaccact tggtggctca 14520
ccatcggtaa cgagatctga ctccctcttc tagagtgtct gaagatagct acagtgtact 14580
tacatataat aaataaacaa atcttaaaaa aaagaatata aaactgcttc cttcccaaca 14640
ggccttggat agttttgtct gtgggaacag cttcccatag gaaaggtgct tttgctactt 14700
ccgaccgtca cacactcctc ctctgcaccc cgtgagggcc tcccaggagt tttgtgttgg 14760
tcacaagcct ccccatgtcc caagggggtc tggagaggga tctgaggtgg tggaaagtgc 14820
tggggtgcca agttatcaga caatgggcac attgagaatg caggtggggc caggcctgtg 14880
tgggctggag cagctgtcgg agcctcaggg ggtgcagctc atgcgcagag ggaagaggca 14940
gtctctctgc tggctgagag gggagggcca cagtaagcaa aggagggggg tgatcccccc 15000
ctcacaagat tccagagcaa agggatgttt gaacgatgac tcacatgaca ggggcggggt 15060
ctgtgagcaa acttcctgtt ggaagcttgt tcttggttcc tgactgtcct tcccaggtca 15120
tagagactgt ctgcaatagg gctggggcct gttaggatgc catcgaggtg ggaaatcctg 15180
gagagcttgg agtagccagc aggccctctt ccctctcctg ccccaggcta gctggaaacc 15240
cgcgaggagg aagggtgtgt tgttccctat cccatggaga ggcttgcatg gtcagaccag 15300
gcctggtgtg acctctgggg ctgctctgtg actgccctgt tctgtgactg cccttctccc 15360
tcccagccct ccccttccat ttgcttctag attcgtctag gagcccatct cagcaaatgg 15420
cagcatcctc gcttaccaga catcttgttt gtttgtttgt ttgttcattc attctgggcc 15480
tgaagatgga gagctgtggt aggggagagc tcagaggctg ggggcagcct taagggcaca 15540
gccaggacgg agcctctgag caaagggcag tgtgtgtaga gtcaggtagg tggtgggcag 15600
caggagacag gaggagcaca gaggtaggtg gcactgtaca gaggccctgg caccattttg 15660
tgacaaggac tctcagaccc ctctagccta ttcccccacc cccaccccca ttacaagcag 15720
tagggtctta atagctaatg gcttggacac cagcctctgg ctgctctggt tcccagctgg 15780
tcagagccct tgttctcctt tgggttctga tccaggtggc acagggtggg ggccctgatt 15840
cacattcttg atagtgccgc taggttccct gctaccagct ggcacattct gtcttccttt 15900
ccagcaggta cttggctggg cttcctgccc agctgctaga cctactgtta ggtcagctca 15960
ttggatgctt cctccaggaa gccttctcta atctccattc ccttggcttc ttttcaagag 16020
cagaagttca ctggcttctc ctgtttcccc agagtagcac ctggtgtctc aagtactcgc 16080
taagcagtta ggagaggtgt gaactgggcc tcagggaccc cagagacagg aggggaggtc 16140
attacaggaa agtcggattc ttttcctggc tttgttctta taaccatcgt gtgtgtgtgt 16200
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt acgtgtgtgt acgtgtgtgt 16260
gtgtgtacat gcgtgcgcgc acacgtgcac gcggctgatg ccctctttct ggccaccctt 16320
tatttatttg taatatttat ttatttattt atttatttat ttttggtttt tttgagacag 16380
ggtttctcgt atagccctgg ctatcctgaa acccacttta tagaccaggc tggccttgaa 16440
ctcagaaatc tgcctgcctc tgcctcccga gtgctgggat taaaggtgtg cgccaccact 16500
gcccggcttc tgttcactct taagcgtacc caacagccca tcctgcacca gcccagagag 16560
tctgcagagt cccctgtgaa aatgtgggca acctgttcct cctggcatca ggtggggagg 16620
agaggcagat tatgcagaat caatcaatag caatcaatag gtccaatgcg gaggagacaa 16680
aggattgaga tgagacaggg ggcgtcccac gtccaattcc tttattgctg cagtcctttc 16740
tgcccctctt tacaaacagg agactgaggt ttagaaaggc aggctagggt agtgggtgga 16800
agggtgaggt gaacctacag gggagactaa ggagccagat gaatggggaa agggaggcag 16860
cctcttaatc cttttgtctg tagctccatc tttggaaatg ctgagtaatt aatcaattgt 16920
taaagggctt tctgccgaat tctggggaaa gcctttactt ttaatgagct gctagtctgt 16980
ctcttcagtg ctgggaatga gtctagagcc acctgtctcc taggcaaaca ctttactgct 17040
aaactactaa gctctgctcc cccacactcc gggttagcct ttacatctgt atctgtctgc 17100
ctctgttggg atttcaggtg tgtgccaccc cctgtgctcc tcagtgtatt tctacagggt 17160
ggtggtacct aaggaaaaat ccattcctag ggactctgac gtaaatattt gggatgaggt 17220
ctgtcaagga ctgggcattt taacttcact tatttttata gccctgaggg tggacatggg 17280
acctcttgta ggctaggtag gtttccttcc cgatcgccca agggcgaatt ccagcacact 17340
ggcggccgtt actagcggta gactaggata gcctcaaact cctaacggtc tgcctgcctc 17400
tacctcttgg cctagggctg tggactgtct ttttggtcct actataagga tcatctggac 17460
cagaacgcac gttctcaagc ctacgctggg gagtgcctca cctagaaagc ttaaaagcgt 17520
agactctcgc tggatgtggt ggctcaggcc tttgatccca gtactcagga ggcagaagca 17580
ggtagatctc tgtgagttcc aggacatcca gggctacata gagagacatt gtttgccccc 17640
aaagcacaga ccctgacagg cctgtccatc ttaaggaacg gaggccagag acctgttggt 17700
agttgatggt ttgatggttt atttagaaac tctccctgat ggttcttgac ttggggagtg 17760
aggagaagcc acttcaagtt gtagacaagg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgcaag 17820
tgtgccaatg tgtaagtgtg tctgtatgcc ttgcacacac acagttgttt caagtgtgct 17880
atgtagccaa ggataacact gaactctgaa ttccccttta tctgtttatg ggcacacatt 17940
tcccccctga gggatataaa ttctccttga agtgttgatt cacccctgaa gtagaatcag 18000
gtctaaagtg gggatgaatc tcagggtcct tccaggtaga aatgtagggc aacaatgaca 18060
gtacactgta ccctcctcct ccctgtcctt ctccccgctt cttttttctt tttgagctct 18120
gagtgactgg aagtcatgta gattggctgg tcccgatctt gtgcctttgc ttcccgggtg 18180
ctgagagtcg tgtgttctga agaacagatt taagcaggca agcaggctat gtaagatgtg 18240
tgacagaatt ccagagttga agaggctgga tggccaaggg acctggctct gtccatccag 18300
ccttcagtct gccttttctt ctcgctggga gagtggcttg gttaatccac accagtgggt 18360
gactttacaa attaactccc gtgaccttgg actgttccat ccataaacac ggctccctag 18420
tttatgagtt gcccagccca gtgttaaaaa tctacggtga actaagccct gggagaagcc 18480
agtgtgaaac tcaaactgag cagagaccag atcaaacatg gagataagac agctacagtt 18540
tcacttttgg gcagggccaa gaatttcagg actttcttta ctacagatgg ggcgttattt 18600
tgctttccta tgggtgtgtg tgtgtgtgtg ctgatttagt ttatgattca ttgattttgg 18660
ggtttgatag caggtctagg gaacacataa tgcgttacag atatttgatt ttaaatgtat 18720
tcctggtact ttttgggggg gggttgttta ttgttttgag gtttctcttt tcccccggct 18780
gtcctagaac tcatgctata gactagactg tcctcaaact caagatttgc ctgcttctgt 18840
ttcctgagta ttggaattaa aggcacgcac caccactgcc aagttgtttg cctggtattt 18900
tagaaagggc aattagtcat gagcctgagg gtttttcaca tttatttgtt ttgcttgtaa 18960
caagttaacc agtgacaggt ttactttagt tctctctgtc tctgtctttg tgtctctgtc 19020
tcttatcttt ccttgacagg ggggtctcat gtagcttcgg ttgaccccaa actcactatt 19080
ttagccacca gggcctttag cacctagtct tctgactgta agtcctctga gtgctggggt 19140
cacaggtcta accttctcat tgaggaaact ttggcctcta tctctggtca tcaatactga 19200
tctggagatc tctgagatac tattactgtg gaaggccatt tgattctctt atgatggagc 19260
ctgatgagcc agaccagaga atggctccta ttaggctcat aaactggaat gcttactcac 19320
tggggagtgg catcatttga aaggattaga aggattaggg gtgtggcctt gttgggggaa 19380
gtatgtcact ggaggtgggc tttgaggttt caaaagccca tgtcaagacc agtgtgtgtg 19440
tgtgtgtgtg tgtatgtgtc tgtctgtctg tctgtctgcc tctttggatc aggttgtagc 19500
tctcagctac tgctccagca ccattcaagc caccatgatg attaatgggc caaacttttg 19560
aaactgttag acaagtcccc agttaaacgc ttttttggat atgagttcct taagtcacat 19620
gcctcttcag caatagaaca gtgatattgg acaaccagga gcgtgctgga aaagtgagaa 19680
atttagaatt tttcccagca gtgggaattt cctgtgtcct gatgccgatg ccctcttttc 19740
aagactaaac tgagaacttt gctcctttgc tgcttccctc cttccatcct tacctgctcc 19800
agtgaagaat ttgttgacat ccgtatctca ggcacaaggg ggaaaacaaa gggaaaataa 19860
agataagagg aggagggctg agtggcaaag tgagtgccat acagcttaga actctgcaga 19920
aagcagacca caaatttgcc tctgttcctg ccaggcaaaa taaagaggga aatctgatca 19980
gccctcctgc tggacttcag tgtgctggcc attagtgggg tgcctggctc ctccagagag 20040
ttcttgcttc attgtagctc ccaccactct aatgtgctag acttcccatt tgcaattgtc 20100
tttactagat aaccaactaa tgcttgggtg gacaacattg cacaatagag ggcagagatt 20160
tcagtcatgt gtgtcaccac ctacacagct ccatgaggag catttttgca tctttgcact 20220
cccccactcc ccgggtaaga tctgtcttgt ataatgcata gcataactat gtaatggtgg 20280
ggattttact aatgctattc actacccagc actctgccgc ctcagggtca cgtgtttact 20340
attccctctg ctgggcacct ttgccttggc atatagctta taactccagg ctctgttaaa 20400
gcttccccca tagtggagtc taccacataa taaaatgtac agttcctttt tcatagcctt 20460
tattataatc cagcttaata ctgtatgcta tttgattgct tctccaacat cccccccctc 20520
caaatgtagg ctccttgaag gtgcaacctg ctttatttca ttggttgctg atagaaaatt 20580
ttcaagtgat cctccccacc ccgcccccct cacactcgct gcatgagatc aggtgctggg 20640
aattgaaccc agcaccttac ctgctacaca tgctaggcaa gtgctctacc atcgaggctc 20700
caggaatatg gatctctctc cttttctctc cccactcctc cagttacagt tcttttgcct 20760
tgacttcact tgaactagct ctgtagacca ggttggcctc aaagactcag gcgtccactt 20820
gcctcccaaa gtgctgggat taaaggtgtg ccatttcagg catcagccag agatttaaaa 20880
agaaaaaaaa aaatccagat ataaaaagaa tactgtttat ctccactttt agaaaattgg 20940
ggagggatat agtgcagaga tagagtacct agcatgtggg tggtcctgga ttgaagagag 21000
tagtctgcaa gagaaaaagc aaaagagatt ctctaataga ggaaggactc catgagaaga 21060
gtagaaagaa ggttctagaa caaccaaggc agggagtctc cagacagaat gagcacagtg 21120
tgccgagaag gaaaaggcca aggcccgtga ctgagatcct tgagggtctg taggtgctgc 21180
acagttatgg aaatgatatc cagggtccag cctctcagtt ctgaagactg ggtaactgcc 21240
tctgtatcca tcagcttctg ccaagatgga gtgatgagtc tgtgttcaaa ccgattcttc 21300
cttctggcca agcatacggt gggtgtggtg cactggtgtg tgcacgtgag tagtaagtga 21360
gtgcgttcct tgttccttca gcccaggagc ttctgggtcc tttggaaaca attgcaggag 21420
accagaataa cacagctcat tcatcactgg gtatggctca gcccagcatc ttgtgtcaga 21480
aacgatccga ggggcatgtt tgatggggat tagcgctgct ctcaatatcc tgccttttgg 21540
tcccagctga ctctgacatt ccttgctggt gagttcctgc tcatttcagt tctagccctg 21600
gagcagcagt cagtattaaa gcaaacactt attctgtgtg tcacagtgcc aaggggaact 21660
atcactattc tgatagtatg ttaacacgcg ttgggtgcaa tcttaccaga gccttacccc 21720
atagcttcta ggtatgcact atatagttca ttgtcttgaa acctgatgta gcttcctcaa 21780
aagtcactat ggaaatggac tgacacaagc caccggccag tgggagaatg gggtttgaag 21840
cttagcgact gtaagttcat catgtaatgt aggaggggga agtgtggtgt tagtaatacc 21900
tatagtctta gttcttgtgg agttgaggca ggaaaatccc ttgagcctaa gtgaagatga 21960
ggtaacatag caggaccctg tgtctgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 22020
tgtgtgtgtg tgtgactgac tgagatagtc tcaatatatg tagccttgtc tgccctggaa 22080
ctcttctcat ggccttgaac tcctagagat ctttttgcct ctgtttctgc ttctgccttc 22140
catgtgctgg gactaaaggc atatgccacc atgccaggtc ccaggtccct gtctctttta 22200
aaaaataaag cagaaagaaa caccatactt ggggctggag agatggctca gcggttaaga 22260
gcactgactg ttcttatgaa ggtcctgagt tcaaatccca acaaccacat gatggcttac 22320
aaccatctgt aacgaaatct gatgctctct tctggagtgt ctgaagacac actacagtgt 22380
acttacatat aataaataaa taaataaata aataaataaa taaatattaa aaaaaaagaa 22440
acaccacact taaactgatg ccttacaaga acttcgtacg tgttttgtac ctgttactgt 22500
gcagctgtgg tcgggacaag ggttatcaga gagagatcta tctggtagag tttgagctct 22560
agatgtcagt ggatgtggca tgtcacgggc ttcggctttg tgccttccta ctttgcagct 22620
gggtgtaatt ttctgcattc acctggtgtt tcttgcagca gaaatcatca cacccataag 22680
agaagtagcc tctgagttaa tcttaagtga ggtagacctc tgggctatgc ttaagttgtc 22740
cgctaattca tcacttgtgc tggaaggaat gtgcactctc caaacagatg ctgtagagga 22800
ctgttatctc caccttgcag tgaagtgaac tgaggttctg agatttaagg acaaaggttc 22860
ctgtcggggg aaggacaggg agaggtgtgt gtggggggtg ggactgggag agaaagggac 22920
aggcaggttt gagacagggc ttctcagtgt agcctaggct tacctggaat tcacagagat 22980
ccacctgtct ctgagtcatg ggtgctggac atttgtttat tttaaagatt tatttattta 23040
ttttatatga gtacagtgta gctgtcttca gacacactag aagagggcat cagataccat 23100
tacagttggt tgtgagtcac catgtggttg ctgggaattg aactcgggac ctccggtaga 23160
gcagtcagtg ctcttaactg ctgagccacc tctccagccc aggatatttg ttttaagagt 23220
gatagaacta ggaagctgga ggaatagggc agtcgataaa gtgcttacct taagttcaaa 23280
gacatgcttt tctgctgctg cttgtcctcc tcctcccctt ccctctttct cttcttcctc 23340
ctcctcctct tttctttcaa gatagggtct ctctctacat agctcttgct gtcctagaac 23400
cctatctgta aaccaggcta gcctcaaact cttacctgct cccgactcct gaggagacag 23460
gttctcaaac agaccctttt gagacgggct ggacttgaac tcttgacctt cctgccttac 23520
ttattctgct agtgctggca ccacaggcag ctgcctggtt ttgtgttaga cctttttagt 23580
ggtggtcaga ggtgccttgg gcagcagctg cagagccacg tgggcatagg gaaaatgccc 23640
aggggcaggg cagaggccat cagggcagcg gagtgagcag ctctcatggc acgtcagcct 23700
ccatcgtgtc ctcggtgtgc acatggttgg atgctcgctt tgagttcttc tgtaggatct 23760
tcccttatcc ccaaatgttt tagttataaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aacaacttcc 23820
cagaggtgca aggagccacc tccttctgca gttcattctg tgaatggagc ttgttgcttt 23880
gtgtcaggca tttgcaagtg cgggtcactc agaggttgag aagtcctcac cctggtgctt 23940
cctggaggct ggggggagga gggcagcggg atggggggaa aggttggcct cccaagtgct 24000
gcaatgaaag tcaggcacca ctacacctgg ctaattttat ttttaaaaac ttctgtatat 24060
gtgtggccat gcacacattt agaggccaga aggtgtcgga tccccagagg tggagttaca 24120
gatggtcatg agccacctaa catgggtgct gggaaccgaa tgtgggtcct ctgcaagaac 24180
agtgcacacc tttgactgct gagccatctt tccagcccca gcttgttcaa ttccaaacaa 24240
taagtcagta tttaggaaaa caaagcattc catgagtcag gataagatgc ctgatgcccc 24300
ttctgaacca tgctgcccgt tctcatgggt aggagattta cagtatcatt tgctgtctag 24360
tccatattca aacaccccca actatcccaa gaatgtttta tttagtgtag gaacttaaac 24420
gcaaggcatc tcagacatga cctccaattc tgtacagtca agaatgtaaa gaaggggagg 24480
tagtcctgcc tttgatcagc ctgcctatcc ctctttcttc tccctcttgg gggttgagcc 24540
aggaagcatc ttattggatt ataggagtca agattctggt tttgtgtttt taagcacatg 24600
gatttcatat aagctacatc tatgcgcaca aatagccaca cacagagctc aagtttgtaa 24660
tttaaaaaga catataatgt ctccccctgt aataaaggca agctggcgtt tctggatctg 24720
aagtgtctgg tagtgtctgc atgttacttc cacaaggaac aaagggcttt gatgcagatg 24780
ctgctgcagt tagtcatgaa ggtcaagccc ccaggtctgt ctgtccttta cagacttctt 24840
tcctcaaagc gggcaatcta ggagagaaag ctgattctgt ttgtccctgg aggcaggcct 24900
ggagctcaac tgtatagacc aggctggcct cagacgtgtg gcagttctgc ctgggcctca 24960
cgtgtggtgg attgttttcc atccaggttt ggagtcacag gcttgtaatc ataaaagttg 25020
gaagtgcagt tagtacactg cagaatggtt tagcagcaca gcatacttac tgctcagcag 25080
aggcaagagg aacgttggaa gtttgaagct agcctagtcc acacagtgag ttctggttta 25140
tccagagctc aagctgtgct tgtctgctgt gtatgaaacc ctggacttgt tctgcagtgc 25200
tgcataaact ggtcatggtg gtccattcca gcacaaggac atttttgcta agtcgtaagc 25260
ctaggctaca tgaggcactg tctcaaaaaa aaattttttt tttaaggtag agaataatag 25320
agaagggaat ccagcatcta cttctgccca aacatatata tcttcttcac tcccaggaac 25380
acacacgcca cacctgaaaa cagctattag cagtactagg cagggaacta tatgcatacc 25440
tcttagatgg ctgagtttaa ggccaacctg ggccacgcag gcaattcaaa gccagccaag 25500
gctatgcata tatagtgagg ctatctggga aagatggaaa acaaatgaaa catcagactg 25560
aggcagagcg ggacacttga cctctcacgt cacaagcttc tggacttaca gtgggtaaca 25620
tcctgctaag ttggaagtgc agttggaaca ctgcaaaatg gtttagcaat acagcatagt 25680
gcccagtggc cgagtgctgc aggctgcaga ctgctagcct gggacccaga tgcaatcttt 25740
atagtctcca tcaaacatgt attacttgat tttgaactgc cgtatccatc acactggcgg 25800
ccgctcgagc ccctccggag gagtggccag ggcgttctgg aggtagaaac tggttattgc 25860
tacacaagat ggagactata tccaaaccac tgaattttgt gttattaaca gtagttttga 25920
ttttaaaaat tgattgccaa ggacaaatac taattacttt taaatattac ctaccagttt 25980
ccttttgctt tgcttttatg ttttaaaaat tatttatttt atgtatatga gtacaatata 26040
gatgtcttca gaagagggca tcagagatct cattacagat ggctgtgagc caccacgtgg 26100
ttgctgggaa ttgaactcag gacctctgga agagcagcca gtgcttttag ctgctgagcc 26160
atctctccag tcccttgttt ttgttattat tatattttat ctacttttgg gtttgtgtct 26220
gtgcacacat accacgttgt gcacatggag gtttgaaaac atgagcgtct tctcctgccg 26280
tcattttact tggctgcatg cctttgcccg ctgagccatc ttgccagcct ttttattttt 26340
gtttcctttt gtccttgttg agataggttc tcactatgga gcccagacta gctttgaact 26400
ccctactcca acctgtccta tctctcaggc aatgacctaa accaaccagt gagtcttcct 26460
gggcccacct aggtttttgg cgcgccctac gtcacccgcc ccgttcccac gccccgcgcc 26520
acgtcacaaa ctccaccccc tcattatcat attggcttca atccaaaata aggtatatta 26580
ttgatgatgt tacatcg 26597
<210> 75
<211> 4056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pBest4
<400> 75
ggccgctgcg gccgtttaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc 60
tggccttttg ctcttaatta aatcgcatca tcaataatat accttatttt ggattgaagc 120
caatatgata atgagggggt ggagtttgtg acgtggcgcg gggcgtggga acggggcggg 180
tgacgtagta gtgtggcgga agtgtgatgt tgcaagtgtg gcggaacaca tgtaagcgac 240
ggatgtggca aaagtgacgt ttttggtgtg cgccggtgta cacaggaagt gacaattttc 300
gcgcggtttt aggcggatgt tgtagtaaat ttgggcgtaa ccgagtaaga tttggccatt 360
ttcgcgggaa aactgaataa gaggaagtga aatctgaata attttgtgtt actcatagcg 420
cgtaatattt gtctagggcc gcggggactt tgaccgttta cgtggagact cgcccaggtg 480
tttttctcag gtgttttccg cgttccgggt caaagttggc gttttattat tatagtcagc 540
tgacgtgtag tgtcgagtgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta 600
cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg 660
gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 720
ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 780
ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca 840
atgacggtaa atggcccgcc tggcattgtg cccagtacat gaccttatgg gactttccta 900
cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt 960
tctgcttcac tctccccatc tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt 1020
tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg 1080
cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga 1140
gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa 1200
agcgaagcgc gcggcgggcg atagggagac ccaagctggt gagtttgggg acccttgatt 1260
gttctttctt tttcgctatt gtaaaattca tgttatatgg agggggcaaa gttttcaggg 1320
tgttgtttag aacgggaaga tgtcccttgt atcaccatgg accctcatga taattttgtt 1380
tctttcactt tctactctgt tgacaaccat tgtctcctct tattttcttt tcattttctg 1440
taactttttc gttaaacttt agcttgcatt tgtaacgaat ttttaaattc acttttgttt 1500
atttgtcaga ttgtaagtac tttctctaat cacttttttt tcaaggcaat cagggtatat 1560
tatattgtac ttcagcacag ttttagagaa caattgttat aattaaatga taaggtagaa 1620
tatttctgca tataaattct ggctggcgtg gaaatattct tattggtaga aacaactaca 1680
tcctggtcat catcctgcct ttctctttat ggttacaatg atatacactg tttgagatga 1740
ggataaaata ctctgagtcc aaaccgggcc cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct 1800
ttttcctaca ggggacccaa gcttggtacc gagctcggat ccactagtaa cggccgccag 1860
tgtgctggaa ttctgcagat atccatcaca ctggcggccg ctcgagcatg catctagagg 1920
gccctattca attctttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc 1980
tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata 2040
atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 2100
attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcatcgatc 2160
cataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatccaga tctcgattta agggtgggaa 2220
agaatatata aggtgggggt cttatgtagt ttaaacgcta gcagtgggct tacatggcga 2280
tagctagact gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc 2340
tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc gccaaggatc 2400
tgatggcgca ggggatcaag ctctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt 2460
gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat 2520
gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag 2580
gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac 2640
gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac 2700
gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc 2760
ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg 2820
ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag 2880
cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat 2940
caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag 3000
gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc 3060
ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg 3120
ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg 3180
ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag 3240
ttcttctgac ctcaggttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat 3300
ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 3360
agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 3420
ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 3480
tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 3540
cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 3600
ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 3660
gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 3720
ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 3780
aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 3840
cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 3900
ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 3960
gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 4020
ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctc 4056
<210> 76
<211> 5624
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAd5pTP
<400> 76
ggatcccctg agggggcccc catgggctag aggatccggc ctcggcctct gcataaataa 60
aaaaaattag tcagccatga gcttggccca ttgcatacgt tgtatccata tcataatatg 120
tacatttata ttggctcatg tccaacatta ccgccatgtt gacattgatt attgactagt 180
tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt 240
acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg 300
tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg 360
gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt 420
acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg 480
accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg 540
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 600
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 660
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 720
tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat 780
ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagctt 840
accatggcct tgagcgtcaa cgattgcgcg cgcctgaccg gccagagcgt cccgaccatg 900
gagcactttt tgccgctgcg caacatctgg aaccgcgtcc gcgactttcc gcgcgcctcc 960
accaccgccg ccggcatcac ctggatgtcc aggtacatct acggatatca tcgccttatg 1020
ttggaagatc tcgcccccgg agccccggcc accctacgct ggcccctcta ccgccagccg 1080
ccgccgcact ttttggtggg ataccagtac ctggtgcgga cttgcaacga ctacgtattt 1140
gactcgaggg cttactcgcg tctcaggtac accgagctct cgcagccggg tcaccagacc 1200
gttaactggt ccgttatggc caactgcact tacaccatca acacgggcgc ataccaccgc 1260
tttgtggaca tggatgactt ccagtctacc ctcacgcagg tgcagcaggc catattagcc 1320
gagcgcgttg tcgccgacct agccctgctt cagccgatga ggggcttcgg ggtcacacgc 1380
atgggaggaa gagggcgcca cctacggcca aactccgccg ccgccgcagc gatagatgca 1440
agagatgcag gacaagagga aggagaagaa gaagtgccgg tagaaaggct catgcaagac 1500
tactacaaag acctgcgccg atgtcaaaac gaagcctggg gcatggccga ccgcctgcgc 1560
attcagcagg ccggacccaa ggacatggtg cttctgtcga ccatccgccg tctcaagacc 1620
gcctacttta attacatcat cagcagcacc tccgccagaa acaaccccga ccgccgcccg 1680
ctgccgcccg ccacggtgct cagcctacct tgcgactgtg actggttaga cgcctttctc 1740
gagaggtttt ccgatccggt cgatgcggac tcgctcaggt ccctcggcgg cggagtacct 1800
acacaacaat tgttgagatg catcgttagc gccgtatccc tgccgcatgg cagccccccg 1860
ccaacccata accgggacat gacgggcggc gtcttccaac tgcgcccccg cgagaacggc 1920
cgcgccgtca ccgagaccat gcgccgtcgc cgcggggaga tgatcgagcg ctttgtcgac 1980
cgcctcccgg tgcgccgtcg tcgccgccgt gtcccccctc ccccaccgcc gccagaagaa 2040
gaagaagggg aggcccttat ggaagaggag attgaagaag aagaagaggc ccctgtagcc 2100
tttgagcgcg aggtgcgcga cactgtcgcc gagctcatcc gtcttctgga ggaggagtta 2160
accgtgtcgg cgcgcaactc ccagtttttc aacttcgccg tggacttcta cgaggccatg 2220
gagcgccttg aggccttggg ggatatcaac gaatccacgt tgcgacgctg ggttatgtac 2280
ttcttcgtgg cagaacacac cgccaccacc ctcaactacc tctttcagcg cctgcgaaac 2340
tacgccgtct tcgcccggca cgtggagctc aatctcgcgc aggtggtcat gcgcgcccgc 2400
gatgccgaag ggggcgtggt ctacagccgc gtctggaacg agggaggcct caacgccttc 2460
tcgcagctca tggcccgcat ttccaacgac ctcgccgcca ccgtggagcg agccggacgc 2520
ggagatctcc aggaggaaga gatcgagcag ttcatggccg agatcgccta tcaagacaac 2580
tcaggagacg tgcaggagat tttgcgccag gccgccgtca acgacaccga aattgattct 2640
gtcgaactct ctttcaggtt caagctcacc gggcccgtcg tcttcacgca gaggcgccag 2700
attcaggaga tcaaccgccg cgtcgtcgcg ttcgccagca acctacgcgc gcagcaccag 2760
ctcctgcccg cgcgcggcgc cgacgtgccc ctgccccctc tcccggcggg tccggagccc 2820
cccctacctc cgggggctcg cccgcgtcac cgcttttagg aattcacccc accagtgcag 2880
gctgcctatc agaaagtggt ggctggtgtg gctaatgccc tggcccacaa gtatcactaa 2940
gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 3000
taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 3060
tattttcatt gcaatgatgt atttaaatta tttctgaata ttttactaaa aagggaatgt 3120
gggaggtcag tgcatttaaa acataaagaa atgaagagct agttcaaacc ttgggaaaat 3180
acactatatc ttaaactcca tgaaagaagg tgaggctgca aacagctaat gcacattggc 3240
aacagcccct gatgcctatg ccttattcat ccctcagaaa aggattcaag tagaggcttg 3300
atttggaggt taaagttttg ctatgctgta ttttacatta cttattgttt tagctgtcct 3360
catgaatgtc ttttcactac ccatttgctt atcctgcatc tctcagcctt gactccactc 3420
agttctcttg cttagagata ccacctttcc cctgaagtgt tccttccatg ttttacggcg 3480
agatggtttc tcctcgcctg gccactcagc cttagttgtc tctgttgtct tatagaggtc 3540
tacttgaaga aggaaaaaca gggggcatgg tttgactgtc ctgtgagccc ttcttccctg 3600
cctcccccac tcacagtgac ccggaatccc tcgacatggc agtctagcac tagtgcggcc 3660
gcatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt 3720
tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag aagtagtgag 3780
gaggcttttt tggaggccgg atcctgccca gatctgagca aaaggccagc aaaaggccag 3840
gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 3900
tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 3960
ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 4020
atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 4080
gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 4140
tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 4200
cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 4260
cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 4320
tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 4380
cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 4440
cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 4500
gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 4560
gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 4620
gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 4680
ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 4740
atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 4800
agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 4860
ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 4920
tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 4980
ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 5040
caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 5100
gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 5160
atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 5220
accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 5280
aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 5340
gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 5400
tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 5460
aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 5520
ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 5580
aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacg 5624
<210> 77
<211> 16392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGLAd4
<400> 77
ttaattaagc agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat ggacagcaag 60
cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct gcaaagtaaa 120
ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagct ctgatcaaga 180
gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc 240
cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga 300
tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct 360
gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaagacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac 420
gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct 480
attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt 540
atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt 600
cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt 660
cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag 720
gctcaaggcg agcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt 780
gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg 840
tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg 900
cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg 960
catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgacct caggttactc atatatactt 1020
tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 1080
aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 1140
gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 1200
acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 1260
tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 1320
ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 1380
atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 1440
agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 1500
cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 1560
agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 1620
acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 1680
gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 1740
ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 1800
gctcttaatt aaatcgattt aagggtggga aagaatatat aaggtggggg tcttatgtag 1860
tttgagctcg gctttggtta tttgatggat tgacctagtt ctcaggcagc cacctgtgtg 1920
gactaaatac acccatttct tctccattct gaaggatgtg ctgaaagccg ccttggacag 1980
tgagaaaagc aaacatggaa gcctgctgta ggatcacctt acaccatcag atacccactt 2040
cccacccccg gcttcctgaa ctttctgtaa ttactcatgc cagtgactag ggctcatgtg 2100
ggccatccca ggaaggagac tagtggctgc cattctgtcc tggtctttgt gtctcccgag 2160
gaggagtgta ggtggtgagg tcacaggcta agccaggcca tttaaggaaa gctgcctcag 2220
ctccagccca gccctctctg ccaggtggat atggaaatcc cggtttactc tctggggcct 2280
tttattggct gaaatgctca ccttggtatc tgttacacat tcccttccaa gagcagagct 2340
agataagcca ggtgtggaga caatcagctc ttgaaatctc ccagaagctg ccaaacccct 2400
aaaatcagca agagacaccc ctcatagtcc agactcagct gttttattct gcctctccct 2460
gatctctttt cagggcataa agttttccaa ggagaagaat gaaatcagta tagcaggtca 2520
ttgagaaagt atagaaaggc tcaggttgaa cttcagtgtc tgctaccaat gtgtcataaa 2580
taagtcattt tactactgtg agactcagtt tacccatttg ttgagtatga aaaaaaatca 2640
tatatatttg ttatgctata tgtatcaatg catcgagcta gactctgggg ctaaagcaat 2700
gagtaaaacg tatttggctg aacataaata tgggaggggg gtggaatgca tgaatgtaaa 2760
gaatgctggc ataagtagga ccagtgagtt gggtgtggca gtgcaccttg gagacagagc 2820
caggcggacc tctgagttca aggacagtca tcagggctcc acagagaaat cctgtccaaa 2880
aaaaaaaaaa aaaatcagtg gggaaaggca cctgccatcg aggctgaaga cctgaatttg 2940
gtccacagga tccacgtggt aggaaagaaa gaacttccaa gggttattct ctaacctcca 3000
tacttatatg tgagtgtaca cttaagtaat gtttgtttgt ttgttttgtt cctgttatgt 3060
tttgtttgtt tttaaagcca agtctggtgg ttcaggcatt taatcatagc acccagaagg 3120
cagagttcaa gggcagcctg gtctacatag gaaattgtag gcctatacag tgaaaccctg 3180
tttcaaagga agattaaagg aaaaaagtct tgcactcttc cacaccctga ccaaagtcct 3240
atagtgaaac tctggtcccc tccctcatca ctgctattgc caaactcagt ctccctctat 3300
gacccacatc atgatagcca gggctagacc gtttgtaaag ataaatcagc cttgtctgga 3360
taaataactc caggaaggag aaactgccgg ctgtaaagaa ccttagcagt cgtattcccc 3420
aaaaccacct atataagcct caagtgcccc tccacctttc acagacaccc ctcccctacg 3480
ggagagtatc tgtcctgcac tgtttgaaat aaacagtcct gtctgttgag gtcagtcttc 3540
agtctttttt tctgcttcca gtctcttaag ttgcttcaga aatttaccaa gaatcactaa 3600
ataaagccag ctgtgatggt ccacatctgt attccagtgc ttcgaaggct gaggcagagg 3660
gtctcaagtg tgaggctagc ctgggctgcc tgtggaaccc tgcctttttt tggggagcag 3720
gcttttaaaa aatatttatc acggtgaaat ataaggcagg aggattgtta gaagttcaat 3780
aaggacaatc tgattctgta gtggggttca ggctagctag ggctacatac taaacaaggt 3840
ctcaaccttg ttttagtaag aggaggagga ggaaacagaa ggaaaaaaaa gtaatttctt 3900
aggcacccag taggcctgca agtcttgttt tgaacaaatg aatggatgca tgaatcaatc 3960
tttgctacct ttcaggctct attctgtgtc cccagagcac ccccggccca ggaaagtgag 4020
cagggcacgg taggtctgct ggaatctctg attgtacttg tgagggctct gcctagcagt 4080
ctccctggaa gctgagcctg gccttagcct cttccttctc tctcagagct tctgaagcca 4140
cagaagggac gcatcaaact cggacctaga aatgaacgat tagtcttttt tagtgatttt 4200
ttttcttccg tctttatttt ttgacactca ctgggtagcc ttggctggcc cagagctccc 4260
taggttggtc agagatctgc ctgcctcctg cctgggtgtt gatatacagg gattcaccac 4320
tctatgctct tacgagctgg cttcgaactc atcaggctta gaatgtcggg tcgtctcact 4380
tatacctcct aagtgttgga ataaccagtg tgcaccaccc aagagcccct agctgggact 4440
cttgccaggc ctgtcttctc taagccttag tatccccatc tccaaaatgg gtataaccat 4500
atgcatacgt atcctaaggg catataccaa aagttcagtg aatacagtag agtatgtagg 4560
accccctgcg ggctagcagt agaagccttt ccctttccat tatacccttg gttctaaagt 4620
tggttgaaag ttcccctaag ctctctcccg cccagcaaac cagtcaaacc agtttcctca 4680
ttccccgggc ttctgtacta agcaaacact gctttgcaaa cggttgacca ggagcttgcc 4740
tttgttagag aaggaagtcc aatggtgttt tcttccttgc aatgccggga gtgggtttgc 4800
tgtgccttag aaagggttca aactgggctg gaagtagggc cccagagtag ctgggggttg 4860
gggattcagg atggcctcaa gtttgttgtt ccccaaaccc tcactttttc tagaactatt 4920
tcataataca catgcttaag gatacccatt tgttgaccca ttgcaaaatg ctctctgacc 4980
cagcttctga gactggttca ccccccatgg ataagaattg agtcatctgg tgccattcac 5040
aaatacagat taacctccct cccccaattt actgaacctc aaccaaaaaa agatccgcct 5100
gcctctgcct cccaagtgct aggattttaa agggccacgg taccacacgg atggacacaa 5160
cattcatttt cctgacagac caggagtcag gtcacaggtg tttgactagt aaacacccgg 5220
tgccaaccag ggtgtgggca tttggctatc taccctgagg cccaagatcc aagagcaccc 5280
gtggtccatg gtgctagggg acccggaaat gtagccagtg catcagagat ccagcctctg 5340
tcctcaggga agttcagaaa catctctgct tactgagact tctgcagggt atttgggaag 5400
aggggccagc acagcaggca tgatcagttt tacatgctgg gcctttgtaa gtaagaggat 5460
gtgtccaggc acagtaaagg aaagtctccc ccaggacctt gggccttttt atccactggt 5520
gaggcttttt ttctctttct gttcccccct ccccacctcc cgggctttcc agacagagtt 5580
tccctgtgta ttcattcctg gctgtcctgg aacttgctag gtagaccggg ctggcctcga 5640
actcagtatg aacaaatgtt tacttatggc tggcactgag acttcctctt caccctgact 5700
cctcacccag agcttcccct gaacagaatt ctcttggtta gccttctcaa gatcttctgt 5760
ggaaaaggca gagatagtca tggggtgtgg ctctgtggtc aggctaaacc taatgagtgt 5820
gaggccctga ctttgattcc tagcattgag gaaaagcaga aacaggaatc ttacccaatt 5880
ttcctctgcc tgttaccaga ctcaaggctg tcccgtggag cccattgccc ttcctgagaa 5940
acccacttcc tttcctgagg ctaggaaaga catccctcat ctctgtgcct caatctcatt 6000
gatttttgtg gtgttaaaat tcagttattt gtctttgaga gggctcccct cccccctttg 6060
cctttcacat cctttccctt ctttattgct atgcagagga ccctaactcc taggcaggcc 6120
ctctaccctt gagatacagc tccatcctct tgctttttaa aaacttataa ttcgagacag 6180
ggtctcactg ctacccaggc tggttttgag cttactctgc agcctcctgc atcagcccac 6240
cgccttgtac gtgagatggt gggcctgaga ctcagcctct tgaccttcac atacatctga 6300
tacgtgctat ctgaacaggc ctgtcttact cagttttctg ggtcctgttg gggggtgagg 6360
tggggagggg agatcttcgt tcaggcatgg agaggtggga aggaaaccag tccacacctc 6420
taacaagtga gttccaacta ggacttgctt agggcacata aggcagacag acgtgggaga 6480
tgtgagcggc ggggaagcga tgatgcttag atgctaccac gaggacctga tgtggtgtgc 6540
ctgaagatga acctgttccc catgagccag ctcataaatg gggaccagca ccggcccctg 6600
tgggataatt ggcctcgtcc tagataataa ttacttagct ttgtaattag gagagcttgt 6660
aagaagccga aagtgtttcg gatttatttt acctggacaa gttcaagact aaactaacac 6720
ctgttcctgt ggtttggcat gcagagccat ctgtttccaa aggaggtcct gcagcagctt 6780
tttttggggt tctcctccct gttccttccc ttctctcccc acatcgcctt ttctccgtcc 6840
agtggtcagt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gttaatgaga cagggtctca 6900
ttatgtagcc ttgggcctgg aactcactat gtagatgtgg ctggcttcaa actcagagag 6960
gcatatctat ccacttgcct ttgcctctgc ctctcaagcg gccgcgtgct gagactaaag 7020
ggatgtgcta ctactcctgg ccagagtgat aagtactcat cctgtttaaa gttgcctggg 7080
attccctgtt tgacactgaa taaaaatcct gcccatgact tccaaggctc tgggtccctc 7140
cttcccccgc agcccatggc ttgggccttc attttaaccc cactccccac atgtgcttcg 7200
ttcagatgct ttgcttcctg attgtactca gaataccatg gcagctcggg ctgaggctgg 7260
ttttgaactc ttaatactcc tgtccgggag tagtagcatc tcaggtgtgt ccaatcacac 7320
tctatgtatt ccttgtttgt gatgtctgta tcactcaccc gtgcccttca aagctttgct 7380
aagatgttgc ctgggcaatg aggaccttct ctttttgctt tatttttctg tagcccccca 7440
cctccccgtt ttttgggtgg ttttggtagg gatgagacat taagatgttg cctgggcaat 7500
gaggaccttc tctttttgct ttatttttct gtagcccccc acctccccgt tttttgggtg 7560
gttttggtag ggatgagaca acagggcctt atgcaggtta tgcaagtacc ctattgctga 7620
tccacatccc agcctttctg gtattttcca ccattgaacc tgtcatgtgg tttgtgtatt 7680
tcctcagttc atagtcttct tccataaaaa cataaatgtg gccggacgtg gtggcgcatg 7740
cctttaatcc cagcactcgg gaggcagagg caggtggatt tctgagttcg aggccagcct 7800
ggtctacaaa gtgagttcca ggacagccag ggctatagag aaaccctgtc tcaaaaccaa 7860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaccaaa accataaatg tgaggaggtc agggtgttct 7920
gtgtttgttg gttcttgagc tgtacttcag gccgtaacaa gttcttagac ctcatctgtt 7980
gaatgagtga acggaggagt gagaggtcca gaaggtaaat atggcgctgt acagttcttt 8040
ttagaagctg tgctgtgggt tttgtttttt ctaagataaa atggggtcca gtgacatggc 8100
tcagagtaaa tgtaaatgtt gtaccttttg gcatcctggg ttttattttt ccagaaccca 8160
tttatcctgt gacttccaga tgcgcaccat accccctgta aacccccccc cccccaacac 8220
acacacacac caaactagca aacagataca gggctgtcag cgtgtgagca catgaggaag 8280
ggatgctatg ttctcaggcc ctgtgtttct tcttggcacc ccctggtttc tctgagccct 8340
gcacagctac agtgtaacct tacctaattg tcttgttaca aagaagtttg ctgcccagag 8400
tctaaaggtc agatgagtca cttgggcctc acacttctgg gtgtatggaa gcaccagatg 8460
gaagtctcaa ggtacacccg acaccggctg cctttccgtc gtcaggcagc acattcctga 8520
agcaggctct ctcagctgtg ccctctcaac cttcatcctg cagcccatta attgttcaag 8580
gccttctagt tcttggcagg tctgagcatc ttggaaggag ctagaagaga gatgtagaaa 8640
gctcaaagac aaaaatgcaa agctaccccc atcagatacc agctcttggg tctattgacc 8700
agccaatatc cattgatagt ggagttctac atccatatgg aagatacacc attctctttc 8760
atggacagga gtgccaaatc agaatacagg acattacatc tttttgagac aaggtcttac 8820
catgtagcct ttgtagacca gctatgtaga ccatgctgcc ctggaaccca cagagatttg 8880
ctagcttctg cctcccaagt gctaagatta gtgacacaca cctccactta cacagtacac 8940
acccaggaaa aaagtaaaac ataaataaaa agcaaaaaat tgttgtgaaa tagctcagta 9000
ttagagtcct tgtctaagat atatgggctc caggcttgcc catccatcta ttttctgaga 9060
ctggattttt ctgtgtagcc ctggctgtcc tgggtcttac tttgtagacc aggctgacct 9120
tgaactcaga gatccacctg cctctgcctc tggagctctg gggttaaagg tagaccccac 9180
cagccatggg cttaagccca gtatgggttt aaaaacatgg aaccgattgg actttgcata 9240
aagttagatt ggatcctgtg ggtgctgacc tcccatgctt tcaagcactt attggtagca 9300
ttcactgaac aagcctgagg gcgggaacag ccctggcatc tttcaaaggg tatccggttc 9360
aaaccagaat cgaatgctct tttcctagcc accccacctc ttggcttgtt gcctaaggaa 9420
aatggctcta gcctggttct ccagtgttct catggcagtc tggagagatt gtccatttgt 9480
atcacaacct tttgggcgct gcccttggtg acccgctgct gatgtggaca ccagcaagac 9540
ttgagactgc agacctcctc ccccacagat ttctcacaat gcccgtgtgg gagtgtttga 9600
aaagggaaca agctgaccaa cctgtttgtg ggaaagtcgt ggctttccta tcagaaaacg 9660
tcacactctg agtcaggagt gggacatacc tgggtacttt aacaggtggg gcagggtcct 9720
gagtcataga gaggtctcac ctgggaaggt ttctctttca aagagtgaat caaccatgac 9780
atcacccatc tggatctaca ccctttcaag ccgtctctct ccttagcaaa caggaatcta 9840
aaagaggaat aataaggtga aagcaaactg gaaataggac agaacagaca agggaaaaag 9900
ttaaagagaa agcttaagag acgcagacac agacgtttac atgcaaacag ggggtccata 9960
aaaacaaaac cggaagccgt aatatatgta catggcctgt aagattagaa acaaatgtcc 10020
tggcacaaca ttatgggaca acttcccaag ctgctgttga gtttgttttg tgttggccgg 10080
catgggccct taaactgagt ggtgtgtttc tctcttagag aatttttcat gaactagttt 10140
ttcatttgca agtggttagt agtttgagat agcttctagg ttaggggtgg ggccgtgtgt 10200
ccactttact cagctctaat gtcccccgtt tggtgcagac ccctgcagac cctatgcgtc 10260
ctgccacagt ctctgagttc atgcctgcat tgttcaaatt gtgtttcctt gatgtcctcc 10320
aatctcctct ttgctgggct ccctggggcc cccaaggtga gggatttggc agaggtattc 10380
attccattta gggttgattg ttccaaggtc cctcactgta cgtgttattt gtcccttctc 10440
cctggcttcc tgctcaggag ttctgcagac atggctggtg tttagtagct tcttggtgaa 10500
gttcaggtag ccagtttcat gaccacccag ctctcaggcc tgactaagcc cgtggagaaa 10560
gcccataaaa taaagggggt gaacttctaa tctacatctg aaaggagaac ccctgtctac 10620
atctacctgt taccctagcc atcggggaga ctgaggcaga aggatctagc ctggaaattt 10680
agggtgagtc tgggcagcat taggagacta tttcacagtg aagaaggaag gaactcactc 10740
acacccttgg tgcacctcac aggtctctgg gctcagattg gagtctttgg ttttgaaatt 10800
tcctcatcat cggccgcctc agctggtttt tcttctggag tctgttacgc cttctcccct 10860
ttcccccctt ctcttgctaa tcctttcgct tgaacaatag gagtccttaa aacctgggag 10920
ggaagtaaat acctttcaga tgagaccctg tcttaagagg gggaaaaaaa aaacaaaaaa 10980
accctaggga ccgggtcacc aagtgtcagg ttaatcagca gatgtcaaga tgactcctga 11040
gtgcttgctc tttcttcagc tggtgaaatt acagcggcaa catagaatga cagtcagcag 11100
ggagggagga gagggcctgg gtggccaaat aaacttataa attgtgagag aaattaatga 11160
atgtctaagt taatgcagaa acggagagac atactatatt catgaactaa aagacttaat 11220
attgtgaagg tatactttct ttccacataa atttgtagtc aatatgttca ccccaaaaaa 11280
gctgtttgtt aacttgccaa cctcattcta aaatgtatat agaagcccaa aagacaataa 11340
caaaaatatt cttgtagaac aaaatgggaa agaatgttcc actaaatatc aagatttaga 11400
gcaaagcatg agatgtgtgg ggatagacag tgaggctgat aaaatagagt agagctcaga 11460
aacagaccca ttgatatatg taagtgacct atgaaaaaaa tatggcattt tacaatggga 11520
aaatgatgat ctttttcttt tttagaaaaa cagggaaata tatttatatg taaaaaataa 11580
aagggaaccc atatgtcata ccatacacac aaaaaaattc cagtgaatta taagtctaaa 11640
tggagaaggc aaaactttaa atcttttaga aaataatata gaagcatgcc atcatgactt 11700
cagtgtagag aaaaatttct tatgactcaa agtcctaacc acaaagaaaa gattgttaat 11760
tagattgcat gaatattaag acttattttt aaaattaaaa aaccattaag aaaagtcagg 11820
ccatagaatg acagaaaata tttgcaacac cccagtaaag agaattgtaa tatgcagatt 11880
ataaaaagaa gtcttacaaa tcagtaaaaa ataaaactag acaaaaattt gaacagatga 11940
aagagaaact ctaaataatc attacacatg agaaactcaa tctcagaaat cagagaacta 12000
tcattgcata tacactaaat tagagaaata ttaaaaggct aagtaacatc tgtggcaata 12060
ttgatggtat ataaccttga tatgatgtga tgagaacagt actttacccc atgggcttcc 12120
tccccaaacc cttaccccag tataaatcat gacaaatata ctttaaaaac cattacccta 12180
tatctaacca gtactcctca aaactgtcaa ggtcatcaaa aataagaaaa gtctgaggaa 12240
ctgtcaaaac taagaggaac ccaaggagac atgagaatta tatgtaatgt ggcattctga 12300
atgagatccc agaacagaaa aagaacagta gctaaaaaac taatgaaata taaataaagt 12360
ttgaacttta gtttttttta aaaaagagta gcattaacac ggcaaagcca ttttcatatt 12420
tttcttgaac attaagtaca agtctataat taaaaatttt ttaaatgtag tctggaacat 12480
tgccagaaac agaagtacaa cagctatctg tgctgtcgcc taactatcca tagctgattg 12540
gtctaaaatg agatacatca acgctcctcc atgttttttg ttttcttttt aaatgaaaaa 12600
ctttattttt taagaggagt ttcaggttca tagcaaaatt gagaggaagg tacattcaag 12660
ctgaggaagt tttcctctat tcctagttta ctgagagatt gcatcatgaa tgggtgttaa 12720
attttgtcaa atgctttttc tgtgtctatc aatatgacca tgtgattttc ttctttaacc 12780
tgttgatggg acaaattacg ttaattgatt ttcaaacgtt gaaccaccct tacatatctg 12840
gaataaattc tacttggttg tggtgtatat tttttgatac attcttggat tctttttgct 12900
aatattttgt tgaaaatgtt tgtatctttg ttcatgagag atattggtct gttgttttct 12960
tttcttgtaa tgtcattttc tagttccggt attaaggtaa tgctggccta gttgaatgat 13020
ttaggaagta ttccctctgc ttctgtcttc tgaaagagat tgtagaaagt tgatacaatt 13080
tttttttctt taaatatgtc gacgcactgg ctttacaggg gccgtctgct ttgtctgtag 13140
atatggtgat aggagtctga tttagaaact tccttgttct cctcttcccg aatccttcct 13200
cctgaacaat aggaatacct aagtgcacaa gtgcaggtgc ccaggaggcc ctgagacaac 13260
cccccctccc cagctgcgag ccttctccgg tggtgctggg aatcgaactg gagtcctctg 13320
caagaacagt atgtgctctt aaccactgca ccatctcttc agccccctct agttctttag 13380
tttgtacata aattagcaag ttcagggaat gcagaagaac tggccagggg tcagagccag 13440
actggaaaca tttttcacca aacaatagct acagtgttca tggcgtgcct ccattgaata 13500
ctaaactagc tgttgatgtg tgactttgat ttttaatctt tgcaccaact ttagttacta 13560
tatagataat tccatttcca aatgatatat agtggaagct tgtaaaagct gcttactatc 13620
ccagggtccc cagccgagat ctacatgata aagctactct caacccagcc tacattcccc 13680
ctccctgtgc tcagccctac ctggggttgt tcactttcaa gctcccagga aggaacctga 13740
gcgctccctg cccccatgca gtccatttct atctctggtc ctttgggtac ttggagcctc 13800
aagctcctga ctgctaatga agcctgtaac agaagggcat tacttactgc ccgccttgtg 13860
ctcccttgaa atctggtcac ctggaggtgg aagtgggcag tgcttccgtg cttccgtgct 13920
tccgctttct cccagctcct tttaatcact attttttttt tttcttttcc aaattactac 13980
ctaggagttt tctagtaatc actttggtgg gagtgggagg gggagtggag gcagttaact 14040
ctgtgagtgc caaggacagt tgttggacgg tggtagtgat ggaggggagg gtgttcacgg 14100
tgagggaact ctgtggagtt acgtagctgg caacaatggg gagagacgga gccgcaccac 14160
cacagacgct ttgcatgagc aactattttg ttttctgtag atgttttcca aaccttaaac 14220
tctgttaagt ctgaaactgg gaggggaacc tctccaccaa aatctaaata tggatcagag 14280
ataaggaaac ttccatagtc tccagctccc tccctgactc agtggcctct gtgaccaact 14340
ccacgtgact ctagtggaca ccttcctggt ggtttggctt tttttttttt tccccatttc 14400
atcttttaaa tggagttttc catgaataag aatataaaac tgcgggggct ggtgagatgg 14460
atcagcaggt aagagcacag aggtcctgag ttcaaatccc agcaaccact tggtggctca 14520
ccatcggtaa cgagatctga ctccctcttc tagagtgtct gaagatagct acagtgtact 14580
tacatataat aaataaacaa atcttaaaaa aaagaatata aaactgcttc cttcccaaca 14640
ggccttggat agttttgtct gtgggaacag cttcccatag gaaaggtgct tttgctactt 14700
ccgaccgtca cacactcctc ctctgcaccc cgtgagggcc tcccaggagt tttgtgttgg 14760
tcacaagcct ccccatgtcc caagggggtc tggagaggga tctgaggtgg tggaaagtgc 14820
tggggtgcca agttatcaga caatgggcac attgagaatg caggtggggc caggcctgtg 14880
tgggctggag cagctgtcgg agcctcaggg ggtgcagctc atgcgcagag ggaagaggca 14940
gtctctctgc tggctgagag gggagggcca cagtaagcaa aggagggggg tgatcccccc 15000
ctcacaagat tccagagcaa agggatgttt gaacgatgac tcacatgaca ggggcggggt 15060
ctgtgagcaa acttcctgtt ggaagcttgt tcttggttcc tgactgtcct tcccaggtca 15120
tagagactgt ctgcaatagg gctggggcct gttaggatgc catcgaggtg ggaaatcctg 15180
gagagcttgg agtagccagc aggccctctt ccctctcctg ccccaggcta gctggaaacc 15240
cgcgaggagg aagggtgtgt tgttccctat cccatggaga ggcttgcatg gtcagaccag 15300
gcctggtgtg acctctgggg ctgctctgtg actgccctgt tctgtgactg cccttctccc 15360
tcccagccct ccccttccat ttgcttctag attcgtctag gagcccatct cagcaaatgg 15420
cagcatcctc gcttaccaga catcttgttt gtttgtttgt ttgttcattc attctgggcc 15480
tgaagatgga gagctgtggt aggggagagc tcagaggctg ggggcagcct taagggcaca 15540
gccaggacgg agcctctgag caaagggcag tgtgtgtaga gtcaggtagg tggtgggcag 15600
caggagacag gaggagcaca gaggtaggtg gcactgtaca gaggccctgg caccattttg 15660
tgacaaggac tctcagaccc ctctagccta ttcccccacc cccaccccca ttacaagcag 15720
tagggtctta atagctaatg gcttggacac cagcctctgg ctgctctggt tcccagctgg 15780
tcagagccct tgttctcctt tgggttctga tccaggtggc acagggtggg ggccctgatt 15840
cacattcttg atagtgccgc taggttccct gctaccagct ggcacattct gtcttccttt 15900
ccagcaggta cttggctggg cttcctgccc agctgctaga cctactgtta ggtcagctca 15960
ttggatgctt cctccaggaa gccttctcta atctccattc ccttggcttc ttttcaagag 16020
cagaagttca ctggcttctc ctgtttcccc agagtagcac ctggtgtctc aagtactcgc 16080
taagcagtta ggagaggtgt gaactgggcc tcagggaccc cagagacagg aggggaggtc 16140
attacaggaa agtcggattc ttttcctggc tttgttctta taaccatcgt gtgtgtgtgt 16200
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt acgtgtgtgt acgtgtgtgt 16260
gtgtgtacat gcgtgcgcgc cctacgtcac ccgccccgtt cccacgcccc gcgccacgtc 16320
acaaactcca ccccctcatt atcatattgg cttcaatcca aaataaggta tattattgat 16380
gatgttacat cg 16392
<210> 78
<211> 30119
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGLAd4_coHTT.HTTmshR1/3
<400> 78
ttaattaagc agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat ggacagcaag 60
cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct gcaaagtaaa 120
ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagct ctgatcaaga 180
gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc 240
cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga 300
tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct 360
gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaagacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac 420
gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct 480
attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt 540
atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt 600
cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt 660
cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag 720
gctcaaggcg agcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt 780
gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg 840
tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg 900
cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg 960
catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgacct caggttactc atatatactt 1020
tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 1080
aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 1140
gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 1200
acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 1260
tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 1320
ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 1380
atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 1440
agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 1500
cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 1560
agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 1620
acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 1680
gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 1740
ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 1800
gctcttaatt aaatcgcatc atcaataata taccttattt tggattgaag ccaatatgat 1860
aatgaggggg tggagtttgt gacgtggcgc ggggcgtggg aacggggcgg gtgacgtagt 1920
agtgtggcgg aagtgtgatg ttgcaagtgt ggcggaacac atgtaagcga cggatgtggc 1980
aaaagtgacg tttttggtgt gcgccggtgt acacaggaag tgacaatttt cgcgcggttt 2040
taggcggatg ttgtagtaaa tttgggcgta accgagtaag atttggccat tttcgcggga 2100
aaactgaata agaggaagtg aaatctgaat aattttgtgt tactcatagc gcgtaatatt 2160
tgtctagggc cgcggggact ttgaccgttt acgtggagac tcgcccaggt gtttttctca 2220
ggtgttttcc gcgttccggg tcaaagttgg cgttttatta ttatagtcag ctgacgtgta 2280
gtgtcgagtg ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat 2340
tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 2400
gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa 2460
cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact 2520
tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta 2580
aatggcccgc ctggcattgt gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt 2640
acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca 2700
ctctccccat ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat 2760
tttgtgcagc gatgggggcg gggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg 2820
gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc 2880
tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg 2940
cgcggcgggc gatagggaga cccaagctgg tgagtttggg gacccttgat tgttctttct 3000
ttttcgctat tgtaaaattc atgttatatg gagggggcaa agttttcagg gtgttgttta 3060
gaacgggaag atgtcccttg tatcaccatg gaccctcatg ataattttgt ttctttcact 3120
ttctactctg ttgacaacca ttgtctcctc ttattttctt ttcattttct gtaacttttt 3180
cgttaaactt tagcttgcat ttgtaacgaa tttttaaatt cacttttgtt tatttgtcag 3240
attgtaagta ctttctctaa tcactttttt ttcaaggcaa tcagggtata ttatattgta 3300
cttcagcaca gttttagaga acaattgtta taattaaatg ataaggtaga atatttctgc 3360
atataaattc tggctggcgt ggaaatattc ttattggtag aaacaactac atcctggtca 3420
tcatcctgcc tttctcttta tggttacaat gatatacact gtttgagatg aggataaaat 3480
actctgagtc caaaccgggc ccctctgcta accatgttca tgccttcttc tttttcctac 3540
aggggaccca agcttggtac cgagctcgga tccaccatgg ctactctgga aaaactgatg 3600
aaggcatttg agtctctgaa gagcttccag caacaacagc aacaacagca acagcaacag 3660
cagcaacaac agcagcaaca gcaacaacaa cagccacctc ctcctccacc tccacctcca 3720
ccccctcagc tgccccagcc accacctcag gcacagcctc tgctgccaca gccccagcca 3780
ccccctcctc ctcctccacc acctccagga ccagcagtgg ccgaggagcc tctgcacaga 3840
ccaaagaagg agctgagcgc cacaaagaag gatagggtga accactgtct gaccatctgc 3900
gagaatatcg tggcccagtc tgtgaggaac agccctgagt ttcagaagct gctgggcatc 3960
gccatggagc tgttcctgct gtgctctgac gatgccgaga gcgatgtgcg gatggtggcc 4020
gacgagtgtc tgaacaaagt gatcaaggcc ctgatggaca gcaacctgcc cagactgcag 4080
ctggagctgt acaaggagat caagaagaat ggagcaccta ggtccctgag ggccgccctg 4140
tggcgcttcg ccgagctggc ccacctggtg cggcctcaga agtgtagacc atatctggtg 4200
aacctgctgc cctgcctgac acggacctcc aagagacctg aggagtctgt gcaggagacc 4260
ctggcagcag cagtgcctaa gatcatggcc agctttggca atttcgccaa cgacaatgag 4320
atcaaggtgc tgctgaaggc ctttatcgcc aacctgaaga gctcctctcc aaccatcagg 4380
agaacagcag caggaagcgc cgtgtccatc tgccagcaca gcaggcgcac ccagtacttc 4440
tattcctggc tgctgaatgt gctgctggga ctgctggtgc cagtggagga tgagcactcc 4500
acactgctga tcctgggcgt gctgctgacc ctgcggtacc tggtgcctct gctgcagcag 4560
caggtgaagg acacatccct gaagggctct tttggcgtga ccagaaagga gatggaggtg 4620
tccccctctg ccgagcagct ggtgcaggtg tatgagctga ccctgcacca cacacagcac 4680
caggaccaca acgtggtgac aggcgccctg gagctgctgc agcagctgtt ccggacccca 4740
cctccagagc tgctgcagac actgaccgca gtgggaggaa tcggacagct gaccgcagca 4800
aaggaggaga gcggaggccg gagcagatcc ggatctatcg tggagctgat cgcaggagga 4860
ggaagctcct gcagccccgt gctgtccagg aagcagaagg gcaaggtgct gctgggagag 4920
gaggaggccc tggaggacga tagcgagtcc cgctctgacg tgagcagctc cgccctgaca 4980
gccagcgtga aggacgagat ctccggagag ctggcagcat ctagcggcgt gtctacccct 5040
ggaagcgccg gccacgacat catcacagag cagccaagaa gccagcacac cctgcaggcc 5100
gattccgtgg acctggcctc ttgtgatctg acctcctctg ccacagatgg cgacgaggag 5160
gacatcctga gccacagctc ctctcaggtg tccgccgtgc cttctgatcc agccatggat 5220
ctgaatgacg gaacccaggc cagctcccca atctccgact ctagccagac cacaaccgag 5280
ggccctgata gcgccgtgac accatccgac tcctctgaga tcgtgctgga tggcaccgac 5340
aaccagtacc tgggactgca gatcggacag ccacaggatg aggacgagga ggcaaccggc 5400
atcctgcctg atgaggccag cgaggccttt cggaatagct ccatggcact gcagcaggca 5460
cacctgctga agaacatgtc tcactgcaga cagcctagcg attctagcgt ggacaagttc 5520
gtgctgaggg atgaggcaac agagccaggc gaccaggaga ataagccttg ccggatcaag 5580
ggcgacatcg gccagtctac cgacgatgac agcgccccac tggtgcactg cgtgcggctg 5640
ctgagcgcct ccttcctgct gaccggaggc aagaacgtgc tggtgcccga tcgggacgtg 5700
agagtgtctg tgaaggccct ggccctgagc tgcgtgggag cagccgtggc cctgcaccct 5760
gagtctttct ttagcaagct gtacaaggtg ccactggata caaccgagta ccccgaggag 5820
cagtatgtga gcgacatcct gaattatatc gatcacggcg acccacaggt gcggggagca 5880
accgccatcc tgtgcggcac actgatctgc tctatcctgt ctaggagccg ctttcacgtg 5940
ggcgactgga tgggcacaat caggacactg accggcaaca ccttctccct ggccgattgc 6000
atccccctgc tgcgcaagac actgaaggac gagtcctctg tgacctgtaa gctggcctgc 6060
acagccgtga gaaattgcgt gatgtccctg tgcagctcct cttactctga gctgggcctg 6120
cagctgatca tcgatgtgct gaccctgaga aacagctcct attggctggt gaggaccgag 6180
ctgctggaga cactggccga gatcgacttt agactggtga gcttcctgga ggccaaggcc 6240
gagaatctgc acaggggagc acaccactac accggactgc tgaagctgca ggagcgcgtg 6300
ctgaacaacg tggtcatcca cctgctgggc gatgaggacc cacgggtgag acacgtggca 6360
gcagccagcc tgatcaggct ggtgcctaag ctgttttaca agtgtgatca gggacaggca 6420
gacccagtgg tggcagtggc aagggatcag tctagcgtgt atctgaagct gctgatgcac 6480
gagacccagc ccccttccca cttctccgtg tctacaatca ccaggatcta ccgcggctat 6540
aacctgctgc cctccatcac agacgtgacc atggagaaca atctgtctag agtgatcgcc 6600
gccgtgtccc acgagctgat cacctctaca acccgcgccc tgacatttgg ctgctgtgag 6660
gccctgtgcc tgctgtccac agccttcccc gtgtgcatct ggtctctggg atggcactgc 6720
ggagtgccac cactgagcgc ctccgatgag tccaggaagt cttgtaccgt gggcatggcc 6780
accatgatcc tgacactgct gtcctctgcc tggtttccac tggatctgag cgcccaccag 6840
gacgcactga tcctggcagg aaatctgctg gcagcaagcg ccccaaagtc cctgcggagc 6900
tcctgggcat ccgaggagga ggcaaaccca gcagcaacca agcaggagga agtgtggcca 6960
gccctgggcg acagagccct ggtgccaatg gtggagcagc tgttcagcca cctgctgaaa 7020
gtgatcaaca tctgcgcaca cgtgctggat gacgtggcac ctggaccagc catcaaggcc 7080
gccctgcctt ccctgacaaa ccctccatct ctgagcccaa tccggagaaa gggcaaggag 7140
aaggagccag gagagcaggc ctctgtgcca ctgagcccta agaagggaag cgaggcctcc 7200
gccgcatcta ggcagagcga cacctccggc ccagtgacaa ccagcaagtc tagctccctg 7260
ggcagctttt accacctgcc ctcctatctg aagctgcacg atgtgctgaa ggccacccac 7320
gccaattaca aggtgacact ggacctgcag aactccaccg agaagtttgg cggcttcctg 7380
aggtctgccc tggatgtgct gagccagatc ctggagctgg ccacactgca ggacatcggc 7440
aagtgcgtgg aggagatcct gggctatctg aagtcttgct tcagccgcga gccaatgatg 7500
gccaccgtgt gcgtgcagca gctgctgaag accctgtttg gcacaaatct ggccagccag 7560
ttcgatggcc tgtctagcaa cccatccaag tctcagggaa gggcacagag actgggatcc 7620
tctagcgtga ggcctggcct gtaccactat tgctttatgg ccccatacac acacttcacc 7680
caggccctgg cagacgcctc cctgcgcaat atggtgcagg ccgagcagga gaacgataca 7740
tctggctggt ttgacgtgct gcagaaggtg agcacccagc tgaagacaaa cctgacctcc 7800
gtgacaaaga atagagccga taagaacgcc atccacaatc acatcaggct gttcgagccc 7860
ctggtcatca aggccctgaa gcagtataca accacaacct gcgtgcagct gcagaagcag 7920
gtgctggacc tgctggccca gctggtgcag ctgagggtga attactgtct gctggattcc 7980
gaccaggtgt ttatcggctt cgtgctgaag cagtttgagt atatcgaagt gggccagttc 8040
cgggagtctg aggccatcat ccctaacatc ttctttttcc tggtgctgct gtcctacgag 8100
agatatcact ctaagcagat catcggcatc ccaaagatca tccagctgtg cgacggcatc 8160
atggcaagcg gaaggaaggc agtgacccac gcaatccccg ccctgcagcc tatcgtgcac 8220
gatctgtttg tgctgcgcgg cacaaataag gcagacgcag gcaaggagct ggagacccag 8280
aaggaggtgg tggtgtccat gctgctgcgc ctgatccagt accaccaggt gctggagatg 8340
ttcatcctgg tgctgcagca gtgtcacaag gagaacgagg ataagtggaa gaggctgtcc 8400
cgccagatcg ccgacatcat cctgcccatg ctggccaagc agcagatgca catcgattct 8460
cacgaggccc tgggcgtgct gaataccctg tttgagatcc tggcaccatc ctctctgagg 8520
cctgtggaca tgctgctgag atctatgttc gtgaccccta acacaatggc cagcgtgtcc 8580
acagtgcagc tgtggatcag cggcatcctg gccatcctgc gggtgctgat ctctcagagc 8640
accgaggata tcgtgctgag cagaatccag gagctgtcct tttctccata cctgatctcc 8700
tgcaccgtga tcaataggct gcgcgatggc gacagcacat ccaccctgga ggagcacagc 8760
gagggcaagc agatcaagaa cctgcccgag gagacatttt cccggttcct gctgcagctg 8820
gtgggcatcc tgctggagga catcgtgacc aagcagctga aggtggagat gagcgagcag 8880
cagcacacat tctattgtca ggagctgggc accctgctga tgtgcctgat ccacatcttt 8940
aagtccggaa tgttcaggag gatcaccgca gcagcaacaa ggctgtttag aagcgatggc 9000
tgcggcggct ccttctacac actggactct ctgaatctgc gggccagaag catgatcaca 9060
acccaccccg ccctggtgct gctgtggtgt cagatcctgc tgctggtgaa ccacaccgac 9120
tataggtggt gggcagaggt gcagcagaca ccaaagaggc acagcctgag ctccaccaag 9180
ctgctgtccc ctcagatgtc tggagaggag gaggattccg acctggcagc aaagctgggc 9240
atgtgcaaca gagagatcgt gcggagaggc gccctgatcc tgttctgtga ttacgtgtgc 9300
cagaatctgc acgacagcga gcacctgacc tggctgatcg tgaaccacat ccaggatctg 9360
atctctctga gccacgagcc ccctgtgcag gactttatct ccgccgtgca ccggaacagc 9420
gccgcatctg gcctgttcat ccaggccatc cagagcagat gcgagaacct gtccacaccc 9480
accatgctga agaagaccct gcagtgtctg gagggcatcc acctgtccca gtctggcgcc 9540
gtgctgacac tgtatgtgga taggctgctg tgcaccccct ttagggtgct ggcccgcatg 9600
gtggacatcc tggcctgtag gcgcgtggag atgctgctgg ccgccaatct gcagtctagc 9660
atggcccagc tgcctatgga ggagctgaac cgcatccagg agtacctgca gtcctctgga 9720
ctggcacaga ggcaccagcg cctgtattct ctgctggata ggttccgcct gagcaccatg 9780
caggacagcc tgtccccatc tccacccgtg agctcccacc cactggatgg cgacggacac 9840
gtgtccctgg agacagtgtc tcccgataag gactggtacg tgcacctggt gaagagccag 9900
tgctggacca ggagcgattc cgccctgctg gagggagcag agctggtgaa tcgcatccct 9960
gccgaggaca tgaacgcctt tatgatgaac agcgagttca atctgtccct gctggcccca 10020
tgtctgtctc tgggcatgag cgagatctcc ggaggacaga agagcgccct gtttgaggcc 10080
gccagggagg tgacactggc ccgcgtgtcc ggaaccgtgc agcagctgcc agcagtgcac 10140
cacgtgtttc agccagagct gccagcagag cctgcagcat actggtctaa gctgaacgat 10200
ctgttcggcg acgccgccct gtaccagagc ctgcctacac tggcaagagc cctggcacag 10260
tatctggtgg tggtgagcaa gctgccatcc cacctgcacc tgcctccaga gaaggagaag 10320
gatatcgtga agttcgtggt ggccaccctg gaggccctga gctggcacct gatccacgag 10380
cagatcccac tgtccctgga tctgcaggca ggactggact gctgttgcct ggccctgcag 10440
ctgccaggac tgtggtctgt ggtgtctagc accgagtttg tgacacacgc ctgtagcctg 10500
atctactgcg tgcacttcat cctggaggca gtggcagtgc agcctggaga gcagctgctg 10560
tccccagagc ggagaacaaa tacccccaag gccatctctg aggaggagga ggaggtggac 10620
ccaaacacac agaatcccaa gtatatcacc gcagcatgcg agatggtggc agagatggtc 10680
gagtctctgc agagcgtgct ggccctggga cacaagcgga acagcggagt gcctgccttc 10740
ctgacaccac tgctgcgcaa tatcatcatc tctctggccc ggctgcccct ggtgaacagc 10800
tacaccagag tgccccctct ggtgtggaag ctgggatggt ccccaaagcc tggaggcgat 10860
tttggcaccg ccttcccaga gatccccgtg gagtttctgc aggagaagga ggtgtttaag 10920
gagttcatct atcgcatcaa tacactgggc tggaccagcc ggacacagtt cgaggagacc 10980
tgggccacac tgctgggcgt gctggtgacc cagcctctgg tcatggagca ggaggagtcc 11040
ccaccagagg aggacaccga gaggacacag atcaacgtgc tggccgtgca ggccatcaca 11100
tctctggtgc tgagcgccat gaccgtgcca gtggcaggaa atcctgccgt gagctgcctg 11160
gagcagcagc caagaaacaa gcccctgaag gccctggata cacggttcgg cagaaagctg 11220
tccatcatcc ggggcatcgt ggagcaggag atccaggcca tggtgtctaa gagagagaac 11280
atcgccaccc accacctgta ccaggcctgg gacccagtgc cctctctgag cccagcaaca 11340
accggcgccc tgatcagcca cgagaagctg ctgctgcaga tcaatcctga gagggagctg 11400
ggctccatgt cttataagct gggccaggtg tccatccaca gcgtgtggct gggcaactcc 11460
atcacacccc tgcgcgagga ggagtgggat gaagaggagg aggaggaggc agacgcacct 11520
gcaccatcct ctcctccaac ctcccctgtg aacagcagga agcaccgcgc cggcgtggat 11580
atccacagct gttcccagtt cctgctggag ctgtacagca gatggatcct gcctagctcc 11640
tctgccaggc gcacaccagc catcctgatc tctgaggtgg tgcgcagcct gctggtggtg 11700
tccgacctgt ttaccgagcg gaaccagttc gagctgatgt acgtgacact gaccgagctg 11760
cggagagtgc acccaagcga ggatgagatc ctggcccagt atctggtgcc agcaacatgc 11820
aaggcagcag ccgtgctggg aatggacaag gcagtggcag agcccgtgag caggctgctg 11880
gagagcaccc tgcgcagctc ccacctgcca tccagggtgg gcgccctgca cggcgtgctg 11940
tacgtgctgg agtgtgatct gctggatgac accgccaagc agctgatccc cgtgatctcc 12000
gactatctgc tgtctaatct gaagggcatc gcccactgcg tgaacatcca cagccagcag 12060
cacgtgctgg tcatgtgcgc cacagccttt tacctgatcg agaactatcc actggacgtg 12120
ggccccgagt tctctgccag catcatccag atgtgcggcg tgatgctgtc cggctctgag 12180
gagagcaccc catccatcat ctaccactgt gcactgaggg gactggagag actgctgctg 12240
agcgagcagc tgtccaggct ggatgccgag agcctggtga agctgtccgt ggacagagtg 12300
aatgtgcaca gcccacacag ggcaatggcc gccctgggac tgatgctgac ctgcatgtat 12360
acaggcaagg agaaggtgtc tccaggaagg accagcgatc caaaccctgc agcacctgac 12420
agcgagtccg tgatcgtggc catggagcgc gtgtccgtgc tgtttgatcg gatcagaaag 12480
ggcttcccat gtgaggcaag ggtggtggca cgcatcctgc cacagtttct ggatgacttt 12540
ttcccccctc aggacatcat gaacaaagtg atcggcgagt tcctgtctaa ccagcagcca 12600
tacccccagt ttatggccac cgtggtgtat aaggtgttcc agaccctgca cagcacaggc 12660
cagtctagca tggtgcgcga ttgggtcatg ctgtctctga gcaacttcac ccagagggca 12720
cctgtggcaa tggcaacctg gtccctgtct tgctttttcg tgagcgcctc cacatctcct 12780
tgggtggccg ccatcctgcc acacgtgatc agccggatgg gcaagctgga gcaggtggat 12840
gtgaacctgt tttgtctggt ggccaccgac ttctacagac accagatcga ggaggagctg 12900
gacaggaggg cattccagtc cgtgctggag gtggtggccg ccccaggctc cccataccat 12960
aggctgctga cctgtctgag gaatgtgcat aaagtgacta cctgttgatg aattctgcag 13020
atatccatca cactggcggc cgctcgagca tgcatctaga gggccctatt caattctttg 13080
tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa 13140
tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 13200
atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt 13260
ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct ggatcatcga tccataactt cgtataatgt 13320
atgctatacg aagttatcca gatctcgatt taagggtggg aaagaatata taaggtgggg 13380
gtcttatgta gtttgagctc ggctttggtt atttgatgga ttgacctagt tctcaggcag 13440
ccacctgtgt ggactaaata cacccatttc ttctccattc tgaaggatgt gctgaaagcc 13500
gccttggaca gtgagaaaag caaacatgga agcctgctgt aggatcacct tacaccatca 13560
gatacccact tcccaccccc ggcttcctga actttctgta attactcatg ccagtgacta 13620
gggctcatgt gggccatccc aggaaggaga ctagtggctg ccattctgtc ctggtctttg 13680
tgtctcccga ggaggagtgt aggtggtgag gtcacaggct aagccaggcc atttaaggaa 13740
agctgcctca gctccagccc agccctctct gccaggtgga tatggaaatc ccggtttact 13800
ctctggggcc ttttattggc tgaaatgctc accttggtat ctgttacaca ttcccttcca 13860
agagcagagc tagataagcc aggtgtggag acaatcagct cttgaaatct cccagaagct 13920
gccaaacccc taaaatcagc aagagacacc cctcatagtc cagactcagc tgttttattc 13980
tgcctctccc tgatctcttt tcagggcata aagttttcca aggagaagaa tgaaatcagt 14040
atagcaggtc attgagaaag tatagaaagg ctcaggttga acttcagtgt ctgctaccaa 14100
tgtgtcataa ataagtcatt ttactactgt gagactcagt ttacccattt gttgagtatg 14160
aaaaaaaatc atatatattt gttatgctat atgtatcaat gcatcgagct agactctggg 14220
gctaaagcaa tgagtaaaac gtatttggct gaacataaat atgggagggg ggtggaatgc 14280
atgaatgtaa agaatgctgg cataagtagg accagtgagt tgggtgtggc agtgcacctt 14340
ggagacagag ccaggcggac ctctgagttc aaggacagtc atcagggctc cacagagaaa 14400
tcctgtccaa aaaaaaaaaa aaaaatcagt ggggaaaggc acctgccatc gaggctgaag 14460
acctgaattt ggtccacagg atccacgtgg taggaaagaa agaacttcca agggttattc 14520
tctaacctcc atacttatat gtgagtgtac acttaagtaa tgtttgtttg tttgttttgt 14580
tcctgttatg ttttgtttgt ttttaaagcc aagtctggtg gttcaggcat ttaatcatag 14640
cacccagaag gcagagttca agggcagcct ggtctacata ggaaattgta ggcctataca 14700
gtgaaaccct gtttcaaagg aagattaaag gaaaaaagtc ttgcactctt ccacaccctg 14760
accaaagtcc tatagtgaaa ctctggtccc ctccctcatc actgctattg ccaaactcag 14820
tctccctcta tgacccacat catgatagcc agggctagac cgtttgtaaa gataaatcag 14880
ccttgtctgg ataaataact ccaggaagga gaaactgccg gctgtaaaga accttagcag 14940
tcgtattccc caaaaccacc tatataagcc tcaagtgccc ctccaccttt cacagacacc 15000
cctcccctac gggagagtat ctgtcctgca ctgtttgaaa taaacagtcc tgtctgttga 15060
ggtcagtctt cagtcttttt ttctgcttcc agtctcttaa gttgcttcag aaatttacca 15120
agaatcacta aataaagcca gctgtgatgg tccacatctg tattccagtg cttcgaaggc 15180
tgaggcagag ggtctcaagt gtgaggctag cctgggctgc ctgtggaacc ctgccttttt 15240
ttggggagca ggcttttaaa aaatatttat cacggtgaaa tataaggcag gaggattgtt 15300
agaagttcaa taaggacaat ctgattctgt agtggggttc aggctagcta gggctacata 15360
ctaaacaagg tctcaacctt gttttagtaa gaggaggagg aggaaacaga aggaaaaaaa 15420
agtaatttct taggcaccca gtaggcctgc aagtcttgtt ttgaacaaat gaatggatgc 15480
atgaatcaat ctttgctacc tttcaggctc tattctgtgt ccccagagca cccccggccc 15540
aggaaagtga gcagggcacg gtaggtctgc tggaatctct gattgtactt gtgagggctc 15600
tgcctagcag tctccctgga agctgagcct ggccttagcc tcttccttct ctctcagagc 15660
ttctgaagcc acagaaggga cgcatcaaac tcggacctag aaatgaacga ttagtctttt 15720
ttagtgattt tttttcttcc gtctttattt tttgacactc actgggtagc cttggctggc 15780
ccagagctcc ctaggttggt cagagatctg cctgcctcct gcctgggtgt tgatatacag 15840
ggattcacca ctctatgctc ttacgagctg gcttcgaact catcaggctt agaatgtcgg 15900
gtcgtctcac ttatacctcc taagtgttgg aataaccagt gtgcaccacc caagagcccc 15960
tagctgggac tcttgccagg cctgtcttct ctaagcctta gtatccccat ctccaaaatg 16020
ggtataacca tatgcatacg tatcctaagg gcatatacca aaagttcagt gaatacagta 16080
gagtatgtag gaccccctgc gggctagcag tagaagcctt tccctttcca ttataccctt 16140
ggttctaaag ttggttgaaa gttcccctaa gctctctccc gcccagcaaa ccagtcaaac 16200
cagtttcctc attccccggg cttctgtact aagcaaacac tgctttgcaa acggttgacc 16260
aggagcttgc ctttgttaga gaaggaagtc caatggtgtt ttcttccttg caatgccggg 16320
agtgggtttg ctgtgcctta gaaagggttc aaactgggct ggaagtaggg ccccagagta 16380
gctgggggtt ggggattcag gatggcctca agtttgttgt tccccaaacc ctcacttttt 16440
ctagaactat ttcataatac acatgcttaa ggatacccat ttgttgaccc attgcaaaat 16500
gctctctgac ccagcttctg agactggttc accccccatg gataagaatt gagtcatctg 16560
gtgccattca caaatacaga ttaacctccc tcccccaatt tactgaacct caaccaaaaa 16620
aagatccgcc tgcctctgcc tcccaagtgc taggatttta aagggccacg gtacgacatt 16680
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 16740
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 16800
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 16860
attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 16920
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 16980
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 17040
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 17100
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 17160
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 17220
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 17280
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttggtacc 17340
gagctcggat cctgctgttg acagtgagcg agaccgtgtg aatcattgtc tatagtgaag 17400
ccacagatgt atagacaatg attcacacgg tcgtgcctac tgcctcggag aattccagca 17460
cactggcggc cgctcgagca tgcatctaga gggccctatt ctatagtgtc acctaaatgc 17520
tagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 17580
ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa 17640
tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 17700
gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg 17760
ctctatgggt accacacgga tggacacaac attcattttc ctgacagacc aggagtcagg 17820
tcacaggtgt ttgactagta aacacccggt gccaaccagg gtgtgggcat ttggctatct 17880
accctgaggc ccaagatcca agagcacccg tggtccatgg tgctagggga cccggaaatg 17940
tagccagtgc atcagagatc cagcctctgt cctcagggaa gttcagaaac atctctgctt 18000
actgagactt ctgcagggta tttgggaaga ggggccagca cagcaggcat gatcagtttt 18060
acatgctggg cctttgtaag taagaggatg tgtccaggca cagtaaagga aagtctcccc 18120
caggaccttg ggccttttta tccactggtg aggctttttt tctctttctg ttcccccctc 18180
cccacctccc gggctttcca gacagagttt ccctgtgtat tcattcctgg ctgtcctgga 18240
acttgctagg tagaccgggc tggcctcgaa ctcagtatga acaaatgttt acttatggct 18300
ggcactgaga cttcctcttc accctgactc ctcacccaga gcttcccctg aacagaattc 18360
tcttggttag ccttctcaag atcttctgtg gaaaaggcag agatagtcat ggggtgtggc 18420
tctgtggtca ggctaaacct aatgagtgtg aggccctgac tttgattcct agcattgagg 18480
aaaagcagaa acaggaatct tacccaattt tcctctgcct gttaccagac tcaaggctgt 18540
cccgtggagc ccattgccct tcctgagaaa cccacttcct ttcctgaggc taggaaagac 18600
atccctcatc tctgtgcctc aatctcattg atttttgtgg tgttaaaatt cagttatttg 18660
tctttgagag ggctcccctc ccccctttgc ctttcacatc ctttcccttc tttattgcta 18720
tgcagaggac cctaactcct aggcaggccc tctacccttg agatacagct ccatcctctt 18780
gctttttaaa aacttataat tcgagacagg gtctcactgc tacccaggct ggttttgagc 18840
ttactctgca gcctcctgca tcagcccacc gccttgtacg tgagatggtg ggcctgagac 18900
tcagcctctt gaccttcaca tacatctgat acgtgctatc tgaacaggcc tgtcttactc 18960
agttttctgg gtcctgttgg ggggtgaggt ggggagggga gatcttcgtt caggcatgga 19020
gaggtgggaa ggaaaccagt ccacacctct aacaagtgag ttccaactag gacttgctta 19080
gggcacataa ggcagacaga cgtgggagat gtgagcggcg gggaagcgat gatgcttaga 19140
tgctaccacg aggacctgat gtggtgtgcc tgaagatgaa cctgttcccc atgagccagc 19200
tcataaatgg ggaccagcac cggcccctgt gggataattg gcctcgtcct agataataat 19260
tacttagctt tgtaattagg agagcttgta agaagccgaa agtgtttcgg atttatttta 19320
cctggacaag ttcaagacta aactaacacc tgttcctgtg gtttggcatg cagagccatc 19380
tgtttccaaa ggaggtcctg cagcagcttt ttttggggtt ctcctccctg ttccttccct 19440
tctctcccca catcgccttt tctccgtcca gtggtcagtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 19500
tgtgtgtgtg ttaatgagac agggtctcat tatgtagcct tgggcctgga actcactatg 19560
tagatgtggc tggcttcaaa ctcagagagg catatctatc cacttgcctt tgcctctgcc 19620
tctcaagcgg ccgcgtgctg agactaaagg gatgtgctac tactcctggc cagagtgata 19680
agtactcatc ctgtttaaag ttgcctggga ttccctgttt gacactgaat aaaaatcctg 19740
cccatgactt ccaaggctct gggtccctcc ttcccccgca gcccatggct tgggccttca 19800
ttttaacccc actccccaca tggacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt 19860
acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 19920
ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 19980
cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggacta tttacggtaa 20040
actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 20100
aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 20160
acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag 20220
tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt 20280
gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac 20340
aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc 20400
agagctctct ggctaactag agaacccact gcttactggc ttatcgaaat taatacgact 20460
cactataggg agacccaagc ttggtaccga gctcggatcc tgctgttgac agtgagcgag 20520
gatacctgaa atcctgcttt tagtgaagcc acagatgtaa aagcaggatt tcaggtatcc 20580
gtgcctactg cctcggagaa ttccagcaca ctggcggccg ctcgagcatg catctagagg 20640
gccctattct atagtgtcac ctaaatgcta gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt 20700
ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg 20760
ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt 20820
gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca 20880
atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcatg tgcttcgttc agatgctttg 20940
cttcctgatt gtactcagaa taccatggca gctcgggctg aggctggttt tgaactctta 21000
atactcctgt ccgggagtag tagcatctca ggtgtgtcca atcacactct atgtattcct 21060
tgtttgtgat gtctgtatca ctcacccgtg cccttcaaag ctttgctaag atgttgcctg 21120
ggcaatgagg accttctctt tttgctttat ttttctgtag ccccccacct ccccgttttt 21180
tgggtggttt tggtagggat gagacattaa gatgttgcct gggcaatgag gaccttctct 21240
ttttgcttta tttttctgta gccccccacc tccccgtttt ttgggtggtt ttggtaggga 21300
tgagacaaca gggccttatg caggttatgc aagtacccta ttgctgatcc acatcccagc 21360
ctttctggta ttttccacca ttgaacctgt catgtggttt gtgtatttcc tcagttcata 21420
gtcttcttcc ataaaaacat aaatgtggcc ggacgtggtg gcgcatgcct ttaatcccag 21480
cactcgggag gcagaggcag gtggatttct gagttcgagg ccagcctggt ctacaaagtg 21540
agttccagga cagccagggc tatagagaaa ccctgtctca aaaccaaaaa aaaaaaaaaa 21600
aaaaaaaaaa aaccaaaacc ataaatgtga ggaggtcagg gtgttctgtg tttgttggtt 21660
cttgagctgt acttcaggcc gtaacaagtt cttagacctc atctgttgaa tgagtgaacg 21720
gaggagtgag aggtccagaa ggtaaatatg gcgctgtaca gttcttttta gaagctgtgc 21780
tgtgggtttt gttttttcta agataaaatg gggtccagtg acatggctca gagtaaatgt 21840
aaatgttgta ccttttggca tcctgggttt tatttttcca gaacccattt atcctgtgac 21900
ttccagatgc gcaccatacc ccctgtaaac cccccccccc ccaacacaca cacacaccaa 21960
actagcaaac agatacaggg ctgtcagcgt gtgagcacat gaggaaggga tgctatgttc 22020
tcaggccctg tgtttcttct tggcaccccc tggtttctct gagccctgca cagctacagt 22080
gtaaccttac ctaattgtct tgttacaaag aagtttgctg cccagagtct aaaggtcaga 22140
tgagtcactt gggcctcaca cttctgggtg tatggaagca ccagatggaa gtctcaaggt 22200
acacccgaca ccggctgcct ttccgtcgtc aggcagcaca ttcctgaagc aggctctctc 22260
agctgtgccc tctcaacctt catcctgcag cccattaatt gttcaaggcc ttctagttct 22320
tggcaggtct gagcatcttg gaaggagcta gaagagagat gtagaaagct caaagacaaa 22380
aatgcaaagc tacccccatc agataccagc tcttgggtct attgaccagc caatatccat 22440
tgatagtgga gttctacatc catatggaag atacaccatt ctctttcatg gacaggagtg 22500
ccaaatcaga atacaggaca ttacatcttt ttgagacaag gtcttaccat gtagcctttg 22560
tagaccagct atgtagacca tgctgccctg gaacccacag agatttgcta gcttctgcct 22620
cccaagtgct aagattagtg acacacacct ccacttacac agtacacacc caggaaaaaa 22680
gtaaaacata aataaaaagc aaaaaattgt tgtgaaatag ctcagtatta gagtccttgt 22740
ctaagatata tgggctccag gcttgcccat ccatctattt tctgagactg gatttttctg 22800
tgtagccctg gctgtcctgg gtcttacttt gtagaccagg ctgaccttga actcagagat 22860
ccacctgcct ctgcctctgg agctctgggg ttaaaggtag accccaccag ccatgggctt 22920
aagcccagta tgggtttaaa aacatggaac cgattggact ttgcataaag ttagattgga 22980
tcctgtgggt gctgacctcc catgctttca agcacttatt ggtagcattc actgaacaag 23040
cctgagggcg ggaacagccc tggcatcttt caaagggtat ccggttcaaa ccagaatcga 23100
atgctctttt cctagccacc ccacctcttg gcttgttgcc taaggaaaat ggctctagcc 23160
tggttctcca gtgttctcat ggcagtctgg agagattgtc catttgtatc acaacctttt 23220
gggcgctgcc cttggtgacc cgctgctgat gtggacacca gcaagacttg agactgcaga 23280
cctcctcccc cacagatttc tcacaatgcc cgtgtgggag tgtttgaaaa gggaacaagc 23340
tgaccaacct gtttgtggga aagtcgtggc tttcctatca gaaaacgtca cactctgagt 23400
caggagtggg acatacctgg gtactttaac aggtggggca gggtcctgag tcatagagag 23460
gtctcacctg ggaaggtttc tctttcaaag agtgaatcaa ccatgacatc acccatctgg 23520
atctacaccc tttcaagccg tctctctcct tagcaaacag gaatctaaaa gaggaataat 23580
aaggtgaaag caaactggaa ataggacaga acagacaagg gaaaaagtta aagagaaagc 23640
ttaagagacg cagacacaga cgtttacatg caaacagggg gtccataaaa acaaaaccgg 23700
aagccgtaat atatgtacat ggcctgtaag attagaaaca aatgtcctgg cacaacatta 23760
tgggacaact tcccaagctg ctgttgagtt tgttttgtgt tggccggcat gggcccttaa 23820
actgagtggt gtgtttctct cttagagaat ttttcatgaa ctagtttttc atttgcaagt 23880
ggttagtagt ttgagatagc ttctaggtta ggggtggggc cgtgtgtcca ctttactcag 23940
ctctaatgtc ccccgtttgg tgcagacccc tgcagaccct atgcgtcctg ccacagtctc 24000
tgagttcatg cctgcattgt tcaaattgtg tttccttgat gtcctccaat ctcctctttg 24060
ctgggctccc tggggccccc aaggtgaggg atttggcaga ggtattcatt ccatttaggg 24120
ttgattgttc caaggtccct cactgtacgt gttatttgtc ccttctccct ggcttcctgc 24180
tcaggagttc tgcagacatg gctggtgttt agtagcttct tggtgaagtt caggtagcca 24240
gtttcatgac cacccagctc tcaggcctga ctaagcccgt ggagaaagcc cataaaataa 24300
agggggtgaa cttctaatct acatctgaaa ggagaacccc tgtctacatc tacctgttac 24360
cctagccatc ggggagactg aggcagaagg atctagcctg gaaatttagg gtgagtctgg 24420
gcagcattag gagactattt cacagtgaag aaggaaggaa ctcactcaca cccttggtgc 24480
acctcacagg tctctgggct cagattggag tctttggttt tgaaatttcc tcatcatcgg 24540
ccgcctcagc tggtttttct tctggagtct gttacgcctt ctcccctttc cccccttctc 24600
ttgctaatcc tttcgcttga acaataggag tccttaaaac ctgggaggga agtaaatacc 24660
tttcagatga gaccctgtct taagaggggg aaaaaaaaaa caaaaaaacc ctagggaccg 24720
ggtcaccaag tgtcaggtta atcagcagat gtcaagatga ctcctgagtg cttgctcttt 24780
cttcagctgg tgaaattaca gcggcaacat agaatgacag tcagcaggga gggaggagag 24840
ggcctgggtg gccaaataaa cttataaatt gtgagagaaa ttaatgaatg tctaagttaa 24900
tgcagaaacg gagagacata ctatattcat gaactaaaag acttaatatt gtgaaggtat 24960
actttctttc cacataaatt tgtagtcaat atgttcaccc caaaaaagct gtttgttaac 25020
ttgccaacct cattctaaaa tgtatataga agcccaaaag acaataacaa aaatattctt 25080
gtagaacaaa atgggaaaga atgttccact aaatatcaag atttagagca aagcatgaga 25140
tgtgtgggga tagacagtga ggctgataaa atagagtaga gctcagaaac agacccattg 25200
atatatgtaa gtgacctatg aaaaaaatat ggcattttac aatgggaaaa tgatgatctt 25260
tttctttttt agaaaaacag ggaaatatat ttatatgtaa aaaataaaag ggaacccata 25320
tgtcatacca tacacacaaa aaaattccag tgaattataa gtctaaatgg agaaggcaaa 25380
actttaaatc ttttagaaaa taatatagaa gcatgccatc atgacttcag tgtagagaaa 25440
aatttcttat gactcaaagt cctaaccaca aagaaaagat tgttaattag attgcatgaa 25500
tattaagact tatttttaaa attaaaaaac cattaagaaa agtcaggcca tagaatgaca 25560
gaaaatattt gcaacacccc agtaaagaga attgtaatat gcagattata aaaagaagtc 25620
ttacaaatca gtaaaaaata aaactagaca aaaatttgaa cagatgaaag agaaactcta 25680
aataatcatt acacatgaga aactcaatct cagaaatcag agaactatca ttgcatatac 25740
actaaattag agaaatatta aaaggctaag taacatctgt ggcaatattg atggtatata 25800
accttgatat gatgtgatga gaacagtact ttaccccatg ggcttcctcc ccaaaccctt 25860
accccagtat aaatcatgac aaatatactt taaaaaccat taccctatat ctaaccagta 25920
ctcctcaaaa ctgtcaaggt catcaaaaat aagaaaagtc tgaggaactg tcaaaactaa 25980
gaggaaccca aggagacatg agaattatat gtaatgtggc attctgaatg agatcccaga 26040
acagaaaaag aacagtagct aaaaaactaa tgaaatataa ataaagtttg aactttagtt 26100
ttttttaaaa aagagtagca ttaacacggc aaagccattt tcatattttt cttgaacatt 26160
aagtacaagt ctataattaa aaatttttta aatgtagtct ggaacattgc cagaaacaga 26220
agtacaacag ctatctgtgc tgtcgcctaa ctatccatag ctgattggtc taaaatgaga 26280
tacatcaacg ctcctccatg ttttttgttt tctttttaaa tgaaaaactt tattttttaa 26340
gaggagtttc aggttcatag caaaattgag aggaaggtac attcaagctg aggaagtttt 26400
cctctattcc tagtttactg agagattgca tcatgaatgg gtgttaaatt ttgtcaaatg 26460
ctttttctgt gtctatcaat atgaccatgt gattttcttc tttaacctgt tgatgggaca 26520
aattacgtta attgattttc aaacgttgaa ccacccttac atatctggaa taaattctac 26580
ttggttgtgg tgtatatttt ttgatacatt cttggattct ttttgctaat attttgttga 26640
aaatgtttgt atctttgttc atgagagata ttggtctgtt gttttctttt cttgtaatgt 26700
cattttctag ttccggtatt aaggtaatgc tggcctagtt gaatgattta ggaagtattc 26760
cctctgcttc tgtcttctga aagagattgt agaaagttga tacaattttt ttttctttaa 26820
atatgtcgac gcactggctt tacaggggcc gtctgctttg tctgtagata tggtgatagg 26880
agtctgattt agaaacttcc ttgttctcct cttcccgaat ccttcctcct gaacaatagg 26940
aatacctaag tgcacaagtg caggtgccca ggaggccctg agacaacccc ccctccccag 27000
ctgcgagcct tctccggtgg tgctgggaat cgaactggag tcctctgcaa gaacagtatg 27060
tgctcttaac cactgcacca tctcttcagc cccctctagt tctttagttt gtacataaat 27120
tagcaagttc agggaatgca gaagaactgg ccaggggtca gagccagact ggaaacattt 27180
ttcaccaaac aatagctaca gtgttcatgg cgtgcctcca ttgaatacta aactagctgt 27240
tgatgtgtga ctttgatttt taatctttgc accaacttta gttactatat agataattcc 27300
atttccaaat gatatatagt ggaagcttgt aaaagctgct tactatccca gggtccccag 27360
ccgagatcta catgataaag ctactctcaa cccagcctac attccccctc cctgtgctca 27420
gccctacctg gggttgttca ctttcaagct cccaggaagg aacctgagcg ctccctgccc 27480
ccatgcagtc catttctatc tctggtcctt tgggtacttg gagcctcaag ctcctgactg 27540
ctaatgaagc ctgtaacaga agggcattac ttactgcccg ccttgtgctc ccttgaaatc 27600
tggtcacctg gaggtggaag tgggcagtgc ttccgtgctt ccgtgcttcc gctttctccc 27660
agctcctttt aatcactatt tttttttttt cttttccaaa ttactaccta ggagttttct 27720
agtaatcact ttggtgggag tgggaggggg agtggaggca gttaactctg tgagtgccaa 27780
ggacagttgt tggacggtgg tagtgatgga ggggagggtg ttcacggtga gggaactctg 27840
tggagttacg tagctggcaa caatggggag agacggagcc gcaccaccac agacgctttg 27900
catgagcaac tattttgttt tctgtagatg ttttccaaac cttaaactct gttaagtctg 27960
aaactgggag gggaacctct ccaccaaaat ctaaatatgg atcagagata aggaaacttc 28020
catagtctcc agctccctcc ctgactcagt ggcctctgtg accaactcca cgtgactcta 28080
gtggacacct tcctggtggt ttggcttttt ttttttttcc ccatttcatc ttttaaatgg 28140
agttttccat gaataagaat ataaaactgc gggggctggt gagatggatc agcaggtaag 28200
agcacagagg tcctgagttc aaatcccagc aaccacttgg tggctcacca tcggtaacga 28260
gatctgactc cctcttctag agtgtctgaa gatagctaca gtgtacttac atataataaa 28320
taaacaaatc ttaaaaaaaa gaatataaaa ctgcttcctt cccaacaggc cttggatagt 28380
tttgtctgtg ggaacagctt cccataggaa aggtgctttt gctacttccg accgtcacac 28440
actcctcctc tgcaccccgt gagggcctcc caggagtttt gtgttggtca caagcctccc 28500
catgtcccaa gggggtctgg agagggatct gaggtggtgg aaagtgctgg ggtgccaagt 28560
tatcagacaa tgggcacatt gagaatgcag gtggggccag gcctgtgtgg gctggagcag 28620
ctgtcggagc ctcagggggt gcagctcatg cgcagaggga agaggcagtc tctctgctgg 28680
ctgagagggg agggccacag taagcaaagg aggggggtga tccccccctc acaagattcc 28740
agagcaaagg gatgtttgaa cgatgactca catgacaggg gcggggtctg tgagcaaact 28800
tcctgttgga agcttgttct tggttcctga ctgtccttcc caggtcatag agactgtctg 28860
caatagggct ggggcctgtt aggatgccat cgaggtggga aatcctggag agcttggagt 28920
agccagcagg ccctcttccc tctcctgccc caggctagct ggaaacccgc gaggaggaag 28980
ggtgtgttgt tccctatccc atggagaggc ttgcatggtc agaccaggcc tggtgtgacc 29040
tctggggctg ctctgtgact gccctgttct gtgactgccc ttctccctcc cagccctccc 29100
cttccatttg cttctagatt cgtctaggag cccatctcag caaatggcag catcctcgct 29160
taccagacat cttgtttgtt tgtttgtttg ttcattcatt ctgggcctga agatggagag 29220
ctgtggtagg ggagagctca gaggctgggg gcagccttaa gggcacagcc aggacggagc 29280
ctctgagcaa agggcagtgt gtgtagagtc aggtaggtgg tgggcagcag gagacaggag 29340
gagcacagag gtaggtggca ctgtacagag gccctggcac cattttgtga caaggactct 29400
cagacccctc tagcctattc ccccaccccc acccccatta caagcagtag ggtcttaata 29460
gctaatggct tggacaccag cctctggctg ctctggttcc cagctggtca gagcccttgt 29520
tctcctttgg gttctgatcc aggtggcaca gggtgggggc cctgattcac attcttgata 29580
gtgccgctag gttccctgct accagctggc acattctgtc ttcctttcca gcaggtactt 29640
ggctgggctt cctgcccagc tgctagacct actgttaggt cagctcattg gatgcttcct 29700
ccaggaagcc ttctctaatc tccattccct tggcttcttt tcaagagcag aagttcactg 29760
gcttctcctg tttccccaga gtagcacctg gtgtctcaag tactcgctaa gcagttagga 29820
gaggtgtgaa ctgggcctca gggaccccag agacaggagg ggaggtcatt acaggaaagt 29880
cggattcttt tcctggcttt gttcttataa ccatcgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 29940
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtacg tgtgtgtacg tgtgtgtgtg tgtacatgcg 30000
tgcgcgccct acgtcacccg ccccgttccc acgccccgcg ccacgtcaca aactccaccc 30060
cctcattatc atattggctt caatccaaaa taaggtatat tattgatgat gttacatcg 30119
<210> 79
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGLAd3_5139Acc_CMV_AF_F
<400> 79
attttaaagg gccacggtac gacattgatt attgactagt tattaa 46
<210> 80
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGLAd3_5139Acc_BGH_AF_R
<400> 80
tgtgtccatc cgtgtggtac ccatagagcc caccgcatcc ccagca 46
<210> 81
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGLAd3_7189Pci_BGH_AF_R
<400> 81
ttaaccccac tccccacatg gacattgatt attgactagt tattaa 46
<210> 82
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGLAd3_7189Pci_BGH_AF_R
<400> 82
gcatctgaac gaagcacatg ccatagagcc caccgcatcc ccagca 46

Claims (42)

1.一种无肠腺病毒生产系统，其包含辅助质粒、基因组质粒及病毒包装细胞株。
2.根据权利要求1所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述辅助质粒不是具有感染性的病毒颗粒。
3.根据权利要求1所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述辅助质粒不转化为具有感染性的病毒颗粒。
4.根据权利要求1所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述辅助质粒不包含末端反向重复序列。
5.根据权利要求1所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述辅助质粒不包含末端反向重复序列及Ψ包装信号序列。
6.根据权利要求1所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述辅助质粒由一个至五个质粒组成。
7.根据权利要求1所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述基因组质粒包含5’同源拉伸位点、3’同源拉伸位点及3’末端反向重复序列。
8.根据权利要求7所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述基因组质粒还包含抗生素抗性基因。
9.根据权利要求7所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述基因组质粒还包含Ori复制起点。
10.根据权利要求7所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述基因组质粒还包含填充DNA。
11.根据权利要求10所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述填充DNA还包含骨架/基质附着元件。
12.根据权利要求1所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述基因组质粒包含包装在无肠腺病毒的衣壳内的无肠腺病毒基因组部分。
13.根据权利要求1所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述基因组质粒包含要使用无肠腺病毒表达的转基因以及在转基因表达中所需的元件。
14.根据权利要求1所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述系统还包含克隆穿梭质粒。
15.根据权利要求14所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述克隆穿梭质粒包含5’同源拉伸位点、5’末端反向重复序列、Ψ包装信号序列、启动子、多克隆位点、poly(A)信号序列及3’同源拉伸位点。
16.根据权利要求15所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述克隆穿梭质粒还包含内含子。
17.根据权利要求15所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述克隆穿梭质粒还包含抗生素抗性基因。
18.根据权利要求15所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述克隆穿梭质粒还包含Ori复制起点。
19.根据权利要求14所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述克隆穿梭质粒包含要使用无肠腺病毒表达的转基因以及在转基因表达中所需的元件。
20.根据权利要求1所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述病毒包装细胞株为表达属于腺病毒的E1区的蛋白质的细胞株。
21.根据权利要求1所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述系统还包含pAd5pTP表达质粒。
22.根据权利要求21所述的无肠腺病毒生产系统，其中所述pAd5pTP表达质粒包含序列76的碱基序列。
23.一种无肠腺病毒的生产方法，其包括：
将最终基因组质粒转染到病毒包装细胞株中的步骤；以及
将辅助质粒转染到病毒包装细胞株中的步骤。
24.根据权利要求23所述的无肠腺病毒的生产方法，其中所述最终基因组质粒由限制酶进行线性化而成。
25.根据权利要求23所述的无肠腺病毒的生产方法，其特征在于，通过磷酸钙沉淀法进行上述转染。
26.根据权利要求23所述的无肠腺病毒的生产方法，其中所述生产方法还包括将pAd5pTP表达质粒转染到病毒包装细胞株中的步骤。
27.根据权利要求23所述的无肠腺病毒的生产方法，其中所述辅助质粒不是具有感染性的病毒颗粒。
28.根据权利要求23所述的无肠腺病毒的生产方法，其中所述辅助质粒不转化为具有感染性的病毒颗粒。
29.根据权利要求23所述的无肠腺病毒的生产方法，其中所述辅助质粒不包含末端反向重复序列。
30.根据权利要求23所述的无肠腺病毒的生产方法，其中所述辅助质粒不包含末端反向重复序列及Ψ包装信号序列。
31.根据权利要求23所述的无肠腺病毒的生产方法，其中所述辅助质粒由一个至五个质粒组成。
32.根据权利要求23所述的无肠腺病毒的生产方法，其中所述最终基因组质粒包含5’末端反向重复序列、Ψ包装信号序列、启动子、内含子、转基因、poly(A)信号序列，填充DNA及3’末端反向重复序列。
33.根据权利要求23所述的无肠腺病毒的生产方法，其中所述最终基因组质粒还包含抗生素抗性基因。
34.根据权利要求23所述的无肠腺病毒的生产方法，其中所述最终基因组质粒还包含Ori复制起点。
35.根据权利要求32所述的无肠腺病毒的生产方法，其中所述填充DNA还包含骨架/基质附着元件。
36.根据权利要求23所述的无肠腺病毒的生产方法，其中所述最终基因组质粒包含包装在无肠腺病毒的衣壳内的无肠腺病毒基因组部分。
37.根据权利要求23所述的无肠腺病毒的生产方法，其中所述最终基因组质粒包含要使用无肠腺病毒表达的转基因以及在转基因表达中所需的元件。
38.根据权利要求23所述的无肠腺病毒的生产方法，其中所述病毒包装细胞株为表达属于腺病毒的E1区的蛋白质的细胞株。
39.根据权利要求23所述的无肠腺病毒的生产方法，其特征在于，通过上述生产方法制备的无肠腺病毒不包含污染物病毒种。
40.根据权利要求39所述的无肠腺病毒的生产方法，其中所述污染物病毒种为腺病毒或复制型腺病毒。
41.根据权利要求26所述的无肠腺病毒的生产方法，其中所述pAd5pTP表达质粒包含序列76的碱基序列。
42.一种无肠腺病毒，其包含5’末端反向重复序列、Ψ包装信号序列、启动子、内含子、转基因、poly(A)信号序列、填充DNA及3’末端反向重复序列。
CN202080058074.4A 2019-10-23 2020-10-23 基于辅助质粒的无肠腺病毒生产系统 Pending CN114787345A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962924711P 2019-10-23 2019-10-23
US62/924,711 2019-10-23
PCT/KR2020/014585 WO2021080377A1 (ko) 2019-10-23 2020-10-23 헬퍼 플라스미드 기반 가틀리스 아데노바이러스 생산 시스템

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114787345A true CN114787345A (zh) 2022-07-22

Family

ID=75620587

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080058074.4A Pending CN114787345A (zh) 2019-10-23 2020-10-23 基于辅助质粒的无肠腺病毒生产系统

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230167460A1 (zh)
EP (1) EP4060028A4 (zh)
JP (1) JP7385742B2 (zh)
KR (1) KR20220027164A (zh)
CN (1) CN114787345A (zh)
WO (1) WO2021080377A1 (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996040955A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Graham Frank L Adenovirus vectors for gene therapy
WO2000073424A1 (en) * 1999-05-28 2000-12-07 Mount Sinai School Of Medicine A novel baculovirus/adenovirus hybrid vector for the rescue, production and titration of high-capacity adenovirus amplicon vectors
CA2522786A1 (en) * 2003-03-19 2004-09-30 Isogenis, Inc. Gene therapy vectors having reduced immunogenicity based on cd8 alpha-chain
CN101619324A (zh) * 2008-07-01 2010-01-06 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统及其应用
US8709778B2 (en) * 2008-10-28 2014-04-29 Xavier Danthinne Method of adenoviral vector synthesis

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3532566B2 (ja) 1993-06-24 2004-05-31 エル． グラハム，フランク 遺伝子治療のためのアデノウイルスベクター
US9388427B2 (en) * 2002-12-02 2016-07-12 Biovec, Llc In vivo and ex vivo gene transfer into renal tissue using gutless adenovirus vectors
CN1453361A (zh) * 2003-05-30 2003-11-05 中国科学院上海生命科学研究院 一种抗癌靶向可调控基因－病毒的构建方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996040955A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Graham Frank L Adenovirus vectors for gene therapy
WO2000073424A1 (en) * 1999-05-28 2000-12-07 Mount Sinai School Of Medicine A novel baculovirus/adenovirus hybrid vector for the rescue, production and titration of high-capacity adenovirus amplicon vectors
CA2522786A1 (en) * 2003-03-19 2004-09-30 Isogenis, Inc. Gene therapy vectors having reduced immunogenicity based on cd8 alpha-chain
CN101619324A (zh) * 2008-07-01 2010-01-06 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统及其应用
US8709778B2 (en) * 2008-10-28 2014-04-29 Xavier Danthinne Method of adenoviral vector synthesis

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220027164A (ko) 2022-03-07
EP4060028A4 (en) 2023-10-04
US20230167460A1 (en) 2023-06-01
JP7385742B2 (ja) 2023-11-22
WO2021080377A1 (ko) 2021-04-29
EP4060028A1 (en) 2022-09-21
JP2022543323A (ja) 2022-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112673092B (zh) 工程化的免疫刺激性细菌菌株及其用途
AU2019271972B2 (en) Adenovirus polynucleotides and polypeptides
CN113271955A (zh) 用于细胞介导的溶瘤病毒疗法的增强的系统
KR20210149060A (ko) Tn7-유사 트랜스포존을 사용한 rna-유도된 dna 통합
KR20150014505A (ko) 아과 e 원숭이 아데노바이러스 a1302, a1320, a1331 및 a1337 및 이것들의 사용
KR20230091894A (ko) 부위 특이적 표적화 요소를 통한 프로그램 가능한 첨가(paste)를 사용하는 부위 특이적 유전 공학을 위한 시스템, 방법, 및 조성물
AU2022200903B2 (en) Engineered Cascade components and Cascade complexes
CN110678202B (zh) 用于体内核酸表达的系统和方法
CN108135991A (zh) 新型腺病毒
KR20220004959A (ko) 종양, 종양-상주 면역 세포, 및 종양 미세환경을 콜로니화하기 위해 조작된 면역자극성 박테리아
KR20210143897A (ko) 오리지아스로부터의 트랜스포사제를 이용한 핵산 작제물의 진핵세포로의 통합
KR20220113943A (ko) 면역자극성 박테리아 전달 플랫폼 및 치료 제품의 전달을 위한 이의 용도
KR20160102024A (ko) 아데노바이러스 및 상응하는 플라스미드의 제조 방법
KR20210144861A (ko) 아마이엘로이스로부터의 트랜스포사제를 이용한 핵산 작제물의 진핵세포 게놈으로의 전위
TW202237826A (zh) 基因編輯的自然殺手細胞
KR20230066000A (ko) 면역자극성 박테리아-기초 백신, 치료제, 및 rna 전달 플랫폼
CN111094569A (zh) 光控性病毒蛋白质、其基因及包含该基因的病毒载体
KR20230046313A (ko) 다중에피토프 백신 카세트
KR20240004253A (ko) 오토펄린 듀얼 벡터 시스템을 사용한 감각신경성 난청을 치료하기 위한 방법
KR20210151785A (ko) 비바이러스성 dna 벡터 및 fviii 치료제 발현을 위한 이의 용도
KR20220027164A (ko) 헬퍼 플라스미드 기반 가틀리스 아데노바이러스 생산 시스템
KR20240037192A (ko) 게놈 통합을 위한 방법 및 조성물
TW202308669A (zh) 嵌合共刺激性受體、趨化激素受體及彼等於細胞免疫治療之用途
CN116323955A (zh) 通过crispr/cas介导的体内末端解析拯救重组腺病毒
KR20230112625A (ko) 나이세리아 고노레아에 대한 백신접종을 위한 조성물 및 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination