JP2023501651A

JP2023501651A - ポリヌクレオチドの高効率テンプレートなしの酵素的合成

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Publication number: JP2023501651A
Application number: JP2022528079A
Authority: JP
Inventors: エリーズシャンピオン，; ミカエルソスキヌ，; エロディシュヌ，; トマスイベール，; シャビエルゴドロン，; ティルマンハイニシュ，
Original assignee: ディーエヌエースクリプト
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2020-11-09
Publication date: 2023-01-18
Also published as: CN114761575A; EP4058590A1; CA3157418A1; KR20220097976A; US20220411840A1; WO2021094251A1; AU2020384271A1; IL292874A

Abstract

本発明は、異なる末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）バリアントを使用して、異なる３’－Ｏ－可逆的ブロックデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を成長鎖に組み込む、ポリヌクレオチドの酵素的テンプレートなしの合成のための組成物及び方法に関する。部分的には、本発明は、４つの３’－Ｏ－可逆的ブロックｄＮＴＰを全て組み込むために使用される単一の「汎用」ＴｄＴバリアントよりも高い効率で特定のｄＮＴＰを優先的に組み込むために異なるＴｄＴバリアントを設計することができるという認識及び理解である。【選択図】なし

Description

背景
［０００１］広範囲の長さの所定の配列の高度に精製された安価なポリヌクレオチドの使用は、ゲノム及び診断配列決定、多重核酸増幅、治療用抗体の開発、合成生物学、核酸ベースの治療薬、ＤＮＡオリガミ、ＤＮＡベースのデータ記憶などを含む多くの技術の中核を成している。最近、化学ベースの合成方法を、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）など、その酵素の証明された効率と穏やかな非毒性反応条件の利点のために、テンプレートなしのポリメラーゼ（ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｆｒｅｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を使用する酵素ベースの方法で補うか又は置き換えることに関心が集まっている（例えば、Ｙｂｅｒｔｅｔａｌ，国際特許公開ＷＯ２０１５／１５９０２３；Ｈｉａｔｔｅｔａｌ，米国特許５７６３５９４；Ｊｅｎｓｅｎｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７：１８２１－１８３２（２０１８）など）。酵素ベースの合成におけるほとんどのアプローチは、ポリヌクレオチド生成物において所望の配列を得るために、可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸の使用を必要とする。残念ながら、天然のＴｄＴは、修飾されていないヌクレオシド三リン酸と比較して、このような修飾されたヌクレオシド三リン酸の組み込み効率が低い。したがって、多くの研究が、修飾されたヌクレオシド三リン酸のより良好な組み込み効率を有する新規ＴｄＴバリアントを開発することに向けられてきた。例えば、Ｃｈａｍｐｉｏｎｅｔａｌ，米国特許公開ＵＳ２０１９／０２１１３１５；Ｙｂｅｒｔｅｔａｌ，国際特許公開ＷＯ２０１７／２１６４７２など。

［０００２］上記を考慮して、可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸の組み込みを改善するために、新規ＴｄＴバリアントのような新規テンプレートなしのポリメラーゼとその使用方法が利用できれば、テンプレートなしの酵素ベースのポリヌクレオチド合成の分野は進歩するであろう。

［０００３］本発明は、ポリヌクレオチドのテンプレートなしの酵素的合成のための方法、組成物及びキットであって、（ｉ）異なる種類の可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸が組み込まれている場合、及び（ｉｉ）所望の生成物のポリヌクレオチド中間体における異なる二次構造（例えば、ヘアピン、クロスストランドハイブリッド、イントラストランドハイブリッド、Ｇカルテットなど）の存在下を含む、異なる反応環境下でヌクレオシド三リン酸を組み込む際の効率の向上を示す末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）バリアントを含む、ポリヌクレオチドのテンプレートなしの酵素的合成のための方法、組成物及びキットに関する。より具体的には、本発明は部分的には、異なるＴｄＴバリアントを設計して、異なる種類の３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸を異なる効率で組み込むことができ、且つこのような効率の違いを使用して、同じプロセスにおいて、異なる種類の３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸又は３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸のサブセットを用いて、異なるＴｄＴバリアントを使用することにより、全体的な合成効率を向上させることができるという認識及び理解である。同様に、本発明は、ポリヌクレオチド中間体に形成され得る異なる二次構造の存在下で、異なるＴｄＴバリアントが３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸を組み込むように設計され得るという認識及び理解である。

［０００４］いくつかの実施態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸と少なくとも９０パーセント同一であり、配列番号１に関して以下の置換：Ａ１７Ｖ＋Ｌ５２Ｆ＋Ｇ５７Ｅ＋Ｍ６３Ｒ＋Ａ１０８Ｖ＋Ｋ１４７Ｒ＋Ｃ１７３Ｇ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｍ２１０Ｑ＋Ｒ３２５Ｖ＋Ｅ３２８Ｋ＋Ｎ３４５Ｅ＋Ｒ３５１Ｋを有するアミノ酸配列を含む末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）バリアント（「ＡＣＴ－ＴｄＴバリアント」）であって、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、（ｉｉ）３’－Ｏ修飾ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、又はｄＴＴＰのそれぞれを、全てのｄＮＴＰに対して実質的に等しい組み込み率を示す参照のＴｄＴよりも高い率で、核酸断片の遊離３’－ヒドロキシルに組み込むことができる、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）バリアントを含む組成物に関する。

［０００５］いくつかの実施態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸と少なくとも９０パーセント同一であり、配列番号１に関して以下の置換：Ａ１７Ｖ＋Ｌ５２Ｆ＋Ｇ５７Ｅ＋Ｍ６３Ｒ＋Ｉ７６Ｖ＋Ａ１０８Ｖ＋Ｃ１７３Ｇ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｆ２５９Ｅ＋Ｑ２６１Ｒ＋Ｋ２６５Ｇ＋Ｒ３２５Ｖ＋Ｅ３２８Ｎ＋Ｒ３５１Ｋを有するアミノ酸配列を含む末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）バリアント（「Ｇ－ＴｄＴバリアント」）であって、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、（ｉｉ）３’－Ｏ修飾ｄＧＴＰを、全てのｄＮＴＰに対して実質的に等しい組み込み率を示す参照のＴｄＴよりも高い率で、核酸断片の遊離３’－ヒドロキシルに組み込むことができる、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）バリアントを含む組成物に関する。

［０００６］いくつかの実施態様では、配列番号２（Ｍ２７）のＴｄＴバリアントは、例えば、ＡＣＴ－ＴｄＴ又はＧ－ＴｄＴバリアントなどの他のＴｄＴバリアントによる組み込み率を評価及び比較するための参照のＴｄＴとして使用される。

［０００７］（ｉｉ）配列番号１と比較して、Ａ１７Ｖ＋Ｌ５２Ｆ＋Ｇ５７Ｅ＋Ｍ６３Ｒ＋Ａ１０８Ｖ＋Ｋ１４７Ｒ＋Ｃ１７３Ｇ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｍ２１０Ｑ＋Ｒ３２５Ｖ＋Ｅ３２８Ｋ＋Ｎ３４５Ｅ＋Ｒ３５１Ｋの置換の組み合わせであることを除いて、配列番号１に記載の全長アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｉｉｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、（ｉｖ）修飾ヌクレオチドを核酸断片に組み込むことができる末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）バリアントを提供することもまた、本発明の目的である。特定の実施態様では、ＴｄＴは、配列番号１と比較して、Ａ１７Ｖ＋Ｑ３７Ｅ＋Ｄ４１Ｒ＋Ｌ５２Ｆ＋Ｇ５７Ｅ＋Ｍ６３Ｒ＋Ｓ９４Ｒ＋Ｇ９８Ｅ＋Ａ１０８Ｖ＋Ｓ１４６Ｅ＋Ｋ１４７Ｒ＋Ｑ１４９Ｒ＋Ｃ１７３Ｇ＋Ｍ１８４Ｔ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｋ２０９Ｈ＋Ｍ２１０Ｑ＋Ｇ２８４Ｌ＋Ｅ２８９Ａ＋Ｒ３２５Ｖ＋Ｅ３２８Ｋ＋Ｎ３４５Ｅ＋Ｒ３５１Ｋの置換の組み合わせを含む。

［０００８］（ｉｉ）配列番号１と比較して、Ａ１７Ｖ＋Ｌ５２Ｆ＋Ｇ５７Ｅ＋Ｍ６３Ｒ＋Ｉ７６Ｖ＋Ａ１０８Ｖ＋Ｃ１７３Ｇ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｆ２５９Ｅ＋Ｑ２６１Ｒ＋Ｋ２６５Ｇ＋Ｒ３２５Ｖ＋Ｅ３２８Ｎ＋Ｒ３５１Ｋの置換の組み合わせであることを除いて、配列番号１に記載の全長アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）バリアントであって、（ｉｉｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、（ｉｖ）修飾ヌクレオチドを核酸断片に組み込むことができるＴｄＴバリアントを提供することは、本発明の別の目的である。特定の実施態様では、ＴｄＴは、配列番号１と比較して、Ａ１７Ｖ＋Ｑ３７Ｅ＋Ｄ４１Ｒ＋Ｌ５２Ｆ＋Ｇ５７Ｅ＋Ｍ６３Ｒ＋Ｉ７６Ｖ＋Ｓ９４Ｒ＋Ｇ９８Ｅ＋Ａ１０８Ｖ＋Ｓ１４６Ｅ＋Ｑ１４９Ｒ＋Ｃ１７３Ｇ＋Ｍ１８４Ｔ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｋ２０９Ｈ＋Ｆ２５９Ｅ＋Ｑ２６１Ｒ＋Ｋ２６５Ｇ＋Ｇ２８４Ｌ＋Ｅ２８９Ａ＋Ｒ３２５Ｖ＋Ｅ３２８Ｎ＋Ｒ３５１Ｋの置換の組み合わせを含む。

［０００９］一態様では、本発明は、上記のＴｄＴバリアント又は類似のＴｄＴバリアントの組成物を使用して、（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを提供する工程；及び（ｂ）（ｉ）伸長条件下で、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有するイニシエーター又は伸長断片を、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）バリアントと接触させ、その結果、イニシエーター又は伸長断片が、３’－Ｏ－ブロック化、塩基保護ヌクレオシド三リン酸の組み込みによって伸長されて、３’－Ｏ－ブロック伸長断片を形成するサイクルと（ｉｉ）伸長断片を脱ブロッキングして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長断片を形成するサイクルを、ポリヌクレオチドが合成されるまで繰り返す工程を含むポリヌクレオチドを合成する方法であって、ここで、第１のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の第１のセットの３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長し、第２のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の第２のセットの３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長し、第１のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、第２のＴｄＴバリアントよりも高い効率で、第１のセットからの３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長し、第２のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、第１のＴｄＴバリアントよりも高い効率で、第２のセットからの３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長する、方法に関する。いくつかの実施態様では、ＡＣＴ－ＴｄＴバリアントは第１のＴｄＴバリアントであり、Ｇ－ＴｄＴバリアントは第２のＴｄＴバリアントである。

［００１０］いくつかの実施態様では、第１、第２及び第３のＴｄＴバリアントを使用することができ、これらはそれぞれ、その第１、第２及び第３のセットのそれぞれからの３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の組み込み率が最も高い。さらに他の実施態様では、第１、第２、第３及び第４のＴｄＴバリアントを使用することができ、これらはそれぞれ、第１、第２、第３、及び第４の３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸のそれぞれに関して、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の組み込み率が最も高い。

［００１１］いくつかの実施態様では、第１及び第２；第１、第２、及び第３；又は、第１、第２、第３、及び第４のＴｄＴバリアントを、それぞれのセットの３’Ｏ－ブロックｄＮＴＰと別々に使用することができ；他の実施態様では、そのようなＴｄＴバリアントは、組み込み及び脱保護の各サイクルにおいて混合物として使用され得る。

［００１２］いくつかの実施態様では、本発明は、上記の方法を実施するためのキットであって、第１のＴｄＴバリアント及び第２のＴｄＴバリアントを含み、ここで、（ｉ）第１のＴｄＴバリアントは、第１のセットの３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを、第２のＴｄＴバリアントよりも高い率でイニシエーター又は伸長断片に組み込み、（ｉｉ）第２のＴｄＴバリアントは、第２のセットの３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを、第１のＴｄＴバリアントよりも高い率でイニシエーター又は伸長断片に組み込み、且つ（ｉｉｉ）ｄＮＴＰの第１のセットと第２のセットは重複していない、キットに関する。

［００１３］いくつかの実施態様では、ＡＣＴ－ＴｄＴバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセント同一であり、以下の置換：Ａ１７Ｖ＋Ｑ３７Ｅ＋Ｄ４１Ｒ＋Ｌ５２Ｆ＋Ｇ５７Ｅ＋Ｍ６３Ｒ＋Ｓ９４Ｒ＋Ｇ９８Ｅ＋Ａ１０８Ｖ＋Ｓ１４６Ｅ＋Ｋ１４７Ｒ＋Ｑ１４９Ｒ＋Ｃ１７３Ｇ＋Ｍ１８４Ｔ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｋ２０９Ｈ＋Ｍ２１０Ｑ＋Ｇ２８４Ｌ＋Ｅ２８９Ａ＋Ｒ３２５Ｖ＋Ｅ３２８Ｋ＋Ｎ３４５Ｅ＋Ｒ３５１Ｋを有するＴｄＴを含む。このようなＴｄＴバリアントには、ＴｄＴバリアントＭ５５が含まれ、これは、前述の文の置換を条件として、配列番号１のアミノ酸配列と１００パーセント同一である。さらなる実施態様では、ＡＣＴ－ＴｄＴバリアントは、突然変異Ｑ４Ｅを有する配列番号１５（Ｍ５５－１）、配列番号１６（Ｍ５５－２）を含む。

［００１４］いくつかの実施態様では、Ｇ－ＴｄＴバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセント同一であり、以下の置換：Ａ１７Ｖ＋Ｑ３７Ｅ＋Ｄ４１Ｒ＋Ｌ５２Ｆ＋Ｇ５７Ｅ＋Ｍ６３Ｒ＋Ｉ７６Ｖ＋Ｓ９４Ｒ＋Ｇ９８Ｅ＋Ａ１０８Ｖ＋Ｓ１４６Ｅ＋Ｑ１４９Ｒ＋Ｃ１７３Ｇ＋Ｍ１８４Ｔ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｋ２０９Ｈ＋Ｆ２５９Ｅ＋Ｑ２６１Ｒ＋Ｋ２６５Ｇ＋Ｇ２８４Ｌ＋Ｅ２８９Ａ＋Ｒ３２５Ｖ＋Ｅ３２８Ｎ＋Ｒ３５１Ｋを有するＴｄＴを含む。このようなＴｄＴバリアントには、ＴｄＴバリアントＭ５６が含まれ、これは、前述の文の置換を条件として、配列番号１のアミノ酸配列と１００パーセント同一である。さらなる実施態様では、Ｇ－ＴｄＴバリアントは、突然変異Ｑ４Ｅを有する、配列番号９（Ｍ３３）、配列番号１０（Ｍ３３－１）、配列番号１１（Ｍ３３－２）、突然変異Ｑ４Ｅを有する、配列番号１３（Ｍ５６－１）及び配列番号１４（Ｍ５６－２）を含む。

［００１５］いくつかの実施態様では、上記のパーセント同一性値は、示された配列番号と少なくとも８０パーセントの同一性である。いくつかの実施態様では、上記のパーセント同一性値は、示された配列番号と少なくとも９０パーセントの同一性である。いくつかの実施態様では、上記のパーセント同一性値は、示された配列番号と少なくとも９５パーセントの同一性である。いくつかの実施態様では、上記のパーセント同一性値は、少なくとも９７パーセントの同一性である。いくつかの実施態様では、上記のパーセント同一性値は、少なくとも９８パーセントの同一性である。いくつかの実施態様では、上記のパーセント同一性値は、少なくとも９９パーセントの同一性である。

［００１６］（ｉｉ）に関して、そのような３’－Ｏ－修飾ヌクレオチドは、３’－Ｏ－ＮＨ２－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－ヌクレオシド三リン酸、３’－Ｏ－アリル－ヌクレオシド三リン酸、３’Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ヌクレオシド三リン酸、又は３’－Ｏ－プロパルギル－ヌクレオシド三リン酸を含み得る。

［００１７］図１は、本発明のＴｄＴバリアントを使用するテンプレートなしの酵素的核酸合成の方法の工程を図式的に示している。

［００１８］本発明は様々な修正及び代替形態に従うことができるが、その詳細は例として図面に示され、詳細に説明される。意図することは、本発明を記載された特定の実施態様に限定することではないことを理解されたい。本発明の精神及び範囲内にある全ての修正、均等物、及び代替物を網羅することが意図されている。本発明の態様に関する指針は、当業者に周知の多数の利用可能な参考文献及び論文（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙなどが含まれる）に見出される。

［００１９］本発明は、全体的な合成効率を高めるために、異なる反応環境下で高められたｄＮＴＰ組み込み効率を有する異なるＴｄＴバリアントを使用して、所定の配列を有するポリヌクレオチドを酵素的に合成するための方法及びキットに関する。いくつかの実施態様では、異なるＴｄＴバリアントは、そのようなＴｄＴバリアントが最大の組み込み効率を提供する反応環境（例えば、組み込まれる３’－Ｏ－ブロックｄＮＴＰのタイプ）を提示する異なる合成サイクル工程において別々に使用される。他の実施態様では、異なるＴｄＴバリアントは、ＴｄＴバリアントが最大の組み込み効率を提供する反応混合物中に常に存在するが、カップリング反応を実施するために存在する他のＴｄＴバリアントとも競合しなければならないように、混合物として使用される。後者のタイプのいくつかの実施態様では、混合物中のＴｄＴバリアントの比率は、合成される標的ポリヌクレオチドの所定の又は予想されるヌクレオチド組成に対してポリヌクレオチド合成時間を最小化するように選択される。いくつかの実施態様では、そのような所定のヌクレオチド組成は、Ａ：Ｃ：Ｇ：Ｔ＝１：１：１：１：１である。

［００２０］いくつかの実施態様では、本発明の方法は、ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを提供する工程；及びｂ）（ｉ）伸長条件下で、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有するイニシエーター又は伸長断片を、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）バリアントと接触させ、その結果、イニシエーター又は伸長断片が、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の組み込みによって伸長されて、３’－Ｏ－ブロック伸長断片を形成するサイクルと（ｉｉ）伸長断片を脱ブロッキングして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長断片を形成するサイクルを、ポリヌクレオチドが合成されるまで繰り返す工程であって、ここで、第１のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の第１のセットから選択される３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長し、第１のＴｄＴバリアントとは異なる第２のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の第２のセットから選択される３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長し、第１のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、第２のＴｄＴバリアントよりも高い効率で、第１のセットからの３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長し、第２のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、第１のＴｄＴバリアントよりも高い効率で、第２のセットからの３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長する、工程を用いて実行される。

［００２１］他の実施態様では、本発明の方法は、ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを提供する工程；及びｂ）（ｉ）伸長条件下で、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有するイニシエーター又は伸長断片を、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸及びＴｄＴ混合物と接触させ、その結果、イニシエーター又は伸長断片が、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の組み込みによって伸長されて、３’－Ｏ－ブロック伸長断片を形成するサイクルと（ｉｉ）伸長断片を脱ブロッキングして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長断片を形成するサイクルを、ポリヌクレオチドが合成されるまで繰り返す工程であって、ここで、ＴｄＴ混合物は、イニシエーター又は伸長断片を、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の第１のセットから選択される３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長する第１のＴｄＴバリアントと、イニシエーター又は伸長断片を、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の第２のセットから選択される３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長する、第１のＴｄＴバリアントとは異なる第２のＴｄＴバリアントとを含み、第１のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、第２のＴｄＴバリアントよりも高い効率で、第１のセットからの３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長し、第２のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、第１のＴｄＴバリアントよりも高い効率で、第２のセットからの３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長する、工程を用いて実行される。いくつかの実施態様では、ＴｄＴ混合物は、所定の生成物収率で所望のポリヌクレオチドを合成するための時間を最小化する比率で、第１のＴｄＴバリアント及び第２のＴｄＴバリアントを含む。

ＴｄＴバリアント
［００２２］上記の本発明のＴｄＴバリアントはそれぞれ、示された置換の存在を条件として、特定の配列番号とのパーセント配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、このように記載された本発明のＴｄＴバリアントと特定の配列番号との間の配列の違いの数及びタイプは、置換、欠失及び／又は挿入に起因し得、置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸は、任意のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施態様では、そのような欠失、置換、及び／又は挿入は、天然に存在するアミノ酸のみを含む。いくつかの実施態様では、Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８５：８６２－８６４（１９７４）に記載されているように、置換は、保存的又は同義のアミノ酸変化のみを含む。つまり、アミノ酸の置換は、その同義アミノ酸のセットのメンバー間でしか起こり得ない。いくつかの実施態様では、使用され得る同義アミノ酸のセットが表１Ａに示されている。
表１Ａ：アミノ酸の同義セットＩ

いくつかの実施態様では、使用され得る同義アミノ酸のセットが表１Ｂに示されている。
表１Ｂ：アミノ酸の同義セットＩＩ

ヌクレオチド組み込み活性の測定
［００２３］本発明のバリアントによるヌクレオチド組み込みの効率は、例えば、Ｂｏｕｌｅｅｔａｌ（以下に引用）；Ｂｅｎｔｏｌｉｌａｅｔａｌ（以下に引用）；及びＨｉａｔｔｅｔａｌ，米国特許第５８０８０４５（後者は、本明細書中で参考として援用される）に記載の伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、又は伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）アッセイによって測定され得る。簡潔に言えば、そのようなアッセイの一形態において、遊離３’－ヒドロキシルを有する蛍光標識したオリゴヌクレオチドを、ＴｄＴ伸長条件下にて可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸の存在下で所定の期間にわたって試験されるべきバリアントＴｄＴと反応させ、その後に伸長反応を停止させ、伸長生成物及び非伸長イニシエーターオリゴヌクレオチドの量をゲル電気泳動による分離後に定量する。そのようなアッセイにより、バリアントＴｄＴの組み込み効率は、他のバリアントの効率又は野生型若しくは参照ＴｄＴ若しくは他のポリメラーゼの効率と容易に比較され得る。いくつかの実施態様では、バリアントＴｄＴ効率の尺度は、等価なアッセイにおいて、野生型ＴｄＴを使用する伸長生成物の量に対する、バリアントＴｄＴを使用する伸長生成物の量の比（パーセンテージとして与えられる）であり得る。

［００２４］いくつかの実施態様では、以下の特定の伸長アッセイを使用して、ＴｄＴの組み込み効率を測定することができる。使用されるプライマーは以下である：
５’－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＧ－３’（配列番号３）
また、プライマーは、５’末端にＡＴＴＯ蛍光色素を有する。使用される代表的な修飾ヌクレオチド（表２中にｄＮＴＰとして示す）には、３’－Ｏ－アミノ－２’，３’－ジデオキシヌクレオチド－５’－三リン酸（ＯＮＨ２、ＦｉｒｅｂｉｒｄＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（３’－Ｏ－アミノ－２’，３’－ジデオキシアデノシン－５’－三リン酸など）が含まれる。試験した各々の異なるバリアントについて、１つの管を反応のために使用する。試薬を、水から開始し、次いで、表２の順序で管に添加した。３７℃で３０分後、ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）の添加によって反応を停止させる。
表２：伸長活性アッセイ試薬

活性緩衝液は、例えば、ＣｏＣｌ_２を補充したＴｄＴ反応緩衝液（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから入手可能）を含む。

［００２５］アッセイの生成物を、従来のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析する。例えば、上記のアッセイ生成物は、１６パーセントポリアクリルアミド変性ゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において分析することができる。ゲルは、分析の直前にガラスプレートの内側にポリアクリルアミドを注ぎ、それを重合させることによって作られる。ガラスプレート内側のゲルを、電気泳動工程のためのＴＢＥ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）を満たした適合タンク上にマウントした。分析する試料を、ゲルの上部にロードする。ゲルの上部と下部との間に５００～２，０００Ｖの電圧を室温で３～６時間印加する。分離後、ゲルの蛍光を、例えば、Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナ（ＧＥＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してスキャンする。ゲル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）又はそれに同等のものを使用して分析し、修飾ヌクレオチドの組み込みのパーセンテージを計算する。

［００２６］ヘアピン完了アッセイ。一態様では、本発明は、ポリヌクレオチド（すなわち、「試験ポリヌクレオチド」）の３’末端にｄＮＴＰを組み込む、ＴｄＴバリアントなどのポリメラーゼの能力を測定する方法を含む。そのような方法の１つは、試験ポリヌクレオチドは実質的に一本鎖のみであるが、ＴｄＴバリアントなどのポリメラーゼを用いて伸長させると、一本鎖ループ及び二本鎖ステムを含む安定なヘアピン構造を形成する反応条件下で、試験ポリヌクレオチドに遊離３’ヒドロキシルを供給する工程を含み、それにより、二本鎖ポリヌクレオチドの存在によって３’末端の伸長の検出を可能にする。二本鎖構造は、二本鎖構造への挿入時に優先的に蛍光を発する蛍光色素、伸長したポリヌクレオチド上のアクセプター（又はドナー）と新規に形成されたヘアピンステムと三重鎖を形成するオリゴヌクレオチド上のドナー（又はアクセプター）との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ＦＲＥＴアクセプター及びドナーであって、これらの両方が試験ポリヌクレオチドに結合しており、この試験ポリヌクレオチドがヘアピンの形成時にＦＲＥＴ近傍に至る、ＦＲＥＴアクセプター及びドナーなどが含まれるがこれらに限定されない様々な方法で検出することができる。いくつかの実施態様では、単一のヌクレオチドによる伸長後の試験ポリヌクレオチドのステム部分は、４～６塩基対長の範囲であり；他の実施態様では、そのようなステム部分は４～５塩基対長であり；さらに他の実施態様では、そのようなステム部分は４塩基対長である。いくつかの実施態様では、試験ポリヌクレオチドの長さは、１０～２０ヌクレオチドの範囲であり；他の実施態様では、試験ポリヌクレオチドの長さは、１２～１５ヌクレオチドの範囲である。いくつかの実施態様では、伸長していないステムと伸長したステムとの間の融解温度の差を最大にするヌクレオチドを用いて試験ポリヌクレオチドを伸長させることが有利であるか都合がよく；したがって、いくつかの実施態様では、試験ポリヌクレオチドは、ｄＣ又はｄＧを用いて伸長される（したがって、試験ポリヌクレオチドは、ステム形成に適切な相補的ヌクレオチドを有するように選択される）。

［００２７］ヘアピン完了アッセイのための例示的な試験ポリヌクレオチドには、ｄＧＴＰを用いた伸長によって完了するｐ８７５（５’－ＣＡＧＴＴＡＡＡＡＡＣＴ）（配列番号４）；ｄＣＴＰを用いた伸長によって完了するｐ８７６（５’－ＧＡＧＴＴＡＡＡＡＣＴ）（配列番号５）；及びｄＧＴＰを用いた伸長によって完了するｐ８７７（５’－ＣＡＧＣＡＡＧＧＣＴ）（配列番号６）が含まれる。そのような試験ポリヌクレオチドのための例示的な反応条件は、以下を含み得る：２．５～５μＭの試験ポリヌクレオチド、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡの挿入色素）の１：４０００希釈物、２００ｍＭカコジレートＫＯＨ（ｐＨ６．８）、１ｍＭＣｏＣｌ_２、０～２０％のＤＭＳＯ、並びに所望の濃度の３’ＯＮＨ_２ｄＧＴＰ及びＴｄＴ。ヘアピンの完了は、３６０ｎｍに設定した励起フィルターセット及び６３５ｎｍに設定した発光フィルターセットを使用した反応温度２８～３８℃での従来の蛍光光度計（ＴＥＣＡＮリーダーなど）を使用したＧｅｌＲｅｄ（登録商標）色素の蛍光の増加によって監視され得る。

［００２８］本発明のこの態様のいくつかの実施態様では、ＴｄＴバリアントは、以下の工程によってヌクレオシド三リン酸をテンプレートなしの組み込みのためのそれらの能力について試験され得る：（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有する試験ポリヌクレオチド、ＴｄＴバリアント、及びヌクレオシド三リン酸を、試験ポリヌクレオチドは一本鎖であるが、ヌクレオシド三リン酸を組み込むと、二本鎖ステム領域を有するヘアピンを形成する条件下で組み合わせる工程、及び（ｂ）ＴｄＴバリアントがヌクレオシド三リン酸を組み込む能力の尺度として、二本鎖ステム領域の形成量を検出する工程。いくつかの実施態様では、ヌクレオシド三リン酸は、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸である。

テンプレートなしの酵素的合成
［００２９］ポリヌクレオチドのテンプレートなしの酵素的合成を、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）などのテンプレートなしのポリメラーゼ（３’－Ｏ－ブロックデオキシヌクレオシド三リン酸（３’－Ｏ－ブロックｄＮＴＰ）の組み込みにおいてより優れた温度安定性又はより高い効率などの改善された特性を有するように設計されたそのバリアントを含む）を使用した様々な既知のプロトコールによって行うことができる（例えば、Ｙｂｅｒｔｅｔａｌ，国際特許公開ＷＯ／２０１５／１５９０２３号；Ｙｂｅｒｔｅｔａｌ，国際特許公開ＷＯ／２０１７／２１６４７２号；Ｈｙｍａｎ，米国特許第５４３６１４３；Ｈｉａｔｔｅｔａｌ，米国特許第５７６３５９４；Ｊｅｎｓｅｎｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７：１８２１－１８３２（２０１８）；Ｍａｔｈｅｗｓｅｔａｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ＆ＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＤＯＩ：０．１０３９／ｃ６ｏｂ０１３７１ｆ（２０１６）；Ｓｃｈｍｉｔｚｅｔａｌ，ＯｒｇａｎｉｃＬｅｔｔ．，１（１１）：１７２９－１７３１（１９９９））。

［００３０］いくつかの実施態様では、酵素ＤＮＡ合成方法は、図１に示されるように、所定のヌクレオチドが各サイクルにおいて添加される、工程のサイクルの反復を含む。例えば、遊離３’－ヒドロキシル基（１０３）を有する、固体支持体（１０２）に結合したイニシエーターポリヌクレオチド（１００）を提供する。イニシエーターポリヌクレオチド（１００）（又は後続のサイクルの伸長イニシエーターポリヌクレオチド）に、イニシエーターポリヌクレオチド（１００）（又は伸長イニシエーターポリヌクレオチド）の３’末端への３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰの酵素的組み込みに有効な条件下（１０４）で、３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰ及びＴｄＴバリアントを添加する。この反応により、３’－ヒドロキシルが保護された伸長イニシエーターポリヌクレオチドが産生される（１０６）。伸長したイニシエーターポリヌクレオチドが競合配列を含む場合、３’－Ｏ－保護基が除去又は脱保護され、元のイニシエーターポリヌクレオチドから所望の配列が切断される。このような切断は、様々な一本鎖切断技術のいずれかを使用して、例えば、元のイニシエーターポリヌクレオチド内の所定の位置に切断可能なヌクレオチドを挿入することによって実施することができる。例示的な切断可能なヌクレオチドは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼによって切断されるウラシルヌクレオチドであり得る。伸長したイニシエーターポリヌクレオチドが完了した配列を含まない場合、３’－Ｏ－保護基が除去されて遊離３’－ヒドロキシル（１０３）が露出し、伸長したイニシエーターポリヌクレオチドがヌクレオチドの付加と脱保護の別のサイクルに供される。

［００３１］本明細書で使用される場合、ヌクレオチド又はヌクレオシドの３’－ヒドロキシルなどの特定の基に関して「保護された」及び「ブロックされた」という用語は、交換可能に使用され、部分が指定された基に共有結合し、化学的又は酵素的プロセス中に基に対する化学的変化を防ぐことを意味することを意図している。指定された基がヌクレオシド三リン酸の３’－ヒドロキシル、又は３’－保護（又はブロック）－ヌクレオシド三リン酸が組み込まれた伸長断片（又は「伸長中間体」）である場合は常に、阻止される化学変化は、酵素的カップリング反応による伸長断片（又は「伸長中間体」）のさらなる、又は後続の伸長である。

［００３２］いくつかの実施態様では、ヌクレオチドの順序付けられた配列は、各合成工程において３’－Ｏ－可逆的ブロックｄＮＴＰの存在下でＴｄＴを使用してイニシエーター核酸にカップリングされる。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドを合成する方法は、（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを準備する工程；（ｂ）伸長条件下で、遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーター又は伸長中間体を、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の存在下においてＴｄＴと反応させて、３’－Ｏ－ブロック伸長中間体を産生する工程；（ｃ）伸長中間体を脱ブロッキングして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長中間体を産生する工程；及び（ｄ）ポリヌクレオチドが合成されるまで工程（ｂ）及び（ｃ）を繰り返す工程を含む。（ときおり、「伸長中間体（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）」は、「伸長断片（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔ）」ともいわれる）。いくつかの実施態様では、イニシエーターは、例えば、その５’末端が固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドとして提供される。上記の方法はまた、反応工程、又は伸長工程の後、及び脱ブロッキング工程の後に、洗浄工程を含み得る。例えば、反応させる工程は、所定のインキュベーション期間又は反応時間の後に、例えば洗浄によって非組み込みヌクレオシド三リン酸を除去するサブ工程を含み得る。そのような所定のインキュベーション期間又は反応時間は、数秒間、例えば３０秒から数分間、例えば３０分間であり得る。

［００３３］上記の方法はまた、反応工程、又は伸長工程後並びに脱ブロッキング工程後のキャッピング工程（複数可）並びに洗浄工程を含み得る。上記のように、いくつかの実施態様では、非伸長遊離３’－ヒドロキシルを、キャッピングされた鎖の任意のさらなる伸長を防止する化合物と反応させるキャッピング工程が含まれ得る。いくつかの実施態様では、そのような化合物は、ジデオキシヌクレオシド三リン酸であり得る。他の実施態様では、遊離３’－ヒドロキシルを有する非伸長鎖は、それらを３’－エキソヌクレアーゼ活性、例えば、ＥｘｏＩで処理することによって分解され得る。例えば、Ｈｙｍａｎ，米国特許第５４３６１４３号を参照のこと。同様に、いくつかの実施態様では、脱ブロックされない鎖は、鎖を除去するか、さらなる伸長に不活性になるように処理され得る。

［００３４］オリゴヌクレオチドの連続合成を含むいくつかの実施態様では、キャッピングが等モル量の複数のオリゴヌクレオチドの産生を防止し得るので、キャッピング工程は望ましくない可能性がある。キャッピングを用いない場合、配列は、欠失エラーが均一に分布するが、複数のオリゴヌクレオチドの各々が等モル量で存在する。これは、非伸長断片がキャッピングされる場合にはあてはまらない。

［００３５］いくつかの実施態様では、伸長工程（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｏｒｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｓｔｅｐ）のための反応条件は、以下を含み得る：２．０μＭ精製ＴｄＴ；１２５～６００μＭ３’－Ｏ－ブロックｄＮＴＰ（例えば、３’－Ｏ－ＮＨ_２－ブロックｄＮＴＰ）；約１０～約５００ｍＭカコジル酸カリウム緩衝液（ｐＨは６．５と７．５の間）、及び約０．０１～約１０ｍＭの二価カチオン（例えば、ＣｏＣ１_２又はＭｎＣ１_２）、ここで、伸長反応は、５０μＬの反応体積中、室温から４５℃までの範囲内の温度で３分間行われ得る。３’－Ｏ－ブロックｄＮＴＰが３’－Ｏ－ＮＨ_２ブロックｄＮＴＰである実施態様では、脱ブロッキング工程のための反応条件は、以下を含み得る：７００ｍＭＮａＮＯ_２；１Ｍ酢酸ナトリウム（酢酸を用いてｐＨ４．８～６．５の範囲に調整）、ここで、脱ブロッキング反応は、５０μＬの体積中、室温から４５℃までの範囲内の温度で３０秒間から数分間行われ得る。

［００３６］特定の適用に応じて、脱ブロッキング及び／又は切断工程は、種々の化学的又は物理的条件、例えば、光、熱、ｐＨ、特定の化学結合を切断することができる酵素などの特定の試薬の存在などを含み得る。３’－Ｏ－ブロッキング基及び対応する脱ブロッキング条件の選択における指針は、参照により援用される以下の参考文献に見出され得る：Ｂｅｎｎｅｒ，米国特許第７５４４７９４号及び同第８２１２０２０号；米国特許第５８０８０４５号；米国特許第８８０８９８８号；国際特許公開ＷＯ９１／０６６７８号；及び以下に引用した参考文献。いくつかの実施態様では、切断剤（脱ブロッキング試薬又は脱ブロッキング剤と呼ばれることもある）は、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの化学的切断剤である。別の実施態様では、切断剤は、３’－リン酸ブロッキング基を切断し得る、例えば、ホスファターゼなどの酵素的切断剤であり得る。当業者は、脱ブロッキング剤の選択が、使用する３’－ヌクレオチドブロッキング基のタイプ、１つ又は複数のブロッキング基が使用されているかどうか、イニシエーターが生細胞若しくは生物体に結合しているのか、或いは固体支持体に結合しているかどうかなどに依存することを理解するであろう。例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などのホスフィンを使用して３’Ｏ－アジドメチル基を切断することができ、パラジウム錯体を使用して３’Ｏ－アリル基を切断することができ、或いは、亜硝酸ナトリウムを使用して３’Ｏ－アミノ基を切断することができる。特定の実施態様では、切断反応は、ＴＣＥＰ、パラジウム錯体、又は亜硝酸ナトリウムを含む。

［００３７］上記のように、いくつかの実施態様では、直交性の脱ブロッキング条件を使用して除去され得る２つ以上のブロッキング基を使用することが望ましい。以下の例示的なブロッキング基の対は、上記の実施態様のような並行合成の実施態様において使用され得る。他のブロッキング基の対又は２つより多くを含む基が、本発明のこれらの実施態様における使用のために利用可能であり得ることが理解される。

［００３８］生細胞上でオリゴヌクレオチドを合成するには、穏やかな脱ブロッキング条件又は脱保護条件、すなわち、細胞膜を破壊せず、タンパク質を変性させず、重要な細胞機能に干渉しない条件などが必要である。いくつかの実施態様では、脱保護条件は、細胞生存に適合する生理学的条件の範囲内にある。そのような実施態様では、酵素的脱保護は、生理学的条件下で実施され得るので望ましい。いくつかの実施態様では、特定の酵素的に除去可能なブロッキング基は、それらの除去のための特定の酵素と関連付けられる。例えば、エステル又はアシルベースのブロッキング基は、アセチルエステラーゼなどのエステラーゼ又は類似の酵素を用いて除去され得、リン酸ブロッキング基は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼなどの３’ホスファターゼを用いて除去され得る。例として、３’－Ｏ－リン酸は、１００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、１０ｍＭＭｇＣ１_２、５ｍＭ２－メルカプトエタノール、及び１単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの溶液での処理によって除去され得る。反応は、３７℃で１分間進行する。

［００３９］「３’－リン酸ブロック」又は「３’－リン酸保護」ヌクレオチドは、３’位のヒドロキシル基がリン酸含有部分の存在によってブロックされているヌクレオチドを指す。本発明による３’－リン酸ブロックヌクレオチドの例は、ヌクレオチジル－３’－リン酸モノエステル／ヌクレオチジル－２’，３’－環状ホスファート、ヌクレオチジル（ｎｕｃｌｃｏｔｉｄｙｌ）－２’－リン酸モノエステル及びヌクレオチジル－２’又は３’－アルキルリン酸ジエステル、並びにヌクレオチジル－２’又は３’－ピロホスファートである。置換がホスファターゼによって遊離３’－ＯＨを生じる脱リン酸化を阻止しないという条件で、チオホスファート又はそのような化合物の他の類似体も使用することができる。

［００４０］３’－Ｏ－エステル保護ｄＮＴＰ又は３’－Ｏ－リン酸保護ｄＮＴＰの合成及び酵素的脱保護のさらなる例は、以下の参考文献に記載されている：Ｃａｎａｒｄｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：１０８５９－１０８６３（１９９５）；Ｃａｎａｒｄｅｔａｌ，Ｇｅｎｅ，１４８：１－６（１９９４）；Ｃａｍｅｒｏｎｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６（２３）：５１２０－５１２６（１９７７）；Ｒａｓｏｌｏｎｊａｔｏｖｏｅｔａｌ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１８（４＆５）：１０２１－１０２２（１９９９）；Ｆｅｒｒｅｒｏｅｔａｌ，ＭｏｎａｔｓｈｅｆｔｅｆｕｒＣｈｅｍｉｅ，１３１：５８５－６１６（２０００）；Ｔａｕｎｔｏｎ－Ｒｉｇｂｙｅｔａｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３８（５）：９７７－９８５（１９７３）；Ｕｅｍｕｒａｅｔａｌ，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，３０（２９）：３８１９－３８２０（１９８９）；Ｂｅｃｋｅｒｅｔａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２（５）：９３６－９５０（１９６７）；Ｔｓｉｅｎ，国際特許公開ＷＯ１９９１／００６６７８号。

［００４１］本明細書中で使用される場合、「イニシエーター」（又は「開始断片」、「イニシエーター核酸」、若しくは「イニシエーターオリゴヌクレオチド」などのような等価な用語）は、テンプレートなしのポリメラーゼ（ＴｄＴなど）によってさらに伸長することができる、遊離３’末端を有する短いオリゴヌクレオチド配列を指す。一実施態様では、開始断片はＤＮＡ開始断片である。別の実施態様では、開始断片はＲＮＡ開始断片である。一実施態様では、開始断片は、３個と１００個との間のヌクレオチド、特に、３個と２０個との間のヌクレオチドを保有する。一実施態様では、開始断片は一本鎖である。別の実施態様では、開始断片は二本鎖である。特定の実施態様では、５’－第一級アミンを用いて合成したイニシエーターオリゴヌクレオチドを、製造者のプロトコールを使用して磁性ビーズに共有結合させ得る。同様に、３’－第一級アミンを用いて合成したイニシエーターオリゴヌクレオチドを、製造者のプロトコールを使用して磁性ビーズに共有結合させ得る。本発明の実施態様での使用に適した他の様々な付着化学は、当技術分野で周知である。例えば、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｂｒｏｃｈｕｒｅ，“ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒＡｔｔａｃｈｉｎｇＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｔｏＳｏｌｉｄＳｕｐｐｏｒｔｓ，” ｖ．６（２０１４）；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，２００８）；及び同様の参考文献。

［００４２］本発明で使用される３’－Ｏ－ブロックｄＮＴＰのうちの多くは、商業的販売者から購入するか、又は公開された技術、例えば、米国特許第７０５７０２６号；国際特許公開番号ＷＯ２００４／００５６６７号、ＷＯ９１／０６６７８号；Ｃａｎａｒｄｅｔａｌ，Ｇｅｎｅ（上記で引用）；Ｍｅｔｚｋｅｒｅｔａｌ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２２：４２５９－４２６７（１９９４）；Ｍｅｎｇｅｔａｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１４：３２４８－３２５２（３００６）；米国特許出願公開第２００５／０３７９９１号を使用して合成することができる。いくつかの実施態様では、修飾ヌクレオチドは、プリン塩基又はピリミジン塩基、及び３’炭素原子が構造：
－Ｏ－Ｚ
の基に結合しているように、除去可能な３’－ＯＨブロッキング基が共有結合で付着したリボース糖部分又はデオキシリボース糖部分を含む修飾ヌクレオチド又はヌクレオシド分子を含み、
ここで、－Ｚは、－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｏ－Ｒ’’、－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｎ（Ｒ’’）_２、－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｎ（Ｈ）Ｒ’’、－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｓ－Ｒ’’、及び－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｆのうちのいずれかであり、各Ｒ’’は、除去可能な保護基であるか又はその一部であり；各Ｒ’は、独立して、水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環式、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、若しくはアミド基、又は連結基を介して結合した検出可能な標識であり；但し、いくつかの実施態様では、かかる置換基は、１０個までの炭素原子及び／又は５個までの酸素若しくは窒素ヘテロ原子を有し；或いは、（Ｒ’）_２は、式＝Ｃ（Ｒ’’’）_２の基を示し、ここで、各Ｒ’’’は、同一でも異なっていてもよく、水素原子及びハロゲン原子並びにアルキル基を含む群から選択され、但し、いくつかの実施態様では、各Ｒ’’’のアルキルは、１～３個の炭素原子を有し；分子が反応して中間体を生成してよく、各Ｒ’’はＨと交換されるか、Ｚは－（Ｒ’）_２－Ｆであり、ＦはＯＨ、ＳＨ、又はＮＨ_２、好ましくはＯＨと交換され、水性条件下で中間体が解離して遊離３’－ＯＨを有する分子が得られ；但し、Ｚが－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｓ－Ｒ’’である場合、両方のＲ’基がＨというわけではない。特定の実施態様では、修飾ヌクレオチド又はヌクレオシドのＲ’は、アルキル又は置換アルキルであり、但し、かかるアルキル又は置換アルキルは、１～１０個の炭素原子及び０～４個の酸素又は窒素ヘテロ原子を有する。特定の実施態様では、修飾ヌクレオチド又はヌクレオシドの－Ｚは、式－Ｃ（Ｒ’）_２－Ｎ３である。特定の実施態様では、Ｚはアジドメチル基である。

［００４３］いくつかの実施態様では、Ｚは、２００以下の分子量を有するヘテロ原子を有するか又は有しない切断可能な有機部分である。他の実施態様では、Ｚは、１００以下の分子量を有するヘテロ原子を有するか又は有しない切断可能な有機部分である。他の実施態様では、Ｚは、５０以下の分子量を有するヘテロ原子を有するか又は有しない切断可能な有機部分である。いくつかの実施態様では、Ｚは、２００以下の分子量を有するヘテロ原子を有するか又は有しない、酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施態様では、Ｚは、１００以下の分子量を有するヘテロ原子を有するか又は有しない、酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施態様では、Ｚは、５０以下の分子量を有するヘテロ原子を有するか又は有しない、酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施態様では、Ｚは、分子量が２００以下の酵素的に切断可能なエステル基である。他の実施態様では、Ｚは、３’－ホスファターゼによって除去可能なリン酸基である。いくつかの実施態様では、次の３’－ホスファターゼの１つ又は複数を、製造者が推奨するプロトコールを用いて使用することができる：Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、仔牛腸アルカリホスファターゼ、組換えエビアルカリホスファターゼ（例えば、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから入手可能）。

［００４４］さらなる特定の実施態様では、３’－ブロックヌクレオチド三リン酸は、３’－Ｏ－アジドメチル基、３’－Ｏ－ＮＨ_２基、又は３’－Ｏ－アリル基のいずれかによってブロックされる。

［００４５］さらに他の実施態様では、本発明の３’－Ｏ－ブロッキング基には、３’－Ｏ－メチル、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）、３’－Ｏ－アリル、３’－Ｏ－アミン、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブトキシエトキシ、３’－Ｏ－（２－シアノエチル）、及び３’－Ｏ－プロパルギルが含まれる。

バリアントＴｄＴの産生
［００４６］本発明のバリアントは、既知の参照ＴｄＴ又は野生型ＴｄＴをコードするポリヌクレオチドを変異させ、次いで、従来の分子生物学技術を用いてこれを発現させることによって産生され得る。例えば、マウスＴｄＴ遺伝子（配列番号１）を、従来の分子生物学技術を使用して、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒｅｔａｌ，Ｇｅｎｅ，１６４：４９－５３（１９９５）；Ｋｏｄｕｍａｌｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０１：１５５７３－１５５７８（２００４）などに記載のプロトコールを使用して、合成断片から組み立てられ得るか、Ｂｏｕｌｅｅｔａｌ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１９９－２０８（１９９８）又はＢｅｎｔｏｌｉｌａｅｔａｌ，ＥＭＢＯＪ．，１４：４２２１－４２２９（１９９５）などに記載のプロトコールを使用して、マウス細胞から直接クローン化され得る。

［００４７］例えば、単離されたＴｄＴ遺伝子を、ｐＥＴ３２（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの発現ベクターに挿入してベクターｐＣＴｄＴを得ることができ、次いでベクターｐＣＴｄＴを使用して、従来のプロトコールを使用してバリアントＴｄＴタンパク質を作製及び発現させることができる。正確な配列を有するベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ産生株において形質転換することができる。

［００４８］形質転換された株を、従来技術を使用してペレットに培養し、このペレットからＴｄＴタンパク質を抽出する。例えば、あらかじめ調製したペレットを３０～３７℃の水浴中で解凍する。完全に解凍した時点で、ペレットを、５０ｍＭｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、５％グリセロール（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）、及び１００ｍＬ用のプロテアーゼカクテル阻害剤１錠（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）からなる溶解緩衝液に再懸濁する。早すぎる溶解及び凝集物の残存を回避するために注意深く再懸濁する。再懸濁した細胞を、完全な色の均一性が得られるまで、数サイクルのフレンチプレスによって溶解する。通常の使用圧力は１４，０００ｐｓｉである。次いで、ライセートを、１０，０００ｒｐｍで１時間～１時間３０分間遠心分離する。カラム精製前に遠心分離物を０．２μｍフィルターに通して、任意のデブリを除去する。

［００４９］ＴｄＴタンパク質は、ワンステップアフィニティー手順で遠心分離物から精製することができる。例えば、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティーカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ポリメラーゼを結合する。最初に、カラムを洗浄し、１５カラム体積の５０ｍＭｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、及び２０ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）で平衡化する。平衡化後にポリメラーゼをカラムに結合させる。次いで、５０ｍＭｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）（ｐＨ７．５）、５００ｍＭＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、及び２０ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）からなる１５カラム体積の洗浄緩衝液を、カラムにアプライする。洗浄後、ポリメラーゼを、５０ｍＭｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）（ｐＨ７．５）、５００ｍＭＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、及び０．５Ｍイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）で溶出する。最高濃度の目的のポリメラーゼに対応する画分を回収し、単一試料にプールする。プールした画分を、透析緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＭｇＯＡｃ、１００ｍＭ［ＮＨ４］２ＳＯ４）に対して透析する。透析液をその後に濃縮フィルター（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－３０，ＭｅｒｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮する。濃縮した酵素を、少量のアリコートに分配し、最終濃度５０％のグリセロールを添加し、次いで、これらのアリコートを－２０℃に凍結し、長期間保存する。精製された酵素の５μＬの様々な画分をＳＤＳＰＡＧＥゲルで分析する。

［００５０］いくつかの実施態様では、ＴｄＴバリアントは、リンカー部分（共有結合又は非共有結合；アミノ酸タグ（例えば、ポリ－アミノ酸タグ、ポリ－Ｈｉｓタグ、６Ｈｉｓ－タグ）；化学化合物（例えば、ポリエチレングリコール）；タンパク質－タンパク質結合対（例えば、ビオチン－アビジン）；親和性カップリング；捕捉プローブ；又はこれらの任意の組み合わせが含まれる）に作動可能に連結され得る。リンカー部分は、ＴｄＴバリアントから分離することができるか、ＴｄＴバリアントの一部であり得る。本発明のＴｄＴバリアントと共に使用するための例示的なＨｉｓタグは、ＭＡＳＨＳＨＨＨＨＨＳＳＧＳＥＮＬＹＦＱＴＧＳＳＧ－（配列番号１２））である。タグ－リンカー部分は、ヌクレオチド結合活性、又はＴｄＴバリアントの触媒活性を阻害しない。

［００５１］上記のプロセス、又は同等のプロセスは、活性及び／又は保存に必要又は有用である、塩、ｐＨ緩衝液などの様々な試薬と混合することができ、それによって、本発明の方法で使用することができる製剤を提供する、単離されたＴｄＴバリアントをもたらす。

本発明の方法を実施するためのキット
［００５２］本発明は、本発明の方法を実施するための様々なキットを含む。一態様では、本発明のキットは、本明細書に記載のテンプレートなしの酵素的ポリヌクレオチド合成を実施するのに適した製剤中の本発明の複数のＴｄＴバリアントを含む。いくつかの実施態様では、複数のＴｄＴバリアントは２個から４個の間である。他の実施態様では、複数とは２個である。このようなキットは、３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰの成長中の鎖へのテンプレートなしの付加又は組み込みを最適にするための反応条件を提供する各ＴｄＴバリアントのための合成緩衝液も含み得る。いくつかの実施態様では、複数のＴｄＴバリアントのそれぞれは、別々に、同じ又は異なる製剤で、別々の容器で提供され得、他の実施態様では、ＴｄＴバリアントのいくつか又は全ては、共通の製剤でそれらの混合物で提供され得る。いくつかの実施態様では、本発明のキットは、３’－Ｏを可逆的に保護したｄＮＴＰをさらに含む。そのような実施態様では、３’－Ｏを可逆的に保護したｄＮＴＰは、３’－Ｏ－アミノ－ｄＮＴＰ又は３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰを含み得る。さらなる実施態様では、キットは、以下の品目のうちの１つ又は複数を、個別に、又は上記品目と一緒に含み得る：（ｉ）本明細書中に記載の脱保護工程を行うための脱保護試薬、（ｉｉ）イニシエーターが結合した固体支持体、（ｉｉｉ）完成したポリヌクレオチドを固体支持体から放出させるための切断試薬、（ｉｖ）酵素付加又は酵素カップリング工程の終了時に未反応の３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰを除去するための洗浄試薬又は洗浄緩衝液、及び（ｖ）精製カラム、脱塩試薬、及び溶出試薬などの合成後の処理試薬。

［００５３］上記の品目（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に関して、特定のイニシエーター及び切断試薬が一緒にされる。例えば、イノシン切断可能なヌクレオチドを含むイニシエーターには、エンドヌクレアーゼＶ切断試薬が付属し得；ニトロベンジル光切断性リンカーを含むイニシエーターには、光切断性リンカーの切断に適切な光源が付属し得；ウラシルを含むイニシエーターには、ウラシルＤＮＡグルコシラーゼ切断試薬が付属し得る、等であり得る。

実施例１
ＴｄＴバリアントＭ５５及びＭ５６の組み込み効率
［００５４］ＴｄＴバリアントＭ５５及びＭ５６（上記で定義）は、２つの異なるプライマー（ｓｙｎＧＧ：５’－ＴＧＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＡＴＧＡＧＧ（配列番号７）及びｐｏｌｙＴ：５’－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（２０Ｔ）（配列番号８）に３’－Ｏ－アジドメチルヌクレオシド三リン酸（ＡＭ－ｄＮＴＰ）を以下の反応条件下で溶液中で組み込む能力について試験された：１ｕＭプライマー、２ｕＭ精製ＴｄＴバリアント、８０ｕＭＡＭ－ｄＮＴＰ、１０％ＤＭＳＯ、緩衝液（１００ｍＭカコジル酸カリウム、１ｍＭＣｏＣｌ２、ｐＨ：６．８）；反応は３７℃で５分間行った；９５℃で５分間加熱することによって反応を停止させた。表３は、異なるプライマー、ｄＮＴＰ、及びＴｄＴバリアントについての伸長プライマーのパーセンテージを示す。
表３

定義
［００５５］アミノ酸は、次の命名法に従って１文字又は３文字のコードで表される：Ａ：アラニン（Ａｌａ）；Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）；Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）；Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）；Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）；Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）；Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）；Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）；Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）；Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）；Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）；Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）；Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）；Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）；Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）；Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）；Ｖ：バリン（Ｖａｌ）；Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）及びＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。

［００５６］２つ以上の異なるＴｄＴのアミノ酸位置に関して「機能的に等価」とは、（ｉ）それぞれの位置のアミノ酸がＴｄＴの活性において同じ機能的役割を果たし、（ｉｉ）アミノ酸がそれぞれのＴｄＴのアミノ酸配列の相同アミノ酸位置に存在することを意味する。配列アラインメント及び／又は分子モデリングに基づいて、２つ以上の異なるＴｄＴのアミノ酸配列内の位置的に同等又は相同なアミノ酸残基を同定することが可能である。いくつかの実施態様では、機能的に等価なアミノ酸位置は、進化的に関連する種、例えば、属、科などによって関連する種のＴｄＴのアミノ酸配列の間で保存されている配列モチーフに属している。このような保存された配列モチーフの例は、Ｍｏｔｅａｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１８０４（５）：１１５１－１１６６（２０１０）；Ｄｅｌａｒｕｅｅｔａｌ，ＥＭＢＯＪ．，２１：４２７－４３９（２００２）；及び同様の参考文献に記載されている。

［００５７］タンパク質に関する「単離された」とは、その自然環境の成分又は不均一な反応混合物から同定され、分離及び／又は回収された化合物を意味する。自然環境又は反応混合物の汚染成分は、タンパク質の機能を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質が含まれ得る。いくつかの実施態様では、本発明のタンパク質は、（１）ローリー法によって決定される場合、９５重量％を超えるタンパク質、最も好ましくは９９重量％を超えるタンパク質まで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によって、Ｎ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クーマシーブルー若しくは好ましくは銀染色を使用した還元条件下又は非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。組換え法によって製造される場合、本発明の単離されたタンパク質は、タンパク質の自然環境のうちの少なくとも１つの成分が存在しないと考えられるので、本発明のタンパク質を組換え細胞内にｉｎｓｉｔｕで含み得る。通常、本発明の単離されたタンパク質は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。

［００５８］「キット」は、本発明の方法を実施するための材料又は試薬を送達するための任意の送達システムを指す。反応アッセイの文脈において、そのような送達システムは、反応試薬（例えば、適切な容器中の１又は複数のＴｄＴバリアント、反応緩衝液、３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰ、脱保護試薬、イニシエーターが結合した固体支持体など）及び／又は補助材料（例えば、緩衝液、アッセイ実施のための書面による指示など）をある場所から別の場所に貯蔵、輸送、又は送達を可能にするシステム及び／又は化合物（希釈剤（ｄｉｌｕｔａｎｔ）、界面活性剤、担体など）を含む。例えば、キットには、関連する反応試薬及び／又は補助材料を含む１つ又は複数のエンクロージャ（例えば、箱）が含まれる。そのような内容物は、意図するレシピエントに一緒に又は個別に送達させることができる。例えば、第１の容器は、合成方法で使用する１つ又は複数のＴｄＴバリアントを含み得、第２又は追加の容器は、脱保護剤、イニシエーターを有する固体支持体、又は３’－Ｏ－保護ｄＮＴＰなどを含み得る。

［００５９］互換的に使用される「変異体」又は「バリアント」は、配列番号１又は他の特定のアミノ酸配列に由来するポリペプチドであって、１つ又は複数の位置での修飾又は改変、すなわち、置換、挿入、及び／又は欠失を含むポリペプチドを指す。このような変異体又バリアントは通常、テンプレートなしのポリメラーゼ活性と、１つ又は複数の可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸前駆体を組み込む能力の両方を備えている。バリアントは、当技術分野で周知の様々な技術によって得ることができる。特に、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変するための技術の例には、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発及び合成オリゴヌクレオチド構築などが含まれるが、これらに限定されない。突然変異誘発活性は、タンパク質の、又は本発明の場合ポリメラーゼの配列中の、１つ又は複数のアミノ酸を欠失させる、挿入する、又は置換することからなる。

［００６０］次の用語法が置換を示すために使用される：Ｌ２３８Ａは、参照又は野生型の配列の２３８位のアミノ酸残基（ロイシン、Ｌ）がアラニン（Ａ）に変更されていることを示す。Ａ１３２Ｖ／Ｉ／Ｍは、親配列の１３２位のアミノ酸残基（アラニン、Ａ）が以下のアミノ酸のうちの１つによって置換されていることを示す：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、又はメチオニン（Ｍ）。置換は、保存的置換又は非保存的置換であり得る。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸、及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、及びスレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システイン、及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン）、及び小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン）のグループ内のものが挙げられる。

［００６１］「配列同一性」とは、２つのポリペプチド配列又は２つのポリヌクレオチド配列などの２つの配列間の一致（例えば、同一のアミノ酸残基）の数（又は分率、通常はパーセンテージで表される）を指す。配列同一性は、配列ギャップを最小限に抑えながら重複及び同一性を最大化するようにアラインメントされたときに配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、２つの配列の長さに応じて、いくつかの数学的なグローバル又は局所のアラインメントアルゴリズムのいずれかを使用して決定され得る。同様の長さの配列は、全長にわたって配列を最適にアラインメントするグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈアルゴリズム；ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，１９７０）を使用してアラインメントすることが好ましく、一方で、実質的に異なる長さの配列は、局所アラインメントアルゴリズム（例えば、ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１）又はＡｌｔｓｃｈｕｌアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，１９９７；Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，２００５））を使用してアラインメントすることが好ましい。アミノ酸配列の同一率を決定する目的のアラインメントを、当技術分野の技術の範囲内である様々な方法で、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／又はｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／などのインターネットウェブサイトで利用可能な公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して行うことができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。本明細書中の目的のために、アミノ酸配列の同一率の値は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して２つの配列の最適なグローバルアラインメントを作出するペアワイズ配列アラインメントプログラムＥＭＢＯＳＳＮｅｅｄｌｅを使用して生成された値を指し、ここで全ての検索パラメーターは、デフォルト値（すなわち、スコアリング行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップ伸長＝０．５、エンドキャップペナルティ＝偽、エンドキャップオープン＝１０、及びエンドキャップ伸長＝０．５）に設定されている。

［００６２］「ポリヌクレオチド」又は「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、各々は、ヌクレオチド単量体の線状ポリマー又はその類似体を意味する。ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドを構成する単量体は、単量体と単量体の相互作用の規則的パターン、例えばワトソン・クリックタイプの塩基対合、塩基スタッキング、又はフーグスティーン若しくは逆フーグスティーンタイプの塩基対合などによって、天然のポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。そのような単量体及びそれらのヌクレオシド間連結は、天然に存在し得るか、又はそれらの類似体、例えば天然に存在する類似体又は天然に存在しない類似体であり得る。天然に存在しない類似体には、ＰＮＡ、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、標識（フルオロフォアなど）を結合可能な連結基を含む塩基、又はハプテンなどが含まれ得る。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの使用が、ポリメラーゼによる伸長、リガーゼによるライゲーションなどの酵素的プロセシングを必要とするときはいつでも、当業者は、それらの例のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、任意の位置又はいくつかの位置にヌクレオチド間連結、糖部分又は塩基の特定の類似体を含まないであろうことを理解することができる。ポリヌクレオチドのサイズは、通常「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる数個の単量体単位、例えば５～４０個から数千個の単量体単位までの範囲である。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字（大文字又は小文字）の配列によって表される場合はいつでも、別段の指示がない限り、又は文脈から明白でない限り、ヌクレオチドが左から右に５’→３’の順序であり、かつ「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシシチジンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」がチミジンを示し、「Ｉ」がデオキシイノシンを示し、「Ｕ」がウリジンを示すと理解される。他に断りのない限り、用語法及び原子番号の慣習は、ＳｔｒａｃｈａｎａｎｄＲｅａｄ，ＨｕｍａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ２（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９９）に開示のものに従うであろう。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結された４つの天然のヌクレオシド（例えば、ＤＮＡについては、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、又はＲＮＡについてはこれらのリボース対応物）を含む；しかしながら、ポリヌクレオチドは、例えば、改変された塩基、糖、又はヌクレオチド間連結を含む非天然ヌクレオチド類似体も含み得る。酵素が活性のための特異的なオリゴヌクレオチド基質又はポリヌクレオチド基質の要件、例えば、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖などを有する場合、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９）などの専門書及び同様の参考文献からのガイダンスを用いて、オリゴヌクレオチド基質又はポリヌクレオチド基質に適切な組成の選択は、当業者の知識の範囲内に十分にあることが当業者に明らかである。同様に、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、一本鎖形態又は二本鎖形態（すなわち、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド及びそのそれぞれの相補鎖の二重鎖）のいずれかを指し得る。使用された用語の文脈から、どちらの形態が意図されているか、或いは両方の形態が意図されているかは当業者には明らかであろう。

［００６３］「プライマー」は、ポリヌクレオチドテンプレートと二重鎖を形成する際に、核酸合成の開始点として作用することができ、伸長した二重鎖が形成されるようにテンプレートに沿ってその３’末端から伸長する、天然又は合成のオリゴヌクレオチドを意味する。通常、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼを用いてプライマー伸長を行う。伸長過程において付加されるヌクレオチド配列は、テンプレートポリヌクレオチド配列によって決定される。通常、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーの長さは、通常、１４～４０ヌクレオチドの範囲、又は１８～３６ヌクレオチドの範囲である。プライマーは、様々な核増幅反応、例えば、単一のプライマーを使用する線形増幅反応、又は２つ以上のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応において使用される。特定の用途のためのプライマーの長さ及び配列の選択のためのガイダンスは、参考として援用される以下の参考文献によって証明されているように、当業者に周知である：Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒ，ＰＣＲＰｒｉｍｅｒ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，２００３）。

［００６４］「置換」とは、アミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置き換えられることを意味する。好ましくは、用語「置換」は、アミノ酸残基の、天然に存在する標準的な２０種のアミノ酸残基、稀な天然に存在するアミノ酸残基（例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、６－Ｎ－メチルリジン（６－Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｙｓｉｎｅ）、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン）、及びしばしば合成で作製される天然に存在しないアミノ酸残基（例えば、シクロヘキシル－アラニン）から選択される別のアミノ酸残基による置き換えを指す。好ましくは、用語「置換」は、あるアミノ酸残基の、天然に存在する標準的な２０種のアミノ酸残基から選択される別のアミノ酸残基による置き換えを指す。記号「＋」は、置換の組み合わせを示す。

［００６５］本明細書では、次の用語法が置換を示すために使用される：Ｌ２３８Ａは、親配列の２３８位のアミノ酸残基（ロイシン、Ｌ）がアラニン（Ａ）に変更されていることを示す。Ａ１３２Ｖ／Ｉ／Ｍは、親配列の１３２位のアミノ酸残基（アラニン、Ａ）が以下のアミノ酸のうちの１つによって置換されていることを示す：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、又はメチオニン（Ｍ）。置換は、保存的置換又は非保存的置換であり得る。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸、及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、及びスレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システイン、及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン）、及び小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン）のグループ内のものが挙げられる。

［００６６］本開示は、記載された特定の形態の範囲に限定されることを意図するものではなく、本明細書に記載の変形形態の代替、修正、及び均等物を網羅することを意図する。さらに、本開示の範囲は、本開示を考慮して当業者に明らかになる可能性のある他の変形を完全に包含する。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims

所定の配列を有するポリヌクレオチドを合成する方法であって、
ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを提供する工程；及び
ｂ）（ｉ）伸長条件下で、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有するイニシエーター又は伸長断片を、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）バリアントと接触させ、その結果、イニシエーター又は伸長断片が、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の組み込みによって伸長されて、３’－Ｏ－ブロック伸長断片を形成するサイクルと（ｉｉ）伸長断片を脱ブロッキングして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長断片を形成するサイクルを、ポリヌクレオチドが合成されるまで繰り返す工程であって、ここで、第１のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の第１のセットから選択される３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長し、第１のＴｄＴバリアントとは異なる第２のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の第２のセットから選択される３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長し、第１のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、第２のＴｄＴバリアントよりも高い効率で、第１のセットからの３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長し、第２のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、第１のＴｄＴバリアントよりも高い効率で、第２のセットからの３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長する、工程、
を含む方法。
第１のＴｄＴバリアント及び第２のＴｄＴバリアントとは異なる第３のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の第３のセットから選択される３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長し、ここで、第１のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、第２のＴｄＴバリアント又は第３のＴｄＴバリアントよりも高い効率で、第１のセットからの３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長し、第２のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、第１のＴｄＴバリアント又は第３のＴｄＴバリアントよりも高い効率で、第２のセットからの３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長し、第３のＴｄＴバリアントは、イニシエーター又は伸長断片を、第１のＴｄＴバリアント又は第２のＴｄＴバリアントよりも高い効率で、第３のセットからの３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸で伸長する、請求項１に記載の方法。
前記第１のセットが、３’－Ｏ－ブロックデオキシアデノシン三リン酸、３’－Ｏ－ブロックデオキシシチジン三リン酸、及び３’－Ｏ－ブロックデオキシチミジン三リン酸を含み、前記第１のＴｄＴバリアントが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、以下の置換の組み合わせ：Ａ１７Ｖ＋Ｌ５２Ｆ＋Ｇ５７Ｅ＋Ｍ６３Ｒ＋Ａ１０８Ｖ＋Ｋ１４７Ｒ＋Ｃ１７３Ｇ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｍ２１０Ｑ＋＋Ｒ３２５Ｖ＋Ｅ３２８Ｋ＋Ｎ３４５Ｅ＋Ｒ３５１Ｋを含む、請求項１又は２に記載の方法。
前記第１のＴｄＴバリアントが、以下の置換の組み合わせ：Ａ１７Ｖ＋Ｑ３７Ｅ＋Ｄ４１Ｒ＋Ｌ５２Ｆ＋Ｇ５７Ｅ＋Ｍ６３Ｒ＋Ｓ９４Ｒ＋Ｇ９８Ｅ＋Ａ１０８Ｖ＋Ｓ１４６Ｅ＋Ｋ１４７Ｒ＋Ｑ１４９Ｒ＋Ｃ１７３Ｇ＋Ｍ１８４Ｔ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｋ２０９Ｈ＋Ｍ２１０Ｑ＋Ｇ２８４Ｌ＋Ｅ２８９Ａ＋Ｒ３２５Ｖ＋Ｅ３２８Ｋ＋Ｎ３４５Ｅ＋Ｒ３５１Ｋを含む、請求項３に記載の方法。
前記第２のセットが、３’－Ｏ－ブロックデオキシグアノシン三リン酸を含み、前記第２のＴｄＴバリアントが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、以下の置換の組み合わせ：Ａ１７Ｖ＋Ｌ５２Ｆ＋Ｇ５７Ｅ＋Ｍ６３Ｒ＋Ｉ７６Ｖ＋Ａ１０８Ｖ＋Ｃ１７３Ｇ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｆ２５９Ｅ＋Ｑ２６１Ｒ＋Ｋ２６５Ｇ＋Ｒ３２５Ｖ＋Ｅ３２８Ｎ＋Ｒ３５１Ｋを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記第２のＴｄＴバリアントが、以下の置換の組み合わせ：Ａ１７Ｖ＋Ｑ３７Ｅ＋Ｄ４１Ｒ＋Ｌ５２Ｆ＋Ｇ５７Ｅ＋Ｍ６３Ｒ＋Ｉ７６Ｖ＋Ｓ９４Ｒ＋Ｇ９８Ｅ＋Ａ１０８Ｖ＋Ｓ１４６Ｅ＋Ｑ１４９Ｒ＋Ｃ１７３Ｇ＋Ｍ１８４Ｔ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｋ２０９Ｈ＋Ｆ２５９Ｅ＋Ｑ２６１Ｒ＋Ｋ２６５Ｇ＋Ｇ２８４Ｌ＋Ｅ２８９Ａ＋Ｒ３２５Ｖ＋Ｅ３２８Ｎ＋Ｒ３５１Ｋを有する、請求項５に記載の方法。
配列番号１に記載の全長アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）配列番号１と比較して、Ａ１７Ｖ＋Ｌ５２Ｆ＋Ｇ５７Ｅ＋Ｍ６３Ｒ＋Ａ１０８Ｖ＋Ｋ１４７Ｒ＋Ｃ１７３Ｇ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｍ２１０Ｑ＋Ｒ３２５Ｖ＋Ｅ３２８Ｋ＋Ｎ３４５Ｅ＋Ｒ３５１Ｋの置換の組み合わせを有する、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）。
配列番号１と比較して、Ａ１７Ｖ＋Ｑ３７Ｅ＋Ｄ４１Ｒ＋Ｌ５２Ｆ＋Ｇ５７Ｅ＋Ｍ６３Ｒ＋Ｓ９４Ｒ＋Ｇ９８Ｅ＋Ａ１０８Ｖ＋Ｓ１４６Ｅ＋Ｋ１４７Ｒ＋Ｑ１４９Ｒ＋Ｃ１７３Ｇ＋Ｍ１８４Ｔ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｋ２０９Ｈ＋Ｍ２１０Ｑ＋Ｇ２８４Ｌ＋Ｅ２８９Ａ＋Ｒ３２５Ｖ＋Ｅ３２８Ｋ＋Ｎ３４５Ｅ＋Ｒ３５１Ｋの置換の組み合わせを含む、請求項７に記載のＴｄＴ。
配列番号１に記載の全長アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）配列番号１と比較して、Ａ１７Ｖ＋Ｌ５２Ｆ＋Ｇ５７Ｅ＋Ｍ６３Ｒ＋Ｉ７６Ｖ＋Ａ１０８Ｖ＋Ｃ１７３Ｇ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｆ２５９Ｅ＋Ｑ２６１Ｒ＋Ｋ２６５Ｇ＋Ｒ３２５Ｖ＋Ｅ３２８Ｎ＋Ｒ３５１Ｋの置換の組み合わせを有する、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）。
配列番号１と比較して、Ａ１７Ｖ＋Ｑ３７Ｅ＋Ｄ４１Ｒ＋Ｌ５２Ｆ＋Ｇ５７Ｅ＋Ｍ６３Ｒ＋Ｉ７６Ｖ＋Ｓ９４Ｒ＋Ｇ９８Ｅ＋Ａ１０８Ｖ＋Ｓ１４６Ｅ＋Ｑ１４９Ｒ＋Ｃ１７３Ｇ＋Ｍ１８４Ｔ＋Ｒ２０７Ｌ＋Ｋ２０９Ｈ＋Ｆ２５９Ｅ＋Ｑ２６１Ｒ＋Ｋ２６５Ｇ＋Ｇ２８４Ｌ＋Ｅ２８９Ａ＋Ｒ３２５Ｖ＋Ｅ３２８Ｎ＋Ｒ３５１Ｋの置換の組み合わせを含む、請求項９に記載のＴｄＴ。
所定の配列を有するポリヌクレオチドを合成する方法を実施するためのキットであって、
－請求項７又は８に記載の第１のＴｄＴバリアント、
－請求項９又は１０に記載の第２のＴｄＴバリアント、及び
－３’－Ｏ－ブロックヌクレオシド三リン酸の第１セットと第２セットであって、前記ｄＮＴＰは重複してない、該第１セットと第２セット
を含む、キット。
ｄＮＴＰの第１のセットが、３’－Ｏ－ブロックデオキシアデノシン三リン酸、３’－Ｏ－ブロックデオキシシチジン三リン酸、及び３’－Ｏ－ブロックデオキシチミジン三リン酸を含み、第２のセットが、３’－Ｏ－ブロックデオキシグアノシン三リン酸を含む、請求項１１に記載のキット。