JP2022137127A - polXファミリーDNAポリメラーゼのバリアント - Google Patents
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Abstract
Description
本文書において、アミノ酸は、次の命名法による1文字または3文字のコード:A:Ala(アラニン)、R:Arg(アルギニン)、N:Asn(アスパラギン)、D:Asp(アスパラギン酸)、C:Cys(システイン)、Q:Gln(グルタミン)、E:Glu(グルタミン酸)、G:Gly(グリシン)、H:His(ヒスチジン)、I:Ile(イソロイシン)、L:Leu(ロイシン)、K:Lys(リシン)、M:Met(メチオニン)、F:Phe(フェニルアラニン)、P:Pro(プロリン)、S:Ser(セリン)、T:Thr(スレオニン)、W:Trp(トリプトファン)、Y:Tyr(チロシン)、V:Val(バリン)によって表される。
ithおよびWaterman(1981年)(Ad. App. Math.、2巻:482頁)の局所相同性アルゴリズムを用いて、NeddlemanおよびWunsch(1970年)(J. Mol. Biol.、48巻:443頁)の局所相同性アルゴリズムを用いて、PearsonおよびLipman(1988年)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85巻:2444頁)の類似性検索法を用いて、これらのアルゴリズムを使用したコンピュータソフトウェア(Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WI)のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)を用いて、Mutalinオンラインアラインメントソフトウェア(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html、1988年、Nucl. Acids Res.、16巻(22号)、10881~10890頁)を用いて、達成することができる。2つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性百分率は、これらの最適にアラインメントされた2つの配列を、これら2つの配列間の最適なアラインメントのための参照配列に対する付加または欠失が、比較される核酸またはアミノ酸配列の領域に含まれ得る比較ウィンドウによって比較することにより、決定される。同一性百分率は、2つの配列間で同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一位置数を決定し、この同一位置数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、得られた結果に100を乗じて、これら2つの配列間の同一性百分率を得ることにより計算される。
で周知である種々の技術によって得ることができる。特に、野生型タンパク質をコードするDNA配列を修飾するための例示的な技術としては、定方向変異誘発、ランダム変異誘発、および合成オリゴヌクレオチドの構築が挙げられるが、これらに限定されない。
ファミリーDNAポリメラーゼのバリアント、またはそのようなポリメラーゼの機能的断片のバリアントであって、前記バリアントが、T331、G332、G333、F334、R336、K338、H342、D343、V344、D345、F346、A397、D399、D434、V436、A446、L447、L448、G449、W450、G452、R454、Q455、F456、E457、R458、R461、N474、E491、D501、Y502、I503、P505、R508、N509、およびA510からなる群より選択される少なくとも1つの位置における残基または機能的に同等な残基の少なくとも1つの変異を含み、示された位置は配列番号1の配列とのアラインメントにより、またはそれを参照して決定される、バリアントに関する。
R454、E457からなる群より選択される少なくとも1つの位置における残基または機能的に同等な残基の少なくとも1つの変異を含み、示された位置は配列番号1とのアラインメントにより決定される。
X1は、M、I、V、Lから選択される残基を表し、
X2は、T、A、M、Qから選択される残基を表し、
X3は、M、K、E、Q、L、S、P、R、Dから選択される残基を表し、
X4は、T、I、M、F、K、V、Y、E、Q、H、S、R、Dから選択される残基を表す)
の少なくとも半保存領域における残基の少なくとも1つの変異をさらに含む。
X1は、A、C、G、Sから選択される残基を表し、
X2は、L、T、Rから選択される残基を表し、
X3は、W、Yから選択される残基を表し、
X4は、T、S、Iから選択される残基を表し、
X5は、Q、L、H、F、Y、N、E、D、またはφから選択される残基を表し、
X6は、F、Yから選択される残基を表す)
の少なくとも1つの半保存領域における残基の少なくとも1つの変異をさらに含む。
X1は、D、E、S、P、A、Kから選択される残基を表し、
X2は、I、L、M、V、A、Tから選択される残基を表し、
X3は、E、Q、P、Y、L、K、G、Nから選択される残基を表し、
X4は、W、S、V、E、R、Q、T、C、K、Hから選択される残基を表し、
X5は、E、Q、D、H、Lから選択される残基を表す)
の少なくとも1つの半保存領域における残基の少なくとも1つの変異をさらに含む。
びN509からなる群より選択される少なくとも1つの位置における残基または機能的に同等な残基の置換、優先的には、R336、A397、R454、E457、N474、D501、Y502、およびI503からなる群より選択される少なくとも1つの位置における残基または機能的に同等な残基の置換、より優先的には、R336、R454、E457からなる群より選択される少なくとも1つの位置における残基または機能的に同等な残基の少なくとも1つの置換を含み、示された位置は配列番号1とのアラインメントにより決定される。
は複数の連続したアミノ酸残基の欠失を有し得る。これらの欠失は、とりわけ、他のタンパク質との結合に関与し、かつ/または細胞局在に関与する、1つまたは複数の酵素ドメインを標的とし得る。例えば、TdTポリペプチド配列は、Ku70/80などの他のタンパク質との相互作用のためのN末端BRCTドメイン、および核局在化ドメイン(NLS)を含む。
、哺乳動物細胞、もしくは植物細胞などの高等真核生物であってもよい。細胞は、哺乳動物細胞、例えばCOS(ミドリザル細胞株)(例えば、COS 1(ATCC CRL-1650)、COS 7(ATCC CRL-1651)、CHO(US4,889,803;US5,047,335、CHO-K1(ATCC CCL-61))、マウス細胞、およびヒト細胞であってもよい。特定の実施形態では、細胞は、非ヒトかつ非胚性である。ベクターは、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、YAC、BAC、Agrobacterium pTiプラスミドなどであり得る。ベクターは、好ましくは、複製起点、多重クローニング部位、および選択可能な遺伝子から選択される1つまたは複数のエレメントを含み得る。好ましい実施形態では、ベクターはプラスミドである。原核生物ベクターのいくつかの非包括的な例は、次のとおりである:pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、ファージスクリプト、psiX174、pブルースクリプト(pbluescript)SK、pbsks、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A(Stratagene);ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pBR322、およびpRIT5(Pharmacia)、pET(Novagen)。真核生物ベクターのいくつかの非包括的な例は、次のとおりである:pWLNEO、pSV2CAT、pPICZ、pcDNA3.1(+)Hyg(Invitrogen)、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene);pSVK3、pBPV、pCI-neo(Stratagene)、pMSG、pSVL(Pharmacia);およびpQE-30(QLAexpress)。ウイルスベクターとしては、アデノウイルス、AAV、HSV、レンチウイルスなどを挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくは、発現ベクターはプラスミドまたはウイルスベクターである。
ク質を産生するための方法は、当業者には周知である。例えば、E.coliにおける産生に関しては、US5,004,689、EP446582、Wangら(Sci. Sin. B、24巻:1076~1084頁、1994年、およびNature、295巻、503頁)、哺乳動物細胞における産生に関してはJAMESら(Protein Science(1996年)、5巻:331~340頁)に記載されている、特定の方法を挙げることができる。
産生株の生成
その構築が[Bouleら、1998年、Mol. Biotechnol.、10巻、199~208頁]に記述されているプラスミドpET28bから、切断型マウスTdT遺伝子を生成した。次のプライマー:
ベクターpET32-配列番号3を出発ベクターとして使用した。点変異を含むプライマー(またはそれらが十分に近ければ、ある特定の場合では複数の点変異)を、Agilentのオンラインツール:(http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp)から生成した。
カナマイシンおよびクロラムフェニコールを適量添加した50mLのLB培地を含む250mLのエルレンマイヤーフラスコ内で、Ec-配列番号3およびEc-DSx細胞を前培養した。この培養物を振盪しながら37℃で一晩インキュベートした。次にこの前培養物を使用して、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを適量補充した2LのLB培地を含む5Lのエルレンマイヤーフラスコに播種した。初期の光学密度(OD)は0.01であった。この培養物を振盪しながら37℃でインキュベートした。ODが0.6から0.9の間の値に達するまでこれを定期的に測定した。この値に達したら、1mLの1Mイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドを培養培地に添加した。この培養物を翌日まで再度37℃でインキュベートした。次に、5000rpmを超えずに遠心分離によって細胞を収集した。得られた種々のペレットを、溶解バッファー(20mMトリス-HCl、pH8.3、0.5M NaCl)を用いた洗浄中に単一のペレットに組み合わせた。細胞ペレットを-20℃で冷凍した。細胞ペレットはこのようにして数か月間保存することができる。
先のステップ中に冷凍した細胞ペレットを25~37℃の水浴中で解凍した。完全に解凍されたら、約100mLの溶解バッファーにこれを再懸濁した。再懸濁は、非常に均質な溶液をもたらし、特に凝集物が全く存在しないことが必要であるため、特に注意した。このように再懸濁した細胞を、14000psiの圧力下でフレンチプレスを使用して溶解した。収集したライセートを、10000gで1時間~1時間30分にわたり高速で遠
心分離した。遠心分離物を0.2μMフィルタで濾過し、十分な容積の管に収集した。
TdTをアフィニティカラムで精製した。5mLのHis-Trap Crudeカラム(GE Life Sciences)を蠕動ポンプ(MINIPULS(登録商標)Evolution、Gilson)と共に使用した。まず、2~3CV(カラム容積)の溶解バッファーを使用してカラムを平衡化した。次に、先のステップの遠心分離物を約0.5~5mL/分の速度でカラムにロードした。遠心分離物の全体をロードしたら、3CVの溶解バッファーおよび3CVの洗浄バッファー(20mMトリス-HCl、pH8.3、0.5M NaCl、60mMイミダゾール)でカラムを洗浄した。このステップの最後に、約0.5~1ml/分で総容積3CVにわたり溶出バッファー(20mMトリス-HCl、pH8.3、0.5M NaCl、1Mイミダゾール)をカラムに注入した。溶出段階全体を通して、カラム出力を1mLの画分に収集した。これらの画分をSDS-PAGEにより分析して、どの画分が溶出ピークを含むかを決定した。決定されたら、これらを単一の画分に組み合わせ、透析バッファー(20mMトリス-HCl、pH6.8、200mM NaCl、50mM MgOAc、100mM [NH4]2SO4)に対して透析した。次にTdTを5~15mg/mLの最終濃度まで濃縮した(Amicon Ultra-30 Centrifugal Filters、Merk Millipore)。濃縮されたTdTに50%グリセロールを添加した後、長期間保存のため-20℃で冷凍した。精製段階全体を通して、SDS-PAGEゲル分析のために種々の試料のアリコート(約5μL)を収集した。分析の結果を図1に提示する。
Mutalinオンラインアラインメントソフトウェア(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html、アクセス日:2016年4月4日)を使用し、PolXファミリーの種々のDNAポリメラーゼのアラインメントを行った。
本発明による様々なバリアントの活性を、以下の試験によって決定した。結果を、各バリアントが由来する天然酵素で得られたものと比較した。
活性試験
先の活性試験の分析のために、16%変性ポリアクリルアミドゲル(Biorad)を使用した。ゲルは事前に注ぎ、放置して重合させた。これを次に、TBEバッファー(Sigma)で満たした好適なサイズの電気泳動槽に載置した。種々の試料を前処理せずにゲルに直接ロードした。
出モードを予め設定したTyphoon機器(GE Life Sciences)を使用して行った可視化のため、蛍光スクリーン(Amersham)を10~60分間使用した。
使用した2つの酵素の比較結果を図3に提示する。
第1の群のバリアント(DS7~DS34の列)は、約50%の取り込みが可能である。第2の群のバリアント(DS46~DS73の列)は、95%超、場合によっては98%超の取り込みが可能である。
第3の群のバリアント(DS83~DS106の列)は、60~80%の取り込みが可能である。
第1の群のバリアント(DS7~DS34の列)は、約5~10%の取り込みが可能である。
第2の群のバリアント(DS46~DS73の列)は、30%超、場合によっては40%超の取り込みが可能である。
第3の群のバリアント(DS83~DS106の列)は、10~25%の取り込みが可能である。
先行する実施例1に従い、R336N-R454A-E457Nの置換の組合せを有する変異体(DS124)を生成し、産生した。
活性試験では、酵素をONH2修飾ヌクレオチドの存在下におき、種々の長さの時間にわたって37℃でインキュベートする。反応を停止させてDS124の取り込み動態を観察し、これを天然のWT酵素(配列番号3)の動態と比較する。
実施例3に記載したプロトコールに従い、ポリアクリルアミドゲル中の種々の試料の泳動により、活性試験の分析を行う。
2つの酵素(DS124およびWT)の比較結果を図4に提示する。
この活性試験では、天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドの高度に濃縮された混合物と、様々なバリアントを合わせた。インキュベーション時間を短縮するため、また定量的な添加を達成するため(実施例4参照)、酵素濃度も増加させる。
積の大きい基である。この混合物は、90%のONH2-dGTP修飾ヌクレオチドおよび10%の天然dGTPヌクレオチドからなる。
実施例3に記載したプロトコールに従い、ポリアクリルアミドゲル中の種々の試料の泳動により、活性試験の分析を行った。
使用した酵素の比較結果を図5に提示する。
de sur-addition)が観察される。このバンドの強度は、ヌクレオチド混合物中に存在する天然ヌクレオチドの割合に対応する。
実施例1に従い、R336N-R454A-E457Gの置換の組合せを有するTdTのバリアント(DS125)を生成し、産生した。
合成
実施例3に記載したプロトコールに従い、ポリアクリルアミドゲル中の種々の試料の泳動により、活性試験の分析を行う。
この合成の結果を図6に提示する。
Claims (24)
- 鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成することができるpolXファミリーDNAポリメラーゼまたはそのようなポリメラーゼの機能的断片のバリアントであって、前記バリアントが、E457、T331、G332、G333、F334、R336、K338、H342、D343、V344、D345、F346、A397、D399、D434、V436、A446、L447、L448、G449、W450、G452、R454、Q455、F456、R458、R461、N474、E491、D501、Y502、I503、P505、R508、N509、およびA510からなる群より選択される少なくとも1つの位置における残基または機能的に同等な残基の少なくとも1つの変異を含み、示された位置は配列番号1とのアラインメントにより決定される、バリアント。
- DNA鎖および/またはRNA鎖を合成することができる、請求項1に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアント。
- Pol IV、Pol μ、または末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)のバリアントである、請求項1または2に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアント。
- 配列番号1の配列と少なくとも60%の同一性、優先的には配列番号1の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有する、前記請求項の一項に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアント。
- 少なくとも1つの変異が、1つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、または付加からなる、前記請求項の一項に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアント。
- 前記バリアントが、T331、G332、G333、F334、R336、D343、L447、L448、G449、W450、G452、R454、Q455、E457、R461、およびR508からなる群より選択される少なくとも1つの位置における残基または機能的に同等な残基の少なくとも1つの変異、優先的には、R336、R454、およびE457からなる群より選択される少なくとも1つの位置における残基または機能的に同等な残基の少なくとも1つの変異を含み、示された位置は配列番号1とのアラインメントにより決定される、前記請求項の一項に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアント。
- R336、R454、およびE457からなる群より選択される少なくとも2つの位置における残基の少なくとも1つの変異、優先的には、前記3つの位置R336、R454、およびE457における残基の変異を含む、前記請求項の一項に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアント。
- 配列
(i)X1X2GGFR1R2GKX3X4(配列番号4)
(式中、
X1は、M、I、V、Lから選択される残基を表し、
X2は、T、A、M、Qから選択される残基を表し、
X3は、M、K、E、Q、L、S、P、R、Dから選択される残基を表し、
X4は、T、I、M、F、K、V、Y、E、Q、H、S、R、Dから選択される残基を表す)、
(ii)X1X2LGX3X4GSR1X5X6ER2(配列番号5)
(式中、
X1は、A、C、G、Sから選択される残基を表し、
X2は、L、T、Rから選択される残基を表し、
X3は、W、Yから選択される残基を表し、
X4は、T、S、Iから選択される残基を表し、
X5は、Q、L、H、F、Y、N、E、D、またはφから選択される残基を表し、
X6は、F、Yから選択される残基を表す)、
(iii)LX1YX2X3PX4X5RNA(配列番号6)
(X1は、D、E、S、P、A、Kから選択される残基を表し、
X2は、I、L、M、V、A、Tから選択される残基を表し、
X3は、E、Q、P、Y、L、K、G、Nから選択される残基を表し、
X4は、W、S、V、E、R、Q、T、C、K、Hから選択される残基を表し、
X5は、E、Q、D、H、Lから選択される残基を表す)
の少なくとも1つの半保存領域における残基の少なくとも1つの変異を有する、前記請求項の一項に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアント。 - - 配列番号4の配列の前記半保存領域の少なくとも1つの位置R1、R2、および/またはKにおける残基の少なくとも1つの置換、ならびに/または
- 配列番号5の配列の前記半保存領域の少なくとも1つの位置S、R1、および/またはEにおける残基の少なくとも1つの置換、ならびに/または
- 配列番号6の配列の前記半保存領域のX1位における残基の欠失ならびに/またはR位および/もしくはN位における少なくとも1つの置換
を有する、請求項8に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアント。 - 前記バリアントが、R336、K338、H342、A397、S453、R454、E457、R461、N474、D501、Y502、I503、R508、およびN509からなる群より選択される少なくとも1つの位置における残基または機能的に同等な残基の置換、優先的には、R336、A397、R454、E457、R461、N474、D501、Y502、およびI503からなる群より選択される少なくとも1つの位置における残基または機能的に同等な残基の置換、より優先的には、R336、R454、およびE457からなる群より選択される少なくとも1つの位置における残基または機能的に同等な残基の置換、さらにより優先的には、E457位における残基または機能的に同等な残基の少なくとも1つの置換を含み、示された位置は配列番号1とのアラインメントにより決定される、前記請求項の一項に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアント。
- R336位、K338位、H342位、A397位、S453位、R454位、E457位、R461位、N474位、D501位、Y502位、I503位、R508位、およびN509位における前記置換が、R336K/H/N/G/D、K338A/C/G/S/T/N、H342A/C/G/S/T.N、A397R/H/K/D/E、S453A/C/G/S/T、R454F/Y/W/A、E457G/N/S/T、N474S/T/N/Q、D501A/G/X、Y502A/G/X、I503A/G/X、R508A/C/G/S/T、N509A/C/G/S/Tからなる群より選択される、請求項10に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアント。
- 前記バリアントが、表1に列挙される置換、欠失、置換および/または欠失の組合せを含むかまたは有し、示された位置は配列番号1とのアラインメントにより決定される、前記請求項の一項に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアント。
- 前記バリアントが、配列番号1の配列のTdTのバリアントであり、C378位からL406位の間の残基または機能的に同等な残基の、配列番号2の配列のポリメラーゼPolμの残基H363~C390または機能的に同等な残基による置換をさらに含む、前記請求項の一項に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアント。
- 前記バリアントが、R336G-E457N、R336N-E457N、R336N-R454A-E457N、R336N-E457N、R336N-R454A-E457G、R336N-E457G、R336G-R454A-E457N、R336G-E457Nから選択される置換の組合せを含み、示された位置は配列番号1とのアラインメントにより決定される、前記請求項の一項に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアント。
- 請求項1から14の一項に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアントをコードする核酸。
- 請求項15に記載の核酸のための発現カセット。
- 請求項15に記載の核酸または請求項16に記載の発現カセットを含むベクター。
- 請求項15に記載の核酸、または請求項16に記載の発現カセット、または請求項17に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項1から14のいずれか一項に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアントを産生するための、請求項15に記載の核酸、請求項16に記載の発現カセット、請求項17に記載のベクター、または請求項18に記載の細胞の使用。
- 請求項1から14のいずれか一項に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアントを産生するためのプロセスであって、前記バリアントをコードする核酸の発現を可能にする培養条件下で請求項18に記載の宿主細胞を培養し、任意選択で、そのように発現した前記バリアントを培養培地または前記宿主細胞から回収する、プロセス。
- 3’-OH修飾ヌクレオチドから鋳型鎖を用いずに核酸分子を合成するための、請求項1から14のいずれか一項に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアントの使用。
- DNA鎖またはRNA鎖を合成するための、請求項21に記載の使用。
- 請求項1から14のいずれか一項に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼのバリアントの存在下で、少なくとも1つのヌクレオチド、優先的には3’-OH修飾ヌクレオチドにプライマー鎖を接触させる、鋳型鎖を用いない核酸分子の酵素的合成のためのプロセス。
- 請求項1から14のいずれか一項に記載のpolXファミリーDNAポリメラーゼの少なくとも1つのバリアントと、ヌクレオチド、優先的には3’-OH修飾ヌクレオチドと、任意選択で少なくとも1つのヌクレオチドプライマーとを含む、鋳型鎖を用いない核酸分子の酵素的合成のためのキット。
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