ES2604329T3 - Enzimas que tienen actividad de alfa amilasa y métodos de uso de las mismas - Google Patents

Enzimas que tienen actividad de alfa amilasa y métodos de uso de las mismas Download PDF

Info

Publication number
ES2604329T3
ES2604329T3 ES10184415.7T ES10184415T ES2604329T3 ES 2604329 T3 ES2604329 T3 ES 2604329T3 ES 10184415 T ES10184415 T ES 10184415T ES 2604329 T3 ES2604329 T3 ES 2604329T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sequences
polypeptides
group
pcr
acid sequences
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES10184415.7T
Other languages
English (en)
Inventor
Walter Callen
Toby Richardson
Gerhard Frey
Jay M. Short
Janne S. Kerovuo
Eric J. Mathur
Matgorzata Slupska
Kevin Gray
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Enzymes LLC
Original Assignee
BASF Enzymes LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF Enzymes LLC filed Critical BASF Enzymes LLC
Application granted granted Critical
Publication of ES2604329T3 publication Critical patent/ES2604329T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/042—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01001—Alpha-amylase (3.2.1.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Cereal-Derived Products (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Paper (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Alcoholic Beverages (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
  • Jellies, Jams, And Syrups (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

Un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que comprende: (A) (i) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene actividad de alfa amilasa, en la que dicha secuencia tiene por lo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 77 o fragmentos enzimáticamente activos de la misma, en la que el fragmento tiene actividad de alfa amilasa, o (ii) la secuencia de (i), en la que se determina la identidad de secuencia mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencia, o se determina mediante inspección visual, o (iii) la secuencia de (ii), en la que el algoritmo de comparación de secuencia comprende un algoritmo 3.0t78 de versión FASTA con parámetros predeterminados; (B) un ácido nucleico que comprende (i) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene actividad de alfa amilasa, en la que la secuencia de aminoácidos del polipéptido tiene por lo menos 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 78 o fragmentos enzimáticamente activos de la misma, en la que el fragmento tiene actividad de alfa amilasa, o (ii) la secuencia de (i), en la que se determina la identidad de secuencia mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencia, o se determina mediante inspección visual, o (iii) la secuencia de (ii), en la que el algoritmo de comparación de secuencia comprende un algoritmo 3.Ot78 de versión FASTA con parámetros predeterminados; (C) un ácido nucleico que comprende una secuencia de cualquiera de (A) a (B) que codifica un polipéptido que carece de una secuencia de señal; (D) un ácido nucleico que comprende: (i) una secuencia de cualquiera de (A) a (C) que codifica un polipéptido que comprende adicionalmente una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga; (ii) la secuencia de (i), en la que la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga codifica una secuencia de señal; (iii) la secuencia de (ii), en la que la secuencia de señal heteróloga comprende una secuencia de señal de amilasa; o (E) una secuencia de ácidos nucleicos completamente complementaria a cualquier secuencia de ácidos nucleicos de (A) a (D).

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
imagen6
imagen7
imagen8
imagen9
imagen10
imagen11
imagen12
imagen13
imagen14
imagen15
imagen16
imagen17
imagen18
imagen19
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
A/C/T, A C/G, o E, donde E es cualquier base que no es A, C, G, o T (E se puede denominar como un oligo diseñador).
En un sentido general, la mutagénesis de saturación se compone de mutagénesis de un grupo completo de casetes mutagénicos (en la que cada casete tiene preferiblemente aproximadamente 1 a 500 bases de longitud) en la secuencia de polinucleótidos definida que se va a mutagenizar (en la que la secuencia que se va a mutagenizar tiene preferiblemente de aproximadamente 15 a 100,000 bases de longitud). Por lo tanto, un grupo de mutaciones (que varía de 1 a 100 mutaciones) se introduce en cada casete que se va a mutagenizar. Una agrupación de mutaciones que se va a introducir en un casete puede ser diferente o el mismo de una segunda agrupación de mutaciones que se va a introducir en un segundo casete durante la aplicación de una ronda de mutagénesis de saturación. Dichas agrupaciones se ejemplifican por supresiones, adiciones, agrupaciones de codones particulares y agrupaciones de casetes de nucleótidos particulares.
Las secuencias definidas que se van a mutagenizar incluyen un gen completo, ruta, cADN, un marco de lectura abierta completo (ORF), y promotor completo, potenciador, represor/transactivador, origen de replicación, intrón, operador, o cualquier grupo funcional de polinucleótido. En general, unas "secuencias definidas" para este propósito pueden ser cualquier polinucleótido de una secuencia de polinucleótidos de 15 bases, y secuencias de polinucleótidos de longitudes entre 15 bases y 15,000 bases (esta divulgación específicamente nombra cada entero entre ellos). Consideraciones en la elección de agrupaciones de codones incluyen tipos de aminoácidos codificados por un casete mutagénico degenerado.
En una ejemplificación particularmente preferida una agrupación de mutaciones se puede introducir en un casete mutagénico, esta divulgación se proporciona específicamente para sustituciones de codones degenerados (utilizando oligos degenerados) que codifican 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, y 20 aminoácidos en cada posición, y una colección de polipéptidos codificados por los mismos.
Un aspecto de la invención es un ácido nucleico aislado que comprende una de las secuencias de secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, las secuencias complementarias de las mismas, o un fragmento que comprende por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, o 500 bases consecutivas de una de las secuencias de una secuencia de ácidos nucleicos del Grupo A (o las secuencias complementarias de las mismas). Los ácidos nucleicos aislados, pueden comprender ADN, que incluyen cADN, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser de cadena doble o de cadena sencilla, y si es de cadena sencilla puede ser la cadena codificante o cadena no codificante (antisentido). Alternativamente, los ácidos nucleicos aislados pueden comprender ARN.
Como se discute en más detalle a continuación, los ácidos nucleicos aislados de una de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, se pueden utilizar para preparar uno de los polipéptidos de una secuencia de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, o fragmentos enzimáticamente activos de uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas.
De acuerdo con lo anterior, otro aspecto de la invención es un ácido nucleico aislado que codifica uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas,
o fragmentos enzimáticamente activos de uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B. Las secuencias de codificación de estos ácidos nucleicos pueden ser idénticas a una de las secuencias de codificación de uno de los ácidos nucleicos de secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, o un fragmento del mismo o pueden ser diferentes secuencias de codificación que codifican uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, y fragmentos enzimáticamente activos de uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, como resultado de la redundancia
o degeneración del código genético. El código genético es bien conocido por aquellos expertos en la técnica y se puede obtener, por ejemplo, en la página 214 de B. Lewin, Genes VI, Oxford University Press, 1997.
El ácido nucleico aislado que codifica uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, puede incluir, pero no se limita a: sólo la secuencia de codificación de una de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas y secuencias de codificación adicionales, tales como secuencias líder o secuencias de proproteína y secuencias sin sentido, tales como intrones o secuencias no codificantes 5 'y/o 3' de la secuencia de codificación. Por lo tanto, como se utiliza aquí, el término "polinucleótido que codifica un polipéptido" abarca un polinucleótido que incluye sólo la secuencia de codificación del polipéptido así como un polinucleótido que incluye secuencia de codificación adicional y/o secuencia de no codificación.
Alternativamente, las secuencias de ácidos nucleicos de secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, se pueden mutagenizar utilizando técnicas convencionales, tales como mutagénesis dirigida a sitio u otras técnicas familiares para aquellos expertos en la técnica, para introducir cambios silenciosos en los polinucleótidos de secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, y secuencias sustancialmente
21
imagen20
imagen21
imagen22
imagen23
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia). Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro vector siempre que sea replicable y viable en la célula anfitriona.
La célula anfitriona puede ser cualquiera de las células anfitrionas familiares para aquellos expertos en la técnica, que incluyen células procariotas, células eucariotas, células de mamífero, células de insecto, o células de plantas. Como ejemplos representativos de anfitriones apropiados, se pueden mencionar: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus, células fúngicas, tales como levaduras, células de insectos tales como Drosophila S2 y Espodóptera Sf9, células de animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes y adenovirus. La selección de un anfitrión apropiado está dentro de las capacidades de aquellos expertos en la técnica.
Se puede introducir el vector en células anfitrionas utilizando cualquiera de una variedad de técnicas, que incluyen transformación, transfección, transducción, infección viral, pistolas de genes o transferencia de genes mediada por Ti. Métodos particulares incluyen transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Cuando sea apropiado, las células anfitrionas manipuladas por ingeniería se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de la invención. Luego de transformación de una cepa anfitriona adecuada y el crecimiento de la cepa anfitriona hasta una densidad celular apropiada, se puede inducir el promotor seleccionado por medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células se pueden cultivar durante un período adicional para que puedan producir el polipéptido o fragmento deseado del mismo.
Las células se recogen normalmente mediante centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante se retiene para una purificación adicional. Las células microbianas empleadas para la expresión de proteínas se pueden romper mediante cualquier método conveniente, que incluyen ciclos de congelacióndescongelación, sonicación, rotura mecánica o uso de agentes de lisis celular. Dichos métodos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. El polipéptido o fragmento expresado del mismo se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes por métodos que incluyen precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Se pueden utilizar etapas de replegamiento de proteína, según sea necesario, para completar la configuración del polipéptido. Si se desea, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se puede emplear para las etapas finales de purificación.
También se pueden emplear diversos sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar la proteína recombinante. Ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las estirpes COS-7 de fibroblastos de riñón de mono (descritas por Gluzman, Cell, 23: 175, 1981), y otras estirpes celulares capaces de expresar proteínas a partir de un vector compatible, tales como estirpes celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK.
Se pueden utilizar construcciones en células anfitrionas de una manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Dependiendo del anfitrión empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos producidos por las células anfitrionas que contienen el vector pueden estar glicosilados o pueden estar no glicosilados. Los polipéptidos de la invención también pueden o no incluir un residuo inicial del aminoácido metionina.
Alternativamente, los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, o fragmentos que comprenden por lo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 de aminoácidos consecutivos de las mismas se pueden producir sintéticamente mediante sintetizadores de péptidos convencionales. En otras realizaciones, se pueden emplear fragmentos o porciones de polipéptidos para producir el correspondiente polipéptido de longitud completa mediante síntesis de péptidos; por lo tanto, se pueden emplear fragmentos como intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa.
También se pueden emplear sistemas de traducción libres de células para producir uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y las secuencias sustancialmente idénticas de las mismas , o fragmentos que comprenden por lo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de las mismas utilizando mARN transcrito de una construcción de ADN que comprende un promotor ligado operativamente a un ácido nucleico que codifica el polipéptido o fragmento del mismo. En algunas realizaciones, la construcción de ADN puede ser linealizada antes de conducir una reacción de transcripción in vitro. El mARN transcrito luego se incuba con un extracto de traducción libre de células adecuado, tal como un extracto de reticulocitos de conejo, para producir el polipéptido o fragmento deseado del mismo.
La invención también se relaciona con variantes de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, o enzimáticamente activas de las mismas. El término
26 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
"variante" incluye derivados o análogos de estos polipéptidos. En particular, las variantes pueden diferir en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y las secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, por una o más sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos, que pueden estar presentes en cualquier combinación.
Las variantes pueden ser de origen natural o creadas in vitro. En particular, se pueden crear dichas variantes utilizando técnicas de ingeniería genética tales como mutagénesis dirigida a sitio, mutagénesis química aleatoria, procedimientos de supresión con exonucleasa III, y técnicas de clonación estándar. Alternativamente, dichas variantes, fragmentos, análogos, o derivados se pueden crear utilizando procedimientos de síntesis química o de modificación.
Otros métodos de fabricación de variantes también son familiares para aquellos expertos en la técnica. Estos incluyen procedimientos en los que las secuencias de ácidos nucleicos obtenidss a partir de aislados naturales se modifican para generar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen características que mejoran su valor en aplicaciones industriales o de laboratorio. En dichos procedimientos, un gran número de secuencias variantes que tienen una o más diferencias de nucleótidos con respecto a la secuencia obtenida a partir del aislado natural son generados y caracterizados. Normalmente, estas diferencias de nucleótidos dan como resultado cambios de aminoácidos con respecto a los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos de los aislados naturales.
Por ejemplo, se pueden crear las variantes utilizando PCR propensa a error. En la PCR propensa a error, la PCR se realiza bajo condiciones donde es baja la fidelidad de copia del ADN polimerasa, de tal manera que se obtiene una alta tasa de mutaciones de punto a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. La PCR propensa a error se describe en Leung, DW, et al, Technique, 1 :11-15, 1989) and Caldwell, R. C. & Joyce G.F., PCR Methods Applic, 2:28-33, 1992. En pocas palabras, en dichos procedimientos, los ácidos nucleicos que se van a mutagenizar se mezclan con cebadores de PCR, regulador de reacción, MgCl2, MnCl2, polimerasa Taq y una concentración apropiada de dNTPs para lograr una alta tasa de mutación puntual a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. Por ejemplo, la reacción se puede llevar a cabo utilizando 20 fmoles de ácido nucleico que se ha mutagenizado, 30pmole de cada cebador de PCR, un regulador de reacción que comprende KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM (pH 8.3) y 0.01% de gelatina, MgCl2 7 mM, MnCl2 0.5 mM, 5 unidades de polimerasa Taq, dGTP 0.2 mM, dATP 0-2 mM, dCTP 1 mM, y dTTP 1 mM. Se puede realizar PCR durante 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 45°C durante 1 min, y 72°C durante 1 min. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros se pueden variar según sea apropiado. Los ácidos nucleicos mutagenizados se clonan en un vector apropiado y la actividad de los polipéptidos codificados por los se evalúa ácidos nucleicos mutagenizados.
También se pueden crear variantes utilizando mutagénesis dirigida por oligonucleótidos para generar mutaciones específicas del sitio en cualquier ADN clonado de interés. La mutagénesis dirigida a oligonucleótidos se describe en Reidhaar-Olson, J.F. & Sauer, R.T., et al., Science, 241:53-57, 1988. En pocas palabras, en dichos procedimientos se sintetiza una pluralidad de oligonucleótidos de cadena doble que llevan una o más mutaciones que se van a introducir en el ADN clonado y se inserta en el ADN clonado para ser mutagenizada. Los clones que contienen el ADN mutado se recuperan y se evalúan las actividades de los polipéptidos que los codifican.
Otro método para la generación de variantes es PCR de ensamble. El PCR de ensamble implica el ensamble de un producto de PCR a partir de una mezcla de pequeños fragmentos de ADN. Un gran número de diferentes reacciones de PCR se producen en paralelo en el mismo frasco, con los productos de una reacción que ceba los productos de otra reacción. El PCR de ensamble se describe en la Patente Estadounidense No. 5,965,408, presentada el 9 de julio de 1996, titulada "Método de Reensamblaje de ADN mediante Interrupción de Síntesis".
Aún otro método de generación de variantes es mutagénesis de PCR sexual. En la mutagénesis de PCR sexual, se produce recombinación homóloga forzada entre moléculas de ADN de diferentes pero muy relacionadas secuencias de ADN in vitro, como resultado de la fragmentación aleatoria de la molécula de ADN con base en la homología de secuencia, seguido de fijación del filtro de cruce mediante extensión de cebador en una reacción de PCR. La mutagénesis de PCR sexual se describe en Stemmer, WP, PNAS, EE.UU., 91: 10747 a 10751, 1994. En resumen, en este tipo de procedimientos de una pluralidad de ácidos nucleicos que se van a recombinar se digiere con DNasa para generar fragmentos que tienen un tamaño promedio de 50 a 200 nucleótidos. Los fragmentos del tamaño promedio deseado se purifican y se resuspenden en una mezcla de PCR. Se realiza bajo condiciones que facilitan recombinación entre los fragmentos de ácido nucleico. Por ejemplo, se puede realizar PCR al resuspender los fragmentos purificados a una concentración de 10-30 ng/: 1 en una solución de 0.2 mM de cada dNTP, MgC12 2.2 mM, KCl 50 mM, Tris HCl10 mM, pH 9.0, y 0,1% de Triton X-100. Se agregan 2.5 unidades de polimerasa Taq por
100: 1 de mezcla de reacción y se realiza PCR utilizando el siguiente régimen: 94°C durante 60 segundos, 94°C durante 30 segundos, 50 a 55°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos (30-45 veces) y 72°C durante 5 minutos. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros se pueden variar según sea apropiado. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos pueden estar incluidos en las reacciones de PCR. En otras realizaciones, se puede utilizar el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I en un primer grupo de reacciones de PCR y se puede utilizar polimerasa Taq en un grupo posterior de reacciones de PCR. Se aíslan las secuencias recombinantes y se evalúan las actividades de los polipéptidos que se van a codificar.
27
imagen24
imagen25
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, o fragmento de la misma. Después de un lavado para eliminar las proteínas unidas no específicamente, se eluyen los polipéptidos unidos específicamente.
La capacidad de las proteínas en una muestra biológica de unirse al anticuerpo se puede determinar utilizando cualquiera de una variedad de procedimientos familiares para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la unión se puede determinar al marcar el anticuerpo con un marcador detectable tal como un agente fluorescente, un marcador enzimático, o un radioisótopo. Alternativamente, se puede detectar la unión del anticuerpo a la muestra utilizando un anticuerpo secundario que tiene dicha una etiqueta detectable sobre el mismo. Los ensayos particulares incluyen ensayos de ELISA, ensayos tipo sándwich, radioinmunoensayos, y transferencias Western.
Los anticuerpos policlonales generados contra los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, o fragmentos enzimáticamente activos de las mismas se pueden obtener mediante inyección directa de los polipéptidos en un animal o al administrar los polipéptidos a un animal, por ejemplo, un no humano. El anticuerpo obtenido de esa manera luego se unirá al polipéptido en sí mismo. De esta manera, se puede utilizar incluso una secuencia que codifica solo un fragmento del polipéptido para generar anticuerpos que pueden unirse a todo el polipéptido nativo. Dichos anticuerpos se pueden utilizar luego para aislar el polipéptido a partir de células que expresan ese polipéptido.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede utilizar cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de estirpes celulares. Ejemplos incluyen técnica del hibridoma (Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497, 1975, y la técnica de hibridoma de células B humanas (Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96.
Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente estadounidense No. 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla a los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, o fragmentos enzimáticamente activos de las mismas. Alternativamente, se pueden utilizar ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados a estos polipéptidos o fragmentos de los mismos.
Los anticuerpos generados contra los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, o fragmentos enzimáticamente activos de las mismas se pueden utilizar en el cribado de polipéptidos similares de otros organismos y muestras. En dichas técnicas, los polipéptidos del organismo se ponen en contacto con el anticuerpo y se detectan aquellos polipéptidos que se unen específicamente al anticuerpo. Se puede utilizar cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente para detectar la unión de anticuerpos. Uno de dichos ensayos de cribado se describe en "Methods for Measuring Cellulase Activities", Methods in Enzymology, Vol 160, pp. 87-116.
Como se utiliza aquí, el término "secuencia de ácidos nucleicos como se estable en las SEQ ID Nos.: abarca las secuencias de nucleótidos de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, así como secuencias homólogas a secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y fragmentos de las mismas y secuencias complementarias a todas las secuencias anteriores. los fragmentos incluyen porciones de las SEQ ID Nos.: que comprende por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, o 500 nucleótidos consecutivos de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas. Las secuencias homólogas y fragmentos de secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, se refieren a una secuencia que tiene por lo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95% de homología con estas secuencias. Se puede determinar la homología utilizando cualquiera de los programas de ordenador y parámetros descritos aquí, que incluyen FASTA versión 3.0t78 con los parámetros predeterminados. Las secuencias homólogas también incluyen secuencias de ARN en la que las uridinas reemplazan las timinas en las secuencias de ácidos nucleicos como se establece en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A. Se pueden obtener secuencias homólogas utilizando cualquiera de los procedimientos descritos aquí o puede resultar de la corrección de un error de secuenciación. Se apreciará que las secuencias de ácidos nucleicos como se establecen en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, se pueden representar en el formato tradicional de carácter individual (Véase la contraportada interior de r, Lubert. Biochemistry, 3rd Ed., W. H Freeman & Co., New York.) o en cualquier otro formato que registra la identidad de los nucleótidos en una secuencia.
Como se utiliza aquí, el término "una secuencia de polipéptidos como se establece en la SEQ ID No: abarca la secuencia de polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, que se codifican por una secuencia como se establece en las SEQ ID Nos: secuencias de polipéptidos homólogas a los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, o fragmentos de cualquiera de las secuencias anteriores. Las secuencias de polipéptidos homóloga se refieren a una secuencia de polipéptidos que tiene por lo menos 99%, 98%, 97% de homología con una de las secuencias de polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B. Se puede determinar la homología utilizando cualquiera de los programas de ordenador y parámetros descritos aquí, que incluyen FASTA versión 3.0t78 con los parámetros predeterminados o con cualesquier parámetros modificados. Se
30
imagen26
imagen27
imagen28
imagen29
imagen30
imagen31
imagen32
imagen33
imagen34
imagen35
imagen36
imagen37
imagen38
imagen39
imagen40
imagen41
imagen42
imagen43
imagen44
imagen45
imagen46
imagen47
estos contaminantes, se utiliza una técnica estéril al hacer 2% de soluciones de almidón rojo y almacenar las cepas ya sea a 4°C o en hielo.
Ejemplo 8
Análisis bioinformático
5 Un análisis bioinformático inicial se hizo con las secuencias de α-amilasa hipertermofílicas conocidas. La figura 14a muestra una alineación de las secuencias, algunas de los cuales se han depositado en la base de datos NCBI. Este análisis reveló el potencial para el diseño de cebadores degenerados para PCR, el gen entero menos su secuencia de señal (véase Figura 14a), produciendo potencialmente alfa amilasas de longitud completa novedosas a partir de una colección.
10 Las siguientes colecciones se cribaron por PCR a partir de ADN genómico:
Tabla 6
Colección #
Nombre Positivo a PCR Subclonado
5
A.lithotropicus No
13
Pyrodictium occultum No
17
Pyrodictium TAG11 No Si
113
Deep sea enrichme Si Si
170
Deep sea enrichme Si Si
198
Archaeglobus No
206
Acidianus sp No
453
Mixed iceland enrich No
455
Mixed iceland enrich Si Si
La Figura 14b muestra una alineación de las secuencias identificadas y la tabla adelante sus porcentajes de identidad relativos.
Tabla 7: % de identidad de secuencias de nucleótidos
SEQ ID NO.: 81
pyro Pyro 2 thermo therm2 SEQ ID NO.: 75 SEQ ID NO.: 77 SEQ ID NO.: 83 SEQ ID NO.: 85 SEQ ID NO.: 79
SEQ ID NO.: 81
100 91.7 75.1 82.1 80.1 82.5 82.6 82.1 82.6 83
pyro
100 100 74.8 82.5 80.5 82 82.2 82.9 82.8 84
Pyro2
100 71.5 71.1 74 74.2 77 77.1 73
therm
100 81.7 83.5 83.8 82.8 83.2 83.8
therm2
100 88.9 88.8 84.1 84.7 84
SEQ ID NO.: 75
100 98.3 84.6 85.2 85.5
53
imagen48
imagen49
imagen50
imagen51
imagen52

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
    imagen3
    imagen4
ES10184415.7T 2001-02-21 2002-02-21 Enzimas que tienen actividad de alfa amilasa y métodos de uso de las mismas Expired - Lifetime ES2604329T3 (es)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27049501P 2001-02-21 2001-02-21
US27049601P 2001-02-21 2001-02-21
US270495P 2001-02-21
US270496P 2001-02-21
US29112201P 2001-05-14 2001-05-14
US291122P 2001-05-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2604329T3 true ES2604329T3 (es) 2017-03-06

Family

ID=27402294

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10184381.1T Expired - Lifetime ES2637501T3 (es) 2001-02-21 2002-02-21 Enzimas que tienen actividad de alfa amilasa y métodos de uso de las mismas
ES10184415.7T Expired - Lifetime ES2604329T3 (es) 2001-02-21 2002-02-21 Enzimas que tienen actividad de alfa amilasa y métodos de uso de las mismas
ES10184478.5T Expired - Lifetime ES2650636T3 (es) 2001-02-21 2002-02-21 Enzimas que tienen actividad de alfa amilasa y métodos de uso de las mismas
ES09171688.6T Expired - Lifetime ES2613277T3 (es) 2001-02-21 2002-02-21 Enzimas que tienen actividad de alfa amilasa y métodos de uso de las mismas.

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10184381.1T Expired - Lifetime ES2637501T3 (es) 2001-02-21 2002-02-21 Enzimas que tienen actividad de alfa amilasa y métodos de uso de las mismas

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10184478.5T Expired - Lifetime ES2650636T3 (es) 2001-02-21 2002-02-21 Enzimas que tienen actividad de alfa amilasa y métodos de uso de las mismas
ES09171688.6T Expired - Lifetime ES2613277T3 (es) 2001-02-21 2002-02-21 Enzimas que tienen actividad de alfa amilasa y métodos de uso de las mismas.

Country Status (16)

Country Link
US (10) US7273740B2 (es)
EP (8) EP2333097B1 (es)
JP (9) JP2004533219A (es)
CN (3) CN101724640B (es)
AT (1) ATE510023T1 (es)
AU (3) AU2002240489C1 (es)
BR (1) BRPI0207770A8 (es)
CA (6) CA2438205C (es)
CY (1) CY1111771T1 (es)
DK (4) DK2169076T3 (es)
ES (4) ES2637501T3 (es)
HK (1) HK1060373A1 (es)
MX (1) MXPA03007527A (es)
PT (1) PT1370674E (es)
WO (2) WO2002068597A2 (es)
ZA (2) ZA200306486B (es)

Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040005673A1 (en) * 2001-06-29 2004-01-08 Kevin Jarrell System for manipulating nucleic acids
DE60042730D1 (de) * 1999-01-05 2009-09-24 Univ Boston Verbessertes klonierungsverfahren
US20030017552A1 (en) * 2000-07-21 2003-01-23 Jarrell Kevin A. Modular vector systems
US7435562B2 (en) 2000-07-21 2008-10-14 Modular Genetics, Inc. Modular vector systems
US7659102B2 (en) 2001-02-21 2010-02-09 Verenium Corporation Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US7560126B2 (en) 2001-02-21 2009-07-14 Verenium Corporation Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
EP2333097B1 (en) 2001-02-21 2017-05-17 BASF Enzymes LLC Enzymes having alpha amylase activity and methods of use thereof
DE10138753B4 (de) * 2001-08-07 2017-07-20 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- und Reinigungsmittel mit Hybrid-Alpha-Amylasen
KR20040029122A (ko) * 2001-08-27 2004-04-03 신젠타 파티서페이션즈 아게 자가-프로세싱 식물 및 식물 부분
WO2004042006A2 (en) 2002-10-31 2004-05-21 Diversa Corporation Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
DK1576152T3 (da) 2002-12-17 2007-04-10 Novozymes As Varmestabile alfa-amylaser
MXPA05009566A (es) * 2003-03-06 2005-12-14 Diversa Corp Amilasas, acidos nucleicos que las codifican, y metodos para hacerlas y usarlas.
AU2015218541A1 (en) * 2003-03-06 2015-10-29 Basf Enzymes Llc Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN104388449A (zh) * 2003-03-06 2015-03-04 维莱尼姆公司 淀粉酶、编码它们的核酸及其制备和应用方法
JP4728950B2 (ja) * 2003-03-10 2011-07-20 ジェネンコー・インターナショナル・インク プレバイオティックであるイソマルトオリゴ糖を含む穀物組成物、及び、この製造方法、並びに、その用途
WO2004111217A2 (en) 2003-06-13 2004-12-23 Danisco A/S Variant pseudomonas polypeptides having a non-maltogenic exoamylase activity and their use in preparing food products
DK2336308T3 (da) * 2003-06-25 2014-11-10 Novozymes As Enzymer til forarbejdning af stivelse
WO2005001064A2 (en) 2003-06-25 2005-01-06 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polypeptides encoding same
US7618795B2 (en) 2003-06-25 2009-11-17 Novozymes A/S Starch process
US8143048B2 (en) 2003-07-07 2012-03-27 Danisco A/S Exo-specific amylase polypeptides, nucleic acids encoding those polypeptides and uses thereof
WO2005007818A2 (en) 2003-07-07 2005-01-27 Genencor International, Inc. Exo-specific amylase polypeptides, nucleic acids encoding those polypeptides and uses thereof
US7169257B2 (en) * 2003-11-12 2007-01-30 Kemira Chemicals, Inc. Method of deinking waste paper using a reduced alkali system
CA2558603A1 (en) * 2004-03-08 2005-10-20 Syngenta Participations Ag Self-processing plants and plant parts
US20050257932A1 (en) * 2004-05-19 2005-11-24 Davidson Eric A Filter cake degradation compositions and associated methods
WO2006003461A2 (en) * 2004-07-07 2006-01-12 Danisco A/S Polypeptide
AU2011203198B2 (en) * 2004-07-07 2013-01-10 Dupont Nutrition Biosciences Aps Polypeptide
US20060084150A1 (en) * 2004-09-29 2006-04-20 Qunyu Gao Method for manufacturing maltose-rich products
ATE540110T1 (de) * 2004-11-11 2012-01-15 Modular Genetics Inc Oligonukleotid-leiterkonstruktion und system zur erzeugung von molekularer vielfalt
DK1926753T3 (da) 2004-12-22 2011-03-14 Novozymes As Hybridenzymer, der består af en endoamylase som første aminosyresekvens og et kulhydratbindingsmodul som anden aminosyresekvens
US20060147581A1 (en) 2004-12-22 2006-07-06 Novozymes A/S Hybrid enzymes
WO2006098952A2 (en) * 2005-03-16 2006-09-21 Syngenta Participations Ag Corn event 3272 and methods of detection thereof
US20070184472A1 (en) * 2005-06-08 2007-08-09 Toagosei Co., Ltd Method of purifying environmental dna and method of efficiently screening for protein-encoding gene from environmental dna
US8030050B2 (en) 2005-07-07 2011-10-04 Danisco A/S Modified amylases from Pseudomonas species
CA2656313C (en) 2006-06-19 2018-07-03 Danisco A/S Ps4 exoamylase h307k/r variant
WO2008008808A2 (en) * 2006-07-11 2008-01-17 Modular Genetics Inc. Methods of introducing targeted diversity into nucleic acid molecules
AU2007356171B8 (en) * 2006-08-04 2014-01-16 Bp Corporation North America Inc. Glucanases, nucleic acids encoding them, and methods for making and using them
US7808342B2 (en) * 2006-10-02 2010-10-05 Skyworks Solutions, Inc. Harmonic phase tuning filter for RF switches
CA2982640A1 (en) 2006-12-21 2008-07-03 Basf Enzymes Llc Amylases and glucoamylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US7915020B2 (en) * 2007-06-01 2011-03-29 Syngenta Participations Ag Process for starch liquefaction and fermentation
US7727726B2 (en) * 2007-06-01 2010-06-01 Syngenta Participations Ag Process for starch liquefaction and fermentation
US7914993B2 (en) * 2007-06-01 2011-03-29 Syngenta Participations Ag. Process for starch liquefaction and fermentation
CN102978258A (zh) 2008-01-02 2013-03-20 丹尼斯科美国公司 应用嗜糖假单胞菌g4-淀粉酶和其变体获得乙醇的无葡糖淀粉酶的方法
US9816119B2 (en) * 2008-02-29 2017-11-14 Syngenta Participations Ag Methods for starch hydrolysis
EP2698434A1 (en) 2008-06-06 2014-02-19 Danisco US Inc. Uses of an alpha-amylase from Bacillus subtilis
US9040279B2 (en) 2008-06-06 2015-05-26 Danisco Us Inc. Saccharification enzyme composition and method of saccharification thereof
CA2726803A1 (en) * 2008-06-06 2009-12-10 Danisco Us Inc. Variant alpha-amylases from bacillus subtilis and methods of use, thereof
US7666457B1 (en) 2008-08-19 2010-02-23 Delavau Llc Dry mixes comprising glycerine
CN102341495A (zh) * 2009-03-10 2012-02-01 丹尼斯科美国公司 巨大芽孢杆菌菌株DSM90相关的α-淀粉酶及其使用方法
CN102378813B (zh) * 2009-04-01 2014-05-14 丹尼斯科美国公司 包含具有改变的性质的α-淀粉酶变体的组合物和方法
WO2010133644A2 (en) * 2009-05-19 2010-11-25 Danisco A/S Amylase polypeptides
CA2771071C (en) * 2009-08-07 2020-03-10 Danisco Us Inc. Alpha-amylase blend for starch processing and method of use thereof
CA2778471A1 (en) * 2009-10-23 2011-04-28 Danisco Us Inc. Methods for reducing blue saccharide
EP2529012A2 (en) * 2010-01-25 2012-12-05 Syngenta Participations AG Compositions and methods relating to dual activity enzymes having xylanase and cellulase activity
BR112013033524A2 (pt) * 2011-06-30 2017-02-07 Novozymes As método para rastrear alfa-amilases, método para selecionar variantes de uma alfa-amilase genitora, polipeptídeo e alfa-amilase variantes, variante, composição detergente, e, utilização de uma alfa-amilase variante
US9672126B2 (en) 2011-12-15 2017-06-06 Sybase, Inc. Hybrid data replication
US20130159253A1 (en) * 2011-12-15 2013-06-20 Sybase, Inc. Directing a data replication environment through policy declaration
GB2499463B (en) * 2012-01-31 2014-04-02 Verenium Corp Reduced sugar syrups and methods of making reduced sugar syrups
CN104379737B (zh) 2012-06-08 2018-10-23 丹尼斯科美国公司 对淀粉聚合物具有增强的活性的变体α淀粉酶
BR112015023620B1 (pt) 2013-03-15 2021-06-22 Grain Processing Corporation Preparação de malto-oligossacarídeos
WO2015050724A1 (en) * 2013-10-03 2015-04-09 Danisco Us Inc. Alpha-amylases from a subset of exiguobacterium, and methods of use, thereof
RU2762075C2 (ru) 2015-04-10 2021-12-15 Зингента Партисипейшнс Аг Кормовые композиции для животных и способы их применения
US11286621B2 (en) 2015-08-14 2022-03-29 Basf Se Aqueous surface treatment composition for paper and board
FR3045055B1 (fr) 2015-12-10 2020-02-21 Roquette Freres Hydrolysat d'amidon de basse viscosite presentant un comportement a la retrogradation ameliore
CA3007668A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 Basf Enzymes Llc A liquid formulation of alpha-amylase
DE102016208466A1 (de) 2016-05-18 2017-11-23 Henkel Ag & Co. Kgaa Verbesserte Waschleistung durch eine neue alpha-Amylase aus Rhizoctonia solani
DE102016209880A1 (de) 2016-06-06 2017-12-07 Henkel Ag & Co. Kgaa Neue Amylasen
WO2017220787A1 (en) * 2016-06-24 2017-12-28 Evaxion Biotech Aps Vaccines against aearomonas salmonicida infection
CN106011107B (zh) * 2016-06-30 2019-09-10 安徽工程大学 一种耐碱性α-淀粉酶及其基因工程菌的构建方法和应用
WO2018051275A2 (en) 2016-09-16 2018-03-22 Basf Se Methods of modifying pulp comprising cellulase enzymes and products thereof
DE102016221851A1 (de) 2016-11-08 2018-05-09 Henkel Ag & Co. Kgaa Amylase für Wasch- und Reinigungsmittelanwendungen
EP3638763A4 (en) * 2017-06-16 2021-04-28 BASF Enzymes LLC PROCESS FOR INCREASING THE OIL YIELD IN THE PRODUCTION OF ETHANOL
WO2019075028A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 Syngenta Participations Ag ENHANCED ANIMAL FEEDING COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
WO2019081976A2 (en) 2017-10-25 2019-05-02 Basf Se BETA-AMYLASE ENZYMES
DE102017220757A1 (de) 2017-11-21 2019-05-23 Henkel Ag & Co. Kgaa Amylase und eine solche enthaltendes Wasch- oder Reinigungsmittel
US20230091532A1 (en) * 2018-03-13 2023-03-23 Lallemand Hungary Liquidity Management Llc Inactivated yeast and yeast product for improving fermentation yield
CA3093776A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-19 Lallemand Hungary Liquidity Management Llc Yeast expressing thermostable alpha-amylases for hydrolysis of starch
CN112368375A (zh) 2018-04-26 2021-02-12 巴斯夫欧洲公司 脂肪酶
US20210115422A1 (en) 2018-05-03 2021-04-22 Basf Se Amylase enzymes
CA3099566A1 (en) * 2018-05-25 2019-11-28 Basf Se Uses of surfactants in starch processing
DE102018208445A1 (de) 2018-05-29 2019-12-05 Henkel Ag & Co. Kgaa Verbesserte Waschleistung durch eine neue alpha-Amylase aus Fomitopsis pinicola (Fpi)
DE102018208444A1 (de) 2018-05-29 2019-12-05 Henkel Ag & Co. Kgaa Verbesserte Waschleistung durch eine neue alpha-Amylase aus Trametes hirsuta (Thi)
DE102018208443A1 (de) 2018-05-29 2019-12-05 Henkel Ag & Co. Kgaa Verbesserte Waschleistung durch eine neue alpha-Amylase Irpex lacteus (IIa)
DE102018208446A1 (de) 2018-05-29 2019-12-05 Henkel Ag & Co. Kgaa Verbesserte Waschleistung durch eine neue alpha-Amylase aus Fomes fomentarius (Ffo)
WO2019229101A1 (en) 2018-05-29 2019-12-05 Basf Se Amylase enzymes
US20220186234A1 (en) 2019-02-20 2022-06-16 Basf Se Industrial Fermentation Process for Bacillus Using Defined Medium and Trace Element Feed
EP3927837A1 (en) 2019-02-20 2021-12-29 Basf Se Industrial fermentation process for bacillus using defined medium and magnesium feed
US20220186200A1 (en) 2019-03-11 2022-06-16 Basf Se Amylases and methods for making and using them
WO2020193534A2 (en) 2019-03-25 2020-10-01 Basf Se Amylase enzymes
EP3947665A2 (en) 2019-03-25 2022-02-09 Basf Se Amylase enzymes
WO2020193532A1 (en) 2019-03-25 2020-10-01 Basf Se Cleaning composition having amylase enzymes
CN114096271B (zh) 2019-04-23 2024-04-12 巴斯夫欧洲公司 β-淀粉酶变体
US11352854B2 (en) 2019-05-13 2022-06-07 Halliburton Energy Services, Inc. Injectivity and production improvement in oil and gas fields
EP3979811A1 (en) * 2019-06-05 2022-04-13 Danisco US Inc. Methods for improving the amino acid content of animal feed products
MX2021015364A (es) 2019-06-13 2022-01-24 Basf Se Metodo de recuperacion de una proteina de un caldo de fermentacion mediante el uso de un cation divalente.
WO2021004830A1 (en) 2019-07-05 2021-01-14 Basf Se Industrial fermentation process for microbial cells using a fed-batch pre-culture
WO2021032881A1 (en) 2019-08-22 2021-02-25 Basf Se Amylase variants
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3847740A (en) 1972-10-02 1974-11-12 Cpc International Inc Process for the production of levulose-bearing syrups
JPS5823799A (ja) 1981-08-03 1983-02-12 株式会社林原生物化学研究所 高純度マルト−スの製造方法
JPS5872598A (ja) 1981-10-26 1983-04-30 Hayashibara Biochem Lab Inc 高純度イソマルト−スの製造方法
US4557927A (en) 1983-03-10 1985-12-10 Kabushiki Kaisha Hoyashibara Food products and process for producing same
EP0208491B1 (en) 1985-07-03 1993-08-25 Genencor International, Inc. Hybrid polypeptides and process for their preparation
JPS62104580A (ja) 1985-10-30 1987-05-15 Kunio Yamane 高耐熱性酵素発現ｄｎａ
FI93859C (fi) * 1985-12-03 1995-06-12 Gist Brocades Nv Menetelmä glukoosisiirappien ja puhdistettujen tärkkelysten tuottamiseksi vehnän ja muiden viljakasvien pentosaaneja sisältävistä tärkkelyksistä
GB8609288D0 (en) * 1986-04-16 1986-05-21 Ici Plc Debranching enzyme
DK311186D0 (da) 1986-06-30 1986-06-30 Novo Industri As Enzymer
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JP2696537B2 (ja) 1988-10-28 1998-01-14 東和化成工業株式会社 高純度マルトースの製造方法
AU7791991A (en) 1990-04-24 1991-11-11 Stratagene Methods for phenotype creation from multiple gene populations
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
WO1993000426A1 (en) 1991-06-25 1993-01-07 Novo Nordisk A/S Mammalian pancreatic lipase and variant thereof
EP0691344B1 (en) 1992-12-28 2003-03-19 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Purification of trehalose
EP0867504B2 (en) 1993-02-11 2011-05-18 Genencor International, Inc. Oxidation-stable alpha-amylase
JP3559585B2 (ja) 1993-06-03 2004-09-02 株式会社林原生物化学研究所 トレハロース遊離酵素とその製造方法並びに用途
EP0648843A1 (en) * 1993-10-01 1995-04-19 Takara Shuzo Co. Ltd. DNA encoding a hyperthermostable alpha-amylase
JPH07143880A (ja) * 1993-10-01 1995-06-06 Takara Shuzo Co Ltd 超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子
AU7807494A (en) * 1993-10-08 1995-05-04 Novo Nordisk A/S Amylase variants
AU5996996A (en) 1995-06-02 1996-12-18 Novo Nordisk A/S Al/fe-treatment of a protein solution, followed by membrane concentration
US5736499A (en) 1995-06-06 1998-04-07 Genencor International, Inc. Mutant A-amylase
JPH09173077A (ja) * 1995-07-20 1997-07-08 Tadayuki Imanaka 超耐熱性酸性α−アミラーゼおよび該α−アミラーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片
US5965408A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US6479258B1 (en) 1995-12-07 2002-11-12 Diversa Corporation Non-stochastic generation of genetic vaccines
US5939250A (en) 1995-12-07 1999-08-17 Diversa Corporation Production of enzymes having desired activities by mutagenesis
CN1222938A (zh) * 1996-05-14 1999-07-14 金克克国际有限公司 经修饰具有改变了的钙离子吉合性质的α－淀粉酶
US5789228A (en) * 1996-05-22 1998-08-04 Diversa Corporation Endoglucanases
AU4551097A (en) * 1996-10-11 1998-05-11 Novo Nordisk A/S Alpha-amylase fused to cellulose binding domain, for starch degradation
AU7107798A (en) 1997-04-09 1998-10-30 Michigan State University Hyperthermostable alpha-amylase
EP2388267A1 (en) * 1997-10-30 2011-11-23 Novozymes A/S Alpha-amylase mutants
AUPP209298A0 (en) * 1998-03-02 1998-03-26 Uniphase Fibre Components Pty Limited Grating writing techniques
FR2778412B1 (fr) * 1998-05-05 2002-08-09 Univ Reims Champagne Ardennes Procede pour preparer une enzyme alpha-amylase thermophile et enzyme ainsi obtenue
KR20010071564A (ko) 1998-06-24 2001-07-28 로버트 흐라이탁, 미쉘 베스트 뭄베이스타틴, 이의 제조방법 및 약제로서의 이의 용도
CN1309835C (zh) 1998-06-25 2007-04-11 应用植物公司 植物可选择标记物和植物转化方法
AU784761B2 (en) 1999-03-25 2006-06-08 Serono Genetics Institute S.A. Biallelic markers related to genes involved in drug metabolism
EP2290060B1 (en) * 1999-03-30 2016-12-07 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
TWI315741B (en) 2000-05-22 2009-10-11 Hayashibara Biochem Lab A-isomaltosyltransferase, process for producing the same and use thereof
AU2001296653A1 (en) 2000-10-04 2002-04-15 Maxygen, Inc. Enantioselective production of amino carboxylic acids
EP2333097B1 (en) * 2001-02-21 2017-05-17 BASF Enzymes LLC Enzymes having alpha amylase activity and methods of use thereof
US7560126B2 (en) 2001-02-21 2009-07-14 Verenium Corporation Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US7659102B2 (en) * 2001-02-21 2010-02-09 Verenium Corporation Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
DE10131441A1 (de) 2001-06-29 2003-01-30 Henkel Kgaa Eine neue Gruppe von alpha-Amylasen sowie ein Verfahren zur Identifizierung und Gewinnung neuer alpha-Amylasen
WO2003012071A2 (en) 2001-08-03 2003-02-13 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids of aspergillus fumigatus encoding industrial enzymes and methods of use
KR20040029122A (ko) 2001-08-27 2004-04-03 신젠타 파티서페이션즈 아게 자가-프로세싱 식물 및 식물 부분
US7255120B2 (en) * 2002-08-06 2007-08-14 Hessa Medical, Inc. Mobility-aid apparatus and method with cores having negative draft
MXPA05009566A (es) 2003-03-06 2005-12-14 Diversa Corp Amilasas, acidos nucleicos que las codifican, y metodos para hacerlas y usarlas.
MX2011006166A (es) 2008-12-15 2011-10-10 Danisco Inc Alfa-amilasas hibridas.
WO2012155131A1 (en) 2011-05-12 2012-11-15 Sealy Technology, Llc Advanced conformance encased coil spring units
CN109738224B (zh) 2013-06-21 2021-07-16 伯乐生命医学产品有限公司 具有流体收集管的微流体系统

Also Published As

Publication number Publication date
US20080047037A1 (en) 2008-02-21
JP5719621B2 (ja) 2015-05-20
BRPI0207770A8 (pt) 2017-12-12
AU2009222426A1 (en) 2009-10-15
WO2002068597A3 (en) 2003-10-02
ES2613277T3 (es) 2017-05-23
US20060234280A1 (en) 2006-10-19
US20030125534A1 (en) 2003-07-03
CA2833423C (en) 2019-03-19
EP2333099A3 (en) 2011-09-07
CA3081363A1 (en) 2002-09-06
MXPA03007527A (es) 2004-07-30
US20160264951A1 (en) 2016-09-15
JP4846760B2 (ja) 2011-12-28
EP2333098A3 (en) 2011-09-07
CA2438205C (en) 2015-11-03
AU2002240489B2 (en) 2006-01-12
CA3032990A1 (en) 2002-09-06
JP2004533220A (ja) 2004-11-04
JP5576718B2 (ja) 2014-08-20
AU2006207843B2 (en) 2010-03-04
EP1370674A4 (en) 2004-10-20
JP4690381B2 (ja) 2011-06-01
JP2014230543A (ja) 2014-12-11
ZA201008280B (en) 2019-12-18
PT1370674E (pt) 2011-08-31
JP6305866B2 (ja) 2018-04-04
AU2006207843A1 (en) 2006-09-28
EP3305894A1 (en) 2018-04-11
CA2438205A1 (en) 2002-09-06
EP2333099A2 (en) 2011-06-15
CA2438884A1 (en) 2002-09-06
US20030170634A1 (en) 2003-09-11
JP2008206525A (ja) 2008-09-11
JP2010263897A (ja) 2010-11-25
AU2009222426B2 (en) 2012-07-12
CN1513059A (zh) 2004-07-14
US7781201B2 (en) 2010-08-24
JP2017074070A (ja) 2017-04-20
DK2333099T3 (da) 2017-11-27
EP2333097B1 (en) 2017-05-17
US7816108B2 (en) 2010-10-19
JP2019010100A (ja) 2019-01-24
EP2333099B1 (en) 2017-11-01
ES2650636T3 (es) 2018-01-19
EP1392815A2 (en) 2004-03-03
EP2292784A3 (en) 2011-06-22
US7666633B2 (en) 2010-02-23
US7273740B2 (en) 2007-09-25
JP6402205B2 (ja) 2018-10-10
DK1370674T3 (da) 2011-08-29
WO2002068589A2 (en) 2002-09-06
EP1392815B1 (en) 2013-06-26
CN100577809C (zh) 2010-01-06
US20070161099A1 (en) 2007-07-12
DK2169076T3 (en) 2017-02-06
CA2833423A1 (en) 2002-09-06
CN101724640B (zh) 2014-10-15
EP2333097A3 (en) 2011-10-12
EP2333098B1 (en) 2016-08-24
ATE510023T1 (de) 2011-06-15
EP2333097A2 (en) 2011-06-15
DK2333097T3 (da) 2017-08-28
US8334118B2 (en) 2012-12-18
EP2169076A2 (en) 2010-03-31
CN101724640A (zh) 2010-06-09
EP2169076A3 (en) 2010-06-30
JP2011172566A (ja) 2011-09-08
US20100047392A1 (en) 2010-02-25
EP1370674A2 (en) 2003-12-17
EP1392815A4 (en) 2005-09-21
EP1370674B1 (en) 2011-05-18
EP2292784A2 (en) 2011-03-09
US20080032378A1 (en) 2008-02-07
WO2002068589A3 (en) 2003-10-23
US7407677B2 (en) 2008-08-05
CA3032990C (en) 2020-07-14
US7785855B2 (en) 2010-08-31
ES2637501T3 (es) 2017-10-13
US10047350B2 (en) 2018-08-14
HK1060373A1 (en) 2004-08-06
EP2169076B1 (en) 2016-11-02
CA2438884C (en) 2014-01-28
JP2004533219A (ja) 2004-11-04
AU2006207843C1 (en) 2010-07-29
WO2002068597A2 (en) 2002-09-06
CY1111771T1 (el) 2015-10-07
US20130224800A1 (en) 2013-08-29
JP2008142080A (ja) 2008-06-26
AU2002240489C1 (en) 2009-02-05
EP2333098A2 (en) 2011-06-15
US20180334660A1 (en) 2018-11-22
ZA200306486B (en) 2011-01-26
BR0207770A (pt) 2004-12-07
CN104593394A (zh) 2015-05-06
CA2897239A1 (en) 2002-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2604329T3 (es) Enzimas que tienen actividad de alfa amilasa y métodos de uso de las mismas
Ho et al. Structure of the GAF domain, a ubiquitous signaling motif and a new class of cyclic GMP receptor
Brown et al. Crystal structure of the bifunctional N‐acetylglucosamine 1‐phosphate uridyltransferase from Escherichia coli: a paradigm for the related pyrophosphorylase superfamily
Rink et al. Primary structure and catalytic mechanism of the epoxide hydrolase from Agrobacterium radiobacterAD1
Hill et al. Investigation of two evolutionarily unrelated halocarboxylic acid dehalogenase gene families
Mueser et al. Structure of bacteriophage T4 RNase H, a 5′ to 3′ RNA–DNA and DNA–DNA exonuclease with sequence similarity to the RAD2 family of eukaryotic proteins
AU716692B2 (en) Esterases
JP4306802B2 (ja) アミダーゼ
Davies et al. The Three-dimensional Structure of a Tn5Transposase-related Protein Determined to 2.9-Å Resolution
JP2000506017A (ja) α―ガラクトシダーゼ
Sivaraman et al. Structure of the 16S rRNA pseudouridine synthase RsuA bound to uracil and UMP
CN108138161A (zh) 具有改良的转化活性的己糖醛酸酯c4-差向异构酶突变体，和使用其制造d-塔格糖的方法
US8859237B2 (en) Diguanylate cyclase method of producing the same and its use in the manufacture of cyclic-di-GMP and analogues thereof
Korndörfer et al. Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family
Webb et al. Crystal structure of a tetrameric GDP‐d‐mannose 4, 6‐dehydratase from a bacterial GDP‐d‐rhamnose biosynthetic pathway
Garces et al. Atomic model of human Rcd‐1 reveals an armadillo‐like‐repeat protein with in vitro nucleic acid binding properties
Myllykallio et al. The membrane-attached electron carrier cytochrome cy from Rhodobacter sphaeroides is functional in respiratory but not in photosynthetic electron transfer
US20220372453A1 (en) Non-ltr-retroelement reverse transcriptase and uses thereof
Kawate et al. Distribution of mutations in human thymidylate synthase yielding resistance to 5-fluorodeoxyuridine
US20140170689A1 (en) Modified Diguanylate Cyclase-Phosphodiesterase and Method for Enzymatic Production of Cyclic-diGMP
Thoden et al. High resolution X-ray structure of galactose mutarotase from Lactococcus lactis
Rezende et al. Essential amino acid residues in the single-stranded DNA-binding protein of bacteriophage T7: Identification of the dimer interface
CN110951705B (zh) 胺脱氢酶突变体、酶制剂、重组载体、重组细胞及其制备方法和应用
Leiros et al. Structure of the uracil-DNA N-glycosylase (UNG) from Deinococcus radiodurans
Chihade et al. Strong selective pressure to use G: U to mark an RNA acceptor stem for alanine