CN108138161A - 具有改良的转化活性的己糖醛酸酯c4-差向异构酶突变体，和使用其制造d-塔格糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有改良的己糖醛酸酯C4‑差向异构酶转化活性的己糖醛酸酯C4‑差向异构酶(hexuronate C4‑epimerase)突变体，以及使用其制造塔格糖的方法。

Description

具有改良的转化活性的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体，和 使用其制造D-塔格糖的方法
技术领域
本发明涉及一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体，其具有改良的转化活性，以及使用其制造D-塔格糖的方法。
背景技术
塔格糖是一种仅少量存在于如牛奶、乳酪、可可等食品和如苹果、中国柑桔等天然甜味水果中的天然甜味剂，并且具有与蔗糖类似的物理性质。塔格糖具有1.5千卡/克的低热量值，相当于蔗糖热量值的三分之一，并且血糖指数(glycemic inde，GI)是3，相当于蔗糖血糖指数的5％。塔格糖尝起来有与蔗糖类似的甜味并且具有多种健康和功能特征，并且因此已经作为能够满足口味和健康的替代甜味剂用于多种产品中。
塔格糖可以通过化学异构化(催化反应)方法和生物学(酶促异构化反应)方法从作为原料的半乳糖制造(参看韩国专利公开案第2009-0082774号)。然而，乳糖作为塔格糖的原料价格不稳定，取决于生产量、全球市场原料乳和乳糖的供应和需求等，并且原料乳的这类价格波动使得难以为塔格糖制造稳定供应原料。因此，需要一种使用常见糖(蔗糖、葡萄糖、果糖等)制造塔格糖的新颖方法。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体，其具有改良的转化活性。根据本发明的一个实施例，提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体，其具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中从己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)的N末端开始位置403处的酪氨酸(Y)、位置125处的丝氨酸(S)、位置185处的丝氨酸(S)、位置267处的缬氨酸(V)、位置268处的丝氨酸(S)、位置272处的苏氨酸(T)、位置306处的色氨酸(W)以及位置386处的精氨酸(R)发生突变。
本发明的另一个目的是提供一种编码己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体的核酸，一种包含所述核酸的转型体或一种用于制造D-塔格糖的组成物，其包含根据本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体。
本发明的另一目的是提供一种用于制造D-塔格糖的方法，其包含：使D-果糖(D-fructose)与己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体、转型体或组成物接触并且差向异构化来制造根据本发明的D-塔格糖。
下文中，将更详细地描述本发明的实施例。本文将省略对所属领域的技术人员显而易知的细节描述。
技术解决方案
为了实现本发明的上述目的和其它目的，本发明的一个方面提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体，其具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中由以下各项组成的群组选出的至少一个氨基酸突变成另一个氨基酸：从己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)的N末端开始位置9处的组氨酸(H)、位置21处的酪氨酸(Y)、位置60处的谷氨酸(E)、位置62处的缬氨酸(V)、位置68处的谷氨酸(E)、位置77处的亮氨酸(L)、位置91处的亮氨酸(L)、位置97处的苏氨酸(T)、位置125处的丝氨酸(S)、位置126处的缬氨酸(V)、位置140处的亮氨酸(L)、位置141处的天冬氨酸(D)、位置145处的色氨酸(W)、位置149处的谷氨酰胺(Q)、位置157处的甘氨酸(G)、位置158处的丙氨酸(A)、位置160处的丙氨酸(A)、位置163处的缬氨酸(V)、位置164处的赖氨酸(K)、位置166处的脯氨酸(P)、位置167处的谷氨酸(E)、位置168处的天冬氨酸(D)、位置175处的谷氨酸(E)、位置176处的甘氨酸(G)、位置177处的苯丙氨酸(F)、位置185处的丝氨酸(S)、位置202处的甲硫氨酸(M)、位置218处的甘氨酸(G)、位置221处的酪氨酸(Y)、位置231处的天冬氨酸(D)、位置241处的缬氨酸(V)、位置242处的酪氨酸(Y)、位置267处的缬氨酸(V)、位置268处的丝氨酸(S)、位置272处的苏氨酸(T)、位置276处的苏氨酸(T)、位置284处的缬氨酸(V)、位置295处的苯丙氨酸(F)、位置297处的苯丙氨酸(F)、位置302处的苯丙氨酸(F)、位置306处的色氨酸(W)、位置316处的亮氨酸(L)、位置337处的赖氨酸(K)、位置351处的脯氨酸(P)、位置361处的苯丙氨酸(F)、位置366处的丙氨酸(A)、位置386处的精氨酸(R)、位置388处的异亮氨酸(I)、位置402处的丝氨酸(S)、位置403处的酪氨酸(Y)、位置415处的缬氨酸(V)、位置429处的天冬氨酸(D)、位置440处的酪氨酸(Y)和位置441处的甘氨酸(G)[参看下文的表2到表5]。
根据本发明的一个实施例，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以是其中从具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)的N末端开始位置403处的酪氨酸(Y)发生突变的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体。
己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体的位置403处的酪氨酸(Y)可以经丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)或色氨酸(W)取代。
在一个实施例中，除了位置403之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置125处的丝氨酸处进一步突变。
己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体的位置125处的丝氨酸(S)可以经天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)或酪氨酸(Y)取代。
在一个实施例中，除了位置403处的酪氨酸(Y)和位置125处的丝氨酸(S)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在由以下各项组成的群组选出的一个或多个氨基酸残基处进一步突变：位置185处的丝氨酸(S)、位置267处的缬氨酸(V)、位置268处的丝氨酸(S)、位置272处的苏氨酸(T)、位置306处的色氨酸(W)以及位置386处的精氨酸(R)。
己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体的位置185处的丝氨酸(S)可以经赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)或甘氨酸(G)取代；位置267处的缬氨酸(V)可以经甲硫氨酸(M)取代；位置268处的丝氨酸(S)可以经半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代；位置272处的苏氨酸(T)可以经丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)或缬氨酸(V)取代；位置306处的色氨酸(W)可以经苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、甲硫氨酸(M)或缬氨酸(V)取代；以及位置386处的精氨酸(R)可以经脯氨酸(P)或缬氨酸(V)取代。
在一个实施例中，除了位置403处的酪氨酸(Y)和位置125处的丝氨酸(S)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置268处的丝氨酸(S)处进一步突变。此处，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置164处的赖氨酸(K)、位置168处的天冬氨酸(D)、位置175处的谷氨酸(E)、位置297处的天冬酰胺(N)和位置388处的异亮氨酸(I)处进一步突变。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置164处的赖氨酸(K)可以经甲硫氨酸取代，位置168处的天冬氨酸(D)可以经谷氨酸取代，位置175处的谷氨酸(E)可以经甘氨酸(G)取代，位置297处的天冬酰胺(N)可以经赖氨酸(K)取代，并且位置388处的异亮氨酸(I)可以经缬氨酸(V)取代。
在一个实施例中，除了位置403处的酪氨酸(Y)和位置125处的丝氨酸(S)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置267处的缬氨酸(V)和位置386处的精氨酸(R)处进一步突变。此处，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置351处的脯氨酸(P)处进一步突变。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置351处的脯氨酸(P)可以经丝氨酸(S)取代。
在一个实施例中，除了位置403处的酪氨酸(Y)和位置125处的丝氨酸(S)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置185处的丝氨酸(S)、位置267处的缬氨酸(V)和位置306处的色氨酸(W)处进一步突变。此处，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置68处的谷氨酸(E)处进一步突变。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置68处的谷氨酸(E)可以经甘氨酸(G)取代。
在一个实施例中，除了位置403处的酪氨酸(Y)和位置125处的丝氨酸(S)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置267处的缬氨酸(V)、位置268处的丝氨酸(S)和位置386处的精氨酸(R)处进一步突变。此处，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置60处的谷氨酸(E)、位置202处的甲硫氨酸(M)、位置221处的酪氨酸(Y)和位置242处的酪氨酸(Y)处进一步突变。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置60处的谷氨酸(E)可以经天冬氨酸(D)取代，位置202处的甲硫氨酸(M)可以经苏氨酸取代，位置221处的酪氨酸(Y)可以经苯丙氨酸(F)取代并且位置242处的酪氨酸(Y)可以经苯丙氨酸(F)取代。
在一个实施例中，除了位置403处的酪氨酸(Y)和位置125处的丝氨酸(S)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在由以下各项组成的群组选出的一个或多个氨基酸残基处进一步突变：位置185处的丝氨酸(S)、位置267处的缬氨酸(V)、位置268处的丝氨酸(S)和位置272处的苏氨酸(T)。此处，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在由以下各项组成的群组选出的一个或多个氨基酸残基处进一步突变：位置91处的亮氨酸(L)、位置141处的天冬氨酸(D)和位置176处的甘氨酸(G)。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置91处的亮氨酸(L)可以经色氨酸(W)、异亮氨酸(I)或天冬酰胺(N)取代；位置141处的天冬氨酸(D)可以经苯丙氨酸(F)取代；并且位置176处的甘氨酸(G)可以经组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)取代。
在一个实施例中，除了位置403处的酪氨酸(Y)和位置125处的丝氨酸(S)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在由以下各项组成的群组选出的一个或多个氨基酸残基处进一步突变：位置267处的缬氨酸(V)、位置268处的丝氨酸(S)、位置272处的苏氨酸(T)和位置306处的色氨酸(W)。此处，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置284处的缬氨酸(V)和位置415处的缬氨酸(V)处进一步突变。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置284处的缬氨酸(V)可以经丙氨酸(A)取代；并且位置415处的缬氨酸(V)可以经谷氨酸(E)取代。
在一个实施例中，除了位置403处的酪氨酸(Y)和位置125处的丝氨酸(S)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在由以下各项组成的群组选出的一个或多个氨基酸残基处进一步突变：位置185处的丝氨酸(S)、位置267处的缬氨酸(V)、位置268处的丝氨酸(S)、位置272处的苏氨酸(T)以及位置306处的色氨酸(W)。此处，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置166处的脯氨酸(P)或位置231处的天冬氨酸(D)处进一步突变。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置166处的脯氨酸(P)可以经精氨酸(R)取代；并且位置231处的天冬氨酸(D)可以经精氨酸(R)取代。
在一个实施例中，除了位置403处的酪氨酸(Y)和位置125处的丝氨酸(S)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置185处的丝氨酸(S)、位置267处的缬氨酸(V)、位置268处的丝氨酸(S)、位置272处的苏氨酸(T)和位置386处的色氨酸(W)处进一步突变。此处，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置126处的缬氨酸(V)处进一步突变。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置126处的缬氨酸(V)可以经丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、天冬酰胺(R)或苏氨酸(T)取代。
在一个实施例中，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以是具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体，其中从己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)的N末端开始位置403处的酪氨酸(Y)、位置125处的丝氨酸(S)、位置185处的丝氨酸(S)、位置267处的缬氨酸(v)、位置268处的丝氨酸(S)、位置272处的苏氨酸(T)、位置306处的色氨酸(W)和位置386处的精氨酸(R)发生突变。
在一个实施例中，除了位置403处的酪氨酸(Y)、位置125处的丝氨酸(S)、位置185处的丝氨酸(S)、位置267处的缬氨酸(v)、位置268处的丝氨酸(S)、位置272处的苏氨酸(T)以及位置386处的色氨酸(W)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置97处的苏氨酸(T)、位置126处的缬氨酸(V)、位置145处的色氨酸(W)、位置163处的缬氨酸(V)、位置164处的赖氨酸(K)、位置166处的脯氨酸(P)、位置231处的天冬氨酸(D)、位置241处的缬氨酸(V)、位置276处的苏氨酸(T)、位置337处的赖氨酸(K)、位置366处的丙氨酸(A)、位置402处的丝氨酸(S)、位置429处的天冬氨酸(D)或位置440处的酪氨酸(Y)处进一步突变。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置97处的苏氨酸(T)可以经丙氨酸(A)或亮氨酸(L)取代；位置126处的缬氨酸(V)可以经苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)或精氨酸(R)取代；位置145处的色氨酸(W)可以经丙氨酸(A)取代；位置163处的缬氨酸(V)可以经丙氨酸(A)、甲硫氨酸(M)或谷氨酰胺(Q)取代；位置164处的赖氨酸(K)可以经甲硫氨酸(M)取代；位置166处的脯氨酸(P)可以经精氨酸(R)取代；位置231处的天冬氨酸(D)可以经精氨酸(R)取代；位置241处的缬氨酸(V)可以经天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)或半胱氨酸(S)取代；位置276处的苏氨酸(T)可以经谷氨酸(E)或丙氨酸(A)取代；位置337处的赖氨酸(K)可以经谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)取代；位置366处的丙氨酸(A)可以经丝氨酸(S)、甘氨酸(G)或半胱氨酸(C)取代；位置402处的丝氨酸(S)可以经苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)或酪氨酸(Y)取代；位置429处的天冬氨酸(D)可以经脯氨酸(P)取代；并且位置440处的酪氨酸(Y)可以经丙氨酸(A)取代。
在一个实施例中，除了位置403处的酪氨酸(Y)、位置125处的丝氨酸(S)、位置185处的丝氨酸(S)、位置267处的缬氨酸(V)、位置268处的丝氨酸(S)、位置272处的苏氨酸(T)以及位置386处的色氨酸(W)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置164处的赖氨酸(K)、位置166处的天冬氨酸(D)或位置231处的天冬氨酸(D)处进一步突变。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置164处的赖氨酸(K)可以经甲硫氨酸(M)取代；位置166处的天冬氨酸(D)可以经精氨酸(R)取代；并且位置231处的天冬氨酸(D)可以经精氨酸(R)取代。
在一个实施例中，除了位置403处的酪氨酸(Y)、位置125处的丝氨酸(S)、位置185处的丝氨酸(S)、位置267处的缬氨酸(V)、位置268处的丝氨酸(S)、位置272处的苏氨酸(T)、位置386处的色氨酸(W)以及位置163处的缬氨酸(V)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置231处的天冬氨酸(D)处进一步突变。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置231处的天冬氨酸(D)可以经精氨酸(R)取代。
在一个实施例中，除了位置403处的酪氨酸(Y)、位置125处的丝氨酸(S)、位置185处的丝氨酸(S)、位置267处的缬氨酸(V)、位置268处的丝氨酸(S)、位置272处的苏氨酸(T)、位置386处的色氨酸(W)以及位置337处的赖氨酸(K)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置157处的甘氨酸(G)、位置160处的丙氨酸(A)、位置167处的谷氨酸(E)、位置177处的苯丙氨酸(F)、位置218处的甘氨酸(G)、位置295处的苯丙氨酸(F)、位置302处的苯丙氨酸(F)、位置361处的苯丙氨酸(F)、位置366处的丙氨酸(A)或位置441处的甘氨酸(G)处进一步突变。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置157处的甘氨酸(G)可以经精氨酸(R)取代；位置160处的丙氨酸(A)可以经亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)取代；位置167处的谷氨酸(E)可以经丙氨酸(A)、色氨酸(W)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)或丝氨酸(S)取代；位置177处的苯丙氨酸(F)可以经酪氨酸(Y)、组氨酸(H)或亮氨酸(L)取代；位置218处的甘氨酸(G)可以经异亮氨酸(I)、丝氨酸(S)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)或半胱氨酸(C)取代；位置295处的苯丙氨酸(F)可以经半胱氨酸(C)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)取代；位置302处的苯丙氨酸(F)可以经半胱氨酸(C)取代；位置361处的苯丙氨酸(F)可以经赖氨酸(K)、谷氨酸(E)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、甲硫氨酸(M)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)或半胱氨酸(C)取代；位置366处的丙氨酸(A)可以经丝氨酸(S)取代；并且位置441处的甘氨酸(G)可以经谷氨酸(E)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、丙氨酸(A)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)或苯丙氨酸(F)取代。
在一个实施例中，除了位置403处的酪氨酸(Y)和位置125处的丝氨酸(S)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置77处的亮氨酸(L)、位置158处的丙氨酸(A)或其组合处进一步突变。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置77处的亮氨酸(L)可以经脯氨酸(P)或精氨酸(R)取代；并且位置158处的丙氨酸(A)可以经苏氨酸(T)取代。位置403处的酪氨酸(Y)、位置125处的丝氨酸(S)、位置77处的亮氨酸(L)和位置158处的丙氨酸(A)发生突变的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置386处的精氨酸(R)处进一步突变。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置386处的精氨酸(R)可以经脯氨酸(P)或缬氨酸(V)取代。
根据本发明的一个实施例，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以是从具有SEQID NO:1的氨基酸序列的己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)的N末端开始位置185处的丝氨酸(S)发生突变的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体。在一个实施例中，除了位置185之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置125处的丝氨酸(S)处进一步突变。
在一个实施例中，除了位置185处的丝氨酸(S)和位置125处的丝氨酸(S)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置268处的丝氨酸(S)、位置272处的苏氨酸(T)或其组合处进一步突变。此处，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置267处的缬氨酸(V)、位置306处的色氨酸(W)或其组合处进一步突变。在一个实施例中，位置185处的丝氨酸(S)、位置125处的丝氨酸(S)、位置268处的丝氨酸(S)、位置272处的苏氨酸(T)、位置267处的缬氨酸(V)和位置306处的色氨酸(W)发生突变的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置386处的精氨酸(R)处进一步突变。
根据本发明的一个实施例，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以是从具有SEQID NO:1的氨基酸序列的己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)的N末端开始位置272处的苏氨酸(T)发生突变的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体。
在一个实施例中，除了位置272处的苏氨酸(T)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置125处的丝氨酸(S)、位置267处的缬氨酸(V)和位置268处的丝氨酸(S)处进一步突变。此处，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置231处的天冬氨酸(D)或位置386处的精氨酸(R)处进一步突变。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置231处的天冬氨酸(D)可以经精氨酸(R)取代；并且位置386处的精氨酸(R)可以经脯氨酸(P)或缬氨酸(V)取代。
在一个实施例中，除了位置272处的苏氨酸(T)、位置125处的丝氨酸(S)、位置185处的丝氨酸(S)、位置267处的缬氨酸(V)、位置268处的丝氨酸(S)和位置386处的精氨酸(R)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在由以下各项组成的群组选出的一个或多个氨基酸残基处进一步突变：位置97处的苏氨酸(T)、位置149处的谷氨酰胺(Q)、位置166处的脯氨酸(P)和位置351处的脯氨酸(P)。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置97处的苏氨酸(T)可以经丙氨酸(A)或亮氨酸(L)取代；位置149处的谷氨酰胺(Q)可以经精氨酸(R)取代；位置166处的脯氨酸(P)可以经精氨酸(R)取代；并且位置351处的脯氨酸(P)可以经丝氨酸(S)取代。
在一个实施例中，除了位置272处的苏氨酸(T)、位置125处的丝氨酸(S)、位置267处的缬氨酸(V)和位置268处的丝氨酸(S)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在由以下各项组成的群组选出的一个或多个氨基酸残基处进一步突变：位置164处的赖氨酸(K)、位置168处的天冬氨酸(D)和位置175处的谷氨酸(E)。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置164处的赖氨酸(K)可以经甲硫氨酸(M)取代；位置168处的天冬氨酸(D)可以经谷氨酸(E)取代；并且位置175处的谷氨酸(E)可以经甘氨酸(G)取代。
根据本发明的一个实施例，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以是从具有SEQID NO:1的氨基酸序列的己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)的N末端开始位置77处的亮氨酸(L)发生突变的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体。
在一个实施例中，除了位置77处的亮氨酸(L)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置125处的丝氨酸(S)处进一步突变。
在一个实施例中，除了亮氨酸(L)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在由以下各项组成的群组选出的一个或多个氨基酸残基处进一步突变：位置158处的丙氨酸(A)或位置351处的脯氨酸(P)。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置158处的丙氨酸(A)可以经苏氨酸(T)取代；并且位置351处的脯氨酸(P)可以经丝氨酸(S)取代。除了位置77处的亮氨酸(L)、位置125处的丝氨酸(S)和158丙氨酸(A)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在由以下各项组成的群组选出的一个或多个氨基酸残基处进一步突变：位置9处的组氨酸、位置60处的谷氨酸(E)和位置415处的缬氨酸(V)。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置9处的组氨酸可以经酪氨酸(Y)取代；位置60处的谷氨酸(E)可以经天冬氨酸(D)取代；并且位置415处的缬氨酸(V)可以经谷氨酸(E)取代。
在本发明的一个实施例中，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以是从具有SEQID NO:1的氨基酸序列的己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)的N末端开始位置158处的丙氨酸(A)发生突变的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体。
在一个实施例中，除了位置158处的丙氨酸(A)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置125处的丝氨酸(S)处进一步突变。
在一个实施例中，除了位置158处的丙氨酸(A)和位置125处的丝氨酸(S)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在由以下各项组成的群组选出的一个或多个氨基酸残基处进一步突变：位置149处的谷氨酰胺(Q)、位置267处的缬氨酸(V)和位置351处的脯氨酸(P)。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置149处的谷氨酰胺(Q)可以经精氨酸(R)取代，位置267处的缬氨酸(V)可以经甲硫氨酸(M)取代，并且位置351处的脯氨酸(P)可以经丝氨酸(S)取代。
在一个实施例中，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以是从具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)的N末端开始位置351处的脯氨酸(P)发生突变的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体。
在一个实施例中，除了位置351处的脯氨酸(P)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置125处的丝氨酸(S)处进一步突变。
在一个实施例中，除了位置351处的脯氨酸(P)和位置125处的丝氨酸(S)之外，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在位置267处的缬氨酸(V)处进一步突变。此处，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在由以下组成的群组选出的一个或多个氨基酸残基处进一步突变：位置21处的酪氨酸(Y)、位置62处的缬氨酸(V)、位置149处的谷氨酰胺(Q)以及位置316处的亮氨酸(L)。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置21处的酪氨酸(Y)可以经苯丙氨酸(F)取代，位置62处的缬氨酸(V)可以经异亮氨酸(I)取代，位置149处的谷氨酰胺(Q)可以经精氨酸(R)取代，并且位置316处的亮氨酸(L)可以经苯丙氨酸(F)取代。
根据本发明的一个实施例，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以是从具有SEQID NO:1的氨基酸序列的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N末端开始位置125处的丝氨酸(S)、位置164处的赖氨酸(K)、位置168处的天冬氨酸(D)以及位置175处的谷氨酸(E)发生突变的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体。
在一个实施例中，位置125处的丝氨酸(S)、位置164处的赖氨酸(K)、位置168处的天冬氨酸(D)以及位置175处的谷氨酸(E)发生突变的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以在由以下各项组成的群组选出的一个或多个氨基酸残基处进一步突变：位置140处的亮氨酸(L)、位置386处的精氨酸(R)、位置268处的丝氨酸(S)和位置297处的天冬酰胺(N)。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体中，位置140处的亮氨酸(L)可以经脯氨酸(P)取代，位置386处的精氨酸(R)可以经脯氨酸(P)或缬氨酸(V)取代，位置268处的丝氨酸(S)可以经半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代，并且位置297处的天冬酰胺(N)可以经赖氨酸(K)取代。
根据本发明的一个实施例，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以是从具有SEQID NO:1的氨基酸序列的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体的N末端开始位置125处的丝氨酸(S)、位置149处的谷氨酰胺(Q)和位置267处的缬氨酸(V)发生突变的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体。
根据本发明的一个实施例，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体与包括由野生型己糖醛酸酯C4-差向异构酶(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列中表2到表5中公开的经修饰氨基酸位置和经取代的氨基酸残基推断的氨基酸序列(例如表3中的SEQ ID NO:3，M125突变体)的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体或具有所公开的氨基酸序列的突变体具有50％或更高的遗传同源性。根据一个实施例，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以具有60％、70％、75％或80％遗传同源性。根据另一实施例，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以具有85％、90％或95％遗传同源性。根据另一实施例，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以包含具有97％或99％同源性的多肽部分。
如本文所用，术语“同源性”指的是两个多肽部分之间的多肽序列一致性百分比。一个部分和另一个部分之间的同源性可以通过已知技术测定。举例来说，可以借助于可商购的计算机程序通过直接比对两个多肽分子之间的序列信息来测定同源性。另外，可以通过在同源区域之间形成稳定双股的条件下杂交多核苷酸，使用单股特异性核酸酶浸煮双股并且测量消化片段的尺寸来测定同源性。
如本文所用，术语“同系物”的所有语法形式和其拼写衍生物包含超家族来源的蛋白质(例如免疫球蛋白超家族)和其它物种来源的同源蛋白质(例如肌球蛋白轻链等)并且指的是具有“共同进化来源”的蛋白质关系。这类蛋白质(和其编码基因)具有高度序列相似性所反映的序列同源性。然而，以常见含义使用并且用于本发明的“同系物”指的是与形容词表述“非常高”有关的“序列相似性”而不是指“共同进化来源”。
如本文所用，术语“序列相似性”指的是具有或不具有共同进化来源的蛋白质的核苷酸序列和氨基酸序列之间的一致性或互补程度。在一个实施例中，当具有所测定长度的两个氨基酸序列的序列相似性是21％(根据一个实施例，至少约50％，根据另一实施例，约75％、90％、95％、96％、97％或99％)时，那两个氨基酸序列可以称为“大体上同源”或“大体上类似”。大体上同源的序列可以通过使用数据库中采用的标准软件鉴别，例如通过在针对特定系统规定的严重条件下通过蛋白质杂交实验比较序列。规定的适合杂交条件属于相应技术的范围(例如参看萨布鲁克(Sambrook)等人,1989，见下文)。
己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体具有将D-果糖在C4处差向异构成D-塔格糖的改良的C4-差向异构单位活性，由此能够从D-果糖制造D-塔格糖。
己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以来源于嗜热性微生物的己糖醛酸酯C4-差向异构酶，所述嗜热性微生物包含嗜热性的红嗜热盐菌属(genus Rhodothermus)、热厌氧菌属(genus Thermoanaerobacter)、栖热袍菌属(genus Thermotoga)或网团菌属(genusDictyoglomus)。具体地，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以来源于栖热袍菌属微生物的己糖醛酸酯C4-差向异构酶。更具体来说，己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以来源于新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)或海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的己糖醛酸酯C4-差向异构酶。
嗜热性微生物产生的己糖醛酸酯C4-差向异构酶可以具有与嗜温性微生物(嗜温菌(mesophile))产生的酶的功能相同的功能，同时在极端反应条件(高温等)下进行稳定反应。因为嗜热性微生物产生的己糖醛酸酯C4-差向异构酶具有许多优势，如预防嗜温性微生物污染、提高在基质中具有低溶解度的材料的溶解度、提高反应速率等，嗜热性微生物产生的己糖醛酸酯C4-差向异构酶可以克服嗜温性酶的工业缺点。
本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体可以通过例如用表达己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体的DNA(例如SEQ ID NO:4)转型如大肠杆菌(E.coli)等菌株，培养经转型的菌株获得经培养的物质，破坏经培养的物质，并且经柱等纯化经破坏的物质来获得。用于转型的菌株可以包含大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterumglutamicum)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。
本发明的另一方面提供一种编码己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体的核酸，包含所述核酸的转型体，或用于制造D-塔格糖的组成物，其包含所述己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体。
本发明的另一方面涉及一种表达载体，其包含编码本发明的C4-差向异构酶突变体的核酸。如本文所用，术语“载体”指的是用于克隆和/或转移核苷酸序列到生物体，例如宿主细胞的任选培养基。载体可以是诱发与其它DNA片段结合并且复制经结合的片段的复制子(replicon)。如本文所用的术语“复制子”指的是任选遗传单元(例如质体、噬菌体、粘质体、染色体、病毒)，其可以用作身体内的自身DNA复制单元，所述单元能够通过自身调节复制。如本文所用的术语“载体”指的是用于将核苷酸序列体外、离体或体内引入到生物体，例如宿主细胞的病毒和非病毒系统。术语“载体”还包含微球形DNA。
如本文所用，术语“核酸”包含DNA或RNA的任何形式。作为核酸的基础结构单元的核苷酸不仅包含天然核苷酸，而且包含糖或核碱基经修饰的其突变体(参看：沙伊特(Scheit),核苷酸类似物(Nucleotide Analogs),约翰威立国际出版公司(John Wiley),纽约(New York)(1980)；乌尔曼(Uhlman)和佩曼(Peyman),化学综述(Chemical Reviews),90:543-584(1990))。
如本文所用，术语“转型”用以指向宿主生物体的基因组中插入核酸片段，导致稳定遗传的方法，而如本文所用的术语“转型体”指的是核酸片段转移到基因组并且引起稳定遗传的生物体。转型体的实例包含例如原核生物或真核生物，具体来说属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)或棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)等，更具体来说埃希氏杆菌属(genus Escherichia)、沙雷氏菌属(genus Ceratia)等的微生物，最具体来说大肠杆菌。
生物体的转型方法包含可以向生物体中引入核酸并且可以通过所属领域中已知的适合标准技术执行的任何方法。举例来说，转型方法可以包含(但不限于)电穿孔(electroporation)、磷酸钙共沉淀(calcium phosphate co-precipitation)、反转录病毒感染(retroviral infection)、微注射(microinjection)、DEAE-聚葡萄糖(DEAE-dextran)和阳离子脂质体(cationic liposome)方法。
用于制造D-塔格糖的包含己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体的组成物可以更包含用于制造D-塔格糖的组成物中常用的任选适合赋形剂。这类赋形剂可以例如是(但不限于)防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂以及等渗剂。组成物可以包含按固体计0.1重量％到70重量％的量的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体。
本发明的另一方面提供一种用于制造D-塔格糖的方法，其包含使D-果糖(D-fructose)与己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体、转型体或包含其的用于制造D-塔格糖的组成物接触来差向异构化D-果糖。
下文中，将描述根据本发明的用于制造D-塔格糖的方法。
根据本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体、包含其编码核酸的转型体或包含其的用于制造D-塔格糖的组成物可以与D-果糖接触，由此使D-果糖的4位置处的碳差向异构化。
一般来说，单糖可以分类成己醛醣(aldohexose)和己酮糖(ketohexose)。在本发明中，优选地使用作为酮己糖的D-果糖来制造D-塔格糖。
可以通过水解蔗糖或异构化葡萄糖来获得D-果糖。本发明提供一种使用常见并且便宜的原料(如果糖、蔗糖和葡萄糖)以高产率生产D-塔格糖的方法，从而使得D-塔格糖能够大量生产。
根据本发明差向异构化D-果糖的步骤可以在pH 5到8下进行。在另一实施例中，差向异构化可以在pH 6到8下进行。差向异构化D-果糖的步骤在60℃到85℃，优选地80℃到85℃下进行。在这些范围内，可以在相对高的温度下进行酶反应，由此提供如使微生物污染降到最低、提高用作基质的果糖的溶解度以及使酶的反应速率和转化率达到最大的作用。
另外，差向异构化D-果糖的步骤可以在浓度为10％(w/v)到50％(w/v)的D-果糖存在下进行。根据一个实施例，差向异构化D-果糖的步骤在浓度为20％(w/v)到50％(w/v)，更具体来说浓度为20％(w/v)到40％(w/v)的D-果糖存在下进行。根据本发明，可以用低成本并且高效的方式从高浓度D-果糖制造D-塔格糖。
差向异构化D-果糖的步骤可以在金属盐存在下进行。在一个实施例中，金属盐可以包含由以下各项组成的群组选出的至少一个：NiSO4、NiCl2、CoCl2、MnCl2和ZnSO4。举例来说，ZnSO4可以用作金属盐。因为D-果糖的差向异构化步骤是在金属盐存在下进行，可能提高转化活性。
在一个实施例中，用于制造D-塔格糖的方法可以更包含在差向异构化D-果糖的步骤之前水解蔗糖获得D-果糖。水解所用的酶可以包含(但不限于)由以下各项所构成的群组选出的至少一个：β-D-果糖苷酶，如β-呋喃果糖苷酶、转化酶以及蔗糖酶；蔗糖酶、α-葡糖苷酶以及α-D-葡糖水解酶。
在一个实施例中，用于制造D-塔格糖的方法可以更包含在差向异构化D-果糖的步骤之前异构化D-葡萄糖获得D-果糖。异构化所用的酶可以包含(但不限于)葡萄糖异构酶或磷酸葡萄糖异构酶。
在另一实施例中，用于制造D-塔格糖的方法可以更包含在D-果糖的差向异构化步骤之后获得差向异构化的物质。
在另一实施例中，用于制造D-塔格糖的方法可以更包含将获得差向异构化物质的步骤之后获得的差向异构化物质纯化。
在另一实施例中，用于制造D-塔格糖的方法可以更包含在纯化差向异构化物质的步骤之后使所纯化的差向异构化物质结晶。
纯化差向异构化物质的方法不受特别限制，并且可以使用所属领域中使用的任何典型纯化方法。纯化方法的实例可以包含(但不限于)层析法、分步结晶和离子纯化。这些纯化方法可以单独进行或以其组合形式进行。举例来说，差向异构化的物质可以通过层析法纯化。通过层析法分离糖可以基于打算分离的糖与附着于离子树脂的金属离子之间的弱结合强度差异来进行。
根据一个实施例制造D-塔格糖的方法可以更包含在纯化之前或之后脱色、脱盐或既脱色又脱盐。通过脱色和/或脱盐方法，有可能获得不具有杂质的更纯的差向异构化物质。
纯化的差向异构化物质可以在通过浓缩和模拟移动床(Simulated Moving Bed，SMB)层析法获得经纯化的D-塔格糖液体之后进行结晶。
根据一个实施例制造D-塔格糖的方法可以更包含在结晶之前浓缩经分离的塔格糖液体。通过浓缩，经纯化的塔格糖反应物质可以浓缩到约2.5到3倍其初始浓度并且可以更高效地进行结晶。
结晶方法不受特别限制并且可以包含典型结晶方法。举例来说，可以通过冷却结晶进行结晶。通过结晶方法，可以高产量制造最终纯化的D-塔格糖。
根据另一个实施例制造D-塔格糖的方法可以更包含在获得差向异构化物质的步骤中纯化之后重新使用未反应的D-果糖，重新使用在纯化步骤中结晶之后从它分离出晶体的母液，或进行这两个步骤。通过这些步骤，有可能获得高产量的D-塔格糖同时减少未充分利用的D-果糖，由此提供低成本优势。
如本文所用，术语“n位置(下文称为Cn)处的碳”指的是根据IUPAC命名法规定的碳位置，其中n是1或更大的整数。举例来说，“碳4位置处的差向异构”表述为“C4-差向异构”。
本发明的具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)的N末端开始n位置处的氨基酸残基(X)可以表述为nX。
另外，除非在本发明中特别提到取代待突变的氨基酸残基处的氨基酸，否则可以考虑本说明书其它部分中提到的相应位置处能够替换的氨基酸。
在本发明中，氨基酸可以通过如下缩写表述。
[表1]
氨基酸 缩写
丙氨酸(alanine) A
精氨酸(arginine) R
天冬酰胺(asparagines) N
天冬氨酸(aspartic acid) D
半胱氨酸(cystein) C
谷氨酸(glutamic acid) E
谷氨酰胺(glutamine) Q
甘氨酸(glycine) G
组氨酸(histidine) H
异亮氨酸(isoleucine) I
亮氨酸(leucine) L
赖氨酸(lycine) K
甲硫氨酸(methionine) M
苯丙氨酸(phenylalanine) F
脯氨酸(proline) P
丝氨酸(serine) S
苏氨酸(threonine) T
色氨酸(tryptophan) W
酪氨酸(tyrosine) Y
缬氨酸(valine) V
有利作用
本发明可以制造具有改良转化活性来差向异构化D-果糖的碳4位置的己糖醛酸酯C4-差向异构酶(hexuronate C4-epimerase)突变体，并且因此有效地使用所制造的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体和D-果糖作为原料制造D-塔格糖。另外，可以用降低制造成本的节省成本方式制造高产量的D-塔格糖。
具体实施方式
在下文中，将参考一些实例更详细描述本发明。应理解提供这些实例仅为了说明，且不应以任何方式解释为限制本发明。
实例
实例1改良目标位点的设计和分析
基于预期与来源于新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的己糖醛酸酯C4-差向异构酶(下文称为野生型)的氨基酸序列具有同源性的直系同源物(ortholog，预期具有其它微生物物种中的相同功能的同源基因)活性位点三级模型结构的分析，主要选择预期功能上重要的氨基酸。基于针对所选氨基酸和D-果糖的丙氨酸扫描突变诱发(alanine-scanning mutagenesis)分析之后精制(refining)的结构之间的对接模型的分析结果，设计改良的目标位点来提高D-果糖的C4-差向异构的单位活性。下文将解释具体实施方式。
实例1-1直系同源物(ortholog)的分析
从GenBank数据库选出与野生型的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)具有同源性的直系同源物(ortholog)(约60个序列覆盖度(sequence coverage)是80％或更高并且同源性(homology)是50％或更高的直系同源物)。通过所选直系同源物的多序列比对(multiplesequence alignment)分析，鉴别出预期功能上重要的保守氨基酸。
实例1-2酶的三级结构形式的分析
因为蛋白质数据库(Protein Data Bank)显示没有蛋白质结构与野生型和直系同源物具有30％或更高氨基酸序列一致性(Identity)，所以预期通过同源性建模预测的野生型的模型结构可能不准确。因此，对通过多种结构建模服务器(RaptorX、Robetta、ModWeb、M4T、HHpred、PHYRE2、I-TASSER、SWISS-MODEL等)利用多种算法获得的模型之间的活性位点结构进行比较，从而获得通常预期结构位点的信息，将它们用于下一步骤中。
实例1-3丙氨酸扫描突变诱发和对接模拟
通过在大肠杆菌中用丙氨酸取代各氨基酸产生重组突变体酶对选自直系同源物之间的氨基酸序列分析和有效位点的三级模型结构分析的氨基酸进行突变诱发。分析各突变位点的特性。选择通过丙氨酸扫描分析精制的模型结构与D-果糖之间的对接模拟预期为功能上重要的氨基酸，并且接着设计改良目标位点来提高用于D-果糖的C4-差向异构的单位活性。从用于活性改良的目标位点去除通过丙氨酸扫描突变诱发分析完全消除活性的氨基酸残基(催化金属离子结合残基和去质子化/质子化(deprotonation/protonation)中涉及的催化残基)。
实例2制备突变体酶和选择具有改良活性的突变体酶
基于实例1中设计的54个目标位点(从野生型己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N末端开始位置9、21、60、62、68、77、91、97、125、126、140、141、145、149、157、158、160、163、164、166、167、168、175、176、177、185、202、218、221、231、241、242、267、268、272、276、284、295、297、302、306、316、337、351、361、366、386、388、402、403、415、429、440和441处的氨基酸残基)建构单位点饱和度突变诱发文库(single-site saturation mutagenesis library)。此后，通过筛选选出具有改良单位活性的突变位点和氨基酸。通过在所选改良位点上并入信息，制备多个突变体酶。此后，开发出针对D-果糖C4-差向异构化转化具有改良单位活性的突变体酶。
实例2-1饱和突变诱发(saturation mutagenesis)
使用所制备的用于表达大肠杆菌BL21(DE3)中的野生型酶基因的重组表达载体(将野生型酶基因引入到pET21a的NdeI和XhoI的限制酶位点，由此在C末端表达6xHis-标签重组酶)作为用于突变体文库构造的饱和突变诱发的模板(template)。鉴于突变频率变化和突变体产量等，使用基于反向(inversed)PCR的饱和突变诱发(2014.分析生物化学(Anal.Biochem.)449:90-98)。为了将筛选所建构的突变体文库的规模降到最低(将针对饱和突变诱发引入的密码子数目降到最低)，设计和使用混合引物NDT/VMA/ATG/TGG(2012.生物技术(Biotechniques)52:149-158)，其中不包含大肠杆菌的终止密码子和稀有密码子(rare codons)。具体来说，使用存在于突变位点前侧的15bp，取代突变位点的3bp(NDT、VMA、ATG和TGG)以及存在于突变位点后侧的15bp来建构总长度是33bp的混合引物。通过重复由以下各项组成的30个周期来进行PCR：在94℃下变性2分钟，在94℃下变性30分钟，在60℃下退火30分钟，并且在72℃下延长10分钟，随后在72℃下伸长60分钟。在构造用于所选氨基酸位点的饱和突变诱发文库之后，无规选择各文库的突变体(<突变11)。分析突变体的碱基序列并且根据氨基酸突变频率评估。基于所述结果，筛选各文库的规模设为序列覆盖度(sequence coverage)是90％或更高(2003.核酸研究(Nucleic Acids Res.)15；31:e30)。
实例2-2筛选具有改良活性的突变体酶并且制备多个突变体酶
为了大规模的从所建构的饱和突变诱发文库高处理量筛选具有改良活性的突变体酶，使用能够专门定量D-果糖的比色方法。具体来说，将70％福林-西奥卡特试剂(folin-ciocalteu reagent)(西格玛-奥德里奇公司(SIGMA-ALDRICH))与反应液体混合成15:1比率的基质，随后在80℃下反应5分钟，接着在900纳米下测量光密度(OD)。对所获得的OD值进行比较和分析。
当与野生型酶(SEQ ID NO:1)比较相对活性时，首先筛选出54种具有改良活性的突变体酶(D-塔格糖转化成D-果糖)。对相应基因进行测序，接着针对氨基酸变化形式进行分析(表2到表5)。
使用纯化酶液体(通过His-标签亲和层析法纯化)使首先选择的突变体酶与D-果糖反应，接着对所得酶反应产物进行HPLC分析(Shodex SUGAR SP-G柱，柱分析温度：80℃，移动相：H2O，流动速率：0.6ml/min，折射率检测器)。基于HPLC分析结果，最终选择与野生型酶相比从D-果糖制造D-塔格糖的活性提高的222种突变体酶。
实例3比较评估具有改良活性的突变体酶
为了评估突变体酶在具有改良单位活性的单个位点处和突变体酶在具有改良单位活性的多个位点处的D-果糖C4-差向异构的相对活性，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达每种酶，随后通过His-标签亲和层析法纯化。向30％(w/v)D-果糖基质添加浓度10单位/毫升的酶液体，随后在60℃和pH 7.0[50mM磷酸钾(potassium phosphate)缓冲液]下反应两小时，由此测量突变体酶与来源于新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的野生型重组酶(野生型，SEQ ID NO:1)相比的D-果糖C4-差向异构相对活性。
[表2]
[表3]
[表4]
[表5]
从上述结果可以看出，确认根据本发明的C4-差向异构酶突变体与野生型酶相比具有改良的D-果糖C4-差向异构化活性，具体来说，M184酶突变体展现比野生型酶提高约20倍的D-塔格糖制造活性。
尽管本文中已经描述了一些实施例，但所属领域的技术人员应理解，这些实施例仅作为说明给出，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改、变化以及更改。因此，本发明的范围应仅由所附权利要求和其等效物来限制。
序列表
<110> CJ 第一制糖株式会社
<120> 具有改良的转化活性的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体，和使用其制造D-塔格糖的方
<130> P16-0840
<140> PCT/KR2016/008412
<141> 2016-07-29
<150> KR 2015/0107436
<151> 2015-07-29
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 481
<212> PRT
<213> 野生型的己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Artificial Sequence)
<400> 1
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Lys Gly Glu Glu Gly Lys Ile Leu Val Val Ala Gly Glu Lys Ala Pro
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Glu Gly Leu Ser Phe Phe Lys Lys Gln Arg Val Glu Gly Val Ser Phe
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Phe Phe Cys Glu Arg Asn His Glu Asn Leu Glu Val Leu Arg Lys Tyr
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Phe Pro Asp Leu Lys Pro Val Arg Ala Gly Leu Arg Ala Ser Phe Gly
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210 215 220
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325 330 335
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Gly
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<213> 野生型的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的核酸序列(Artificial Sequence)
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Claims (16)

1.一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体，其具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中从己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)的N末端开始位置125处的丝氨酸(S)、位置185处的丝氨酸(S)、位置267处的缬氨酸(V)、位置268处的丝氨酸(S)、位置272处的苏氨酸(T)、位置306处的色氨酸(W)、位置386处的精氨酸(R)以及位置403处的酪氨酸(Y)发生突变。
2.根据权利要求1所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体，其中
位置403处的酪氨酸(Y)经丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)或色氨酸(W)取代
位置125处的丝氨酸(S)经半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)取代，
位置185处的丝氨酸(S)经丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)或精氨酸(R)取代，
位置267处的缬氨酸(V)经甲硫氨酸(M)取代，
位置268处的丝氨酸(S)经半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代，
位置272处的苏氨酸(T)经丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)或缬氨酸(V)取代，
位置306处的色氨酸(W)经苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、甲硫氨酸(M)或缬氨酸(V)取代，，以及
位置386处的精氨酸(R)经脯氨酸(P)或缬氨酸(V)取代。
3.根据权利要求1所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体，所述己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体在由以下各项组成的群组选出的一个或多个氨基酸残基处进一步突变：位置97处的苏氨酸(T)、位置126处的缬氨酸(V)、位置145处的色氨酸(W)、位置163处的缬氨酸(V)、位置164处的赖氨酸(K)、位置166处的脯氨酸(P)、位置231处的天冬氨酸(D)、位置241处的缬氨酸(V)、位置276处的苏氨酸(T)、位置337处的赖氨酸(K)、位置366处的丙氨酸(A)、位置402处的丝氨酸(S)、位置429处的天冬氨酸(D)以及位置440处的酪氨酸(Y)。
4.根据权利要求3所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体，其中
位置97处的苏氨酸(T)经丙氨酸(A)或亮氨酸(L)取代，
位置126处的缬氨酸(V)经苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)或精氨酸(R)取代，
位置145处的色氨酸(W)经丙氨酸(A)取代，
位置163处的缬氨酸(V)经丙氨酸(A)、甲硫氨酸(M)或谷氨酰胺(Q)取代，
位置164处的赖氨酸(K)经甲硫氨酸(M)取代，
位置166处的脯氨酸(P)经精氨酸(R)取代，
位置231处的天冬氨酸(D)经精氨酸(R)取代，
位置241处的缬氨酸(V)经天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)或半胱氨酸(S)取代，
位置276处的苏氨酸(T)经谷氨酸(E)或丙氨酸(A)取代，
位置337处的赖氨酸(K)经谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)取代，
位置366处的丙氨酸(A)经丝氨酸(S)、甘氨酸(G)或半胱氨酸(C)取代，
位置402处的丝氨酸(S)经苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)或酪氨酸(Y)取代，
位置429处的天冬氨酸(D)经脯氨酸(P)取代，以及
位置440处的酪氨酸(Y)经丙氨酸(A)取代。
5.根据权利要求3所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体，其中位置97处的苏氨酸(T)进一步突变的所述C4-差向异构酶突变体另外在由以下各项组成的群组选出的一个或多个氨基酸残基处突变：位置164处的赖氨酸(K)、位置166处的天冬氨酸(D)和位置231处的天冬氨酸(D)。
6.根据权利要求5所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体，其中位置164处的赖氨酸(K)经甲硫氨酸(M)取代，位置166处的天冬氨酸(D)经精氨酸(R)取代并且位置231处的天冬氨酸(D)经精氨酸(R)取代。
7.根据权利要求3所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体，其中位置163处的缬氨酸(V)进一步突变的所述C4-差向异构酶突变体另外在位置231处的天冬氨酸(D)处突变。
8.根据权利要求7所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体，其中位置231处的天冬氨酸(D)经精氨酸(R)取代。
9.根据权利要求3所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体，其中位置337处的赖氨酸(K)进一步突变的所述C4-差向异构酶突变体另外在由以下各项组成的群组选出的一个或多个氨基酸残基处突变：位置157处的甘氨酸(G)、位置160处的丙氨酸(A)、位置167处的谷氨酸(E)、位置177处的苯丙氨酸(F)、位置218处的甘氨酸(G)、位置295处的苯丙氨酸(F)、位置302处的苯丙氨酸(F)、位置361处的苯丙氨酸(F)、位置366处的丙氨酸(A)以及位置441处的甘氨酸(G)。
10.根据权利要求9所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体，其中
位置157处的甘氨酸(G)经精氨酸(R)取代，
位置160处的丙氨酸(A)经亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)取代，
位置167处的谷氨酸(E)经丙氨酸(A)、色氨酸(W)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)或丝氨酸(S)取代，
位置177处的苯丙氨酸(F)经酪氨酸(Y)、组氨酸(H)或亮氨酸(L)取代，
位置218处的甘氨酸(G)经异亮氨酸(I)、丝氨酸(S)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)或半胱氨酸(C)取代，
位置295处的苯丙氨酸(F)经半胱氨酸(C)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)取代，
位置302处的苯丙氨酸(F)经半胱氨酸(C)取代，
位置361处的苯丙氨酸(F)经赖氨酸(K)、谷氨酸(E)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、甲硫氨酸(M)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)或半胱氨酸(C)取代，
位置366处的丙氨酸(A)经丝氨酸(S)取代，以及
位置441处的甘氨酸(G)经谷氨酸(E)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、丙氨酸(A)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)或苯丙氨酸(F)取代。
11.一种核酸，其编码根据权利要求1到10中任一项所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体。
12.一种转型体，其包括根据权利要求11所述的核酸。
13.一种用于制造D-塔格糖的组成物，其包括根据权利要求1到10中任一项所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体。
14.一种用于制造D-塔格糖的方法，其包括：
通过使D-果糖(D-fructose)与根据权利要求1所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶突变体、根据权利要求12所述的转型体或根据权利要求13所述的用于制造D-塔格糖的组成物接触使D-果糖差向异构化(epimerization)。
15.根据权利要求14所述的用于制造D-塔格糖的方法，其中所述差向异构化是在金属盐存在下进行。
16.根据权利要求14所述的用于制造D-塔格糖的方法，其更包括：
在差向异构化步骤之前，使用酶水解蔗糖以获得D-果糖或使用酶异构化D-葡萄糖以获得D-果糖。
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