CN108368498A - 具有改良的d-塔格糖转化活性的己糖醛酸酯c4-差向异构酶变异体和用它制造d-塔格糖的方法 - Google Patents

具有改良的d-塔格糖转化活性的己糖醛酸酯c4-差向异构酶变异体和用它制造d-塔格糖的方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种具有改良的己糖醛酸酯C4‑差向异构酶转化活性的己糖醛酸酯C4‑差向异构酶变异体和用它制造D‑塔格糖的方法。

Description

具有改良的D-塔格糖转化活性的己糖醛酸酯C4-差向异构酶 变异体和用它制造D-塔格糖的方法
技术领域
本发明涉及一种具有改良的D-塔格糖转化活性的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体和用它制造D-塔格糖的方法。
背景技术
塔格糖是一种少量存在于如牛奶、乳酪、可可等食品和如苹果与橘子的天然甜味水果中的天然甜味剂，并且还具有与糖的物理性质类似的物理性质。塔格糖所具有的热量是1.5千卡/克，大约是糖的三分之一，并且所具有的血糖生成指数(glycemic index，GI)是3，大约是糖的5％。塔格糖具有多种健康功能，而且甜度类似于糖，因此，塔格糖可被用作在应用于各种产品时能够同时满足健康和口味需求的替代甜味剂。
已知常规塔格糖制造方法包含化学(催化反应)方法和生物(异构化酶反应)方法，使用半乳糖作为主原料(参见第2009-0082774号韩国专利特许公开公布)。然而，因为原料乳(原乳)和乳糖在国际市场上的生产量、需求量和供应量，所以作为上述制造方法中半乳糖的基本原料的乳糖的价格不稳定，因此对稳定地满足用于制造塔格糖的原材料的供求造成了限制。因此需要一种新方法，其中塔格糖能够通过使用常见的、普通的糖(糖、葡萄糖、果糖等)作为原材料来制造。因此，本发明人报告了一种使用新颖的己糖醛酸酯C4-差向异构酶从果糖制造塔格糖的方法(第10-2014-0143109号韩国专利特许公开公布)。然而，对于工业生产来说，必须开发出一种具有较高的塔格糖转化活性的酶。
在这些情况下，本发明人证实了当己糖醛酸酯C4-差向异构酶的特定位置的氨基酸发生突变时，从果糖到塔格糖的转化活性相比于野生型的转化活性来说显著增加，并且完成了本发明。
在本说明书通篇中提到了多个专利和文献，并且其引用显示于圆括号中。这些专利和出版物的公开内容以全文引用的方式并入本文中，从而更加清楚地阐明本发明和本发明所涉及的技术领域的水平。
发明内容
技术问题
本发明的一个目标是提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)变异体，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的酪氨酸(Y)-403氨基酸残基发生突变。
本发明的另一个目标是提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)变异体，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的苏氨酸(T)-272氨基酸残基发生突变。
本发明的再另一个目标是提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)变异体，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的丝氨酸(S)-185氨基酸残基发生突变。
本发明的再另一个目标是提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)变异体，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的亮氨酸(L)-77氨基酸残基发生突变。
本发明的再另一个目标是提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)变异体，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的丙氨酸(A)-158氨基酸残基发生突变。
本发明的再另一个目标是提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)变异体，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的脯氨酸(P)-351氨基酸残基发生突变。
本发明的再另一个目标是提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)变异体，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的丝氨酸(S)-125、赖氨酸(K)-164、天冬氨酸(D)-168以及谷氨酸(E)-175氨基酸残基发生突变。
本发明的再另一个目标是提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)变异体，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的丝氨酸(S)-125、谷氨酰胺(Q)-149以及缬氨酸(V)-267氨基酸残基发生突变。
本发明的再另一个目标是提供一种编码本文中所公开的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体的核酸、包含所述核酸的转化体、表达本发明的变异体的微生物或其培养物或包括本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体的用于制造D-塔格糖的组合物。
本发明的再另一个目标是提供一种用于制造D-塔格糖的方法，所述方法包括使本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体、本发明的转化体、表达本发明的变异体的微生物或其培养物或用于制造本发明的塔格糖的组合物与D-果糖(D-fructose)接触。
在下文中更详细地描述本发明。从以下详细说明和所附的权利要求可以更加清楚本发明的其它目标且优点。类似于本技术领域的技术领域的普通技术人员完全能够想到并推论出本说明书中未加以说明的内容，忽略其细节。
技术解决方案
为了实现本发明的目标，根据本发明的示范性实施例，提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)变异体，其中一个或多个由以下组成的群组中选出的氨基酸残基突变为其它氨基酸残基：由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的组氨酸(H)-9、酪氨酸(Y)-21、谷氨酸(E)-60、缬氨酸(V)-62、谷氨酸(E)-68、亮氨酸(L)-77、亮氨酸(L)-91、苏氨酸(T)-97、丝氨酸(S)-125、缬氨酸(V)-126、亮氨酸(L)-140、天冬氨酸(D)-141、色氨酸(W)-145、谷氨酰胺(Q)-149、甘氨酸(G)-157、丙氨酸(A)-158、丙氨酸(A)-160、缬氨酸(V)-163、赖氨酸(K)-164、脯氨酸(P)-166、谷氨酸(E)-167、天冬氨酸(D)-168、谷氨酸(E)-175、甘氨酸(G)-176、苯丙氨酸(F)-177、丝氨酸(S)-185、蛋氨酸(M)-202、甘氨酸(G)-218、酪氨酸(Y)-221、天冬氨酸(D)-231、缬氨酸(V)-241、酪氨酸(Y)-242、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268、苏氨酸(T)-272、苏氨酸(T)-276、缬氨酸(V)-284、苯丙氨酸(F)-295、苯丙氨酸(F)-297、苯丙氨酸(F)-302、色氨酸(W)-306、亮氨酸(L)-316、赖氨酸(K)-337、脯氨酸(P)-351、苯丙氨酸(F)-361、丙氨酸(A)-366、精氨酸(R)-386、异亮氨酸(I)-388、丝氨酸(S)-402、酪氨酸(Y)-403、缬氨酸(V)-415、天冬氨酸(D)-429、酪氨酸(Y)-440以及甘氨酸(G)-441[参见表2到表10]。
根据本发明的另一个示范性实施例，提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)变异体，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的酪氨酸(Y)-403氨基酸残基发生突变。
酪氨酸(Y)-403氨基酸残基可被以下取代：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)或色氨酸(W)，并且更具体来说，可被苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或异亮氨酸(I)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了第403号位置之外，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的丝氨酸(S)-125氨基酸残基也可以另外发生突变。丝氨酸(S)-125氨基酸残基可被天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)或酪氨酸(Y)取代。在示范性实施例的一个实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中酪氨酸(Y)-403氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)或缬氨酸(V)取代，并且丝氨酸(S)-125氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代。
在示范性实施例的一个实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中除了酪氨酸(Y)-403氨基酸残基和丝氨酸(S)-125氨基酸残基之外，一个或多个由以下组成的群组中选出的氨基酸残基也可以另外发生突变：由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的丝氨酸(S)-185、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268、苏氨酸(T)-272、色氨酸(W)-306以及精氨酸(R)-386。丝氨酸(S)-185可被赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)或甘氨酸(G)取代；缬氨酸(V)-267可被蛋氨酸(M)取代；丝氨酸(S)-268可被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代；苏氨酸(T)-272可被丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、缬氨酸(V)或酪氨酸(Y)取代；色氨酸(W)-306可被苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)取代；精氨酸(R)-386可被脯氨酸(P)或缬氨酸(V)取代。
在示范性实施例的一个实例中，本发明可以提供这样一种变异体，所述变异体除了酪氨酸(Y)-403氨基酸残基和丝氨酸(S)-125氨基酸残基的突变之外，还在丝氨酸(S)-185、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268、苏氨酸(T)-272、色氨酸(W)-306以及精氨酸(R)-386中的任何一个位置发生突变。举例来说，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中酪氨酸(Y)-403氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或异亮氨酸(I)取代，丝氨酸(S)-125氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代，并且丝氨酸(S)-185氨基酸残基被赖氨酸(K)、组氨酸(H)或谷氨酰胺(Q)取代。在一个实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中酪氨酸(Y)-403氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或异亮氨酸(I)取代，丝氨酸(S)-125氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代，并且缬氨酸(V)-267氨基酸残基被蛋氨酸(M)取代。在一个实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中酪氨酸(Y)-403氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或异亮氨酸(I)取代，丝氨酸(S)-125氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代，并且丝氨酸(S)-268氨基酸残基被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代。在一个实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中酪氨酸(Y)-403氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或异亮氨酸(I)取代，丝氨酸(S)-125氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代，并且苏氨酸(T)-272氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代。在一个实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中酪氨酸(Y)-403氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或异亮氨酸(I)取代，丝氨酸(S)-125氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代，并且色氨酸(W)-306氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)取代。在一个实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中酪氨酸(Y)-403氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或异亮氨酸(I)取代，丝氨酸(S)-125氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代，并且精氨酸(R)-386氨基酸残基被脯氨酸(P)或缬氨酸(V)取代。
在示范性实施例的另一个实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，所述变异体除了酪氨酸(Y)-403氨基酸残基和丝氨酸(S)-125氨基酸残基之外，还在由丝氨酸(S)-185、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268、苏氨酸(T)-272、色氨酸(W)-306以及精氨酸(R)-386中选出的任何两个位置处发生取代。突变位置可以是位置185和267、位置185和268、位置185和272、位置185和306、位置185和386、位置267和268、位置267和272、位置267和306、位置267和386、位置268和272、位置268和306、位置268和386、位置272和306、位置272和386或位置306和386。举例来说，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中酪氨酸(Y)-403氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或异亮氨酸(I)取代，丝氨酸(S)-125氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代，丝氨酸(S)-185氨基酸残基被赖氨酸(K)、组氨酸(H)或谷氨酰胺(Q)取代，并且缬氨酸(V)-267被蛋氨酸(M)取代。在一个实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中酪氨酸(Y)-403氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或异亮氨酸(I)取代，丝氨酸(S)-125氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代，丝氨酸(S)-185氨基酸残基被赖氨酸(K)、组氨酸(H)或谷氨酰胺(Q)取代，并且丝氨酸(S)-268氨基酸残基被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代。在一个实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中酪氨酸(Y)-403氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或异亮氨酸(I)取代，丝氨酸(S)-125氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代，丝氨酸(S)-185氨基酸残基被赖氨酸(K)、组氨酸(H)或谷氨酰胺(Q)取代，并且苏氨酸(T)-272被天冬氨酸(D)取代。在一个实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中酪氨酸(Y)-403氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或异亮氨酸(I)取代，丝氨酸(S)-125氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代，丝氨酸(S)-268氨基酸残基被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代，并且色氨酸(W)-306被苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)取代。在一个实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中酪氨酸(Y)-403氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或异亮氨酸(I)取代，丝氨酸(S)-125氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代，丝氨酸(S)-268氨基酸残基被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代，并且精氨酸(R)-386氨基酸残基被脯氨酸(P)或缬氨酸(V)取代。
在示范性实施例的另一个实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，所述变异体除了酪氨酸(Y)-403氨基酸残基和丝氨酸(S)-125氨基酸残基之外，还在由丝氨酸(S)-185、缬氨酸(V)-267、苏氨酸(T)-272、色氨酸(W)-306以及精氨酸(R)-386中选出的任何三个位置处发生取代。突变位置可以是例如位置185、267和268；位置185、267和272；位置185、267和306；位置185、267和386；位置185、268和272；位置185、268和306；位置185、268和386；位置185、272和306；位置185、272和386；位置267、268和272；位置267、268和306；位置267、268和386；位置267、272和306；位置267、272和386；位置267、386和306；位置268、272和306；位置268、272和386；位置268、306和386；或位置272、306和386。在一个实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中酪氨酸(Y)-403氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或异亮氨酸(I)取代，丝氨酸(S)-125氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代，丝氨酸(S)-185氨基酸残基被赖氨酸(K)、组氨酸(H)或谷氨酰胺(Q)取代，缬氨酸(V)-267氨基酸残基被蛋氨酸(M)取代，并且丝氨酸(S)-268氨基酸残基被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代。举例来说，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中酪氨酸(Y)-403氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或异亮氨酸(I)取代，丝氨酸(S)-125氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代，丝氨酸(S)-185氨基酸残基被赖氨酸(K)、组氨酸(H)或谷氨酰胺(Q)取代，缬氨酸(V)-267氨基酸残基被蛋氨酸(M)取代，并且苏氨酸(T)-272被天冬氨酸(D)取代。举例来说，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中酪氨酸(Y)-403氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或异亮氨酸(I)取代，丝氨酸(S)-125氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代，丝氨酸(S)-185氨基酸残基被赖氨酸(K)、组氨酸(H)或谷氨酰胺(Q)取代，缬氨酸(V)-267氨基酸残基被蛋氨酸(M)取代，并且色氨酸(W)-306氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)取代。
在示范性实施例的另一个实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，所述变异体除了酪氨酸(Y)-403氨基酸残基和丝氨酸(S)-125氨基酸残基之外，还在由丝氨酸(S)-185、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268、苏氨酸(T)-272、色氨酸(W)-306以及精氨酸(R)-386中选出的任何四个、五个或六个位置处发生取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了酪氨酸(Y)-403、丝氨酸(S)-125以及丝氨酸(S)-268氨基酸残基之外，由氨基酸序列SEQ IDNO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的赖氨酸(K)-164、天冬氨酸(D)-168、谷氨酸(E)-175、天冬酰胺(N)-297以及异亮氨酸(I)-388也可以另外发生突变。赖氨酸(K)-164可被蛋氨酸(M)取代，天冬氨酸(D)-168可被谷氨酸(E)取代，谷氨酸(E)-175可被甘氨酸(G)取代，天冬酰胺(N)-297可被赖氨酸(K)取代，并且异亮氨酸(I)-388可被缬氨酸(V)取代。示范性实施例的一个实例的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中酪氨酸(Y)-403氨基酸残基被苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或异亮氨酸(I)取代，丝氨酸(S)-125氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代，丝氨酸(S)-268氨基酸残基被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代，并且赖氨酸(K)-164被蛋氨酸(M)取代，天冬氨酸(D)-168被谷氨酸(E)取代，谷氨酸(E)-175被甘氨酸(G)取代，天冬酰胺(N)-297被赖氨酸(K)取代，并且异亮氨酸(I)-388被缬氨酸(V)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了酪氨酸(Y)-403、丝氨酸(S)-125、缬氨酸(V)-267以及精氨酸(R)-386氨基酸残基之外，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的脯氨酸(P)-351也可以另外发生突变。具体来说，脯氨酸(P)-351可被丝氨酸(S)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了酪氨酸(Y)-403、丝氨酸(S)-125、丝氨酸(S)-185、缬氨酸(V)-267以及色氨酸(W)-306氨基酸残基之外，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的谷氨酸(E)-68也可以另外发生突变。谷氨酸(E)-68可被甘氨酸(G)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了酪氨酸(Y)-403、丝氨酸(S)-125、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268以及精氨酸(R)-386氨基酸残基之外，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的谷氨酸(E)-60、蛋氨酸(M)-202、酪氨酸(Y)-221以及酪氨酸(Y)-242也可以另外发生突变。谷氨酸(E)-60可被天冬氨酸(D)取代，蛋氨酸(M)-202可被苏氨酸(T)取代，酪氨酸(Y)-221可被苯丙氨酸(F)取代，并且酪氨酸(Y)-242可被苯丙氨酸(F)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了酪氨酸(Y)-403和丝氨酸(S)-125氨基酸残基之外，一个或多个由丝氨酸(S)-185、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268、苏氨酸(V)-272、色氨酸(W)-306以及精氨酸(R)-386组成的群组中选出的氨基酸残基也可以另外发生突变，并且在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，一个或多个由以下组成的群组中选出的氨基酸残基可以另外发生突变：由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的亮氨酸(L)-91、天冬氨酸(D)-141以及甘氨酸(G)-176。具体来说，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了酪氨酸(Y)-403、丝氨酸(S)-125、丝氨酸(S)-185、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268以及苏氨酸(T)-272氨基酸残基之外，亮氨酸(L)-91、天冬氨酸(D)-141或甘氨酸(G)-176氨基酸残基也可以另外发生突变。亮氨酸(L)-91可被色氨酸(W)、异亮氨酸(I)或天冬酰胺(N)取代，天冬氨酸(D)-141可被苯丙氨酸(F)取代，并且甘氨酸(G)-176可被组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了酪氨酸(Y)-403和丝氨酸(S)-125氨基酸残基之外，一个或多个由缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268、苏氨酸(T)-272以及色氨酸(W)-306组成的群组中选出的氨基酸残基也可以另外发生突变，并且在己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的缬氨酸(V)-284或缬氨酸(V)-415可以另外发生突变。具体来说，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了酪氨酸(Y)-403、丝氨酸(S)-125、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268、苏氨酸(T)-272以及色氨酸(W)-306氨基酸残基之外，缬氨酸(V)-284和缬氨酸(V)-415氨基酸残基也可以另外发生突变。缬氨酸(V)-284可被丙氨酸(A)取代，并且缬氨酸(V)-415可被谷氨酸(E)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了酪氨酸(Y)-403和丝氨酸(S)-125氨基酸残基之外，一个或多个由丝氨酸(S)-185、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268、苏氨酸(V)-272以及色氨酸(W)-306组成的群组中选出的氨基酸残基也可以另外发生突变，并且在己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，由氨基酸序列SEQ IDNO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的脯氨酸(P)-166或天冬氨酸(D)-231可以另外发生突变。具体来说，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了酪氨酸(Y)-403、丝氨酸(S)-125、丝氨酸(S)-185、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268、苏氨酸(T)-272以及色氨酸(W)-306氨基酸残基之外，脯氨酸(P)-166或天冬氨酸(D)-231也可以另外发生突变。脯氨酸(P)-166可被精氨酸(R)取代，并且天冬氨酸(D)-231可被精氨酸(R)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了酪氨酸(Y)-403和丝氨酸(S)-125氨基酸残基之外，丝氨酸(S)-185、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268、苏氨酸(V)-272以及色氨酸(W)-386氨基酸残基也可以另外发生突变，并且在己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的缬氨酸(V)-126可以另外发生突变。具体来说，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了酪氨酸(Y)-403、丝氨酸(S)-125、丝氨酸(S)-185、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268、苏氨酸(T)-272以及色氨酸(W)-386氨基酸残基之外，缬氨酸(V)-126也可以另外发生突变。缬氨酸(V)-126可被丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、天冬酰胺(R)或苏氨酸(T)取代。
根据本发明的示范性实施例，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)的N端的酪氨酸(Y)-403、丝氨酸(S)-125、丝氨酸(S)-185、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268、苏氨酸(T)-272、色氨酸(W)-306以及精氨酸(R)-386氨基酸残基发生突变。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了SEQ ID NO：1的酪氨酸(Y)-403、丝氨酸(S)-125、丝氨酸(S)-185、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268、苏氨酸(T)-272以及色氨酸(W)-386氨基酸残基之外，苏氨酸(T)-97、缬氨酸(V)-126、色氨酸(W)-145、缬氨酸(V)-163、赖氨酸(K)-164、脯氨酸(P)-166、天冬氨酸(D)-231、缬氨酸(V)-241、苏氨酸(T)-276、赖氨酸(K)-337、丙氨酸(A)-366、丝氨酸(S)-402、天冬氨酸(D)-429或酪氨酸(Y)-440氨基酸残基也可以另外发生突变。苏氨酸(T)-97可被丙氨酸(A)或亮氨酸(L)取代；缬氨酸(V)-126可被苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)或精氨酸(R)取代；色氨酸(W)-145可被丙氨酸(A)取代；缬氨酸(V)-163可被丙氨酸(A)、蛋氨酸(M)或谷氨酰胺(Q)取代；赖氨酸(K)-164可被蛋氨酸(M)取代；脯氨酸(P)-166可被精氨酸(R)取代；天冬氨酸(D)-231可被精氨酸(R)取代；缬氨酸(V)-241可被天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)或丝氨酸(S)取代；苏氨酸(T)-276可被谷氨酸(E)或丙氨酸(A)取代；赖氨酸(K)-337可被谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)取代；丙氨酸(A)-366可被丝氨酸(S)、甘氨酸(G)或半胱氨酸(C)取代；丝氨酸(S)-402可被苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)或酪氨酸(Y)取代；天冬氨酸(D)-429可被脯氨酸(P)取代，并且酪氨酸(Y)-440可被丙氨酸(A)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了酪氨酸(Y)-403、丝氨酸(S)-125、丝氨酸(S)-185、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268、苏氨酸(T)-272、色氨酸(W)-386以及苏氨酸(T)-97氨基酸残基之外，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的赖氨酸(K)-164、天冬氨酸(D)-166或天冬氨酸(D)-231氨基酸残基也可以另外发生突变。赖氨酸(K)-164可被蛋氨酸(M)取代；天冬氨酸(D)-166可被精氨酸(R)取代；并且天冬氨酸(D)-231可被精氨酸(R)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了酪氨酸(Y)-403、丝氨酸(S)-125、丝氨酸(S)-185、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268、苏氨酸(T)-272、色氨酸(W)-386以及缬氨酸(V)-163氨基酸残基之外，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的天冬氨酸(D)-231氨基酸残基也可以另外发生突变。天冬氨酸(D)-231可被精氨酸(R)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了酪氨酸(Y)-403、丝氨酸(S)-125、丝氨酸(S)-185、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268、苏氨酸(T)-272、色氨酸(W)-386以及赖氨酸(K)-337氨基酸残基之外，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的甘氨酸(G)-157、丙氨酸(A)-160、谷氨酸(E)-167、苯丙氨酸(F)-177、甘氨酸(G)-218、苯丙氨酸(F)-295、苯丙氨酸(F)-302、苯丙氨酸(F)-361、丙氨酸(A)-366或甘氨酸(G)-441氨基酸残基也可以另外发生突变。甘氨酸(G)-157可被精氨酸(R)取代；丙氨酸(A)-160可被亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)取代；谷氨酸(E)-167可被丙氨酸(A)、色氨酸(W)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)或丝氨酸(S)取代；苯丙氨酸(F)-177可被酪氨酸(Y)、组氨酸(H)或亮氨酸(L)取代；甘氨酸(G)-218可被异亮氨酸(I)、丝氨酸(S)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)或半胱氨酸(C)取代；苯丙氨酸(F)-295可被半胱氨酸(C)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)取代；苯丙氨酸(F)-302可被半胱氨酸(C)取代；苯丙氨酸(F)-361可被赖氨酸(K)、谷氨酸(E)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、蛋氨酸(M)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)或半胱氨酸(C)取代；丙氨酸(A)-366可被丝氨酸(S)取代；甘氨酸(G)-441可被谷氨酸(E)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、丙氨酸(A)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)或苯丙氨酸(F)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了酪氨酸(Y)-403氨基酸残基和丝氨酸(S)-125氨基酸残基之外，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的亮氨酸(L)-77氨基酸残基、丙氨酸(A)-158氨基酸残基或所述氨基酸残基的组合也可以另外发生突变。亮氨酸(L)-77可被脯氨酸(P)或精氨酸(R)取代，并且丙氨酸(A)-158可被苏氨酸(T)取代。在酪氨酸(Y)-403、丝氨酸(S)-125、亮氨酸(L)-77氨基酸残基以及丙氨酸(A)-158氨基酸残基发生突变的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的精氨酸(R)-386氨基酸残基可以另外发生突变。精氨酸(R)-386可被脯氨酸(P)或缬氨酸(V)取代。
根据本发明的另一个示范性实施例，提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)变异体，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的丝氨酸(S)-185氨基酸残基发生突变。丝氨酸(S)-185氨基酸残基可被丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)或精氨酸(R)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了第185号位置之外，丝氨酸(S)-125氨基酸残基也可以另外发生突变。丝氨酸(S)-125氨基酸残基可被半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)取代。在示范性实施例的一个实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中丝氨酸(S)-185氨基酸残基被丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)或精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)-125氨基酸残基被半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)取代。在一个具体实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中丝氨酸(S)-185氨基酸残基被丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)或精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)-125氨基酸残基被天冬氨酸(D)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了丝氨酸(S)-185和丝氨酸(S)-125之外，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的丝氨酸(S)-268氨基酸残基也另外发生突变。丝氨酸(S)-268可被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代。
根据本发明的另一个示范性实施例，提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)变异体，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的苏氨酸(T)-272氨基酸残基发生突变。苏氨酸(T)-272可被丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、缬氨酸(V)或酪氨酸(Y)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了苏氨酸(T)-272氨基酸残基之外，丝氨酸(S)-125氨基酸残基也可以另外发生突变。丝氨酸-125氨基酸残基可被半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)取代。因此，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中苏氨酸(T)-272被丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、缬氨酸(V)或酪氨酸(Y)取代，并且丝氨酸(S)-125被半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)取代。在一个实例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中苏氨酸(T)-272被丝氨酸(S)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、组氨酸(H)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、赖氨酸(K)或酪氨酸(Y)取代，并且丝氨酸(S)-125被天冬氨酸(D)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了苏氨酸(T)-272和丝氨酸(S)-125氨基酸残基之外，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的丝氨酸(S)-185氨基酸残基也可以另外发生突变。丝氨酸(S)-185氨基酸残基可被丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)或精氨酸(R)取代。在一个示范性实施例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中苏氨酸(T)-272被天冬氨酸(D)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)或丝氨酸(S)取代，丝氨酸(S)-125被天冬氨酸(D)取代，并且丝氨酸(S)-185被赖氨酸(K)取代。
在示范性实施例的一个实例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了苏氨酸(T)-272、丝氨酸(S)-125以及丝氨酸(S)-185氨基酸残基之外，一个或多个由以下组成的群组中选出的氨基酸残基也另外发生突变：由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268以及色氨酸(W)-306。变异体可以是这样的变异体，其中缬氨酸(V)-267被蛋氨酸(M)取代，丝氨酸(S)-268被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代，并且色氨酸(W)-306被苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)取代。在一个示范性实施例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中苏氨酸(T)-272被天冬氨酸(D)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)或丝氨酸(S)取代，丝氨酸(S)-125被天冬氨酸(D)取代，丝氨酸(S)-185被赖氨酸(K)取代，并且缬氨酸(V)-267被蛋氨酸(M)取代。在一个示范性实施例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中苏氨酸(T)-272被天冬氨酸(D)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)或丝氨酸(S)取代，丝氨酸(S)-125被天冬氨酸(D)取代，丝氨酸(S)-185被赖氨酸(K)取代，并且丝氨酸(S)-268被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代。在一个示范性实施例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中苏氨酸(T)-272被天冬氨酸(D)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)或丝氨酸(S)取代，丝氨酸(S)-125被天冬氨酸(D)取代，丝氨酸(S)-185被赖氨酸(K)取代，并且色氨酸(W)-306被苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)取代。在一个示范性实施例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中苏氨酸(T)-272被天冬氨酸(D)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)或丝氨酸(S)取代，丝氨酸(S)-125被天冬氨酸(D)取代，丝氨酸(S)-185被赖氨酸(K)取代，缬氨酸(V)-267被蛋氨酸(M)取代，并且丝氨酸(S)-268被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代。在一个示范性实施例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中苏氨酸(T)-272被天冬氨酸(D)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)或丝氨酸(S)取代，丝氨酸(S)-125被天冬氨酸(D)取代，丝氨酸(S)-185被赖氨酸(K)取代，缬氨酸(V)-267被蛋氨酸(M)取代，并且色氨酸(W)-306被苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)取代。在一个示范性实施例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中苏氨酸(T)-272被天冬氨酸(D)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)或丝氨酸(S)取代，丝氨酸(S)-125被天冬氨酸(D)取代，丝氨酸(S)-185被赖氨酸(K)取代，丝氨酸(S)-268被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代，并且色氨酸(W)-306被苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)取代。在一个示范性实施例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中苏氨酸(T)-272被天冬氨酸(D)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)或丝氨酸(S)取代，丝氨酸(S)-125被天冬氨酸(D)取代，丝氨酸(S)-185被赖氨酸(K)取代，缬氨酸(V)-267被蛋氨酸(M)取代，丝氨酸(S)-268被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代，并且色氨酸(W)-306被苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)取代。
在一个示范性实施例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中除了苏氨酸(T)-272和丝氨酸(S)-125残基之外，缬氨酸(V)-267残基、丝氨酸(S)-268残基或缬氨酸(V)-267残基与丝氨酸(S)-268残基的组合也另外发生突变。缬氨酸(V)-267残基可被蛋氨酸(M)取代，并且丝氨酸(S)-268可被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代。在一个示范性实施例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中苏氨酸(T)-272被天冬氨酸(D)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)或丝氨酸(S)取代，丝氨酸(S)-125被天冬氨酸(D)取代，缬氨酸(V)-267被蛋氨酸(M)取代，并且丝氨酸(S)-268被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代。
在一个示范性实施例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中除了苏氨酸(T)-272和丝氨酸(S)-125；以及缬氨酸(V)-267和/或丝氨酸(S)-268之外，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的天冬氨酸(D)-231、精氨酸(R)-386或其组合也另外发生突变。天冬氨酸(D)-231可被精氨酸(R)取代，并且精氨酸(R)-386可被脯氨酸(P)或缬氨酸(V)取代。在一个示范性实施例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中苏氨酸(T)-272被天冬氨酸(D)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)或丝氨酸(S)取代，丝氨酸(S)-125被天冬氨酸(D)取代，缬氨酸(V)-267被蛋氨酸(M)取代，丝氨酸(S)-268被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代，天冬氨酸(D)-231被精氨酸(R)取代，精氨酸(R)-386被脯氨酸(P)或缬氨酸(V)取代，或第231号和第386号这两个位置分别被精氨酸(R)或脯氨酸(P)或缬氨酸(V)取代。
在一个示范性实施例中，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中除了苏氨酸(T)-272、丝氨酸(S)-125、缬氨酸(V)-267、丝氨酸(S)-268以及精氨酸(R)-386之外，一个或多个由以下组成的群组中选出的氨基酸残基也另外发生突变：由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的苏氨酸(T)-97、谷氨酰胺(Q)-149、脯氨酸(P)-166或脯氨酸(P)-351。苏氨酸(T)-97可被丙氨酸(A)或亮氨酸(L)取代，谷氨酰胺(Q)-149可被精氨酸(R)取代，脯氨酸(R)-166可被精氨酸(R)取代，并且脯氨酸(P)-351可被丝氨酸(S)取代。在示范性实施例的一个实例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，苏氨酸(T)-272可被天冬氨酸(D)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、谷氨酰胺(Q)或丝氨酸(S)取代，丝氨酸(S)-125可被天冬氨酸(D)取代，缬氨酸(V)-267可被蛋氨酸(M)取代，丝氨酸(S)-268可被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代，精氨酸(R)-386可被缬氨酸(V)取代，或苏氨酸(T)-97可被丙氨酸(A)或亮氨酸(L)取代，或谷氨酰胺(Q)-149可被精氨酸(R)取代，脯氨酸(P)-166可被精氨酸(R)取代，或脯氨酸(P)-351可被丝氨酸(S)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了苏氨酸(T)-272、丝氨酸(S)-125以及缬氨酸(V)-267和/或丝氨酸(S)-268氨基酸残基之外，一个或多个由以下组成的群组中选出的氨基酸残基也可以另外发生突变：由氨基酸序列SEQID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的赖氨酸(K)-164、天冬氨酸(D)-168以及谷氨酸(E)-175。赖氨酸(K)-164可被蛋氨酸(M)取代，天冬氨酸(D)-168可被谷氨酸(E)取代，并且谷氨酸(E)-175可被甘氨酸(G)取代。
根据本发明的另一个示范性实施例，提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)变异体，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的亮氨酸(L)-77氨基酸残基发生突变。亮氨酸(L)-77可被脯氨酸(P)或精氨酸(R)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了亮氨酸(L)-77氨基酸残基之外，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的丝氨酸(S)-125氨基酸残基也可以另外发生突变。丝氨酸-125可被半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了亮氨酸(L)-77和丝氨酸(S)-125氨基酸残基之外，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的丙氨酸(A)-158、脯氨酸(P)-351或所述氨基酸残基的组合也可以另外发生突变。丙氨酸(A)-158可被苏氨酸(T)取代，并且脯氨酸(P)-351可被丝氨酸(S)取代。
在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了亮氨酸(L)-77、丝氨酸(S)-125以及丙氨酸(A)-158氨基酸残基之外，一个或多个由以下组成的群组中选出的氨基酸残基也可以另外发生突变：由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的组氨酸(H)-9、谷氨酸(E)-60以及缬氨酸(V)-415。具体来说，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，亮氨酸(L)-77、丝氨酸(S)-125、丙氨酸(A)-158、组氨酸(H)-9、谷氨酸(E)-60以及缬氨酸(V)-415氨基酸残基可以发生突变。组氨酸(H)-9可被酪氨酸(Y)取代，谷氨酸(E)-60可以是天冬氨酸(D)，并且缬氨酸(V)-415可被谷氨酸(E)取代。
根据本发明的另一个示范性实施例，提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)变异体，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的丙氨酸(A)-158氨基酸残基发生突变。丙氨酸(A)-158可被苏氨酸(T)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了丙氨酸(A)-158氨基酸残基之外，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的丝氨酸(S)-125氨基酸残基也可以另外发生突变。丝氨酸(S)-125可被半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)取代。在一个实例中，在氨基酸序列SEQ ID NO：1中，丙氨酸(A)-158可被苏氨酸(T)取代，并且丝氨酸(S)-125可被半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)取代。在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了丙氨酸(A)-158和丝氨酸(S)-125氨基酸残基之外，一个或多个由以下组成的群组中选出的氨基酸残基也可以另外发生突变：由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的谷氨酰胺(Q)-149和缬氨酸(V)-267以及脯氨酸(P)-351。谷氨酰胺(Q)-149可被精氨酸(R)取代，缬氨酸(V)-267可被蛋氨酸(M)取代，并且脯氨酸(P)-351可被丝氨酸(S)取代。因此，可以提供这样的变异体，其中丙氨酸(A)-158氨基酸残基被苏氨酸(T)取代，丝氨酸(S)-125被天冬氨酸(D)取代，并且谷氨酰胺(Q)-149另外被精氨酸(R)取代或缬氨酸(V)-267被蛋氨酸(M)取代或脯氨酸(P)-351被丝氨酸(S)取代。
根据本发明的另一个示范性实施例，提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)变异体，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的脯氨酸(P)-351氨基酸残基发生突变。脯氨酸(P)-351可被丝氨酸(S)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了脯氨酸(P)-351氨基酸残基之外，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的丝氨酸(S)-125氨基酸残基也可以另外发生突变。丝氨酸(S)-125可被半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)取代。因此，可以提供这样的变异体，其中脯氨酸(P)-351被丝氨酸(S)取代并且丝氨酸(S)-125被半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)取代。
在一个示范性实施例中，在本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，除了脯氨酸(P)-351和丝氨酸(S)-125氨基酸残基之外，缬氨酸(V)-267氨基酸残基也可以另外发生突变。缬氨酸(V)-267可被蛋氨酸(M)取代。在己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，一个或多个由以下组成的群组中选出的氨基酸残基可以另外发生突变：酪氨酸(Y)-21、缬氨酸(V)-62、谷氨酰胺(Q)-149以及亮氨酸(L)-316。酪氨酸(Y)-21可被苯丙氨酸(F)取代，缬氨酸(V)-62可被异亮氨酸(I)取代，谷氨酰胺(Q)-149可被精氨酸(R)取代，并且亮氨酸(L)-316可被苯丙氨酸(F)取代。在示范性实施例的一个实例中，变异体可以是这样的变异体，其中脯氨酸(P)-351被丝氨酸(S)取代，丝氨酸(S)-125被天冬氨酸(D)取代，缬氨酸(V)-267被蛋氨酸(M)取代，酪氨酸(Y)-21被苯丙氨酸(F)取代，缬氨酸(V)-62被异亮氨酸(I)取代，并且谷氨酰胺(Q)-149被精氨酸(R)取代，并且亮氨酸(L)-316被苯丙氨酸(F)取代。
本发明的再另一个目标是提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的丝氨酸(S)-125氨基酸残基、赖氨酸(K)-164氨基酸残基、天冬氨酸(D)-168氨基酸残基以及谷氨酸(E)-175氨基酸残基发生突变。丝氨酸(S)-125可被半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)取代，赖氨酸(K)-164可被蛋氨酸(M)取代，天冬氨酸(D)-168可被谷氨酸(E)取代，并且谷氨酸(E)-175可被甘氨酸(G)取代。
在一个示范性实施例中，在丝氨酸(S)-125、赖氨酸(K)-164、天冬氨酸(D)-168以及谷氨酸(E)-175氨基酸残基发生突变的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体中，一个或多个由以下组成的群组中选出的氨基酸残基可以另外发生突变：由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的亮氨酸(L)-140、精氨酸(R)-386、丝氨酸(S)-268以及天冬酰胺(N)-297。亮氨酸(L)-140可被脯氨酸(P)取代，精氨酸(R)-386可被脯氨酸(P)或缬氨酸(V)取代，丝氨酸(S)-268可被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)取代，并且天冬酰胺(N)-297可被赖氨酸(K)取代。在示范性实施例的一个实例中，变异体可以是这样的变异体，其中丝氨酸(S)-125被天冬氨酸(D)取代，赖氨酸(K)-164被蛋氨酸(M)取代，天冬氨酸(D)-168被谷氨酸(E)取代，谷氨酸(E)-175被甘氨酸(G)取代，亮氨酸(L)-140被脯氨酸(P)取代，并且精氨酸(R)-386被脯氨酸(P)取代。根据示范性实施例的一个实例的本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以是这样的变异体，其中丝氨酸(S)-125被天冬氨酸(D)取代，赖氨酸(K)-164被蛋氨酸(M)取代，天冬氨酸(D)-168被谷氨酸(E)取代，谷氨酸(E)-175被甘氨酸(G)取代，丝氨酸(S)-268被苏氨酸(T)取代，并且天冬酰胺(N)-297被赖氨酸(K)取代。
根据本发明的再另一个示范性实施例，提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体，其中由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端的丝氨酸(S)-125、谷氨酰胺(Q)-149以及缬氨酸(V)-267氨基酸残基发生突变。丝氨酸(S)-125可被半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)取代，谷氨酰胺(Q)-149可被精氨酸(R)取代，并且缬氨酸(V)-267可被蛋氨酸(M)取代。
根据本发明的示范性实施例，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以包含与以下变异体相比具有至少50％的遗传同一性的多肽部分：由某种氨基酸序列组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体(例如，表2到表10中的M125变异体)，所述氨基酸序列能够从野生型己糖醛酸酯C4-差向异构酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)中在表2到表9中所公开的发生突变的氨基酸残基位置和被取代的氨基酸残基衍生得到，或具有所述氨基酸序列的变异体，并且根据本发明的示范性实施例，本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以包含具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％到99％的同一性的多肽部分。
如本文所用，术语“同一性”是指两个多肽部分之间的同一性的百分比。可以通过已知技术从一个部分到另一个部分确定序列之间的对应性。举例来说，可以通过使用计算机程序直接比对两个多肽分子之间的序列信息来确定同一性，在所述计算机程序中，序列信息发生比对且容易获得。还可以通过以下确定同一性：使多核苷酸在同源区之间形成稳定双股的条件下杂交，然后通过单股特异性核酸酶降解以测定降解后的片断的大小。
如本文所用，术语“相同的”的所有语法形式或拼写修改形式包括超家族衍生蛋白(例如，免疫球蛋白超家族)和衍生自其它物种的同源蛋白质(例如，肌球蛋白轻链等)，并且是指具有“共同的进化起源”的蛋白质之间的关系。蛋白质(和其编码基因)所具有的序列同一性由高度的序列相似性反映。然而，术语“相同的”在一般用法中和在本发明中是指序列相似性，并且当用如“非常高”等形容词提到时并不意指共同的进化起源。
如本文所用，术语“序列相似性”是指可能共用或可能不共用共同的进化起源的蛋白质的碱基序列或氨基酸序列之间的同一性或对应性程度。在一个示范性实施例中，当两个氨基酸序列关于预定长度的氨基酸序列具有至少21％(在一个实施例中至少约50％，并且在另一个实施例中至少75％、90％、95％、96％、97％或99％)的多肽匹配度时，它们“大体上相同”或“大体上相似”。大体上相同的序列可以通过使用数据库中所用的标准软件鉴别，或例如通过在针对特定系统所规定的严格条件下通过Southern杂交实验来比较序列。所规定的适当的杂交条件在本领域的范围内(例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，参见下文)。
本文所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体具有改良的C4-差向异构酶单位活性，其中通过使碳数4处的D-果糖发生差向异构而将D-果糖转化成D-塔格糖，从而有效地从D-果糖产生D-塔格糖。
本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以衍生自红嗜热盐菌属(Rhodothermus)、嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、热袍菌属(Thermotoga)或网团菌属(Dictyoglomus)中所包括的嗜热微生物的己糖醛酸酯C4-差向异构酶。具体来说，变异体可以衍生自热袍菌属(Thermotoga)微生物的己糖醛酸酯C4-差向异构酶，并且更具体来说，可以衍生自新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)或海栖热袍菌(Thermotogamaritima)的己糖醛酸酯C4-差向异构酶。
本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶可以在极端的反应条件(例如高温)下进行稳定反应，同时具有与由嗜温(mesophilic)微生物(中温微生物)产生的酶相同的功能，并且可能具有多个优点，如防止被嗜温微生物污染、提高具有低底物溶解度的材料的溶解度以及提高反应速率等。因此，它的有利之处在于有可能克服使用嗜温酶的工业缺点。
本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体可以通过以下获得：用表达本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体的DNA转化例如大肠杆菌(E.coli)或类似菌株，培养转化后的菌株以获得培养物，将培养物压碎，然后用柱纯化，等。用于转化的菌株的实例包括大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。
根据本发明的另一个示范性实施例，本发明提供一种编码如本发明中所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体的核酸、包含所述核酸的转化体或用于制造D-塔格糖的组合物，所述组合物包含表达本发明中所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体的微生物或所述微生物的培养物或本发明中所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体。
另一个示范性实施例是针对一种表达载体，所述表达载体包含编码本发明中所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体的核酸。术语“载体”在本发明中是指任何用于将碱基克隆和/或转移到生物体中，例如宿主细胞中的介体。载体可以是能够实现不同DNA片段组合后的组合片段的复制的复制子(replicon)。这里，术语“复制子”是指任何充当DNA体内复制的自主单位(self-unit)，即能够通过自主调节来复制的遗传单位(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)。术语“载体”包含用于将碱基引入到生物体中，例如宿主细胞中、体外、离体或体内的病毒性和非病毒性介体。术语“载体”还可以包含小球形DNA(mini-sphericalDNA)。
如本文所用的术语“核酸”意味着它涵盖DNA或RNA分子，其中核酸中作为基本组成单位的核苷酸不仅可以包含天然核苷酸，而且还可以包含糖或碱基位点经过修饰的类似物(参见税特(Scheit)，《核苷酸类似物》(Nucleotide Analogs)，约翰威立出版社(JohnWiley)，纽约(1980)；厄尔曼(Uhlman)和佩曼(Peyman)，《化学综述》(Chemical Reviews)，90：543-584(1990))。
如本文所用的术语“转化”意味着核酸片段迁移到宿主生物体的基因组中以引起遗传上的稳定转变，并且术语“转化体”是指通过核酸迁移到基因组中而引起了遗传上的稳定转变的生物体。转化体可以是例如原核细胞或真核细胞。具体来说，转化体可以是肠杆菌科微生物或棒状菌群微生物等，更具体来说是埃希氏菌属微生物、沙雷氏菌属微生物等，并且最具体来说是大肠杆菌。
用于转化到生物体中的方法包含任何用于将核酸引入到生物体中的方法并且可以通过恰当地选择适当的如本领域中已知的标准技术来进行。举例来说，方法包含电穿孔(electroporation)、磷酸钙共沉淀(calcium phosphate co-precipitation)、逆转录病毒感染(retroviral infection)、显微注射(microinjection)、DEAE-葡聚糖(DEAE-dextran)、阳离子脂质体(cationic liposome)法等，但不限于这些。
用于制造D-塔格糖、包含己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体的组合物可以还包含任何合适的、在用于制造D-塔格糖的组合物中常规使用的赋形剂。赋形剂可以是例如但不限于防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂或类似试剂。组合物中所包含的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体以组合物的固体重量计可以是在0.1重量％到70重量％的范围内。
根据本发明的再另一个示范性实施例，本发明提供一种用于制造D-塔格糖的方法，所述方法包括：使本发明中所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体、本发明中所述的转化体或本发明中所述的用于制造塔格糖的组合物与D-果糖(D-fructose)接触以使D-果糖发生差向异构。
下文描述根据本发明的一个示范性实施例制造D-塔格糖的方法。
所述方法可以包含使本发明的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体、表达所述变异体的微生物或所述微生物的培养物或包括所述变异体的用于制造D-塔格糖的组合物与D-果糖接触。因此，有可能使碳数4处的D-果糖发生差向异构。
单糖一般可以分成己醛糖(aldohexose)和己酮醣(ketohexose)。作为本发明中的原材料的D-果糖是已酮醣的一个实例，并且可以用D-果糖来制造D-塔格糖。
D-果糖可以通过糖水解产生，或可以通过使葡萄糖异构产生。因此，有可能通过使用像果糖、糖和葡萄糖这种普遍而又便宜的原材料以高产量生产塔格糖，由此实现塔格糖的大批量生产。
本发明的D-果糖的差向异构步骤可以在pH 5到9、pH 6到9、pH 7到9或pH 7.5到8.5下进行。本发明的D-果糖的差向异构步骤可以在50℃到85℃、50℃到75℃或50℃到70℃下进行。当在上述pH或温度条件下处理本发明的变异体酶时，能够在相对较高的温度下继续进行反应，因此有可能把生产过程中的微生物污染降到最低，从而提高用作底物的果糖的溶解度，并使酶的反应速率和转化率达到最大。
此外，本发明的D-果糖可以具有10％(w/v)到50％(w/v)的浓度。根据一个示范性实施例，浓度可以是20％(w/v)到50％(w/v)、20％(w/v)到40％(w/v)、20％(w/v)到30％(w/v)。本发明的变异体酶能够从高浓度的D-果糖产生D-塔格糖，因此能够经济有效地生产D-塔格糖。
本发明的D-果糖的差向异构步骤可以在金属盐存在下进行。在一个示范性实施例中，本发明的金属盐中的金属可以是至少一种由Ni、Ni、Co、Mn和Zn组成的群组中选出的金属。具体来说，本发明的金属盐可以是由NiSO4、NiCl2、CoCl2、MnCl2和ZnSO4组成的群组中选出的至少一种。因为本发明的D-果糖的差向异构步骤是在金属盐存在下进行的，所以能够获得提高转化活性的效果。
根据本发明的示范性实施例，本发明的制造方法可以还包含在本发明的接触步骤之前使糖水解以获得D-果糖。水解所用的酶可以包含由以下组成的群组中选出的至少一种：包含β-呋喃果糖苷酶、转化酶和蔗糖酶等的β-D-果糖苷酶；蔗糖酶、α-葡糖苷酶和α-D-葡糖水解酶，但不限于这些。
根据本发明的示范性实施例，本发明的制造方法可以还包含在本发明的接触步骤之前使葡萄糖异构以获得D-果糖。异构酶可以是葡萄糖异构酶或磷酸葡萄糖异构酶，但不限于这些。
根据本发明的示范性实施例，本发明的制造方法可以还包含在本发明的接触步骤之后获得包含D-塔格糖的差向异构反应产物。
根据本发明的示范性实施例，本发明的制造方法可以还包含在获得本发明的差向异构反应产物这个步骤之后纯化所获得的包含D-塔格糖的差向异构反应产物。
根据本发明的示范性实施例，本发明的制造方法可以还包含在所获得的本发明的差向异构反应产物的纯化步骤之后使纯化后的包含D-塔格糖的差向异构反应产物结晶。
差向异构反应产物的纯化方法不受特定限制，并且可以是本发明的技术领域中常用的方法。其非限制性实例可以包含色谱法、分步结晶、离子纯化等。纯化方法可以只用一种方法进行，或通过两种或超过两种方法一起进行。举例来说，可以通过色谱法纯化差向异构反应产物，并且通过色谱法进行的糖分离可以通过利用待分离的糖与离子树脂上所连接的金属离子之间的弱结合力差异来进行。
此外，本发明可以还包含在本发明的纯化步骤之前或之后进行脱色、脱盐或脱色和脱盐。通过进行脱色和/或脱盐，有可能获得更加纯化、没有杂质的差向异构反应产物。
纯化后的差向异构反应产物可以相继通过SMB色谱法、结晶进行浓缩，获得纯的塔格糖溶液。
根据本发明的示范性实施例，本发明的制造方法可以还包含在本发明的结晶步骤之前浓缩分离后的纯塔格糖溶液。浓缩步骤可以进行约2.5次到3次以具有一定浓度的包含纯化后的D-塔格糖的差向异构反应产物，并且可以通过浓度步骤更有效地进行结晶。
本发明的结晶步骤中所用的方法不受特定限制，并且可以是常用的结晶方法。举例来说，可以使用使用冷却结晶方法的结晶方法。通过结晶步骤，有可能以高产量获得经过最后纯化的D-塔格糖。
根据本发明的示范性实施例，本发明的制造方法可以还包含在本发明的纯化步骤之后再使用本发明的接触步骤中未反应的D-果糖，或在本发明的结晶步骤之后再使用纯化步骤中能分离出晶体的母液，或这两个步骤都进行。再使用步骤在经济上是有利的，因为可以按更高的产量获得D-塔格糖，并且可以减少D-果糖的舍弃量。
如本文所用的术语“碳数n”是指根据IUPAC命名法中所规定的碳编号确定的碳位置，并且可以表示为Cn。这里，n是1或大于1的整数。举例来说，“在碳数4处的差向异构”用“C4-差向异构”来表示。
从由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)的N端起第n个位置处的氨基酸残基(x)在本发明中可以缩写为n X。
此外，除非本文中关于本发明中待突变的氨基酸残基中的被取代的氨基酸另有说明，否则可以认为在本发明的其它部分中所提到的相应位置处的氨基酸残基处的氨基酸是可取代的。
在本发明中，氨基酸可以用以下缩写或氨基酸名称来表示。
[表1]
氨基酸类型 缩写
丙氨酸(alanine) A
精氨酸(arginine) R
天冬酰胺(asparagine) N
天冬氨酸(aspartic acid) D
半胱氨酸(cysteine) C
谷氨酸(glutamic acid) E
谷氨酰胺(glutamine) Q
甘氨酸(glycine) G
组氨酸(histidine) H
异亮氨酸(isoleucine) I
亮氨酸(leucine) L
赖氨酸(lysine) K
蛋氨酸(methionine) M
苯丙氨酸(phenylalanine) F
脯氨酸(proline) P
丝氨酸(serine) S
苏氨酸(threonine) T
色氨酸(tryptophan) W
酪氨酸(tyrosine) Y
缬氨酸(valine) V
此外，第10-2014-0143109号韩国专利特许公开公布的公开内容以引入的方式并入本文中。
有利作用
本发明提供一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶(hexuronate C4-epimerase)变异体，所述变异体通过使碳数4处的D-果糖发生差向异构而具有改良的将D-果糖转化成D-塔格糖的活性，从而有效地实现了使用普遍的原材料D-果糖大批量生产D-塔格糖，并且因此可以降低生产成本，提供经济优点。
具体实施方式
下文将参考以下实例更详细地描述本发明。但以下实例只是本发明的实例，并且本发明的内容不应被理解为只限于这些实例。
实例
实例1.经过改良的靶位点设计和分析
首先基于对与衍生自新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的己糖醛酸酯C4-差向异构酶(下文称为野生型)的氨基酸具有同一性的直系同源物(ortholog，预测在不同的微生物物种中具有相同功能的同源基因)的活性位点的三级结构模型的分析选出预测在功能上重要的氨基酸。然后，基于D-果糖与在丙氨酸扫描诱变(alanine scanningmutagenesis)之后改进(refining)的活性位点结构之间的对接模型的分析结果，设计一个经过修饰的靶位点来改良D-果糖通过C4-差向异构实现的转化反应的单位活性。其详情描述如下。
1-1.直系同源物(ortholog)分析
使用GenBank基因数据库筛选出与野生型氨基酸序列(SEQ ID NO：1)具有同一性的同源基因(直系同源物(ortholog))[约60个同源基因，具有80％序列覆盖率(sequencecoverage)和50％或大于50％的同源性(homology)]。通过对所选出来的同源基因的氨基酸序列进行多序列比对(multiple sequence alignment)分析，鉴别野生型氨基酸序列中预测在功能上重要的保守氨基酸残基。
1-2.分析酶的三级结构模型
在蛋白质数据库(Protein Data Bank)中不存在与野生型的同源基因具有30％或大于30％的氨基酸序列同一性(identity)的蛋白质结构，由此猜想通过同源建模法来预测野生型的三级结构模型的准确性将会很低。因此，在从各种建模服务器(RaptorX、Robetta、ModWeb、M4T、HHpred、PHYRE2、ITASSER以及SWISS-MODEL)获得的三级结构模型中，比较并分析活性位点，从而获得关于预测是相同的结构位点的信息。
1-3.丙氨酸扫描诱变和对接结合分析
基于对如上所述的同源基因的氨基酸序列分析和活性位点的三级结构模型的分析而选出的氨基酸经过丙氨酸取代和突变，并且在大肠杆菌中产生这些重组突变酶。然后分析每个突变位点的特征。通过D-果糖与在分析丙氨酸扫描诱变之后改进的活性位点结构之间的对接模拟选出预测在功能上重要的氨基酸。然后设计经过修饰的靶位点来改良D-果糖通过C4-差向异构实现的转化反应的单位活性。为了改良活性，从靶位点中排除经过丙氨酸扫描诱变[采用催化性金属离子结合残基和去质子化/质子化(deprotonation/protonation)所涉及的催化性残基]后活性完全消失的氨基酸位点。
实例2.制造突变酶并选择活性改良的突变酶
构筑实例1中所设计的54个靶位点(从野生型己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端起在以下编号的位置处的氨基酸残基：9、21、60、62、68、77、91、97、125、126、140、141、145、149、157、158、160、163、164、166、167、168、175、176、177、185、202、218、221、231、241、242、267、268、272、276、284、295、297、302、306、316、337、351、361、366、386、388、402、403、415、429、440以及441)的单位点饱和诱变库(single-site saturation mutagenesislibrary)，并筛选单位活性改良的突变位点和氨基酸。通过整合筛选出来的经过修饰的位点的信息，研发一种具有改良的D-果糖通过C4-差向异构实现的转化反应的单位活性的突变酶，制得多突变酶。
2-1.饱和诱变(saturation mutagenesis)
将为了表达野生型酶基因而构筑的重组表达载体野生型大肠杆菌BL21(DE3)(它表达重组酶，在所述重组酶中，野生型被引入pET21a的NdeI和XhoI限制酶位点中并在野生型的C端结合6xHis-tag)用作模板(template)进行饱和诱变来制造变异体库。考虑到变异体的突变分布的多样性和产量，使用基于反向(inverse)PCR的饱和诱变(2014.《分析生物化学》(Anal.Biochem.)449：90-98)，设计并使用NDT、VMA、ATG和TGG混合的引物，为了将所构筑的变异体库的筛选量表降到最低(即，为了将在饱和诱变过程中引入的密码子的数量降到最低)，在所述引物中，不包括终止密码子并且将大肠杆菌的稀有密码子(rare codon)降到了最低(2012.《生物技术》(Biotechniques)52：149-158)。具体来说，构筑并使用这样的混合引物，其包含15bp用于各个突变位点的前面的碱基、3bp(NDT、VMA、ATG和TGG，一对一地)用于取代置换位点以及15bp用于后面的碱基，即总长度33bp。PCR在以下条件下重复30次：在94℃下变性2分钟，在94℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，在72℃下延伸10分钟，以及在72℃下延伸60分钟。在构筑好每个突变位点的饱和诱变库之后，随机选择每个库的变异体(＜突变11)，并分析碱基序列以评估氨基酸突变分布。基于分析结果，确定每个库的序列覆盖率(sequence coverage)达90％或大于90％的筛选量表(2003.《核酸研究》(NucleicAcids Res.)15；31：e30)。
2-2.筛选活性改良的突变酶并构筑多突变酶
为了在所产生的饱和诱变库中迅速筛选出大量的活性改良的突变酶，使用显色分析(chromogenic assay)专门定量D-果糖。具体来说，将70％的福林酚试剂(folin-ciocalteu reagent)(西格玛-奥德里奇公司(SIGMA-ALDRICH))与底物反应溶液以15∶1的比率混合并在80℃下反应5分钟。比较并分析在900nm下测量的OD值。
首先选择与野生型酶(SEQ ID NO：1)的相对活性相比具有增加的活性(通过D-果糖的转化来制造D-塔格糖)的突变位点中的54个变异体。分析相应基因的碱基序列并分析氨基酸突变信息(表2到表10)。
使用经过纯化的酶溶液(His-tag亲和色谱法)，使首先选择的突变酶与D-果糖反应，并且通过使用HPLC(柱Shodex SUGAR SP-G，柱分析温度80℃，流动相H2O，流速0.6ml/min，折射率(Refractive Index)检测器)，使用反应产物最后选出236个在通过从D-果糖转化来产生D-塔格糖方面相比于野生型酶具有增加的活性的变异体。
实例3.比较性评估活性改良的突变酶的特征
为了评估具有改良的单位活性的单一位点突变酶上的和呈其组合形式的多位点突变酶上的D-果糖C4-差向异构的相对活性，通过常规方法(参见萨姆布鲁克等人1989)在大肠杆菌BL21(DE3)中表达每种酶，并(通过His-tag亲和色谱法)纯化每种酶。然后，在NiSO4存在下，向25％(w/v)D-果糖底物中加入浓度为10单位/毫升的每种酶，并在pH 8.0[50mM磷酸钾(potassium phosphate)缓冲液]和65℃下反应2小时，并测量与衍生自新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的野生型重组酶(野生型，SEQ ID NO：1)相比的D-果糖C4-差向异构的相对活性。
[表2]
[表3]
[表4]
[表5]
[表6]
[表7]
[表8]
[表9]
[表10]
从以上结果可以确定，本发明的C4-差向异构酶变异体相比于野生型酶具有增加的D-果糖C4-差向异构活性，并且具体来说，M199的酶变异体经过分析发现单位活性增加约20倍，因此可以确定，本发明的塔格糖的生产活性相比于野生型酶来说显著增加。
序列表
<110> CJ 第一制糖株式会社
<120> 具有改良的D-塔格糖转化活性的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体和用它制造D-塔格糖的方法
<130> P17-6116
<150> KR 2016-0097500
<151> 2016-07-29
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 481
<212> PRT
<213> 野生型己糖醛酸酯C4-差向异构酶(A wild type of Hexuronate C4-epimerase)
<400> 1
Met Val Leu Lys Val Phe Lys Asp His Phe Gly Arg Gly Tyr Glu Val
1 5 10 15
Tyr Glu Lys Ser Tyr Arg Glu Lys Asp Ser Leu Ser Phe Phe Leu Thr
20 25 30
Lys Gly Glu Glu Gly Lys Ile Leu Val Val Ala Gly Glu Lys Ala Pro
35 40 45
Glu Gly Leu Ser Phe Phe Lys Lys Gln Arg Val Glu Gly Val Ser Phe
50 55 60
Phe Phe Cys Glu Arg Asn His Glu Asn Leu Glu Val Leu Arg Lys Tyr
65 70 75 80
Phe Pro Asp Leu Lys Pro Val Arg Ala Gly Leu Arg Ala Ser Phe Gly
85 90 95
Thr Gly Asp Arg Leu Gly Ile Thr Thr Pro Ala His Val Arg Ala Leu
100 105 110
Lys Asp Ser Gly Leu Phe Pro Ile Phe Ala Gln Gln Ser Val Arg Glu
115 120 125
Asn Glu Arg Thr Gly Arg Thr Trp Arg Asp Val Leu Asp Asp Ala Thr
130 135 140
Trp Gly Val Phe Gln Glu Gly Tyr Ser Glu Gly Phe Gly Ala Asp Ala
145 150 155 160
Asp His Val Lys Arg Pro Glu Asp Leu Val Ser Ala Ala Arg Glu Gly
165 170 175
Phe Thr Met Phe Thr Ile Asp Pro Ser Asp His Val Arg Asn Leu Ser
180 185 190
Lys Leu Ser Glu Arg Glu Lys Asn Glu Met Phe Glu Glu Ile Leu Lys
195 200 205
Lys Glu Arg Ile Asp Arg Ile Tyr Leu Gly Lys Lys Tyr Thr Val Leu
210 215 220
Gly Glu Arg Leu Glu Phe Asp Glu Lys Asn Leu Arg Asp Ala Ala Leu
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Asp Ala Ile Ala His Val Asp Met Met Tyr Gln Ile Leu
245 250 255
Lys Asp Glu Thr Pro Asp Phe Asp Phe Glu Val Ser Val Asp Glu Thr
260 265 270
Glu Thr Pro Thr Ser Pro Leu Phe His Ile Phe Val Val Glu Glu Leu
275 280 285
Arg Arg Arg Gly Val Glu Phe Thr Asn Leu Ala Leu Arg Phe Ile Gly
290 295 300
Glu Trp Glu Lys Gly Ile Asp Tyr Lys Gly Asp Leu Ala Gln Phe Glu
305 310 315 320
Arg Glu Ile Lys Met His Ala Glu Ile Ala Arg Met Phe Glu Gly Tyr
325 330 335
Lys Ile Ser Leu His Ser Gly Ser Asp Lys Phe Ser Val Tyr Pro Ala
340 345 350
Phe Ala Ser Ala Thr Gly Gly Leu Phe His Val Lys Thr Ala Gly Thr
355 360 365
Ser Tyr Leu Glu Ala Val Lys Val Ile Ser Met Val Asn Pro Glu Leu
370 375 380
Phe Arg Glu Ile Tyr Arg Cys Ala Leu Asp His Phe Glu Glu Asp Arg
385 390 395 400
Lys Ser Tyr His Ile Ser Ala Asp Leu Ser Lys Val Pro Glu Val Glu
405 410 415
Lys Val Lys Asp Glu Asp Leu Pro Gly Leu Phe Glu Asp Ile Asn Val
420 425 430
Arg Gln Leu Ile His Val Thr Tyr Gly Ser Val Leu Lys Asp Ala Ser
435 440 445
Leu Lys Glu Arg Leu Phe Lys Thr Leu Glu Gln Asn Glu Glu Leu Phe
450 455 460
Tyr Glu Thr Val Ala Lys His Ile Lys Arg His Val Asp Leu Leu Lys
465 470 475 480
Gly

Claims (15)

1.一种己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体，其特征在于，由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的己糖醛酸酯C4-差向异构酶(Hexuronate C4-epimerase)的N端在位置272处的苏氨酸(T)氨基酸残基发生突变。
2.根据权利要求1所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体，其中在位置272处的苏氨酸(T)残基被丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、缬氨酸(V)或酪氨酸(Y)替换。
3.根据权利要求1所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体，其中所述己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端在位置125处的丝氨酸(S)残基另外发生突变。
4.根据权利要求3所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体，其中在位置125处的丝氨酸(S)残基被半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)替换。
5.根据权利要求3所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体，其中所述己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端在以下位置的残基另外发生突变：(i)在位置185处的丝氨酸(S)残基，或者是(ii)在位置267处的缬氨酸(V)残基、在位置268处的丝氨酸(S)残基或在位置267处的缬氨酸(V)残基与在位置268处的丝氨酸(S)残基的组合。
6.根据权利要求5所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体，其中在位置185处的丝氨酸(S)残基被丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)或精氨酸(R)替换。
7.根据权利要求5所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体，其中所述己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端，除了在位置185处的丝氨酸(S)残基另外发生突变以外，一个或多个选自由在位置267处的缬氨酸(V)残基、在位置268处的丝氨酸(S)残基和在位置306处的色氨酸(W)残基组成的群组的氨基酸残基另外发生突变。
8.根据权利要求7所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体，其中在位置267处的缬氨酸(V)残基被蛋氨酸(M)替换，在位置268处的丝氨酸(S)残基被半胱氨酸(C)或苏氨酸(T)替换，在位置306处的色氨酸(W)残基被苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)替换。
9.根据权利要求5所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体，其中除了在位置267处的缬氨酸(V)残基、在位置268处的丝氨酸(S)残基或在位置267处的缬氨酸(V)残基与在位置268处的丝氨酸(S)残基的组合另外发生突变以外，以下残基另外发生突变：(i)所述己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端在位置231处的天冬氨酸(D)残基、在位置386处的精氨酸(R)残基或在位置231处的天冬氨酸(D)残基与在位置386处的精氨酸(R)残基的组合；或者是(ii)所述己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端在一个或多个选自由在位置164处的赖氨酸(K)残基、在位置处168的天冬氨酸(D)残基和在位置175处的谷氨酸(E)残基组成的群组的氨基酸残基。
10.根据权利要求9所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体，其中在位置231处的天冬氨酸(D)残基被精氨酸(R)替换，并且在位置386处的精氨酸(R)残基被脯氨酸(P)或缬氨酸(V)替换。
11.根据权利要求9所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体，其中除了在位置267处的缬氨酸(V)残基和在位置386处的精氨酸(R)残基另外发生突变以外，所述己糖醛酸酯C4-差向异构酶的N端在一个或多个选自由在位置97处的苏氨酸(T)残基、在位置149处的谷氨酰胺(Q)残基、在位置166处的脯氨酸(P)残基和在位置351处的脯氨酸(P)残基组成的群组的氨基酸残基另外发生突变。
12.根据权利要求11所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体，其中在位置97处的苏氨酸(T)残基被丙氨酸(A)或亮氨酸(L)替换，在位置149处的谷氨酰胺(Q)残基被精氨酸(R)替换，在位置166处的脯氨酸(P)残基被精氨酸(R)替换，并且在位置351处的脯氨酸(P)残基被丝氨酸(S)替换。
13.根据权利要求9所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体，其中在位置164处的赖氨酸(K)残基被蛋氨酸(M)替换，在位置168处的天冬氨酸(D)残基被谷氨酸(E)替换，并且在位置175处的谷氨酸(E)残基被甘氨酸(G)替换。
14.一种核酸，其特征在于，编码根据权利要求1到13中任一项所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体。
15.一种用于制造D-塔格糖的方法，其特征在于，包括使根据权利要求1到13中任一项所述的己糖醛酸酯C4-差向异构酶变异体、表达所述变异体的微生物或所述微生物的培养物与D-果糖(D-fructose)接触。
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