JP6629987B2 - D−タガトース転換活性が高められたヘキスロン酸c4−エピメラーゼ変異体及びこれを用いたd−タガトースの製造方法 - Google Patents
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Description
テルモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)由来のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ(以下、野生型という)のアミノ酸と相同性を有する相同遺伝子(ortholog、他の微生物種で同一機能を有すると予測される相同遺伝子)の活性部位の3次構造モデル分析に基づいて、機能的に重要であると予測されるアミノ酸を1次選定し、これらのアラニンスキャニング突然変異(alanine−scanning mutagenesis)分析後、再設計された(refining)活性部位の構造とD−フルクトースの間のドッキングモデル分析の結果に基づいて、D−フルクトースC4−エピマー化転換反応の活性単位を高めるために改良ターゲット部位を設計した。以下、これを詳細に説明する。
野生型のアミノ酸配列(配列番号1)と相同性を有する相同遺伝子(ortholog)を、GenBank遺伝子データベースを利用して選別し[配列包括度(sequence coverage)80%と相同性(homology)50%以上の相同遺伝子を約60本]、選別した相同遺伝子のアミノ酸配列間の多重配列アラインメント(multiple sequence alignment)分析により、野生型のアミノ酸配列において機能的に重要であると予測されるアミノ酸残基を同定した。
タンパク質データバンク(Protein Data Bank)のデータベース内に、野生型および相同遺伝子と30%以上のアミノ酸配列の相同性(Identity)を示すタンパク質の構造がなく、ホモロジーモデリング方法による野生型の3次構造モデル予測の精度が低いと予想されるため、様々なモデリングサーバー(RaptorX、Robetta、ModWeb、M4T、HHpred、PHYRE2、ITASSERとSWISS−MODEL)を介して得られた3次構造モデルの間の活性部位を比較・分析し、同一であると予測される構造部位に関する情報を得た。
上述した相同遺伝子間のアミノ酸配列の分析と活性部位の3次構造モデルの分析に基づいて選定されたアミノ酸をアラニンに置換変異して、これらの組換え変異酵素を大腸菌で生産した後、各変異部位の特性を分析した。前記アラニンスキャニング変異分析の後、再設計された活性部位の構造とD−フルクトース間のドッキングシミュレーションを介して、機能的に重要であると予測されるアミノ酸を選別してD−フルクトースC4−エピマー化転換反応の活性単位を高めるために、改良ターゲット部位を設計した。アラニンスキャン変異を介して活性が完全に消失するアミノ酸部位[触媒金属イオン結合残基と脱プロトン化/プロトン化(deprotonation/protonation)に関与する触媒残基であると推定]は、活性を改良するためのターゲット部位から排除した。
実施例1で設計したターゲット部位(野生型ヘキスロン酸C4−エピメラーゼのN−末端から9、21、60、62、68、77、91、97、125、126、140、141、145、149、157、158、160、163、164、166、167、168、175、176、177、185、202、218、221、231、241、242、267、268、272、276、284、295、297、302、306、316、337、351、361、366、386、388、402、403、415、429、440および441番のアミノ酸残基)の54カ所の一部位飽和突然変異ライブラリー(single−site saturation mutagenesis library)を作製し、活性単位が改良される変異部位とアミノ酸をスクリーニング選別した。選抜された改良部位の情報を統合して複数の変異酵素を作製した後、D−フルクトースC4−エピマー化転換反応の活性単位が高められた変異酵素を開発した。
野生型酵素遺伝子の大腸菌BL21(DE3)発現のために製作された組換えベクター(pET21aのNdeIおよびXhoI制限酵素部位に野生型を導入し、野生型のC−末端に6xHis−tagが結合した組換え酵素を発現)を変異株ライブラリー作成用の飽和突然変異誘発法のテンプレート(template)として用いた。変異分布の多様性および変異体の収率などを考慮して、逆(inverse)PCRベースの飽和突然変異誘発法を使用し(2014.Anal.Biochem.449:90−98)、製作された変異株ライブラリーのスクリーニング規模を最小限に抑えるため(飽和突然変異時に導入されるコドンの数を最小限に抑えること)、終止コドンを排除し、大腸菌のレアコドン(rare codons)が最小化されたNDT、VMA、ATGとTGGの混合プライマーを(2012 Biotechniques 52:149−158)を設計して使用した。詳細には、各々の変異部位の上流塩基15bpと変異部位を置換する塩基3bp(各々NDT、VMA、ATGとTGG)、下流塩基15bpで全長は33bpにして、混合プライマーを製作して使用した。PCR条件は、94℃で2分間変性後、94℃で30秒の変性、60℃で30秒のアニーリング、72℃で10分間の伸長を30回繰り返した後、72℃で60分間伸長反応を行った。変異部位別の飽和突然変異ライブラリーを作製した後、ライブラリー別の変異株をランダム選抜<変異11個>して塩基配列を分析して、アミノ酸変異の分布を評価した。この分析結果に基づいて、ライブラリー別配列包括度(sequence coverage)90%以上のスクリーニング規模を設定した(2003.Nucleic Acids Res.15;31:e30)。
製作された飽和突然変異ライブラリーから活性改良の変異酵素を大量で高速スクリーニングするために、D−フルクトースを特異的に定量化できる発色測定法を用いた。詳細には、70%のフォリン-チオカルトー溶液(folin−ciocalteu reagent、SIGMA−ALDRICH)と基質反応完了液を15:1の割合で混合した後、80℃で5分間反応し900nmで測定してOD値で比較分析した。
単位活性が改善した単一部位の変異酵素と、これらの組み合わせた多重部位の変異酵素に対して、D−フルクトースC4−エピマー化の相対活性を評価するために、各酵素を通常の方法(参照:Sambrook et al.、1989)により大腸菌BL21(DE3)で発現させて後精製(His−tag親和クロマトグラフィー)し、NiSO4が存在する条件で各酵素を10unit/mlの濃度で25%(w/v)D−フルクトース基質に添加した後、pH8.0[50mMのリン酸カリウム(potassium phosphate)緩衝液]と65℃で2時間反応させテルモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)由来の野生型組換え酵素(野生型、配列番号1)と比較して、D−フルクトースC4−エピマー化の相対活性を測定した。
Claims (12)
- 配列番号1のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸C4−エピメラーゼ(Hexuronate C4−epimerase)のN−末端から125番セリン(S)のアミノ酸残基が、システイン(C)、チロシン(Y)、グルタミン(Q)、グルタミン酸(E)、スレオニン(T)、アスパラギン(N)、またはアスパラギン酸(D)で置換されたことを特徴とする、ヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。
- 前記125番セリン(S)がアスパラギン酸(D)で置換され、さらにN−末端から77番ロイシン(L)のアミノ酸残基がプロリン(P)またはアルギニン(R)で置換されたことを特徴とする、請求項1に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。
- 前記125番セリン(S)がアスパラギン酸(D)で置換され、さらに
i)N−末端から158番アラニン(A)のアミノ酸残基がスレオニン(T)で置換されたこと、または
ii)N−末端から351番プロリン(P)がセリン(S)で置換されたことを特徴とする、請求項1に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。 - 前記125番セリン(S)がアスパラギン酸(D)で置換され、前記158番アラニン(A)がスレオニン(T)で置換され、さらに
i)N−末端から77番ロイシン(L)がプロリン(P)またはアルギニン(R)で置換されたこと、
ii)N−末端から351番プロリン(P)がセリン(S)で置換されたこと、
iii)N−末端から149番グルタミン(Q)がアルギニン(R)で置換されたこと、または
iv)N−末端から267番バリン(V)がメチオニン(M)で置換されたことを特徴とする、請求項1に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。 - 前記125番セリン(S)がアスパラギン酸(D)で置換され、さらにN−末端から77番ロイシン(L)がプロリン(P)で置換され、かつ、N−末端から351番プロリン(P)がセリン(S)で置換されたことを特徴とする、請求項1に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。
- 前記125番セリン(S)がアスパラギン酸(D)で置換され、さらにN−末端から149番グルタミン(Q)がアルギニン(R)で置換され、かつ、N−末端から267番バリン(V)がメチオニン(M)で置換されたことを特徴とする、請求項1に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。
- 前記125番セリン(S)がアスパラギン酸(D)で置換され、さらにN−末端から267番バリン(V)がメチオニン(M)で置換され、かつ、N−末端から351番プロリン(P)がセリン(S)で置換されたことを特徴とする、請求項1に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。
- 前記125番セリン(S)がアスパラギン酸(D)で置換され、さらにN−末端から9番ヒスチジン(H)がチロシン(Y)で置換され、N−末端から60番グルタミン酸(E)がアスパラギン酸(D)で置換され、N−末端から77番ロイシン(L)がプロリン(P)で置換され、N−末端から158番アラニン(A)のアミノ酸残基がスレオニン(T)で置換され、かつ、N−末端から415番バリン(V)のアミノ酸残基がグルタミン酸(E)で置換されたことを特徴とする、請求項1に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。
- 前記125番セリン(S)がアスパラギン酸(D)で置換され、さらにN−末端から164番リジン(K)がメチオニン(M)で置換され、N−末端から168番アスパラギン酸(D)がグルタミン酸(E)で置換され、N−末端から175番グルタミン酸(E)がグリシン(G)で置換され、さらに
i)N−末端から140番ロイシン(L)がプロリン(P)で置換され、かつ、N−末端から386番アルギニン(R)がバリン(V)で置換されたこと、または
ii)N−末端から268番セリン(S)がスレオニン(T)で置換され、かつ、N−末端から297番アスパラギン(N)がリジン(K)で置換されたことを特徴とする、請求項1に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。 - 前記125番セリン(S)がアスパラギン酸(D)で置換され、さらにN−末端から21番チロシン(Y)がフェニルアラニン(F)で置換され、N−末端から62番バリン(V)がイソロイシン(I)で置換され、N−末端から149番グルタミン(Q)がアルギニン(R)で置換され、N−末端から267番バリン(V)がメチオニン(M)で置換され、N−末端から316番ロイシン(L)がフェニルアラニン(F)で置換され、かつ、N−末端から351番プロリン(P)がセリン(S)で置換されたことを特徴とする、請求項1に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。
- 請求項1ないし10のいずれか一つに記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体をコードする核酸。
- 請求項1ないし10のいずれか一つに記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体、前記変異体を発現する微生物又は前記微生物の培養物とD−フルクトース(D−fructose)を接触させるステップを備える、D−タガトースの製造方法。
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