KR101940785B1

KR101940785B1 - 써모토가 페트로필라 유래의 헥수론산 c4-에피머화 변이체 효소 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101940785B1
Application number: KR1020170155291A
Authority: KR
Inventors: 신홍식; 이상왕; 오덕근; 신경철
Original assignee: (주)케비젠
Priority date: 2017-11-21
Filing date: 2017-11-21
Publication date: 2019-01-21

Abstract

본 발명은 써모토가 페트로필라 유래의 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명을 통해 미생물로부터 얻은 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 이용하여 과당으로부터 타가토스를 생산할 수 있어 친환경적이며, 종래 타가토스 생산과 비교하여 단가가 낮은 기질인 과당을 사용할 수 있고, 수율이 높기 때문에 생산경비 절감과 동시에 생산 효과를 극대화할 수 있는 효과가 있어 관련 산업에 매우 유용하다.

Description

써모토가 페트로필라 유래의 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소 및 이의 용도{Hexuronate C4-epimerase mutant from Thermotoga petrophila and uses thereof}

본 발명은 써모토가 페트로필라 유래의 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 써모토가 페트로필라(Thermotoga petrophila) 유래의 헥수론산 C4-에피머화 효소(hexuronate C4-epimerase)의 코딩 유전자에 돌연변이를 유도하여 수득한 변이체 효소 그리고 그 해당 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 또한 상기 벡터로 형질전환된 미생물과 해당 변이체 효소를 얻는 제조방법 및 상기 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 이용하여 과당으로부터 타가토스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

타가토스(D-tagatose)는 설탕의 30% 수준의 저칼로리(1.5kcal/g)를 나타내고 설탕의 92%의 당도를 갖는 감미료로서, 체내 흡수과정 중 거의 대사가 되지 않는 비 열량(non-caloric) 감미료로 섭취한 양의 15~20 퍼센트가 체내에 흡수된다. 하지만 이마저도 인간의 소화 능력이 아닌 대장 내 미생물에 의한 분해로 인한 흡수이므로 혈당 수치에 영향이 없으며, 이러한 특징으로 인해 당뇨병 환자의 혈당 조절 효과를 기대할 수 있으며, 장내 미생물에 먹이를 제공하여 배변활동에 도움을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한 충치를 유발하지 않는 기능적 특성을 갖는 건강 감미료이며, 설탕 과잉으로 인한 질병 예방에도 기여할 수 있는 물질로서 많은 관심을 받고 있다. 또한 타가토스는 끓는점이 134℃, pH 2-7로 열과 pH에 대한 안정성이 높아서 대부분의 인공 감미료와 달리 잘 파괴되지 않고 설탕과 유사한 물리적, 화학적 성질을 가지며 가열시 갈색화 반응(browning reaction)의 특성이 과당과 비슷한 케토스(ketose)이므로 대체당으로서 중요한 특징을 갖고 있다.

이와 같은 이유로 타가토스를 효율적으로 생산할 수 있는 방법에 대한 개발의 필요성이 높아지고 있으며, 현재는 L-아라비노스 이성질화효소를 이용한 생물전환법으로 갈락토스로부터 타가토스를 생산하고 있으나, 갈락토스의 수급이 불안정 하고 낙농시장의 변동에 따라 공급가액의 변화폭이 크기 때문에 안정적이고 지속적인 대량 생산을 위한 갈락토스의 확보에 어려움이 제기되고 있다. 따라서, 이와 같은 문제점을 해결하기 위해서는 수급이 안정적이고 원가가 낮은 포도당이나 과당을 기질로 하여 타가토스를 생산하는 것이 필요한 실정이다.

한편, 한국공개특허 제2017-0015250호에서는 '전환 활성이 향상된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 D-타가토스의 제조 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '써모토가 페트로필라 유래의 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 수급이 안정적이고 원가가 낮은 과당을 타가토스로 효과적으로 전환시킬수 있는 써모토가 페트로필라로부터 유래한 활성이 높은 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 제조하였으며, 상기 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물로부터 제조된 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 과당(D-fructose)에 첨가하여 반응시킨 결과, 타가토스(D-tagatose)를 고농도 고수율로 생산할 수 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 써모토가 페트로필라(Thermotoga petrophila) 유래의 헥수론산 C4-에피머화 효소(Hexuronate C4-epimerase)의 125번째, 181번째, 268번째 및 362번째의 아미노산 중 하나 이상이 돌연변이된 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하여 상기 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 코딩하는 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 과당에 처리하고 반응시키는 단계를 포함하는 타가토스(D-tagatose)를 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 유효성분으로 함유하는 타가토스(D-tagatose) 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명은 써모토가 페트로필라(Thermotoga petrophila) 균주로부터 헥수론산 C4-에피머화 효소 유전자를 분리하여 유전자 변이로 제작한 효소 활성이 높은 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 제공하는 효과가 있다.

본 발명을 통해 미생물로부터 얻은 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 이용하여 과당으로부터 타가토스를 생산할 수 있어 친환경적이며, 종래 타가토스 생산과 비교하여 단가가 낮은 기질인 과당을 사용할 수 있고, 수율이 높기 때문에 생산경비 절감과 동시에 생산 효과를 극대화할 수 있는 효과가 있어 본 발명은 관련 산업에 매우 유용하다.

도 1은 본 발명의 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소(hexuronate C4-epimerase)의 제조를 위해 스크리닝으로 얻은 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 이중 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소의 제조를 위해 트레오닌 181번 잔기에 점돌연변이를 실행하여 얻은 변이체들의 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 이중 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소의 제조를 위해 세린 268번 잔기에 점돌연변이를 실행하여 얻은 변이체들의 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 이중 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소의 제조를 위해 히스티딘 362번 잔기에 점돌연변이를 실행하여 얻은 변이체들의 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 삼중 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소의 제조를 위해 잔기의 변이 조합을 실행하여 얻은 변이체들의 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 S125D 변이체(6a) 및 S125D/H362L/T181A 삼중 변이체 (6b)헥수론산 C4-에피머화 효소의 온도에 따른 안정성을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 S125D 변이체(7a) 및 S125D/H362L/T181A 삼중 변이체 (7b)헥수론산 C4-에피머화 효소의 시간에 따른 안정성을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 야생형, S125D 변이체, S125D/H362L/T181A 삼중 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소에 시간에 따른 타가토스의 생산량을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 S125D/H362L/T181A 삼중 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소가 과당 기질 50%(w/v)를 14시간 반응을 통해 타가토스로 전환하는 전환률을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 S125D/H362L/T181A 삼중 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소의 농도변화에 따른 과당 기질 50%(w/v)를 14시간동안 타가토스로 전환하는 전환률을 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 써모토가 페트로필라(Thermotoga petrophila) 유래의 헥수론산 C4-에피머화 효소(Hexuronate C4-epimerase)의 125번째, 181번째, 268번째 및 362번째의 아미노산 중 하나 이상이 돌연변이된 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소에서, 상기 125번째 아미노산 돌연변이는 S125D, 181번째 아미노산 돌연변이는 T181A 또는 T181D, 268번째 아미노산 돌연변이는 S268F, 362번째 아미노산 돌연변이는 H362L 또는 H362W일 수 있고, 바람직하게는 S125D/T181A, S125D/T181D, S125D/S268F, S125D/H362L, S125D/H362W, S125D/H362L/T181A, S125D/H362L/T181D, S125D/H362W/T181A 또는 S125D/H362W/T181D일 수 있고, 가장 바람직하게는 S125D/H362L/T181A일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 예로, 본 발명의 상기 돌연변이 S125D/T181A는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 헥수론산 C4-에피머화 효소의 125번과 181번 잔기의 아미노산을 각각 세린(Ser)에서 아스파르트산(Asp)과 트레오닌(Thr)에서 알라닌(Ala)으로 변환시킨 S125D와 T181A 이중돌연변이 헥수론산 C4-에피머화 효소를 의미하는 것이며,

본 발명의 상기 돌연변이 S125D/H362L/T181A는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 헥수론산 C4-에피머화 효소의 125번, 362번, 그리고 181번 잔기의 아미노산을 각각 세린(Ser)에서 아스파르트산(Asp), 히스티딘(His)에서 류신(Leu)으로, 그리고 트레오닌(Thr)에서 알라닌(Ala)으로 변환시킨 S125D, H362L, 그리고 T181A 삼중돌연변이 헥수론산 C4-에피머화 효소를 의미하는 것이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한, 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 코딩하는 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 코딩하는 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 또한, 본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있다.

바람직하게는, 상기 발현벡터는 상기 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 pET 29b, pETDuet-1 및 pNZ8152일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 재조합 발현 벡터의 제조시 타가토스의 생산에 사용될 수 있는 것이라면 발현 벡터 pET 29b와 pETDuet-1을 포함하여 유전자 재조합 방법에 이용되는 어느 벡터라도 사용될 수 있고, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환되는 미생물로는 대장균 이알 2566 (ER 2566)을 사용하는 것이 바람직하나, 재조합 발현 벡터로 형질전환되어 목적하는 유전자를 과발현하고 활성이 있는 효소 단백질을 생산할 수 있는 균주라면 어느 것이라도 사용될 수 있다. 특히 유산균인 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)를 효소 생산 균주로 활용하여 재조합 단백질을 생산할 경우 과발현 벡터로는 pNZ8152을 사용하고, 이를 활용 효소 생산을 목적으로 하는 유전자를 과발현 유산균주는 NZ9130을 사용하는 것이 바람직하나, 다음의 특징을 갖는 과발현 벡터와 유산균주일 경우에는 (a) 락토코커스 락티스 아종 크레모리스 MG1363에서 유래한 플라스미드 프리 균주; (b) 상기 균주 중 형질전환시 벡터에 삽입으로 인해 L-알라닌을 활용하여 선택적 배양이 가능하도록 알라닌 레이스메이즈(Alanine racemase(alr)); L-알라닌을 D-알라닌으로 이성화질체로 변화시키는 이성화 효소)가 결손되어 있고, 벡터에 상기 유전자가 삽입되어 있을 것; (c) 또한 균주에는 유산균으로부터 생성되는 일종의 항균 펩타이드인 나이신(Nisin)에 의해 목적 단백질의 생합성을 조절하는 유전자로 nisR, nisK가 삽입되어 있고 이를 통해 벡터에 삽입된 목적 유전자의 발현이 유도될 것; 어느 것이라도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 방법에 의해 생산된 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 효소의 농도는 18~22㎎/㎖, 과당의 농도는 45~55%(w/v)으로 첨가하여 56~66℃에서 12~16시간 반응시키는 것일 수 있고, 바람직하게는 효소의 농도는 20㎎/㎖, 과당의 농도는 50%(w/v)으로 첨가하여 60℃에서 14시간 반응시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서 사용한 헥수론산 C4-에피머화 효소는 효소 활성을 증진시키는 금속에 대해 영향을 받는 금속 이온 의존성 효소이다. 따라서, 상기 효소반응은 니켈 금속이온을 0.1 mM 내지 2 mM 범위로 처리한 상태에서 수행할 수 있으며, 1.5 mM의 상기 금속이온을 처리하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 상기 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소의 농도는 18~22㎎/㎖ 범위인 것이 바람직하며, 20㎎/㎖ 범위인 것이 가장 바람직하다.

또한, 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소의 기질로서 과당을 사용하는 것이 바람직하고, 상기 기질 농도는 45~55%(w/v) 범위인 것이 더욱 바람직하며, 50%(w/v) 범위인 것이 가장 바람직하다.

또한, 상기 효소 반응은 pH 7.0 내지 pH 9.0 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, pH 8.0 내외 범위에서 이루어지는 것은 더욱 바람직하다.

또한 상기 효소 반응은 온도 50℃ 내지 70℃ 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, 온도 60℃ 내외 범위에서 이루어지는 것은 더욱 바람직하나, 상기 효소 반응 시간도 통상적인 방법에 따라 적절히 조절할 수 있다.

또한, 상기 효소 반응 시간은 12~16시간 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, 14 시간 내외 범위에서 이루어지는 것은 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 유효성분으로 함유하는 타가토스(D-tagatose) 생산용 조성물을 제공한다. 본 발명의 타가토스 생산용 조성물은 유효성분으로 상기 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 함유하며, 상기 효소에 기질인 과당을 처리하여 반응시키면 타가토스를 생산할 수 있는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 헥수론산 C4-에피머화 효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제조

헥수론산 C4-에피머화 효소를 제조하기 위하여, 써모토가 페트로필라(Thermotoga petrophila) 균주로부터 유래한 헥수론산 C4-에피머화 효소를 코딩하는 유전자를 먼저 분리하였다. 구체적으로 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 써모토가 페트로필라 균주를 선별하고, 이로부터 유래한 헥수론산 C4-에피머화 효소의 공지의 DNA 염기서열(Genebank Accession Number CP000702)을 기초로 하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하기 위하여 게놈 DNA를 추출하여 이를 PCR의 주형으로 사용하였다. 또한 Gibson assembly method를 이용하여 헥수론산 C4-에피머화 효소의 DNA 염기서열을 기초로 한 프라이머(F:5'-AGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGACATATGATGGTCTTGAAAGTGTTCAAAGATCACTTT-3'(서열번호 3), R:5'-ATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCACCCCTTCAACAGGTCTACGTGCCTTTT-3'(서열번호 4))를 고안하여 중합효소 연쇄반응을 실시하였으며, 재조합 플라스미드 벡터 pET 29b의 염기서열을 기초로 한 프라이머(F:5'-AAAAGGCACGTAGACCTGTTGAAGGGGTGACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGAT-3'(서열번호 5), R:5'-AAAGTGATCTTTGAACACTTTCAAGACCATCATATGTCCCTGAAAATACAGGTTTTCGCT-3'(서열번호 6))를 고안하여 중합효소 연쇄반응을 실시하여 제한효소 없이 연결하여 pET 29b/헥수론산 C4-에피머화 효소를 제작하였다.

상기와 같이 얻은 재조합 발현 벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 ER 2566 균주에 형질전환하였다. 또한, 상기 형질전환된 미생물은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 타가토스의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.

실시예 2. 헥수론산 C4-에피머화 효소의 변이체 제조를 위한 1차 스크리닝

헥수론산 C4-에피머화 효소의 변이체를 만들기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작한 pET 29b/헥수론산 C4-에피머화 효소를 Clontech 사 Diversify PCR random mutagenesis kit을 이용하여 error prone을 진행하였다. PCR을 이용하여 뉴클레오티드 약 2~3개의 변이를 주었고. 변이를 준 PCR 산물을 pET 29b에 연결하여 대장균 ER 2566에 형질전환하였다. 1차 스크리닝을 위해 변이가 일어난 콜로니를 96 웰 플레이트에서 LB에 IPTG를 첨가하여 37℃에서 500rpm에서 26시간 배양하였고, 배양된 콜로니를 10 g/L의 D-프럭토스를 이용하여 60℃에서 12시간 반응한 후 프럭토스 분석 키트(Toyobo 사)을 이용하여 프럭토스 분석을 진행하여 야생형과 비교하여 그 활성이 1.5배 이상 높은 콜로니를 선별하였다. 이렇게 1차 스크리닝을 통하여 얻은 약 50주의 콜로니를 다시 선별하기 위해 2차 스크리닝을 진행하였다.

실시예 3. 헥수론산 C4-에피머화 효소의 변이체 제조를 위한 2차 스크리닝

2차 스크리닝은 50주의 균주의 효소만의 반응을 확인하기 위해 진행하였다. LB에 37℃에서 배양하다가 세포 OD가 0.8일 때 0.1mM IPTG를 이용하여 37℃에서 유도하였다. 그 후 100mM 인산칼륨 완충액 pH 7.0 조건에서 crude 효소를 추출하여 얻고, 이 효소에 1.5mM Ni² ⁺를 임의적으로 넣어서 효소를 안정화시킨 후 대장균 유래의 효소들을 제거하기 위해 70℃에서 10분 열처리하여 부분적인 정제를 진행하였다. 그 후 부분적인 정제가 진행된 효소를 같은 양으로 맞춘 후 1.5mM Ni²⁺를 처리하여 30분 이상 효소를 안정화시킨 후 10 g/L D-프럭토스를 기질로 60℃에서 12시간 동안 반응한 후 2M HCl을 이용하여 효소의 활성을 정지시키고 분석하였다. 이때 야생형에 비해 D-타가토스의 생성량이 높은 잔기를 골라 마크로젠사에 시퀀싱을 의뢰하여 변이가 된 잔기를 확인하였다. 그 결과, 변이체중 S125D가 가장 증가한 활성을 보였으며 도 1에서와 같이 야생형 효소보다 활성이 약 3.5배 증가함을 확인할 수 있었다.

따라서, S125D 변이체를 기준으로 상기 실시예 2와 실시예 3과 같이 스크리닝을 수행하였고, 그 결과, 도 1에서와 같이 S125D와 T181D 이중돌연변이체, S125D와 S268F 이중돌연변이체, S125D와 H362L 이중돌연변이체가 S125D 변이체보다 각각 약 2배, 1.9배, 1.5배 높은 활성을 보임을 확인하였다.

실시예 4. 이중돌연변이체의 점돌연변이체 제조

상기 실시예 3에서 확인한 높은 활성을 갖는 변이체들의 잔기들을 QuickChange사 site directed mutagenesis kit(Stratagene; SDM)를 이용하여 S125D 변이체를 기준으로 각 하나의 이중 돌연변이체를 만들고, 이렇게 제조된 점변이체들의 활성을 S125D 변이체와 비교하였다.

도 2에서와 같이 트레오닌 181번 잔기를 치환하여 S125D/T181A, S125D/T181D, S125D/T181F, S125D/T181G, S125D/T181K, S125D/T181L, S125D/T181V, S125D/T181W 이상 8개의 이중 변이체를 제조하였으며, 이 중 S125D/T181A와 S125D/T181D는 각각 S125D 보다 약 2배씩 활성이 높음을 확인할 수 있었다.

또한, 도 3에서와 같이 세린 268번 잔기를 치환하여 S125D/S268A, S125D/S268D, S125D/S268F, S125D/S268G, S125D/S268K, S125D/S268L, S125D/S268V, S125D/S268W 이상 8개의 이중 변이체를 제조하였으며, 이 중 S125D/S268F가 S125D 보다 약 1.9배 활성이 높음을 확인할 수 있었다.

또한, 도 4에서와 같이 히스티딘 362번 잔기를 치환하여 S125D/H362A, S125D/H362D, S125D/H362F, S125D/H362G, S125D/H362L, S125D/H362T, S125D/H362V, S125D/H362W 이상 8개의 이중 변이체를 제조하였으며, 이 중 S125D/H362L과 S125D/H362W는 각각 S125D 보다 약 1.5배씩 활성이 높음을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 잔기의 변이 조합에 따른 돌연변이체 제조

상기 실시예 4에서 확인한 높은 활성을 갖는 변이체의 잔기들을 조합하여 삼중 돌연변이체를 만들고, 도 5에서와 같이 이렇게 제조된 변이체들의 활성을 S125D 변이체와 이중 변이체들과 함께 비교하였다.

S125D/S268F/T181A, S125D/S268F/T181D, S125D/S268F/H362L, S125D/S268F/H362W, S125D/H362L/T181A, S125D/H362L/T181D, S125D/H362W/T181A, S125D/H362W/T181D 이상 8개의 삼중 변이체를 제조하였으며, 이 중 S125D/H362L/T181A는 가장 높은 활성을 보였으며 S125D 보다 약 2.4배 활성이 높음을 확인할 수 있었다.

상기의 변이체들을 유산균에서 발현시키기 위해 이들로부터 플라스미드 DNA를 추출하여 이를 주형으로 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 이때 사용된 프라이머(F:5'-GGGGTCGACATGGTCTTGAAAGTGTTCAAAG-3'(서열번호 7), R:5'-GGGAAGCTTCTATCACCCCTTCAACAGGTCTA-3'(서열번호 8))를 고안하여 중합효소 연쇄반응을 실시 후 제한효소 Scal과 HindIII를 활용하고 연결하여 pNZ8152/헥수론산 C4-에피머화 효소를 제작하였다.

실시예 6. 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소의 제조

변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소를 대량 생산하기 위하여, 상기 실시예 4또는 실시예 5에서 제작하고, 냉동 보관된 재조합 대장균 ER 2566 균주를 LB 배지 3 ㎖이 들어있는 시험관(test tube)에 접종하고 600 ㎚에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그 다음 상기 종균 배양된 배양액을 LB 배지 500 ㎖이 들어있는 2,000 ㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 또한, 600 ㎚에서의 흡광도가 0.8이 될 때, 0.1 mM 아이피티지(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside; IPTG)를 첨가하여 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소의 대량 발현을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 37℃가 유지하도록 조절하고, IPTG를 첨가한 후에 같은 조건으로 6시간동안 배양하였다.

아울러 유산균을 활용한 효소의 생산을 위해 실시예 5에서 제조하고, 냉동 보관된 재조합 유산균 NZ9130 균주를 0.5% 포도당과 200㎍/㎖의 L-알라닌이 포함된 M17 배지 5㎖이 들어있는 시험관(test tube)에 접종하고 30℃에서 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그 다음 상기 종균 배양된 배양액을 0.5% 포도당과 200㎍/㎖의 L-알라닌이 포함된 M17 배지 1,000 ㎖이 들어있는 2,000 ㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 또한, 600 ㎚에서의 흡광도가 0.4가 될 때, 5ng/ml 나이신(Nisin)을 첨가하여 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소의 대량 발현을 유도하였다.

이후, 상기와 같이 과발현되어 생산된 헥수론산 C4-에피머화 효소는 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000×g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두번 세척한 다음 100 mM 인산칼륨 완충액과 0.1 mM 단백분해 효소 저해제(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하여 상기 세포 용액을 초음파파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 65℃에서 10분간 열처리를 한 후 다시 13,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 세포 펠렛을 제거한 다음 세포 상등액만을 얻어 고속 단백질 액체 크로마토그라피(fast protein liquid chromatography system(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA))에 친화성 수지인 히스트랩 에이치피(His Trap^TM HP) 흡착 컬럼을 장착하여 타가토스 생산에 사용되는 효소액으로서 분리하였다.

실시예 7. 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소의 온도 안정성 조사

상기 실시예 6에서 분리한 변이체 S125D와 삼중 변이체 S125D/H362L/T181A 헥수론산 C4-에피머화 효소의 시간 및 온도 변화에 따른 안정성을 다음과 같이 비교하였다. 다양한 시간 및 온도 조건 하에서 효소와 기질을 반응시키고 효소들의 활성을 비교하였다.

7-1. 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소의 온도에 따른 안정성 확인

S125D 변이체와 S125D/H362L/T181A 삼중 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소의 온도에 따른 안정성을 조사하기 위하여, 온도 60℃에서 80℃까지의 범위에서 효소를 8시간동안 방치한 후, 100 g/L 과당, 1.5 mM 니켈, 4 mg/㎖ 효소가 포함된 pH 8.0인 100 mM 인산칼륨 완충액을 사용하여 각각 14시간동안 반응을 진행하였다. 반응이 끝난 다음, 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시키고, 타가토스로의 전환을 HPLC를 통해 측정하였다.

도 6에서와 같이, S125D 변이체의 경우 온도 처리를 하지 않은 대조구에 비해 온도 60℃에서 75℃까지 방치한 경우 상대활성이 80% 미만으로 측정되었으며, 80℃에서는 약 48%로 현저히 낮은 수준의 상대활성을 보였다. 반면에 S125D/H362L/T181A 삼중 변이체의 경우 60℃에서 75℃까지 방치한 경우 상대활성이 80% 이상으로 측정되었으며, 80℃에서는 약 75%로 S125D 변이체보다 높은 안정성을 보임을 확인하였다.

7-2. 변이체 헥수론산 C4 - 에피머화 효소의 시간에 따른 안정성 확인

S125D 변이체와 S125D/H362L/T181A 삼중 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소의 시간에 따른 안정성을 조사하기 위하여, 48시간까지의 범위에서 12시간 간격으로 효소를 60℃에서 8시간동안 방치한 후, 100 g/L 과당, 1.5 mM 니켈, 4 mg/㎖ 효소가 포함된 pH 8.0인 100 mM 인산칼륨 완충액을 사용하여 각각 14시간동안 반응을 진행하였다. 반응이 끝난 다음, 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 상기 반응을 정지시키고, 타가토스로의 전환을 HPLC를 통해 측정하였다.

도 7에서와 같이, S125D 변이체의 경우 60℃에서 48시간까지 방치한 경우 상대활성이 약 66%로 측정되었으나, S125D/H362L/T181A 삼중 변이체의 경우 60℃에서 48시간까지 방치한 경우 상대활성이 약 94%로 S125D 변이체보다 높은 안정성을 보임을 확인하였다.

실시예 8. 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소를 이용한 타가토스의 생산

변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소를 이용한 타가토스의 생산 방법을 개발하기 위하여, pH 7.0, 온도 60℃에서 4 mg/ml의 헥수론산 C4-에피머화 효소를 100 g/L 과당과 반응하여 타가토스의 시간별 생산량을 측정하였다.

도 8은 기질로서 농도 100 g/L의 과당에서 본 발명의 야생형, S125D 변이체, S125D/H362L/T181A 삼중 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소에 의한 타가토스의 생산량을 나타낸 그래프로, S125D/H362L/T181A 삼중 변이체는 100 g/L의 과당으로부터 반응시간 24시간 후에 28.12 g/L 타가토스를 얻어 약 28%의 전환수율을 나타내었다. 반면에 야생형과 S125D 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소는 24시간 후에 각각 약 4%와 약 15%의 전환수율을 보이며 S125D/H362L/T181A 삼중 변이체와 약 7배와 약 1.9배 낮은 농도의 타가토스를 생산하였다.

실제 과당으로부터 타가토스를 양산하기 위한 제품 생성 공정을 확보하기 위해 기질로서 과당의 농도를 500g/L(50% w/v)로 증가시킨 후 본 발명의 S125D/H362L/T181A 삼중 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소를 1~5㎎/㎖에 의한 타가토스의 생산을 확인했다. 도 9는 상기 조건에서의 타가토스 전환률을 보여주고 있는 그래프로서, 반응시간 14시간 후 Bio-LC를 통한 분석을 통해 효소의 농도가 증가함에 따라 과당이 타가토스로 전환되는 것 또한 점차 증가함을 확인할 수 있었다. 이때 반응시간의 경우 시간에 따른 전환률이 14시간에서 최대를 보이고 이후 시간이 증가해도 전환률의 증가는 나타나지 못했다. 이상의 결과를 토대로 양산을 위한 기질의 농도는 생산성을 기준으로 기존의 10%(w/v)보다는 50%(w/v)가 적합한 것으로 확인됐다.

상기 반응을 통해 확인된 적정 기질농도에 적합한 효소의 농도를 확인했다. 기질의 농도가 50%(w/v)일 때 S125D/H362L/T181A 삼중 변이체 헥수론산 C4-에피머화 효소가 4~20㎎/㎖까지 점진적으로 증가함에 따른 전환률의 차이를 도 10에서 나타내고 있다. 해당 효소의 농도가 최대 20㎎/㎖일 때 전환률은 최대 29.51%를 나타내는 것을 확인하였고 이때 반응 시간은 14시간인 것을 확인했다. 종합적으로 효소의 농도는 20㎎/㎖, 기질인 과당의 농도는 50%(w/v)으로하여 60℃에서 14시간 전환반응을 실시하는 것이 합당하다는 결론을 내릴 수 있었다.

<110> CHEBIGEN INC. <120> Hexuronate C4-epimerase mutant from Thermotoga petrophila and uses thereof <130> PN17457 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1446 <212> DNA <213> Thermotoga petrophila <400> 1 atggtcttga aagtgttcaa agatcacttt ggaaggggat acgaagttta cgaaaagtct 60 tatagagaaa aggattctct ctctttcttc ttgacaaagg gagaggaagg aaaaattctg 120 gtagtggctg gagaaaaggc acctgagggt ctgtcgtttt tcaaaaaaca gcgggtggag 180 ggtgtttcgt tctttttctg tgagagaaat catgagaact tggaagttct cagaaaatac 240 tttccagatc tcaaaccagt tcgagcggga ttgagagcgt cttttggaac aggtgacaga 300 ctcggtatca ccacaccggc tcacgtgagg gcgttgaagg attcagggct ttttcccatc 360 tttgcgcagc agtcggtgag ggagaacgag agaacgggaa ggacctggag agatgtgctg 420 gacgatgcca catggggagt tttccaggag ggatacagtg agggattcgg agcagacgcc 480 gatcacgtga agcggccgga ggatcttgtt tcggctgcaa gggaaggttt caccatgttc 540 acaatcgatc cttcggatca tgtgaggaat ctttcaaaac ttacagaaaa ggaaagaaat 600 gagaaattcg aagagattct gagaaaggaa aggatcgaca ggatctatct cggtaagaaa 660 tactctgttc tcggtgagaa gatcgaattc gatgagaaga atctcagaga tgcggcgctc 720 gtgtattacg atgcgattgc ccacgtggat atgatgtatc aaattttgaa agacgaaacc 780 ccggatttcg acttcgaagt gtcagttgac gaaacagaaa ctcccacgag tcctctcttc 840 cacattttcg ttgtggaaga actcagacga agaggtgtgg agttcaccaa tcttgccctg 900 agattcatcg gcgaatggga aaagggaata gattacaagg gggatcttgc acagttcgag 960 agagaaatca aaatgcacgc agaaatcgca aggatgttcg aaggatacaa aatatcactc 1020 cactctggaa gcgacaaatt ttccgtgtat cctgcttttg cttccgcgac aggaggcctt 1080 ttccacgtga agacagccgg aacgagttat cttgaggcgg tgaaggtcat atccatggtc 1140 aacccggagc tcttccggga gatctacagg tgtgctctcg atcactttga ggaagacaga 1200 aagtcctatc acatatctgc ggatctgtcg aaagttccgg aagtagagaa agtgaaagat 1260 gaagatcttc caggtctttt tgaagacatc aacgtgagac agttgatcca tgtcacctat 1320 ggctctgttc tgaaagatgc atctttgaaa gaacggctgt ttaagacgct tgaacaaaat 1380 gaggaactct tctacgagac cgtggcaaaa catataaaaa ggcacgtaga cctgttgaag 1440 gggtga 1446 <210> 2 <211> 482 <212> PRT <213> Thermotoga petrophila <400> 2 Met Val Leu Lys Val Phe Lys Asp His Phe Gly Arg Gly Tyr Glu Val 1 5 10 15 Tyr Glu Lys Ser Tyr Arg Glu Lys Asp Ser Leu Ser Phe Phe Leu Thr 20 25 30 Lys Gly Glu Glu Gly Lys Ile Leu Val Val Ala Gly Glu Lys Ala Pro 35 40 45 Glu Gly Leu Ser Phe Phe Lys Lys Gln Arg Val Glu Gly Val Ser Phe 50 55 60 Phe Phe Cys Glu Arg Asn His Glu Asn Leu Glu Val Leu Arg Lys Tyr 65 70 75 80 Phe Pro Asp Leu Lys Pro Val Arg Ala Gly Leu Arg Ala Ser Phe Gly 85 90 95 Thr Gly Asp Arg Leu Gly Ile Thr Thr Pro Ala His Val Arg Ala Leu 100 105 110 Lys Asp Ser Gly Leu Phe Pro Ile Phe Ala Gln Gln Ser Val Arg Glu 115 120 125 Asn Glu Arg Thr Gly Arg Thr Trp Arg Asp Val Leu Asp Asp Ala Thr 130 135 140 Trp Gly Val Phe Gln Glu Gly Tyr Ser Glu Gly Phe Gly Ala Asp Ala 145 150 155 160 Asp His Val Lys Arg Pro Glu Asp Leu Val Ser Ala Ala Arg Glu Gly 165 170 175 Phe Thr Met Phe Thr Ile Asp Pro Ser Asp His Val Arg Asn Leu Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Glu Lys Glu Arg Asn Glu Lys Phe Glu Glu Ile Leu Arg 195 200 205 Lys Glu Arg Ile Asp Arg Ile Tyr Leu Gly Lys Lys Tyr Ser Val Leu 210 215 220 Gly Glu Lys Ile Glu Phe Asp Glu Lys Asn Leu Arg Asp Ala Ala Leu 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Asp Ala Ile Ala His Val Asp Met Met Tyr Gln Ile Leu 245 250 255 Lys Asp Glu Thr Pro Asp Phe Asp Phe Glu Val Ser Val Asp Glu Thr 260 265 270 Glu Thr Pro Thr Ser Pro Leu Phe His Ile Phe Val Val Glu Glu Leu 275 280 285 Arg Arg Arg Gly Val Glu Phe Thr Asn Leu Ala Leu Arg Phe Ile Gly 290 295 300 Glu Trp Glu Lys Gly Ile Asp Tyr Lys Gly Asp Leu Ala Gln Phe Glu 305 310 315 320 Arg Glu Ile Lys Met His Ala Glu Ile Ala Arg Met Phe Glu Gly Tyr 325 330 335 Lys Ile Ser Leu His Ser Gly Ser Asp Lys Phe Ser Val Tyr Pro Ala 340 345 350 Phe Ala Ser Ala Thr Gly Gly Leu Phe His Val Lys Thr Ala Gly Thr 355 360 365 Ser Tyr Leu Glu Ala Val Lys Val Ile Ser Met Val Asn Pro Glu Leu 370 375 380 Phe Arg Glu Ile Tyr Arg Cys Ala Leu Asp His Phe Glu Glu Asp Arg 385 390 395 400 Lys Ser Tyr His Ile Ser Ala Asp Leu Ser Lys Val Pro Glu Val Glu 405 410 415 Lys Val Lys Asp Glu Asp Leu Pro Gly Leu Phe Glu Asp Ile Asn Val 420 425 430 Arg Gln Leu Ile His Val Thr Tyr Gly Ser Val Leu Lys Asp Ala Ser 435 440 445 Leu Lys Glu Arg Leu Phe Lys Thr Leu Glu Gln Asn Glu Glu Leu Phe 450 455 460 Tyr Glu Thr Val Ala Lys His Ile Lys Arg His Val Asp Leu Leu Lys 465 470 475 480 Gly Glx <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 agcgaaaacc tgtattttca gggacatatg atggtcttga aagtgttcaa agatcacttt 60 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atctcagtgg tggtggtggt ggtgctcgag tcaccccttc aacaggtcta cgtgcctttt 60 60 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aaaaggcacg tagacctgtt gaaggggtga ctcgagcacc accaccacca ccactgagat 60 60 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aaagtgatct ttgaacactt tcaagaccat catatgtccc tgaaaataca ggttttcgct 60 60 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggggtcgaca tggtcttgaa agtgttcaaa g 31 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gggaagcttc tatcacccct tcaacaggtc ta 32

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 써모토가 페트로필라(Thermotoga petrophila) 유래의 헥수론산 C4-에피머화 효소(Hexuronate C4-epimerase)의 125번째, 181번째, 268번째 및 362번째의 아미노산 중 하나 이상이 돌연변이된 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소.
제1항에 있어서, 상기 125번째 아미노산 돌연변이는 S125D, 181번째 아미노산 돌연변이는 T181A 또는 T181D, 268번째 아미노산 돌연변이는 S268F, 362번째 아미노산 돌연변이는 H362L 또는 H362W인 것을 특징으로 하는 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소.
제1항에 있어서, 상기 돌연변이는 S125D/T181A, S125D/T181D, S125D/S268F, S125D/H362L, S125D/H362W, S125D/H362L/T181A, S125D/H362L/T181D, S125D/H362W/T181A 또는 S125D/H362W/T181D인 것을 특징으로 하는 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 코딩하는 유전자.
제4항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제5항의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하여 상기 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 코딩하는 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 생산하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항의 방법에 의해 생산된 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소.
제1항의 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 과당에 처리하고 반응시키는 단계를 포함하는 타가토스를 생산하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 효소의 농도는 18~22㎎/㎖, 과당의 농도는 45~55%(w/v)으로 첨가하여 56~66℃에서 12~16시간 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 헥수론산 C4-에피머화 변이체 효소를 유효성분으로 함유하는 타가토스 생산용 조성물.