KR20140143109A

KR20140143109A - 타가토스의 제조방법

Info

Publication number: KR20140143109A
Application number: KR1020140067867A
Authority: KR
Inventors: 양성재; 김양희; 김성보; 박승원; 박일향; 김민회; 이영미
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2013-06-05
Filing date: 2014-06-03
Publication date: 2014-12-15
Also published as: ES2751691T3; CA2912540A1; BR112015029933A2; HUE046414T2; MX2015016535A; CN105431541B; US10745720B2; US20160138053A1; EP3006568B1; EP3006568A4; BR112015029933B1; EP3006568A1; BR112015029933B8; CA2912540C; KR101550796B1; PL3006568T3; CN105431541A; JP2016523526A; DK3006568T3; WO2014196811A1

Abstract

본 발명은 타가토스의 제조방법에 관한 것이다.

Description

타가토스의 제조방법 {Manufacturing method for tagatose}

본 발명은 과당으로부터 타가토스를 제조하는 방법, 더욱 구체적으로, 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화시켜 타가토스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

타가토스는 설탕과 거의 구별할 수 없는 천연의 단맛을 가지고 있으며, 물리적 성질 또한 설탕과 비슷하다. 그러나 섭취한 타가토스는 소장에서 잘 흡수되지 않기 때문에 혈당치에 영향을 주지 않으며, 칼로리는 설탕의 약 30 %인 저칼로리 감미료이다. 또한 타가토스는 장내 미생물에 의하여 발효되어 유익한 유산균의 증식을 촉진시키는 전생물적 효과(prebiotic effect)를 가지고 있다.

타가토스는 섭취량의 20 % 정도 만이 소장에서 흡수되고, 나머지 80%는 장내 미생물이 서식하는 대장으로 이동되어 선택적으로 유산균 생성을 촉진함으로써 단쇄 지방산을 생성하며, 특히, 대장암을 예방하는 부티릭산(butyrate)를 다량으로 (전체 단쇄 지방산의 50 % 수준까지) 생성하는 프리바이오틱(prebiotic) 성질을 가지고 있다. 또한 타가토스는 1.5 kcal/g의 저칼로리 천연당으로서, 미국 FDA의 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 인정되어, 식품, 음료, 건강식품, 다이어트 첨가물 등에 기능성 감미료로서 사용되고 있다.

그러나 타가토스는 자연계에 흔하게 존재하는 것이 아니라 유제품 또는 일부 식물에 미량 함유되어 있는 희소당이므로, 저칼로리의 기능성 감미료로 사용되기 위해서는 저렴한 원료로부터 대량 생산할 수 있는 기술이 개발되어야 한다.

종래에는 타가토스의 제조는 갈락토스의 이성화 반응을 통하여 수행되어 왔으며, 갈락토스를 경제적으로 수득하기 위하여 갈락토스를 함유한 다양한 기초 원료 및 이로부터의 갈락토스의 수득 및 타가토스의 제조에 대한 연구가 선행되어 왔다. 가장 대표적인 기초 원료로는 유당을 사용하였으나, 유당 혹은 유당을 함유하고 있는 제품의 가격은 날씨에 따른 원유의 생산량, 분유의 수요, 제 3국에서의 유당 소비량 변화 등의 다양한 요인들에 의하여 상승과 하락을 반복하는 고유의 가격 패턴을 가져 시장에서의 가격의 불안정성이 존재하여 안정적인 타가토스의 생산 원료 수급을 어렵게 하는 문제가 있었다. 따라서, 보편화된 일반 원료(포도당, 설탕, 과당 등)를 사용하여 타가토스를 제조하는 신 공정개발이 필요하다.

이에, 대한민국 공개특허 제10-2009-0125004호에서는 에피머화를 통하여 포도당으로부터 갈락토스를 생산하는 방법을 개시할 뿐이고, 대한민국 공개특허 제10-2006-0125971호에서는 케토헥소오스의 C3-에피머화 반응을 개시하고 있으나, 상기 문헌 모두에서 C4-에피머화 반응을 이용한 과당으로부터 타가토스를 제조하는 방법은 개시하고 있지 않다.

대한민국 공개특허 제10-2009-0125004호(2009.12.03 공개) 대한민국 공개특허 제10-2006-0125971호(2006. 12. 07 공개)

없음

종래에는 유당 또는 유당을 함유하고 있는 제품 및 기타 갈락토스를 함유한 다양한 생물자원으로부터 분해되는 갈락토스를 이용하여 타가토스를 제조하였다. 그러나 현재까지 원료의 안정적 수급 및 투자 효율성 등을 고려하여 현재까지 상업화되거나 그 수준까지 제조가 가능한 원료는 유당 혹은 유당을 함유하고 있는 제품 (유청 등)으로 평가되고 있다. 그러나, 유당 또는 유당을 함유하고 있는 제품은 가격의 변동이 심하고, 최근 유당의 소비량이 증가하면서 가격이 상승함에 따라 안정적인 타가토스의 공급이 어려운 문제가 있다.

또한, 종래 유당을 갈락토스로 전환하는 화학전환법은 에피머화에 한계가 있었고, 효소전환법은 여전히 갈락토스를 이용하는 한계가 있었다.

따라서, 종래 타가토스 제조법에 비해 안정적이고 경제적이면서도 생산 효율이 높은 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

이에, 본 발명은 과당을 헥수론산 C4-에피머화 효소 (hexuronate C4-epimerase)로 에피머화시켜 타가토스를 포함하는 에피머화 반응물을 수득하는 단계; 상기 에피머화 반응물을 정제하는 단계; 및 상기 정제된 에피머화 반응물을 결정화하는 단계를 포함하는 타가토스의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서는 가격 변동이 큰 유당이 아닌, 보편화된 원료인 과당을 사용하여 제조원가를 절감시킴으로서 경제적이면서도 높은 수율의 타가토스 제조방법을 제공할 수 있다.

보편적으로 과당은 포도당 혹은 설탕으로부터 공업적으로 제조 가능함은 매우 널리 알려져 있는 사실이므로, 본 발명에서 제시하는 공정의 원료는 과당 이외에 보다 저렴한 생산을 위하여 과당을 전체에 혹은 일부 함유한 형태로 사용하는 경우까지 확장하여 포함할 수 있다. 즉, 본 발명은 타가토스를 전분질 혹은 원당 혹은 설탕으로부터 효소적 전환을 통하여 생산하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 과당을 이용하여 타가토스를 제조하여 오늘날 중요한 식품 소재로 각광받고 있는 타가토스를 효율적으로 대량 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 양태에 따른 타가토스의 제조 공정을 나타내는 흐름도이다.
도 2 내지 도 5는 각각 상이한 양태에 따른 타가토스의 제조 공정을 나타내는 흐름도이다.
도 6은 과당을 기질로 하여 C4-에피머화 효소 반응에 의한 타가토스 생성을 보여주는 HPLC 그래프이다.
도 7은 반응 온도 변화에 따른 C4-에피머화 효소 활성 정도를 보여주는 그래프이다.
도 8은 pH 변화에 따른 C4-에피머화 효소 활성 정도를 보여주는 그래프이다.
도 9는 금속염 종류에 따른 C4-에피머화 효소 활성 정도를 보여주는 그래프이다.
도 10은 기질인 과당의 농도 변화에 따른 타가토스로의 전환율 정도를 보여주는 그래프이다.
도 11은 과당과 타가토스의 전환율과 회수율 간의 상관성을 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 발명의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.

본원에서 상기 용어 "n번 탄소 위치"란, IUPAC에서 규정하는 탄소 번호를 매기는 규칙에 따라 정해진 탄소 위치를 의미하며, 이는 Cn으로 표현할 수 있다. 이 때, n은 1 이상인 정수를 말한다. 예를 들어, "4번 탄소 위치에서 에피머화"되는 것을 "C4-에피머화"로 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, a) 과당을 헥수론산 C4-에피머화 효소 (hexuronate C4-epimerase)로 에피머화시켜 타가토스를 포함하는 에피머화 반응물을 수득하는 단계; b) 상기 에피머화 반응물을 정제하는 단계; 및 c) 상기 정제된 에피머화 반응물을 결정화하는 단계를 포함하는 타가토스의 제조방법일 수 있다.

일반적으로, 단당류는 알도헥소오스(aldohexose)와 케토헥소오스(ketohexose)로 분류될 수 있다. 알도헥소오스란 탄소 원자 여섯 개로 이루어지진 알도스로, 한쪽 끝에 알데하이드기를 가지고 있는 것을 의미하고, 비제한적인 예로는 포도당(glucose), 갈락토스(galactose), 알로스(allose), 굴로스(gulose), 알트로스(altrose), 만노스(mannose), 탈로스(talose), 아이도스(idose)가 있다. 또한, 본원에서 케토헥소오스는 탄소 원자 여섯 개로 이루어지고 케톤기를 가진 단당류를 의미하고, 비제한적인 예로는 과당(fructose), 타가토스(tagatose), 사이코스(psicose) 및 소보스(sorbose)가 있으며, 바람직하게는 과당일 수 있다. 상기 과당 및 상기 타가토스는 본원에서 특별한 다른 언급이 없는 한 D-형 과당 또는 D-형 타가토스를 의미한다.

본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, 상기 과당은 설탕 또는 포도당으로부터 얻어질 수 있다. 이를 통해, 포도당, 과당, 설탕과 같이 보편화되고 저렴한 원료를 사용하여 높은 수율의 타가토스를 제조하는 방법을 제공하여 타가토스의 대량 생산을 가능하게 할 수 있다.

따라서, 상기 a) 단계 전, 설탕를 가수분해하여 과당을 얻는 단계를 추가적으로 수행할 수 있다. 상기 가수분해에 사용되는 효소는 β-프룩토푸라노시다아제, 인버타아제, 사카라제 등을 포함하는 β-D-프룩토시다아제; 수크라아제, α-글루코시다아제 및 α-D-글루코하이드롤라아제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 a) 단계 전, 포도당을 이성질화하여, 과당를 얻는 단계를 추가적으로 수행할 수 있다. 상기 이성질화 효소로는 글루코스 아이소머라아제 또는 포스포글루코 아이소머라아제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용될 수 있는 헥수론산 C4-에피머화 효소 (hexuronate C4-epimerase)는 Thermotoga sp . 유래 효소 또는 그 변이체 일 수 있고, 구체적으로는 Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, 또는 Thermotoga thermarum 유래 효소 또는 그 변이체 일 수 있다.

또한, 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소는, 예를 들어, 서열목록 번호 1 내지 서열목록 번호 3의 genomic DNA로 E. coli 등의 균주에 형질전환시키고, 이를 배양하여 배양물을 수득하고, 상기 배양물을 파쇄하여, 컬럼 등을 통해 정제한 것일 수 있다. 상기 형질전환용 균주로는 Escherichia . coli, Corynebacterum glutamicum, Aspergillus oryzae, 또는 Bacillus subtilis 등이 있으며, 상기 E. coli 형질전환된 균주로는 예를 들어, E.coli BL21(DE3)pET21a-TM (기탁번호: KCCM11542P), E.coli BL21(DE3) pET21a-TN (기탁번호: KCCM11543P), 또는 E.coli BL21(DE3) pET28a-TN(m) 균주 (기탁번호: KCCM11544P) 등이 있다. 상기 E.coli BL21(DE3)pET21a-TM, E.coli BL21(DE3) pET21a-TN 및 E.coli BL21(DE3) pET28a-TN(m) 균주는 각각 한국미생물보존센터(Korean Cuture Center of Microorganisms)(서울시 서대문구 홍제1동 361-221 유림빌딩 소재)에 2014. 5.23.자로 기탁되었으며, 기탁번호는 각각 KCCM11542P, KCCM11543P, 및 KCCM11544P이다.

따라서, 본 발명의 다른 양태는, 상기 기탁 균주 E.coli BL21(DE3)pET21a-TM(기탁번호: KCCM11542P), E.coli BL21(DE3) pET21a-TN(기탁번호: KCCM11543P), 또는 E.coli BL21(DE3) pET28a-TN(m) 균주(기탁번호: KCCM11544P) 각각에 대한 것이다.

상기 과당을 헥수론산 C4-에피머화 효소로 에피머화시키는 반응은 pH 5 내지 8, 60 내지 90 ℃ 온도 조건에서 이루어질 수 있고, 바람직하게는 pH 6 내지 8 및 70 내지 90 ℃ 또는 75 내지 90℃의 고온 조건에서 이루어질 수 있다. 상기 pH 및 온도 범위 내에서 효소반응 시, 상대적으로 고온에서 반응을 진행시 킬 수 있어 제조공정 중 미생물 오염을 최소화할 수 있고, 기질로 사용되는 케토헥소오스의 용해도를 증가시킬 수 있으며 효소의 반응속도 및 전환율을 극대화할 수 있는 효과가 나타날 수 있다. 반응 온도가 효소 활성에 미치는 영향을 도 7을 참조하여 설명하면, 온도가 증가할수록 C4-에피머화 효소 활성이 증가하지만, 90℃를 경계로 하여 효소 활성이 급격히 저하될 수 있다.

또한, pH가 효소 활성에 미치는 영향은 도 8을 참조하면, 일반적으로 pH가 증가할수록 효소 활성이 증가하는 경향이 있다. 특히 완충액의 종류에 따라 적정 pH 영역이 달라질 수 있다. 예컨데, 인산염 완충액에서는 pH 5 내지 9이 적정 pH일 수 있으며, Tris 완충액에서는 pH 8.0 내지 8.5가 적정 pH일 수 있다. 다만, 후속 공정을 위해 pH를 8 이하로 하는 것이 적절할 수 있다.

일 예에서, 상기 C4-에피머화 효소로 에피머화시키는 반응은 금속염의 존재하에 실시할 수 있다. 상기 금속염은 상기 에피머화 반응에 있어서 촉매 역할을 할 수 있으며, 예를 들어, NiSO₄, NiCl₂, CoCl₂, MnCl₂, 또는 ZnSO₄를 들 수 있다. 구체적으로, NiSO₄, NiCl₂ 또는 CoCl₂를 1종 이상 사용할 수 있다. 도 9를 참조하면, 금속염 종류에 따라 에피머화 효소 활성이 달라질 수 있으며, 활성도가 높은 금속염부터 낮은 순서대로 배열할 때, NiSO₄, NiCl₂, CoCl₂, Mn Cl₂, 및 ZnSO₄의 순서임을 알 수 있다. 상기 금속염의 농도는 0.001mM 내지 50mM일 수 있다. 구체적으로 금속염의 농도는 0.01mM 내지 25mM의 범위일 수 있다.

상기 에피머화 반응물 중 타가토스는 0.05 중량% 이상, 예를 들어, 0.07 중량% 이상, 구체적으로 0.1 중량% 이상으로 포함될 수 있으며, 타가토스의 전환율은 5% 이상, 예를 들어, 7% 이상일 수 있다.

상기 정제 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 본원 발명의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 비제한적인 예로, 이온 정제, 크로마토그래피 또는 분별 결정 등을 들 수 있다. 상기 크로마토그래피에 의한 당의 분리는 분리하고자 하는 당과 이온 수지에 부착된 금속 이온 사이의 약한 결합력의 차이를 이용하여 수행될 수 있다. 일 예에서, 이온 수지는 K, Na, Ca, Mg 잔기가 부착된 강산성 양이온 교환수지일 수 있다.

과당과 타가토스와 같은 동일한 케토헥소스 당일 경우, 구조가 유사함에 따라 K, Na 등과 같은 잔기를 가진 별도의 수지를 사용하여야 한다. 이는 기본적으로 두 개의 개별적인 크로마토그래피를 순차적으로 수행하여야 타가토스를 순수 분리할 수 있음을 나타낸다. 상기 크로마토그래피 분리에 사용할 수 있는 금속 이온 잔기의 예로 K, Na, Ca, Mg 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 크로마토그래피는 구체적으로 SMB (Simulated Moving Bed) 크로마토그래피일 수 있다.

일 양태에서, 상기 정제 단계의 전 또는 후에 탈색, 탈염 또는 이 둘다를 추가로 실시할 수 있다. 구체적으로는 상기 정제 단계 전에, 탈색, 탈염 또는 이 둘 다를 실시할 수 있다. 상기 탈색은 활성탄을 에피머화 반응물의 중량을 기준으로 0.05 내지 5.0 중량%로 첨가하고 교반하는 것을 포함할 수 있다. 상기 교반은 30분 내지 3시간 동안 10 내지 1000 rpm, 구체적으로 10 내지 100 rpm의 교반 속도로 수행될 수 있다.

상기 탈염은 양이온 교환수지, 음이온 교환수지 또는 이 둘 다를 사용하여 수행할 수 있다. 상기와 같은 탈색 및 이온 정제 과정을 통해 에피머화 반응물 중 색소 물질 및 이온성 물질 등의 불순물이 제거될 수 있다.

상기 양이온 교환수지는 산기를 가지고 있는 중합체로, 수소 이온이나 금속 이온과 같은 양이온을 교환시킬 수 있으며, 상기 음이온 교환수지는 염기성기를 가지고 있는 중합체로, 암모늄기를 주로 히드록시 이온이나 할로겐화 이온과 같은 음이온을 교환시킬 수 있다. 본원 발명에서 상기 양이온 교환수지나 상기 음이온 교환수지를 1종 이상 사용할 수 있으며, 이온성 물질의 효과적 제거를 위해 양이온 교환수지와 음이온 교환수지를 동시에 사용할 수 있다. 이 경우 양이온 교환수지와 음이온 교환수지의 비율은 1:1 내지 1:3, 구체적으로, 1:1.5 내지 1:2일 수 있다. 상기 이온 정제 후 에피머화 반응물 중 이온성 물질의 함량은 전기 전도계로 측정시 단위 cm 당 10 마이크로 지맨스 이하일 수 있다.

상기 정제, 탈색 및/또는 탈염 공정을 거치면서 타가토스의 분리, 색소 물질 및 이온성 물질 등의 불순물이 제거된 에피머화 반응물은 임의로 다음 반응을 위해 추가 농축될 수 있다. 예를 들어, 타가토스가 농도가 40 Bx 이상이 되도록 농축할 수 있다. 또는 타가토스 농도가 50 Bx 이상이 되도록 농축할 수 있다.

상기 정제된 에피머화 반응물의 결정화 단계는, 에피머화 반응물의 온도를 서서히 냉각시켜 결정을 성장시킬 수 있다. 상기 결정화는 예를 들어, 40 내지 90℃의 온도에서 시간 당 0.1 내지 5 ℃씩 서서히 냉각시켜 결정화시키는 것을 들 수 있다. 상기 수득된 타가토스 결정은 추가로 탈수 및 건조될 수 있다.

도 2를 참조하면, 본 발명의 다른 양태에 따른 타가토스의 제조 방법은, 과당을 헥수론산 C4-에피머화 효소 (hexuronate C4-epimerase)로 에피머화시켜 타가토스를 포함하는 에피머화 반응물을 수득하고, 상기 에피머화 반응물을 정제하고, 상기 정제된 에피머화 반응물을 농축시키고, 이를 결정화하여 타가토스 결정을 수득하고, 이를 탈수 및 건조하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 양태 혹은 다른 양태들에 따른 제조 방법에 의해 제조된 타가토스는 80% 이상의 순도, 예를 들어, 90% 이상의 순도, 구체적으로 95% 이상의 순도, 보다 구체적으로 98% 이상의 순도를 가질 수 있다. 상기 순도는 b) 단계 후, c) 단계 전에 측정된 순도일 수 있다. 다른 예에서, 상기 순도는 c) 단계 후에 측정된 순도일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, 상기 b) 단계 후 미반응된 과당을 a) 단계에 재사용하거나, 상기 c) 단계 후 결정이 분리된 모액을 b) 단계에 재사용하거나, 또는 이 둘 다를 추가적으로 실시할 수 있다.

상기 예를 도 4를 참조하여 설명하면, 상기 정제 단계를 통해 에피머화 반응물 중 타가토스와 과당이 분리되며, 분리된 과당은 a) 단계인 에피머화 반응의 기질로 재사용될 수 있다. 또한, 도 3을 참조하면 상기 결정화 단계에서 결정 형태의 타가토스와 결정이 분리된 모액으로 분리되며, 상기 결정이 분리된 모액은 소정량의 타가토스를 포함할 수 있으므로 정제 단계에서 재사용될 수 있다. 도 5는 분리된 과당의 a) 단계로의 재사용 및 결정이 분리된 모액의 b) 단계로의 재사용이 동시에 이루지는 본 발명의 일 양태를 도시한다.

본 발명의 일 예에 따른 설탕의 가수분해, 포도당의 이성질화 및/또는 헥수론산 C4-에피머화를 통하여 수득된 당액은 설탕, 포도당, 과당 및 타가토스로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 함유하는 혼합당으로 이루어진 당액일 수 있으며, 상기 당액은 크로마토그래피 분리법을 이용하여 분리할 수 있다.

일반적으로 상기 알도헥소오스와 상기 케토헥소오스로 구성된 혼합당의 분리는 양이온 잔기를 가진 수지를 이용한 크로마토그래피로 경제적인 분리가 가능하다. 그러나, 동일한 형의 당일 경우, 구조가 유사함에 따라 K, Na와 같은 잔기를 가진 별도의 수지를 사용하여야 한다. 이는 기본적으로 두 개의 개별적인 크로마토그래피를 순차적으로 수행하여야 타가토스를 순수 분리할 수 있음을 나타낸다. 상기 크로마토그래피 분리에 사용할 수 있는 금속 이온 잔기의 예로 K, Na, Ca, Mg 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 크로마토그래피는 바람직하게는 SMB (Simulated Moving Bed) 크로마토그래피일 수 있다. 이 때, 상기 크로마토그래피 분리 단계에서 미반응물의 재순환은 당액의 종류에 따라 다음과 같이 임의로 선택할 수 있다.

타가토스를 주성분(90% 이상)으로 함유한 당액의 경우에는, 상기 타가토스를 농축한 후 필요에 따라 결정화하는 단계로 이루어질 수 있다.

과당을 주성분으로 함유한 당액의 경우에는, 상기 당액을 농축하여, 에피머화 단계의 전 단계로 재순환시킬 수 있다.

포도당을 주성분으로 함유한 당액의 경우에는, 상기 당액을 농축하여, 이성화 단계의 전 단계로 재순환시킬 수 있다.

설탕을 주성분으로 함유한 당액의 경우에는, 상기 당액을 농축 또는 결정화한 후, 가공처리하여 설탕액으로 사용하거나 다른 생산 원료로 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 기술함으로써 본원 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예들은 본원 발명의 일 예시에 불과하며, 본원 발명의 내용이 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

실시예 1

효소 전환율에 따른 크로마토그래피 분리 특성 평가

혼합당(과당 및 타가토스)로부터 목적 물질(타가토스)를 고순도 분리 및 결정화를 수행하기 위하여는, 크로마토분리를 이용한 순수 분리 단계가 매우 중요하다. 일반적으로 결정 제품화를 목적으로 하는 당액의 순수분리는 목적물질(타가토스)의 함량이 얼마인가에 따라, 상이한 회수율(%)을 얻게 된다. 일반적으로 목적물질(타가토스)의 함량이 높아질수록, 이에 비례하여 높은 회수율(%)을 얻게 되며, 이에 따라 상대적으로 적은 제조 가공비로 최종 제품을 제조 가능하게 된다. 일반적으로 결정당을 효율적(고순도, 고수율)으로 제조하기 위하여는 모액 (Feed)에 함유되어 있는 목적물질(타가토스)의 순도가 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 에 이르는 것이 매우 중요하다.

크로마토그래피 운전 조건은 사용하는 모액 (Feed)의 조성비, 분리 수지의 종류, 분리액 내 목적물질(타가토스)의 목표 수율 혹은 목표 순도에 따라 다양한 결과를 얻을 수 있다. 따라서 과당의 타가토스로의 효소적 전환 공정에서 얻어지는 반응액의 조성, 즉 과당의 타가토스로의 전환율(%)은 크로마토그래피에서의 수율 결과에 영향을 미친다. 결정공정에 사용하기 위한 바람직한 결과인 분리액 내 타가토스의 순도를 95% 수준으로 고정하였을 때, 모액 (Feed) 내 과당 및 타가토스의 조성비(%)에 따른 크로마토분리 수율(%) 값의 변화를 관찰하고자 하였다.

당의 크로마토그래피 분리 효율성의 극대화하기 위하여는 크로마토그래피 분리에 사용되는 수지의 크기, 수식화된 금속 이온 잔기 종류 (예를 들어 K, Na, Ca, Mg 등)를 변경하여 일부 개선된 결과값을 얻을 수 있으나, 본 발명에서는 과당과 타가토스의 일반적인 분리 특성을 고려하여 Ca 잔기를 수식하고 있는 분리 수지를 사용하였다. 평가에 사용된 조건은 다음 표 1과 같다.

샘플	과당 및 타가토스의 혼합 단당 샘플
공급하는 샘플의 농도	Bx. 60%
흡착제	앰버라이트 (Amberlite CR-1310; Ca-type)
컬럼 사이즈	20 mm x 1000 mm (314ml)
탈착제	H2O
공급 부피	15ml
유속	26 ml/min (LV5m/h)
온도	60℃

상기 조건을 적용하였을 때, 과당과 타가토스의 조성비(%)에 따른 SMB 크로마토그래피 분리 테스트 결과는 아래 표와 같다. 결정화 공정에 사용하기에 매우 바람직한 조건인 타가토스 순도 95% 수준을 유지하였을 때, 과당과 타가토스 조성비에 따른 타가토스 및 과당의 회수율 (%)을 측정한 결과, 아래의 표 2와 같은 결과를 얻었다.

과당과 타가토스의 조성비에 따른 크로마토그래피 분리 특성 분석 결과

		Sample 1	Sample 2	Sample 3	Sample 4	Sample 5	Sample 6	Sample 7
Feed content (%)	Tagatose	5	10	15	20	25	30	35
Feed content (%)	Fructose	95	90	85	80	75	70	65
Recovery yield (%)	Tagatose	82.14	86.15	90.98	92.16	94.13	94.45	95.48
Recovery yield (%)	Fructose	99.99	99.56	99.44	99.02	98.49	98.12	97.53
Tagatose Purity (%)		95.46	95.76	95.85	95.63	95.39	95.48	95.62

상기 표 2의 결과 및 도 11을 참조하여 보면, 특히 과당에 비하여 타가토스의 회수율 (%)이 효소 전환율(%)에 민감하게 영향을 받는 것을 알 수 있었다. 타가토스를 90% 이상의 회수율 및 순도 95% 수준으로 제조하기 위하여는 최소한 15% 이상의 효소전환율(%)을 얻을 수 있도록 효소 역가 및 공정 조건을 확립하여야 하며, 마찬가지로 타가토스 85% 이상의 회수율 및 순도 95% 제조를 위하여는 최소한 10% 이상의 효소전환율(%)을 확보하여야 함을 의미한다. 따라서 효소전환율(%)은 본 특허에서 구성하고자 하는 제조 공정의 효율성에 매우 중요한 요소임을 재차 확인할 수 있다.

실시예 2

케토헥소오스 C4 - 에피머화 효소의 제조

내열성 미생물인 Thermotoga maritima(strain ATCC 43589 / MSB8 / DSM 3109 / JCM 10099)의 genomic DNA(서열목록 1)를 주형으로, 정방향 (5'-GGGCATATGATGGTCTTGAAAGTGTTCAAAG-3') 및 역방향 (5'-AAACTCGAGCCCCTCCAGCAGATCCACGTG-3')의 프라이머를 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다.

내열성 미생물인 Thermotoga neapolitana (DSM 4359)의 genomic DNA(서열목록 2)를 주형으로, 정방향 (5'- GGGCATATGATGGTCTTGAAAGTGTTCAAAG -3') 및 역방향 (5'-AAACTCGAGTCACCCCTTCAACAGGTCTACGTG-3')의 프라이머를 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다.

PCR 반응 조건은 하기의 표 3 및 4와 같다. PCR 반응을 통하여 증폭된 유전자를 pET-21a 벡터에 삽입하였고, E. coli DH5α 균주에 형질전환하였으며, 이로부터 플라스미드를 분리하여 삽입된 유전자의 염기서열을 확인한 후 단백질 발현용 균주인 E. coli BL21(DE3)에 다시 형질전환하여 케토헥소오스 C4-에피머화 효소를 생산하는데 이용하였다. 상기 케토헥소오스 C4-에피머화 효소를 생산하기 위하여 E.coli BL21(DE3)pET21a-TM(Thermotoga maritima 유래 효소 발현 유전자 포함)및 E.coli BL21(DE3) pET21a-TN(Thermotoga neapolitana 유래 효소 발현 유전자 포함)를 100 mg/ml 농도의 암피실린을 포함한 LB 배지에서 2시간 정도 배양하였으며, 이 때 배양온도 37 ℃, 교반속도 180 rpm에서 상기 배양과정을 수행하였다. 배양 후, 600 nm에서 미생물의 광학밀도(optical density)를 측정하여 그 값이 0.4 내지 0.8 범위에 들어오면, 0.25 mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 동일 조건에서 하룻밤 동안(overnight) 배양하여, 단백질 발현을 유도하였다.

반응용액 조성	첨가량 (㎕)
PCR 완충액 (5X)	10
dNTPs (2.5 mM each)	1
PCR 주형 (T. maritime gDNA)	1
정방향 프라이머 (100pmol)	1
역방향 프라이머 (100pmol)	1
DNA 중합효소 (Phusion, NEB사)	0.5
멸균 증류수	35.5

단계	온도 (℃)	시간(초)	사이클
Initial Denaturation	98	30	1
Denaturation	98	10	35
Annealing	65.7	30
Extension	72	50
Final Extension	72	350	1

실시예 3

케토헥소오스 C4 - 에피머화 효소의 정제

미생물 내에 발현된 케토헥소오스 C4-에피머화 효소의 활성을 측정하기 위하여, 하기와 같은 방법을 이용하여 단백질 정제를 수행하였다. 단백질 발현이 완료된 배양액을 8,000 rpm에서 10분간 원심분리를 하여 균체를 수거한 후, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어있는 50 mM NaH₂PO₄ (pH 8.0) 완충 용액에 재현탁하였다. 상기 현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하였으며, 이를 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 상기 회수된 상등액을 충진제로서 Ni-NTA 수지가 충진되어 있는 컬럼에 통액하고, 20 mM 이미다졸 및 300mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄ (pH8.0) 완충 용액을 컬럼안의 충진제가 차지하는 부피의 10배 부피로 흘려주어 비특이적으로 결합될 수 있는 단백질을 제거하였다. 최종 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl이 포함된 50 mM NaH₂PO₄ (pH 8.0) 완충 용액을 흘려주어 케토헥소오스 C4-에피머화 효소를 용출 정제하였으며, 정제 효소 내의 이미다졸을 제거하기 위하여 50 mM NaH₂PO₄ (pH 8.0) 완충 용액을 수 회 흘려주어 그 농도가 0.01 mM 이하가 되도록 하였다. 정제된 효소는 브래드포드 법(Bradford assay)을 이용하여 단백질을 정량하였다.

실시예 4

과당으로부터 타가토스로의 전환

상기 실시예 2 및 3에서 얻어진 효소들의 활성을 측정하기 위하여 상기 정제된 효소를 1 중량% 과당, 0.01 mM ZnSO₄, 50 mM 인산염 완충용액 (pH 7.0)에 넣어 반응온도 60 ℃에서 3시간 동안 반응을 수행하였다. 케토헥소오스 C4-에피머화 효소에 의해 전환된 타가토스의 농도 및 과당으로부터 타가토스로 전환된 전환율을 하기의 표 5에 나타내었다.

또한, 반응 후 남아있는 과당과 생성물인 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량하였다. 사용한 컬럼은 Shodex Sugar SP0810이며, 컬럼 온도를 80 ℃로 하였고, 이동상으로 물을 0.5 ml/분으로 흘려주었고, 도 6에 HPLC 크로마토그래피를 이용하여 과당을 기질로 하는 상기 효소의 반응으로 나타나는 피크를 검출하여 정량하였다.

	타가토스 농도 (%)	전환율 (%)
T.maritima	0.093	9.3
T.neapolitana	0.080	8.0

상기 표 5 및 도 6를 참조하면, 과당을 첨가하지 않고, 상기 효소만을 인산염 완충용액에 넣어 전환반응을 시킨 경우(파쇄선;

의 경우), 과당 및 타가토스를 나타내는 피크가 전혀 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다.

그러나, 과당과 상기 효소를 함께 첨가하여 에피머화 반응을 시킨 경우(실선;

의 경우)에는, 효소 반응 시작 후, 30분이 경과되기 이전에는 과당을 나타내는 피크만이 관찰된 반면, 시간이 지남에 따라, 약 30분 경과 후부터는 타가토스를 나타내는 피크가 관찰되었다.

따라서, 상기 표 5 및 도 6의 결과를 종합하면, 실시예 2 및 3에서 제조된 상기 효소를 이용하여 과당을 타가토스로 에피머화 전환할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5

개량주 제작 및 선별

T.neapolitana 유래 유전자를 주형으로 하여 무작위 돌연변이를 수행하였다. 구체적으로, ClonTech사의 Diversify random mutagenesis kit을 이용하여 T.neapolitana에 대해 무작위 돌연변이를 유도하였고, 아래 표 6 및 7의 조건의 PCR 반응을 통하여 증폭된 유전자를 pET-28a 벡터에 삽입하여 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질전환시켰다. 이후 단계는 실시예 2와 동일하게 실시하였다.

반응용액 조성	첨가량 (㎕)
PCR Grade Water	36
10X TITANIUM Taq Buffer	5
MnSO4 (8 mM)	4
dGTP (2 mM)	1
50X Diversify dNTP Mix	1
Primer mix	1
Template DNA	1
TITANIUM Taq Polym.	1

단계	온도 (℃)	시간(초)	사이클
Initial Denaturation	94	30	1
Denaturation	94	30	25
Annealing/ Extension	68	60	25
Final Extension	68	60	1

상기 무작위 돌연변이를 통하여 확보한 변이주 라이브러리로부터 고 활성 보유 후보 변이주를 선별하고 염기서열 분석하여 변위부위를 확인하였다. 총 5개의 아미노산 변이를 확인하였다. (S125D/V163A/D186N/F263I/D311G)

상기 변이주는 서열목록 번호 3의 genomic DNA 염기서열을 가지며, 상기 변이주에 의해 생산되는 효소를 인코딩하는 아미노산 서열은 서열목록 번호 4와 같다. 상기 케토헥소오스 C4-에피머화 효소를 생산하는 상기 변이주는 E.coli BL21(DE3) pET28a-TN(m)(기탁번호: KCCM11544P)이다. 상기 변이주에 대해 상기 실시예 2 및 3과 동일한 방법으로 실시하여 C4-에피머화 효소를 제조하였다.

실시예 6

개량주 이용 과당으로부터 타가토스로의 한계 전환율 평가

상기 개량주 유래 효소를 사용하여 아래에 기재된 것과 같은 방법으로 온도, pH, 금속염 등에 따른 전환율을 평가하였다.

(1) 반응온도별 효소활성 비교평가

반응온도 변화에 따른 효소 활성의 변화를 확인하기 위해 상기 실시예 5에서 얻어진 정제된 효소를 10 중량% 과당, 0.3 mM ZnSO₄, 50 mM 인산염 완충용액 (pH 7.0)에 넣어 3시간 동안 반응을 수행하였다. 도 7에 도시된 바와 같이 37℃에서 96℃까지의 각각 상이한 반응 온도에서 효소 활성을 측정하였다.

온도가 증가할수록 효소활성 증가하는 경향 보이나 90℃이상 반응 시 활성 저하를 보였다.

(2) 반응 pH별 효소활성 비교평가

반응 pH 변화에 따른 효소 활성의 변화를 확인하기 위해 상기 실시예 5에서 얻어진 정제된 효소를 10 중량% 과당, 0.01 mM NiSO₄, 인산염 완충용액 또는 Tris 완충용액에 넣어 3시간 동안 반응을 수행하였다. 구체적으로 pH 5에서 pH 8.0의 범위에서는 potassium phosphate buffer을, pH 8.0에서 pH 8.5 범위에서 Tris buffer를 이용하였다. 도 8에 도시된 바와 같이 각각 상이한 pH에서 효소 활성을 측정하였다. 결과는 potassium phosphate buffer 사용 시와 Tris buffer 사용시 모두에서 pH가 올라갈수록 활성 증가하는 경향을 보였으며, 동일 pH에서 Tris buffer를 사용한 경우가 활성이 저하되었다.

(3) 금속염 종류에 따른 효소활성 비교평가

금속염 종류에 따른 효소 활성의 변화를 확인하기 위해 상기 실시예 5에서 얻어진 정제된 효소를, 10 중량% 과당, 50mM 인산염 완충용액에 넣어 3시간 동안 반응을 수행하였다. 이 때, 상기 반응에는 각각 상이한 13종의 금속염이 1mM로 첨가되었다.

결과는 NiSO₄>NiCl₂>CoCl₂>MnCl₂=ZnSO₄ 순으로 효소 활성에 있어 차이가 있었다(도 9 참조).

(4) 효소반응에 의한 한계 전환율 평가

기질 농도에 따른 효소 활성의 변화를 확인하기 위해 상기 실시예 5에서 얻어진 정제된 효소를, 10 중량% 과당, 0.3mM NiSO₄, 50mM 인산염 완충용액에 넣어 60 ℃에서 3시간 동안 반응을 수행하였다. 상기 효소반응에서의 한계전환율을 평가하기 위하여 18시간 동안 효소반응을 수행하였다. 도 10을 참조하면 본 실험에 사용한 개량효소 사용 시 과당에서 타가토스로의 전환율이 30%임을 알 수 있다.

실시예 7

과당과 타가토스의 크로마토그래피 분리

상기 실시예 5에서 얻어진 정제된 효소를 10 중량% 과당, 0.01 mM NiSO₄, 50mM 인산염 완충용액에 넣어 60 ℃에서 3시간 동안 반응을 수행하였다. 상기 얻어진 타가토스의 혼합액을 분말 활성탄(powder activated carbon) 0.1 내지 0.5%(wt/v)를 첨가하고 0.5 내지 1 시간 동안 10 내지 100 rpm으로 교반한 다음, 이를 필터프레스로 여과하여 유색 물질을 제거하였다.

상기 유색 물질이 제거된 과당과 타가토스의 혼합물로부터 과당과 타가토스를 효율적으로 크로마토그래피 분리해내기 위하여, 수소기로 치환된 양이온교환수지와 수산화기로 치환된 음이온교환수지가 충진된 컬럼에 통과시켜 상기 용액 중의 이온 성분을 제거하는 공정을 수행하였다.

상기 탈색 및 탈염으로 유색 물질 및 이온 성분 등의 불순물이 제거된 과당으로부터 생산된 타가토스 혼합액을 60% (g/g 용액)까지 농축하여 칼슘기로 치환시킨 강산성양이온교환수지 (Amberlite CR1310 Ca)가 충진된 개선된 시뮬레이티드 무빙-베드 시스템(Advanced Simulated Moving-bed System; Organo, Japan) 장비를 활용하여 용액을 분획, 크로마토분리하여 성분의 순도(purity), 회수율(recovery yield) 및 과당으로부터 전환된 타가토스 혼합 공급액과 이동상인 물의 비율(탈착제/공급 부피율)을 측정하였다.

조건	결과
과당으로부터 전환된 타가토스 혼합 공급액 비율(%)	과당 75.4%, 타가토스 24.6%
탈착제/공급 부피율	2.96
타가토스 순도 (%)	99.1
타가토스 회수율 (%)	94.4
과당 순도 (%)	92.9
과당 회수율 (%)	99.6

실시예 8

타가토스의 결정화

상기 실시예 7의 크로마토그래피 분리로 회수된 용액을 사용하여 타가토스의 결정화를 하였다. 타가토스 당농도가 70 Bx로 되도록 진공, 가열 농축하여 온도를 60℃에서 30℃로 시간당 0.7 내지 1℃ 씩 서서히 냉각하여 결정화시켰다.

결정화 종료 후 원심탈수기를 이용하여 결정회수를 진행하였고, 60℃ 유동층건조기를 사용하여 1시간 동안 건조하여, 제품의 순도 및 결정회수율을 측정하였다.

결정화 결과 요약

조건	결과
타가토스 결정 순도 (%)	99.9
타가토스 결정 회수율 (%)	40.2

실시예 9

크로마토그래피 분리 기술을 이용한 개량주 이용 과당으로부터 타가토스의 연속 재순환 생산 공정 설계

상기 실시예 5에서 얻어진 정제된 효소를 사용한 타가토스의 연속 재순환 생산 공정을 아래와 같은 방법으로 설계하였다.

이와 같은 연속 재순환 생산 공정은 도 2, 3, 4, 5에 간략한 도식으로 설명하였다. 당해 도식에서 정제 단계에서는 탈색, 탈염 등과 같은 제품 품질 향상을 위한 단위 공정을 별도로 필요에 따라 추가하여 실시하거나 배제할 수 있다.

상기 연속 재순환 생산 공정은 우선 과당을 주성분으로 함유한 액을 헥수론산 C4-에피머화 효소(hexuronate C4-epimerase) 반응기를 통과하여 타가토스를 생산하고, 과당과 타가토스의 혼합당으로 구성된 에피머화 산출물을 크로마토그래피 분리하고, 정제된 에피머화 반응물 중 타가토승의 농도에 따라 선택적으로 농축 단계를 삽입 혹은 배제하고, 타가토스를 주성분 (90% 이상) 으로 함유한 크로마토그래피 분리액을 농축하고 (필요시) 결정화하여 타가토스를 제조하는 것을 포함하며, 여기서 과당을 주성분으로 함유한 크로마토그래피 잔여액을 에피머화 반응기 앞으로 재순환시키고/재순환시키거나 타가토스의 결정화 단계에서 수득되는 비결정 모액을 에피머화 후단계로 재순환시킬 수 있다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11542P

20140523

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11543P

20140523

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11544P

20140523

<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> Manufacturing method for tagatose <130> P14-0383 <150> KR 2013/065,002 <151> 2013-06-05 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1446 <212> DNA <213> A genomic DNA of Hexuronate C4-epimerase <400> 1 atggtcttga aagtgttcaa agaccacttt ggaaggggat acgaagttta cgaaaagtct 60 tatagagaaa aggattctct ttctttcttc ttgacaaagg aagaggaagg aaaaattctg 120 gtggtggctg gagaaaaggc acctgaaggt ctgtcgtttt tcaaaaaaca gcgggcggag 180 ggtgtttcgt tctttttctg tgagagaaat catgagaact tggaagttct cagaaaatac 240 tttccagatc tcaaaccagt tcgagcggga ttgagagcgt cttttggaac aggtgacaga 300 ctcggtatca ccacaccggc tcacgtgagg gcgttgaagg attcagggct ttttcccatc 360 tttgcgcagc agtcggtgag ggagaacgag agaacgggaa ggacctggag agatgtgctg 420 gacgatgcca catggggagt tttccaggag ggatacagtg agggattcgg agcggatgca 480 gaccatgtga agcggccgga ggatcttgtt tcggctgcaa gggaaggttt caccatgttc 540 acaatcgatc cttcggatca tgtgaggaat ctttcaaaac ttacagaaaa ggaaagaaat 600 gagaaattcg aagagattct gagaaaggaa aggatcgaca ggatctatct 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Hexuronate C4-epimerase <400> 2 atggtcttga aagtgttcaa agatcacttt ggaaggggat acgaagttta cgaaaagtct 60 tatagagaaa aggattctct ctctttcttc ttgacaaagg gagaggaagg aaaaattctg 120 gtagtggctg gagaaaaggc acctgagggt ctgtcgtttt tcaaaaaaca gcgggtggag 180 ggtgtttcgt tctttttctg tgagagaaat catgagaact tggaagttct cagaaaatac 240 tttccagatc tcaaaccagt tcgagcggga ttgagagcgt cttttggaac aggtgacaga 300 ctcggtatca ccacaccggc tcacgtgagg gcgttgaagg attcagggct ttttcccatc 360 tttgcgcagc agtcggtgag ggagaacgag agaacgggaa ggacctggag agatgtgctg 420 gacgatgcca catggggagt tttccaggag ggatacagtg agggattcgg agcagacgcc 480 gatcacgtga agcggccgga ggatcttgtt tcggctgcaa gggaaggttt caccatgttc 540 acaatcgatc cttcggatca tgtgaggaat ctttcaaaac tcagtgaaag agaaaagaac 600 gagatgttcg aggaaatact gaaaaaagag cgaatcgaca ggatctatct tgggaaaaaa 660 tacaccgtcc tcggtgaaag actggagttc gacgagaaaa atttgaggga tgctgctctg 720 gtgtactatg atgcgatcgc ccacgtggat atgatgtatc aaattttgaa agacgaaacc 780 ccggatttcg acttcgaagt gtcagttgac gaaacagaaa ctcccacgag 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Arg Lys Tyr 65 70 75 80 Phe Pro Asp Leu Lys Pro Val Arg Ala Gly Leu Arg Ala Ser Phe Gly 85 90 95 Thr Gly Asp Arg Leu Gly Ile Thr Thr Pro Ala His Val Arg Ala Leu 100 105 110 Lys Asp Ser Gly Leu Phe Pro Ile Phe Ala Gln Gln Asp Val Arg Glu 115 120 125 Asn Glu Arg Thr Gly Arg Thr Trp Arg Asp Val Leu Asp Asp Ala Thr 130 135 140 Trp Gly Val Phe Gln Glu Gly Tyr Ser Glu Gly Phe Gly Ala Asp Ala 145 150 155 160 Asp His Ala Lys Arg Pro Glu Asp Leu Val Ser Ala Ala Arg Glu Gly 165 170 175 Phe Thr Met Phe Thr Ile Asp Pro Ser Asn His Val Arg Asn Leu Ser 180 185 190 Lys Leu Ser Glu Arg Glu Lys Asn Glu Met Phe Glu Glu Ile Leu Lys 195 200 205 Lys Glu Arg Ile Asp Arg Ile Tyr Leu Gly Lys Lys Tyr Thr Val Leu 210 215 220 Gly Glu Arg Leu Glu Phe Asp Glu Lys Asn Leu Arg Asp Ala Ala Leu 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Asp Ala Ile Ala His Val Asp Met Met Tyr Gln Ile Leu 245 250 255 Lys Asp Glu Thr Pro Asp Ile Asp Phe Glu Val Ser Val Asp Glu Thr 260 265 270 Glu Thr Pro Thr Ser Pro Leu Phe His Ile Phe Val Val Glu Glu Leu 275 280 285 Arg Arg Arg Gly Val Glu Phe Thr Asn Leu Ala Leu Arg Phe Ile Gly 290 295 300 Glu Trp Glu Lys Gly Ile Gly Tyr Lys Gly Asp Leu Ala Gln Phe Glu 305 310 315 320 Arg Glu Ile Lys Met His Ala Glu Ile Ala Arg Met Phe Glu Gly Tyr 325 330 335 Lys Ile Ser Leu His Ser Gly Ser Asp Lys Phe Ser Val Tyr Pro Ala 340 345 350 Phe Ala Ser Ala Thr Gly Gly Leu Phe His Val Lys Thr Ala Gly Thr 355 360 365 Ser Tyr Leu Glu Ala Val Lys Val Ile Ser Met Val Asn Pro Glu Leu 370 375 380 Phe Arg Glu Ile Tyr Arg Cys Ala Leu Asp His Phe Glu Glu Asp Arg 385 390 395 400 Lys Ser Tyr His Ile Ser Ala Asp Leu Ser Lys Val Pro Glu Val Glu 405 410 415 Lys Val Lys Asp Glu Asp Leu Pro Gly Leu Phe Glu Asp Ile Asn Val 420 425 430 Arg Gln Leu Ile His Val Thr Tyr Gly Ser Val Leu Lys Asp Ala Ser 435 440 445 Leu Lys Glu Arg Leu Phe Lys Thr Leu Glu Gln Asn Glu Glu Leu Phe 450 455 460 Tyr Glu Thr Val Ala Lys His Ile Lys Arg His Val Asp Leu Leu Lys 465 470 475 480 Gly

Claims

a) 과당을 헥수론산 C4-에피머화 효소 (hexuronate C4-epimerase)로 에피머화시켜 타가토스를 포함하는 에피머화 반응물을 수득하는 단계; 및
b) 상기 에피머화 반응물을 정제하는 단계;
c) 상기 정제된 에피머화 반응물을 결정화하는 단계를 포함하는 타가토스의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소가 Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana , Thermotoga thermarum 또는 이의 변이주 유래 효소인, 타가토스의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소가 Escherichia . coli, Corynebacterum glutamicum, Aspergillus oryzae, 또는 Bacillus subtilis 균주로부터 생성된, 타가토스의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 생산 균주가, E.coli BL21(DE3) pET21a-TM(기탁번호: KCCM11542P), E.coli BL21(DE3) pET21a-TN(기탁번호: KCCM11543P), 또는 E.coli BL21(DE3) pET28a-TN(m)(기탁번호: KCCM11544P)인 타가토스의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 에피머화 반응이, 60 내지 90℃의 온도, pH 5 내지 8에서 과당과 헥수론산 C4-에피머화 효소를 반응시키는 것을 포함하는 타가토스의 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 에피머화 반응이 금속염 존재하에 실시되는, 타가토스의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 금속염이 NiSO₄, NiCl₂, CoCl₂, MnCl₂, 및 ZnSO₄ 중 1종 이상인 타가토스의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 에피머화 반응물 중 타가토스가 0.05 중량% 이상으로 포함된타가토스의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 과당이 설탕의 가수분해에 의해 제조되거나, 포도당을 이성질화하여 제조된, 타가토스의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 정제 단계가, 크로마토그래피, 분별 결정, 및 이온 정제 중 하나 이상을 실시하는, 타가토스의 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 정제 단계의 전 또는 후에 탈색, 탈염 또는 이 둘 다를 실시하는, 타가토스의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 결정화하기 전에 상기 정제된 에피머화 반응물을 농축시키는 것을 포함하는, 타가토스의 제조방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 b) 단계 후, 미반응된 과당을 a) 단계에 재사용하거나, 상기 c) 단계 후 결정이 분리된 모액을 b) 단계에 재사용하거나, 또는 이 둘 다를 실시하는 것을 특징으로 하는, 타가토스의 제조방법.
Escherichia . coli BL21(DE3)pET21a-TM(기탁번호: KCCM11542P) 균주.
Escherichia . coli BL21(DE3) pET21a-TN(기탁번호: KCCM11543P) 균주.
Escherichia . coli BL21(DE3) pET28a-TN(m)(기탁번호: KCCM11544P)균주.
서열목록 번호 4의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체.