BR112015029933B1

BR112015029933B1 - Método de produção de tagatose

Info

Publication number: BR112015029933B1
Application number: BR112015029933-4A
Authority: BR
Inventors: Sung Jae Yang; Yang Hee Kim; Seong Bo Kim; Seung Won Park; Il Hyang Park; Min Hae Kim; Young Mi Lee
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2013-06-05
Filing date: 2014-06-03
Publication date: 2023-02-28
Also published as: KR101550796B1; CA2912540A1; EP3006568B1; KR20140143109A; BR112015029933A2; US20160138053A1; ES2751691T3; HUE046414T2; MX2015016535A; BR112015029933B8; CA2912540C; JP6171094B2; WO2014196811A1; CN105431541B; PL3006568T3; CN105431541A; JP2016523526A; EP3006568A1; DK3006568T3; EP3006568A4

Abstract

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE TAGATOSE A presente invenção se refere a um método de produção de tagatose.

Description

Campo Técnico

A presente invenção se refere a um método de produção de tagatose a partir da frutose, mais especificamente, a presente invenção se refere a um método para produzir tagatose pela epimerização da frutose na posição C4.

Antecedentes da Invenção

A tagatose tem um sabor doce natural que é dificilmente distinguível da sacarose e tem propriedades físicas semelhantes às da sacarose. No entanto, a tagatose ingerida não é bem absorvida no intestino delgado e, portanto, tem um impacto mínimo no nível de glicose no sangue. Além disso, a tagatose é um adoçante de baixas calorias, possuindo cerca de 30% das calorias da sacarose. Além disso, a tagatose tem um efeito prebiótico que promove o crescimento de bactérias ácido-lácticas benéficas através da fermentação promovida pela microflora intestinal.

Apenas cerca de 20% da tagatose ingerida é absorvida no intestino delgado, e a fração restante de 80% da tagatose ingerida atinge o intestino grosso onde habita a microflora intestinal que promove seletivamente a produção de bactérias ácido-lácticas, produzindo assim os ácidos graxos de cadeia curta. Particularmente, a tagatose tem urna propriedade prebiótica capaz de produzir grandes quantidades de butirato (até 50% do total dos ácidos graxos de cadeia curta), o que pode prevenir o câncer de cólon. Além disso, a tagatose é um açúcar natural com baixo valor calórico de 1,5 kcal/g e atende o padrão GRAS (Geralmente Reconhecido como Seguro) pelo U.S. Food and Drug Administration, permitindo assim o seu uso como um adoçante funcional em alimentos, bebidas, alimentos saudáveis, aditivos dietéticos, e assemelhados.

Entretanto, a tagatose não é frequentemente encontrada na natureza e é um açúcar raro presente apenas em pequenas quantidades em produtos lácteos e algumas plantas. A fim de usar a tagatose como um adoçante funcional de baixo teor calórico, é necessário desenvolver um método para a produção de tagatose em grandes quantidades a partir de matérias-primas baratas.

A tagatose tem sido convencionalmente produzida peia isomerização de galactose. A fim de se obter economicamente a galactose, estudos têm sido realizados para desenvolver várias matérias-primas contendo galactose, métodos para a obtenção de galactose e métodos para produzir tagatose utilizando diferentes matérias-primas. A lactose tem sido utilizada como a principal matéria-prima para a obtenção da tagatose. No entanto, os preços da lactose e de produtos contendo lactose apresentam frequentes oscilações com quedas e aumentos em decorrência da vários fatores, tais como a quantidade de leite cru produzido de acordo com as condições do tempo, a demanda por leite em pó, as mudanças na quantidade de lactose consumida nos países em desenvolvimento, e fatores similares. Essas oscilações de preços no mercado de leite cru dificultam a oferta estável de matérias-primas para a produção de tagatose. Por conseguinte, existe a necessidade de um novo método para a produção de tagatose utilizando matérias-primas comuns (glicose, sacarose, frutose, e similares).

A patente coreana requerida sob o n° 10-2009-0125004 revela um método para a produção de galactose pela epimerização da glicose. A patente coreana requerida sob o n° 102006-0125971 revela a epimerização C3 da cetohexose. No entanto, ambos os documentos não divulgam um método para a produção de tagatose pela epimerização C4 da frutose.

Divulgação Problema Técnico

No passado, a tagatose era produzida a partir da galactose decomposta a partir da lactose ou produtos contendo lactose e várias outras fontes biológicos contendo galactose. No entanto, até agora, as matérias-primas avaliadas capazes de serem produzidas comercialmente ou que se aproximam da comercialização, em termos de fornecimento estável de matérias-primas e eficiência de investimento, são a lactose ou os produtos contendo lactose (soro de leite, etc.)- Todavia, a lactose ou os produtos contendo lactose sofrem significativas mudanças de preços, além da dificuldade de fornecimento estável da tagatose em decorrência do recente aumento no consumo de lactose e do consequente aumento no seu preço.

Além disso, um método químico convencional para converter a lactose em galactose apresenta um limite no processo epimerização e o método enzimático convencional é igual mente limitado devido ao uso da galactose.

Assim sendo, a presente invenção visa proporcionar um método mais estável e econômico para a produção de tagatose e ao mesmo tempo garantir maior eficiência na produção em relação ao método tradicional de produção de tagatose.

Solução Técnica

As configurações da presente invenção proporcionam um método para a produção de tagatose compreendendo: realizar a epimerização da frutose utilizando hexuronato C4- epimerase para se obter um produto epimerizado incluindo tagatose; purificar o produto epimerizado; e cristalizar o produto epimerizado purificado.

Efeitos Vantajosos

A presente invenção proporciona um método de produção de tagatose econômico e com melhor rendimento utilizando uma matéria-prima comum, a frutose, no lugar da lactose que é sujeita a significativas variações de preço, reduzindo assim os custos de produção.

De modo geral, embora os peritos na arte saibam que a frutose pode ser produzida industrialmente a partir da glicose ou da sacarose, as matérias-primas sugeridas na presente invenção compreendem não só a frutose mas também outras matérias-primas contendo frutose total ou parcialmente, de modo a assegurar uma produção mais econômica. Especificamente, a presente invenção compreende a produção de tagatose através da conversão enzimática do amido, açúcar cru ou sacarose.

Além disso, a presente invenção permite produzir tagatose a partir da frutose garantindo assim a produção eficiente de tagatose em grande escala como um importante produto alimentar.

Descrição das Figuras

A FIG. I é um fluxograma de um processo de produção de tagatose de acordo com uma configuração da presente invenção.

As FIGs. 2 a 5 mostram lluxogramas de processos de produção de tagatose de acordo com configurações da presente invenção.

A FIG. 6 é um gráfico HPLC demonstrando a produção de tagatose através da epimerização no C4 utilizando a frutose como um substrato.

A FIG. 7 é um gráfico demonstrando a atividade de C4-epimerase dependendo da temperatura da reação.

A FIG. 8 é um gráfico demonstrando a atividade de C4-epimerase dependendo do pH.

A FIG. 9 é um gráfico demonstrando a atividade de C4-epimerase dependendo do tipo de sódio metálico.

A FIG. 10 é um gráfico demonstrando uma taxa de conversão de frutose em tagatose dependendo da concentração de frutose como um substrato.

A FIG. 11 mostra um gráfico ilustrando a relação entre a taxa de conversão e o rendimento de recuperação da frutose e tagatose.

Modo Ideal

A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes. Considerações óbvias e facilmente interpretáveis pelos peritos na arte serão omitidas no presente relatório descritivo.

O termo “Cn-”, tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a uma determinada posição do carbono de acordo com a numeração de carbono prescrita pela nomenclatura IPUAC, onde n é um número inteiro igual ou maior do que 1. Por exemplo, a "posição 4 do carbono na epimerização" é representada por "C4-epimerização".

De acordo com uma configuração da presente invenção, o método para a produção de tagatose compreende: a) realização de epimerização da frutose utilizando hexuronato C4- epimerase para obter um produto epimerizado incluindo tagatose; b) purificação o produto epímerizado; e c) cristalização do produto epimerizado purificado.

De modo geral, os monossacarídeos podem ser classificados como aldohexoses e cetohexoses. A aldohexose se refere a uma aldose que possui seis átomos de carbono e um grupo aldeído em uma de suas extremidades. Os exemplos de aldohexose incluem glucose, galactose, alose, gulose, altrose, manose, talose, e idose, sem ser limitar a estas. Além disso, uma cetohexose, tal como utilizada na presente invenção, se refere a um monossacarídeo com seis átomos de carbono e um grupo celona. Exemplos de cetohexose incluem frutose. tagatose, psicose, e sorbose, sem se limitar a estas. Preferivelmente, a frutose é utilizada como uma cetohexose. Tanto a frutose como a tagatose, tal como utilizadas na presente invenção, se referem a D-frutose e D-tagatose, a menos que especificadas de outra forma.

De acordo com outra configuração da presente invenção, a frutose é obtida a partir da sacarose ou da glicose. Por conseguinte, a presente invenção proporciona um método para a produção de tagatose com elevado rendimento usando matérias primas comuns e baratas, tais corno glicose, frutose, sacarose, ou outras semelhantes, permitindo assim a produção de tagatose em grande escala.

Antes da execução da etapa a), o método pode compreender ainda a realização de hidrólise da sacarose para obter frutose. As enzimas utilizadas na hidrólise podem incluir pelo menos uma enzima selecionada dentre um grupo compreendendo β-D-frutosidases, tais como β-frutofuranosidase, invertase e sacarase; sucrase, α-glicosidase e α-D-glicohidroiase,sem se limitar a estas.

Além disso, antes da execução da etapa a), o método pode compreender ainda a realização de isomerização da glicose para obter frutose. As enzimas utilizadas na isomerização (isomerases) podem incluir glicose isomerase ou fosfoglicoisomerase, sem se limitar a estas.

O hexuronato C4-epimerase de acordo com a presente invenção pode incluir enzimas derivadas de Thermotoga sp. ou variantes destas. Especificamente, o hexuronato C4- cpimerase pode incluir enzimas derivadas de Thermotoga marítima, Thermotoga neapolitana, ou Thermotoga thermarum ou variantes destas.

Além disso, o hexuronato C4-epimerase pode ser obtido, por exemplo, pela transformação de uma estirpe (microrganismo) tal como Escherichia coli (£. coli) e similares com o DNA genômico representado por SEQ ÍD NOs: 1 a 3, pela cultura da estirpe transformada para obter uma célula cultivada, pela desregulação da célula cultivada e pela purificação do extrato da célula através de uma coluna, e similares. As estirpes para transformação podem incluir Escherichia coli, Corynebacterum glutamicum, Aspergillus oryzae, ou Bacillus suhtilis, e aims. Exemplos das estirpes de E. coli transformadas incluem E. coli BL21 (DE3) pET21a-TM (número de acesso: KCCM1 1542P), E. coli BL21 (DE3) pET21a-TN (número de acesso: KCCM11543P), ou E. coli BL2I (DE3) pET28a-TN (m) (número de acesso: KCCM11544P), e similares. As estirpes E. coli BL2I (DE3) pET21a- TM, E. coli BL2I (DE3) pET21a-TN e E. coli BL21 (DE3) pET28a-TN (m) foram depositadas no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (KCCM) (361 -221 Hongje 1- dong, Seodaemun-gu. Seoul, República de Coréia), que é um depositário internacional, em 23 de maio de 2014, com números de acesso KCCM1I542P, K.CCM11543P e K.CCMI I544P, respectivamente.

Assim, outra configuração da presente invenção se refere a cada estirpe depositada de E. coli BL2I (DE3) pET21a-TM (número de acesso: KCCM11542P), E. coli BL21 (DE3) pET21a-TN (número de acesso: KCCMI I543P), ou E. coli BL21 (DE3) pET28a-TN (m) (número de acesso: KCCMI 1544P).

A epimerização de frutose utilizando hexuronato C4-epimerase pode ser realizada entre 60° C e 90° C e com um pH entre 5 e 8, preferivelmente com urn pl I entre 6 e 8 e uma temperatura alta variando entre 70° C e 90° C ou entre 75° C e 90° C. Dentro destes parâmetros, a reação enzimática pode ser realizada a uma temperatura relativamente elevada, minimizando a contaminação por microorganismos durante o processo e proporcionando assim um aumento da solubilidade de cetohexoses utilizadas como substratos e maximizando a taxa de reação e a taxa de conversão de enzimas. O efeito da temperatura de reação sobre a atividade enzimática é ilustrado na FIG. 7. Conforme a temperatura aumenta, a atividade da C4-epimerase também aumenta. Entretanto, a atividade enzimática pode declinar rapidamente quando a temperatura atinge cerca de 90° C.

Além disso, o efeito do pH sobre a atividade enzimática é ilustrado na FIG. 8. À medida que o pH aumenta, a atividade da C4-epimerase tende a aumentar. Um nível adequado de pH pode requerer o uso de tampões na reação enzimática. Por exemplo, um pH adequado para o tampão de fosfato pode variar de pH 5 a pH 9, e um pH adequado para o tampão de Tris pode variar de pH 8,0 a pH 8,5. Considerando-se os processos subsequentes, o nível adequado de pH é 8 ou menos.

Numa configuração da presente invenção, a epimerização usando a C4-epimerase pode ser realizada na presença de um sal metálico. O sal metálico pode atuar como um catalisador na epimerização. Exemplos de sais metálicos podem incluir NiSO4, NiCE, CoCl2, MnCE, ou ZnSO4. Especificamente, pelo menos um sal dentre os sais NiSO4, NiCI2ou CoCE pode ser utilizado. Com referência à FIG. 9, a atividade de C4-epimerase pode variar dependendo do tipo de sal metálico. Os sais NiSO4, NiCE, CoCE, MnCE e ZnSO4 estão aqui descritos por ordem decrescente de atividade da C4-epimerase. A concentração do sal metálico pode variar de 0,001 mM a 50 mM. Mais especificamente, a concentração do sal metálico pode variar de 0,0! mM a 25 mM.

O produto epimerizado pode incluir tagatose numa quantidade de 0,05% em peso (wt%) ou mais, por exemplo, 0,07 wt% ou mais, mais especificamente 0,1 wt% ou mais. A taxa de conversão de tagatose pode ser de 5% ou mais, por exemplo. 7% ou mais.

De acordo com a presente invenção, podem ser utilizados quaisquer métodos de purificação conhecidos na arte. Exemplos de métodos de purificação podem incluir a purificação por ions e cromatografia ou cristalização, sem ser limitar a estes. A separação dos açúcares através do método de cromatografia pode ser realizada com base na diferença das forças de ligação fracas entre os açúcares a serem separados e os ions metálicos ligados às resinas de ions. Numa configuração da presente invenção, as resinas de ions podem ser resinas de troca catiônica fortemente ácidas às quais um resíduo de K, Na, Ca ou Mg está ligado.

No caso em que os açúcares a serem separados sejam cetohexoses como a frutose e a tagatose, resinas separadas com resíduos tais como K, Na e similares são utilizadas devido à semelhança estrutural. Isto significa que a tagatose pura pode ser separada apenas quando dois métodos cromatográficos separados são executados em sequência. Exemplos de resíduos de íons metálicos utilizados na separação cromatográfica podem incluir K, Na, Ca e Mg, sem se limitar a estes.

A cromatografia utilizada é especificamente a cromatografia SMB (Leito Móvel Simulado).

Numa configuração da presente invenção, antes ou depois da purificação, é possível ainda executar a descoloração, dessalinização ou ambas. Especificamente, antes da purificação, a descoloração, dessalinização ou ambas podem ser executadas. A descoloração pode compreender a adição de carbono ativado com agitação numa quantidade de 0,05 wt% a 5,0 w% no produto epimerizado. A agitação pode ser realizada a uma velocidade de 10 ppm a 1000 rpm, mais especificamente a uma velocidade de 10 ppm a 100 ppm por 30 minutos a 3 horas.

A dessalinização pode ser executada utilizando-se uma resina de troca catiônica, uma resina de troca aniônica, ou ambas. Através dos processos de descoloração e de purificação de ions, é possível remover impurezas tais como materiais corantes e materiais iônicos no produto epimerizado.

A resina de troca catiônica é um polímero que tem grupos ácidos e é capaz de trocar cátions, tais como ions de hidrogênio ou ions metálicos. A resina de troca aniônica é um polímero que tem grupos básicos e é capaz de trocar grupos de amónia com ânions, tais como íons hidroxilo ou ions halogeneto. De acordo com a presente invenção, pelo menos uma das resinas de troca catiônica e das resinas de troca aniônica podem ser utilizadas. As resinas de troca catiônica e as resinas de troca aniônica podem ser utilizadas simultaneamente a fim de remover eficazmente os materiais iônicos. Neste caso, a proporção entre as resinas de troca catiônica para as resinas de troca aniônica pode ser de 1:1 a 1:3, mais especificamente de 1:1.5 a 1:2. Após a purificação iônica, o conteúdo de materiais iônicos no produto epimerizado pode ser 10 microsiemens ou menos por unidade de centímetro em medição feita através de um sistema de condução elétrica.

O produto epimerizado passa pela purificação, descoloração e/ou processos de dessalinização para que a tagatose seja separada e impurezas tais como materiais corantes e materiais iônicos sejam removidos e em seguida concentrados para serem utilizados na reação subsequente. Por exemplo, o produto epimerizado pode ser concentrado para ter uma concentração de tagatose de 40 Bx ou mais ou 50 ou mais Bx.

O produto epimerizado purificado pode ser cristalizado por arrefecimento lento do produto epimerizado. A cristalização pode ser realizada pelo arrefecimento do produto epimerizado de 40° C a 90° C a uma taxa de 0,1° C a 5° C por hora. Os cristais de tagatose obtidos podem ser submetidos à desidratação e secagem.

Conforme ilustrado na FIG. 2. um método para a produção de tagatose inclui a execução da epimerização de frutose utilizando hexuronato C4-epimerase para se obter um produto epimerizado incluindo tagatose; a purificação do produto epimerizado; a concentração do produto epimerizado purificado; a cristalização do produto epimerizado concentrado para se obter cristais de tagatose; e então a desidratação e secagem dos cristais de tagatose.

A tagatose produzida pelo método de produção de acordo com uma configuração da presente invenção pode ter um grau de pureza de 80% ou mais, por exemplo, 90% ou mais, especificamente 95% ou mais, mais especificamente 98% ou mais. A pureza pode ser medida após a etapa b) e antes da etapa c). Em uma outra configuração da presente invenção, a pureza pode ser medida após a etapa c).

De acordo com outra configuração da presente invenção, a frutose que não reagiu depois da etapa b) pode ser reciclada na etapa a), ou o alimento do qual os cristais são separados depois da etapa c) podem ser reciclados na etapa b), ou ambos os processos podem ser realizados.

Conforme ilustrado na FIG. 4, a tagatose e a frutose no produto epimerizado são separadas na etapa de purificação, e a frutose separada pode ser reutilizada como um substrato para a epimerização na etapa a). Além disso, de acordo com a FIG. 3, a tagatose na forma de cristais e os alimentos dos quais são removidos os cristais, são separados na etapa de cristalização. O alimento pode incluir uma certa quantidade de tagatose, que é reutilizada na etapa de purificação. A FIG. 5 representa uma configuração da presente invenção em que a reutilização da frutose separada na etapa a) e a reutilização do alimento do qual os cristais são removidos na etapa b) são realizadas ao mesmo tempo.

A solução de açúcares obtida a partir da hidrólise da sacarose, isomerização da glicose e/ou hexuronato C4-epimerização de acordo com uma configuração da presente invenção, pode ser uma solução mista de açúcares contendo pelo menos um açúcar selecionado dentre o grupo compreendendo sacarose, glicose, frutose e tagatose. A solução de açúcares pode ser separada através do método de separação cromatográfica.

De modo geral, o açúcar misto compreendendo aldohexose e cetohexose pode ser economicamente separado por cromatografia utilizando uma resina com resíduos de cátions. No entanto, quando o açúcar misto compreende o mesmo tipo de açúcar, uma resina de separação com resíduos tais como K e Na é utilizada devido à semelhança estrutural. Isto significa que a tagatose pura pode ser obtida apenas pela execução sequencial de dois processos diferentes de cromatografia. Exemplos de resíduos de íons metálicos utilizáveis na separação cromatográfica podem incluir K, Na, Ca e Mg, sem se limitar a estes.

A cromatografia é preferivelmente a cromatografia SMB (Leito Móvel Simulado). Os reagentes que não reagiram na etapa de separação cromatográfica podem ser opcionalmente reciclados dependendo do tipo de solução de açúcar, conforme seja necessário.

Quando a solução de açúcar contém tagatose como um componente principal (90% ou mais), a tagatose pode ser concentrada e cristalizada, conforme seja necessário.

Quando a solução de açúcar contém frutose como um componente principal, a solução de açúcar pode ser concentrada e reciclada numa etapa que antecede a epimerização.

Quando a solução de açúcar contém glicose como um componente principal, a solução de açúcar pode ser concentrada e reciclada numa etapa que antecede a isomerização.

Quando a solução de açúcar contém sacarose como um componente principal, a solução de açúcar pode ser concentrada ou cristalizada e em seguida processada, sendo utilizada como uma solução de sacarose ou como outra matéria-prima.

Configuração da invenção

A seguir a presente invenção será descrita em detalhes com relação aos exemplos abaixo descritos. Os referidos exemplos são meramente ilustrativos e não devem ser entendidos como limitativos da presente invenção.

Exemplo 1 Avaliação das características da separação cromatográfica de acordo com a taxa de conversão da enzima

A fim de separar e cristalizar um material alvo (tagatose) com elevado grau de pureza a partir de uma mistura de açúcares (frutose e tagatose), a purificação utilizando separação cromatográfica é muito importante. De modo geral, a purificação de uma solução de açúcares para a obtenção de produtos cristalizados alcança diferentes rendimentos de recuperação (%) dependendo do conteúdo do material alvo (tagatose). Um alto rendimento de recuperação (%) é obtido proporcionalmente ao aumento do conteúdo do material alvo. Como resultado, é possível produzir um produto final com custos de produção e de processamento relativamente baixos. A fim de produzir eficazmente açúcares cristalizados (elevada pureza, elevado rendimento), é muito importante assegurar que o material alvo (tagatose) contido no alimento tenha uma pureza de 90% ou mais, preferivelmente 95%.

As condições operacionais disponíveis para a execução do processo de cromatografia podem levar a vários resultados dependendo do conteúdo do alimento, do tipo de resina de separação, do rendimento desejado ou da pureza de um material alvo (tagatose) presente no líquido separado. Consequentemente, o conteúdo do alimento utilizado na solução de reação obtida pelo processo de conversão enzimática da frutose em tagatose, ou seja, a taxa de conversão (%) de frutose em tagatose, afeta o rendimento da cromatografia. Quando a pureza da tagatose presente no líquido separado foi fixada em 95%, que é o percentual preferível no processo de cristalização, foram observadas alterações no rendimento (%) da separação cromatográfica dependendo do teor de (%) de frutose e tagatose presente no alimento.

A fim de maximizar a eficiência da separação cromatográfica de açúcares, foram obtidos resultados parcialmente melhorados através da alteração do tamanho das resinas usadas na separação cromatográfica c do tipo de resíduo modificado de íons metálicos (por exemplo, K, Na, Ca, Mg e similares) . Entretanto, de acordo com a presente invenção, uma resina de separação com resíduos de Ca modificados foi utilizada levando em conta as características gerais de separação da frutose e da tagatose. A Tabela I mostra as condições usadas na avaliação.TABELA 1

Sob as condições acima mencionadas, os resultados do teste de separação cromatográfica SMB dependendo do conteúdo (%) de frutose e tagatose do alimento se encontram na tabela seguinte. Quando a pureza de tagatose no líquido separado foi fixada em 95%. que é o percentual preferível no processo de cristalização, o rendimento de recuperação de frutose e tagatose dependendo do conteúdo de frutose e tagatose do alimento foi observada. Os resultados se encontram na Tabela 2.TABELA 2 Resultados da análise das características da separação cromatográfica dependendo do conteúdo de frutose e tagatose do alimento.

Observando a Tabela 2 e a FIG. 11, é possível verificar que o rendimento de recuperação (%) da tagatose c especialmente suscetível à taxa de conversão da enzima (%) quando comparada com a frutose. A fim de produzir tagatose com um rendimento de recuperação de 90% ou mais e uma pureza de 95%, o título da enzima e as condições do processo devem ser estabelecidos de tal modo que uma taxa de conversão da enzima (%) de 15% ou mais possa ser obtida. Da mesma forma, a fim de produzir tagatose com um rendimento de recuperação de 85% ou mais e uma pureza de 95%, uma taxa de conversão da enzima (%) de 10% ou mais deve ser assegurada. Deste modo foi possível confirmar que a taxa de conversão da enzima (%) é um fator muito importante em termos de eficiência do processo de produção de acordo com a presente invenção.

Exemplo 2 Preparação de cetohexose C4-epimerase

Reações em cadeia da polimerase (PCRs) foram realizadas usando, como modelo, um DNA genômico (SEQ 1D NO: 1) de Thermotoga marítima (estirpe ATCC 43589 / MSB8 / DSM 3109 / JCM 10099), um microrganismo resistente ao calor, e adicionando um iniciador direto (5’-GGGCATATGATGGTCTTGAAAGTGTTCAAAG-3') e um iniciador reverso (5'- AAACTCGAGCCCCTCCAGCAGATCCACGTG-3’).

Além disso, as reações em cadeia da polimerase (PCR) foram realizadas usando, como modelo, um DNA genômico (SEQ ID NO: 2) de Thermotoga neapolitana (DSM 4359), um microrganismo resistente ao calor, e adicionando um iniciador direto (5- GGGCATATGATGGTCTTGAAAGTGTTCAAAG-3') e um iniciador reverso (5- AAACTCGAGTCACCCCTTCAACAGGTCTACGTG-3').

As condições para a PCR estão apresentadas nas Tabelas 3 e 4. Os genes amplificados por PCR foram introduzidos em um vetor pET-2la, seguido de transformação em E. coli da estirpe DH5a. A partir da estirpe transformada, foram isolados plasmídeos, os quais foram sequenciados para identificar as sequências de bases dos genes introduzidos. Os plasmídeos foram transformados numa estirpe de expressão proteica E. coli BL21 (DE3), que foi utilizada na produção de cetohexose C4-epimerase. A fim de produzir cetohexose C4- epimerase, E. coli BL2I (DE3) pET21a-TM (incluindo um gene de expressão da enzima derivada da Thermotoga marítima} e E. coli BL21 (DE3) pET21a-TN (incluindo um gene de expressão enzimática derivado da Thermotoga neapolitana) foram cultivadas em um meio LB, incluindo 100 μg/ml de ampicilina por cerca de 2 horas, a uma temperatura de cultivo de 37° C e velocidade de agitação de 180 rpm. Após o cultivo, a densidade óptica dos microorganismos a 600 nm foi medida. Se o valor da densidade óptica ficou dentro de 0,4 a 0,8, foram adicionados 0,25 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG), seguido de cultura durante a noite sob as mesmas condições para induzir a expressão da proteína.TABELA 3

TABELA 4

Exemplo 3 Purificação de cetohexose C4-epimerase

A fim de medir a atividade de cetohexose C4-epimerase expressa no microrganismo, a purificação da proteína foi realizada através do método descrito a seguir. Uma solução de cultura na qual a expressão da proteína foi completada, foi centrifugada a 8.000 rpm durante 10 minutos para coletar células cultivadas que foram re-suspensas em um tampão 50 mM NaH2Pθ4 (pH 8.0) incluindo 10 mM de imidazol e 300 mM de NaCl. As células suspensas foram desruptadas por um sonicador e centrifugadas a 13.000 rpm durante 10 minutos para colher um sobrenadante. O sobrenadante colhido foi introduzido numa coluna preenchida com uma resina de Ni-NTA. Para a execução deste procedimento, um tampão 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0) incluindo 20 mM de imidazol e 300 mM de NaCl foi adicionado numa quantidade equivalente a 10 vezes o volume da resina existente na coluna, removendo assim as proteínas não específicas ligadas à resina. Finalmente, um tampão 50 mM NaH2PO4 (pFl 8.0) incluindo 250 mM de imidazol e 300 mM de NaCl foi adicionado para eluir e purificar a cetohexose C4-epimerase. A fim de remover o imidazol da enzima purificada, um tampão 50 mM Nall2PO4 (pH 8,0) foi adicionado diversas vezes reduzindo assim a concentração de imidazol a 0,01 mM ou menos. A enzima purificada foi quantificada através do ensaio de Bradford.

Exemplo 4 Conversão de frutose em tagatose

A fim de medir a atividade das enzimas obtidas nos Exemplos 2 e 3, a enzima purificada foi adicionada a lwt% dc frutose. 0,01 mM de ZnSO4 e a um tampão fosfato 50 mM (pH 7,0), seguida de reação a uma temperatura de 60° C durante 3 horas. A concentração de tagatose convertida por cetohexose C4-epimerase e a taxa de conversão de frutose em tagatose são mostrados na Tabela 5.

Além disso, depois da reação, a frutose e a tagatose remanescentes como produtos foram quantificadas por IIPLC. sendo utilizada coluna Shodex Sugar SP08I0 a urna temperatura de 80° C, e água como fase móvel foi adicionada a uma taxa de 0,5 ml/min, A FIG. 6 descreve os resultados da reação enzimática utilizando a frutose como um substrato por detecção e quantificação de picos por HPLC.TABELA 5

De acordo com a Tabela 5 e a FIG. 6. foi possível identificar que os picos de frutose e tagatose não foram observados quando a conversão foi realizada adicionando apenas enzimas para o tampão de fosfato, sem a adição de frutose (representada por uma linha tracejada).

No entanto, quando a frutose e as enzimas foram adicionadas a fim de realizar a epimerização (representado por uma linha contínua), apenas o pico para a frutose foi observado antes de 30 minutos após o início da reação enzimática. Com o passar do tempo foram observados picos para a tagatose passados cerca de 30 minutos após o início da reação enzimática.

Os resultados apresentados na Tabela 5 e na FIG. 6 confirmam que a frutose pode ser convertida em tagatose utilizando as enzimas preparadas nos Exemplos 2 e 3.

Exemplo 5 Construção de biblioteca de mutantes e seleção de mutante melhorado

Um gene derivado de T. neapolitana foi utilizado como um modelo para realizar uma mutação aleatória. Especificamente, o T. neapolitana foi submetido a mutagênese aleatória usando um kit de mutagênese aleatória Diversify (fabricado por ClonTech Co., Ltd.). O gene resultante foi amplificado através de PCR sob as condições indicadas nas Tabelas 6 e 7 abaixo. O gene amplificado foi introduzido em um vetor pET-28a para transformar a estirpe E. coli BL21 (DE3). As etapas subsequentes foram realizadas da mesma forma empregada no Exemplo 2.TABELA 6

TABELA 7

Llm candidato a mutante com grande atividade foi selecionado das bibliotecas de genes mutantes obtidos através de mutagênese aleatória, e porções mutadas na sequência de bases dos mutantes foram identificadas por sequenciamento de DNA. O gene mutante teve um total de 5 posições mutadas na sequência de aminoácidos (S125D / V163A / DI86N / F263I/D311G).

O gene mutante apresenta uma sequência de bases de DNA genômico representada na SEQ ID NO: 3, e a sequência de aminoácidos que codifica a enzima produzida pelo gene mutante é a descrita na SEQ ID NO: 4. O gene mutante que produz cetohexose C4-epimerase é E. coli BL21 (DE3) pET28a-TN(m) (número de acesso: KCCM11544P). O gene mutante foi utilizado para produzir C4-epimerase da mesma forma empregada nos Exemplos 2 e 3.

Exemplo 6 Avaliação da taxa de conversão de frutose em tagatose utilizando o mutante melhorado

Utilizando-se a enzima mutante-derivada melhorada, as taxas de conversão dependendo da temperatura, pH, e sal metálico foram avaliados pelo método a seguir descrito. (1) Avaliação comparada da atividade da enzima dependendo da temperatura reacional.

A fim de identificar uma alteração na atividade da enzima dependendo da temperatura reacional, a enzima purificada obtida no Exemplo 5 foi adicionada a 10 wt% de frutose, 0,3 mM ZnSCU, e tampão fosfato 50 mM (pH 7,0), e cm seguida levada a reagir durante 3 horas. Conforme mostra a FIG. 7, a atividade da enzima foi medida em diferentes temperaturas de reação, de 37° C a 96° C.

A atividade da enzima mostrou uma tendência de aumento com o aumento da temperatura. No entanto, a atividade da enzima diminuiu a uma temperatura de reação de 90° C ou mais. (2) Comparação de avaliação da atividade enzimática dependendo do pH do meio reacional.

A fim de identificar alterações na atividade da enzima em função do pH do meio reacional, a enzima purificada obtida no Exemplo 5 foi adicionada a 10 wt% de frutose, 0,01 mM NÍSO4, e um tampão de fosfato ou tampão Tris, e submetida a reação durante um período de 3 horas. Especificamente, um tampão de fosfato de potássio foi usado com pH variando entre pH 5 e pH 8,0, e um tampão Tris foi usado com pH variando entre pH 8,0 e pH 8,5. Conforme demonstra a FIG. 8, a atividade da enzima foi medida sob diferentes valores de pH da reação. Quando o tampão de fosfato de potássio e o tampão Tris foram utilizados, a atividade da enzima mostrou uma tendência de aumento com o aumento do pH. No mesmo pH, foi observada uma diminuição da atividade enzimática quando o tampão Trisfoi utilizado. (3) Comparação da avaliação da atividade enzimática em função do tipo de sal metálico.

A fim de identificar alterações na atividade enzimática em função do tipo de sal metálico, a enzima purificada obtida no Exemplo 5 foi adicionada a 10 wt% de frutose, tampão fosfato 50 mM, e submetida a reação durante 3 horas. Nesta reação, I mM de 13 diferentes sais metálicos foram utilizados. Como resultado, os sais metálicos mostraram atividade enzimática diferente na ordem NiSC^NiC^CoC^MnC^-ZnSCU da listagem de sais metálicos, em ordem decrescente de atividade (ver FIG. 9). (4) Avaliação da taxa de conversão por reação enzimática

A fim de identificar alterações na atividade enzimática em função da concentração de substrato, a enzima purificada obtida no Exemplo 5 foi adicionada a 10 wt% de frutose. 0,3 mM NÍSO4, tampão fosfato 50 mM. e em seguida levada a reagir a 60° C durante 3 horas. A fim de avaliar a taxa de conversão, a reação enzimática foi realizada durante 18 horas. De acordo com a FIG. 10, é possível verificar que a taxa de conversão de frutose em tagatose foi de 30% quando a enzima mutante melhorada foi utilizada.

Exemplo 7 Separação cromatográfica de frutose e tagatose

A enzima purificada obtida no Exemplo 5 foi adicionada a 10 wt% de frutose, 0,01 mM NÍSO4, tampão fosfato 50 mM, e em seguida levada a reagir a 60° C durante 3 horas. A solução mista de tagatose obtida foi adicionada a uma quantidade entre 0,1 e 0,5% (wt/v) de pó de carvão ativado, seguida de agitação entre 10 rpm e 100 rpm durante 0,5 hora a 1 hora, filtrada através de um filtro de prensa para remover materiais coloridos, obtendo-se assim uma solução mista de frutose e tagatose.

A fim de separar eficazmente a frutose e a tagatose a partir da solução mista de frutose e tagatose por cromatografia. a solução mista foi introduzido numa coluna preenchida com uma resina de troca catiônica substituída com grupos de hidrogênio e urna resina de troca aniônica substituída com grupos de hidroxila, removendo assim componentes de íons da solução.

Através dos processos de descoloração e dessalinização acima mencionados, foi obtida uma solução mista de tagatose produzida a partir da frutose, da qual as impurezas tais como materiais coloridos e componentes de íons foram removidos. A solução mista foi concentrada a 60% (solução g/g) e em seguida submetida a cromatografia fracionada utilizando o Sistema Avançado de Leito Móvel Simulado (fabricado por Organo, Japão), com urna resina de troca catiônica fortemente ácida substituída com grupos de cálcio (Amberlite CRI310 Ca), para medir a pureza dos componentes, o rendimento de recuperação e uma proporção entre um alimento misto de tagatose convertido a partir de frutose e água como uma fase móvel (proporção do volume de dessorvente/alimento).TABELA 8

Exemplo 8 Cristalização da tagatose

A solução coletada da separação cromatográfica do Exemplo 7 foi submetida a cristalização. A cristalização foi realizada pela concentração de calor da solução sob vácuo, de modo a que a concentração de tagatose se tornou 70 Bx, seguida de arrefecimento lento de 60° C para 30° C a uma taxa de 0,7° Ca I ° C por hora.

Depois da cristalização, os cristais resultantes foram submetidos a desidratação centrífuga para a coleta dos cristais. Os cristais foram secos a uma temperatura de 60° C utilizando um secador de leito fluidizado durante 1 hora para medir a pureza e o rendimento de recuperação dos cristais.TABELA 9 Resumo dos resultados da cristalização

Exemplo 9 Criação de um processo contínuo de reciclagem

Um processo contínuo de reciclagem para a produção de tagatose utilizando a enzima purificada obtida no Exemplo 5 foi concebido da seguinte forma.

O processo de produção através da reciclagem contínua é brevemente ilustrado nas FIGs. 2, 3, 4 e 5. Na etapa de purificação, processos para melhorar a qualidade do produto, tais como descoloração e, opcionalmente, dessalinização, podem ser realizados conforme necessário.

O processo de produção através da reciclagem contínua inclui a passagem de uma solução contendo frutose como um componente principal através de um reator hexuronato C4-epimerase para produzir tagatose; submissão do produto epimerizado composto de açúcar misto de frutose e tagatose a separação cromatográfica; opcionalmente, execução de uma etapa de concentração dependendo da concentração de tagatose no produto epimerizado purificado; concentração da solução da separação cromatográfica contendo tagatose como um componente principal (90% ou mais); e, se necessário, realização de cristalização para produzir tagatose. O restante do líquido cromatográfico contendo frutose como um componente principal foi reciclado no passo anterior para o reator de epimerização e/ou o alimento não cristalizados obtido na cristalização da tagatose foi reciclado no passosubsequente para a epimerização.

Claims

1. Um método de produção de tagatose, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) realização da epimerização da frutose utilizando hexuronato C4-epimerase para obter um produto epimerizado compreendendo tagatose; e b) purificação do produto epimerizado.

2. O método de produção de tagatose de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda a cristalização do produto epimerizado purificado após a etapa de purificação.

3. O método de produção de tagatose de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do hexuronato C4-epimerase ser uma enzima derivada da Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermotoga thermarum ou mutantes destas.

4. O método de produção de tagatose de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do hexuronato C4-epimerase ser produzido a partir de estirpes de Escherichia.coli, Corynebacterum glutamicum, Aspergillus oryzae, ou Bacillus subtilis.

5. O método de produção de tagatose de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato da estirpe de produção do hexuronato C4-epimerase ser a E. Coli BL21(DE3) pET21a- TM (número de acesso: KCCM11542P), E. Coli BL21(DE3) pET21a-TN (número de acesso: KCCM11543P), ou E. Coli BL21(DE3) pET28a-TN(m) (número de acesso: KCCM11544P).

6. O método de produção de tagatose de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da etapa de epimerização compreender a reação de frutose e do hexuronato C4- epimerase a uma temperatura variando entre 60° C e 90° C e um nível de pH variando entre pH 5 e pH 8.

7. O método de produção de tagatose de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato da etapa de epimerização ser realizada na presença de um sal metálico.

8. O método de produção de tagatose de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato do sal metálico compreender ao menos um sal selecionado dentre os sais de NiSO4, NiCl2, CoCl2, MnCl2, e ZnSO4.

9. O método de produção de tagatose de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do produto epimerizado compreender tagatose numa quantidade de 0,05 wt% ou mais.

10. O método de produção de tagatose de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da frutose ser produzida pela hidrólise da sacarose ou isomerização da glicose.

11. O método de produção de tagatose de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da etapa de purificação ser realizada através de pelo menos um dos seguintes métodos: cromatografia, cristalização fracionada e purificação de íons.

12. O método de produção de tagatose de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato da descoloração, dessalinização ou ambas serem realizadas antes ou após a etapa de purificação.

13. O método de produção de tagatose de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato do produto epimerizado purificado ser concentrado antes da etapa de cristalização.

14. O método de produção de tagatose de acordo com qualquer reivindicação de 1 a 13, caracterizado pelo fato de, após a etapa b), a frutose que não reagiu ser reciclada na etapa a) ou após a etapa de cristalização, o alimento do qual os cristais são separados ser reciclado na etapa b), ou ambas as etapas serem realizadas.

15. Método de produção de tagatose, caracterizado pelo fato da estirpe Escherichia.Coli BL21(DE3)pET21a-TM estar depositada (número de acesso: KCCM11542P).

16. Método de produção de tagatose, caracterizado pelo fato da estirpe Escherichia.Coli BL21(DE3) pET21a-TN estar depositada (número de acesso: KCCM11543P).

17. Método de produção de tagatose, caracterizado pelo fato da estirpe Escherichia.Coli BL21(DE3) pET28a-TN(m) estar depositada (número de acesso: KCCM11544P).

18. Método de produção de tagatose, caracterizado pelo fato do hexuronato C4-epimerase mutante ser representado por SEQ ID NO: 4.