RU2671087C2 - Варианты l-арабинозоизомеразы с улучшенной превращающей активностью и способ получения d-тагатозы с их применением - Google Patents
Варианты l-арабинозоизомеразы с улучшенной превращающей активностью и способ получения d-тагатозы с их применением Download PDFInfo
- Publication number
- RU2671087C2 RU2671087C2 RU2016135530A RU2016135530A RU2671087C2 RU 2671087 C2 RU2671087 C2 RU 2671087C2 RU 2016135530 A RU2016135530 A RU 2016135530A RU 2016135530 A RU2016135530 A RU 2016135530A RU 2671087 C2 RU2671087 C2 RU 2671087C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- arabinose isomerase
- amino acid
- microorganism
- tagatose
- galactose
- Prior art date
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 67
- 108010018080 L-arabinose isomerase Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 20
- BJHIKXHVCXFQLS-PQLUHFTBSA-N keto-D-tagatose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-PQLUHFTBSA-N 0.000 title description 5
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 claims abstract description 104
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 claims abstract description 104
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 claims abstract description 96
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 96
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 89
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 43
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 39
- LKDRXBCSQODPBY-OEXCPVAWSA-N D-tagatose Chemical compound OCC1(O)OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-OEXCPVAWSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims abstract description 20
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims abstract description 16
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 11
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims abstract description 10
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 44
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 21
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 claims description 14
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 14
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 claims description 14
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 claims description 14
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 claims description 14
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 claims description 9
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 7
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 7
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 7
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical compound [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 claims description 3
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 36
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 36
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 241000204664 Thermotoga neapolitana Species 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 5
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 4
- LONLXRPIYFRSMN-WNQIDUERSA-N (2r)-2-amino-3-sulfanylpropanoic acid;9h-carbazole Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O.C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 LONLXRPIYFRSMN-WNQIDUERSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000011692 calcium ascorbate Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 3
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 3
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 3
- 239000000626 magnesium lactate Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZAQJHHRNXZUBTE-UCORVYFPSA-N L-ribulose Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-UCORVYFPSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 1
- 235000000638 D-biotin Nutrition 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108700034062 EC 5.99.-.- Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 229930194542 Keto Natural products 0.000 description 1
- -1 Keto Sugars Chemical class 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000204652 Thermotoga Species 0.000 description 1
- 101900301386 Thermotoga neapolitana L-arabinose isomerase Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 125000000089 arabinosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 208000002925 dental caries Diseases 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000002804 saturated mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 235000021092 sugar substitutes Nutrition 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 150000003641 trioses Chemical class 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
- C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
- C12Y503/01003—Arabinose isomerase (5.3.1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
- C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
- C12Y503/01004—L-Arabinose isomerase (5.3.1.4)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, в частности к L-арабинозоизомеразе, обладающей увеличенной активностью превращения D-галактозы в D-тагатозу по сравнению с арабинозоизомеразой, содержащей замещение лейцина в положении 469 пролином, или арабинозоизомеразой дикого типа. Указанная L-арабинозоизомераза содержит замену аминокислоты в положении 275 аминокислотой, имеющей неполярную алифатическую боковую цепь, кроме фенилаланина, и замену аминокислоты в положении 469 пролином в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1. Изобретение также относится к микроорганизму рода Corynebacterium, продуцирующему указанную L-арабинозоизомеразу, и способу получения D-тагатозы с использованием указанного микроорганизма. Изобретение позволяет получать D-тагатозу с высокой эффективностью. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 4 табл., 8 ил., 5 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к варианту L-арабинозоизомеразы из Thermotoga neapolitana DSM 5068, которая получена с помощью белковой инженерии и обладает повышенной активностью превращения D-галактозы в D-тагатозу, к микроорганизму, который экспрессирует вариант L-арабинозоизомеразы, и к способу получения D-тагатозы из D-галактозы с применением такого микроорганизма.
Уровень техники
D-тагатоза является моносахаридом, которая имеет сладость, равную приблизительно 90% сладости сахара, и обладает такими свойствами, как низкая калорийность и неспособность вызывать кариес. Она может применяться в качестве диетического подсластителя, который в отличие от обычных подсластителей не вызывает различные заболевания у взрослых.
Благодаря таким свойствам D-тагатоза рассматривается в качестве заменителя сахара и, как известно, обладает большим потенциалом на продовольственном рынке. Однако тагатоза является редким сахаром, который мало распространен в природе, но содержится в молочных продуктах или некоторых растениях в очень малых количествах. Поэтому для применения тагатозы в качестве низкокалорийного функционального подсластителя необходимо разработать технологию, позволяющую получать тагатозу.
D-тагатоза была получена способом химической изомеризации из D-галактозы при использовании Ca(OH)2 в качестве катализатора компанией Arla Foods Ingredients Inc. в 2003 году и выпущена под товарным знаком "Gaio-тагатоза". Однако известно, что процесс химический изомеризации превосходен с точки зрения выхода изомеризационного превращения, но имеет недостатки, связанные с трудностью выделения и очистки, а также сложностью процесса, и, таким образом, общий выход процесса ниже, чем в случае процесса ферментативной изомеризации.
L-арабинозоизомераза (EC 5.3.1.5) является ферментом, который катализирует реакцию изомеризации превращения L-арабинозы в L-рибулозу. Кроме того, известно, что L-арабинозоизомераза не только превращает L-арабинозу (которая является ее естественным субстратом) в L-рибулозу, но также и D-галактозу (которая является субстратом, структурно подобным L-арабинозе) в D-тагатозу.
Наиболее важный фактор, способный обеспечить повышение производительности процесса производства D-тагатозы из D-галактозы с применением L-арабинозоизомеразы, состоит в разработке фермента, который обладает хорошой реакционной способностью и может быть успешно применен в процессе получения путем модификации изомеразы. Поскольку повышение производительности играет важную роль в максимизации прибыли при уменьшении издержек производства и успешности бизнеса, сохранялась потребность в модификации арабинозоизомеразы.
Арабинозоизомераза из Thermotoga neapolitana DSM 5068, который является термофильным микроорганизмом, обладает очень высокой термостабильностью, но требуется ее дополнительное улучшение, чтобы гарантировать экономическую производительность арабинозоизомеразы, которая сопоставима с производительностью глюкозоизомеразы.
Как правило, способы получения вариантов ферментов с целью повышения активности ферментов или создания ферментов, активных в отношении новых субстратов, в основном подразделяются на способ случайного мутагенеза и способ рационального дизайна. Способ случайного мутагенеза широко применяется, поскольку его можно использовать без необходимости в специальной информации в отношении целевого фермента. Впрочем, для этого требуется система скрининга, способная обрабатывать очень большое количество различных ферментов. С другой стороны, модификация ферментов с помощью рационального дизайна не требует никакой специальной системы скрининга, поскольку она дает лишь ограниченное число различных ферментов. Однако в случае рационального дизайна факторы, которые определяют каталитический механизм, способность связывания субстрата или субстратную специфичность целевого фермента, требуется тщательно исследовать.
Техническая задача
Таким образом, заявитель попытался увеличить субстратную специфичность L-арабинозоизомеразы из Thermotoga neapolitana DSM 5068 в отношении D-галактозы путем изменения трехмерной структуры L-арабинозоизомеразы на основе белковой инженерии, молекулярного моделирования и анализа механизма ферментативной реакции таким образом, чтобы арабинозоизомераза, обладающая потенциалом получения тагатозы, могла обеспечивать промышленное получение тагатозы.
Цель настоящего изобретения состоит в предоставлении варианта арабинозоизомеразы из Thermotoga neapolitana DSM 5068, который обладает повышенной превращающей активностью, и нуклеотидной последовательности гена, кодирующей указанный вариант.
Другая цель настоящего изобретения состоит в предоставлении рекомбинантного вектора, включающего нуклеотидную последовательность гена, и микроорганизма рода Corynebacterium, трансформированного указанным рекомбинантным вектором.
Еще одна цель настоящего изобретения состоит в предоставлении способа получения D-тагатозы из D-галактозы с применением варианта арабинозоизомеразы или трансформированного микроорганизма, или культуры трансформированного микроорганизма.
Техническое решение
Для достижения вышеуказанных целей в настоящем изобретении предложен вариант арабинозоизомеразы, обладающий повышенной активностью превращения D-галактозы в D-тагатозу, при этом вариант арабинозоизомеразы содержит замену лейцина в положении 469 на пролин и замену на аминокислоту кроме фенилаланина аминокислоты в положении 275 арабинозоизомеразы из Thermotoga neapolitana DSM 5068, и нуклеотидная последовательность гена, кодирующая вариант арабинозоизомеразы.
В настоящем изобретении также предложен рекомбинантный вектор, включающий нуклеотидную последовательность гена, и микроорганизм рода Corynebacterium, трансформированный рекомбинантным вектором.
В настоящем изобретении также предложен способ получения D-тагатозы из D-галактозы с применением варианта арабинозоизомеразы или трансформированного микроорганизма, или культуры трансформированного микроорганизма.
Полезные эффекты
Согласно настоящему изобретению продукция D-тагатозы может быть увеличена с применением микроорганизма рода Corynebacterium, трансформированного новым вариантом арабинозоизомеразы или нуклеотидной последовательностью гена, кодирующей вариант арабинозоизомеразы, что обеспечивает уменьшение издержек производства и инвестиций в инфраструктуру.
Описание фигур
На Фиг. 1 показана структура, состоящая из активного центра и иона марганца в качестве кофактора L-арабинозоизомеразы из Thermotoga neapolitana.
На Фиг. 2 показаны участки L-арабинозы и D-галактозы, которые связываются с активным центром L-арабинозоизомеразы, и функциональные группы L-арабинозы и D-галактозы, которые взаимодействуют с активным центром L-арабинозоизомеразы. Показано, что углерод 6 D-галактозы вызывает стерическое затруднение с остатком фенилаланина в положении 275 L-арабинозоизомеразы.
На Фиг. 3 показаны результаты, полученные при насыщающем мутагенезе остатка 275 L-арабинозоизомеразы и сравнении относительной активности вариантов, отобранных с помощью цистеин-карбазольного метода, посредством реакции с развитием цвета. Было обнаружено значительное количество вариантов, показывающих более высокую активность, чем у контроля.
На Фиг. 4 показаны структуры отобранных вариантов (F275V/L469P, F275M/L469P и F275I/L469P), предсказанных с помощью методики молекулярного моделирования.
На Фиг. 5 показаны результаты анализа с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ выделенных и очищенных вариантов L-арабинозоизомеразы Thermotoga neapolitana.
На Фиг. 6 показаны результаты оценки относительной активности отобранных вариантов при различных температурах для определения оптимальных температур вариантов.
На Фиг. 7 показаны результаты измерения термостабильности отобранных вариантов при 95°C в зависимости от времени.
На Фиг. 8 показаны результаты оценки относительной активности отобранных вариантов для определения зависимости вариантов от марганца.
Вариант осуществления изобретения
В варианте осуществления настоящего изобретения предложен вариант арабинозоизомеразы из Thermotoga neapolitana DSM 5068, который обладает повышенной превращающей активностью, и нуклеотидная последовательность гена, кодирующая указанный вариант.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложен вариант арабинозоизомеразы, обладающий повышенной активностью превращения D-галактозы в D-тагатозу, при этом вариант арабинозоизомеразы содержит замену лейцина в положении 469 на пролин и замену на аминокислоту кроме фенилаланина аминокислоты в положении 275 арабинозоизомеразы из Thermotoga neapolitana DSM 5068, и нуклеотидная последовательность гена, кодирующая указанный вариант арабинозоизомеразы.
При использовании в настоящем описании, выражение "арабинозоизомераза, которая превращает D-галактозу в D-тагатозу" означает фермент, который катализирует реакцию изомеризации с использованием D-галактозы в качестве субстрата для продукции D-тагатозы.
Вариант арабинозоизомеразы согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит замену аминокислоты в положении 275 арабинозоизомеразы на аминокислоту, имеющую неполярную алифатическую боковую цепь.
При использовании в настоящем описании, выражение "аминокислота, имеющая неполярную алифатическую боковую цепь", означает аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин или пролин.
Предпочтительно аминокислота в положении 275 арабинозоизомеразы заменена любой аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из валина, метионина и изолейцина.
Предпочтительно вариант арабинозоизомеразы согласно настоящему изобретению дополнительно содержит замену лейцина в положении 469 арабинозоизомеразы на пролин.
При использовании в настоящем описании, термин "замена" означает замену аминокислоты в определенном положении другой аминокислотой с получением мутации. Подходящий метод мутагенеза может быть любым методом, который может использоваться специалистами для этой цели. В частности, метод мутагенеза может быть методом насыщающего мутагенеза, методом случайного мутагенеза или методом сайт-направленного мутагенеза (Evolutionary molecular 15 engineering based on RNA replication, Pure Appl. Chem. 1984, 56:967-978; Promoters selected from random DNA-sequences, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83:7405-7409; Mutants generated by the insertion of random oligonucleotides into the active-site of the beta-lactamase gene, Biochemistry 1989, 28:5703-5707).
Предпочтительно в варианте арабинозоизомеразы согласно настоящему изобретению аминокислота в положении 275 заменена с использованием метода насыщающего мутагенеза, и лейцин в положении 469 заменен с использованием метода сайт-направленного мутагенеза.
В варианте осуществления настоящего изобретения случайный мутагенез был выполнен с использованием арабинозоизомеразы дикого типа (имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6) из Thermotoga neapolitana DSM 5068 в качестве матрицы, в результате чего были получены варианты, обладающие улучшенными ферментативными характеристиками, и генетическая информация о вариантах. Варианты были проанализированы совместно, и в результате было обнаружено, что вариация аминокислотной последовательности C-концевой области арабинозоизомеразы влияла на увеличение ферментативной активности.
Кроме того, аминокислоты в C-концевой области, составляющей активный центр арабинозизомеразы дикого типа и варианта арабинозоизомеразы, проанализировали с помощью молекулярного моделирования. В результате было обнаружено, что вариант содержал замену лейцина в положении 469 арабинозоизомеразы дикого типа на пролин, и таким образом бета-лист в положении 18 белка исчезал, при этом угол основной цепи наклонялся, тогда как трехмерная структура альфа-спирали в положении 17 смещалась к телу белка, что указывает на то, что структура белка была изменена.
Исходя из вышеописанных результатов, лейцин в положении 469 арабинозоизомеразы дикого типа был заменен пролином при использовании сайт-направленного мутагенеза, с получением варианта (L469P) (имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7). Вариант инкубировали, затем измеряли его активность, и в результате было обнаружено, что данный вариант показал более высокую активность в отношении субстрата галактозы по сравнению с арабинозоизомеразой дикого типа.
В варианте осуществления настоящего изобретения, с целью получения фермента, обладающего повышенной превращающей активностью по сравнению с вариантом арабинозоизомеразы (L469P), были выбраны главные остатки субстрат-связывающей области и активной области фермента, и был оценен механизм реакции, в результате чего была выбрана аминокислота в положении 275. Мутации были введены в положение 275 при использовании метода насыщающего мутагенеза, после чего варианты подвергли скринингу, отбрав таким образом варианты, обладающие повышенной превращающей активностью.
Отобранные варианты секвенировали, и в результате было обнаружено, что варианты содержали замены аминокислоты в положении 275 на валин (L469P/F275V), метионин (L469P/F275M) и изолейцин (L469P/F275I), соответственно. Каждый из этих трех вариантов трансформировали в микроорганизмы рода Corynebacterium, и реакцию изомеризации проводили при культивировании указанных микроорганизмов. В результате обнаружено, что все три варианта показали увеличенную активность по сравнению с вариантом L469P, содержащим замену лейцина в положении 469 на пролин.
Для исследования свойств этих трех вариантов, экспрессированные арабинозоизомеразы выделяли из микроорганизмов рода Corynebacterium, культивированных при вышеописанных условиях. Было обнаружено, что очищенные белки показали арабинозоизомеразную активность в отношении D-галактозы. Кроме того, с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ было обнаружено, что очищенные белки имели молекулярные массы, соответствующие молекулярной массе арабинозоизомеразы.
Используя очищенные варианты ферментов, измеряли оптимальную температуру, термостабильность, использование ионов металлов и ферментативную активность различных ферментов. В результате было обнаружено, что эти три варианта показали наиболее высокую активность при 75°C, но при этом несколько уменьшилась термостабильность, использование ионов металлов существенно не отличалось, и удельные активности вариантов арабинозоизомеразы приблизительно в 5,5 раз (F275V/L469P), в 5 раз (F275M/L469P) и в 3,9 раза (F275I/L469P), соответственно, превышали активность варианта L469P.
В варианте осуществления настоящего изобретения предложена нуклеотидная последовательность гена, кодирующая вариант арабинозоизомеразы.
Нуклеотидная последовательность гена может быть любой последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10.
Варианты арабинозоизомеразы согласно настоящему изобретению могут иметь нуклеотидные последовательности генов, кодирующие белки, обладающие гомологией по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 97%, с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 3-5, при условии, что арабинозоизомеразная активность вариантов арабинозоизомеразы согласно настоящему изобретению может быть сохранена или увеличена. Наиболее предпочтительно варианты арабинозоизомеразы согласно настоящему изобретению имеют нуклеотидные последовательности генов, представленные в SEQ ID NO: 8-10.
При использовании в настоящем описании, термин "гомология" относится к идентичности между двумя аминокислотными последовательностями. Гомология может быть определена при использовании методов, известных специалистам в данной области техники, например, BLAST 2.0, который вычисляет такие параметры, как оценку, идентичность или подобие.
Кроме того, полинуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть вариантами, кодирующими варианты арабинозоизомеразы, которые могут гибридизоваться с полинуклеотидами, представленными в SEQ ID NO: 8-10, или зондами из таких полинуклеотидов при строгих условиях, и которые нормально функционируют.
При использовании в настоящем описании термин "строгие условия" означает условия, которые обеспечивают специфичную гибридизацию между полинуклеотидами. Например, гибридизацию проводят в гибридизационном буфере (3,5> SSC, 0,02% фиколла, 0,02% поливинилпирролидона, 0,02% бычьего сывороточного альбумина, 2,5 мМ NaH2PO4 (pH 7), 0,5% ДСН, 2 мМ ЭДТА) при 65°C ("Molecular Cloning", A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 или Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York). В данном случае, SSC обозначает 0,15 М хлорида натрия/0,15 М цитрата натрия (pH 7). После гибридизации мембрану, на которую перенесена ДНК, промывают 2> SSC при комнатной температуре, и затем промывают 0,1-0,5> SSC/0,1×ДСН при температуре 68°C.
В варианте осуществления настоящего изобретения предложен вариант изомеразы, имеющий любую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5. В частности, вариант является мутантом арабинозоизомеразы, который содержит замену аминокислоты в положении 275 на любую аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из валина, метионина и изолейцина, а также содержит замену аминокислоты в положении 469 на пролин.
Впрочем, вариант изомеразы не ограничивается этим, поскольку аминокислотная последовательность фермента, демонстрирующего активность полипептида, может отличаться в зависимости от видов или штаммов микроорганизмов. В частности, вариант настоящего изобретения может быть мутантом или искусственным мутантом, кодирующим полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, включающую замену, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в одном или более положениях кроме положений 275 и 469 аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 3-5, при условии, что активность арабинозоизомеразы может быть сохранена или увеличена.
При использовании в настоящем описании термин "несколько аминокислот" означает 2-20 аминокислот, предпочтительно 2-10 аминокислот и более предпочтительно 2-5 аминокислот, в зависимости от типа или положений остатков аминокислот в трехмерной структуре белка.
Кроме того, замены, делеции, вставки, добавления или инверсии аминокислот могут включать природные мутанты или искусственные варианты, основанные на индивидуальных различиях и/или видовых различиях микроорганизма, экспрессирующего арабинозоизомеразу.
В варианте осуществления настоящего изобретения также предложен рекомбинантный вектор, включающий полинуклеотид, функционально связанный с ним.
При использовании в настоящем описании термин "вектор" относится к конструкции ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность гена, кодирующего целевой белок, функционально связанную с подходящей регуляторной последовательностью, что позволяет экспрессировать целевой ген в подходящей клетке-хозяине. Регуляторная последовательность включает промотор, способный инициировать транскрипцию, какой-либо оператор для регуляции этой транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий мРНК участок связывания рибосомы, и последовательность для регуляции терминации транскрипции и трансляции. После трансформации подходящего организма-хозяина вектор может реплицироваться или функционировать независимо от генома организма-хозяина, или может интегрироваться в геном непосредственно.
Вектор, который применяется в настоящем изобретении, специально не ограничен и может быть любым вектором, известным в уровне техники, при условии, что он может реплицироваться в организме-хозяине. Примеры обычно используемых векторов могут включать природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги.
Кроме того, вектор, который применяется в настоящем изобретении, является вектором, способным к трансформации клеток-хозяев, которая приводит к вставке полинуклеотида, кодирующего целевой белок, в хромосому клетки-хозяина. Определенные примеры вектора включают, без ограничения, шаттл-вектор pECCG112, который может самореплицироваться в обоих направлениях в E. coli и бактериях корине-типа (Kap-Soo, Noh, Kor. Jour. Microb iol. July 1991, p 149-154).
Кроме того, полинуклеотид, кодирующий эндогенный целевой белок в хромосоме, может быть заменен новым полинуклеотидом с помощью вектора для вставки в бактериальную хромосому. Вставка полинуклеотида в хромосому может быть выполнена любым методом, известным в уровне техники, например, гомологичной рекомбинацией.
Поскольку вектор настоящего изобретения может быть вставлен в хромосому посредством гомологичной рекомбинации, он может также включать селективный маркер для подтверждения его вставки в хромосому. Селективный маркер используется для отбора клетки, трансформированной вектором, то есть подтверждения вставки целевого полинуклеотида. Селективный маркер, который применяется в настоящем изобретении, может быть выбран из маркеров, которые обеспечивают селектируемые фенотипы, такие как устойчивость к лекарственному средству, ауксотрофия, устойчивость к цитотоксическим средствам или поверхностная экспрессия белков. Только клетки, экспрессирующие селективный маркер, могут выживать или демонстрировать различные фенотипы в среде, обработанной селективным агентом, и таким образом могут быть отобраны трансформированные клетки.
В варианте осуществления настоящего изобретения также предложен микроорганизм рода Corynebacterium, трансформированный рекомбинантным вектором.
При использовании в настоящем описании термин "трансформация" означает введение вектора, включающего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяина, с тем чтобы экспрессировать белок, кодируемый полинуклеотидом, в клетке-хозяине. Трансформированные полинуклеотиды включают все гены, вставленные в хромосому клетки-хозяина или расположенные вне хромосомы, при условии, что они могут экспрессироваться в клетке-хозяине. Кроме того, полинуклеотиды включают ДНК и РНК, которые кодируют целевой белок. При условии, что полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина и экспрессироваться в ней, ген может быть введен в любой форме. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме кассеты экспрессии, которая является полинуклеотидной конструкцией, включающей все элементы для экспрессии гена. Кассета экспрессии включает промотор, который функционально связан с геном, сигнал терминации транскрипции, участок связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции. Кассета экспрессии может быть в форме вектора экспрессии, способного к саморепликации. Полинуклеотид может быть также введен в клетку-хозяина сам по себе и может быть функционально связан с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетке-хозяине.
Микроорганизм настоящего изобретения включает любой из прокариотических микроорганизмов и эукариотических микроорганизмов, при условии, что он может экспрессировать вариант изомеразы. Например, он может включать микроорганизм, относящийся к роду Escherichia, роду Erwinia, роду Serratia, роду Providencia, роду Corynebacterium или роду Brevibacterium. Предпочтительно микроорганизм настоящего изобретения является микроорганизмом, относящимся к роду Corynebacterium. Более предпочтительно он является Corynebacterium glutamicum.
В примере настоящего изобретения Corynebacterium glutamicum, обладающую способностью продуцировать L-аминокислоту, трансформировали вектором, имеющим нуклеотидную последовательность каждого SEQ ID NO: 8, 9 и 10, и сконструированные штаммы были названы Corynebacterium glutamicum pFIS-1-TNAI-2, pFIS-1-TNAI-3 и pFIS-1-TNAI-4, соответственно, и были депонированы в Корейском центре культур микроорганизмов (Korean Culture Center of Microorganisms, 361-221, Honje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, South Korea), международном депонирующем органе, 14 февраля 2013 года, под регистрационными номерами KCCM11378P, KCCM11379P и KCCM11380P, соответственно. В варианте осуществления настоящего изобретения также предложена культура микроорганизма рода Corynebacterium.
Культура может быть неразведенной культурой, включающей клетки микроорганизма, или может быть микробной клеткой, полученной при удалении супернатанта культуры или концентрировании культуры. Состав среды для культивирования микроорганизма может включать не только обычные компоненты, требуемые для культуры микроорганизмов рода Corynebacterium, но также компоненты, оказывающие синергическое воздействие на рост микроорганизмов рода Corynebacterium, и может быть легко подобран специалистами в данной области техники. Кроме того, культура может находиться в жидком или сухом состоянии, и способы сушки культуры включают, без ограничения, воздушную сушку, естественную сушку, сушку распылением и лиофильную сушку.
Микроорганизм рода Corynebacterium согласно настоящему изобретению можно культивировать любым стандартным способом. В частности, микроорганизм можно культивировать путем его инокулирования в среду, которая полностью или частично содержит сахарозу или глюкозу в качестве источника углерода. Процесс культивирования можно вести в подходящей среде и условиях культивирования, известных в уровне техники. Этот процесс культивирования может быть легко изменен любым специалистом в данной области в зависимости от типа выбранного штамма. Примеры процесса культивирования включают, без ограничения, периодическое культивирование, непрерывное культивирование и культивирование с подпиткой. Среда, которая используется при культивировании микроорганизма настоящего изобретения, должна надлежащим образом соответствовать потребностям микроорганизма настоящего изобретения.
В частности, среда, которая используется в настоящем изобретении, содержит сахарозу или глюкозу в качестве основного источника углерода. Кроме того, патока, содержащая высокую концентрацию сахарозы, также может использоваться в качестве источника углерода. Кроме того, может использоваться подходящее количество различных источников углерода. Предпочтительно используется очищенная глюкоза. Примеры источников азота, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включают органические источники азота, такие как пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, кукурузный сироп и соевую муку, и неорганические источники азота, такие как мочевину, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Предпочтительно используется пептон. Указанные источники азота могут использоваться отдельно или в комбинации. Среда может содержать дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия и соответствующие натрийсодержащие соли в качестве источников фосфора. Кроме того, среда может содержать соль металла, такую как сульфат магния или сульфат железа. Кроме того, питательная среда может содержать аминокислоты, витамины и подходящие предшественники. Указанные среды или предшественники можно добавлять в среду в периодическом или непрерывном режиме.
Среду обычно поддерживают при температуре в пределах от 27°C до 37°C и предпочтительно от 30°C до 37°C. Культивирование микроорганизма можно продолжать до тех пор, пока не будет получен требуемый уровень белка. Предпочтительно период культивирования составляет от 10 до 100 часов.
В настоящем изобретении предложен способ получения D-тагатозы, включающий реакцию раствора, содержащего D-галактозу, с источником ионов металла, выбранных из группы, состоящей из ионов марганца, ионов магния и ионов цинка, в присутствии варианта арабинозоизомеразы, обладающего активностью превращения D-галактозы в D-тагатозу, трансформированного микроорганизма рода Corynebacterium или культуры трансформированного микроорганизма рода Corynebacterium, с получением в результате D-тагатозы.
Чтобы обеспечить введение субстрата в трансформированный микроорганизм рода Corynebacterium или культуру трансформированного микроорганизма рода Corynebacterium, микробные клетки, получаемые при центрифугировании трансформированного микроорганизма или культуры, можно обработать поверхностно-активным веществом, лизоцимом или ксилолом. Предпочтительно микробные клетки можно обработать 0,1% POESA.
Раствор, содержащий D-галактозу, которая используется в настоящем изобретении, может быть выбран из группы, состоящей из очищенной D-галактозы, полученной из биомассы D-галактозы и D-галактозы, полученной при гидролизе лактозы, но не ограничивается этим.
Арабинозоизомераза является металлоферментом, который использует ион металла в качестве кофактора. Ион металла может быть выбран из группы, состоящей из ионов марганца, ионов магния и ионов цинка, но не ограничен, и может быть любым ионом металла, который может связываться с изомеразой для выполнения реакции изомеризации. В частности, источник иона марганца включает хлорид марганца; источник иона магния включает хлорид магния; и источник иона цинка включает хлорид цинка; впрочем, объем настоящего изобретения не ограничивается этими источниками ионов металлов.
Реакционный раствор для получения D-тагатозы содержит буферную систему для поддержания pH, такую как Трис-буфер или фосфатный буфер. Предпочтительно он содержит Трис-буфер (pH 6,5-7,5). Хлорид марганца, хлорид магния или хлорид цинка содержатся в концентрации от 0,1 мМ до 10 мМ, и предпочтительно от 1 мМ до 5 мМ. Субстрат D-галактозу добавляют в количестве 1-300 г/л и предпочтительно 18-300 г/л, и реакцию изомеризации инициируют при температуре от 60°C до 95°C, предпочтительно от 70°C до 80°C и более предпочтительно от 72°C до 78°C, с получением в результате D-тагатозы.
В дальнейшем настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Специалистам в данной области будет очевидно, что эти примеры предназначены исключительно в иллюстративных целях и не должны ограничивать объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1: Моделирование белка арабинозоизомеразы Thermotoga neapolitana для конструирования фермента, обладающего увеличенной превращающей активностью, и отбор основных аминокислотных мутаций
Поскольку трехмерная структура арабинозоизомеразы дикого типа из Thermotoga neapolitana DSM 5068 пока не была установлена, предсказание трехмерной структуры выполняли с помощью методики молекулярного моделирования при использовании в качестве матрицы арабинозоизомеразы Escherichia coli, трехмерная структура которой уже была установлена и которая обладает высокой гомологией последовательности. Для предсказания трехмерной структуры использовали методику сравнительного моделирования, и структурная модель была получена при использовании модуля APM (Tripos, USA) в пакете молекулярного моделирования.
Методика сравнительного моделирования является способом, который наиболее часто используют для предсказания трехмерных структур белков. Если аминокислотная последовательность требуемого белка обладает высоким подобием с последовательностью другого белка, трехмерная структура которого была известна, трехмерная структура требуемого белка может быть легко предсказана при использовании методики сравнительного моделирования, и в этом случае точность предсказания очень высока.
Структура арабинозоизомеразы E. coli, используемой в данном Примере, являлась структурой тримерного типа, зарегистрированной как 2HXG.pdb в Protein Data Bank (PDB).
На основе результатов моделирования было предсказано, что арабинозоизомераза дикого типа (имеющая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6) из Thermotoga neapolitana DSM 5068 обладала бы очень высоким подобием с арабинозоизомеразой E. coli не только в отношении нуклеотидной последовательности, но также и дву- и трехмерных структур. В нескольких исследованиях арабинозоизомеразы E. coli сообщали информацию о субстрат-связывающем участке, кофакторе ионе марганца (Mn2+) и главных аминокислотах ((Manjasetty & Chance, J. Mol. Biol., 2006. 360:297-309). На основе такой информации были отобраны главные остатки изомеразы из Thermotoga neapolitana DSM 5068.
Для анализа главных аминокислотных остатков проводили выравнивание последовательностей, моделирование молекулярного докинга и анализ механизма реакции. Выравнивание последовательностей выполняли при использовании алгоритма clustalW (//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) на основе информации о последовательностях 10 различных L-арабинозоизомераз и арабинозоизомеразы Thermotoga neapolitana.
Результаты выравнивания последовательностей указывают, что последовательности металлсвязывающего участка и активного центра арабинозоизомеразы из Thermotoga neapolitana DSM 5068 являлись высококонсервативными, как и у других изомераз. Изомераза из Thermotoga neapolitana DSM 5068 имела активный центр, включающий аминокислотные остатки E302 (глутаминовая кислота в положении 302), E329 (глутаминовая кислота в положении 329), H346 (гистидин в положении 346) и H445 (гистидин в положении 445) и ионы марганца (Фиг. 1), при этом аминокислотные остатки E302, E329, H346 и H445 влияли на связывание иона марганца. В частности, было предсказано, что остатки E302 и E329 являются наиболее важными факторами, которые способствуют протеканию реакции изомеризации (Manjasetty & Chance, J. Mol. Biol., 2006. 360:297-309).
Предполагали, что субстратная специфичность арабинозоизомеразы Thermotoga neapolitana будет определяться в зависимости от размера и морфологии активного центра, а также свойств аминокислотных остатков активного центра. С помощью моделирования молекулярного докинга (surflexDock; Tripos, USA), выполненного с использованием исходного субстрата L-арабинозы, были отобраны остатки, важные при распознавании субстрата. Кроме того, с помощью анализа механизма реакции (Adrian J. Mulholland, Drug Discov. Today. 2005. 10(20):1393-402) было выбрано наиболее подходящее положение связывания D-галактозы. На основе такого выбора был выбран аминокислотный остаток, имеющий высокую возможность препятствовать связыванию между активным центром арабинозоизомеразы и D-галактозой.
Аминокислота в положении 275 состояла из фенилаланина, который имеет ароматическую боковую цепь, относительно большой размер и является менее гибким, при этом было предсказано, что аминокислота в положении 275 вызовет стерическое затруднение с углеродом 6 D-галактозы (Фиг. 2). Поскольку L-арабиноза, пентоза, демонстрирует по существу такую же структуру, что и D-галактоза, за исключением того, что количество атомов углерода меньше на один, чем в D-галактозе, предполагали, что реакционная способность арабинозоизомеразы с D-галактозой могла быть значительно увеличена посредством только замены аминокислоты в положении 275 другой аминокислотой.
В качестве аминокислот, способных заменить фенилаланин, были выбраны валин, метионин и изолейцин, которые имеют полярность по сравнению с фенилаланином, имеют относительно малый размер и очень гибкие, и, таким образом, как ожидают, будут оказывать меньшее воздействие на полную структуру арабинозоизомеразы, при минимальном отталкивании с углеродом 6 D-галактозы.
Поскольку эти выбранные аминокислоты состоят из неполярной алифатической цепи в отличие от фенилаланина, включающего ароматическую цепь, предполагали, что эти аминокислоты могли заменить фенилаланин, и при этом они будут структурно свободными.
Структуры вариантов (имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3-5 и нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 8-10), содержащих точечные мутации, были предсказаны с помощью методики молекулярного моделирования. В результате было предсказано, что влияние мутаций на полную структуру арабинозоизомеразы будет незначительным.
Кроме того, с помощью случайного мутагенеза, выполненного при использовании арабинозоизомеразы дикого типа из Thermotoga neapolitana DSM 5068 в качестве матрицы, были получены варианты, демонстрирующие улучшенные ферментативные характеристики, а также генетическая информация о вариантах. Варианты были проанализированы совместно, и в результате было обнаружено, что изменение аминокислотной последовательности C-концевой области арабинозоизомеразы привело к увеличению ферментативной активности.
Явление, вызвавшее значительное изменение структуры цепи C-концевой области арабинозоизомеразы, проанализировали с помощью методики молекулярного предсказания. В результате предположили, что реакционная способность арабинозоизомеразы в отношении D-галактозы может быть значительно увеличена даже посредством только замены лейцина на пролин в положении 469 арабинозоизомеразы дикого типа.
Пример 2: Получение сконструированных вариантов арабинозоизомеразы
(1) Замена лейцина на пролин в положении 469
Лейцин в положении 469 арабинозоизомеразы дикого типа из Thermotoga neapolitana DSM 5068 заменяли пролином с помощью метода сайт-направленного мутагенеза при использовании специфичных праймеров.
В качестве праймеров использовали N-концевой праймер (SEQ ID NO: 13) и C-концевой праймер (SEQ ID NO: 14), которые являются олигонуклеотидами, содержащими комплементарные нуклеотидные последовательности с мутацией. При использовании плазмидной ДНК в качестве матрицы, плазмиду, содержащую новую мутацию, амплифицировали и синтезировали в пробирке, а затем ДНК дикого типа удаляли путем расщепления рестриктазой Dpn I. Другими словами, ДНК дикого типа, используемая в качестве матрицы, представляла собой ДНК, выделенную из E. coli, и была расщеплена Dpn I, которая распознает и расщепляет Gm6ATC, но при этом ДНК, синтезированная в пробирке, не была расщеплена.
ДНК трансформировали в E. coli DH5 альфа с получением варианта гена, и затем нуклеотидную последовательность варианта гена проанализировали с целью подтверждения, что мутация прошла надлежащим образом. Вариант гена трансформировали в Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 с получением рекомбинантного штамма, который затем назвали L469P. Рекомбинантный штамм использовали в качестве контроля.
(2) Замена аминокислоты в положении 259 аминокислотой кроме фенилаланина
Чтобы вызвать дополнительную мутацию в сконструированном варианте L469P, вектор, клонированный с изомеразой, подвергали насыщающему мутагенезу с использованием пары праймеров, содержащих мутацию.
Подобранная пара праймеров была подобрана таким образом, чтобы кодон аминокислоты в положении 275 был заменен NNS (N: A, T, G или C; и S: G или C). Варианты, полученные таким способом, могут включать 20 видов аминокислот (SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12). Такие варианты дали одиночные колонии при трансформации, и изменения активности при 20 аминокислотных мутациях в соответствующих положениях могли быть надежно подтверждены с помощью скрининга одиночных колоний и анализа их активности.
В частности, для получения библиотеки, включающей 20 видов аминокислот, проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) при использовании 100 мкл/мл плазмиды pECCG117-CJ1-TNAI_L469P (выложенная корейская патентная публикация 10-2010-0016948) в качестве матрицы и прямого и обратного праймеров. Реакцию ПЦР проводили при условиях, показанных в Таблицах 1 и 2 ниже. Библиотеку, полученную с помощью реакции ПЦР, трансформировали в штамм E. coli K12 DH5 α, получив колонии. Используемую плазмиду экспрессировали в штамме E. coli и тестировали ее активность в E. coli, поскольку она могла реплицироваться и экспрессироваться и в E. coli, и в бактериях корине-типа.
Активности изомераз, экспрессированных из 110 колоний, полученных, как описано, анализировали с помощью цистеин-карбазольного метода (Dische, Z., and E. Borenfreund., A New Spectrophotometric Method for the Detection and Determination of Keto Sugars and Trioses, J. Biol. Chem., 192:583-587, 1951), и в результате мог быть обнаружен ряд клонов, обладающих более высокой активностью, чем контроль (L469P) (Фиг. 3).
Из них отобрали и секвенировали 10 колоний, которые по результатам измерения имели наиболее высокую активность. В результате, как ожидалось, можно было наблюдать, что активность повышалась в порядке: валин, метионин и изолейцин (аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3-5 и нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 8-10). Кроме того, мутации в аминокислотах помимо аминокислоты в положении 275 не были обнаружены, что указывает на то, что остаток фенилаланина в положении 275 вызывает ингибирование реакционной способности D-галактозы.
Для исследования, оказывает ли мутация какое-либо воздействие на изомеразу, структуры вариантов предсказывали с помощью методики молекулярного моделирования (Фиг. 4). Результаты предсказания структур показали, что все три аминокислоты заменяли фенилаланин в положении 275, не вызывая существенных изменений в дву- и трехмерных структурах. Таким образом, можно было ожидать, что реакционная способность изомеразы в отношении D-галактозы увеличится без значительных увеличений термостабильности и других производственных показателей.
Варианты трансформировали в Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, получив рекомбинантные штаммы. Рекомбинантные штаммы назвали "Corynebacterium glutamicum pFIS-1-TNAI-2, pFIS-1-TNAI-3 и pFIS-1-TNAI-4", соответственно, и депонировали в Корейском центре культур микроорганизмов (361-221, Honje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, South Korea), международном депонирующем органе, 14 февраля 2013 года под регистрационными номерами KCCM11378P, KCCM11379P и KCCM11380P, соответственно.
Таблица 1: ПЦР с насыщающим мутагенезом
| Состав реакционного раствора | Добавленное количество (мкл) |
| ПЦР буффер (pfu-ultra) 10× | 5 |
| дНТФ (2,5 мМ) | 5 |
| pCJ1-TNAI_L469P | 1 |
| праймер TNAI275_F | 1 |
| праймер TNAI275_R | 1 |
| pfu-ultra | 1 |
| DDW | До 50 мкл |
Таблица 2: условия реакции ПЦР
| Этап | Температура | Время | Циклы |
| Первичная денатурация | 95°C | 5 мин | 1 |
| Денатурация | 95°C | 45 сек | 18 |
| Отжиг | 60°C | 45 сек | |
| Элонгация | 68°C | 18 мин | |
| Конечная элонгация | 72°C | 10 мин | 1 |
Пример 3: Экспрессия вариантов арабинозоизомеразы в микроорганизмах рода Corynebacterium
Для оценки степени увеличения активности отобранных вариантов и применимости вариантов для фактического производства D-тагатозы три варианта экспрессировали в микроорганизмах рода Corynebacterium и проводили исследования производительности и связанных с производством показателей.
Три варианта, отобранные в Примере 2, трансформировали в Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, получив рекомбинантные штаммы. Эти рекомбинантные штаммы культивировали в среде (20 г/л глюкозы, 10 г/л полипептона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л сульфата аммония, 5,2 г/л KH2PO4, 10,7 г/л K2HPO4, 0,5 г/л MgSO4, 1,5 г/л мочевины, 1,8 мг/л D-биотина, 9 мг/л тиамина, 9 мг/л пантотената Ca, 60 мг/л ниацинамида), содержащей 50 мкг/мл канамицина, при 30°C в течение 20 часов для индукции экспрессии мутантов рекомбинантной арабинозоизомеразы.
Для измерения активности экспрессированных арабинозоизомераз, культуры центрифугировали при 8000 g в течение 10 минут для сбора бактериальных клеток, которые затем ресуспендировали в 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5) буфере. Суспендированные клетки обрабатывали 0,1% POESA при комнатной температуре в течение 1 часа для ослабления клеточной стенки. Затем центрифугирование выполняли снова при вышеописанных условиях для сбора клеток, которые затем ресуспендировали в смешанном растворе 300 г/л D-галактозы, 5 мМ хлорида марганца и 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5) при концентрации 4% (в/об). Суспензии позволяли реагировать при 75°C в течение 1 часа и проводили ВЭЖХ анализ (WATERS HPLC, EMPOWER system, колонка WATERS SugarPak ID 6.5-L 300 мм, рефрактометрический детектор 2414) для определения количества D-галактозы и D-тагатозы.
Результаты одного часа реакции показали, что контроль L469P давал 35 г/л D-тагатозы, тогда как вариант F275V/L469P показал производительность 121 г/л⋅ч, вариант F275M/L469P показал производительность 117 г/л⋅ч и вариант F275I/L469P показал 101 г/л⋅ч.
Пример 4: Выделение вариантов арабинозоизомеразы, экспрессированных в коринебактериях
200 мл рекомбинантного штамма, включающего каждый из трех вариантов (F275V/L469P, F275M/L469P и TNAI-F275I/L469P), активности которых были подтверждены, и контроль L469P культивировали после инокулирования в 2 л колбе при таких же условиях, как описано в Примере 3. Для исследования, экспрессировались ли арабинозоизомеразы, активности изомераз измеряли при использовании части каждой культуры при таких же условиях, описанных в Примере 3.
Бактериальные клетки, полученные из каждой культуры, ресуспендировали в 20 мМ Трис-HCl буфере (pH 7,5), содержащем 0,1 мМ хлорида марганца, и разрушали с использованием клеточного гомогенизатора высокого давления серии T (4,0 кВт: Constant systems, UK). Для удаления эндогенных белков кроме изомераз, клетки подвергали термической обработке при 75°C в течение 20 минут. Термически обработанный клеточный дебрис удаляли с помощью центрифугирования при 8000 g в течение 10 минут, а затем клеточный дебрис и липиды дополнительно удаляли с помощью ультрацентрифугирования (ультрацентрифуга BECKMAN COULTER Optima L-80 XP) при 60000 g.
Полученный в результате клеточный экстракт очищали с помощью анионообменной хроматографии (Mono QTM 10/100GL, GE Healthcare). Очищенный клеточный экстракт предварительно уравновешивали связывающим раствором (50 мМ NaCl, 0,1 мМ хлорида марганца, 20 мМ Трис-HCl (pH 7,5), и затем избыточное количество клеточного экстракта связывали и фракционировали с повышением соотношения элюирующего раствора [1 М NaCl, 0,1 мМ хлорида марганца, 20 мМ Трис-HCl (pH 7,5). Фракции, показывающие активность в отношении субстрата (D-галактозы), отбирали с помощью цистеин-карбазол-сернокислотного метода, и затем анализировали с помощью ДСН-ПААГЭ.
В результате можно было заметить, что очищенный белок имел молекулярную массу приблизительно 56 кДа, что соответствует известной молекулярной массе арабинозоизомеразы Thermotoga neapolitana. Фракция, имеющая самую высокую степень очистки, была выбрана с помощью ДСН-ПААГЭ, и высокая концентрация NaCl была удалена из нее при использовании обессоливающей колонки PD-10 (GE Healthcare). Полученный в результате очищенный фермент анализировали с помощью ДСН-ПААГЭ (Фиг. 5). Выделенный и очищенный белок определяли количественно при помощи анализа Брэдфорд, при этом BSA (бычий сывороточный альбумин) использовали в качестве стандартного белка.
Пример 5: Работы по исследованию вариантов арабинозоизомеразы
Было обнаружено, что три варианта арабинозоизомеразы, полученные в Примере выше, показали значительно более высокую активность по сравнению с вариантом, имеющим замену лейцина на пролин в положении 469. На основе данного результата были проведены эксперименты по параметрам, связанным с условиями реакции, влияющими на фактическую продукцию D-тагатозы.
5-1: Исследование оптимальной температуры
Арабинозоизомераза Thermotoga neapolitana, термофильный фермент, имеет относительно высокую термостабильность и оптимальную температуру. Температура, подходящая для продукции D-тагатозы из D-галактозы, составляет от 55°C до 75°C. При температуре ниже 55°C появляются проблемы, вызванные контаминацией гетерологичными штаммами, а при температуре выше 75°C возникают проблемы в отношении стабильности получаемой D-тагатозы. Арабинозоизомераза дикого типа или контроль L469P, оптимальная температура реакции для которых составляет 85°C, имеет недостаток, связанный с тем, что она показывает относительно низкую активность при температуре, при которой может применяться способ получения.
Для исследования оптимальных температур для вариантов арабинозоизомеразы, очищенных в Примере 4, каждый из очищенных ферментов добавляли к 100 мМ субстрата D-галактозы, и их активность измеряли в 50 мМ Трис-HCl буфере (pH 7,5), содержащем 1 мМ хлорида марганца (MnCl2), при температуре от 60°C до 90°C с интервалами 5°C.
Измерение активности выполняли с помощью цистеин-карбазольного метода. Как показано на Фиг. 6, результаты измерения ферментативной активности в зависимости от температуры показали, что оптимальная температура реакции трех вариантов арабинозоизомераз составила 75°C, что было на 10°C ниже, чем у L469P. Таким образом, было обнаружено, что активность изомераз в диапазоне температур, в котором может применяться способ получения, может быть в целом высокой, и что диапазон температур применения способа получения может быть более широким.
Кроме того, эти три варианта показали сходные температурные профили, что указывает на то, что свойства остатка фенилаланина в положении 275 влияли на оптимальную температуру реакции. Таким образом, можно заметить, что необходимо обеспечить достаточную гибкость, чтобы стерическое затруднение фенилаланина в положении 275 с D-галактозой в ходе реакции изомеразы с D-галактозой могло быть сведено к минимуму. При повышении температуры молекулярное движение фенильного остатка фенилаланина и окружающих остатков может быть более активным, и таким образом стерическое затруднение с углеродом 6 D-галактозы может быть уменьшено. В то же время можно ожидать, что оптимальная температура может быть сформирована в пределах диапазона, который не оказывает значительного влияния на трех- и четырехмерные структуры белка. Таким образом, может присутствовать изменение оптимальной температуры вариантов, стерическое затруднение которых было существенно снижено в результате мутации в положении 275. Впрочем, необходим дополнительный анализ и эксперименты для научного подтверждения этого факта.
5-2: Исследование термостабильности
Для исследования термостабильности вариантов арабинозоизомеразы каждый из очищенных ферментов добавляли к раствору 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5) и 1 мМ хлорида марганца в концентрации 20 мкг/мл и инкубировали в термостатируемой водяной бане при 95°C в течение 180 минут. Ферментативную реакцию проводили при использовании ферментного раствора, с отбором проб в различные точки времени для измерения остаточной активности фермента.
Как показано на Фиг. 7, результаты исследования термостабильности показали, что варианты арабинозоизомеразы демонстрировали уменьшение остаточной активности с течением времени при 95°C, однако различие в термостабильности между вариантами не было значимым. Для получения дополнительных количественных данных измеряли полупериод существования активности каждого варианта. В результате было обнаружено, что L469P имел полупериод существования приблизительно 3 часа, а варианты, имеющие мутацию в положении 275, имели полупериод существования приблизительно 2 часа (Таблица 3). Термостабильность вариантов, имеющих мутацию в положении 275, как было измерено, являлась относительно низкой, однако считается, что различие в термостабильности не является значимым и может быть в достаточной мере скомпенсировано увеличением активности и снижением температуры процесса.
Таблица 3: Полупериод существования арабинозоизомераз, измеренный при 95°C
| Варианты | Полупериод существования (мин) |
| L469P | 185 |
| F275V/L469P | 122 |
| F275M/L469P | 126 |
| F275I/L469P | 134 |
5-3: Исследование изменения активности, вызванного влиянием ионов металлов
Многие ферменты требуют присутствия ионов металлов для катализа. Поэтому для исследования зависимости термостабильности вариантов арабинозоизомеразы настоящего изобретения от ионов металлов исследовали изменение активности вариантов в присутствии ионов металлов при использовании каждого из очищенных ферментов.
Для исследования изменения активности фермента в зависимости от концентрации фермента, каждый из очищенных ферментов добавляли к 100 мМ субстрата D-галактозы и измеряли активность каждого фермента в 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5) буферном растворе, содержащем 1-5 мМ хлорида марганца (MnCl2) при 75°C в течение 10 минут (Фиг. 8). В результате можно было заметить, что все варианты показали аналогичные активности в диапазоне концентраций хлорида марганца, используемом в эксперименте, и что влияние ионов марганца на активность изомераз при концентрации хлорида марганца, необходимой для активности фермента, не было значимым.
5-4: Исследование активности ферментов
Для исследования скорости реакции ферментов удельные активности вариантов арабинозоизомеразы измеряли при температуре реакции 75°C. В частности, каждый из ферментов добавляли к 1 мМ хлорида марганца и 100 мМ D-галактозы и измеряли реакционную способность 1 мг фермента при pH 7,5 и 75°C. Удельную активность каждого фермента во время реакции измеряли при указанных выше условиях в течение 10 минут, и в результате было показано, что удельные активности вариантов, имеющих мутацию в положении 275, приблизительно в 5,5 раз (F275V), 5 раз (F275M) и 3,9 раза (F275I), соответственно, превышали удельную активность L469P (Таблица 4).
Таблица 4: Удельные активности вариантов
| L469P | F275V/L469P | F275M/L469P | F275I/L469P | |
| Удельная активность (Ед/мг) | 2,4 | 13,1 | 12,1 | 9,3 |
Регистрационные номера
Депонирующий орган: Корейский центр культур микроорганизмов;
Регистрационный номер: KCCM11378P;
Дата депонирования: 14 февраля 2013 года.
Депонирующий орган: Корейский центр культур микроорганизмов;
Регистрационный номер: KCCM11379P;
Дата депонирования: 14 февраля 2013 года.
Депонирующий орган: Корейский центр культур микроорганизмов;
Регистрационный номер: KCCM11380P;
Дата депонирования: 14 февраля 2013 года.
Claims (12)
1. L-арабинозоизомераза, обладающая увеличенной активностью превращения D-галактозы в D-тагатозу по сравнению с арабинозоизомеразой, содержащей замещение лейцина в положении 469 пролином, или арабинозоизомеразой дикого типа, где L-арабинозоизомераза содержит замену аминокислоты в положении 275 аминокислотой, имеющей неполярную алифатическую боковую цепь, кроме фенилаланина, и замену аминокислоты в положении 469 пролином в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1.
2. L-арабинозоизомераза по п.1, где аминокислоту, имеющую неполярную алифатическую боковую цепь, выбирают из группы, состоящей из валина, метионина и изолейцина.
3. Полинуклеотид, кодирующий L-арабинозоизомеразу по п. 1 или 2.
4. Полинуклеотид по п.3, который имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10.
5. Микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-арабинозоизомеразу по п.1, трансформированный рекомбинантным вектором, включающим полинуклеотид по п. 3.
6. Микроорганизм по п.5, который представляет собой Corynebacterium glutamicum.
7. Микроорганизм по п.5, который представляет собой Corynebacterium glutamicum pFIS-1-TNAI-2 (KCCM 11378P), pFIS-1-TNAI-3 (KCCM 11379P) или pFIS-1-TNAI-4 (KCCM 11380P).
8. Способ получения D-тагатозы, включающий превращение D-галактозы в D-тагатозу с использованием L-арабинозоизомеразы по п.1, с реагированием раствора, содержащего D-галактозу и источник ионов металлов, в присутствии L-арабинозоизомеразы.
9. Способ по п.8, где источник ионов металла выбирают из группы, состоящей из иона марганца, иона магния и иона цинка в присутствии микроорганизма.
10. Способ получения D-тагатозы, включающий культивирование микроорганизма по любому из пп.5-7, с реагированием раствора, содержащего D-галактозу, с источником ионов металла в присутствии микроорганизма.
11. Способ по п.10, где источник ионов металла, выбирают из группы, состоящей из хлорида марганца, хлорида магния и хлорида цинка, в присутствии микроорганизма.
12. Способ по п.11, где хлорид марганца добавляют в концентрации 0,1-10 мМ.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2014/001789 WO2014137148A1 (ko) | 2013-03-06 | 2014-03-05 | 향상된 전환 활성을 가지는 l-아라비노스 이성화효소 변이체 및 이를 이용한 d-타가토스의 생산 방법 |
| KRPCT/KR2014/001789 | 2014-03-05 | ||
| PCT/KR2014/003658 WO2015133678A1 (ko) | 2014-03-05 | 2014-04-25 | 향상된 전환 활성을 가지는 l-아라비노스 이성화효소 변이체 및 이를 이용한 d-타가토스의 생산 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016135530A RU2016135530A (ru) | 2018-04-25 |
| RU2671087C2 true RU2671087C2 (ru) | 2018-10-29 |
Family
ID=54062541
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016135530A RU2671087C2 (ru) | 2014-03-05 | 2014-04-25 | Варианты l-арабинозоизомеразы с улучшенной превращающей активностью и способ получения d-тагатозы с их применением |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9593321B2 (ru) |
| EP (1) | EP3115453B1 (ru) |
| KR (2) | KR101721396B1 (ru) |
| CN (1) | CN106062188B (ru) |
| DK (1) | DK3115453T3 (ru) |
| PL (1) | PL3115453T3 (ru) |
| RU (1) | RU2671087C2 (ru) |
| WO (1) | WO2015133678A1 (ru) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9593321B2 (en) * | 2014-03-05 | 2017-03-14 | Cj Cheiljedang Corporation | L-arabinose isomerase variants with improved conversion activity and method for production of D-tagatose using them |
| WO2018117773A2 (ko) * | 2016-12-23 | 2018-06-28 | 경북대학교 산학협력단 | 변형된 당 대사 경로를 갖는 재조합 균주 및 이를 이용한 당이성화 효소의 스크리닝 방법 |
| WO2019166514A1 (en) | 2018-02-28 | 2019-09-06 | C-Lecta Gmbh | Enzymatic in-situ fortification of food with functional carbohydrates |
| CN110904087B (zh) * | 2019-12-28 | 2021-05-11 | 浙江工业大学 | L-阿拉伯糖差向异构酶突变体及其应用 |
| CN110951717B (zh) * | 2019-12-28 | 2023-08-18 | 浙江工业大学 | 一种l-阿拉伯糖异构酶异构体及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004007738A1 (en) * | 2002-07-12 | 2004-01-22 | Tongyang Confectionery Co. | Optimization method for preparation of tagatose by thermostable isomerase isomerase |
| KR20100016948A (ko) * | 2008-08-05 | 2010-02-16 | 씨제이제일제당 (주) | 효소 활성이 향상된 아라비노스 이성화효소 변이체 |
| RU2451688C2 (ru) * | 2008-01-28 | 2012-05-27 | СиДжей ЧЕЙЛДЖЕЙДАНГ КОРПОРЕЙШН | Способ получения тагатозы с использованием олигосахарида сои |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002050282A1 (en) * | 2000-12-19 | 2002-06-27 | Tongyang Confectionery Co. | Novel thermostable galactose isomerase and tagatose production thereby |
| WO2002052021A1 (en) * | 2000-12-22 | 2002-07-04 | Yu Ryang Pyun | Thermostable l-arabinose isomerase and process for preparing d-tagatose thereby |
| US6991923B2 (en) * | 2001-07-16 | 2006-01-31 | Arla Foods Amba | Process for manufacturing of tagatose |
| US7052898B2 (en) * | 2001-07-16 | 2006-05-30 | Bioneer A/S | Thermostable isomerase and use hereof, in particular for producing tagatose |
| US20100173366A1 (en) * | 2004-12-29 | 2010-07-08 | Centre Of Biotechnology Of Safx | Polypeptides Having L-Arabinose Isomerase Activity Exhibiting Minimum Dependence on Metal Ions for Its Activity and for Thermostability and Nucleic Acids Encoding the Same |
| KR100872694B1 (ko) * | 2006-11-27 | 2008-12-10 | 씨제이제일제당 (주) | 코리네박테리움 속 균주로부터 발현된 아라비노스이성화효소 및 그를 이용한 타가토스의 제조방법 |
| ES2542506T3 (es) * | 2007-11-23 | 2015-08-06 | Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) | L-arabinosa-isomerasa para la conversión de D-galactosa en D-tagatosa en un producto lácteo que contiene D-galactosa |
| WO2013150069A1 (en) * | 2012-04-04 | 2013-10-10 | Nutrilab N.V. | Improved galactose isomerases and use thereof in the production of tagatose |
| KR20140111093A (ko) * | 2013-03-06 | 2014-09-18 | 씨제이제일제당 (주) | 향상된 전환 활성을 가지는 l-아라비노스 이성화효소 변이체 및 이를 이용한 d-타가토스의 생산 방법 |
| US9593321B2 (en) | 2014-03-05 | 2017-03-14 | Cj Cheiljedang Corporation | L-arabinose isomerase variants with improved conversion activity and method for production of D-tagatose using them |
-
2014
- 2014-04-25 US US15/112,232 patent/US9593321B2/en active Active
- 2014-04-25 EP EP14884327.9A patent/EP3115453B1/en active Active
- 2014-04-25 DK DK14884327.9T patent/DK3115453T3/en active
- 2014-04-25 RU RU2016135530A patent/RU2671087C2/ru active
- 2014-04-25 KR KR1020177002316A patent/KR101721396B1/ko active IP Right Grant
- 2014-04-25 CN CN201480076841.9A patent/CN106062188B/zh active Active
- 2014-04-25 KR KR1020147030959A patent/KR101704890B1/ko active IP Right Grant
- 2014-04-25 PL PL14884327T patent/PL3115453T3/pl unknown
- 2014-04-25 WO PCT/KR2014/003658 patent/WO2015133678A1/ko active Application Filing
-
2017
- 2017-01-24 US US15/413,960 patent/US9896705B2/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004007738A1 (en) * | 2002-07-12 | 2004-01-22 | Tongyang Confectionery Co. | Optimization method for preparation of tagatose by thermostable isomerase isomerase |
| RU2451688C2 (ru) * | 2008-01-28 | 2012-05-27 | СиДжей ЧЕЙЛДЖЕЙДАНГ КОРПОРЕЙШН | Способ получения тагатозы с использованием олигосахарида сои |
| KR20100016948A (ko) * | 2008-08-05 | 2010-02-16 | 씨제이제일제당 (주) | 효소 활성이 향상된 아라비노스 이성화효소 변이체 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| OH H.J. et al. Increase in D-tagatose production rate by site-directed mutagenesis of L-arabinose isomerase from Geobacillus thermodenitrificans. Biotechnology Letters, 2006. * |
| OH H.J. et al. Increase in D-tagatose production rate by site-directed mutagenesis of L-arabinose isomerase from Geobacillus thermodenitrificans. Biotechnology Letters, 2006. RHIMI M. et al. Probing the essential catalytic residues and substrate affinity in the thermoactive Bacillus stearothermophilus US100 L-arabinose isomerase by site-directed mutagenesis. Journal of Bacteriology, 2007. * |
| RHIMI M. et al. Probing the essential catalytic residues and substrate affinity in the thermoactive Bacillus stearothermophilus US100 L-arabinose isomerase by site-directed mutagenesis. Journal of Bacteriology, 2007. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3115453A4 (en) | 2017-07-19 |
| WO2015133678A1 (ko) | 2015-09-11 |
| CN106062188A (zh) | 2016-10-26 |
| KR20150113811A (ko) | 2015-10-08 |
| US9593321B2 (en) | 2017-03-14 |
| US20170137856A1 (en) | 2017-05-18 |
| US9896705B2 (en) | 2018-02-20 |
| KR101704890B1 (ko) | 2017-02-09 |
| KR20170015530A (ko) | 2017-02-08 |
| US20160333335A1 (en) | 2016-11-17 |
| DK3115453T3 (en) | 2018-08-06 |
| PL3115453T3 (pl) | 2018-11-30 |
| EP3115453B1 (en) | 2018-06-27 |
| RU2016135530A (ru) | 2018-04-25 |
| KR101721396B1 (ko) | 2017-04-10 |
| EP3115453A1 (en) | 2017-01-11 |
| CN106062188B (zh) | 2019-11-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2770464C1 (ru) | Новая аденилосукцинат-синтетаза и способ получения нуклеотидов пурина с ее использованием | |
| US9896705B2 (en) | L-arabinose isomerase variants with improved conversion activity and method for production of D-tagatose using them | |
| CN102597232B (zh) | 变异型酶的设计法、制备方法和变异型酶 | |
| KR20080047844A (ko) | 코리네박테리움 속 균주로부터 발현된 아라비노스이성화효소 및 그를 이용한 타가토스의 제조방법 | |
| WO2016119230A1 (en) | Expression of klebsiella oxytoca polypeptides involved in lysine decarboxylation, and methods and applications thereof | |
| US20050158818A1 (en) | Cephalosporin C acylases | |
| Wu et al. | Identification and characterization of GDP-d-mannose 4, 6-dehydratase and GDP-l-fucose synthetase in a GDP-l-fucose biosynthetic gene cluster from Helicobacter pylori | |
| KR101627921B1 (ko) | 알돌레이즈 돌연변이체 및 이를 이용한 타가토스 생산 방법 | |
| RU2730602C2 (ru) | Новая полифосфат-зависимая глюкокиназа и способ получения глюкозо-6-фосфата с ее использованием | |
| JP4815219B2 (ja) | 好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素遺伝子を含有するｄｎａ、組み換え体ｄｎａ、および好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素の製造法 | |
| KR20180132408A (ko) | 사이코스 에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스의 제조 방법 | |
| Yi et al. | Cloning of dextransucrase gene from Leuconostoc citreum HJ-P4 and its high-level expression in E. coli by low temperature induction | |
| ES2678022T3 (es) | Variante de L-arabinosa isomerasa para producir D-tagatosa | |
| KR20190068470A (ko) | 신규한 사이코스-6-인산 탈인산효소, 상기 효소를 포함하는 사이코스 생산용 조성물, 상기 효소를 이용하여 사이코스를 제조하는 방법 | |
| KR20170116979A (ko) | 과당 6-인산으로부터 타가토스 6-인산으로의 전환 활성을 가진 락토바실러스 플란타룸에서 분리한 과당 1,6-이인산 알돌레이즈 및 이를 이용한 타가토스 생산 방법 | |
| KR20230006803A (ko) | 미생물 공정을 통한 nmn 및 이의 유도체 생산 | |
| KR101940785B1 (ko) | 써모토가 페트로필라 유래의 헥수론산 c4-에피머화 변이체 효소 및 이의 용도 | |
| KR101280030B1 (ko) | 이중 조효소 특이성을 갖는 리비톨 탈수소화효소 및 그의 용도 | |
| CN113302299A (zh) | 阿洛酮糖差向异构酶变体、其生产方法以及使用其生产阿洛酮糖的方法 | |
| CN115052976B (zh) | 新型乙酰羟酸合酶变体和包括其的微生物 | |
| JP7445947B2 (ja) | アラビノースイソメラーゼ変異体 | |
| KR20170116978A (ko) | 비피도박테리움 롱검 균주 유래의 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 유효성분으로 함유하는 프럭토스 6-포스페이트로부터 인산화 타가토스를 생산하기 위한 조성물 | |
| KR20050051055A (ko) | 더머스 칼도필러스 ｇｋ24 균주 유래의 알파-글루칸포스포릴라제, 재조합 균주를 이용한 상기 효소의제조방법 및 상기 효소를 이용한알파--디-포도당-1-인산염의 합성방법 | |
| KR100941304B1 (ko) | 신규 뉴클레오시드 하이드롤라제ⅰ | |
| JP2023554112A (ja) | 熱安定性に優れたアルロースエピマー化酵素変異体、その製造方法およびこれを用いたアルロースの製造方法 |