CN114616328A - 新型的果糖-4-差向异构酶以及使用其制备塔格糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种具有塔格糖转化活性的果糖‑4‑差向异构酶变体以及使用其制备塔格糖的方法。
Description
技术领域
本申请涉及一种具有增强的转化活性或稳定性的果糖-4-差向异构酶变体以及使用其制备塔格糖的方法。
背景技术
塔格糖的天然甜味与蔗糖几乎无法区分，并且其物理性质也与糖相似。塔格糖是一种天然甜味剂，其少量存在于诸如牛奶、奶酪、可可的食物，以及诸如苹果和橘子的天然甜水果中。塔格糖的热量值为1.5kcal/g，为蔗糖的三分之一，血糖指数(Glycemic index，GI)为3，为蔗糖的5％。塔格糖具有多种健康益处，同时有类似于蔗糖的甜味，因此，能够作为同时满足口感和健康的替代甜味剂而应用于多种产品。
常规已知的塔格糖制备方法包括使用半乳糖作为主要原料的化学方法(催化反应)和生物方法(异构化酶反应)(参见韩国专利公开号2009-0082774)。为了经济地获得作为反应原料的半乳糖，已对含有半乳糖的各种基础原料以及使用其获得半乳糖和制备塔格糖的方法进行了研究。获得半乳糖的常用基础原料是乳糖，但由于取决于全球市场上原料奶和乳糖的产量、需求和供应，乳糖或含乳糖产品的价格不稳定，因此，塔格糖生产原料的稳定供应受到限制。因此，需要一种能够以普通简单糖(蔗糖、葡萄糖、果糖等)来制备塔格糖的新方法。
同时，已知塔格糖-二磷酸醛缩酶以D-塔格糖1,6-二磷酸为底物，生成磷酸甘油酮和D-甘油醛3-磷酸，参与半乳糖代谢。然而，虽然没有关于塔格糖-二磷酸醛缩酶是否表现出产生塔格糖的活性的研究，但韩国专利公开号2018-0111678已经证实塔格糖-二磷酸醛缩酶具有将果糖转化为塔格糖的功能。
发明内容
技术问题
本发明人发现了一种新型修饰蛋白，其在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代，并证实所述修饰蛋白表现出SEQ ID NO:1的野生型的转化活性，或与野生型相比，表现出增强的转化活性或稳定性，并提高了塔格糖的生产能力，从而完成本发明。
技术方案
本申请的一个目的是提供一种果糖-4-差向异构酶变体，其包含氨基酸序列，其中对应SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N-末端位置97、124、367和390的氨基酸残基被其他氨基酸取代。
本申请的另一个目的是提供编码本申请的果糖-4-差向异构酶变体的多核苷酸。
本申请的另一个目的是提供一种包含本申请的多核苷酸的载体。
本申请的另一个目的是提供一种微生物，其包含本申请的变体、本申请的多核苷酸或本申请的载体。
本申请的另一个目的是提供一种用于制备塔格糖的组合物，其包含本申请的果糖-4-差向异构酶变体；微生物，其包含本申请的变体、本申请的多核苷酸，或本申请的载体；或者本申请的微生物的培养物。
本申请的另一个目的是提供一种制备塔格糖的方法，所述方法包括：(a)使本申请的果糖-4-差向异构酶变体；微生物，其包含本申请的变体、本申请的多核苷酸，或本申请的载体；或者本申请的微生物的培养物与果糖接触；和(b)将果糖转化为塔格糖。
有益效果
本申请的果糖-4-差向异构酶变体可以工业化规模制备塔格糖，其表现出优异性能，并将果糖(一种普通糖)转化为塔格糖，因此具有高经济效益。
附图说明
图1是HPLC色谱结果，其显示本申请的T124W_N97Y_N367V_T390R(CJ_KO_F4E)变体表现出果糖-4-差向异构酶活性；和
图2和3是测量选定变体在60℃下随时间变化的热稳定性结果。
具体实施方式
本申请的配置和效果将在下文中详细描述。同时，本申请中所公开的每个描述和实施方案可以应用于其他描述和实施方案。即，本申请所公开的各种要素的所有组合均落入本申请的范围内。另外，本申请的范围不受限于以下的具体描述。
为了实现本申请目的，本申请一方面提供一种果糖-4-差向异构酶变体，其包含氨基酸序列，其中对应SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N-末端位置97、124、367和390的氨基酸残基被其他氨基酸取代。
如本文所用，术语“果糖-4-差向异构酶”是表现出果糖-4-差向异构化活性的酶，其将果糖的第4碳位置差向异构化，将果糖转化为塔格糖。对于本申请目的而言，果糖-4-差向异构酶可以包括没有限制的任何酶，只要其是能够以果糖为底物产生塔格糖的酶，并且塔格糖-二磷酸醛缩酶或塔格糖-二磷酸醛缩酶II类辅助蛋白，EC 4.1.2.40，在已知数据库KEGG(京都基因和基因组百科全书)中，可以包括在果糖-4-差向异构酶中，只要其表现出将作为底物的果糖转化为塔格糖的活性。塔格糖-二磷酸醛缩酶已知为一种酶，其使用D-塔格糖1,6-二磷酸作为底物产生磷酸甘油酮和D-甘油醛3-磷酸，如下面的[反应式1]所示。
[反应式1]
D-塔格糖1,6-二磷酸<＝>磷酸甘油酮+D-甘油醛3-磷酸
此外，塔格糖-6-磷酸激酶(EC 2.7.1.144)可以包括在果糖-4-差向异构酶中，只要其表现出将作为底物的果糖转化为塔格糖的活性。塔格糖-6-磷酸激酶已知为一种酶，其使用ATP和D-塔格糖6-磷酸作为底物来产生ADP和D-塔格糖1,6-二磷酸，如下面的[反应式2]中所示。
[反应式2]
ATP+D-塔格糖6-磷酸<＝>ADP+D-塔格糖1,6-二磷酸
关于果糖-4-差向异构酶的活性，作为底物的果糖向塔格糖的转化率(转化率＝塔格糖重量/初始果糖重量×100)为0.01％或更多，具体地为0.1％或更多，更具体地为0.3％或更多。更具体地，转化率可以在0.01％至100％的范围内、0.3％至100％的范围内、0.1％至50％的范围内或0.3％至100％的范围内。
SEQ ID NO:1的氨基酸序列可以从NCBI的GenBank或已知数据库KEGG(京都基因与基因组百科全书)获得。例如，SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可以来源于Kosmotogaolearia，更具体地，可以是多肽/蛋白，其包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，但不限于此。SEQ ID NO:1的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其具有70％或更高同源性或相同性的氨基酸序列，并表现出对应本申请的果糖-4-差向异构酶活性的效力，但不限于此。具体地，氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列和与SEQ ID NO:1具有70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同源性或相同性的氨基酸序列，并表现出对应本申请的果糖-4-差向异构酶活性的效力。显然，具有氨基酸序列的蛋白，其中一些序列缺失、修饰、取代或添加，也包括在本申请的范围内，只要其是具有上述同源性或相同性的氨基酸序列，并表现出对应所述果糖-4-差向异构酶的效力。
换言之，即使在本申请中将其描述为“具有特定SEQ ID NO所示氨基酸序列的蛋白、酶或多肽”，显然，具有氨基酸序列的蛋白，其中一些序列缺失、修饰、取代、保守取代或添加，也可用于本申请，只要其表现出与由相应SEQ ID NO的氨基酸序列组成的蛋白的活性相同或对应的活性。例如，显然，不排除在所述氨基酸序列之前或之后添加不改变蛋白功能的序列、天然存在的突变、其沉默突变或保守取代，并且具有氨基酸序列的蛋白，其具有上述的序列添加或突变，也落入本申请的范围内，只要所述蛋白表现出与修饰的蛋白相同或相应的活性。
如本文所用，术语“塔格糖”是单糖中的一种己酮糖，并且可与“D-塔格糖”互换使用。
本申请的“对应位置N的氨基酸残基”可以包括在位置N的氨基酸残基和对应位置N的氨基酸残基。具体地，对应位置N的氨基酸残基可以包括在特定氨基酸序列中公开的成熟多肽中对应任意氨基酸残基的氨基酸位置。具体的氨基酸序列可以是SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
对应位置N的氨基酸残基或在特定氨基酸序列中公开的成熟多肽中对应任意氨基酸残基的氨基酸位置可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)进行确定，具体地是在EMBOSS软件包的Needle程序中执行的5.0.0或更高版本(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276–277)。使用的参数可以是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)置换矩阵。
对应位置N的氨基酸残基或在特定氨基酸序列中公开的成熟多肽中对应任意氨基酸残基的氨基酸位置的氨基酸残基可以使用多个多肽序列的比对进行确定，但不限于，几个使用各自默认参数的计算机程序，其包括通过对数期望进行的多序列比较(MUSCLE；3.5版或更高版本)；Edgar,2004,Nucleic Acids Research 32:1792–1797,MAFFT(6.857版或更高版本)；Katoh and Kuma,2002,Nucleic Acids Research 30:3059–3066；Katoh etal.,2005,Nucleic Acids Research 33:511–518；Katoh and Toh,2007,Bioinformatics23:372–374；Katoh et al.,2009,Methods in Molecular Biology 537:39–64；Katoh andToh,2010,Bioinformatics 26:1899–1900和EMBOSS EMMA使用ClustalW(1.83或更高版本)；以及Thompson et al.,1994,Nucleic Acids Research 22:4673–4680。
当其他多肽偏离特定氨基酸序列的成熟多肽时，传统的基于序列的比较无法检测到它们的关系(Lindahl and Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613–615)，可以使用其他成对序列比较算法。使用多肽家族概率图(配置文件)搜索程序进行数据库搜索可以在基于序列的搜索中实现更高的灵敏度。例如，PSI-BLAST程序可以通过迭代数据库搜索过程计算配置文件并检测远距离同源物(Atschul et al.,1997,Nucleic Acids Res.25:3389–3402)。如果多肽家族或超家族在蛋白结构数据库中有一个或多个标示，则甚至可以实现更高的灵敏度。诸如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.287:797–815；McGuffin and Jones,2003,Bioinformatics 19:874–881)的程序使用来自各种来源的信息(PSI-BLAST、二级结构预测、对齐配置文件和溶解潜力)作为预测所查询序列的结构折叠的神经网络输入。类似地，文献(Gough et al.,2000,J.Mol.Biol.313:903–919)方法可用于将未知结构的序列与SCOP数据库中存在的超家族模型进行比对。上述比对又可以用于创建多肽的同源性、相似性或相同性模型，并且上述模型的准确性可以使用为此目的开发的各种工具进行评估。
本申请的“其他氨基酸”没有限制，只要其与各位置对应的氨基酸不同。“氨基酸”根据侧链的性质分为酸性、碱性、极性(亲水性)和非极性(疏水性)四种。
具体地，本申请的其他氨基酸可以是选自以下的一种或多种氨基酸：非极性氨基酸甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和脯氨酸(P)；极性氨基酸丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；酸性氨基酸天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；以及碱性氨基酸赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)，但不限于此。
更具体地，本申请的其他氨基酸可以选自非极性氨基酸、极性氨基酸和碱性氨基酸，并且非极性氨基酸、极性氨基酸和碱性氨基酸可以选自酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、缬氨酸(V)和精氨酸(R)，但其他氨基酸不限于此。例如，对应位置97的氨基酸残基可以是天冬酰胺(N)被酪氨酸(Y)取代但不限于此，对应位置124的氨基酸残基可以是苏氨酸(T)被色氨酸(W)取代但不限于此，对应位置367的氨基酸残基可以是天冬酰胺(N)被缬氨酸(V)取代但不限于此，对应位置390的氨基酸残基可以是苏氨酸(T)被精氨酸(R)取代但不限于此。本申请的变体可以包括氨基酸序列，其中氨基酸序列中的对应选自位置158、321、210、239和318的一个或多个位置的氨基酸残基被其他氨基酸额外取代，其中对应包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果糖-4-差向异构酶N-末端位置97、124、367和390的氨基酸残基被其他氨基酸取代，但不仅限于此。此外，本申请的变体可以包括氨基酸序列，其中氨基酸序列中的对应选自位置210、239和318的一个或多个位置的氨基酸残基被其他氨基酸额外取代，其中对应包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果糖-4-差向异构酶N-末端位置97、124、367和390以及位置158和/或位置321的氨基酸残基被其他氨基酸取代，但不仅限于此。
对应选自位置158、321、210、239和318的一个或多个位置的氨基酸残基可以被非极性氨基酸、极性氨基酸、酸性氨基酸或碱性氨基酸取代，具体地可以被选自以下的氨基酸取代：谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、甲硫氨酸(M)、精氨酸(R)、亮氨酸(L)、天冬酰胺(N)、异亮氨酸(I)和赖氨酸(K)，但不限于此。更具体地，对应位置158的氨基酸可以被非极性氨基酸、极性氨基酸、酸性氨基酸或碱性氨基酸取代，并且可以被谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、甲硫氨酸(M)、精氨酸(R)或亮氨酸(L)取代。对应位置321的氨基酸可以被非极性氨基酸、酸性氨基酸或碱性氨基酸取代，并且可以被甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)或亮氨酸(L)取代。对应位置210的氨基酸可以被极性氨基酸取代，更具体地，可以被半胱氨酸(C)取代。对应位置239的氨基酸可以被碱性氨基酸取代，并且可以被赖氨酸(K)取代，但不限于此。位置318的氨基酸可以被非极性氨基酸取代，并且可以被甘氨酸(G)取代。
本申请的果糖-4-差向异构酶变体可以包括氨基酸序列，其不同于所述一个或多个氨基酸残基的保守取代和/或修饰的氨基酸序列，而是对应特定位置(例如，选自SEQ IDNO:1的氨基酸序列N-末端的位置97、124、367和390以及位置158、321、210、239和318)的氨基酸残基被另一氨基酸残基取代，但保持果糖-4-差向异构酶的功能或性质。
如本文所用，术语“保守取代”是指用表现出相似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代一个氨基酸。例如，变体可以具有一个或多个保守取代，同时仍保留一种或多种生物学活性。保守取代对所得多肽的活性影响很小或没有影响。
上述特定位置氨基酸以外的一个或多个氨基酸发生突变的突变体可以包括对多肽的性质和二级结构影响最小的氨基酸的缺失或添加。例如，多肽可以在蛋白的N末端与信号(或前导)序列偶联，所述蛋白以共翻译或翻译后的方式参与蛋白的转移。多肽可以与其他序列或连接子偶联，以实现多肽的鉴定、纯化或合成。
对于本申请的目的，与野生型相比，果糖-4-差向异构酶变体表现出增强的转化活性或稳定性。
术语“转化活性”是指使D-果糖(果糖)的第4碳位置差向异构化并将D-果糖转化为塔格糖，并且术语“稳定性”是指作为表现出高耐热性的酶表现出热稳定性。
具体地，与包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型果糖-4-差向异构酶相比，本申请的果糖-4-差向异构酶变体表现出使D-果糖(果糖)的第4碳位置差向异构化并将D-果糖转化为塔格糖的增强活性。
例如，本申请的果糖-4-差向异构酶变体可以是表现出高耐热性的酶。具体地，本申请的果糖-4-差向异构酶变体在50℃至70℃下可以表现出的活性为最大活性的50％至100％、60％至100％、70％至100％或75％至100％。更具体地，本申请的果糖-4-差向异构酶变体在55℃至60℃、60℃至70℃、55℃、60℃或70℃下可表现出的活性为最大活性的80％至100％或85％至100％。
果糖-4-差向异构酶变体可以是，例如表3至6中所列变体，但不限于此。
本申请的另一方面是提供一种编码本申请的果糖-4-差向异构酶变体的多核苷酸，或包含本申请的多核苷酸的载体。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指作为核苷酸聚合物的特定长度或更长的DNA或RNA链，其中核苷酸单体以长链形状共价连接，更具体地，是指编码修饰蛋白的多核苷酸片段。
编码本申请的果糖-4-差向异构酶变体的多核苷酸可以包括没有限制的任何多核苷酸，只要其是编码本申请的果糖-4-差向异构酶变体的多核苷酸序列。例如，编码本申请的果糖-4-差向异构酶变体的多核苷酸可以是编码本申请的变体中包含的氨基酸序列的多核苷酸序列，但不限于此。在多核苷酸中，由于密码子具有简并性或考虑到生物体中优选密码子而要在本申请的酶变体的氨基酸序列不变的范围内表达本申请的酶变体，所以可以对编码区进行各种修饰。因此，显然，由于密码子简并性，还可以包括可以翻译成包括在本申请的变体中的氨基酸序列或与其具有同源性或相同性的氨基酸序列的多核苷酸。
可以包括与探针杂交的编码果糖-4-差向异构酶变体的任何序列，但不限于此，所述探针可以由已知基因序列制备，例如，由在严格条件下与本申请的多核苷酸的全部或部分核酸序列的互补序列。
“严格条件”是指能够在多核苷酸之间特异性杂交的条件。上述条件具体请参见文献(参见Sambrook et al.,supra,9.50–9.51,11.7–11.8)。其实例包括基因具有高度同源性或相同性的条件，即，具有70％或更多、80％或更多、85％或更多、具体地90％或更多、更具体地95％或更多、仍然更具体地97％或更高，以及特别具体地99％或更高同源性或者相同性的基因彼此杂交，并且具有低于上述同源性或相同性的基因彼此不杂交，或如下条件：进行洗涤一次，具体地在对应60℃、1 X SSC和0.1％SDS，具体地60℃、0.1 X SSC和0.1％SDS，以及更具体地68℃、0.1 X SSC和0.1％SDS的盐溶液浓度和温度下洗涤2至3次，上述为常规Southern杂交的洗涤条件。
杂交需要两种核酸具有互补序列，尽管碱基之间的错配可能取决于杂交的严格程度。术语“互补”用于描述能够相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，以及胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本申请还可以包括分离的核酸片段，其与基本上相似的核酸序列以及整个序列互补。
具体地，具有同源性或相同性的多核苷酸可以使用杂交条件，其包括Tm值为55℃的杂交步骤，和使用上述条件进行检测。Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且本领域技术人员可以根据目的适当调整。
用于杂交多核苷酸的合适的严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且所述参数是本领域已知的(例如，J.Sambrook et al.,supra)。
如本文所用，术语“同源性”或“相同性”是指两个给定的氨基酸序列或核酸序列彼此相关的程度并且可以表示为百分比。
术语“同源性”和“相同性”通常可以互换使用。
保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或相同性由标准比对算法确定，并且可以与所使用的程序所建立的默认空位罚分一起使用。基本上，通常在中等或高度严格条件下，同源或相同序列相互杂交，整个序列的整体上约50％、60％、70％、80％或90％或更多或者全长序列杂交。关于杂交，还考虑了在多核苷酸中包含简并密码子而非密码子的多核苷酸。
任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或相同性可以通过已知的计算机算法例如“FASTA”程序(Pearson et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444)使用默认参数来确定。或者，也可以通过Needleman-Wunsch算法(Needleman andWunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)，其通过使用EMBOSS软件包的Needleman程序进行(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276-277)(5.0.0版或之后的版本)对同源性、相似性或相同性进行确定(包括GCG程序包(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research 12:387(1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul,S.F.et al.,J MOLEC BIOL 215:403(1990)；Guide toHuge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994，以及CARILLOet al.(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，国家生物技术信息中心的BLAST或ClustalW可用于确定同源性、相似性或相同性。
多核苷酸或多肽的同源性、相似性或相同性可以通过使用例如GAP计算机程序，例如在Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中公开的Needleman et al.(1970),J Mol Biol.48:443，进行序列比对来确定。总之，GAP程序将同源性、相似性或相同性定义为通过用相似比对的符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短者的符号的总数而获得的值。GAP程序的默认参数可以包括(1)一元比较矩阵(其包含的数值对于相同为1，对于不相同为0)；以及在Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas of ProteinSequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358,1979中描述的Gribskov et al.(1986),Nucl.Acids Res.14:6745(或EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)的加权比较矩阵；(2)每个空位罚分3.0，对于每个符号的每个空位另加0.10罚分(或空位开放罚分10和空位扩展罚分0.5)；以及(3)末端空位不罚分。因此，如本文所用，术语“同源性”或“相同性”是指序列之间的相关性。
如本文所用，术语“载体”是指一种DNA制备物，其含有编码靶修饰蛋白的多核苷酸的核酸序列，其可操作地连接到合适的控制序列，使得靶修饰蛋白可以在合适的宿主中表达。控制序列可以包括能够启动转录的启动子、用于调节上述转录的任意操纵子序列、合适的mRNA核糖体结合位点以及用于控制转录和翻译终止的序列。在转化到合适的宿主细胞中后，载体可以独立于宿主基因组进行复制或发挥作用，并且可以整合到基因组本身中。
本申请中使用的载体没有特别限制，只要其能够在宿主细胞中复制，并且可以使用本领域已知的任意载体。常用载体的例子包括天然或重组状态的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等作为噬菌体载体或粘粒载体，并且可以使用pBR系统、pUC系统、pBluescriptII系统、pGEM系统、pTZ系统、pCL系统、pET系统等作为质粒载体。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等。
例如，编码靶修饰蛋白(或酶变体)的多核苷酸可以通过用于细胞内染色体插入的载体对染色体中突变的多核苷酸进行替换。染色体的多核苷酸插入可以通过本领域已知的任意方法进行，例如同源重组，但不限于此。载体可以进一步包括选择标记，其用于确定载体是否插入染色体。选择标记被用于选择用载体转化的细胞，即，确认是否插入了靶核酸分子，以及使用的标记具有可选择表型如耐药性、营养缺陷型、细胞毒性剂抗性或表面修饰蛋白表达。在用选择剂处理的环境中，只有表达选择标记的细胞才能存活或表现出其他表达特征，从而可以选择转化的细胞。本申请可以提供一种产生塔格糖的微生物，其包含所述修饰蛋白或编码所述修饰蛋白的多核苷酸。具体地，包含修饰蛋白和/或编码修饰蛋白的多核苷酸的微生物可以是用包含编码修饰蛋白的多核苷酸的载体转化制备的微生物，但不限于此。
在本申请中，术语“转化”是指将包含编码靶蛋白的多核苷酸(即本申请的变体)的载体引入宿主细胞，使得所述多核苷酸编码的蛋白可以在宿主细胞中表达。转化的多核苷酸可以包括所有的多核苷酸，无论多核苷酸是通过插入宿主细胞的染色体中定位还是定位在染色体外，只要它们可以在宿主细胞中表达。多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式引入，只要它可以引入宿主细胞并在宿主细胞中表达。例如，可以将多核苷酸以表达盒的形式引入宿主细胞，表达盒是一种基因构建体，包括自我表达所必需的所有元件。表达盒通常可以包括与多核苷酸可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。多核苷酸可以以其自身的形式引入宿主细胞并且可操作地连接到在宿主细胞中表达所必需的序列，但不限于此。
如上文所用，术语“可操作地连接”是指启动子序列，其启动和介导编码本申请的靶修饰蛋白的多核苷酸的转录，和基因序列在功能上彼此连接。
本申请的另一方面是提供一种微生物，其包含本申请的果糖-4-差向异构酶变体、编码本申请的果糖-4-差向异构酶变体的多核苷酸、或包含本申请的多核苷酸的载体。
本申请的微生物可以是产生所述果糖-4-差向异构酶变体或塔格糖的微生物。
如本文所用，术语“包含果糖-4-差向异构酶变体的微生物”可以指经重组以表达本申请的果糖-4-差向异构酶变体的微生物。例如，微生物是指宿主细胞或微生物，其包含编码果糖-4-差向异构酶变体的多核苷酸或用包含编码果糖-4-差向异构酶变体的多核苷酸的载体进行转化，并因此可以表达所述变体。
本申请的果糖-4-差向异构酶变体可以通过将表达本申请变体的DNA转化到如大肠杆菌(E.coli)的菌株中，培养菌株得到培养物，将培养物粉碎，并通过层析柱等纯化粉碎产物获得。转化菌株除大肠杆菌外，还可包括谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，但不限于此。
本申请的微生物可以包括原核微生物和真核微生物，只要其是包含本申请的多核苷酸或本申请的载体并且能够产生本申请的果糖-4-差向异构酶的微生物。例如，本申请的微生物可以包括属于埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗威登斯菌属(Providencia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和短杆菌属(Brevibacterium)的微生物菌株，但不限于此。
除引入多核苷酸或载体以外，本申请的微生物可以包括经由各种已知方法而能够表达本申请的果糖-4-差向异构酶的所有微生物。
本申请的微生物的培养物可以通过在培养基中培养表达本申请的果糖-4-差向异构酶的微生物来制备。
在所述方法中，术语“培养”是指在适当控制的环境条件下培养微生物。微生物的培养过程没有特别限定，但可以通过已知的分批培养、连续培养或补料分批培养的方法等进行。此时，培养条件没有特别限制，但可使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)来将培养物的pH调节到合适的pH(例如，pH 5至9，具体地，pH 6至8，以及更具体地pH 6.8)，可以向培养物中注入氧气或含氧的气体混合物以保持培养物的有氧状态。培养温度可以维持在20℃至45℃，具体地可以维持在25℃至40℃，微生物可以培养约10至160小时，但培养条件不限于此。
此外，作为用于培养基中的碳源，可以单独或组合使用糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油脂和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)和有机酸(例如，乙酸)等，但不限于此。作为用于培养基中的氮源，可以单独或组合使用含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等，但不限于此。作为用于培养基中的磷源，可以单独或组合使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、其相应的含钠盐等，但不限于此。培养基可以包含必需的促生长物质，例如其他金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素。
本申请的另一方面提供了一种用于制备塔格糖的组合物，其包含本申请的果糖-4-差向异构酶变体；微生物，其包含本申请的变体、编码本申请的变体的多核苷酸，或包含本申请的多核苷酸的载体；或者本申请的微生物的培养物。
本申请的用于制备塔格糖的组合物可以进一步包含果糖。
本申请的用于制备塔格糖的组合物可以进一步包含在用于制备塔格糖的组合物中通常使用的任何合适的赋形剂。赋形剂可以是例如防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂或等渗剂，但不限于此。
本申请的用于制备塔格糖的组合物可以进一步包含金属离子或金属盐。在一实施方案中，金属离子或金属盐的金属可以是包括二价阳离子的金属。具体地，本申请的金属可以是镍(Ni)、铁(Fe)、钴(Co)、镁(Mg)或锰(Mn)。更具体地，金属盐可以是NiSO4、NiCl2、FeSO4、MgSO4、MgCl2、CoSO4、MnCl2或MnSO4。
本申请的另一方面提供了一种制备塔格糖的方法，所述方法包括：(a)使本申请的果糖-4-差向异构酶变体；微生物，其包含本申请的变体、编码本申请的变体的多核苷酸，或包含本申请的多核苷酸的载体；或者本申请的微生物的培养物与果糖接触；和(b)将果糖转化为塔格糖。
例如，本申请的接触可以在pH 5.0至pH 9.0的条件下和30℃至80℃的温度条件下和/或进行0.5小时至48小时。
具体地，本申请的接触可以在pH 6.0至pH 9.0条件下或pH 7.0至pH9.0条件下进行。本申请的接触可以在35℃至80℃、40℃至80℃、45℃至80℃、50℃至80℃、55℃至80℃、60℃至80℃、30℃至70℃、35℃至70℃、40℃至70℃、45℃至70℃、50℃至70℃、55℃至70℃、60℃至70℃、30℃至65℃、35℃至65℃、40℃至65℃、45℃至65℃、50℃至65℃、55℃至65℃、30℃至60℃、35℃至60℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或55℃至60℃的温度条件下进行。本申请的接触可以进行0.5小时至36小时、0.5小时至24小时、0.5小时至12小时、0.5小时至6小时、1小时至48小时、1小时至36小时、1小时至24小时、1小时至12小时、1小时至6小时、3小时至48小时、3小时至36小时、3小时至24小时、3小时至12小时、3小时至6小时、6小时至48小时、6小时至36小时、6小时至24小时、6小时至12小时、12小时至48小时、12小时至36小时、12小时至24小时、18小时48小时、18小时至36小时或18小时至30小时。
本申请的接触可以在金属离子或金属盐的存在下进行。可使用的金属与前述相同。
本申请的制备方法可以进一步包括对制备的塔格糖进行分离和/或纯化的步骤。分离和/或纯化可以通过本申请技术领域中常用的方法进行。作为非限制性实例，可以使用透析、沉淀、吸附、电泳、离子交换层析和分级结晶。可以仅通过一种方法或通过两种或更多种方法进行纯化。
本申请的制备方法可以进一步包括在分离和/或纯化步骤之前或者之后进行脱色和/或脱盐的步骤。通过进行脱色和/或脱盐，可以获得质量非常优异的塔格糖。
作为另一实例，本申请的制备方法可以进一步包括在本申请的将果糖转化为塔格糖的步骤、分离和/或纯化步骤、或者脱色和/或脱盐步骤之后进行结晶塔格糖的步骤。结晶可以通过常用的结晶方法进行。例如，可以通过冷却结晶法进行结晶。
本申请的制备方法可以进一步包括在结晶步骤之前进行浓缩塔格糖的步骤。浓缩可以提高结晶效率。
作为另一实例，本申请的制备方法可以进一步包括在本申请的分离和/或纯化步骤之后使未反应的果糖与本申请的酶、表达所述酶的微生物或所述微生物的培养物进行接触的步骤；在本申请的结晶步骤之后重新利用来自分离和/或纯化步骤中分离了晶体的母液的步骤；或其组合。包括额外步骤在经济上是有利的，因为可以获得更高产率的塔格糖并且可以减少果糖的浪费量。
实施例
在下文中，通过实施例更详细地描述本申请。然而，实施例仅用于说明目的，本申请的范围不限于实施例。
实施例1：含有果糖-4-差向异构酶基因的重组表达载体和转化体的构建
实施例1-1：含有果糖-4-差向异构酶基因重组表达载体的构建
所使用的果糖-4-差向异构酶为来自Kosmotoga olearia的酶(以下称为KO)，在韩国专利公开号2018-0111678中已知其表现出将果糖转化为塔格糖的活性。
具体地，果糖-4-差向异构酶基因选自KEGG(京都基因与基因组百科全书)中登记的Kosmotoga olearia基因序列，并基于果糖-4-差向异构酶基因的氨基酸序列(SEQ IDNO:1)和核酸序列(SEQ ID NO:2)，将重组表达载体pBT7-C-His-KO插入能够在大肠杆菌中表达的pBT7-C-His载体，通过BIONEER进行合成和构建。
实施例1-2：KO变体库的构建和活性增强变体的筛选
使用实施例1-1中所选的基因为模板，通过随机诱变构建KO变体库。具体地，使用Diversify随机诱变试剂盒(ClonTech)进行随机诱变，在KO基因中每1000个碱基对诱导2至3个突变。PCR反应条件列于下表1和2中。构建编码KO变体的基因库，随后将其插入大肠杆菌BL21(DE3)。
表1
| 反应溶液组成 | 加入量(μL) |
| PCR级水 | 36 |
| 10X TITANIUM Tag缓冲液 | 5 |
| MnSO4(8mM) | 4 |
| dGTP(2mM) | 1 |
| 50X Diversify dNTP混合物 | 1 |
| 引物混合物 | 1 |
| 模板DNA | 1 |
| TITANIUM Tag Polym | 1 |
表2
将具有含有KO变种基因的pBT7-C-His质粒的大肠杆菌BL21(DE3)接种到装有0.2mL含有氨苄青霉素抗生素的LB液体培养基的深孔培养架中，并在37℃的振荡培养箱中进行接种培养16小时或更长时间。将通过接种培养获得的培养液接种到装有含有LB和乳糖(蛋白表达调节剂)的液体培养基的深孔培养架中，并且进行主培养。接种培养和主培养在振荡速度180rpm、37℃的条件下进行。接着，将主培养液在4,000rpm、4℃下离心20分钟，回收细胞，用于活性试验。
采用能够特异性定量D-果糖的比色法对于所构建的随机诱变库中活性增强的突变酶进行大规模高速筛选。具体地，将70％Folin-Ciocalteu试剂(SIGMA-ALDRICH)和底物反应完成溶液以15:1的比例混合并在80℃下反应5分钟，根据在900nm的OD值测量结果，选出含有野生型酶基因(KO,SEQ ID NO:1)的细胞和含有在相对活性比较中表现出更高活性(从D-果糖转化为D-塔格糖)的变体基因的细胞。其中，选择表现出最高活性的10个菌落并测序鉴定其核酸序列。结果证实，氨基酸残基N末端位置97、124、158、210、239、318、321、367和390发生了突变，变体T124W_N97Y_N367V表现出最高活性。
表3
| 突变位置 | 额外突变 | 与WT(KO)的相对活性(％) |
| T124WN97Y | T210D | 347 |
| T124WN97Y | T210S | 421 |
| T124WN97Y | T210K | 370 |
| T124WN97Y | T210L | 417 |
| T124WN97Y | T210V | 806 |
| T124WN97Y | T210G | 870 |
| T124WN97Y | P318H | 337 |
| T124WN97Y | P318G | 635 |
| T124WN97Y | P318I | 479 |
| T124WN97Y | P318A | 571 |
| T124WN97Y | P318C | 854 |
表4
| 突变位置 | 现有序列 | 突变序列 | 与WT(KO)的相对活性(％) |
| 239 | N | V | 112 |
| G | 242 | ||
| A | 226 | ||
| E | 132 | ||
| K | 215 | ||
| W | 102 | ||
| L | 169 | ||
| P | 139 |
实施例2：突变酶的构建及其活性的比较评估
为了评估实施例1-2中所得到的重组变体T124W_N97Y_N367V在果糖-4-差向异构化中的转化活性，对KO和T124W_N97Y_N367V进行纯化。具体地，将包含KO基因的微生物和包含变体T124W_N97Y_N367V基因的微生物分别接种到装有5mL含有氨苄青霉素抗生素的LB液体培养基的培养管中，并且在37℃的振荡培养箱中进行接种培养，直至600nm处的吸光度达到2.0。将通过接种培养获得的培养液接种到装有含有LB和乳糖(蛋白表达调节剂)的液体培养基的培养瓶中，并进行主培养。接种培养和主培养在振荡速度180r pm、37℃的条件下进行。接着，将主培养液在8,000rpm、4℃下离心20分钟，回收细胞。将回收的细胞用50mMTris-HCl(pH 8.0)缓冲液洗涤2次，并重悬浮在含有10mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液中。将重悬浮的细胞用超声仪粉碎，在13,000rpm，4℃条件下离心20分钟，然后仅取上清液。将上清液通过His-tag亲和层析进行纯化，使含有20mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液以10倍于填料体积的体积量流过，从而去除非特异性结合的蛋白。随后，再使含有250mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液流过，进行洗脱和纯化，然后用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液进行透析，获得每种纯化的酶。
为了测量所获得的纯化酶的果糖-4-差向异构化活性，将50mM Tris-HCl(pH8.0)、3mM MnSO4和2mg/mL的每种酶加入到30重量％果糖中并分别在50℃和60℃温度下反应最长2小时。结果显示，在120min，50℃和60℃的反应条件下，野生型酶(KO)的转化活性分别为4.1％和5.2％，变体的转化活性分别17.3％和23.7％。换言之，与野生型酶(KO)活性相比，变体T124W_N97Y_N367V的活性增加，具体结果如下表5所示。
表5
实施例3：额外突变酶的构建和活性增强突变酶的选择
实施例3-1：定点诱变
实施例1-2中所选的T124W_N97Y_N367V的N末端第390的苏氨酸被精氨酸取代，其通过使用特异性引物进行定点诱变。
具体地，N末端引物(SEQ ID NO:3：AAAGAAATCCCGTTAAGACTTATAAGCCAGTTC)和C末端引物(SEQ ID NO:4：GAACTGGCTTATAAGTCTTAACGGGATTTCTTT)用作引物，其为具有突变的2个互补核酸序列的寡核苷酸。使用质粒DNA作为模板在试管中扩增和合成具有新突变的质粒，然后通过Dpn I限制酶消化去除原始模板DNA。换言之，实施例1-2中所选并用作模板的突变DNA，是从大肠杆菌中分离的DNA，其被识别并切割Gm6 ATC的Dpn I切割，但试管中合成的突变DNA未被切割。将其转化到大肠杆菌DH5α中，获得突变体，然后对突变基因的核酸序列进行分析，确定正确产生突变。换言之，构建了其中总共四个氨基酸序列突变的T124W_N97Y_N367V_T390R变体。将上述变体转化到表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)中，以构建重组菌株大肠杆菌BL21(DE3)_T124W_N97Y_N367V_T390R。
实施例3-2：活性增强突变酶的构建及其活性的比较评估
将实施例3-1中构建的大肠杆菌BL21(DE3)_T124W_N97Y_N367V_T390R接种到装有5mL含有氨苄青霉素抗生素的LB液体培养基的培养管中，在37℃的振荡培养箱中进行接种培养，直至在600nm处的吸光度达到2.0。将通过接种培养获得的培养液接种到装有含有LB和乳糖(蛋白表达调节剂)的液体培养基的培养瓶中，并进行主培养。接种培养和主培养在振荡速度180rpm、37℃的条件下进行。接着，将主培养液在8,000rpm、4℃下离心20分钟，回收细胞。将回收的细胞用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液洗涤2次，并重悬浮在含有10mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液中。将重悬浮的细胞使用超声仪粉碎，在13,000rpm和4℃下离心20分钟，然后仅取上清液。将上清液通过His-tag亲和层析进行纯化，使含有20mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液以10倍于填料体积的体积量流过，从而去除非特异性结合的蛋白。随后，再使含有250mM咪唑和300mM NaCl的50mMNaH2PO4(pH 8.0)缓冲液流过，进行洗脱和纯化，然后用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液进行透析，获得纯化的酶T124W_N97Y_N367V_T390R(以下简称WRVY)，用于酶特性分析。
为了测量所获得的WRVY的果糖-4-差向异构化活性，将50mM Tris-HCl(pH 8.0)、3mM MnSO4和2mg/mL的每种T124W_N97Y_N367V和WRVY加入到30重量％的果糖中并在60℃下反应0.5小时。
结果显示，WRVY的转化率是野生型的8倍或更多。具体结果如下表6所示。
表6
| 0.5H | |
| WT | 2.1 |
| T124W_N97Y_N367V | 13.7 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R(WRVY) | 17.8 |
实施例3-3：饱和诱变
为了利用实施例3-1中构建的变体WRVY来研发在果糖-4-差向异构化转化反应中表现出额外的单位活性增强的突变酶，采用实施例1-2中所选的两个(第158和第321)活性增强位点作为饱和诱变的模板，用于额外构建突变体库。考虑到突变分布多样性和变体产率，使用基于反向PCR的饱和诱变(2014.Anal.Biochem.449:90–98)。为了最小化构建的变体库的筛选规模(最小化饱和诱变过程中引入的密码子数量)，排除终止密码子并设计和采用NDT/VMA/ATG/TGG混合引物与最小化的大肠杆菌稀有密码子(2012.Biotechniques 52:149–158)。具体地，构建和使用的引物总长度为33bp，包括每个位点的前碱基15bp、取代碱基3bp、后碱基15bp。PCR条件为94℃变性2分钟、94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸10分钟，重复30次，接着72℃延伸反应60分钟。为每个选定的氨基酸位点构建饱和诱变库，随机选择每个库的变体(<11个突变)，并分析核酸序列以评估氨基酸突变的分布。根据分析结果，为每个库设定90％或更多序列覆盖率的筛选规模(2003.Nucleic Acids Res.15；31:e30)。
通过饱和诱变构建高活性候选变体，并进行核酸序列分析，确定WRVY中加入的代替位点。通过上述方法，总共获得了18个变体(表7)。
表7
实施例3-4：活性增强突变酶的构建
为了比较评估多位点突变酶的果糖-4-差向异构化活性，将实施例3-3中构建的饱和诱变库基因转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，然后将每种转化微生物接种到装有5mL含有氨苄青霉素抗生素的LB液体培养基的培养管中，在37℃振荡培养箱中进行接种培养，直至600nm处的吸光度达到2.0。将通过接种培养获得的培养液接种到装有含有LB和乳糖(蛋白表达调节剂)的液体培养基的培养瓶中，并进行主培养。接种培养和主培养在振荡速度180rpm、37℃的条件下进行。接着，将主培养液在8,000rpm、4℃下离心20分钟，回收细胞。将回收的细胞用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液洗涤2次，并重悬浮在含有10mM咪唑和300mMNaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液中。将重悬浮的细胞使用超声仪粉碎，在13,000rpm和4℃下离心20分钟，然后仅取上清液。将上清液通过His-tag亲和层析进行纯化，使含有20mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液以10倍于填料体积的体积量流过，从而去除非特异性结合的蛋白。随后，再使含有250mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH8.0)缓冲液流过，进行洗脱和纯化，然后用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液进行透析，获得每种纯化的酶，用于酶特性分析。
实施例4：活性和稳定性增强突变酶的性质比较评估
为了测量实施例3-4中所获得变体的果糖-4-差向异构化活性，将50mM Tris-HCl(pH 8.0)、3mM MnSO4和2mg/mL的每种变体加入到30重量％果糖中并在60℃反应0.5小时。为了测量所获得变体的热稳定性，将每种纯化酶以5mg/mL的浓度加入，酶溶液在60℃下放置最少19小时至最多90小时，然后在冰上放置5分钟，将根据时间取样的酶溶液、50mMTris-HCl(pH 8.0)和3mM MnSO4加入到30重量％果糖中进行酶反应，测量酶的残留活性。
结果显示，所有变体都表现出是野生型酶(KO)最多8倍或更高的转化率。具体结果如下表8所示。此外，60℃的热稳定性研究结果证实，所述变体表现出优于野生型酶(KO)的热稳定性，如图2和3所示。
表8
| 0.5H | |
| WT | 2.5 |
| T124W_N97Y_N367V | 13.9 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R(WRVY) | 17.9 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C158Q(WRVY+C158Q) | 18 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C158H(WRVY+C158H) | 13.3 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C158A(WRVY+C158A) | 17.3 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C158V(WRVY+C158V) | 19 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C158G(WRVY+C158G) | 20 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C158T(WRVY+C158T) | 16.9 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C158E(WRVY+C158E) | 18.9 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C158M(WRVY+C158M) | 19.6 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C158R(WRVY+C158R) | 17.1 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C158L(WRVY+C158L) | 20.1 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C321L(WRVY+C321L) | 19.5 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C321E(WRVY+C321E) | 15.9 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C321N(WRVY+C321N) | 18.0 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C321I(WRVY+C321I) | 15.7 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C321K(WRVY+C321K) | 13.7 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C321A(WRVY+C321A) | 17.1 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C321G(WRVY+C321G) | 16.9 |
| T124W_N97Y_N367V_T390R+C321V(WRVY+C321V) | 16.3 |
本发明人将WRVY转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，制备了名为大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_KO_F4E_WRVY的转化体(转化微生物)，并于2019年7月24日将转化体保藏在布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物培养中心(KCCM)，登录号为KCCM 12567P(E.coliBL21(DE3)/CJ_KO_F4E_WRVY)。
基于以上描述，本领域技术人员会理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，本发明可以以不同的具体形式来体现。因此，应当理解上述的实施方案在所有方面都仅仅是示例性的而非限制性的。本发明的范围由所附的权利要求而非前文的描述所界定。因此，落入权利要求的范围或此范围的等同的所有变化和修改都涵盖在权利要求的范围内。
序列表
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 新型的果糖-4-差向异构酶以及使用其制备塔格糖的方法
<130> OPA20080-PCT
<150> KR 10/2019/0099815
<151> 2019-08-14
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 435
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Kosmotoga olearia
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(435)
<223> Tagatose-bisphosphate aldolase
<400> 1
Met Lys Lys His Pro Leu Gln Asp Ile Val Ser Leu Gln Lys Gln Gly
1 5 10 15
Ile Pro Lys Gly Val Phe Ser Val Cys Ser Ala Asn Arg Phe Val Ile
20 25 30
Glu Thr Thr Leu Glu Tyr Ala Lys Met Lys Gly Thr Thr Val Leu Ile
35 40 45
Glu Ala Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln Phe Gly Gly Tyr Thr Gly Met
50 55 60
Thr Pro Ala Asp Phe Arg Glu Met Val Phe Ser Ile Ala Glu Asp Ile
65 70 75 80
Gly Leu Pro Lys Asn Lys Ile Ile Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro
85 90 95
Asn Pro Trp Lys Gly Gln Pro Ser Asp Gln Ala Met Arg Asn Ala Ile
100 105 110
Glu Met Ile Arg Glu Tyr Ala Lys Ala Gly Phe Thr Lys Leu His Leu
115 120 125
Asp Ala Ser Met Arg Leu Ala Asp Asp Pro Gly Asn Glu Asn Glu Pro
130 135 140
Leu Asn Pro Glu Val Ile Ala Glu Arg Thr Ala Leu Leu Cys Leu Glu
145 150 155 160
Ala Glu Arg Ala Phe Lys Glu Ser Ala Gly Ser Leu Arg Pro Val Tyr
165 170 175
Val Ile Gly Thr Asp Val Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gln Asn Glu Gly
180 185 190
Lys Ser Ile His Val Thr Ser Val Gln Asp Phe Glu Arg Thr Val Glu
195 200 205
Leu Thr Lys Lys Ala Phe Phe Asp His Gly Leu Tyr Glu Ala Trp Gly
210 215 220
Arg Val Ile Ala Val Val Val Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Asn Glu
225 230 235 240
His Ile Phe Glu Tyr Asp Arg Asn Arg Ala Arg Glu Leu Thr Glu Ala
245 250 255
Ile Lys Lys His Pro Asn Ile Val Phe Glu Gly His Ser Thr Asp Tyr
260 265 270
Gln Thr Ala Lys Ala Leu Lys Glu Met Val Glu Asp Gly Val Ala Ile
275 280 285
Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ala Leu Arg Glu Ala Phe Phe
290 295 300
Ala Leu Ser Ser Ile Glu Lys Glu Leu Phe Tyr Asp Thr Pro Gly Leu
305 310 315 320
Cys Ser Asn Phe Val Glu Val Val Glu Arg Ala Met Leu Asp Asn Pro
325 330 335
Lys His Trp Glu Lys Tyr Tyr Gln Gly Glu Glu Arg Glu Asn Arg Leu
340 345 350
Ala Arg Lys Tyr Ser Phe Leu Asp Arg Leu Arg Tyr Tyr Trp Asn Leu
355 360 365
Pro Glu Val Arg Thr Ala Val Asn Lys Leu Ile Thr Asn Leu Glu Thr
370 375 380
Lys Glu Ile Pro Leu Thr Leu Ile Ser Gln Phe Met Pro Met Gln Tyr
385 390 395 400
Gln Lys Ile Arg Asn Gly Leu Leu Arg Lys Asp Pro Ile Ser Leu Ile
405 410 415
Lys Asp Arg Ile Thr Leu Val Leu Asp Asp Tyr Tyr Phe Ala Thr His
420 425 430
Pro Glu Cys
435
<210> 2
<211> 1308
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Kosmotoga olearia
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1308)
<223> Tagatose-bisphosphate aldolase
<400> 2
atgaaaaaac atcctcttca ggacattgtt tcattgcaaa aacagggaat acccaaaggg 60
gttttctctg tatgtagtgc caatagattt gttattgaaa ccactctgga atatgcgaag 120
atgaaaggga caacggttct tatagaggcc acctgcaatc aggtaaacca gttcggtggc 180
tacaccggta tgactcctgc tgatttcaga gaaatggttt tttctatcgc tgaggatatt 240
ggacttccca aaaataaaat catccttggt ggcgaccatc ttggcccaaa tccctggaag 300
ggtcagccgt cagatcaggc tatgcgtaac gccattgaaa tgattcgaga atacgctaaa 360
gctgggttta ccaagcttca tctggatgcc agcatgcgtc ttgcagacga tccggggaac 420
gaaaacgagc cgctgaaccc ggaagttata gcggaaagaa cagctcttct ctgtcttgaa 480
gccgagaggg cttttaaaga atccgccggt tctctccggc ctgtttacgt tattggtacg 540
gatgttccgc caccgggtgg agcgcaaaac gaaggtaaat cgattcatgt aaccagtgtt 600
caggattttg agcgtaccgt tgagttgacc aaaaaggcat ttttcgacca tggtttgtat 660
gaagcctggg gaagggtgat tgcggttgtt gtgcaaccgg gagtagaatt cgggaatgaa 720
catatattcg aatatgatag aaatcgagcg agagaactta ctgaggcgat aaaaaagcat 780
ccaaatatag tttttgaagg tcactcgaca gattatcaaa cggcaaaagc attgaaagaa 840
atggtagaag acggtgtagc catactcaag gttgggccag ctctaacatt tgcgctcaga 900
gaggcttttt ttgcgttgag cagcattgaa aaagagttat tttatgatac acccgggctt 960
tgttcaaact ttgttgaagt tgtcgagaga gcgatgcttg acaatccaaa acattgggaa 1020
aaatattacc agggagaaga gagagaaaat agattagccc gtaaatacag ctttctcgat 1080
cgcttgaggt attactggaa tcttcctgag gttagaacag cggtgaataa gctgataacc 1140
aaccttgaaa caaaagaaat cccgttaacg cttataagcc agttcatgcc gatgcagtac 1200
caaaaaatca gaaacggttt gctaagaaag gatccaataa gccttataaa agatcgaatt 1260
acccttgttc ttgatgacta ctatttcgca actcaccctg aatgttga 1308
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 1
<400> 3
gaccatcttg gcccataccc ctggaagggt cag 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 2
<400> 4
ctgacccttc caggggtatg ggccaagatg gtc 33
Claims (12)
1.一种果糖-4-差向异构酶变体，其包含用其他氨基酸取代对应果糖-4-差向异构酶N-末端的位置97、124、367和390的氨基酸残基，所述果糖-4-差向异构酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
2.权利要求1的果糖-4-差向异构酶变体，其中所述其他氨基酸选自非极性氨基酸、极性氨基酸和碱性氨基酸。
3.权利要求1的果糖-4-差向异构酶变体，其中所述非极性氨基酸、极性氨基酸和碱性氨基酸选自酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、缬氨酸(V)和精氨酸(R)。
4.权利要求1的果糖-4-差向异构酶变体，其中所述变体进一步包含用另一氨基酸取代对应158或321位置的氨基酸。
5.权利要求4的果糖-4-差向异构酶变体，其中所述其他氨基酸选自谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、甲硫氨酸(M)、精氨酸(R)、亮氨酸(L)、天冬酰胺(N)、异亮氨酸(I)和赖氨酸(K)。
6.权利要求1的果糖-4-差向异构酶变体，其中所述变体进一步包含用其他氨基酸取代对应一个或多个选自以下位置的氨基酸残基：位置210、位置239和位置318。
7.一种多核苷酸，其编码权利要求1-6中任一项所述的果糖-4-差向异构酶变体。
8.一种载体，其包含权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种微生物，其包含权利要求1-6中任一项所述的果糖4-差向异构酶变体，或载体，所述载体包含编码权利要求1-6中任一项所述的果糖4-差向异构酶变体的多核苷酸。
10.一种用于制备塔格糖的组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的果糖4-差向异构酶变体；微生物，其包含所述果糖-4-差向异构酶变体；或者所述微生物的培养物。
11.权利要求10的用于制备塔格糖的组合物，其中所述组合物进一步包含果糖。
12.一种制备塔格糖的方法，所述方法包括使权利要求1-6中任一项所述的果糖-4-差向异构酶变体；包含所述果糖-4-差向异构酶变体的微生物；或者所述微生物的培养物与果糖接触，并将果糖转化为塔格糖。
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