ES2537340T3 - Producción a gran escala de hialuronidasa soluble - Google Patents
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- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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-
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Abstract
Un método para producir rHuPH20 soluble, en donde rHuPH20 soluble hace referencia a una forma soluble de PH20 humana (también conocida como proteína de superficie de espermatozoides PH20) que es expresada recombinantemente, por ejemplo, en células de Ovario de Hámster Chino (CHO), comprendiendo el método: a) inocular medio celular en un biorreactor con un inóculo de células que codifican rHuPH20 soluble para producir un cultivo celular, en donde: las células comprenden entre 150 y 300 copias de ácido nucleico que codifica rHuPH20 soluble; el biorreactor contiene al menos 100 litros de cultivo celular; se inoculan 1010 - 1011 células por 100 litros de cultivo celular; y las células se cultivan a una temperatura de ajuste; b) alimentar las células con un primer medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, insulina humana y extracto de levadura en cantidades suficientes para incrementar el crecimiento celular y la densidad celular máxima, y para incrementar la síntesis de rHuPH20 soluble, en donde el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 0,5% a 20% del volumen de cultivo celular; c) alimentar las células con un segundo medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para incrementar la síntesis de rHuPH20 soluble e inducir la detención del ciclo celular; y disminuir la temperatura en comparación con la temperatura de la etapa a) a una temperatura suficiente para incrementar la detección del ciclo celular, aumentar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble; en donde: la cantidad de L-alanil-L-glutamina se reduce en comparación con la cantidad de L-alanil-L-glutamina de la etapa b); la cantidad de extracto de levadura se incrementa en comparación con la cantidad de extracto de levadura de la etapa b); y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 0,5% a 20% del volumen de cultivo celular; d) alimentar las células con un tercer medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para incrementar la síntesis de rHuPH20 soluble e incrementar la detención del ciclo celular, y reducir la temperatura en comparación con la temperatura de la etapa c) a una temperatura suficiente para incrementar la detención del ciclo celular, aumentar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble; en donde: la cantidad de L-alanil-L-glutamina se reduce en comparación con la cantidad de L-alanil-L-glutamina en la etapa c); las cantidades de extracto de levadura, glucosa y butirato de sodio se incrementan en comparación con las cantidades de extracto de levadura, glucosa y butirato de sodio en la etapa c); y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 0,5% a 20% del volumen del cultivo celular; e) alimentar la células con un cuarto medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para incrementar la síntesis de rHuPH20 soluble e incrementar la detención del ciclo celular, y disminuir la temperatura en comparación con la temperatura en la etapa d) a una temperatura suficiente para incrementar la detención del ciclo celular, incrementar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble; en donde: la cantidad de L-alanil-L-glutamina y glucosa se reducen en comparación con la cantidad de L-alanil-L45 glutamina y glucosa de la etapa d); la cantidad de butirato de sodio se reduce en comparación con la cantidad de butirato de sodio en la etapa d); y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 0,5% a 20% del volumen de cultivo celular; f) continuar cultivando las células hasta que la viabilidad cae por debajo de al menos 50%; g) obtener el líquido de cultivo de la cosecha; y h) purificar la rHuPH20 del líquido de cultivo celular de la cosecha.
Description
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- SÍMBOLO
-
imagen7 imagen8
- 1-Letra
- 3-Letras AMINOÁCIDOS
- I
- Él Isoleucina
- L
- Leu Leucina
- T
- Thr Treonina
- V
- Val Valina
- P
- Pro Prolina
- K
- Lys Lisina
- H
- Su Histidina
- Q
- Gln Glutamina
- E
- Glu Ácido glutamico
- Z
- Glx Glu y/o Gln
- W
- Trp Triptófano
- R
- Arg Arginina
- D
- Áspid Ácido aspártico
- N
- Asn Asparragina
- B
- Asx Asn y/o Asp
- C
- Cys Cisteína
- X
- Xaa Desconocido u otro
Cabe señalar que todas las secuencias de residuos de aminoácidos representadas en la presente memoria por fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional del extremo amino al extremo carboxilo-terminal. Además, la frase "residuo de aminoácido" se define ampliamente para incluir los aminoácidos que
5 figuran en la Tabla de Correspondencia (Tabla 1) y aminoácidos modificados e inusuales, como los mencionados en 37 CFR §§ 1.821-1.822. Además, se debe tener en cuenta que un guión al principio o al final de una secuencia de residuos de aminoácidos indica un enlace peptídico a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácidos, a un grupo amino-terminal tal como NH2 o a un grupo carboxilo-terminal tal como COOH.
10 Según se utiliza en la presente memoria, "aminoácidos de origen natural" se refiere a los ácidos 20 L-aminoácidos que aparecen en los polipéptidos.
Según se utiliza en la presente memoria, "aminoácido no natural" se refiere a un compuesto orgánico que tiene una estructura similar a un aminoácido natural pero que ha sido modificado estructuralmente para imitar la estructura y
15 reactividad de un aminoácido natural. Los aminoácidos de origen no natural por lo tanto incluyen, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos de origen natural e incluyen, pero no se limitan a, los D-isostereómeros de aminoácidos. Los aminoácidos no naturales ilustrativos se describen en la presente memoria y son conocidos por los expertos en la técnica.
20 Según se utiliza en la presente memoria, un constructo de ADN es una molécula de ADN monocatenario o bicatenario, lineal o circular que contiene segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos de una manera que no se encuentra en la naturaleza. Existen constructos de ADN como resultado de la manipulación humana, e incluyen clones y otras copias demoléculas manipuladas.
25 Según se utiliza en la presente memoria, "similitud" entre dos proteínas o ácidos nucleicos se refiere a la relación entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas o las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos. La similitud puede basarse en el grado de identidad y/u homología de las secuencias de residuos y los residuos contenidos en las mismas. Los métodos para evaluar el grado de similitud entre las proteínas o los ácidos nucleicos son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, en un método de evaluación de la similitud de secuencia,
30 dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos se alinean de una manera que produce un nivel máximo de identidad entre las secuencias. "Identidad" se refiere al grado en el que las secuencias de aminoácido o de nucleótidos son invariantes. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos, y hasta cierto punto de las secuencias de nucleótidos, también puede tomar en cuenta las diferencias conservativas y/o las sustituciones frecuentes en los aminoácidos (o nucleótidos). Diferencias conservativas son aquellas que preservan las propiedades físico-químicas
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homologías o identidades por encima de aproximadamente 85-90%, el resultado debería ser independiente del programa y del ajuste de parámetros delos huecos; dichos altos niveles de identidad pueden evaluarse fácilmente, a menudo por medio de alineamientomanual sin depender del soporte lógico.
Según se utiliza en la presente memoria, una secuencia alineada se refiere al uso de homología (similitud y/o identidad) para alinear las posiciones correspondientes en una secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Típicamente, dos o más secuencias que están relacionadas por 50% o más de identidad están alineadas. Un conjunto alineado de secuencias se refiere a 2 o más secuencias que se alinean en posiciones correspondientes y pueden incluir el alineamiento de secuencias derivadas de ARN, tales como EST y otros ADNc, alineados con la secuencia de ADN genómico.
Según se utiliza en la presente memoria, "cebador" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede actuar como un punto de iniciación de la síntesis de ADN dirigida por molde en condiciones apropiadas (p. ej., en presencia de cuatro nucleósidos trifosfato diferentes y un agente de polimerización, tal como ADN polimerasa , ARN polimerasa o transcriptasa inversa) en un tampón apropiado y a una temperatura adecuada. Se apreciará que ciertas moléculas de ácido nucleico pueden servir como "sonda" y como "cebador". Un cebador, sin embargo, tiene un grupo 3' hidroxilo para la extensión. Se puede utilizar un cebador en una variedad de métodos, incluyendo, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), transcriptasa inversa (RT)-PCR, PCR con ARN, LCR, PCR múltiplex, PCR angosta, PCR de captura, PCR de expresión, RACE 3' y 5', PCR in situ, PCR mediada por ligación y otros protocolos de amplificación.
Según se utiliza en la presente memoria, una variante alélica o variación alélica hace referencia a cualquiera de dos
- o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de mutación, y puede dar como resultado polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos alterada. El término "variante alélica" también se utiliza en la presente memoria para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. Típicamente, la forma de referencia del gen codifica una forma de tipo salvaje y/o una forma predominante de un polipéptido de una población
- o miembro de referencia individual de una especie. Típicamente, las variantes alélicas, que incluyen variantes intere intra-especie tienen típicamente al menos 80%, 90% o más de identidad de aminoácidos con una forma de tipo salvaje y/o predominante de la misma especie; el grado de identidad depende del gen y de si la comparación es interespecífica o intraespecífica. Generalmente, la variantes alélicas intraespecíficas tienen al menos aproximadamente 80%, 85%, 90% o 95% o más de identidad con una forma de tipo salvaje y/o predominante de un polipéptido, incluyendo 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad con una forma de tipo salvaje y/o predominante. La referencia a una variante alélica en la presentememoria generalmente se refiere a las variaciones de proteínas entre losmiembros de lamisma especie.
Según se utiliza en la presente memoria, "alelo", que se utiliza indistintamente en la presente memoria con "variante alélica" se refiere a formas alternativas de un gen o porciones del mismo. Los alelos ocupan el mismo locus o posición en cromosomas homólogos. Cuando un sujeto tiene dos alelos idénticos de un gen, se dice que el sujeto es homocigótico para ese gen o alelo. Cuando un sujeto tiene dos alelos diferentes de un gen, se dice que el sujeto es heterocigótico para el gen. Los alelos de un gen específico pueden diferir entre sí en un solo nucleótido o varios nucleótidos, y pueden incluir sustituciones, deleciones e inserciones de nucleótidos. Un alelo de un gen también puede ser una forma de un gen que contiene una mutación.
Según se utiliza en la presente memoria, variantes de especie se refieren variantes en polipéptidos entre diferentes especies, incluyendo diferentes especies demamíferos, tales como ratón y ser humano.
Según se utiliza en la presente memoria, una variante de empalme se refiere a una variante producida por procesamiento diferencial de un transcrito primario de ADN genómico que da como resultado más de un tipo de ARNm.
Según se utiliza en la presente memoria, la modificación es en referencia a la modificación de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico e incluye deleciones, inserciones, y sustituciones de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente. Métodos demodificación de un polipéptido son rutinarios para los expertos en la técnica, tal como mediante el uso de metodologías de ADN recombinante.
Según se utiliza en la presente memoria, el término promotor significa una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan la unión de la ARN polimerasa y la iniciación de la transcripción. Las secuencias promotoras se encuentran comúnmente, pero nosiempre, en la región no codificante 5' delos genes.
Según se utiliza en la presente memoria, polipéptido o proteína o porción biológicamente activa de los mismos aislados o purificados están sustancialmente libres dematerial celular u otras proteínas contaminantes de la célula o
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tejido del que deriva la proteína, o sustancialmente libres de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente. Se puede determinar que las preparaciones están sustancialmente libres si aparecen libres de impurezas fácilmente detectables según se determina por medio de métodos de análisis convencionales, tales como cromatografía en capa fina (TLC), electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), utilizadas por los expertos en la técnicapara evaluar tal pureza, o son suficientemente puras de manera que la purificación adicional no alteraría de forma detectable las propiedades físicas y químicas, por ejemplo las actividades enzimática y biológicas, de la sustancia. Los métodos para la purificación de los compuestos para producir compuestos sustancialmente químicamente puros son conocidos por los expertos en la técnica. Un compuesto sustancialmente químicamente puro, sin embargo, puede ser una mezcla de estereoisómeros. En tales casos, la purificación adicional podría aumentar la actividad específica del compuesto.
El término sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas en las que la proteína se separa de los componentes celulares de las células de las que se aísla o produce de forma recombinante. En una realización, el término sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de proteínas no enzimáticas (también denominadas en la presente memoria proteínas contaminantes), generalmente menos de aproximadamente 20% de proteínas no enzimáticas o 10% de proteínas no enzimáticas o menos de aproximadamente 5% de proteínas no enzimáticas. Cuando se produce de forma recombinante la proteína enzimática, también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa cantidades de menos de aproximadamente, o de, 20%, 10% o 5% del volumen de la preparación de proteína enzimática.
Según se utiliza en la presente memoria, el término sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos incluye preparaciones de proteínas enzimáticas en las que la proteína está separada de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. El término incluye preparaciones de proteínas enzimáticas tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) 20%, 10%, 5% o menos de precursores químicos o productos químicos no enzimáticos o componentes.
Según se utiliza en la presente memoria, sintético, con referencia a, por ejemplo, una molécula sintética de ácido nucleico o un gen sintético o un péptido sintético se refiere a una molécula de ácido nucleico o molécula de polipéptido que se produce por métodos recombinantes y/o por métodos de síntesis química.
Según se utiliza en la presente memoria, un vector de expresión incluye vectores capaces de expresar ADN que está conectado operativamente a secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión de tales fragmentos de ADN. Tales segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y opcionalmente pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación, y similares. Los vectores de expresión derivan generalmente de ADN plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos. Por lo tanto, un vector de expresión se refiere a un constructo de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un fago, virus recombinante u otro vector que, tras la introducción en una célula anfitriona apropiada, da como resultado la expresión del ADN clonado. Los vectores de expresión apropiados son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen aquellos que son replicables en células eucarióticas y/o células procarióticas y aquellos que permanecen episómicos o aquellos que se integran en el genoma dela célula anfitriona.
En la presente memoria, vector también incluye "virus vectores" o "vectores virales". Los vectores virales son virus modificados genéticamente que están unidos operativamente a genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas) los genes exógenos a las células.
Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término evaluar incluya la determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la actividad de una proteasa, o un dominio de la misma, presente en la muestra, y también de obtener un índice, razón, porcentaje, valor visual u otro valor indicativo del nivel de actividad. La evaluación puede ser directa o indirecta y las especies químicas detectadas realmente no tienen que ser, por supuesto, el propio producto de la proteólisis, sino que puede ser por ejemplo un derivado de la misma o alguna sustancia adicional. Por ejemplo, la detección de un producto de escisión de una proteína del complemento, por ejemplomediante SDS-PAGE y tinción deproteínas con azul de Coomasie.
Según se utiliza en la presente memoria, una composición se refiere a cualquier mezcla. Puede ser una disolución, suspensión, líquido, polvo, pasta, acuosos, no acuosos o cualquier combinación de los mismos. Según se utiliza en la presente memoria, un kit es una combinación empaquetada que opcionalmente incluye otros elementos, tales como reactivos adicionales einstrucciones de uso de la combinación o elementos delosmismos.
Según se utiliza en la presente memoria, "enfermedad o trastorno" se refiere a una afección patológica en un organismo que resulta de causa o afección, incluyendo, pero no limitada a, infecciones, afecciones adquiridas, afecciones genéticas, y se caracterizan por síntomasidentificables.
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- Parámetro
- HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
- Volumen de producto eluido (mL)
- 17595 22084 20686 19145
- Conc. de proteína del producto eluido (mg/mL)
- 0,0 0,03 0,03 0,04
- Conc. de proteína del producto eluido filtrado (mg/mL)
- No sometido a ensayo 0,03 0,00 0,04
- Análisis enzimático del producto eluido (U/mL)
- 4050 2410 1523 4721
- Rendimiento de Proteína (%)
- 0 11 11 12
- Rendimiento de enzima (%)
- no determinado 41 40 69
Tabla 7. Datos de la columna de hidroxiapatita
- Parámetro
-
HUA0406C
imagen35 HUA0410C HUA0415C HUA0420C
- Volumen antes de la adición de la disolución de partida (mL)
-
16345
imagen36 20799 20640 19103
- Razón de volumen de carga/volumen de resina
-
10,95
imagen37 13,58 14,19 12,81
- Volumen de la columna (mL)
-
1500
imagen38 1540 11462 1500
- Volumen de carga (mL)
-
16429
imagen39 20917 20746 19213
- Volumen de producto eluido (mL)
-
4100
imagen40 2415 1936 2419
- Conc. de proteína del producto eluido (mp/mL)
- No sometido ensayo a 0,24 0,17 0,23
- Conc. de proteína del producto eluido filtrado (mg/mL)
-
N/A
imagen41 N/A 0,17 N/A
- Analisis enzimático del producto eluido (U/mL)
-
14051
imagen42 29089 20424 29826
- Rendimiento de Proteína (%)
-
No sometido a ensayo
imagen43 93 53 73
- Rendimiento de enzima (%)
-
87
imagen44 118 140 104
Tabla 8. Datos de filtración DV20
- Parámetro
- HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
- Volumen inicial (mL)
- 4077 2233 1917 2419
- Volumen de producto filtrado (mL)
- 4602 3334 2963 3504
- Conc. de proteína del producto filtrado (mg/mL)
- 0,1 N/A 0,09 N/A
- Conc. de proteína del producto eluido filtrado (mg/mL)
- N/A 0,15 0,09 0,16
- Rendimiento de Proteína (%)
- No sometido a ensayo 93 82 101
Tabla 9. Datos de concentración final
- Parámetro
- HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
- Volumen Inicial (mL)
- 4575 3298 2963 3492
- Volumen Concentrado (mL)
- 562 407 237 316
- Conc. de proteína de producto concentrado (mg/mL)
- 0,9 1,24 1,16 1,73
- Rendimiento de Proteína (%)
- 111 102 103 98
Tabla 10. Intercambio de tampón en datos deformulación final
- Parámetro
- HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
37
Claims (1)
-
imagen1 imagen2 imagen3
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