ES2887219T3 - Producción a gran escala de hialuronidasa soluble - Google Patents

Producción a gran escala de hialuronidasa soluble

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ES2887219T3 ES20186922T ES20186922T ES2887219T3 ES 2887219 T3 ES2887219 T3 ES 2887219T3 ES 20186922 T ES20186922 T ES 20186922T ES 20186922 T ES20186922 T ES 20186922T ES 2887219 T3 ES2887219 T3 ES 2887219T3
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Abstract

Líquido de cultivo celular recogido que comprende PH20 humana recombinante (rHuPH20) soluble con una actividad enzimática que es mayor de 5000 y menor de o igual a 24.000 unidades de actividad hialuronidasa/ml de líquido de cultivo celular tal como se recoge, en el que: la rHuPH20 soluble es una forma soluble de PH20 humana que se expresa de manera recombinante en células de ovario de hámster chino (CHO); la secuencia de aminoácidos de la rHuPH20 codificada por las células comprende un polipéptido cuya secuencia se expone en SEQ ID NO:4 o variantes del mismo que tienen el 96% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO:4, en el que la identidad de secuencia se determina a lo largo de la longitud de la secuencia completa; una unidad de actividad hialuronidasa puede determinarse incubando rHuPH20 soluble con hialuronato de sodio (ácido hialurónico) durante un periodo de tiempo establecido (10 minutos), precipitando el hialuronato de sodio sin digerir con la adición de albúmina sérica acidificada, midiendo la turbidez de la muestra resultante a 640 nm después de un periodo de desarrollo de 30 minutos y comparando con una curva de calibración generada con diluciones de un patrón de referencia de trabajo de ensayo de rHuPH20 soluble; y el líquido de cultivo celular recogido es el líquido tal como se separa a partir de las células, del residuo celular y de los agregados.

Description

DESCRIPCIÓN
Producción a gran escala de hialuronidasa soluble
Campo de la invención
En el presente documento se describen métodos para la producción a gran escala de PH20 humana recombinante (rHuPH20) y un líquido de cultivo celular recogido que comprende rHuPH20 soluble.
Antecedentes
Las hialuronidasas son una familia de enzimas que degradan el ácido hialurónico (también conocido como hialuronano o hialuronato), un componente esencial de la matriz extracelular y un constituyente principal de la barrera intersticial. Al catalizar la hidrólisis del ácido hialurónico, la hialuronidasa reduce la viscosidad del ácido hialurónico, aumentando de ese modo la permeabilidad tisular. Como tal, las hialuronidasas se han usado, por ejemplo, como agente de difusión o dispersión junto con otros agentes, fármacos y proteínas para potenciar su dispersión y administración. Las hialuronidasas también tienen otros usos terapéuticos y cosméticos. Debido al creciente uso de hialuronidasas para usos terapéuticos y cosméticos, existe la necesidad de cantidades a gran escala de hialuronidasa purificada. Por tanto, entre los objetos en el presente documento, un objeto es describir métodos para la producción y purificación de hialuronidasas.
El documento US 2004/268425 A1 divulga una glicoproteína hialuronidasa soluble (sHASEGP), un procedimiento para la preparación de la misma, usos y composiciones farmacéuticas que comprenden la misma.
Sumario
En el presente documento se proporciona:
[Punto 1] Un líquido de cultivo celular recogido que comprende PH20 humana recombinante (rHuPH20) soluble con una actividad enzimática que es mayor de 5000 y menor de o igual a 24.000 unidades de actividad hialuronidasa/ml de líquido de cultivo celular tal como se recoge, en el que: la rHuPH20 soluble es una forma soluble de PH20 humana que se expresa de manera recombinante en células de ovario de hámster chino (CHO); la secuencia de aminoácidos de la rHuPH20 codificada por las células comprende un polipéptido cuya secuencia se expone en SEQ ID NO:4 o variantes del mismo que tienen el 96% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO:4, en el que la identidad de secuencia se determina a lo largo de la longitud de la secuencia completa; una unidad de actividad hialuronidasa puede determinarse incubando rHuPH20 soluble con hialuronato de sodio (ácido hialurónico) durante un periodo de tiempo establecido (10 minutos), precipitando el hialuronato de sodio sin digerir con la adición de albúmina sérica acidificada, midiendo la turbidez de la muestra resultante a 640 nm después de un periodo de desarrollo de 30 minutos y comparando con una curva de calibración generada con diluciones de un patrón de referencia de trabajo de ensayo de rHuPH20 soluble; y el líquido de cultivo celular recogido es el líquido tal como se separa a partir de las células, del residuo celular y de los agregados.
[Punto 2] El líquido de cultivo celular recogido según el punto 1, en el que la actividad enzimática es mayor de 5000 y menor de o igual a 22.000 unidades/ml.
[Punto 3] El líquido de cultivo celular recogido según el punto 1 o el punto 2, en el que la actividad enzimática es mayor de 5000 y menor de o igual a 20.000 unidades/ml.
[Punto 4] El líquido de cultivo celular recogido según cualquiera de los puntos 1-3, en el que la actividad enzimática es mayor de 5000 y menor de o igual a 18.000 unidades/ml.
[Punto 5] El líquido de cultivo celular recogido según cualquiera de los puntos 1-4, en el que la secuencia de aminoácidos de la rHuPH20 codificada por las células comprende un polipéptido cuya secuencia se expone en cualquiera de las SEQ ID NO:4-9.
[Punto 6] El líquido de cultivo celular recogido según cualquiera de los puntos 1-5, en el que la actividad enzimática es de 10.000, 12.000, 14.000, 16.000 ó 18.000 unidades/ml.
[Punto 7] El líquido de cultivo celular recogido según cualquiera de los puntos 1-6, en el que las células que codifican para PH20 humana soluble son células CHO DG44.
En el presente documento se describen métodos para la producción y purificación de hialuronidasas solubles. En particular, en el presente documento se describen métodos para la producción y purificación de rHuPH20 soluble. En el presente documento también se describen un medio celular y un líquido de cultivo celular recogido que contienen rHuPH20 soluble. Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para producir y purificar cualquier cantidad de hialuronidasa soluble, tal como rHuPH20. Por ejemplo, los métodos y las etapas descritos en el presente documento pueden modificarse para aumentar o disminuir la escala, tal como resultaría evidente para un experto en la técnica.
Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para producir y purificar cantidades a gran escala de rHuPH20 soluble. Los métodos descritos en el presente documento para producir rHuPH20 soluble pueden incluir a) inocular medio celular en un biorreactor con un inóculo de células que codifican para rHuPH20 soluble para producir un cultivo celular, en el que las células contienen entre 150 y 300 copias de ácido nucleico que codifica para rHuPH20 soluble, el biorreactor contiene al menos 100 litros de cultivo celular y se inoculan aproximadamente 1010 - 1011 células por 100 litros de cultivo celular y las células se cultivan a una temperatura establecida; b) alimentar las células con un primer medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, insulina humana y extracto de levadura en cantidades suficientes para aumentar el crecimiento celular y la densidad celular máxima y para aumentar la síntesis de rHuPH20 soluble, en el que el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen del 4% del volumen de cultivo celular; c) alimentar las células con un segundo medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para aumentar la síntesis de rHuPH20 soluble e inducir la detención del ciclo celular, en el que la cantidad de L-alanil-L-glutamina se reduce en comparación con la cantidad de L-alanil-L-glutamina en la segunda etapa y la cantidad de extracto de levadura se aumenta en comparación con la cantidad de extracto de levadura en la etapa b), y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen del 4% del volumen de cultivo celular y la temperatura se reduce en comparación con la temperatura en la etapa a) hasta una temperatura suficiente para aumentar la detención del ciclo celular, aumentar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble; d) alimentar las células con un tercer medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para aumentar la síntesis de rHuPH20 soluble y aumentar la detención del ciclo celular, en el que el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen del 4% del volumen de cultivo celular, la cantidad de L-alanil-L-glutamina y glucosa se reduce en comparación con la cantidad de L-alanil-L-glutamina y glucosa en la etapa c), y la cantidad de extracto de levadura y butirato de sodio se aumenta en comparación con la cantidad de extracto de levadura y butirato de sodio en la etapa c) y la temperatura se reduce en comparación con la temperatura en la etapa c) hasta una temperatura suficiente para aumentar la detención del ciclo celular, aumentar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble; e) alimentar las células con un cuarto medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para aumentar la síntesis de rHuPH20 soluble y aumentar la detención del ciclo celular, en el que la cantidad de L-alanil-L-glutamina y glucosa se reduce en comparación con la cantidad de L-alanil-L-glutamina y glucosa en la etapa d), la cantidad de butirato de sodio se reduce en comparación con la cantidad de butirato de sodio en la etapa d), la temperatura se reduce en comparación con la temperatura en la etapa d) hasta una temperatura suficiente para aumentar la detención del ciclo celular, aumentar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen del 4% del volumen de cultivo celular; f) cultivar las células hasta que la viabilidad disminuye por debajo de al menos o aproximadamente el 50%; g) obtener el líquido de cultivo celular de recogida; y h) la rHuPH20 soluble se purifica a partir del líquido de cultivo de recogida.
El líquido de cultivo celular de recogida puede filtrarse antes de la purificación. En algunos ejemplos, la temperatura en la etapa a) es de 37°C, la temperatura en la etapa c) es de 36,5°C, la temperatura en la etapa d) es de 36°C y la temperatura en la etapa d) es de 35,5°C. La purificación de rHuPH20 soluble puede efectuarse mediante cromatografía en columna, tal como cromatografía en columna de agarosa reticulada con perlas, cromatografía en columna de agarosa sustituida con fenilo reticulada con perlas, cromatografía en columna de boronato de aminofenilo y cromatografía en columna de hidroxiapatita.
En un ejemplo, el método para producir rHuPH20 soluble incluye las etapas de a) inocular medio celular en un biorreactor con un inóculo de células que codifican para rHuPH20 soluble para producir un cultivo celular, en el que las células contienen entre 150 y 300 copias de ácido nucleico que codifica para rHuPH20 soluble, el biorreactor contiene al menos 100 litros de cultivo celular, la densidad celular de inoculación es de o de aproximadamente 4 x 105 células/ml y las células se cultivan a 37°C; b) alimentar las células con un primer medio de alimentación que contiene o que contiene aproximadamente 33 g/l de glucosa, L-alanil-L-glutamina 32 mM, 16,6 g/l de extracto de levadura y 33 mg/l de insulina, en el que el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen del 4% del volumen de cultivo celular; c) alimentar las células con un segundo medio de alimentación que contiene o que contiene aproximadamente 33 g/l de glucosa, L-alanil-L-glutamina 16 mM, 33,4 g/l de extracto de levadura y 0,92 g/l de butirato de sodio, en el que el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen del 4% del volumen de cultivo celular y la temperatura se reduce hasta 36,5°C; d) alimentar las células con un tercer medio de alimentación que contiene o que contiene aproximadamente 50 g/l de glucosa, L-alanil-L-glutamina 10 mM, 50 g/l de extracto de levadura y 1,8 g/l de butirato de sodio, en el que el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen del 4% del volumen de cultivo celular y la temperatura se reduce hasta 36°C; e) alimentar las células con un cuarto medio de alimentación que contiene o que contiene aproximadamente 33 g/l de glucosa, L-alanil-L-glutamina 6,6 mM, 50 g/l de extracto de levadura y 0,92 g/l de butirato de sodio, en el que el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen del 4% del volumen de cultivo celular y la temperatura se reduce hasta 36°C; f) continuar cultivando las células hasta que la viabilidad disminuye por debajo de al menos o aproximadamente el 50%; g) obtener el líquido de cultivo celular de recogida; h) filtrar el líquido de cultivo celular de recogida; e i) purificar la rHuPH20 a partir del líquido de cultivo de recogida usando cromatografía en columna de agarosa reticulada con perlas, cromatografía en columna de agarosa sustituida con fenilo reticulada con perlas, cromatografía en columna de boronato de aminofenilo y cromatografía en columna de hidroxiapatita.
En otro ejemplo, el método para producir rHuPH20 soluble incluye las etapas de a) inocular medio celular en un biorreactor con un inóculo de células que codifican para rHuPH20 soluble para producir un cultivo celular, en el que las células comprenden entre 150 y 300 copias de ácido nucleico que codifica para rHuPH20 soluble; el biorreactor contiene al menos 100 litros de cultivo celular; la densidad celular de inoculación es de o de aproximadamente 4 x 105 células/ml; y las células se cultivan a o a aproximadamente 37°C; b) alimentar las células con un primer medio de alimentación que contiene o que contiene aproximadamente 33 g/l de glucosa, L-alanil-L-glutamina 32 mM, 83,3 g/l de extracto de levadura y 33 mg/l de insulina, en el que el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen del 4% o aproximadamente el 4% del volumen de cultivo celular; c) alimentar las células con un segundo medio de alimentación que contiene o que contiene aproximadamente 33 g/l de glucosa, L-alanil-L-glutamina 13 mM, 166,7 g/l de extracto de levadura y 0,92 g/l de butirato de sodio, en el que el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de o de aproximadamente el 4% del volumen de cultivo celular y la temperatura se reduce hasta 36,5°C; d) alimentar las células con un tercer medio de alimentación que contiene o que contiene aproximadamente 50 g/l de glucosa, L-alanil-L-glutamina 10 mM, 250 g/l de extracto de levadura y 1,8 g/l de butirato de sodio, en el que el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen del 4% o aproximadamente el 4% del volumen de cultivo celular y la temperatura se reduce hasta 36°C; e) alimentar las células con un cuarto medio de alimentación que contiene o que contiene aproximadamente 33 g/l de glucosa, L-alanil-L-glutamina 6,7 mM, 250 g/l de extracto de levadura y 0,92 g/l de butirato de sodio, en el que el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen del 4% o aproximadamente el 4% del volumen de cultivo celular y la temperatura se reduce hasta 36°C; f) continuar cultivando las células hasta que la viabilidad disminuye por debajo de al menos o aproximadamente el 50%; g) obtener el líquido de cultivo celular de recogida; h) filtrar el líquido de cultivo celular de recogida; e i) purificar la rHuPH20 a partir del líquido de cultivo de recogida usando cromatografía en columna de agarosa reticulada con perlas, cromatografía en columna de agarosa sustituida con fenilo reticulada con perlas, cromatografía en columna de boronato de aminofenilo y cromatografía en columna de hidroxiapatita.
En algunos ejemplos, el volumen de cultivo celular en el biorreactor es o es aproximadamente de 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 ó 3500 litros. En algunos ejemplos, la cantidad de rHuPH20 soluble que se produce por 100 l de cultivo celular usando los métodos descritos en el presente documento es de al menos o aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ó 40 gramos de rHuPH20 soluble. La actividad específica de la rHuPH20 soluble puede ser de al menos o aproximadamente 80000, 100000, 120000, 140000, 160000 ó 180.000 unidades/mg. Las células que codifican para rHuPH20 soluble pueden ser, en algunos casos, células CHO DG44. Además, la rHuPH20 puede estar codificada por el ácido nucleico expuesto en SEQ ID NO:47.
En el presente documento se describen medios de cultivo celular que contienen rHuPH20 soluble con una actividad enzimática mayor de 5000 unidades/ml, tal como 10.000, 12.000, 14.000, 16.000, 18.000, 20.000, 22.000 ó 24.000 unidades/ml. En el presente documento también se proporciona un líquido de cultivo celular recogido que contiene rHuPH20 soluble con una actividad enzimática mayor de 5000 unidades/ml, tal como 10.000, 12.000, 14.000, 16.000, 18.000, 20.000, 22.000 ó 24.000 unidades/ml.
Descripción detallada
Esquema
A. Definiciones
B. Visión general
C. Hialuronidasa
1. Estructura y función
2. PH20
3. Usos terapéuticos de las hialuronidasas
a. Uso como agente de difusión
b. Uso en hipodermóclisis
c. Uso en vitrectomía y en trastornos y estados oftálmicos
d. Uso en terapia génica
e. Usos cosméticos
f. Uso en el trasplante de órganos
g. Uso en el tratamiento del cáncer
h. Uso en el tratamiento de la acumulación de glicosaminoglicanos en el cerebro i. Uso en el tratamiento de la acumulación de glicosaminoglicanos en enfermedad cardiovascular j. Uso en enfermedad pulmonar
k. Otros usos
D. Células que expresan hialuronidasa
a. Células 3D35M
b. Células 2B2
E. Expansión del cultivo celular
F. Producción de proteína
G. Concentración de proteína e intercambio del tampón
H. Purificación
1. Columna de agarosa reticulada con perlas
2. Columna de agarosa sustituida con fenilo reticulada con perlas
3. Columna de boronato de aminofenilo
4. Columna de hidroxiapatita
6. Eliminación de virus, concentración de proteína e intercambio del tampón
I. Llenado
J. Monitorización y ensayos
1. Condiciones de monitorización
2. Monitorización de la producción de rHuPH20 soluble
K. Ejemplos
A. Definiciones
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece(n) la(s) invención/invenciones.
En el caso de que haya una pluralidad de definiciones para los términos en el presente documento, prevalecerán aquellas en esta sección. Cuando se hace referencia a una URL u otro identificador o dirección, se entiende que tales identificadores pueden cambiar y que la información particular en Internet puede aparecer y desaparecer, pero puede encontrarse información equivalente buscando en Internet. La referencia a los mismos evidencia la disponibilidad y difusión pública de tal información.
Tal como se usa en el presente documento, hialuronidasa se refiere a una enzima que degrada el ácido hialurónico. Las hialuronidasas humanas a modo de ejemplo incluyen PH20 (SEQ ID NO:1). Entre las hialuronidasas también se incluyen PH20 humana soluble y rHuPH20 soluble.
La referencia a hialuronidasas incluye polipéptidos de hialuronidasa precursores y polipéptidos de hialuronidasa maduros (tal como aquellos en los que se ha eliminado una secuencia señal), formas truncadas de los mismos que tienen actividad, e incluye variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por variantes de corte y empalme y otras variantes.
Por ejemplo, la referencia a hialuronidasa también incluye las variantes de polipéptido precursor de PH20 humana expuestas en las SEQ ID NO:48-49. Las hialuronidasas también incluyen aquellas que contienen modificaciones químicas o postraduccionales y aquellas que no contienen modificaciones químicas ni postraduccionales. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, pegilación, albuminación, glicosilación, farnesilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación y otras modificaciones de polipéptidos conocidas en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, PH20 humana soluble o sHuPH20 incluyen polipéptidos maduros que carecen de la totalidad o de una porción del sitio de unión a glicosilfosfatidil inositol (GPI) en el extremo C-terminal, de tal manera que, tras la expresión, los polipéptidos son soluble. Los polipéptidos de sHuPH20 a modo de ejemplo incluyen polipéptidos maduros que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO:4-9 y 45-46. Los polipéptidos precursores para tales polipéptidos de sHuPH20 a modo de ejemplo incluyen una secuencia señal. Ejemplos de precursores son aquellos expuestos en las SEQ ID NO:3 y 38-44 que contienen, cada uno, una secuencia señal de 35 aminoácidos en las posiciones de aminoácido 1-35. Los polipéptidos de HuPH20 soluble también incluyen aquellos degradados durante o después de los métodos de producción y purificación descritos en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, rHuPH20 soluble se refiere a una forma soluble de PH20 humana que se expresa de manera recombinante en células de ovario de hámster chino (CHO). La rHuPH20 soluble está codificada por un ácido nucleico que incluye la secuencia señal y se expone en SEQ ID NO:47. También se incluyen moléculas de ADN que son variantes alélicas de la misma y otras variantes solubles. El ácido nucleico que codifica para rHuPH20 soluble se expresa en células CHO que secretan el polipéptido maduro. Cuando se produce en el medio de cultivo, existe heterogeneidad en el extremo C-terminal, de modo que el producto incluye una mezcla de especies que pueden incluir una o más de las SEQ ID NO:4-9 en diversas abundancias. También se incluyen las variantes alélicas correspondientes y otras variantes, incluyendo aquellas correspondientes a los polipéptidos precursores de PH20 humana expuestos en las SEQ ID NO:48-49. Otras variantes pueden tener el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO:4 siempre que conserven una actividad hialuronidasa y sean solubles.
Tal como se usa en el presente documento, “células que expresan rHuPH20 soluble” se refiere a cualquier célula CHO que expresa rHuPH20 soluble. Las células que expresan rHuPH20 soluble a modo de ejemplo incluyen células 2B2 y 3D35M. Las células que expresan rHuPH20 soluble son células CHO en las que se ha introducido un ácido nucleico que contiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO:55.
Tal como se usa en el presente documento, actividad hialuronidasa se refiere a cualquier actividad mostrada por un polipéptido de hialuronidasa. Tales actividades pueden someterse a prueba in vitro y/o in vivo e incluyen, pero no se limitan a, actividad enzimática, tal como para efectuar la escisión del ácido hialurónico. La actividad hialuronidasa se refiere a cualquier actividad mostrada por un polipéptido de hialuronidasa.
Tal como se usa en el presente documento, actividad enzimática se refiere a la actividad de una hialuronidasa, tal como se evalúa en ensayos enzimáticos in vitro, para escindir un sustrato, tal como ácido hialurónico. Los ensayos in vitro para determinar la actividad enzimática de las hialuronidasas, tales como rHuPH20 soluble, se conocen en la técnica y se describen en el presente documento. Los ensayos a modo de ejemplo incluyen el ensayo de microturbidez descrito a continuación (véase, por ejemplo, el ejemplo 9 y la sección I) que mide indirectamente la escisión de ácido hialurónico mediante hialuronidasa detectando el precipitado insoluble formado cuando el ácido hialurónico sin escindir se une con albúmina sérica.
Tal como se usa en el presente documento, actividad específica con referencia una rHuPH20 soluble es la actividad enzimática en relación con la cantidad de rHuPH20 soluble. La actividad específica se calcula dividiendo la actividad enzimática (unidades/ml) entre la concentración de proteína (mg/ml).
Tal como se usa en el presente documento, “muestra al menos una actividad” o “conserva al menos una actividad” se refiere a la actividad mostrada por una rHuPH20 soluble variante en comparación con cualquier rHuPH20 soluble expuesta en las SEQ ID NO:4-9 en las mismas condiciones. Normalmente, una rHuPH20 soluble variante que conserva o muestra al menos una actividad de una rHuPH20 soluble expuesta en las SEQ ID NO:4-9 conserva la actividad de una rHuPH20 soluble expuesta en las SEQ ID NO:4-9 del o aproximadamente del 0,5%, el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 100%, el 200%, el 300%, el 400%, el 500% o más. Las actividades a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, actividad hialuronidasa y actividad enzimática.
En cuanto a la invención reivindicada, la secuencia de aminoácidos de la hialuronidasa producida es tal como se define en la reivindicación 1.
Tal como se usa en el presente documento, cromatografía en columna de agarosa reticulada con perlas se refiere a cromatografía usando una columna empaquetada con agarosa reticulada con perlas. Un ejemplo de agarosa reticulada con perlas es Q Sepharose™.
Tal como se usa en el presente documento, cromatografía en columna de agarosa sustituida con fenilo reticulada con perlas se refiere a cromatografía usando una columna empaquetada con agarosa sustituida con fenilo reticulada con perlas. Un ejemplo de agarosa sustituida con fenilo reticulada con perlas es Phenyl Sepharose™.
Tal como se usa en el presente documento, cromatografía en columna de boronato de aminofenilo se refiere a cromatografía usando una columna empaquetada con agarosa de boronato de aminofenilo.
Tal como se usa en el presente documento, cromatografía en columna de hidroxiapatita se refiere a cromatografía usando una columna empaquetada con hidroxiapatita.
Tal como se usa en el presente documento, líquido de cultivo celular recogido o líquido de cultivo celular de recogida (HCCF) se refiere al líquido obtenido tras la recogida de las células a partir del biorreactor y la separación del medio de cultivo celular a partir de las células, del residuo celular y de otros agregados. El cultivo celular que se recoge del biorreactor puede filtrarse para clarificar el cultivo, retirar las células, el residuo celular y otros agregados para dejar el líquido de cultivo celular recogido.
Tal como se usa en el presente documento, densidad celular se refiere al número de células en un volumen de medio dado.
Tal como se usa en el presente documento, cultivo celular o cultivo se refiere a una población de células que está suspendida en un medio en condiciones adecuadas para mantener la viabilidad de las células o hacer crecer a las células.
Tal como se usa en el presente documento, medio, medio celular o medio de cultivo celular se refiere a una disolución que contiene nutrientes suficientes para fomentar el crecimiento de las células en un cultivo. Normalmente, estas disoluciones contienen aminoácidos esenciales y no esenciales, vitaminas, fuentes de energía, lípidos y/u oligoelementos. El medio también puede contener complementos adicionales, tales como hormonas, factores de crecimiento e inhibidores del crecimiento. La referencia a medio de cultivo celular incluida
Tal como se usa en el presente documento, los residuos de a-aminoácidos que se producen de manera natural son los residuos de los 20 a-aminoácidos hallados en la naturaleza que se incorporan en la proteína mediante el reconocimiento específico de la molécula de ARNt cargada con su codón de ARNm relacionado en humanos.
Tal como se usa en el presente documento, “en cantidades suficientes para aumentar”, cuando hace referencia a una sustancia que aumenta parámetros tales como la tasa de crecimiento celular, densidad celular máxima, síntesis de proteína o detención del ciclo celular, se refiere a la cantidad de una sustancia que efectúa un aumento de uno de estos parámetros en comparación con lo observado en ausencia de la sustancia. Los parámetros pueden evaluarse en presencia y ausencia de una sustancia, y puede determinarse la cantidad de sustancia que aumenta el parámetro (tal como la tasa de crecimiento celular, densidad celular máxima, síntesis de proteína o detención del ciclo celular) en comparación con en ausencia de la sustancia. La tasa de crecimiento, densidad celular máxima, síntesis de proteína o detención del ciclo celular en presencia de la sustancia puede aumentar en o en aproximadamente el 0,5%, el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 100%, el 200%, el 300%, el 400%, el 500% o más en comparación con la tasa de crecimiento, densidad celular máxima, síntesis de proteína o detención del ciclo celular en ausencia de la sustancia.
Tal como se usa en el presente documento, los ácidos nucleicos incluyen ADN, ARN y análogos de los mismos, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos (PNA) y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Cuando se hace referencia a sondas o cebadores, que están opcionalmente marcados, tal como con un marcador detectable, tal como un marcador fluorescente o radiomarcador, se contemplan las moléculas monocatenarias. Tales moléculas tienen normalmente una longitud de tal manera que su diana es estadísticamente única o tiene un bajo número de copias (normalmente menor de 5, generalmente menor de 3) para sondear o cebar una librería. En general, una sonda o un cebador contiene al menos 14, 16 ó 30 nucleótidos contiguos de secuencia complementaria o idéntica a un gen de interés. Las sondas y los cebadores pueden tener una longitud de 10, 20, 30, 50, 100 o más ácidos nucleicos.
Tal como se usa en el presente documento, un péptido se refiere a un polipéptido que tiene una longitud de desde 2 hasta 40 aminoácidos.
Tal como se usa en el presente documento, los aminoácidos que aparecen en las diversas secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento se identifican según sus abreviaturas conocidas de tres letras o de una letra (tabla 1). Los nucleótidos que aparecen en los diversos fragmentos de ácido nucleico se designan con las designaciones convencionales de una letra usadas de manera rutinaria en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, un “aminoácido” es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo ácido carboxílico. Un polipéptido contiene dos o más aminoácidos. Para los fines en el presente documento, los aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos que se producen de manera natural, aminoácidos no naturales y análogos de aminoácidos (es decir, aminoácidos en los el que el carbono a tiene una cadena lateral).
Tal como se usa en el presente documento, “residuo de aminoácido” se refiere a un aminoácido formado tras la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus enlaces peptídicos. Se supone que los residuos de aminoácido descritos en el presente documento están en la forma isomérica “L”. Los residuos en la forma isomérica “D”, que se designan de ese modo, pueden estar sustituidos por cualquier residuo de L-aminoácido siempre que el polipéptido conserve la propiedad funcional deseada. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino-terminal de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxilo libre presente en el extremo carboxilo-terminal de un polipéptido. De acuerdo con la nomenclatura convencional de polipéptidos descrita en J. Biol. Chem., 243: 3552-3559 (1969) y adoptada en 37 C.F.R.. §§ 1.821-1.822, las abreviaturas para los residuos de aminoácido se muestran en la tabla 1:
Tabla 1 - Tabla de correspondencia
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Debe indicarse que todas las secuencias de residuos de aminoácido representadas en el presente documento mediante fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional de extremo aminoterminal a extremo carboxilo-terminal. Además, la expresión “residuo de aminoácido” se define ampliamente para incluir los aminoácidos enumerados en la tabla de correspondencia (tabla 1) y aminoácidos modificados e inusuales, tales como aquellos a los que se hace referencia en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822. Además, debe indicarse que un guion al principio o al final de una secuencia de residuos de aminoácido indica un enlace peptídico con una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácido, con un grupo amino-terminal tal como NH2 o con un grupo carboxiloterminal tal como COOH.
Tal como se usa en el presente documento, “aminoácidos que se producen de manera natural” se refieren a los 20 L-aminoácidos que se producen en los polipéptidos.
Tal como se usa en el presente documento, “aminoácido no natural” se refiere a un compuesto orgánico que tiene una estructura similar a un aminoácido natural pero que se ha modificado estructuralmente para imitar la estructura y reactividad de un aminoácido natural. Por tanto, los aminoácidos que no se producen de manera natural incluyen, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos que se producen de manera natural, e incluyen, pero no se limitan a, los D-isoestereómeros de aminoácidos. En el presente documento se describen aminoácidos no naturales a modo de ejemplo y que conocen los expertos en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, un constructo de ADN es una molécula de ADN lineal o circular, monocatenaria o bicatenaria, que contiene segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos de una manera no hallada en la naturaleza. Los constructos de ADN existen como resultado de una manipulación humana, e incluyen clones y otras copias de moléculas manipuladas.
Tal como se usa en el presente documento, “similitud” entre dos proteínas o ácidos nucleicos se refiere a la semejanza entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas o las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos. La similitud puede basarse en el grado de identidad y/u homología de las secuencias de residuos y los residuos contenidos en las mismas. Los expertos en la técnica conocen métodos para evaluar el grado de similitud entre proteínas o ácidos nucleicos. Por ejemplo, en un método de evaluación de la similitud de secuencia, se alinean dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos de una manera que se produce un nivel máximo de identidad entre las secuencias. “Identidad” se refiere al grado en el que las secuencias de aminoácidos o nucleótidos son invariantes. La alineación de secuencias de aminoácidos, y en cierta medida las secuencias de nucleótidos, también pueden tener en cuenta diferencias conservativas y/o sustituciones frecuentes en aminoácidos (o nucleótidos). Las diferencias conservativas son aquellas que conservan las propiedades fisicoquímicas de los residuos implicados. Las alineaciones pueden ser globales (alineación de las secuencias comparadas en toda la longitud de las secuencias e incluyendo todos los residuos) o locales (alineación de una porción de las secuencias que incluye sólo la región o las regiones más similar(es)).
“ Identidad” por sí misma tiene un significado reconocido en la técnica y puede calcularse usando técnicas publicadas. (Véase, por ejemplo; Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Aunque existen varios métodos para medir la identidad entre dos polinucleótidos o polipéptidos, el término “identidad” lo conocen bien los expertos en la técnica (Carillo, H. y Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).
Tal como se usa en el presente documento, homóloga (con respecto a secuencias de ácido nucleico y/o de aminoácidos) significa aproximadamente mayor de o igual al 25% de homología de secuencia, normalmente mayor de o igual al 25%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90% o el 95% de homología de secuencia; si fuese necesario, puede especificarse el porcentaje preciso. Para los fines en el presente documento, los términos “homología” e “identidad” se usan a menudo de manera intercambiable, a menos que se indique lo contrario. En general, para la determinación del porcentaje de homología o identidad, se alinean las secuencias de modo que se obtiene el apareamiento de orden más alto (véase, por ejemplo; Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Mediante la homología de secuencia, el número de aminoácidos conservados se determina por medio de programas de algoritmos de alineación convencionales, y pueden usarse con las penalizaciones de hueco por defecto establecidas por cada proveedor. Las moléculas de ácido nucleico sustancialmente homólogas se hibridarían normalmente con rigurosidad moderada o rigurosidad alta en toda la longitud del ácido nucleico de interés. También se contemplan moléculas de ácido nucleico que contienen codones degenerados en lugar de codones en la molécula de ácido nucleico en hibridación.
Si cualesquiera dos moléculas tienen secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos que son al menos el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% “idénticas” u “homólogas” puede determinarse usando algoritmos informáticos conocidos, tales como el programa “FASTA”, usando, por ejemplo, los parámetros por defecto como en Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (otros programas incluyen el paquete de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo et al. (1988) S iA m J Applied Math 48:1073). Por ejemplo, puede usarse la función BLAST de la base de datos del Centro Nacional para la Información Biotecnológica para determinar la identidad. Otros programas disponibles comercial o públicamente incluyen, el programa “MegAlign” de DNAStar (Madison, WI) y el programa “Gap” del Grupo de Computación Genética de la Universidad de Wisconsin (UWG) (Madison WI). El porcentaje de homología o identidad de proteínas y/o moléculas de ácido nucleico puede determinarse, por ejemplo, comparando la información de secuencia usando un programa informático GAP (por ejemplo, Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443, revisado por Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482). En resumen, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares dividido entre el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros por defecto para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, tal como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358 (1979); (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo en cada hueco; y (3) ninguna penalización para los huecos terminales.
Por tanto, tal como se usa en el presente documento, el término “identidad” u “homología” representa una comparación entre un polipéptido o polinucleótido de prueba y uno de referencia. Tal como se usa en el presente documento, el término al menos “el 90% idéntica a” se refiere a identidades en porcentaje de desde el 90 hasta el 99,99% con respecto a la secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos de referencia del polipéptido. La identidad a un nivel del 90% o más es indicativa del hecho de que, suponiendo con fines de ejemplificación, se comparan una longitud de polipéptido de prueba y de referencia de 100 aminoácidos. No más del 10% (es decir, 10 de cada 100) de los aminoácidos en el polipéptido de prueba difieren de los del polipéptido de referencia. Pueden realizarse comparaciones similares entre polinucleótidos de prueba y de referencia. Tales diferencias pueden representarse como mutaciones puntuales distribuidas al azar en toda la longitud de un polipéptido o pueden estar agrupadas en una o más ubicaciones de longitud variable hasta el máximo permitido, por ejemplo, una diferencia de 10/100 aminoácidos (aproximadamente el 90% de identidad). Las diferencias se definen como sustituciones, inserciones o deleciones de ácido nucleico o aminoácidos. Al nivel de homologías o identidades superiores a aproximadamente el 85-90%, el resultado debe ser independiente del programa y de los parámetros de hueco establecidos; tales altos niveles de identidad pueden evaluarse fácilmente, a menudo mediante alineación manual sin depender de un software.
Tal como se usa en el presente documento, una secuencia alineada se refiere al uso de homología (similitud y/o identidad) para alinear posiciones correspondientes en una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos. Normalmente, se alinean dos o más secuencias que están relacionadas con una identidad de un 50% o más. Un conjunto alineado de secuencias se refiere a 2 o más secuencias que se alinean en posiciones correspondientes, y puede incluir la alineación de secuencias derivadas de ARN, tales como EST y otros ADNc, alineadas con una secuencia de ADN genómico.
Tal como se usa en el presente documento, “cebador” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede actuar como punto de inicio de la síntesis de ADN dirigida por molde en condiciones apropiadas (por ejemplo, en presencia de cuatro nucleósidos trifosfato diferentes y un agente de polimerización, tal como ADN polimerasa, ARN polimerasa o transcriptasa inversa) en un tampón apropiado y a una temperatura adecuada. Se apreciará que unas determinadas moléculas de ácido nucleico pueden servir como “sonda” y como “cebador”. Un cebador, sin embargo, tiene un grupo 3'-hidroxilo para la extensión. Un cebador puede usarse en una variedad de métodos, incluyendo, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR con transcriptasa inversa (RT), PCR de ARN, LCR, PCR múltiple, PCR angosta (“panhandle PCR"), Pc R de captura, PCR de expresión, 3' y 5' rAc E, PCR in situ, PCR mediada por ligación y otros protocolos de amplificación.
Tal como se usa en el presente documento, una variante alélica o variación alélica hace referencia a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de manera natural mediante mutación, y puede dar como resultado polimorfismo fenotípico dentro de poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar para polipéptidos que tienen alterada la secuencia de aminoácidos. El término “variante alélica” también se usa en el presente documento para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. Normalmente, la forma de referencia del gen codifica para una forma de tipo natural y/o una forma predominante de un polipéptido a partir de una población o un miembro individual de referencia de una especie. Normalmente, las variantes alélicas, que incluyen variantes interespecie y intraespecie, tienen normalmente al menos el 80%, el 90% o más de identidad de aminoácidos con una forma de tipo natural y/o predominante de la misma especie; el grado de identidad depende del gen y de si la comparación es interespecie o intraespecie. En general, las variantes alélicas intraespecie tienen al menos aproximadamente el 80%, el 85%, el 90% o el 95% o más de identidad con una forma de tipo natural y/o predominante, incluyendo el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más de identidad con una forma de tipo natural y/o predominante de un polipéptido. En general, la referencia a una variante alélica en el presente documento se refiere a variaciones en proteínas entre los miembros de la misma especie.
Tal como se usa en el presente documento, “alelo”, que se usa de manera intercambiable en el presente documento con “variante alélica”, se refiere a formas alternativas de un gen o porciones del mismo. Los alelos ocupan el mismo locus o la misma posición en cromosomas homólogos. Cuando un sujeto tiene dos alelos idénticos de un gen, se dice que el sujeto es homocigótico para ese gen o alelo. Cuando un sujeto tiene dos alelos diferentes de un gen, se dice que el sujeto es heterocigótico para el gen. Los alelos de un gen específico pueden diferir entre sí en un solo nucleótido o en varios nucleótidos, y pueden incluir sustituciones, deleciones e inserciones de nucleótidos. Un alelo de un gen también puede ser una forma de un gen que contiene una mutación.
Tal como se usa en el presente documento, variantes de especie se refieren a variantes en polipéptidos entre diferentes especies, incluyendo diferentes especies de mamíferos, tales como ratón y humano.
Tal como se usa en el presente documento, una variante de corte y empalme se refiere a una variante producida mediante procesamiento diferencial de un transcrito primario de ADN genómico que da como resultado más de un tipo de ARNm.
Tal como se usa en el presente documento, modificación se refiere a la modificación de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o de una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico, e incluye deleciones, inserciones y reemplazos de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente. Los métodos de modificación de un polipéptido son rutinarios para los expertos en la técnica, tales como el uso de metodologías de ADN recombinante.
Tal como se usa en el presente documento, el término promotor significa una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan la unión de ARN polimerasa y el inicio de la transcripción. Las secuencias promotoras se hallan habitualmente, pero no siempre, en la región 5' no codificante de los genes.
Tal como se usa en el presente documento, polipéptido o proteína, o porción biológicamente activa de los mismos, aislado o purificado está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula o del tejido del que se deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. Puede determinarse que las preparaciones están sustancialmente libres si parecen estar libres de impurezas fácilmente detectablestal como se determina mediante métodos de análisis convencionales, tales como cromatografía en capa fina (CCF), electroforesis en gel y cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), usados por los expertos en la técnica para evaluar tal pureza, o suficientemente puras de tal manera que la purificación adicional no alteraría de manera detectable las propiedades físicas y químicas de la sustancia, tales como las actividades enzimática y biológica. Los expertos en la técnica conocen métodos para la purificación de los compuestos para producir compuestos sustancial y químicamente puros. Sin embargo, un compuesto sustancial y químicamente puro puede ser una mezcla de estereoisómeros. En tales casos, una purificación adicional podría aumentar la actividad específica del compuesto.
El término sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas en las que la proteína se separa a partir de los componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce de manera recombinante. En un aspecto, el término sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menos de aproximadamente el 30% (en peso seco) de proteínas no enzimáticas (también denominadas en el presente documento proteínas contaminantes), generalmente menos de aproximadamente el 20% de proteínas no enzimáticas o el 10% de proteínas no enzimáticas o menos de aproximadamente el 5% de proteínas no enzimáticas. Cuando la proteína enzimática se produce de manera recombinante, también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de o menos de aproximadamente el 20%, el 10% o el 5% del volumen de la preparación de proteínas enzimáticas.
Tal como se usa en el presente documento, el término sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas incluye preparaciones de proteínas enzimáticas en las que la proteína se separa a partir de los precursores químicos u otras sustancias químicas que están implicados en la síntesis de la proteína. El término incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menos de aproximadamente el 30% (en peso seco), el 20%, el 10%, el 5% o menos de precursores químicos o sustancias químicas o componentes no enzimáticos.
Tal como se usa en el presente documento, sintético, con referencia a, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico sintética o un gen sintético o un péptido sintético, se refiere a una molécula de ácido nucleico o molécula de polipéptido que se produce mediante métodos recombinantes y/o mediante métodos de síntesis química.
Tal como se usa en el presente documento, un vector de expresión incluye vectores capaces de expresar ADN que está unido operativamente con secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión de tales fragmentos de ADN. Tales segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras y, opcionalmente, pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación y similares. En general, los vectores de expresión se derivan de ADN plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos. Por tanto, un vector de expresión se refiere a un constructo de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un fago, un virus recombinante u otro vector que, tras la introducción en una célula huésped apropiada, da como resultado la expresión del ADN clonado. Los expertos en la técnica conocen bien vectores de expresión apropiados, e incluyen aquellos que son replicables en células eucariotas y/o células procariotas y aquellos que permanecen episómicos o aquellos que se integran en el genoma de las células huésped.
Tal como se usa en el presente documento, vector también incluye “vectores de virus” o “vectores virales”. Los vectores virales son virus modificados por ingeniería que se unen operativamente a los genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas) los genes exógenos al interior de las células.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término evaluar incluya la determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la actividad de una proteasa, o un dominio de la misma, presente en la muestra, y también de obtener un índice, una razón, un porcentaje, un valor visual u otro valor indicativo del nivel de la actividad. La evaluación puede ser directa o indirecta y, por supuesto, no es necesario que la especie química realmente detectada sea el propio producto de la proteólisis, sino que puede ser, por ejemplo, un derivado del mismo o alguna sustancia adicional. Por ejemplo, la detección de un producto de escisión de una proteína del complemento, tal como mediante SDS-PAGE y tinción de proteínas con azul de Coomassie.
Tal como se usa en el presente documento, una composición se refiere a cualquier mezcla. Puede ser una disolución, una suspensión, un líquido, un polvo, una pasta, una sustancia acuosa, una sustancia no acuosa o cualquier combinación de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, un kit es una combinación envasada que opcionalmente incluye otros elementos, tales como reactivos adicionales e instrucciones para el uso de la combinación o los elementos del mismo.
Tal como se usa en el presente documento, “enfermedad o trastorno” se refiere a un estado patológico en un organismo resultante de una causa o estado que incluye, pero sin limitarse a, infecciones, estados adquiridos, estados genéticos, y está caracterizado por síntomas identificables.
Tal como se usa en el presente documento, “tratar” a un sujeto con una enfermedad o un estado significa que los síntomas del sujeto se alivian parcial o totalmente, o permanecen estáticos tras el tratamiento. Por tanto, tratamiento abarca la profilaxis, terapia y/o cura. La invención no abarca tales métodos de tratamiento.
Profilaxis se refiere a la prevención de una posible enfermedad y/o a la prevención del empeoramiento de los síntomas o la progresión de una enfermedad. Tratamiento también abarca cualquier uso farmacéutico de un interferón modificado y de las composiciones descritas en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, un agente farmacéuticamente eficaz incluye cualquier agente terapéutico o agente bioactivo, incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, anestésicos, vasoconstrictores, agentes de dispersión, fármacos terapéuticos convencionales incluyendo fármacos de molécula pequeña y proteínas terapéuticas.
Tal como se usa en el presente documento, tratamiento significa cualquier manera en la que se mejoran o alteran de otro modo de manera beneficiosa los síntomas de un estado, un trastorno o una enfermedad u otra indicación.
Tal como se usa en el presente documento, un paciente se refiere a un sujeto humano.
Tal como se usa en el presente documento, una cantidad eficaz es la cantidad de un agente terapéutico necesaria para prevenir, curar, mejorar, detener o detener parcialmente un síntoma de una enfermedad o un trastorno.
Tal como se usa en el presente documento, animal incluye cualquier animal, tal como, pero no se limitan a, primates incluyendo humanos, gorilas y monos; roedores tales como ratones y ratas; aves de corral tales como gallinas; rumiantes tales como cabras, vacas, ciervos, ovejas; ovinos tales como cerdos y otros animales. Los animales no humanos excluyen a los humanos como animal contemplado. Las hialuronidasas descritas en el presente documento son de cualquier fuente, animal, vegetal, procariota y fúngica. La mayoría de las enzimas son de origen animal, incluyendo de origen mamífero.
Tal como se usa en el presente documento, un control se refiere a una muestra que es sustancialmente idéntica a la muestra de prueba, excepto que no se trata con un parámetro de prueba, o, si es una muestra de plasma, puede ser de un voluntario normal no afectado por el estado de interés. Un control también puede ser un control interno.
Tal como se usa en el presente documento, las formas en singular “un”, “uno/una” y “el/la” incluyen los referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a un compuesto que comprende “un dominio extracelular” incluye compuestos con uno o una pluralidad de dominios extracelulares.
Tal como se usa en el presente documento, los intervalos y las cantidades pueden expresarse como “aproximadamente” un valor o intervalo particular. Aproximadamente también incluye la cantidad exacta. Por tanto, “aproximadamente 5 mM” significa “aproximadamente 5 mM” y también “5 mM”.
Tal como se usa en el presente documento, las abreviaturas para los grupos protectores, aminoácidos y cualquier otro compuesto, a menos que se indique lo contrario, según su uso habitual, son abreviaturas reconocidas o según la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB (véase, (1972) Biochem. 11:1726).
B. Visión general
En el presente documento se describen métodos para la producción a gran escala de hialuronidasas solubles, tales como hialuronidasas humanas solubles, incluyendo PH20 humana soluble (sHuPH20), tal como, por ejemplo, rHuPH20 soluble. Normalmente, los métodos utilizan biorreactores para cultivar células que producen la hialuronidasa soluble, tales como células CHO (por ejemplo, células CHO DG44). Ejemplos de tales células son células 2B2 que producen rHuPH20 soluble. El volumen de cultivo celular en el biorreactor puede oscilar desde 1 l hasta 5000 l o más, pero normalmente es de o de aproximadamente 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 ó 3500 litros. Antes de la inoculación del biorreactor, las células se expanden a través de una serie de volúmenes crecientes de cultivo celular para generar el número requerido de células para la siembra del biorreactor. Normalmente, el cultivo celular en el biorreactor se siembra con de 105 a 106 células/ml, pero puede sembrarse con más o menos. Después se incuban las células en el biorreactor durante 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o más días.
Durante esta incubación, se añaden medios de alimentación al cultivo celular para suministrar nutrientes y complementos adicionales. Los complementos o nutrientes a modo de ejemplo que pueden incluirse en los medios de alimentación incluyen, pero no se limitan a, glucosa, glutamina o sustituto de glutamina, tal como L-alanil-L-glutamina, insulina y butirato de sodio. El tipo y la cantidad de complemento añadido pueden influir en el crecimiento celular y en la producción de proteína. Por ejemplo, la insulina y la glutamina o el sustituto de glutamina pueden incorporarse en el primer medio de alimentación añadido al cultivo celular para aumentar el crecimiento celular y la densidad celular máxima. Los medios de alimentación posteriores pueden diseñarse para fomentar más la producción de proteína que el crecimiento celular. Los complementos tales como la insulina pueden excluirse o reducirse en cantidad, al igual que la glutamina o el sustituto de glutamina, tal como L-alanil-L-glutamina. En cambio, los complementos tales como el extracto de levadura que potencian la síntesis de proteína pueden aumentarse en cantidad. Además, también pueden incluirse complementos que potencian la detención del ciclo celular y, por tanto, el aumento de la producción de proteína. Un ejemplo de tales complementos es el butirato de sodio.
Tras la producción de proteína en el biorreactor, se recogen las células y se concentra la hialuronidasa soluble, tal como rHuPH20 soluble, que se ha secretado en los medios de cultivo celular, antes del inicio del procedimiento de purificación. Después se purifica la hialuronidasa soluble a partir de la disolución concentrada de proteínas usando una serie de etapas de purificación. Métodos de purificación a modo de ejemplo que se usan para los métodos en el presente documento es una combinación de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía de afinidad. Después se concentra la proteína purificada y se somete a diafiltración.
Utilizando los métodos descritos en el presente documento, se producen entre aproximadamente 0,5-50 gramos de hialuronidasas solubles, tales como rHuPH20 soluble, por 100 l de cultivo celular. En algunos ejemplos, la cantidad de rHuPH20 soluble producida por 100 l de cultivo es de o de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30 ó 40 gramos o más. En algunos ejemplos, el rendimiento de hialuronidasa soluble tras la purificación puede oscilar entre o entre aproximadamente el 10% y el 50% de la cantidad producida antes de la purificación. Por ejemplo, el rendimiento tras la purificación puede ser de o de aproximadamente el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45% o el 50% de la cantidad producida antes de la purificación. En general, la actividad específica de rHuPH20 soluble producida usando los métodos en el presente documento es de al menos o aproximadamente 80000, 100000, 120000, 140000, 160000 ó 180000 unidades/mg.
C. Hialuronidasas
Las hialuronidasas son una familia de enzimas que degradan el ácido hialurónico (también conocido como hialuronano o hialuronato), un componente esencial de la matriz extracelular y un constituyente principal de la barrera intersticial. Al catalizar la hidrólisis del ácido hialurónico, la hialuronidasa reduce la viscosidad del ácido hialurónico, aumentando de ese modo la permeabilidad tisular. Como tal, las hialuronidasas se han usado, por ejemplo, como agente de difusión o dispersión junto con otros agentes, fármacos y proteínas para potenciar su dispersión y administración.
1. Estructura y función de las hialuronidasas
Hay tres clases generales de hialuronidasas: hialuronidasa de mamífero, hialuronidasa bacteriana y hialuronidasa de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos. Las hialuronidasa de tipo mamífero (EC 3.2.1.35) son endo-fi-N-acetil-hexosaminidasas que hidrolizan el enlace glicosídico f i1 ^ 4 del ácido hialurónico en oligosacáridos de diversas longitudes, tales como tetrasacáridos y hexasacáridos. Tienen actividades tanto hidrolíticas como transglicosidasa y pueden degradar el ácido hialurónico y los sulfatos de condroitina, tales como C4-S y C6-S. Las hialuronidasas de este tipo incluyen hialuronidasas humanas.
Hay seis genes similares a hialuronidasa en el genoma humano: HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4, HYALP1 y PH20/SPAM1. HYALP1 es un pseudogén y no se ha demostrado que HYAL3 (SEQ ID NO:36) posea actividad enzimática frente a ninguna de los sustratos conocidos. HYAL4 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO:37) es una condroitinasa y muestra poca actividad frente al ácido hialurónico. HYAL1 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO:34) es la enzima activa ácida prototípica y PH20 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO:1) es la enzima activa neutra prototípica. En general, las hialuronidasas activas ácidas, tales como HYAL1 y HYAL2 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO:35) carecen de actividad catalítica a pH neutro (es decir, pH 7). Por ejemplo, HYAL1 tiene poca actividad catalítica in vitro por encima de pH 4,5 (Frost et al. (1997) Anal Biochemistry 251:263-269). HYAL2 es una enzima activa ácida con una actividad específica muy baja in vitro. Las enzimas similares a hialuronidasa también pueden estar caracterizadas por aquellas que generalmente están fijadas a la membrana plasmática mediante un ancla de glicosilfosfatidil inositol, tales como HYAL2 humana y PH20 humana (Danilkovitch-Miagkova, et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA. 100(8):4580-5) y aquellas que generalmente son solubles, tales como HYAL1 humana (Frost et al, (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5). Al catalizar la hidrólisis del ácido hialurónico, un constituyente principal de la barrera intersticial, la hialuronidasa reduce la viscosidad del ácido hialurónico, aumentando de ese modo la permeabilidad tisular. También se ha demostrado que muestra actividades antineoplásicas y anticarcinogénicas.
La glicosilación ligada a N de algunas hialuronidasas puede ser muy importante para su actividad catalítica y estabilidad. Aunque la alteración del tipo de glicano que modifica una glicoproteína puede tener efectos drásticos sobre la antigenicidad, el plegamiento estructural, la solubilidad y la estabilidad de una proteína, se cree que muchas enzimas no requieren glicosilación para una actividad enzimática óptima. Por tanto, las hialuronidasas son únicas en este aspecto, en que la eliminación de glicosilación ligada a N puede dar como resultado una inactivación casi completa de la actividad hialuronidasa. Para tales hialuronidasas, la presencia de glicanos ligados a N es crítica para generar una enzima activa.
Hay siete posibles sitios de glicosilación ligada a N en N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 de PH20 humana ejemplificada en SEQ ID NO:1. Se forman enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína C60 y C351 y entre C224 y C238 para formar el dominio central de hialuronidasa. Sin embargo, se requieren cisteínas adicionales en el extremo carboxilo-terminal para una actividad catalítica enzimática neutra de tal manera que los aminoácidos 36 a 464 de SEQ ID NO:1 contienen el dominio de hialuronidasa PH20 humana mínimamente activo. Por tanto, no se requiere el sitio de glicosilación ligada a N N490 para una actividad hialuronidasa apropiada.
Los oligosacáridos ligados a N se dividen en varios tipos principales (de oligomanosa, complejos, híbridos, sulfatados), teniendo todos ellos núcleos de (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc unidos a través del nitrógeno de amida de los residuos de Asn que se encuentran dentro de las secuencias -Asn-Xaa-Thr/Ser- (donde Xaa no es Pro). Se ha notificado la glicosilación en un sitio -Asn-Xaa-Cys- para la de proteína C de coagulación. En algunos casos, la hialuronidasa puede contener enlaces tanto N-glicosídicos como O-glicosídicos. Por ejemplo, rHuPH20 (tal como se produce en los métodos descritos en el presente documento) tiene oligosacáridos ligados a O así como oligosacáridos ligados a N.
Los métodos descritos en el presente documento proporcionan un procedimiento para la producción y purificación de grandes cantidades de una preparación soluble de preparación de hialuronidasa PH20 humana.
2. PH20
La PH20 humana (también conocida como proteína de superficie del espermatozoide PH20), tal como se indicó anteriormente, es la enzima activa neutra prototípica que generalmente está fijada a la membrana plasmática mediante un ancla de glicosilfosfatidil inositol (GPI). Está implicada de manera natural en la adhesión espermatozoide-óvulo y ayuda a que el espermatozoide penetre en la capa de células del cúmulo digiriendo el ácido hialurónico. El transcrito de ARNm de PH20 se traduce normalmente para generar una proteína precursora de 509 aminoácidos que contiene una secuencia señal de 35 aminoácidos en el extremo N-terminal (posiciones de residuo de aminoácido 1-35). Por tanto, el polipéptido de PH20 maduro es un polipéptido de 474 aminoácidos con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2.
Las formas solubles de PH20 humana (sHuPH20) pueden producirse y purificarse usando los métodos descritos en el presente documento. La generación de sHuPH20 se describe en las solicitudes de patente estadounidense relacionadas n.os 10/795.095, 11/065.716 y 11/238.171 (también denominada en estas solicitudes sHASEGP o rHuPH20) y en los ejemplos 1 y 4 a continuación. Las formas solubles se producen expresando el ácido nucleico que codifica para los truncamientos C-terminales del polipéptido de PH20 maduro que carecen de los sitios de unión a GPI. Las formas solubles de PH20 humana incluyen rHuPH20 soluble que se produce y purifica usando los métodos descritos en el presente documento.
D. Células que expresan rHuPH20 soluble
Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para generar y purificar grandes cantidades de rHuPH20 soluble. La rHuPH20 soluble se expresa en células CHO que se hacen crecer en cultivo celular a gran escala. La expresión se efectúa usando un vector de expresión que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3 (correspondiente a los aminoácidos 1 a 482 del polipéptido de PH20 humana precursor expuesto en SEQ ID NO:1). Tras la traducción, se escinde la secuencia señal de 35 aminoácidos y se secreta la rHuPH20 soluble al medio. El vector también contiene un IRES en el sentido de 3' de la región que codifica para rHuPH20 soluble, un gen de dihidrofolato reductasa de ratón y la secuencia de pA SV40. El vector de expresión se introdujo en células DG44, que son deficientes en dihidrofolato reductasa (dhfr-), que se han adaptado para crecer en cultivo en suspensión en un medio libre de productos animales químicamente definido. Las células resultantes que expresan rHuPH20 soluble incluyen aquellas descritas en los ejemplos 1 y 4 a continuación, e incluyen células denominadas células 3D35M, 2B2, 3E10B, 1 B3 , 5C1, 1G11 y 2G10.
Las líneas celulares a modo de ejemplo incluyen CHO (incluyendo células DG44 y células CHO-S).
Las líneas celulares adaptadas a medios libres de suero también están disponibles, lo que facilita la purificación de proteínas secretadas a partir de los medios de cultivo celular.
a. Células 3D35M
Ejemplos de células que expresan rHuPH20 soluble son células 3D35M, descritas en el ejemplo 1 a continuación y en las publicaciones de patente estadounidense n.os 20040268425, 20050260186 y 20060104968. Las células 3d 35M son células CHO DG44 deficientes en dihidrofolato reductasa (dhfr-) que expresan rHuPH20 soluble. Las células se transformaron con un vector de expresión HZ24 que tenía la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:50. Este vector contiene un promotor de CMV que dirige la expresión de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de 482 aminoácidos (SEQ ID NO:3) que corresponde a las posiciones de aminoácido 1 a 482 de PH20 humana de longitud completa expuesta en SEQ Id NO:1. Este incluye una secuencia señal N-terminal de 35 aminoácidos. El vector también contiene un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) después de la secuencia que codifica para PH20, seguido de un gen de dihidrofolato reductasa de ratón y la secuencia de poliadenilación SV40. Tras la traducción, se procesa el polipéptido de 482 aminoácidos para eliminar la secuencia señal de 35 aminoácidos, dando como resultado la secreción de rHuPH20 soluble.
La caracterización de células 3D35M demostró que la región de ácido nucleico que codifica para rHuPH20 soluble está presente en las células en un número de copias de aproximadamente 318 copias/célula. La rHuPH20 soluble producida a partir de células 3D35M mediante los métodos en el presente documento es una mezcla de especies que pueden incluir uno o más de los polipéptidos que tienen las secuencias expuestas en las SEQ ID NO:4-9. En una caracterización a modo de ejemplo de estas especies (descrita en el ejemplo 11), la especie expuesta en SEQ ID NO:4 estaba presente en una abundancia del 0,2%, la especie expuesta en SEQ ID NO:5 (correspondiente a los aminoácidos 1 a 446 de SEQ ID NO:4) estaba presente en una abundancia del 18,4%, la especie expuesta en SEQ ID NO:6 (correspondiente a los aminoácidos 1 a 445 de SEQ ID NO:4) estaba presente en una abundancia del 11,8%, la especie expuesta en SEQ ID NO:7 (correspondiente a los aminoácidos 1 a 444 de SEQ ID NO:4) estaba presente en una abundancia del 56,1%; y la especie expuesta en SEQ ID NO:8 (correspondiente a los aminoácidos 1 a 443 de SEQ ID NO:4) estaba presente en una abundancia del 13,6%. Tal heterogeneidad en la preparación de rHuPH20 soluble es probablemente el resultado de la escisión C-terminal mediante las peptidasas presentes durante los métodos de producción y purificación descritos en el presente documento.
Las células 3D35M pueden hacerse crecer en medio de cultivo celular con o sin metotrexato. También pueden añadirse complementos adicionales, tales como glutamina. En algunos ejemplos, las células se hacen crecer en medio de cultivo celular que contiene, por ejemplo, metotrexato 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 |iM o 2 |iM y que carece de hipoxantina y timidina. En un ejemplo, las células 3D35M se cultivan a 37°C en el 5-7% de CO2 en medio de cultivo (tal como medio CD CHO, Invitrogen) sin hipoxantina ni timidina y con 100 nM de metotrexato y glutamina o un sustituto de glutamina, tal como L-alanil-L-glutamina, una forma dipeptídica estabilizada de la L-glutamina. Pueden usarse otros medios de cultivo celular apropiados para células CHO para cultivar células 3D35M, incluyendo, pero sin limitarse a, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo de Eagle (EMEM), medio de Eagle modificado por Iscove (IMEM), F12 y RPMI. Las células 3D35M que se hicieron crecer en tales condiciones en matraces de centrifugación pueden producir una actividad enzimática en exceso de 1000 unidades/ml. Cuando se cultivan en un biorreactor, tal como se describe en el ejemplo comparativo 3 a continuación, las células 3D35M pueden producir rHuPH20 soluble con una actividad enzimática en exceso de 2000 unidades/ml.
b. Células 2B2
Los ejemplos de células que expresan rHuPH20 soluble para la producción de rHuPH20 en los métodos descritos en el presente documento se describen en el ejemplo 4 y se denominan células 2B2. Las células 2B2 se generaron adaptando células 3D35M a mayores niveles de metotrexato (es decir, 20 |iM) y seleccionando clones que crecieron en la mayor concentración de metotrexato. Esta adaptación aumentó la actividad hialuronidasa producida por las células. Las células DG44 son deficientes en dihidrofolato reductasa (dhfr-) y, por tanto, no pueden producir nucleósidos. El vector de expresión presente en células 3D35M y 2B2 contiene, además del gen PH20, la secuencia codificante para la dihidrofolato reductasa de ratón. El metotrexato es un potente inhibidor competitivo de la dihidrofolato reductasa. Por tanto, al aumentar la concentración de metotrexato en los medios de cultivo, las células que expresan hialuronidasa se ven forzadas a producir más dihidrofolato reductasa de ratón para permanecer viables. Esto puede efectuarse, por ejemplo, mediante amplificación de genes o reorganización del ADN integrado para dar una disposición más estable y productiva. Por tanto, forzar un aumento de la producción de dihidrofolato reductasa de ratón también puede dar como resultado un aumento de la producción de sHuPH20. Una comparación de la actividad enzimática de rHuPH20 soluble producida por células 2B2 y células 3D35M demostró que la actividad estaba normalmente entre el 80% y el 100% mayor en células 2B2 (véase, por ejemplo, el ejemplo 5 a continuación) en comparación con células 3D35M.
Las células 2B2 se seleccionaron de entre los clones celulares que se aislaron tras la selección con metotrexato 20 |iM como la línea celular que produjo rHuPH20 soluble que tenía la actividad enzimática más alta (véase, por ejemplo, el ejemplo 4). Cuando se caracterizó, se observó que la región de ácido nucleico que codifica para rHuPH20 soluble estaba presente en células 2B2 en un número de copias de aproximadamente 206 copias/célula. El análisis por transferencia de tipo Southern de ADN genómico de células 2B2 digerido con Spe I-, Xba I- y BamH I/Hind III usando una sonda específica para la región de ácido nucleico que codifica para rHuPH20 soluble reveló el siguiente perfil de digestión de restricción: una banda de hibridación principal de ~7,7 kb y cuatro bandas de hibridación secundarias (~13,9, ~6,6, -5,7 y ~4,6 kb) con ADN digerido con Spe I; una banda de hibridación principal de ~5,0 kb y dos bandas de hibridación secundarias (~13,9 y ~6,5 kb) con ADN digerido con Xba I; y una única banda de hibridación de ~1,4 kb observada usando ADN de 2B2 digerido con BamH I/Hind III.
Las células 2B2 pueden hacerse crecer en medio de cultivo celular con o sin metotrexato. También pueden añadirse complementos adicionales, tales como glutamina, insulina y extracto de levadura. En algunos ejemplos, las células se hacen crecer en medio de cultivo celular que contiene, por ejemplo, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 |iM, 2 |iM, 5 |iM, 10 |iM, 20 |iM o más de metotrexato y que carece de hipoxantina y timidina. En un ejemplo, las células 2B2 se cultivan a 37°C en el 5-7% de CO2 en medio de cultivo (tal como medio CD CHO, Invitrogen) sin hipoxantina ni timidina y con metotrexato 20 |iM y glutamina o L-alanil-L-glutamina, una forma dipeptídica estabilizada de la L-glutamina. Pueden usarse otros medios de cultivo celular apropiados para células CHO para cultivar células 2B2, incluyendo, pero sin limitarse a, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo de Eagle (EMEM), medio de Eagle modificado por Iscove (IMEM), F l2 y RPMI. Las células 2B2 que se hicieron crecer en tales condiciones en matraces de centrifugación pueden producir una actividad hialuronidasa en exceso de 3000 unidades/ml. Cuando se cultivan en un biorreactor, tal como se describe en el ejemplo 8 a continuación, las células 2B2 pueden producir rHuPH20 soluble que tiene una actividad enzimática en exceso de 17000 unidades/ml de actividad hialuronidasa.
La rHuPH20 soluble producida a partir de células 2B2 mediante los métodos en el presente documento es una mezcla de especies de polipéptidos que tienen las secuencias expuestas en las SEQ ID NO:4-9. En una caracterización a modo de ejemplo del producto de rHuPH20 soluble producido mediante células 2B2 (descrita en el ejemplo 11), la especie expuesta en SEQ ID NO:4 estaba presente en una abundancia del 1,9%, la especie expuesta en SEQ ID NO:5 (correspondiente a los aminoácidos 1 a 446 de SEQ ID NO:4) estaba presente en una abundancia del 46,7%, la especie expuesta en SEQ ID NO:6 (correspondiente a los aminoácidos 1 a 445 de SEQ ID NO:4) estaba presente en una abundancia del 16,7%, la especie expuesta en SEQ ID NO:7 (correspondiente a los aminoácidos 1 a 444 de SEQ ID NO:4) estaba presente en una abundancia del 27,8%; y la especie expuesta en SEQ ID NO:8 (correspondiente a los aminoácidos 1 a 443 de SEQ ID NO:4) estaba presente en una abundancia del 6,9%. Tal como se indicó para la rHuPH20 soluble producida a partir de células 3D35M, la heterogeneidad en la preparación de rHuPH20 soluble a partir de células 2B2 es probablemente el resultado de la escisión C-terminal mediante las peptidasas presentes durante los métodos de producción y purificación descritos en el presente documento.
E. Expansión del cultivo celular
Los métodos descritos en el presente documento emplean biorreactores para hacer crecer grandes volúmenes de cultivo celular para producir grandes cantidades de rHuPH20 soluble. Tal como se describe con detalle a continuación, estos métodos incluyen una fase de expansión celular, una fase de producción de proteína, una fase de concentración de proteína e intercambio del tampón y una fase de purificación. Las células que expresan rHuPH20 soluble, tales como las células 2B2, se expanden inicialmente desde un inóculo original, tal como una alícuota de células de un banco de células de trabajo (BCT) o banco de células maestro (BCM), hasta un volumen más grande antes del cultivo en el biorreactor para la fase de producción. El volumen de cultivo final en la fase de expansión es directamente proporcional al volumen del biorreactor usado en la siguiente fase de producción. Normalmente, un biorreactor más grande se inocula usando un volumen de cultivo final más grande de la fase de expansión que un biorreactor más pequeño.
Las células que expresan rHuPH20 soluble se expanden a través de una serie de cultivos, aumentando cada uno en cuanto a volumen con respecto al anterior y usándose cada uno como inóculo para el siguiente cultivo. Ejemplos de tales células son células 2B2. Normalmente, el inóculo original es uno en el que la pureza e identidad de las células y el número de células están definidos. Estas células pueden almacenarse congeladas, tal como a -20°C, -70°C o -80°C, o pueden mantenerse en medios líquidos a, por ejemplo, 4°C, o mantenerse en cultivo a, por ejemplo, 37°C. En algunos casos, el inóculo original es una alícuota de un banco de células maestro o banco de células de trabajo que se ha almacenado congelada. En tales casos, el inóculo se descongela, tal como en un baño de agua a 37°C. Normalmente, el inóculo celular original se centrifuga y las células se resuspenden en un medio de cultivo celular apropiado. Por ejemplo, las células 2B2 pueden resuspenderse en, y posteriormente cultivarse en, medios basales, tales como medios CD CHO (Invitrogen), o medios CD CGO AGT™ en polvo reconstituidos (Invitrogen), complementados con glutamina o L-alanil-L-glutamina 8 mM y metotrexato 20 |iM. En otro ejemplo, las células pueden hacerse crecer en medios basales complementados con glutamina o L-alanil-L-glutamina 8 mM y metotrexato 100 mM. También puede usarse cualquier otro medio de cultivo celular adecuado para expandir células que expresan hialuronidasa. Por ejemplo, las células pueden cultivarse en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo de Eagle (EMEM), medio de Eagle modificado por Iscove (IMEM), F12, RPMI u otros medios químicamente definidos o indefinidos, con o sin complementos adicionales. Normalmente, las células se hacen crecer en medios libres de suero, pero también pueden hacerse crecer en medios que contienen suero. Un experto en la técnica podría preparar medios de cultivo celular usando otros medios de cultivo celular basales que pueden complementarse con diversos nutrientes para producir medios de cultivo celular en los que se cultivan las células que expresan rHuPH20 soluble.
El inóculo celular se añade al primero de una serie volúmenes crecientes de medios de cultivo celular, expandiendo de ese modo el cultivo celular. Tras la inoculación inicial, las células se expanden en un biorreactor o una incubadora humidificada a una temperatura apropiada con una cantidad de CO2 apropiada. Normalmente, la cantidad de CO2 está entre el 4% y el 9%, normalmente entre el 6,0% y el 8,0%, tal como el 7,0% y la temperatura es de entre 35°C y 39°C, normalmente de entre 36°C y 38°C, tal como de 37°C. Por ejemplo, pueden hacerse crecer células 2B2 y 3D35M en una incubadora humidificada a 37°C con el 7% de CO2. El cultivo puede agitarse, tal como a 90-130 rpm, durante este procedimiento. Cuando las células alcanzan la densidad deseada, tal como, por ejemplo, mayor de 1,0 * 106 células/ml (por ejemplo, entre 1,5 * 106 células/ml y 2,5 * 106 células/ml), el cultivo celular se usa para inocular un volumen más grande de medios de cultivo celular nuevos. Por ejemplo, las células pueden inocularse en el siguiente cultivo a una densidad de 4 * 104 a 4 * 106 células/ml, normalmente de 2 * 105 a 6 * 105 células/ml, tal como de 4 * 105 células/ml. El procedimiento se repite hasta que las células se han expandido hasta el volumen y la densidad celular deseados para la siembra, por ejemplo, de 4 * 104 a 4 * 106 células/ml en el biorreactor.
En un ejemplo, las células que expresan rHuPH20 soluble, tales como células 2B2, se añaden inicialmente a aproximadamente 20 ml de medios de cultivo celular nuevos en un matraz de agitación de 125 ml, dando como resultado un volumen de cultivo de 20-30 ml, normalmente de 25 ml. Tras la incubación a 37°C, el 7% de CO2 y expansión de las células hasta una densidad mayor de 1,5 * 106 células/ml, se añaden medios nuevos al matraz para expandir el cultivo celular hasta 40 ml. Las células se incuban de nuevo hasta lograr una densidad mayor de 1,5 * 106 células/ml, después de lo cual se añade todo el cultivo celular (aproximadamente 40 ml) a medios nuevos para producir un volumen de cultivo de 100 ml en un matraz de centrifugación de 125 ml. Este procedimiento se repite transfiriendo todo el cultivo celular (aproximadamente 100 ml) a un matraz de centrifugación de 250 ml que contiene suficiente medio nuevo como para producir un volumen de cultivo final de 200 ml, después a un matraz de centrifugación de 1 l que contiene suficiente medio nuevo como para producir un volumen de cultivo final de 800 ml, después a un matraz de centrifugación de 6 l que contiene suficiente medio nuevo como para producir un volumen de cultivo final de 5 l y finalmente a un matraz de centrifugación de 36 l que contiene suficiente medio nuevo como para producir un volumen de cultivo final de 32 l. Entre cada transferencia, las células se incuban hasta que el cultivo alcanza una densidad mayor de 1,5 * 106 células/ml. En algunos ejemplos, se logra una mayor densidad celular tras la incubación del matraz de centrifugación de 36 l final. Por ejemplo, las células en el matraz de centrifugación de 36 l pueden expandirse hasta una densidad celular de 3,55 * 106 células/ml a 6,05 * 106 células/ml. Este procedimiento puede usarse para expandir células que expresan rHuPH20 soluble antes de la introducción en un biorreactor de 400 l (300 l de volumen de cultivo) para la fase de producción de proteína (véase, por ejemplo, el ejemplo 8). Pueden usarse volúmenes de cultivo celular más pequeños y densidades celulares diferentes para biorreactores más pequeños. Por ejemplo, las células pueden expandirse hasta un volumen de aproximadamente 20 l con una densidad celular de entre 1,8 * 106 células/ml y 2,5 * 106 células/ml antes de la introducción en un biorreactor de 125 l. En otro ejemplo, las células que expresan rHuPH20 soluble se expanden hasta un volumen de aproximadamente 800 ml con una densidad celular de entre 1,5 * 106 células/ml y 2,5 * 106 células/ml antes de la introducción en un biorreactor de 5 l.
Un experto en la técnica también puede aumentar de escala este procedimiento, al igual que cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, para la introducción de las células en un biorreactor con un volumen de cultivo mayor de 300 l. Por ejemplo, el procedimiento puede aumentarse de escala para la introducción de las células en un biorreactor con un volumen de cultivo de 2500 l, tal como se describe en el ejemplo 12. Por tanto, en un ejemplo de los métodos descritos en el presente documento, tras la descongelación, las células se expanden en serie a través de un matraz de agitación de 125 ml (volumen de trabajo de 20-30 ml, tal como 25 ml), un matraz de agitación de 250 ml (volumen de trabajo de 45-55 ml, tal como 50 ml), un matraz de agitación de 1 l (volumen de trabajo de 190-210 ml, tal como 200 ml), dos matraces de agitación de 2 l (volumen de trabajo de 350-450 ml por matraz, tal como 400 ml por matraz), seis matraces de agitación de 2 l (volumen de trabajo de 350-450 ml por matraz, tal como 400 ml por matraz), un biorreactor de onda de 25 l (volumen de trabajo de 14-16 l, tal como 15 l), un biorreactor de onda de 100 l (volumen de trabajo de 75-85 l, tal como 80 l) y un biorreactor de siembra de 600 l (volumen de trabajo de 440-520 l, tal como 480 l).
F. Producción de proteína
Tras la expansión celular, las células que expresan rHuPH20 soluble se transfieren a un biorreactor para la fase de producción, durante la cual se secretan grandes cantidades de rHuPH20 soluble al medio celular. Esta fase está diseñada normalmente de tal manera que se maximiza el crecimiento celular en la primera mitad de la ejecución en el biorreactor y se maximiza la producción de rHuPH20 soluble en la segunda mitad de la ejecución en el biorreactor. A las células se les proporciona una serie de medios de alimentación en puntos de tiempo particulares durante la producción para regular este procedimiento. Normalmente, las condiciones del biorreactor también se monitorizan para garantizar que se mantienen unas condiciones óptimas durante todo el procedimiento. Los métodos descritos en el presente documento para la proteína pueden aumentarse o disminuirse de escala por un experto en la técnica. Además, modificaciones a, por ejemplo, medios celulares, tiempos de incubación, protocolos de alimentación. Un experto en la técnica puede determinar empíricamente las condiciones apropiadas para la producción de proteína para cualquier biorreactor y tipo de célula dados.
Pueden utilizarse biorreactores de diferentes tamaños y diseños en los métodos en el presente documento. Pueden usarse biorreactores con volúmenes de trabajo de entre 1 l y 5000 l o más en los métodos en el presente documento.
En algunos ejemplos, se usa un biorreactor de 5 l, 36 l, 125 l, 400 l o 3500 l en los métodos en el presente documento para cultivar células en volúmenes de aproximadamente 4 l, 23 l, 100 l, 300 l y 2500 l, respectivamente. Normalmente, el biorreactor se esteriliza antes de la adición de medios de cultivo celular o células. La esterilización puede efectuarse mediante esterilización en autoclave o tratando de otro modo con vapor para algunos biorreactores, o mediante tratamiento con una disolución esterilizante, tal como hidróxido de sodio diluido, ácido nítrico diluido o hipoclorito de sodio. En algunos ejemplos, el biorreactor se esteriliza por vapor a 121°C, 20 PSI durante 30 minutos. Tras la esterilización, pueden añadirse los medios de cultivo celular al biorreactor y después evaluar la contaminación, tal como la contaminación microbiana, después de un periodo de tiempo para garantizar que el procedimiento de esterilización fue eficaz.
El cultivo celular de la fase de expansión, descrita anteriormente, se añade al biorreactor esterilizado que contiene medios de cultivo celular nuevos. En general, las células que expresan rHuPH20 soluble se inoculan en los medios de cultivo celular nuevos a una densidad celular de 104 a 107 células/ml, tal como de 105 a 106 células/ml. Por ejemplo, las células pueden inocularse a una densidad de 1 * 104, 5 * 104, 1 * 105, 5 * 105, 1 * 106, 4 * 106 ó 1 * 107 células/ml. En un ejemplo, las células que expresan rHuPH20 soluble se inoculan a una densidad celular de 4 * 105 células/ml. Por tanto, el recuento total de células tras la inoculación puede estar entre 107 y 1014, dependiendo del tamaño del biorreactor y de la densidad celular. Por ejemplo, un volumen de cultivo celular de 100 l puede tener una densidad celular tras la inoculación de aproximadamente 109, 1010, 1011 ó 1012 células. En otro ejemplo, un volumen de cultivo celular de 2500 l puede tener una densidad celular tras la inoculación de aproximadamente 1010, 1011, 1012 ó 1013 células.
Los volúmenes de cultivo celular de inoculación y medios de cultivo nuevos usados dependen del tamaño del biorreactor y de la densidad celular del inóculo. Por ejemplo, pueden añadirse aproximadamente 30 l de células que expresan rHuPH20 soluble, tales como células 2B2, a un biorreactor de 400 l que contiene 230 l de medios de cultivo celular nuevos, para un volumen total de aproximadamente 260 l y una densidad celular de inoculación de 4 * 105 células/ml (recuento total de células de aproximadamente 1011 células). Este puede aumentarse o disminuirse de escala según sea necesario, dependiendo del biorreactor. Por ejemplo, pueden añadirse aproximadamente 20 l de células que expresan rHuPH20 soluble, tales como células 3D35M, a un biorreactor de 125 l que contiene 65 l de medios de cultivo celular nuevos, para un volumen total de aproximadamente 85 l y una densidad celular de inoculación de 4 * 105 células/ml (recuento total de células de aproximadamente 3,4 * 1010 células). En otro ejemplo, para la producción en un biorreactor de 3500 l, se añaden células 2B2 a medios de cultivo celular nuevos para un volumen de cultivo celular total de 1900-2300 l, tal como de 2100 l.
Los medios de cultivo celular nuevos contienen los complementos apropiados para proporcionar los nutrientes necesarios a las células para fomentar el crecimiento celular. Los complementos que pueden añadirse al medio celular basal incluyen, pero no se limitan a, glucosa, insulina, butirato de sodio, extracto de levadura y glutamina o un sustituto de glutamina, tal como L-alanil-L-glutamina. En algunos casos, el medio basal contiene suficiente glucosa, por lo que no es necesario añadir glucosa adicional. En otros casos, se añade glucosa a los medios más adelante en el procedimiento de producción, tal como en un medio de alimentación posterior. La adición de insulina al medio puede fomentar el crecimiento celular y aumentar la densidad celular máxima. La glutamina o los sustitutos de glutamina, tales como L-alanil-L-glutamina, puede respaldar la progresión del ciclo celular y también potenciar el crecimiento celular. Un experto en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad y calidad de los nutrientes con los que puede complementarse el medio basal. En algunos ejemplos, se añade glutamina o sustituto de glutamina al medio de cultivo celular basal a 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 15 mM o 20 mM. Puede añadirse insulina al medio de cultivo celular a, por ejemplo, de 0,5 mg/l a 50 mg/l, tal como de 1 mg/l a 40 mg/l, de 2 mg a 30 mg/l o de 5 mg/l a 20 mg/l. Por ejemplo, puede usarse medio de cultivo celular basal complementado con 5 mg/l de insulina y L-alanil-L-glutamina 8 mM como medio de cultivo celular nuevo en el que se inoculan las células que expresan rHuPH20 soluble. También pueden añadirse complementos adicionales, tales como antibióticos, antifúngicos, indicadores, sales, vitaminas, aminoácidos y factores de crecimiento.
Los parámetros individuales del biorreactor pueden establecerse para mantener las condiciones óptimas durante todo el procedimiento de producción de proteína. Los parámetros específicos que pueden establecerse depende del biorreactor usado, y pueden incluir, pero no se limitan a, temperatura, pH, oxígeno disuelto, velocidad del impulsor, presión del recipiente, burbujeo de aire y la superposición de aire. En un ejemplo, las condiciones de un biorreactor de 125 l que contiene 100 l de cultivo celular de células 3D35M se establecen en: temperatura: 37°C; oxígeno disuelto: 25% ± 10%; velocidad del impulsor: 50 RPM; presión del recipiente: 3 psi; burbujeo de aire: 1 l/minuto; superposición de aire: 1 l/minuto, pH:7,2. En otro ejemplo, las condiciones de un biorreactor de 400 l que contiene un volumen de cultivo celular inicial de 260 l se establecen en: temperatura: 37°C; velocidad del impulsor 40-55 RPM; presión del recipiente: 3 psi; burbujeo de aire: 0,5-1,5 l/minuto; superposición de aire: 1 l/minuto. En un ejemplo adicional, las condiciones de un biorreactor de 3000 l que contiene un volumen de cultivo inicial de 2100 l se establecen en: temperatura: 37°C (o entre 36,5°C y 37,5°c ); velocidad del impulsor: 35 RPM (o 70-80 RPM); presión del recipiente: 5 psi (o 3-7 psi); burbujeo de aire: 12 l/minuto (u 11-13 l/minuto); oxígeno disuelto: 25% o > 25%; pH antes de la inoculación: 7,2 (o pH 7,1-7,3); pH después de la inoculación: <7,2 (o <7,3). Un experto en la técnica puede determinar empíricamente las condiciones apropiadas para el crecimiento de una célula que expresa rHuPH20 soluble particular en un biorreactor particular.
Las células que expresan rHuPH20 soluble se cultivan normalmente en el biorreactor durante entre 10 y 25 días. En algunos ejemplos, las células que expresan rHuPH20 soluble se cultivan en el biorreactor durante 12, 13, 14, 15 ó 16 días antes de la recogida. En otro ejemplos, las células se recogen cuando el recuento de células viables (VCC) se disminuye a un nivel particular, tal como, por ejemplo, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60% o el 70%. En un ejemplo, las células se recogen cuando el VCC está entre el 30% y el 35%. En otro ejemplo, las células se recogen en el plazo de 24 horas posteriores a la disminución del VCC por debajo del 50%.
Durante el cultivo en el biorreactor, las células pueden hacerse crecer como cultivos discontinuos, en los que el cultivo se hace crecer hasta su completitud sin la adición de nutrientes adicionales. En otros ejemplos, las células se hacen crecer como cultivos semicontinuos y se les proporciona una serie de medios de alimentación en puntos de tiempo particulares para complementar con nutrientes y glucosa de principio a fin. En algunos casos, los nutrientes proporcionados en el medio de cultivo celular en el que se inocularon las células se han agotado en 3, 4, 5, 6, 7 días o más posteriores a la inoculación. Por tanto, proporcionar nutrientes o complementos adicionales puede producir mayores rendimientos de proteína que los cultivos discontinuos. En un ejemplo, a las células se les proporcionan medios de alimentación los días 6, 9 y 11 posteriores a la inoculación. En otro ejemplo, a las células se les proporcionan medios de alimentación los días 7, 9 y 11 posteriores a la inoculación. En un ejemplo adicional, a las células se les proporcionan medios de alimentación los días 5, 7, 9 y 11 posteriores a la inoculación. El volumen de medios de alimentación añadido al cultivo del biorreactor puede oscilar, por ejemplo, entre el 0,5% y el 20%, tal como el 1-20%, el 2-15%, el 3-10% o el 4-5% del volumen de cultivo celular. En algunos casos, los medios de alimentación se añaden a un volumen equivalente al 4% del volumen de cultivo celular.
La adición de diversos complementos a los medios de alimentación también puede usarse para regular el crecimiento y/o ciclo celular de las células. Los nutrientes y complementos a modo de ejemplo que pueden incluirse en los medios de alimentación incluyen, pero no se limitan a, glutamina o sustituto de glutamina, tal como L-alanil-L-glutamina, insulina, extracto de levadura, glucosa y butirato de sodio o butirato de sodio. Además, los medios basales usados en los medios de alimentación también pueden estar concentrados, proporcionando de ese modo nutrientes adicionales, tales como aminoácidos esenciales, que pueden haberse agotado durante el cultivo celular. Los medios basales en los medios de alimentación pueden estar 2*, 3*, 4*, 5*, 6* o más concentrados. En otros ejemplos, los medios basales están menos concentrados, o tienen la misma concentración que los medios de cultivo celular en el biorreactor.
Los complementos incluidos en los medios de alimentación pueden usarse para regular el crecimiento celular y la producción de proteína. Por ejemplo, el primer medio de alimentación añadido al cultivo celular puede incluir nutrientes que potencian la progresión del ciclo celular, el crecimiento celular y la densidad celular máxima. Los medios de alimentación posteriores pueden fomentar la detención del crecimiento celular y/o la síntesis de proteína. La cantidad de cada complemento en cada medio de alimentación puede variar, tal como aumentando o disminuyendo de un medio de alimentación al siguiente, o puede ser la misma de un medio de alimentación al siguiente. En algunos ejemplos, la cantidad de un complemento aumenta de un medio de alimentación al siguiente, tal como en un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o más. En otros ejemplos, la cantidad de un complemento disminuye de un medio de alimentación al siguiente, tal como en un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más. En un ejemplo, se omite un complemento de un medio de alimentación. En otros ejemplos, la cantidad de un complemento en los medios de alimentación permanece igual. Un experto en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad óptima de cada complemento para cada medio de alimentación para fomentar la cantidad deseada de crecimiento celular y producción de proteína.
Los complementos o nutrientes a modo de ejemplo que pueden incluirse en los medios de alimentación incluyen, pero no se limitan a, glucosa, glutamina o sustituto de glutamina, tal como L-alanil-L-glutamina, insulina y butirato de sodio. El tipo y la cantidad de complemento añadido pueden influir en el crecimiento celular y en la producción de proteína. Por ejemplo, la insulina y la glutamina o el sustituto de glutamina pueden incorporarse en el primer medio de alimentación añadido al cultivo celular para aumentar el crecimiento celular y la densidad celular máxima. Los medios de alimentación posteriores pueden diseñarse para fomentar más la producción de proteína que el crecimiento celular. Los complementos tales como la insulina pueden excluirse o reducirse en cantidad, al igual que la glutamina o el sustituto de glutamina, tal como L-alanil-L-glutamina. En cambio, los complementos tales como el extracto de levadura que potencian la síntesis de proteína pueden aumentarse en cantidad. Además, también pueden incluirse complementos que potencian la detención del ciclo celular y, por tanto, el aumento de la producción de proteína. Un ejemplo de tales complementos es el butirato de sodio.
En un ejemplo, se añade insulina a uno o más medios de alimentación. La adición de insulina puede aumentar la densidad celular máxima en, por ejemplo, un 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% o más. Aunque la insulina puede incorporarse en cualquier medio de alimentación, la insulina se añade normalmente a medios de alimentación tempranos, tales como el primer medio de alimentación, o el primer y el segundo medio de alimentación, para fomentar el crecimiento celular máximo en la fase inicial de la ejecución en el biorreactor. Por ejemplo, un medio de alimentación, tal como el primer medio de alimentación, puede contener una cantidad de insulina de o de aproximadamente 5 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l, 25 mg/l, 30 mg/l, 35 mg/l, 40 mg/l, 45 mg/l, 50 mg/l, 55 mg/l, 60 mg/l o más. En cambio, la cantidad de insulina añadida a los medios de alimentación posteriores puede reducirse u omitirse por completo.
La glutamina o el sustituto de glutamina, tal como L-alanil-L-glutamina, también puede añadirse a los medios de alimentación. En algunos casos, la cantidad de glutamina o sustituto de glutamina añadida al primer medio de alimentación es mayor que la cantidad de glutamina o sustituto de glutamina añadida a los medios de alimentación posteriores. En ejemplos particulares, la cantidad de glutamina o sustituto de glutamina añadida a cada medio de alimentación posterior se reduce en comparación con la cantidad añadida en los medios de alimentación anteriores. Un experto en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad óptima añadida a cada medio de alimentación, y puede incluir, por ejemplo, concentraciones de glutamina o sustituto de glutamina de o de aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM o más.
Normalmente, los medios basales usados en los medios de alimentación también se complementan con glucosa. La cantidad de glucosa añadida a cada medio de alimentación puede aumentarse o reducirse con respecto a los medios de alimentación anteriores, o puede permanecer aproximadamente constante. En algunos ejemplos, la cantidad de glucosa añadida a los medios de alimentación es de o de aproximadamente 10 g/l, 15 g/l, 20 g/l, 25 g/l, 30 g/l, 35 g/l, 40 g/l, 45 g/l, 50 g/l, 55 g/l, 60 g/l, 75 g/l, 80 g/l o más.
Además, también pueden incluirse complementos que fomentan la síntesis de proteína. Tales nutrientes incluyen, por ejemplo, extracto de levadura. En algunos casos, la cantidad de extracto de levadura incluida en los medios de alimentación se aumenta durante la ejecución en el biorreactor. Por ejemplo, la cantidad de extracto de levadura en el tercer medio de alimentación puede aumentarse en comparación con la cantidad en el segundo medio de alimentación, que puede aumentarse en comparación con la cantidad en el segundo medio de alimentación. En algunos ejemplos, la cantidad de extracto de levadura añadida a los medios de alimentación está entre 5 y 1000 g/l, tal como de, o de aproximadamente, 10 g/l, 20 g/l, 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 75 g/l, 100 g/l, 125 g/l, 150 g/l, 175 g/l, 200 g/l, 250 g/l, 300 g/l, 350 g/l, 400 g/l o más.
También pueden incluirse complementos que potencian la detención del ciclo celular y, por tanto, el aumento de la producción de proteína. Normalmente, tales complementos se incluyen en medios de alimentación que se añaden al biorreactor más adelante en la ejecución y que no se incluyen en el primer medio de alimentación. Por ejemplo, pueden añadirse complementos que potencian la detención del ciclo celular al segundo medio de alimentación y medios de alimentación posteriores. Un ejemplo de tales complementos es el butirato de sodio. En algunos ejemplos, la cantidad de butirato de sodio añadida a los medios de alimentación está entre 0,1 g/l y 10 g/l, tal como de, o de aproximadamente, 0,2 g/l, 0,3 g/l, 0,4 g/l, 0,5 g/l, 0,6 g/l, 0,7 g/l, 0,8 g/l, 0,9 g/l, 1,0 g/l, 1,1 g/l, 1,2 g/l, 1,3 g/l, 1,4 g/l, 1,5 g/l, 1,6 g/l, 1,7 g/l, 1,8 g/l, 1,9 g/l, 2,0 g/l, 2,5 g/l, 3,0 g/l, 3,5 g/l o más.
Además, pueden alterarse una cualquiera o más de las condiciones del biorreactor durante la fase de producción para optimizar la producción de proteína. En un ejemplo, se disminuye la temperatura. Esto puede servir para fomentar la detención del ciclo celular, prolongar la viabilidad celular (aumentando de ese modo la producción de proteína total) y ayudar a estabilizar la hialuronidasa que se ha secretado. Por ejemplo, la temperatura del biorreactor puede reducirse en cada alimentación, tal como desde 37°C hasta 36,5°C en la segunda alimentación, hasta 36°C en la tercera alimentación y hasta 35,5°C en la cuarta alimentación. Un experto en la técnica puede determinar empíricamente los medios de alimentación apropiados y el momento en el que proporcionar la alimentación, así como las condiciones apropiadas en el biorreactor.
En un ejemplo, a las células se les proporcionan medios de alimentación los días 6, 9 y 11 posteriores a la inoculación. En otro ejemplo, a las células se les proporcionan medios de alimentación los días 7, 9 y 11 posteriores a la inoculación. En un ejemplo adicional, a las células se les proporcionan medios de alimentación los días 5, 7, 9 y 11 posteriores a la inoculación. Los medios de alimentación proporcionados en cada punto de tiempo pueden ser iguales o diferentes, y pueden incluir complementos tales como, pero sin limitarse a, glucosa, butirato de sodio, insulina, glutamina o un sustituto de glutamina y extracto de levadura. Por ejemplo, a las células 2B2 que se hacen crecer en un cultivo de 260 l en un biorreactor de 400 l se les puede proporcionar una primera alimentación el día 5 que contiene 10,4 l de 4* medios basales (por ejemplo, medios CD CHO) con 33 g/l de glucosa, L-alanil-L-glutamina 32 mM, 16,6 g/l de extracto de levadura y 33 mg/l de insulina, una segunda alimentación el día 7 que contiene 10,8 l de 2* medios basales (por ejemplo, medios CD CHO), 33 g/l de glucosa, L-alanil-L-glutamina 16 mM, 33,4 g/l de extracto de levadura y 0,92 g/l de butirato de sodio, una tercera alimentación el día 9 que contiene 10,8 l de 1* medios basales (por ejemplo, medios CD CHO), 50 g/l de glucosa, L-alanil-L-glutamina 10 mM, 50 g/l de extracto de levadura y 1,80 g/l de butirato de sodio y una cuarta alimentación el día 11 que contiene 1* medios basales (por ejemplo, medios CD CHO), 33 g/l de glucosa, L-alanil-L-glutamina 6,6 mM, 50 g/l de extracto de levadura y 0,92 g/l de butirato de sodio. Un experto en la técnica puede aumentar o disminuir la escala para la producción de rHuPH20 en biorreactores más grandes o más pequeños, respectivamente. Además, un experto en la técnica puede alterar la cantidad y el tipo de uno más complementos añadidos a los medios para potenciar el crecimiento celular y/o la producción de proteína.
En otro ejemplo, a las células se les proporcionan los siguientes medios de alimentación los días 5, 7, 9 y 11: medio #1 de alimentación: medios basales 33 g/l de glucosa L-alanil-L-glutamina 26,6 mM 83,3 g/l de Yeastolate 33 mg/l de rHuInsulina; alimentación #2: medios basales 33 g/l de glucosa L-alanil-L-glutamina 13,4 mM 166,7 g/l de Yeastolate 0,92 g/l de butirato de sodio; alimentación #3: medios basales 50 g/l de glucosa L-alanil-L-glutamina 10 mM 250 g/l de Yeastolate 1,8 g/l de butirato de sodio; alimentación #4: medios basales 33,3 g/l de glucosa L-alanil-L-glutamina 6,7 mM 250 g/l de Yeastolate 0,92 g/l de butirato de sodio.
G. Recogida del cultivo celular, concentración de proteína e intercambio del tampón
Tras la fase de producción de proteína, las células se recogen y la rHuPH20 soluble que se ha secretado en los medios de cultivo celular se concentra antes del inicio del procedimiento de purificación. Además de concentrar la proteína, los medios de cultivo celular pueden intercambiarse con un tampón apropiado en ese momento. En la técnica se conocen múltiples sistemas y procedimientos para efectuar la concentración de proteína y el intercambio del tampón, y pueden usarse en los métodos en el presente documento. A continuación se describen métodos a modo de ejemplo, y un experto en la técnica reconocerá que estos métodos pueden modificarse con o sustituirse por otros métodos eficaces para conseguir un nivel satisfactorio de concentración de proteína e intercambio del tampón.
Las células se recogen del biorreactor y se procesan a través de un sistema de retirada y clarificación celular para separar el líquido de cultivo celular que contiene la hialuronidasa a partir de las células y del residuo celular. Un ejemplo de un sistema de este tipo es uno que contiene una serie de filtros que permiten que pase a su través y se recoja únicamente la proteína. Puede usarse cualquier filtro o serie de filtros capaz de separar la hialuronidasa a partir de las células y del residuo celular. Por ejemplo, el cultivo celular recogido puede hacerse pasar a través de una serie de filtros de cápsula, tales como filtros de poliétersulfona. Estos pueden tener tamaños de poro decrecientes para eliminar gradualmente, por ejemplo, las células, el residuo celular y las partículas más pequeñas, tales como los virus. En algunos ejemplos, se usa una serie de cuatro filtros con tamaños de poro de 8,0 |im, 0,65 |im, 0,22 |im y 0,22 |im para clarificar el cultivo celular para obtener el líquido de cultivo celular recogido (HCCF). Otro ejemplo de un sistema de eliminación y clarificación de células que puede usarse en los métodos en el presente documento es una serie de filtros que, en la primera etapa, contiene cuatro módulos en paralelo, conteniendo cada uno una capa de tierra de diatomeas graduada a 4-8 |im y una capa de tierra de diatomeas graduada a 1,4-1,1 |im, seguido de una membrana de celulosa. La segunda etapa contiene un único módulo que contiene una capa de tierra de diatomeas graduada a 0,1 -0,11 |im y una capa de tierra de diatomeas graduada a <0,1 |im, seguido de una membrana de celulosa, y la tercera etapa es un filtro de cápsula de poliéter sulfona de 0,22 |im.
Una vez separadas las células y el sedimento celular a partir del HCCF, normalmente se concentra la proteína en el HCCF y se intercambian los medios de cultivo celular con un tampón apropiado. La proteína puede concentrarse 2*, 3*, 4*, 5*, 6*, 7*, 8*, 9*, 10*, 11*, 12*, 13* o más. En algunos ejemplos, la proteína se concentra 10*. En otros ejemplos, la proteína se concentra 6*. Puede utilizarse cualquier método de concentración de proteína conocido en la técnica. Los ejemplos de tales métodos incluyen concentración usando sistemas de filtración de flujo tangencial (TFF) con filtros de corte de peso molecular (MWCO). Por ejemplo, el HCCF clarificado puede hacerse pasar a través de una serie de dos filtros de poliéter sulfona en espiral de 30 kDa de MWCO para concentrar la proteína 10*. En otro ejemplo, el HCCF se hace pasar a través de una serie de cuatro filtros de 30 kDa de MWCO. Para la producción a gran escala de hialuronidasa, tal como, por ejemplo, cultivos de 100 l y 300 l, normalmente se emplean filtros con áreas de superficie de entre 0,5 y 5 m2 para este fin. En algunos ejemplos, se usan filtros con un área de superficie de 1,2 m2 o 2,8 m2.
Se realiza un intercambio del tampón tras la concentración de proteína. Un experto en la técnica puede determinar empíricamente un tampón apropiado. Un ejemplo de tampones adecuados es tampón Hepes 10 mM, NaCl 25 mM, pH 7,0 o tampón Tris 10 mM, Na2SO420 mM, pH 7,5. Normalmente, tras la recogida, la concentración y el intercambio del tampón, la disolución de proteína concentrada se hace pasar a través de otro filtro, tal como un filtro de cápsula de 0,22 |im, antes de almacenarse en una bolsa de almacenamiento estéril.
En algunos ejemplos, la disolución de proteína concentrada se trata para inactivar cualquier contaminación viral residual. La inactivación de virus puede efectuarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la disolución de proteína concentrada puede mezclarse con Triton X-100 al 10%, fosfato de tri(n-butilo) (TNBP) al 3%, hasta una concentración final de Triton X-100 al 1%, TNBP al 0,3%, a temperatura ambiente durante entre 15 y 75 minutos. En algunos ejemplos, la proteína se expone a la disolución de inactivación de virus durante 30-45 minutos.
H. Purificación
La rHuPH20 soluble se purifica a partir de la disolución de proteína concentrada usando una serie de etapas de purificación. En la técnica se conocen muchas técnicas de purificación, y pueden utilizarse en los métodos en el presente documento. Tales métodos pueden incluir, pero no se limitan a, métodos cromatográficos, tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de afinidad (AC), cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), cromatografía de fase inversa (RPC) y cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), y métodos de filtración en gel, o cualquier combinación de los mismos.
Un ejemplo de métodos de purificación que se usan para los métodos en el presente documento es una combinación de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía de afinidad. En la cromatografía de intercambio iónico, las proteínas pueden separarse a partir de una disolución o mezcla compleja basándose en las fuerzas electrostáticas entre los grupos funcionales cargados de las proteínas y los grupos funcionales cargados de la matriz de la columna de cromatografía. Las resinas de intercambio catiónico tienen grupos funcionales cargados negativamente que atraen a los grupos funcionales cargados positivamente de las proteínas y las resinas de intercambio aniónico tienen grupos funcionales cargados positivamente que atraen a los grupos funcionales cargados negativamente de las proteínas. Las proteínas unidas a través de fuerzas electrostáticas a la matriz pueden eluirse aumentando la fuerza iónica de la disolución de tampón dentro de la columna de cromatografía a lo largo del tiempo. En la cromatografía de interacción hidrófoba, una proteína puede separarse a partir de una disolución o mezcla compleja basándose en su hidrofobicidad. Se aplica una disolución compleja que contiene la proteína a una columna de cromatografía equilibrada con un tampón con alto contenido en sales que facilita la unión de la proteína a la resina. Después se introduce una fase móvil de gradiente de sales con fuerza iónica descendente en la columna de cromatografía para liberar las proteínas unidas de la matriz. Alternativamente, la cromatografía de interacción hidrófoba puede separar una proteína monomérica a partir de una disolución o mezcla compleja uniendo impurezas hidrófobas, incluyendo agregados y dímeros inactivos de la proteína, al tiempo que se permite que la proteína monomérica fluya a través de la columna de cromatografía relativamente sin obstáculos. En la cromatografía de afinidad, una proteína puede separarse a partir de una disolución compleja basándose en la afinidad de la proteína por un ligando o una entidad de unión a ligando que se une covalentemente a la matriz. Otras proteínas en la disolución 0 mezcla compleja con afinidad débil, o que carecen de afinidad, por el ligando o la entidad de unión a ligando fluyen a través de la columna de cromatografía sin obstáculos, dejando a la proteína de interés unida a la matriz. Después puede eluirse la proteína de la columna de cromatografía alterando las condiciones del tampón para disminuir la afinidad por el ligando o la entidad de unión a ligando.
En un ejemplo, la rHuPH20 soluble se purifica a partir de la disolución de proteína concentrada mediante purificación secuencial a través de una columna de agarosa reticulada con perlas, tal como una columna Q Sepharose™ (cromatografía de intercambio iónico), una columna de agarosa sustituida con fenilo reticulada con perlas, tal como una columna Phenyl Sepharose™ (cromatografía de interacción hidrófoba), una columna de boronato de aminofenilo (cromatografía de afinidad) y finalmente a través de una columna de hidroxiapatita (cromatografía de intercambio iónico). Cada una de estas columnas presenta diferentes propiedades de unión con respecto a la hialuronidasa, de tal manera que la columna de agarosa reticulada con perlas (por ejemplo, columna Q Sepharose™) es una etapa de captura (es decir, la rHuPH20 soluble se une a la resina mientras que otras proteínas fluyen a su través), la columna de agarosa sustituida con fenilo reticulada con perlas (por ejemplo, columna Phenyl Sepharose™) es una etapa de fracción no retenida (es decir, la rHuPH20 soluble fluye a través de la columna mientras que otras proteínas son capturadas), la columna de boronato de aminofenilo es otra etapa de captura y la columna de hidroxiapatita es una etapa de pulido para purificar adicionalmente la rHuPH20 soluble.
Normalmente, antes de su uso, se esterilizan y equilibran las columnas. La esterilización puede efectuarse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, esterilización con NaOH 1,0 M. El equilibrado puede efectuarse mediante la adición de un tampón apropiado a la columna, tal como un tampón similar a o el mismo que el tampón usado para lavar posteriormente la columna o el tampón en el que está contenida la proteína antes de la carga. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente tampones adecuados para su uso en el equilibrado de cada columna. A continuación se proporcionan tampones a modo de ejemplo. Entre cada etapa de cromatografía, la proteína eluida puede filtrarse, tal como a través de un filtro de 0,22 |im, para retirar cualquier microorganismo contaminante o agregados grandes. En algunos ejemplos, el eluato filtrado se almacena, tal como en bolsas de almacenamiento estériles, antes de su uso en la siguiente etapa. Tras la cromatografía en columna, la hialuronidasa purificada puede someterse posteriormente a una etapa de eliminación de virus, seguido de concentración de proteína e intercambio del tampón para la formulación final. A continuación se describen con más detalle métodos de purificación a modo de ejemplo.
1. Columna de agarosa reticulada con perlas
La proteína concentrada obtenida a partir del líquido de cultivo celular recogido (HCCF) puede cargarse en una columna de agarosa reticulada con perlas, tal como, por ejemplo, una columna Q Sepharose™, que es un intercambiador aniónico fuerte y captura la rHuPH20 soluble mientras deja fluir a su través otras proteínas. Después puede eluirse la rHuPH20 soluble unida usando un tampón apropiado. Las dimensiones de la columna usada dependen normalmente del volumen de proteína concentrada obtenida a partir de1HCCF. Por ejemplo, la proteína concentrada obtenida a partir del cultivo de células que expresan hialuronidasa en un cultivo de biorreactor de 100 l puede cargarse en una columna que tiene 20 cm de alto, 14 cm de diámetro y contiene 3 l de resina. En otro ejemplo, la proteína concentrada obtenida a partir del cultivo de células que expresan rHuPH20 soluble en un cultivo de biorreactor de 300 l puede cargarse en una columna que tiene 29 cm de alto, 20 cm de diámetro y contiene 9 l de resina. Esta puede aumentarse o disminuirse de escala según sea necesario, dependiendo del volumen de la disolución de proteína concentrada y de la cantidad esperada de proteína. Por ejemplo, la proteína concentrada obtenida a partir del cultivo de células que expresan rHuPH20 soluble en un cultivo de biorreactor de 20 l puede cargarse en una columna Q Sepharose™ que tiene 28 cm de alto, 7 cm de diámetro y contiene 1,1 l de resina, y la proteína concentrada obtenida a partir del cultivo de células que expresan rHuPH20 soluble en un cultivo de biorreactor de 2500 l puede cargarse en una columna Q Sepharose™ que tiene 26 cm de alto, 63 cm de diámetro y contiene 81 1 de resina.
Normalmente, antes de la carga con la proteína, se equilibra la columna. El equilibrado puede efectuarse haciendo pasar a su través 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más volúmenes de columna de tampón. En algunos ejemplos, se hacen pasar 5 volúmenes de columna de tampón a través de la columna para el equilibrado. Los tampones adecuados para el equilibrado incluyen aquellos similares a los tampones que se usarán para lavar la columna después de haberse cargado la proteína. Por ejemplo, una columna de agarosa reticulada con perlas, tal como una columna Q Sepharose™, puede equilibrarse con Hepes 10 mM, NaCl 25 mM, pH 7,5. Pueden usarse otros tampones de pH neutro, tal como reconocerá un experto en la técnica.
Después de cargar el concentrado de proteína, se lava la columna y se eluye la proteína. Los tampones adecuados para lavar tales columnas que contienen rHuPH20 soluble unida incluyen, por ejemplo, Hepes 10 mM, NaCl 25 ml, pH 7,0; Hepes 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0; y Tris 10 mM, Na2SO420 mM, pH 7,5. La columna puede lavarse con uno o más tipos de tampón. Por ejemplo, la columna puede lavarse con Na2SO420 mM, pH 7,5 y Hepes 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0. Normalmente, el lavado se efectúa haciendo pasar a su través 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más volúmenes de columna de tampón. En algunos ejemplos, se usan 5 volúmenes de columna de tampón para lavar la columna. Después se eluye la rHuPH20 soluble usando un tampón con una mayor concentración de sales, tal como, por ejemplo, Hepes 10 mM, NaCl 400 mM, pH 7,0. En algunos ejemplos, se monitoriza la absorbancia a A280 para determinar cuándo recoger el eluato, ya que generalmente cualquier absorbancia durante este procedimiento indica la presencia de rHuPH20 soluble. Por tanto, en un ejemplo, el eluato se recoge cuando la absorbancia que comienza a leerse es de 0,025. Normalmente, el eluato se filtra a través de un filtro apropiado, tal como un filtro de 0,22 |im, antes de almacenarse, tal como en una bolsa de almacenamiento estéril.
2. Columna de agarosa sustituida con fenilo reticulada con perlas
Tras la purificación a través de una columna de agarosa reticulada con perlas, la disolución de proteína puede someterse a cromatografía de interacción hidrófoba usando una columna de agarosa sustituida con fenilo reticulada con perlas, tal como una columna Phenyl Sepharose™, en la que la rHuPH20 soluble fluye a través de la columna mientras que otras proteínas contaminantes son capturadas. La columna usada en los métodos en el presente documento puede oscilar en cuanto a tamaño, dependiendo del volumen y de la cantidad de proteína que va a purificarse a través de la misma. Los tamaños a modo de ejemplo incluyen columnas que tienen 29 cm de alto, 20 cm de diámetro con 9 l de resina para su uso en la purificación de rHuPH20 soluble a partir de células hechas crecer en un cultivo de biorreactor de 100 l, columnas que tienen 29 cm de alto, 30 cm de diámetro con 19-21 l de resina para su uso en la purificación de hialuronidasa a partir de células hechas crecer en un cultivo de biorreactor de 300 l y columnas que tienen 35 cm de alto, 80 cm de diámetro con 176 l de resina para su uso en la purificación de rHuPH20 soluble a partir de células hechas crecer en un cultivo de biorreactor de 2500 l. Un experto en la técnica puede aumentar o disminuir la escala según sea apropiado.
La columna de agarosa sustituida con fenilo reticulada con perlas, tal como una columna Phenyl Sepharose™, esterilizada puede equilibrarse antes de la carga de la proteína con un tampón apropiado, tal como, por ejemplo, fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, CaCh 0,1 mM, pH 7,0. El eluato de proteína a partir de la purificación en columna Q Sepharose también se complementa con sulfato de amonio, fosfato de potasio y CaCh. Estos pueden complementarse a la proteína hasta concentraciones finales de aproximadamente, por ejemplo, fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M y CaCh 0,1 mM, pH 7,0. Tras la carga de la proteína, también se añade fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M y CaCh 0,1 mM, pH 7,0 a la columna y se recoge lo filtrado que fluyó a su través, tal como en una bolsa estéril.
3. Columna de boronato de aminofenilo
Tras la cromatografía de interacción hidrófoba, la proteína purificada en columna puede cargarse en una columna de boronato de aminofenilo para una purificación adicional. La cromatografía mediada por ligandos boronato de aminofenilo difiere de muchos otros ligandos usados para la cromatografía de afinidad. Mientras que la mayoría de los ligandos se unen a un sitio de unión particular en una proteína mediante una mezcla de interacciones no covalentes, el boronato de fenilo interacciona predominantemente formando un enlace covalente temporal con los grupos 1,2-cisdiol. El ligando boronato se unirá a cualquier molécula que contenga el grupo apropiado, incluyendo a la rHuPH20 soluble, que está altamente glicosilada.
La columna de boronato de aminofenilo usada en los métodos en el presente documento puede oscilar en cuanto a tamaño, dependiendo del volumen y de la cantidad de proteína que va a purificarse a través de la misma. Los tamaños a modo de ejemplo incluyen columnas que tienen 29 cm de alto, 20 cm de diámetro con 6,3 l de resina para su uso en la purificación de hialuronidasa a partir de células hechas crecer en un cultivo de biorreactor de 100 l, columnas que tienen 29 cm de alto, 30 cm de diámetro con 19-21 l de resina para su uso en la purificación de hialuronidasa a partir de células hechas crecer en un cultivo de biorreactor de 300 l y columnas que tienen 35 cm de alto, 80 cm de diámetro con 176 l de resina para su uso en la purificación de hialuronidasa a partir de células hechas crecer en un cultivo de biorreactor de 2500 l. Un experto en la técnica puede aumentar o disminuir la escala según sea apropiado. Los tampones adecuados para equilibrar la columna de boronato de aminofenilo incluyen, por ejemplo, tampones que contienen fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0.
Tras la carga de la proteína purificada en columna Phenyl Sepharose en la columna de boronato de aminofenilo, se lava la columna con tampones de lavado adecuados. Los tampones de lavado a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0 y bicina 20 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 9,0 y bicina 20 mM, NaCl 100 mM, pH 9,0. En un ejemplo, la columna de boronato de aminofenilo con la hialuronidasa unida se lava en primer lugar con fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0, después con bicina 20 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 9,0 y finalmente con bicina 20 mM, NaCl 100 mM, pH 9,0. Después puede eluirse la hialuronidasa unida, tal como con Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,0. Un experto en la técnica puede modificar uno o más de los tampones para efectuar de manera similar la purificación. Normalmente, la rHuPH20 soluble eluida también se filtra para retirar cualquier contaminación microbiana o agregados grandes.
4. Columna de hidroxiapatita
Tras la cromatografía en columna de boronato de fenilo, la disolución de proteína que contiene la rHuPH20 soluble puede cargarse en una columna de hidroxiapatita en una etapa de pulido final. La hidroxiapatita es una forma cristalina de fosfato de calcio con la fórmula molecular Ca1ü(PO4)6(OH)2. Puede usarse como etapa de pulido para separar proteínas que se purifican conjuntamente muy cerca, funcionando mediante intercambio iónico en modo mixto debido a la inclusión de restos cargados tanto positiva como negativamente. Hay diversos medios cromatográficos de hidroxiapatita disponibles comercialmente, y puede usarse cualquier forma disponible del material en los métodos en el presente documento. Los ejemplos de hidroxiapatitas incluyen, pero no se limitan a, aquellas que se aglomeran para formar partículas y se sinterizan a altas temperaturas para dar una masa cerámica porosa estable. El tamaño de partícula puede variar, tal como desde aproximadamente 1 |im hasta aproximadamente 1.000 |im de diámetro. La porosidad también puede variar, tal como desde aproximadamente 100 A hasta aproximadamente 10.000 A.
La columna de hidroxiapatita usada en los métodos en el presente documento puede oscilar en cuanto a tamaño, dependiendo del volumen y de la cantidad de proteína que va a purificarse a través de la misma. Los tamaños a modo de ejemplo incluyen columnas que tienen 20 cm de alto, 30 cm de diámetro con 13 l de resina para su uso en la purificación de hialuronidasa a partir de células hechas crecer en un cultivo de biorreactor de 300 l y columnas que tienen 23 cm de alto, 80 cm de diámetro con 116 l de resina para su uso en la purificación de hialuronidasa a partir de células hechas crecer en un cultivo de biorreactor de 2500 l. Un experto en la técnica puede aumentar o disminuir la escala según sea apropiado.
Para los métodos descritos en el presente documento, la columna de hidroxiapatita puede equilibrarse con fosfato de potasio 5 mM, NaCl 200 mM o fosfato de potasio 5 mM, NaCl 200 mM, CaCh 0,1 mM, pH 7,0. El equilibrado usando disoluciones tales como estas, hace que la columna sea compatible con la hialuronidasa parcialmente purificada, que a su vez se complementa con fosfato de potasio y CaCh hasta concentraciones finales de 5 mM y 0,1 mM, respectivamente. Tras la carga de la proteína en la columna, la columna puede lavarse con, por ejemplo, fosfato de potasio 10 mM, NaCl 100 mM, CaCh 0,1 mM, pH 7,0, para retirar cualquier proteína contaminante no unida. Después puede eluirse la rHuPH20 soluble unida con un tampón de elución apropiado. Por ejemplo, la elución puede efectuarse mediante la adición de fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0. En algunos ejemplos, el eluato se filtra, tal como a través de un filtro de 0,22 |im.
6. Eliminación de virus, concentración de proteína e intercambio del tampón
La rHuPH20 soluble obtenida tras la cromatografía en columna puede someterse a etapas posteriores a la purificación que sirven para formular la proteína en el tampón deseado a la concentración deseada. La proteína también puede someterse a una etapa de eliminación de virus para garantizar que esté libre de contaminación y sea adecuada para su uso como opción terapéutica. La eliminación de virus se efectúa normalmente con el uso de un filtro que permite que pase a su través únicamente la proteína soluble mientras que atrapa cualquier virus (y otros contaminantes que tienen el mismo tamaño o son más grandes que los virus). Tales filtros están disponibles comercialmente, y puede usarse cualquiera en los métodos en el presente documento. Los tamaños de poro de los filtros útiles para la eliminación de virus incluyen, pero no se limitan a, 10 nm, 15 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 75 nm y 100 nm. En un ejemplo, la hialuronidasa purificada se filtra a través de un filtro que contiene poros de 20 nm. La proteína puede bombearse hacia el filtro, por ejemplo, mediante una bomba peristáltica o mediante el uso de un tanque de presión.
Tras la eliminación de virus, la rHuPH20 soluble puede concentrarse y someterse a intercambio del tampón. La rHuPH20 soluble puede concentrarse 2*, 3*, 4*, 5*, 6*, 7*, 8*, 9*, 10*, 11*, 12*, 13* o más. En algunos ejemplos, la proteína se concentra aproximadamente 6*. Esto puede dar como resultado, por ejemplo, una concentración de entre 0,1 mg/ml y 50 mg/ml. En algunos ejemplos, la hialuronidasa purificada se concentra hasta aproximadamente 1 mg/ml. En otros ejemplos, la hialuronidasa purificada se concentra hasta aproximadamente 10 mg/ml. Puede utilizarse cualquier método de concentración de proteína conocido en la técnica. Los ejemplos de tales métodos incluyen concentración usando sistemas de filtración de flujo tangencial (TFF) con filtros de corte de peso molecular (MWCO). Por ejemplo, la hialuronidasa purificada puede hacerse pasar a través de un filtro de poliéter sulfona en espiral de 10 kDa de MWCO para concentrar la proteína 10*. En otro ejemplo, la proteína se hace pasar a través de una serie de cuatro filtros de 30 kDa de MWCO. Para la producción a gran escala de hialuronidasa, tal como, por ejemplo, cultivos de 100 l y 300 l, normalmente se emplean filtros con áreas de superficie de entre 0,5 y 5 m2 para este fin. En algunos ejemplos, se usan filtros con un área de superficie de 1,2 m2 o 2,8 m2.
En general, el intercambio del tampón se realiza tras la concentración de proteína para formular la proteína en el tampón deseado para su uso posterior, por ejemplo, como opción terapéutica. Un experto en la técnica puede determinar empíricamente un tampón apropiado. Ejemplos de tampones adecuados son tampones salinos, incluyendo, pero sin limitarse a, Hepes 10 mM, NaCl 130 mM, pH 7,0 e histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,0. En algún ejemplo, la hialuronidasa purificada puede hacerse pasar a través de otro filtro, tal como un filtro de cápsula de 0. 22 |im, antes de almacenarse en un entorno estéril.
1. Llenado
Los métodos descritos en el presente documento para la producción y purificación de rHuPH20 soluble también pueden incluir una etapa de llenado, en la que la proteína purificada se llena de manera aséptica en recipientes más pequeños para almacenamiento a largo plazo y uso. La rHuPH20 soluble puede cargarse en los recipientes como una formulación líquida, o como un polvo, tal como después de la liofilización. Para la producción a gran escala, normalmente se usan sistemas de llenado automatizados que incluyen, por ejemplo, bombas para transferir la proteína a los recipientes y plataformas de pesaje para medir el volumen de llenado, y están ampliamente disponibles. Sin embargo, también puede realizarse el llenado manual o una combinación de llenado automatizado y manual de recipientes. Los recipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, viales de vidrio o plástico, envases alveolados, frascos, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, jeringas, frascos o cualquier otro recipiente adecuado. También pueden usarse cierres o tapas adecuados para sellar el recipiente. El procedimiento de llenado puede incluir, en primer lugar, hacer pasar la rHuPH20 soluble a través de un filtro antes del llenado para retirar los contaminantes microbianos y agregados o sedimentos más grandes. Por ejemplo, la proteína puede filtrarse a través de un filtro de 0,22 |im antes de dividirla en alícuotas en recipientes adecuados. Un experto en la técnica puede determinar el volumen de llenado apropiado, y puede incluir, por ejemplo, volúmenes que oscilan desde 0,1 ml hasta 100 ml. En algunos ejemplos, los viales se llenan de manera aséptica con 1 ml, 5 ml o 20 ml de rHuPH20 soluble. Tras el tapado o cierre de los recipientes, los recipientes pueden almacenarse a una temperatura apropiada. En algunos ejemplos, los recipientes se ultracongelan y se almacenan a entre -15°C y -35°C. En otros ejemplos, los recipientes se refrigeran, tal como a entre 3°C y 15°C. Normalmente, el almacenamiento a largo plazo de líquidos es a temperaturas más bajas para minimizar la degradación. La rHuPH20 soluble en forma de polvo puede almacenarse durante largos periodos a temperatura ambiente sin degradación significativa.
J. Monitorización y ensayos
Los métodos descritos en el presente documento pueden monitorizarse en una o más etapas, midiendo una o más condiciones, parámetros o productos en cada punto. Esto puede garantizar que se mantengan las condiciones óptimas en todo momento, y también puede usarse para evaluar la eficiencia y productividad del procedimiento. La monitorización puede tener lugar, por ejemplo, una o más veces durante la fase de expansión celular, la fase de producción de proteína (es decir, en el biorreactor) y/o la fase de purificación de proteína, así como en cualquier momento entre, antes o después, tal como durante los procedimientos de concentración/intercambio del tampón o llenado. La monitorización puede incluir, pero no se limita a, medir el pH, la temperatura, los volúmenes, la contaminación, la pureza, la concentración de proteína, la actividad enzimática, la viabilidad celular y el número de células. Además de monitorizar las condiciones, los parámetros o los productos durante todo el procedimiento, puede evaluarse la rHuPH20 soluble purificada producida como producto final y caracterizarse con respecto a, por ejemplo, la concentración de proteína, la actividad enzimática, las impurezas, la contaminación, la osmolaridad, la degradación, las modificaciones postraduccionales y el contenido de monosacáridos.
1. Monitorización de las condiciones
Las condiciones durante una o más de las etapas en los métodos descritos en el presente documento pueden monitorizarse para garantizar que se mantengan las condiciones óptimas durante todo el procedimiento. Si la monitorización demuestra que las condiciones no se encuentran dentro de un intervalo óptimo, entonces pueden alterarse las condiciones. Las condiciones que pueden monitorizarse varían para cada procedimiento. Por ejemplo, durante las fases de cultivo celular (es decir, expansión celular y producción de proteína en el biorreactor), las condiciones que van a monitorizarse incluyen, pero no se limitan a, temperatura, pH del cultivo celular, nutrientes del cultivo celular (por ejemplo, glucosa), niveles de CO2 y niveles de O2. Normalmente, las condiciones se monitorizan automáticamente usando sistemas integrados en, por ejemplo, la incubadora o el biorreactor.
Durante la etapa de purificación de proteína, las condiciones que pueden monitorizarse incluyen, pero no se limitan a, pH, conductividad y velocidad de flujo. Estas condiciones pueden monitorizarse antes, durante y/o después de una o más etapas de cromatografía en columna. Por ejemplo, pueden monitorizarse los tampones usados para equilibrar, lavar o eluir la columna. Esto puede realizarse antes de cargar el tampón o después de hacer pasar el tampón a través de la columna.
2. Monitorización de la producción de rHuPH20 soluble
La producción de rHuPH20 soluble, y los parámetros asociados con la producción de rHuPH20 soluble, también pueden monitorizarse durante todo el procedimiento. Estos incluyen, pero no se limitan a, número de células, viabilidad celular, contaminación, concentración de proteína, actividad enzimática, pureza, osmolaridad, modificaciones postraduccionales. Puede usarse cualquier método para evaluar estos parámetros. Por ejemplo, la viabilidad de células de mamífero puede evaluarse tomando una pequeña alícuota del cultivo celular y tiñendo con azul de tripano, que permea únicamente membranas celulares dañadas, tiñendo de ese modo únicamente células muertas. Las células pueden visualizarse bajo un microscopio y contarse usando, por ejemplo, un hemocitómetro. Otros métodos incluyen evaluar la viabilidad celular midiendo la actividad metabólica. Por ejemplo, puede incubarse una alícuota del cultivo celular con una sal de tetrazolio (por ejemplo, MTT, XTT o WST-1) que se escinde en un producto de formazano coloreado por células metabólicamente activas.
La concentración de rHuPH20 soluble en una muestra particular puede evaluarse mediante métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA); SDS-PAGE; métodos de Bradford, Lowry y/o BCA; absorbancia UV y otros métodos cuantificables de marcaje de proteínas, tales como, pero sin limitarse a, métodos inmunológicos, radiactivos y fluorescentes y métodos relacionados. Además, la presencia y el grado de degradación pueden medirse mediante técnicas convencionales tales como electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), inmunotransferencia de tipo Western de muestras que contienen hialuronidasa sometida a electroforesis y cromatografía, tal como, por ejemplo, RP-HPLC. La pureza de una muestra que contiene hialuronidasa puede evaluarse, por ejemplo, mediante SDS-PAGE, RP-HPLC, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de intercambio aniónico y isoelectroenfoque (IEF). Las muestras que contienen rHuPH20 soluble, tales como muestras que contienen hialuronidasa purificada, pueden caracterizarse adicionalmente evaluando el contenido de ácido siálico y de monosacáridos. Esto puede lograrse, por ejemplo, hidrolizando la muestra con ácido trifluoroacético al 40%, marcando de manera fluorescente los monosacáridos liberados y separándolos usando RP-HPLC (véase el ejemplo 10).
La rHuPH20 soluble producida y purificada usando los métodos descritos en el presente documento también puede evaluarse para determinar la presencia de modificaciones postraduccionales. Tales ensayos se conocen en la técnica, e incluyen ensayos para medir la glicosilación, hidroxilación y carboxilación. En un ensayo a modo de ejemplo para la glicosilación, puede realizarse el análisis de hidratos de carbono, por ejemplo, mediante análisis por SDS-PAGE de rHuPH20 soluble expuesta a tratamiento de hidrazinólisis o con endoglicosidasa. La hidrazinólisis libera glicanos unidos a N y O a partir de glicoproteínas mediante incubación con hidrazina anhidra, mientras que la liberación de endoglicosidasa implica a la PNGasa F, que libera la mayoría de los N-glicanos a partir de las glicoproteínas. El tratamiento de hidrazinólisis o con endoglicosidasa de polipéptidos de rHuPH20 soluble genera un extremo reductor que puede etiquetarse con un marcador fluoróforo o cromóforo. Los polipéptidos de rHuPH20 soluble marcados pueden analizarse mediante electroforesis de hidratos de carbono asistida por fluoróforo (FACE). La etiqueta fluorescente para glicanos también puede usarse para el análisis de monosacáridos, el perfilado o análisis de la huella de patrones de glicosilación complejos mediante HPLC. Los métodos de HPLC a modo de ejemplo incluyen cromatografía de interacción hidrófila, interacción electrónica, intercambio iónico, interacción hidrófoba y cromatografía de exclusión molecular. Las sondas de glicanos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, 3-(acetilamino)-6-aminoacridina (AA-Ac) y ácido 2-aminobenzoico (2-AA). Los restos de hidrato de carbono también pueden detectarse mediante el uso de anticuerpos específicos que reconocen el polipéptido de hialuronidasa glicosilada.
Un ensayo a modo de ejemplo para medir la p-hidroxilación comprende análisis por HPLC de fase inversa de polipéptidos de rHuPH20 soluble que se han sometido a hidrólisis alcalina (Przysiecki et al. (1987) PNAS 84:7856-7860). La carboxilación y y-carboxilación de polipéptidos de hialuronidasa puede evaluarse usando espectrometría de masas con análisis de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF), tal como se describe en la técnica (véase, por ejemplo, Harvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369, Maum et al. Prot Sci 14:1171-1180).
La actividad enzimática de rHuPH20 soluble en una muestra puede evaluarse en cualquier punto durante los métodos descritos en el presente documento. En un ejemplo, la actividad se mide usando un ensayo de microturbidez (véase, por ejemplo, el ejemplo 10). Este se basa en la formación de un precipitado insoluble cuando el ácido hialurónico se une con albúmina sérica. La actividad se mide incubando rHuPH20 soluble con hialuronato de sodio (ácido hialurónico) durante un periodo de tiempo establecido (por ejemplo, 10 minutos) y después precipitando el hialuronato de sodio sin digerir con la adición de albúmina sérica acidificada. La turbidez de la muestra resultante se mide a 640 nm después de un periodo de desarrollo de 30 minutos adicionales. La disminución de la turbidez resultante de la actividad enzimática sobre el sustrato de hialuronato de sodio es una medida de la actividad enzimática de rHuPH20 soluble.
En la técnica también se conocen otros ensayos para medir la actividad enzimática (véase, por ejemplo, Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263).
También puede monitorizarse la presencia de cualquier contaminación. La contaminación puede incluir, pero no se limita a, contaminación microbiana (por ejemplo, virus, bacterias y micoplasma), contaminación por productos microbianos (por ejemplo, endotoxina) u otras impurezas relacionadas con el procedimiento. Puede usarse cualquier método o ensayo adecuado. Por ejemplo, los virus y las bacterias pueden cultivarse usando métodos bien conocidos en la técnica para determinar si están presentes o no en una muestra, y si es así, en qué cantidades. La microscopía también puede usarse para detectar la contaminación microbiana. Por ejemplo, una muestra puede evaluarse para determinar la presencia de virus o bacterias usando microscopía electrónica de transmisión (TEM). La detección de micoplasma puede efectuarse usando, por ejemplo, técnicas bioquímicas o moleculares, incluyendo, pero sin limitarse a, PCR para amplificar ácido nucleico específico de micoplasma, pruebas bioquímicas para detectar enzimas micoplásmicas y fluorescencia basada en células para detectar antígenos o ácidos nucleicos micoplásmicos.
También puede monitorizarse la presencia de productos microbianos, tales como endotoxinas bacterianas. Un ejemplo de un ensayo adecuado para detectar la presencia de endotoxina es el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL). Pueden usarse dos tipos de ensayos de LAL: coagulación en gel y fotométrico (cromógeno y turbométrico). El LAL es un extracto acuoso de células sanguíneas (amebocitos) del cangrejo herradura. La endotoxina desencadena una cascada de reacciones enzimáticas, que dan como resultado una enzima de coagulación activada. En presencia de endotoxinas bacterianas, a una temperatura elevada, el reactivo de LAL se coagulará después de la adición del reactivo. La formación del coágulo de gel es proporcional a la concentración de la endotoxina. En el ensayo cinético, la proenzima en el LAL se activa cuando entra en contacto con endotoxinas producidas por bacterias Gram-negativas. La tasa de activación es directamente proporcional a la concentración de la endotoxina presente. El nivel de activación puede medirse a través de una reacción posterior con el sustrato que se mide espectrofotométricamente.
K. Ejemplos
EJEMPLO 1
Generación de una línea celular que expresa rHuPH20 soluble
Se usó el plásmido HZ24 (expuesto en SEQ ID NO:50) para transfectar células de ovario de hámster chino (CHO) (véase, por ejemplo, las solicitudes relacionadas n.os 10.795.095, 11/065.716 y 11/238.171). El vector plasmídico HZ24 para la expresión de rHuPH20 soluble contiene una estructura principal de vector pCI (Promega), ADN que codifica para los aminoácidos 1-482 de hialuronidasa PH20 humana (s Eq ID NO:47), un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) del virus ECMV (Clontech) y el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón. La estructura principal de vector pCI también incluye ADN que codifica para el gen resistente a beta-lactamasa (AmpR), un origen de replicación f1, una región potenciadora/promotora inmediata-temprana del citomegalovirus (CMV), un intrón quimérico y una señal de poliadenilación tardía del SV40 (SV40). El ADN que codifica para el constructo de rHuPH20 soluble contiene un sitio NheI y una secuencia consenso de Kozak antes del ADN que codifica para la metionina en la posición de aminoácido 1 de la secuencia señal de 35 aminoácidos nativa de PH20 humana y un codón de terminación tras el ADN que codifica para la tirosina correspondiente a la posición de aminoácido 482 de la hialuronidasa PH20 humana expuesta en SEQ ID NO:1), seguido de un sitio de restricción BamHI. Por tanto, el constructo pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ24) da como resultado una única especie de ARNm dirigida por el promotor de CMV que codifica para los aminoácidos 1-482 de PH20 humana (expuesta en SEQ ID NO:3) y los aminoácidos 1-186 de dihidrofolato reductasa de ratón (expuesta en SEQ ID NO:51), separados por el sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
Se sembraron células CHO DG44 no transfectadas que se hicieron crecer en medios CD-CHO modificados por GIBCO para las células DHFR(-), complementados con glutamina 4 mM y Pluronic F68/L 18 ml/l (Gibco), a 0,5 x 106 células/ml en un matraz de agitación en preparación para la transfección. Las células se hicieron crecer a 37°C en el 5% de CO2 en una incubadora humidificada, agitando a 120 rpm. Se sometieron a prueba células CHO DG44 no transfectadas en crecimiento exponencial para determinar la viabilidad antes de la transfección.
Se sedimentaron sesenta millones de células viables del cultivo de células CHO DG44 no transfectadas y se resuspendieron hasta una densidad de 2 * 107 células en 0,7 ml de 2* tampón de transfección (2* HeBS: Hepes 40 mM, pH 7,0, NaCl 274 mM, KCl 10 mM, Na2HPO4 1,4 mM, dextrosa 12 mM). A cada alícuota de células resuspendidas se le añadieron 0,09 ml (250 |ig) del plásmido HZ24 lineal (linealizado mediante digestión durante la noche con Cla I (New England Biolabs) y se transfirieron las disoluciones de células/ADN a cubetas de electroporación BTX (Gentronics) con separación de 0,4 cm a temperatura ambiente. Se realizó una electroporación de control negativo sin ADN plasmídico mezclado con las células. Las mezclas de células/plásmido se sometieron a electroporación con una descarga de condensador de 330 V y 960 |iF o a 350 V y 960 |iF.
Las células se retiraron de las cubetas después de la electroporación y se transfirieron a 5 ml de medios CD-CHO modificados para las células DHFR(-), complementados con glutamina 4 mM y Pluronic F68/L 18 ml/l (Gibco), y se dejaron crecer en un pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos sin selección durante 2 días a 37°C en el 5% de CO2 en una incubadora humidificada.
Dos días después de la electroporación, se retiraron 0,5 ml de medios de cultivo tisular de cada pocillo y se sometieron a prueba para determinar la presencia de actividad hialuronidasa, usando el ensayo de microturbidez descrito en el ejemplo 9.
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Se recogieron las células de la transfección 2 (350 V) del pocilio de cultivo tisular, se contaron y se diluyeron hasta de 1 x 104 a 2 x 104 células viables por ml. Se transfirió una alícuota de 0,1 ml de la suspensión celular a cada pocillo de cinco placas de cultivo tisular de fondo redondo de 96 pocillos. Se añadieron cien microlitros de medios CD-CHO (GIBCO) que contenían complemento GlutaMAX™-I 4 mM (GIBCO™, Invitrogen Corporation) y sin los complementos hipoxantina y timidina a los pocillos que contenían células (volumen final de 0,2 ml).
Se identificaron diez clones a partir de las 5 placas hechas crecer sin metotrexato.
Tabla 2. Actividad hialuronidasa de los clones identificados
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Se expandieron seis clones de HZ24 en cultivo y se transfirieron a matraces de agitación como suspensiones celulares individuales. Los clones 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, l E l l y 4D10 se sembraron en placas de cultivo tisular de fondo redondo de 96 pocillos usando una estrategia de dilución infinita bidimensional en la que las células se diluyeron 1:2 a lo largo de la placa y 1:3 a lo ancho de la placa, comenzando a 5000 células en el pocillo superior a mano izquierda. Se hicieron crecer los clones diluidos en un fondo de 500 células CHO DG44 no transfectadas por pocillo, para proporcionar los factores de crecimiento necesarios para los días iniciales en cultivo. Se realizaron diez placas por subclon, con 5 placas que contenían metotrexato 50 nM y 5 placas sin metotrexato.
El clon 3D3 produjo 24 subclones visuales (13 a partir del tratamiento sin metotrexato y 11 a partir del tratamiento con metotrexato 50 nM. Se midió una actividad hialuronidasa significativa en los sobrenadantes de 8 de los 24 subclones (>50 Unidades/ml), y estos 8 subclones se expandieron en matraces de cultivo tisular T-25. Los clones aislados del protocolo de tratamiento con metotrexato se expandieron en presencia de metotrexato 50 nM. El clon 3D35M se expandió adicionalmente en metotrexato 500 nM, dando lugar a clones que producían más de 1.000 Unidades/ml en matraces de agitación (clon 3D35M; o 3D35M Gen1). Después se preparó un banco de células maestro (BCM) de las células 3D35M.
EJEMPLO 2
Determinación del número de copias de la región de ácido nucleico que codifica para rHuPH20 soluble en células 3D35M
Se determinó el número de copias de la región de ácido nucleico que codifica para rHuPH20 soluble en células 3D35M mediante PCR cuantitativa. Se extrajo ADN genómico total a partir de células 3D35M del BCM. Se prepararon seis diluciones independientes del ADN para su análisis por duplicado, que contenía cada una aproximadamente 6,6 ng de ADN (equivalentes a aproximadamente 100 células). También se prepararon controles negativos que no contenían molde, así como controles positivos que contenían el plásmido y el ADN equivalente de 1000 células CHO (6,6 ng). Las reacciones se ensamblaron según el protocolo de mezcla maestra de PCR universal TaqMan (Applied Biosystems) y se ejecutaron por duplicado. Se generó una curva de calibración usando ocho diluciones del plásmido HZ24, que representaban un intervalo de aproximadamente 5 x 106 a 49 copias de ADN plasmídico. Se diluyó el patrón en ADN genómico de control de CHO (equivalente de 100 células). Las reacciones se ensamblaron según el protocolo de mezcla maestra de PCR universal TaqMan™ (Applied Biosystems) usando el cebador directo HZM3.P1 y el cebador inverso HZM3.P2 (expuestos en las SEQ ID NO:52 y 53, respectivamente) y la sonda HZM3 (SEQ ID NO:54), que contenía los colorantes fluorescentes 6FAM (6-carboxifluoresceína) y TAMRA (6-carboxitetrametilrrodamina). Las reacciones se ejecutaron por duplicado usando las siguientes condiciones de ciclo: 50°C durante 2 minutos, 95°C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 minuto. También se realizó una reacción de PCR cuantitativa convencional para someter a ensayo las copias de GAPDH para cada muestra de ADN. Se recopilaron los datos mediante el software de sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700™, versión 1.9 (Applied Biosystems).
Se calcularon los números de copias de genes diana por célula como la razón de copias diana (rHuPH20 soluble) con respecto a copias normalizadas (GAPDH) para las seis diluciones de ADN genómico de 3D35M. Se aplicó la prueba estadística de la Q de Dixon para valores extremos al conjunto de datos. Se halló que el número de copias de la región de sHuPH20 en células 3D35M era de 317,87 ± 11,64.
EJEMPLO 3 (COMPARATIVO)
Producción y purificación de rHuPH20 soluble del Gen1
A. Procedimiento en biorreactor de 5 l
Se descongeló un vial de 3D35M y se expandió a partir de matraces T-25 a matraces de centrifugación de 1 l en CD CHO (Invitrogen, Carlsbad Calif.) complementado con metotrexato 100 nM y 40 ml/l de GlutaMAX™-I (Invitrogen; disolución madre 200 mM). Se transfirieron las células de los matraces de centrifugación a un biorreactor de 5 l (Braun) a una densidad de inoculación de 4 * 105 células viables por ml en 5 l de medios. Los parámetros fueron punto de ajuste de temperatura de 37°C, pH de 7,2 (punto de ajuste de partida), con punto de ajuste de oxígeno disuelto del 25% y una superposición de aire de 0-100 cc/min. A las 168 horas, se añadieron 250 ml de medio #1 de alimentación (CD CHO con 50 g/l de glucosa). A las 216 horas, se añadieron 250 ml de medio #2 de alimentación (CD CHO con 50 g/l de glucosa y butirato de sodio 10 mM) y a las 264 horas se añadieron 250 ml de medio #2 de alimentación. Este procedimiento dio como resultado una productividad final de 1600 Unidades por ml con una densidad celular máxima de 6 * 106 células/ml. La adición de butirato de sodio fue para potenciar la producción de rHuPH20 soluble en las etapas finales de producción.
Los medios acondicionados del clon 3D35M se clarificaron mediante filtración profunda y diafiltración de flujo tangencial en Hepes 10 mM, pH 7,0. Después se purificó la rHuPH20 soluble mediante cromatografía secuencial en intercambio iónico en Q Sepharose (Pharmacia), cromatografía de interacción hidrófoba en Phenyl Sepharose (Pharmacia), boronato de aminofenilo (ProMedics) y cromatografía de hidroxiapatita (Biorad, Richmond, CA).
La rHuPH20 soluble se unió a Q Sepharose y eluyó a NaCl 400 mM en el mismo tampón. Se diluyó el eluato con sulfato de amonio 2 M hasta una concentración final de sulfato de amonio 500 mM y se hizo pasar a través de una columna Phenyl Sepharose (low sub), seguido de la unión en las mismas condiciones a una resina de boronato de fenilo. La rHuPH20 soluble se eluyó a partir de la resina Phenyl Sepharose en Hepes pH 6,9 después de lavar a pH 9,0 en bicina 50 mM sin sulfato de amonio. Se cargó el eluato en una resina cerámica de hidroxiapatita a pH 6,9 en fosfato de potasio 5 mM y CaCh 1 mM y se eluyó con fosfato de potasio 80 mM, pH 7,4 con CaCh 0,1 mM.
La rHuPH20 soluble resultante presentaba una actividad específica de más de 65.000 Unidades/mg de proteína mediante el ensayo de microturbidez (véase el ejemplo 9). La rHuPH20 soluble purificada eluida como un único pico desde 24 hasta 26 minutos a partir de una columna de estireno-divinilbenceno Pharmacia 5RPC con un gradiente de entre el 0,1% de TFA/H2O y el 0,1% de TFA/el 90% de acetonitrilo/el 10% de H2O y se resolvió como una única banda ancha de 61 kDa mediante electroforesis con SDS que se redujo hasta dar una banda nítida de 51 kDa tras el tratamiento con PNGasa-F. La secuenciación de los aminoácidos N-terminales reveló que el péptido líder se había retirado eficazmente.
B. Procedimiento de expansión de cultivo celular aguas arriba en un cultivo celular de biorreactor de 100 l
Se usó un procedimiento aumentado a escala para purificar por separado rHuPH20 soluble a partir de cuatro viales diferentes de células 3D35M para producir 4 lotes independientes de sHuPH20; HUA0406C, h Ua 0410C, HUA0415C y HUA0420C. Cada vial se expandió y cultivó por separado a través de un biorreactor de 125 l, después se purificó usando cromatografía en columna. Se tomaron muestras durante todo el procedimiento para evaluar parámetros tales como el rendimiento de enzima. La descripción del procedimiento proporcionado a continuación expone especificaciones representativas para cuestiones tales como los volúmenes iniciales del biorreactor y de los medios de alimentación, densidades celulares de transferencia y volúmenes de lavado y elución. Los números exactos varían ligeramente con cada lote, y se detallan en las tablas 3 a 10.
Se descongelaron cuatro viales de células 3D35M en un baño de agua a 37°C, se añadió CD CHO que contenía metotrexato 100 nM y 40 ml/l de GlutaMAX™-I y se centrifugaron las células. Se resuspendieron las células en un matraz de agitación de 125 ml con 20 ml de medios recién preparados y se colocaron en una incubadora a 37°C, el 7% de CO2. Se expandieron las células hasta 40 ml en el matraz de agitación de 125 ml. Cuando la densidad celular alcanzó 1,5 - 2,5 x 106 células/ml, se expandió el cultivo en un matraz de centrifugación de 125 ml en un volumen de cultivo de 100 ml. Se incubó el matraz a 37°C, el 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó 1,5 - 2,5 x 106 células/ml, se expandió el cultivo en un matraz de centrifugación de 250 ml en un volumen de cultivo de 200 ml y se incubó el matraz a 37°C, el 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó 1,5 - 2,5 x 106 células/ml, se expandió el cultivo en un matraz de centrifugación de 1 l en un volumen de cultivo de 800 ml y se incubó a 37°C, el 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó 1,5 - 2,5 x 106 células/ml, se expandió el cultivo en un matraz de centrifugación de 6 l en un volumen de cultivo de 5 l y se incubó a 37°C, el 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó 1.5 - 2,5 x 106 células/ml, se expandió el cultivo en un matraz de centrifugación de 36 l en un volumen de cultivo de 20 l y se incubó a 37°C, el 7% de CO2.
Se esterilizó un reactor de 125 l con vapor a 121°C, 20 PSI y se añadieron 65 l de medios CD CHO. Antes de su uso, se comprobó el reactor para determinar la contaminación. Cuando la densidad celular en los matraces de centrifugación de 36 l alcanzó 1,8 - 2,5 x 106 células/ml, se transfirieron 20 l de cultivo celular desde los matraces de centrifugación de 36 l al biorreactor de 125 l (Braun), dando como resultado un volumen final de 85 l y una densidad de siembra de aproximadamente 4 * 105 células/ml. Los parámetros fueron punto de ajuste de temperatura, 37°C; pH: 7,2; oxígeno disuelto: 25% ± 10%; velocidad del impulsor de 50 rpm; presión del recipiente de 3 psi; burbujeo de aire de 1 l/min; superposición de aire: 1 l/min. Se tomaron muestras del reactor diariamente para determinar el recuento celular, la verificación del pH, el análisis de los medios, la producción y la retención de proteína. Se añadieron alimentaciones de nutrientes durante la ejecución. El día 6, se añadieron 3,4 l de medio #1 de alimentación (CD CHO 50 g/l de glucosa 40 ml/l de GlutaMAX™-I) y se cambió la temperatura de cultivo a 36,5°C. El día 9, se añadieron 3.5 l de alimentación #2 (CD CHO 50 g/l de glucosa 40 ml/l de GlutaMAX™-I 1,1 g/l de butirato de sodio) y se cambió la temperatura de cultivo a 36°C. El día 11, se añadieron 3,7 l de alimentación #3 (CD CHO 50 g/l de glucosa 40 ml/l de GlutaMAX™-I 1,1 g/l de butirato de sodio) y se cambió la temperatura de cultivo a 35,5°C. Se recogió el reactor a los 14 días o cuando la viabilidad de las células se encontraba por debajo del 50%. El procedimiento dio como resultado la producción de rHuPH20 soluble con una actividad enzimática de 1600 Unidades/ml con una densidad celular máxima de 8 millones de células/ml. En la recogida, se tomaron muestras del cultivo para determinar micoplasma, carga biológica, endotoxina y virus in vitro e in vivo, microscopía electrónica de transmisión (TEM) para las partículas virales y actividad enzimática.
Se filtró el cultivo celular recogido del biorreactor de cien litros a través de una serie de filtros de cápsula desechables que tenían un medio de poliéter sulfona (Sartorius): en primer lugar a través de una cápsula de 8,0 |im de profundidad, una cápsula de 0,65 |im de profundidad, una cápsula de 0,22 |im y finalmente a través de un filtro Sartopore de 2000 cm2 de 0,22 |im y en una bolsa de almacenamiento estéril de 100 l. Se concentró el cultivo 10* usando dos TFF con filtros de 30 kDa de MWCO de poliéter sulfona en espiral (Millipore), seguido de intercambio del tampón 6* con HEPES 10 mM, Na2SO425 mM, pH 7,0 hacia un filtro final de 0,22 |im en una bolsa de almacenamiento estéril de 20 l. La tabla 3 proporciona datos de monitorización relacionados con las etapas de cultivo celular, recogida, concentración e intercambio del tampón.
Tabla 3. Datos de monitorización para las etapas de cultivo celular, recogida, concentración e intercambio del tampón.
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Se preparó una columna de intercambio iónico Q Sepharose (Pharmacia) (3 l de resina, altura = 20 cm, diámetro = 14 cm). Se recogieron muestras de lavado para la determinación del pH, la conductividad y la endotoxina (ensayo de LAL). Se equilibró la columna con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2SO420 mM, pH 7,5. Se cargó la recogida sometida a diafiltración concentrada en la columna Q a una velocidad de flujo de 100 cm/h. Se lavó la columna con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2SO420 mM, pH 7,5 y Hepes 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0. Se eluyó la proteína con Hepes 10 mM, NaCl 400 mM, pH 7,0 y se filtró a través de un filtro final de 0,22 |im en una bolsa estéril.
A continuación se realizó una cromatografía de interacción hidrófoba en Phenyl Sepharose (Pharmacia). Se preparó una columna Phenyl Sepharose (PS) (9,1 l de resina, altura = 29 cm, diámetro = 20 cm). Se equilibró la columna con 5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, CaCh 0,1 mM, pH 7,0. Se complementó el eluato de proteína anterior con disoluciones madre de sulfato de amonio 2 M, fosfato de potasio 1 M y CaCh 1 M hasta concentraciones finales de 5 mM, 0,5 M y 0,1 mM, respectivamente. Se cargó la proteína en la columna PS a una velocidad de flujo de 100 cm/h. Se añadió fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M y CaCh 0,1 mM, pH 7,0 a 100 cm/h. Se hizo pasar la fracción no retenida a través de un filtro final de 0,22 |im en una bolsa estéril.
Se cargó la proteína purificada en PS en una columna de boronato de aminofenilo (ProMedics) (6,3 l de resina, altura = 20 cm, diámetro = 20 cm) que se había equilibrado con 5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M. Se hizo pasar la proteína a través de la columna a una velocidad de flujo de 100 cm/h y se lavó la columna con fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0. Después se lavó la columna con bicina 20 mM, NaCl 100 mM, pH 9,0 y se eluyó la proteína con Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,9 a través de un filtro estéril y en una bolsa estéril de 20 l. Se sometió a prueba el eluato para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad enzimática.
Se equilibró una columna de hidroxiapatita (HAP) (BioRad) (1,6 l de resina, altura = 10 cm, diámetro = 14 cm) con fosfato de potasio 5 mM, NaCl 100 mM, CaCh 0,1 mM, pH 7,0. Se recogieron muestras de lavado y se sometieron a prueba para determinar el pH, la conductividad y la endotoxina (ensayo de LAL). Se complementó la proteína purificada en boronato de aminofenilo con fosfato de potasio y CaCh hasta concentraciones finales de fosfato de potasio 5 mM y CaCl20,1 mM y se cargó en la columna de HAP a una velocidad de flujo de 100 cm/h. Se lavó la columna con fosfato de potasio 5 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM, CaCh 0,1 mM, después fosfato de potasio 10 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM, CaCl20,1 mM, pH. Se eluyó la proteína con fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0 y se filtró a través de un filtro de 0,22 |im en una bolsa de almacenamiento estéril de 5 l. Se sometió a prueba el eluato para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad enzimática.
Después se bombeó la proteína purificada en HAP a través de un filtro de eliminación de virus de 20 nM mediante un tanque de presión. Se añadió la proteína al tanque de presión DV20 y al filtro (Pall Corporation), que se hizo pasar a través de un filtro Ultipor DV20 con poros de 20 nm (Pall Corporation) en una bolsa de almacenamiento estéril de 20 l. Se sometió a prueba el filtrado para determinar la concentración de proteína, la actividad enzimática, el perfil de oligosacáridos, monosacáridos y ácido siálico y las impurezas relacionadas con el procedimiento. Después se concentró la proteína en el filtrado hasta 1 mg/ml usando un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) Sartocon Slice de corte de peso molecular (MWCO) de 10 kD (Sartorius). En primer lugar, se preparó el filtro lavando con una de disolución Hepes/solución salina (Hepes 10 mM, NaCl 130 mM, pH 7,0) y se tomaron muestras del permeado para determinar el pH y la conductividad. Tras la concentración, se tomaron muestras de la proteína concentrada y se sometieron a prueba para determinar la concentración de proteína y la actividad enzimática. Se realizó un intercambio del tampón 6* en la proteína concentrada con el tampón final: Hepes 10 mM, NaCl 130 mM, pH 7,0. Se hizo pasar la proteína concentrada a través de un filtro de 0,22 |im en una bolsa de almacenamiento estéril de 20 l. Se tomaron muestras de la proteína y se sometieron a prueba para determinar la concentración de proteína, la actividad enzimática, los grupos sulfhidrilo libres, el perfil de oligosacáridos y la osmolaridad.
Las tablas 4 a 10 proporcionan datos de monitorización relacionados con cada una de las etapas de purificación descritas anteriormente, para cada lote de células 3D35M.
Tabla 4. Datos de columna Q Sepharose
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Tabla 5. Datos de columna Phenyl Sepharose
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Tabla 6. Datos de columna de boronato de aminofenilo
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Tabla 7. Datos de columna de hidroxiapatita
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Tabla 8. Datos de filtración DV20
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Tabla 9. Datos de concentración final
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Tabla 10. Datos de intercambio del tampón en formulación final
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Se cargó de manera aséptica la proteína rHuPH20 soluble purificada y concentrada en viales estériles con volúmenes de llenado de 5 ml y 1 ml. Se hizo pasar la proteína a través de un filtro de 0,22 |im hasta una bomba controlada por operario que se usó para llenar los viales usando una lectura gravimétrica. Se cerraron los viales con tapones y se aseguraron con tapas engarzadas. Se inspeccionaron visualmente los viales cerrados para determinar partículas extrañas y después se etiquetaron. Tras el etiquetado, se ultracongelaron los viales mediante inmersión en nitrógeno líquido durante no más de 1 minuto y se almacenaron a <15°C (-20 ± 5°C). La producción y purificación de rHuPH20 soluble usando este método produjo aproximadamente 400-700 mg de rHuPH20 soluble con una actividad específica de 96.000 unidades/mg a 144.000 unidades/mg.
EJEMPLO 4
Producción de rHuPH20 soluble del Gen2
Se adaptó la línea celular 3D35M del Gen1 descrita anteriormente a mayores niveles de metotrexato para producir clones del Gen2. Se sembraron células 3D35M a partir de cultivos que contenían metotrexato establecidos en medio CD CHO que contenía GlutaMAX™-I 8 mM y metotrexato 1,0 |iM. Se adaptaron las células a un mayor nivel de metotrexato haciéndolas crecer y pasar 9 veces durante un periodo de 46 días en una incubadora humidificada a 37°C, el 7% de CO2. Se clonó la población amplificada de células mediante dilución limitante en placas de cultivo tisular de 96 pocillos que contenían medio con metotrexato 2,0 |iM. Después de aproximadamente 4 semanas, se identificaron los clones y se seleccionó el clon 3E10B para la expansión. Se hicieron crecer células 3E10B en medio CD CHO que contenía GlutaMAX™-I 8 mM y metotrexato 2,0 |iM durante 20 pases, sometiendo a prueba para determinar la viabilidad celular mediante tinción con azul de tripano y recuento con un hemocitómetro y la actividad enzimática mediante el ensayo de microturbidez (descrito a continuación en el ejemplo 9). Se creó un banco de células maestro (BCM) de la línea celular 3E10B y se congeló, y se usó para estudios posteriores.
La amplificación de la línea celular continuó cultivando células 3E10B en medio CD CHO que contenía GlutaMAX™-I 8 mM y metotrexato 4,0 |iM. Después del 12° pase, se congelaron las células en viales como banco de células de investigación (RCB). Se descongeló un vial del RCB y se cultivó en medio que contenía metotrexato 8,0 |iM. Después de 5 días, la concentración de metotrexato en el medio aumentó hasta 16,0 |iM, después 20,0 |iM 18 días más tarde. Se clonaron las células del 8° pase en medio que contenía metotrexato 20,0 |iM mediante dilución limitante en placas de cultivo tisular de 96 pocillos que contenían medio CD CHO que contenía GlutaMAX™-I 4 mM y metotrexato 20,0 |iM. Se identificaron los clones 1B3, 2B2 y 5C1 5-6 semanas más tarde. También se clonaron las células del 9° pase de 3D35M mediante dilución limitante en placas de cultivo tisular de 96 pocillos con medio CD CHO que contenía GlutaMAX™-I 8 mM y metotrexato 20,0 |iM, y se identificaron los clones 1G11, 2E10 y 2G10.
Se sembraron los cultivos celulares de cada uno de 1B3, 2B2, 5C1, 1G11, 2E10 y 2G10 a una densidad de 4 x 105 células/ml en un volumen de 50 ml en matraces de agitación de 250 ml. Se dejaron crecer y decrecer los cultivos sin alimentaciones adicionales durante 10-14 días para determinar la tasa de crecimiento y la productividad de las células. Se tomaron muestras periódicamente y se sometieron a ensayo para determinar la actividad hialuronidasa (tablas 11 y 12).
Tabla 11. Actividad hialuronidasa de células 1B3, 2B2 y 5C1
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Tabla 12. Actividad hialuronidasa de células 1B3, 2B2 y 2E10
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Se compararon cuatro líneas celulares (2B2, 2G10, 1G11 y 2E10) en un estudio en el que todas ellas se sembraron a una densidad de 4 * 105 células/ml en un volumen de 50 ml en un matraz de agitación de 250 ml. Todas recibieron alimentaciones al 10% (v/v) el día 8 y alimentaciones al 5% con medios de alimentación que contenían medio CD CHO complementado con 50 g/l de glucosa, 40 g/l de extracto de levadura y 1,1 g/l de butirato de sodio. Se recogieron las células el día 15. Se tomaron muestras periódicamente y se sometieron a ensayo para determinar la actividad enzimática de rHuPH20 soluble (tabla 13).
Tabla 13. Actividad hialuronidasa de células 2E10, 1G11,2G10 y 2B2
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Tanto en las condiciones discontinuas como en las semicontinuas, el cultivo de células 2B2 mostró una mayor actividad enzimática, aunque otras células (por ejemplo, células 2G10) también mostraron una buena productividad enzimática, por lo que se seleccionó la línea celular 2B2 para la expansión en medio que contenían metotrexato 20,0 |iM. Después del 11° pase, se congelaron las células 2B2 en viales como banco de células de investigación (RCB).
EJEMPLO 5
Actividad enzimática de rHuPH20 soluble producida en células 3E10B y 2B2
Se sometió a ensayo la rHuPH20 soluble producida por células 3E10B y 2B2 para determinar la actividad enzimática usando el ensayo de microturbidez (ejemplo 9). Se descongelaron viales congelados de bancos de células 3E10B y 2B2 y se cultivaron las células por separado durante dos pases en medio de crecimiento (medio CD CHO con GlutaMAX™-I 8 mM y o bien metotrexato 2,0 |iM para células 3E10B o bien metotrexato 20,0 |iM para células 2B2) en una incubadora humidificada a 37°C, el 6% de CO2. Se inocularon las células en 20 ml de medio de crecimiento en matraces Erlenmeyer de 125 ml (Corning) a 5 * 105 células/ml y se hicieron crecer durante 8 días en una incubadora humidificada a 37°C, el 6% de CO2 con una plataforma agitadora que giraba a aproximadamente 100 rpm. Los días 8 y 10, los cultivos recibieron el 5% v/v de medio de alimentación que contenía medio CD CHO complementado con 50 g/l de glucosa, 50 g/l de extracto de levadura y 2,2 g/l (20 mM) de butirato de sodio para iniciar la fase de producción. Se tomaron muestras de los cultivos durante la fase de producción el día 8 (190 horas), el día 10 (240 horas), el día 14 (332 horas), el día 15 (258 horas), el día 16 (382 horas) y el día 18 (427 horas), y se dejó que la viabilidad disminuyera hasta cero. Después se analizaron las muestras para determinar la actividad hialuronidasa.
Las tablas 14 y 15 exponen la viabilidad (densidad de células viables (VCD) y porcentaje de viabilidad) y la actividad (unidades/matraz) de las células 3E10B y 2B2 en cada punto de tiempo. La actividad enzimática de rHupH20 soluble producida por células 2B2 fue sistemáticamente mayor que la producida por células 3E10B. Por ejemplo, el día 8, la actividad enzimática de rHuPH20 soluble producida por células 2B2 fue un 69% mayor que la producida por células 3E10B (2484 unidades/ml en comparación con 1469 unidades/ml). Se observó una tendencia similar durante toda la fase de producción. La viabilidad de los cultivos celulares disminuyó a una tasa similar. Cuando se calculó la tasa de producción de las células, se observó que las células 3E10B produjeron 0,23 picogramos de rHuPH20 soluble por célula por día (pcd) el día 8 y 0,38 pcd el día 15. En comparación, las células 2B2 produjeron 0,46 picogramos de rHuPH20 soluble pcd el día 8 y 0,69 pcd el día 15, que fueron un 100% y un 82% mayores que la producción de 3E10B los días 8 y 15, respectivamente. Después se preparó un banco de células maestro (BCM) de células 2B2 para estudios posteriores.
Tabla 14. Viabilidad y actividad del clon 3E10B
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Tabla 15. Viabilidad y actividad del clon 2B2
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EJEMPLO 6
Pruebas de estabilidad genética de células 2B2
A. Determinación del número de copias de la región de ácido nucleico que codifica para rHuPH20 soluble en células 2B2
Se determinó el número de copias de la región de ácido nucleico que codifica para rHuPH20 soluble en células 2B2 mediante PCR. Se extrajo ADN genómico total a partir de 2 * 107 células 2B2 del BCM usando un kit QlAamp DNeasy (Qiagen). También se extrajo ADN genómico a partir de células CHO DG-44 como control negativo. Se verificó la pureza del ADN extraído mediante electroforesis en gel de agarosa y espectrofotometría UV. Para generar fragmentos de ADN (frente a ADN de alto peso molecular), se cortó el ADN genómico mediante sonicación. Esto garantizó un pipeteo más preciso y accesibilidad al molde. Se prepararon seis diluciones independientes del ADN genómico (hasta diluciones de cantidades equivalentes a aproximadamente 1000 células/|il) a partir de células 2B2 y DG-44 y se analizaron por duplicado en dos ensayos; un ensayo objetivo, que dirigió y amplificó una secuencia específica para la región de ácido nucleico que codifica para ADN plasmídico de rHuPH20 soluble, y un control endógeno, que dirigió y amplificó una secuencia de GAPDH. El control endógeno se usó como normalización de los resultados. El ensayo objetivo incluía una curva de calibración generada a partir de una dilución en serie de cantidades conocidas del plásmido HZ24 mezclado en ADN genómico de CHO DG-44. El control endógeno incluía una curva de calibración generada a partir de diluciones en serie de ADN genómico de CHO DG-44 mezclado con ADN del plásmido HZ24. Se supuso que el tamaño de genoma de mamífero era de 3 * 109 pares de bases. Cada ensayo incluía un control negativo (sin molde) y un control positivo (ADN del plásmido HZ24 para el ensayo objetivo y ADN de células huésped para el ensayo de normalización con control endógeno). Se prepararon las reacciones usando el cebador directo HZM3.P1 y el cebador inverso HZM3.P2 (expuestos en las SEQ ID NO:52 y 53, respectivamente) y la sonda HZM3 (SEQ iD NO:54), que contenía los colorantes fluorescentes 6FAM (6-carboxifluoresceína) y TAMRA (6-carboxitetrametilrrodamina). Se amplificaron las muestras usando el sistema de detección de secuencias Prism® 7900 de Applied Biosystems con condiciones de ciclo convencionales (50°C durante 2 minutos, 95°C durante 10 min, 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 min durante 40 ciclos).
Se calcularon los números de copias de genes diana por célula como la razón de copias diana con respecto a copias normalizadas (GAPDH) para las seis diluciones de a Dn genómico de 2B2. Se aplicó la prueba estadística de la Q de Dixon para valores extremos al conjunto de datos. Se halló que el número de copias de la región de ácido nucleico que codifica para el plásmido de rHuPH20 soluble en células 2B2 era de 206,61 ± 8,35.
B. Análisis de secuencias de ARNm
Se determinó la secuencia del ARNm de PH20 generado a partir del plásmido HZ24 en células 2B2. Se extrajo ARN de 2 * 107 células 2B2 a partir del BCM usando un mini-kit RNeasy (Qiagen). Se trató la muestra con ADNasa I para retirar el ADN contaminante y se verificó la pureza del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa y espectrofotometría UV. Se realizó una reacción de transcripción inversa usando transcriptasa inversa SuperScript™ (Invitrogen) y una reacción de control sin transcriptasa inversa usando el ARN extraído y cebadores oligo d(t) y aleatorios. Después se usaron los productos de ADNc resultantes como moldes en amplificaciones por PCR. Se usaron dos conjuntos de pares de cebadores diferentes; AP01/AP03 y AP10/AP12. AP01/AP03 se diseñó para amplificar una región de 1719 pares de bases, mientras que el par de cebadores AP10/AP12 se diseñó para amplificar una región más amplia (1811 pares de bases) para obtener la secuencia de hebra inversa del extremo 3'. La tabla 5 expone las secuencias de los cebadores. Cada reacción de PCR incluía controles de cebador único, un control negativo que usa el control sin transcriptasa inversa (descrito anteriormente) como molde y un control positivo con cebadores de control y molde de control. Se visualizaron los productos de amplificación mediante electroforesis en gel de agarosa y se confirmó que tenían el tamaño esperado, después se purificaron para retirar los cebadores en exceso y los dNTP mediante extracción en gel o EXOSa P (USB).
Se secuenciaron los productos purificados usando el kit de secuenciación de ciclo BigDye® Terminator v1.1 (Applied Biosystems) y los cebadores expuestos en la tabla 16. Se ensamblaron los datos de secuencia y se comparó la secuencia consenso derivada (s Eq ID NO:55) con la secuencia de referencia usando el software Sequencher, versión 4.1.2 (Gene Code Corporation). Se generaron un total de 1449 pares de bases de datos de secuencia. Se halló que la secuencia era idéntica a la secuencia de referencia (SEQ ID NO:47) excepto por una diferencia de pares de bases en la posición 1131, que se observó que era una timidina (T) en lugar de la citosina I esperada. Esta es una mutación silenciosa, sin ningún efecto sobre la secuencia de aminoácidos.
Tabla 16. Cebadores para la amplificación por PCR y la secuenciación
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C. Análisis por transferencia de tipo Southern de células 2B2
Se realizó un análisis por transferencia de tipo Southern en células 2B2 para obtener un mapa de estructura. Se extrajo ADN total a partir de 1 * 107 células 2B2 y 1 * 107 células DG-44 de control usando un sistema Maxwell 16® (Promega). Se evaluaron el ADN extraído y un constructo de control de plásmido HZ24 para determinar la pureza mediante electroforesis en gel de agarosa. Se digirió ADN a partir de células 2B2, células DG-44 y control de plásmido HZ24 con Spe I, Xba I y una digestión doble usando BamH I/Hind III. Se realizó otra digestión con BamH I/Hind en el control de plásmido HZ24 y se purificó aproximadamente 1,4 kb mediante extracción en gel y se marcó radiactivamente con a-32P para generar una sonda marcada. Se sometieron a electroforesis aproximadamente 10 |ig de cada uno de ADN de 2B2 y ADN de DG-44 digeridos y 10 |ig de ADN de DG-44 con 250 pg de ADN de plásmido HZ24 en un gel de agarosa. Se tomó una imagen del gel tras la electroforesis, después se realizó una transferencia de tipo Southern. Se hibridó la membrana de nailon con la sonda marcada, después se lavó a temperatura ambiente durante 30 minutos, después dos veces a 55°C durante 30 minutos. Se expuso una autorradiografía inicial durante 24 horas y se inspeccionó visualmente. Se determinó que era necesaria una exposición más larga, de modo que se expuso una segunda autorradiografía durante 3 días durante una exposición más oscura de las bandas hibridadas. Después de desarrollar la película, se dimensionaron las bandas usando un dispositivo AlphaImager® (Alpha Innotech).
No se observaron bandas de hibridación para la digestión de control negativo de DG-44 y se observaron bandas de hibridación únicas de tamaños esperados en las digestiones de HZ24 (digestión con BamH I/Hind III: ~1,4 kb; digestión con Spe I: ~6,6 kb; digestión con Xba I: ~6,5 kb). Había una banda de hibridación principal de ~7,7 kb y cuatro bandas de hibridación secundarias (—13,9, ~6,6, ~5,7 y ~4,6 kb) observadas usando ADN de 2B2 digerido con Spe I, una banda de hibridación principal de —5,0 kb y dos bandas de hibridación secundarias (—13,9 y —6,5 kb) observadas usando ADN de 2B2 digerido con Xba I y una única banda de hibridación de —1,4 kb observada usando ADN de 2B2 digerido con BamH I/Hind III. La presencia de la única banda de hibridación de —1,4 kb en BamH I/Hind III indicó que no había inserciones o deleciones de secuencia grandes dentro de la región sondeada. Los resultados de las digestiones con Xba I y Spe I únicamente indican que hay múltiples sitios de integración del plásmido HZ24 en el genoma de las células 2B2.
EJEMPLO 7
Producción de rHuPH20 soluble del Gen2 en un cultivo celular de biorreactor de 30 l
Se produjo y purificó rHuPH20 soluble a partir de células 2B2 usando un biorreactor de 36 l (30 l de volumen de cultivo) para determinar los procedimientos óptimos para aumentar la escala hasta un biorreactor de 400 l (300 l de volumen de cultivo). A continuación se detalla, en las secciones A D, cuatro ejecuciones en un biorreactor de 36 l independientes.
A. Producción y caracterización de los lotes 056-099 y 056-100 de rHuPH20 soluble
Se descongeló un vial de 2B2 (1 * 107 células) y se cultivó a 37°C, el 7% de CO2 durante 8 pases en CD CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con metotrexato 20 |iM y 40 ml/l de GlutaMAX™-I (Invitrogen), después de lo cual se expandió hasta 600 ml. Una semana más tarde, se expandió el cultivo hasta 5 l en medio CD CHO complementado con 40 ml/l de GlutaMAX™-I y sin metotrexato. Se inoculó un biorreactor de 36 l que contenía 25 l de medio CD CHO complementado con 1 l de GlutaMAX™-I y 30 ml de sulfato de gentamicina con el cultivo de 5 l a una densidad de siembra inicial de 3,6 * 105 célula/ml. El punto de ajuste de agitación del biorreactor se estableció en 75 RPM; temperatura: 37°C; pH: 7,15; oxígeno disuelto: 30%. El biorreactor recibió una superposición de aire filtrado y un burbujeo de aire/oxígeno/CO2, tal como se controla mediante un controlador Applikon.
Se alimentó el cultivo 7 veces durante toda la ejecución en el biorreactor, a las 161, 184, 237, 256, 280, 304 y 328 horas tras la inoculación. Se filtraron los medios de alimentación en el biorreactor mediante una bomba peristáltica. El contenido de cada medio de alimentación y los parámetros de alimentación del biorreactor durante toda la ejecución se proporcionan en las tablas 17 y 18, respectivamente.
Tabla 17. Formulaciones de los medios de alimentación
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Tabla 18. Parámetros del biorreactor
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Se recogió el biorreactor y se filtró a través de un sistema que contenía una serie de filtros de cápsula (Sartorius) con tamaños de poro de 8 |im, 0,65 |im, 0,45 |im y 0,22 |im, respectivamente. La recogida se realizó usando una bomba peristáltica y se completó en aproximadamente 5 horas, produciendo aproximadamente 32 l de líquido de cultivo celular recogido (HCCF). Se complementó el HCCF con EDTA y Tris hasta concentraciones finales de 10 mM cada uno, pH 7,6. Después se almacenó el HCCF a 2-8°C antes de concentrarlo y someterlo a intercambio del tampón.
Para concentrar la proteína, en primer lugar se equilibró un cartucho enrollado en espiral de Millipore de 2,5 ft2 con un MWCO de 30 kDa en NaCl 150 mM, Hepes 10 mM, EDTA 10 mM, pH 7,5. Se concentraron 15 l de HCCF 15* hasta 1 l. Se sometió a intercambio del tampón el concentrado 10* con el tampón NaCl 150 mM, Hepes 10 mM, EDTA 10 mM, pH 7,5 y se filtró el retenido a través de una cápsula de 0,2 |im en una bolsa de almacenamiento de 2 l, para un volumen final de 1,1 l. Después se almacenó el retenido a 2-8°C.
Después se purificó la disolución de proteína concentrada y sometida a intercambio del tampón usando cromatografía en columna a través de una columna Q Sepharose, una columna Phenyl Sepharose, una columna de aminofenilo y una columna de hidroxiapatita. Se evaluaron las unidades de hialuronidasa en la disolución de proteína antes y después de cada etapa de cromatografía y se usaron para determinar el rendimiento de cada etapa.
En resumen, se higienizó una columna Q Sepharose con un lecho de columna de 1,1 l con 2,8 l de NaOH 1,0 N y se almacenó en NaOH 0,1 N antes de su uso. Después se limpió con 2,5 l de Hepes 10 mM, NaCl 400 mM, pH 7,0, se enjuagó en 4,1 l de agua estéril para inyección (SWFI) y se equilibró con 2,5 l de Hepes 10 mM, NaCl 25 mM, pH 7,0. Se cargó la proteína sometida a intercambio del tampón (1 l a 170.160 unidades/ml) en la columna. La fracción no retenida fue 1,0 l a 479 unidades/ml, lo que indica que prácticamente todo el producto se unió a la resina. Se lavó la columna con 4 l de Hepes 10 mM, NaCI 25 mM, pH 7,0, y 4,2 l de Hepes 10 mM, NaCI 50 mM, pH 7,0. Después se eluyó el producto en 3,0 l de Hepes 10 mM, NaCl 400 mM, pH 7,0, produciendo 3 l a 49.940 unidades/ml, y se filtró a través de un filtro de 0,2 |im.
Se higienizó una columna Phenyl Sepharose con un lecho de columna de 2,1 l con 4,8 l de NaOH 1,0 N y se almacenó en NaOH 0,1 N antes de su uso. Después se enjuagó con 5,0 l de SWFI y se limpió con 4,6 l de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M y se enjuagó de nuevo con 6,8 l de SWFI. Después se equilibró la columna en 5,5 l de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M. Al eluato de la columna Q Sepharose, se le añadieron 10,3 ml de fosfato monobásico de potasio 1 M, 10,3 ml de fosfato dibásico de potasio 1 M y 0,42 ml de CaCh 1 mM. Después se cargó esto en la columna y se recogieron la fracción no retenida y el retenido (1 l de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 mM), produciendo 7,4 l a 20.030 unidades/ml. Se filtró el producto a través de un filtro de 0,2 |im.
Se higienizó una columna de boronato de aminofenilo con un lecho de columna de 1,8 l con 4,5 l de NaOH 1,0 N y se almacenó en NaOH 0,1 N antes de su uso. Después se enjuagó con 3,9 l de SWFI, se limpió con 4,2 l de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M y se enjuagó de nuevo con 4,0 l de SWFI. Después se equilibró la columna con 7,5 l de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M. Después se cargó el material de la fracción no retenida de la columna Phenyl Sepharose en la columna de boronato de aminofenilo después de complementarse con sulfato de amonio hasta una concentración final de 0,5 M. Se lavó la columna con 6,5 l de fosfato de potasio 5 mM, pH 7,0, después con 7,8 l de bicina 20 mM, pH 9,0, después con 9,0 l de bicina 20 mM, NaCl 100 mM, pH 9,0. Se eluyó el producto con 4,8 l de Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,0, dando como resultado 4,8 l a 22.940 unidades/ml, y se filtró a través de un filtro de 0,2 |im.
Se higienizó una columna de hidroxiapatita con un lecho de columna de 0,8 l con 2,7 l de NaOH 1,0 N y se almacenó en NaOH 0,1 N antes de su uso. Se neutralizó la columna con 2,1 l de fosfato de potasio 200 mM, pH 7,0, después se equilibró en 2,2 l de fosfato de potasio 5 mM, NaCl 100 mM. Al eluato de la columna de boronato de aminofenilo, se le añadieron 9,1 ml de fosfato monobásico de potasio 1 M, 9,1 ml de fosfato dibásico de potasio 1 M y 0,452 ml de CaCl21 mM. Después se cargó esto en la columna y la fracción no retenido fue de 4,5 l a 10 unidades/ml, lo que indica una buena unión de la HuPH20 soluble. Se lavó la columna con 3,3 l de fosfato de potasio 5 mM, NaCl 100 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0, después con 2,9 l de fosfato de potasio 10 mM, NaCl 100 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0. Se eluyó el producto con 1,0 l de fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0, dando como resultado 1 l a 130.000 unidades/ml, y se filtró a través de un filtro de 0,2 |im.
Se concentró el producto purificado usando un cartucho de 30 kDa de MWCO de Millipore de 2,5 ft2 que se había equilibrado en NaCl 130 mM, Hepes 10 mM, pH 7,0. Se concentró el producto hasta 74 ml y se sometió a intercambio del tampón 10* con el tampón NaCl 130 mM, Hepes 10 mM, pH 7,0, después se filtró a través de un filtro de 0,2 |im. Se realizaron mediciones de A280 e indicaron que la concentración de proteína era de 11,3 mg/ml. Se usaron 9,6 ml adicionales de tampón NaCl 130 mM, Hepes 10 mM, pH 7,0 para llevar la concentración de proteína hasta 10 mg/ml (lote 056-99). Se diluyeron diez ml de la disolución de proteína de 10 mg/ml en el tampón para producir una disolución de 1 mg/ml (lote 056-100). Ambas disoluciones se filtraron a través de un filtro de 0,2 |im.
Se cargó el producto formulado en viales de vidrio de 10 ml y 1 ml, cuyo total combinado produjo 761 mg de rHuPH20 soluble. Se congelaron los viales a -80°C, después se transfirieron hasta -20°C para su almacenamiento. Después se caracterizaron los lotes 056-99 y 056-100 con respecto a la actividad y la pureza. Los lotes 056-99 y 056-100 mostraron una actividad enzimática de 1.350.786 unidades/ml y 129.982 unidades/ml y una actividad específica de 130.00 unidades/mg y 124.00 unidades/mg (calculada a partir de la actividad enzimática y la concentración de proteína). Se determinó la pureza de las muestras de rHuPH20 soluble mediante SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), cromatografía de líquidos de alta presión de fase inversa (RP-HPLC), cromatografía de exclusión molecular (SEC) y cromatografía de intercambio aniónico. Tal como se determina mediante RP-HPLC, se observó que la pureza de los dos lotes era de aproximadamente el 95%. Tal como se determina mediante SEC, se observó que la pureza de los dos lotes era de aproximadamente el 99%. Se mostró que los niveles de endotoxina eran <0,5 UE/ml y 0,1 UE/ml para los lotes 056-99 y 056-100, respectivamente. Se midió que la osmolaridad era de 271 mOsm/kg y 291 mOsm/kg para los lotes 056-99 y 056-100, respectivamente.
B. Modificaciones para aumentar la producción de rHuPH20 soluble: lote 2B2-20K.5 de biorreactor
Se realizaron modificaciones al método descrito anteriormente en la sección A. Estas modificaciones estaban destinadas a aumentar el rendimiento del producto y mejorar la eficiencia y escalabilidad de fabricación. Las etapas de fabricación descritas a continuación incluyen la descongelación de las células congeladas a partir del banco de células de investigación, la expansión de las células en cultivo continuo, la operación de sistema de biorreactor semicontinuo, la recogida y la clarificación del líquido de cultivo celular y la concentración y el intercambio del tampón del producto a granel. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, la adición de insulina humana recombinante al medio del biorreactor para aumentar la tasa de crecimiento y los niveles de expresión de producto de las células. Además, se ha reducido el número de alimentaciones desde 7 hasta 5. También se realizaron otras modificaciones de los métodos descritos anteriormente.
Se descongeló un vial de 2B2 (1 * 107 células) y se cultivó en CD CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con metotrexato 20 |iM y 40 ml/l de GlutaMAX™-I (Invitrogen), después de lo cual se expandió hasta 100 ml, 450 ml y después hasta 4,5 l en medio CD CHO complementado con 40 ml/l de GlutaMAX™-I y sin metotrexato. Se inoculó un biorreactor de 36 l que contenía 20 l de medio CD CHO complementado con 800 l de GlutaMAX™-I, 30 ml de sulfato de gentamicina y 100 mg de insulina humana recombinante con 3,6 l de cultivo de 2B2 a una densidad de siembra inicial de 4,3 * 105 célula/ml. El punto de ajuste de agitación del biorreactor se estableció en 80 RPM; temperatura: 37°C; pH: 7,15; oxígeno disuelto: 25%. El biorreactor recibió una superposición de aire filtrado y un burbujeo de aire/oxígeno/CO2, tal como se controla mediante un controlador Applikon.
Se alimentó el cultivo 5 veces durante toda la ejecución de 13 días en el biorreactor, a las 117, 143, 196, 235 y 283 horas tras la inoculación. Se filtraron los medios de alimentación en el biorreactor mediante una bomba peristáltica. El contenido de cada medio de alimentación y los parámetros de alimentación del biorreactor durante toda la ejecución se proporcionan en las tablas 19 y 20, respectivamente.
Tabla 19. Formulaciones de los medios de alimentación
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Tabla 20. Parámetros del biorreactor
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Se recogió el biorreactor y se filtró a través de un sistema que contenía una serie de filtros Millipore Pod D0HC (0,5 m2) y apilamientos A1HC, que contenían capas de tierra de diatomeas de tamaño de poro graduado, seguido de una filtración final a través de un filtro de cápsula (Sartorius Sartobran 300) en una bolsa de almacenamiento de 50 l. La recogida se realizó usando una bomba peristáltica y se completó en aproximadamente 2 horas, produciendo aproximadamente 30 l de líquido de cultivo celular recogido (HCCF). Se complementaron veintiocho litros de HCCF con EDTA y Tris hasta concentraciones finales de 10 mM cada uno y un pH 7,5. Los 2 l de HCCF restantes se dejaron sin Tris/EDTA, para evaluar el efecto de la adición de Tris/EDTA sobre la etapa de concentración/intercambio del tampón. Después se almacenó el HCCF a 2-8°C antes de concentrarlo y someterlo a intercambio del tampón.
Para concentrar la proteína, en primer lugar se equilibró un casete de malla Pellicon 2 biomax A de Millipore de 0,1 m2 con un MWCO de 3o kDa en Na2SO420 mM, Tris 10 mM, pH 7,5. Se concentraron 2 l de HCCF con y sin Tris/EDTA 10* y se sometieron a intercambio del tampón 10* con el tampón Na2SO420 mM, Tris 10 mM, pH 7,5. Se midieron los niveles de proteína mediante absorbancia a A260. Después se concentró e1HCCF restante (aproximadamente 26,5 l) y se sometió a intercambio del tampón. Se ensamblaron dos casetes de malla Pellicon 2 biomax A de Millipore de 0,1 m2 con un MWCO de 30 kDa en el sistema de TFF y se equilibraron en Na2SO420 mM, Tris 10 mM, pH 7,5. Se concentró el HCCF aproximadamente 10* hasta 2,5 l y se sometió a intercambio del tampón 10* con Na2SO420 mM, Tris 10 mM, pH 7,5. Se filtró el retenido a través de un filtro de vacío de 0,2 |im en bolsas de almacenamiento de 1 l y de 500 ml, para un volumen final de 2,6 l. Después se almacenó el retenido a 2-8°C. Se analizaron las muestras tomadas durante el procedimiento de concentración e intercambio del tampón mediante RP-HPLC para determinar el efecto de la adición de Tris/EDTA a la muestra. Se observó que la adición de Tris/EDTA facilitó una etapa de procesamiento más eficiente.
C. Producción y caracterización de los lotes 056-122 y 056-123 de rHuPH20 soluble (lote 2B2-20K.6 de biorreactor).
Se incorporaron las modificaciones descritas anteriormente en la sección C en las etapas de fabricación para producir y purificar dos lotes de rHuPH20 soluble; lotes 056-122 y 056-123. El procedimiento descrito a continuación incluye la descongelación de células congeladas a partir del banco de células de investigación HZ24-2B2; la expansión de células en cultivo continuo; la operación de sistema de biorreactor semicontinuo de 36 l a escala de 30 l; la retirada de células, la clarificación y el intercambio del tampón del producto a granel; cromatografía en columna de 4 etapas; y las operaciones de formulación, llenado y acabado.
Se descongeló un vial de 2B2 (1 * 107 células) y se cultivó a 37°C, el 7% de CO2 en CD CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con metotrexato 20 |iM y 40 ml/l de GlutaMAX™-I (Invitrogen), después de lo cual se expandió hasta 400 ml, después hasta 4,4 l en medio CD CHO complementado con 40 ml/l de GlutaMAX™-I y sin metotrexato. Se inoculó un biorreactor de 36 l (serie Bellco 1964) que contenía 20 l de medio CD CHO complementado con 800 l de GlutaMAX™-I, 100 mg de insulina humana recombinante y 30 ml de sulfato de gentamicina con el cultivo de 4 l a una densidad de siembra inicial de 4,9 * 105 célula/ml. El punto de ajuste de agitación del biorreactor se estableció en 80 RPM; temperatura: 37°C; pH: 7,15; oxígeno disuelto: 25%. El biorreactor recibió una superposición de aire filtrado y un burbujeo de aire/oxígeno/CO2, tal como se controla mediante un controlador Applikon ADI 1030.
Se alimentó el cultivo 4 veces durante toda la ejecución de 13 días en el biorreactor, a las 127, 163, 208 y horas tras la inoculación. Se filtraron los medios de alimentación en el biorreactor mediante una bomba peristáltica. El punto de ajuste de temperatura del biorreactor se redujo desde 37°C hasta 36,5°C el día 7, hasta 36,0°C el día 9 y finalmente hasta 35,5°C el día 11. El contenido de cada medio de alimentación y los parámetros de alimentación del biorreactor durante toda la ejecución se proporcionan en las tablas 21 y 22, respectivamente.
Tabla 21. Formulaciones de los medios de alimentación
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Tabla 22. Parámetros del biorreactor
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Se recogió el biorreactor y se filtró a través de un sistema que contenía una serie de filtros Millipore Pod D0HC (0,5 m2) y apilamientos A1HC (0,1 m2), que contenían capas de tierra de diatomeas de tamaño de poro graduado, seguido de una filtración final a través de un filtro de cápsula (Sartorius Sartobran 300) en bolsas de almacenamiento de 20 l. La recogida se realizó usando una bomba peristáltica y se completó en aproximadamente 1 hora, produciendo aproximadamente 34 l de líquido de cultivo celular recogido (HCCF). Este incluye los 29 l de volumen de biorreactor más aproximadamente 5 l de retenido en PBS. Se complementó el HCCF con EDTA y Tris hasta concentraciones finales de 10 mM cada uno y un pH final de 7,5. Después se almacenó el HCCF a 2-8°C antes de concentrarlo y someterlo a intercambio del tampón.
Para concentrar la proteína, en primer lugar se equilibró un casete de flujo cruzado Sartocon 2 de Sartorius de 7,0 ft2 con un MWCO de 30 kDa en Na2SO420 mM, Tris 10 mM, pH 7,5. Se concentraron 34 l de HCCF 10* hasta 3 l y se sometieron a intercambio del tampón 10* con el tampón Na2SO420 mM, Tris 10 mM, pH 7,5. Se filtró el retenido a través de un filtro de cápsula de 0,2 |im en una bolsa de almacenamientos de 5 l para un volumen final de 3,0 l. Después se almacenó el retenido a 2-8°C.
Después se purificó la disolución de proteína concentrada y sometida a intercambio del tampón usando cromatografía en columna a través de una columna Q Sepharose, una columna Phenyl Sepharose, una columna de aminofenilo y una columna de hidroxiapatita. Se evaluaron las unidades de hialuronidasa en la disolución de proteína antes y después de cada etapa de cromatografía y se usaron para determinar el rendimiento de cada etapa.
En resumen, se higienizó una columna Q Sepharose con un lecho de columna de 1,1 l, diámetro de 7 cm, altura de 28 cm con 2,1 l de NaOH 1,0 N y se almacenó en NaOH 0,1 N antes de su uso. Después se limpió con 2,5 l de Hepes 10 mM, NaCl 400 mM, pH 7,0, se enjuagó en 4,5 l de agua estéril para inyección (SWFI) y se equilibró con 4,3 l de Hepes 10 mM, NaCl 25 mM, pH 7,0. Se cargó la proteína sometida a intercambio del tampón (3 l a 94.960 unidades de hialuronidasa /ml) en la columna. La fracción no retenida y el primer lavado eran 5830 ml a 75 unidades de hialuronidasa /ml, lo que indica que prácticamente todo el producto (99,8%) se unió a la resina. Se lavó la columna con 4,2 l de Hepes 10 mM, NaCl 25 mM, pH 7,0 y 4,6 l de Hepes 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0. Después se eluyó el producto en 2,9 l de Hepes 10 mM, NaCl 400 mM, pH 7,0, produciendo 2880 ml a 96.080 unidades/ml, y se filtró a través de un filtro de 0,2 |im.
Se higienizó una columna Phenyl Sepharose con un lecho de columna de 2,2 l (altura de 28 cm, diámetro de 10 cm) con 5,0 l de NaOH 1,0 N y se almacenó en NaOH 0,1 N antes de su uso. Después se enjuagó con 4,5 l de SWFI y se limpió con 4,6 l de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M y se enjuagó de nuevo con 6,8 l de SWFI. Después se equilibró la columna en 4,6 l de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 mM. Al eluato de la columna Q Sepharose, se le añadieron 9,6 ml de fosfato monobásico de potasio 1 M, 9,6 ml de fosfato dibásico de potasio 1 M y 0,4 ml de CaCh 1 mM. Después se cargó esto en la columna y se recogieron la fracción no retenida y el retenido (fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 mM), produciendo 6905 ml a 36.280 unidades/ml. Se filtró el producto a través de un filtro de 0,2 |im.
Se higienizó una columna de boronato de aminofenilo con un lecho de columna de 2,2 l (altura de 29 cm, diámetro de 10 cm) con 3,8 l de NaOH 1,0 N y se almacenó en NaOH 0,1 N antes de su uso. Después se enjuagó con 5,0 l de SWFI, se limpió con 5,0 l de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M y se enjuagó de nuevo con 5,0 l de SWFI. Después se equilibró la columna con 5,0 l de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M. Después se cargó el material filtrado de la columna Phenyl Sepharose en la columna de boronato de aminofenilo. Se lavó la columna con 9,9 l de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0, después con 9,7 l de bicina 20 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 9,0, después con 9,9 l de bicina 20 mM, NaCl 100 mM, pH 9,0. Se eluyó el producto con 5,0 l de Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,0, dando como resultado 4460 ml a 48.400 unidades/ml, y se filtró a través de un filtro de 0,2 |im.
Se higienizó una columna de hidroxiapatita con un lecho de columna de 1,1 l (diámetro de 7 cm, altura de 28 cm) con 2,7 l de NaOH 1,0 N y se almacenó en NaOH 0,1 N antes de su uso. Se neutralizó la columna con 2,1 l de fosfato de potasio 200 mM, pH 7,0, después se equilibró en 2,2 l de fosfato de potasio 5 mM, NaCl 100 mM. Al eluato de la columna de boronato de aminofenilo, se le añadieron 11,2 ml de fosfato monobásico de potasio 1 M, 11,2 ml de fosfato dibásico de potasio 1 M y 0,45 ml de CaCh 1 mM. Después se cargó esto en la columna y posteriormente se lavó con 3,5 l de fosfato de potasio 5 mM, NaCl 100 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0, después con 3,5 l de fosfato de potasio 10 mM, NaCl 100 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0. Se eluyó el producto con 1,4 l de fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0, dando como resultado 1260 ml a 152.560 unidades/ml, y se filtró a través de un filtro de 0,2 |im.
Se concentró el producto purificado usando un cartucho de Millipore de 0,05 ft2 de 30 kDa de MWCO que se había equilibrado en NaCl 130 mM, Hepes 10 mM, pH 7,0. Se concentró el producto desde 1250 ml a 1,04/mg/ml hasta 120 ml y se sometió a intercambio del tampón 10* con el tampón NaCl 130 mM, Hepes 10 mM, pH 7,0, después se filtró a través de un filtro de 0,2 |im. Se realizaron mediciones de A280 e indicaron que la concentración de rHuPH20 soluble de los 118 ml restantes era de 11,45 mg/ml. Se añadieron 17 ml adicionales de tampón NaCl 130 mM, Hepes 10 mM, pH 7,0 para llevar la concentración de proteína hasta 10 mg/ml (lote 056-122). Se diluyeron diez ml de la disolución de proteína de 10 mg/ml en el tampón para producir una disolución de 1 mg/ml (lote 056-123). Ambas disoluciones se filtraron a través de un filtro de 0,2 |im.
Se cargó el producto formulado en viales de vidrio de 10 ml y 1 ml, cuyo total combinado produjo 1308 mg de rHuPH20 soluble. Se congelaron los viales a -80°C, después se transfirieron hasta -20°C para su almacenamiento. Después se caracterizaron los lotes 056-122 y 056-123 con respecto a la actividad y la pureza. Los lotes 056-122 y 056-123 mostraron una actividad enzimática de 1.376.992 unidades/ml y 129.412 unidades/ml y una actividad específica de 136.900 unidades/mg y 124.400 unidades/mg (calculada a partir de la actividad enzimática y la concentración de proteína). Se determinó la pureza de las muestras de rHuPH20 soluble mediante SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), cromatografía de líquidos de alta presión de fase inversa (RP-HPLC), cromatografía de exclusión molecular (SEC) y cromatografía de intercambio aniónico. Tal como se determina mediante RP-HPLC, se observó que la pureza de los dos lotes era de aproximadamente el 96,2%. Tal como se determina mediante SEC, se observó que la pureza de los dos lotes era mayor del 99%. Se mostró que los niveles de endotoxina eran <0,8 UE/ml y 0,09 UE/ml para los lotes 056-122 y 056-123, respectivamente. Se midió que la osmolaridad era de 265 mOsm/kg y 256 mOsm/kg para los lotes 056-122 y 056-123, respectivamente. El pH de cada uno era de 7,2.
D. Reproducibilidad del procedimiento de producción de rHuPH20 soluble del Gen2 en un cultivo celular de biorreactor de 30 l
Se usó el procedimiento descrito anteriormente para el lote 2B2-20K.6 para un lote posterior para demostrar la reproducibilidad del procedimiento. Se modificó el procedimiento ligeramente mediante la incorporación de una etapa de inactivación viral inmediatamente antes de las etapas de cromatografía en columna.
Se descongeló un vial de células 2B2 (1 * 107 células) y se cultivó a 37°C, el 7% de CO2 durante 7 pases en CD CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con metotrexato 20 |iM y 40 ml/l de GlutaMAX™-I (Invitrogen), después de lo cual se expandió hasta 400 ml, después hasta 4,4 l en medio CD CHO complementado con 40 ml/l de GlutaMAX™-I y sin metotrexato. Se inoculó un biorreactor de 36 l (serie Bellco 1964) que contenía 20 l de medio CD CHO complementado con 800 ml de GlutaMAX™-I, 100 mg de insulina humana recombinante y 300 mg de sulfato de gentamicina con 3 l de cultivo a una densidad de siembra inicial de 4,7 * 105 célula/ml. El punto de ajuste de agitación del biorreactor se estableció en 80 RPM; temperatura: 37°C; pH: 7,15; oxígeno disuelto: 25%. El biorreactor recibió una superposición de aire filtrado y un burbujeo de aire/oxígeno/CO2, tal como se controla mediante un controlador Applikon ADI 1030.
Se alimentó el cultivo 4 veces durante toda la ejecución de 13 días en el biorreactor, a las 127, 163, 208 y horas tras la inoculación. Se filtraron los medios de alimentación en el biorreactor mediante una bomba peristáltica. El punto de ajuste de temperatura del biorreactor se redujo desde 37°C hasta 36,5°C el día 7, hasta 36,0°C el día 9 y finalmente hasta 35,5°C el día 11. El contenido de cada medio de alimentación y los parámetros de alimentación del biorreactor durante toda la ejecución se proporcionan en las tablas 23 y 24, respectivamente.
Tabla 23. Formulaciones de los medios de alimentación
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Tabla 24. Parámetros del biorreactor
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Se recogió el biorreactor y se filtró a través de un sistema que contenía una serie de filtros Millipore Pod D0HC (0,5 m2) y apilamientos A1HC (0,1 m2), que contenían capas de tierra de diatomeas de tamaño de poro graduado, seguido de una filtración final a través de un filtro de cápsula (Sartorius Sartobran 300) en bolsas de almacenamiento de 20 l. La recogida se realizó usando una bomba peristáltica y se completó en aproximadamente 75 minutos, produciendo aproximadamente 30 l de líquido de cultivo celular recogido (HCCF). Este incluye los 28 l de volumen de biorreactor más aproximadamente 2 l de retenido en PBS. Se complementó el HCCF con EDTA y Tris hasta concentraciones finales de 10 mM cada uno y un pH final de 7,5. Después se almacenó el HCCF a 2-8°C antes de concentrarlo y someterlo a intercambio del tampón.
Para concentrar la proteína, en primer lugar se equilibró un sistema Sartorius Slice con 3* casetes de flujo cruzado Sartocon Slice de 1,0 ft2 (30 kDa de MWCO) en Na2SO420 mM, Tris 10 mM, pH 7,5. Se concentraron treinta litros de HCCF 10* hasta 3 l y se sometieron a intercambio del tampón 10* con el tampón Na2SO420 mM, Tris 10 mM, pH 7,5. La velocidad de flujo promedio durante la concentración fue de 115 ml/minuto y la presión transmembrana promedio fue de 16 psig. La velocidad de flujo promedio durante la diafiltración fue de 150 ml/minuto y la presión transmembrana promedio fue de 15 psig. Se filtró el retenido a través de sistema de filtros de vacío de 0,2 |im en una bolsa de almacenamiento de 5 l para un volumen final de 3,0 L. Después se almacenó el retenido a 2-8°C.
Se realizó la inactivación viral mezclando 235 ml de una disolución filtrada de Triton X-100 al 10% p/p, fosfato de tributilo al 35% p/p en SWFI con 2,15 l de proteína concentrada a temperatura ambiente y sometida a intercambio del tampón en un matraz de centrifugación de vidrio con agitación a 30-40 rpm. Después de 45 minutos, se cargó la disolución de proteína en la columna Q Sepharose (tal como se describe a continuación). La carga duró 24 minutos, lo que dio como resultado un tiempo de exposición total a la disolución de detergente de 69 minutos.
Se higienizó la columna Q Sepharose con un lecho de columna de 1,1 l, diámetro de 7 cm, altura de 28 cm con 2,1 l de NaOH 1,0 N y se almacenó en NaOH 0,1 N antes de su uso. Después se limpió con 2,5 l de Hepes 10 mM, NaCl 400 mM, pH 7,0, se enjuagó en 4,5 l de agua estéril para inyección (SWFI) y se equilibró con 4,5 l de Hepes 10 mM, NaCl 25 mM, pH 7,0. Se cargó la proteína sometida a inactivación viral e intercambio del tampón (2385 ml a 133.040 unidades de hialuronidasa /ml) en la columna. Se lavó la columna con 4,5 l de Hepes 10 mM, NaCl 25 mM, pH 7,0 y 4,5 l de Hepes 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0. Después se eluyó el producto en 2,5 l de Hepes 10 mM, NaCl 400 mM, pH 7,0, produciendo 2500 ml a 133.680 unidades/ml, y se filtró a través de un filtro de 0,2 |im.
Se higienizó una columna Phenyl Sepharose con un lecho de columna de 2,2 l (altura de 28 cm, diámetro de 10 cm) con 5,0 l de NaOH 1,0 N y se almacenó en NaOH 0,1 N antes de su uso. Después se enjuagó con 6,0 l de SWFI y se equilibró en 4,6 l de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 mM. Para eluir la columna, se añadieron 9,6 ml de fosfato monobásico de potasio 1 M, 9,6 ml de fosfato dibásico de potasio 1 M y 0,4 ml de CaCh 1 mM. Después se cargó esto en la columna y se recogieron la fracción no retenida y el retenido (fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 mM), produciendo 6450 ml a 43.840 unidades/ml. Se filtró el producto a través de un filtro de 0,2 |im.
Se higienizó una columna de boronato de aminofenilo con un lecho de columna de 2,2 l (altura de 29 cm, diámetro de 10 cm) con 3,5 l de NaOH 1,0 N y se almacenó en NaOH 0,1 N antes de su uso. Después se enjuagó con 5,0 l de SWFI y se equilibró con 9,0 l de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M. Después se cargó el material de la fracción no retenida de la columna Phenyl Sepharose en la columna de boronato de aminofenilo. Se lavó la columna con 9,9 l de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0, después con 9,9 l de bicina 20 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 9,0. Se eluyó el producto con 4,4 l de Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,0, produciendo 4389 ml a 33.840 unidades/ml, y se filtró a través de un filtro de 0,2 |im.
Se higienizó una columna de hidroxiapatita con un lecho de columna de 1,1 l (diámetro de 7 cm, altura de 28 cm) con 2,1 l de NaOH 1,0 N y se almacenó en NaOH 0,1 N antes de su uso. Se neutralizó la columna con 3,6 l de fosfato de potasio 200 mM, pH 7,0, después se equilibró en 3,2 l de fosfato de potasio 5 mM, NaCl 100 mM. Al eluato de la columna de boronato de aminofenilo, se le añadieron 11 ml de fosfato monobásico de potasio 1 M, 11 ml de fosfato dibásico de potasio 1 M y 0,44 ml de CaCh 1 mM. Después se cargó esto en la columna y posteriormente se lavó con 4,8 l de fosfato de potasio 5 mM, NaCl 100 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0, después con 3,8 l de fosfato de potasio 10 mM, NaCl 100 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0. Se eluyó el producto con 1,5 l de fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0, dando como resultado 1500 ml a 114.320 unidades/ml, y se filtró a través de un filtro de 0,2 |im.
Se concentró el producto purificado usando un cartucho de Millipore de 0,05 ft2 de 30 kDa de MWCO que se había equilibrado en NaCl 130 mM, Hepes 10 mM, pH 7,0. Se concentró el producto desde 1500 ml a 0,961 mg/ml hasta 125 ml y se sometió a intercambio del tampón 10* con el tampón NaCl 130 mM, Hepes 10 mM, pH 7,0, después se filtró a través de un filtro de 0,2 |im. Se realizaron mediciones de A280 e indicaron que la concentración de proteína de los 122 ml restantes era de 11,431 mg/ml. Se añadieron 17,5 ml adicionales de tampón NaCl 130 mM, Hepes 10 mM, pH 7,0 para llevar la concentración de proteína hasta 10 mg/ml (lote 056-135). Se diluyeron diez ml de la disolución de proteína de 10 mg/ml en el tampón para producir una disolución de 1 mg/ml (lote 056-136). Ambas disoluciones se filtraron a través de un filtro de 0,2 |im.
Se cargó el producto formulado en viales de vidrio de 5 ml y 1 ml, cuyo total combinado produjo 1324 mg de rHuPH20 soluble. Se congelaron los viales a -80°C, después se transfirieron hasta -20°C para su almacenamiento. Después se caracterizaron los lotes 056-135 y 056-136 con respecto a la actividad y la pureza. Los lotes 056-135 y 056-136 mostraron una actividad enzimática de 1.301.010 unidades/ml y 127.661 unidades/ml y una actividad específica de 121.600 unidades/mg y 127.700 unidades/mg (calculada a partir de la actividad enzimática y la concentración de proteína). Se determinó la pureza de las muestras de rHuPH20 soluble mediante SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), cromatografía de líquidos de alta presión de fase inversa (RP-HPLC), cromatografía de exclusión molecular (SEC) y cromatografía de intercambio aniónico. Tal como se determina mediante RP-HPLC, se observó que la pureza de los dos lotes estaba entre el 93,5% y el 93,7%. Tal como se determina mediante SEC, se observó que la pureza de los dos lotes era mayor del 99%. Se mostró que los niveles de endotoxina eran <0,84 UE/ml y 0,09 UE/ml para los lotes 056-135 y 056-136, respectivamente. Se midió que la osmolaridad era de 255 mOsm/kg y 260 mOsm/kg para los lotes 056-135 y 056-136, respectivamente. El pH de cada uno era de 7,2.
EJEMPLO 8
A. Producción de rHuPH20 soluble del Gen2 en un cultivo celular de biorreactor de 300 l
Se aumentaron a escala los métodos de producción y purificación detallados en el ejemplo 7 anterior para la producción usando un biorreactor de 400 l. Se descongeló un vial de células 2B2 (1 * 107 células) y se expandió a partir de matraces de agitación a matraces de centrifugación de 36 l en CD CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con metotrexato 20 |iM y GlutaMAX™-I 8 mM (Invitrogen). En resumen, se descongeló un vial de células en un baño de agua a 37°C, se añadieron medios y se centrifugaron las células. Se resuspendieron las células en un matraz de agitación de 125 ml con 20 ml de medios recién preparados y se colocaron en una incubadora a 37°C, el 7% de CO2. Se expandieron las células hasta 40 ml en el matraz de agitación de 125 ml. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/ml, se expandió el cultivo en un matraz de centrifugación de 125 ml en un volumen de cultivo de 100 ml. Se incubó el matraz a 37°C, el 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/ml, se expandió el cultivo en un matraz de centrifugación de 250 ml en un volumen de cultivo de 200 ml y se incubó el matraz a 37°C, el 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/ml, se expandió el cultivo en un matraz de centrifugación de 1 l en un volumen de cultivo de 800 ml y se incubó a 37°C, el 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/ml, se expandió el cultivo en un matraz de centrifugación de 6 l en un volumen de cultivo de 5000 ml y se incubó a 37°C, el 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/ml, se expandió el cultivo en un matraz de centrifugación de 36 l en un volumen de cultivo de 32 l y se incubó a 37°C, el 7% de CO2.
Se esterilizó un reactor de 400 l con vapor a 121°C durante 30 minutos y se añadieron 230 ml de medios CD CHO complementados con GlutaMAX™-I 8 mM y 5 mg/l de rHuInsulina. Antes de su uso, se comprobó el reactor para determinar la contaminación. Se transfirieron aproximadamente 30 l de células desde los matraces de centrifugación de 36 l al biorreactor de 400 l (Braun) a una densidad de inoculación de 4,0 * 105 células viables por ml y un volumen total de 260 l. Los parámetros fueron punto de ajuste de temperatura, 37°C; velocidad del impulsor de 40-55 RPM; presión del recipiente: 3 psi; burbujeo de aire de 0,5-1,5 l/min; superposición de aire: 3 l/min. Se tomaron muestras del reactor diariamente para determinar el recuento celular, la verificación del pH, el análisis de los medios, la producción y la retención de proteína. Además, se añadieron alimentaciones de nutrientes durante la ejecución. A las 120 h (día 5), se añadieron 10,4 l de medio #1 de alimentación (4* CD CHO 33 g/l de glucosa 160 ml/l de GlutaMAX™-I 16,6 g/l de Yeastolate 33 mg/l de rHuInsulina). A las 168 horas (día 7), se añadieron 10,8 l de alimentación #2 (2* CD CHO 33 g/l de glucosa 80 ml/l de GlutaMAX™-I 33,4 g/l de Yeastolate 0,92 g/l de butirato de sodio) y se cambió la temperatura de cultivo a 36,5°C. A las 216 horas (día 9), se añadieron 10,8 l de alimentación #3 (1* CD CHO 50 g/l de glucosa 50 ml/l de GlutaMAX™-I 50 g/l de Yeastolate 1,80 g/l de butirato de sodio) y se cambió la temperatura de cultivo a 36°C. A las 264 horas (día 11), se añadieron 10,8 l de alimentación #4 (1* c D CHO 33 g/l de glucosa 33 ml/l de GlutaMAX™-I 50 g/l de Yeastolate 0,92 g/l de butirato de sodio) y se cambió la temperatura de cultivo a 35,5°C. Se observó que la adición de los medios de alimentación potenciaba drásticamente la producción de rHuPH20 soluble en las etapas finales de producción. Se recogió el reactor a los 14 días o cuando la viabilidad de las células se encontraba por debajo del 40%. El procedimiento dio como resultado una productividad final de 17.000 Unidades por ml con una densidad celular máxima de 12 millones de células/ml. En la recogida, se tomaron muestras del cultivo para determinar micoplasma, carga biológica, endotoxina y virus in vitro e in vivo, TEM para las partículas virales y actividad enzimática.
Se bombeó el cultivo mediante una bomba peristáltica a través de cuatro módulos de sistema de filtración Millistak (Millipore) en paralelo, conteniendo cada uno una capa de tierra de diatomeas graduada a 4-8 |im y una capa de tierra de diatomeas graduada a 1,4-1,1 |im, seguido de una membrana de celulosa, después a través de un segundo y único sistema de filtración Millistak (Millipore) que contenía una capa de tierra de diatomeas graduada a 0,4-0,11 |im y una capa de tierra de diatomeas graduada a <0,1 |im, seguido de una membrana de celulosa, y después a través de un filtro final de 0,22 |im en una bolsa flexible estéril de un solo uso con una capacidad de 350 l. Se complementó el líquido de cultivo celular recogido con EDTA 10 mM y Tris 10 mM a un pH de 7,5. Se concentró el cultivo 10* con un aparato de filtración de flujo tangencial (TFF) modelo usando cuatro filtros de poliéter sulfona (PES) de corte de peso molecular (MWCO) de 30 kDa para TFF Sartoslice (Sartorius), seguido de intercambio del tampón 10* con Tris 10 mM, Na2SO420 mM, pH 7,5 en un filtro final de 0,22 |im en una bolsa de almacenamiento de 50 l estéril.
Se somete a inactivación viral la recogida sometida a diafiltración concentrada. Antes de la inactivación viral, se preparó una disolución de Triton X-100 al 10%, fosfato de tri(n-butilo) (TNBP) al 3%. Se expuso la recogida sometida a diafiltración concentrada a Triton X-100 al 1%, TNBP al 0,3% durante 1 hora en un recipiente de reacción de vidrio de 36 l inmediatamente antes de la purificación en la columna Q.
B. Purificación de sHuPH20 del Gen2
Se preparó una columna de intercambio iónico Q Sepharose (Pharmacia) (9 l de resina, H = 29 cm, D = 20 cm). Se recogieron muestras de lavado para la determinación del pH, la conductividad y endotoxina (ensayo de LAL). Se equilibró la columna con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2SO420 mM, pH 7,5. Tras la inactivación viral, se cargó la recogida sometida a diafiltración concentrada en la columna Q a una velocidad de flujo de 100 cm/h. Se lavó la columna con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2SO420 mM, pH 7,5 y Hepes 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0. Se eluyó la proteína con Hepes 10 mM, NaCl 400 mM, pH 7,0 en un filtro final de 0,22 |im en una bolsa estéril. Se sometió a prueba la muestra de eluato para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad enzimática. Se tomaron lecturas de absorbancia A280 al principio y al final del intercambio.
A continuación se realizó una cromatografía de interacción hidrófoba en Phenyl Sepharose (Pharmacia). Se preparó una columna Phenyl Sepharose (PS) (19-21 l de resina, H = 29 cm, D = 30 cm). Se recogió el lavado y se tomaron muestras para determinar el pH, la conductividad y endotoxina (ensayo de LAL). Se equilibró la columna con 5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, CaCh 0,1 mM, pH 7,0. Se complementó el eluato de proteína anterior con disoluciones madre de sulfato de amonio 2 M, fosfato de potasio 1 M y CaCh 1 M para producir concentraciones finales de 5 mM, 0,5 M y 0,1 mM, respectivamente. Se cargó la proteína en la columna PS a una velocidad de flujo de 100 cm/h. Se añadieron fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M y CaCh 0,1 mM, pH 7,0 a 100 cm/h. Se hizo pasar la fracción no retenida a través de un filtro final de 0,22 |im en una bolsa estéril. Se tomaron muestras de la fracción no retenida para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad enzimática.
Se preparó una columna de boronato de aminofenilo (ProMedics; 21 l de resina, H = 29 cm, D = 30 cm). Se recogió el lavado y se tomaron muestras para determinar el pH, la conductividad y endotoxina (ensayo de LAL). Se equilibró la columna con 5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M. Se cargó la proteína purificada en PS en la columna de boronato de aminofenilo a una velocidad de flujo de 100 cm/h. Se lavó la columna con fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0. Se lavó la columna con bicina 20 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 9,0. Se lavó la columna con bicina 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 9,0. Se eluyó la proteína con Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,9 y se hizo pasar a través de un filtro estéril en una bolsa estéril. Se sometió a prueba la muestra eluida para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad enzimática.
Se preparó la columna de hidroxiapatita (HAP) (BioRad; 13 l de resina, H =20 cm, D = 30 cm). Se recogió el lavado y se sometió a prueba para determinar el pH, la conductividad y endotoxina (ensayo de LAL). Se equilibró la columna con fosfato de potasio 5 mM, NaCl 100 mM, CaCh 0,1 mM, pH 7,0. Se complementó la proteína purificada en boronato de aminofenilo hasta concentraciones finales de fosfato de potasio 5 mM y CaCh 0,1 mM y se cargó en la columna de HAP a una velocidad de flujo de 100 cm/h. Se lavó la columna con fosfato de potasio 5 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCl20,1 mM. A continuación se lavó la columna con fosfato de potasio 10 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCh 0,1 mM. Se eluyó la proteína con fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0 y se hizo pasar a través de un filtro estéril de 0,22 |im en una bolsa estéril. Se sometió a prueba la muestra eluida para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad enzimática.
Después se hizo pasar la proteína purificada en HAP a través de un filtro de eliminación de virus. En primer lugar se preparó el filtro Virosart esterilizado (Sartorius) lavando con 2 l de fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0. Antes de su uso, se tomaron muestras del tampón filtrado para determinar el pH y la conductividad. Se bombeó la proteína purificada en HAP mediante una bomba peristáltica a través del filtro de eliminación de virus de 20 nM. Se hizo pasar la proteína filtrada en fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0 a través de un filtro final de 0,22 |im en una bolsa estéril. Se sometió a prueba la muestra filtrada de virus para determinar la concentración de proteína, la actividad enzimática, el perfil de oligosacáridos, monosacáridos y ácido siálico (tal como se describe en los ejemplos 9 a 10 a continuación).
Después se concentró la proteína en el filtrado hasta 10 mg/ml usando un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) Sartocon Slice de corte de peso molecular (MWCO) de 10 kD (Sartorius). En primer lugar se preparó el filtro lavando con histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,0 y se tomaron muestras del permeado para determinar el pH y la conductividad. Tras la concentración, se tomaron muestras de la proteína concentrada y se sometieron a prueba para determinar la concentración de proteína y la actividad enzimática. Se realizó un intercambio del tampón 6* en la proteína concentrada en el tampón final: histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,0. Tras el intercambio del tampón, se hizo pasar la proteína concentrada a través de un filtro de 0,22 |im en una bolsa de almacenamiento estéril de 20 l. Se tomaron muestras de la proteína y se sometieron a prueba para determinar la concentración de proteína, la actividad enzimática, los grupos sulfhidrilo libres, el perfil de oligosacáridos y la osmolaridad (tal como se describe en los ejemplos 9 a 10 a continuación).
Después se dispensó de manera aséptica la proteína a granel filtrada estéril a 20 ml en viales de Teflon estériles de 30 ml (Nalgene). Después se ultracongelaron los viales y se almacenaron a -20 ± 5°C. La producción y purificación de rHuPH20 soluble usando este método produjeron aproximadamente 11 y 15 gramos, con una actividad específica de 95.000 unidades/mg a 120.000 unidades/mg.
C. Comparación de la producción y purificación de sHuPH20 del Gen1 y Gen2
Se compararon la producción y purificación de rHuPH20 soluble del Gen2 en un cultivo celular de biorreactor de 300 l, que contenía algunos cambios en los protocolos, con la producción y purificación de rHuPH20 soluble del Geni en un cultivo celular de biorreactor de 100 l (descrito en el ejemplo 4). La tabla 25 expone diferencias a modo de ejemplo, además de cambios a escala sencillos, entre los métodos.
Tabla 25. Diferencias a modo de ejemplo entre la producción y purificación de rHuPH20 soluble del Geni y Gen2 usando los métodos de cultivo celular de los biorreactores de 100 l y 300 l
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EJEMPLO 9
Determinación de la actividad enzimática de rHuPH20 soluble Se determinó la actividad enzimática de rHuPH20 soluble en muestras tales como cultivos celulares, fracciones de purificación y disoluciones purificadas usando un ensayo turbidimétrico, que se basa en la formación de un precipitado insoluble cuando el ácido hialurónico se une con albúmina sérica. La actividad se mide incubando rHuPH20 soluble con hialuronato de sodio (ácido hialurónico) durante un periodo de tiempo establecido (10 minutos) y después precipitando el hialuronato de sodio sin digerir con la adición de albúmina sérica acidificada. La turbidez de la muestra resultante se mide a 640 nm después de un periodo de desarrollo de 30 minutos. La disminución de la turbidez resultante de la actividad enzimática en el sustrato de hialuronato de sodio es una medida de la actividad enzimática de rHuPH20 soluble. El método se ejecuta usando una curva de calibración generada con diluciones de un patrón de referencia de trabajo de ensayo de rHuPH20 soluble, y las mediciones de actividad de la muestra se realizan en relación con esta curva de calibración.
Se prepararon diluciones de la muestra en disoluciones de diluyente de enzimas. La disolución de diluyente de enzimas se preparó disolviendo 33,0 ± 0,05 mg de gelatina hidrolizada en 25,0 ml del tampón de reacción PIPES 50 mM (NaCl 140 mM, PIPES 50 mM, pH 5,5) y 25,0 ml de SWFI y diluyendo 0,2 ml de disolución de Buminate al 25% en la mezcla y agitando en vórtex durante 30 segundos. Esto se realizó en el plazo de 2 horas de uso y se almacenó en hielo hasta que se necesitó. Se diluyeron las muestras hasta aproximadamente 1-2 U/ml. En general, la dilución máxima por etapa no superó 1:100 y el tamaño de muestra inicial para la primera dilución no fue menor de 20 |il. Los volúmenes mínimos de muestra necesarios para realizaron el ensayo fueron: muestras en el procedimiento, fracciones de FPLC: 80 |il; sobrenadantes de cultivo tisular:1 ml; material concentrado: 80 |il; material purificado o de etapa final: 80 |il. Las diluciones se realizaron por triplicado en una placa de 96 pocillos de baja unión de proteínas, y se transfirieron 30 |il de cada dilución a placas de fondo negro/transparente Optilux (BD BioSciences).
Se prepararon diluciones de rHuPH20 soluble conocida con una concentración de 2,5 U/ml en disolución de diluyente de enzimas para generar una curva de calibración y se añadieron a la placa Optilux por triplicado. Las diluciones incluían 0 U/ml, 0,25 U/ml, 0,5 U/ml, 1,0 U/ml, 1,5 U/ml, 2,0 U/ml y 2,5 U/ml. Se incluyeron pocillos de “blanco de reactivo” que contenían 60 |il de disolución de diluyente de enzimas en la placa como control negativo. Después se cubrió la placa y se calentó en un bloque térmico durante 5 minutos a 37°C. Se retiró la cubierta y se agitó la placa durante 10 segundos. Después de la agitación, se devolvió la placa al bloque térmico y se sensibilizó el dispositivo de manipulación de líquidos MULTIDROP 384 con la disolución caliente de hialuronato de sodio 0,25 mg/ml (preparada disolviendo 100 mg de hialuronato de sodio (LifeCore Biomedical) en 20,0 ml de SWFI. Esta se mezcló mediante rotación y/o movimiento suave a 2-8°C durante 2-4 horas, o hasta que se disolvió por completo). Se transfirió la placa de reacción al dispositivo MULTIDROP 384 y se inició la reacción presionando la tecla de inicio para dispensar 30 |il de hialuronato de sodio en cada pocillo. Después se retiró la placa del dispositivo MULTIDROP 384 y se agitó durante 10 segundos antes de transferirla a un bloque térmico con la cubierta de la placa reemplazada. Se incubó la placa a 37°C durante 10 minutos
Se preparó el dispositivo MULTIDROP 384 para detener la reacción sensibilizando a la máquina con disolución de trabajo de suero y cambiando el ajuste de volumen a 240 |il. (25 ml de disolución madre de suero [se diluyó 1 volumen de suero de caballo (Sigma) con 9 volúmenes de disolución de tampón acetato 500 mM y se ajustó el pH a 3,1 con ácido clorhídrico] en 75 ml de disolución de tampón acetato 500 mM). Se retiró la placa del bloque térmico y se colocó en el dispositivo MULTIDROP 384 y se dispensaron 240 |il de disoluciones de trabajo de suero en los pocillos. Se retiró la placa y se agitó en un lector de placas durante 10 segundos. Después de 15 minutos adicionales, se midió la turbidez de las muestras a 640 nm y se determinó la actividad enzimática (en U/ml) de cada muestra mediante el ajuste con la curva de calibración.
Se calculó la actividad específica (Unidades/mg) dividiendo la actividad enzimática (U/ml) entre la concentración de proteína (mg/ml).
EJEMPLO 10
Determinación del contenido de ácido siálico y monosacáridos
El contenido de ácido siálico y monosacáridos de rHuPH20 soluble puede evaluarse mediante cromatografía de líquidos de fase inversa (RPLC) tras la hidrólisis con ácido trifluoroacético. En un ejemplo, se determinó el contenido de ácido siálico y monosacáridos del lote #HUB0701E de hialuronidasa purificada (1,2 mg/ml; producida y purificada esencialmente tal como se describió en el ejemplo 8). En resumen, se hidrolizaron 100 |ig de muestra con ácido trifluoroacético al 40% (v/v) a 100°C durante 4 horas por duplicado. Tras la hidrólisis, se secaron las muestras y se resuspendieron en 300 |il de agua. Se transfirió una alícuota de 45 |il de cada muestra resuspendida a un tubo nuevo y se secó, y se añadieron 10 |il de una disolución de acetato de sodio 10 mg/ml a cada uno. Se marcaron de manera fluorescente los monosacáridos liberados mediante la adición de 50 |il de una disolución que contenía ácido 2-aminobenzoico 30 mg/ml, cianoborohidruro de sodio 20 mg/ml, acetato de sodio aproximadamente 40 mg/ml y ácido bórico 20 mg/ml en metanol. Se incubó la mezcla durante 30 minutos a 80°C en la oscuridad. Se extinguió la reacción de derivatización mediante la adición de 440 |il de fase móvil A (n-butilamina al 0,2% (v/v), ácido fosfórico al 0,5% (v/v), tetrahidrofurano al 1% (v/v)). También se hidrolizó y derivatizó un blanco de matriz de agua tal como se describe para la muestra de hialuronidasa como control negativo. Se separaron los monosacáridos liberados mediante RPLC usando una columna de fase inversa de octadecilo (C18) (4,6 x 250 mm, tamaño de partícula de 5 |im; J.T. Baker) y se monitorizaron mediante detección por fluorescencia (360 nm de excitación, 425 nm de emisión). Se realizó la cuantificación del contenido de monosacáridos comparando los cromatogramas de la muestra de hialuronidasa con los cromatogramas de los patrones de monosacáridos incluyendo W-D-glucosamina (GlcN), W-D-galactosamina (GaIN), galactosa, fucosa y manosa. La tabla 26 presenta la razón molar de cada monosacárido por molécula de hialuronidasa.
Tabla 26. Contenido de monosacáridos de rHuPH20 soluble
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* Los resultados de GalN estaban por debajo de límite de detección
EJEMPLO 11
Heterogeneidad C-terminal de rHuPH20 soluble a partir de células 3D35M y 2B2
Se realizó la secuenciación C-terminal en dos lotes de sHuPH20 producida y purificada a partir de células 3D35M en un volumen de biorreactor de 100 l (lote HUA0505MA) y células 2B2 en un volumen de biorreactor de 300 l (lote HUB0701EB). Se digirieron por separado los lotes con endoproteinasa Asp-N, que escinde específicamente los enlaces peptídicos N-terminales a ácido aspártico y cisteico. Esto libera la porción C-terminal de la rHuPH20 soluble en el ácido aspártico en la posición 431 de SEQ ID NO:4. Se separaron y caracterizaron los fragmentos C-terminales para determinar la secuencia y abundancia de cada población en el lote HUA0505MA y el lote HUB0701EB.
Se observó que las preparaciones de rHuPH20 soluble a partir de células 3D35M y células 2B2 presentaban heterogeneidad y contenían polipéptidos que diferían entre sí en su secuencia C-terminal (tablas 27 y 28). Esta heterogeneidad es probablemente el resultado de la escisión C-terminal del polipéptido de 447 aminoácidos expresado (SEQ ID NO:4) mediante las peptidasas presentes en el medio de cultivo celular u otras disoluciones durante el procedimiento de producción y purificación. Los polipéptidos en las preparaciones de rHuPH20 soluble tienen las secuencias de aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 1-447, 1-446, 1-445, 1-444 y 1-443 de la secuencia de rHuPH20 soluble expuesta SEQ ID NO:4. La secuencia de aminoácidos completa de cada uno de estos polipéptidos se expone en las SEQ ID NO:4 a 8, respectivamente. Tal como se indica en las tablas 27 y 28, la abundancia de cada polipéptido difiere en las preparaciones de rHuPH20 soluble a partir células 3D35M y células 2B2.
Tabla 27. Análisis de los fragmentos C-terminales del lote HUA0505MA
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Tabla 28. Análisis de los fragmentos C-terminales del lote HUB0701EB
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EJEMPLO 12
Producción y purificación de rHuPH20 soluble en cultivo celular de biorreactor de 2500 l
La producción y purificación de rHuPH20 soluble puede aumentarse a escala desde un procedimiento de biorreactor semicontinuo de 300 l (descrito en el ejemplo 8) hasta un procedimiento de biorreactor semicontinuo de 2500 l. Al igual que la producción de rHuPH20 en un cultivo celular de biorreactor de 300 l, la producción de rHuPH20 en un cultivo celular de biorreactor de 2500 l se realiza, en primer lugar, descongelando y expandiendo un vial de células 2B2, cultivando en un biorreactor, recogiendo y clarificando el cultivo, concentrando y sometiendo a intercambio del tampón la recogida, seguido de inactivación viral. Después se purifica la rHuPH20 a partir del concentrado usando una serie de etapas de purificación que utilizan Q Sepharose, Phenyl Sepharose, boronato de aminofenilo y boronato de hidroxiapatita, seguido de filtración viral.
1. Expansión del cultivo celular
Para generar mayores números de células requeridos para la siembra del cultivo celular de biorreactor de 2500 l en comparación con el cultivo de 300 l, se expande en serie el cultivo celular a través de un matraz de agitación de 125 ml, un matraz de agitación de 250 ml, un matraz de agitación de 1 l, dos matraces de agitación de 2 l, seis matraces de agitación de 2 l, un dispositivo WAVE Biorreactor™ de 25 l (GE Healthcare Life Sciences), un dispositivo WAVE Biorreactor™ de 100 l y un biorreactor de siembra de tanque agitado de 600 l (ABEC, Inc. Betlehem, PA; Stainless Technology division). En cada expansión, la densidad de siembra objetivo es de 4 x 105 células/ml. La temperatura durante toda la expansión es de 37°C (o entre 36°C y 38°C) con el 7% de CO2 (o entre el 6-8% de CO2). Se agitan los matraces a aproximadamente 110 RPM (o 90-130 RPM), se mueven los dispositivos WAVE Biorreactor™ de 25 l y 100 l a 20 RPM (o 15-25 ó 18-22 RPM, respectivamente) y se agita el biorreactor de siembra de 600 l a 90 RPM (u 85-95 RPM).
En primer lugar, se descongela un vial de células 2B2 (1 * 107 células) a partir del banco de células de trabajo en un baño de agua a 37°C durante aproximadamente 2 minutos (preferiblemente no más de 5 minutos) antes de añadir los medios y se centrifugan las células. Se resuspenden las células hasta aproximadamente 25 ml (o entre 20-30 ml) con medios recién preparados (CD CHO AGT™ con 40 ml/l de GlutaMAX™-I (8 mM) y metotrexato 20 |iM) en un matraz de agitación de 125 ml y se colocan en una incubadora a 37°C, el 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanza aproximadamente 8 x 105 células/ml, se transfiere el cultivo a un matraz de agitación de 250 ml en un volumen de cultivo de 50 ml (o 45-55 ml). Tras la incubación, cuando la densidad celular alcanza aproximadamente 1,6 x 106 células/ml, se expande el cultivo en un matraz de 1 l en un volumen de cultivo de 200 ml (o 190-210 ml) y se incuba. Cuando la densidad celular en el matraz de 1 l alcanza aproximadamente 1,6 x 106 células/ml, se expande el cultivo en 2 matraces de 2 l, cada uno con un volumen de cultivo total de aproximadamente 400 ml (o entre 350-450 ml por matraz) y se incuba. Cuando la densidad celular en los matraces de 2 l alcanza aproximadamente 1,2 x 106 células/ml, se expande el cultivo en 6 matraces de 2 l, cada uno con un volumen de cultivo total de aproximadamente 400 ml (o entre 350-450 ml por matraz) y se incuba. Cuando la densidad celular en los matraces de 2 l alcanza aproximadamente 2,5 x 106 células/ml, se expande el cultivo en un dispositivo WAVE Biorreactor™ de 25 l, con un volumen de cultivo total de aproximadamente 15 l (o entre 14-16 l) y se incuba con un flujo de aire de 1,5 l/minuto.
Cuando la densidad celular en el dispositivo WAVE Biorreactor™ de 25 l alcanza aproximadamente 2,2 x 106 células/ml, se expande el cultivo en un dispositivo WAVE Biorreactor™ de 100 l, con un volumen de cultivo total de aproximadamente 80 l (o entre 75-85 l), usando medios CD-CHO AGT™ que se complementan con 3,6 g/l de metotrexato, 40 ml/l de GlutaMAX™-I y 1 ml/l de NaOH 1 N, y se incuba con un flujo de aire de 1,5 l/minuto. Cuando la densidad celular en el dispositivo WAVE Biorreactor™ de 100 l alcanza aproximadamente 2,6 x 106 células/ml, se expande el cultivo en un biorreactor de siembra de 600 l (ABEC, Inc. Betlehem, PA; Stainless Technology division) con un volumen de cultivo total de aproximadamente 480 l (o entre 440-520 l) usando medios CD-CHO AGT™ que se complementan con 40 ml/l de GlutaMAX™-I, y se incuba hasta que la densidad celular en el biorreactor de 600 l alcanza aproximadamente 1,6 x 106 células/ml.
2. Producción de rHuPH20
Se usa un biorreactor de 3500 l con un volumen total de 3523 l y un volumen de trabajo de 500-2500 l (ABEC, Inc., Betlehem, PA) para la producción de alto rendimiento de rHuPH20. Tras la esterilización, se añaden al biorreactor aproximadamente 1800-2000 l de medios CD-CHO AGT™ que contienen 24,3 g/l de polvo de CD-CHO AGT™, complementado con 40 ml/l de GlutaMAX™-I y 5 mg/l de rHuInsulina. Parámetros se establecen en: punto de ajuste de temperatura, 37°C; velocidad del impulsor: 75 RPM; presión del recipiente: 5 psi; burbujeo de aire: l8 l/min; oxígeno disuelto: 25%; pH <7,2. Antes de su uso, se comprueba el reactor para determinar la contaminación. Se inoculan aproximadamente entre 300-500 l de células (dependiendo del recuento celular) del cultivo de biorreactor de siembra de 600 l en el medio de cultivo celular en el biorreactor de 3500 l a una densidad de inoculación de 4,0 * 105 células viables por ml, para alcanzar un volumen total de 2100 l. Durante la incubación celular de 14 días, se toman muestras del biorreactor diariamente para determinar la viabilidad celular, la densidad celular, la verificación del pH y la actividad enzimática. También se monitorizan la temperatura y el oxígeno disuelto minuciosamente.
Se añaden alimentaciones de nutrientes durante la ejecución de 14 días en el biorreactor, cada una a aproximadamente el 4% v/v. El día 5, se añaden aproximadamente 84 l (o el 4% v/v) de medio #1 de alimentación (81 g/l de polvo de CD-CHO AGT™ 33 g/l de glucosa 13,3 ml/l de GlutaMAX™-I 83,3 g/l de Yeastolate 33 mg/l de rHuInsulina). El día 7, se añaden aproximadamente 87 l (o el 4% v/v) de alimentación #2 (40,5 g/l de polvo de CD-CHO AGT™ 33 g/l de glucosa 66,7 ml/l de GlutaMAX™-I 166,7 g/l de Yeastolate 0,92 g/l de butirato de sodio) y se cambió la temperatura de cultivo a 36,5°C. El día 9, se añaden aproximadamente 91 l (o el 4% v/v) de alimentación #3 (20,3 g/l de polvo de CD-CHO AGT™ 50 g/l de glucosa 50 ml/l de GlutaMAX™-I 250 g/l de Yeastolate 1,8 g/l de butirato de sodio) y se cambia la temperatura de cultivo a 36°C. El día 11, se añaden aproximadamente 94 l (o el 4% v/v) de alimentación #4 (20,3 g/l de polvo de CD-CHO AGT™ 33,3 g/l de glucosa 33,3 ml/l de GlutaMAX™-I 250 g/l de Yeastolate 0,92 g/l de butirato de sodio) y se cambia la temperatura de cultivo a 35,5°C. Se recoge el reactor a los 14 días, produciendo una recogida de 2400-2600 l (normalmente de aproximadamente 2500 l).
Se transfiere a presión el cultivo a través de un sistema de 20 módulos de filtración Millistak (Millipore) en paralelo, conteniendo cada uno una capa de tierra de diatomeas graduada a 4-8 |im y una capa de tierra de diatomeas graduada a 1,4-1,1 |im, seguido de una membrana de celulosa, después a través de un segundo sistema de filtración Millistak (Millipore) que contiene 10 módulos, cada uno con una capa de tierra de diatomeas graduada a 0,4-0,11 |im y una capa de tierra de diatomeas graduada a <0,1 |im, seguido de una membrana de celulosa, y después a través de un filtro final de 0,22 |im en una bolsa flexible estéril de un solo uso con una capacidad de 350 l. Se complementa el líquido de cultivo celular recogido con EDTA 10 mM y Tris 10 mM, pH 8,4, hasta un pH objetivo de 7,5. Se concentra el cultivo 10* con un aparato de filtración de flujo tangencial (TFF) (Pall) usando filtros de poliéter sulfona (PES) de corte de peso molecular (MWCO) de 30 kDa para TFF Sartoslice de 18-21 m2 (Sartorius), seguido de intercambio del tampón 10* con Tris 10 mM, Na2SO420 mM, pH 7,5 en un filtro final de 0,22 |im en una bolsa de almacenamiento estéril de 350 l.
Se somete a inactivación viral la recogida sometida a diafiltración concentrada. Antes de la inactivación viral, se preparó una disolución de Triton X-100 al 10%, fosfato de tri(n-butilo) (TNBP) al 3%. Se expuso la recogida sometida a diafiltración concentrada a Triton X-100 al 1%, TNBP al 0,3% hasta 2 horas en recipientes de reacción de acero inoxidable de 500 l inmediatamente antes de la purificación en la columna Q.
B. Purificación de rHuPH20 del Gen2
Se prepara una columna de intercambio iónico Q Sepharose (Pharmacia) (81 l de resina, H = 26 cm, D = 63 cm). Se equilibra la columna con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2SO420 mM, pH 7,5. Tras la inactivación viral, se carga la recogida sometida a inactivación vital, sometida a diafiltración, concentrada de aproximadamente 250 l en la columna Q a una velocidad de flujo de 150 cm/h. Se lava la columna con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2SO420 mM, pH 7,5 y Hepes 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0. Se eluye la proteína con Hepes 10 mM, NaCl 400 mM, pH 7,0 en un filtro final de 0,22 |im en una bolsa estéril. Se somete a prueba la muestra de eluato para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad enzimática. Se tomaron lecturas de absorbancia A280 al principio y al final del intercambio.
A continuación se realiza una cromatografía de interacción hidrófoba en Phenyl Sepharose (Pharmacia). Se prepara una columna Phenyl Sepharose (PS) (176 l de resina, H = 35 cm, D = 80 cm). Se equilibra la columna con 5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, CaCh 0,1 mM, pH 7,0. Se complementa el eluato de proteína anterior con disoluciones madre de sulfato de amonio 2 M, fosfato de potasio 1 M y CaCh 1 M para producir concentraciones finales de 5 mM, 0,5 M y 0,1 mM, respectivamente. Se carga la proteína en la columna PS a una velocidad de flujo de 100 cm/h. Se añadió fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M y CaCh 0,1 mM, pH 7,0 a 100 cm/h. Se hace pasar la fracción no retenida a través de un filtro final de 0,22 |im en una bolsa estéril. Se toman muestras de la fracción no retenida para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad enzimática.
Después se prepara una columna de boronato de aminofenilo (ProMedics; 176 l de resina, H = 35 cm, D = 80 cm). Se equilibra la columna con 5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M. Se carga la proteína purificada en PS en la columna de boronato de aminofenilo a una velocidad de flujo de 50 cm/h. Se aumentó la velocidad de flujo hasta 100 cm/h para la parte restante del procedimiento. En primer lugar se lavó la columna con fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0, después con bicina 20 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 9,0 y después con bicina 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 9,0. Se eluye la proteína con Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,9 y se hace pasar a través de un filtro estéril en una bolsa estéril. Se somete a prueba la muestra eluida para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad enzimática.
Se prepara la columna de hidroxiapatita (HAP) (BioRad; 116 l de resina, H = 23 cm, D = 80 cm). Se equilibra la columna con fosfato de potasio 5 mM, NaCl 100 mM, CaCh 0,1 mM, pH 7,0. Se complementa la proteína purificada en boronato de aminofenilo hasta concentraciones finales de fosfato de potasio 5 mM y CaCh 0,1 mM y se carga en la columna de HAP a una velocidad de flujo de 100 cm/h. En primer lugar se lava la columna con fosfato de potasio 5 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCh 0,1 mM, después con fosfato de potasio 10 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCh 0,1 mM. Se eluye la proteína con fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0 y se hace pasar a través de un filtro estéril de 0,22 |im en una bolsa estéril. Se somete a prueba la muestra eluida para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad enzimática.
Después se hace pasar la proteína purificada en HAP a través de un filtro de eliminación de virus. En primer lugar se prepara el filtro Viosart esterilizado (Sartorius) lavando con 2 l de fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0. Se bombea la proteína purificada en HAP mediante una bomba peristáltica a través del filtro de eliminación de virus de 20 nM. Después se hace pasar la proteína filtrada en fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0 a través de un filtro final de 0,22 |im en una bolsa estéril. Se somete a prueba la muestra sometida a filtración viral para determinar la concentración de proteína, la actividad enzimática, el perfil de oligosacáridos, monosacáridos y ácido siálico (tal como se describe en los ejemplos 9 a 10 a continuación).
Después se concentró la proteína en el filtrado 8-12* usando tres casetes de PES Sartocon de corte de peso molecular (MWCO) de 10 kD, cada uno con un área de superficie de filtro de 0,7 m2, para un área de superficie total de 2,1 m2. Tras la concentración, se tomaron muestras de la proteína concentrada y se sometieron a prueba para determinar la concentración de proteína y la actividad enzimática. Después se realizó una diafiltración 10* en la proteína concentrada. Esto puede realizarse de dos maneras: 1) usando un tampón histidina 20 mM, NaCl 130 mM, pH 6,5 y polisorbato 80 al 1%; o 2) usando un tampón histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,5. La proteína a granel sometida a diafiltración concentrada tiene una concentración de aproximadamente 10 mg/ml. Tras el intercambio del tampón, se hace pasar la proteína concentrada a través de un filtro de 0,22 |im en una bolsa de almacenamiento estéril de 20 l.
Después se dispensa de manera aséptica la proteína a granel filtrada estéril a 400 ml en frascos de PFA estériles de 1 l Nalgene. Después se ultracongelan los frascos en un baño de nitrógeno líquido y se almacenan a menos de -20°C para la proteína a granel que no contiene el polisorbato 80 y a menos de -70°C para la proteína a granel que contiene el polisorbato 80.
La tabla 29 expone algunas diferencias a modo de ejemplo entre la producción de rHuPH20 en un cultivo de biorreactor de 300 l y 2500 l.
Tabla 29. Diferencias a modo de ejemplo entre la producción de rHuPH20 en un cultivo de biorreactor de 300 l y 2500 l
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Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Líquido de cultivo celular recogido que comprende PH20 humana recombinante (rHuPH20) soluble con una actividad enzimática que es mayor de 5000 y menor de o igual a 24.000 unidades de actividad hialuronidasa/ml de líquido de cultivo celular tal como se recoge, en el que:
la rHuPH20 soluble es una forma soluble de PH20 humana que se expresa de manera recombinante en células de ovario de hámster chino (CHO);
la secuencia de aminoácidos de la rHuPH20 codificada por las células comprende un polipéptido cuya secuencia se expone en SEQ ID NO:4 o variantes del mismo que tienen el 96% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO:4, en el que la identidad de secuencia se determina a lo largo de la longitud de la secuencia completa;
una unidad de actividad hialuronidasa puede determinarse incubando rHuPH20 soluble con hialuronato de sodio (ácido hialurónico) durante un periodo de tiempo establecido (10 minutos), precipitando el hialuronato de sodio sin digerir con la adición de albúmina sérica acidificada, midiendo la turbidez de la muestra resultante a 640 nm después de un periodo de desarrollo de 30 minutos y comparando con una curva de calibración generada con diluciones de un patrón de referencia de trabajo de ensayo de rHuPH20 soluble; y el líquido de cultivo celular recogido es el líquido tal como se separa a partir de las células, del residuo celular y de los agregados.
2. Líquido de cultivo celular recogido según la reivindicación 1, en el que la actividad enzimática es mayor de 5000 y menor de o igual a 22.000 unidades/ml.
3. Líquido de cultivo celular recogido según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la actividad enzimática es mayor de 5000 y menor de o igual a 20.000 unidades/ml.
4. Líquido de cultivo celular recogido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la actividad enzimática es mayor de 5000 y menor de o igual a 18.000 unidades/ml.
5. Líquido de cultivo celular recogido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la secuencia de aminoácidos de la rHuPH20 codificada por las células comprende un polipéptido cuya secuencia se expone en cualquiera de las SEQ ID NO:4-9.
6. Líquido de cultivo celular recogido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la actividad enzimática es de 10.000, 12.000, 14.000, 16.000 ó 18.000 unidades/ml.
7. Líquido de cultivo celular recogido según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que las células que codifican para PH20 humana soluble son células CHO DG44.
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