KR20100135777A - 가용성 히알루로니다아제의 대규모 제조 - Google Patents

가용성 히알루로니다아제의 대규모 제조 Download PDF

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Abstract

가용성 히알루로니다아제의 제제를 대규모 제조하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 가용성 히알루로니다아제를 인코딩하는 핵산의 활성 카피의 복수를 포함하는 세포 및 다양한 공급 및 온도 변화를 채용함으로써, 인코딩되는 가용성 히알루로니다아제가 세포 배양 배지로 분비되도록 한다.

Description

가용성 히알루로니다아제의 대규모 제조{LARGE-SCALE PRODUCTION OF SOLUBLE HYALURONIDASE}
관련 출원
David Baker 및 Louis Bookbinder 의, 발명의 명칭이 "가용성 히알루로니다아제의 대규모 제조" 인, 2008 년 3 월 6 일에 출원된 U.S.가출원 일련 번호 61/068,622 에 대해 우선권을 청구한다.
본 출원은, Louis Bookbinder, Anirban Kundu 및 Gregory I. Frost 의, 발명의 명칭이 "가용성 히알루로니다아제 당단백질 (SHASEGP), 그의 제조 방법, 용도 및 그것을 함유하는 약제학적 조성물" 인, 2004 년 3 월 5 일에 출원되고, U.S.공개 번호 20040268425 로 공개된 U.S. 출원 일련 번호 10/795,095 의 일부 계속 출원인, Louis Bookbinder, Anirban Kundu, Gregory I. Frost, Michael F. Haller, Gilbert A. Keller 및 Tyler M. Dylan 의, 발명의 명칭이 "가용성 글리코사미노글리칸 및 가용성 글리코사미노글리칸의 제조 및 사용 방법" 인, 2005 년 2 월 23 일에 출원되고, U.S. 공개 번호 20050260186 로 공개된 U.S. 출원 일련 번호 11/065,716 의 일부 계속 출원인, Louis Bookbinder, Anirban Kundu, Gregory I. Frost, Michael F. Haller, Gilbert A. Keller 및 Tyler M. Dylan 의, 발명의 명칭이 "가용성 글리코사미노글리칸 및 가용성 글리코사미노글리칸의 제조 및 사용 방법" 인, 2005 년 9 월 27 일에 출원되고, U.S. 공개 번호 20060104968 로 공개된 U.S. 출원 일련 번호 11/238,171 와 관련되어 있다. 상기 언급한 출원들 각각의 소재는 그 전부가 참고로 포함된다.
기술 분야
재조합 인간 단백질의 대규모 제조 방법을 제공한다.
히알루로니다아제는 히알루론산 (히알루로난 또는 히알루로네이트로 공지되어 있기도 함) 을 분해하는 효소들의 패밀리로, 세포외 기질의 핵심적인 성분이며, 간극 장벽 (interstitial barrier) 의 주된 구성원이다. 히알루론산의 가수분해를 촉매함으로써, 히알루로니다아제는 히알루론산의 점도를 낮추고, 그로써 조직 투과성을 증가시킨다. 이와 같이, 히알루로니다아제는, 예를 들어 다른 제제(agent), 약물들 및 단백질들과 함께 전착제(spreading agent) 또는 분산제로서 사용되어 그의 분산성 및 전달성을 증강시킨다. 히알루로니다아제는 또한 기타 치료 및 화장 용도를 갖는다. 치료 및 화장 용도를 위한 히알루로니다아제의 사용 증가 때문에, 대량의 정제된 히알루로니다아제를 필요로 한다.
따라서, 본원에서의 목적들 중에서도 특히 가용성 히알루로니다아제의 제조 및 정제 방법을 제공하는 것이 목적이다.
개요
본원에서는 가용성 히알루로니다아제의 제조 및 정제 방법을 제공한다. 특히, 본원에서는 가용성 rHuPH20 의 제조 및 정제 방법을 제공한다. 또한, 본원에서는 가용성 rHuPH20 을 포함하는 세포 배지 및 수확 세포 배양물을 제공한다. 본원에서 제공하는 방법은 임의의 양의 가용성 히알루로니다아제, 예컨대 rHuPH20 를 제조 및 정제하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법 및 단계는, 당업자에게는 자명하듯이, 규모 확대 또는 규모 축소를 위해 변경될 수 있다.
본원에서 제공하는 방법은 대규모 용량의 가용성 rHuPH20 의 제조 및 정제에 이용될 수 있다. 본원에서 제공하는 가용성 rHuPH20 의 제조 방법은, a) 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 세포의 접종원으로 생물 반응 장치 내의 세포 배지를 접종하여 세포 배양물을 제조하는 단계, 여기서 상기 세포는 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 핵산을 150 내지 300 카피 포함하고, 상기 생물 반응 장치는 100 리터 이상의 세포 배양물을 포함하고, 100 리터의 세포 배양물마다 약 1010 내지 1011 개의 세포가 접종되고, 세포는 설정 온도에서 배양됨; b) 상기 세포에 글루코오스, L-알라닐-L-글루타민, 인간 인슐린 및 효모 추출물을 함유하는 제 1 피드(feed) 배지를, 세포 성장 및 정점 세포 밀도를 증가시키고, 가용성 rHuPH20 합성을 증가시키기에 충분한 양으로 공급하는 단계, 여기서 상기 피드 배지는 배양물에 세포 배양물 부피의 4% 의 부피로 첨가됨; c) 상기 세포에 글루코오스, L-알라닐-L-글루타민, 효모 추출물 및 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 2 피드 배지를, 가용성 rHuPH20 합성을 증가시키고, 세포 주기 정지를 유도하기에 충분한 양으로 공급하는 단계; 여기서 L-알라닐-L-글루타민의 양은 제 2 단계에서의 L-알라닐-L-글루타민의 양과 비교하여 감소되고, 효모 추출물의 양은 단계 b) 에서의 효모 추출물의 양과 비교하여 증가되고, 피드 배지는 세포 배양물 부피의 4% 의 부피로 배양물에 첨가하고, 온도는 단계 a) 에서의 온도와 비교하여, 세포 주기 정지, 세포 생존력 증가 및 가용성 히알루로니다아제 안정화에 충분한 온도로 강하시킴; d) 세포에 글루코오스, L-알라닐-L-글루타민, 효모 추출물 및 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 3 피드 배지를, 가용성 rHuPH20 합성을 증가시키고, 세포 주기 정지를 증가시키기에 충분한 양으로 공급하는 단계, 여기서 피드 배지는 세포 배양물 부피의 4% 의 부피로 배양물에 첨가되고, L-알라닐-L-글루타민 및 글루코오스의 양은 단계 c) 에서의 L-알라닐-L-글루타민 및 글루코오스의 양과 비교하여 감소되고, 효모 추출물 및 나트륨 부티레이트의 양은 단계 c) 에서의 효모 추출물 및 나트륨 부티레이트의 양과 비교하여 증가되고, 온도는 단계 c) 에서의 온도와 비교하여, 세포 주기 정지를 증가시키고, 세포 생존력을 증가시키고, 가용성 히알루로니다아제를 안정화시키기에 충분한 온도로 강하시킴; e) 세포에 글루코오스, L-알라닐-L-글루타민, 효모 추출물 및 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 4 피드 배지를, 가용성 rHuPH20 합성을 증가시키고, 세포 주기 정지를 증가시키기에 충분한 양으로 공급하는 단계, 여기서 L-알라닐-L-글루타민 및 글루코오스의 양은 단계 d) 에서의 L-알라닐-L-글루타민 및 글루코오스의 양과 비교하여 감소되고, 나트륨 부티레이트의 양은 단계 d) 에서의 나트륨 부티레이트의 양과 비교하여 감소되고, 온도는 단계 d) 에서의 온도와 비교하여, 세포 주기 정지를 증가시키고, 세포 생존력을 증가시키고, 가용성 히알루로니다아제를 안정화시키기에 충분한 온도로 강하시키고, 피드 배지는 배양물에 세포 배양물 부피의 4% 부피로 첨가됨; f) 생존력이 약 또는 적어도 50% 미만으로 강하할 때까지 세포를 배양하는 단계; g) 수확 세포 배양액을 수득하는 단계; 및 h) 수확 세포 배양액으로부터 가용성 rHuPH20 를 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
수확 세포 배양액은 정제 전에 여과할 수 있다. 일부 구현예에서, 단계 a) 에서의 온도는 37℃ 이고, 단계 c) 에서의 온도는 36.5℃ 이고, 단계 d) 에서의 온도는 36℃ 이고, 단계 d) 에서의 온도는 35.5℃ 이다. 가용성 rHuPH20 정제는 비드 가교 아가로오스 컬럼 크로마토그래피, 비드 가교 페닐-치환 아가로오스 컬럼 크로마토그래피, 아미노 페닐 보로네이트 컬럼 크로마토그래피 및 히드록시아파타이트 컬럼 크로마토그래피와 같은 컬럼 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다.
한 구현예에서, 가용성 rHuPH20 의 제조 방법은, a) 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 세포의 접종원으로 생물 반응 장치 내의 세포 배지를 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계, 여기서 상기 세포는 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 핵산을 150 내지 300 카피 포함하고, 상기 생물 반응 장치는 100 리터 이상의 세포 배양물을 포함하고, 접종 세포 밀도는 약 또는 4 × 105 세포/mL 이고, 세포는 37℃ 에서 배양함; b) 세포에 약 또는 33 g/L 글루코오스, 32 mM L-알라닐-L-글루타민, 16.6 g/L 효모 추출물 및 33 mg/L 인슐린을 함유하는 제 1 피드 배지를 공급하는 단계, 여기서 상기 피드 배지는 배양물에 세포 배양물 부피의 4% 의 부피로 첨가됨; c) 세포에 약 또는 33 g/L 글루코오스, 16 mM L-알라닐-L-글루타민, 33.4 g/L 효모 추출물 및 0.92 g/L 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 2 피드 배지를 공급하는 단계, 여기서 상기 피드 배지는 배양물에 세포 배양물 부피의 4% 의 부피로 첨가되고, 온도는 36.5℃ 로 강하함; d) 세포에 약 50 g/L 글루코오스, 10 mM L-알라닐-L-글루타민, 50 g/L 효모 추출물 및 1.8 g/L 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 3 피드 배지를 공급하는 단계, 여기서 상기 피드 배지는 배양물에 세포 배양물 부피의 4% 의 부피로 첨가되고, 온도는 36℃ 로 강하됨; e) 세포에 약 또는 33 g/L 글루코오스, 6.6 mM L-알라닐-L-글루타민, 50 g/L 효모 추출물 및 0.92 g/L 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 4 피드 배지를 공급하는 단계, 여기서 상기 피드 배지는 배양물에 세포 배양물 부피의 4% 의 부피로 첨가되고, 온도는 36℃ 로 강하됨; f) 생존력이 적어도 약 또는 50% 미만으로 강하될 때까지 세포 배양을 계속하는 단계; g) 수확 세포 배양액을 수득하는 단계; h) 수확 세포 배양액을 여과하는 단계; 및 i) 상기 수확 배양액으로부터 rHuPH20 를, 비드 가교 아가로오스 컬럼 크로마토그래피, 비드 가교 페닐-치환 아가로오스 컬럼 크로마토그래피, 아미노 페닐 보로네이트 컬럼 크로마토그래피 및 히드록시아파타이트 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계를 포함한다.
또다른 구현예에서, 가용성 rHuPH20 의 제조 방법은, a) 생물 반응 장치 중의 세포 배지를 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 세포의 접종원으로 접종하는 단계, 여기서 상기 세포는 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 핵산을 150 내지 300 카피 포함하고; 상기 생물 반응 장치는 100 리터 이상의 세포 배양물을 포함하고; 접종 세포 밀도는 약 또는 4 × 105 세포/mL 이고; 세포를 약 또는 37℃ 에서 배양함; b) 상기 세포에 약 33 g/L 글루코오스, 32 mM L-알라닐-L-글루타민, 83.3 g/L 효모 추출물 및 33 mg/L 인슐린을 함유하는 제 1 피드 배지를 공급하는 단계, 여기서 상기 피드 배지는 상기 배양물에 세포 배양물 부피의 4% 또는 약 4% 의 부피로 첨가됨; c) 상기 세포에 약 33 g/L 글루코오스, 13 mM L-알라닐-L-글루타민, 166.7 g/L 효모 추출물 및 0.92 g/L 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 2 피드 배지를 공급하는 단계, 여기서 상기 피드 배지는 상기 배양물에 세포 배양물 부피의 약 또는 4% 의 부피로 첨가되고, 온도는 36.5℃ 로 강하함; d) 상기 세포에 약 50 g/L 글루코오스, 10 mM L-알라닐-L-글루타민, 250 g/L 효모 추출물 및 1.8 g/L 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 3 피드 배지를 공급하는 단계, 여기서 상기 피드 배지는 상기 배양물에 세포 배양물 부피의 4% 또는 약 4% 의 부피로 첨가하고, 온도는 36℃ 로 강하함; e) 상기 세포에 약 33 g/L 글루코오스, 6.7 mM L-알라닐-L-글루타민, 250 g/L 효모 추출물 및 0.92 g/L 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 4 피드 배지를 공급하는 단계, 여기서 상기 피드 배지는 배양물에 세포 배양물 부피의 4% 또는 약 4% 의 부피로 첨가하고, 온도는 36℃ 로 강하함; f) 생존력이 적어도 약 50% 미만으로 강하될 때까지 세포 배양을 계속하는 단계; g) 수확 세포 배양액을 수득하는 단계; h) 수확 세포 배양액을 여과하는 단계; 및 i) rHuPH20 를 수확 배양액으로부터, 비드 가교 아가로오스 컬럼 크로마토그래피, 비드 가교 페닐-치환 아가로오스 컬럼 크로마토그래피, 아미노 페닐 보로네이트 컬럼 크로마토그래피 및 히드록시아파타이트 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 생물 반응 장치 내의 세포 배양물의 부피는 약 또는 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 또는 3500 리터이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공되는 방법을 이용해 제조되는, 세포 배양물 100 L 당 가용성 rHuPH20 의 양은 적어도 또는 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40 g 의 가용성 rHuPH20 이다. 가용성 rHuPH20 의 비활성(specific activity)은 적어도 또는 약 80000, 100000, 120000, 140000, 160000 또는 180,000 유닛/mg 일 수 있다. 가용성 rHuPH20 을 인코딩하는 세포는, 일부의 경우, DG44 CHO 세포일 수 있다. 추가로, rHuPH20 는 서열번호: 47 에 개시된 핵산으로 인코딩될 수 있다.
본원에서 효소 활성이 5,000 유닛/mL 초과, 예컨대 10,000, 12,000, 14,000, 16,000, 18,000, 20,000, 22,000 또는 24,000 유닛/mL 인 가용성 rHuPH20 를 함유하는 세포 배양 배지를 제공한다. 또한, 본원에서 효소 활성이 5,000 유닛/mL 초과, 예컨대 10,000, 12,000, 14,000, 16,000, 18,000, 20,000, 22,000 또는 24,000 유닛/mL 인 가용성 rHuPH20 를 함유하는 수확 세포 배양액을 제공한다.
발명의 상세한 설명
개요
A. 정의
B. 개관
C. 히알루로니다아제
1. 구조 및 기능
2. PH20
3. 히알루로니다아제의 치료 용도
a. 전착제로서의 용도
b. 피하주입에서의 용도
c. 유리체절제술 및 안과 장애 및 상태에서의 용도
d. 유전자 요법에서의 용도
e. 화장 용도
f. 장기 이식에서의 용도
g. 암 치료에서의 용도
h. 뇌에서의 글리코사미노글리칸 축적의 치료에서의 용도
i. 심혈관 질환에서의 글리코사미노글리칸 축적의 치료에서의 용도
j. 폐 질환에서의 용도
k. 기타 용도
D. 히알루로니다아제 -발현 세포
a. 3 D35M 세포
b. 2B2 세포
E. 세포 배양 증량
F. 단백질 제조
G. 단백질 농축 및 완충액 교환
H. 정제
1. 비드 가교 아가로오스 컬럼
2. 비드 가교 페닐 -치환 아가로오스 컬럼
3. 아미노 페닐 보로네이트 컬럼
4. 히드록시아파타이트 컬럼
6. 바이러스 제거, 단백질 농도 및 완충액 교환
I. 충전
J. 모니터링 및 검정
1. 모니터링 조건
2. 가용성 rHuPH20 제조의 모니터링
K. 실시예
A. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 과학기술 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자가 통상 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원의 전체 개시를 통틀어 언급된 모든 특허, 특허 출원, 공보 및 출판물, Genbank 서열, 데이터베이스, 웹사이트 및 기타 공지된 문건들은, 달리 언급되지 않는 한, 그의 전체가 참조로써 포함된다. 본원에서 용어에 대한 여러가지 정의가 있는 경우, 본 섹션에 있는 것을 우선으로 한다. URL 또는 기타 그러한 식별자 또는 주소를 언급한 경우, 상기 식별자들은 바뀔 수 있고, 인터넷 상의 특별한 정보는 변천할 수 있지만, 동등한 정보는 인터넷 검색으로 찾을 수 있는 것으로 이해된다. 그곳에서 참고되는 내용은 상기 정보의 이용가능성 및 공개적 보급성을 입증한다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로니다아제는 히알루론산을 분해하는 효소이다. 히알루로니다아제는 박테리아의 히알루로니다아제 (EC 4.2.99.1), 거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래의 히알루로니다아제 (EC 3.2.1.36), 및 포유류-타입 히알루로니다아제 (EC 3.2.1.35) 를 포함한다. 히알루로니다아제는 또한, 이에 제한되지 않으나, 쥐과동물, 개, 고양이, 토끼류, 조류, 소, 양, 돼지, 말, 물고기류, 개구리류, 균류 및 임의의 거머리류, 기타 기생충류 및 갑각류를 포함하는 임의의 비-인간 기원의 것을 포함한다. 예시되는 비-인간 히알루로니다아제는, 소 (서열번호: 10), 말벌 (서열번호: 11 및 12), 꿀벌 (서열번호: 13), 흰얼굴 호박벌 (서열번호: 14), 장수말벌 (서열번호: 15), 마우스 (서열번호: 16 내지 18, 29), 돼지 (서열번호: 19-20), 래트 (서열번호: 21 내지 23, 28), 토끼 (서열번호:24), 양 (서열번호: 25), 오랑우탄 (서열번호: 26), 필리핀 원숭이 (서열번호: 27), 기니 피그 (서열번호: 30), 황색포도상구균 (서열번호: 31), 연쇄상구균 (서열번호: 32), 및 클로스트리디움 페르프린겐스 (Clostridium perfringens) (서열번호: 33) 유래의 히알루로니다아제를 포함한다. 예시 인간 히알루로니다아제는, HYAL1 (서열번호: 34), HYAL2 (서열번호: 35), HYAL3 (서열번호:36), HYAL4 (서열번호:37) 및 PH20 (서열번호: 1) 을 포함한다. 또한, 히알루로니다아제들 중에는 가용성 인간 PH20 및 가용성 rHuPH20 가 포함된다.
히알루로니다아제라는 언급은 전구체 히알루로니다아제 폴리펩티드 및 성숙형 히알루로니다아제 폴리펩티드 (예컨대, 시그널 서열이 제거된 것), 활성을 갖는 그의 절단된 형태를 포함하고, 대립유전자 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 인코딩되는 변이체 및, 서열번호: 1 및 10 내지 37 에 개시된 전구체 폴리펩티드와 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 기타 변이체, 또는 그의 성숙형 형태를 포함한다. 예를 들어, 히알루로니다아제라는 언급은 또한 서열번호: 48 내지 49 에 개시된 인간 PH2O 전구체 폴리펩티드 변이체를 포함한다. 히알루로니다아제는 또한 화학적 또는 번역후 변형을 포함하는 것들, 및 화학적 또는 번역후 변형을 포함하지 않는 것들을 포함한다. 상기 변형에는, 이에 제한되지 않으나, 페길화, 알부민화, 글리코실화, 파르네실화, 카르복실화, 히드록실화, 포스포릴화 및 기타 당업계에 공지된 폴리펩티드 변형이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 가용성 인간 PH20 또는 sHuPH20 는, 예컨대 발현시 폴리펩티드가 가용성이 되도록 하는, C-말단에서의 글리코실포스파티딜 이노시톨 (GPI) 결합 부위의 전부 또는 일부가 결핍된 성숙형 폴리펩티도 포함한다. 예시 sHuPH20 폴리펩티드에는, 서열번호 4 내지 9 및 45 내지 46 중 임의의 하나에 개시된 아미노산 서열을 가진 성숙형 폴리펩티드가 포함된다. 상기 예시 sHuPH20 폴리펩티드에 대한 전구체 폴리펩티드에는 시그널 서열이 포함된다. 전구체의 예시는, 서열번호: 3 및 38 내지 44 에 개시된 것으로서, 각각 아미노산 위치 1 내지 35 에 35 개의 아미노산 시그널 서열을 포함하는 것이다. 가용성 HuPH20 폴리펩티드는 또한 본원에 기재된 제조 및 정제 방법의 도중 또는 이후에 분해되는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 가용성 rHuPH20 는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 재조합적으로 발현되는 인간 PH2O 의 가용성 형태를 지칭한다. 가용성 rHuPH20 는, 시그널 서열을 포함하고, 서열번호: 47 에 개시된 핵산에 의해 인코딩된다. 또한, 그의 대립형질 변이체 및 기타 가용성 변이체인 DNA 분자가 포함된다. 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 핵산은 성숙형 폴리펩티드를 분비하는 CHO 세포에서 발현된다. 배양 배지에서 제조되면, C-말단에는 비균질성이 있게 되는데, 따라서 생성물은 다양한 풍부함으로 하나 이상의 서열번호 4 내지 9 를 포함할 수 있는 종 들의 혼합물을 포함한다. 서열번호: 48 내지 49 에 개시된 전구체 인간 PH2O 폴리펩티드에 상응하는 것을 포함하여, 상응하는 대립형질 변이체 및 기타 변이체가 또한 포함된다. 기타 변이체는, 히알루로니다아제 활성을 보유하고 가용성인 한, 서열번호 4 의 것들 중 임의의 것과 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "가용성 rHuPH20-발현 세포" 는 가용성 rHuPH20 를 발현하는 임의의 CHO 세포를 지칭한다. 예시하는 가용성 rHuPH20-발현 세포에는 2B2 및 3D35M 세포가 포함된다. 가용성 rHuPH20-발현 세포는, 서열번호: 55 에 개시된 서열을 포함하는 핵산이 도입된 CHO 세포이다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로니다아제 활성은 히알루로니다아제 폴리펩티드에 의해 나타나는 임의의 활성을 지칭한다. 상기 활성은 시험관내 및/또는 생체내에서 시험될 수 있고, 이에 제한되지 않으나, 히알루론산의 절단을 수행하는 것과 같은 효소활성, 분산제 또는 전착제로서 작용하는 능력 및 항원성을 포함한다. 히알루로니다아제 활성은 히알루로니다아제 폴리펩티드에 의해 나타나는 임의의 활성을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 효소 활성은 시험관내 효소 검정에서 평가되는, 히알루론산과 같은 기질을 절단하는 히알루로니다아제의 활성을 지칭한다. 가용성 rHuPH20 과 같은 히알루로니다아제의 효소 활성을 측정하는 시험관내 검정은 당업계에 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있다. 예시되는 검정에는, 절단되지 않은 히알루론산이 혈청 알부민과 결합하고 있을 때 형성되는 불용성 침전물을 검출함으로써 간접적으로 히알루로니다아제에 의한 히알루론산의 절단을 측정하는, 하기에 기재된 미세탁도 검정 (예를 들어, 실시예 9 및 섹션 I 참고) 이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 가용성 rHuPH20 과 관련된 비활성(specific activity)은 가용성 rHuPH20 의 양과 상관있는 효소 활성이다. 비활성은 효소 활성 (유닛/mL) 을 단백질 농도 (mg/mL) 로 나누어 계산된다.
본원에 사용된 바와 같이, "하나 이상의 활성을 나타내다" 또는 "하나 이상의 활성을 보유하다" 는 동일한 조건 하에 서열번호 4 내지 9 에 개시된 임의의 가용성 rHuPH20 와 비교되는 변이체 가용성 rHuPH20 에 의해 나타나는 활성을 지칭한다. 전형적으로는, 서열번호 4 내지 9 에 개시된 가용성 rHuPH20 의 하나 이상의 활성을 보유하거나 또는 나타내는 변이체 가용성 rHuPH20 은, 서열번호 4 내지 9 에 개시된 가용성 rHuPH20 의 활성의 약 또는 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상을 보유한다. 예시되는 활성에는, 이에 제한되지 않으나, 히알루로니다아제 활성 및 효소 활성이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 비드 가교 아가로오스 컬럼 크로마토그래피는 비드 가교 아가로오스로 팩킹된 컬럼을 이용하는 크로마토그래피를 지칭한다. 비드 가교 아가로오스의 예시는 Q 세파로오스™ 이다.
본원에 사용된 바와 같이, 비드 가교 페닐-치환 아가로오스 컬럼 크로마토그래피는 비드 페닐-치환 가교 아가로오스로 팩킹된 컬럼을 이용하는 크로마토그래피를 지칭한다. 비드 페닐-치환 가교 아가로오스의 예시는 페닐 세파로오스™ 이다.
본원에 사용된 바와 같이, 아미노 페닐 보로네이트 컬럼 크로마토그래피는 아미노 페닐 보로네이트 아가로오스로 팩킹된 컬럼을 이용하는 크로마토그래피를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 히드록시아파타이트 컬럼 크로마토그래피는 히드록시아파타이트로 팩킹된 컬럼을 이용하는 크로마토그래피를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 수확된 세포 배양액 또는 수확 세포 배양액 (HCCF) 은 생물 반응 장치로부터의 세포의 수확 및, 세포, 세포 찌꺼기 및 기타 응집물로부터의 세포 배양 배지의 분리에 후속하여 수득되는 액체를 지칭한다. 생물 반응 장치로부터 수확된 세포 배양물은 배양물을 정화하기 위해 여과되어, 세포, 세포 찌꺼기 및 기타 응집물을 제거하고 수확된 세포 배양액만을 남길 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 밀도는 주어진 부피의 배지 내 세포의 갯수를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 배양물 또는 배양물은 세포의 생존력을 유지하거나 또는 세포가 성장하기에 적합한 조건 하에 배지 중에 현탁되어 있는 세포 집단을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 배지, 세포 배지 또는 세포 배양 배지는 배양물 중의 세포의 성장을 촉진하기에 충분한 영양물을 포함하는 용액을 지칭한다. 전형적으로, 상기 용액은 필수 및 비필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 지질 및/또는 미량원소를 포함한다. 배지는 또한 추가적인 보충물, 예컨대 호르몬, 성장 인자 및 성장 저해제를 포함할 수 있다. 언급한 세포 배양 배지도 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 천연 발생 α-아미노산의 잔기는 인간에서의 충전된 tRNA 분자의 그의 관련된 mRNA 코돈의 특이적인 인식에 의해 단백질로 혼입되는, 자연에서 발견되는 20 가지 α-아미노산의 잔기이다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 성장 속도, 정점 세포 밀도, 단백질 합성 또는 세포 주기 정지와 같은 파라미터들을 증가시키는 물질을 언급할 때 "증가시키기에 충분한 양" 은, 해당 물질의 부재시 관찰되는 것에 비해 상기 파라미터들 중 하나에서의 증가를 달성하는 물질의 양을 지칭한다. 파라미터들은 해당 물질의 존재 및 부재시 평가될 수 있고, 해당 물질의 부재시와 비교하여 파라미터 (예컨대, 세포 성장 속도, 정점 세포 밀도, 단백질 합성 또는 세포 주기 정지) 를 증가시키는 물질의 양을 측정할 수 있다. 해당 물질 존재 하의 세포 성장, 정점 세포 밀도, 단백질 합성 또는 세포 주기 정지는, 해당 물질 부재 시의 성장 속도, 정점 세포 밀도, 단백질 합성 또는 세포 주기 정지에 비해, 약 또는 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상으로 증가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산은, DNA, RNA, 및 펩티드 핵산 (PNA) 및 이들의 혼합물을 포함한, 이들의 유사체를 포함한다. 핵산은 단일 또는 이중-가닥일 수 있다. 예컨대, 형광 또는 방사성동위원소표지와 같은 검출가능한 표지를 이용하여 임의로 표지되는 프로브 또는 프라이머 언급시, 단일-가닥 분자들이 고려된다. 상기 분자들은 전형적으로는 그들의 표적이 통계적으로 독특하거나 또는 라이브러리를 탐침 또는 프라이밍하기 위한 낮은 카피수 (전형적으로는 5 미만, 일반적으로는 3 미만) 의 것인 길이의 것이다. 일반적으로, 프로브 또는 프라이머는 관심대상의 유전자에 대해 상보적이거나 또는 동일한, 적어도 14, 16 또는 30 개의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 프로브 및 프라이머는 길이가 10, 20, 30, 50, 100 또는 그 이상인 핵산일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 펩티드는 길이가 2 내지 40 아미노산인 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 제공되는 각종 아미노산 서열에서 나타나는 아미노산들은 그의 공지된 3-문자 또는 1-문자 약어로 식별된다 (표 1). 각종 핵산 절편에서 나타나는 뉴클레오티드는 당업계에서 일상적으로 사용되는 표준 1-문자 표기법으로 기재한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산" 은 1 개의 아미노기 및 1 개의 카르복실산기를 포함하는 유기 화합물이다. 폴리펩티드는 2 개 이상의 아미노산을 포함한다. 본원에서의 목적에 있어서, 아미노산은 20 가지의 천연 발생 아미노산, 비-천연적 아미노산 및 아미노산 유사체 (즉, α-탄소가 측쇄를 가진 아미노산) 를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기" 는 그의 펩티드 결합에서 폴리펩티드의 화학적 소화 (가수분해) 시 형성되는 아미노산을 지칭한다. 본원에 기재된 아미노산 잔기는 "L" 이성질체 형태인 것으로 여겨진다. "D" 이성질체 형태의 잔기는, 그렇게 지정된 것은, 바람직한 관능 특성이 폴리펩티드에 의해 보유되는 한, 임의의 L-아미노산을 대체할 수 있다. NH2 는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 유리된 아미노기를 지칭한다. COOH 는 폴리펩티드의 카르복실 말단에 존재하는 유리된 카르복시기를 지칭한다. J. Biol. Chem., 243: 3552-3559 (1969), 및 채택된 37 C.F.R..§§ 1.821 내지 1.822 에 기재된 표준 폴리펩티드 명명법을 고수하여, 아미노산 잔기에 대한 약어는 표 1 에 나타낸다:
표 1 - 대응표
Figure pct00001
화학식으로 본원에서 나타낸 모든 아미노산 잔기 서열들은 아미노-말단으로부터 카르복실-말단으로의 통상적인 방향으로 좌측에서 우측으로의 배향을 갖는다. 추가로, 어구 "아미노산 잔기" 는 대응표 (표 1) 에 열거된 아미노산 및 변형된 특이한 아미노산, 예컨대 본원에 참고문헌으로 포함되는 37 C.F.R.§§ 1.821 내지1.822 에서 언급된 것을 포함한다. 더욱이, 아미노산 잔기 서열의 시작부분 또는 말단에서의 대쉬 (dash) 는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가적 서열, NH2 와 같은 아미노-말단기 또는 COOH 와 같은 카르복실-말단기에 대한 펩티드 결합을 표시한다.
본원에 사용된 바와 같이, "천연 발생 아미노산" 은 폴리펩티드에 나타나는 20 가지 L-아미노산을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "비-천연 아미노산" 은 천연 아미노산과 유사한 구조를 갖지만, 천연 아미노산의 구조 및 반응성을 모방하도록 구조적으로 변형된 유기 화합물을 지칭한다. 따라서, 비-천연 발생 아미노산에는, 예를 들어, 20 가지 천연 발생 아미노산 이외의 아미노산 또는 아미노산의 유사체가 포함되며, 이에 제한되지 않으나, 아미노산의 D-이소입체이성질체 (D-isostereomer) 가 포함된다. 예시 비-천연 아미노산은 본원에 기재되어 있고, 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 구축물은 자연에서 발견되지 않는 방식으로 조합 및 병치된 DNA 의 분절(segment)들을 포함하는, 단일 또는 이중 가닥의, 선형 또는 환형 DNA 분자이다. DNA 구축물은 인간의 조작 결과로서 존재하며, 조작된 분자의 클론 및 기타 카피들이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 두 단백질 또는 핵산간의 "유사성" 은 단백질들의 아미노산 서열 또는 핵산들의 뉴클레오티드 서열 간 관련성을 지칭한다. 유사성은 잔기들의 서열 및 그곳에 포함된 잔기들의 동일성 및/또는 상동성 정도에 근거할 수 있다. 단백질 또는 핵산간 유사성 정도의 평가 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 서열 유사성 평가의 한가지 방법에서, 두 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 서열간 최대 수준의 동일성을 제공하도록 하는 방식으로 정렬된다. "동일성" 은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 변함없는 정도를 지칭한다. 아미노산 서열의 정렬 및 어느 정도까지의 뉴클레오티드 서열의 정렬은 또한 아미노산 (또는 뉴클레오티드) 에서의 보존적 차이 (conservative difference) 및/또는 빈번한 치환을 고려할 수 있다. 보존적 차이는 수반되는 잔기들의 물리화학적 특성을 보존하는 것이다. 정렬은 전체적 (서열의 전장에 걸쳐 모든 잔기들을 포함하여 비교하는 서열의 정렬) 이거나 또는 국지적 (가장 유사한 영역 또는 영역들만을 포함하는 서열들의 일부분의 정렬) 일 수 있다.
"동일성" 은 자체로 당해 분야에서 인식된 의미를 갖고, 공지된 기법을 이용하여 계산될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.편저, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. 편저, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., 및 Griffin, H. G. 편저, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysus Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J. 편저, M Stockton Press, New York, 1991). 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 동일성 측정방법이 다수 존재하나, 용어 "동일성" 은 당업자에게 널리 공지되어 있다 (Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).
본원에 사용된 바와 같이, 상동함 (핵산 및/또는 아미노산 서열과 관련하여) 은 대략 25% 이상의 서열 상동성, 전형적으로는 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 이상의 서열 상동성을 의미하고; 필요한 경우, 정확한 백분율이 특정될 수 있다. 본원에서의 목적을 위해, 용어 "상동성" 및 "동일성" 은 달리 표시되지 않는 한, 호환하여 사용된다. 일반적으로, 백분율 상동성 또는 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최고 수준의 맷치 (match) 가 수득되도록 정렬된다 (참고문헌은, 예를 들어: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. 편저 Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. 편저, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., 및 Griffin, H.G. 편저, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J. 편저, M Stockton Press, New York, 1991 ; Carillo 등 (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). 서열 상동성에 의해, 보존성 아미노산의 갯수를 표준 정렬 알고리즘 프로그램으로 결정하고, 각각의 공급자에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티 (default gap penalty) 와 함께 이용될 수 있다. 실질적으로 상동인 핵산 분자는 관심대상의 핵산의 길이를 따라 전형적으로 중간정도의 엄격성으로 또는 고도의 엄격성으로 혼성화한다. 핵산 분자 혼성화에서, 코돈들을 대신해 축퇴성 코돈을 포함하는 핵산 분자가 또한 고려된다.
임의의 두 분자가 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 "동일" 또는 "상동" 인 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 갖는지 여부는, "FASTA" 프로그램, 예를 들어, Pearson 등의 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 55:2444 에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하는 공지된 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다 (기타 프로그램에는 GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., 등, Nucleic Acids Research 12(I):3%1 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F. 등, J Molec Biol 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop 편저, Academic Press, San Diego, 1994, 및 Carillo 등 (1988) SIAM J Applied Math 48:1073 가 포함됨). 예를 들어, National Center for Biotechnology Information 데이터베이스의 BLAST 기능이 동일성 결정에 이용될 수 있다. 기타 시판되거나 또는 공지되어 이용가능한 프로그램에는, DNAStar "MegAlign" 프로그램 (Madison, WI) 및 University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) "Gap" 프로그램 (Madison WI) 이 포함된다. 단백질 및/또는 핵산 분자의 백분율 상동성 또는 동일성은 예를 들어 GAP 컴퓨터 프로그램 (예를 들어, Needleman 등 (1970) J. Mol. Biol. 48:443, 이는 Smith 및 Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482 에서 개정됨) 을 이용하는 서열 정보 비교에 의해 결정될 수 있다. 간략하게, GAP 프로그램에서는, 유사성을 두 서열 중 더 짧은 것의 기호의 총 갯수로 나눈 유사한 정렬된 기호 (즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산) 의 갯수로 정의한다. GAP 프로그램에 대한 디폴트 파라미터는 다음을 포함할 수 있다: (1) Schwartz and Dayhoff, 편저, ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) 에 기재된, 단항 비교 매트릭스 (동일함에 대해서는 1 의 값을, 비-동일함에 대해서는 0 의 값을 내포함) 및 Gribskov 등 (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745 의 칭량 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대해서는 3.0 의 페널티, 각각의 갭에서의 각 기호에 대해서는 추가적인 0.10 의 페널티; 및 (3) 말단 갭에 대해서는 페널티 없음.
따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동일성" 또는 "상동성" 은 시험 및 기준 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 비교를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 적어도 "90% 동일" 은 폴리펩티드의 기준 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 90 내지 99.99 의 백분율 동일성을 지칭한다. 90% 이상의 수준의 동일성은 예시 목적으로 100 개 아미노산의 시험 및 기준 폴리펩티드 길이를 비교함을 가정했음을 표시한다. 시험 폴리펩티드에서 10% (즉, 100 개 중 10 개) 이하의 아미노산이 기준 폴리펩티드의 것과 상이하다. 시험 및 기준 폴리뉴클레오티드 사이에서도 유사한 비교가 가능하다. 그러한 차이는 폴리펩티드의 전장에 걸쳐 무작위로 분포하는 점 돌연변이로서 나타날 수 있거나, 또는 최대 허용되는, 예를 들어 10/100 아미노산 차이 (약 90% 동일성) 까지 다양한 길이의 한 군데 이상의 위치에서 무리를 이룰 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로 규정된다. 약 85 내지 90% 를 상회하는 동일성 또는 상동성 수준에서는, 그 결과가 프로그램 및 갭 파라미터 셋트와는 독립적이며; 그러한 높은 수준의 동일성은, 종종 소프트웨어에 의지하지 않고 수동적인 정렬에 의해서도 쉽게 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 정렬된 서열은 뉴클레오티드 또는 아미노산 내에 상응하는 위치에 정렬되는 상동성 (유사성 및/또는 동일성) 의 이용을 지칭한다. 전형적으로는, 50% 이상의 동일성으로 연관되어 있는 2 개 이상의 서열이 정렬된다. 서열의 정렬된 셋트란, 상응하는 위치에서 정렬되는 2 개 이상의 서열을 지칭하고, 게놈 DNA 서열과 정렬되는, EST 및 기타 cDNA 와 같은 RNA 로부터 유도된 정렬 서열이 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머" 는 적당한 조건 하 (예를 들어, 4 가지 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합제, 예컨대 DNA 폴리머라아제, RNA 폴리머라아제 또는 역전사효소의 존재 하), 적당한 완충액 및 적합한 온도 하에서의 템플레이트-지령 DNA 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 특정 핵산 분자가 "프로브" 및 "프라이머" 로서 제공될 수 있음이 인식될 것이다. 그러나, 프라이머는 신장을 위한 3' 히드록실기를 갖는다. 프라이머는, 예를 들어 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR), 역전사효소 (RT)-PCR, RNA PCR, LCR, 멀티플렉스 PCR, 팬핸들 (panhandle) PCR, 캡춰 (capture) PCR, 발현 PCR, 3' 및 5' RACE, 제자리 (in situ) PCR, 라이게이션-매개 PCR 및 기타 증폭 프로토콜을 포함하는 다양한 방법에서 이용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 대립형질 변이체 또는 대립형질 변이는 동일한 염색체 위치를 차지하는 유전자의 임의의 2 가지 이상의 대안적인 형태를 지칭한다. 대립형질 변이체는 돌연변이를 통해 자연적으로 나타나며, 집단내 표현형 다형질성을 초래할 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵형 (인코딩되는 폴리펩티드에서는 변화가 없음) 일 수 있거나 또는 변경된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 용어 "대립형질 변이체" 는 또한 본원에서 유전자의 대립형질 변이체에 의해 인코딩되는 단백질을 지칭하기 위해 이용된다. 전형적으로는, 유전자의 기준 형태가 야생형 형태 및/또는 집단의 폴리펩티드의 우세형 또는 종의 단독 기준 구성원을 인코딩한다. 전형적으로는, 종간 변이체를 포함하는 대립형질 변이체는 동종 유래 야생형 및/또는 우세형과 적어도 80%, 90%, 또는 더 큰 아미노산 동일성을 가지고; 동일성의 정도는 유전자에 좌우되고, 비교가 동종간 또는 이종간인지 여부에 따라 좌우된다. 일반적으로, 이종간의 대립형질 변이체들은, 폴리펩티드의 야생형 및/또는 우성형과, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 더 큰 동일성을 포함하여, 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성 또는 더 큰 동일성을 갖는다. 본원에서 대립형질 변이체라는 언급은 일반적으로 동종 구성원간 단백질에서의 변이를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "대립 형질" 은, 본원에서 "대립형질 변이체" 와 호환되어 사용되는데, 유전자 또는 그의 일부분의 대안적인 형을 지칭한다. 대립형질은 상동 염색체에서 동일한 구역 또는 위치를 차지한다. 대상체가 유전자의 2 개의 동일 대립형질을 갖는 경우, 상기 대상체는 해당 유전자 또는 대립형질에 대해 동형접합성이라고 일컫는다. 대상체가 유전자의 2 개의 상이한 대립형질을 갖는 경우, 상기 대상체는 해당 유전자에 대해 이형접합성이라고 일컫는다. 특정 유전자의 대립형질은 단일 뉴클레오티드 또는 여러 뉴클레오티드에서 서로 상이할 수 있고, 뉴클레오티드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 유전자의 대립형질은 또한 돌연변이를 포함하는 유전자의 형태일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 종 변이체는, 마우스 및 인간과 같은 상이한 포유류를 포함하는, 상이한 종들간의 폴리펩티드에 있어서의 변이를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 스플라이스 변이체는 한 가지를 초과하는 유형의 mRNA 를 제공하는, 게놈 DNA 의 1 차적인 전사물의 차별적인 프로세싱에 의해 제공되는 변이체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 변형은 폴리펩티드의 아미노산의 서열 또는 핵산 분자에서의 뉴클레오티드의 서열의 변형을 지칭하고, 각각 아미노산 및 뉴클레오티드의 결실, 삽입 및 치환을 포함한다. 폴리펩티드의 변형 방법은, 예컨대 재조합 DNA 방법론을 이용하는 것과 같이, 당업자에게는 일상적인 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 프로모터는, RNA 폴리머라아제의 결합 및 전사의 개시를 제공하는, DNA 서열을 포함하는 유전자의 일부분을 지칭한다. 프로모터 서열은 통상, 언제나 그런 것은 아니지만, 유전자의 5' 비-코딩 영역에서 발견된다.
본원에 사용된 바와 같이, 단리 또는 정제된 폴리펩티드 또는 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부분에는, 해당 단백질이 유래하는 세포 또는 조직으로부터의 세포 물질 또는 기타 오염성 단백질로부터 실질적으로 유리되어 있거나, 또는 화학적으로 합성된 경우 화학적 전구체 또는 기타 화학물로부터 실제적으로 유리되어 있다. 제제들은, 그들이 박층 크로마토그래피 (TLC), 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 와 같은, 순도 평가를 위해 당업자가 이용하는 표준 분석 방법으로 측정되는 쉽게 검출가능한 불순물로부터 유리되어 있거나, 또는 추가 정제가 해당 물질의 효소 및 생물학적 활성과 같은 물리적 및 화학적 특성을 눈에띄게 변경하지 않을 정도로 충분히 순수하다면, 실질적으로 유리되어 있다고 결정될 수 있다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 제조하기 위한 화합물의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 그런 경우, 추가 정제는 화합물의 특이적 활성을 증대시킬 수 있다.
용어 세포성 물질로부터 실질적으로 유리되었다는 것은, 단리되거나 또는 재조합적으로 제조된 세포의 세포 구성원들로부터 분리된 단백질들의 제제를 포함한다. 한 구현예에서, 용어 세포성 물질로부터 실질적으로 유리되었다는 것은, 약 30% (건중량) 미만의 비-효소 단백질 (본원에서는 오염 단백질로도 언급함), 일반적으로 약 20% 미만의 비-효소 단백질 또는 10% 미만의 비-효소 단백질 또는 약 5% 미만의 비-효소 단백질을 가진 효소 단백질의 제제를 포함한다. 효소 단백질이 재조합적으로 제조된 경우, 이는 또한 배양 배지로부터 실질적으로 유리되어 있는데, 즉 배양 배지는 약 20%, 10% 또는 5% 미만의 부피의 효소 단백질 제제를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 화학물 전구체 또는 기타 화학물이 실질적으로 없음은, 단백질의 합성에 수반되는 화학물 전구체 또는 기타 화학물로부터 단백질이 분리된 효소 단백질의 제제를 포함한다. 상기 용어는 약 30% (건중량) 20%, 10%, 5% 미만 또는 그 미만의 화학물 전구체 또는 비-효소 화학물 또는 성분들을 가진 효소 단백질의 제제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 예를 들어 합성 핵산 분자 또는 합성 유전자 또는 합성 펩티드에서 언급되는 합성은, 재조합 방법 및/또는 화학 합성 방법으로 제조된 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 발현 벡터는 해당 DNA 절편의 발현을 수행할 수 있는 프로모터 영역과 같은 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 DNA 를 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 상기 추가적인 분절은 프로모터 및 종결 서열을 포함할 수 있고, 임의로는 하나 이상의 복제 기원, 하나 이상의 선별가능한 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 시그널 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA 로부터 유도되거나, 또는 이들 두가지의 구성원을 포함할 수도 있다. 따라서, 발현 벡터는 적당한 숙주 세포에 도입시 클로닝된 DNA 의 발현을 제공하는, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 기타 벡터와 같은 재조합 DNA 또는 RNA 구축물을 지칭한다. 적당한 발현 벡터는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 진핵 세포 및/또는 원핵 세포에서 복제가능한 것들 및 에피좀으로 남아있는 것들 또는 숙주 세포 게놈으로 통합하는 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터는 또한 "바이러스 벡터" 또는 "바이러스성 벡터" 를 포함한다. 바이러스성 벡터는 외인성 유전자를 세포에 (비히클로서 또는 셔틀로서) 전달하기 위해 외인성 유전자에 작동가능하게 연결되어 있는 조작된 바이러스이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 평가는 시료 내에 존재하는 프로테아제 또는 그의 도메인의 활성에 대한 절대적인 값을 수득하고, 또한 활성 수준의 지수, 비율, 백분율, 시각적 또는 기타의 표시값을 수득한다는 맥락에서의 정량적 및 정성적 측정을 포함한다. 평가는 직접적 또는 간접적일 수 있고, 실질적으로 검출되는 화학종들이 물론 단백질 가수분해 생성물 자체일 필요는 없고, 예를 들어 그의 유도체 또는 일부 추가 물질일 수 있다. 예를 들어, 보체 단백질의 절단 생성물의, 예컨대 SDS-PAGE 및 쿠마씨 블루를 이용한 단백질 염색에 의한 검출.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물은 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액, 액제, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 키트는 임의로는 기타 구성품, 예컨대 추가적인 시약 및 조합물 또는 그의 구성품의 이용에 대한 사용설명서를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "질환 또는 장애" 는, 이에 제한되지 않으나, 감염, 후천적 상태, 유전적 상태를 포함하는 원인 또는 상태에 기인하며, 식별가능한 징후를 특징으로 하는 유기체 내 병리학적 상태를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환 또는 상태에 처한 대상체를 "치료" 한다는 것은, 대상체의 징후를 부분적으로 또는 전체적으로 완화시키거나, 또는 치료 후 정체되도록 한다는 것을 의미한다. 따라서, 치료는 예방, 요법 및/또는 치유를 포함한다. 예방은 잠재적인 질환의 예방 및/또는 질환의 징후 악화 또는 진행의 예방을 지칭한다. 치료는 또한 본원에 제공되는 변형된 히알루로니다아제 및 조성물의 임의의 약제학적 용도를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 약제학적 유효한 제제(agent)는, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 마취제, 혈관 수축제, 분산제, 저분자 약물 및 치료 단백질을 포함하는 통상적인 치료 약물을 포함하는 임의의 치료제 또는 생물활성 제제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료는 상태, 장애 또는 질환 또는 기타 적응증의 징후가 개선되거나 또는 그렇지 않으면 이득이 되도록 변경되는 임의의 방식을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 환자는 인간 대상체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 유효량은 질환 또는 장애의 징후를 예방, 치유, 개선, 정지 또는 부분적으로 정지하기 위해 필요한 치료제의 양이다.
본원에 사용된 바와 같이, 동물은 임의의 동물, 예컨대 이에 제한되지 않지만, 인간, 고릴라 및 원숭이를 포함하는 영장류; 마우스 및 래트와 같은 설치류; 닭과 같은 가금류; 염소, 소, 사슴, 양과 같은 반추동물; 돼지와 같은 양류 등을 포함한다. 비-인간 동물은 인간을 고려 동물에서 배제한다. 본원에서 제공하는 히알루로니다아제는 임의의 공급원, 동물, 식물, 원핵생물 및 균류 유래일 수 있다. 대부분의 효소는 포유류 기원을 포함하는 동물 기원의 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 대조군은, 시험 파라미터로 처리하지 않거나, 또는 혈장 시료인 경우, 관심대상의 상태에 영향을 받지 않은 정상 자원자 유래인 것을 제외하고는, 시험 시료와 실질적으로 동일한 시료를 지칭한다. 대조군은 또한 내부 대조군일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태의 대표 단수는 문맥상 달리 표현되지 않으면 복수의 대상체까지도 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포외 도메인" 을 포함하는 화합물을 언급하는 것은 하나 이상의 복수의 세포외 도메인들을 가진 화합물들도 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정값 또는 범위로서 표현될 수 있다. 약은 또한 정확한 양까지도 포함한다. 따라서, "약 5 mM" 은 "약 5 mM" 및 또한 "5 mM" 까지도 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 임의의 보호기, 아미노산 및 기타 화합물에 대한 약어는, 달리 표시되지 않는 한, 그의 범용되는 용례, 인식되는 약어 또는 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (참고, (1972) Biochem. 11:1726) 에 따른 것이다.
B. 개관
예를 들어 가용성 rHuPH20 와 같은 가용성 인간 PH20 (sHuPH20) 을 포함하는 가용성 인간 히알루로니다아제와 같은 가용성 히알루로니다아제의 대규모 제조 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 전형적으로는 가용성 히알루로니다아제를 생산하는 세포, 예컨대 CHO 세포 (예를 들어, DG44 CHO 세포) 를 배양하기 위한 생물 반응 장치를 이용한다. 상기 세포의 예시는 2B2 세포로, 이는 가용성 rHuPH20 를 생산한다. 생물 반응 장치 내 세포 배양물의 부피는 1 L 내지 5000 L 또는 그 이상이나, 전형적으로는 약 또는 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 또는 3500 리터이다. 생물 반응 장치의 접종에 앞서, 생물 반응 장치의 시딩을 위해 필요한 세포 수를 만들기 위하여 세포 배양물 부피의 일련의 증가를 통해 세포를 증량시킨다. 전형적으로는, 생물 반응 장치 내 세포 배양물은 105 내지 106 세포/mL 로 시딩하나, 그보다 더 많이 또는 더 적게 시딩할 수 있다. 이어서, 세포는 생물 반응 장치에서 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 일 동안 또는 더 오래 인큐베이션한다.
상기 인큐베이션 동안, 피드 배지를 세포 배양물에 첨가하여 추가적인 영양분 및 보충물을 공급한다. 피드 배지에 포함될 수 있는 예시 보충물 또는 영양ㅂ분, 이에 제한되지 않으나, 글루코오스, 글루타민 또는 글루타민-대체물, 예컨대 L-알라닐-L-글루타민, 인슐린, 및 나트륨 부티레이트를 포함한다. 첨가되는 보충물의 유형 및 양은 세포 성장 및 단백질 생산에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 인슐린 및 글루타민 또는 글루타민-치환물은 세포 배양물에 첨가되는 제 1 피드 배지에 혼입되어 세포 성장 및 정점 세포 밀도를 증가시킬 수 있다. 후속 피드 배지는 세포 성장보다는 단백질 생산을 촉진하도록 고안될 수 있다. 인슐린같은 보충물은 배제되거나 또는 감량할 수 있고, 글루타민 또는 글루타민-치환물, 예컨대 L-알라닐-L-글루타민도 마찬가지일 수 있다. 대조적으로, 단백질 합성을 증강시키는 효모 추출물과 같은 보충물은 증량시킬 수 있다. 추가로, 세포 주기 정지를 강화하여 단백질 생산을 증가시키는 보충물도 또한 포함시킬 수 있다. 상기 보충물의 예시는 나트륨 부티레이트이다.
생물 반응 장치에서의 단백질 제조에 후속하여, 세포를 수확하고, 세포 배양 배지로 분비되었을 가용성 히알루로니다아제, 예컨대 가용성 rHuPH20 를 농축한 후, 정제 프로세스를 개시한다. 이어서, 가용성 히알루로니다아제를 일련의 정제 단계를 이용하여 농축한 단백질 용액으로부터 정제한다. 본원에서의 방법에 이용되는 정제 방법의 예시는 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피의 조합이다. 이어서, 정제된 단백질은 농축하고 정용여과 (diafilter) 한다.
본원에 기재된 방법을 이용하여, 100 L 의 세포 배양물 당 약 0.5 내지 50 g 의 가용성 히알루로니다아제, 예컨대 가용성 rHuPH20 가 제조된다. 일부 구현예에서, 100 L 의 배양물 당 제조되는 가용성 rHuPH20 의 양은 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 또는 40 g 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, 정제 후 가용성 히알루로니다아제의 수율은 정제 전 생산량의 약 또는 10% 내지 50% 의 범위일 수 있다. 예를 들어, 정제 후 수율은 정제 전 제조된 양의 약 또는 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 일 수 있다. 일반적으로, 본원의 방법을 이용하여 제조된 가용성 rHuPH20 의 비활성은 적어도 약 또는 80000, 100000, 120000, 140000, 160000 또는 180,000 유닛/mg 이다.
C. 히알루로니다아제
히알루로니다아제는 히알루론산 (히알루로난 또는 히알루로네이트로 공지되어 있기도 함) 을 분해하는 효소들의 패밀리로, 세포외 기질의 핵심적인 성분이며, 간극 장벽의 주된 구성원이다. 히알루론산의 가수분해를 촉매함으로써, 히알루로니다아제는 히알루론산의 점도를 낮추고, 그로써 조직 투과성을 증가시킨다. 이와 같이, 히알루로니다아제는, 예를 들어 다른 제제(agent), 약물들 및 단백질들과 함께 전착제 또는 분산제로서 사용되어 그의 분산성 및 전달성을 증강시킨다.
1. 히알루로니다아제의 구조 및 기능
히알루로니다아제의 세가지 일반적 클래스가 있다; 포유류 히알루로니다아제, 박테리아 히알루로니다아제, 및 거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래의 히알루로니다아제. 포유류-유형 히알루로니다아제 (EC 3.2.1.35) 는 히알루론산의 β1 → 4 글리코시드 결합을 각종 길이의 올리고당류, 예컨대 사당류 및 육당류로 가수분해하는 엔도-β-N-아세틸-헥소사미니다아제이다. 이들은 가수분해성 및 트랜스글리코시다아제 활성의 두가지를 모두 갖고 있으며, 히알루론산 및 콘드로이틴 설페이트, 예컨대 C4-S 및 C6-S 를 분해할 수 있다. 이러한 유형의 히알루로니다아제에는, 이에 제한되지 않지만, 소 유래의 히알루로니다아제 (서열번호: 10), 말벌 (서열번호: 11 및 12), 꿀벌 (서열번호: 13), 흰얼굴 호박벌 (서열번호: 14), 장수말벌 (서열번호: 15), 마우스 (서열번호: 16-18, 29), 돼지 (서열번호: 19 내지 20), 래트 (서열번호: 21 내지 23, 228), 토끼 (서열번호: 24), 양 (서열번호: 25), 오랑우탄 (서열번호: 26), 필리핀 원숭이 (서열번호: 27), 기니 피그 (서열번호: 30) 및 인간 히알루로니다아제가 포함된다.
인간 게놈에는 6 개의 히알루로니다아제-유사 유전자가 있다: HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4, HYALPl 및 PH20/SPAM1. HYALP1 은 슈도유전자 (pseudogene) 이고, HYAL3 (서열번호: 36) 은 임의의 공지된 기질에 대한 효소 활성을 보유하지 않는 것으로 나타났다. HYAL4 (서열번호: 37 에 개시된 전구체 폴리펩티드) 는 콘드로이티나아제이고, 히알루론산에 대해서는 약한 활성을 나타낸다. HYAL1 (서열번호: 34 에 개시된 전구체 폴리펩티드) 는 원형적 (prototypical) 산-활성 효소이고, PH20 (서열번호: 1 에 개시된 전구체 폴리펩티드) 는 원형적 천연-활성 효소이다. 산-활성 히알루로니다아제, 예컨대 HYAL1 및 HYAL2 (서열번호: 35 에 개시된 전구체 폴리펩티드) 는 일반적으로 중성 pH (즉, pH 7) 에서 촉매 활성이 결핍되어 있다. 예를 들어, HYAL1 은 pH 4.5 를 초과하면 시험관내에서 촉매 활성을 거의 갖지 않는다 (Frost 등 (1997) Anal Biochemistry 251: 263-269). HYAL2 는 시험관내에서 매우 낮은 비활성을 갖는 산-활성 효소이다. 히알루로니다아제-유사 효소는 또한 일반적으로 인간 HYAL2 및 인간 PH20 와 같은 글리코실포스파티딜 이노시톨 앵커를 통해 원형질막에 고정되어 있는 것 (Danilkovitch-Miagkova, 등 (2003) Proc. Natl Acad Sci USA. 100(8):4580-5), 및 인간 HYAL1 과 같은 가용성인 것 (Frost 등 (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5) 을 특징으로 한다. 간극 장벽의 주된 구성성분인 히알루론산의 가수분해를 촉매함으로써, 히알루로니다아제가 히알루론산의 점도를 낮추고, 그로써 조직 투과성을 증가시킨다. 이는 또한 항암 및 항발암 활성을 나타내는 것으로 나타났다.
일부 히알루로니다아제의 N-연결 글리코실화는 그의 촉매 활성 및 안정성을 위해 매우 중요할 수 있다. 글리칸의 유형을 변경시키면서, 당단백질을 수식하는 것은 단백질의 항원성, 구조적 폴딩, 가용성 및 안정성에 대한 극적인 영향력을 가질 수 있지만, 수많은 효소들이 최적의 효소 활성을 위한 글리코실화를 필요로 하는 것으로 생각되지 않는다. 따라서, 히알루로니다아제는 그러한 면에 있어서 특이한 것으로, N-연결 글리코실화의 제거가 히알루로니다아제 활성의 거의 완전한 불활성화를 초래할 수 있다. 그러한 히알루로니다아제에 대해, N-연결 글리칸의 존재는 활성 효소의 생성에 중요하다.
서열번호: 1 로 예시된 인간 PH2O 의 7 개의 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위 N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 가 있다. 이황화결합의 시스테인 잔기 C60 및 C351 사이, 및 C224 및 C238 사이에 형성되어 코어 히알루로니다아제 도메인을 형성하게 된다. 그러나, 추가적인 시스테인이 중성 효소 촉매 활성을 위한 카르복시 말단에 필요하며, 따라서 서열번호: 1 의 아미노산 36 내지 464 가, 최소 활성 인간 PH20 히알루로니다아제 도메인을 포함한다. 따라서, N-연결 글리코실화 부위 N490 는 적절한 히알루로니다아제 활성에 필요하지 않다.
N-연결 올리고당류에는 몇가지 주된 타입 (올리고만노오스, 복합체, 하이브리드, 설페이트화) 이 있는데, 이들은 모두 -Asn-Xaa-Thr/Ser- 서열 (여기서, Xaa 는 Pro 가 아님) 내에 있는 Asn 잔기의 아미드 질소를 통해 결합된 (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc-코어를 갖는다. -Asn-Xaa-Cys-부위에서의 글리코실화는 응고 단백질 C 에 대해 보고된 바 있다. 일부의 경우, 히알루로니다아제는 N-글리코시드 및 O-글리코시드 결합의 두가지를 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, rHuPH20 (본원에 기재된 방법에서 제조됨) 은 O-연결 올리고당류 뿐만 아니라 N-연결 올리고당류를 갖는다.
본원에 기재된 방법은 인간 PH20 히알루로니다아제 제제의 대량의 가용성 제제의 제조 및 정제 방법을 제공한다.
2. PH20
상기 기재한 바와 같이, 인간 PH20 (정자 표면 단백질 PH20 로도 공지됨) 은, 일반적으로 글리코실포스파티딜 이노시톨 (GPI) 앵커를 통해 원형질막에 고정되는 원형적 중성-활성 효소이다. 이는 본래 정자-난자 결합에 관여하고, 히알루론산 소화에 의해 난구 세포층의 정자에 의한 침투를 보조한다. PH20 mRNA 전사물은 일반적으로 번역되어 N-말단 (아미노산 잔기 위치 1 내지 35) 에 35 개의 아미노산 시그널 서열을 포함하는 509 개의 아미노산 전구체 단백질을 생성한다. 따라서, 성숙형 PH20 폴리펩티드는 서열번호: 2 에 개시된 아미노산 서열을 가지는 474 개의 아미노산 폴리펩티드이다.
인간 PH20의 가용성 형태 (sHuPH20)는 본원에 기재된 방법을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. sHuPH20 의 생성은 관련 U.S.특허 출원 제 10/795,095 호, 제 11/065,716 호 및 제 11/238,171 호 (상기 출원에서는 sHASEGP 또는 rHuPH20 로써 언급), 및 하기의 실시예 1 및 4 에 기재되어 있다. 가용성 형태들은 GPI-결합 부위가 결핍되어 있는 성숙형 PH2O 폴리펩티드의 C-말단 절단물들을 인코딩하는 핵산 발현으로 제조된다. 인간 PH20 의 가용성 형태들은 가용성 rHuPH20 를 포함하는데, 이는 본원에 기재된 방법을 이용하여 제조 및 정제된다.
3. 히알루로니다아제의 치료 용도
각종 형태의 히알루로니다아제들이 인간에서의 치료 용도를 위해 제조되었고 승인되었다. 예를 들어, 동물-유래의 히알루로니다아제 제제는, Vitrase® (ISTA Pharmaceuticals) 인 정제된 양 고환 히알루로니다아제, 및 Amphadase® (Amphastar Pharmaceuticals) 인 소 고환 히알루로니다아제를 포함한다. Hylenex® (Halozyme Therapeutics) 는 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 조작된 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에 의해 제조되는 인간 재조합 히알루로니다아제이다. 히알루로니다아제에 대해 승인된 치료 용도는 피하주입 (피하 액체 투여)을 위한, 다른 주사되는 약물의 흡수 및 분산 증대를 위한 아쥬반트로서의 용도, 및 방사선불투과성 약제의 재흡수 개선을 위한 피하 요로조영술에서의 아쥬반트로서의 용도를 포함한다. 상기 적응증에 추가하여, sHuPH20 를 포함하는 히알루로니다아제는 추가적인 질환 및 상태의 치료를 위한 치료제 또는 화장용 제제로서 이용될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 히알루로니다아제는 결합 조직 및 탯줄 및 유리체액과 같은 특정한 특화된 조직의 세포간 기저에서 발견되는 히알루론산, 다당류의 가수분해를 통해 결합 조직의 투과성을 변형하는 전착 또는 확산 물질이다. 전착 인자가 존재하지 않는 경우, 약물, 단백질, 펩티드 및 핵산과 같은 피하 주입된 물질들은 매우 느리게 전착(spreading)된다. 그러나, 히알루로니다아제와의 공동주입은 신속한 전착을 제공할 수 있다. 확산 속도는 효소의 양과 비례하고, 확산 정도는 용액의 부피와 비례한다. 주입된 약물 및 약제의 흡수 및 분산은 10 내지 1000 유닛의 히알루로니다아제를 주입 용액에 첨가함으로써 증강될 수 있다. 일부의 경우 150 U 히알루로니다아제를 첨가한다. 히알루로니다아제는 전착제로서의 그의 용도를 포함하고 그에 더해 다중적인 용도를 갖는다. 히알루로니다아제는, 예를 들어 안과 수술 전 국소 마취에서 눈둘레 차단을 위해 통상적으로 이용된다. 효소의 존재로 인해 추가적인 차단에 대한 필요를 막고, 무운동 (akinesia; 운동성 상실) 안착 시간을 가속시킨다. 눈둘레 및 테논낭하 (sub-Tenon) 의 차단은 안과적 과정을 위한 히알루로니다아제의 가장 범용되는 적용이다. 히알루로니다아제는 또한 눈꺼풀수술 및 안판 리프팅과 같은 성형수술에서의 무운동을 촉진할 수 있다. 히알루로니다아제에 대한 예시적 치료 및 화장 용도는 하기에 기재한다.
a. 전착제로서의 용도
본원에 기재된 방법을 이용하여 제조되는 히알루로니다아제, 예컨대 가용성 rHuPH20 는 생체내 임의의 각종 포유류 조직에 약제 및 분자들의 전달을 촉진 또는 증강하기 위해 이용될 수 있다. 이는 확산을 촉진하기 위해 이용되어, 저분자 약리학적 제제 뿐만 아니라 더큰 분자 약리학적 제제, 예컨대 단백질, 핵산 및 리보핵산, 및 이에 제한되지 않으나 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 지질계 분자 및 약물을 포함하는 성분들의 조합을 포함할 수 있는 거대분자 조성물의 전달을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 직경이 약 10 nm 내지 약 500 nm 인 분자 및 거대분자 복합체는, 간극 공간을 사전에 또는 동시에 히알루로니다아제에 노출되는 경우, 간극 공간을 통한 전달에 있어서 극적인 개선을 나타낼 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 U.S.특허 출원 제 10/795,095 호, 제 11/065,716 호 및 제 11/238,171 호).
히알루로니다아제와 투여될 수 있는 약제학적, 치료적 및 화장용 제제 및 분자의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 마취제; 대사길항물질, 항종양제 및 기타 항암제; 항바이러스제; 항박테리아제 및 기타 항생제, 항진균제 및 기타 항감염제를 포함하는 항감염제; 면역조정제; 스테로이드성 및 비-스테로이드성 항염증제; 베타 차단제; 교감신경유사약물; 듀코사노이드, 프로스타글란딘 및 프로스타글란딘 유사체; 축동제, 콜린성 및 항-콜린에스테라아제; 항-알레르겐 및 충혈제거제; 호르몬제; 성장 인자; 면역억제제; 백신 및 독소; 면역 혈청; 항체; 및 이들의 임의의 조합이 포함된다. 한 구현예에서, 가용성 rHuPH20 는 카텝신 L 과 같은 카텝신과 함께 투여된다.
b. 피하주입( hypodermoclysis )에서의 용도
피부의 피하조직에 대한 액체 및 전해질의 주입인 피하주입은, 약간 내지 중간 정도로 탈수된 성인 환자, 특히 노인에게 적합한 유용하고 단순한 수분공급 기법이다. 안전하고 유효한 것으로 간주됨에도 불구하고, 가장 빈번한 부작용은 국소 마사지 또는 전신 이뇨로 치료될 수 있는 약한 피하 부종이다. 2 개의 별개 부위에서 24 시간 내에 약 3 L 가 공급될 수 있다. 통상적인 주입 부위에는 흉부, 복부, 대퇴부 및 상완이 포함된다. 피하주입에 이용되는 용액에는, 예를 들어, 노르말 식염수, 하프-노르말 식염수, 식염수가 있는 글루코오스 및 5% 글루코오스가 포함된다. 염화칼륨이 또한 용액에 첨가될 수 있다. 용액에 대한 히알루로니다아제의 첨가는 액체 흡수를 증강시킬 수 있고, 전반적인 투여율을 증대시킬 수 있다.
c. 유리체절제술 및 안과 장애 및 상태에서의 용도
히알루로니다아제는 유리체절제술 동안 망막의 박리 또는 인열을 최소화하기 위해 이용될 수 있다. 이는, 예를 들어 유리체의 제거에 앞서 유리체가 망막으로부터 이탈되거나 또는 "건부착부파열(disinserted)" 되는 것을 야기할 수 있다. 유리체의 그러한 건부착부 파열 또는 이탈은 유리체가 제거될 때 망막의 추가적인 박리 또는 인열이 일어날 수 있는 가능성을 최소화한다.
히알루로니다아제는 U.S.특허 제 5,292,509 호에 기재된 유리체절제술 부속 적용을 포함하는 각종 안과적 적용에 이용될 수 있다. 예를 들어 본원에 기재된 방법으로 제조 및 정제된 가용성 rHuPH20 와 같은 고도의 정제된 히알루로니다아제의 이용은 면역원성 및 독성을 최소화하는 안내 수술을 위해 바람직하다. 일부 구현예에서, 페길화된 히알루로니다아제는 유리체내 체류성을 연장시키고 국소적 흡수를 방지하기 위해 이용될 수 있다.
히알루로니다아제는, 예를 들어 신생혈관생성을 방지하고 유리체로부터의 망막에 독성인 물질들의 제거율을 증가시킴으로써 안과 장애를 치료 및/또는 예방하기 위해 이용될 수 있다. 히알루로니다아제는 눈에 독성 손상을 야기하지 않으면서 눈의 유리체액을 액화시키기에 유효한 양으로 투여될 수 있다. 유리체액의 액화는 초자체로부터의 액체 교환율을 증대시킨다. 이러한 교환 증대는 안과적 및 망막 손상을 초래할 수 있는 오염 물질들을 제거한다.
히알루로니다아제는 또한 수술후 안압 감소에 이용될 수 있다. 히알루론산은 백내장 및 안구내 렌즈 외과 수술 동안 안구에 주로 스페이서로서 이용되어 왔다. 이는 또한 녹내장, 유리체 및 망막 수술 및 각막 이식에서와 같은 기타 안 외과적 수술에서 이용된다. 백내장 수술후 환자에게서 흔한 부작용은 현저하게 빠른, 종종 지속적인 안압 상승이다. 그러한 상태는 종종, 특히 녹내장성 시신경 원판 변화가 있는 환자에게 심각하다. 수술후 안압을 감소시키기 위해 수술에 앞서 눈에 히알루론산과 함께 히알루로니다아제를 공동투여할 수 있다. 히알루로니다아제는 수술 동안에는 그의 유효성을 감소시키거나 환자에게서 부작용을 일으키지 않으면서, 히알루론산을 파괴하여 안압을 수술전 수준으로 감소시키기에 유효한 양으로 투여된다 (U.S.특허 제 6,745,776 호).
히알루로니다아제는 또한 잔기둥 그물로부터 글리코사미노글리칸을 제거하고, 안압을 감소시키기 위해 녹내장이 있는 환자에게 투여될 수 있고, 유리체에 적용하여 당뇨 망막병증, 망막의 신생혈관증량, 망막의 정맥폐쇄, 후 유리체 박리, 망막의 인열, 눈의 외상 등과 같은 상태와 연계하여 일어날 수 있는 유리체 출혈 소실 (즉, 혈액의 유리체로의 혈관외유출) 을 촉진할 수 있다. 일반적으로 분해되기에는 느린 유리체 출혈의 존재로 인해, 종종 증량성 당뇨 망막병증과 같은 상태에 대한 1 차적인 치료법인 레이저 광응고술 등과 같은 진단 및/또는 치료 수술을 위해 망막이 유리체를 통해 가시화되어야 하는 수술이 지연되거나, 번잡하게 되거나 또는 방해받게 된다.
d. 유전자 요법에서의 용도
생체내 대부분의 유전자 전달 비히클의 효능은 시험관내에서 관찰되는 효능에 대응하지 않는다. 글리코사미노글리칸은 DNA 및 바이러스 벡터의 많은 세포 유형으로의 이동 및 확산을 방해할 수 있다. 그러한 세포외 매트릭스 물질의 수준은 해당 프로세스를 심각하게 방해할 수 있다. 히알루로니다아제의 투여는 세포외 기질 내 채널을 열어줄 수 있어, 유전자 요법의 전달을 증강시킨다. 예를 들어, 히알루로니다아제는 콜라게나아제와 함께 투여되어 생체내 DNA 의 형질도입을 촉진시킬 수 있다 (Dubensky 등 (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81(23):7529-33). 히알루로니다아제는 또한 아데노-연관 바이러스를 이용하는 유전자 요법을 강화할 수 있다 (Favre 등 (2000) Gene Therapy 7(16): 1417-20). 히알루로니다아제의 투여 후 열리는 채널은 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 및 DNA 복합체와 같은 더 작은 분자들 (및 기타 관심대상의 치료제 및 약학적 제) 의 확산을 일반적으로 강화하는 크기이다. 그러나, 세포의 이탈 및 이동을 촉진할 만큼 포어 (pore) 가 큰 것은 아니다.
일부 예에서, 바이러스는 표적 조직 내에서의 그의 복제 및 전착을 촉진하기 위해 히알루로니다아제를 발현하도록 조작될 수 있다. 표적 조직은, 예를 들어 암 조직일 수 있어, 바이러스는 종양 내에서의 선별적인 복제가 가능하다. 바이러스는 또한 조직 특이적 프로모터 하에 선별적으로 복제하는 비-용균성 바이러스일 수 있다. 바이러스가 복제하면, 바이러스 유전자와 히알루로니다아제의 공동발현이 생체내 바이러스의 전착을 촉진할 수 있다.
e. 화장 용도
히알루로니다아제는 셀룰라이트의 축적에 수반되는 글리코사미노글리칸을 제거하고 림프계 흐름을 촉진하기 위해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 가용성 rHuPH20 와 같은 인간 히알루로니다아제는 셀룰라이트의 치료에 이용된다. 히알루로니다아제는 반복적인 피하 주사를 통해, 연고 또는 크림의 형태의 경피 전달을 통해, 또는 주입가능한 서방성 제형물의 이용을 통해 투여하여 글리코사미노글리칸의 연속적인 분해를 촉진하고 그의 회귀를 예방할 수 있다.
히알루로니다아제는 또한 "돼지피부" 부종 또는 "귤껍질" 부종과 같은 상태의 치료에 이용될 수 있다. 히알루로니다아제는, 진피 내에 축적될 수 있고, 결합된 물의 체류 및 모세관 압력에 의해, 대사 폐기물을 제거하는 유기 액체의 확산 둔화에 원인을 제공하는 장쇄 점액다당류의 분해를 수행할 수 있다. 지방세포의 지방 과부하와 연관된 그러한 물 및 폐기물의 체류는 고전적인 "돼지피부" 부종 또는 "귤껍질" 부종을 구성한다. 분해는 점액다당류의 장쇄를 단쇄로 잘라내어, 결합된 물 및 폐기물의 제거 및 정맥 및 림프계 순환의 회복을 제공하여, 궁극적으로 국소 부종을 소실시킨다.
f. 장기 이식에서의 용도
장기에서의 히알루론산의 함량은 염증과 함께 증가할 수 있다. 증가된 히알루론산 농도는 폐포염 (Nettelbladt 등 (1991) Am. Rev. Resp. Dis. 139: 759-762) 및 심근경색증 (Waldenstrom 등 (1991) J. Clin. Invest. 88(5): 1622-1628) 과 같은 염증-면역학적 손상을 특징으로 하는 상이한 장기 유래의 조직에서 관찰된다. 기타 예시는 신장 (Ha'llgren 등 (1990) J. Exp. Med. 171 : 2063-2076; Wells 등 (1990) Transplantation 50: 240-243), 소장 (Wallander 등 (1993) Transplant. Int. 6: 133-137) 또는 심장 (Haellgren 등 (1990) J Clin Invest 185:668-673) 이식 후 동종이식 거부; 또는 바이러스 기원의 심근염 (Waldenstrdm 등 (1993) Eur. J. Clin. Invest. 23: 277-282) 을 포함한다. 장기 이식과 연계된 간극 부종의 발생은 이식외과 분야에서 심각한 문제가 되고 있다. 간극 부종이 있는 이식편은 기능이 일시적으로 소실될 정도로 부어오를 수 있다. 일부의 경우, 부종은 신장의 파괴를 초래하여, 대량 출혈을 야기할 수 있다. 히알루로니다아제는 장기 이식에서의 축적된 글리코사미노글리칸을 분해하기 위해 이용될 수 있다. 상기 글리코사미노글리칸의 제거는 이식편으로부터의 물의 제거를 촉진하여, 장기 기능을 증강시킨다.
g. 암 치료에서의 용도
히알루로니다아제는 직접적인 항암 효과를 갖는다. 히알루로니다아제는 마우스에 이식된 종양의 성장을 방지하고 (De Maeyer 등, (1992) Int. J. Cancer 51 :657-660), 발암물질에 노출시 종양 형성을 억제한다 (Pawlowski 등 (1979) Int. J. Cancer 23:105-109). 히알루로니다아제는 뇌암 (신경아교종) 의 치료에서 단독적인 치료제로서 유효하다 (WO 198802261). 이러한 효과에 더하여, 히알루로니다아제는 또한 고형 종양 내로 화학치료제의 침투를 증강시키기 위해 이용될 수 있다. 이들은 항암제와 함께 종양내로 또는 파종성 암 또는 도달하기 힘든 종양에 대해 정맥 내로 투여될 수 있다. 항암제는 화학치료제, 항체, 펩티드 또는 유전자 치료 벡터, 바이러스 또는 DNA 일 수 있다. 추가적으로, 히알루로니다아제는 후천적인 다발성 약물 내성이 있는, 이전의 화학치료로는 난치성인 종양에서의 감작을 위한 싸이클링 풀 (cycling pool) 내로의 종양 세포의 인도에 이용될 수 있다 (St Croix 등, (1998) Cancer Lett September 131(1): 35-44). 예를 들어, 가용성 rHuPH20 와 같은 히알루로니다아제는 또한 모노클로날 항체, 싸이토카인 및 기타 약물과 같은 생물학적 제제의 글리코사미노글리칸을 축적하는 종양으로의 전달을 증강시킬 수 있다.
히알루로니다아제는 또한 통상적인 화학요법에는 내성이 있는 종양의 감작성 증가에 이용될 수 있다. 예를 들어, 가용성 rHuPH20 와 같은 히알루로니다아제는, HYAL1 결함과 연관된 종양이 있는 환자에게 종양 주변의 확산 (예를 들어, 종양 부위 및 그 주변에서의 화학치료제의 순환 및/또는 농축을 촉진하기 위하여)을 증가시키기에 유효한 양으로 투여해, 예컨대 히알루론산 분해에 의해 종양 세포 운동성을 저해하고/하거나 종양 세포 아폽토시스 역치를 낮출 수 있다. 이는 종양 세포(들)로 하여금 아노이키스 (anoikis) 의 상태로 되도록 하여, 종양 세포가 화학치료제의 작용에 더 많이 반응하게 만들 수 있다. 히알루로니다아제의 투여는 췌장, 위장, 대장, 난소 및 유방의 사전 화학치료에 내성인 종양의 응답성을 이끌어낼 수 있다 (Baumgartner 등 (1988) Reg. Cancer Treat. 1 :55-58; Zanker 등 (1986) Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 27:390).
한 구현예에서, 히알루로니다아제는 비-암 세포와 비교하여 감소된 내재적 히알루로니다아제 활성을 가지는 것을 포함하는, 전이성 및 비-전이성 암 치료에 이용된다. 히알루로니다아제는 화학치료제로서 단독으로 또는 기타 화학치료제와 병용하여 사용될 수 있다. 예시 암에는, 이에 제한되지 않으나, 소세포 폐암, 편평세포폐암, 및 유방, 난소, 두경부의 암, 또는 감소된 수준의 히알루로니다아제 활성 또는 감소된 히알루론산 이화와 연관된 임의의 기타 암이 포함된다.
h. 뇌에서의 글리코사미노글리산 축적의 치료에서의 용도
히알루론산 수준은 많은 뇌척수 병리 상태에서 상승된다. 뇌척수 히알루론산의 수준은 정상적으로는 성인에서 200 ㎍/L 미만이나 (Laurent 등 (1996) Acta Neurol Scand September 94(3): 194-206), 수막염, 척추관협착증, 두부 손상 및 뇌경색증과 같은 질환에서는 8000 ㎍/L 를 초과하는 수준으로 상승될 수 있다. 예를 들어 가용성 rHuPH20 와 같은 히알루로니다아제는 확연하게 상승된 수준의 기질을 분해하기 위해 이용될 수 있다.
뇌에서의 유효 림프관의 부족은 또한 두부 외상에 후속해 수명을 위협하는 부종을 유도할 수 있다. 히알루론산 축적은 히알루론산 합성효소에 의한 합성 증가 및 분해 감소의 결과이다. 히알루론산의 축적은 백혈구 일혈을 촉진하기 위해 손상된 조직에서의 물 함량 증가의 유리한 목적으로 초기에 제공되지만, 계속적인 축적은 사망에 이르게 할 수 있다. 두부 외상으로 고생하는 환자에 대한 경막내 또는 정맥내 투여와 같은 히알루로니다아제의 투여가, 조직 히알루론산 축적 및 그와 연관된 물을 제거하기 위해 제공될 수 있다.
히알루로니다아제는 또한 뇌 종양, 특히 다형성아교모세포종과 연관된 부종의 치료에 이용될 수 있다. 뇌 종양과 연관된 부종은 종양 부근의 뇌의 비-암 부분에서의 히알루론산의 축적에 기인한다. 히알루론산 축적 부위에 대한 히알루로니다아제의 (예를 들어, 정맥내 주사 또는 션트를 통한) 투여는 해당 부위에서의 과량의 히알루론산을 분해시켜 상기 악성종양과 연계된 부종을 경감시킬 수 있다.
i. 심혈관 질환에서의 글리코사미노글리칸 축적 치료에서의 용도
히알루로니다아제는 일부 심혈관 질환 치료에 이용될 수 있다. 실험적인 심근 경색증에 후속한 동물 모델에서의 히알루로니다아제의 투여는 경색 크기를 줄일 수 있다 (Maclean, 등 (1976) Science 194(4261): 199-200). 이것이 발생할 수 있는 한가지 제안된 메커니즘은, 허혈 재관류에 후속하여 일어나는 히알루론산 축적의 감소로 인한 것이다. 경색 크기의 감소는 증가된 림프 배출 및 증가된 조직 산소 첨가 및 심근 함수량의 감소에 기인하는 것으로 여겨진다.
히알루로니다아제는 또한 동맥경화증으로 인한 심장 플라크를 제한하기 위해 이용될 수 있다. 상기 플라크는 글리코사미노글리칸을 축적시키고, 마크로파지 및 발포 세포 결합을 중재한다 (Kolodgie 등 (2002) Arterioscler Thromb Vase Biol. 22(10): 1642-8).
j. 폐 질환에서의 용도
정상적인 개인에서의 기관지폐포 세척액 (BAL) 중의 히알루론산의 수준은 일반적으로 15 ng/ml 미만이다. 그러나, 호흡곤란 상태에서는 BAL 중 히알루론산 수준이 극적으로 증가한다 (Bjermer 등 (1987) Br Med J (Clin Res Ed) 295(6602):803-6). 폐내 증가된 히알루론산은 산소 확산 및 기체 교환 뿐만 아니라 중성구 및 마크로파지 응답성 활성화를 방해할 수 있다. 본원에 기재된 방법을 이용해 제조되는 것과 같은 정제된 가용성 rHuPH20 제제는, 그러한 상태를 나타내는 환자에게 폐 또는 정맥내 전달로 전달되어 히알루로난 수준을 감소시킬 수 있다. 히알루로니다아제는 또한 상승된 글리코사미노글리칸과 연계된 기타 폐 합병증으로 고생하는 환자에게 또는 폐에 대한 기타 공동전달할 분자의 전달 증강을 위해 투여할 수 있다.
k. 기타 용도
그의 치료 용도의 추가 예시에서, 히알루로니다아제는 빈카 알칼로이드(vinka alkaloids)와 같은 괴사성 물질의 정맥옆 (paravenous) 주입으로 인한 국소적 괴사에 대한 해독제로서의 목적으로 (Few 등 (1987) Amer. J. Matern. Child Nurs. 12, 23-26), 결절 낭종의 치료에서 (Paul 등 (1997) J Hand Surg. 22 (2): 219 - 21) 및 정맥 부전증으로 인한 조직 괴사 치료에서 (Elder 등 (1980) Lancet 648-649) 와 같은 목적을 위해 이용될 수 있다. 히알루로니다아제는 또한 가장 흔한 손의 연조직 덩어리이고, 피부 아래에서 느껴질 수 있는 체액 충전낭인 결절 낭종 (이는 손목 낭종, 바이블 낭종 (Bible cyst) 또는 후방 힘줄 낭종으로도 공지되어 있음) 의 치료에 이용될 수 있다.
히알루로니다아제는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (CSPG) 의 분해에 의한 척수 손상의 치료에 이용될 수 있다. 척수 손상 후, CSPG 를 포함하는 신경교성 반흔은 성상세포에 의해 생겨난다. CSPG 는 액손 성장 저해에서 중요한 역할을 한다. 추가로, CSPG 의 발현은 중추신경계 (CNS) 의 손상 후에 증가하는 것으로 나타난다. 히알루로니다아제는 또한 화학핵소체용해술로 공지된 프로세스에서의 탈출추간판 치료에 이용될 수 있다. 히알루로니다아제와 유사한 기질을 절단하는 효소인 콘드로이티나아제 ABC 는, 요추 뼈에서의 간판내 압력 감소를 유도할 수 있다. 세가지 유형의 추간판 손상이 있다. 돌출된 추간판은 온전하지만 팽출된 것이다. 압출된 추간판에서는, 섬유성 겉부분이 인열되어 있고, NP 가 흘러나와 있지만, 추간판에 여전히 연결되어 있다. 격리된 추간판에서는, NP 의 절편이 추간판으로부터 느슨하게 절단되어 척추관과 유리되어 있다. 화학핵소체융해술은 일반적으로 돌출 및 압출된 추간판에서는 유효하나, 격리된 추간판 상해에 대해서는 그렇지 못하다.
D. 가용성 rHuPH20 -발현 세포
본원에 기재된 방법은 대량의 가용성 rHuPH20 의 생성 및 정제에 이용될 수 있다. 가용성 rHuPH20 은 대규모 세포 배양으로 배양하는 CHO 세포에서 발현된다. 발현은 서열번호: 3 에 개시된 아미노산의 서열 (서열번호: 1 에 개시된 전구체 인간 PH2O 폴리펩티드의 아미노산 1 내지 482 에 해당함) 을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 이용하여 수행된다. 번역 후, 35 개의 아미노산 시그널 서열이 잘리고, 가용성 rHuPH20 는 배지에 분비된다. 벡터는 또한 가용성 rHuPH20 인코딩 영역의 IRES 하류, 마우스 디히드로폴레이트 리덕타아제 유전자 및 SV40 pA 서열을 포함한다. 발현 벡터는 DG44 세포에 도입하는데, 이는 화학적으로 규정된, 동물 생성물이 없는 배지 중의 현탁 배양물에서 성장하도록 적응시킨 디히드로폴레이트 리덕타아제 결핍성 (dhfr-) 이다. 결과로서 수득한 가용성 rHuPH20-발현 세포는 하기의 실시예 1 및 4 에 기재된 것을 포함하고, 3D35M, 2B2, 3E10B, 1B3, 5C1, 1G11 및 2G10 세포로 지정된 세포를 포함한다.
기타 세포들도 rHuPH20 와 유사한 히알루로니다아제 제조에 이용될 수 있다. 일반적으로, 히알루로니다아제 상에 중요 N-연결 글리코실화 잔기의 도입에 적합한 단백질 발현 시스템이 이용된다. 상기 세포에는, 예를 들어 효모 세포, 진균 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포가 포함된다. 마우스, 래트, 인간, 원숭이, 닭 및 햄스터 세포를 포함하는 다수의 세포주들이 포유류 발현에 이용가능하다. 예시 세포주에는, 이에 제한되지 않으나, CHO (DG44 세포 및 CHO-S 세포 포함), Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NSO (비분비성) 및 기타 미엘로마 세포주, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주, 림프구, 섬유아세포, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8 및 HKB 세포가 포함된다. 세포주는 또한 세포 배양 배지 유래의 분비된 단백질의 정제를 촉진하는 무혈청 배지에 적응시킬 수도 있다.
a. 3 D35M 세포
가용성 rHuPH20-발현 세포의 예시는 하기의 실시예 1 및 U.S.특허 공보 제 20040268425 호, 제 20050260186 호 및 제 20060104968 호에 기재된 3D35M 세포이다. 3D35M 세포는 가용성 rHuPH20 를 발현하는 디히드로폴레이트 리덕타아제 결핍성 (dhfr-) DG44 CHO 세포이다. 세포는 서열번호: 50 으에 개시된 뉴클레오티드 서열을 가진 HZ24 발현 벡터로 형질전환되었다. 상기 벡터는 서열번호: 1 에 개시된 전장 인간 PH20 의 아미노산 위치 1 내지 482 에 해당하는 482 개의 아미노산 (서열번호: 3) 을 인코딩하는 핵산의 발현을 구동하는 CMV 프로모터를 포함한다. 이는 35 개의 아미노산 N-말단 시그널 서열을 포함한다. 상기 벡터는 또한 PH20-인코딩 서열 다음에 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)에 이어 마우스 디히드로폴레이트 리덕타아제 유전자 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 번역 후, 482 개의 아미노산 폴리펩티드는 35 개의 아미노산 시그널 서열을 제거하도록 가공되어, 그 결과 가용성 rHuPH20 의 분비를 제공한다.
3D35M 세포의 특징분석은, 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 핵산 영역이 약 318 카피/세포의 카피수로 세포 내에 존재한다는 것을 증명했다. 본원의 방법으로 3D35M 세포로부터 생산된 가용성 rHuPH20 은 서열번호: 4 내지 9 에 개시된 서열을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있는 종들의 혼합물이다. 상기 종들 (실시예 11 에 기재됨) 의 예시 특징분석에서, 서열번호: 4 에 개시된 종은 0.2% 의 풍부성으로, 서열번호: 5 에 개시된 종 (서열번호:4 의 아미노산 1 내지 446 에 해당함) 은 18.4% 의 풍부성으로, 서열번호: 6 에 개시된 종 (서열번호: 4 의 아미노산 1 내지 445 에 해당함) 은 11.8% 의 풍부성으로, 서열번호: 7 에 개시된 종 (서열번호: 4 의 아미노산 1 내지 444 에 해당함) 은 56.1% 의 풍부성으로; 서열번호: 8 에 개시된 종 (서열번호: 4 의 아미노산 1 내지 443 에 해당함) 은 13.6% 의 풍부성으로 존재한다. 가용성 rHuPH20 제제에서의 그러한 비균질성은 본원에 제공되는 제조 및 정제 방법 동안 존재하는 펩티다아제에 의한 C-말단 절단의 결과인 것으로 추정된다.
3D35M 세포는 메토트렉세이트의 존재 또는 부재 하에 세포 배양 배지에서 배양시킬 수 있다. 글루타민과 같은 추가적인 보충물이 또한 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 또는 2 μM 메토트렉세이트를 포함하고, 하이포크산틴 및 티미딘이 결핍되어 있는 세포 배양 배지에서 배양시킨다. 한 구현예에서, 3D35M 세포는 하이포크산틴 및 티미딘 부재, 및 100 nM 메토트렉세이트 및 글루타민 또는 글루타민 치환물, 예컨대 L-알라닐-L-글루타민, L-글루타민의 안정화된 디펩티드 형태의 존재 하에 5 내지 7% CO2 배양 배지 (예컨대, CD CHO 배지, Invitrogen) 에서 37℃ 로 배양한다. 이에 제한되지 않으나, Dulbecco's 변형된 Eagle's 배지 (DMEM), Eagle's 최소 필수 배지 (EMEM), Iscove's 변형된 Eagle's 배지 (IMEM), F12 및 RPMI 를 포함하는, CHO 세포에 적당한 기타 세포 배양 배지가 3D35M 세포 배양에 이용될 수 있다. 진탕 플라스크 내에서의 상기 조건 하에 배양하는 3D35M 세포는 과량의 1000 유닛/mL 히알루로니다아제 활성을 제공할 수 있다. 하기의 실시예 3 에 기재된 바와 같은 생물 반응 장치에서의 배양의 경우, 3D35M 세포는 2000 유닛/mL 의 과량으로 효소 활성이 있는 가용성 rHuPH20 를 제공할 수 있다.
b. 2B2 세포
본원에서 제공하는 방법에서의 rHuPH20 의 제조를 위한 가용성 rHuPH20-발현 세포의 예시는 실시예 4 에 기재되었고, 2B2 세포로 지정했다. 2B2 세포는 3D35M 세포를 더욱 높은 메토트렉세이트 수준 (즉, 20 μM) 에 적응시키고, 더 높은 메토트렉세이트 농도에서 성장하는 클론을 선별하여 생성되었다. 상기 적응은 세포에 의해 제조되는 히알루로니다아제 활성을 증가시켰다. DG44 세포는 디히드로폴레이트 리덕타아제-결핍성 (dhfr-) 이고, 따라서 뉴클레오시드를 생산할 수 없다. 3D35M 및 2B2 세포에 존재하는 발현 벡터는 PH20 유전자에 추가하여, 마우스 디히드로폴레이트 리덕타아제에 대한 코딩 서열을 포함한다. 메토트렉세이트는 강력한 경쟁적 디히드로폴레이트 리덕타아제 저해제이다. 따라서, 배양 배지 내의 메토트렉세이트의 농도를 증가시킴으로써 히알루로니다아제-발현 세포는 살아남기 위해 더 많은 마우스 디히드로폴레이트 리덕타아제를 생산하게 된다. 이는 예를 들어 유전자 증폭 또는 더욱 안정하고 생산적인 배열로의 통합된 DNA 의 재배열을 통해 수행될 수 있다. 따라서, 마우스 디히드로폴레이트 리덕타아제의 생산 증가를 강화시키는 것은 또한 sHuPH20 의 생산을 증대시키는 결과를 낳을 수 있다. 2B2 세포 및 3D35M 세포에 의해 생산되는 가용성 rHuPH20 의 효소 활성의 비교는 2B2 세포에서의 활성 (예를 들어, 하기의 실시예 5 참조) 이 3D35M 세포에 비해 일반적으로 80% 내지 100% 더 높다는 것을 증명했다.
20 μM 메토트렉세이트를 이용한 선별 후 최대의 효소 활성을 가진 가용성 rHuPH20 을 생산한 세포주로서 단리한 세포 클론들 중에서 2B2 세포를 선별했다 (예를 들어, 실시예 4 참조). 특징분석시, 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 핵산 영역은 약 206 카피/세포의 카피수로 2B2 세포에 존재하는 것으로 관찰되었다. SpeI-, XbaI- 및 BamHI/HindIII-소화 게놈 2B2 세포 DNA 의, 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 핵산 영역에 특이적인 프로브를 이용한 서던 블롯 분석은 하기의 제한효소 소화 프로파일을 밝혀냈다: SpeI 로 소화한 DNA 가 있는 ~7.7 kb 의 1 개의 주된 혼성화 밴드 및 4 개의 작은 혼성화 밴드 (~13.9, ~6.6, ~5.7 및 ~4.6 kb); XbaI 로 소화한 DNA 가 있는 ~ 5.0 kb 의 1 개의 주된 혼성화 밴드 및 2 개의 작은 혼성화 밴드 (~13.9 및 ~6.5 kb); BamH I/Hind III 로 소화한 2B2 DNA 를 이용하여 관찰되는 ~1.4 kb 의 1 개의 단일한 혼성화 밴드.
2B2 세포는 메토트렉세이트의 존재 또는 부재 하에 세포 배양 배지에서 성장시킬 수 있다. 추가적인 보충물, 예컨대 글루타민, 인슐린 및 효모 추출물을 또한 첨가할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 2 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM 또는 그 이상의 메토트렉세이트를 포함하고 하이포크산틴 및 티미딘이 결핍된 세포 배양 배지에서 성장한다. 한 구현예에서, 2B2 세포는 하이포크산틴 및 티미딘의 부재, 및 20 μM 메토트렉세이트 및 글루타민 또는 L-글루타민의 안정화된 디펩티드 형태인 L-알라닐-L-글루타민의 존재 하에 배양 배지 (예컨대, CD CHO 배지, Invitrogen) 에서 5 내지 7% CO2 중에서 37℃ 로 배양한다. 이에 제한되지 않으나, Dulbecco's 변형 Eagle's 배지 (DMEM), Eagle's 최소 필수 배지 (EMEM), Iscove's 변형 Eagle's 배지 (IMEM), Fl 2 및 RPMI 을 포함하는 CHO 세포에 적당한 기타 세포 배양 배지가 2B2 세포 배양에 이용될 수 있다. 진탕 플라스크 내에서 상기 조건 하에 성장한 2B2 세포는 3000 유닛/mL 초과의 히알루로니다아제 활성을 제공할 수 있다. 하기의 실시예 8 에 기재된 바와 같이 생물 반응 장치에서 배양하는 경우, 2B2 세포는 17000 유닛/mL 초과의 히알루로니다아제 활성의 효소 활성을 가진 가용성 rHuPH20 을 생산할 수 있다.
본원의 방법으로 2B2 세포로부터 생산되는 가용성 rHuPH20 는 서열번호: 4 내지 9 에 개시된 서열을 가진 폴리펩티드 종의 혼합물이다. 2B2 세포에 의해 생산되는 가용성 rHuPH20 생성물의 예시적인 특징분석에서 (실시예 11 에 기재됨), 서열번호: 4 에 개시된 종은 1.9% 의 풍부성으로, 서열번호: 5 에 개시된 종 (서열번호: 4 에 개시된 아미노산 1 내지 446 에 해당됨) 은 46.7% 의 풍부성으로, 서열번호: 6 에 개시된 종 (서열번호: 4 에 개시된 아미노산 1 내지 445 에 해당함) 은 16.7% 의 풍부성으로, 서열번호: 7 에 개시된 종 (서열번호: 4 에 개시된 아미노산 1 내지 444 에 해당함) 은 27.8% 의 풍부성으로; 서열번호: 8 에 개시된 종 (서열번호: 4 의 아미노산 1 내지 443 에 해당함) 은 6.9% 의 풍부성으로 존재한다. 3D35M 세포로부터 생산된 가용성 rHuPH20 에 대해 언급한 바와 같이, 2B2 세포 유래의 가용성 rHuPH20 제제의 비균질성은 본원에 제공되는 생산 및 정제 방법 동안 존재하는 펩티다아제의 C-말단 절단의 결과인 것으로 여겨진다.
E. 세포 배양 증량
본원에 기재된 방법은 대량의 가용성 rHuPH20 를 생산하기 위해 대용량 세포 배양물을 배양하는 생물 반응 장치를 채용한다. 하기에 상세히 기재된 바와 같이, 이들 방법은 세포 증량 단계, 단백질 생산 단계, 단백질 농축 및 완충액 교환 단계 및 정제 단계를 포함한다. 2B2 세포와 같은 가용성 rHuPH20-발현 세포는, 워킹 세포 은행 (working cell bank (WCB)) 또는 마스터 세포 은행 (master cell bank (MCB)) 으로부터의 세포의 분취물과 같은, 본래 접종원으로부터 상기 생산 단계를 위한 생물 반응 장치에서의 배양 전에 더 큰 부피로 최초 증량된다. 증량 단계에서의 최종 배양 부피는 후속 생산기에 사용되는 생물 반응 장치의 부피에 직접 비례한다. 일반적으로, 더 큰 생물 반응 장치는, 더 작은 생물 반응 장치에서보다, 증량기로부터의 더 큰 최종 배양 부피를 이용하여 접종된다.
가용성 rHuPH20-발현 세포는, 각각 그 이전의 부피보다 부피를 증가시키고, 각각 후속 배양을 위한 접종원으로 사용되는 일련의 배양을 통해 증량된다. 상기 세포의 예시는 2B2 세포이다. 본래 접종원은 일반적으로 세포의 순도 및 정체 및 세포수가 규정되어 있는 것이다. 이들 세포는 -2O℃, -7O℃ 또는 -8O℃ 에서와 같이 냉동되어 저장될 수 있거나, 또는 예를 들어 4℃ 에서 액체 배지 중에 유지될 수 있거나, 또는 예를 들어 37℃ 에서 배양액 중에 유지될 수 있다. 일부의 경우, 본래 접종원은 냉동으로 저장된 마스터 세포 은행 또는 워킹 세포 은행 분취물이다. 상기의 경우, 접종원은 예컨대 37℃ 항온조에서 해동된다. 본래 세포 접종원을 일반적으로 원심분리하고, 세포를 적당한 배양 배지에 재현탁시킨다. 예를 들어, 2B2 세포는 CD CHO 배지 (Invitrogen) 와 같은 기본 배지, 또는 8 mM 글루타민 또는 L-알라닐-L-글루타민 및 20 μM 메토트렉세이트를 보충한 재구성 분말화 CD CGO AGT™ 배지 (Invitrogen) 중에 재현탁한 후에 배양될 수 있다. 또다른 구현예에서, 세포는 8 mM 글루타민 또는 L-알라닐-L-글루타민 및 100 mM 메토트렉세이트를 보충한 기본 배지에서 배양할 수 있다. 임의의 기타 적합한 세포 배양 배지가 또한 히알루로니다아제-발현 세포 증량에 이용될 수 있다. 예를 들어, 세포는 Dulbecco's 변형 Eagle's 배지 (DMEM), Eagle's 최소 필수 배지 (EMEM), Iscove's 변형 Eagle's 배지 (IMEM), F 12, RPMI, 또는 추가적인 보충물의 존재 또는 부재 하의 기타 화학적으로 규정되거나 또는 비규정된 배지에서 배양될 수 있다. 일반적으로, 세포는 무혈청 배지에서 배양하나, 또한 혈청을 포함하는 배지에서 배양할 수도 있다. 당업자는 가용성 rHuPH20-발현 세포가 배양될 세포 배양 배지를 제조하기 위해 각종 영양물이 보충될 수 있는 기타 기본 세포 배양 배지를 이용하여 세포 배양 배지를 제조할 수 있다.
세포 접종원은 세포 배양 배지의 일련의 부피 증가의 첫번째 것에 첨가하여, 세포 배양물을 증량시킨다. 최초 접종에 후속하여, 세포는 적당량의 CO2 와 함께 적당한 온도에서 습식 배양기 또는 생물 반응 장치에서 증량된다. 일반적으로, CO2 의 양은 4% 내지 9%, 일반적으로 6.0% 내지 8.0% 이고, 예컨대 7.0% 이고, 온도는 35℃ 내지 39℃, 일반적으로 36℃ 내지 38℃, 예컨대 37℃ 이다. 예를 들어, 2B2 및 3D35M 세포는 7% CO2 가 있는 37℃ 습식 배양기에서 배양할 수 있다. 배양물은 상기 프로세스 동안 예컨대 90 내지 130 rpm 으로 진탕시킬 수 있다. 세포가 예를 들어 1.0 × 106 세포/mL 초과 (예를 들어, 1.5 × 106 세포/mL 내지 2.5 × 106 세포/mL) 와 같은 원하는 밀도에 도달하면, 세포 배양물은 더 큰 부피의 신선한 세포 배양 배지에 접종하는데 사용된다. 예를 들어, 세포는 4 × 104 내지 4 × 106 세포/mL, 일반적으로 2 × 105 내지 6 × 105 세포/mL, 예컨대 4 × 105 세포/mL 의 밀도로 후속 배양물에 접종할 수 있다. 생물 반응 장치에 대한 시딩을 위해 원하는 부피 및 세포 밀도, 예를 들어 4 × 104 내지 4 × 106 세포/mL 까지 세포가 증량할 때까지 프로세스를 반복한다.
한 예에서, 가용성 rHuPH20-발현 세포, 예컨대 2B2 세포는 최초에 125 mL 진탕 플라스크 내의 약 20 mL 의 신선한 세포 배양 배지에 첨가하여, 20 내지 30 mL, 일반적으로 25 mL 의 배양 부피를 제공한다. 37℃, 7% CO2 에서의 인큐베이션 및 1.5 × 1O6 세포/mL 를 초과하는 밀도까지의 세포의 증량에 후속하여, 세포 배양을 40 mL 로 증량하기 위해 신선한 배지를 플라스크에 첨가한다. 1.5 × 106 세포/mL 를 초과하는 밀도가 수득될 때까지 세포를 다시 인큐베이션하고, 이후 전체 세포 배양물 (약 40 mL) 을 신선한 배지에 첨가해 125 mL 스피너 플라스크에서 100 mL 배양 부피를 만든다. 전체 세포 배양물 (약 100 mL) 을, 최종 배양 부피를 200 mL 로 만들기에 충분한 신선한 배지를 포함하는 250 mL 스피너 플라스크에 옮기고, 이후 최종 배양 부피를 800 mL 로 만들기에 충분한 신선한 배지를 포함하는 1 L 스피너 플라스크에 옮기고, 이후 최종 배양 부피를 5 L 로 만들기에 충분한 신선한 배지를 포함하는 6 L 스피너 플라스크에 옮기고, 최종적으로 최종 배양 부피를 32 L 로 만들기에 충분한 신선한 배지를 포함하는 36 L 스피너 플라스크에 옮겨서 상기 프로세스를 반복한다. 각각의 이동 사이에, 배양물이 1.5 × 106 세포/mL 를 초과하는 밀도에 도달할 때까지 세포를 인큐베이션한다. 일부 구현예에서, 최종 36 L 스피너 플라스크의 인큐베이션 후 더 큰 세포 밀도가 수득된다. 예를 들어, 36 L 스피너 플라스크 내 세포는 3.55 × 106 세포/mL 내지 6.05 × 106 세포/mL 의 세포 밀도로 증량될 수 있다. 상기 프로세스는 단백질 생산 단계를 위한 400 L 생물 반응 장치 (300 L 배양 부피) 로의 도입 전에 가용성 rHuPH20-발현 세포를 증량시키기 위해 이용될 수 있다 (예를 들어, 실시예 8 참고). 더 작은 생물 반응 장치를 위해 더 적은 부피의 세포 배양 및 상이한 세포 밀도가 이용될 수 있다. 예를 들어, 125 L 생물 반응 장치로의 도입 전에 세포는 1.8 × 106 세포/mL 내지 2.5 × 106 세포/mL 의 세포 밀도를 가지는 약 20 L 의 부피로 증량될 수 있다. 또다른 구현예에서, 가용성 rHuPH20-발현 세포는 5 L 생물 반응 장치로의 도입 전에 1.5 × 106 세포/mL 내지 2.5 × 106 세포/mL 의 세포 밀도를 가지는 약 800 mL 의 부피로 증량된다.
상기 프로세스는, 본원에 기재된 임의의 프로세스와 마찬가지로, 300 L 보다 더 큰 배양 부피를 가진 생물 반응 장치로의 세포의 도입을 위해 당업자에 의해 규모 확장(스케일업)될 수 있다. 예를 들어, 상기 프로세스는 실시예 12 에 기재된 것과 같이 2500 L 배양 부피를 가진 생물 반응 장치에 세포를 도입하기 위해 규모 확장될 수 있다. 따라서, 본원에서 제공하는 방법의 한 예에서, 해동 후에, 세포를 125 mL 진탕 플라스크 (작동 부피는 20 내지 30 mL, 예컨대 25 mL), 250 mL 진탕 플라스크 (작동 부피는 45 내지 55 mL, 예컨대 50 mL), 1 L 진탕 플라스크 (작동 부피는 190 내지 210 mL, 예컨대 200 mL), 2 개의 2 L 진탕 플라스크 (플라스크 당 작동 부피는 350 내지 450 mL, 예컨대 플라스크 당 400 mL), 6 개의 2 L 진탕 플라스크 (플라스크 당 작동 부피는 350 내지 450 mL, 예컨대 플라스크 당 400 mL), 25 L 웨이브 생물 반응 장치 (작동 부피는 14 내지 16 L, 예컨대 15 L), 100 L 웨이브 생물 반응 장치 (작동 부피는 75 내지 85 L, 예컨대 80 L), 및 600 L 시드 생물 반응 장치 (작동 부피는 440 내지 520 L, 예컨대 480 L) 를 통해 일련으로 증량된다.
F. 단백질 제조
세포 증량에 후속하여, 가용성 rHuPH20-발현 세포는, 대량의 가용성 rHuPH20 가 세포 배지로 분비되는 기간인 생산 단계를 위해 생물 반응 장치로 옮겨진다. 상기 단계는 일반적으로, 생물 반응 장치 가동의 첫번째 절반에서는 세포 성장이 최대화되고, 생물 반응 장치 가동의 두번째 절반에서는 가용성 rHuPH20 생산이 최대화되도록 고안된다. 해당 프로세스를 제어하기 위해 생산에 걸쳐 특별한 시점에 일련의 피드 배지를 세포에 제공한다. 생물 반응 장치 조건은 또한 일반적으로 최적 상태 유지를 프로세스 내내 보장하도록 모니터링된다. 단백질에 대해 본원에 기재된 방법은 당업자에 의해 규모가 확장되거나 또는 축소될 수 있다. 추가로, 예를 들어 세포 배지, 인큐베이션 시간, 피드 프로토콜에 대한 변형. 당업자는 임의의 주어진 생물 반응 장치 및 세포 유형에 대한, 단백질 생산에 적당한 조건을 경험적으로 결정할 수 있다.
상이한 크기 및 디자인의 생물 반응 장치가 본원의 방법에 이용될 수 있다. 1 L 내지 5000 L, 또는 그 이상의 작동 부피를 가진 생물 반응 장치가 본원의 방법에 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 5L, 36L, 125 L, 400 L 또는 3500 L 생물 반응 장치가 각각 약 4 L, 23 L, 10O L, 300 L 및 2500 L 부피에서의 세포 배양을 위해 본원의 방법에서 이용된다. 일반적으로, 생물 반응 장치는 세포 배양 배지 또는 세포의 첨가 전에 멸균된다. 멸균은 일부 생물 반응 장치에 대해서는 오토클레이브로 또는 그렇지 않으면 증기를 이용한 다른 처리법으로, 또는 묽은 수산화나트륨, 묽은 질산 또는 하이포아염소산나트륨과 같은 멸균 용액을 이용한 처리로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 생물 반응 장치는 121℃, 20 PSI 에서 30 분 동안 수증기에 의해 멸균된다. 멸균에 후속하여, 세포 배양 배지는 생물 반응 장치에 첨가되고, 멸균 프로세스가 유효한 것을 보장하는 일정 기간 후, 오염, 예컨대 미생물 오염에 대해 평가될 수 있다.
상기에 기재된, 증량 단계로부터의 세포 배양물은 신선한 세포 배양 배지를 포함하는 멸균된 생물 반응 장치에 첨가한다. 일반적으로, 가용성 rHuPH20-발현 세포를 104 내지 107 세포/mL, 예컨대 105 내지 106 세포/mL 의 세포 밀도로 신선한 세포 배양 배지에 접종한다. 예를 들어, 세포는 1 × 104, 5 × 104, 1 × 105, 5 × 105, 1 × 106, 4 × 106, 또는 1 × 107 세포/mL 의 밀도로 접종될 수 있다. 한 구현예에서, 가용성 rHuPH20-발현 세포는 4 × 105 세포/mL 의 세포 밀도로 접종된다. 따라서, 접종 후 전체 세포 카운트는, 생물 반응 장치의 크기 및 세포 밀도에 따라 107 내지 1014 일 수 있다. 예를 들어, 100 L 의 세포 배양 부피는 세포 접종 후 약 109, 1010, 1011 또는 1012 세포의 세포 밀도를 가질 수 있다. 또다른 구현예에서, 2500 L 의 세포 배양 부피는 접종 후 약 1010, 1O11, 1012 또는 1013 세포의 세포 밀도를 가질 수 있다.
사용되는 접종 세포 배양물 및 신선한 배양 배지의 부피는 생물 반응 장치의 크기 및 접종원의 세포 밀도에 좌우된다. 예를 들어, 약 30 L 의 가용성 rHuPH20-발현 세포, 예컨대 2B2 세포는, 약 260 L 의 총 부피 및 4 × 105 세포/mL 의 접종 세포 밀도 (전체 세포 카운트는 약 1O11 세포) 를 위해 230 L 의 신선한 세포 배양 배지를 포함하는 400 L 생물 반응 장치에 첨가될 수 있다. 이는 생물 반응 장치에 따라 필요에 따라 규모를 확대 또는 축소할 수 있다. 예를 들어, 약 20 L 의 가용성 rHuPH20-발현 세포, 예컨대 3D35M 세포는 약 85 L 의 총 부피 및 4 × 105 세포/mL 의 접종 세포 밀도 (전체 세포 카운트는 약 3.4 × 1010 세포) 를 위해 65 L 의 신선한 세포 배양 배지를 포함하는 125 L 생물 반응 장치에 첨가될 수 있다. 또다른 구현예에서, 3500 L 생물 반응 장치에서의 제조를 위해, 1900 내지 2300 L, 예컨대 2100 L 의 총 세포 배양 부피를 위해 2B2 세포를 신선한 세포 배양 배지에 첨가한다.
신선한 세포 배양 배지는 세포 성장을 촉진하기 위해 세포에 필요한 영양물을 공급하기 위한 적당한 보충물을 포함한다. 기본 세포 배지에 첨가될 수 있는 보충물에는, 이에 제한되지 않으나, 글루코오스, 인슐린, 나트륨 부티레이트, 효모 추출물 및 글루타민 또는 글루타민 대체물, 예컨대 L-알라닐-L-글루타민이 포함된다. 일부의 경우, 기본 배지는 글루코오스를 추가로 첨가할 필요가 없도록 충분한 글루코오스를 포함한다. 또다른 경우, 제조 프로세스에서 더 이후에, 예컨대 피드 배지에 후속하여 배지에 글루코오스를 첨가한다. 배지에 대한 인슐린의 첨가는 세포 성장을 촉진하고 정점 세포 밀도를 증가시킨다. 글루타민 또는 글루타민-대체물, 예컨대 L-알라닐-L-글루타민은, 세포 주기 진행을 지지할 수 있고, 또한 세포 성장을 증강시킬 수 있다. 당업자는 기본 배지에 보충될 수 있는 영양물의 양 및 품질을 경험적으로 결정할 수 잇다. 일부 예에서, 글루타민 또는 글루타민-대체물은 기본 세포 배양 배지에 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 15 mM 또는 20 mM 로 첨가된다. 인슐린은, 예를 들어 0.5 mg/L 내지 50 mg/L, 예컨대 1 mg/L 내지 40 mg/L, 2 mg 내지 30 mg/L, 또는 5 mg/L 내지 20 mg/L 로 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 5 mg/L 인슐린 및 8 mM L-알라닐-L-글루타민을 보충한 기본 세포 배양 배지가 가용성 rHuPH20-발현 세포가 접종되는 신선한 세포 배양 배지로서 사용될 수 있다. 추가적인 보충물, 예컨대 항생제, 항진균제, 지시약, 염, 비타민, 아미노산 및 성장 인자가 또한 첨가될 수 있다.
생물 반응 장치의 개별 파라미터는 단백질 제조 프로세스 내내 최적 조건을 유지하도록 설정될 수 있다. 설정될 수 있는 특이적 파라미터는 사용되는 생물 반응 장치에 좌우되고, 해당 파라미터에는, 이에 제한되지 않으나, 온도, pH, 용존 산소, 임펠러 속도, 용기 압력, 공기 분사 및 공기 오버레이가 포함된다. 한 구현예에서, 3D35M 의 100 L 세포 배양물을 포함하는 125 L 생물 반응 장치의 조건은 다음과 같이 설정된다: 온도: 37℃; 용존 산소: 25% ± 10%; 임펠러 속도: 50 RPM; 용기 압력: 3 psi; 공기 분사: 1 L/분; 공기 오버레이: 1 L/분, pH:7.2. 또다른 구현예에서, 260 L 의 최초 세포 배양 부피를 포함하는 400 L 생물 반응 장치의 조건은 다음과 같이 설정된다: 온도: 37℃; 임펠러 속도 40 내지 55 RPM; 용기 압력: 3 psi; 공기 분사: 0.5 내지 1.5 L/분; 공기 오버레이: 1 L/분. 또다른 구현예에서, 2100 L 의 최초 배양 부피를 포함하는 3000 L 생물 반응 장치의 조건은 다음가 같이 설정된다; 온도: 37℃ (또는 36.5℃ 내지 37.5℃; 임펠러 속도: 35 RPM (또는 70 내지 80 RPM); 용기 압력: 5 psi (또는 3 내지 7 psi); 공기 분사: 12 L/분 (또는 11 내지 13 L/분); 용존 산소: 25%, 또는 25% 미만; 접종전 pH: 7.2 (또는 pH 7.1 내지 7.3); 접종후 pH: ≤7.2 (또는 ≤7.3). 당업자는 특별한 생물 반응 장치에서의 특정 가용성 rHuPH20-발현 세포의 배양을 위한 적당한 조건을 경험적으로 결정할 수 있다.
가용성 rHuPH20-발현 세포는 일반적으로 생물 반응 장치에서 10 내지 25 일 동안 배양한다. 일부 구현예에서, 가용성 rHuPH20-발현 세포는 수확 전에 생물 반응 장치에서 12, 13, 14, 15 또는 16 일 동안 배양한다. 또다른 구현예에서, 세포는 생존 세포 카운트 (VCC) 가 특정한 수준, 예컨대 25%, 30%, 35%, 40%, 45 %, 50%, 55%, 60% 또는 70% 가 될 때 수확한다. 한 구현예에서, 세포는 VCC 가 30% 내지 35% 일 때 수확한다. 또다른 구현예에서, 세포는 VCC 가 50% 미만으로 떨어진 24 시간 이내에 수확한다.
생물 반응 장치 배양 동안, 세포는 추가적인 영양물의 첨가없이 배양물을 완료시까지 성장시키는 뱃치식 배양으로 성장시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 세포를 공급-뱃치 배양물로 배양하고, 특정 시점에 영양물 및 글루코오스를 전체적으로 보충하기 위해 일련의 피드 배지를 제공한다. 일부의 경우에서, 세포를 접종하는 세포 배양 배지에 제공되는 영양물들은 접종 후 3, 4, 5, 6, 7 일째 또는 그 이후에 고갈된다. 따라서, 추가적인 영양물 또는 보충물의 제공은 뱃치식 배양보다는 더 높은 수율의 단백질을 제공할 수 있다. 한 구현예에서, 접종 후 6, 9 및 11 일째에 피드 배지를 세포에 제공한다. 또다른 구현예에서, 접종 후 7, 9 및 11 일째에 피드 배지를 세포에 제공한다. 또다른 구현예에서, 접종 후 5, 7, 9 및 11 일째에 피드 배지를 세포에 제공한다. 생물 반응 장치 배양물에 첨가되는 피드 배지의 부피는, 예를 들어 세포 배양물 부피의 0.5 % 내지 20%, 예컨대 1 내지 20%, 2 내지 15%, 3 내지 10% 또는 4 내지 5% 의 범위일 수 있다. 일부 예의 경우, 피드 배지는 세포 배양물 부피의 4% 와 동등한 부피로 첨가된다.
피드 배지에 대한 각종 보충물의 첨가는 또한 세포의 성장 및/또는 세포 주기의 조절에 이용될 수 있다. 피드 배지에 포함될 수 있는 예시 영양물 및 보충물에는, 이에 제한되지 않으나, 글루타민 또는 글루타민-대체물, 예컨대 L-알라닐-L-글루타민, 인슐린, 효모 추출물, 글루코오스 및 나트륨 부티레이트 또는 나트륨 부티레이트가 포함된다. 추가로, 피드 배지에 사용되는 기본 배지는 또한 농축되어, 세포 배양 동안 결핍될 수 있는 추가적인 영양물, 예컨대 필수 아미노산을 제공할 수 있다. 피드 배지 중의 기본 배지는 2×, 3×, 4×, 5×, 6× 또는 그 이상으로 농축될 수 있다. 또다른 구현예에서, 기본 배지는 덜 농축되거나, 또는 생물 반응 장치 중의 배양 배지와 동일한 농도이다.
피드 배지에 포함되는 보충물들은 세포 성장 및 단백질 제조 조절에 이용될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양물에 첨가되는 제 1 배양 배지는 세포 주기 진행, 세포 성장 및 정점 세포 밀도를 증강시키는 영양물을 포함할 수 있다. 후속 피드 배지는 세포 성장 정지 및/또는 단백질 합성을 촉진할 수 있다. 각각의 피드 배지 중의 각 보충물의 양은, 예컨대 후속하는 피드 배지보다 증가시키거나 또는 감소시킴으로써 달라질 수 있거나, 또는 후속하는 것과 동일하게 할 수 있다. 일부 구현예에서, 보충물의 양은 후속하는 피드 배지를 본래 피드 배지보다, 예컨대 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 그 이상 증가시킨다. 다른 구현예에서, 보충물의 양은 후속하는 피드 배지를 본래 피드 배지보다, 예컨대 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 감소시킨다. 한 구현예에서, 보충물을 피드 배지에서 생략한다. 또다른 구현예에서, 피드 배지 중의 보충물의 양을 동일하게 유지한다. 당업자는 원하는 양의 세포 성장 및 단백질 제조를 촉진할 각 피드 배지에 대한 각각의 보충물의 최적의 양을 경험적으로 결정할 수 있다.
피드 배지에 포함될 수 있는 예시 보충물 또는 영양물에는, 이에 제한되지 않으나, 글루코오스, 글루타민 또는 글루타민-대체물, 예컨대 L-알라닐-L-글루타민, 인슐린, 및 나트륨 부티레이트가 포함된다. 첨가되는 보충물의 유형 및 양은 세포 성장 및 단백질 생산에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 인슐린 및 글루타민 또는 글루타민-대체물은 세포 배양물에 대한 제 1 피드 배지에 혼입되어, 세포 성장 및 정점 세포 밀도를 증가시킬 수 있다. 후속하는 피드 배지는 세포 성장보다는 단백질 제조를 촉진하도록 고안될 수 있다. 인슐린과 같은 보충물은 배제하거나 또는 감량시킬 수 있고, 글루타민 또는 글루타민-대체물, 예컨대 L-알라닐-L-글루타민도 마찬가지이다. 대조적으로, 단백질 합성을 증강시키는 보충물, 예컨대 효모 추출물은 증량시킬 수 있다. 추가로, 세포 주기 정지를 증강시켜, 단백질 제조를 증가시키는 보충물들도 또한 포함될 수 있다. 상기 보충물의 예시는 나트륨 부티레이트이다.
한 구현예에서, 인슐린은 하나 이상의 피드 배지에 첨가된다. 인슐린의 첨가는 정점 세포 밀도를, 예를 들어 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 그 이상 증가시킬 수 있다. 인슐린이 임의의 피드 배지에 혼입될 수 있지만, 일반적으로 인슐린은 생물 반응 장치 가동의 초기 단계에 최대한의 세포 성장을 촉진하기 위해, 제 1 피드 배지 또는 제 1 및 제 2 피드 배지와 같은 초기의 피드 배지에 첨가된다. 예를 들어, 제 1 피드 배지와 같은 피드 배지는, 인슐린을 약 또는 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, 25 mg/L, 30 mg/L, 35 mg/L, 40 mg/L, 45 mg/L, 50 mg/L, 55 mg/L, 60 mg/L 또는 그 이상 포함할 수 있다. 대조적으로, 후반 피드 배지에 첨가되는 인슐린의 양은 감소될 수 있거나, 또는 완전히 생략될 수 있다.
글루타민 또는 글루타민-대체물, 예컨대 L-알라닐-L-글루타민도 또한 피드 배지에 첨가될 수 있다. 일부의 경우, 제 1 피드 배지에 첨가되는 글루타민 또는 글루타민-대체물의 양은 후속 피드 배지에 첨가되는 글루타민 또는 글루타민-대체물의 양보다 더 많다. 특별한 구현예에서, 각각의 후속 피드 배지에 첨가되는 글루타민 또는 글루타민-대체물의 양은 이전의 피드 배지에 첨가되는 양과 비교하여 감소된다. 각각의 피드 배지에 첨가되는 최적의 양은 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있고, 예를 들어 약 또는 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM 또는 그 이상의 글루타민 또는 글루타민-대체물 농도를 포함할 수 있다.
일반적으로, 피드 배지에 사용되는 기본 배지에는 또한 글루코오스를 보충한다. 각각의 피드 배지에 첨가되는 글루코오스의 양은 이전 피드 배지에 비해 증가 또는 감소될 수 있거나, 또는 거의 일정하게 유지될 수 있다. 일부 구현예에서, 피드 배지에 첨가되는 글루코오스의 양은 약 또는 10 g/L, 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L, 35 g/L, 40 g/L, 45 g/L, 50 g/L, 55 g/L, 60 g/L, 75 g/L, 80 g/L 또는 그 이상이다.
추가로, 단백질 합성을 촉진하는 보충물도 또한 포함될 수 있다. 상기 영양물은, 예를 들어 효모 추출물을 포함할 수 있다. 일부의 경우, 피드 배지에 포함되는 효모 추출물의 양은 생물 반응 장치 가동 동안 증가된다. 예를 들어, 제 3 피드 배지 중의 효모 추출물의 양은 제 2 피드 배지 중의 양보다 증가될 수 있고, 이는 제 2 피드 배지 중의 양보다 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, 피드 배지에 첨가되는 효모 추출물의 양은 5 내지 1000 g/L, 예컨대 약 또는 10 g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 75 g/L, 100 g/L, 125 g/L, 150 g/L, 175 g/L, 200 g/L, 250 g/L, 300 g/L, 350 g/L, 400 g/L 또는 그 이상이다.
세포 주기 정지를 촉진하여, 단백질 제조를 증가시키는 보충물이 또한 포함될 수 있다. 일반적으로, 상기 보충물은 가동 중의 생물 반응 장치에 이후 첨가되는 피드 배지에 포함되며, 제 1 피드 배지에는 포함되지 않는다. 예를 들어, 세포 주기 정지를 촉진시키는 보충물은 제 2 피드 배지 및 후속 피드 배지에 포함될 수 있다. 상기 보충물의 예시는 나트륨 부티레이트이다. 일부 구현예에서, 피드 배지에 첨가되는 나트륨 부티레이트의 양은 0.1 g/L 내지 10 g/L, 예컨대 약 또는 0.2 g/L, 0.3 g/L, 0.4 g/L, 0.5 g/L, 0.6 g/L, 0.7 g/L, 0.8 g/L, 0.9 g/L, 1.0 g/L, 1.1 g/L, 1.2 g/L, 1.3 g/L, 1.4 g/L, 1.5 g/L, 1.6 g/L, 1.7 g/L, 1.8 g/L, 1.9 g/L, 2.0 g/L, 2.5 g/L, 3.0 g/L, 3.5 g/L, 또는 그 이상이다.
추가로, 임의의 한가지 이상의 생물 반응 장치 조건이 단백질 제조를 최적화하기 위해 생산 단계 동안 변경될 수 있다. 한 구현예에서, 온도가 강하된다. 이는 세포 주기 정지를 촉진하고, 세포 생존력을 연장시키고 (이로써, 총 단백질 제조가 증가됨), 분비된 히알루로니다아제 안정화를 보조하도록 제공될 수 있다. 예를 들어, 생물 반응 장치의 온도는 각각의 주입시, 예컨대 제 2 주입시에는 37℃ 에서 36.5℃ 로, 제 3 주입시에는 36℃ 로, 제 4 주입시에는 35.5℃ 로 강하될 수 있다. 당업자는 생물 반응 장치에서의 주입 및 적당한 조건을 제공하는 적당한 피드 배지 및 시간을 경험적으로 결정할 수 있다.
한 구현예에서, 세포에 접종 후 6, 9 및 11 일째에 피드 배지를 제공한다. 또다른 구현예에서, 세포에 접종 후 7, 9 및 11 일째에 피드 배지를 제공한다. 추가적 구현예에서, 세포에 접종 후 5, 7, 9 및 11 일째에 피드 배지를 제공한다. 각 시점에 제공되는 피드 배지는 상동이거나 또는 상이할 수 있고, 이에 제한되지 않으나, 글루코오스, 나트륨 부티레이트, 인슐린, 글루타민 또는 글루타민 대체물 및 효모 추출물과 같은 보충물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 400 L 생물 반응 장치 중의 260 L 배양물에서 성장한 2B2 세포에, 제 5 일째에 33 g/L 글루코오스, 32 mM L-알라닐-L-글루타민, 16.6 g/L 효모 추출물 및 33 mg/L 인슐린을 보충한 10.4 L 의 4× 기본 배지 (예를 들어, CD CHO 배지) 를 포함하는 제 1 피드물을, 제 7 일째에는 10.8 L 의 2× 기본 배지 (예를 들어, CD CHO 배지), 33 g/L 글루코오스, 16 mM L-알라닐-L-글루타민, 33.4 g/L 효모 추출물 및 0.92 g/L 나트륨 부티레이트를 포함하는 제 2 피드를, 제 9 일째에는 10.8 L 1× 기본 배지 (예를 들어, CD CHO 배지), 50 g/L 글루코오스, 10 mM L-알라닐-L-글루타민, 50 g/L 효모 추출물 및 1.80 g/L 나트륨 부티레이트를 포함하는 제 3 피드를, 제 11 일째에는 1 × 기본 배지 (예를 들어, CD CHO 배지), 33 g/L 글루코오스, 6.6 mM L-알라닐-L-글루타민, 50 g/L 효모 추출물 및 0.92 g/L 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 4 피드를 제공할 수 있다. 이는 더 크거나 또는 더 작은 생물 반응 장치에서 각각 rHuPH20 를 제조하기 위해, 당업자에 의해 규모를 확대하거나 또는 축소할 수 있다. 추가로, 당업자는 세포 성장 및/또는 단백질 제조를 촉진시키기 위해 배지에 첨가되는 한가지 이상의 보충물의 유형 또는 양을 변경시킬 수 있다.
또다른 구현예에서, 하기의 피드 배지가 5, 7, 9 및 11 일째에 제공된다: 피드 #1 배지: 기본 배지 + 33 g/L 글루코오스 + 26.6 mM L-알라닐-L-글루타민 + 83.3 g/L Yeastolate + 33 mg/L rHulnsulin; 피드 #2: 기본 배지 + 33 g/L 글루코오스 + 13.4 mM L-알라닐-L-글루타민 + 166.7 g/L Yeastolate + 0.92 g/L 나트륨 부티레이트; 피드 #3: 기본 배지 + 50 g/L 글루코오스 + 10 mM L-알라닐-L-글루타민 + 250 g/L Yeastolate + 1.8 g/L 나트륨 부티레이트; 피드 #4: 기본 배지 + 33.3 g/L 글루코오스 + 6.7 mM L-알라닐-L-글루타민 + 250 g/L Yeastolate + 0.92 g/L 나트륨 부티레이트.
G. 세포 배양물 수확 , 단백질 농축 및 완충액 교환
단백질 생산 단계에 후속하여, 세포를 수확하고, 세포 배양 배지로 분비된 가용성 rHuPH20 는 정제 프로세스 개시 전에 농축한다. 단백질의 농축에 추가하여, 세포 배양 배지는 이 시점에 적당한 완충액으로 교환할 수 있다. 단백질 농축 및 완충액 교환을 수행할 다중 시스템 및 프로세스는 당업계에 공지되어 있으며, 본원의 방법에서 이용될 수 있다. 그러한 방법의 예시가 하기에 기재되어 있고, 당업자는 만족스런 수준의 단백질 농축 및 완충액 교환을 달성하기 위해 이들 방법을 변형하거나 또는 다른 유효한 방법으로 대체할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
세포를 생물 반응 장치로부터 수확하고, 세포 제거 및 정화 시스템을 통해 가공하여, 세포 및 세포 찌꺼기들로부터 히알루로니다아제를 포함하는 세포 배양액을 분리할 수 있다. 상기 시스템의 예시는 해당 단백질만이 통과하여 수집될 수 있도록 하는 일련의 필터를 포함하는 것이다. 히알루로니다아제를 세포 및 세포 찌꺼기로부터 분리할 수 있는 임의의 필터 및 일련의 필터들을 이용할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양물 수확물을 일련의 캡슐 필터, 예컨대 폴리에테르술폰 필터에 통과시킬 수 있다. 이들은, 예를 들어 세포, 세포 찌꺼기 및 더 작은 입자들, 예컨대 바이러스를 점증적으로 제거하기 위해 작아지는 포어 크기를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 포어 크기가 8.0 ㎛, 0.65 ㎛, 0.22 ㎛ 및 0.22 ㎛ 인 일련의 4 개의 필터를 세포 배양물 정화에 이용해, 수확된 세포 배양액 (HCCF) 을 수득한다. 본원의 방법에 이용될 수 있는 세포 제거 및 정화 시스템의 또다른 예시는, 첫번째 단계에서 각각 4 내지 8 ㎛ 등급의 규조토 층 및 1.4 내지 1.1 ㎛ 등급의 규조토 층을 포함하는 평행한 4 개의 모듈에 이어 셀룰로오스 멤브레인을 포함하는 일련의 필터들이다. 두번째 단계에서는 0.1 내지 0.11 ㎛ 등급의 규조토 층 및 0.1 ㎛ 미만의 규조토 층을 포함하는 단독 모듈에 이어 셀룰로오스 멤브레인을 포함하고, 세번째 단계에서는 0.22 ㎛ 폴리에테르술폰 캡슐 필터를 포함한다.
세포 및 찌꺼기를 일단 HCCF 로부터 분리하면, HCCF 중의 단백질은 일반적으로 농축하고, 세포 배양 배지는 적당한 완충액으로 교환한다. 단백질은 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 11×, 12×, 13× 또는 그 이상 농축될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 10× 로 농축된다. 또다른 구현예에서, 단백질은 6× 로 농축된다. 당업계에 공지된 임의의 단백질 농축 방법이 이용될 수 있다. 상기 방법의 예시에는, 분자량 차단 (MWCO) 필터가 있는 접선 유동 여과 (TFF) 시스템을 이용하는 농축이 포함된다. 예를 들어, 정화된 HCCF 는 일련의 2 개의 30 kDa MWCO 나선형 폴리에테르술폰 필터를 통해 통과하여 단백질을 10× 로 농축할 수 있다. 또다른 구현예에서, HCCF 는 일련의 4 개의 30 kDa MWCO 필터를 통해 통과한다. 예를 들어, 100 L 및 300 L 배양과 같은 히알루로니다아제의 대규모 제조를 위해서는, 상기 목적을 위해 일반적으로 표면적이 0.5 내지 5 평방미터인 필터를 채용한다. 일부 구현예에서, 표면적인 1.2 평방미터 또는 2.8 평방미터인 필터를 사용한다.
완충액 교환은 단백질 농축에 후속하여 수행한다. 당업자는 적당한 완충액을 경험적으로 결정할 수 있다. 적합한 완충액의 예시는, 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.0 완충액, 또는 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 완충액이다. 수확, 농축 및 완충액 교환에 후속하여, 농축한 단백질 용액은 일반적으로, 멸균 저장 백에 저장하기 전에, 0.22 ㎛ 캡슐 필터와 같은 또다른 필터를 통해 통과시킨다.
일부 구현예에서, 농축한 단백질 용액은 임의의 잔류 바이러스 오염물을 불활성화시키도록 처리된다. 바이러스 불활성화는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 유효하게 될 수 있다. 예를 들어, 농축한 단백질 용액은 10% Triton X-1OO, 3% 트리(n-부틸)포스페이트 (TNBP) 와, 최종 농도 1% Triton X-1OO, 0.3% TNBP 이 되도록 실온에서 15 내지 75 분 동안 혼합할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 바이러스 불활성화 용액에 30 내지 45 분 동안 노출시킨다.
H. 정제
가용성 rHuPH20 는 일련의 정제 과정을 이용해 농축한 단백질 용액으로부터 정제한다. 많은 정제 기법이 당업계에 공지되어 있으며, 본원의 방법에 이용될 수 있다. 상기 방법에는, 이에 제한되지 않으나, 이온-교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 (AC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 역상 크로마토그래피 (RPC) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 및 겔 여과 방법, 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.
본원의 방법에 이용되는 정제 방법의 예시는 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피의 조합이다. 이온-교환 크로마토그래피에서, 단백질은 크로마토그래피-컬럼 매트릭스의 하전된 관능기 및 단백질의 하전된 관능기 사이의 정전기력에 기초하여 복합체 용액 또는 혼합물로부터 분리될 수 있다. 양이온-교환 수지는 단백질의 양으로 하전된 관능기를 끌어당기는 음으로 하전된 관능기를 갖고 있고, 음이온-교환 수지는 단백질의 음으로 하전된 관능기를 끌어당기는 양으로 하전된 관능기를 갖고 있다. 매트릭스에 정전기력을 통해 결합되어 있는 단백질은 크로마토그래피 컬럼 내의 완충액 용액의 이온 강도를 경시적으로 증가시킴으로써 용출될 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피에서, 단백질은 소수성에 기초하여 복합체 용액 또는 혼합물로부터 분리될 수 있다. 단백질을 포함하는 복합체 용액은 단백질의 수지에 대한 결합을 촉진하는 고농도 염 (high salt) 완충액을 이용하여 평형화된 크로마토그래피 컬럼에 적용된다. 이어서, 감소하는 이온 강도를 가지는 염-구배 이동상을 크로마토그래피 컬럼에 도입하여 매트릭스로부터 결합된 단백질을 유리해 낸다. 대안적으로, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 단백질의 불활성 이량체 및 응집물을 포함하는 소수성 불순물을 결합시키고, 단량체성 단백질이 크로마토그래피 컬럼을 통해 비교적 방해받지 않고 유출되도록 함으로써 복합체 용액 또는 혼합물로부터 단량체성 단백질을 분리할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에서, 매트릭스에 공유결합으로 결합되어 있는 리간드 또는 리간드-결합 본체에 대한 단백질의 친화성에 기초하여 단백질을 복합체 용액으로부터 분리할 수 있다. 리간드 또는 리간드-결합 본체에 대해 친화성이 약하거나 또는 친화성이 결핍된 복합체 용액 또는 혼합물 중의 다른 단백질은 방해받지 않고 크로마토그래피 컬럼을 통해 유출되고, 매트릭스에 결합된 관심대상의 단백질을 남긴다. 이어서, 상기 단백질은, 리간드 또는 리간드-결합 본체에 대한 친화성을 감소시키도록 완충액 조건을 변경시켜 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출시킬 수 있다.
한 구현예에서, 가용성 rHuPH20 은 비드 가교 아가로오스 컬럼, 예컨대 Q 세파로오스™ 컬럼 (이온-교환 크로마토그래피), 비드 가교 페닐-치환 아가로오스 컬럼, 예컨대 페닐 세파로오스™ 컬럼 (소수성 상호작용 크로마토그래피), 아미노 페닐 보로네이트 컬럼 (친화성 크로마토그래피) 을 통해, 그리고 최종적으로는 히드록시아파타이트 컬럼 (이온-교환 크로마토그래피) 을 통해 연속적 정제로 농축한 단백질 용액으로부터 정제된다. 각각의 상기 컬럼은 히알루로니다아제에 대한 상이한 결합 특성을 나타내며, 따라서, 비드 가교 아가로오스 컬럼 (예를 들어, Q 세파로오스™ 컬럼) 은 포획 단계 (즉, 가용성 rHuPH20 는 수지에 결합하나, 일부 기타 단백질을 유출됨) 이고, 비드 가교 페닐-치환 아가로오스 (예를 들어, 페닐 세파로오스™ 컬럼) 는 유출 단계 (즉, 가용성 rHuPH20 는 컬럼을 통해 유출되고, 일부 기타 단백질들은 포획됨) 이고, 아미노 페닐 보로네이트 컬럼은 또다른 포획 단계이고, 히드록시아파타이트 컬럼은 가용성 rHuPH20 을 추가로 정제하기 위한 손질 단계(polishing step)이다.
사용 전에, 컬럼은 일반적으로 멸균되고 평형화된다. 멸균은, 이에 제한되지 않으나, 1.0 M NaOH 를 이용한 멸균을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 평형화는, 후속하여 컬럼을 세척하기 위해 이용되는 완충액 또는 로오딩 전에 단백질이 포함되어 있던 완충액과 같이, 컬럼에 적당한 완충액을 첨가하여 수행될 수 있다. 당업자는 각 컬럼의 평형화에 이용하기에 적합한 완충액을 쉽게 결정할 수 있다. 예시 완충액은 하기에 제공한다. 각각의 크로마토그래피 단계 사이에서, 용출된 단백질은, 예컨대 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과되어, 임의의 오염 미생물 또는 커다란 응집물을 제거할 수 있다. 일부 구현예에서, 여과된 용출물은 후속 단계에서의 사용 전에, 예컨대 멸균 저장 백에 저장된다. 컬럼 크로마토그래피에 후속하여, 정제된 히알루로니다아제는 바이러스 제거 단계에 이어, 최종 제형물을 위해 단백질 농축 및 완충액 교환에 적용될 수 있다. 예시 정제 방법은 하기에 더욱 상세하게 기재될 것이다.
1. 비드 가교 아가로오스 컬럼
수확한 세포 배양액 (HCCF) 으로부터 수득한 농축한 단백질을, 강한 음이온 교환자이고, 다른 단백질들은 유출하도록 하면서 가용성 rHuPH20 을 포획하는 Q 세파로오스™ 컬럼과 같은 비드 가교 아가로오스 컬럼 상에 로오딩한다. 이어서, 결합된 가용성 rHuPH20 은 적당한 완충액을 이용하여 용출할 수 있다. 사용하는 컬럼의 치수는 일반적으로 HCCF 로부터 수득되는 농축된 단백질의 부피에 좌우된다. 예를 들어, 100 L 생물 반응 장치 배양물에서의 히알루로니다아제-발현 세포의 배양물로부터 수득되는 농축된 단백질은 높이 20 cm, 직경 14 cm 이고, 3 L 수지를 포함하는 컬럼 상에 로오딩할 수 있다. 또다른 구현예에서, 300 L 생물 반응 장치 배양물 중의 가용성 rHuPH20-발현 세포의 배양물로부터 수득되는 농축한 단백질은 높이 29 cm, 직경 20 cm 이고, 9 L 수지를 포함하는 컬럼 상에 로오딩할 수 있다. 이는 농축한 단백질 용액의 부피 및 예상되는 단백질의 양에 따라, 필요에 따라 규모 확대 또는 축소시킬 수 있다. 예를 들어, 20 L 생물 반응 장치 배양물 중의 가용성 rHuPH20-발현 세포의 배양물로부터 수득되는 농축한 단백질은 높이 28 cm, 직경 7 cm 이고, 1.1 L 수지를 포함하는 Q 세파로오스™ 컬럼 상에 로오딩할 수 있고, 2500 L 생물 반응 장치 배양물 중의 가용성 rHuPH20-발현 세포의 배양물로부터 수득되는 농축한 단백질은 높이 26 cm, 직경 63 cm 이고, 81 L 수지를 포함하는 Q 세파로오스™ 컬럼 상에 로오딩할 수 있다.
단백질을 로오딩하기 전에, 컬럼은 일반적으로 평형화시킨다. 평형화는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 컬럼 부피의 완충액을 통과시켜 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 평형화를 위해 5 컬럼 부피의 완충액을 컬럼에 통과시킨다. 평형화에 적합한 완충액에는 단백질을 로오딩한 후 컬럼을 세척하기 위해 사용할 완충액과 유사한 것이 포함된다. 예를 들어, 비드 가교 아가로오스 컬럼, 예컨대 Q 세파로오스™ 컬럼은 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.5 로 평형화될 수 있다. 당업자가 알 수 있는 기타 중성 pH 완충액이 사용될 수 있다.
단백질 농축물을 로오딩한 후, 컬럼을 세척하고 단백질을 용출시킨다. 결합된 가용성 rHuPH20 를 포함하는 상기 컬럼의 세척에 적합한 완충액에는, 예를 들어, 10 mM Hepes, 25 mL NaCl, pH 7.0; 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0; 및 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 이 포함된다. 컬럼은 한가지 이상의 유형의 완충액으로 세척할 수 있다. 예를 들어, 컬럼은 20 mM Na2SO4, pH 7.5 및 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0 으로 세척할 수 있다. 일반적으로, 세척은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 컬럼 부피의 완충액을 통과시켜 수행된다. 일부 구현예에서, 5 컬럼 부피의 완충액을 컬럼 세척에 이용한다. 이어서, 가용성 rHuPH20 을 더 높은 염 농도의 완충액, 예컨대 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0 를 이용하여 용출한다. 일부 구현예에서는, 상기 프로세스 동안 임의의 흡광도가 가용성 rHuPH20 의 존재를 나타내므로, 용출물을 수집할 때를 결정하기 위하여 A280 에서의 흡광도를 모니터링한다. 따라서, 한 구현예에서, 흡광도 검독값이 0.025 이기 시작하여 용출물을 수집한다. 일반적으로, 용출물은 0.22 ㎛ 필터와 같은 적당한 필터를 통해 여과하고, 예컨대 멸균 저장 백에 저장한다.
2. 비드 가교 페닐 -치환 아가로오스 컬럼
비드 가교 아가로오스 컬럼을 통한 정제에 후속하여, 단백질 용액은, 다른 오염성 단백질들은 포획하면서 가용성 rHuPH20 은 유출시키는, 페닐 세파로오스™ 컬럼과 같은 비드 가교 페닐-치환 아가로오스 컬럼을 이용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시킬 수 있다. 본원의 방법에 사용되는 컬럼은 그것을 통해 정제할 단백질의 부피 및 양에 좌우되어 그 크기의 범위가 정해질 수 있다. 예시 크기로는, 100 L 생물 반응 장치 배양물에서 배양한 세포 유래의 가용성 rHuPH20 의 정제에 사용하기 위해서는 9L 수지가 있는, 높이 29 cm, 직경 20 cm 인 컬럼, 300 L 생물 반응 장치 배양물에서 배양한 세포 유래의 히알루로니다아제의 정제에 사용하기 위해서는 19 내지 21 L 수지가 있는, 높이 29 cm , 직경 30 cm 인 컬럼, 2500 L 생물 반응 장치 배양물에서 배양한 세포 유래의 가용성 rHuPH20 의 정제에 사용하기 위해서는 176 L 수지가 있는 높이 35 cm, 직경 80 cm 인 컬럼이 포함된다. 당업자는 적절하게 규모를 확대 또는 축소할 수 있다.
페닐 세파로오스™ 컬럼과 같은, 멸균된 비드 가교 페닐-치환 아가로오스 컬럼은 예를 들어, 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0 와 같은 적당한 완충액을 이용해, 단백질의 로오딩 전에 평형화될 수 있다. Q 세파로오스 컬럼 정제로부터의 단백질 용출물에는 또한 황산암모늄, 인산칼륨 및 CaCl2 을 보충한다. 이는 예를 들어 약 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄 및 0.1 mM CaCl2, pH 7.0 의 최종 농도로 단백질에 보충될 수 있다. 단백질의 로오딩에 후속하여, 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄 및 0.1 mM CaCl2, pH 7.0 를 또한 컬럼에 추가하고, 여과된 통과물을, 예컨대 멸균 백에 수집한다.
3. 아미노 페닐 보로네이트 컬럼
소수성 상호작용 크로마토그래피에 후속하여, 컬럼-정제된 단백질은 추가 정제를 위해 아미노 페닐 보로네이트 컬럼에 로오딩할 수 있다. 아미노 페닐 보로네이트 리간드-매개 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피에 이용되는 많은 다른 리간드와는 상이하다. 비공유성 상호작용의 혼합에 의해 대부분의 리간드가 특별한 결합 부위에 결합하는 반면, 페닐 보로네이트는 1,2-시스-디올기와 일시적인 공유결합을 형성함으로써 우세하게 상호작용한다. 보로네이트 리간드는, 고도로 글리코실화되어 있는, 가용성 rHuPH20 를 포함하는 적당한 기를 포함하는 임의의 분자에 결합할 것이다.
본원의 방법에 사용되는 아미노 페닐 보로네이트 컬럼은 그것을 통해 정제할 단백질의 부피 및 양에 좌우되어 크기의 범위가 정해질 수 있다. 예시 크기는, 100 L 생물 반응 장치 배양물에서 배양된 세포 유래의 히알루로니다아제의 정제에 사용을 위하여 높이 29 cm, 직경 20 cm 인, 6.3 L 수지가 있는 컬럼, 300 L 생물 반응 장치 배양물에서 배양한 세포 유래의 히알루로니다아제의 정제에 사용을 위하여 높이 29 cm, 직경 30 cm 인, 19 내지 21 L 수지가 있는 컬럼, 2500 L 생물 반응 장치 배양물에서 배양한 세포 유래의 히알루로니다아제의 정제에 사용을 위하여 높이 35 cm, 직경 80 cm 인, 176 L 수지가 있는 컬럼이 포함된다. 당업자는 적당하게 규모를 확대 또는 축소할 수 있다. 아미노 페닐 보로네이트 컬럼의 평형화에 적합한 완충액에는, 예를 들어 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄, pH 7.0 를 포함하는 완충액이 포함된다.
페닐 세파로오스 컬럼-정제된 단백질의 아미노 페닐 보로네이트 컬럼에 대한 로오딩에 후속하여, 컬럼은 적합한 세척 완충액으로 세척한다. 예시 세척 완충액에는, 이에 제한되지 않으나, 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄, pH 7.0, 및 20 mM 비신, 0.5 M 황산암모늄, pH 9.0 및 20 mM 비신, 100 mM NaCl, pH 9.0 이 포함된다. 한 구현예에서, 결합된 히알루로니다아제가 있는 아미노 페닐 보로네이트 컬럼은 먼저 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄, pH 7.0 로 세척한 후, 이어서 20 mM 비신, 0.5 M 황산암모늄, pH 9.0 로 세척하고, 최종적으로 20 mM 비신, 100 mM NaCl, pH 9.0 으로 세척한다. 이어서, 결합된 히알루로니다아제는 예컨대 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7.0 로 용출시킬 수 있다. 당업자는 정제를 비슷하게 수행하기 위해 한가지 이상의 완충액을 변형할 수 있다. 일반적으로, 용출된 가용성 rHuPH20 는 또한 여과하여, 임의의 미생물성 오염물 또는 큰 응집물들을 제거한다.
4. 히드록시아파타이트 컬럼
페닐 보로네이트 컬럼 크로마토그래피에 후속하여, 가용성 rHuPH20 를 포함하는 단백질 용액을 최종 손질 단계(polishing step)에서 히드록시아파타이트 컬럼에 로오딩할 수 있다. 히드록시아파타이트는 분자식이 Ca10(PO4)6(OH)2 인 칼슘 포스페이트의 결정성 형태이다. 이는, 양으로 및 음으로 모두 하전된 부분들의 봉입으로 인한 혼합-양태 이온 교환에 의해 작동하는, 근접하게 공동정제된 단백질의 분리를 위한 손질 단계(polishing step)로서 이용될 수 있다. 각종 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질이 시판되어 이용가능하며, 임의의 이용가능한 재료 형태가 본원의 방법에 이용될 수 있다. 히드록시아파타이트의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 입자를 형성하도록 뭉쳐지고, 고온에서는 안정한 다공성 세라믹 덩어리로 소결되는 것이 포함된다. 입자 크기는, 예컨대 약 1 ㎛ 내지 약 1,000 ㎛ 의 직경 범위와 같이 다양할 수 있다. 다공도도 또한, 약 100 A 내지 약 10,000 A 와 같이 다양할 수 있다.
본원의 방법에 사용되는 히드록시아파타이트 컬럼은 그것을 통해 정제될 단백질의 부피 및 양에 좌우되어, 크기의 범위가 정해질 수 있다. 예시 크기에는, 300 L 생물 반응 장치 배양물에서 배양한 세포 유래의 히알루로니다아제의 정제에 사용하기 위한 높이 20 cm, 직경 30 cm 인, 13 L 수지가 있는 컬럼, 및 2500 L 생물 반응 장치 배양물에서 배양한 세포 유래의 히알루로니다아제의 정제에 사용하기 위한 높이 23 cm, 직경 80 cm 인, 116 L 수지가 있는 컬럼이 포함된다. 당업자는 적당하게 규모를 확대 또는 축소시킬 수 있다.
본원에 기재된 방법을 위해, 히드록시아파타이트 컬럼은 5 mM 인산칼륨, 200 mM NaCl 또는 5 mM 인산칼륨, 200 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0 를 이용하여 평형화될 수 있다. 이와 같은 용액을 이용한 평형화는, 자체로 인산칼륨 및 CaCl2 이 최종 농도 5 mM 및 0.1 mM 로 각각 보충된 부분-정제 히알루로니다아제와 컬럼과 상용성이 되도록 한다. 컬럼에 대한 단백질의 로오딩에 후속하여, 컬럼은, 예를 들어 10 mM 인산칼륨, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0 로 세척하여 임의의 결합되지 않은 오염성 단백질을 제거할 수 있다. 이어서, 결합된 가용성 rHuPH20 는 적당한 용출 완충액으로 용출할 수 있다. 예를 들어, 용출은 70 mM 인산칼륨, pH 7.0 의 첨가로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 용출물은, 예컨대 0.22 ㎛ 필터를 통과하여 여과된다.
6. 바이러스 제거, 단백질 농축 및 완충액 교환
플로잉 컬럼 크로마토그래피로 수득한 가용성 rHuPH20 는 원하는 농도로 원하는 완충액 중에 단백질을 제형화하기 위해 정제후 단계에 적용시킬 수 있다. 단백질은 또한 오염이 없고 치료제로서 이용하기에 적합하도록 보장하기 위해 바이러스 제거 단계에 적용할 수 있다. 바이러스 제거는 일반적으로, 임의의 바이러스 (및 바이러스와 크기가 같거나 또는 더 큰 기타 오염물) 를 가두면서 가용성 단백질만 통과하도록 하는 필터의 이용으로 수행된다. 그러한 필터는 시판되어 이용가능하며, 임의의 것이 본원 방법에 이용될 수 있다. 바이러스 제거에 유용한 필터의 포어 크기는, 이에 제한되지 않으나, 10 nm, 15 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 75 nm 및 100 nm 를 포함한다. 한 구현예에서, 정제된 히알루로니다아제는 20 nm 포어를 포함하는 필터를 통해 여과한다. 단백질은 예를 들어 유량제어 튜브연동식 펌프 (연동 펌프) 로, 또는 가압 탱크의 이용으로 필터에 펌핑해 넣을 수 있다.
바이러스 제거에 후속하여, 가용성 rHuPH20 는 농축하고, 완충액 교환에 적용시킬 수 있다. 가용성 rHuPH20 는 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 11×, 12×, 13× 또는 그 이상 농축될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 약 6× 로 농축된다. 이는, 예를 들어 0.1 mg/mL 내지 50 mg/mL 의 농도를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 정제된 히알루로니다아제는 약 1 mg/mL 로 농축된다. 또다른 구현예에서, 정제된 히알루로니다아제는 약 10 mg/mL 로 농축된다. 당업계에 공지된 임의의 단백질 농축 방법이 이용될 수 있다. 그러한 방법의 예시에는, 분자량 차단 (MWCO) 필터가 있는 접선 유동 여과 (TFF) 시스템을 이용하는 농축이 포함된다. 예를 들어, 정제된 히알루로니다아제는 10 kDa MWCO 나선형 폴리에테르술폰 필터를 통과하여, 단백질 10× 로 농축될 수 있다. 또다른 구현예에서는, 단백질은 일련의 4 개의 30 kDa MWCO 필터를 통해 통과한다. 예를 들어 100 L 및 300 L 배양물과 같은 대규모 히알루로니다아제의 제조를 위해서는, 상기 목적을 위해 표면적이 0.5 내지 5 평방미터인 필터를 채용한다. 일부 구현예에서, 표면적이 1.2 평방미터 또는 2.8 평방미터인 필터를 사용한다.
완충액 교환은 일반적으로 단백질 농축에 후속해 수행하여, 후속 용도, 예를 들어 치료제를 위해 원하는 완충액 중에 단백질을 제형화한다. 당업자는 적당한 완충액을 경험적으로 결정할 수 있다. 적합한 완충액의 예시는, 이에 제한되지 않으나, 10 mM Hepes, 130 mM NaCl, pH 7.0, 및 10 mM 히스티딘, 130 mM NaCl, pH 6.0 을 포함하는 식염수 완충액이다. 정제된 히알루로니다아제는, 일부 구현예에서 멸균 환경에 저장하기 전에, 0.22 ㎛ 캡슐 필터와 같은 또다른 필터를 통해 통과시킬 수 있다.
I. 충전
가용성 rHuPH20 의 제조 및 정제를 위해 본원에 기재된 방법은 또한 충전 단계를 포함하는데, 여기서 정제된 단백질은 장기간 저장 및 사용을 위해 더 작은 용기에 무균상태로 충전된다. 가용성 rHuPH20 는 액체 제형물로서 또는, 예컨대 동결건조에 후속하여, 분말로서 용기에 충전될 수 있다. 대규모 제조를 위해서는, 예를 들어 단백질을 용기에 이동시키는 펌프 및 충전 부피를 측정하는 칭량 스테이션을 포함하는 자동화된 충전 시스템이 일반적으로 사용되고, 널리 이용가능하다. 그러나, 용기의 수동식 충전 또는 자동 및 수동 충전의 조합이 또한 수행될 수 있다. 적합한 용기에는, 이에 제한되지 않으나, 유리 또는 플라스틱 바이알, 블리스터 팩, 병, 관, 흡입기, 펌프, 백, 주사기, 병 또는 임의의 기타 적합한 용기가 포함된다. 적합한 마개 또는 캡이 또한 용기 밀봉에 이용될 수 있다. 충전 전에 필터를 통해 가용성 rHuPH20 를 먼저 통과시켜 미생물성 오염물 및 더 큰 응집물 또는 침전물을 제거할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 적합한 용기에 분취하기 전에 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과할 수 있다. 당업자는 적당한 충전 부피를 결정할 수 있고, 여기에는, 예를 들어 0.1 mL 내지 100 mL 의 부피 범위가 포함된다. 일부 구현예에서, 바이알은 1 mL, 5 mL 또는 20 mL 가용성 rHuPH20 로 무균상태로 충전된다. 용기의 캡핑 또는 폐쇄에 후속하여, 용기를 적당한 온도에서 저장할 수 있다. 일부 구현예에서, 용기는 급속 냉동하여, -15℃ 내지 -35℃ 에서 저장한다. 다른 구현예에서, 용기는 3℃ 내지 15℃ 와 같이 냉장된다. 일반적으로, 액체의 장기간 저장은 더 낮은 온도에서 하여 분해를 최소화한다. 분말 형태의 가용성 rHuPH20 는 심각한 분해없이 실온에서 장기간 저장될 수 있다.
J. 모니터링 및 검정
본원에 기재된 방법은, 각 시점에서의 한가지 이상의 상태, 파라미터 또는 생성물을 측정하여, 하나 이상의 단계에서 모니터링할 수 있다. 이는 최적 조건이 내내 유지되도록 보장할 수 있고, 또한 프로세스의 효율 및 생산성을 평가하기 위해 이용될 수 있다. 모니터링은, 예를 들어 세포 증량 단계, 단백질 생산 단계 (즉, 생물 반응 장치 내에서), 및/또는 단백질 정제 단계 동안 뿐만 아니라, 예컨대 농축/완충액 교환 과정 또는 충전 동안과 같은, 전후 사이의 임의의 시점에 할 수 있다. 모니터링은, 이에 제한되지 않으나, pH, 온도, 부피, 오염, 순도, 단백질 농도, 효소 활성, 세포 생존력 및 세포수 측정을 포함할 수 있다. 프로세스 전반의 조건, 파라미터 또는 생성물을 모니터링하는 것에 추가하여, 최종 생성물로서 제조된 정제된 가용성 rHuPH20 는 또한 예를 들어, 단백질 농도, 효소 활성, 불순물, 오염, 삼투성, 분해, 번역 후 변형 및 단당류 함량에 대해서 평가 및 특징분석될 수 있다.
1. 조건의 모니터링
본원에서 제공하는 방법에서의 하나 이상의 단계 동안의 조건은, 최적 조건이 프로세스를 내내 유지되도록 보장하기 위해 모니터링할 수 있다. 조건들이 최적 범위 내에 있지 않음을 모니터링이 보여주는 경우, 조건을 변경할 수 있다. 모니터링될 수 있는 조건은 각 프로세스마다 다양하다. 예를 들어, 세포 배양 단계 (즉, 생물 반응 장치 내에서의 세포 증량 및 단백질 생산) 동안, 모니터링될 조건에는, 이에 제한되지 않으나, 온도, 세포 배양물 pH, 세포 배양물 영양물 (예를 들어, 글루코오스), CO2 수준 및 O2 수준이 포함된다. 일반적으로, 상기 조건들은 예를 들어, 인큐베이터 또는 생물 반응 장치 내의, 내부장착 시스템을 이용하여 자동으로 모니터링한다.
단백질 정제 단계 동안, 모니터링할 수 있는 조건에는, 이에 제한되지 않으나, pH, 전도도 및 유속이 포함된다. 이들 조건은 하나 이상의 컬럼 크로마토그래피 단계들의 이전, 동안 및/또는 이후에 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 컬럼의 평형화, 세척 또는 용출에 이용되는 완충액이 모니터링될 수 있다. 이는 완충액을 로오딩하기 전에 또는 완충액이 컬럼을 통과한 후 수행될 수 있다.
2. 가용성 rHuPH20 제조의 모니터링
가용성 rHuPH20 제조 및 가용성 rHuPH20 제조에 연관된 파라미터를 프로세스 내내 모니터링할 수 있다. 여기에는, 이에 제한되지 않으나, 세포 수, 세포 생존력, 오염, 단백질 농도, 효소 활성, 순도, 삼투성, 번역후 변형이 포함된다. 이들 파라미터를 평가하는 임의의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 포유동물 세포 생존력은 세포 배양물의 작은 분취량을 취해, 손상된 세포막만을 투과하여 사멸 세포만을 염색하는 트립판 블루로 염색함으로써 평가될 수 있다. 세포는 현미경 하에서 볼 수 있고, 예를 들어 혈구계산기를 이용하여 계수할 수 있다. 기타 방법에는, 대사 활성 측정에 의한 세포 생존력의 평가가 포함된다. 예를 들어, 세포 배양물의 분취물은, 대사가 활발한 세포에 의해 착색된 포르마잔 생성물로 절단되는 테트라졸륨 염 (예를 들어, MTT, XTT 또는 WST-I) 과 함께 인큐베이션할 수 있다.
특정 시료 중의 가용성 rHuPH20 농도는, 이에 제한되지 않으나, 효소-연계 면역흡수 검정 (ELISA); SDS-PAGE; Bradford, Lowry 및/또는 BCA 방법; UV 흡광 및 기타 정량가능한 단백질 표지법, 예컨대 이에 제한되지 않으나 면역학적, 방사활성 및 형광 방법 및 관련된 방법을 포함하는 방법으로 평가할 수 있다. 추가로, 분해의 존재 및 정도는 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크리아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE), 전기영동한 히알루로니다아제-포함 시료의 웨스턴 블롯 및 예를 들어, RP-HPLC 와 같은 크로마토그래피와 같은 표준 기법으로 측정할 수 있다. 히알루로니다아제-포함 시료의 순도는 예를 들어 SDS-PAGE, RP-HPLC, 크기-배제 크로마토그래피, 음이온-교환 크로마토그래피 및 등전점 포커싱 (IEF) 으로 평가할 수 있다. 가용성 rHuPH20-포함 시료, 예컨대 정제된 히알루로니다아제를 포함하는 시료는 추가로, 시알산 및 단당류 함량을 평가하여 특징분석할 수 있다. 이는, 예를 들어 시료를 40% 트리플루오로아세트산으로 가수분해하고, 방출된 단당류를 형광으로 표지하고, 이들을 RP-HPLC 을 이용해 분리하여 수행될 수 있다 (실시예 10 참고).
본원에서 제공하는 방법으로 제조 및 정제된 가용성 rHuPH20 은 또한 번역 후 변형의 존재에 대해 평가할 수 있다. 상기 검정은 당업계에 공지되어 있고, 글리코실화, 히드록실화 및 카르복실화를 측정하는 검정을 포함한다. 글리코실화에 대한 예시 검정에서, 탄수화물 분석은 히드라진분해 또는 엔도글리코시다아제 처리에 노출된 가용성 rHuPH20 의 SDS 페이지 분석으로 수행될 수 있다. 히드라진분해는 무수 히드라진과의 인큐베이션에 의해 당단백질로부터 N- 및 O-연결ㄹ 글리칸을 방출하며, 엔도글리코시다아제 방출은, 당단백질로부터 대부분 N-글리칸을 방출하는 PNGase F 를 수반한다. 가용성 rHuPH20 폴리펩티드의 히드라진분해 또는 엔도글리코시다아제 처리는 형광단 또는 발색단 표지로 태그될 수 있는 환원성 말단을 생성한다. 표지된 가용성 rHuPH20 폴리펩티드는 형광단-보조 탄수화물 전기영동 (FACE) 으로 분석할 수 있다. 글리칸에 대한 형광단 태그는 또한 HPLC 에 의한 단당류 분석, 복잡한 글리코실화 패턴의 프로파일링 또는 핑거프린팅에 이용될 수 있다. 예시 HPLC 방법에는, 친수성 상호작용 크로마토그래피, 전기적 상호작용, 이온-교환, 소수성 상호작용, 및 크기 배제 크로마토그래피가 포함된다. 예시 글리칸 프로브에는, 이에 제한되지 않으나, 3-(아세틸아미노)-6-아미노아크리딘 (AA-Ac) 및 2-아미노벤조산 (2-AA) 이 포함된다. 탄수화물 부분은 또한 글리코실화 히알루로니다아제 폴리펩티드를 인식하는 특이적 항체의 이용을 통해 검출될 수 있다.
β-히드록실화를 측정하는 예시 검정은, 알칼리성 가수분해에 적용된 가용성 rHuPH20 폴리펩티드의 역상 HPLC 분석을 포함한다 (Przysiecki 등 (1987) PNAS 84:7856-7860). 히알루로니다아제 폴리펩티드의 카르복실화 및 γ-카르복실화는 당업계에 공지된 매트릭스-보조 레이저 흡수 이온화 비행 시간 (MALDI-TOF) 분석을 이용하여 평가할 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Harvey 등 J Biol Chem 278:8363-8369, Maum 등 Prot Sci 14:1 171-1 180).
시료 중의 가용성 rHuPH20 의 효소 활성은 본원에 기재된 방법 동안의 임의 의 시점에 평가할 수 있다. 한 구현예에서, 활성은 미세탁도 검정을 이용해 측정한다 (실시예 10 참고). 이는, 히알루론산이 혈청 알부민에 결합할 때의 불용성 침전물의 형성을 근거로 한다. 상기 활성은, 가용성 rHuPH20 을 나트륨 히알루로네이트 (히알루론산) 와 설정된 시간 (예를 들어, 10 분) 동안 인큐베이션한 후, 산성화된 혈청 알부민을 첨가하여 절단되지 않은 나트륨 히알루로네이트를 침전시켜 측정한다. 결과로서 수득한 시료의 탁도는 추가적인 진행 시간 후 640 nm 에서 측정한다. 나트륨 히알루로네이트 기질에 대한 효소 활성으로 인한 결과인 탁도 감소는 가용성 rHuPH20 효소 활성의 측정값이다. 또다른 구현예에서, 효소 활성은 가용성 rHuPH20 을 포함하는 시료와의 인큐베이션 후 잔류하는 바이오틴화된 히알루론산을 측정하는 마이크로타이터 검정을 이용하여 측정한다 (참고문헌은, 예를 들어 Frost 및 Stern (1997) Anal. Biochem. 251: 263-269, U.S.특허 공보 제 20050260186 호). 히알루론산의 글루쿠론산 잔기 상의 유리된 카르복실기를 바이오틴화하고, 바이오틴화된 히알루론산 기질을 마이크로타이터 플레이트에 공유결합으로 커플링시킨다. 가용성 rHuPH20 을 포함하는 시료와의 인큐베이션 후, 잔류하는 바이오틴화된 히알루론산 기질을 아비딘-퍼옥시다아제 반응을 이용하여 검출하고, 공지 활성의 히알루로니다아제 표준과의 반응 후 수득되는 것과 비교한다. 효소 활성을 측정하는 기타 검정이 또한 당업계에 공지되어 있고, 본원의 방법에 이용할 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Delpech 등, (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi 등, (2003) Anal. Biochem. 322:257-263).
임의의 오염물의 존재도 모니터링할 수 있다. 오염물에는, 이에 제한되지 않으나, 미생물성 오염물 (예를 들어, 바이러스, 박테리아 및 마이코플라즈마), 미생물 생성물 오염물 (예를 들어, 내독소) 또는 기타 프로세스-관련 불순물이 포함된다. 임의의 적합한 방법 및 검정이 이용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 및 박테리아는, 시료 내에 그들이 존재하는지 여부를 측정하고, 존재하는 경우 정량하는, 당업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 배양될 수 있다. 현미경이 또한 미생물성 오염물을 검출하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 투과형 전자 현미경 (TEM) 을 이용하여 바이러스 또는 박테리아의 존재에 대해 시료를 평가할 수 있다. 마이코플라즈마 검출은 예를 들어, 이에 제한되지 않으나, 마이코플라즈마-특이적 핵산을 증폭하는 PCR, 마이코플라즈마의 효소를 검출하는 생화학적 시험 및 마이코플라즈마 항원 또는 핵산을 검출하기 위한 세포-기재 형광을 포함하는 생화학적 또는 분자적 기법을 이용하여 수행될 수 있다.
바이러스성 내독소와 같은 미생물 생성물의 존재를 또한 모니터링할 수 있다. 내독소의 존재 검출을 위한 적합한 검정법의 예시는 리물러스 변형세포 용해물 (Limulus Amebocyte Lysate (LAL)) 검정이다. 두가지 유형의 LAL 검정이 이용될 수 있다: 겔 응고 및 광도측정 (발색측정 (chromogenic) 및 탁도측정 (turbometric)). LAL 은 투구게 유래의 혈구 세포 (변형 세포) 의 수성 추출물이다. 내독소는 효소 반응의 캐스캐이드를 촉발하여, 활성화된 혈병형성 효소를 제공한다. 박테리아 내독소의 존재 하에서, 상승된 온도에서는, LAL 시약은 시약 첨가후 혈병을 형성한다. 겔 혈병의 형성은 내독소의 농도에 비례한다. 운동성 검정에서는, LAL 중의 프로엔자임은 그람 음성 박테리아에 의해 생성되는 내독소와 접촉시 활성화된다. 활성화 속도는 존재하는 내독소의 농도에 직접적으로 비례한다. 활성화 수준은 분광측정법으로 측정되는 후속 기질 반응을 통해 측정될 수 있다.
K. 실시예
하기의 실시예들은 오직 설명의 목적으로 포함되는 것이고, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1
가용성 rHuPH20 -발현 세포주의 생성
HZ24 플라스미드 (서열번호: 50 에 개시) 를 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary (CHO 세포)) 를 트랜스펙션하기 위해 이용했다 (참고문헌은, 예를 들어 관련 출원 10,795,095, 11/065,716 및 11/238,171). 가용성 rHuPH20 의 발현을 위한 HZ24 플라스미드 벡터는 pCI 벡터 백본 (Promega), 인간 PH20 히알루로니다아제의 아미노산 1-482 를 인코딩하는 DNA (서열번호: 47), ECMV 바이러스 유래의 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) (Clontech), 및 마우스 디히드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR) 유전자를 포함한다. pCI 벡터 백본은 또한 베타-락타마아제 내성 유전자 (AmpR) 를 인코딩하는 DNA, 복제의 fl 기원, 사이토메갈로바이러스 극초기 인핸서/프로모터 영역 (CMV), 키메라성 인트론 및 SV40 레이트 폴리아데닐화 시그널 (SV40) 을 포함한다. 가용성 rHuPH20 구축물을 인코딩하는 DNA 는, NheI 부위 및 Kozak 컨센서스 서열을, 인간 PH20 의 천연 35 아미노산 시그널 서열의 아미노산 위치 1 에서의 메티오닌을 인코딩하는 DNA 에 앞서 포함하고, 정지 코돈을 서열번호: 1 로 설정한 인간 PH20 히알루로니다아제의 아미노산 위치 482 에 해당하는 타이로신을 인코딩하는 DNA 에 후속하여 포함하고, 이어서 BamHI 제한효소 부위를 포함한다. 따라서, 구축물 pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ24) 은, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 에 의해 분리되는, 인간 PH20 의 아미노산 1 내지 482 (서열번호: 3 로 설정함) 및 마우스 디히드로폴레이트 리덕타아제의 아미노산 1 내지 186 (서열번호: 51 로 설정함) 을 인코딩하는, CMV 프로모터에 의해 구동되는, 단독 mRNA 종을 결과물로 제공한다.
DHFR(-) 세포용의, 4 mM 글루타민 및 18 ml/L Plurionic F68/L (Gibco) 를 보충한 GIBCO 변형 CD-CHO 배지에서 배양한 미-트랜스펙션 DG44 CHO 세포를, 트랜스펙션을 위한 준비에서, 진탕 플라스크 내에 0.5 × 106 세포/ml 로 시딩했다. 세포를 120 rpm 으로 진탕 중인 습식 배양기에서 5% CO2 중 37℃ 에서 배양했다. 기하급수적으로 성장하는 미-트랜스펙션 DG44 CHO 세포를 트랜스펙션에 앞서 생존력에 대해 시험했다.
미-트랜스펙션 DG44 CHO 세포 배양물의 육천만개의 생존성 세포를 펠렛화하고, 0.7 mL 의 2× 트랜스펙션 완충액 (2x HeBS: 40 mM Hepes, pH 7.0, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.4 mM Na2HPO4, 12 mM 덱스트로오스) 중에 2×107 세포의 밀도로 재현탁시켰다. 재현탁 세포의 각 분취물에, 0.09 mL (250 ㎍) 의 선형 HZ24 플라스미드 (ClaI (New England Biolabs) 를 이용한 밤새 소화로 선형화함) 를 첨가하고, 세포/DNA 용액을 실온에서 0.4 cm gap BTX (Gentronics) 전자천공 큐벳으로 옮겼다. 음성 대조군 전자천공은 세포와 혼합된 플라스미드 DNA 없이 수행했다. 세포/플라스미드 믹스는 330 V 및 960 μF 또는 350 V 및 960 μF 의 축전기 방전으로 전기천공했다.
세포는 전기천공 후 큐벳으로부터 제거하고, DHFR(-) 세포를 위한, 4 mM 글루타민 및 18 ml/L Plurionic F68/L (Gibco) 을 보충한 5 mL 의 변형된 CD-CHO 배지에 이동시키고, 습식 배양기 내에서 5% CO2 중에 37℃ 에서 선별없이 6-웰 조직 배양 플레이트의 웰에서 2 일 동안 배양했다.
전기천공 이틀 후, 0.5 mL 의 조직 배양 배지를 각 웰에서 제거하고, 히알루로니다아제 활성의 존재에 대해, 실시예 9 에 기재된 미세탁도 검정을 이용해 시험했다.
표 1: 트랜스펙션 후 40 시간째에 HZ24 트랜스펙 션된 DG44 CHO 세포의 초기 히알루로니다아제 활성
희석배수 활성
유닛/ml
트랜스펙션 1
330V		 1 대 10 0.25
트랜스펙션 2
350V		 1 대 10 0.52
음성 대조군 1 대 10 0.015
트랜스펙션 2 (35OV) 로부터의 세포를 조직 배양 웰로부터 수집하고, 계수하고, mL 당 1 × 104 내지 2 × 104 생존성 세포로 희석했다. 세포 현탁액의 0.1 mL 분취물을, 96-웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트의 5 개의 각 웰에 옮겼다. 4 mM GlutaMAX™-I 보충물 (GIBCO™, Invitrogen Corporation) 을 포함하고, 하이포크산틴 및 티미딘 보충물이 없는 CD-CHO 배지 (GIBCO) 의 100 마이크로리터를, 세포를 포함하고 있는 웰에 추가했다 (최종 부피 0.2 mL).
메토트렉세이트없이 배양한 5 개 플레이트로부터 10 개의 클론을 동정하였다.
동정된 클론의 히알루로니다아제 활성
플레이트/웰 ID 상대적인 히알루로니다아제
1C3 261
2C2 261
3D3 261
3E5 243
3C6 174
2G8 103
1B9 304
2D9 273
4D10 302
6 개의 HZ24 클론을 배양물에서 증량하고, 진탕 플라스크에 단일 세포 현탁액으로서 옮겼다. 클론 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, IE11, 및 4D10 를, 좌측 상단 웰에서 5,000 개의 세포로 출발하여, 플레이트의 아래쪽으로는 1:2 로, 가로질러 1:3 으로 세포를 희석하는 2 차원적 무한 희석 전략을 이용하여 96-웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에 플레이팅했다. 희석한 클론들은 웰 당 500 개의 미-트랜스펙션 DG44 CHO 세포의 배경에서 배양하여, 배양 최초일에 필요한 성장 인자를 제공했다. 서브클론마다 10 개의 플레이트를 만들었고, 여기서 5 개 플레이트는 50 nM 메토트렉세이트를 포함했고, 5 개 플레이트는 메토트렉세이트를 포함하지 않았다.
클론 3D3 는 24 개의 육안으로 보이는 서브클론을 제공했다 (메토트렉세이트 처리가 없는 곳에서 13 개, 50 nM 메토트렉세이트 처리한 곳에서 11 개). 24 개의 서브클론들 중 8 개로부터의 상청액에서 현저한 히알루로니다아제 활성이 측정되었고 (>50 유닛/mL), 이들 8 개의 서브클론들은 T-25 조직 배양 플라스크에서 증량시켰다. 메토트렉세이트 처리 프로토콜로 단리한 클론들은 50 nM 메토트렉세이트의 존재 하에 증량시켰다. 클론 3D35M 은 500 nM 메토트렉세이트에서 더욱 증량시켜, 진탕 플라스크에서 1,000 유닛/ml 의 초과로 클론 생산을 제공했다 (클론 3D35M; 또는 Genl 3D35M). 이어서, 3D35M 세포의 마스터 세포 은행 (MCB) 을 제조했다.
실시예 2
3 D35M 세포에서 가용성 rHuPH20 을 인코딩하는 핵산 영역의 카피수 결정
3D35M 세포에서 가용성 rHuPH20 을 인코딩하는 핵산 영역의 카피수는 정량적 PCR 로 결정했다. 전체 게놈 DNA 를 MCB 로부터의 3D35M 세포로부터 추출했다. 각각 약 6.6 ng DNA (약 100 개의 세포와 동등함) 을 포함하는, DNA 의 6 가지 독립적인 희석물을 분석용으로 두개씩 준비했다. 또한 템플레이트를 포함하지 않는 음성 대조군도 제조하고, 플라스미드 및 1,000 개의 CHO 세포와 동등한 DNA (6.6 ng) 를 포함하는 양성 대조군도 제조했다. TaqMan Universal PCR Master Mix Protocol (Applied Biosystems) 에 따라 반응을 조직하고, 두개씩 진행했다. HZ24 플라스미드의 8 개 희석물을 이용해, 약 5 × 106 내지 49 카피 범위의 플라스미드 DNA 를 대표하는 표준 곡선을 만들었다. 표준을 CHO 대조군 게놈 DNA (100 개의 세포와 동등함) 에 희석했다. TaqMan™ Univeral PCR Master Mix Protocol (Applied Biosystems) 에 따라, HZM3.P1 정방향 프라이머 및 HZM3.P2 역방향 프라이머 (각각 서열번호: 52 및 53 로 설정함) 및, 형광 염료 6FAM (6-카르복시플루오레신) 및 TAMRA (6-카르복시테트라메틸로다민) 를 포함하는, HZM3 프로브 (서열번호:54) 를 이용하여 반응을 조직했다. 반응은 다음의 싸이클링 조건을 이용하여 두개씩 진행했다: 50℃ 에서 2 분, 95℃ 에서 10 분, 후속하여 95℃ 에서 15 초 및 6O℃ 에서 1 분의 40 싸이클. 또한, 각 DNA 샘플에 대한 GAPDH 카피를 검정하기 위한 표준 정량적 PCR 반응도 수행했다. ABI Prism 7700™ Sequence Detection System 소프트웨어 버젼 1.9 (Applied Biosystems) 로 데이터를 수집했다.
세포 당 표적 유전자 카피수는, 표적 카피 (가용성 rHuPH20) 대 3D35M 게놈 DNA 의 6 개의 희석물에 대한 정규화된 카피 (GAPDH) 의 비율로 계산했다. 데이터 셋트에 Dixon Q Outlier 통계 테스트를 적용했다. 3D35M 세포에서의 sHuPH20 영역의 카피수는 317.87 ± 11.64 인 것으로 나타났다.
실시예 3
Gen1 가용성 rHuPH20 의 제조 및 정제
A. 5 L 생물 반응 장치 프로세스
3D35M 의 바이알을 해동하고, 100 nM 메토트렉세이트 및 40 mL/L GlutaMAX™-I (Invitrogen; 200 mM 모액(stock solution)) 을 보충한 CD CHO (Invitrogen, Carlsbad Calif.) 에서 1 L 스피너 플라스크를 통해 T-25 플라스크로부터 증량시켰다. 세포는 스피너 플라스크로부터 5 L 생물 반응 장치 (Braun) 로, 5 L 배지 중에 ml 당 4 × 105 개의 생존성 세포의 접종 밀도로 이동시켰다. 파라미터는 용존 산소 설정점 25% 및 공기 오버레이 0 내지 100 cc/분으로 한, 온도 설정점 37℃, pH 7.2 (출발 설정점) 였다. 168 시간째에, 250 ml 의 제 1 피드 배지 (50 g/L 글루코오스가 있는 CD CHO) 를 첨가했다. 216 시간째에, 250 ml 의 제 2 피드 배지 (50 g/L 글루코오스 및 10 mM 나트륨 부티레이트가 있는 CD CHO) 를 첨가하고, 264 시간째에 250 ml 의 제 2 피드 배지를 첨가했다. 이러한 프로세스는 최대 세포 밀도 6 × 106 세포/mL 으로, ml 당 1,600 유닛의 최종 생산성을 제공했다. 나트륨 부티레이트의 첨가는 제조 최종 단계에서 가용성 rHuPH20 의 생산을 촉진시켰다.
3D35M 클론으로부터의 조건화된 배지는 10 mM Hepes pH 7.0 으로의 심층 여과 및 접선 유동 정용여과에 의해 정화했다. 이어서, 가용성 rHuPH20 은 Q 세파로오스 (Pharmacia) 이온 교환, 페닐 세파로오스 (Pharmacia) 소수성 상호작용 크로마토그래피, 아미노 페닐 보로네이트 (ProMedics) 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피 (Biorad, Richmond, CA) 에 의한 연쇄적인 크로마토그래피로 정제했다.
가용성 rHuPH20 는 Q 세파로오스에 결합되고, 동일한 완충액 내에서 400 mM NaCl 로 용출되었다. 용출물을 2 M 황산암모늄을 이용하여 최종 농도 500 mM 황산암모늄으로 희석하고, 페닐 세파로오스 (로우 서브) 컬럼을 통해 통과시킨 후, 동일한 조건 하에 페닐 보로네이트 수지에 결합시켰다. 가용성 rHuPH20 는, pH 9.0 에서 황산암모늄 없이 50 mM 비신 (bicine) 에서 세척 후 Hepes pH 6.9 에서 페닐 세파로오스 수지로부터 용출했다. 용출액을 5 mM 인산칼륨 및 1 mM CaCl2 중 pH 6.9 에서 세라믹 히드록시아파타이트 수지 상에 로오딩하고, 0.1 mM CaCl2 이 있는 80 mM 인산칼륨, pH 7.4 를 이용해 용출했다.
결과물인 가용성 rHuPH20 는 미세탁도 검정 (실시예 9 참조) 에서 65,000 유닛/mg 단백질의 초과의 비활성을 보유했다. 정제된 가용성 rHuPH20 는, 0.1% TFA/H2O 내지 0.1% TFA/90% 아세토니트릴/10% H2O 사이의 구배가 있는 Pharmacia 5RPC 스티렌 디비닐벤젠 컬럼으로부터 24 내지 26 분에 단일 피크로서 용출되고, SDS 전기영동에 의해, PNGASE-F 를 이용한 처리시 샤프한 51 kDa 밴드로 감소되어 나오는, 단일한 넓은 61 kDa 밴드로서 결정되었다. N-말단 아미노산 서열분석은 리더 펩티드가 유효하게 제거되었음을 밝혀냈다.
B. 100 L 생물 반응 장치 세포 배양으로의 상향 세포 배양 증량 프로세스
3D35M 세포의 4 가지 상이한 바이알로부터 개별적으로 가용성 rHuPH20 를 정제하기 위해 스케일업(규모확장) 프로세스를 이용해, sHuPH20 의 4 가지 구분되는 뱃치를 제조했다; HUA0406C, HUA0410C, HUA0415C 및 HUA0420C. 각각의 바이알을 개별적으로 증량시키고, 125 L 생물 반응 장치를 통해 배양하고, 이어서 컬럼 크로마토그래피를 이용해 정제했다. 프로세스 내내 시료를 취해 효소 수율로서 상기 파라미터드들을 평가했다. 하기에 제공하는 프로세스의 설명은, 생물 반응 장치 출발 및 피드 배지 부피, 이동 세포 밀도, 및 세척 및 용출 부피와 같은 대표적인 세부사항들을 제공한다. 정확한 수치는 각 뱃치마다 약간씩 다르며, 표 3 내지 10 에 상세하게 기재한다.
3D35M 세포의 4 개의 바이알을 37℃ 수조에서 해동시키고, 100 nM 메토트렉세이트 및 40 mL/L GlutaMAX™-I 을 함유하는 CD CHO 를 첨가하고, 세포를 원심분리했다. 세포를 20 mL 의 신선한 배지가 있는 125 mL 진탕 플라스크에서 재분산시키고, 37℃, 7% CO2 인큐베이터에 두었다. 세포를 125 mL 진탕 플라스크에서 40 mL 까지 증량시켰다. 세포 밀도가 1.5 내지 2.5 × 106 세포/mL 에 도달하면, 배양물을 100 mL 배양 부피의 125 mL 스피너 플라스크로 증량시켰다. 플라스크를 37℃, 7% CO2 에서 인큐베이션했다. 세포 밀도가 1.5 내지 2.5 × 106 세포/mL 에 도달하면, 배양물을 200 mL 배양 부피의 250 mL 스피너 플라스크로 증량시키고, 플라스크를 37℃, 7% CO2 에서 인큐베이션했다. 세포 밀도가 1.5 내지 2.5 × 106 세포/mL 에 도달하면, 배양물을 800 mL 배양 부피의 1 L 스피너 플라스크로 증량시키고, 37℃, 7% CO2 에서 인큐베이션했다. 세포 밀도가 1.5 내지 2.5 × 106 세포/mL 에 도달하면, 배양물을 5 L 배양 부피의 6 L 스피너 플라스크로 증량시키고, 37℃, 7% CO2 에서 인큐베이션했다. 세포 밀도가 1.5 내지 2.5 × 106 세포/mL 에 도달하면, 배양물을 20 L 배양 부피의 36 L 스피너 플라스크로 증량시키고, 37℃, 7% CO2 에서 인큐베이션했다.
125 L 반응기를 수증기로 121℃, 20 PSI 에서 멸균시키고, 65 L 의 CD CHO 배지를 첨가했다. 사용 전에, 반응기를 오염에 대해 체크했다. 36 L 스피너 플라스크 내 세포 밀도가 1.8 내지 2.5 × 106 세포/mL 에 도달하면, 20 L 세포 배양물을 36 L 스피너 플라스크로부터 125 L 생물 반응 장치 (Braun) 로 옮겨, 최종 부피 85 L 및 시딩 밀도 약 4 × 105 세포/mL 가 되도록 했다. 파라미터는, 온도 설정점, 37℃; pH: 7.2; 용존 산소: 25% ± 10%; 임펠러 속도 50 rpm; 용기 압력 3 psi; 공기 분사 1 L/ min.; 공기 오버레이: 1 L/분이었다. 반응기는 세포 계수, pH 확인, 배지 분석, 단백질 제조 및 잔류에 대해 매일 샘플링했다. 영양 피드를 가동하는 동안 첨가했다. 6 일째에, 3.4 L 의 피드 #1 배지 (CD CHO + 50 g/L 글루코오스 + 40 mL/L GlutaMAX™-I) 를 첨가하고, 배양 온도를 36.5℃ 로 변경했다. 9 일째에, 3.5 L 의 피드 #2 배지 (CD CHO + 50 g/L 글루코오스 + 40 mL/L GlutaMAX™-I + 1.1 g/L 나트륨 부티레이트) 를 첨가하고, 배양 온도를 36℃ 로 변경했다. 11 일 째에, 3.7 L 의 피드 #3 배지 (CD CHO + 50 g/L 글루코오스 + 40 mL/L GlutaMAX™-I + 1.1 g/L 나트륨 부티레이트) 를 첨가하고, 배양 온도를 35.5℃ 로 변경했다. 반응기는 14 일째에, 또는 세포의 생존력이 50% 미만으로 떨어졌을 때 수확했다. 프로세스는 최대 세포 밀도 8 백만 세포/mL 로 효소 활성이 1,600 유닛/ml 인 가용성 rHuPH20 의 제조를 결과로 제공했다. 수확시, 배양물은 시험관내 및 생체내에서의 마이코플라즈마, 멸균유효성 (bioburden), 내독소 및 바이러스, 바이러스 입자에 대해 투과형 전자 현미경 (TEM), 및 효소활성에 대해 샘플링했다.
100 리터의 생물 반응 장치 세포 배양 수확물을, 폴리에테르술폰 매질 (Sartorius) 을 가진 일련의 1 회용 캡슐 필터를 통해 여과했다: 100 L 멸균 저장 백으로 최초 8.0 ㎛ 깊이 캡슐, 0.65 ㎛ 깊이 캡슐, 0.22 ㎛ 캡슐을 통해, 최종적으로는 0.22 ㎛ Sartopore 2000 cm2 필터를 통과시킴. 배양물은 나선형 폴리에테르술폰 30 kDa MWCO 필터 (Millipore) 가 있는 2 개의 TFF 를 이용해 10× 농축하고, 후속하여 10 mM HEPES, 25 mM Na2SO4, pH 7.0 를 이용해 0.22 ㎛ 최종 필터 내로, 20 L 멸균 저장 백 내로 6× 완충액 교환을 했다. 표 3 은 세포 배양, 수확, 농축 및 완충액 교환 단계와 관련된 모니터링 데이터를 제공한다.
세포 배양, 수확, 농도 및 완충액 교환 단계에 대한 모니터링 데이터
파라미터 HUA0406C HUA04010C HUA0415C HUA0420C
해동부터 100 L 생물 반응 장치 접종까지의 시간 (경과일) 21 19 17 18
100 L 접종 밀도 (×106 세포/mL) 0.45 0.33 0.44 0.46
대수적 성장에서 2 배수가 되는 시간 (시간) 29.8 27.3 29.2 23.5
최대 세포 밀도(×106 세포/mL) 5.65 8.70 6.07 9.70
수확물 생존력 (%) 41 48 41 41
수확물 역가 (U/ml) 1964 1670 991 1319
100-L 생물 반응 장치에서의 경과시간 (경과일) 13 13 12 13
정화된 수확물 부피 (mL) 81800 93300 91800 89100
정화된 수확물 효소 검정 (U/mL) 2385 1768 1039 1425
농축 효소 검정 (U/mL) 22954 17091 8561 17785
완충액 교환 농축 효소 검정 (U/mL) 15829 11649 9915 8679
여과된 완충액 교환 농축 효소 검정 (U/mL) 21550 10882 9471 8527
완충액교환 농축 부피(mL) 10699 13578 12727 20500
농축물/수확물 효소 유닛 비율 0.87 0.96 1.32 1.4
Q 세파로오스 (Pharmacia) 이온 교환 컬럼 (3 L 수지, 높이 = 20 cm, 직경 = 14 cm) 을 준비했다. 세척 시료들을 pH, 전도도 및 내독소 (LAL) 검정 측정을 위해 수집했다. 컬럼을 5 컬럼 부피의 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 를 이용해 평형화했다. 농축시킨, 정용여과한 수확물을 Q 컬럼 상에 100 cm/hr 의 유속으로 로오딩했다. 컬럼을 5 컬럼 부피의 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 및 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0 로 세척했다. 단백질을 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0 로 용출시키고, 0.22 ㎛ 최종 필터를 통해 멸균 백으로 여과했다.
이어서, 페닐-세파로오스 (Pharmacia) 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행했다. 페닐-세파로오스 (PS) 컬럼 (9.1 L 수지, 높이 = 29 cm, 직경 = 20 cm) 를 준비했다. 컬럼을 5 컬럼 부피의 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0 으로 평형화시켰다. 상기로부터의 단백질 용출물에 2M 황산암모늄, 1 M 인산칼륨 및 1 M CaCl2 모액(stock solution)을 보충하여 최종 농도가 각각 5 mM, 0.5 M 및 0.1 mM 가 되도록 했다. 단백질을 PS 컬럼 상에 100 cm/hr 의 유속으로 로오딩했다. 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄 및 0.1 mM CaCl2 pH 7.0 을 100 cm/hr 으로 첨가했다. 유출물을 0.22 ㎛ 최종 필터를 통해 멸균 백으로 통과시켰다.
PS-정제된 단백질을 5 컬럼 부피의 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄으로 평형화시킨 아미노페닐 보로네이트 컬럼 (ProMedics) (6.3 L 수지, 높이 = 20 cm, 직경 = 20cm) 상에 로오딩했다. 단백질을 컬럼을 통해 100 cm/hr 의 유속으로 통과시키고, 컬럼을 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄, pH 7.0 으로 세척했다. 이어서, 컬럼을 20 mM 비신, 100 mM NaCl, pH 9.0 으로 세척하고, 단백질을 50 mM Hepes, 100 mM NaCl pH 6.9 를 이용해 멸균 필터를 통해 20 L 멸균 백으로 용출시켰다. 용출물을 멸균유효성, 단백질 농도 및 효소 활성에 대해 시험했다.
히드록시아파타이트 (HAP) 컬럼 (BioRad) (1.6 L 수지, 높이 = 10 cm, 직경 = 14 cm) 을 5 mM 인산칼륨, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2 pH 7.0 로 평형화했다. 세척 시료를 수집하고, pH, 전도도 및 내독소 (LAL 검정) 에 대해 시험했다. 아미노페닐 보로네이트 정제 단백질에 인산칼륨 및 CaCl2 을, 최종 농도 5 mM 인산칼륨 및 0.1 mM CaCl2 을 수득하도록 보충하고, HAP 컬럼 상에 100 cm/hr 의 유속으로 로오딩했다. 컬럼을 5 mM 인산칼륨 pH 7.0, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2 로 세척한 후, 10 mM 인산칼륨 pH 7.0, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2 pH 로 세척했다. 단백질은 70 mM 인산칼륨 pH 7.0 로 용출하고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 5 L 멸균 저장 백으로 여과했다. 용출물을 멸균유효성, 단백질 농도 및 효소 활성에 대해 시험했다.
이어서, HAP-정제된 단백질을 가압 탱크를 경유해 20 nM 바이러스 제거 필터를 통해 펌핑했다. 단백질을 DV20 가압 탱크 및 필터 (Pall Corporation) 에 넣고, 20 nm 포어가 있는 Ultipor DV20 Filter (Pall Corporation) 를 통해 멸균 20 L 저장백으로 통과시켰다. 여과액을 단백질 농도, 효소 활성, 올리고당류, 단당류 및 시알산 프로파일링, 및 프로세스-관련 불순물에 대해 시험했다. 이어서, 여과액 중의 단백질을 10 kD 분자량 차단 (MWCO) Sartocon Slice 접선 유동 여과 (TFF) 시스템 (Sartorius) 을 이용하여 1 mg/mL 로 농축했다. 필터는 먼저 Hepes/식염수 용액 (10 mM Hepes, 130 mM NaCl, pH 7.0) 으로 세척하여 준비하고, 침투물은 pH 및 전도도에 대해 샘플링했다. 농축에 후속하여, 농축한 단백질을 샘플링하고, 단백질 농도 및 효소 활성에 대해 시험했다. 6× 완충액 교환을 농축한 단백질에 대해 다음과 같은 최종 완충액 내로 수행했다: 10 mM Hepes, 130 mM NaCl, pH 7.0. 농축한 단백질을 0.22 ㎛ 필터를 통해 20 L 멸균 저장 백으로 통과시켰다. 단백질을 샘플링하고, 단백질 농도, 효소 활성, 유리된 술프히드릴기, 올리고당류 프로파일링 및 삼투성에 대해 시험했다.
표 4 내지 10 은 각각의 3D35M 세포 로트(lot)에 대한, 상기 기재된 각각의 정제 단계와 관련된 모니터링 데이터를 제공한다.
Q 세파로오스 컬럼 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
로오드 부피 (mL) 10647 13524 12852 20418
로오드 부피/수지 부피 비율 3.1 4.9 4.5 7.3
컬럼 부피 (mL) 2770 3840 2850 2880
용출액 부피 (mL) 6108 5923 5759 6284
용출액의 단백질 농도 (mg/mL) 2.8 3.05 2.80 2.86
용출액 효소 검정 (U/mL) 24493 26683 18321 21052
효소 수율 (%) 65 107 87 76
페닐 세파로오스 컬럼 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
모액 첨가 전의 부피 (mL) 5670 5015 5694 6251
로오드 부피 (mL) 7599 6693 7631 8360
컬럼 부피 (mL) 9106 9420 9340 9420
로오드 부피/수지 부피 비율 0.8. 0.71 0.82 0.89
용출액 부피 (mL) 16144 18010 16960 17328
용출액의 단백질 농도 (mg/mL) 0.4 0.33 0.33 0.38
용출액 효소 검정 (U/mL) 8806 6585 4472 7509
단백질 수율 (%) 41 40 36 37
효소 수율 (%) 102 88 82 96
아미노페닐 보로네이트 컬럼 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
로오드 부피 (mL) 16136 17958 16931 17884
로오드 부피/수지 부피 비율 2.99 3.15 3.08 2.98
컬럼 부피 (mL) 5400 5700 5500 5300
용출액 부피 (mL) 17595 22084 20686 19145
용출액의 단백질 농도 (mg/mL) 0.0 0.03 0.03 0.04
여과된 용출액의 단백질 농도 (mg/mL) 시험하지 않음 0.03 0.00 0.04
용출액 효소 검정 (U/mL) 4050 2410 1523 4721
단백질 수율 (%) 0 11 11 12
효소 수율 (%) 미측정 41 40 69
히드록시아파타이트 컬럼 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
모액 첨가 전의 부피 (mL) 16345 20799 20640 19103
로오드 부피/수지 부피 비율 10.95 13.58 14.19 12.81
컬럼 부피 (mL) 1500 1540 1462 1500
로오드 부피 (mL) 16429 20917 20746 19213
용출액 부피 (mL) 4100 2415 1936 2419
용출액의 단백질 농도 (mg/mL) 시험하지 않음 0.24 0.17 0.23
여과된 용출액의 단백질 농도 (mg/mL) NA NA 0.17 NA
용출액 효소 검정 (U/mL) 14051 29089 20424 29826
단백질 수율 (%) 시험하지 않음 93 53 73
효소 수율 (%) 87 118 140 104
DV8 여과 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
출발 부피 (mL) 4077 2233 1917 2419
여과액 부피 (mL) 4602 3334 2963 3504
여과액의 단백질 농도 (mg/mL) 0.1 NA 0.09 NA
여과된 용출액의 단백질 농도 (mg/mL) NA 0.15 0.09 0.16
단백질 수율 (%) 시험하지 않음 93 82 101
최종 농축 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
출발 부피 (mL) 4575 3298 2963 3492
농축 부피 (mL) 562 407 237 316
농축물의 단백질 농도 (mg/mL) 0.9 1.24 1.16 1.73
단백질 수율 (%) 111 102 103 98
최종 제형물로의 완충액 교환 데이터
파라미터 HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
출발 부피 (mL) 562 407 237 316
완충액 교환 농축물의 최종 부피 (mL) 594 516 310 554
농축물의 단백질 농도 (mg/mL) 1.00 0.97 0.98 1.00
여과된 농축물의 단백질 농도 (mg/mL) 0.95 0.92 0.95 1.02
단백질 수율 (%) 118 99 110 101
정제 및 농축한 가용성 rHuPH20 단백질을 5 mL 및 1 mL 충전 부피를 가진 멸균 바이알에 무균으로 충전했다. 단백질을 0.22 ㎛ 필터를 통해, 중력측정 검독을 이용하는, 바이알 충전에 이용되는 작동자 조절 펌프로 통과시켰다. 바이알을 마개로 막고, 권축 캡으로 봉인했다. 폐쇄한 바이알을 외래 입자에 대해 육안으로 관찰하고 표시했다. 표시 후, 바이알을 1 분 이하로 액체 질소 내에 침잠시켜 급속냉각시키고, -15℃ 이하 (-20 ± 5℃) 로 저장했다. 이 방법을 이용한 가용성 rHuPH20 의 제조 및 정제로 96,000 유닛/mg 내지 144,000 유닛/mg 의 비활성을 가진 약 400 내지 700 mg 의 가용성 rHuPH20 을 수득했다.
실시예 4
Gen2 가용성 rHuPH20 의 제조
상기 기재한 Gen1 3D35M 세포주를 더 높은 메토트렉세이트 수준에 적응시켜, Gen2 클론을 제조했다. 3D35M 세포를 확립된 메토트렉세이트-포함 배양물로부터, 8 mM GlutaMAX™-I 및 1.0 μM 메토트렉세이트를 함유하는 CD CHO 배지로 시딩했다. 37℃, 7% CO2 습식 배양기에서 세포를 46 일에 걸쳐 배양 및 9 회 계대하여 세포를 더 높은 메토트렉세이트 수준에 적응시켰다. 세포의 증폭된 집단을, 2.0 μM 메토트렉세이트가 있는 배지를 포함하는 96-웰 조직 배양 플레이트에서의 제한 희석으로 클로닝했다. 약 4 주 후, 클론들을 동정하고, 클론 3E10B 을 증량을 위해 선별했다. 3E10B 세포를 8 mM GlutaMAX™-I 및 2.0 μM 메토트렉세이트를 포함하는 CD CHO 배지에서, 트립판 블루 염색 및 혈구계산기를 이용한 계수에 의하여 세포 생존력을, 및 미세탁도 검정 (하기 실시예 9 에 기재함)에 의하여 효소활성을 시험하며 20 계대 동안 배양했다. 3E10B 세포주의 마스터 세포 은행 (MCB) 을 만들어내고, 냉동하고, 후속 연구에 이용했다.
8 mM GlutaMAX™-I 및 4.0 μM 메토트렉세이트를 포함하는 CD CHO 배지에서의 3E10B 세포 배양으로 세포주의 증폭을 계속했다. 12 번째 계대 후, 세포를 리서치 세포 은행 (RCB) 으로서 바이알에 냉동시켰다. RCB 의 1 개 바이알을 해동하고, 8.0 μM 메토트렉세이트를 포함하는 배지에서 배양했다. 5 일 후, 배지 중 메토트렉세이트 농도를 16.0 μM 로 증가시키고, 이후 18 일 후에는 20.0 μM 로 증가시켰다. 20.0 μM 메토트렉세이트를 포함하는 배지 중의 8 번째 계대 유래의 세포를 4 mM GlutaMAX™-I 및 20.0 μM 메토트렉세이트를 포함하는 CD CHO 배지를 포함하는 96-웰 조직 배양 플레이트에서의 제한 희석으로 클로닝했다. 클론 1B3, 2B2 및 5C1 를 5 내지 6 주 후 동정했다. 3D35M 의 9 번째 계대로부터의 세포를 또한 8 mM GlutaMAX™-I 및 20.0 μM 메토트렉세이트를 함유하는 CD CHO 배지가 있는 96-웰 조직 배양 플레이트에서의 제한 희석으로 클로닝하고, 클론 1G11, 2E10 및 2G10 을 동정했다.
각각의 1B3, 2B2, 5C1, 1G11, 2E10 및 2G10 의 세포 배양물을 4 × 1O5 세포/mL 의 세포 밀도로 250 mL 진탕 플라스크 내 50 mL 의 부피에 시딩했다. 배양물은 10 내지 14 일 동안 추가적인 피드 없이 배양 및 쇠퇴하도록 두어, 세포의 성장 속도 및 생산성을 측정했다. 시료를 정기적으로 취해, 히알루로니다아제 활성에 대해 검정했다 (표 11 및 12).
1B3, 2B2 및 5C1 세포의 히알루로니다아제 활성
접종 후
경과시간 		세포 배양물에서의 가용성 rHuPH20 효소 활성 (유닛)
1B3 2B2 5 C1
74 382
95 942
101 582
142 2287
144 955
169 1200
195
238 1611
242 2139
265 3070
336 2252
1B3, 2B2 및 2E10 세포의 히알루로니다아제 활성
접종 후
경과시간 		세포 배양물에서의 가용성 rHuPH20 효소 활성 (유닛)
1B3 2B2 2 E10
98 470
123 1179
143 2228
216 2814
290 2860
291 2542
337 2992
4 개의 세포주 (2B2, 2G10, 1G11 및 2E10) 는, 250 mL 진탕 플라스크 내 50 mL 의 부피에 4 × 105 세포/mL 의 밀도로 전부 시딩하는 연구에서 비교했다. 전체에 50 g/L 글루코오스, 40 g/L 효모 추출물 및 1.1 g/L 나트륨 부티레이트를 보충한 CD CHO 배지를 포함하는 배양 배지로, 8 일째에는 10% (v/v) 피드 및 5% 피드를 제공했다. 세포를 15 일째에 수확했다. 시료를 정기적으로 취해, 가용성 rHuPH20 효소 활성에 대해 검정했다 (표 13).
2E10, IG11, 2G10 및 2B2 세포의 히알루로니다아제 활성
접종 후 경과시간 세포 배양물에서의 가용성 rHuPH20 효소 활성 (유닛)
2 E10 1 G11 2 G10 2B2
122 991 87 1688
124 878
194 2151 1387 2430
196 2642
285 6231 3831 7952
287 8822
364 5880 2955 11064
366 15684
뱃치식 및 공급-뱃치식 조건의 두가지 모두에서, 나머지 세포들 (예를 들어, 2G10 세포) 도 우수한 효소 생산성을 나타냈지만, 2B2 세포의 배양물은 더 높은 활성을 나타내, 2B2 세포주를 20.0 μM 메토트렉세이트를 함유하는 배지에서의 증량을 위해 선택했다. 11 번째 계대 후, 2B2 세포를 리서치 세포 은행 (RCB) 으로서 바이알에 냉동시켰다.
실시예 5
3 E10B 및 2B2 세포에서 제조된 가용성 rHuPH20 의 효소 활성
3E10B 및 2B2 세포에서 제조된 가용성 rHuPH20 를 미세탁도 검정 (실시예 9) 을 이용해 효소 활성에 대해 검정했다. 3E10B 및 2B2 세포 은행의 냉동시킨 바이알을 해동시키고, 세포를 습식 배양기 내 37℃, 6% CO2 에서의, 성장 배지 (8 mM GlutaMAX™-I 및, 3E10B 세포에 대해서 2.0 μM 메토트렉세이트, 또는 2B2 세포에 대해서 20.0 μM 메토트렉세이트를 포함하는 CD CHO 배지) 에서 2 계대에 대해 개별적으로 배양했다. 세포를 5 × 105 세포/mL 로 125 mL Erlenmeyer 플라스크 (Corning) 중의 20 mL 성장 배지에 접종하고, 약 100 rpm 으로 회전하는 진탕 플랫폼이 있는 습식 배양기에서 37℃, 6% CO2 로 8 일 동안 배양했다. 8 일 및 10 일 째에, 배양물에 50 g/L 글루코오스, 50 g/L 효모 추출물 및 2.2 g/L (20 mM) 나트륨 부티레이트를 보충한 CD CHO 배지를 포함하는 피드 배지를 5% v/v 로 제공하여 생산 단계를 개시했다. 생산 단계 동안 8 일째 (190 시간째), 10 일째 (240 시간째), 14 일째 (332 시간째), 15 일째 (258 시간째), 16 일째 (382 시간째) 및 18 일째 (427 시간째) 에 배양물을 샘플링하고, 생존력을 0 으로 떨어지게 했다. 이어서, 샘플을 히알루로니다아제 활성에 대해 분석했다.
표 14 및 15 는 3E10B 및 2B2 세포의 각 시점에서의 생존력 (생존성 세포 밀도 (VCD) 및 백분율 생존력) 및 활성 (유닛/플라스크) 을 제공한다. 2B2 세포에 의해 생산된 가용성 rHuPH20 의 효소 활성은 3E10B 세포에 의해 생산된 것보다 일관되게 더 높았다. 예를 들어, 8 일째에, 2B2 세포에 의해 생산된 가용성 rHuPH20 의 효소 활성은 3E10B 세포에 의해 생산된 것보다 69% 더 높았다 (2484 유닛/mL 대 1469 유닛/mL). 생산 단계를 통틀어 비슷한 경향이 관찰되었다. 세포 배양물의 생존력은 비슷한 속도로 감소했다. 세포의 생산 속도를 계산할 때, 3E10B 세포는 8 일째에 1 일 한 세포당 (per cell per day; pcd) 0.23 피코그램의 가용성 rHuPH20 를 생산했고, 15 째에는 0.38 pcd 였다. 대조적으로, 2B2 세포는 8 일째에 0.46 피코그램의 가용성 rHuPH20 pcd 를, 15 일째에는 0.69 pcd 를 생산하였고, 이는 3E10B 에 의해 8 일째 및 15 일째 각각 생산된 것보다 100% 및 82% 더 높았다는 것이 관찰되었다. 이어서, 후속 연구를 위해 B2B 세포의 마스터 세포 은행 (MCB) 을 제작했다.
클론 3E10B 의 생존력 및 활성
접종 후 경과시간 VCD % 생존력 활성 (유닛/ mL ) 부피( mL )
0 5 99 0 20
190 79.8 96 1469 20
240 61.6 76 2388 20
332 16.8 22 5396 20
358 16.4 17 5628 20
382 8.4 10 6772 20
427 0 0 6476 20
플라스크 당 총 활성 (유닛) (U/mL 곱하기 부피 (mL)): 129520
클론 2B2 의 생존력 및 활성
접종 후 경과시간 VCD % 생존력 활성 (유닛/플라스크) 부피 ( mL )
0 5 99 0 20
190 68 94 2484 20
240 77.6 89 3532 20
332 32 38 8196 20
358 15.8 17 9680 20
382 9.8 13 10788 20
427 0 0 10044 20
플라스크 당 총 활성 (유닛) (U/mL 곱하기 부피 (mL)): 200880
실시예 6
2B2 세포의 유전적 안정성 시험
A. 2B2 세포에서 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 핵산 영역의 카피수 결정
2B2 세포에서 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 핵산 영역의 카피수를 PCR 로 결정했다. 전체 게놈 DNA 를, MCB 로부터의 2 × 107 2B2 세포로부터 QIAamp DNeasy 키트 (Qiagen) 를 이용해 추출했다. 게놈 DNA 은 또한 음성 대조군으로서의 DG-44 CHO 세포로부터 추출했다. 추출한 DNA 의 순도는 아가로스 겔 전기영동 및 UV 분광계로 확인했다. DNA 의 절편(고분자량 DNA 와 대비되는)을 생성하기 위해, 게놈 DNA 를 초음파처리로 전단시켰다. 이는 더욱 정확한 피펫팅 및 템플레이트 접근성을 보장해준다. 2B2 및 DG-44 세포로부터의 게놈 DNA 의 6 가지 독립적인 희석물(약 1000 세포/μl 와 동등한 희석에 해당하는 양의)을 제조하고, 두가지 검정법에서 두번씩 분석했다; 표적 검정으로서, 가용성 rHuPH20 플라스미드 DNA 를 인코딩하는 핵산 영역에 특이적인 서열을 표적으로 하고 증폭하는 검정, 및 내재성 대조군으로서, GAPDH 서열을 표적으로 하고 증폭하는 것. 내재성 대조군은 그 결과를 정규화하는 것으로써 이용했다. 표적 검정은 DG-44 CHO 게놈 DNA 에 혼합된 공지된 양의 HZ24 플라스미드의 일련의 희석물로부터 만들어낸 표준 곡선을 포함했다. 내재성 대조군은 HZ24 플라스미드 DNA 와 혼합된 DG-44 CHO 게놈 DNA 의 일련의 희석물로부터 만든 표준 곡선을 포함했다. 포유류 게놈 크기는 3 × 109 염기쌍으로 가정했다. 각각의 검정은 음성 대조군 (템플레이트 없음) 및 양성 대조군 (표적 검정에 대해서는 HZ24 플라스미드 DNA, 내재성 대조군 정규화 검정에 대해서는 숙주 세포 DNA) 을 포함했다. 반응물은 HZM3.P1 정방향 프라이머 및 HZM3.P2 역방향 프라이머 (각각 서열번호: 52 및 53 으로 설정함) 및 형광 염료 6FAM (6-카르복시플루오레신) 및 TAMRA (6-카르복시테트라메틸로다민) 을 포함하는 HZM3 프로브 (서열번호: 54) 를 이용하여 제조했다. 시료는 표준 싸이클링 조건 (50℃ 에서 2 분, 95℃ 에서 10 분, 95℃ 에서 15 초 및 60℃ 에서 1 분, 40 싸이클) 으로 Applied Biosystems Prism® 7900 Sequence Detection System 을 이용하여 증폭했다.
세포 당 표적 유전자 카피수는, 2B2 게놈 DNA 의 6 개 희석물에 대해 정규화된 카피 (GAPDH) 에 대한 표적 카피의 비율로 계산했다. Dixon Q Outlier 통계학 시험을 데이터 셋트에 적용했다. 2B2 세포에서 가용성 rHuPH20 플라스미드를 인코딩하는 핵산의 카피수는 206.61 ± 8.35 인 것으로 나타났다.
B. mRNA 서열 분석
2B2 세포에서 HZ24 플라스미드로부터 생성된 PH20 mRNA 의 서열을 결정했다. RNA 는 RNeasy Mini Kit (Qiagen) 를 이용하여 MCB 로부터의 2 × 107 2B2 세포로부터 추출했다. 시료를 DNase I 로 처리하여 오염성 DNA 를 제거하고, RNA 의 순도는 아가로스 겔 전기영동 및 UV 분광측정으로 확인했다. Superscript™ Reverse Transcriptase (Invitrogen) 을 이용한 역전사 반응 및 역전사효소가 결핍되어 있는 대조군 반응을, 추출한 RNA 및 올리고 d(t) 및 랜덤 프라이머를 이용하여 수행했다. 이어서, 결과로서 수득한 cDNA 생성물을 PCR 증폭에서 템플레이트로 이용했다. 2 가지 상이한 프라이머쌍 셋트를 사용했다; AP01/AP03 및 AP10/AP12. AP01/AP03 는 1719 염기쌍 영역을 증폭하기 위해 고안했고, 프라이머쌍 AP 10/AP 12 는 3' 말단의 역방향 가닥 서열을 수득하기 위한 더 큰 영역 (1811 염기쌍) 을 증폭하기 위해 고안했다. 표 5 는 프라이머의 서열을 제공한다. 각각의 PCR 반응은 단독 프라이머 대조군, 템플레이트로서의 역전사효소 대조군 (상기에 기재함) 을 사용하지 않은 음성 대조군, 및 대조군 프라이머 및 대조군 템플레이트를 이용한 양성 대조군을 포함했다. 증폭 생성물은 아가로스 겔 전기영동으로 육안으로 확인했고, 예상한 크기의 것을 확인했으며, 이후 정제하여 과량의 프라이머 및 dNTP 를 겔 추출 또는 EXOSAP (USB) 로 제거했다.
정제된 생성물은 BigDye® Terminator vl.l Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) 및 표 16 에 제시한 프라이머를 이용하여 서열분석했다. 서열분석 데이터를 취합하고, 유도된 컨센서스 서열 (서열번호:55) 을 Sequencher 소프트웨어 버젼 4.1.2 (Gene Code Corporation) 을 이용하여 기준 서열과 비교했다. 서열 데이터의 총 1449 염기쌍을 만들었다. 위치 1131 에서의, 예상했던 싸이토신 (C) 대신 티미딘 (T) 이 발견된 1 개의 염기상 차이를 제외하고는 기준 서열 (서열번호: 47) 과 동일한 것으로 나타났다. 이는 아미노산 서열에는 영향이 없는 침묵 돌연변이이다.
PCR 증폭 및 서열분석을 위한 프라이머
프라이머 명칭 서열 서열번호
AP01 TTCTCTCCACAGGTGTC 56
AP02 AAGATTTCCTTACAAGAC 57
AP03 TGGCGAGAGGGGAAAGAC 58
AP04 CCATTTATTTGAACACTC 59
AP06 CCGAACTCGATTGCGCAC 60
AP07 AGCCATTCCCAAATTGTC 61
AP08 CTCCCAGTTCAATTACAG 62
AP09 CGTTAGCTATGGATCCTC 63
AP10 CGAGACAGAGAAGACTCTTGCG 64
AP12 CATTCAACAGACCTTGCATTCC 65
C. 2B2 세포의 서던 블롯 분석
구조 맵을 수득하기 위해 2B2 세포에 대해 서던 블롯 분석을 수행했다. 전체 DNA 를 Maxwell 16® system (Promega) 를 이용하여 1 × 107 2B2 세포 및 1 × 107 대조군 DG-44 세포로부터 추출했다. 추출한 DNA 및 HZ24 플라스미드 대조군 구축물은 아가로스 겔 전기영동에 의해 순도에 대해 평가했다. 2B2 세포, DG-44 세포 및 HZ24 플라스미드 대조군 유래의 DNA 를 SpeI, XbaI 및, BamHI/HindIII 를 이용하는 이중 소화로 절단했다. 또다른 BamH I/HindIII 절단을 HZ24 플라스미드 대조군 상에서 수행했고, 약 1.4 kb 를 겔 추출로 정제하고, α-32P 로 방사성활성 표지하여, 표지된 프로브를 만들었다. 약 10 ㎍ 의 소화된 각각의 2B2 DNA 및 DG-44 DNA, 및 250 pg HZ24 플라스미드 DNA 가 있는 10 ㎍ DG-44 DNA 를 아가로스 겔 상에서 전기영동했다. 전기영동 후 겔 상에서 영상을 취하고, 이후 서던 블롯 이동을 수행했다. 나일론 멤브레인을 표지된 프로브로 혼성화하고, 실온에서 30 분 동안 세척한 후, 55℃ 에서 30 분 동안 2 회 세척했다. 최초의 방사선접사를 24 시간 동안 노출시키고, 육안으로 관찰했다. 더 긴 노출이 필요한 것으로 판단되어, 혼성화 밴드의 더 진한 노출을 위해 두번째 방사선접사를 3 일 동안 노출시켰다. 필름의 현상 후, 밴드를 Alphalmager® (Alpha Innotech) 를 이용해 크기측정했다.
DG-44 음성 대조군 소화물에서는 혼성화 밴드가 관찰되지 않았고, 예상한 크기의 단독 혼성화 밴드가 HZ24 소화물에서 관찰되었다 (BamHI/HindIII 소화물: ∼1.4 kb; SpeI 소화물: ∼ 6.6 kb; XbaI 소화물: ∼ 6.5 kb). SpeI 로 소화한 2B2 DNA 를 이용해서는 ∼ 7.7 kb 의 1개의 주된 혼성화 밴드 및 4 개의 부수적인 혼성화 밴드 (∼ 13.9, ∼ 6.6, ∼ 5.7 및 ∼ 4.6 kb) 가 관찰되었고, XbaI 로 소화한 2B2 DNA 를 이용해서는 ∼ 5.0 kb 의 1 개의 주된 혼성화 밴드 및 2 개의 부수적인 혼성화 밴드 (∼ 13.9 및 ∼ 6.5 kb) 가 관찰되었으며, BamHI/HindIII 로 소화한 2B2 DNA 를 이용해서는 ∼ 1.4 kb 의 1 개의 단독 혼성화 밴드가 관찰되었다. BamH I/Hind III 에서의 단독 ∼ 1.4 kb 혼성화 밴드의 존재는, 탐지된 영역 내에 큰 서열 삽입이 없음을 나타났다. 단독 Xba I 및 Spe I 소화물로부터의 결과는 2B2 세포인 경우, 게놈 내 HZ24 플라스미드의 다중적인 통합 부위가 있음을 나타낸다.
실시예 7
30 L 생물 반응 장치 세포 배양에서의 Gen2 가용성 rHuPH20 의 제조
가용성 rHuPH20 을 36 L 생물 반응 장치 (30 L 배양 부피) 를 이용하여 2B2 세포로부터 제조 및 정제하여, 400 L 생물 반응 장치 (300 L 배양 부피) 로 규모 확장하기 위한 최적 프로세스를 결정했다. 4 가지 별개의 36 L 생물 반응 장치 가동은 섹션 A 내지 D 에 기재한다.
A. 가용성 rHuPH20 로트(lot) 056-099 및 056- 100 의 제조 및 특징분석
2B2 (1 × 107 세포) 의 바이알을 해동하고, 37℃, 7% CO2 에서, 20 μM 메토트렉세이트 및 40 mL/L GlutaMAX™-I (Invitrogen) 을 보충한 CD CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) 에서 8 계대 동안 배양하고, 이후 이를 600 mL 로 증량시켰다. 1 주 후, 배양물을 40 mL/L GlutaMAX™-I 을 보충하고 메토트렉세이트는 없는 CD CHO 배지에서 5 L 로 증량시켰다. 1 L GlutaMAX™-I 및 30 mL 젠타마이신 설페이트를 보충한 25 L CD CHO 배지를 포함하는 36 L 생물 반응 장치에 초기 시딩 밀도 3.6 × 105 세포/mL 로 5 L 배양물을 접종했다. 생물 반응 장치의 진탕 설정점은, 75 RPM; 온도: 37℃; pH: 7.15; 용존 산소: 30% 였다. 생물 반응 장치에, Applikon 제어기로 제어하면서, 여과한 공기 오버레이 및 공기/산소/CO2 분사를 제공했다.
생물 반응 장치 가동을 통틀어, 접종 후 161, 184, 237, 256, 280, 304 및 328 시간째에 배양물을 7 회 공급했다. 피드 배지는 연동 펌프를 경유해 생물 반응 장치로 여과했다. 가동 내내 각 피드 배지의 함량 및 생물 반응 장치 피드 파라미터는 표 17 및 18 에 각각 제공한다.
피드 배지 제형물
성분 피드 #1 피드 #2 피드 #3 피드 #4 피드 #5 피드 #6 피드 #7
CD CHO 액체 배지 1 L 1 L 1 L 1 L 1 L 1 L 1 L
GlutaMAX ™-I 120 mL 80 mL 40 mL 40 mL 40 mL 30 mL 30 mL
CD CHO AGT 분말 48.6 g 24.3 g 0 0 0 0 0
Yeastolate 한외여과액 (200g/L) 150 mL 300 mL 300 mL 150 mL 150 ml 0 0
나트륨 부티레이트 1.65 g 2.35 g 1.65 g 1.65 g 1.65 g 1.65 g 1.65 g
생물 반응 장치 파라미터
시간 VCD % 생존력 pH 히알루로니
다아제 유닛 		부피 (L) 글루코오스 피드
0 3.6 97 7.28 0 31 6000 -
15 6.2 94 7.45 117 31 5780 -
44 11.3 97 7.15 290 31 5320 -
88 25.6 97 6.85 517 31 3430 -
115 42.6 95 6.75 1132 31 2920 -
139 56.4 96 6.74 1320 31 2220 -
161 71.9 97 6.82 2296 31 520 피드 #1
184 83.9 96 6.81 2748 32 610 피드 #2
213 82.7 96 6.87 3396 33 1190 -
237 80.5 89 7.21 4450 33 200 피드 #3
256 62.3 71 7.03 4750 34 240 피드 #4
280 52.7 66 7.01 5030 35 600 피드 #5
304 44.6 59 7.00 5970 36 560 피드 #6
328 33.3 47 7.00 7240 37 570 피드 #7
351 26.1 34 7.00 7360 37 250 -
생물 반응 장치를 수확하고, 포어 크기가 각각 8 ㎛, 0.65 ㎛, 0.45 ㎛ 및 0.22 ㎛ 인 일련의 캡슐 필터 (Sartorius) 를 포함하는 시스템을 통해 여과했다. 수확은 연동 펌프를 이용해 수행했고, 약 5 시간 내에 완료하여, 약 32 L 의 수확한 세포 배양액 (HCCF) 을 제공했다. HCCF 에는 EDTA 및 Tris 를, 각각 최종 농도 10 mM, pH 7.6 이 되도록 보충했다. 이어서, HCCF 는 농축 및 완충액 교환에 대한 적용 전에 2 내지 8℃ 에서 저장했다.
단백질 농축을 위해, 30 kDa MWCO 이 있는 2.5 ft2 Millipore 나선형 와운드 카트리지를 먼저 150 mM NaCl, 10 mM Hepes, 10 mM EDTA, pH 7.5 로 평형화했다. 15 L 의 HCCF 를 1 L 로 15× 농축했다. 상기 농축물을 150 mM NaCl, 10 mM Hepes, 10 mM EDTA, pH 7.5 완충액을 이용해 10× 완충액 교환하고, 함유물을 0.2 ㎛ 캡슐을 통해, 최종 부피 1.1 L 를 위해 2 L 저장 백 내로 여과했다. 이어서, 함유물을 2 내지 8℃ 에서 저장했다.
이어서, 농축하고 완충액 교환한 단백질 용액을 Q 세파로오스 컬럼, 페닐 세파로오스 컬럼, 아미노 페닐 컬럼 및 히드록시아파타이트 컬럼을 통한 컬럼 크로마토그래피로 정제했다. 각 크로마토그래피 단계 전후에 단백질 용액 중의 히알루로니다아제 유닛을 평가하고, 각 단계의 수율 결정에 이용했다.
간략하게, 1.1 L 컬럼층이 있는 Q 세파로오스 컬럼을 2.8 L 1.0 N NaOH 로 위생처리하고, 사용 전에 0.1 N NaOH 에서 저장했다. 이어서, 2.5 L 의 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0 로 세정하고, 4.1 L 주입용 멸균수 (SWFI) 로 헹구고, 2.5 L 의 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.0 로 평형화시켰다. 완충액 교환된 단백질 (170,160 유닛/mL 으로 1 L) 을 컬럼 상에 로오딩했다. 유출물은 479 유닛/mL 로 1.0 L 이었으며, 생성물의 거의 전부가 수지에 결합되어 있음을 나타냈다. 컬럼을 4 L 의 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.0, 및 4.2 L 의 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0 로 세척했다. 이어서, 생성물을 3.0 L 의 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0 로 용출하여, 49,940 유닛/mL 으로 3 L 를 수득하고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다.
2.1 L 컬럼층이 있는 페닐 세파로오스 컬럼을 4.8 L 1.0 N NaOH 으로 위생처리하고, 사용 전에 0.1 N NaOH 에서 저장했다. 이어서, 5.0 L SWFI 로 헹구고, 4.6 L 의 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄으로 세정하고, 6.8 L SWFI 로 다시 헹구었다. 이어서, 컬럼을 5.5 L 의 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄으로 평형화시켰다. Q 세파로오스 컬럼으로부터 용출물에, 10.3 mL 의 1 M 인산칼륨 모노베이직, 10.3 mL 1 M 인산칼륨 디베이직 및 0.42 mL 1 mL CaCl2 를 첨가했다. 이어서, 이것을 컬럼에 로오딩하고, 유출물 및 체이스 (1 L 의 5 mM 인산칼륨, 0.5 mM 황산암모늄) 를 수집하여, 20,030 유닛/mL 으로 7.4 L 를 수득했다. 생성물을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다.
1.8 L 컬럼층이 있는 아미노 페닐 보로네이트 컬럼을 4.5 L 1.0 N NaOH 로 위생처리하고, 사용 전에 0.1 N NaOH 에서 저장했다. 이어서, 3.9 L SWFI 로 헹구고, 4.2 L 의 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄으로 세정하고, 다시 4.0 L SWFI 로 헹구었다. 이어서, 컬럼을 7.5 L 의 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄으로 평형화시켰다. 페닐 세파로오스 컬럼으로부터의 유출물을 황산암모늄을 최종 농도 0.5 M 가 되도록 보충한 후 아미노 페닐 보로네이트 컬럼 상에 로오딩했다. 컬럼을 6.5 L 의 5 mM 인산칼륨 pH 7.0 로, 이어서 7.8 L 의 20 mM 비신, pH 9.0 로, 이어서 9.0 L 의 20 mM 비신, 100 mM NaCl, pH 9.0 으로 세척했다. 생성물을 4.8 L 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7.0 로 용출하여, 22,940 유닛/mL 으로 4.8 L 을 수득해, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다.
0.8 L 컬럼층이 있는 히드록시아파타이트 컬럼을 2.7 L 1.0 N NaOH 으로 위생처리하고, 사용 전에 0.1 N NaOH 에 저장했다. 컬럼을 2.1 L 의 200 mM 인산칼륨, pH 7.0 으로 중화시킨 후, 2.2 L 의 5 mM 인산칼륨, 100 mM NaCl 에서 평형화시켰다. 아미노 페닐 보로네이트 컬럼으로부터의 용출물에, 9.1 mL 의 1 M 인산칼륨 모노베이직, 9.1 mL 1 M 인산칼륨 디베이직 및 0.452 mL 1 mL CaCl2 을 첨가했다. 이어서, 이것을 컬럼 상에 로오딩하고, 유출물은 10 유닛/mL 으로 4.5 L 이었으며, 가용성 HuPH20 의 양호한 결합성을 나타냈다. 컬럼을 3.3 L 의 5 mM 인산칼륨, 100 mM NaCl, 0.5 M 황산암모늄, pH 7.0 으로 세척한 후, 2.9 L 의 10 mM 인산칼륨, 100 mM NaCl, 0.5 M 황산암모늄, pH 7.0 로 세척했다. 생성물을 1.0 L 의 70 mM 인산칼륨, pH 7.0 로 용출하여, 130,000 유닛/mL 으로 1 L 를 수득해, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다.
정제된 생성물을, 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0 에서 평형화시킨 2.5 ft2 Millipore 30 kDa MWCO 카트리지를 이용해 농축했다. 생성물은 농축한 74 mL 였고, 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0 완충액으로 10× 완충액 교환을 한 후, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다. A28O 측정을 수행하여, 단백질 농도가 11.3 mg/mL 임을 나타냈다. 추가적인 9.6 mL 의 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0 완충액을 첨가하여, 단백질 농도가 10 mg/mL (로트 056-99) 이 되었다. 10 mL 의 10 mg/mL 단백질 용액을 완충액에서 희석하여, 1 mg/mL 용액 (로트 056-100) 을 수득했다. 두 용액을 모두 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다.
제형화된 생성물을 10 mL 및 1 mL 유리 바이알에 충전시키고, 조합한 총량은 761 mg 가용성 rHuPH20 였다. 바이알을 -80℃ 에서 냉동시키고, 이어서 저장을 위해 -20℃ 로 옮겼다. 이어서, 로트 056-99 및 056-100 을 활성 및 순도에 대해 특징분석했다. 로트 056-99 및 056-100 는 1,350,786 유닛/mL 및 129,982 유닛/mL 효소 활성을, 그리고 130,00 유닛/mg 및 124,00 유닛/mg 비활성 (효소 활성 및 단백질 농도로부터 계산) 을 나타냈다. 가용성 rHuPH20 시료의 순도는 SDS-PAGE, 등전점 포커싱 (IEF), 역상 고압 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC), 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 음이온-교환 크로마토그래피로 측정했다. RP-HPLC 로 측정한 바와 같이, 두 로트의 순도는 약 95% 로 관찰되었다. SEC 로 측정시, 두 로트의 순도는 약 99% 로 관찰되었다. 내독소 수준은 로트 056-99 및 056-100 에 대해 각각 ≤0.5 ELVmL 및 0.1 EU/mL 로 나타났다. 삼투성은 로트 056-99 및 056-100 에 대해 각각 271 mOsm/kg 및 291 mOsm/kg 였다.
B. 가용성 rHuPH20 생산 증가를 위한 변형: 생물 반응 장치 뱃치 2B2-20K.5
섹션 A 에서 상기 기재된 방법에 변형을 가했다. 상기 변형은 생성물 수율을 증가시키고, 제조 효율 및 확장성을 개선하기 위한 의도였다. 하기에 기재하는 제조 단계는 리서치 세포 은행으로부터의 냉동 세포의 해동, 연속적 배양에서의 세포의 증량, 공급-뱃치 생물 반응 장치 시스템의 조작, 세포 배양액의 수확 및 정화, 및 벌크 생성물의 농축 및 완충액 교환을 포함한다. 변형은, 예를 들어, 세포의 성장 속도 및 생성물 발현 수준 증가를 위한, 재조합 인간 인슐린의 생물 반응 장치 배지에 대한 추가를 포함한다. 또한, 피드 갯수도 7 개에서 5 개로 줄였다. 상기 기재된 방법의 기타 변형도 또한 가했다.
2B2 (1 × 107 세포) 의 바이알을 해동하고, 20 μM 메토트렉세이트 및 40 mL/L GlutaMAX™-I (Invitrogen) 를 보충한 CD CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) 에서 배양한 후, 40 mL/L GlutaMAX™-I 를 보충하고, 메토트렉세이트는 없는 CD CHO 배지에서 100 mL, 450 ml 에 이어 4.5L 로 증량시켰다. 800 mL GlutaMAX™-I, 30 mL 젠타마이신 설페이트 및 100 mg 재조합 인간 인슐린을 보충한 20 L CD CHO 배지를 포함하는 36 L 생물 반응 장치에 초기 시딩 밀도 4.3 × 105 세포/mL 로 3.6 L 2B2 배양물을 접종했다. 생물 반응 장치의 진탕 설정점은 80 RPM; 온도: 37℃; pH: 7.15; 용존 산소: 25% 였다. 생물 반응 장치에 Applikon 제어기로 제어되는 여과한 공기 오버레이 및 공기/산소/CO2 분사를 제공했다.
배양물을 13 일의 생물 반응 장치 가동을 통틀어, 접종 후 117, 143, 196, 235, 및 283 시간째에 5 회 공급했다. 피드 배지는 연동 펌프를 경유하여 생물 반응 장치로 여과했다. 가동을 통틀어 각각의 피드 배지의 함량 및 생물 반응 장치 피드 파라미터는 표 19 및 20 에 각각 제공했다.
피드 배지 제형물
성분 최초 생물 반응 장치 배지 피드 #1 피드 #2 피드 #3 피드 #4 피드 #5
CD CHO 액체 배지 12 L 0 0 0 0 0
GlutaMAX ™-I 800 mL 120 mL 80 mL 40 mL 40 mL 40 mL
CD CHO AGT 분말 194.4 g 97.2 g 48.6 g 24.3 g 24.3 g 24.3 g
SWFI 8 L 800 mL 900 mL 700 mL 700 mL 700 mL
Yeastolate 한외여과액 (200g/L) 0 0 0 200 mL 200 mL 200 mL
덱스트로오스 0 30 g 60 g 40 g 40 g 40 g
젠타마이신 30 mL 0 0 0 0 0
rHuInsulin 25 mL 0 0 0 0 0
나트륨 부티레이트 0 0 0 2.2 g 1.1 g 1.1 g
생물 반응 장치 파라미터
시간 VCD % 생존력 pH 히알루로니
다아제 유닛 		부피 (L) 글루코오스 피드
0 4.3 98 7.28 0 25 8820 -
55 17.1 99 7.07 580 25 4950 -
94 40.6 99 6.77 1059 25 3800 -
117 57.5 99 6.76 1720 25 2310 피드 #1
143 88.8 99 6.75 3168 26 2770 피드 #2
167 93.7 99 6.80 6982 27 3830 -
196 96.2 97 6.89 4560 27 2060 피드 #3
222 78.9 85 6.83 4920 28 2720 -
235 80 76 6.81 5670 28 1870 피드 #4
260 54.3 65 6.76 5865 29 2930 -
283 38.7 44 6.73 6540 29 1880 피드 #5
308 37.3 39 6.78 8460 29 2400 -
313 33.7 34 6.78 8190 29 2300 -
생물 반응 장치를 수확하고, 일련의 Millipore Pod 필터 DOHC (0.5 m2) 및, 규모별 포어 크기의 규조토층들을 포함하는 AlHC 스택을 포함하는 시스템을 통해 여과하고, 이어서 캡슐 필터 (Sartorius Sartobran 300) 를 통한 최종 여과로 50 L 저장 백으로 여과했다. 수확은 연동 펌프를 이용해 수행하고, 약 2 시간 내에 완료해, 약 30 L 의 수확 세포 배양액 (HCCF) 을 수득했다. 28 L HCCF 에 EDTA 및 Tris 를 보충하여 각각 최종 농도가 10 mM, pH 7.5 가 되도록 했다. 잔류하는 2 l HCCF 는 Tris/EDTA 없이 남겨두어, 농축/완충액 교환 단계에 대한 Tris/EDTA 첨가의 효과를 평가했다. 이어서, HCCF 는 농축 및 완충액 교환에 대한 적용 전에 2 내지 8℃ 에서 저장했다.
단백질을 농축하기 위해, 30 kDa MWCO 이 있는 0.1 m2 Millipore Pellicon 2 바이오맥스 A 스크린 카셋트를 먼저 20 mM Na2SO4, 10 mM Tris, pH 7.5 에서 평형화시켰다. Tris/EDTA 의 존재 또는 부재 하에 2L 의 HCCF 를 10× 로 농축하고, 20 mM Na2SO4, 10 mM Tris, pH 7.5 완충액을 이용해 10× 완충액 교환을 했다. 단백질 수준은 A260 에서의 흡광도로 측정했다. 이어서, 잔류하는 HCCF (약 26.5 L) 를 농축하고, 완충액 교환에 적용했다. 30 kDa MWCO 가 있는 2 개의 0.1 m2 Millipore Pellicon 2 바이오맥스 스크린 카셋트를 TFF 시스템에서 조립하고, 20 mM Na2SO4, 10 mM Tris, pH 7.5 에서 평형화시켰다. HCCF 를 약 10× 로 2.5 L 까지 농축하고, 20 mM Na2SO4, 10 mM Tris, pH 7.5 를 이용해 10× 완충액 교환했다. 함유물을 0.2 ㎛ 진공 필터를 통해 1 L 및 500 mL 저장 백으로 최종 부피 2.6 L 가 되도록 여과했다. 이어서, 함유물을 2 내지 8℃ 에서 저장했다. 농축 및 완충액 교환 프로세스 동안 취한 시료들은 RP-HPLC 로 분석하여, 시료에 대한 Tris/EDTA 의 첨가 효과를 결정했다. Tris/EDTA 의 첨가가 더욱 효율적인 프로세싱 단계를 촉진하는 것으로 관찰되었다.
C. 가용성 rHuPH20 로트 056-122 및 056-123 (생물 반응 장치 뱃치 2B2-20K.6) 의 제조 및 특징분석.
섹션 C 에서 상기에 기재된 변형은 가용성 rHuPH20 의 두 로트의 제조 및 정제를 위한 제조 단계에 포함된다; 로트 056-122 및 056-123. 하기에 기재하는 프로세스는 리서치 세포 은행 HZ24-2B2 로부터의 냉동된 세포의 해동; 연속 배양에서의 세포의 증량; 36 L 공급-뱃치 생물 반응 장치 시스템의 30 L 규모에서의 조작; 벌크 생성물의 세포 제거, 정화 및 완충액 교환; 4-단계 컬럼 크로마토그래피; 및 제형화, 충전 및 마감 조작을 포함한다.
2B2 (1 × 107 세포) 의 바이알을 해동시키고, 20 μM 메토트렉세이트 및 40 mL/L GlutaMAX™-I (Invitrogen) 를 보충한 CD CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) 에서 37℃, 7% CO2 에서 배양하고, 이후 이것을, 40 mL/L GlutaMAX™-I 를 보충하고 메토트렉세이트는 없는 CD CHO 배지에서 400 mL 에 이어 4.4 L 로 증량시켰다. 800 mL GlutaMAX™-I, 100 mg 재조합 인간 인슐린 및 30 mL 젠타마이신 설페이트를 보충한 20 L CD CHO 배지를 포함하는 36 L 생물 반응 장치 (Bellco 1964 시리즈) 에, 초기 시딩 밀도 4.9 × 105 세포/mL 로 4 L 배양물을 이용해 접종했다. 생물 반응 장치의 진탕 설정점은, 80 RPM; 온도: 37℃; pH: 7.15; 용존 산소: 25% 였다. 생물 반응 장치에는, Applikon ADI 1030 제어기로 제어되는, 여과된 공기 오버레이 및 공기/산소/CO2 분사를 제공했다.
배양물은 13 일 생물 반응 장치 가동을 통틀어, 접종 후 127, 163, 208 및 시간째에 4 회 공급했다. 피드 배지는 연동 펌프를 경유하여 생물 반응 장치로 여과했다. 생물 반응 장치의 온도 설정점은 7 일째에 37℃ 에서 36.5℃ 로, 9 일째에는 36.0℃ 로, 최종적으로 11 일째에는 35.5℃ 로 강하시켰다. 가동을 통틀어 각 피드 배지의 함량 및 생물 반응 장치 피드 파라미터는 표 21 및 22 에 각각 제공한다.
피드 배지 제형물
성분 최초 생물 반응 장치 배지 피드 #1 피드 #2 피드 #3 피드
#4
CD CHO AGT 분말 (Invitrogen; 부분 #:10743-029; 로트 # 1366333) 0 97.2 g 48.6 g 24.3 g 24.3 g
CD CHO AGT 분말
( Invitrogen ; 부분 #:10743-029; 로트 # 1320613) 		267.3 g 0 0 0 0
CD CHO AGT 분말 (Invitrogen; 부분 #:12490-017; 로트 # 1300803) 218.7 g 0 0 0 0
SWFI 20 L 700 mL 700 mL 600 mL 600 mL
GlutaMAX ™-I ( Invitrogen ) 800 mL 160 mL 80 mL 60 mL 40 mL
Yeastolate 한외여과액 (Invitrogen; 200g/L) 0 100 mL 200 mL 300 mL 300 mL
덱스트로오스 (D-글루코오스) 0 40 g 40 g 60 g 40 g
젠타마이신 30 mL 0 0 0 0
rHuInsulin 100 mg 40 mg 0 0 0
나트륨 부티레이트 0 0 1.1 g 2.2 g 1.1 g
생물 반응 장치 파라미터
시간 생존 세포 밀도 (×10 5 세포/ mL ) % 생존력 pH 히알루로니
다아제 유닛 		부피 (L) 글루코오스 피드
0 4.9 92 7.26 79 25 7780 -
24 9.2 95 7.21 141 25 6060 -
48 17.3 97 7.13 243 25 5280 -
72 33 99 6.82 407 25 3910 -
98 49.3 99 6.77 658 25 3200 -
127 67 98 6.83 1296 25 1610 피드 #1
144 88.1 98 6.78 1886 26 2860 -
163 92.4 99 6.89 2439 26 1680 피드 #2
192 91 97 6.85 3140 27 1480 -
208 92.7 96 6.91 3188 27 230 피드 #3
235 70 76 6.86 5118 28 1940 -
261 63 61 6.84 5862 28 280 피드 #4
291 36.4 45 6.76 7072 29 1570 -
307 29.3 32 6.81 8160 29 1250 수확물
생물 반응 장치를 수확하고, 일련의 Millipore Pod 필터 DOHC (0.5 m2) 및, 포어-크기-등급의 규조토 층들을 포함하는 AlHC 스택 (0.1 m2) 을 포함하는 시스템을 통해 여과하고, 이어서 캡슐 필터 (Sartorius Sartobran 300) 를 통한 최종 여과로 20 L 저장 백으로 여과했다. 수확은 연동 펌프를 이용하여 수행했고, 약 1 시간 내에 완료하여, 약 34 L 의 수확한 세포 배양액 (HCCF) 을 수득했다. 이는, 29 L 생물 반응 장치 부피 및 약 5 L PBS 체이스를 포함한다. HCCF 에는 EDTA 및 Tris 를 보충하여 최종 농도가 각각 10 mM, 최종 pH 가 7.5 가 되도록 했다. 이어서, 농축 및 완충액 교환에 대한 적용 전에 HCCF 를 2 내지 8℃ 에서 저장했다.
단백질 농축을 위해, 30 kDa MWCO 가 있는 7.0 ft2 Sartorius Sartocon 2 크로스플로우 카셋트를 먼저 20 mM Na2SO4, 10 mM Tris, pH 7.5 에서 평형화했다. 34 L 의 HCCF 를 1O× 로 3 L 로 농축하고, 20 mM Na2SO4, 10 mM Tris, pH 7.5 완충액을 이용해 10× 완충액 교환을 했다. 함유물을 0.2 ㎛ 캡슐 필터를 통해 5 L 저장 백에 최종 부피 3.0 L 가 되도록 여과했다. 이어서, 함유물을 2 내지 8℃ 에서 저장했다.
이어서, 농축하고 완충액 교환한 단백질 용액을 Q 세파로오스 컬럼, 페닐 세파로오스 컬럼, 아미노 페닐 컬럼 및 히드록시아파타이트 컬럼을 통한 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제했다. 각 크로마토그래피 단계 전후의 단백질 용액 중의 히알루로니다아제 유닛을 평가하고, 각 단계에 대한 수율 결정에 이용했다.
간략하게, 1.1 L 컬럼층, 직경 7 cm, 높이 28 cm 를 가진 Q 세파로오스 컬럼을 2.1 L 1.0 N NaOH 로 위생처리하고, 사용 전에 0.1 N NaOH 에서 저장했다. 이어서, 이것을 2.5 L 의 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0 로 세정하고, 4.5 L 주입용 멸균수 (SWFI) 로 헹구어내고, 4.3 L 의 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.0 로 평형화시켰다. 완충액 교환한 단백질 (94,960 히알루로니다아제 유닛/mL 으로 3 L) 을 컬럼 상에 로오딩했다. 유출물 및 첫번째 세척물은 75 히알루로니다아제 유닛/mL 으로 5830 mL 이었으며, 거의 모든 생성물 (99.8%) 이 수지에 결합되어 있음을 나타냈다. 컬럼을 4.2 L 의 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.0, 및 4.6 L 의 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0 로 세척했다. 이어서, 생성물을 2.9 L 의 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0 에서 용출하여, 96,080 유닛/mL 으로 2880 mL 를 수득하고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다.
2.2 L 컬럼층이 있는 페닐 세파로오스 컬럼 (높이 28 cm, 직경 10 cm) 을 5.0 L 1.0 N NaOH 로 위생처리하고, 사용 전에 0.1 N NaOH 에서 저장했다. 이어서, 4.5 L SWFI 로 헹구어내고, 4.6 L 의 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄으로 세정하고, 다시 6.8 L SWFI 로 헹구어냈다. 이어서, 컬럼을 4.6 L 의 5 mM 인산칼륨, 0.5 mM 황산암모늄에서 평형화시켰다. Q 세파로오스 컬럼으로부터의 용출물에, 9.6 mL 의 1 M 인산칼륨 모노베이직, 9.6 mL 1 M 인산칼륨 디베이직 및 0.4 mL 1 mL CaCl2 을 첨가했다. 이어서, 이것을 컬럼에 로오딩하고, 유출물 및 체이스 (5 mM 인산칼륨, 0.5 mM 황산암모늄) 를 수집하고, 36,280 유닛/mL 으로 6095 mL 를 수득했다. 생성물을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다.
2.2 L 컬럼층이 있는 아미노 페닐 보로네이트 컬럼 (높이 29 cm, 직경 10 cm) 을 3.8 L 1.0 N NaOH 로 위생처리하고, 사용 전에 0.1 N NaOH 에서 저장했다. 이어서, 이것을 5.0 L SWFI 로 헹구어내고, 5.0 L 의 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄으로 세정하고, 다시 5.0 L SWFI 로 헹구어냈다. 이어서, 컬럼을 5.0 L 의 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄으로 평형화했다. 페닐 세파로오스 컬럼으로부터의 재료 유출물을 아미노 페닐 보로네이트 컬럼에 로오딩했다. 컬럼을 9.9 L 의 5 mM 인산칼륨, 0.5M 황산암모늄, pH 7.0 에 이어, 9.7 L 의 20 mM 비신, 0.5 M 황산암모늄, pH 9.0 에 이어, 9.9 L 의 20 mM 비신, 100 mM NaCl, pH 9.0 으로 세척했다. 생성물을 5.0 L 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7.0 로 용출하여, 48,400 유닛/mL 으로 4460 mL 을 수득하여, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다.
1.1 L 컬럼층이 있는 히드록시아파타이트 컬럼 (직경 7 cm, 높이 28 cm) 을 2.7 L 1.0 N NaOH 로 위생처리하고, 사용 전에 0.1 N NaOH 에서 저장했다. 컬럼을 2.1 L 의 200 mM 인산칼륨, pH 7.0 로 중화한 후, 2.2 L 의 5 mM 인산칼륨, 100 mM NaCl 에서 평형화했다. 아미노 페닐 보로네이트 컬럼으로부터의 용출물에, 11.2 mL 의 1 M 인산칼륨 모노베이직, 11.2 mL 1 M 인산칼륨 디베이직 및 0.45 mL 1 mL CaCl2 을 첨가했다. 이어서,이것을 컬럼에 로오딩하고, 후속하여 3.5 L 의 5 mM 인산칼륨, 100 mM NaCl, 0.5 M 황산암모늄, pH 7.0 에 이어, 3.5 L 의 10 mM 인산칼륨, 100 mM NaCl, 0.5 M 황산암모늄, pH 7.0 으로 세척했다. 생성물을 1.4 L 의 70 mM 인산칼륨, pH 7.0 으로 용출하여, 152,560 유닛/mL 으로 1260 mL 을 수득해, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다.
정제된 생성물을 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0 에서 평형화시킨 0.05 ft2 Millipore 30 kDa MWCO 카트리지를 이용하여 농축했다. 생성물을 1250 mL 으로부터 1.04/mg/mL 로 120 mL 까지 농축하고, 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0 완충액을 이용해 10× 완충액 교환을 한 후, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다. A280 측정을 수행하고, 잔류 118 ml 의 가용성 rHuPH20 농도가 11.45 mg/mL 임을 나타냈다. 추가적인 17 mL 의 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0 완충액을 첨가하여, 단백질 농도가 10 mg/mL 가 되도록 했다 (로트 056-122). 10 mL 의 10 mg/mL 단백질 용액을 완충액에서 희석하여, 1 mg/mL 용액을 수득했다 (로트 056-123). 두 용액을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다.
제형화한 생성물을 10 mL 및 1 mL 유리 바이알에 충전했고, 조합한 총량은 1308 mg 가용성 rHuPH20 이다. 바이알을 -80℃ 에서 냉동시킨 후, 저장을 위해 -20℃ 로 이동시켰다. 이어서, 로트 056-122 및 056-123 을 활성 및 순도에 대해 특징분석했다. 로트 056-122 및 056-123 은 1,376,992 유닛/mL 및 129,412 유닛/mL 효소 활성, 및 136,900 유닛/mg 및 124,400 유닛/mg 비활성 (효소 활성 및 단백질 농도로부터 계산) 을 나타냈다. 가용성 rHuPH20 시료의 순도는 SDS-PAGE, 등전점 포커싱 (IEF), 역상 고압 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC), 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 음이온-교환 크로마토그래피로 결정했다. RP-HPLC 로 결정한 바, 두 로트의 순도는 약 96.2% 인 것으로 관찰되었다. SEC 로 측정한 바, 두 로트의 순도는 99% 를 초과하는 것으로 관찰되었다. 내독소 수준은 로트 056-122 및 056-123 에 대해 각각 ≤0.8 EU/mL 및 0.09 EU/mL 인 것으로 나타났다. 삼투성은 로트 056-122 및 056-123 에 대해 각각 265 mOsm/kg 및 256 mOsm/kg 인 것으로 관찰되었다. 각각의 pH 는 7.2 였다.
D. 30 L 생물 반응 장치 세포 배양에서의 Gen 2 가용성 rHuPH20 의 제조 프로세스의 재현성
뱃치 2B2-20K.6 에 대해 상기 기재한 프로세스를 후속 뱃치에 이용하여, 프로세스의 재현성을 증명했다. 컬럼 크로마토그래피 단계 직전에 바이러스 불활성화 단계를 포함시켜 프로세스를 약간 변형했다.
2B2 세포 (1 × 107 세포) 의 바이알을 해동시키고, 20 μM 메토트렉세이트 및 40 mL/L GlutaMAX™-I (Invitrogen) 를 보충한 CD CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) 에서, 37℃, 7% CO2 에서 7 계대 동안 배양한 후, 40 mL/L GlutaMAX™-I 를 보충하고 메토트렉세이트는 없는 CD CHO 배지에서 400 mL 로, 이후 4.4 L 로 증량시켰다. 800 mL GlutaMAX™-I, 100 mg 재조합 인간 인슐린 및 300 mg 젠타마이신 설페이트를 보충한 20 L CD CHO 배지를 포함하는 36 L 생물 반응 장치 (Bellco 1964 시리즈) 에, 최초 시딩 밀도 4.7 × 105 세포/mL 로 3 L 배양물을 접종했다. 생물 반응 장치의 진탕 설정점은, 80 RPM; 온도: 37℃; pH: 7.15; 용존 산소: 25% 로 했다. 생물 반응 장치에, Applikon ADI 1030 제어기로 제어되는 여과 공기 오버레이 및 공기/산소/CO2 분사를 제공했다.
배양물을, 13 일간의 생물 반응 장치 가동을 통틀어, 접종 후 127, 163, 208 및 시간째에 4 회 공급했다. 피드 배지를 연동 펌프를 경유해 생물 반응 장치로 여과했다. 생물 반응 장치의 온도 설정점은, 7 일째에는 37℃ 에서 36.5℃ 로, 9 일째에는 36.0℃ 로, 최종적으로 11 일째에는 35.5℃ 로 강하시켰다. 가동을 통틀어 각각의 피드 배지의 함량 및 생물 반응 장치 피드 파라미터는 표 23 및 24 에 각각 제공한다.
피드 배지 제형물
성분 최초 생물 반응 장치 배지 피드 #1 피드 #2 피드 #3 피드 #4
CD CHO 액체 배지 ( Invitrogen ) 20 L 0 0 0 0
CD CHO AGT 분말
0 g 97.2 g 48.6 g 24.3 g 24.3 g
SWFI 0 700 mL 700 mL 600 mL 600 mL
GlutaMAX ™-I ( Invitrogen ) 800 mL 160 mL 80 mL 60 mL 40 mL
Yeastolate 한외여과액 (Invitrogen; 200g/L) 0 100 mL 200 mL 300 mL 300 mL
덱스트로오스 (D-글루코오스) 0 40 g 40 g 60 g 50 g
젠타마이신 300 mg 0 0 0 0
rHuInsulin 100 mg 40 mg 0 0 0
나트륨 부티레이트 0 0 1.1 g 2.2 g 1.1 g
생물 반응 장치 파라미터
시간 생존 세포 밀도 (×10 5 세포/ mL ) % 생존력 pH 히알루로니
다아제 유닛 		부피 (L) 글루코오스 피드
0 4.7 98 7.28 113 24 8200 -
24 8.9 98 7.23 202 24 6160 -
50 19.3 97 7.15 332 24 5480 -
76 36.7 99 6.85 680 24 3620 -
120 73.6 99 6.76 1619 24 2100 피드 #1
145 84.3 99 6.75 2842 25 2660 -
165 98.8 99 6.87 3756 25 840 피드 #2
190 95.3 99 6.85 4773 26 1330 -
201 105 97 6.90 5484 26 270 피드 #3
214 95.9 93 6.82 6344 27 2590 -
242 81.2 81 6.75 7890 27 1350 피드 #4
268 51.9 48 6.65 10398 28 2500 -
287 38.4 41 6.70 11864 28 2170 -
308 31.6 31 6.66 12864 28 1850 수확물
생물 반응 장치를 수확하고, 일련의 Millipore Pod 필터 DOHC (0.5 m2) 및, 포어-크기-등급의 규조토층들을 포함하는 AlHC 스택 (0.1 m2) 을 포함하는 시스템에 이어, 캡슐 필터 (Sartorius Sartobran 300) 를 통한 최종 여과로 20 L 저장 백으로 여과했다. 수확은 연동 펌프를 이용하여 수행하고, 약 75 분 내에 완료하여, 약 30 L 의 수확한 세포 배양액 (HCCF) 을 제공했다. 이는 28 L 생물 반응 장치 부피 및 약 2 L PBS 체이스 (chase) 를 포함한다. HCCF 에는 EDTA 및 Tris 를, 각각 최종 농도가 10 mM, 최종 pH 가 7.5 가 되도록 보충했다. 이어서, HCCF 를 농축 및 완충액 교환에 대한 적용 전에 2 내지 8℃ 에서 저장했다.
단백질 농축을 위해, 3 × 1.0 ft2 Sartocon Slice 크로스플로우 카셋트 (30 kDa MWCO) 가 있는 Sartorius Slice 시스템을 먼저 20 mM Na2SO4, 10 mM Tris, pH 7.5 에서 평형화시켰다. 30 리터의 HCCF 를 3 L 로 10× 농축하고, 20 mM Na2SO4, 10 mM Tris, pH 7.5 완충액을 이용해 10× 완충액 교환을 했다. 농축 동안 평균 유동률 (flux rate) 은 115 mL/분이었고, 평균 막투과 압력은 16 psig 였다. 정용여과 동안의 평균 유동률은 150 mL/분이었고, 평균 막투과 압력은 15 psig 였다. 함유물을 0.2 ㎛ 진공 필터 시스템을 통해 5 L 저장 백에 최종 부피 3.0 L 가 되도록 여과했다. 이어서, 함유물을 2 내지 8℃ 에서 저장했다.
바이러스 불활성화는 SWFI 중 10% w/w Triton X-100, 35 w/w Tri-부틸 포스페이트의 여과 용액 235 mL 와 2.15 L 의 실온의 농축되고 완충액 교환된 단백질을 30 내지 40 rpm 으로 교반하는 유리 스피너 플라스크 내에서 혼합하여 수행했다. 45 분 후, 단백질 용액을 Q 세파로오스 컬럼 (하기에 기재된 바와 같음) 에 로오딩했다. 로오딩에는 24 분 걸렸고, 이는 계면활성제 용액에 대한 총 노출시간이 69 분이 되도록 했다.
1.1 L 컬럼층, 직경 7 cm, 높이 28 cm 의 Q 세파로오스 컬럼을 2.1 L 1.0 N NaOH 로 위생처리하고, 사용 전에 0.1 N NaOH 에서 저장했다. 이어서, 2.5 L 의 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0 로 세정하고, 4.5 L 주입용 멸균수 (SWFI) 로 헹구어내고, 4.5 L 의 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.0 로 평형화시켰다. 완충액을 교환하고, 바이러스 불활성화 단백질 (133,040 히알루로니다아제 유닛/mL 으로 2385 mL) 을 컬럼 상에 로오딩했다. 컬럼을 4.5 L 의 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.0, 및 4.5 L 의 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0 로 세척했다. 이어서, 생성물을 2.5 L 의 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0 에서 용출하여, 133,680 유닛/mL 으로 2500 mL 을 수득했으며, 이를 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다.
2.2 L 컬럼층이 있는 페닐 세파로오스 컬럼 (높이 28 cm, 직경 10 cm) 을 5.0 L 1.0 N NaOH 으로 위생처리하고, 사용 전에 0.1 N NaOH 에 저장했다. 이어서, 6.0 L SWFI 로 헹구어 내고, 4.6 L 의 5 mM 인산칼륨, 0.5 mM 황산암모늄에서 평형화시켰다. 컬럼 용출을 위해, 9.6 mL 의 1 M 인산칼륨 모노베이직, 9.6 mL 1 M 인산칼륨 디베이직 및 0.4 mL 1 mL CaCl2 을 첨가했다. 이어서, 이것을 컬럼 상에 로오딩하고, 유출물 및 체이스 (5 mM 인산칼륨, 0.5 mM 황산암모늄) 를 수집하여, 43,840 유닛/mL 으로 6450 mL 를 수득했다. 생성물을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다.
2.2 L 컬럼층이 있는 아미노 페닐 보로네이트 컬럼 (높이 29 cm, 직경 10 cm) 을 3.5 L 1.0 N NaOH 로 위생처리하고, 사용 전에 0.1 N NaOH 에 저장했다. 이어서, 5.0 L SWFI 로 헹구어내고, 9.0 L 의 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄으로 평형화시켰다. 페닐 세파로오스 컬럼으로부터의 재료 유출물을 아미노 페닐 보로네이트 컬럼에 로오딩했다. 컬럼을 9.9 L 의 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄, pH 7.0 에 이어, 9.9 L 의 20 mM 비신, 0.5 M 황산암모늄, pH 9.0 으로 세척했다. 생성물을 4.4 L 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7.0 로 용출하여, 33,840 유닛/mL 으로 4389 mL 을 수득하고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다.
1.1 L 컬럼층이 있는 히드록시아파타이트 컬럼 (직경 7 cm, 높이 28 cm) 을 2.1 L 1.0 N NaOH 로 위생처리하고, 사용 전에 0.1 N NaOH 에 저장했다. 컬럼을 3.6 L 의 200 mM 인산칼륨, pH 7.0 로 중화한 후, 3.2 L 의 5 mM 인산칼륨, 100 mM NaCl 로 평형화했다. 아미노 페닐 보로네이트 컬럼으로부터의 용출물에, 11 mL 의 1 M 인산칼륨 모노베이직, 11 mL 1 M 인산칼륨 디베이직 및 0.44 mL 1 mL CaCl2 을 첨가했다. 이어서, 이것을 컬럼에 로오딩하고, 후속하여 4.8 L 의 5 mM 인산칼륨, 100 mM NaCl, 0.5 M 황산암모늄, pH 7.0 에 이어, 3.8 L 의 10 mM 인산칼륨, 100 mM NaCl, 0.5 M 황산암모늄, pH 7.0 으로 세척했다. 생성물을 1.5 L 의 70 mM 인산칼륨, pH 7.0 로 용출하여, 114,320 유닛/mL 으로 1500 mL 를 수득해, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다.
정제된 생성물을 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0 로 평형화시킨 0.05 ft2 Millipore 30 kDa MWCO 카트리지를 이용하여 농축했다. 생성물을 1500 mL 로부터 0.961 mg/mL 로 125 mL 까지 농축하고, 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0 완충액을 사용하여 10× 완충액 교환하고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다. A280 측정을 수행하여, 잔류한 122 ml 의 단백질 농도가 11.431 mg/mL 임을 나타냈다. 추가적인 17.5 mL 의 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0 완충액을 첨가하여 단백질 농도를 10 mg/mL 로 만들었다 (로트 056-135). 10 mL 의 10 mg/mL 단백질 용액을 완충액에 희석하여, 1 mg/mL 용액을 수득했다 (로트 056-136). 두 용액을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과했다.
제형화한 생성물을 5 mL 및 1 mL 유리 바이알에 충전시키고, 전체 조합량은 1324 mg 가용성 rHuPH20 였다. 바이알을 -80℃ 에서 냉동시킨 후, 저장을 위해 -20℃ 로 이동시켰다. 이어서, 로트 056-135 및 056-136 을 활성 및 순도에 대해 특징분석했다. 로트 056-135 및 056-136 은 1,301,010 유닛/mL 및 127,661 유닛/mL 효소 활성, 및 121,600 유닛/mg 및 127,700 유닛/mg 비활성 (효소 활성 및 단백질 농도로부터 계산함) 을 나타냈다. 가용성 rHuPH20 시료의 순도는 SDS-PAGE, 등전점 포커싱 (IEF), 역상 고압 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC), 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 음이온-교환 크로마토그래피로 측정했다. RP-HPLC 로 측정한 바, 두 로트의 순도는 93.5% 내지 93.7% 인 것으로 관찰되었다. SEC 로 측정한 바, 두 로트의 순도는 99% 초과인 것으로 관찰되었다. 내독소 수준은 로트 056-135 및 056-136 에 대해 각각 ≤0.84 EU/mL 및 0.09 EU/mL 인 것으로 나타났다. 삼투성은 로트 056-135 및 056-136 에 대해 각각 255 mOsm/kg 및 260 mOsm/kg 인 것으로 나타났다. 각각의 pH 는 7.2 였다.
실시예 8
A. 300 L 생물 반응 장치 세포 배양에서의 Gen2 가용성 rHuPH20 의 제조
상기 실시예 7 에 기재한 제조 및 정제 방법을 400 L 생물 반응 장치를 이용하는 제조를 위해 규모 확장(스케일업)했다. 2B2 세포의 바이알 (1 × 107 세포) 을 해동시키고, 20 μM 메토트렉세이트 및 8 mM GlutaMAX™-I (Invitrogen) 을 보충한 CD CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) 에서, 36 L 스피너 플라스크를 통해, 진탕 플라스크로부터 증량시켰다. 간략하게, 세포의 바이알을 37℃ 항온조에서 해동하고, 배지를 첨가하고, 세포를 원심분리했다. 세포를 20 mL 의 신선한 배지가 있는 125 mL 진탕 플라스크에서 재현탁하고, 37℃, 7% CO2 인큐베이터에 두었다. 세포를 125 mL 진탕 플라스크에서 40 mL 까지 증량시켰다. 세포 밀도가 1.5 × 106 세포/mL 초과에 도달하면, 배양물을 100 mL 배양 부피 중의 125 mL 스피너 플라스크로 증량시켰다. 플라스크를 37℃, 7% CO2 에서 인큐베이션했다. 세포 밀도가 1.5 × 106 세포/mL 초과에 도달하면, 배양물을 200 mL 배양 부피 중의 250 mL 스피너 플라스크로 증량시키고, 플라스크를 37℃, 7% CO2 에서 인큐베이션했다. 세포 밀도가 1.5 × 106 세포/mL 초과에 도달하면, 배양물을 800 mL 배양 부피로 1 L 스피너 플라스크로 증량시켰다. 세포 밀도가 1.5 × 106 세포/mL 초과에 도달하면, 배양물은 5000 mL 배양 부피에서 6 L 스피너 플라스크로 증량시키고, 37℃, 7% CO2 에서 인큐베이션했다. 세포 밀도가 1.5 × 106 초과에 도달하면, 배양물을 32 L 배양 부피의 36 L 스피너 플라스크에 증량시키고, 37℃, 7% CO2 에서 인큐베이션했다.
400 L 반응기를 수증기에 의해 121℃ 에서 30 분 동안 멸균시키고, 8 mM GlutaMAX™-I 및 5mg/L rHuInsulin 을 보충한 CD CHO 배지 230 mL 을 첨가했다. 사용 전에, 반응기를 오염에 대해 체크했다. 약 30 L 세포를 36 L 스피너 플라스크로부터 400 L 생물 반응 장치 (Braun) 로, ml 당 4.0 × 105 개의 생존성 세포의 접종 밀도 및 총 부피 260 L 로 이동시켰다. 파라미터는 온도 설정점, 37℃; 임펠러 속도 40 내지 55 RPM; 용기 압력: 3 psi; 공기 분사 0.5 내지 1.5 L/분.; 공기 오버레이: 3 L/분이었다. 반응기는 매일 세포 계수, pH 확인, 배지 분석, 단백질 생산 및 정체에 대해 샘플링했다. 또한, 가동 동안 영양분 피드를 첨가했다. 120 시간째 (제 5 일) 에, 10.4 L 의 피드 #1 배지 (4× CD CHO + 33 g/L 글루코오스 + 160 mL/L GlutaMAX™-I + 16.6 g/L Yeastolate + 33 mg/L rHu인슐린) 를 첨가했다. 168 시간째 (제 7 일) 에, 10.8 L 의 피드 #2 (2× CD CHO + 33 g/L 글루코오스 + 80 mL/L GlutaMAX™-I + 33.4 g/L Yeastolate + 0.92 g/L 나트륨 부티레이트) 을 첨가하고, 배양 온도를 36.5℃ 로 변경했다. 216 시간째 (제 9 일) 에, 10.8 L 의 피드 #3 (1 × CD CHO + 50 g/L 글루코오스 + 50 mL/L GlutaMAX™-I + 50 g/L Yeastolate + 1.80 g/L 나트륨 부티레이트) 을 첨가하고, 배양 온도를 36℃ 로 변경했다. 264 시간째 (제 11 일) 에, 10.8 L 의 피드 #4 (1 × CD CHO + 33 g/L 글루코오스 + 33 mL/L GlutaMAX™-I + 50 g/L Yeastolate + 0.92 g/L 나트륨 부티레이트) 을 첨가하고, 배양 온도를 35.5℃ 로 변경했다. 피드 배지의 첨가는 제조 최종 단계에서 가용성 rHuPH20 의 제조를 극적으로 증강시키는 것으로 관찰되었다. 반응기는 14 일째에, 또는 세포의 생존력이 40% 미만으로 떨어졌을 때 수확했다. 프로세스의 결과로, 최대 세포 밀도가 12 백만 세포/mL 인, ml 당 17,000 유닛의 최종 생산성을 수득했다. 수확시, 배양물을 마이코플라즈마, 멸균유효성, 내독소 및 시험관내 및 생체내 바이러스, 바이러스 입자에 대한 TEM 및 효소 활성에 대해 샘플링했다.
배양물은 연동 펌프에 의해, 각각 4 내지 8 ㎛ 등급의 규조토층 및 1.4 내지 1.1 ㎛ 등급의 규조토층을 포함하는 4 개의 평행 Millistak 여과 시스템 모듈 (Millipore) 를 통해, 이어서, 셀룰로오스 멤브레인, 그리고 이어서 0.4 내지 0.11 ㎛ 등급의 규조토층 및 <0.1 ㎛ 등급의 규조토층을 포함하는 제 2 단독 Millistak 여과 시스템 (Millipore) 을 통해, 이어서 셀룰로오스 멤브레인에, 그리고 이어서 0.22 ㎛ 최종 필터를 통해, 350 L 용량의 멸균 단일 용도 신축성 백으로 펌핑했다. 수확한 세포 배양액에는 10 mM EDTA 및 10 mM Tris 을 pH 7.5 까지 보충했다. 배양물을 4 개의 Sartoslice TFF 30 kDa 분자량 차단 (MWCO) 폴리에테르 술폰 (PES) 필터 (Sartorius) 를 이용한 모델 접선 유동 여과 (TFF) 기구를 이용해 10× 농축하고, 후속하여 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 로 10× 완충액 교환하고, 0.22 ㎛ 최종 필터를 통해 50 L 멸균 저장 백으로 여과했다.
농축하고 정용여과한 수확물을 바이러스에 대해 불활성화시켰다. 바이러스 불활성화 전에, 10% Triton X-100, 3% 트리(n-부틸)포스페이트 (TNBP) 의 용액을 제조했다. 농축하고 정용여과한 수확물을 Q 컬럼 상의 정제 직전에 36 L 유리 반응 용기에서 1 % Triton X-100, 0.3% TNBP 에 1 시간 동안 노출시켰다.
B. Gen2 sHuPH20 의 정제
Q 세파로오스 (Pharmacia) 이온 교환 컬럼 (9 L 수지, H= 29 cm, D= 20 cm) 을 준비했다. 세척 시료를 pH, 전도도 및 내독소 (LAL) 검정 측정을 위해 수집했다. 컬럼을 5 컬럼 부피의 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 로 평형화했다. 바이러스 불활성화에 후속하여, 농축하고 정용여과한 수확물을 Q 컬럼 상에 100 cm/hr 의 유속으로 로오딩했다. 컬럼을 5 컬럼 부피의 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 및 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0 로 세척했다. 단백질을 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0 을 이용해, 0.22 ㎛ 최종 필터 내로, 멸균 백 내로 용출시켰다. 용출물 시료를 멸균유효성, 단백질 농도 및 효소 활성에 대해 시험했다. A280 흡광도 검독값을 교환 시작 및 종료시 취했다.
페닐-세파로오스 (Pharmacia) 소수성 상호작용 크로마토그래피를 후속하여 수행했다. 페닐-세파로오스 (PS) 컬럼 (19 내지 21 L 수지, H=29 cm, D= 30 cm) 을 준비했다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소 (LAL 검정) 에 대해 샘플링했다. 컬럼은 5 컬럼 부피의 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0 으로 평형화시켰다. 상기로부터의 단백질 용출물에 2 M 황산암모늄, 1 M 인산칼륨 및 1 M CaCl2 모액을 보충하여, 최종 농도를 각각 5 mM, 0.5 M 및 0.1 mM 으로 수득했다. 단백질을 PS 컬럼 상에 100 cm/hr 의 유속으로 로오딩했다. 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄 및 0.1 mM CaCl2 pH 7.0 를 100 cm/hr 로 첨가했다. 유출물을 0.22 ㎛ 최종 필터를 통해 멸균 백으로 통과시켰다. 유출물을 멸균유효성, 단백질 농도 및 효소 활성에 대해 샘플링했다.
아미노페닐 보로네이트 컬럼 (ProMedics; 21 L 수지, H=29 cm, D= 30 cm) 을 준비했다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소 (LAL assay) 에 대해 샘플링했다. 컬럼은 5 컬럼 부피의 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄으로 평형화했다. PS 정제된 단백질을 아미노페닐 보로네이트 컬럼 상에 100 cm/hr 의 유속으로 로오딩했다. 컬럼을 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄, pH 7.0 으로 세척했다. 컬럼을 20 mM 비신, 0.5 M 황산암모늄, pH 9.0 으로 세척했다. 컬럼을 20 mM 비신, 100 mM 염화나트륨, pH 9.0 으로 세척했다. 단백질을 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 6.9 로 용출하고, 멸균 필터를 통해 멸균 백으로 통과시켰다. 용출된 시료를 멸균유효성, 단백질 농도 및 효소 활성에 대해 시험했다.
히드록시아파타이트 (HAP) 컬럼 (BioRad; 13 L 수지, H=20 cm, D= 30 cm) 을 준비했다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소 (LAL 검정) 에 대해 시험했다. 컬럼을 5 mM 인산칼륨, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0 로 평형화했다. 아미노페닐 보로네이트 정제된 단백질을, 최종 농도 5 mM 인산칼륨 및 0.1 mM CaCl2 이 될 때까지 보충하고, HAP 컬럼 상에 100 cm/hr 의 유속으로 로오딩했다. 컬럼을 5 mM 인산칼륨, pH 7, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2 로 세척했다. 컬럼을 후속하여 10 mM 인산칼륨, pH 7, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2 로 세척했다. 단백질을 70 mM 인산칼륨, pH 7.0 로 용출하고, 0.22 ㎛ 멸균 필터를 통해 멸균 백으로 통과시켰다. 용출된 시료를 멸균유효성, 단백질 농도 및 효소 활성에 대해 시험했다.
이어서, HAP 정제된 단백질을 바이러스 제거 필터를 통해 통과시켰다. 멸균된 Virosart 필터 (Sartorius) 를 먼저 2 L 의 70 mM 인산칼륨, pH 7.0 으로 세척하여 준비했다. 사용 전에, 여과한 완충액을 pH 및 전도도에 대해 샘플링했다. HAP 정제된 단백질을 연동 펌프를 경유하여 20 nM 바이러스 제거 필터를 통해 펌핑했다. 70 mM 인산칼륨, pH 7.0 중의 여과한 단백질을 0.22 ㎛ 최종 필터를 통해 멸균 백으로 통과시켰다. 바이러스 여과 시료를 단백질 농도, 효소 활성, 올리고당류, 단당류 및 시알산 프로파일링에 대해 (하기의 실시예 9 내지 10 에 기재된 바와 같이) 시험했다.
이어서, 여과액 중의 단백질을 10 kD 분자량 차단 (MWCO) Sartocon Slice 접선 유동 여과 (TFF) 시스템 (Sartorius) 을 이용해 10 mg/mL 로 농축했다. 필터는 먼저 10 mM 히스티딘, 130 mM NaCl, pH 6.0 으로 세척하여 준비하고, 투과물을 pH 및 전도도에 대해 샘플링했다. 농축에 후속하여, 농축한 단백질을 단백질 농도 및 효소 활성에 대해 샘플링하고 시험했다. 농축한 단백질에 대해 6× 완충액 교환을 최종 완충액 내로 수행하였다: 10 mM 히스티딘, 130 mM NaCl, pH 6.0. 완충액 교환에 후속하여, 농축한 단백질은 0.22 ㎛ 필터를 통해 20 L 멸균 저장 백으로 통과시켰다. 단백질을 단백질 농도, 효소 활성, 자유 술피드릴기, 올리고당류 프로파일링 및 삼투성에 대해 (하기 실시예 9 내지 10 에 기재된 바와 같이) 샘플링 및 시험했다.
이어서, 멸균여과한 벌크 단백질을 20 mL 으로 30 mL 멸균 Teflon 바이알 (Nalgene) 로 무균적으로 분산시켰다. 이어서, 바이알을 급속냉각하여, -20±5℃ 에서 저장했다. 상기 방법을 이용한 가용성 rHuPH20 의 제조 및 정제는 약 11 및 15 그램의 수율, 95,000 유닛/mg 내지 120,000 유닛/mg 의 비활성을 제공했다.
C. Gen1 및 Gen2 sHuPH20 의 제조 및 정제의 비교
300 L 생물 반응 장치 세포 배양에서의 Gen2 가용성 rHuPH20 의 제조 및 정제는, 100 L 생물 반응 장치 세포 배양에서의 Gen1 가용성 rHuPH20 의 제조 및 정제 (실시예 4 에 기재함) 와 비교해 프로토콜에 있어서 약간의 변화를 포함했다. 표 25 는 두 방법간의, 간단한 규모 확장 변화에 추가되는, 예시적인 차이점들을 제공한다.
100 L 및 300 L 생물 반응 장치 세포 배양법을 이용한 Gen1 및 Gen2 가용성 rHuPH20 제조 및 정제 사이에서의 예시적인 차이
프로세스 차이 Gen1 가용성 rHuPH20 Gen2 가용성 rHuPH20
세포주 3D35M 2B2
세포 접종원 증량에 사용한 배지 0.10 μM 메토트렉세이트 함유 (0.045 mg/L) 20 μM 메토트렉세이트 함유 (9 mg/L)
6L 배양 이후에서의 배지 0.10 μM 메토트렉세이트 함유 메토트렉세이트를 함유하지 않음
36 L 스피너 플라스크 기기장치없음




20 L 조작부피		 pH, 용존 산소, 분사 및 오버레이 기체 유속을 모니터링하고 제어하는 기기장치를 설치함

32 L 조작 부피
생물 반응 장치에서의 최종 조작 부피 125 L 생물 반응 장치에서 약 100 L
(최초 배양 부피 + 65 L)		 400L 생물 반응 장치에서 약 300 L (최초 배양 부피 + 260L)
최종 생물 반응 장치에서의 배양 배지 rHuInsulin 없음 5.0 mg/L rHuInsulin
배지 피드 부피 생물 반응 장치 세포 배양 부피의 4% 의 규모, 즉 3.4, 3.5 및 3.7 L 로 하여, 표적 생물 반응 장치 부피가 ∼92 L 가 됨. 생물 반응 장치 세포 배양 부피의 4% 의 규모, 즉, 10.4, 10.8, 11.2 및 11.7 L 로 하여, 표적 생물 반응 장치 부피가 ∼303L 가 됨.
배지 공급 피드 #1 배지: CD CHO + 50 g/L 글루코오스 + 8 mM G
GlutaMAX™-I

피드 #2 (CD CHO + 50 g/L 글루코오스 + 8 mM GlutaMAXTM-I + 1.1 g/L 나트륨 부티레이트

피드 #3: CD CHO + 50 g/L 글루코오스 + 8 mM GlutaMAXTM-I + 1.1 g/L 나트륨 부티레이트		 피드 #1 배지: 4×CD CHO + 33 g/L 글루코오스 + 32 mM GlutaMAX™-I + 16.6 g/L Yeastolate + 33 mg/L rHuInsulin

피드 #2: 2×CD CHO + 33 g/L 글루코오스 + 16 mM
GlutaMAX™-I + 33.4 g/L Yeastolate + 0.92 g/L 나트륨 부티레이트

피드 #3: 1×CD CHO + 50 g/L 글루코오스 + 10 mM GlutaMAXTM-I + 50 g/L Yeastolate + 1.80 g/L 나트륨 부티레이트

피드 #4: 1× CD CHO + 33 g/L 글루코오스 + 6.6 mM G
GlutaMAX™-I + 50 g/L Yeastolate + 0.92 g/L 나트륨 부티레이트
생물 반응 장치 세포 배양물의 여과 일련의 4 가지 폴리에테르술폰 필터 (8.0 ㎛, 0.65 ㎛, 0.22 ㎛ 및 0.22 ㎛)














100 L 저장 백		 첫번째 단계- 평행한 4개의 모듈, 각각 4 내지 8 ㎛ 등급의 규조토층 및 1.4 내지 1.1 ㎛ 등급의 규조토층, 이어서 셀룰로오스 멤브레인.
두번째 단계- 0.4 내지 0.11 ㎛ 등급의 규조토층 및 0.1 ㎛ 미만 등급의 규조토층을 포함하는 단독 모듈, 이어서 셀룰로오스 멤브레인.
세번째 단계- 0.22 ㎛ 폴리에테르술폰 필터

300L 저장 백

수확한 세포 배양물에는 10 mM EDTA, 10 mM Tris 를 pH 7.5 까지 보충함.
크로마토그래피 이전의 농축 및 완충액 교환 Millipore 나선형 폴리에테르술폰 30K MWCO 필터가 있는 2TFF 를 이용해 농축

농축물 6× 를 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.0 를 이용해 완충액 교환

20L 멸균 저장 백		 4 개의 Sartorius Sartoslice TFF 30K MWCO 필터를 이용해 농축


농축물 10× 를 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 를 이용해 완충액 교환

50L 멸균 저장 백
크로마토그래피 이전의 바이러스 불활성화 없음 1% Triton X-100, 0.3% 트리부틸 포스페이트, pH 7.5 의 첨가로 바이러스 불활성화를 수행함.
첫번째 정제 단계 (Q 세파로오스) 흡광도 검독을 하지 않음 개시 및 종결시 A280 측정
크로마토그래피 이후의 바이러스 여과 Pall DV-20필터 (20 nm) Sartorius Virosart 필터 (20 nm)
크로마토그래피 이후의 농축 및 완충액 교환 Hepes/식염수 pH 7.0 완충액

단백질을 1 mg/ml 로 농축		 히스티딘/식염수, pH 6.0 완충액

단백질을 10 mg/ml 로 농축
바이알 충전 5 mL 및 1 mL 충전 부피

≤30℃ 에서 저장

유리/고무 마개		 20 mL 충전 부피

≤20℃ 에서 저장

테플론/스크류 캡
가용성 rHuPH20 수율 약 400 내지 700 mg 약 11 내지 25 g
실시예 9
가용성 rHuPH20 의 효소 활성의 측정
세포 배양물, 정제 분획 및 정제 용액과 같은 시료 중의 가용성 rHuPH20 의 효소 활성은, 히알루론산이 혈청 알부민과 결합시 불용성 침전물을 형성하는 것에 근거한 탁도측정 검정법을 이용하여 측정했다. 활성은 가용성 rHuPH20 을 나트륨 히알루로네이트 (히알루론산) 와 설정된 시간 (10 분) 동안 인큐베이션한 후, 소화되지 않은 나트륨 히알루로네이트를 산성화된 혈청 알부민의 첨가로 석출시켜 측정한다. 결과로서 수득한 시료의 탁도는 30 분의 현상 기간 후 640 nm 에서 측정한다. 나트륨 히알루오네이트 기질에 대한 효소 활성에 기인한 탁도 감소는 가용성 rHuPH20 효소 활성의 측정값이다. 상기 방법은 가용성 rHuPH20 검정 작용 참조 표준의 희석물로 만든 보정 곡선을 이용하여 진행하고, 시료 활성 측정은 상기 보정 곡선을 참조하여 한다.
시료의 희석물은 효소 희석 용액에서 제조했다. 효소 희석 용액은 33.0 ± 0.05 mg 의 가수분해된 젤라틴을, 25.0 mL 의 50 mM PIPES 반응 완충액 (140 mM NaCl, 50 mM PIPES, pH 5.5) 및 25.0 mL 의 SWFI 에 용해시키고, 0.2 mL 의 25% 부미네이트 용액을 혼합물 내로 희석하고, 30 초 동안 와류시켜 제조했다. 이는 사용 2 시간 이내에 수행하고, 필요할 때까지 얼음에서 저장했다. 시료를 약 1 내지 2 U/mL 로 희석했다. 일반적으로, 단계 당 최대 희석은 1:100 을 초과하지 않았고, 최초 희석을 위한 초기 시료 크기는 20 ㎕ 미만이 되지 않았다. 검정을 수행하기 위해 필요한 최소 시료 부피는 다음과 같다: 프로세스 중의 시료, FPLC 분획: 80 ㎕; 조직 배양 상청액: 1 mL; 농축한 물질 80 ㎕; 정제되거나 또는 최종 단계 물질: 80 ㎕. 희석은 Low Protein Binding 96-웰 플레이트에서 3 회씩 했고, 30 ㎕ 의 각 희석물을 Optilux 블랙/클리어 바닥 플레이트 (BD BioSciences) 에 옮겼다.
2.5 U/mL 의 농축물을 이용한 공지된 가용성 rHuPH20 의 희석물은 효소 희석 용액에서 제조하여 표준 곡선을 만들고, Optilux 플레이트에 3 개씩 추가했다. 희석물은 0 U/mL, 0.25 U/mL, 0.5 U/mL, 1.0 U/mL, 1.5 U/mL, 2.0 U/mL, 및 2.5 U/mL 을 포함했다. 60 ㎕ 의 효소 희석 용액을 포함하는 "시약 블랭크 (blank)" 웰을 음성 대조군으로서 플레이트에 포함시켰다. 이어서, 플레이트를 덮고, 가열 블록 상에서 5 분 동안 37℃ 로 가온시켰다. 덮개를 제거하고 플레이트를 10 초 동안 진탕시켰다. 진탕 후, 플레이트로 가열 블록 상에 되돌려놓고, 따뜻한 0.25 mg/mL 나트륨 히알루로네이트 용액 (100 mg 의 나트륨 히알루로네이트 (LifeCore Biomedical) 을 20.0 mL 의 SWFI 에 용해시켜 제조함. 이는 2 내지 8 ℃ 로 2 내지 4 시간 동안, 또는 완전히 용해될 때까지 조심스럽게 회전시키고/시키거나 흔들어 혼합했다) 을 이용해 MULTIDROP 384 Liquid Handling Device 를 프라이밍(priming)했다. 반응 플레이트는 MULTIDROP 384 로 옮기고, 반응은 스타트 키를 눌러 시작해, 30 ㎕ 나트륨 히알루로네이트를 각각의 웰에 넣었다. 이어서, 플레이트를 MULTIDROP 384 에서 치우고, 10 초 동안 진탕시키고, 이후 플레이트 덮개를 다시 덮어 가열 블록에 옮겼다. 플레이트를 37℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션했다.
혈청 작용 용액으로 기계를 프라이밍하고, 부피 설정을 240 ㎕ 로 변경함으로써 MULTIDROP 384 를 반응 정지를 위해 준비했다. (75 mL 의 500 mM 아세테이트 완충 용액 중의 25 mL 의 혈청 모액 [1 부피의 말 혈청 (Sigma) 을 9 부피의 500 mM 아세테이트 완충 용액으로 희석하고, 염산을 이용해 pH 를 3.1 로 조정함]). 플레이트를 가열 블록에서 치우고, MULTIDROP 384 에 놓고, 240 ㎕ 의 혈청 작용 용액을 웰에 넣었다. 플레이트를 치우고, 플레이트 검독기 상에서 10 초 동안 진탕했다. 추가 15 분 후, 시료의 탁도를 640 nm 에서 측정하고, 각 시료의 효소 활성 (U/mL) 은 표준 곡선에 맞춰 결정했다.
비활성 (유닛/mg) 은 효소 활성 (U/ml) 을 단백질 농도 (mg/mL) 로 나누어 계산했다.
실시예 10
시알산 및 단당류 함량의 측정
가용성 rHuPH20 의 시알산 및 단당류 함량은, 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 에 후속한 트리플루오로아세트산을 이용한 가수분해로 평가할 수 있다. 한 구현예에서, 정제된 히알루로니다아제 로트 # HUB0701E (1.2 mg/mL; 본질적으로 실시예 8 에 기재된 바와 같이 제조 및 정제함) 의 시알산 및 단당류 함량을 결정했다. 간략하게, 100 ㎍ 시료를 두개씩 40% (v/v) 트리플루오로아세트산을 이용하여 100℃ 에서 4 시간 동안 가수분해했다. 가수분해에 후속하여, 시료를 건조시키고, 300 ㎕ 물에 재현탁시켰다. 각 재현탁 시료의 45 ㎕ 분취물을 새 관에 옮기고 건조시키고, 10 ㎕ 의 10 mg/mL 나트륨 아세테이트 용액을 각각에 첨가했다. 방출된 단당류는 30 mg/mL 2-아미노벤조산, 20 mg/mL 나트륨 시아노보로히드라이드, 약 40 mg/mL 나트륨 아세테이트 및 메탄올 중 20 mg/mL 붕산을 함유하는 용액 50 ㎕ 을 첨가하여 형광으로 표지했다. 혼합물을 암실에서 30 분 동안 80℃ 로 인큐베이션했다. 유도체 형성 반응을, 440 ㎕ 의 이동상 A (0.2% (v/v) n-부틸아민, 0.5% (v/v) 인산, 1% (v/v) 테트라히드로푸란) 의 첨가로 켄칭하였다. 음성 대조군으로서 히알루로니다아제 시료에 대해 기재된 바와 같이 물의 매트릭스 블랭크 (matrix blank) 도 가수분해하고 유도체 형성시켰다. 방출된 단당류를 옥타데실 (C18) 역상 컬럼 (4.6 × 250 mm, 5 ㎛ 입자 크기; J.T. Baker) 를 이용하여 분리하고, 형광 검출로 모니터링했다 (360 nm 여기, 425 nm 발광). 단당류 함량의 정량은 히알루로니다아제 시료로부터의 크로마토그램을 N-D-글루코사민 (GlcN), N-D-갈락토사민 (GalN), 갈락토오스, 푸코오스 및 만노오스를 포함하는 단당류 표준의 크로마토그램과 비교하여 했다. 표 26 은 히알루로니다아제 분자 당 각 단당류의 몰비를 나타낸다.
가용성 rHuPH20 의 단당류 함량
로트 복제 GlcN GalN 갈락토오스 만노오스 퓨코오스
HUB0701E

1 14.28 0.07* 6.19 25.28 2.69
2 13.66 0.08* 6.00 24.34 2.61
평균 13.97 0.08* 6.10 24.81 2.65
* GalN 결과는 검측 한계 미만이었음
실시예 11
3 D35M 및 2B2 세포 유래의 가용성 rHuPH20 의 C-말단 비균질성
100 L 생물 반응 장치 부피에서의 3D35M 세포 (로트 HUA0505MA) 및 300L 생물 반응 장치 부피에서의 2B2 세포 (로트 HUB0701EB) 로부터 제조 및 정제한 두 로트의 sHuPH20 에 대해 C-말단 서열분석을 수행했다. 아스파르트산 및 시스테인산의 N-말단에서 펩티드 결합을 특이적으로 절단하는 엔도프로테이나아제 Asp-N 를 이용하여 로트들을 개별적으로 소화시켰다. 이는 서열번호: 4 의 위치 431 에서의 아스파르트산에서 가용성 rHuPH20 의 C-말단 부분을 방출한다. C-말단 절편을 분리하고, 로트 HUA0505MA 및 로트 HUB0701EB 에서의 각 집단의 서열 및 풍부성을 결정하기 위해 특징분석했다.
3D35M 세포 및 2B2 세포로부터의 가용성 rHuPH20 제제는 비균질성을 나타내고, 그의 C-말단 서열이 상이한 폴리펩티드를 포함하는 것으로 관찰되었다 (표 27 및 28). 상기 비균질성은 제조 및 정제 프로세스 동안 세포 배양 배지 또는 기타 용액에 존재하는 펩티다아제에 의한 발현된 447 아미노산 폴리펩티드 (서열번호:4) 의 C-말단 절단의 결과로 여겨진다. 가용성 rHuPH20 제제 중의 폴리펩티드는 서열번호: 4 에 개시된 가용성 rHuPH20 서열의 아미노산 1-447, 1-446, 1-445, 1-444 및 1-443 에 해당하는 아미노산 서열을 갖는다. 각각의 상기 폴리펩티드의 전장 아미노산 서열은 서열번호: 4 내지 8 에 각각 개시되어 있다. 표 27 및 28 에 나타낸 바와 같이, 3D35M 세포 및 2B2 세포로부터의 가용성 rHuPH20 제제에서의 각 폴리펩티드의 풍부성은 상이하다.
로트 HUA0505MA 로부터의 C-말단 절편의 분석
절편 아미노산 위치 (서열번호 4 를 기준으로 함) 서열 이론값 질량 검측값 질량 오차 용출 시간 풍부성
D28a 431-447 DAFKLPPMETEEPQIFY
(서열번호: 66)		 2053.97 2054.42 0.45 99.87 0.2%
D28b 431-446 DAFKLPPMETEEPQIF
(서열번호: 67)		 1890.91 1891.28 0.37 97.02 18.4%
D28c 431-445 DAFKLPPMETEEPQI
(서열번호: 68)		 1743.84 1744.17 0.33 86.4 11.8%
D28d 431-444 DAFKLPPMETEEPQ
(서열번호: 69)		 1630.70 1631.07 0.32 74.15 56.1%
D28e 431-443 DAFKLPPMETEEP
(서열번호: 70)		 1502.70 1502.98 0.28 77.36 13.6%
D28f 431-442 DAFKLPPMETEE
(서열번호: 71)		 1405.64 ND N/A N/A 0.0%
로트 HUB0701EB 로부터의 C-말단 절편의 분석
절편 아미노산 위치 (서열번호 4 를 기준으로 함) 서열 이론값 질량 검측값 질량 오차 용출 시간 풍부성
D28a 431-477 DAFKLPPMETEEPQIFY
(서열번호: 66)		 2053.97 2054.42 0.45 99.89 1.9%
D28b 431-446 DAFKLPPMETEEPQIF
(서열번호: 67)		 1890.91 1891.36 0.45 96.92 46.7%
D28c 431-445 DAFKLPPMETEEPQI
(서열번호: 68)		 1743.84 1744.24 0.40 85.98 16.7%
D28d 431-444 DAFKLPPMETEEPQ
(서열번호: 69)		 1630.70 1631.14 0.39 73.9 27.8%
D28e 431-443 DAFKLPPMETEEP
(서열번호: 70)		 1502.70 1503.03 0.33 77.02 6.9%
D28f 431-442 DAFKLPPMETEE
(서열번호: 71)		 1405.64 ND N/A N/A 0.0%
실시예 12
2500 L 생물 반응 장치 세포 배양에서의 가용성 rHuPH20 의 제조 및 정제
가용성 rHuPH20 의 제조 및 정제는, 300 L 뱃치-공급 생물 반응 장치 프로세스 (실시예 8 에 기재됨) 로부터 2500 L 뱃치-공급 생물 반응 장치 프로세스로 규모확대(스케일업)될 수 있다. 300 L 생물 반응 장치 세포 배양에서의 rHuPH20 의 제조와 마찬가지로, 2500 L 생물 반응 장치 세포 배양에서의 rHuPH20 의 제조는 2B2 세포의 바이알을 먼저 해동 및 증량시키고, 생물 반응 장치에서 배양하고, 배양물을 수확 및 정화하고, 수확물을 농축 및 완충액 교환한 후, 바이러스 불활성화하여 수행된다. 이어서, rHuPH20 은 Q 세파로오스, 페닐 세파로오스, 아미노페닐 보로네이트 및 히드록시아파타이트 보로네이트에 이어 바이러스 여과를 이용하는 일련의 정제 단계를 이용해 농축물로부터 정제된다.
1. 세포 배양 증량
300 L 배양과 비교하여 2500 L 생물 반응 장치세포 배양 시딩에 필요한 더 많은 세포수를 생성하기 위해, 세포 배양은 125 mL 진탕 플라스크, 250 mL 진탕 플라스크, 1 L 진탕 플라스크, 2 개의 2 L 진탕 플라스크, 6 개의 2 L 진탕 플라스크, 25 L WAVE BioreactorTM(GE Healthcare Life Sciences), 100 L WAVE BioreactorTM 및 600 L 교반 탱크 시드 생물 반응 장치 (ABEC, Inc. Bethlehem, PA; Stainless Technology division) 를 통해 순차적으로 증량시킨다. 각 증량시, 표적 시딩 밀도는 4 × 105 세포/mL 이다. 증량을 통틀어 온도는 37℃ (또는 36℃ 내지 38℃) 이고, 7% CO2 (또는 6 내지 8% CO2) 이다. 플라스크를 약 110 RPM (또는 90 내지 130 RPM) 으로 진탕하고, 25 L 및 100 L WAVE BioreactorTM를 20 RPM (또는 각각 15 내지 25 또는 18 내지 22 RPM) 로 흔들고, 600 L 시드 생물 반응 장치를 90 RPM (또는 85 내지 95 RPM) 로 진탕한다.
먼저, 작용 세포 은행으로부터의 2B2 세포의 바이알 (1 × 107 세포) 을 37℃ 항온조에서 약 2 분 (바람직하게는 5 분 이하) 동안 해동하고, 배지를 첨가하고, 세포를 원심분리한다. 세포를 신선한 배지 (40 mL/L (8 mM) GlutaMAXTM-I 및 20 mM 메토트렉세이트를 보충한 CD CHO AGT) 를 가지고 125 mL 진탕 플라스크 내에서 약 25 mL (또는 20 내지 30 mL)까지 재현탁하고, 37℃, 7% CO2 인큐베이터에 넣었다. 세포 밀도가 약 8 × 105 세포/mL 에 도달하면, 배양물을 250 mL 진탕 플라스크 내 50 mL 배양 부피 (또는 45 내지 55 mL) 에 증량시킨다. 인큐베이션에 후속하여, 세포 밀도가 약 1.6 × 106 세포/mL 에 도달하면, 배양물은 1 L 플라스크 내 약 200 mL 배양 부피 (또는 190 내지 210 mL) 로 증량시키고 인큐베이션한다. 1 L 플라스크 내 세포 밀도가 약 1.6 × 106 세포/mL 에 도달하면, 배양물은, 각각 총 배양 부피가 약 400 mL (또는 플라스크 당 350 내지 450 mL) 인 2 × 2 L 플라스크에 증량시키고, 인큐베이션했다. 2 L 플라스크 내 세포 밀도가 약 1.2 × 106 세포/mL 에 도달하면, 배양물을, 각각 총 배양 부피가 약 400 mL (또는 플라스크 당 350 내지 450 mL) 인, 6 × 2 L 플라스크에 증량시키고, 인큐베이션했다. 2 L 플라스크 내 세포 밀도가 약 2.5 × 106 세포/mL 에 도달하면, 배양물은 총 부피가 약 15 L (또는 14 내지 16 L) 인 25L WAVE BioreactorTM 에 증량시키고, 1.5 L/분의 공기유동과 함께 인큐베이션했다.
25 L WAVE BioreactorTM 내 세포 밀도가 약 2.2 × 106 세포/mL 에 도달하면, 배양물을 총 배양 부피가 약 80 L (또는 75 내지 85 L) 인 100 L WAVE BioreactorTM에, 3.6 g/L 메토트렉세이트, 40 mL/L GlutaMAXTM-I 및 1 mL/L 1N NaOH 을 보충한 CD-CHO AGTTM-배지를 이용하여 증량시키고, 1.5 L/분의 공기유동과 함께 인큐베이션했다. 100 L WAVE BioreactorTM 내 세포 밀도가 약 2.6 × 106 세포/mL 에 도달하면, 배양물을 총 배양 부피가 약 480 L (또는 440 내지 520 L) 인 600 L 시드 생물 반응 장치 ABEC, Inc. Bethlehem, PA; Stainless Technology division) 에, 40 mL/L GlutaMAXTM-I 을 보충한 CD-CHO AGTTM 배지를 이용하여 증량시키고, 600 L 생물 반응 장치 내 세포 밀도가 약 1.6 × 106 세포/mL 에 도달할 때까지 인큐베이션한다.
2. rHuPH20 제조
총 부피가 3523 L 이고, 작동 부피가 500 내지 2500 L 인 3500 L 생물 반응 장치 (ABEC, Inc, Bethlehem, PA) 를, rHuPH20 의 고수율 제조에 이용한다. 멸균 후, 40 mL/L GlutaMAXTM-I 및 5 mg/L rHuInsulin 을 보충한 24.3 g/L 분말화 CD-CHO AGTTM 를 포함하는 약 1800 내지 2000 L CD-CHO AGTTM 배지를 생물 반응 장치에 추가한다. 파라미터는 다음과 같이 설정한다: 온도 설정점, 37℃; 임펠러 속도 75 RPM; 용기 압력: 5 psi; 공기 분사 18 L/분; 용존 산소: 25%; pH ≤7.2. 사용 전, 반응기를 오염에 대해 체크한다. 600 L 시드 생물 반응 장치 배양물로부터의 대략 300 내지 500 L 의 세포 (세포 계수에 좌우됨) 를 3500 L 생물 반응 장치에, ml 당 4.0 × 105 개의 생존성 세포의 접종 밀도로 접종하여, 총 부피 2100 L 에 도달했다. 14 일 세포 인큐베이션 동안, 생물 반응 장치를 세포 생존력, 세포 밀도, pH 확인 및 효소 활성에 대해 매일 샘플링한다. 온도 및 용존 산소도 또한 밀접하게 모니터링한다.
영양분 피드를 14 일 생물 반응 장치 가동 동안 첨가하고, 각각 약 4% v/v 이다. 5 일째에, 약 84 L (또는 4 % v/v) 의 피드 #1 배지 (81 g/L 분말화 CD-CHO AGTTM + 33 g/L 글루코오스 + 13.3 mL/L GlutaMAXTM-I + 83.3 g/L Yeastolate + 33 mg/L rHuInsulin) 를 첨가한다. 7 일째에, 약 87 L (또는 4 % v/v) 의 피드 #2 (40.5 g/L 분말화 CD-CHO AGTTM + 33 g/L 글루코오스 + 66.7 mL/L GlutaMAXTM-I + 166.7 g/L Yeastolate + 0.92 g/L 나트륨 부티레이트) 를 첨가하고, 배양 온도를 36.5℃ 로 변경한다. 9 일째에, 약 91 L (또는 4 % v/v) 의 피드 #3 (20.3 g/L 분말화 CD-CHO AGTTM + 50 g/L 글루코오스 + 50 mL/L GlutaMAXTM-I + 250 g/L Yeastolate + 1.8 g/L 나트륨 부티레이트) 를 첨가하고, 배양 온도를 36℃ 로 변경한다. 11 일째에, 약 94 L (또는 4 % v/v) 의 피드 #4 (20.3 g/L 분말화 CD-CHO AGTTM + 33.3 g/L 글루코오스 + 33.3 mL/L GlutaMAXTM-I + 250 g/L Yeastolate + 0.92 g/L 나트륨 부티레이트) 를 첨가하고, 배양 온도를 35.5℃ 로 변경한다. 반응기를 14 일째에 수확하고, 2400 내지 2600 L 수확물 (일반적으로 약 2500 L) 을 제공한다.
배양물을, 각각 4 내지 8 ㎛ 등급의 규조토층 및 1.4 내지 1.1 ㎛ 등급의 규조토층을 포함하는 20 Millistak 여과 시스템 모듈 (Millipore) 을 통해, 이어서 셀룰로오스 멤브레인, 그리고 각각 0.4 내지 0.11 ㎛ 등급의 규조토층 및 <0.1 ㎛ 등급의 규조토층을 포함하는 10 개 모듈을 포함하는 제 2 Millistak 여과 시스템 (Millipore) 을 통해, 이어서 셀룰로오스 멤브레인, 그리고 이어서 0.22 ㎛ 최종 필터를 통해 350 L 용량을 가진 멸균 단독 용도 신축성 백 내로 가압 이동시켰다. 수확한 세포 배양액에 10 mM EDTA 및 10 mM Tris, pH 8.4 를 목표 pH 7.5 까지 보충했다. 배양물을 18 내지 21 m2 의 Sartoslice TFF 30 kDa 분자량 차단 (MWCO) 폴리에테르 술폰 (PES) 필터 (Sartorius) 을 이용한 접선 유동 여과 (TFF) 기구 (Pall) 로 10 배 농축하고, 이어서 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 를 이용해 0.22 ㎛ 최종 필터 내로 350 L 멸균 저장 백 내로 10× 완충액 교환을 했다.
농축시킨, 정용여과한 수확물을 바이러스에 대해 불활성화시킨다. 바이러스 불활성화 전에, 10% Triton X-100, 3% 트리(n-부틸)포스페이트 (TNBP) 의 용액을 제조했다. Q 컬럼 상에서의 정제 직전에, 농축시킨, 정용여과한 수확물을 500 L 스테인레스 스틸 반응 용기 내에서 1% Triton X-100, 0.3% TNBP 에 2 시간까지 노출시켰다.
B. Gen2 rHuPH20 의 정제
Q 세파로오스 (Pharmacia) 이온 교환 컬럼 (81 L 수지, H= 26 cm, D= 63 cm)을 준비한다. 컬럼은 5 컬럼 부피의 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 로 평형화한다. 바이러스 불활성화에 후속하여, 약 250 L 의 농축하고, 정용여과한, 바이러스-불활성화 수확물을 150 cm/hr 의 유속으로 Q 컬럼 상에 로오딩한다. 컬럼을 5 컬럼 부피의 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 및 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0 로 세척한다. 단백질을 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0 을 이용해 0.22 ㎛ 최종 필터를 통해 멸균 백으로 용출시킨다. 용출물 시료를 멸균유효성, 단백질 농도 및 효소 활성에 대해 시험했다. A280 흡광도 검독값을 교환 시작 및 종결시 취했다.
페닐-세파로오스 (Pharmacia) 소수성 상호작용 크로마토그래피를 후속하여 수행한다. 페닐-세파로오스 (PS) 컬럼 (176 L 수지, H=35 cm, D= 80 cm) 을 준비한다. 컬럼을 5 컬럼 부피의 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0 로 평형화시킨다. 상기로부터의 단백질 용출물에 2 M 황산암모늄, 1 M 인산칼륨 및 1 M CaCl2 모액을 보충하여, 각각 최종 농도 5 mM, 0.5 M 및 0.1 mM 을 수득한다. 단백질을 100 cm/hr 의 유속으로 PS 컬럼 상에 로오딩한다. 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄 및 0.1 mM CaCl2 pH 7.0 을 100 cm/hr 로 첨가한다. 유출물을 0.22 ㎛ 최종 필터를 통해 멸균 백으로 통과시킨다. 유출물을 멸균유효성, 단백질 농도 및 효소 활성에 대해 샘플링한다.
이어서, 아미노페닐 보로네이트 컬럼 (ProMedics; 176 L 수지, H=35 cm, D= 80 cm) 을 준비한다. 컬럼을 5 컬럼 부피의 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄으로 평형화시킨다. PS-정제된 단백질을 50 cm/hr 의 유속으로 아미노페닐 보로네이트 컬럼에 로오딩한다. 나머지 프로세스에 대해 유속을 100 cm/hr 로 증가시켰다. 컬럼은 먼저 5 mM 인산칼륨, 0.5 M 황산암모늄, pH 7.0 로 세척하고, 이후 20 mM 비신, 0.5 M 황산암모늄, pH 9.0 으로, 이후 20 mM 비신, 100 mM 염화나트륨, pH 9.0 으로 세척하였다. 단백질은 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 6.9 으로 용출하고, 멸균 필터를 통해 멸균 백으로 통과시킨다. 용출된 시료를 멸균유효성, 단백질 농도 및 효소 활성에 대해 시험한다.
히드록시아파타이트 (HAP) 컬럼 (BioRad; 116 L 수지, H=23 cm, D= 80 cm) 을 준비한다. 컬럼을 5 mM 인산칼륨, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0 으로 평형화시킨다. 아미노페닐 보로네이트 정제된 단백질을 5 mM 인산칼륨 및 0.1 mM CaCl2 의 최종 농도로 보충하고, 100 cm/hr 의 유속으로 HAP 컬럼 상에 로오딩한다. 컬럼을 먼저 5 mM 인산칼륨, pH 7, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2 로, 이어서 10 mM 인산칼륨, pH 7, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2 로 세척한다. 단백질은 70 mM 인산칼륨, pH 7.0 로 용출시키고, 0.22 ㎛ 멸균 필터를 통해 멸균 백으로 통과시킨다. 용출된 시료를 멸균유효성, 단백질 농도 및 효소 활성에 대해 시험한다.
이어서, HAP 정제된 단백질을 바이러스 제거 필터를 통해 통과시킨다. 멸균된 Viosart 필터 (Sartorius) 를 먼저, 2 L 의 70 mM 인산칼륨, pH 7.0 로 세척하여 준비한다. HAP 정제된 단백질을 연동 펌프를 경유해 20 nM 바이러스 제거 필터를 통해 펌핑한다. 이어서, 70 mM 인산칼륨, pH 7.0 중의 여과된 단백질을 0.22 ㎛ 최종 필터를 통해 멸균 백으로 통과시킨다. 바이러스 여과 시료는 단백질 농도, 효소 활성, 올리고당류, 단당류 및 시알산 프로파일링에 대해 시험한다 (하기의 실시예 9 및 10 에 기재된 바와 같음).
이어서, 여과액 중의 단백질을, 전체 표면적 2.1 m2 에 대해 각각 필터 표면적이 0.7 m2 인 3 개의 10 kD 분자량 차단 (MWCO) Sartocon PES 카셋트를 이용하여 8 내지 12× 로 농축했다. 농축에 후속하여, 농축한 단백질을 샘플링하고, 단백질 농도 및 효소 활성에 대해 시험했다. 이어서, 10× 정용여과를 농축한 단백질 상에서 수행했다. 이는 두가지 방법 중 하나로 수행될 수 있다: 1) 20 mM 히스티딘, 130 mM NaCl, pH 6.5 완충액 및 1% 폴리소르베이트 80 을 이용함; 또는 2) 10 mM 히스티딘, 130 mM NaCl, pH 6.5 완충액을 이용함. 농축한, 정용여과한 벌크 단백질은 약 10 mg/mL 의 농도였다. 완충액 교환 후, 농축한 단백질을 0.22 ㎛ 필터를 통해 20 L 멸균 저장 백으로 통과시킨다.
이어서, 멸균 여과한 벌크 단백질을 1 L 멸균 PFA Nalgene 병에 400 mL 로 무균적으로 넣었다. 이어서, 병을 액체 질소 조에서 급속 냉각시키고, 폴리소르베이트 80 를 포함하지 않는 벌크 단백질에 대해서는 -20℃ 미만에서, 폴리소르페이트 80 를 포함하는 벌크 단백질에 대해서는 -70℃ 미만에서 저장했다.
표 29 는 300 L 및 2500 L 생물 반응 장치 배양에서의 rHuPH20 제조 사이에서의 소정의 예시적 차이를 제시한다.
300 L 및 2500 L 생물 반응 장치 배양에서의 rHuPH20 제조 사이에서의 예시적 차이
프로세스 차이 300 L 세포 배양 2500 L 세포 배양
세포주 2B2 2B2
세포 접종원 증량에 사용된 배지 20 μM 메토트렉세이트 포함 (9 mg/L) 20 μM 메토트렉세이트 포함 (9 mg/L)
세포 증량 125 mL 플라스크, 250 mL 플라스크, 1 L 플라스크, 6 L 플라스크 및 36 L 플라스크를 통한 증량. 125 mL 플라스크, 250 mL 플라스크, 1 L 플라스크, 2 × 2 L 진탕 플라스크, 6 × 2 L 진탕 플라스크, 25 L WAVE BioreactorTM 100 L WAVE Bioreactor 및 600 L 교반 탱크 및 시드 생물 반응 장치를 통한 증량
생물 반응 장치에서의 최종 조작 부피 400L 생물 반응 장치에서 약 300L 3500 L 생물 반응 장치에서 약 2500 L
생물 반응 장치 접종시
배양 배지		 5.0 mg/L rHuInsulin
40 mL/L (8 mM) GlutaMAXTM-I 가 있는 CD CHO		 5.0 mg/L rHuInsulin
40 mL/L (8 mM) GlutaMAXTM-I 가 있는 CD CHO AGTTM
배지 피드 부피 생물 반응 장치 세포 배양 부피의 4% 규모, 즉 약 10.4, 10.8, 11.2 및 11.7 L 로 하여, 표적 생물 반응 장치 부피가 약 300 L 가 됨. 생물 반응 장치 세포 배양 부피의 4% 규모, 즉 약 84, 87, 91 및 94 L 로 하여, 표적 생물 반응 장치 부피가 약 2500 L 가 됨.
배지 공급 피드 #1 배지: 4× CD CHO + 33 g/L 글루코오스 + 32 mM GlutaMAXTM-I + 16.6 g/L Yeastolate + 33 mg/L rHuInsulin

피드 #2: 2× CD CHO + 33 g/L 글루코오스 + 16 mM GlutaMAXTM-I + 33.4 g/L Yeastolate + 0.92 g/L 나트륨 부티레이트

피드 #3: 1× CD CHO + 50 g/L 글루코오스 + 10 mM GlutaMAXTM-I + 50 g/L Yeastolate + 1.80 g/L 나트륨 부티레이트

피드 #4: 1×CD CHO + 33 g/L Glucose + 6.7 mM GlutaMAXTM-I + 50 g/L Yeastolate + 0.92 g/L 나트륨 부티레이트		 피드 #1 배지: 81 g/L 분말화 CD-CHO AGTTM + 33 g/L 글루코오스 + 26.6 mM GlutaMAXTM-I + 83.3 g/L Yeastolate + 33 mg/L rHuInsulin

피드 #2: 40.5 g/L 분말화된 CD-CHO AGTTM + 33 g/L 글루코오스 + 13.4 mM GlutaMAXTM-I + 166.7 g/L Yeastolate + 0.92 g/L 나트륨 부티레이트

피드 #3: 20.3 g/L 분말화된 CD-CHO AGTTM + 50 g/L 글루코오스 + 10 mM GlutaMAXTM-I + 250 g/L Yeastolate + 1.8 g/L 나트륨 부티레이트

피드 #4: 20.3 g/L 분말화된 CD-CHO AGTTM + 33.3 g/L 글루코오스 + 6.7 mM GlutaMAXTM-I + 250 g/L Yeastolate + 0.92 g/L 나트륨 부티레이트
생물 반응 장치 세포 배양물의 여과 첫번째 단계- 각각 4 내지 8 ㎛ 등급의 규조토층 및 1.4 내지 1.1 ㎛ 등급의 규조토층을 포함하는 평행한 4 개의 모듈에 이어, 셀룰로오스 멤브레인.

두번째 단계- 0.4 내지 0.11 ㎛ 등급의 규조토층 및 0.1 ㎛ 미만 등급의 규조토층을 포함하는 단독 모듈에 이어, 셀룰로오스 멤브레인.

세번째 단계- 0.22 ㎛ 폴리에테르술폰 필터

300L 저장 백

 첫번째 단계 - 각각 4 내지 8 ㎛ 등급의 규조토층 및 1.4 내지 1.1 ㎛ 등급의 규조토층을 동시에 포함하는 평행한 20 개의 모듈에 이어, 셀룰로오스 멤브레인.

두번째 단계 - 0.4 내지 0.11 ㎛ 등급의 규조토층 및 0.1 ㎛ 미만 등급의 규조토층을 포함하는 10 개의 모듈에 이어, 셀룰로오스 멤브레인.

세번째 단계- 약 0.22 ㎛ 폴리에테르술폰 필터

350L 저장 백
크로마토그래피 이전의 농축 및 완충액 교환 4 개의 Sartorius Sartoslice TFF 30K MWCO 필터를 이용해 농축


농축물 10× 를 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 를 이용해 완충액 교환

50L 멸균 저장 백		 Millipore 나선형 폴리에테르술폰 30K MWCO 필터가 있는 2TFF 를 이용해 농축

농축물 6×를 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.0 를 이용해 완충액 교환

20L 멸균 저장 백
Q 세파로오스 컬럼 9 L 수지, H= 29 cm, D= 20 cm 81 L 수지, H= 26 cm, D= 63 cm
페닐-세파로오스 (PS) 컬럼 19 내지 21 L 수지, H=29 cm, D= 30 cm 176 L 수지, H=35 cm, D= 80 cm
아미노페닐 보로네이트 컬럼 21 L 수지, H=29 cm, D= 30 cm 176 L 수지, H=35 cm, D= 80 cm
히드록시아파타이트 (HAP) 컬럼 13 L 수지, H=20 cm, D= 30 cm 116 L 수지, H=23 cm, D= 80 cm
단백질 농축 단독 10 kD MWCO Sartocon Slice 접선 유동 여과(TFF) 3 개의 10 kD 분자량 차단 (MWCO) Sartocon PES 카셋트
10 mM 히스티딘, 130 mM NaCl, pH 6.0 를 이용한 6× 완충액 교환 다음을 이용한 10×정용여과:
1) 20 mM 히스티딘, 130 mM NaCl, pH 6.5 완충액 및 1% 폴리소르베이트 80; 또는
2) 10 mM 히스티딘, 130 mM NaCl, pH 6.5 완충액.
바이알 충전 20 mL 부피 충전

≤20℃ 에서 저장

 400 mL 부피 충전

단백질이 폴리소르베이트 80 를 포함하지 않으면 ≤20℃ 에서 저장,
또는
단백질이 폴리소르베이트 80 를 포함하면 ≤70℃ 에서 저장
변경은 당업자에게 자명하므로, 본 발명은 첨부하는 특허청구범위의 범주에 의해서만 제한하는 것을 의도로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Halozyme, Inc. <120> LARGE-SCALE PRODUCTION OF SOLUBLE HYALURONIDASE <130> P10-061-INP-KNL <140> PCT/US2009/001455 <141> 2009-03-06 <150> 61/068,622 <151> 2008-03-06 <160> 71 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> precursor human PH20 <400> 1 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile 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Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 465 470 475 480 Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 485 490 495 Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505 <210> 2 <211> 474 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Mature PH20 <400> 2 Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15 Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30 Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 35 40 45 Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60 Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 65 70 75 80 Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 85 90 95 Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 100 105 110 Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125 Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 130 135 140 Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160 Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175 Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190 His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 195 200 205 Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220 Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240 Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 245 250 255 Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 260 265 270 Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285 Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 290 295 300 Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320 Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 325 330 335 Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 340 345 350 Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365 Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380 Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400 Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415 Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 420 425 430 Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 435 440 445 Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val Ser Ile Leu 450 455 460 Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 465 470 <210> 3 <211> 482 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> precursor soluble rHuPH20 <400> 3 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 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<212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> PH20 variant P48A <400> 48 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Ala 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe 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Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 465 470 475 480 Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 485 490 495 Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505 <210> 49 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> precursor PH20 variant L499W <400> 49 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 465 470 475 480 Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 485 490 495 Ser Ile Trp Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505 <210> 50 <211> 6630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HZ24 vector <400> 50 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660 cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat 780 tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc 840 gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa 900 actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac 960 tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc cagttcaatt acagctctta 1020 aggctagagt acttaatacg actcactata ggctagcatg ggagtgctaa aattcaagca 1080 catctttttc agaagctttg ttaaatcaag tggagtatcc cagatagttt tcaccttcct 1140 tctgattcca tgttgcttga ctctgaattt cagagcacct cctgttattc caaatgtgcc 1200 tttcctctgg gcctggaatg ccccaagtga attttgtctt ggaaaatttg atgagccact 1260 agatatgagc ctcttctctt tcataggaag cccccgaata aacgccaccg ggcaaggtgt 1320 tacaatattt tatgttgata gacttggcta ctatccttac atagattcaa tcacaggagt 1380 aactgtgaat ggaggaatcc cccagaagat ttccttacaa gaccatctgg acaaagctaa 1440 gaaagacatt acattttata tgccagtaga caatttggga atggctgtta ttgactggga 1500 agaatggaga cccacttggg caagaaactg gaaacctaaa gatgtttaca agaataggtc 1560 tattgaattg gttcagcaac aaaatgtaca acttagtctc acagaggcca ctgagaaagc 1620 aaaacaagaa tttgaaaagg cagggaagga tttcctggta gagactataa aattgggaaa 1680 attacttcgg ccaaatcact tgtggggtta ttatcttttt ccggattgtt acaaccatca 1740 ctataagaaa cccggttaca atggaagttg cttcaatgta gaaataaaaa gaaatgatga 1800 tctcagctgg ttgtggaatg aaagcactgc tctttaccca tccatttatt tgaacactca 1860 gcagtctcct gtagctgcta cactctatgt gcgcaatcga gttcgggaag ccatcagagt 1920 ttccaaaata cctgatgcaa aaagtccact tccggttttt gcatataccc gcatagtttt 1980 tactgatcaa gttttgaaat tcctttctca agatgaactt gtgtatacat ttggcgaaac 2040 tgttgctctg ggtgcttctg gaattgtaat atggggaacc ctcagtataa tgcgaagtat 2100 gaaatcttgc ttgctcctag acaattacat ggagactata ctgaatcctt acataatcaa 2160 cgtcacacta gcagccaaaa tgtgtagcca agtgctttgc caggagcaag gagtgtgtat 2220 aaggaaaaac tggaattcaa gtgactatct tcacctcaac ccagataatt ttgctattca 2280 acttgagaaa ggtggaaagt tcacagtacg tggaaaaccg acacttgaag acctggagca 2340 attttctgaa aaattttatt gcagctgtta tagcaccttg agttgtaagg agaaagctga 2400 tgtaaaagac actgatgctg ttgatgtgtg tattgctgat ggtgtctgta tagatgcttt 2460 tctaaaacct cccatggaga cagaagaacc tcaaattttc tactgaggat ccatagctaa 2520 cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg 2580 tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc 2640 cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa 2700 ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 2760 caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc 2820 ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc 2880 cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac 2940 aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 3000 tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac 3060 ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataagctt gccacaaccc acagcggccg 3120 ctgccatcat ggttcgacca ttgaactgca tcgtcgccgt gtcccaaaat atggggattg 3180 gcaagaacgg agacctaccc tggcctccgc tcaggaacga gttcaagtac ttccaaagaa 3240 tgaccacaac ctcttcagtg gaaggtaaac agaatctggt gattatgggt aggaaaacct 3300 ggttctccat tcctgagaag aatcgacctt taaaggacag aattaatata gttctcagta 3360 gagaactcaa agaaccacca cgaggagctc attttcttgc caaaagtttg gatgatgcct 3420 taagacttat tgaacaaccg gaattggcaa gtaaagtaga catggtttgg atagtcggag 3480 gcagttctgt ttaccaggaa gccatgaatc aaccaggcca cctcagactc tttgtgacaa 3540 ggatcatgca ggaatttgaa agtgacacgt ttttcccaga aattgatttg gggaaatata 3600 aacttctccc agaataccca ggcgtcctct ctgaggtcca ggaggaaaaa ggcatcaagt 3660 ataagtttga agtctacgag aagaaagact aaacgcgtgg tacctctaga gtcgacccgg 3720 gcggccgctt cgagcagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag 3780 aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac 3840 cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt 3900 tcagggggag atgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat 3960 cgataaggat ccgggctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 4020 gttgcgcagc ctgaatggcg aatggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt 4080 gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc 4140 gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg 4200 gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat 4260 tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg 4320 ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct 4380 atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa 4440 aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gcttacaatt 4500 tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca 4560 ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac 4620 ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga 4680 ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac 4740 gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 4800 agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 4860 aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 4920 attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 4980 cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 5040 aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 5100 ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 5160 gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 5220 attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 5280 tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 5340 tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 5400 atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 5460 agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 5520 aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 5580 caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 5640 ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 5700 gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 5760 tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 5820 atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 5880 tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 5940 accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 6000 gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 6060 caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc 6120 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 6180 ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 6240 tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 6300 gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 6360 tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 6420 gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 6480 gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 6540 ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 6600 ggccttttgc tcacatggct cgacagatct 6630 <210> 51 <211> 186 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> dihydrofolate reductase <400> 51 Val Arg Pro Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly Ile 1 5 10 15 Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Phe Lys 20 25 30 Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln Asn 35 40 45 Leu Val Ile Met Gly Arg Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys Asn 50 55 60 Arg Pro Leu Lys Asp Arg Ile Asn Ile Val Leu Ser Arg Glu Leu Lys 65 70 75 80 Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys Ser Leu Asp Asp Ala 85 90 95 Leu Arg Leu Ile Glu Gln Pro Glu Leu Ala Ser Lys Val Asp Met Val 100 105 110 Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Gln Glu Ala Met Asn Gln Pro 115 120 125 Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Glu Phe Glu Ser 130 135 140 Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Leu Pro 145 150 155 160 Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile Lys 165 170 175 Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys Asp 180 185 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HZM3.P1 forward primer <400> 52 tttgaacact cagcagtctc ctg 23 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HZM3.P2 reverse primer <400> 53 aactctgatg gcttcccgaa 20 <210> 54 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HZM3 probe <400> 54 agctgctaca ctctatgtgc gcaatcga 28 <210> 55 <211> 1449 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> PH20 mRNA sequence from 3D35M cells <400> 55 atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta 60 tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca 120 cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt 180 cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcccccga 240 ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct 300 tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360 caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420 ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480 aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540 ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600 gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660 tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720 gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac 780 ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840 cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt 900 tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960 cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020 accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta catggagact 1080 atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag tcaagtgctt 1140 tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200 aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260 ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc 1320 ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380 gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440 ttctactga 1449 <210> 56 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP01 <400> 56 ttctctccac aggtgtc 17 <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP02 <400> 57 aagatttcct tacaagac 18 <210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP03 <400> 58 tggcgagagg ggaaagac 18 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP04 <400> 59 ccatttattt gaacactc 18 <210> 60 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP06 <400> 60 ccgaactcga ttgcgcac 18 <210> 61 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP07 <400> 61 agccattccc aaattgtc 18 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP08 <400> 62 ctcccagttc aattacag 18 <210> 63 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP09 <400> 63 cgttagctat ggatcctc 18 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP10 <400> 64 cgagacagag aagactcttg cg 22 <210> 65 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP12 <400> 65 cattcaacag accttgcatt cc 22 <210> 66 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> C-terminal peptide cleaved from soluble rHuPH20 aa 431-447 <400> 66 Asp Ala Phe Lys Leu Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe 1 5 10 15 Tyr <210> 67 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> C-terminal peptide cleaved from soluble rHuPH20 aa 431-446 <400> 67 Asp Ala Phe Lys Leu Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe 1 5 10 15 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> C-terminal peptide cleaved from soluble rHuPH20 aa 431-445 <400> 68 Asp Ala Phe Lys Leu Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 1 5 10 15 <210> 69 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> C-terminal peptide cleaved from soluble rHuPH20 aa 431-444 <400> 69 Asp Ala Phe Lys Leu Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln 1 5 10 <210> 70 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> C-terminal peptide cleaved from soluble rHuPH20 aa 431-443 <400> 70 Asp Ala Phe Lys Leu Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro 1 5 10 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> C-terminal peptide cleaved from soluble rHuPH20 aa 431-442 <400> 71 Asp Ala Phe Lys Leu Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu 1 5 10

Claims (20)

  1. 하기 단계를 포함하는 가용성 rHuPH20 의 제조 방법:
    a) 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 세포의 접종원으로 생물 반응 장치 내의 세포 배지를 접종하여 세포 배양물을 제조하는 단계, 여기서:
    상기 세포는 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 핵산의 150 내지 300 카피를 포함하고;
    상기 생물 반응 장치는 100 리터 이상의 세포 배양물을 포함하고; 그리고
    100 리터 세포 배양물마다 약 1010 내지 1011 개의 세포가 접종되고;
    세포는 설정 온도에서 배양됨;
    b) 상기 세포에 글루코오스, L-알라닐-L-글루타민, 인간 인슐린 및 효모 추출물을 함유하는 제 1 피드 배지를, 세포 성장 및 정점 세포 밀도를 증가시키고, 가용성 rHuPH20 합성을 증가시키기에 충분한 양으로 공급하는 단계, 여기서 상기 피드 배지는 세포 배양물 부피의 0.5% 또는 약 0.5% 내지 20% 또는 약 20% 의 부피로 배양물에 첨가됨;
    c) 상기 세포에 글루코오스, L-알라닐-L-글루타민, 효모 추출물 및 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 2 피드 배지를, 가용성 rHuPH20 합성을 증가시키고, 세포 주기 정지를 유도하기에 충분한 양으로 공급하고; 그리고
    온도를, 단계 a) 에서의 온도와 비교하여, 세포 주기 정지를 증가시키고, 세포 생존력을 증가시키고, 가용성 히알루로니다아제를 안정화하기에 충분한 온도로 강하시키는 단계; 여기서
    L-알라닐-L-글루타민의 양은 단계 b) 에서의 L-알라닐-L-글루타민의 양과 비교하여 감소시키고;
    효모 추출물의 양은 단계 b) 에서의 효모 추출물의 양과 비교하여 증가시키고; 그리고
    피드 배지는 세포 배양물 부피의 0.5% 또는 약 0.5 % 내지 20% 의 부피로 배양물에 첨가됨;
    d) 상기 세포에 글루코오스, L-알라닐-L-글루타민, 효모 추출물 및 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 3 피드 배지를, 가용성 rHuPH20 합성을 증가시키고, 세포 주기 정지를 증가시키기에 충분한 양으로 공급하고,
    온도를 단계 c) 에서의 온도와 비교하여, 세포 주기 정지를 증가시키고, 세포 생존력을 증가시키고, 가용성 히알루로니다아제 안정화하기에 충분한 온도로 강하시키는 단계; 여기서:
    L-알라닐-L-글루타민의 양은 단계 c) 에서의 L-알라닐-L-글루타민의 양과 비교하여 감소시키고;
    효모 추출물, 글루코오스 및 나트륨 부티레이트의 양은 단계 c) 에서의 효모 추출물, 글루코오스 및 나트륨 부티레이트의 양과 비교하여 증가시키고; 그리고
    피드 배지는 세포 배양물 부피의 0.5% 또는 약 0.5% 내지 20% 의 부피로 배양물에 첨가됨;
    e) 상기 세포에 글루코오스, L-알라닐-L-글루타민, 효모 추출물 및 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 4 피드 배지를, 가용성 rHuPH20 합성을 증가시키고, 세포 주기 정지를 증가시키기에 충분한 양으로 공급하고,
    온도를 단계 d) 에서의 온도과 비교하여, 세포 주기 정지를 증가시키고, 세포 생존력을 증가시키고, 가용성 히알루로니다아제를 안정화하기에 충분한 온도로 강하시키는 단계; 여기서:
    L-알라닐-L-글루타민 및 글루코오스의 양은 단계 d) 에서의 L-알라닐-L-글루타민 및 글루코오스의 양과 비교하여 감소시키고;
    나트륨 부티레이트의 양은 단계 d) 에서의 나트륨 부티레이트의 양과 비교하여 감소시키고;
    피드 배지는 세포 배양물 부피의 0.5% 또는 약 0.5% 내지 20% 의 부피로 배양물에 첨가됨;
    f) 생존력이 적어도 또는 약 50% 미만으로 강하될 때까지 세포 배양을 계속하는 단계;
    g) 수확 세포 배양액을 수득하는 단계; 및
    h) 수확 세포 배양액으로부터 rHuPH20 를 정제하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 단계 a) 에서의 온도가 약 또는 37℃ 인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계 c) 에서의 온도가 약 또는 36.5℃ 인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d) 에서의 온도가 36℃ 인 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 e) 에서의 온도가 35.5℃ 인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 수확 세포 배양액을 정제 전에 여과하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 rHuPH20 정제가 컬럼 크로마토그래피에 의해 수행되는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 컬럼 크로마토그래피가 비드 가교 아가로오스 컬럼 크로마토그래피, 비드 가교 페닐-치환 아가로오스 컬럼 크로마토그래피, 아미노 페닐 보로네이트 컬럼 크로마토그래피 및 히드록시아파타이트 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 피드 배지가 세포 배양 부피의 4% 또는 약 4% 의 부피로 배양물에 첨가되는 방법.
  10. 하기 단계를 포함하는 가용성 rHuPH20 의 제조 방법:
    a) 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 세포의 접종원으로 생물 반응 장치 내의 세포 배지를 접종하여 세포 배양물을 제조하는 단계, 여기서:
    상기 세포는 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 핵산의 150 내지 300 카피를 포함하고;
    상기 생물 반응 장치는 100 리터 이상의 세포 배양물을 포함하고;
    접종 세포 밀도는 약 또는 4 × 105 세포/mL 이고; 그리고
    세포는 약 또는 37℃ 에서 배양됨;
    b) 상기 세포에 약 또는 33 g/L 글루코오스, 32 mM L-알라닐-L-글루타민, 16.6 g/L 효모 추출물 및 33 mg/L 인슐린을 함유하는 제 1 피드 배지를 공급하는 단계, 여기서 상기 피드 배지는 세포 배양물 부피의 4% 또는 약 4% 의 부피로 배양물에 첨가됨;
    c) 상기 세포에 약 또는 33 g/L 글루코오스, 16 mM L-알라닐-L-글루타민, 33.4 g/L 효모 추출물 및 0.92 g/L 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 2 피드 배지를 공급하고, 여기서 상기 피드 배지는 세포 배양물 부피의 4% 또는 약 4% 의 부피로 배양물에 첨가되고;
    온도는 36.5℃ 로 강하시키는 단계;
    d) 상기 세포에 약 또는 50 g/L 글루코오스, 10 mM L-알라닐-L-글루타민, 50 g/L 효모 추출물 및 1.8 g/L 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 3 피드 배지를 공급하고, 여기서 상기 피드 배지는 세포 배양물 부피의 4% 또는 약 4% 의 부피로 배양물에 첨가되고; 그리고
    온도는 36℃ 로 강하시키는 단계;
    e) 상기 세포에 약 또는 33 g/L 글루코오스, 6.6 mM L-알라닐-L-글루타민, 50 g/L 효모 추출물 및 0.92 g/L 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 4 피드 배지를 공급하고, 여기서 상기 피드 배지는 세포 배양물 부피의 4% 또는 약 4% 의 부피로 배양물에 첨가되고; 그리고
    온도는 36℃ 로 강하시키는 단계;
    f) 생존력이 적어도 또는 약 50% 미만으로 강하될 때까지 세포 배양을 계속하는 단계;
    g) 수확 세포 배양액을 수득하는 단계;
    h) 수확 세포 배양액을 여과하는 단계;
    i) 상기 수확 배양액으로부터 rHuPH20 를, 비드 가교 아가로오스 컬럼 크로마토그래피, 비드 가교 페닐-치환 아가로오스 컬럼 크로마토그래피, 아미노 페닐 보로네이트 컬럼 크로마토그래피 및 히드록시아파타이트 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계.
  11. 하기 단계를 포함하는 가용성 rHuPH20 의 제조 방법:
    a) 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 세포의 접종원으로 생물 반응 장치 중의 세포 배지를 접종하여 세포 배양물을 제조하는 단계, 여기서:
    상기 세포는 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 핵산의 150 내지 300 카피를 포함하고;
    상기 생물 반응 장치는 100 리터 이상의 세포 배양물을 포함하고;
    접종 세포 밀도는 약 또는 4 × 105 세포/mL 이고; 그리고
    세포는 약 또는 37℃ 에서 배양됨;
    b) 상기 세포에 약 또는 33 g/L 글루코오스, 32 mM L-알라닐-L-글루타민, 83.3 g/L 효모 추출물 및 33 mg/L 인슐린을 함유하는 제 1 피드 배지를 공급하는 단계, 여기서 상기 피드 배지는 세포 배양물 부피의 4% 또는 약 4% 의 부피로 배양물에 첨가됨;
    c) 상기 세포에 약 또는 33 g/L 글루코오스, 13 mM L-알라닐-L-글루타민, 166.7 g/L 효모 추출물 및 0.92 g/L 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 2 피드 배지를 공급하고, 여기서 상기 피드 배지는 세포 배양물 부피의 약 4% 의 부피로 배양물에 첨가되고; 그리고
    온도는 36.5℃ 로 강하시키는 단계;
    d) 상기 세포에 약 50 g/L 글루코오스, 10 mM L-알라닐-L-글루타민, 250 g/L 효모 추출물 및 1.8 g/L 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 3 피드 배지를 공급하고, 여기서 상기 피드 배지는 세포 배양물 부피의 4% 또는 약 4% 의 부피로 배양물에 첨가되고; 그리고
    온도는 36℃ 로 강하시키는 단계;
    e) 상기 세포에 약 또는 33 g/L 글루코오스, 6.7 mM L-알라닐-L-글루타민, 250 g/L 효모 추출물 및 0.92 g/L 나트륨 부티레이트를 함유하는 제 4 피드 배지를 공급하고, 여기서 상기 피드 배지는 세포 배양물 부피의 4% 또는 약 4% 의 부피로 배양물에 첨가되고; 그리고
    온도는 36℃ 로 강하시키는 단계;
    f) 생존력이 적어도 또는 약 50% 미만으로 떨어질 때까지 세포 배양을 계속하는 단계;
    g) 수확 세포 배양액을 수득하는 단계;
    h) 수확 세포 배양액을 여과하는 단계; 및
    i) rHuPH20 를 수확 배양액으로부터, 비드 가교 아가로오스 컬럼 크로마토그래피, 비드 가교 페닐-치환 아가로오스 컬럼 크로마토그래피, 아미노 페닐 보로네이트 컬럼 크로마토그래피 및 히드록시아파타이트 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양물 100 L 당 적어도 또는 약 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40 그램의 가용성 rHuPH20 가 제조되는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 rHuPH20 의 비활성이 적어도 또는 약 80000, 100000, 120000, 140000, 160000 또는 180,000 유닛/mg 인 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 생물 반응 장치 중의 세포 배양물의 부피가 약 또는 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 또는 3500 리터인 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 세포가 DG44 CHO 세포인 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, rHuPH20 가 서열번호: 47 에 개시된 핵산에 의해 인코딩되는 방법.
  17. 5000 유닛/mL 을 초과하는 효소 활성을 가진 가용성 rHuPH20 를 함유하는 세포 배양 배지.
  18. 제 17 항에 있어서, 효소 활성이 약 또는 10,000, 12,000, 14,000, 16,000, 18,000, 20,000, 22,000 또는 24,000 유닛/mL 인 세포 배양 배지.
  19. 5000 유닛/mL 을 초과하는 효소 활성을 가진 가용성 rHuPH20 를 함유하는 수확된 세포 배양액.
  20. 제 19 항에 있어서, 효소 활성이 약 또는 10,000, 12,000, 14,000, 16,000, 18,000, 20,000, 22,000 또는 24,000 유닛/mL 인 수확된 세포 배양액.
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