KR20140079829A - Uv 광으로의 노출로 인한 단백질 변형 및 분해의 감소 또는 제거 방법 - Google Patents
Uv 광으로의 노출로 인한 단백질 변형 및 분해의 감소 또는 제거 방법 Download PDFInfo
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Abstract
단백질 성분을 포함하는 표본 중 바이러스의 불활성화 방법들이 제공된다. 또한, 반응종, 예컨대 UV 노출 결과 생성되는 반응종의 존재 하에 단백질 분해 또는 변형의 감소 방법들이 또한 제공된다. 또 다른 측면에서, UV 광을 받는 단백질 중 메티오닌 잔기, 트립토판 잔기 또는 메티오닌 및 트립토판 잔기 모두의 산화 감소 방법이 제공된다. 개시된 방법들은 임의 규모로 수행될 수 있고, 필요에 따라 자동화될 수 있다.
Description
본 발명은 일반적으로 단백질계 분자들의 UV 광으로의 노출이 관여되는 공정들, 특히 UV-C 파장들의 광을 이용한 바이러스 불활성화 공정들 동안 분해 및 변형으로부터 단백질계 분자들을 보호하고 단백질들에 손상을 주지 않고 증가된 UV-C 노출을 촉진하기 위한 화합물들 및 방법들에 관한 것이다.
세포 배지들 및 상청액들의 바이러스 오염은 세계적으로 생물의약 제조업체들에 어려움을 부여한다. 세포 상청액들로부터 크거나 작은, 외피를 보유하거나 보유하지 않은(또는 "미보유한") DNA 또는 RNA 바이러스 입자들을 불활성화하고/하거나 제거하기 위해 몇몇 방법들이 채용되고 있다. 이들 접근법들의 예들에는 20nm 여과 기술, 음이온 교환 막 크로마토그래피, 저pH 인큐베이션 및 뎁스 여과 기술이 포함된다.
상기 기법들에 부가하여, 자외선도 바이러스들을 불활성화하기 위해 단백질 함유 용액들을 처리하는 데 사용되고 있다. 그러나 효율적인 바이러스 불활성화를 달성하기 위해서 용액은 UV-C 대역의 충분한 UV 광 선량에 노출되어야 한다. 일부 경우들에서, 원하는 수준의 UV-C광 노출은 용액 중 단백질의 원하지 않는 변형 및/또는 분해를 일으킬 수 있다. 예를 들어 일부 경우들에서 반응종이 용액 중에 형성되어 용액 중 단백질들의 간접적 산화 또는 변형을 일으킬 수 있다; UV-C 노출로 인한 간접적 변형의 다른 기전들도 가능하다. 예로, Cabiscol 등, (2010) Int . Microbiol, 3:315; Bandyopadhyay 등, (1999) Curr . Sci . 77:658-666; Schoneich, (2005) Biochim Biophys Acta 1703:111-19; Stadtman 등, (2003) Antioxid . Redox . Signal 5:577-82; Stadtman, (1993) Ann . Rev . Biochem . 62:797-821; 및 Dean 등, (1997) Biochem . J. 324:1-18을 참고하라.
본 개시에서는 UV 대역 광, 보다 구체적으로는 UV-C광에 노출된 용액 중 단백질의 산화, 변형 및 분해를 감소시키는 방법들을 제공함으로써 이들 및 기타 문제들을 해결한다. UV-C로의 노출은 기재된 바와 같이 바이러스 불활성화 공정의 성분일 수 있고, 용액 중 단백질은 임의 유형, 예를 들어 항원 결합 단백질과 같은 단백질(예로, (i) 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 단일쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체, 및 이들의 단편들 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 단백질, (ii) Fc 도메인; (iii) 펩티드; (iv) Fc 융합 단백질; 및 (v) 치료 단백질 중 하나 이상)일 수 있다.
발명의 요약
하나의 측면에서, 단백질 성분을 포함하는 표본 중 바이러스의 불활성화 방법이 제공된다. 하나의 구현예에서, 본 방법은 (a) 단백질 성분을 포함하는 표본을 제공하고(여기서 상기 표본은 바이러스를 함유하는 것으로 알려져 있거나 이렇게 추정됨); (b) 바이러스가 불활성화되는 표적 UV 광 선량을 확인하고; (c) 표본에 보호제를 첨가하여 안정화된 혼합물을 형성하고; (d) 안정화된 혼합물을, 선택된 시기 동안 선택된 전력 수준 및 선택된 파장에서 작동하는 광원에 의해 제공되는 UV 광에 노출시키고; (e) 안정화된 혼합물의 UV-C 노출 수준을 평가하고; (f) 평가에서 표적 UV 광 선량이 안정화된 혼합물에 전달되지 않은 것으로 나타나는 경우, 파장, UV 광원 전력 및 UV 광 노출 시간 중 하나 이상을 조정하는 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 표본은 크로마토그래피 컬럼 풀을 포함하며; 특정 구현예들에서, 풀은 단백질 성분을 포함하는 단백질 A(Protein A) 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G(Protein G) 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 풀, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 풀 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 표본은 크로마토그래피 컬럼 배출액 스트림을 포함한다; 특정 구현예들에서, 배출액 스트림은 단백질 성분을 포함하는 단백질 A 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 배출액 스트림, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 배출액 스트림 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
다른 구현예들에서, 단백질 성분은 (i) 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 단일쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체, 및 이들의 단편들 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 단백질, (ii) Fc 도메인; (iii) 펩티드; (iv) Fc 융합 단백질; 및 (v) 치료 단백질 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
추가 구현예들에서, 바이러스는 dsDNA 바이러스, ssDNA 바이러스, dsRNA 바이러스 및 ssRNA 바이러스 중 하나 이상을 포함한다; 구체적 구현예들에서, 바이러스는 아데노비리대, 아스파르비리대, 헤르페스비리대, 이리도비리대, 파필로마비리대, 폴리오마비리대, 폭스비리대, 시르코비리대, 헤파드나비리대, 파르보비리대, 비르나비리대, 레오비리대, 아레나비리대, 보르나비리대, 부나이아비리대, 델타비리대, 필로비리대, 오르소믹소비리대, 파라믹소비리대, 랩도비리대, 아르테리오비리대, 아스트로비리대, 칼리시비리대, 코르노나비리대, 플라비비리대, HEV-유사 바이러스들, 노다비리대, 피코나비리대, 토가비리대, 및 테르트로비리대 바이러스 과 중 하나 이상의 바이러스를 포함할 수 있다. 특정 구현예들에서, 바이러스는 파르보바이러스 MVM, 레트로바이러스 MuLV 또는 부나이아바이러스 CVV이다.
또 다른 구현예에서, 보호제는 단백질 200부에 대해 보호제 1부 초과의 농도비로 표본에 첨가되며, 다른 구현예들에서 보호제는 티로신, 트립토판, 메티오닌, 피리독신 및 리보플라빈 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 구현예들에서, 보호제는 (i) 티로신; (ii) 트립토판; 및 (iii) 티로신과 트립토판 중 하나를 포함한다.
추가 구현예들에서, UV 광의 파장은 약 200nm 내지 약 280nm 범위이다; 특정 구현예들에서, UV 광의 파장은 약 254nm이다. 다양한 구현예들에서, 표적 선량은 약 1mJ/cm2, 약 10mJ/cm2, 약 25mJ/cm2, 약 50mJ/cm2, 약 75mJ/cm2, 약 100mJ/cm2, 약 125mJ/cm2, 약 200mJ/cm2, 약 250mJ/cm2, 약 300mJ/cm2, 약 350mJ/cm2, 약 400mJ/cm2, 약 450mJ/cm2, 약 500mJ/cm2, 약 600mJ/cm2, 약 700mJ/cm2, 약 800mJ/cm2, 약 900mJ/cm2, 약 1000mJ/cm2 및 약 1000mJ/cm2 초과 중 하나 이상일 수 있다.
일부 구현예들에서, 본 방법은 약 0.5, 약 1.0, 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5 이상 또는 6.5 초과의 바이러스 로그 감소값(LRV)을 제공한다.
또 다른 구현예에서 방법은 자동화되며, 또 다른 구현예에서 방법은 단백질 정제 공정에서의 한 단계로서 수행된다.
또 다른 측면에서, UV 노출 동안 생성되는 반응종의 존재로 인한 단백질 분해 또는 변형의 감소 방법이 제공된다. 하나의 구현예에서, 본 방법은 (a) 반응종의 존재 하에 분해되거나 변형되는 것으로 알려져 있거나 이렇게 추정되는 단백질 성분을 포함하는 표본을 제공하고; (b) 표적 UV 광 선량을 확인하고; (c) 표본에 보호제를 첨가하여 안정화된 혼합물을 형성하고; (d) 안정화된 혼합물을, 선택된 시기 동안 선택된 전력 수준 및 선택된 파장에서 작동하는 광원에 의해 제공되는 UV 광에 노출시키고; (e) 안정화된 혼합물의 UV-C 노출 수준을 평가하고; (f) 평가에서 표적 UV 광 선량이 안정화된 혼합물에 전달되지 않은 것으로 나타나는 경우, 파장, UV 광원 전력 및 UV 광 노출 시간 중 하나 이상을 조정하는 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 표본은 크로마토그래피 컬럼 풀을 포함하며; 특정 구현예들에서, 풀은 단백질 성분을 포함하는 단백질 A 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 풀, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 풀 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 표본은 크로마토그래피 컬럼 배출액 스트림을 포함한다; 특정 구현예들에서, 배출액 스트림은 단백질 성분을 포함하는 단백질 A 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 배출액 스트림, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 배출액 스트림 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
다른 구현예들에서, 단백질 성분은 (i) 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 단일쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체, 및 이들의 단편들 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 단백질, (ii) Fc 도메인; (iii) 펩티드; (iv) Fc 융합 단백질; 및 (v) 치료 단백질 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 보호제는 단백질 200부에 대해 보호제 1부 초과의 농도비로 표본에 첨가되며, 다른 구현예들에서 보호제는 티로신, 트립토판, 메티오닌, 피리독신 및 리보플라빈 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 구현예들에서, 보호제는 (i) 티로신; (ii) 트립토판; 및 (iii) 티로신과 트립토판 중 하나를 포함한다.
추가 구현예들에서, UV 광의 파장은 약 200nm 내지 약 280nm 범위이다; 특정 구현예들에서, UV 광의 파장은 약 254nm이다. 다양한 구현예들에서, 표적 선량은 약 1mJ/cm2, 약 10mJ/cm2, 약 25mJ/cm2, 약 50mJ/cm2, 약 75mJ/cm2, 약 100mJ/cm2, 약 125mJ/cm2, 약 200mJ/cm2, 약 250mJ/cm2, 약 300mJ/cm2, 약 350mJ/cm2, 약 400mJ/cm2, 약 450mJ/cm2, 약 500mJ/cm2, 약 600mJ/cm2, 약 700mJ/cm2, 약 800mJ/cm2, 약 900mJ/cm2, 약 1000mJ/cm2 및 약 1000mJ/cm2 초과 중 하나 이상일 수 있다.
일부 구현예들에서, 본 방법은 약 0.5, 약 1.0, 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5 이상 또는 6.5 초과의 바이러스 로그 감소값(LRV)을 제공한다.
또 다른 구현예에서 방법은 자동화되며, 또 다른 구현예에서 방법은 단백질 정제 공정에서의 한 단계로서 수행된다.
추가 측면에서, UV 광을 받는 단백질 중 메티오닌 잔기, 트립토판 잔기 또는 메티오닌과 트립토판 잔기 둘 다의 산화 감소 방법이 제공된다. 하나의 구현예에서, 본 방법은 (a) 메티오닌 잔기, 트립토판 잔기 또는 메티오닌과 트립토판 잔기 둘 다를 포함하는 단백질 성분을 포함하는 표본을 제공하고; (b) 표적 UV 광 선량을 확인하고; (c) 표본에 보호제를 첨가하여 안정화된 혼합물을 형성하고; (d) 안정화된 혼합물을, 선택된 시기 동안 선택된 전력 수준 및 선택된 파장에서 작동하는 광원에 의해 제공되는 UV 광에 노출시키고; (e) 안정화된 혼합물의 UV-C 노출 수준을 평가하고; (f) 평가에서 표적 UV 광 선량이 안정화된 혼합물에 전달되지 않은 것으로 나타나는 경우, 파장, UV 광원 전력 및 UV 광 노출 시간 중 하나 이상을 조정하는 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 표본은 크로마토그래피 컬럼 풀을 포함하며; 특정 구현예들에서, 풀은 단백질 성분을 포함하는 단백질 A 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 풀, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 풀 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 표본은 크로마토그래피 컬럼 배출액 스트림을 포함한다; 특정 구현예들에서, 배출액 스트림은 단백질 성분을 포함하는 단백질 A 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 배출액 스트림, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 배출액 스트림 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
다른 구현예들에서, 단백질 성분은 (i) 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 단일쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체, 및 이들의 단편들 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 단백질, (ii) Fc 도메인; (iii) 펩티드; (iv) Fc 융합 단백질; 및 (v) 치료 단백질 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 보호제는 단백질 200부에 대해 보호제 1부 초과의 농도비로 표본에 첨가되며, 다른 구현예들에서 보호제는 티로신, 트립토판, 메티오닌, 피리독신 및 리보플라빈 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 구현예들에서, 보호제는 (i) 티로신; (ii) 트립토판; 및 (iii) 티로신과 트립토판 중 하나를 포함한다.
추가 구현예들에서, UV 광의 파장은 약 200nm 내지 약 280nm 범위이다; 특정 구현예들에서, UV 광의 파장은 약 254nm이다. 다양한 구현예들에서, 표적 선량은 약 1mJ/cm2, 약 10mJ/cm2, 약 25mJ/cm2, 약 50mJ/cm2, 약 75mJ/cm2, 약 100mJ/cm2, 약 125mJ/cm2, 약 200mJ/cm2, 약 250mJ/cm2, 약 300mJ/cm2, 약 350mJ/cm2, 약 400mJ/cm2, 약 450mJ/cm2, 약 500mJ/cm2, 약 600mJ/cm2, 약 700mJ/cm2, 약 800mJ/cm2, 약 900mJ/cm2, 약 1000mJ/cm2 및 약 1000mJ/cm2 초과 중 하나 이상일 수 있다.
일부 구현예들에서, 본 방법은 약 0.5, 약 1.0, 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5 이상 또는 6.5 초과의 바이러스 로그 감소값(LRV)을 제공한다.
또 다른 구현예에서 방법은 자동화되며, 또 다른 구현예에서 방법은 단백질 정제 공정에서의 한 단계로서 수행된다.
도 1은 SEC-HPLC 분석에 의한 3개의 상이한 pH 수준들(ph 4.3, 5.0 및 7.0)에서 모니터링된 UV-C 노출의 함수로서의 3개의 상이한 모노클로날 항체 표본들(Mab X, Mab Y, Mab Z)에서의 메인 피크 변화 백분율의 그래프이다; y-축은 용액 표면으로 전달되는 0mJ 선량에 대비한 값의 변화 %로 도식화되며, x-축은 용액 표면으로 전달되는 산출 선량(mJ/cm2)으로 도식화된다. 모든 표본들은 여과된 바이러스 불활성화 풀들(FVIP)이었다.
도 2는 CEX-HPLC 분석에 의한 3개의 상이한 pH 수준들(pH 4.3, 5.0 및 7.0)에서 모니터링된 UV-C 노출의 함수로서의 2개의 상이한 모노클로날 항체 표본들(Mab X, Mab Z)에서의 메인 피크, 산성 피크 및 염기성 피크 순도의 그래프이다; y-축은 용액 표면으로 전달되는 0mJ/cm2 선량에 대비한 측정 종의 분포 %로 도식화되며, x-축은 용액 표면으로 전달되는 산출 선량(mJ/cm2)으로 도식화된다. 모든 표본들은 여과된 바이러스 불활성화 풀들(FVIP)이었다.
도 3은 SEC-HPLC 분석에 의한 3개의 상이한 전도성 수준들(낮음(30mM HOAc), 표준(100mM HOAc), 및 높음(300mM HOAc))에서 모니터링된 UV-C 노출의 함수로서의 3개의 상이한 모노클로날 항체 표본들(Mab X, Mab Y, Mab Z)에서의 메인 피크 변화 백분율의 그래프이다; y-축은 용액 표면으로 전달되는 0mJ/cm2 선량에 대비한 값의 변화 %로 도식화되며, x-축은 용액 표면으로 전달되는 산출 선량(mJ/cm2)으로 도식화된다.
도 4는 CEX-HPLC 분석에 의한 3개의 상이한 전도성 수준들(낮음(30mM HOAc), 표준(100mM HOAc), 및 높음(300mM HOAc))에서 모니터링된 UV-C 노출의 함수로서의 2개의 상이한 모노클로날 항체 표본들(Mab X, Mab Z)에서의 메인 피크, 산성 피크 및 염기성 피크 순도의 그래프이다; y-축은 용액 표면으로 전달되는 0mJ/cm2 선량에 대비한 측정 종의 분포 %로 도식화되며, x-축은 용액 표면으로 전달되는 산출 선량(mJ/cm2)으로 도식화된다. 모든 표본들은 여과된 바이러스 불활성화 풀들(FVIP)이었다.
도 5는 SEC-HPLC 분석에 의한 3개의 상이한 농도들(낮음(6g/L), 표준(12g/L), 및 높음(24g/L))에서 모니터링된 UV-C 노출의 함수로서의 모노클로날 항체(Mab X)의 메인 피크 농도의 그래프이다; y-축은 용액 표면으로 전달되는 0mJ/cm2 선량에 대비한 값의 변화 %로 도식화되며, x-축은 용액 성분들에 의한 UV 흡광도를 고려할 때 수신되는 산출 선량(mJ/cm2)으로 도식화된다.
도 6은 SEC-HPLC 분석에 의해 모니터링된 UV-C 노출의 함수로서의 모노클로날 항체(Mab X)의 메인 피크 순도의 3개 자취들 및 그래프이다. 그래프는 Mab X, UV 노출 수행 1 및 UV 노출 수행 2에 대한 2개의 펩티드 맵들을 나타낸다. y-축은 용액 표면으로 전달되는 0mJ/cm2 선량에 대비한 값의 변화 %로 도식화되며, x-축은 용액 표면으로 전달되는 산출 선량(mJ/cm2)으로 도식화된다.
도 7은 용액 표면으로 전달되는 10,000mJ/cm2의 UV-C 노출 후 모노클로날 항체(Mab X)의 아미노산 잔기에서 관찰되는 산화 효과들을 강조하는 펩티드 맵이다. 위치 425 및 249의 메티오닌 잔기의 산화가 이 매우 높은 수준의 UV-C 선량 노출 시 관찰되었다.
도 8은 0, 150, 375 및/또는 1000mJ/cm2의 UV-C 노출 선량들의 함수로서 모노클로날 항체(Mab X)의 순도 및 활성 경향들을 요약하는 표이다. 펩티드 맵 결과들은 선량 증가로 단백질 상의 특정 메티오닌 잔기의 산화 수준이 증가함을 확인시킨다. Mab X는 "대조군"로 나타내며, 티로신은 "첨가제 1"로 나타낸다.
도 9는 SEC-HPLC 분석에 의해 모니터링된 보호제의 존재 및 부재 하 UV-C 노출의 함수로서의 모노클로날 항체(Mab X)의 메인 피크 순도의 그래프이다; y-축은 측정된 종의 분포로서의 메인 피크%로 도식화되며, x-축은 용액 표면으로 전달되는 산출 선량(mJ/cm2)으로 도식화된다. 그래프는 Mab X에 대해 UV 노출 수행 1 및 UV 노출 수행 2, 미처리 반복 수행들, 및 트립토판을 이용해서 보호 수행한 UV 노출 "첨가제 #2"의 3개의 펩티드 맵들을 나타낸다.
도 10은 보호제 및 모노클로날 항체(Mab Y)의 존재 및 부재 하 UV-C 노출의 함수로서의 xmuLV불활성화의 그래프이다 y-축은 알고 있는 바이러스 부하 스파이크로부터의 상대 로그 감소(로그 감소값(LRV))로 도식화된다. x-축은 용액 성분들에 의한 UV 흡광도를 고려할 때 수신된 산출 선량(mJ/cm2)으로 도식화된다. 표본 "대조군"(Mab Y) 중의 단백질 농도는 2g/L 및 30g/L이고, 표본 "첨가제 1"(Mab Y + 티로신) 중의 단백질 농도는 2g/L 및 30g/L이다.
도 11a 및 11b는 DNA 바이러스들(도 11a) 및 RNA 바이러스들(도 11b)의 불활성화에 필요한 요구 UV-C 선량들을 나타내는 표들이다.
도 12는 다양한 바이러스들의 불활성화에 필요한 UV 선량 대비 예측 로그 감소값(LRV)을 나타내는 표이다.
도 13은 다량의 안정화된 표본을 수용하기 위해 병렬 작동 중인 여러 UV-C 광원들의 모식도이다.
도 14는 SEC-HPLC 분석에 의해 모니터링되는 티로신(TYR), 트립토판(TRP), 페닐알라닌(PHE), 엽산, 메티오닌(MET) 및 히스티딘(HIS)을 포함하는 다양한 보호제들의 존재 하 UV-C 노출의 함수로서의 모노클로날 항체(Mab X)의 메인 피크 순도의 그래프이다; y-축은 측정된 종의 분포로서의 메인 피크%로 도식화되며, x-축은 용액 표면으로 전달되는 산출 선량으로 도식화된다. 아미노산 대 Mab X의 몰비는 20:1이다. Mab X의 대조군도 제공된다.
도 15는 SEC-HPLC 분석에 의해 모니터링되는 티로신(TYR), 트립토판(TRP), 페닐알라닌(PHE), 엽산, 메티오닌(MET) 및 히스티딘(HIS)을 포함하는 다양한 보호제들의 존재 하 UV-C 노출의 함수로서의 모노클로날 항체(Mab X)의 메인 피크 순도의 그래프이며 초기 순도로부터의 변화 백분율로 나타낸다; y-축은 메인 피크 순도에서 정상화된 변화 %로 도식화되며, x-축은 용액 표면으로 전달되는 산출 선량으로 도식화된다. 아미노산 대 Mab X의 몰비는 20:1이다. Mab X의 대조군도 제공된다.
도 2는 CEX-HPLC 분석에 의한 3개의 상이한 pH 수준들(pH 4.3, 5.0 및 7.0)에서 모니터링된 UV-C 노출의 함수로서의 2개의 상이한 모노클로날 항체 표본들(Mab X, Mab Z)에서의 메인 피크, 산성 피크 및 염기성 피크 순도의 그래프이다; y-축은 용액 표면으로 전달되는 0mJ/cm2 선량에 대비한 측정 종의 분포 %로 도식화되며, x-축은 용액 표면으로 전달되는 산출 선량(mJ/cm2)으로 도식화된다. 모든 표본들은 여과된 바이러스 불활성화 풀들(FVIP)이었다.
도 3은 SEC-HPLC 분석에 의한 3개의 상이한 전도성 수준들(낮음(30mM HOAc), 표준(100mM HOAc), 및 높음(300mM HOAc))에서 모니터링된 UV-C 노출의 함수로서의 3개의 상이한 모노클로날 항체 표본들(Mab X, Mab Y, Mab Z)에서의 메인 피크 변화 백분율의 그래프이다; y-축은 용액 표면으로 전달되는 0mJ/cm2 선량에 대비한 값의 변화 %로 도식화되며, x-축은 용액 표면으로 전달되는 산출 선량(mJ/cm2)으로 도식화된다.
도 4는 CEX-HPLC 분석에 의한 3개의 상이한 전도성 수준들(낮음(30mM HOAc), 표준(100mM HOAc), 및 높음(300mM HOAc))에서 모니터링된 UV-C 노출의 함수로서의 2개의 상이한 모노클로날 항체 표본들(Mab X, Mab Z)에서의 메인 피크, 산성 피크 및 염기성 피크 순도의 그래프이다; y-축은 용액 표면으로 전달되는 0mJ/cm2 선량에 대비한 측정 종의 분포 %로 도식화되며, x-축은 용액 표면으로 전달되는 산출 선량(mJ/cm2)으로 도식화된다. 모든 표본들은 여과된 바이러스 불활성화 풀들(FVIP)이었다.
도 5는 SEC-HPLC 분석에 의한 3개의 상이한 농도들(낮음(6g/L), 표준(12g/L), 및 높음(24g/L))에서 모니터링된 UV-C 노출의 함수로서의 모노클로날 항체(Mab X)의 메인 피크 농도의 그래프이다; y-축은 용액 표면으로 전달되는 0mJ/cm2 선량에 대비한 값의 변화 %로 도식화되며, x-축은 용액 성분들에 의한 UV 흡광도를 고려할 때 수신되는 산출 선량(mJ/cm2)으로 도식화된다.
도 6은 SEC-HPLC 분석에 의해 모니터링된 UV-C 노출의 함수로서의 모노클로날 항체(Mab X)의 메인 피크 순도의 3개 자취들 및 그래프이다. 그래프는 Mab X, UV 노출 수행 1 및 UV 노출 수행 2에 대한 2개의 펩티드 맵들을 나타낸다. y-축은 용액 표면으로 전달되는 0mJ/cm2 선량에 대비한 값의 변화 %로 도식화되며, x-축은 용액 표면으로 전달되는 산출 선량(mJ/cm2)으로 도식화된다.
도 7은 용액 표면으로 전달되는 10,000mJ/cm2의 UV-C 노출 후 모노클로날 항체(Mab X)의 아미노산 잔기에서 관찰되는 산화 효과들을 강조하는 펩티드 맵이다. 위치 425 및 249의 메티오닌 잔기의 산화가 이 매우 높은 수준의 UV-C 선량 노출 시 관찰되었다.
도 8은 0, 150, 375 및/또는 1000mJ/cm2의 UV-C 노출 선량들의 함수로서 모노클로날 항체(Mab X)의 순도 및 활성 경향들을 요약하는 표이다. 펩티드 맵 결과들은 선량 증가로 단백질 상의 특정 메티오닌 잔기의 산화 수준이 증가함을 확인시킨다. Mab X는 "대조군"로 나타내며, 티로신은 "첨가제 1"로 나타낸다.
도 9는 SEC-HPLC 분석에 의해 모니터링된 보호제의 존재 및 부재 하 UV-C 노출의 함수로서의 모노클로날 항체(Mab X)의 메인 피크 순도의 그래프이다; y-축은 측정된 종의 분포로서의 메인 피크%로 도식화되며, x-축은 용액 표면으로 전달되는 산출 선량(mJ/cm2)으로 도식화된다. 그래프는 Mab X에 대해 UV 노출 수행 1 및 UV 노출 수행 2, 미처리 반복 수행들, 및 트립토판을 이용해서 보호 수행한 UV 노출 "첨가제 #2"의 3개의 펩티드 맵들을 나타낸다.
도 10은 보호제 및 모노클로날 항체(Mab Y)의 존재 및 부재 하 UV-C 노출의 함수로서의 xmuLV불활성화의 그래프이다 y-축은 알고 있는 바이러스 부하 스파이크로부터의 상대 로그 감소(로그 감소값(LRV))로 도식화된다. x-축은 용액 성분들에 의한 UV 흡광도를 고려할 때 수신된 산출 선량(mJ/cm2)으로 도식화된다. 표본 "대조군"(Mab Y) 중의 단백질 농도는 2g/L 및 30g/L이고, 표본 "첨가제 1"(Mab Y + 티로신) 중의 단백질 농도는 2g/L 및 30g/L이다.
도 11a 및 11b는 DNA 바이러스들(도 11a) 및 RNA 바이러스들(도 11b)의 불활성화에 필요한 요구 UV-C 선량들을 나타내는 표들이다.
도 12는 다양한 바이러스들의 불활성화에 필요한 UV 선량 대비 예측 로그 감소값(LRV)을 나타내는 표이다.
도 13은 다량의 안정화된 표본을 수용하기 위해 병렬 작동 중인 여러 UV-C 광원들의 모식도이다.
도 14는 SEC-HPLC 분석에 의해 모니터링되는 티로신(TYR), 트립토판(TRP), 페닐알라닌(PHE), 엽산, 메티오닌(MET) 및 히스티딘(HIS)을 포함하는 다양한 보호제들의 존재 하 UV-C 노출의 함수로서의 모노클로날 항체(Mab X)의 메인 피크 순도의 그래프이다; y-축은 측정된 종의 분포로서의 메인 피크%로 도식화되며, x-축은 용액 표면으로 전달되는 산출 선량으로 도식화된다. 아미노산 대 Mab X의 몰비는 20:1이다. Mab X의 대조군도 제공된다.
도 15는 SEC-HPLC 분석에 의해 모니터링되는 티로신(TYR), 트립토판(TRP), 페닐알라닌(PHE), 엽산, 메티오닌(MET) 및 히스티딘(HIS)을 포함하는 다양한 보호제들의 존재 하 UV-C 노출의 함수로서의 모노클로날 항체(Mab X)의 메인 피크 순도의 그래프이며 초기 순도로부터의 변화 백분율로 나타낸다; y-축은 메인 피크 순도에서 정상화된 변화 %로 도식화되며, x-축은 용액 표면으로 전달되는 산출 선량으로 도식화된다. 아미노산 대 Mab X의 몰비는 20:1이다. Mab X의 대조군도 제공된다.
발명의 상세한 설명
본 개시는 자외선 범위의 C 대역(UV-C, 대략 254nm)의 조사로 단백질 함유 용액들을 처리하는 방법들을 제공한다. 보다 구체적으로 본 개시는 단백질을 안정화하거나 단백질 변형들, 예로 메티오닌 및 트립토판과 같은 잔기의 산화를 최소화하는 화합물들의 존재 하에서 자외선 범위의 C 대역(UV-C, 대략 254nm)의 조사로 단백질 함유 용액들을 처리하는 방법을 제공한다.
본원에서 제공되는 바이러스 불활성화 방법들은 바이러스 및 바이러스 관련 입자들의 불활성화 가능성을 최대화하면서 단백질 손상, 변형 또는 변조를 최소화하는 세심한 균형을 목표로 한다. 본 개시는 UV-C 대역의 광에 의한 용액의 처리 시 생성되는 종에 의한 간접적 변형으로부터 용액 단백질들의 보호를 제공할 수 있는 다양한 용액 첨가제들을 확인시킨다. 단백질 변형에 대한 UV-C의 효과들을 확립하기 위해 여러 폴리펩티드 분자들, 현저하게는 항원 결합 단백질들(예로 모노클로날 항체 분자들)에 걸쳐 데이터가 수집되었다. SEC-HPLC(응집 및 이량체화를 조사하기 위해), CEX-HPLC(전하 변형을 조사하기 위해), 펩티드 맵핑(분자 변형, 산화 및 기타 효과들을 조사하기 위해) 및 생체활성(분자 역가를 조사하기 위해)에 의해 측정되는 선량 수준(투과 UV-C의 mJ/cm2) 및 단백질 변형 수준 간 관계가 확립되었다.
따라서 하나의 측면에서, 본 개시는 단백질 성분을 함유하는 표본 중 바이러스의 불활성화 방법에 관한 것이다. 방법에는 바이러스를 불활성화하기 위한 UV 광의 사용이 관여된다. 개시된 방법의 하나의 유익한 측면은 표본의 단백질 성분의 분해 또는 변형 가능성을 최소화할 수 있는 보호제를 혼입한다는 것이다. 방법에는 피드백 성분이 관여될 수 있으며, 여기서 보호제를 포함하는 표본은 이것이 바이러스를 불활성화하기 충분한 UV 광 선량을 얻으면서 동시에 단백질에 손상을 줄 수 있는 UV 광 선량들로 단백질 성분의 노출을 최소화도록 모니터링된다. 이 절차는 단백질 분해를 최소화하는 동시에 표본 중 바이러스들을 효율적으로 제거할 수 있고, 표본 용량 또는 병렬 공정들의 견지들에서 대량 수준들로 작업할 때 유익할 수 있는데, 이는 특히 방법이 수 리터들 수준의 배양들이 관여되는 실험실 규모에서 수천 리터들의 배양들이 관여되는 생산 규모까지 확장 가능하기 때문이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 반응종, 예컨대 UV 광으로의 용액 노출에 의해 생성될 수 있는 반응종의 존재 하에 단백질 분해 또는 변형을 감소하는 방법에 관한 것이다. UV 광에 대한 연장된 노출 결과 단백질들이 분해되거나 변형될 수 있음이 관찰되었다. 단백질 성분을 포함하는 표본 중에 보호제를 포함시킴으로써, 단백질에 대한 손상이 감소되거나 제거될 수 있다. 방법에는 피드백 성분이 관여될 수 있으며, 여기서 보호제를 포함하는 표본은 이것이 바이러스를 불활성화하기 충분한 UV 광 선량을 얻으면서 동시에 단백질에 손상을 줄 수 있는 UV 광 선량들로 단백질 성분의 노출을 최소화도록 모니터링된다. 이 절차는 표본의 단백질 성분을 단백질 분해 또는 변형으로부터 효율적으로 보호할 수 있고, 표본 용량 또는 병렬 공정들의 견지들에서 대량 수준들로 작업할 때 유익할 수 있는데, 이는 특히 방법이 수 리터들 수준의 배양들이 관여되는 실험실 규모에서 수천 리터들의 배양들이 관여되는 생산 규모까지 확장 가능하기 때문이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 UV 광을 받는 단백질 중 메티오닌 잔기, 트립토판 잔기 또는 메티오닌 및 트립토판 잔기 둘 다의 산화 감소 방법에 관한 것이다. UV 광에 대한 연장된 노출 결과 트립토판 및 메티오닌이 산화될 수 있음이 관찰되었다. 단백질 성분을 포함하는 표본 중에 보호제를 포함시킴으로써, 이러한 산화가 감소되거나 제거될 수 있다. 방법에는 피드백 성분이 관여될 수 있으며, 여기서 보호제를 포함하는 표본은 이것이 바이러스를 불활성화하기 충분한 UV 광 선량을 얻으면서 동시에 단백질에 손상을 줄 수 있는 UV 광 선량들로 단백질 성분의 노출을 최소화도록 모니터링된다. 이 절차는 표본의 단백질 성분을 단백질 분해 또는 변형으로부터 효율적으로 보호할 수 있고, 표본 용량 또는 병렬 공정들의 견지들에서 대량 수준들로 작업할 때 유익할 수 있는데, 이는 특히 방법이 수 리터들 수준의 배양들이 관여되는 실험실 규모에서 수천 리터들의 배양들이 관여되는 생산 규모까지 확장 가능하기 때문이다.
개시된 방법들의 하나의 장점은 이것이 실험실 규모(통상 밀리리터 또는 리터 수준), 파일로트 공장 규모(통상 수백 리터들) 또는 산업적 규모(통상 수천 리터들)의 다양한 범위의 규모들로 수행될 수 있다는 것이다. 또한, 절차는 병렬 또는 순차적으로 여러 번 수행될 수도 있다. 따라서 절차는 쉽게 자동화될 수 있다. 개시된 방법들의 대규모 적용은 특히 생체분자 제조 방법에서 바람직할 수 있다.
I. 정의들
본원에서 사용되는 용어들 "하나의" 및 "한"는 달리 명시적으로 나타내지 않는 한 하나 이상을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "항원"는 항원 결합 단백질(예로 항체 또는 이들의 면역원성 기능성 단편 포함)과 같은 선택적 결합제에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 나타내며, 그 항원에 결합할 수 있는 항체들을 생성하기 위해 동물에서도 사용될 수 있다. 항원은 상이한 항원 결합 단백질들, 예로 항체들과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 에피토프들을 보유할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 단백질"란 항원 결합 부분이 항원 결합 단백질의 항원으로의 결합을 촉진하는 입체구조를 채용하도록 허용하는 항원 또는 표적 및 선택적으로 골격 또는 틀 부분에 결합하는 부분을 포함하는 단백질을 나타낸다. 항원결합 단백질들의 예들에는 모노클로날 항체; 인간 항체; 인간화 항체; 키메라 항체; 재조합 항체; 단일쇄 항체; 디아바디; 트리아바디; 테트라바디; 도메인 항체; Fab 단편; F(ab')2 단편; IgD 항체; IgE 항체; IgM 항체; IgG1 항체; IgG2 항체; IgG3 항체; 또는 IgG4 항체, 및 이들의 단편들이 포함된다. 항원 결합 단백질은, 예를 들어 그래프트된 CDR들 또는 CDR 유도체들을 갖는 대안적 단백질 골격 또는 인공 골격을 포함할 수 있다. 이러한 골격들에는, 예를 들어 항원 결합 단백질의 3차원 구조를 안정화하기 위해 도입된 돌연변이들을 포함하는 항체 유래 골격들뿐만 아니라, 예를 들어 생체적합성 중합체를 포함하는 전체 합성 골격들이 비제한적으로 포함된다. 예로 Korndorfer 등, (2003) Proteins : Structure , Function , and Bioinformatics, 53(1):121-129; Roque 등, (2004) Biotechnol . Prog . 20:639-654를 참고하라. 또한, 펩티드 항체 모사체들("PAMs")은 피브로넥틴 성분들을 이용하는 항체 모사체들에 근거한 하나의 골격뿐만 아니라 골격들을 형성할 수 있다.
항원 결합 단백질은, 예를 들어 천연 생성 면역글로불린의 구조를 가질 수 있다. "면역글로불린"는 사량체 분자이다. 천연 생성 면역글로불린에서, 각각의 사량체는 각각의 쌍이 하나의 "경쇄"(약 25kDa) 및 하나의 "중쇄"(약50-70kDa)를 갖는 두 개의 동일한 폴리펩티드 사슬들의 쌍들로 이루어진다. 각 사슬의 아미노 말단부에는 항원 인식에 주로 관여하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산들의 가변 영역이 포함된다. 각 사슬의 카르복시 말단부는 작용기 기능에 주로 관여하는 불변 영역을 정의한다. 인간 경쇄들은 카파 및 람다 경쇄들로 분류된다. 중쇄들은 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되며, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역들은 약 12개 이상의 아미노산들의 "J" 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산들의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로 그 전문이 모든 목적들을 위해 참조로 도입된 Fundamental Immunology 2nd ed. Ch. 7 (Paul, W. ed. Raven Press, N.Y. (1989))을 참고하라. 각각의 경쇄/중쇄의 가변 영역들은 온전한 면역글로불린이 2개의 결합 부위들을 갖도록 항체 결합 부위를 형성한다.
천연 생성 면역글로불린 사슬들은 상보성 결정 영역들 또는 CDR들로도 불리는 3개의 고가변 영역들에 의해 연결된 상대적으로 보존된 틀 영역들(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. N-말단에서부터 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄는 모두 도메인들 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인으로의 아미노산들의 지정은 Kabat 등, (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed. US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242의 정의들에 따라 수행될 수 있다. Kabat 명명 체계를 이용하여 나타내었지만, 필요하다면 본원에 개시된 CDR들은 Chothia의 것과같은 대안적 명명 방식에 따라 재정의될 수도 있다(Chothia & Lesk, (1987) J. Mol . Biol . 196:901-917; Chothia 등, (1989) Nature 342:878-883 또는 Honegger & Pluckthun, (2001) J. Mol . Biol . 309:657-670 참고).
본원에서 사용되는 용어 "항체"란 달리 명시되지 않는 한, 온전한 면역글로불린 또는 특이적 결합에 대해 온전한 항체와 경쟁하는 항원 결합 부분을 나타낸다. 항원 결합 부분들은 재조합 DNA 기법들 또는 온전한 항체들의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 항원 결합 부분들에는 특히 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체들(dAb들), 상보성 결정 영역들(CDR들)을 포함하는 단편들, 단일쇄 항체들(scFv), 키메라 항체들, 디아바디들, 트리아바디들, 테트라바디들, 및 폴리펩티드에 대한 특이적 항원 결합을 부여하기 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩티드들이 포함된다.
Fab 단편은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인들을 갖는 1가 단편이다; F(ab')2 단편은 힌지 영역에서 디설피드 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 갖는 2가 단편이다; Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인들을 갖는다; Fv 단편은 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인들을 갖는다; 그리고 dAb 단편은 VH 도메인, VL 도메인, 또는 VH 또는 VL 도메인의 항원 결합 단편을 갖는다(US 특허 번호들 6,846,634, 및 6,696,245; 및 US 출원 공개 번호들 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507, 03/0039958, Ward 등, Nature 341:544-546 (1989)).
단일쇄 항체(scFv)는 VL 및 VH 영역이 링커(예로 아미노산 잔기의 합성 서열)를 통해 연결되어 연속 단백질쇄를 형성하는 항체이며, 여기서 링커는 단백질쇄가 스스로 되접혀서 1가 항원 결합 부위를 형성하도록 만들기에 충분히 길다(예로 Bird 등, (1988) Science 242:423-26 및 Huston 등, (1988) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 85:5879-83 참고). 디아바디들은 두 폴리펩티드쇄들을 포함하는 2가 항체들이며, 여기서 각각의 폴리펩티드쇄는 동일쇄 상에서 두 도메인들 간의 쌍 형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인들을 포함하여 각각의 도메인은 또 다른 폴리펩티드쇄 상에서 상보적 도메인과 쌍을 형성할 수 있다(예로 Holliger 등, (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:6444-48, 및 Poljak 등, (1994) Structure 2:1121-23 참고). 디아바디의 두 폴리펩티드쇄들이 동일한 경우, 이들의 쌍 형성으로 생성되는 디아바디는 2개의 동일한 항원 결합 부위들을 가질 것이다. 상이한 서열들을 갖는 폴리펩티드쇄들을 이용하여 2개의 상이한 항원 결합 부분들을 갖는 디아바디를 제조할 수 있다. 유사하게, 트리아바디들 및 테트라바디들은 각각 3개 및 4개의 폴리펩티드쇄들을 포함하며 각각 동일하거나 상이할 수 있는 3개 및 4개의 항원 결합 부위들을 형성하는 항체들이다.
주어진 항체의 상보성 결정 영역들(CDR들) 및 틀 영역들(FR)은 Kabat 등, (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed. US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242에 기재된 바와 같은 시스템을 이용하여 확인될 수 있다. Kabat 명명 체계를 이용하여 나타내었지만, 필요하다면 본원에 개시된 CDR들은 Chothia의 것과같은 대안적 명명 방식에 따라 재정의될 수도 있다(Chothia & Lesk, (1987) J. Mol . Biol . 196:901-917; Chothia 등, (1989) Nature 342:878-883 또는 Honegger & Pluckthun, (2001) J. Mol . Biol . 309:657-670 참고). 하나 이상의 CDR들은 공유적으로 또는 비공유적으로 분자 내에 혼입되어 이를 항원 결합 단백질로 만들 수 있다. 항원 결합 단백질은 더 큰 폴리펩티드쇄의 일부로서 CDR(들)을 혼입할 수 있거나, CDR(들)을 또 다른 폴리펩티드쇄에 공유 연결할 수 있거나, CDR(들)을 비공유 혼입할 수 있다. CDR들은 항원 결합 단백질이 관심 대상인 특정 항원에 특이적으로 결합할 수 있도록 한다.
항원 결합 단백질은 하나 이상의 결합 부위들을 가질 수 있다. 둘 이상의 결합 부위가 있는 경우, 결합 부위들은 서로 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. 예를 들어 천연 생성 인간 면역글로불린은 통상 2개의 동일한 결합 부위들을 갖는 반면, "2특이적" 또는 "2기능적" 항체는 2개의 상이한 결합 부위들을 갖는다. 이러한 2특이적 형태의 항원 결합 단백질들이 본 개시의 측면들을 형성한다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"란 인간 면역글로불린 서열들에서 유래된 하나 이상의 가변 및 불변 영역들을 갖는 모든 항체들을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 모든 가변 및 불변 도메인들은 인간 면역글로불린(완전인간 항체) 서열들에서 유래된다. 이들 항체들은 다양한 방식들로 제조될 수 있으며, 인간 중쇄 및/또는 경쇄 인코딩 유전자들에서 유래한 항체들을 발현하도록 유전적으로 변형된 마우스, 예컨대 Xenomouse®, UltiMabTM, HuMAb-Mouse®, Velocimouse®, Velocimmune®, KyMouse, 또는 AlivaMab 시스템 유래 마우스, 또는 인간 중쇄 유전자도입 마우스 유래의 관심 항원의 면역화를 통한 유전자 도입 래트 인간 항체 레퍼토리, 유전자도입 토끼 인간 항체 레퍼토리 또는 소 인간 항체 레퍼토리 또는 HuTargTM 기술을 포함하는 그 예들이 기술된다. 파지 기반 접근법들도 채용될 수 있다.
인간화 항체는 하나 이상의 아미노산 치환들, 결실들, 및/또는 부가들에 의해 비인간종 유래의 항체 서열과 상이한 서열을 가져서 인간화 항체는 인간 대상체에 투여될 때 비인간종의 항체에 비해 면역 반응을 유도할 가능성이 더 적고/적거나 덜 심한 면역 반응을 유도한다. 하나의 구현예에서, 비인간 종 항체의 중쇄 및/또는 경쇄들의 틀 및 불변 영역들의 특정 아미노산들이 돌연변이되어 인간화 항체를 생성한다. 또 다른 구현예에서, 인간 항체의 불변 도메인(들)이 비인간 종의 가변 도메인(들)에 융합된다. 또 다른 구현예에서, 비인간 항체의 하나 이상의 CDR 서열들에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 인간 대상체에게 투여될 때 비인간 항체의 면역원성을 감소시킬 수 있도록 변경되며, 여기서 변경된 아미노산 잔기는 항체의 그 항원으로의 면역특이적 결합에 결정적인 것이 아니거나 인간화 항체의 항원으로의 결합이 비인간 항체의 항원으로의 결합에 비해 크게 악화되지 않도록 아미노산 서열들의 변경이 보존적 변경들이다. 인간화 항체들의 제조 예들은 U.S. 특허 번호들 6,054,297, 5,886,152 및 5,877,293에서 찾아볼 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "키메라 항체"란 하나의 항체로부터의 하나 이상의 영역들 그리고 하나 이상의 다른 항체들로부터의 하나 이상의 영역들을 함유하는 항체를 나타낸다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 CDR들은 선택된 표적에 결합하는 인간 항체에서 유래된다. 또 다른 구현예에서, 모든 CDR들은 선택된 표적에 결합하는 인간 항체로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 선택된 표적에 결합하는 둘 이상의 인간 항체로부터의 CDR들이 키메라 항체에서 혼합되고 매칭된다. 예를 들어 키메라 항체는 선택된 표적에 결합하는 제 1 인간 항체의 경쇄로부터의 CDR1, 선택된 표적에 결합하는 제 2 인간 항체의 경쇄로부터의 CDR2 및 CDR3, 그리고 선택된 항체에 결합하는 제 3 항체의 중쇄로부터의 CDR들을 포함할 수 있다. 또한, 틀 영역들은 선택된 표적에 결합하는 동일 항체들 중 하나로부터, 하나 이상의 상이한 항체들, 예컨대 인간 항체로부터 또는 인간화 항체로부터 유래될 수 있다. 키메라 항체의 한 예에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하거나 특정 종으로부터의 항체와 동일하거나, 상동성이거나, 이로부터 유래되는 반면, 사슬(들)의 나머지는 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하거나 또 다른 종으로부터의 항체 또는 항체들과 동일하거나, 상동성이거나, 이로부터 유래된다. 또한 원하는 생물학적 활성(예로 선택된 표적에 특이적으로 결합하는 능력)을 나타내는 항체들의 단편들이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어들 "Fc" 및 "Fc 영역"는 상호교환적으로 사용되며, 인간 또는 비인간(예로 설치류) CH2 및 CH3 면역글로불린 도메인들을 포함하거나 또는 인간 또는 비인간 CH2 및 CH3 면역글로불린 도메인들과 적어도 90% 동일한 2개의 인접 영역들을 포함하는 항체의 단편을 나타낸다. 2개의 중쇄 단편들은 2개 이상의 디설피드 결합들에 의해 그리고 CH3 도메인들의 소수성 상호작용들에 의해 함께 유지된다. Fc는 Fc 수용체와 상호작용하는 능력을 가질 수 있지만 꼭 필요한 것은 아니다. 예로 본원에 그 전문이 참조로 도입되는 William E. Paul, ed. Fundamental Immunology, Second Edition, 209, 210-218 (1989)의Hasemann & Capra, "Immunoglobulins: Structure and Function,"를 참고하라.
본원에서 사용되는 용어들 "Fc 융합" 및 "Fc 융합 단백질"는 상호교환적으로 사용되며, Fc 도메인에 공유 부착된 펩티드 또는 폴리펩티드를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어들 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 상호교환적으로 사용되며, 펩티드 결합들에 의해 연결되는 적어도 5개의 천연 또는 비천연 생성 아미노산들의 임의의 사슬을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "펩티바디"는 선택적으로 링커들을 통해 Fc 도메인과 함께 연결된 하나 이상의 생체활성 펩티드들을 포함하는 폴리펩티드이다. 펩티바디들의 예들로 US 특허 번호 6,660,843, US 특허 번호 7,138,370 및 US 특허 번호 7,511,012를 참고하라.
본원에서 사용되는 용어 "Fab' 단편"란 하나의 경쇄 및 VH 도메인 및 CH1 도메인을 함유하는 하나의 중쇄의 일부 그리고 또한 CH1 및 CH2 도메인들 간 영역을 함유하여 사슬간 디설피드 결합이 두 Fab' 단편들의 2개의 중쇄들 간에 형성되어 F(ab')2 분자를 형성하도록 하는 구조를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "F(ab')2 단편"는 CH1 및 CH2 도메인들간의 불변 영역의 일부를 함유하는 2개의 중쇄들 및 2개의 경쇄들을 함유하여 사슬간 디설피드 결합이 두 중쇄들 간에 형성되도록 하는 구조를 나타낸다. 따라서 F(ab')2 단편은 2개의 중쇄들 간의 디설피드 결합으로 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편들로 이루어진다.
본원에서 사용되는 용어 "Fv 영역"란 중쇄 및 경쇄 둘로부터의 가변 영역들을 포함하지만 불변 영역들은 없는 구조를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "도메인 항체"는 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 함유하는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편을 나타낸다. 일부 경우들에서, 2개 이상의 VH 영역들이 펩티드 링커로 공유 결합되어 2가 도메인 항체를 생성한다. 2가 도메인 항체의 2개의 VH 영역들은 동일하거나 상이한 항원들을 표적으로 할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "헤미바디"란 완전한 중쇄, 완전한 경쇄, 및 완전한 중쇄의 Fc 영역과 짝을 이룬 제 2 중쇄 Fc 영역을 포함하는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 구축물을 나타낸다. 링커는 중쇄 Fc 영역 및 제 2 중쇄 Fc 영역을 결합하는데 사용될 수 있지만 반드시 그래야 하는 것은 아니다. 추가 구현예들에서, 헤미바디는 본원에 개시된 항원 결합 단백질의 1가 형태이다. 다른 구현예들에서, 하전된 잔기의 쌍들은 하나의 Fc 영역을 제 2 Fc 영역과 연합하는데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어들 "2가 항원 결합 단백질" 또는 "2가 항체"란 2개의 항원 결합 부위들을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단백질을 나타낸다. 일부 예들에서, 2개의 결합 부위들은 동일한 항원 특이성들을 갖는다. 2가 항원 결합 단백질들 및 2가 항체들은 본원에 기재된 바와 같이 2특이적일 수 있고, 본 개시의 측면들을 형성한다.
본원에서 사용되는 용어들 "다특이적 항원 결합 단백질" 또는 "다특이적 항체"는 단백질 성분의 맥락에서 사용되는 경우 둘 이상의 항원 또는 에피토프를 표적으로 하는 것이며, 본 개시의 또 다른 측면을 형성한다.
본원에서 사용되는 용어들 "2특이적," "이중 특이적" 또는 "2기능적"란 항원 결합 단백질 또는 항체 단백질 성분의 맥락에서 사용되는 경우, 각각 2개의 상이한 항원 결합 부위들을 갖는 하이브리드 항원 결합 단백질 또는 항체이다. 2특이적 항원 결합 단백질들 및 항체들은 다특이적 항원 결합 단백질 또는 다특이적 항체의 종이며, 하이브리도마들의 융합 또는 Fab' 단편들의 결합을 비제한적으로 포함하는 다양한 방법들에 의해 생성될 수 있다. 예로 Songsivilai and Lachmann, (1990) Clin . Exp . Immunol . 79:315-321; Kostelny 등, (1992) J. Immunol . 148:1547-1553을 참고하라. 2특이적 항원 결합 단백질 또는 항체의 2개의 결합 부위들은 2개의 상이한 에피토프들과 결합할 것이며, 이는 동일하거나 상이한 단백질 표적들 상에 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단백질 A"란 단백질 A의 시판 및/또는 재조합 형태들을 포함하는 스타필라코커스의 단백질 A와 동일하거나 실질적으로 유사한 임의의 단백질을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 단백질 A에는 구체적으로 엔지니어링된 단백질 A 유래 배지, 예컨대 단일 서브유닛(예로 B 서브유닛)이 2회 이상 복제되고 인접 서열로 연결되어 재조합 단백질 A 분자를 형성하는 Mab Select SuReTM 배지(GE Healthcare) 및 기타 비천연 생성 단백질 A 분자들이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "단백질 G"란 단백질 G의 시판 및/또는 재조합 형태들을 포함하는 스트렙토코커스의 단백질 G와 동일하거나 실질적으로 유사한 임의의 단백질을 의미한다. 단백질들 A 및 G는 종종 친화도 크로마토그래피에 의해 항원 결합 단백질들(예로 항체들, 펩티바디들 및 Fc 영역을 포함하는 기타 융합 단백질들)을 정제하는데 사용된다. 예로 Vola 등 (1994), Cell Biophys . 24-25: 27-36; Aybay and Imir (2000), J. Immunol . Methods 233(1-2): 77-81; Ford 등 (2001), J. Chromatogr . B 754: 427-435를 참고하라. 단백질들 A 및 G는 이들 유형들의 단백질들의 Fc 영역에 결합하므로 이와 관련하여 유용하다. IgG 항체의 Fc 영역을 포함하는 재조합 융합 단백질들은 유사한 방법들을 이용하여 정제될 수 있다. 단백질들 A 및 G는 분리 기질의 흡착 성분으로 개시된 방법들에서 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어들 "단리하다" 및 "정제하다"는 상호교환적으로 사용되며, 예를 들어 관심 단백질을 포함하는 표본 중에 존재할 수 있는 이종성 요소들, 예를 들어 단백질들 또는 DNA와 같은 생물학적 거대분자들을 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 이상의 양으로 감소시킨다는 것을 의미한다. 이종성 단백질들의 존재는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 겔 전기영동 및 염색 및/또는 ELISA 분석을 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해 분석될 수 있다. DNA 및 다른 핵산들의 존재는 겔 전기영동 및 염색 및/또는 폴리머라아제 연쇄 반응을 채용하는 분석들을 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해 분석될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "보호제" 및 "첨가제"는 상호교환적으로 사용되며, UV-C 선량 수준에 반응하여 단백질 변형 범위를 제한하거나 조정하는 능력을 갖는 화합물을 의미한다. 개시된 방법들에 사용하기 적합한 보호제들의 비제한적 목록에는 티로신, 트립토판, 메티오닌, 피리독신 및 리보플라빈 중 하나 이상이 포함된다. "보호제"라는 용어는 단일 화합물들뿐만 아니라 서로에 대해 임의 비로 존재할 수 있는 티로신 및 트립토판과 같은 화합물들의 조합들을 포괄한다. 본원에서 기재되는 바와 같이, 티로신은 전체적인 UV 흡광도에 대해 가장 낮은 기여도를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "UV 광 선량"란 UV 광 형태로 표적에 전달되는 에너지의 양을 의미한다. 표적에 전달되는 UV 광 선량은 강도 및 노출 시간의 함수이다. "UV 광 선량"의 예들의 비제한적 목록에는 약 1mJ/cm2, 약 10mJ/cm2, 약 25mJ/cm2, 약 50mJ/cm2, 약 75mJ/cm2, 약 100mJ/cm2, 약 125mJ/cm2, 약 200mJ/cm2, 약 250mJ/cm2, 약 300mJ/cm2, 약 350mJ/cm2, 약 400mJ/cm2, 약 450mJ/cm2, 약 500mJ/cm2, 약 600mJ/cm2, 약 700mJ/cm2, 약 800mJ/cm2, 약 900mJ/cm2, 약 1000mJ/cm2 및 약 1000mJ/cm2 초과가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "UV 광"란 최소한 10nm에서 최대한 400nm의 파장을 갖는 광 스펙트럼 영역을 의미한다. 예로서, "UV 광"란 용어는 약 254nm의 파장을 포함하여 약 200nm 내지 약 280nm 범위의 파장을 갖는 빛을 포괄한다. 본원에서 제공되는 방법들에서, UV 광은 균일한 시준으로 여과된 방식으로 전달될 수 있다; 따라서 균일한 시준 및 비시준의 UV뿐만 아니라 여과된 UV 광 및 비여과된 UV 광이 "UV 광"이라는 용어에 포괄된다.
본원에서 사용되는 용어 "단백질 성분을 포함하는 표본"란 적어도 수성 성분 및 단백질 성분을 포함하는 액체의 분취물을 의미한다. 다양한 구현예들에서, 수성 성분은 완충액을 포함할 수 있다. 단백질 성분은 펩티드 결합에 의해 연결된 둘 이상의 아미노산들을 포함하는 임의 종을 포함할 수 있다. 단백질 성분은 20개의 천연 생성 아미노산들의 전체 일부를 포함하거나 포함하지 않을 수 있고, 단백질 성분의 나머지는 임의의 비천연 생성 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서 본원에서 제공되는 방법들은 하나 이상의 천연 생성 아미노산들 또는 하나 이상의 비천연 생성 아미노산들을 포함하는 단백질을 포함하는 표본 상에서 수행될 수 있다. 다양한 구현예들에서, 단백질 성분을 포함하는 표본 중의 단백질은 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 단일쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체, 및 이들의 단편들 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 단백질; Fc 도메인; 펩티드; Fc 융합 단백질; 및 치료 단백질이다.
본원에서 사용되는 용어 "반응종"이란 반응 성분의 변형 또는 산화를 야기하는 또 다른 성분과 반응할 수 있는 임의의 용액 성분을 의미한다. "반응종"의 예들의 비제한적 목록에는 산소 이온들(예로 O2 -), 히드록실 이온들(예로 OH-) 및 페록시드들(예로 H2O2)이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "수분 요인"는 다음 공식으로 계산되는 값이다: 수분 요인
, 여기서 a=용액의 흡광도이고 l은 경로길이(미터)이다.
II
. 표본 중 바이러스의 불활성화 방법
바이러스 불활성화는 치료적 용도를 위한 단백질 용액들의 제조에서 결정적인 단계이다. 실제로, 다양한 규제 당국들은 바이러스 불활성화를 위한 기준들을 확립하였으며, 여러 공급업체들이 이러한 문제에 당면하였다. 바이러스 불활성화 기술들은 여과 기술, HTST 및 UV-C 기술을 포함하는 여러 방향들로 개발되었다. 이들 기술들은 각각 그 강점을 갖지만, 각각 단점들도 갖는다. UV-C의 경우, 바이러스들을 불활성화하는데 효과적이고 효율적인 접근법이지만, 단백질들의 UV-C광으로의 연장된 노출은 단백질 분해 및/또는 산화를 일으킬 수 있다는 것이 관찰되었다. 따라서 UV-C 기술이 바이러스들을 불활성화하기 위해 효과적인 접근법이지만, 단백질을 포함하는 표본의 높은 UV-C 광 선량으로의 노출은 단백질 자체에 해로운 효과들을 가질 수 있다. 따라서 본 개시의 한 측면에서, 단백질 성분을 포함하는 표본 중 바이러스를 불활성화하는데 필요한 높은 UV-C 선량들을 채용할 수 있으면서 동시에 단백질 자체에 대한 손상 가능성을 감소시키거나 제거하는 방법이 제공된다. 따라서 단백질 성분을 포함하는 표본 중 바이러스의 불활성화 방법이 제공된다. 하나의 구현예에서, 본 방법은 다음과 같이 수행될 수 있다.
처음에는 단백질 성분을 포함하는 표본이 제공되며, 여기서 표본은 바이러스를 함유하고 있는 것이 알려져 있거나 이렇게 추정된다. 단백질 성분을 포함하는 표본은 이것이 단백질을 함유하는 한 임의의 조성일 수 있다. 예를 들어, 표본은 풀로 수집된 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출액을 포함할 수 있다. 본 구현예에서, 크로마토그래피 컬럼 풀은 임의 유형의 크로마토그래피 공정으로부터 수집될 수 있다. 크로마토그래피 컬럼 풀들의 예들에는 단백질 성분을 포함하는 단백질 A 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 풀, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 풀이 포함된다.
단백질 성분을 포함하는 표본은 크로마토그래피 컬럼 용출액 스트림을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 용출액 스트림은 이것이 크로마토그래피 컬럼에서 배출될 때 입수될 수 있다; 따라서, 본 방법은 원 위치에서 그리고 실시간으로 수행될 수 있다. 크로마토그래피 용출액 스트림들의 예들에는 단백질 성분을 포함하는 단백질 A 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 배출액 스트림, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 배출액 스트림이 포함된다.
개시된 방법이 임의 유형의 단백질 성분을 포함하는 표본으로 적용될 수 있지만, 개시된 방법은 바이러스 불활성화 기준들이 채택된 영역인 단백질 기반 치료제의 맥락에서 특히 유용할 수 있다. 따라서 하나의 예에서, 단백질 성분을 포함하는 표본은 단백질 기반 약학 분자를 포함하는 표본이다. 특정 구현예들에서, 개시된 방법의 표본의 단백질 성분은 항원 결합 단백질(예로 (i) 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 단일쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체, 및 이들의 단편들 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 단백질, (ii) Fc 도메인; (iii) 펩티드; (iv) Fc 융합 단백질; 및 (v) 치료 단백질 중 하나 이상), Fc 도메인, 펩티드, 및 치료 단백질을 포함한다. 이들 유형들의 분자들은 일반적으로 치료 분자들에 대한 양식들로 확인된다. 항체 항원 결합 단백질들에 관해, 본원에 주지된 바와 같은 용어 "항체"는 완전 인간 항체들, 인간화 항체들, 또는 완전 비인간(예로 설치류) 항체들을 시사하며, 개시된 방법은 이들 유형들의 분자들에 모두 적용될 수 있다.
개시된 방법의 다양한 구현예들에서, 개시된 방법들로 처리되는 표본은 바이러스를 불활성화하는 것이 바람직한 세포들을 포함하는 표본일 수 있다. 이러한 표본들의 예들에는 바이러스들의 불활성화가 바람직한 혈소판 세포들, CHO 세포들 또는 박테리아 세포들, 예컨대 대장균을 포함하는 표본이 포함된다. 이러한 표본은 세포 배양물들을 포함할 수 있다. 이들 구현예들에서, 본 방법은 기재된 바와 같이 단백질 성분을 포함하는 표본을 세포들을 포함하는 표본으로 치환하여 수행될 수 있다.
UV-C 바이러스 불활성화는 단백질 성분을 포함하는 표본들 또는 혈소판들과 같은 세포들을 포함하는 표본들에 가장 일반적으로 적용되지만 이것이 요구되는 것은 아니며, 다른 구현예들에서 개시된 방법들은 또한 단백질 성분을 포함하지 않는 표본에서 바이러스를 제거하는데 채용될 수 있다.
하나의 측면에서, 개시된 방법들은 단백질 성분을 포함하는 표본들 내로 의도하지 않게 도입될 수 있는 바이러스들의 불활성화에 관한 것이다. 단백질 제조 절차에서 의도하지 않은 바이러스 도입의 가능한 원천들에는 오염된 원료들 또는 제조 직원에 의한 노출이 포함된다. 개시된 방법들의 하나의 장점은 이들이 임의 유형의 바이러스에 채용될 수 있으며, 바이러스가 외피를 포함하는지 포함하지 않는지와 무관하다는 것이다. 따라서 방법은 이중쇄 DNA 바이러스들, 단일쇄 DNA 바이러스들, 이중쇄 RNA 바이러스들 및 단일쇄 RNA 바이러스들에 적용될 수 있다. 개시된 방법들을 이용해서 불활성화될 수 있는, 내포적으로 모든 패밀리 멤버들을 포함하는 바이러스 패밀리들의 예들에는 아데노비리대, 아스파르비리대, 헤르페스비리대, 이리도비리대, 파필로마비리대, 폴리오마비리대, 폭스비리대, 시르코비리대, 헤파드나비리대, 파르보비리대, 비르나비리대, 레오비리대, 아레나비리대, 보르나비리대, 부나이아비리대, 델타비리대, 필로비리대, 오르소믹소비리대, 파라믹소비리대, 랩도비리대, 아르테리오비리대, 아스트로비리대, 칼리시비리대, 코르노나비리대, 플라비비리대, HEV-유사 바이러스들, 노다비리대, 피코나비리대, 토가비리대, 및 테르트로비리대가 포함된다. 특히 치료적 단백질 제조 공정들에 관련될 수 있는 특정 구현예들에서, 개시된 방법들을 이용해서 불활성화될 수 있는 바이러스들에는 파르보바이러스 MVM, 레트로바이러스 MuLV 또는 부나이아 바이러스 CVV가 포함된다.
방법을 계속해서 바이러스가 불활성화되는 표적 UV 광 선량이 확인된다. UV-C를 이용해서 바이러스를 가장 효과적으로 그리고 효율적으로 불활성화하기 위해, 원하는 결과를 달성할 표적 UV-C선량을 확인하는 것이 바람직하다. 개시된 방법들은 불활성화될 바이러스 유형 및 임의의 편리한 UV-C 선량에서 수행되는 방법으로 UV-C 노출 조건들("UV-C 선량"를 종합적으로 포함함)을 최적화하지 않고 수행될 수 있지만, 불활성화될 바이러스에 특이적인 표적 선량을 확인하여 방법의 효율성이 증강될 수 있다. 일부 바이러스들은 UV-C광에 의해 불활성화될 조건들을 공유할 수 있고, 적절한 노출 조건들을 선택함으로써 2개 이상의 유형들의 바이러스들이 개시된 방법의 단일 공정으로 불활성화될 수 있음이 주지된다. 다양한 DNA- 및 RNA-함유 바이러스들의 UV 감도들을 확인하기 위해 다양한 연구들이 수행되었다. 예로 본원에 참조로 도입되는 Lytle & Sagripanti, (2005) J Virol . 79:14244-252, 및 Knipe 등, (2007) Field's Virology, Lippincott Williams & Wilkins 및 도 11 및 12를 참고하라.
계속해서, 보호제가 표본으로 첨가되어 안정화된 혼합물을 형성한다. 보호제의 하나의 기능은 표본의 UV-C 광으로의 노출 결과 일어날 수 있는 임의의 변형이나 분해를 감소시키거나 제거하기 위해 표본의 성분들, 예로 표본 중 단백질을 분해하거나 변형할 수 있는 반응종을 포획하는 것이다. 보다 구체적으로, 특정 공정, 예로 바이러스 불활성화에 필요한 UV-C광 선량들로의 용액 노출은 반응종을 만들 수 있다. 일부 경우들에서, 표본 중 이들 반응종의 존재는, 예를 들어 단백질들을 포함하는 표본 성분들의 간접적 산화를 통해 원하지 않는 변형들로 이어질 수 있다. 다른 경우들에서, 표본 중 반응종의 존재는 또한 표본 성분들의 간접적 변형에 기여할 수 있다. 본원에서 주지된 바와 같이, 단백질 변형 및/또는 분해 가능성은 바이러스 불활성화 방법들에서 UV-C광의 용도에 연관된 문제들 중 하나이다.
단백질들을 분해하거나 변형할 수 있는 반응종의 예들에는 산소 이온들(예로 O2 -), 히드록실 이온들(예로 OH-) 및 페록시드들(예로 H2O2)과 같은 반응종이 포함된다. 이들 및 기타 반응종은 종종 효과적인 바이러스 불활성화를 위해 필요한 고선량의 UV-C광으로의 용액 노출 동안 일반적으로 생성되므로, UV 광으로의 표본 노출 전에 보호제를 첨가하는 것이 바람직하다.
모든 화학종이 보호제로서 작용할 수는 없다. 실제로 본원에 나타낸 실시예들에 개략한 바와 같이, 적합한 보호제들을 확인하기 위해 상세한 검색이 수행되었다. UV-C 노출 동안 생성되는 것과 같이 표본 중에 존재하는 임의의 반응종을 포획할 능력을 갖는 화합물은 표본의 성분들(예로 단백질)에 대한 이들 반응종의 효과가 보호제의 부재 시 표본 성분들 상의 반응종의 효과에 비해 감소되므로 적합한 보호제이다. 일부 경우들에서, UV-C 공정 동안 생성된 반응종에 대한 노출로 인한 표본 성분들의 분해 또는 변형은 보호제를 이용해서 완전히 제거될 수 있다.
표본 중에 존재하는 임의의 반응종의 바람직하지 못한 결과들을 중화시키는 그 효과에 부가하여, 보호제를 선택할 때의 또 다른 고려사항은 UV-C 노출 후 표본으로부터 이를 제거하는 것과 연관된 어려움이다. 개시된 방법은 항원 결합 단백질 또는 치료 단백질과 같은 치료 분자(예로, (i) 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 단일쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체, 및 이들의 단편들 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 단백질, (ii) Fc 도메인; (iii) 펩티드; (iv) Fc 융합 단백질; 및 (v) 치료 단백질 중 하나 이상)를 포함하는 표본으로 적용된다. 제품 품질 상의 규제적 제약들로 인해, 보호제의 바람직한 특성은 그 보호 기능을 수행한 후 표본으로부터 이를 제거하는 능력이다.
바람직한 보호제의 상기 모든 특성들을 고려하여, 적합한 보호제들의 목록이 제공되며, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 피리독신 및 리보플라빈이 비제한적으로 포함된다. 다양한 구현예들에서, 보호제는 다양한 비율들로 둘 이상의 화합물들을 포함한다. 예를 들어 보호제는 티로신, 트립토판 또는 임의의 바람직한 비율로 티로신과 트립토판을 둘 다 포함할 수 있다. 보호제들의 조합의 정확한 조성 및 비율은 실험적으로 및/또는 본원에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
추가적인 보호제들은 본 개시를 지침으로 이용하여 쉽게 확인될 수 있다. 이러한 하나의 스크리닝에서, 후보 보호제가 단백질을 포함하는 표본으로 첨가되고, 하나 이상의 바이러스들을 불활성화하기 적합한 선량으로 UV-C광에 노출된 후(도 11 및 12뿐만 아니라 본원에서 제공되는 참고문헌들이 관련 UV-C선량을 확립하는 지침으로 사용될 수 있다), 단백질의 분해 또는 변형 정도를 결정하기 위해 조사될 수 있다. 표준 크로마토그래피 및 분석 기법들이 이와 관련해서 채용될 수 있다. 예를 들어 IEC를 채용하여 단백질의 변형을 평가할 수 있고, 또는 SEC 또는 질량 분광측정을 이용하여 단백질 분해를 검사할 수 있다.
개시된 방법들에서 채용되는 보호제는 임의의 농도로 첨가될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 보호제는 표본 성분의 변형 또는 분해를 효과적으로 감소시키거나 제거할 농도로 첨가된다. 보호제의 양은 보호제의 확인과 유사한 방식으로 결정될 수 있다. 즉, 선택된 보호제는 초기 농도로 표본에 첨가되고, 표본이 UV-C광에 노출되고, 표본 성분(예로 단백질)의 분해 및/또는 변형 정도가 확립된 방법론을 이용하여 결정될 수 있다. 보호제의 확인의 경우에서와 같이, 적합한 기법들에는 IEC, SEC 및 질량 분광측정이 포함된다. 단백질 성분이 원하는 정도로 보호되지 않는 경우, 원하는 보호 정도를 제공하는 농도가 확인될 때까지 평가가 반복될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 보호제는 단백질 200부 당 보호제 1부 초과의 농도비로 표본에 첨가된다. 다른 방식으로 말하면, 보호제는 단백질 200mM에 대해 보호제 1mM 초과의 농도비로(즉, 1:200) 표본에 첨가될 수 있다. 채용될 수 있는 다른 농도비들에는 1:180, 1:170, 1:160, 1:150, 1:140, 1:130, 1:120, 1:110, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20 또는 1:10이 포함된다.
제공된 보호제들 및 보호제 농도들이 기재된 바와 같이 채용될 수 있지만, 추가적 보호제들 및 보호제 농도들의 확인이 실험적 매트릭스 유형 접근법을 이용하여 쉽게 수행될 수 있다. 이러한 접근법의 한 예에서, 매트릭스는 다양한 후보 보호제들을 구현하는 하나의 축 및 다양한 농도 수준들을 구현하는 또 다른 축으로 확립될 수 있다. 실험들은 기재된 바와 같이(예로 SEC, IEC 및/또는 질량 분광측정을 이용하여 주어진 보호제 및 농도의 효과를 평가) 수행되어 바람직한 보호제들과 이들 보호제들에 대해 바람직한 농도들로 매트릭스를 채울 수 있다. 이 접근법은 다른 추가적 보호제들 및 보호제 농도들을 제공할 것이다.
단백질 성분 및 보호제를 포함하는 표본을 포함하는 안정화된 혼합물을 형성한 뒤, 안정화된 혼합물이 선택된 시기 동안 선택된 전력 수준 및 선택된 파장에서 작동하는 광원에 의해 제공되는 UV 광에 노출된다. 이들 파라미터들의 조합은 본원에서 UV-C 선량으로 총칭된다. 개시된 방법에 채용될 수 있는 광원들의 예들에는 Newport Oriel® Flood UV-C 광원들, 예를 들어 모델 97536이 포함된다.
UV-C 광원은 바람직하게는 일정 범위의 전력 수준으로 맞춰지도록 채택된다. 바람직한 전력 수준들은 약 1mJ 내지 약 1000mJ 범위이다. 특정 예들에서, UV-C 광원은 약 1mJ, 약 10mJ, 약 25mJ, 약 50mJ, 약 75mJ, 약 100mJ, 약 125mJ, 약 200mJ, 약 250mJ, 약 300mJ, 약 350mJ, 약 400mJ, 약 500mJ, 약 600mJ, 약 700mJ, 약 800mJ, 약 900mJ 또는 약 1000mJ을 전달할 수 있다. UV-C 광원에 있어서 바람직한 또 다른 특징은 모니터로부터의 피드백에 반응하여 자동으로 또는 작동자에 의해 수동으로 제 1 전력 수준에서 제 2 전력 수준으로 교체하는 능력이다
UV-C광원은 또한 바람직하게는 일정 범위의 파장들에 걸쳐 UV-C광을 전달하도록 채택된다. 바람직한 파장들은 UV 스펙트럼의 전체 C 대역에 해당하는 약 200nm 내지 약 280nm 범위이다. 특히 바람직한 구현예들에서, 파장은 약 254nm이다.
보호제 또는 보호제들의 조합이 표본에 첨가되어 안정화된 혼합물을 형성하는 경우, 안정화된 혼합물의 흡광도는 보호제가 첨가되지 않은 표본의 흡광도와 상이할 수 있다. 예를 들어 안정화된 표본 중에 존재하는 첨가된 보호제(들) 또는 다른 화합물들(예로 완충액 성분들, 가용화제들 등)이 표본이 노출된 UV 광을 일부 흡수할 수 있다. 이는 표본 중에 존재하는 임의 바이러스로 전달되는 유효 UV 광의 감소, 결과적으로 바이러스 불활성화의 감소를 일으킬 수 있다.
보호제(들) 및/또는 다른 용액 성분들의 내재적 흡광도를 고려하고 표적 UV-C광 선량이 안정화된 혼합물에 의해 수신되도록 하기 위해서 피드백 루프가 채용될 수 있으며, 여기서 UV 광 노출의 특성들은 UV 혼합물 흡광도의 평가에 반응하여 변한다. 따라서, UVC 노출 장치로 들어가는 혼합물 흡광도의 평가 후 장치 내의 특성들(예로 램프 전력, 체류 시간, 또는 다른 수단들)이 장치로부터 나오는 안정화된 혼합물이 표적 선량을 받도록 일시적으로 변경될 수 있다. 이러한 평가는 대안적으로는 장치를 떠나는 혼합물의 흡광도를 측정하여 수행되거나 또는 장치내 혼합물의 측정에 의해 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 평가는 특정 파장, 예컨대 254nm에서 표본의 흡광도를 모니터링하여 수행될 수 있다. 흡광도 데이터는 수신한 선량을 결정하는데 사용될 수 있고, 표본 중에 함유될 수 있는 성분들(예로 단백질, 보호제 화합물들 또는 기타 용액 화합물들)에 의한 자외선 흡광도를 고려하여 전달된 에너지 선량의 조정으로 정의될 수 있다. 하나의 구현예에서, 평가는 용액 표면에서 광원 전력을 측정하여 수행될 수 있다. 대안적으로 광원 전력은 램프 표면에서 측정될 수 있다. 또한, 램프에 의해 유도된 전력은 측정되어 광원 전력을 평가할 수 있다.
평가는 안정화된 표본 중 보호제(들)의 흡광도로 인해 수신된 선량의 감소를 나타낼 것으로 예측된다. 따라서 평가에서 표적 UV 광 선량이 안정화된 혼합물에 전달되지 않은 것으로 나타나면, 파장, UV 광원 전력 및 UV 광 노출 시간 중 하나 이상이 조정된다.
하나의 구현예에서, UVc 조사의 시준 빔을 받는 잘 혼합된 용기에 대해 선량은 다음 공식을 채용하여 조정될 수 있다: 수분 요인
, 식 중 a=용액의 흡광도이고, l은 경로길이이다. 예로 Bolton, (2003) ASCE, 129(3): 209-215를 참고하라. 주어진 바이러스 불활성화 공정의 수분 요인을 결정하면, 표적 UV 광 선량을 수분 요인으로 나누어 처리를 위한 노출 시간을 결정한다. 또 다른 구현예에서, UVc 조사를 받는 혼합되지 않은 용기에 있어서(예로 박막 공정 반응기 또는 동등물에 있어서) 선량은 다음 공식을 채용하여 조정될 수 있다: 선량 ~ (P / Q)exp(-al) = (P0 / Q0)exp(-a0l), 식 중 a=용액의 흡광도이고, l은 고리들의 경로길이이다. 식 중, P는 램프의 전력 출력이고 Q는 흡광도=a를 갖는 혼합물에 대한 용적 유속이며; P0 및 Q0는 흡광도=a0를 갖는 참고 혼합물에 대한 전력 및 유속이다. 예로 Ye, Z (2007) "UV Disinfection Between Concentric Cylinders" PhD dissertation, Georgia Institute of Technology를 참고하라.
개시된 방법들의 일부 또는 모든 단계들은 수동으로 또는 임의의 편리한 자동화 수단들로, 예컨대 자동화 또는 컴퓨터 제어 시스템들을 채용해서 수행될 수 있음이 주지된다. 일부 구현예들에서, 전체 방법이 자동화될 수 있다. 다른 구현예들에서, 하나 이상의 단계들이 자동화될 수 있다. 예를 들어 표적 선량 수준들로부터의 변화들에 반응하여 전달된 선량의 평가 및 조정이 단일 자동화 단계를 형성할 수 있다. 하나의 구현예에서, 안정화된 표본이 UV 광에 노출되며 표적 선량으로부터의 변화들에 대해 동시에 모니터링된다. 표적으로부터의 변화들이 검출되면, 제어 모듈은 표적 선량이 달성되도록 노출 시간, 노출 파장 또는 UV 광원의 전력을 조정할 수 있다. 이는 피드백 루프 유형 배열로 실시간으로 수행될 수 있다.
개시된 방법은 임의의 규모로 그리고 개별 단위 공정 또는 연속 연결 공정으로 수행될 수 있다. 개별 단위 공정의 하나의 구현예에서, 임의 용량의 안정화된 표본이 용기 내에 형성된다. 이어서 용기가 UV 광(예로 UV-C광)에 노출된 후 바이러스 불활성화의 평가가 수행된다. 공정은 표본 중에 존재하는 모든 바이러스가 불활성화될 때까지 반복될 수 있다. 대안적으로 평가는 UV 광으로의 노출과 연속으로 수행될 수 있다. 바이러스의 불활성화 후 표본을 추가 가공 또는 포장을 위해 별도 용기로 보낼 수 있다.
연속 연결 공정의 구현예에 있어서, 안정화된 표본은 이전 정제 단계의 배출액에서 형성될 수 있으며, 보호제는 이전 컬럼에서 배출액 스트림이 나올 때 여기에 첨가된다. 보호제는 배출액 스트림 내로의 보호제 도입과 연관된 임의의 전단력들로 인해 배출액 스트림과 혼합될 수 있다. 이어서 안정화된 표본은 장치를 통과하는 표본으로의 UV 광의 연속 노출을 위해 배치된 장치를 통해 통과될 수 있다. 일단 표적 UV 광 선량이 달성되면, 스트림은 정제 단계와 같은 제 2 정제 공정으로 통과되어 안정화된 표본에 존재하는 원하지 않는 보호제(들) 또는 기타 화합물들을 제거할 수 있다.
또 다른 측면에서, 개시된 방법은 실험실 규모에서 상업적 규모까지의 임의 규모로 수행될 수 있다. 상업적 규모 상에서 방법을 수행할 때에는 안정화된 표본을 분취량들로 분할하고 각각의 분취량을 병렬 처리하는 것이 편리할 수 있다. 예를 들어, 다중 UV-C 광원들이 병렬로 수행되어 다량의 안정화된 표본을 수용할 수 있다. 도 13은 그러한 배치의 모식적 예시를 나타낸다.
III
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UV
노출 동안 생성된 반응종의 존재로 야기되는 단백질 분해 또는 변형의 감소 방법
본원에 기재되고 도 1-8에 나타낸 바와 같이, 단백질 성분을 포함하는 표본은 UV 광, 특히 UV-C 대역의 광에 노출될 경우 분해 또는 변형을 겪을 수 있다. 그러나 UV-C 대역은 다양한 목적들, 예로 바이러스들의 불활성화를 위한 가장 효과적인 스펙트럼 영역이며, 제조 용도들에서 특히 유용하다. 관찰된 단백질 분해 및/또는 변형은 UV 광 또는 이온화 방사선으로 표본의 용매 성분의 조사에 의해 생성되는 반응종의 존재로부터 야기될 수 있다. 반응종의 예들에는 산소 이온들(예로 O2-), 히드록실 이온들(예로 OH-) 및 페록시드종(예로 H2O2)이 포함된다. 반응종의 존재는 단백질들 상에 해로운 효과를 가질 수 있다. 예로 Cabiscol 등, (2010) Int. Microbiol , 3:315 및 Bandyopadhyay 등 (1999) Curr . Sci . 77:658-666을 참고하라.
단백질 제조 방법에서, UV 광의 이용은 바이러스들을 불활성화하기 위해 채용될 수 있지만, 단백질 분해 및/또는 변형을 촉진할 수도 있다. 따라서, 한 측면에서 본 개시는 UV 노출 동안 생성된 반응종의 존재로부터 야기되는 단백질 분해 또는 변형의 감소 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 개시된 방법은 하기와 같이 수행될 수 있다.
처음에, 반응종의 존재 하에 분해되거나 변형되는 것으로 알려져 있거나 이렇게 추정되는 단백질 성분을 포함하는 표본이 제공된다. 단백질 성분을 포함하는 표본은 표본이 단백질을 함유하는 한 임의의 조성일 수 있다. 예를 들어 표본은 풀 내로 수집된 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출액을 포함할 수 있다. 본 구현예에서, 크로마토그래피 컬럼 풀은 임의 유형의 크로마토그래피 공정으로부터 수집될 수 있다. 크로마토그래피 컬럼 풀들의 예들에는 단백질 성분을 포함하는 단백질 A 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 풀, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 풀이 포함된다.
단백질 성분을 포함하는 표본은 크로마토그래피 컬럼 용출액 스트림을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 용출액 스트림은 이것이 크로마토그래피 컬럼에서 배출될 때 입수될 수 있다; 따라서, 본 방법은 원 위치에서 그리고 실시간으로 수행될 수 있다. 크로마토그래피 용출액 스트림들의 예들에는 단백질 성분을 포함하는 단백질 A 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 배출액 스트림, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 배출액 스트림이 포함된다.
개시된 방법은 임의 유형의 단백질 성분을 포함하는 표본으로 적용될 수 있지만, 개시된 방법은 단백질 분해 및/또는 변형이 중요한 문제가 될 수 있는 영역인 단백질 기반 치료제의 맥락에서 특히 유용할 수 있다. 따라서 하나의 예에서, 단백질 성분을 포함하는 표본은 단백질 기반 약학 분자를 포함하는 표본이다. 특정 구현예들에서, 개시된 방법의 표본의 단백질 성분은 항원 결합 단백질(예로 (i) 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 단일쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체, 및 이들의 단편들 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 단백질, (ii) Fc 도메인; (iii) 펩티드; (iv) Fc 융합 단백질; 및 (v) 치료 단백질 중 하나 이상), Fc 도메인, 펩티드, 및 치료 단백질을 포함한다. 이들 유형들의 분자들은 일반적으로 치료 분자들에 대한 양식들로 확인된다. 항체에 관해, 본원에 주지된 바와 같은 용어 "항체"는 완전 인간 항체들, 인간화 항체들, 또는 완전 비인간(예로 설치류) 항체들을 시사하며, 개시된 방법은 이들 유형들의 분자들에 모두 적용될 수 있다.
개시된 방법의 다양한 구현예들에서, 개시된 방법들로 처리되는 표본은 바이러스를 불활성화하는 것이 바람직한 세포들을 포함하는 표본일 수 있다. 이러한 표본들의 예들에는 바이러스들의 불활성화가 바람직한 혈소판 세포들, CHO 세포들 또는 박테리아 세포들, 예컨대 대장균을 포함하는 표본이 포함된다. 이러한 표본은 세포 배양물들을 포함할 수 있다. 이들 구현예들에서, 본 방법은 기재된 바와 같이 단백질 성분을 포함하는 표본을 세포들을 포함하는 표본으로 치환하여 수행될 수 있다.
방법을 계속해서 표적 UV 광 선량이 확인된다. 표적 선량은 임의의 이유에 대해 선택될 수 있지만, 하나의 구현예에서 관심 바이러스가 불활성화되는 선량이 표적 선량으로 선택된다. UV-C를 이용해서 바이러스를 가장 효과적이고 효율적으로 불활성화하기 위해, 예로서 특정 관심 바이러스를 불활성화하는 것으로 알려져 있거나 이렇게 추정되는 UV 선량에 해당하는 표적 선량의 선택을 이용하여 원하는 결과를 달성할 표적 UV-C선량을 확인하는 것이 바람직하다. 개시된 방법들은 불활성화될 바이러스 유형 및 임의의 편리한 UV-C 선량에서 수행되는 방법으로 UV-C 노출 조건들("UV-C 선량"를 종합적으로 포함함)을 최적화하지 않고 수행될 수 있지만, 불활성화될 바이러스에 특이적인 표적 선량을 확인하여 방법의 효율성이 증강될 수 있다. 일부 바이러스들은 UV-C광에 의해 불활성화될 조건들을 공유할 수 있고, 적절한 노출 조건들을 선택함으로써 2개 이상의 유형들의 바이러스들이 개시된 방법의 단일 공정으로 불활성화될 수 있음이 주지된다. 다양한 DNA- 및 RNA-함유 바이러스들의 UV 감도들을 확인하기 위해 다양한 연구들이 수행되었다. 예로 본원에 참조로 도입되는 Lytle & Sagripanti, (2005) J Virol . 79:14244-252, 및 Knipe 등, (2007) Field's Virology, Lippincott Williams & Wilkins 및 도 11 및 12를 참고하라.
방법을 계속해서, 보호제가 표본으로 첨가되어 안정화된 혼합물을 형성한다. 보호제의 하나의 기능은 표본의 UV-C 광으로의 노출 결과 일어날 수 있는 임의의 변형이나 분해를 감소시키거나 제거하기 위해 표본의 성분들, 예로 표본 중 단백질을 분해하거나 변형할 수 있는 반응종을 포획하는 것이다. 보다 구체적으로, 필요한 UV-C광 선량들로의 용액 노출은 본원에 기재된 바와 같이 반응종을 만들 수 있다. 실제로, 이것은 바이러스 불활성화 방법들에서 UV-C광의 사용에 연관된 문제들 중 하나이다. 표본 중 이들 반응종의 존재는 단백질들을 포함하는 표본 성분들의 간접적 산화로 이어질 수 있다. 또한, 반응종의 존재는 또한 표본 성분들의 간접적 변형에 기여할 수 있다.
단백질들을 분해하거나 변형할 수 있는 반응종의 예들에는 산소 이온들(예로 O2 -), 히드록실 이온들(예로 OH-) 및 페록시드들(예로 H2O2)과 같은 반응종이 포함된다. 이들 및 기타 반응종은 종종 효과적인 바이러스 불활성화를 위해 필요한 고선량의 UV-C광으로의 용액 노출 동안 일반적으로 생성되므로, UV 광으로의 표본 노출 전에 보호제를 첨가하는 것이 바람직하다.
모든 화학종이 보호제로서 작용할 수는 없다. 실제로 본원에 나타낸 실시예들에 개략한 바와 같이, 적합한 보호제들을 확인하기 위해 상세한 검색이 수행되었다. UV-C 노출 동안 생성되는 것과 같이 표본 중에 존재하는 임의의 반응종을 포획할 능력을 갖는 화합물은 표본의 성분들(예로 단백질)에 대한 이들 반응종의 효과가 보호제의 부재 시 표본 성분들 상의 반응종의 효과에 비해 감소되므로 적합한 보호제이다. 일부 경우들에서, UV-C 공정 동안 생성된 반응종에 대한 노출로 인한 표본 성분들의 분해 또는 변형은 보호제를 이용해서 완전히 제거될 수 있다.
표본 중에 존재하는 임의의 반응종의 바람직하지 못한 결과들을 중화시키는 그 효과에 부가하여, 보호제를 선택할 때의 또 다른 고려사항은 UV-C 노출 후 표본으로부터 이를 제거하는 것과 연관된 어려움이다. 개시된 방법이 항원 결합 단백질 또는 치료 단백질과 같은 치료 분자(예로 (i) 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 단일쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체, 및 이들의 단편들 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 단백질, (ii) Fc 도메인; (iii) 펩티드; (iv) Fc 융합 단백질; 및 (v) 치료 단백질 중 하나 이상)를 포함하는 표본으로 적용되는 경우, 이 고려사항은 매우 중요한 요인이 된다. 제품 품질 상의 규제적 제약들로 인해, 보호제의 바람직한 특성은 그 보호 기능을 수행한 후 표본으로부터 이를 제거하는 능력이다.
바람직한 보호제의 상기 모든 특성들을 고려하여, 적합한 보호제들의 목록이 제공되며, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 피리독신 및 리보플라빈이 비제한적으로 포함된다. 다양한 구현예들에서, 보호제는 다양한 비율들로 둘 이상의 화합물들을 포함한다. 예를 들어 보호제는 티로신, 트립토판 또는 임의의 바람직한 비율로 티로신과 트립토판을 둘 다 포함할 수 있다. 보호제들의 조합의 정확한 조성 및 비율은 실험적으로 및/또는 본원에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
추가적인 보호제들은 본 개시를 지침으로 이용하여 쉽게 확인될 수 있다. 이러한 하나의 스크리닝에서, 후보 보호제가 단백질을 포함하는 표본으로 첨가되고, 하나 이상의 바이러스들을 불활성화하기 적합한 선량으로 UV-C광에 노출된 후(도 11 및 12뿐만 아니라 본원에서 제공되는 참고문헌들이 관련 UV-C선량을 확립하는 지침으로 사용될 수 있다), 단백질의 분해 또는 변형 정도를 결정하기 위해 조사될 수 있다. 표준 크로마토그래피 및 분석 기법들이 이와 관련해서 채용될 수 있다. 예를 들어 IEC를 채용하여 단백질의 변형을 평가할 수 있고, 또는 SEC 또는 질량 분광측정을 이용하여 단백질 분해를 검사할 수 있다.
개시된 방법들에서 채용되는 보호제는 임의의 농도로 첨가될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 보호제는 표본 성분의 변형 또는 분해를 효과적으로 감소시키거나 제거할 농도로 첨가된다. 보호제의 양은 보호제의 확인과 유사한 방식으로 결정될 수 있다. 즉, 선택된 보호제는 초기 농도로 표본에 첨가되고, 표본이 UV-C광에 노출되고, 표본 성분(예로 단백질)의 분해 및/또는 변형 정도가 확립된 방법론을 이용하여 결정될 수 있다. 보호제의 확인의 경우에서와 같이, 적합한 기법들에는 IEC, SEC 및 질량 분광측정이 포함된다. 단백질 성분이 원하는 정도로 보호되지 않는 경우, 원하는 보호 정도를 제공하는 농도가 확인될 때까지 평가가 반복될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 보호제는 단백질 200부 당 보호제 1부 초과의 농도비로 표본에 첨가된다. 다른 방식으로 말하면, 보호제는 단백질 200mM에 대해 보호제 1mM 초과의 농도비로(즉, 1:200) 표본에 첨가될 수 있다. 채용될 수 있는 다른 농도비들에는 1:180, 1:170, 1:160, 1:150, 1:140, 1:130, 1:120, 1:110, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20 또는 1:10이 포함된다.
제공된 보호제들 및 보호제 농도들이 기재된 바와 같이 채용될 수 있지만, 추가적 보호제들 및 보호제 농도들의 확인이 실험적 매트릭스 유형 접근법을 이용하여 쉽게 수행될 수 있다. 이러한 접근법의 한 예에서, 매트릭스는 다양한 후보 보호제들을 구현하는 하나의 축 및 다양한 농도 수준들을 구현하는 또 다른 축으로 확립될 수 있다. 실험들은 기재된 바와 같이(예로 SEC, IEC 및/또는 질량 분광측정을 이용하여 주어진 보호제 및 농도의 효과를 평가) 수행되어 바람직한 보호제들과 이들 보호제들에 대해 바람직한 농도들로 매트릭스를 채울 수 있다. 이 접근법은 다른 추가적 보호제들 및 보호제 농도들을 제공할 것이다.
단백질 성분 및 보호제를 포함하는 표본을 포함하는 안정화된 혼합물을 형성한 뒤, 안정화된 혼합물이 선택된 시기 동안 선택된 전력 수준 및 선택된 파장에서 작동하는 광원에 의해 제공되는 UV 광에 노출된다. 이들 파라미터들의 조합은 본원에서 UV-C 선량으로 총칭된다. 개시된 방법에 채용될 수 있는 광원들의 예들에는 Newport Oriel® Flood UV-C 광원들, 예를 들어 모델 97536이 포함된다.
UV-C 광원은 바람직하게는 일정 범위의 전력 수준으로 맞춰지도록 채택된다. 바람직한 전력 수준들은 약 1mJ 내지 약 1000mJ 범위이다. 특정 예들에서, UV-C 광원은 약 1mJ, 약 10mJ, 약 25mJ, 약 50mJ, 약 75mJ, 약 100mJ, 약 125mJ, 약 200mJ, 약 250mJ, 약 300mJ, 약 350mJ, 약 400mJ, 약 450mJ, 약 500mJ, 약 600mJ, 약 700mJ, 약 800mJ, 약 900mJ, 약 1000mJ 또는 약 1000mJ초과를 전달할 수 있다. UV-C 광원에 있어서 바람직한 또 다른 특징은 모니터로부터의 피드백에 반응하여 자동으로 또는 작동자에 의해 수동으로 제 1 전력 수준에서 제 2 전력 수준으로 교체하는 능력이다
UV-C광원은 또한 바람직하게는 일정 범위의 파장들에 걸쳐 UV-C광을 전달하도록 채택된다. 바람직한 파장들은 UV 스펙트럼의 전체 C 대역에 해당하는 약 200nm 내지 약 280nm 범위이다. 특히 바람직한 구현예들에서, 파장은 약 254nm이다.
보호제 또는 보호제들의 조합이 표본에 첨가되어 안정화된 혼합물을 형성하는 경우, 안정화된 혼합물의 흡광도는 보호제가 첨가되지 않은 표본의 흡광도와 상이할 수 있다. 예를 들어 안정화된 표본 중에 존재하는 첨가된 보호제(들) 또는 다른 화합물들(예로 완충액 성분들, 가용화제들 등)이 표본이 노출된 UV 광을 일부 흡수할 수 있다. 이는 표본 중에 존재하는 임의 바이러스로 전달되는 유효 UV 광의 감소, 결과적으로 바이러스 불활성화의 감소를 일으킬 수 있다.
보호제(들) 및/또는 다른 용액 성분들의 내재적 흡광도를 고려하고 표적 UV-C광 선량이 안정화된 혼합물에 의해 수신되도록 하기 위해서 피드백 루프가 채용될 수 있으며, 여기서 UV 광 노출의 특성들은 UV 혼합물 흡광도의 평가에 반응하여 변한다. 따라서, UVC 노출 장치로 들어가는 혼합물 흡광도의 평가 후 장치 내의 특성들(예로 램프 전력, 체류 시간, 또는 다른 수단들)이 장치로부터 나오는 안정화된 혼합물이 표적 선량을 받도록 일시적으로 변경될 수 있다. 이러한 평가는 대안적으로는 장치를 떠나는 혼합물의 흡광도를 측정하여 수행되거나 또는 장치내 혼합물의 측정에 의해 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 평가는 특정 파장, 예컨대 254nm에서 표본의 흡광도를 모니터링하여 수행될 수 있다. 흡광도 데이터는 수신한 선량을 결정하는데 사용될 수 있고, 표본 중에 함유될 수 있는 성분들(예로 단백질, 보호제 화합물들 또는 기타 용액 화합물들)에 의한 자외선 흡광도를 고려하여 전달된 에너지 선량의 조정으로 정의될 수 있다. 하나의 구현예에서, 평가는 용액 표면에서 광원 전력을 측정하여 수행될 수 있다. 대안적으로 광원 전력은 램프 표면에서 측정될 수 있다. 또한, 램프에 의해 유도된 전력은 측정되어 광원 전력을 평가할 수 있다.
평가는 안정화된 표본 중 보호제(들)의 흡광도로 인해 수신된 선량의 감소를 나타낼 것으로 예측된다. 따라서 평가에서 표적 UV 광 선량이 안정화된 혼합물에 전달되지 않은 것으로 나타나면, 파장, UV 광원 전력 및 UV 광 노출 시간 중 하나 이상이 조정된다.
하나의 구현예에서, UVc 조사의 시준 빔을 받는 잘 혼합된 용기에 대해 선량은 다음 공식을 채용하여 조정될 수 있다: 수분 요인
, 식 중 a=용액의 흡광도이고, l은 경로길이이다. 예로 Bolton, (2003) ASCE, 129(3): 209-215를 참고하라. 주어진 바이러스 불활성화 공정의 수분 요인을 결정하면, 표적 UV 광 선량을 수분 요인으로 나누어 처리를 위한 노출 시간을 결정한다. 또 다른 구현예에서, UVc 조사를 받는 혼합되지 않은 용기에 있어서(예로 박막 공정 반응기 또는 동등물에 있어서) 선량은 다음 공식을 채용하여 조정될 수 있다: 선량 ~ (P / Q)exp(-al) = (P0 / Q0)exp(-a0l), 식 중 a=용액의 흡광도이고, l은 고리들의 경로길이이다. 식 중, P는 램프의 전력 출력이고 Q는 흡광도=a를 갖는 혼합물에 대한 용적 유속이며; P0 및 Q0는 흡광도=a0를 갖는 참고 혼합물에 대한 전력 및 유속이다. 예로 Ye, Z (2007) "UV Disinfection Between Concentric Cylinders" PhD dissertation, Georgia Institute of Technology를 참고하라.
개시된 방법들의 일부 또는 모든 단계들은 수동으로 또는 임의의 편리한 자동화 수단들로, 예컨대 자동화 또는 컴퓨터 제어 시스템들을 채용해서 수행될 수 있음이 주지된다. 일부 구현예들에서, 전체 방법이 자동화될 수 있다. 다른 구현예들에서, 하나 이상의 단계들이 자동화될 수 있다. 예를 들어 표적 선량 수준들로부터의 변화들에 반응하여 전달된 선량의 평가 및 조정이 단일 자동화 단계를 형성할 수 있다. 하나의 구현예에서, 안정화된 표본이 UV 광에 노출되며 표적 선량으로부터의 변화들에 대해 동시에 모니터링된다. 표적으로부터의 변화들이 검출되면, 제어 모듈은 표적 선량이 달성되도록 노출 시간, 노출 파장 또는 UV 광원의 전력을 조정할 수 있다. 이는 피드백 루프 유형 배열로 실시간으로 수행될 수 있다.
개시된 방법은 임의의 규모로 그리고 개별 단위 공정 또는 연속 연결 공정으로 수행될 수 있다. 개별 단위 공정의 하나의 구현예에서, 임의 용량의 안정화된 표본이 용기 내에 형성된다. 이어서 용기가 UV 광(예로 UV-C광)에 노출된 후 바이러스 불활성화의 평가가 수행된다. 공정은 표본 중에 존재하는 모든 바이러스가 불활성화될 때까지 반복될 수 있다. 대안적으로 평가는 UV 광으로의 노출과 연속으로 수행될 수 있다. 바이러스의 불활성화 후 표본을 추가 가공 또는 포장을 위해 별도 용기로 보낼 수 있다.
연속 연결 공정의 구현예에 있어서, 안정화된 표본은 이전 정제 단계의 배출액에서 형성될 수 있으며, 보호제는 이전 컬럼에서 배출액 스트림이 나올 때 여기에 첨가된다. 보호제는 배출액 스트림 내로의 보호제 도입과 연관된 임의의 전단력들로 인해 배출액 스트림과 혼합될 수 있다. 이어서 안정화된 표본은 장치를 통과하는 표본으로의 UV 광의 연속 노출을 위해 배치된 장치를 통해 통과될 수 있다. 일단 표적 UV 광 선량이 달성되면, 스트림은 정제 단계와 같은 제 2 정제 공정으로 통과되어 안정화된 표본에 존재하는 원하지 않는 보호제(들) 또는 기타 화합물들을 제거할 수 있다.
또 다른 측면에서, 개시된 방법은 실험실 규모에서 상업적 규모까지의 임의 규모로 수행될 수 있다. 상업적 규모 상에서 방법을 수행할 때에는 안정화된 표본을 분취량들로 분할하고 각각의 분취량을 병렬 처리하는 것이 편리할 수 있다. 예를 들어, 다중 UV-C 광원들이 병렬로 수행되어 다량의 안정화된 표본을 수용할 수 있다. 도 13은 그러한 배치의 모식적 예시를 나타낸다.
IV
.
UV
광에 노출된 단백질 중 메티오닌
잔기
, 트립토판
잔기
또는 메티오닌 및 트립토판
잔기
모두의 산화 감소 방법
본 개시의 또 다른 측면에서, UV 광에 노출된 단백질 중 메티오닌 잔기, 트립토판 잔기 또는 메티오닌 및 트립토판 잔기 모두의 산화 감소 방법이 제공된다. 본원 및 관련 문헌에 기재된 바와 같이, 메티오닌 및 트립토판 잔기는 산화에 취약하며 단백질 불활성화로 이어질 수 있다. 예로 Schoneich, (2005) Biochim Biophys Acta 1703:111-19; Stadtman 등, (2003) Antioxid . Redox . Signal 5:577-82; Stadtman, (1993) Ann . Rev . Biochem . 62:797-821; 및 Dean 등, (1997) Biochem. J. 324:1-18을 참고하라. 본 개시를 통해 주지된 바와 같이, UV 광은 다양한 용도들, 예로 그 가장 일반적인 산업적 용도인 바이러스 불활성화에 효과적이지만 바람직하지 않은 단백질들의 변형들 및 분해로 이어질 수 있다. 일부 경우들에서, 단백질 변형 및/또는 분해는 직접적이거나 또는 UV 노출 동안 생성되는 반응종의 존재로 인한 간접적인 것일 수 있다. 분자적 수준에서, 이들 반응종은 단백질들 중의 측쇄 잔기, 현저하게는 메티오닌 및 트립토판 잔기의 측쇄들을 공격할 수 있다. 단백질 기반 치료제의 맥락에서, 이들 변형들은 궁극적으로 고분자량 종(예로 응집물들 및 다량체들) 및 저분자량 종(예로 단편화 단백질들)의 형성으로 이어질 수 있다. 치료제 중 이들 종의 존재는 치료제를 복용하는 환자들에게 심각한 문제들이 될 수 있다.
이러한 잠재적 문제들의 관점에서, 단백질, 특히 단백질 기반 치료제의 변형 및/또는 분해의 가능성을 제거하는 것이 바람직하다. 따라서, UV 광에 노출된 단백질 중 메티오닌 잔기, 트립토판 잔기 또는 메티오닌 및 트립토판 잔기 또는 메티오닌 및 트립토 잔기 모두의 산화 감소 방법이 제공된다. 하나의 구현예에서, 개시된 방법은 다음과 같이 수행될 수 있다.
처음에는 메티오닌 잔기, 트립토판 잔기 또는 메티오닌 및 트립토판 잔기 모두를 포함하는 단백질 성분을 포함하는 표본이 제공된다. 단백질 성분을 포함하는 표본은 표본이 단백질을 함유하고 이 단백질이 메티오닌 잔기, 트립토판 잔기 또는 메티오닌 및 트립토판 잔기 모두를 포함하는 한 임의의 조성일 수 있다. 예를 들어, 표본은 풀로 수집된 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출액을 포함할 수 있다. 본 구현예에서, 크로마토그래피 컬럼 풀은 임의 유형의 크로마토그래피 공정으로부터 수집될 수 있다. 크로마토그래피 컬럼 풀들의 예들에는 단백질 성분을 포함하는 단백질 A 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 풀, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 풀이 포함된다.
단백질 성분을 포함하는 표본은 크로마토그래피 컬럼 용출액 스트림을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 용출액 스트림은 이것이 크로마토그래피 컬럼에서 배출될 때 입수될 수 있다; 따라서, 본 방법은 원 위치에서 그리고 실시간으로 수행될 수 있다. 크로마토그래피 용출액 스트림들의 예들에는 단백질 성분을 포함하는 단백질 A 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 배출액 스트림, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 배출액 스트림이 포함된다.
개시된 방법이 임의 유형의 단백질 성분을 포함하는 표본으로 적용될 수 있지만, 개시된 방법은 메티오닌 잔기, 트립토판 잔기 또는 메티오닌 및 트립토판 잔기 모두의 산화를 통한 단백질 변형 및/또는 분해가 단백질 기반 치료제를 환자에게 활성이 없거나 해롭게 만들 수 있는 영역인 단백질 기반 치료제의 맥락에서 특히 유용할 수 있다. 따라서 하나의 예에서, 단백질 성분을 포함하는 표본은 단백질 기반 약학 분자를 포함하는 표본이다. 특정 구현예들에서, 개시된 방법의 표본의 단백질 성분은 항원 결합 단백질(예로 (i) 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 단일쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체, 및 이들의 단편들 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 단백질, (ii) Fc 도메인; (iii) 펩티드; (iv) Fc 융합 단백질; 및 (v) 치료 단백질 중 하나 이상), Fc 도메인, 펩티드, 및 치료 단백질을 포함한다. 이들 유형들의 분자들은 일반적으로 치료 분자들에 대한 양식들로 확인된다. 항체에 관해, 본원에 주지된 바와 같은 용어 "항체"는 완전 인간 항체들, 인간화 항체들, 또는 완전 비인간(예로 설치류) 항체들을 시사하며, 개시된 방법은 이들 유형들의 분자들에 모두 적용될 수 있다.
개시된 방법의 다양한 구현예들에서, 개시된 방법들로 처리되는 표본은 바이러스를 불활성화하는 것이 바람직한 세포들을 포함하는 표본일 수 있다. 이러한 표본들의 예들에는 혈소판 세포들, CHO 세포들 또는 박테리아 세포들, 예컨대 대장균을 포함하는 표본이 포함된다. 이러한 표본은 세포 배양물들을 포함할 수 있다. 이들 구현예들에서, 본 방법은 기재된 바와 같이 단백질 성분을 포함하는 표본을 세포들을 포함하는 표본으로 치환하여 수행될 수 있다.
개시된 방법의 한 용도를 나타내는 UV-C 바이러스 불활성화는 단백질 성분을 포함하는 표본들 또는 혈소판들과 같은 세포들을 포함하는 표본들에 가장 일반적으로 적용되지만 이것이 요구되는 것은 아니며, 다른 구현예들에서 개시된 방법들은 또한 단백질 성분을 포함하지 않는 표본에서 바이러스를 제거하는데 사용될 수 있다.
방법을 계속해서 표적 UV 광 선량이 확인된다. 표적 선량은 임의의 이유에 대해 선택될 수 있지만, 하나의 구현예에서 관심 바이러스가 불활성화되는 선량이 표적 선량으로 선택된다. UV-C를 이용해서 바이러스를 가장 효과적이고 효율적으로 불활성화하기 위해, 예로서 특정 관심 바이러스를 불활성화하는 것으로 알려져 있거나 이렇게 추정되는 UV 선량에 해당하는 표적 선량의 선택을 이용하여 원하는 결과를 달성할 표적 UV-C선량을 확인하는 것이 바람직하다. 개시된 방법들은 불활성화될 바이러스 유형 및 임의의 편리한 UV-C 선량에서 수행되는 방법으로 UV-C 노출 조건들("UV-C 선량"를 종합적으로 포함함)을 최적화하지 않고 수행될 수 있지만, 불활성화될 바이러스에 특이적인 표적 선량을 확인하여 방법의 효율성이 증강될 수 있다. 일부 바이러스들은 UV-C광에 의해 불활성화될 조건들을 공유할 수 있고, 적절한 노출 조건들을 선택함으로써 2개 이상의 유형들의 바이러스들이 개시된 방법의 단일 공정으로 불활성화될 수 있음이 주지된다. 다양한 DNA- 및 RNA-함유 바이러스들의 UV 감도들을 확인하기 위해 다양한 연구들이 수행되었다. 예로 본원에 참조로 도입되는 Lytle & Sagripanti, (2005) J Virol . 79:14244-252, 및 Knipe 등, (2007) Field's Virology, Lippincott Williams & Wilkins, 그리고 도 11 및 12를 참고하라.
방법을 계속해서, 보호제가 표본으로 첨가되어 안정화된 혼합물을 형성한다. 보호제의 하나의 기능은 표본의 UV-C 광으로의 노출 결과 일어날 수 있는 임의의 변형이나 분해를 감소시키거나 제거하기 위해 표본의 성분들, 예로 표본 중 단백질을 분해하거나 변형할 수 있는 반응종을 포획하는 것이다. 보다 구체적으로, 필요한 UV-C광 선량들로의 용액 노출은 본원에 기재된 바와 같이 반응종을 만들 수 있다. 실제로, 이것은 바이러스 불활성화 방법들에서 UV-C광의 사용에 연관된 문제들 중 하나이다. 표본 중 이들 반응종의 존재는 단백질들을 포함하는 표본 성분들의 간접적 산화로 이어질 수 있다. 또한, 반응종의 존재는 또한 표본 성분들의 간접적 변형에 기여할 수 있다.
단백질들을 분해하거나 변형할 수 있는 반응종의 예들에는 산소 이온들(예로 O2 -), 히드록실 이온들(예로 OH-) 및 페록시드들(예로 H2O2)과 같은 반응종이 포함된다. 이들 및 기타 반응종은 종종 효과적인 바이러스 불활성화를 위해 필요한 고선량의 UV-C광으로의 용액 노출 동안 일반적으로 생성되므로, UV 광으로의 표본 노출 전에 보호제를 첨가하는 것이 바람직하다.
모든 화학종이 보호제로서 작용할 수는 없다. 실제로 본원에 나타낸 실시예들에 개략한 바와 같이, 적합한 보호제들을 확인하기 위해 상세한 검색이 수행되었다. UV-C 노출 동안 생성되는 것과 같이 표본 중에 존재하는 임의의 반응종을 포획할 능력을 갖는 화합물은 표본의 성분들(예로 단백질)에 대한 이들 반응종의 효과가 보호제의 부재 시 표본 성분들 상의 반응종의 효과에 비해 감소되므로 적합한 보호제이다. 일부 경우들에서, UV-C 공정 동안 생성된 반응종에 대한 노출로 인한 표본 성분들의 분해 또는 변형은 보호제를 이용해서 완전히 제거될 수 있다.
표본 중에 존재하는 임의의 반응종의 바람직하지 못한 결과들을 중화시키는 그 효과에 부가하여, 보호제를 선택할 때의 또 다른 고려사항은 UV-C 노출 후 표본으로부터 이를 제거하는 것과 연관된 어려움이다. 개시된 방법은 항원 결합 단백질 또는 치료 단백질과 같은 치료 분자(예로, (i) 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 단일쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체, 및 이들의 단편들 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 단백질, (ii) Fc 도메인; (iii) 펩티드; (iv) Fc 융합 단백질; 및 (v) 치료 단백질 중 하나 이상)를 포함하는 표본으로 적용된다. 제품 품질 상의 규제적 제약들로 인해, 보호제의 바람직한 특성은 그 보호 기능을 수행한 후 표본으로부터 이를 제거하는 능력이다.
바람직한 보호제의 상기 모든 특성들을 고려하여, 적합한 보호제들의 목록이 제공되며, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 피리독신 및 리보플라빈이 비제한적으로 포함된다. 다양한 구현예들에서, 보호제는 다양한 비율들로 둘 이상의 화합물들을 포함한다. 예를 들어 보호제는 티로신, 트립토판 또는 임의의 바람직한 비율로 티로신과 트립토판을 둘 다 포함할 수 있다. 보호제들의 조합의 정확한 조성 및 비율은 실험적으로 및/또는 본원에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
추가적인 보호제들은 본 개시를 지침으로 이용하여 쉽게 확인될 수 있다. 이러한 하나의 스크리닝에서, 후보 보호제가 단백질을 포함하는 표본으로 첨가되고, 하나 이상의 바이러스들을 불활성화하기 적합한 선량으로 UV-C광에 노출된 후(도 11 및 12뿐만 아니라 본원에서 제공되는 참고문헌들이 관련 UV-C선량을 확립하는 지침으로 사용될 수 있다), 단백질의 분해 또는 변형 정도를 결정하기 위해 조사될 수 있다. 표준 크로마토그래피 및 분석 기법들이 이와 관련해서 채용될 수 있다. 예를 들어 IEC를 채용하여 단백질의 변형을 평가할 수 있고, 또는 SEC 또는 질량 분광측정을 이용하여 단백질 분해를 검사할 수 있다.
개시된 방법들에서 채용되는 보호제는 임의의 농도로 첨가될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 보호제는 표본 성분의 변형 또는 분해를 효과적으로 감소시키거나 제거할 농도로 첨가된다. 보호제의 양은 보호제의 확인과 유사한 방식으로 결정될 수 있다. 즉, 선택된 보호제는 초기 농도로 표본에 첨가되고, 표본이 UV-C광에 노출되고, 표본 성분(예로 단백질)의 분해 및/또는 변형 정도가 확립된 방법론을 이용하여 결정될 수 있다. 보호제의 확인의 경우에서와 같이, 적합한 기법들에는 IEC, SEC 및 질량 분광측정이 포함된다. 단백질 성분이 원하는 정도로 보호되지 않는 경우, 원하는 보호 정도를 제공하는 농도가 확인될 때까지 평가가 반복될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 보호제는 단백질 200부 당 보호제 1부 초과의 농도비로 표본에 첨가된다. 다른 방식으로 말하면, 보호제는 단백질 200mM에 대해 보호제 1mM 초과의 농도비로(즉, 1:200) 표본에 첨가될 수 있다. 채용될 수 있는 다른 농도비들에는 1:180, 1:170, 1:160, 1:150, 1:140, 1:130, 1:120, 1:110, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20 또는 1:10이 포함된다.
제공된 보호제들 및 보호제 농도들이 기재된 바와 같이 채용될 수 있지만, 추가적 보호제들 및 보호제 농도들의 확인이 실험적 매트릭스 유형 접근법을 이용하여 쉽게 수행될 수 있다. 이러한 접근법의 한 예에서, 매트릭스는 다양한 후보 보호제들을 구현하는 하나의 축 및 다양한 농도 수준들을 구현하는 또 다른 축으로 확립될 수 있다. 실험들은 기재된 바와 같이(예로 SEC, IEC 및/또는 질량 분광측정을 이용하여 주어진 보호제 및 농도의 효과를 평가) 수행되어 바람직한 보호제들과 이들 보호제들에 대해 바람직한 농도들로 매트릭스를 채울 수 있다. 이 접근법은 다른 추가적 보호제들 및 보호제 농도들을 제공할 것이다.
단백질 성분 및 보호제를 포함하는 표본을 포함하는 안정화된 혼합물을 형성한 뒤, 안정화된 혼합물이 선택된 시기 동안 선택된 전력 수준 및 선택된 파장에서 작동하는 광원에 의해 제공되는 UV 광에 노출된다. 이들 파라미터들의 조합은 본원에서 UV-C 선량으로 총칭된다. 개시된 방법에 채용될 수 있는 광원들의 예들에는 Newport Oriel® Flood UV-C 광원들, 예를 들어 모델 97536이 포함된다.
UV-C 광원은 바람직하게는 일정 범위의 전력 수준으로 맞춰지도록 채택된다. 바람직한 전력 수준들은 약 1mJ 내지 약 1000mJ 범위이다. 특정 예들에서, UV-C 광원은 약 1mJ, 약 10mJ, 약 25mJ, 약 50mJ, 약 75mJ, 약 100mJ, 약 125mJ, 약 200mJ, 약 250mJ, 약 300mJ, 약 350mJ, 약 400mJ, 약 450mJ, 약 500mJ, 약 600mJ, 약 700mJ, 약 800mJ, 약 900mJ, 약 1000mJ 또는 약 1000mJ초과를 전달할 수 있다. UV-C 광원에 있어서 바람직한 또 다른 특징은 모니터로부터의 피드백에 반응하여 자동으로 또는 작동자에 의해 수동으로 제 1 전력 수준에서 제 2 전력 수준으로 교체하는 능력이다
UV-C광원은 또한 바람직하게는 일정 범위의 파장들에 걸쳐 UV-C광을 전달하도록 채택된다. 바람직한 파장들은 UV 스펙트럼의 전체 C 대역에 해당하는 약 200nm 내지 약 280nm 범위이다. 특히 바람직한 구현예들에서, 파장은 약 254nm이다.
보호제 또는 보호제들의 조합이 표본에 첨가되어 안정화된 혼합물을 형성하는 경우, 안정화된 혼합물의 흡광도는 보호제가 첨가되지 않은 표본의 흡광도와 상이할 수 있다. 예를 들어 안정화된 표본 중에 존재하는 첨가된 보호제(들) 또는 다른 화합물들(예로 완충액 성분들, 가용화제들 등)이 표본이 노출된 UV 광을 일부 흡수할 수 있다. 이는 표본 중에 존재하는 임의 바이러스로 전달되는 유효 UV 광의 감소, 결과적으로 바이러스 불활성화의 감소를 일으킬 수 있다.
보호제(들) 및/또는 다른 용액 성분들의 내재적 흡광도를 고려하고 표적 UV-C광 선량이 안정화된 혼합물에 의해 수신되도록 하기 위해서 피드백 루프가 채용될 수 있으며, 여기서 UV 광 노출의 특성들은 UV 혼합물 흡광도의 평가에 반응하여 변한다. 따라서, UVC 노출 장치로 들어가는 혼합물 흡광도의 평가 후 장치 내의 특성들(예로 램프 전력, 체류 시간, 또는 다른 수단들)이 장치로부터 나오는 안정화된 혼합물이 표적 선량을 받도록 일시적으로 변경될 수 있다. 이러한 평가는 대안적으로는 장치를 떠나는 혼합물의 흡광도를 측정하여 수행되거나 또는 장치내 혼합물의 측정에 의해 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 평가는 특정 파장, 예컨대 254nm에서 표본의 흡광도를 모니터링하여 수행될 수 있다. 흡광도 데이터는 수신한 선량을 결정하는데 사용될 수 있고, 표본 중에 함유될 수 있는 성분들(예로 단백질, 보호제 화합물들 또는 기타 용액 화합물들)에 의한 자외선 흡광도를 고려하여 전달된 에너지 선량의 조정으로 정의될 수 있다. 하나의 구현예에서, 평가는 용액 표면에서 광원 전력을 측정하여 수행될 수 있다. 대안적으로 광원 전력은 램프 표면에서 측정될 수 있다. 또한, 램프에 의해 유도된 전력은 측정되어 광원 전력을 평가할 수 있다.
평가는 안정화된 표본 중 보호제(들)의 흡광도로 인해 수신된 선량의 감소를 나타낼 것으로 예측된다. 따라서 평가에서 표적 UV 광 선량이 안정화된 혼합물에 전달되지 않은 것으로 나타나면, 파장, UV 광원 전력 및 UV 광 노출 시간 중 하나 이상이 조정된다.
하나의 구현예에서, UVc 조사의 시준 빔을 받는 잘 혼합된 용기에 대해 선량은 다음 공식을 채용하여 조정될 수 있다: 수분 요인
, 식 중 a=용액의 흡광도이고, l은 경로길이이다. 예로 Bolton (2003) ASCE 129(3):209-215를 참고하라. 주어진 바이러스 불활성화 공정의 수분 요인을 결정하면, 표적 UV 광 선량을 수분 요인으로 나누어 처리를 위한 노출 시간을 결정한다. 또 다른 구현예에서, UVc 조사를 받는 혼합되지 않은 용기에 있어서(예로 박막 공정 반응기 또는 동등물에 있어서) 선량은 다음 공식을 채용하여 조정될 수 있다: 선량 ~ (P / Q)exp(-al) = (P0 / Q0)exp(-a0l), 식 중, a=용액의 흡광도이고, l 은 고리들의 경로길이이다. 식 중, P는 램프의 전력 출력이고 Q는 흡광도=a를 갖는 혼합물에 대한 용적 유속이며; P0 및 Q0는 흡광도=a0를 갖는 참고 혼합물에 대한 전력 및 유속이다. Ye, Z (2007) "UV Disinfection Between Concentric Cylinders," PhD dissertation, Georgia Institute of Technology
개시된 방법들의 일부 또는 모든 단계들은 수동으로 또는 임의의 편리한 자동화 수단들로, 예컨대 자동화 또는 컴퓨터 제어 시스템들을 채용해서 수행될 수 있음이 주지된다. 일부 구현예들에서, 전체 방법이 자동화될 수 있다. 다른 구현예들에서, 하나 이상의 단계들이 자동화될 수 있다. 예를 들어 표적 선량 수준들로부터의 변화들에 반응하여 전달된 선량의 평가 및 조정이 단일 자동화 단계를 형성할 수 있다. 하나의 구현예에서, 안정화된 표본이 UV 광에 노출되며 표적 선량으로부터의 변화들에 대해 동시에 모니터링된다. 표적으로부터의 변화들이 검출되면, 제어 모듈은 표적 선량이 달성되도록 노출 시간, 노출 파장 또는 UV 광원의 전력을 조정할 수 있다. 이는 피드백 루프 유형 배열로 실시간으로 수행될 수 있다.
개시된 방법은 임의의 규모로 그리고 개별 단위 공정 또는 연속 연결 공정으로 수행될 수 있다. 개별 단위 공정의 하나의 구현예에서, 임의 용량의 안정화된 표본이 용기 내에 형성된다. 이어서 용기가 UV 광(예로 UV-C광)에 노출된 후 바이러스 불활성화의 평가가 수행된다. 공정은 표본 중에 존재하는 모든 바이러스가 불활성화될 때까지 반복될 수 있다. 대안적으로 평가는 UV 광으로의 노출과 연속으로 수행될 수 있다. 바이러스의 불활성화 후 표본을 추가 가공 또는 포장을 위해 별도 용기로 보낼 수 있다.
연속 연결 공정의 구현예에 있어서, 안정화된 표본은 이전 정제 단계의 배출액에서 형성될 수 있으며, 보호제는 이전 컬럼에서 배출액 스트림이 나올 때 여기에 첨가된다. 보호제는 배출액 스트림 내로의 보호제 도입과 연관된 임의의 전단력들로 인해 배출액 스트림과 혼합될 수 있다. 이어서 안정화된 표본은 장치를 통과하는 표본으로의 UV 광의 연속 노출을 위해 배치된 장치를 통해 통과될 수 있다. 일단 표적 UV 광 선량이 달성되면, 스트림은 정제 단계와 같은 제 2 정제 공정으로 통과되어 안정화된 표본에 존재하는 원하지 않는 보호제(들) 또는 기타 화합물들을 제거할 수 있다.
또 다른 측면에서, 개시된 방법은 실험실 규모에서 상업적 규모까지의 임의 규모로 수행될 수 있다. 상업적 규모 상에서 방법을 수행할 때에는 안정화된 표본을 분취량들로 분할하고 각각의 분취량을 병렬 처리하는 것이 편리할 수 있다. 예를 들어, 다중 UV-C 광원들이 병렬로 수행되어 다량의 안정화된 표본을 수용할 수 있다. 도 13은 그러한 배치의 모식적 예시를 나타낸다.
다양한 참고문헌들이 본 개시에서 제공되었다. 본원에 언급된 모든 참고문헌들은 모든 목적에 대해 이들의 전문들이 도입된다.
실시예들
하기 실시예들은 개시된 방법들의 구현예들 및 측면을 설명하며, 제한을 위한 것이 아니다.
실시예
1
단백질 변형에 대한 공정 화학 평가
UV
-C 선량으로의 노출 시
Fc 부분을 포함하는 3개의 상이한 재조합 단백질들, 즉 IgG2 모노클로날 항체들, Mab X, Mab Y 및 Mab Z를 포유류 발현 시스템, 즉 CHO 세포들에서 발현시켰다. 단백질을 원심분리에 의해 세포들 및 기타 고형 파편들로부터 분리하고 단백질 A 크로마토그래피 수지를 이용해서 정제하였다. 단백질을 50-300mM 나트륨 아세테이트의 염 범위들, 4.3 내지 7.4의 pH 범위들, 그리고 2 내지 30g/L의 단백질 농도들을 포함하는 상이한 조건들의 용액들 내로 교환하였다.
이들 단백질 각각의 정제 후 분취량들을 사용자 구성 500와트 Hg Newport Oreil® Flood 노출 광원(모델 97536)으로 전달되는 254nM 파장에서 UV-C광으로의 노출로 처리하였다. 노출 광원은 0 내지 1000mJ/cm2 표적 선량 수신 범위에 걸쳐 균일한 시준 여과 광을 제공하도록 구성하였다. 수신 선량은 표본 중에 함유될 수 있는 성분들(예로 단백질, 보호제 화합물들, 또는 기타 용액 화합물들)에 의한 자외선 흡광도를 고려하여 전달된 에너지 선량의 조정으로 정의하였다. 선량은 다음 공식으로 조정하였다: 수분 요인
, 식 중 a=용액의 흡광도이고, l은 경로길이이다. 원하는 수신 선량을 수분 요인으로 나누어 처리에 대한 표적 전달 선량 설정값을 결정하였다. 선량은 용액 표면에서의 광원 전력을 측정하고 노출 시간을 조정하여 달성하였다.
각각의 표본을 다음 중 하나 또는 전체에 의해 단백질 변형에 대해 분석하였다: 응집물 수준에 대해 SEC-HPLC, 하전 이소형 수준들에 대해 CEX-HPLC, 아미노산 잔기 변형에 대해 펩티드 맵, 및 역가 비교를 위한 세포 기반 생물활성 분석.
관찰된 결과들은 pH, 전도성, 및 단백질 농도가 단백질 변형 수준에 크게 영향을 미치지 않았음을 시사하였다. 이들 실험들은 단백질 순도/및 또는 변형의 주요 변화 원인이 UV-C 선량 수준임을 확인시켰다. 도 1-8은 연구한 3개의 모노클로날 항체들에 대한 UV-C 노출의 효과를 요약한다.
실시예
2
단백질 변형 및 바이러스 불활성화에 대한 용액 첨가제들의 평가
UV
-C 선량으로의 노출 시
pH, 전도성 또는 단백질 농도가 아닌 UV-C 노출이 모노클로날 항체 단백질 대상체들의 변형 및/또는 분해에 관여함을 확립하고, UV-C 노출과 연관된 바람직하지 못한 효과들로부터 단백질들을 보호할 화합물들을 확인하기 위해 집중적인 연구를 수행하였다.
Fc 부분을 포함하는 재조합 단백질인 모노클로날 항체 Mab X를 포유류 발현 시스템, 즉 CHO 세포들에서 발현시켰다. 단백질을 원심분리에 의해 세포들 및 기타 고형 파편들로부터 분리하고 단백질 A 크로마토그래피 수지를 이용해서 정제하였다. 단백질 A 컬럼 용출액 풀을 pH 5.0으로 조정하고, 단백질 농도 2, 12 또는 30g/L의 농도들로 희석하거나 농축하였다.
정제 후, 각 농도의 표본을 단백질 20mM 당 첨가제 1mM의 비율로 첨가제와 조합하였다. 첨가제들은 티로신, 트립토판, 메티오닌, 히스티딘, 엽산, 페닐알라닌, 피리독신, 및 리보플라빈 중 하나 이상을 포함하였다. 이들 단백질 분취량들을 각각 사용자 구성 Newport Oreil® Flood 노출 광원(모델 97536)으로 전달되는 254nM 파장에서 UV-C광으로의 노출로 처리하였다. 노출 광원은 0 내지 1000mJ/cm2 표적 선량 수신 범위에 걸쳐 균일한 시준 여과 광을 제공하도록 구성하였다. 수신 선량은 표본 중에 함유될 수 있는 성분들(예로 단백질, 보호제 화합물들, 또는 기타 용액 화합물들)에 의한 자외선 흡광도를 고려하여 전달된 에너지 선량의 조정으로 정의하였다. 선량은 다음 공식으로 조정하였다: 수분 요인
, 식 중 a=용액의 흡광도이고, l은 경로길이이다. 원하는 수신 선량을 수분 요인으로 나누어 처리에 대한 표적 전달 선량 설정값을 결정하였다. 선량은 용액 표면에서의 광원 전력을 측정하고 노출 시간을 조정하여 달성하였다.
각각의 표본을 다음 중 하나 또는 전체에 의해 단백질 변형에 대해 분석하였다: 응집물 수준에 대해 SEC-HPLC, 하전 이소형 수준들에 대해 CEX-HPLC, 아미노산 잔기 변형에 대해 펩티드 맵, 및 역가 비교를 위한 세포 기반 생물활성 분석. 이들 분석들의 결과들을 도 1-9에 나타낸다.
관찰된 결과들은 일부 첨가제들, 즉 엽산 및 히스티딘이 단백질 변형 수준에 긍정적인 방식으로 크게 영향을 미치지 않았으며, 메티오닌은 약간의 이득을 나타내었음을 시사하였다. 그러나 다른 첨가제들, 예컨대 트립토판 또는 티로신은 UV 방사선량 수준에 대해 단백질 변형 정도를 제한하는데 큰 긍정적 효과를 가졌다. 도 9-10 및 14-15는 이 연구 결과들을 요약한다. 티로신과 트립토판이 효과적인 보호제들인 반면 히스티딘과 페닐알라닌이 훨씬 더 보호성이 적거나 보호성이 아니라는 것은 놀랍다. 티로신과 트립토판에서 확인되는 고리 구조들은 페닐알라닌과 히스티딘에서 발견되는 구조들과 유사하다. 티로신 및 페닐알리닌은 구조적으로 매우 가깝게 관련된 아미노산들이다. 트립토판은 효과적인 보호제이고 또한 고선량들의 UV-C로 처리된 단백질에서 산화되는 것으로 주지된 반면, 메티오닌은 고선량의 UV-C로 처리된 단백질에서 크게 산화되는 것으로 주지되었으므로(도 7 및 8) 이것에 효과적인 보호제가 아니라는 것이 또한 놀라웠다.
또한, 달성된 바이러스 불활성화 수준(즉 xmuLV)은 UV-C 선량 수준에 반응하며, 첨가제들의 존재와 무관하게 실제적으로 상당할 수 있다(도 10 참고)는 것이 나타났다. 이들 실험들의 결과들은 첨가제들이 UV-C 매개 변형에 대한 보호를 제공하며, UV 선량 수준에 의한 바이러스 불활성화에 부정적으로 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
실시예
3
UV
-C 처리의 공정 내 시행 평가
Fc 부분을 포함하는 2개의 상이한 재조합 단백질들, 즉 IgG2 모노클로날 항체들 Mab W 및 Mab X를 포유류 발현 시스템, 즉 CHO 세포들에서 발현시켰다. 단백질을 원심분리 및 뎁스 여과에 의해 세포들 및 기타 고형 파편에서 분리하였다. 정제, 컨디셔닝 및 평가 후, 일련의 전처리 표본들을 형성하였다. 2개의 표본 다리들을 생성하였다; 하나는 원심분리 및 뎁스 여과된 재료에서 유래되었고, 또 다른 것은 단백질 크로마토그래피 수지에 걸친 추가 정제 및 그 풀의 중화에서 유래되었다. 이들 풀들 각각을 형광 코팅된 마이크로스피어와 조합한 뒤 보호 첨가제, 즉 티로신을 첨가한 풀과 하지 않은 풀로 더 나누었다. 안정화된 개별 혼합물들을 254nm 파장 분광측정에서 흡광도에 대해 평가하였다. 이어서 이들 안정화된 단백질 혼합물들 각각을 다양한 UV-C 광 선량들에 대한 노출로 처리하였다. 33와트 Hq 램프를 함유하는 Atlantic UV Infinity® 박막 반응기를 통해 혼합물을 통과시켜 처리를 수행하였다. 혼합물을 스테인리스 스틸 셸 및 1.5m 램프를 둘러싼 석영 슬리브 사이에 형성된 0.9mm의 고리형 공간을 통해 흘렸다.
각각의 전처리 풀을 개별 선량 노출 풀들로 나누었다. 반응기 내로 전달된 선량을 유속 조정을 통해 노출 시간을 변화시켜 조정하였다. 전달된 선량을 다음 공식에 따라 조정하였다: 선량 ~ (P / Q)exp(-al) = (P0/Q0)exp(-a0l), 식 중, a=용액의 흡광도이고, l은 고리들의 경로길이이다. 식 중, P는 램프의 전원 출력이고 Q는 흡광도=a를 갖는 혼합물에 대한 용적 유속이고; P0 및 Q0는 흡광도=a0를 갖는 참고 혼합물에 대한 전력 및 유속이다.
이어서 각 표본을 응집물 수준에 대해 SEC-HPLC로 단백질 변형에 대해 분석하였다(표 1).
표 1 티로신 보호제를 포함 및 불포함하는 Mab W
실시예
4
UV
-C 처리의 공정 내 및 인라인 시행 평가
Fc 부분을 포함하는 3개의 상이한 재조합 단백질들, 즉 모노클로날 항체들을 포유류 발현 시스템, 즉 CHO 세포들에서 발현시켰다. 단백질을 원심분리에 의해 세포들 및 기타 고형 파편에서 분리하고 단백질 A 크로마토그래피 수지를 이용하여 정제하였다. 흐르는 단백질 A 배출액 중 정제된 단백질을 서지 용기를 통해 통과시키고, 여기서 보호제로 컨디셔닝하여 안정화된 혼합물을 형성한 뒤 인라인 흡광도 분광측정에 의해 254nm 파장에서 흡광도에 대해 평가하였다.
서지 용기로부터 흘러 나오는 안정화되고 평가된 단백질 혼합물들을 UV-C 광으로의 노출로 처리하였다. 33와트 Hq 램프를 함유하는 Atlantic UV Infinity® 박막 반응기를 통해 혼합물을 통과시켜 처리를 수행하였다. 혼합물을 스테인리스 스틸 셸 및 1.5m 램프를 둘러싼 석영 슬리브 사이에 형성된 0.9mm의 고리형 공간을 통해 흘렸다.
반응기 내로 전달된 선량을 램프 전력 또는 유속을 변화시켜 조정하였다. 전달된 선량을 다음 공식에 따라 일정한 표적 수신 선량을 유지하도록 서지 용기에서 나오는 안정화된 혼합물의 흡광도 변화에 대응하도록 조정하였다: 선량 ~ (P / Q)exp(-al) = (P0/Q0)exp(-a0l), 식 중 a=용액의 흡광도이고, l은 고리들의 경로길이이다. 식 중, P는 램프의 전원 출력이고 Q는 흡광도=a를 갖는 혼합물에 대한 용적 유속이고; P0 및 Q0는 흡광도=a0를 갖는 참고 혼합물에 대한 전력 및 유속이다.
이어서 각각의 표본을 다음 중 하나 또는 전체에 의해 단백질 변형에 대해 분석하였다: 응집물 수준에 대해 SEC-HPLC, 하전 이소형 수준들에 대해 CEX-HPLC, 아미노산 잔기 변형에 대해 펩티드 맵, 및 역가 비교를 위한 세포 기반 생물활성 분석.
Claims (46)
- (a) 단백질 성분을 포함하고, 바이러스를 함유하는 것으로 알려져 있거나 이렇게 추정되는 표본을 제공하고;
(b) 바이러스가 불활성화되는 표적 UV 광 선량을 확인하고;
(c) 표본에 보호제를 첨가하여 안정화된 혼합물을 형성하고;
(d) 안정화된 혼합물을, 선택된 시기 동안 선택된 전력 수준 및 선택된 파장에서 작동하는 광원에 의해 제공되는 UV 광에 노출시키고;
(e) 안정화된 혼합물의 UV-C 노출 수준을 평가하고;
(f) 평가에서 표적 UV 광 선량이 안정화된 혼합물에 전달되지 않은 것으로 나타나는 경우에는 파장, UV 광원 전력 및 UV 광 노출 시간 중 하나 이상을 조정하는 것
을 포함하는, 단백질 성분을 포함하는 표본 중 바이러스의 불활성화 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 표본이 크로마토그래피 컬럼 풀을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 5에 있어서, 상기 풀이 단백질 성분을 포함하는 단백질 A(Protein A) 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G(Protein G) 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 풀, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 풀 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 표본이 크로마토그래피 컬럼 배출액 스트림을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 배출액 스트림이 단백질 성분을 포함하는 단백질 A 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 배출액 스트림, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 배출액 스트림 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 단백질 성분이 (i) 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 단일쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체, 및 이들의 단편들 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 단백질, (ii) Fc 도메인; (iii) 펩티드; (iv) Fc 융합 단백질; 및 (v) 치료 단백질 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 바이러스가 dsDNA 바이러스, ssDNA 바이러스, dsRNA 바이러스 및 ssRNA 바이러스 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 바이러스가 아데노비리대, 아스파르비리대, 헤르페스비리대, 이리도비리대, 파필로마비리대, 폴리오마비리대, 폭스비리대, 시르코비리대, 헤파드나비리대, 파르보비리대, 비르나비리대, 레오비리대, 아레나비리대, 보르나비리대, 부나이아비리대, 델타비리대, 필로비리대, 오르소믹소비리대, 파라믹소비리대, 랩도비리대, 아르테리오비리대, 아스트로비리대, 칼리시비리대, 코르노나비리대, 플라비비리대, HEV-유사 바이러스들, 노다비리대, 피코나비리대, 토가비리대, 및 테르트로비리대 바이러스 과 중 하나 이상의 바이러스를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 바이러스가 파르보바이러스 MVM, 레트로바이러스 MuLV 또는 부나이아바이러스 CVV인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 보호제가 단백질 200부에 대해 보호제 1부 초과의 농도비로 표본에 첨가되는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 보호제가 티로신, 트립토판, 메티오닌, 피리독신 및 리보플라빈 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 11에 있어서, 상기 보호제가 (i) 티로신; (ii) 트립토판; 및 (iii) 티로신과 트립토판 중 하나를 포함하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 UV 광의 파장이 약 200nm 내지 약 280nm 범위인 방법.
- 청구항 13에 있어서, 상기 UV 광의 파장이 약 254nm인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 표적 선량이 약 1mJ/cm2, 약 10mJ/cm2, 약 25mJ/cm2, 약 50mJ/cm2, 약 75mJ/cm2, 약 100mJ/cm2, 약 125mJ/cm2, 약 200mJ/cm2, 약 250mJ/cm2, 약 300mJ/cm2, 약 350mJ/cm2, 약 400mJ/cm2, 약 450mJ/cm2, 약 500mJ/cm2, 약 600mJ/cm2, 약 700mJ/cm2, 약 800mJ/cm2, 약 900mJ/cm2, 약 1000mJ/cm2 및 약 1000mJ/cm2 초과 중 하나 이상인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 약 0.5, 약 1.0, 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5 이상 또는 6.5 초과의 바이러스 로그 감소값(LRV)을 제공하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 자동화되는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 단백질 정제 공정에서의 단계로서 수행되는 방법.
- (a) 반응종의 존재 하에 분해되거나 변형되는 것으로 알려져 있거나 이렇게 추정되는 단백질 성분을 포함하는 표본을 제공하고;
(b) 표적 UV 광 선량을 확인하고;
(c) 표본에 보호제를 첨가하여 안정화된 혼합물을 형성하고;
(d) 안정화된 혼합물을, 선택된 시기 동안 선택된 전력 수준 및 선택된 파장에서 작동하는 광원에 의해 제공되는 UV 광에 노출시키고;
(e) 안정화된 혼합물의 UV-C 노출 수준을 평가하고;
(f) 평가에서 표적 UV 광 선량이 안정화된 혼합물에 전달되지 않은 것으로 나타나는 경우에는 파장, UV 광원 전력 및 UV 광 노출 시간 중 하나 이상을 조정하는 것
을 포함하는, UV 노출 동안 생성되는 반응종의 존재로 인한 단백질 분해 또는 변형의 감소 방법. - 청구항 19에 있어서, 상기 표본이 크로마토그래피 컬럼 풀을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 20에 있어서, 상기 풀이 단백질 성분을 포함하는 단백질 A 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 풀, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 풀 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 19에 있어서, 상기 표본이 크로마토그래피 컬럼 배출액 스트림을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 22에 있어서, 상기 배출액 스트림이 단백질 성분을 포함하는 단백질 A 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 배출액 스트림, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 배출액 스트림 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 19에 있어서, 상기 단백질 성분이 (i) 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 단일쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체, 및 이들의 단편들 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 단백질, (ii) Fc 도메인; (iii) 펩티드; (iv) Fc 융합 단백질; 및 (v) 치료 단백질 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 19에 있어서, 상기 보호제가 단백질 200부에 대해 보호제 1부 초과의 농도비로 표본에 첨가되는 것인 방법.
- 청구항 19에 있어서, 상기 보호제가 티로신, 트립토판, 메티오닌, 피리독신 및 리보플라빈 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 26에 있어서, 상기 보호제가 (i) 티로신; (ii) 트립토판; 또는 (iii) 티로신과 트립토판 중 하나를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 19에 있어서, 상기 UV 광의 파장이 약 200nm 내지 약 280nm 범위인 방법.
- 청구항 28에 있어서, 상기 UV 광의 파장이 약 254nm인 방법.
- 청구항 19에 있어서, 상기 표적 선량이 약 1mJ/cm2, 약 10mJ/cm2, 약 25mJ/cm2, 약 50mJ/cm2, 약 75mJ/cm2, 약 100mJ/cm2, 약 125mJ/cm2, 약 200mJ/cm2, 약 250mJ/cm2, 약 300mJ/cm2, 약 350mJ/cm2, 약 400mJ/cm2, 약 450mJ/cm2, 약 500mJ/cm2, 약 600mJ/cm2, 약 700mJ/cm2, 약 800mJ/cm2, 약 900mJ/cm2, 약 1000mJ/cm2 및 약 1000mJ/cm2 초과 중 하나 이상인 방법.
- 청구항 19에 있어서, 자동화되는 방법.
- 청구항 19에 있어서, 단백질 정제 공정에서의 단계로서 수행되는 방법.
- (a) 메티오닌 잔기, 트립토판 잔기 또는 메티오닌과 트립토판 잔기 둘 다를 포함하는 단백질 성분을 포함하는 표본을 제공하고;
(b) 표적 UV 광 선량을 확인하고;
(c) 표본에 보호제를 첨가하여 안정화된 혼합물을 형성하고;
(d) 안정화된 혼합물을, 선택된 시기 동안 선택된 전력 수준 및 선택된 파장에서 작동하는 광원에 의해 제공되는 UV 광에 노출시키고;
(e) 안정화된 혼합물의 UV-C 노출 수준을 평가하고;
(f) 평가에서 표적 UV 광 선량이 안정화된 혼합물에 전달되지 않은 것으로 나타나는 경우에는 파장, UV 광원 전력 및 UV 광 노출 시간 중 하나 이상을 조정하는 것
을 포함하는, UV 광을 받는 단백질 중 메티오닌 잔기, 트립토판 잔기 또는 메티오닌과 트립토판 잔기 둘 다의 산화 감소 방법. - 청구항 33에 있어서, 상기 표본이 크로마토그래피 컬럼 풀을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 33에 있어서, 상기 풀이 단백질 성분을 포함하는 단백질 A 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G 컬럼 용출액 풀, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 풀, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 풀, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 풀 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 33에 있어서, 상기 표본이 크로마토그래피 컬럼 배출액 스트림을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 36에 있어서, 상기 배출액 스트림이 단백질 성분을 포함하는 단백질 A 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 단백질 G 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 HIC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 SEC 컬럼 배출액 스트림, 단백질 성분을 포함하는 IEC 컬럼 배출액 스트림, 및 단백질 성분을 포함하는 히드록시아파타이트 컬럼 배출액 스트림 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 33에 있어서, 상기 단백질 성분이 (i) 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 단일쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체, 및 이들의 단편들 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 단백질, (ii) Fc 도메인; (iii) 펩티드; (iv) Fc 융합 단백질; 및 (v) 치료 단백질 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 33에 있어서, 상기 보호제가 단백질 200부에 대해 보호제 1부 초과의 농도비로 표본에 첨가되는 것인 방법.
- 청구항 33에 있어서, 상기 보호제가 티로신, 트립토판, 메티오닌, 피리독신 및 리보플라빈 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 33에 있어서, 상기 보호제가 (i) 티로신; (ii) 트립토판; 및 (iii) 티로신과 트립토판 중 하나를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 33에 있어서, 상기 UV 광의 파장이 약 200nm 내지 약 280nm 범위인 방법.
- 청구항 42에 있어서, 상기 UV 광의 파장이 약 254nm인 방법.
- 청구항 33에 있어서, 상기 표적 선량이 약 1mJ/cm2, 약 10mJ/cm2, 약 25mJ/cm2, 약 50mJ/cm2, 약 75mJ/cm2, 약 100mJ/cm2, 약 125mJ/cm2, 약 200mJ/cm2, 약 250mJ/cm2, 약 300mJ/cm2, 약 350mJ/cm2, 약 400mJ/cm2, 약 450mJ/cm2, 약 500mJ/cm2, 약 600mJ/cm2, 약 700mJ/cm2, 약 800mJ/cm2, 약 900mJ/cm2, 약 1000mJ/cm2 및 약 1000mJ/cm2 초과 중 하나 이상인 방법.
- 청구항 33에 있어서, 자동화되는 방법.
- 청구항 33에 있어서, 단백질 정제 공정에서의 단계로서 수행되는 방법.
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