JP2022542317A - ウイルス不活性化のための方法 - Google Patents

Abstract

本開示の実施形態は、ポリペプチドを含む混合物中のｐＨを調節するためのシステムおよび方法に関する。ｐＨは、適切な目的、例えば、混合物中のウイルスを不活性化するために調節することができる。方法は、クロマトグラフィーカラムから、例えば３．９より高く例えば８．５未満のｐＨを有する混合物（例えば、溶出液）を溶出させることを含み得る。方法はさらに、混合物のタンパク質濃度を測定すること、および混合物のｐＨを測定することのうちの１つ以上を含むことができる。次いで、混合物のｐＨを目標ｐＨに低下させるために必要な酸の量を、混合物のタンパク質濃度、混合物のｐＨ、またはその両方に基づいて計算することができる。酸添加量を計算した後、酸の一部を混合物に添加してもよく、この場合、酸の一部は目標ｐＨを達成するために十分である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月１日に出願された米国仮特許出願第６２／８８１，６９２号の優先権を主張し、その開示全体を参照により本明細書に組み込む。

技術分野
本開示は一般に、ポリペプチドを含有する混合物中で標的ｐＨを達成するための方法に関する。より具体的には、本開示は、エンベロープを有するウイルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ）またはウイルス様粒子が不活性化されることを確実にするのを助けるために、ポリペプチドを含有する混合物において標的ｐＨを達成するための方法に関する。

ポリペプチドの製造において、標的分子（例えば、医薬製品（ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ）の標的ポリペプチド成分）を培地から分離する場合がある。例えば、アフィニティークロマトグラフィーなどの分離プロセスが、標的分子調製プロセスの一部として実施され得る。このような分離プロセスの後、ポリペプチドを含有する得られた混合物は、潜在的に望ましくないウイルスまたは医薬製品中に含有するのに望ましくない他の汚染物質を含み得る。したがって、このような汚染物質を除去または不活性化する方法が望ましい。

いくつかの商業規模の標的分子合成プロセスにおいて、プロセス分析技術（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＰＡＴ）が実施され得る。ＰＡＴは、標的分子の製造プロセスの設計、分析、および制御に関与するシステムおよび方法を含む。ＰＡＴは、製品の品質に影響を与えるプロセスパラメータを特定し、定期的にパラメータを監視して製品の品質が維持されるようにすることを含む。ＰＡＴは、標的分子及び医薬製品に関連するリスクを全般的に低減するために、規制機関によって奨励されている。ＰＡＴは、標的分子および／または製品の品質を改善または維持することができる１つ以上のプロセス条件が満たされていることの統計的検証または確認を提供することができる。

本明細書に開示された方法およびシステムは、ウイルス不活性化を含むポリペプチド調製方法の効率および／または生産性を改善し得る。本明細書に開示された方法およびシステムはまた、医薬製品調製方法の効率および／または生産性を改善することができ、上記で同定された１つ以上の問題に対処することができる。

概要
本開示の実施形態は、混合物、例えば溶出液（ｅｌｕａｔｅ）中のウイルスを不活性化する方法に関するものであり得る。この方法は、クロマトグラフィーカラムから、３．９より高く８．５未満のｐＨで混合物を溶出することを含み得る。この方法は、混合物のタンパク質濃度を測定すること、および、混合物のｐＨを測定することをさらに含み得る。次いで、混合物のタンパク質濃度に基づいて、混合物のｐＨを不活性化ｐＨ（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐＨ）に低下させるために必要な酸の量を計算することができる。酸添加量を計算した後、酸の第１の部分であって、酸添加量の６８％～９９％である酸の第１の部分を、混合物に添加してよい。この方法はさらに、混合物のｐＨが不活性化ｐＨ以下になるように、混合物に酸の追加部分を加えることを含み得る。本開示の方法において、混合物は、不活性化ｐＨで、不活性化時間（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｖａｌ）の間保持され得、混合物中のウイルスが不活性化するように構成され得る。

本開示のいくつかの実施形態において、混合物中のウイルスを不活性化するための方法は、標的分子を含む混合物をクロマトグラフィーカラムに装填することを含み得、装填は、約５．０以上約８．５以下のｐＨで行われ得る。この方法はさらに、クロマトグラフィーカラムから、約３．９より高く約５．０以下のｐＨで標的分子を含む溶出混合物（ｅｌｕｔｅｄ ｍｉｘｔｕｒｅ）を溶出することを含み得る。この方法はまた、混合物に酸を加えて、混合物と酸との組み合わせを形成することを含み得、この組み合わせは、効果的なウイルス不活性化を示すように構成され、この組み合わせは、約３．８以下約３．０以上のｐＨを有する。ｐＨ確認モデルを用いて、組み合わせの予測ｐＨ（ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｐＨ）を予め決定することができる。さらに、組み合わせのｐＨを測定および／または記録してもよい。予測ｐＨと記録されたｐＨとの差を計算し、予測ｐＨと記録されたｐＨとの計算された差に基づいて補正措置をとってもよい。

本開示のさらなる実施形態は、酸性不活性化プロトコル（ａｃｉｄｉｃ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を開発するための方法を含み得る。この方法は、溶出液のプールを作製することを含み得、ここで、溶出液のプールの各溶出液は、タンパク質アフィニティーキャプチャ（ｐｒｏｔｅｉｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃａｐｔｕｒｅ）プロセスにおいて精製された標的分子を含む。この方法は、溶出液のプールの各溶出液のｐＨおよび／またはタンパク質濃度を測定することを含み得る。さらに、溶出液のプールの各溶出液を滴定して、溶出液を不活性化ｐＨにするために必要な酸の量を決定することができる。次いで、酸の添加量、溶出液タンパク質濃度、溶出液ｐＨ、および不活性化ｐＨの間の関係を回帰することができる。

本開示のいくつかの実施形態において、混合物中のウイルスを不活性化するための方法は、混合物のタンパク質濃度を測定することを含み得る。次いで、混合物のタンパク質濃度に基づいて、混合物のｐＨを不活性化ｐＨに低下させるために必要な酸の量を計算することができる。酸の添加量を算出した後、混合物のｐＨを低下させるのに必要な酸の量を混合物に添加してもよい。

図面の簡単な説明
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、様々な例示的実施形態を図示し、説明と共に、開示された実施形態の原理を説明する役割を果たす。本明細書に記載される実施形態または実施例の任意の特徴（例えば組成物、処方（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、方法など）は、任意の他の実施形態または実施例と組み合わせることができ、そのようなすべての組み合わせが、本開示によって包含される。さらに、記載されたシステムおよび方法は、任意の単一の態様またはその実施形態にも、そのような態様および実施形態の任意の組み合わせまたは順列にも限定されない。簡潔にするために、特定の置換および組み合わせについては、本明細書で個別に説明および／または図示しない。

図１は、本開示による、溶出液中のウイルスを不活性化するための例示的なプロセスをフローチャート形式で示す。

図２は、本開示による、溶出液中のウイルスを不活性化するための例示的なプロセスをフローチャート形式で示す。および

図３は、本開示による、酸性不活性化プロトコルを開発するための例示的なプロセスをフローチャート形式で示す。

本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、またはそれらの他の変形は、非排他的包含をカバーすることを意図しており、要素のリストを含むプロセス、方法、物品、または装置は、それらの要素のみを含むのではなく、そのようなプロセス、方法、物品、または装置に明示的にリストされていない、または固有でない他の要素を含んでもよい。「例示的（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）」という用語は、「理想的（ｉｄｅａｌ）」という意味ではなく、「例（ｅｘａｍｐｌｅ）」という意味で使用される。用語「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｐｍｌｅ）」および「（例えば）～など（ｓｕｃｈ ａｓ）」ならびにそれらの文法的等価物に関しては、特に明示的に記述されない限り、語句「および限定なしに」が続くものと理解される。

本明細書で使用される用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、実験誤差による変動を説明することを意味する。数値に適用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、異なる変動が指定されない限り、開示された数値から＋／－５％の変動を示し得る。ｐＨ値に適用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、＋／－０．０５の変動を示し得る。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の基準を含む。

本明細書に開示された全ての数値（開示されたすべての値、限度、範囲を含む）は、異なる変動が指定されない限り、開示された数値から＋／－５％の変動を有し得ることに留意されたい。本明細書に開示されたｐＨ値は、＋／－０．０５の変動を有し得る。さらに、全ての範囲は、終点を含むものと理解され、例えば１センチメートル（ｃｍ）～５ｃｍは、１ｃｍ、５ｃｍの長さ、及び１ｃｍ～５ｃｍの間の全ての距離を含む。

詳細な説明
本開示は、本明細書に開示された特定の組成物、処方、材料製造業者、医薬製品（ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ）、デバイス、システム、実験条件、または特定の方法に限定されず、当業者の範囲内で多くの変形が可能である。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、限定することを意図するものではない。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本開示の実施または試験において、任意の適切な方法および材料（例えば、本明細書に記載されているものと類似または同等のもの）を使用することができるが、ここでは特定の方法について説明する。記載されているすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、アミド結合を介して共有結合した約２０個を超えるアミノ酸を有する任意のアミノ酸ポリマーを指す。タンパク質は１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖（例えばポリペプチド）を含む。したがって、ポリペプチドはタンパク質であり得、タンパク質は、単一の機能性生体分子を形成するために複数のポリペプチドを含有し得る。

翻訳後修飾（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）はポリペプチドの構造を修飾又は変化させ得る。例えば、ジスルフィド架橋（例えばシステイン残基間のＳ－Ｓ結合）は、いくつかのタンパク質において翻訳後に形成され得る。いくつかのジスルフィド架橋は、ポリペプチド、免疫グロブリン、タンパク質、補因子（ｃｏｆａｃｔｏｒｓ）、基質などの適切な構造、機能、および相互作用に必須である。ジスルフィド結合形成に加えて、タンパク質は、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）（例えばミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ）、パルミトイル化（ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネソイル化（ｆａｒｎｅｓｏｙｌａｔｉｏｎ）、ゲラニルゲラニル化（ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌａｔｉｏｎ）、およびグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー形成）、アルキル化（例えばメチル化）、アシル化、アミド化、グリコシル化（例えばアルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリジン、セリン、トレオニン、チロシンおよび／またはトリプトファンにおけるグリコシル基の付加）、およびリン酸化（すなわちセリン、トレオニン、チロシン、および／またはヒスチジンへのリン酸基の付加）などの他の翻訳後修飾を受け得る。翻訳後修飾は、疎水性、静電表面特性、またはポリペプチドが関与する表面間相互作用を決定する他の特性に影響し得る。

本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」は、生物療法（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）タンパク質、研究または治療において使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質および他のＦｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含む。対象となるタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｏｆ－ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（ＰＯＩ）は、単離、精製、または他の方法で調製することが望ましい任意のポリペプチドまたはタンパク質を含むことができる。ＰＯＩは、抗体を含む、細胞によって産生される標的ポリペプチドまたは他のポリペプチドを含み得る。

本明細書で使用される用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖：ジスルフィド結合によって相互連結された２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）からなる免疫グロブリンを含む。典型的には、抗体は、１００ｋＤａを超える分子量、例えば、１３０ｋＤａ～２００ｋＤａなど、例えば、約１４０ｋＤａ、１４５ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１５５ｋＤａまたは１６０ｋＤａなど、の分子量を有する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略記する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインから成る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ここではＬＣＶＲまたはＶＬと略記する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域とともに散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分けることができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、それらは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と略記することができる；軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と略記することができる。

例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と呼ばれる種類の免疫グロブリンはヒトの血清中によくみられ、２本の軽鎖と２本の重鎖の４本のポリペプチド鎖を含む。各軽鎖はシスチンジスルフィド結合を介して１本の重鎖に結合し、２本の重鎖は２本のシスチンジスルフィド結合を介して互いに結合している。ヒト免疫グロブリンの他のクラスには、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥが含まれる。ＩｇＧの場合は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の４つのサブクラスが存在する。各サブクラスは、その定常領域が異なるため、異なるエフェクタ機能を有し得る。本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、ＰＯＩは、ＩｇＧを含む標的ポリペプチドを含み得る。少なくとも１つの実施形態において、標的ポリペプチドはＩｇＧ４を含む。

本明細書において使用される用語「抗体」はまた、完全な抗体分子の抗原結合フラグメントを含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などの用語は、本明細書において使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する任意の天然に存在する、酵素的に入手可能な、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、抗体可変ドメインおよび任意に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含むタンパク質分解消化または組換え遺伝子工学技術などの任意の適切な標準技術を用いて、完全な抗体分子から例えば誘導され得る。そのようなＤＮＡは、例えば市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ－抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、および／または合成可能である。ＤＮＡは、化学的に、または分子生物学的技術を用いて、例えば、１以上の可変ドメインおよび／または定常ドメインを適切な構成に配置するために、またはコドンを導入するために、システイン残基を生成するために、アミノ酸を修飾するために、付加するために、もしくは削除するために、配列決定および操作され得る。

標的分子（例えば標的ポリペプチド）は、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えばＰｉｃｈｉａ ｓｐ．）、または哺乳動物系（例えばＣＨＯ細胞およびＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ））などの組換え細胞ベースの生産系を用いて生産され得る。用語「細胞」は、組換え核酸配列を発現するのに適した細胞を含む。細胞には、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａl）細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの株。）、抗酸菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ－９、ＳＦ－２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または、例えばハイブリドーマまたはクアドローマなどの細胞融合体が含まれる。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト、サル（ｍｏｎｋｅｙ）、類人猿（ａｐｅ）、ハムスター、ラットまたはマウス細胞であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は真核生物であり得、以下の細胞から選択され得る：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ－６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ ４３１（表皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および上記した細胞に由来する細胞系。いくつかの実施形態において、細胞は、１以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えばＰＥＲ．Ｃ６（ＴＭ）細胞）を含み得る。

用語「標的分子」は、本明細書中では、標的ポリペプチド（例えば、抗体、抗体断片、または他のタンパク質もしくはタンパク質断片）、または、製造され、単離され、精製され、および／または医薬製品中に含まれることを意図した他の分子を指すために使用され得る（例えば、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ）（ＡＡＶ）または治療用の他の分子）。本開示による方法は、標的ポリペプチドに言及することができるが、他の標的分子にも同様に適用することができる。例えば、ＡＡＶは、適切な方法（例えば、深層濾過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、アフィニティークロマトグラフィーなど）に従って調製することができ、ＡＡＶを含む混合物（例えば、ＡＡＶを含む溶出液）は、本開示に従う方法に供され得る。本開示の１つ以上の方法に従う前または後に、ＡＡＶを含む混合物は、追加の手順（例えば、標的配列を含まない「空のカセット」またはＡＡＶの除去）に供され得る。

「ウイルス含量（ｖｉｒａｌ ｃｏｎｔｅｎｔ）」という用語は、混合物の定性的記載を指す。例えば、混合物がウイルスまたはウイルス様粒子を含む場合、その混合物はウイルス含量を有する。ある実施形態において、ウイルス含量は、混合物の体積当たりのウイルス粒子の数または感染単位（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｕｎｉｔ）の数（すなわち濃度）によって定量することができる。用語「ウイルス濃度」は、ウイルス粒子（例えば、活性および不活性ウイルス粒子）の濃度または感染単位の濃度を意味し得る。

ウイルス不活性化のための例示的な方法は、いくつかのウイルスおよびウイルス様粒子を不活性化することが知られているｐＨを達成するために混合物に酸を添加すること、及び、所定の時間、達成されたｐＨで混合物を保持することを含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、レトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子を不活性化し得る。いくつかの実施形態において、標的分子を含む混合物から標的分子を調製するための方法は、混合物をクロマトグラフィー装置に接触させることを含み得る。このようなクロマトグラフィー装置は、予め製造された装置（例えば、Ｃａｄｅｎｃｅ（ＴＭ） ＢｉｏＳＭＢ（Ｐａｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢｉｏＳＣ（登録商標）（ｎｏｖａｓｅｐ）、Ｖａｒｉｃｏｌ（登録商標）（ｎｏｖａｓｅｐ）、Ｏｃｔａｖｅ（Ｓｅｍｂａ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、カスタム製造された装置、手動で組み立てられた装置、または単にタンデムで使用される２つ以上の標準的なバッチクロマトグラフィー装置を含むことができる。

いくつかの実施形態において、標的分子は、ストリッピングバッファ（ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）をクロマトグラフィー装置（例えばクロマトグラフィーカラム）に接触させることによって、および／または平衡化バッファ（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）をクロマトグラフィー装置に接触させることによって、クロマトグラフィー装置から溶出され得る。いくつかの実施形態において、ストリッピングバッファは、水、アルカリ溶液、またはアルコールを含む溶液を含むことができる。例えば、脱イオン水などの水は、５体積％（ｖｏｌ．％）未満の溶解イオン、１体積％未満の溶解イオン、０．１体積％未満の溶解イオン、または０．０１体積％未満の溶解イオンを有し得る。いくつかの実施形態によれば、アルカリ溶液は、ＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２、ＮＨ_４ＯＨまたは他のアルカリ化合物などの１つ以上のアルカリイオン化合物を含み得る。ストリッピングバッファ中のアルカリ化合物の濃度は、例えば、約０．１Ｎ～約１．５Ｎ、約０．１Ｎ～約１Ｎ、約０．１Ｎ～約１．５Ｎ、約０．５Ｎ～約１．５Ｎ、約０．１Ｎ～約０．８Ｎ、約０．１Ｎ～約０．６Ｎ、約０．１Ｎ～約０．５Ｎ、約０．１Ｎ～約０．４Ｎ、または約０．１Ｎ～約０．３Ｎの範囲であり得る。例えば、ストリッピングバッファ中のアルカリ化合物の濃度は、約０．１Ｎ、約０．２Ｎ、約０．３Ｎ、約０．４Ｎ、約０．５Ｎ、約０．６Ｎ、約０．７Ｎ、約０．８Ｎ、約０．９Ｎ、約１Ｎ、約１．１Ｎ、約１．２Ｎ、約１．３Ｎ、約１．４Ｎ、または約１．５Ｎとすることができる。アルコールを含むストリッピングバッファは、メタノール、エタノール、プロパノール、ベンジルアルコール、または他のアルコールを含むことができる。ストリッピングバッファ中のアルコール濃度は、ストリッピングバッファの合計重量に対して、約０．１体積（ｖｏｌ．）％～約３０体積％、例えば、０．５体積％～約３０体積％、約０．５体積％～約２５体積％、約０．５体積％～約２５体積％。約０．５体積％～約２５体積％、約１体積％～約２０体積％、約１体積％～約１５体積％、約１体積％～約１０体積％、約１０体積％～約５０体積％、約１０体積％～約４０体積％、約１０体積％～約３０体積％、約１０体積％～約２５体積％、約１５体積％～約２５体積％、または約２０体積％～約２５体積％であり得る。例えば、ストリッピングバッファ中のアルコール濃度は、約０．１体積％、約０．５体積％、約１体積％、約２体積％、約３体積％、約５体積％、約１０体積％、約１５体積％、約２０体積％、または約２５体積％であり得る。

いくつかの実施形態において、平衡化バッファは、組成がストリッピングバッファと類似であってもよく、または同一であってもよい。他の実施形態では、平衡化バッファは、ストリッピングバッファと比較して組成が変化してもよい。いくつかの実施形態において、平衡化バッファは、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、硫酸塩、Ｔｒｉｓ、または他の塩などの１つ以上の塩を含んでもよい。

１つ以上の実施形態において、ウイルス不活性化のための方法は、標的分子を含む混合物がクロマトグラフィー装置（例えば、充填層床（ｐａｃｋｅｄ ｂｅｄ）アフィニティークロマトグラフィーカラム、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム、イオン交換クロマトグラフィーカラム、および／またはサイズ排除クロマトグラフィーカラム）から溶出された後に使用され得る。クロマトグラフィー装置への標的分子の装填（ｌｏａｄｉｎｇ）は、上流工程に依存して変化し得るが、標的分子を含有する混合物は、一定の体積（ｖｏｌｕｍｅ）でクロマトグラフィー装置から溶出され得る。いくつかの実施形態において、標的分子を含む混合物を、約５．０以上約８．５以下のｐＨ、例えば、約５．５以上約８．５以下、約６．０以上約８．５以下、または約５．０～約６．５などのｐＨでクロマトグラフィーカラムに装填する。装填の変動の結果として、溶出液（例えば、クロマトグラフィー装置から溶出される溶出液）のタンパク質濃度および／またはｐＨは変動し得る。この変動により、ウイルス不活性化に必要な酸の量も変動する。

従来の製造プロセスでは、低ｐＨウイルス不活性化は試行錯誤法によって達成され、そこでは、所定量の酸が溶出液に添加され、溶出液および酸混合物のｐＨが測定され、添加および測定ステップは不活性化ｐＨに達するまで反復的に継続される。過剰な酸の添加から生じる可能性のあるコストと損失のために、そのようなプロセスは保守的であり、少量の酸の添加量と、しばしば時間のスケールでの長い不活性化プロセス時間を伴う。

本開示の態様は、標的ポリペプチドまたは他の標的分子を調製するプロセスに様々な利点を提供し得る。例えば、本明細書に記載される１つ以上の方法および／または数学的モデルを実施して、酸添加量、例えば、混合物（標的分子と、潜在的に望ましくないウイルスまたはウイルス様粒子を含む）を不活性化ｐＨにするのに必要な酸の量を決定することができる。酸添加量にほぼ等しい量の酸を混合物に添加してもよい。以下により詳細に説明するように、酸添加量に相当する酸の量を、１回のボーラス（ｂｏｌｕｓ）として、または酸の２回以上の投与で添加することができる。このような方法でのウイルス不活性化のための酸の投与は、従来の試行錯誤法よりも効率的であり、誤りの影響を受けにくい。

本開示のいくつかの態様において、プロセスの一部として、混合物中のウイルス含量または感染単位の含有量は、最小であるかまたは存在しないことが知られる得るか、または予想され得る。本開示のいくつかのそのような態様において、本明細書に開示されたシステムおよび方法は、有利には、ＰＡＴの一部として製造プロセスに組み込まれて、例えば、プロセス内の潜在的な変動を減少させ、プロセス標準への準拠のリアルタイムの確認を提供し、および／またはプロセスの完全性の信頼性を高めることができる。

本開示の態様のさらなる利点および利点は、当業者には明らかであろう。

上記で示唆したように、標的分子を１つ以上のクロマトグラフィーおよび／または分離プロセスを用いて調製した後、混合物（例えば、溶出液）を得ることができる。いくつかの実施形態において、例えば、タンパク質濃度、標的分子濃度、ｐＨ、またはそれらの組み合わせを含む、混合物の１つ以上の測定を行ってもよい。タンパク質濃度は、例えば、紫外／可視光分光法を含む任意の適切な方法によって測定することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質濃度は、ポリペプチドであってもよい標的分子によって特徴的に吸収される波長を用いて測定される。そのような実施形態において、全体のタンパク質濃度は、標的分子（例えば標的ポリペプチド）の濃度とほぼ同等であり得る。いくつかの実施形態において、標的分子を含む混合物は、溶出液の１リットル当たりのグラム数（ｇ／Ｌ）で約７．０ｇ／Ｌ～約３５．０ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ以上約２０．０ｇ／Ｌ以下、約８．５ｇ／Ｌ～約１８．５ｇ／Ｌ、または約１０．０ｇ／Ｌ～約１７．０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有し得る。

混合物のｐＨは、任意の適切な方法によって測定することができる。ｐＨの正確で一貫した測定は、低ｐＨによるウイルス蛋白質の不活性化を成功させるために重要である。ｐＨの測定は、温度、使用するｐＨプローブのタイプ、同じタイプのｐＨプローブ間の個体差、および／または測定された媒体（ｍｅｄｉｕｍ）とｐＨプローブとの間の物理的相互作用によって影響され得る。標準化されたｐＨ測定プロセスでも、±０．０５ｐＨの変動が一般的である。ポリペプチドの製造又はウイルス不活性化の分野では、±０．０５ｐＨのスケールの変動は、作業ｐＨ範囲の約２０％に相当し、ウイルス不活性化及び／又は工程バリデーションに有害な影響を及ぼす可能性がある。このような変動は、時間の経過とともに複合的になり、機器のドリフトおよびｐＨ測定値のより極端な変動をもたらすことさえある。したがって、いくつかの実施形態では、ｐＨを測定する際にｐＨ測定の変動を考慮することができる。いくつかの実施形態において、示唆されるように、溶出液のｐＨは、ｐＨ測定における変動性を低減または排除することを目的として、標準化された方法によって測定することができる。ｐＨ測定方法の標準化は、ｐＨプローブの単一製造業者の使用、ｐＨプローブの単一ロットの使用、所定温度でのｐＨの測定、測定サンプルマトリクスの標準化などを含むことができる。いくつかの実施形態において、溶出液のｐＨは、例えば電位差計ｐＨ計などのｐＨ計によって測定することができる。いくつかの実施形態において、標的分子を含む溶出液は、約３．９以上約８．５以下のｐＨ、例えば、約３．９～約６．５、約３．９～約５．５、約４．５～約６．５、約４．０～約４．４、約３．９～約４．４、または約４．０～約４．３などのｐＨを有し得る。本明細書中では、ｐＨ値またはｐＨ値の範囲は、±０．０５ｐＨ単位の変動を有し得る。

混合物（例えば溶出液）、処方、及び／又は医薬製品中のある種のウイルス及びウイルス様粒子（例えば、エンベロープウイルス、レトロウイルス、レトロウイルス様粒子、仮性狂犬病（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）、ヘルペスウイルスなど）の存在は、そのような混合物、処方、及び／又は医薬製品の成分、特性、又は使用性に影響を及ぼす可能性がある。例えば、医薬製品中に望まれていないウイルス又はウイルス様粒子が存在すると、製品の安定性に影響を及ぼし、製品の有効期間を短縮し、又は製品が社内規格、公定書又は規制（例：米国食品医薬品局）に適合しなくなる可能性がある。ウイルスやウイルス様粒子の中には、ウイルスを含む製剤の投与により免疫原性反応などの臨床的影響を引き起こすものがある。本開示の実施形態は、ウイルスまたはウイルス様粒子を不活性化して、そのような望ましくない作用のいずれかまたはすべてを減少または排除するのに有用であり得る。例えば、本開示の実施形態は、１以上のポリペプチド精製プロセス（例えば、プロテインＡアフィニティーカラムを含む分離プロセス）の後で、ウイルス含量を有する混合物（例えば溶出液）に適用可能であり得る。

いくつかの実施形態において、ウイルス不活性化の前に、混合物の導電率を測定することができる。いくつかの実施形態において、ウイルス不活性化の前に、１つ以上の塩を混合物に添加して、その導電率を調整する（例えば、導電率を増加させる）ことができる。そのような１つ以上の塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、ハロゲン化物、および／または１つ以上の他のイオン活性化合物を含み得る。理論によって制限されることなく、導電率を調節するための１つ以上の塩の添加は、標的分子、ウイルスまたはレトロウイルス様粒子の凝集を低減し得る。標的分子、ウイルスまたはレトロウイルス様粒子の凝集は、これらの種の表面が酸とどのように相互作用するかに影響し得る。混合物への塩の添加は、混合物のイオン活性を増加させ、混合物の導電率を増加させ、標的分子またはウイルス凝集を減少させ得る。したがって、いくつかの実施形態において、混合物の導電率は、標的分子またはウイルスの凝集の程度に関連し得る。

いくつかの場合において、本開示の実施形態は、極めて低いウイルス含量（例えば、１ｍＬ当たり約０．０００１ウイルス粒子または感染単位以下）、または存在しないウイルス含量を有する混合物に適用可能であり得る。クロマトグラフィーおよび他の分離プロセスは、単独または組み合わせて、標的分子を十分に精製および／または分離し、混合物から望まれていないウイルスまたはウイルス様粒子を除去することができる。そのような場合には、本開示による方法は、ウイルスまたはウイルス様粒子が不活性化されていることを追加的に保証し、製品の安定性、製品の安全性、製品の有効性、および内部仕様または規制仕様への適合を保証するために有益であり得る。したがって、本開示の実施形態は、例えば、規制ガイドラインが満たされていることを確実にし、および／または冗長な品質管理を提供するために、既知のウイルス含量のない混合物にも適用することができる。

本明細書に記載のウイルス不活性化プロトコルおよび方法は、ＡＡＶ（例えば、標的配列を含むＡＡＶ）などの特定のタイプのウイルスに悪影響を及ぼすことなく実施することができる。例えば、有利には、本明細書に記載のプロトコルおよび方法は、ＡＡＶを劣化させることなく実施することができる。したがって、本明細書に記載の方法は、標的分子としてＡＡＶを含有する混合物中での使用に適していてもよい。

上記で示唆したように、混合物中のウイルスは、混合物を不活性化ｐＨで不活性化時間の間保持することによって不活性化され得る。不活性化ｐＨは、３．８以下３．０以上のｐＨ、例えば、３．３５～３．８、３．７５以下３．０以上、３．７以下３．０以上、３．６５以下３．０以上、３．６以下３．０以上、３．５５以下３．０以上、３．５以下３．０以上、３．４５以下３．０以上、３．４０以下３．０以上、３．３５～３．７５、３．５～３．８、３．５～３．７５、３．５～３．７、３．５～３．６、または３．５～３．６５のｐＨなどであり得る。本明細書中で用いるように、ｐＨ値またはｐＨ値の範囲は、±０．０５ｐＨ単位の変動を有し得る。不活性化ｐＨを高くしすぎると、不活性化工程内でばらつきが生じ、ウイルス不活性化が不十分となるおそれがある。不活性化ｐＨを低くしすぎると、標的分子または他のタンパク質を変性させたり、あるいは望ましくない方法で混合物を変化させたりするリスクがある。

不活性化時間は、混合物が不活性化ｐＨで保持される時間（ｉｎｔｅｒｖａｌ ｏｆ ｔｉｍｅ）を示す。不活性化時間は、約２０分～約９０分、例えば、約３０分、約４５分、約６０分、約３０分～約４５分、約３０分～約６０分、約３０分～約７５分、約３０分～約９０分、約４５分～約６０分、約４５分～約７５分、約４５分～約９０分、約６０分～約７５分、又は約６０分～約９５分などであり得る。混合物を不活性化ｐＨで不活性化時間の間保持することにより、混合物中のウイルス活性を低下させ、除去し、または確実に不活性化することができる。低ｐＨ環境は、例えば、ウイルスエンベロープタンパク質などのウイルスタンパク質を変性させ得る。変性したウイルスタンパク質はレトロウイルスおよびレトロウイルス様粒子を不活性化させ得、混合物の望ましくないウイルス活性を低下させ得る。

混合物中のウイルス活性の減少は、減少係数（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）によって定量することができる。減少係数は、以下に示す式１に従って計算することができる。

式中、Ｖ_１はウイルス不活性化前の混合物の体積であり、Ｃ_１はウイルス不活性化前の混合物の体積当たりのウイルス濃度または感染単位であり、Ｖ_２はウイルス不活性化後の混合物の体積であり、Ｃ_２はウイルス不活性化後の混合物のウイルス濃度である。ウイルス不活性化のための方法を含む本開示の種々の実施形態において、２．５以上の減少係数、例えば、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、または５以上などの減少係数が達成される。本明細書において、「有効なウイルス不活性化」は、２．５以上、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、または５以上の減少係数と関連するウイルス不活性化を意味し得る。

１つ以上の実施形態によれば、酸添加量は、混合物のタンパク質濃度および不活性化ｐＨに基づいて算出することができる。例えば、下記の式２に従って酸添加量を算出することができる。
ｗ＝Ａｘ＋Ｂｙ＋Ｃ 式（２）
式中、ｘは１リットル当たりのグラム数（ｇ／Ｌ）で表した混合物のタンパク質濃度であり、ｙは不活性化ｐＨであり、ｗは混合物の１キログラム当たりの酸のモル数（ｍｏｌ／ｋｇ）で表した酸添加量であり、Ａ、Ｂ、およびＣは定数である。式２の定数Ａは、混合物の１グラム－キログラム当たりの酸のリットル－モルの単位（Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ）を有する。定数Ａは、０．０００３Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ以上０．０００６Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ以下、例えば、約０．０００３Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ～約０．０００５Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ、約０．０００４Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ～約０．０００６Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ、約０．０００３５Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ～約０．０００５Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ、約０．０００３５Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ～約０．０００６Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ、または約０．０００４Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ～約０．０００５５Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇなどであり得る。式２の定数ＢおよびＣは、混合物の１キログラム当たりの酸のモル数の単位（ｍｏｌ／ｋｇ）を有する。定数Ｂは、－０．１ｍｏｌ／ｋｇ以上０ｍｏｌ／ｋｇ以下、例えば、約－０．１ｍｏｌ／ｋｇ～約０ｍｏｌ／ｋｇ、約－０．１ｍｏｌ／ｋｇ～約－０．０５ｍｏｌ／ｋｇ、約－０．０５ｍｏｌ／ｋｇ～約０ｍｏｌ／ｋｇ、または約－０．０８ｍｏｌ／ｋｇ～約－０．０１ｍｏｌ／ｋｇなどであり得る。定数Ｃは、０．０２ｍｏｌ／ｋｇ以上０．１ｍｏｌ／ｋｇ以下、例えば、約０．０２ｍｏｌ／ｋｇ～約０．１ｍｏｌ／ｋｇ、約０．０２ｍｏｌ／ｋｇ～約０．０５ｍｏｌ／ｋｇ、約０．０５ｍｏｌ／ｋｇ～約０．１ｍｏｌ／ｋｇ、または約０．０４ｍｏｌ／ｋｇ～約０．０８ｍｏｌ／ｋｇなどであり得る。

いくつかの実施形態において、酸添加量は、混合物のタンパク質濃度、不活性化ｐＨ、および混合物のｐＨに基づいて計算することができる。例えば、以下に示す式３に従って酸添加量を算出することができる。
ｗ＝Ｅｘ＋Ｆｙ＋Ｇｚ＋Ｈ 式（３）
式中、ｘは１リットル当たりのグラム数（ｇ／Ｌ）で表される混合物のタンパク質濃度であり、ｙは不活性化ｐＨであり、ｚは混合物ｐＨであり、ｗは混合物の１キログラム当たりの酸のモル数（ｍｏｌ／ｋｇ）で表される酸添加量であり、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨは定数である。式３の定数Ｅは、混合物の１グラム－キログラム当たりの酸のリットル－モルの単位（Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ）を有し、定数Ｆ、Ｇ及びＨは、混合物の１キログラム当たりの酸のモル数の単位（ｍｏｌ／ｋｇ）を有する。定数Ｅは、０．００００５Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ以上、０．０００５Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ以下、例えば、約０．００００５Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ～約０．０００５Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ、約０．０００１Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ～０．０００５Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ、約０．００００５Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ～０．０００４５Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ、約０．０００１Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ～約０．０００３５Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ、または約０．０００３５Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ～約０．０００５Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇなどであり得る。定数Ｆは、－０．２ｍｏｌ／ｋｇ以上０ｍｏｌ／ｋｇ以下、例えば、約－０．１ｍｏｌ／ｋｇ～約０ｍｏｌ／ｋｇ、約－０．１ｍｏｌ／ｋｇ～約－０．０５ｍｏｌ／ｋｇ、約－０．０５ｍｏｌ／ｋｇ～約０ｍｏｌ／ｋｇ、または約－０．０８ｍｏｌ／ｋｇ～約－０．０１ｍｏｌ／ｋｇなどであり得る。定数Ｇは、０ｍｏｌ／ｋｇ以上０．０３ｍｏｌ／ｋｇ以下、例えば、約０ｍｏｌ／ｋｇ～約０．０３ｍｏｌ／ｋｇ、約０．００１ｍｏｌ／ｋｇ～約０．０３ｍｏｌ／ｋｇ、約０．００５ｍｏｌ／ｋｇ～約０．３ｍｏｌ／ｋｇ、または約０．００５ｍｏｌ／ｋｇ～約０．０２５ｍｏｌ／ｋｇなどであり得る。定数Ｈは、－０．１ｍｏｌ／ｋｇ以上、０．１ｍｏｌ／ｋｇ以下、例えば、約－０．１ｍｏｌ／ｋｇ～約０．１ｍｏｌ／ｋｇ、約－０．０８ｍｏｌ／ｋｇ～約０．０８ｍｏｌ－１０／ｋｇ、約－０．０５ｍｏｌ／ｋｇ～約０．１ｍｏｌ／ｋｇ、または約－０．１ｍｏｌ／ｋｇ～約０．０５ｍｏｌ／ｋｇなどであり得る。

混合物タンパク質濃度を酸添加量および不活性化ｐＨに関連付ける具体的な式（必要に応じて、混合物ｐＨに依存し得る）は、使用する標的分子および／または酸系によって異なり得る。所定の標的分子および酸系に適用される上記で定義された定数の値は、上記で定義された一般式に従って回帰によって決定することができる。下記の実施例のセクションで説明するように、酸添加量は、上記の定義式に従って混合物タンパク質濃度と強い相関を有することが、予想外に見出される。この予想外に強い相関は、本明細書に記載される一般式およびそれらの導関数をＰＡＴに組み込むことを可能にする。

一つ以上の実施形態において、酸添加量は、混合物の１ｋｇ当たり０．００２モル（ｍｏｌ／ｋｇ）～約０．０２５ｍｏｌ／ｋｇであり、例えば、約０．００２ｍｏｌ／ｋｇ～約０．０２５ｍｏｌ／ｋｇ、約０．０１ｍｏｌ／ｋｇ～約０．０２５ｍｏｌ／ｋｇ、約０．００２ｍｏｌ／ｋｇ～約０．０２０ｍｏｌ／ｋｇ、または約０．００５ｍｏｌ／ｋｇ～約０．０２０ｍｏｌ／ｋｇなどである。

いくつかの実施形態において、酸添加量が計算された後、酸を混合物に添加して、混合物を不活性化ｐＨにすることができる。例えば、少なくとも１つの実施形態において、酸添加量に相当する酸のボーラスを混合物に添加して、混合物のｐＨを不活性化ｐＨ以下にすることができる。他の実施形態では、酸の第１の部分が混合物に添加され、次いで、混合物のｐＨが不活性化ｐＨ以下になるように、酸の１つ以上の追加の部分が混合物に添加されてもよい。そのような実施形態において、酸の第１の部分は、酸添加量の６８％～９９％であり、例えば、約７５％～約９９％、約８０％～約９９％、約８５％～約９９％、約９０％～約９９％、約８５％～約９５％、または約９０％～約９９％などである。

酸の第１の部分は、可能な限り低いｐＨを有する混合物中の標的分子が第１の部分の添加によって変性されないように配分され得る。酸の追加の部分は、酸の第１の部分の添加後に行われる酸の１回以上の添加（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ａｄｄｉｔｉｏｎｓ）を含み得、例えば、酸の第１の部分の添加後に行われる酸の３回の添加（３ ａｄｄｉｔｉｏｎｓ）、酸の４回の添加（４ ａｄｄｉｔｉｏｎｓ）、または酸の５回の添加（５ ａｄｄｉｔｉｏｎｓ）などを含み得る。酸の１回以上の添加の各々は、酸添加量の０．１％～３２％の量、例えば、約０．１％～約３０％、約０．１％～約２５％、約０．１％～約２０％、約１％～約２５％、約０．１％～約１５％、約０．１％～約１０％、約１％～約１５％、約１％～約１０％、または約０．１％～約５％などの量であり得る。酸の１回以上の添加の各添加は、酸の他の１回以上の添加と同じ量であってもよい。他の実施形態では、酸の各添加は、酸の他の各添加と同じ量である。

いくつかの実施形態において、ｐＨを、酸の第１の部分が混合物に添加された後であるが、酸の追加の部分の添加の前に測定することができる。いくつかのそのような実施形態において、酸の最初の部分が添加された後に測定された混合物のｐＨは、３．５以上３．７５以下であり、例えば、約３．５～約３．７５、約３．６～約３．７、約３．５～約３．６５、約３．６～約３．７５、または約３．５～約３．６５などである。本明細書中では、ｐＨ値またはｐＨ値の範囲は、±０．０２ｐＨ単位の変動を有し得る。

酸は、１つ以上の酸溶液の形態で添加することができる。酸溶液は、任意の適切な酸、例えば、ＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ_３ＰＯ_４、ＨＯ_２Ｃ_２Ｏ_２Ｈ、Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_７、Ｈ_２ＳＯ_３、Ｈ_３ＰＯ_４、ＨＮＯ_２、Ｃ_６Ｈ_５ＣＯ_２Ｈ、ＣＨ_３ＣＯ_２Ｈ、ＨＣｌＯ、ＨＣＮ、Ｈ_３ＢＯ_３、またはそれらの組み合わせを含み得る。加えて、または代替的に、酸溶液は、例えば、グリシン、アルギニン、酢酸ナトリウム、および／または塩化ナトリウムなどの１つ以上の塩を含み得る。

目的分子を含む混合物に酸添加量を加えた後、生成した混合物は不活性化ｐＨ以下のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、形成された混合物のｐＨは、例えば、それが所望の範囲内にあることを確認するために測定され得る。前述したように、混合物を不活性化ｐＨで不活性化時間の間保持してもよい。混合物を不活性化ｐＨで不活性化時間の間保持した後、ウイルス活性の減少が、例えば、２．５以上、３以上、３．５以上、または４以上の減少因子と等価で生じ得る。混合物を不活性化ｐＨで不活性化時間の間保持した後、混合物のｐＨが４．５以上８．５以下、例えば、４．５以上８．５以下、５．０以上８．５以下、５．８以上８．５以下、５．９以上８．５以下、６．０以上８．５以下、６．１以上８．５以下、６．２以上８．５以下、６．３以上８．５以下、６．４以上８．５以下などになるように、アルカリ溶液を添加することによって、混合物を滴定することができる。本明細書中では、ｐＨ値またはｐＨ値の範囲は、±０．０２ｐＨ単位の変動を有し得る。アルカリ溶液は、例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２、ＮＨ_４ＯＨ、ＮａＣＨ_３ＣＯ_２および／または（ＨＯＣＨ_２）_３ＣＮＨ_２などの１つ以上の塩基を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、混合物は、酸の最初の部分が添加されてから１時間未満、例えば、約５０分未満、約４５分未満、約４０分未満、約３５分未満、または約３０分未満などの時間で滴定される。

本開示の態様は、組み合わせ（すなわち、混合物と酸との組み合わせ）のｐＨを予測する関数（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を決定するための方法も含むことができる。例えば、測定されたタンパク質濃度および／または混合物のｐＨと、混合物に添加された酸の量とに基づいて、組み合わせのｐＨ（例えば不活性化ｐＨ）を予測する関数を決定することができる。このような関数を使用して、処理エラー（例えば、不十分な混合、不十分なサンプリングなど）や機器の不具合（機器誤差、機器ドリフト、ｐＨプローブ異常など）を検出することができる。

いくつかの実施形態において、酸性化された混合物の予測ｐＨ（ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｐＨ）は、確認モデルに従って予め決定され得る。確認モデルは、以下に示す式４の形式であり得る。
ｙ＝Ｋｘ＋Ｌｗ＋Ｍｚ＋Ｎ 式（４）
式中、ｙは不活性化ｐＨであり、ｘは１リットル当たりのグラム数（ｇ／Ｌ）で表した混合物のタンパク質濃度であり、ｚは混合物ｐＨであり、ｗは混合物の１キログラム当たりの酸のモル数（ｍｏｌ／ｋｇ）で表した酸添加量であり、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎは定数である。式４の定数Ｋは１グラム当たりリットルの単位を有し、定数Ｌは酸の１モル当たりの混合物のキログラム数の単位を有し、定数Ｍ及びＮは単位なしである。定数Ｋは、０Ｌ／ｇ以上０．０３Ｌ／ｇ以下、例えば、約０Ｌ／ｇ～約０．０３Ｌ／ｇ、約０．００１Ｌ／ｇ～約０．０３Ｌ／ｇ、約０Ｌ／ｇ～約０．０２５ｇ／Ｌ、または約０．００１ｇ／Ｌ～約０．０２５Ｌ／ｇなどであり得る。定数Ｌは、－８０ｋｇ／ｍｏｌ以上－６０ｋｇ／ｍｏｌ以下、例えば、約－７５ｋｇ／ｍｏｌ～約－６０ｋｇ／ｍｏｌ、約－８０ｋｇ／ｍｏｌ～－約６５ｋｇ／ｍｏｌ、または約－７５ｋｇ／ｍｏｌ～約－６５ｋｇｍｏｌなどであり得る。定数Ｍは、０以上２．０以下、例えば、約０～約２．０、約０．３～約２．０、約０～約１．７、または約０．３～約１．７など下であり得る。定数Ｎは、－１．０以上０以下の数、例えば、約－１．０～約０、約－１．０～約－０．１、または約－０．９～約－０．１などであり得る。

いくつかの実施形態において、酸の添加前の混合物のｐＨおよびタンパク質濃度を測定および／または記録することができる。混合物ｐＨ、混合物タンパク質濃度、および酸添加量に基づいて、確認モデルを用いて、酸性化された混合物の予測ｐＨを予め決定することができる。酸性化された混合物の実際のｐＨを測定し、記録し、および／または予測ｐＨと比較することができる。記録されたｐＨを予測ｐＨと比較することは、記録されたｐＨと予測ｐＨとの間の差（例えば、パーセント差）を計算することを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、記録されたｐＨと予測ｐＨとの差が閾値より大きい場合、補正措置が取られてもよい。閾値は、例えば、予測ｐＨから±０．０３ｐＨ、予測ｐＨから±０．０５ｐＨ、予測ｐＨから±０．０７ｐＨ、予測ｐＨから±０．０９ｐＨ、予測ｐＨから±０．１ｐＨ、予測ｐＨから±０．１５ｐＨ、または予測ｐＨから±０．２ｐＨであり得る。補正措置には、ｐＨ計の調整、混合物の組成の調整、プロセスの１つ以上の環境条件の調整、またはこれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。ｐＨメータの調整は、ｐＨメータを標準化すること、ｐＨメータを再較正すること、ｐＨプローブを洗浄、リセットおよび／または交換すること、参照電極溶液を調整すること、ｐＨメータの一部を交換すること、ｐＨプローブの位置を調整すること、および／またはｐＨメータの信号対雑音比を変更する他の行為を含み得る。混合物の組成を調整することは、混合物または上流組成物の任意の成分溶液を再配合すること、１つ以上のクロマトグラフィーまたは分離プロセスのプロセス条件または装置部品を変更すること、および／または混合物の材料組成を変更する他の行為を含み得る。プロセスの１つ以上の環境条件を調整することは、混合および／または均質化プロセスおよびシステムを調整すること、プロセスの温度を調整すること、プロセスの湿度を調整すること、プロセスの圧力を調整すること、またはこれらの組み合わせを含み得る。予測されるパラメータからの偏差（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）に基づくこのような調整は、ＰＡＴの一部として組み込むことができる。

上記の式および数学的モデルは、酸性不活性化プロトコルを開発するための方法の一部として作成され得る。酸性不活性化プロトコルを開発するための方法は、混合物（例えば溶出液）のプールを作製することを含み得、ここで、プールの各混合物は、タンパク質アフィニティーキャプチャプロセスにおいて精製された標的分子を含む。例えば、サンプルのプールを、タンパク質アフィニティークロマトグラフィーカラムの溶出液から収集することができる。この方法は、各サンプルのｐＨおよびタンパク質濃度（例えば、標的分子の濃度）を測定することをさらに含み得る。各サンプルのｐＨおよびタンパク質濃度を決定した後、各サンプルを滴定して、サンプルを不活性化ｐＨにするのに必要な酸の量を決定することができる。いくつかの実施形態において、不活性化ｐＨは、プールの各サンプルから複数のデータポイントの収集を可能にする、２回以上の滴定の繰り返しが行われ得る十分に広い範囲として定義され得る。他の実施形態では、各サンプルから単一のデータポイントのみを収集することができる。

いくつかの実施形態において、関係（ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）（例えば数学モデル）は、添加された酸の量、溶出液タンパク質濃度、混合物ｐＨ、および／または不活性化ｐＨの間で回帰され得る。この関係は、上述したように、式２または式３に従って回帰することができる。いくつかの実施形態において、酸性不活性化プロトコルを開発する方法は、確認モデルを回帰することをさらに含む。確認モデルは、上述した式４に従って回帰することができる。

図１は、本開示による、混合物中のウイルスを不活性化するための例示的なプロセス１００をフローチャート形式で示す。工程１０１に従って、第１のｐＨ（例えば、３．９より高い）の混合物をクロマトグラフィーカラムから溶出することができる。ステップ１０２に従って、混合物のタンパク質濃度（例えば標的分子濃度）を、例えば、紫外／可視光分光法または他の方法によって測定することができる。任意に、混合物の導電率および／またはｐＨを、例えば、電位差計または他の方法を用いて測定することができる。工程１０３に従って、混合物の導電率を調節するのに十分な量の一つ以上の塩を混合物に添加することができる。工程１０４に従って、混合物のｐＨを第２のｐＨ（例えば不活性化ｐＨ）に低下させるのに必要な酸の量を計算することができる。この計算は、混合物のタンパク質濃度、混合物のｐＨ、またはこれらの組み合わせに基づいて行うことができる。工程１０５に従って、酸の第１の部分を混合物に添加することができる。いくつかの実施形態において、酸の第１の部分は、計算された酸添加量に相当する酸のボーラスである。他の実施形態において、酸の第１の部分は、計算された酸添加量としての酸の体積または量の６８％～９９％であり得る。工程１０５に従って、任意に、第２の（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）酸を、混合物と酸の組み合わせが第２のｐＨ（例えば不活性化ｐＨ）以下になるように混合物に添加してもよい。工程１０６に従って、混合物と酸の組み合わせを、第２のｐＨ（例えば不活性化ｐＨ）で、不活性化間隔の間、保持し、溶出液中のウイルスを不活性化し得る。いくつかの実施形態において、

図２は、本開示による、混合物中のウイルスを不活性化するための例示的なプロセス２００をフローチャート形式で示す。工程２０１に従って、標的分子を含む混合物を、第１のｐＨ（例えば、約５．０以上約８．５以下）でクロマトグラフィーカラムに装填し得る。工程２０２に従って、第２のｐＨ（例えば、約３．９より高く約５．０以下）の溶出混合物（ｅｌｕｔｅｄ ｍｉｘｔｕｒｅ）をクロマトグラフィーカラムから溶出してもよい。工程２０３に従って、溶出混合物のタンパク質濃度（例えば標的分子濃度）を、例えば、紫外／可視光分光法によって測定し、および／または記録することができる。工程２０４に従って、任意に、溶出混合物のｐＨおよび／または導電率を測定してよい。ｐＨは、例えば電位差計を用いて測定し、および／または記録することができる。工程２０５に従って、混合物の導電率を調節するのに十分な量の一つ以上の塩を混合物に添加することができる。工程２０６に従って、酸を溶出混合物に添加して、溶出混合物と酸との組み合わせを形成し、その組み合わせが有効なウイルス不活性化を示すように構成することができる。さらに、その組み合わせは、第２のｐＨ以下のｐＨ（例えば、約３．８以下および約３．０以上）を有してもよい。工程２０７に従って、ｐＨ確認モデルを用いて、組み合わせの予測ｐＨが予め決定されてもよい。工程２０８に従って、組み合わせのｐＨを測定および／または記録することができる。工程２０９に従って、組み合わせの予測ｐＨと測定／記録されたｐＨとの差を計算することができる。工程２１０に従って、組み合わせの予測ｐＨと測定および／または記録されたｐＨとの間の計算された差に基づいて、補正措置がとられてもよい。

図３は、本開示による、酸性不活性化プロトコルを開発するための例示的なプロセス３００をフローチャート形式で示す。工程３０１に従って、溶出液サンプルのプールを作製することができ、ここで、溶出液サンプルのプールの各溶出液サンプルは、アフィニティーキャプチャープロセスで精製された標的分子を含む。工程３０２に従って、溶出液サンプルのプールの各溶出液サンプルのタンパク質濃度（例えば標的分子濃度）を、例えば、紫外／可視光分光法を用いて測定することができる。任意に、溶出液サンプルのプールの各溶出液サンプルのｐＨを、例えば電位差計を用いて測定してもよい。工程３０３に従って、各溶出液サンプルのｐＨを不活性化ｐＨに低下させるのに必要な酸の量を、溶出液サンプルのプールの各溶出液サンプルを滴定することによって決定することができる。工程３０４に従って、酸の添加量、溶出液タンパク質濃度、溶出液ｐＨ、及び／又は不活性化ｐＨの関係を回帰することができる。工程３０５に従って、必要に応じて、確認モデルを回帰してもよい。

図１～３はそれぞれ、特定の順序の工程を示しているが、実行される工程およびそれらが実行される順序は改変されてもよいことを理解されたい。さらに、工程（例えば、測定および／または記録工程の１つ以上）を、本明細書に開示された任意の方法から追加または除去することができる。さらに、図１～３の各々は、溶出液に関して工程を示しているが、工程は、標的分子を含有する任意の混合物に適用可能であることが理解されるべきである。

以下の実施例は、本質的に限定されることなく本開示を説明することを意図している。本開示は、前述の説明および以下の実施例と一致するさらなる態様および実施形態を含むことが理解される。

以下の実施例において、標的ポリペプチドは、標的ポリペプチド、宿主細胞タンパク質、ウイルス、および他の汚染物質、不純物、および成分を含む混合物から調製された。標的ポリペプチドを、懸濁培養で成長させたチャイニーズハムスター卵巣細胞で調製した。

例（ＥＸＡＭＰＬＥ）１
標的ポリペプチドをプロテインＡアフィニティーカラムから溶出し、混合物の複数のサンプルを得た。各混合物サンプルのタンパク質濃度は、紫外／可視分光法によって得られ、混合物の１リットル当たりのタンパク質のグラム数の単位で以下の表１に示される。さらに、各混合物サンプルのｐＨを測定し、表１に示す。

溶出液のプールは４０の溶出液サンプル（すなわち、４０の混合物サンプル）を含み、各サンプルをリン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）の０．２５Ｍ溶液を用いて不活性化ｐＨ３．３５～３．８６まで滴定し、酸添加量（例えば、混合物を不活性化ｐＨにするために添加する必要がある酸の量）を決定した。４０サンプルのうちの６サンプル（表１に示すサンプル１～６）について、滴定を複数回繰り返して複数のデータポイントを得た。例えば、サンプルＮｏ．１を不活性化ｐＨ３．７０にする混合物の１キログラム当たり３０．８９ｇの酸は１つのデータポイントであり、混合物の１キログラム当たり５．３５ｇの酸をさらに加えると、サンプルＮｏ．１を不活性化ｐＨ３．５９にする混合物のキログラム当たり３６．２４ｇの酸は別のデータポイントである。これらの滴定のためのデータを、酸添加量を混合物のキログラム当たりの酸のグラム数の単位および混合物のキログラム当たりの酸のモル数の単位で、以下の表１に示す。
表１－混合物滴定データ

例（ＥＸＡＭＰＬＥ）２
表１に示す滴定データを用いて、式２に従って、混合物タンパク質濃度、不活性化ｐＨ、および酸添加量の間の関係を回帰した。下記の回帰式（式５）は、決定係数（Ｒ^２）が０．８４であると決定された。
ｗ＝０．０００４５３２ｘ－０．０１１３５ｙ＋０．０４２１３ 式（５）

例（ＥＸＡＭＰＬＥ）３
さらに表１に示す滴定データを参照して、式３に従って、混合物タンパク質濃度、混合物ｐＨ、不活性化ｐＨ、および酸添加量の間の関係を回帰した。下記の回帰式（式６）は、決定係数（Ｒ^２）が０．９７であると決定された。予想外に、酸添加量は一般式２および３に示される蛋白質濃度、混合物ｐＨおよび不活性化ｐＨの間の関係と高度に相関した。
ｗ＝０．０００１９８６ｘ－０．０１１６２ｙ＋０．０１５１０ｚ－０．０１６９２
式（６）

例（ＥＸＡＭＰＬＥ）４
表１に示した滴定データを用いて、一般式４に従って確認モデルを回帰した。下記の回帰式（式７）は、決定係数（Ｒ^２）が０．９３であると決定された。また、予想外に、不活性化ｐＨはタンパク質濃度、混合物ｐＨおよび不活性化ｐＨの間の関係と高度に相関した。
y＝０．０１４８８ｘ－７１．６５ｗ＋１．０９４ｚ－０．６７２７ 式（７）

当業者は、本開示の基礎となる概念が、本開示のいくつかの目的を実施するための他の方法およびシステムを設計するための基礎として容易に使用できることを理解するであろう。さらに、本開示の態様は、特定のプロセスにおける特定の工程（例えば、混合物中のウイルス不活性化）に関して記載されているが、当業者は、本明細書に開示されたシステムおよび方法は、他のコンテキスト（例えば、処方された薬物を製造する工程において、クロマトグラフィー工程の前又は溶出液と他の成分との組み合わせの後など、ポリペプチドを含む他の混合物中でのウイルス不活性化）においても適用可能であることを理解するであろう。したがって、特許請求の範囲は、前述の説明によって限定されるものとはみなされない。

Claims (26)

1. 混合物中のウイルスを不活性化するための方法であって、
   クロマトグラフィーカラムから、３．９より高く８．５未満のｐＨで前記混合物を溶出させること；
   前記混合物のタンパク質濃度を測定すること；
   混合物のタンパク質濃度に基づいて、前記混合物のｐＨを不活性化ｐＨに低下させるために必要な酸の量を計算すること；
   酸の第１の部分であって、前記混合物のｐＨを不活性化ｐＨに低下させるために必要な酸の量の６８％～９９％である、酸の第１の部分を、前記混合物に添加すること；および
   前記混合物と酸の組み合わせのｐＨが前記不活性化ｐＨ以下になるように、前記混合物に酸の追加部分を加えることを含む、方法。
2. 前記組み合わせを、前記不活性化ｐＨで不活性化時間の間保持すること；および
   前記不活性化時間の後で、前記混合物に前記酸の第１の部分を加えた後１時間未満で、前記組み合わせをｐＨが４．５以上８．５以下になるまで滴定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記混合物に前記酸の第１の部分を加える前に、前記混合物のｐＨを測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記混合物のｐＨを前記不活性化ｐＨに低下させるために必要な酸の量が、下記式に従って計算される、請求項３に記載の方法。
   ｗ＝Ａｘ＋Ｂｙ＋Ｃ
   （式中、ｗは混合物の１キログラム当たりの酸のモル数で表した酸の量であり、ｘは１リットル当たりのグラム数で表した前記混合物の前記タンパク質濃度であり、ｙは前記不活性化ｐＨであり、Ａ、ＢおよびＣは定数である。）
5. Ａが、約０．０００３Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ以上約０．０００６Ｌ・ｍｏｌ／ｇ・ｋｇ以下であり；
   Ｂが、約－０．１ｍｏｌ／ｋｇ以上約０．０ｍｏｌ／ｋｇ以下であり；および
   Ｃが、約０．０２以上約０．１以下である、
   請求項４記載の方法。
6. 前記混合物のタンパク質濃度および前記混合物のｐＨに基づいて、前記混合物のｐＨを前記不活性化ｐＨに低下させるために必要な酸の量が計算される、請求項３に記載の方法。
7. 前記混合物のｐＨを前記不活性化ｐＨに低下させるために必要な酸の量が、前記混合物の１キログラム当たり約０．００２モル～約０．０２５モルである、請求項１に記載の方法。
8. 前記不活性化ｐＨが約３．８以下約３．０以上である、請求項１に記載の方法。
9. 前記混合物の導電率を測定すること；および
   前記混合物の導電率を調節するために十分な量の１つ以上の塩を前記混合物に加えることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記クロマトグラフィーカラムが、タンパク質アフィニティーキャプチャプロセスを実行するように構成される、請求項１に記載の方法。
11. 前記酸の第１の部分が添加された後、かつ前記酸の追加の部分が添加される前に、前記混合物のｐＨが約３．５～約３．７５である、請求項１に記載の方法。
12. 混合物中のウイルスを不活性化するための方法であって、
    標的分子を含む混合物であって、ｐＨが約５．０以上約８．５以下である混合物を、クロマトグラフィーカラムに装填すること；
    前記クロマトグラフィーカラムから、前記標的分子を含む溶出混合物であって、約３．９より高く約５．０以下のｐＨを有する溶出混合物を溶出させること；
    前記溶出混合物にある量の酸を加え、前記溶出混合物と酸との組み合わせであって、効果的なウイルス不活性化を示すように構成され、約３．８以下かつ約３．０以上のｐＨを有する組み合せを形成すること；
    ｐＨ確認モデルを用いて前記組み合わせの予測ｐＨを予め決定すること；
    前記組み合わせのｐＨを記録すること；
    前記予測ｐＨと前記記録されたｐＨとの差を計算すること；および
    前記予測ｐＨと前記記録されたｐＨとの計算された差に基づいて、補正措置をとることを含む、方法。
13. 前記予測ｐＨと前記記録されたｐＨとの差が約０．１５以上である場合に、前記補正措置がとられる、請求項１２に記載の方法。
14. 前記補正措置が、ｐＨ計を調整すること、前記混合物の組成を調整すること、一つ以上の環境条件を調整すること、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１２に記載の方法。
15. 前記組み合わせが、約３．８以下約３．０以上のｐＨで約３０分間保持される、請求項１２に記載の方法。
16. 前記混合物に前記量の酸を加えた後１時間未満で、前記組み合わせを約４．５以上約８．５以下のｐＨまで滴定することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
17. 前記混合物の導電率を測定すること；および
    前記混合物の導電率を調節するために十分な量の１つ以上の塩を前記混合物に加えることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
18. 前記混合物に前記量の酸を加える前に前記混合物のｐＨを測定すること；および
    前記混合物のタンパク質濃度を測定することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
19. 前記ｐＨ確認モデルは、下記式を含む、請求項１８に記載の方法。
    ｙ＝Ｋｘ＋Ｌｗ＋Ｍｚ＋Ｎ
    （式中、ｙは、前記組み合わせのｐＨであり、ｘは、１リットル当たりのグラム数で表した前記混合物のタンパク質濃度であり、ｚは、前記混合物に前記量の酸を加える前の前記混合物のｐＨであり、ｗは、溶出液の１キログラム当たりの酸のモル数で表した前記混合物に加えられた酸の量であり、Ｋ、Ｌ、ＭおよびＮは定数である。）
20. 混合物の酸性不活性化プロトコルを開発するための方法であって、
    前記混合物の溶出液サンプルのプールであって、前記溶出液サンプルのプールの各溶出液サンプルは、タンパク質アフィニティーキャプチャプロセスで精製された標的分子を含有する、溶出液サンプルのプールを作製すること；
    各溶出液サンプルのｐＨおよびタンパク質濃度を測定すること；
    前記溶出液サンプルのプールの各溶出液サンプルを滴定して各溶出液サンプルを不活性化ｐＨにするために必要な酸の量を決定すること；
    前記溶出液サンプルのプールの各溶出液サンプルを使用してデータポイントを決定すること；および
    前記データポイントを用いて、前記混合物を不活性化ｐＨにするために必要な酸の量、前記混合物のタンパク質濃度、前記混合物のｐＨ、および前記不活性化ｐＨの間の関係を回帰することを含む、方法。
21. 確認モデルを回帰することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記溶出液のプールの少なくとも一つの溶出液を用いて、複数のデータポイントを決定することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
23. 混合物中のウイルスを不活性化するための方法であって、
    前記混合物のタンパク質濃度を測定すること；
    前記混合物のタンパク質濃度に基づいて、前記混合物のｐＨを不活性化ｐＨに低下させるために必要な酸の量を計算すること；および
    前記混合物のｐＨを不活性化ｐＨにするために必要な酸の量を混合物に加えることを含む、方法。
24. ｐＨ確認モデルを用いて、前記酸が前記混合物に添加された後に、前記混合物の予測ｐＨを予め決定することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
25. 酸と前記混合物の組み合わせのｐＨを記録すること；
    前記予測ｐＨと前記記録されたｐＨとの差を計算すること；および
    前記予測ｐＨと前記記録されたｐＨとの間の計算された差に基づいて、補正措置をとることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記量の酸を加える前に：
    前記混合物の導電率を測定すること；および
    前記混合物の導電率を調節するために十分な量の１つ以上の塩を前記混合物に加えることをさらに含む、請求項２３に記載の方法。

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