KR20190057083A

KR20190057083A - 공정 불순물에 대한 결합이 감소된 항체

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Publication number: KR20190057083A
Application number: KR1020197010590A
Authority: KR
Inventors: 헬라 보스틸스; 슈구이 첸; 카옐레잇 파로우; 리차드 쿠시아-트란; 윌리엄 존 케네스 레위스; 앤드류 에스. 톰슨; 마크 우덴
Original assignee: 글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 디벨로프먼트 리미티드
Priority date: 2016-10-06
Filing date: 2017-10-03
Publication date: 2019-05-27
Also published as: TW201829453A; US20190225708A1; BR112019004938A2; CA3037264A1; RU2771330C2; SG11201901468SA; RU2019106819A3; MX2019003890A; JP7471819B2; CN109790216A; US11254753B2; IL265748A; RU2019106819A; AU2017338291A1; JP2019532957A; WO2018065389A1; EP3523329A1

Abstract

본 발명은 변이 항체 및 공정 불순물로의 결합 수준이 감소된 상기 항체를 생성하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 중쇄 불변 영역에서 Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 영역의 아미노산 중 임의의 하나의 아미노산 또는 아미노산의 조합에서 변형된 변이 IgG4 항체로서, 비변형된 IgG4 항체와 비교하여 숙주 세포 단백질(HCP)로의 감소된 결합 수준을 갖는 변이 IgG4 항체를 기술한다. 본 발명은 또한, 상기 변이 IgG4 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

공정 불순물에 대한 결합이 감소된 항체

본 발명은 비-특정 및/또는 특정 상호작용을 통해 숙주 세포 단백질과 같은 제조 공정 불순물과의 결합 능력이 감소된 신규한 항체에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 신규한 면역글로불린으로서, 항체의 아미노산 서열에 대한 변형을 통해 이러한 제조 공정 불순물에 결합하는 능력이 감소된 신규한 면역글로불린에 관한 것이다.

모노클로날 항체(mAb)는 광범위한 질병의 치료학적 처리에 사용되는 생물약제이다. 이러한 복잡한 재조합 단백질의 제조는 전형적으로 생물학적 숙주 시스템의 사용을 필요로 하며, 이러한 숙주 시스템은 유전 공학을 통해 적절한 활성 형태로 생성물을 발현시킬 수 있다. 이와 관련하여, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유동물 세포주는 수많은 mAb 생성물의 산업적 생산을 위한 숙주로서의 이들의 용도로 어디에나 이용되고 있는데, 이들 세포주는 이들 단백질을 폴딩하고, 조립하며, 이러한 단백질에 대한 적절한 번역-후 번형을 가해 인간 시스템과의 이들의 양립성을 보장할 수 있기 때문이다.

결과적으로 이에 의해, mAb의 생성을 위한 세포 기반 시스템의 사용에서 주요 과제는 다양한 다른 복잡한 불순물로부터 생성물 단백질을 분리시킬 필요가 있다는 것이다. 이것들은 공정-관련 불순물로 불리며, 숙주 유기체에 내인성이거나 이러한 세포(예컨대, 바이러스-유사-단백질)와 관련된 다양한 범위의 단백질을 포함한다. 이러한 소위 숙주 세포 단백질(HCP)은 생물약제학적 약물의 안정성 및 안전성 둘 모두에 부정적인 영향을 미칠 가능성을 갖는 광범위한 부류의 분자를 나타낸다. 일부 HCP는 생성물 단백질의 안정성에 불리한 영향을 미칠 수 있는 단백질 분해 활성을 지닐 수 있다. 다른 HCP는 최종 약물 생성물에 존재하는 경우 환자에서 면역원성 반응을 일으킬 가능성을 갖는다. 이러한 이유로, HCP의 제거는 모든 생물약제학적 제품의 제조에 있어서 주요 난제를 나타낸다.

숙주 세포 단백질의 제거는 전형적으로 직교 분리 화학을 이용한 다중 크로마토그래픽 정제 기법의 사용을 통해 달성된다. 전형적으로 이러한 접근 방식이 효과적이지만, 생성물 mAb가 HCP 집단을 포함하는 단백질 중 하나 이상에 대한 일부 상호작용 또는 친화성을 나타내는 경우 문제가 발생하여 생성물과 이들 HCP의 공동-정제를 발생시킨다. 이러한 경우, 표준 접근 방식은 이러한 상호작용을 방해하기 위해 물리화학적 관점에서 설계된 적절한 크로마토그래피 칼럼 워시 전략을 개발하고자 하는 것이다. HCP 상호작용에 대한 성향은 mAb 분자 간에 상이하므로, 일반적으로, 항체의 초가변 상보성 결정 영역(CDR)이 이러한 상호작용의 주요 원인이 되는 것으로 여겨진다. 그러나, 이러한 영역 내에서 상호작용을 증가시키는 정확한 서열 및 구조적 모티프는 설명되고 있지 않다.

G, A, M, D 및 E로 표기되는 면역글로불린(Ig)의 5개 부류 중 mAb 생물약제의 대다수는 면역글로불린 G(IgG) 부류에 속하며, 이 중 1부터 4까지의 4개 하위부류가 존재한다.

최근에는 HCP 예컨대, 포스포리파제 B 도메인 함유 단백질 2(PLBD2)로서 또한 공지된 추정 포스포리파제 B-유사 2(PLBL2)가 특정 면역글로불린 변이체와의 증가된 공동-정제 성향이 갖는 것으로 나타났다. 단지 일부 IgG 아이소형과 공동-정제되는 성향에 있어서 이러한 차이에 대한 정확한 이유는 알려져 있지 않으나, 이전의 연구들은 IgG과 PLBL2 간의 상호작용이 CDR에 의해 주로 구동되며, IgG1 하위부류와 구별되게 하는 IgG4 불변 영역의 특징부에 의해 촉진된다고 단정하였다(Tran et al. (2016) J. Chromatogr. 1438:31-38). 그러나, 이러한 차이의 정확한 특성은 여전히 알려져 있지 않다. PLBL2와 같은 공정 불순물은 환자에서 면역 반응을 부적합하게 할 가능성을 갖는다. 게다가, PLBL2와 같은 리파제는 제형 부형제의 분해에 대한 잠재적인 원인 제제로서 확인되었다(Dixit et al., (2016) J. Pharm. Sci ., 105(5):1657-66 및 US2016/0101181). 이러한 부형제는 최종 제형에서 생성물 단백질의 안정화에 필요한데, 이들의 분해는 약물의 반감기 및 따라서, 잠재적인 안전성을 저하시킬 것이다. 이러한 이유로, 최종 약물 생성물 중의 공정 불순물 및 HCP 예컨대, PLBL2의 존재는 매우 바람직하지 않다.

특정 면역글로불린이 PLBL2와 같은 HCP와 상호작용하는 성향의 증가는 충분하게 안전한 최종 약물 생성물을 보장하기 위해 전문화된 정제 계획의 개발을 필요로 하였다. 그러나, 이러한 접근방식은 효과적이지만, 관련 제조 비용을 증가시킬 뿐만 아니라 공정 유효성 확인에 대한 부담을 증가시키며, 정제 공정이 공정 불순물을 허용가능한 수준으로 강력하게 제거할 수 있음을 보여줄 필요성 때문에 이상적이지 않다. 그 후, 이는 또한 PLBL2가 기존 기법을 통해 검출하기 어려워 종종 맞춤 면역검정의 사용을 필요로 하는 것으로 나타났기 때문에, 분석 요구사항의 증가에 있어서 영향을 미친다(WO2015/038884).

따라서, 치료학적 면역글로불린의 최종 약물 생성물 중 HCP의 수준을 더욱 효과적으로 그리고, 비용 효과적으로 감소시킬 필요성이 남아있다.

발명의 개요

본 발명의 제1 양태에 따르면, 중쇄 불변 영역에서 Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 영역의 아미노산 중 임의의 하나의 아미노산 또는 아미노산의 조합에서 변형된 변이 IgG4 항체로서, 비변형된 IgG4 항체와 비교하여 숙주 세포 단백질(HCP)에 대한 감소된 결합 수준을 갖는 변이 IgG4 항체가 제공된다.

본 발명의 추가의 양태에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 변이 IgG4 항체를 인코딩하는 세포주가 제공된다.

본 발명의 추가의 양태에 따르면, 하기 단계를 포함하여 IgG 항체를 변형시켜 공정 불순물에 대한 결합을 감소시키는 방법이 제공된다:

a) 공정 불순물의 결합에 관련된 적어도 하나의 아미노산을 확인하는 단계; 및

b) 공정 불순물과의 결합에 관련된 것으로 확인된 아미노산을 다른 아미노산으로 치환함으로써 IgG 항체의 변이체를 생성시키는 단계.

본 발명의 추가의 양태에 따르면, 중쇄 불변 영역에서 Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 영역의 아미노산 중 임의의 하나의 아미노산 또는 아미노산의 조합에서 항체 서열을 변형시키는 것을 포함하여, 숙주 세포 단백질(HCP)에 대한 결합이 감소된 IgG4 항체를 생성하는 방법이 제공된다.

본 발명의 추가의 양태에 따르면, 본원에 정의된 바와 같이 변이 IgG4 항체를 포함하는 조성물이 제공된다.

도 1: 최종 벌크 mAb의 HCP ELISA 희석 직선성 . 상이한 하위유형의 인간화된 IgG 생성물의 최종 벌크 샘플을 HCP ELISA에 의해 분석하여 검정에서 희석 비-직선성에 대해 평가하였다. 조절된 HCP 값은 측정된 HCP 농도에 희석 배수를 곱한 후 생성물 농도로 나눔으로써 각 희석에 대해 계산된다. 각 샘플 희석에 대한 조절된 HCP 값은 로그-로그 스케일에서 희석 배수의 함수로서 플롯팅된다. 조절된 HCP 값이 희석 배수가 증가함에 따라 증가하는 경우 비-직선성이 관찰된다. 단지 mAb7만이 HCP ELISA에서 비-직선성을 나타낸다.
도 2a-b: 다양한 mAb의 항- PLBL2 웨스턴 블롯 . 인간화된 IgG 생성물의 최종 벌크 샘플을 웨스턴 블롯에 의해 분석하여 PLBL2의 존재를 검출하였다. (a) 샘플의 동일한 로딩을 입증하기 위한 SyproRUBY 염색된 겔. (b) 항-PLBL2 항체로 프로빙된 웨스턴 블롯. PLBL2는 이미지의 오른쪽에 있는 화살표로 나타낸 바와 같이 약 60 kDa의 mAb7 샘플에서만 검출된다.
도 3a-c: SPR에 의한 다양한 mAb에 대한 PLBL2의 결합. 다양한 mAb에 대한 PLBL2 결합의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 센소그램. (a) 센소그램은 고정화된 항-인간 IgG Fc 모노클로날 항체에 의한 모든 7개 mAb의 유사한 포획 수준을 입증하며, mAb 주입은 ~-200초에서 화살표로 나타내며, PLBL2 주입은 0 초에서 화살표로 나타낸다. 확대된 센소그램은 mAb1, mAb3, mAb5 및 mAb7, (b) 및 mAb2, mAb4 및 mAb6 (c)로부터의 PLBL2 결합 및 분리를 보여주며, 이는 PLBL2가 IgG4 분자에 선택적으로 결합함을 입증한다.
도 4a-b: mAb7의 PLBL2 결합 친화성. mAb7의 PLBL2 결합 친화성을 계산하기 위한 표면 플라즈몬 공명 결합 실험. (a) 센소그램은 1.25 μM에서 80 μM로의 PLBL2 농도 증가가 mAb7에의 결합 증가와 관련됨을 보여준다. (b) PLBL2 농도의 함수로서 안정적 상태 결합 반응의 플롯. K_D를 계산하는데 사용되는 1:1 결합 모델.
도 5: mAb3 , mAb6A 및 mAb6B에 대한 PLBL2의 결합. 2개의 상이한 숙주 세포 발현 시스템에서 발현되는 mAb3 및 mAb6에의 PLBL2 결합의 표면 플라즈몬 공명 센소그램. mAb6A는 CHO K1a 숙주 시스템을 사용하여 발현된 반면, mAb6B는 HEK 293 숙주 발현 시스템을 사용하여 발현되었다. 결과는 두 IgG4 분자(mAb6A 및 mAb6B) 모두가 상이한 세포주에서 생성됨에도 불구하고 PLBL2와 유사하게 상호작용함을 보여준다. 한편, IgG2 분자(mAb3)는 상호작용하지 않는다.
도 6a-c: mAb3 , mAb6A 및 mAb6B에 대한 PLBL2 결합 친화성. (a) mAb3, (b) mAb6A 및 (c) mAb6B에 대한 바이오 층 간섭계(BLI) 실험의 결과는 PLBL2에 대한 이들 분자의 결합 친화성의 핏팅을 보여준다. K_D 결과는 1:1 결합 모델로의 로컬 핏을 사용하여 계산되었다. 상호작용이 없었기 때문에 mAb3에 있어서 친화성 데이터가 획득될 수 없었다는 점이 주지된다.
도 7: mAb7 단독 및 PLBL2 결합 샘플의 HDX 차등 플롯. 중수소 라벨링은 0.5분, 5분, 60분, 120분, 180분 및 240분에 측정되었다. 수직 스틱은 6개의 라벨링 시점으로부터 각 펩티드의 총 HDX 차이를 나타낸다. 용매 노출이 현저하게 감소된 서열 영역은 K218-F256(중쇄)으로 표시된다.
도 8: 상이한 mAb의 서열 정렬. mAb 1-7의 하위 CH1, 힌지 및 상위 CH2 도메인의 아미노산 서열은 인간 생식계열 IgG1, IgG2 및 IgG4의 상응하는 위치에서 아미노산에 대해 정렬되었다. 정렬은 상이한 mAb 분자의 PLBL2 결합과 비교하여 실험에 기초한 가능한 PLBL2 결합 부위인 IgG4의 힌지 영역에 국한되었다. 서열 간의 차이는 회색으로 강조된다. 관심 아미노산 잔기는 PLBL2가 결합하는 것으로 관찰된 IgG4 분자에서 보존되며, PLBL2가 결합하지 않는 것으로 관찰된 다른 IgG 하위유형에서 보존되지 않는(즉, 상이한 잔기) 것들이다. 10개의 이러한 아미노산이 확인되었으며, 이는 블랙 박스로 윤곽을 그렸다.
도 9: 돌연변이유발을 통한 상이한 mAb의 서열 정렬. 총 7개의 상이한 힌지 변형된 IgG4 변이체(mAb5-1B 내지 7B)를 모(parent) IgG4(mAb5)의 돌연변이유발을 통해 생성시켰다. 이러한 정렬은 IgG4 변이체의 아미노산 서열을 모 IgG4의 아미노산 서열은 물론 2개의 다른 비-힌지 변형된 IgG4(mAb6 및 mAb7), 및 IgG2(mAb3) 및 IgG1(mAb8)과 비교한다. 접미사 "A" 또는 "B"는 항체가 CHO (a) 또는 HEK (b) 포유동물 숙주 세포를 통해 발현되었는지 여부를 나타낸다. 아미노산 서열의 차이는 회색으로 강조된다. 그 후, 회색 윤곽의 박스는 PLBL2 결합에 영향을 미치는 역할을 담당하는 것으로 간주되었던 아미노산 잔기를 강조한다. IgG4 변이체에서 힌지 서열의 돌연변이는 검정색으로 강조된다.
도 10: IgG2 , IgG4 및 변이 IgG4 분자와 PLBL2의 상호작용. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 실험의 결과는 비변형된 모 IgG4 (mAb5B) 대비 힌지 변형된 IgG4 변이체(mAb5-1B 내지 7B)에의 PLBL2의 결합을 평가한다. IgG1 (mAb8A), IgG2 (mAb3B) 및 IgG4 (mAb6B 및 mAb7A)를 포함하는 여러 다른 mAb는 추가의 대조군으로서 분석에 포함되었다. 접미사 "A" 또는 "B"는 항체가 CHO (a) 또는 HEK (b) 포유동물 숙주 세포를 통해 발현되었는지 여부를 나타낸다.

발명의 상세한 설명

이러한 본 발명은 PLBL2를 포함하는 HCP와 같은 공정 불순물과의 감소된 상호작용을 갖는 항체에 관한 것이다. 특정 위치의 잔기에서 아미노산의 (예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실에 의한) 변형은 특정 항체가 PLBL2와 같은 HCP에 결합하는 능력을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 상호작용에 대한 이러한 감소된 성향은 PLBL2와 같은 공정 불순물의 공동-정제 수준을 감소시키며, 이는 이러한 공정 관련 불순물을 제거하는 것을 목적으로 하는 특정 정제 전략의 필요성을 제거한다. 실제로, 예를 들어, 이러한 아미노산 잔기 변화를 포함하는 IgG4 분자에 대한 PLBL2 결합 수준은 PLBL2 공동-정제가 문제가 되는 것으로 밝혀지지 않은 것과 일치한다. 이는 결국, 제조 공정의 효율성을 높이고, 관련 비용을 줄이며, 과도한 제품 시험의 필요성을 완화하며, 궁극적으로 환자의 안전을 보장하는데 도움이 된다. 이와 더불어, PLBL2와 같은 리파제는 최종 제형에서 생성물 단백질(재조합 항체)의 안정화에 필요한 폴리소르베이트 80과 같은 제형 부형제의 분해에 대한 잠재적 원인 물질로 확인되었다. PLBL2의 결합을 감소시키면 최종 제형화된 약물에서 이러한 HCP의 잠재적 수준을 최소화할 것이며, 이에 따라 생성물(재조합 항체)의 반감기를 최대화시키며, 이는 비용을 추가로 절감시키고 안전을 보장할 것이다.

IgG4의 이펙터 기능

IgG4는 IgG 아이소형 IgG1, IgG2 및 IgG3과 중쇄 불변 영역에서 95% 초과의 서열 상동성을 공유한다. IgG4는 IgG1과 비교하여 활성화 Fc 감마 수용체, FcγRIIa 및 FcγRIIIa에 대해 낮은 결합 친화성을 갖는다. IgG4는 IgG1과 비교할 경우, 고-친화성 FcγRI에 대한 약함 내지 중간의 결합 친화성을 갖는다. IgG4는 IgG1과 유사한, 억제 FcγRIIb에 대한 결합 친화성을 유지한다. IgG4는 또한 IgG1과 유사한 방식으로 FcRn에 결합한다. IgG4는 C1q 단백질 복합물에 대한 결합이 없거나 무시할 정도의 결합을 보여주며, 고전적인 보완 경로를 활성화시킬 수 없어 감소된 CDC 활성을 갖는다. IgG4는 감소된 ADCC 활성을 갖거나 ADCC 활성을 갖지 않는다. 이펙터 결합에서 이러한 감소는 이펙터 기능이 불필요하거나 바람직하지 않은 재조합 항체에 사용하기 위한 IgG4 중쇄 불변 도메인의 선택으로 이어질 수 있다.

코어 IgG4 힌지는 서열 CPSC (SEQ ID NO: 19)를 포함하는 반면, 코어 IgG1 힌지는 CPPC (SEQ ID NO: 20)를 포함하며, 이는 감소에 덜 민감하다. IgG4에서 S241(Kabat)은 사슬내 고리화된 디설파이드의 형성을 가능하게 하는 더욱 유연한 힌지를 발생시키며, '반쪽-항체'의 출현으로 이어지며, 이는 IgG4 Fab 암 교체로서 일반적으로 공지된 상이한 항체로부터의 비-공유적으로 연결된 중쇄를 함유한다. IgG4의 코어 힌지는 IgG1에서와 같이 S241을 프롤린(즉, S241P)으로 변형시킴으로써 안정화될 수 있다.

많은 치료학적 IgG4 항체는 S241P 치환을 포함하는 힌지-조작된 영역을 갖는다. IgG4-S241P 단일 치환은 L248E 변이체의 부재하에 가능하여 정상적인 FcγRI 결합을 유지한다. IgG4 L248E 변이체는 IgG1 대비 FcγRI에 대한 IgG4-PE의 결합 친화성을 감소시키며, IgG4 야생형보다 FcγRI에 대해 약 20배 더 약한 친화성을 갖는다.

IgG4 서열 변형

본 발명자들은 비제한적으로 PLBL2를 포함하는 HCP와 같은 공정 불순물에 대한 상기 분자의 결합 능력과 IgG 분자의 보존 영역 사이의 예상치 못한 관련성을 확인하였다. 특히, 본 발명자들은 IgG4 하위부류의 항체의 고도로 보존된 힌지 영역 및 주변 서열에서 주요 아미노산 잔기를 확인하였으며, 이는 PLBL2와 같은 HCP에의 이들의 항체의 결합을 유발하는 원인이 된다. 이러한 아미노산 잔기가 변형되는 경우, 생성된 변형된 IgG4 분자는 상기 언급된 변형(들)이 없는 모 IgG4 분자와 비교하여, PLBL2와 같은 HCP에 결합하는 능력이 감소됨을 보이는 반면, 상기 변형(들) 없이, 동일한 IgG4 이펙터 기능(예를 들어, IgG4 분자의 FcRn 수용체 결합 행동)을 유지한다. 게다가, 변형된 IgG4 분자는 상기 변형(들)이 없는 IgG4의 생물물리적 특성 예컨대, 안정성, 전단 거동을 적어도 유지시킨다(또는 강화시킨다).

따라서, 본 발명의 제1 양태에 따르면, 중쇄 불변 영역에서 Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 영역의 아미노산 중 임의의 하나의 아미노산 또는 아미노산의 조합에서 변형된 변이 IgG4 항체로서, 비변형된 IgG4 항체와 비교하여 숙주 세포 단백질(HCP)로의 감소된 결합 수준을 갖는 변이 IgG4 항체가 제공된다.

일 구체예에서, 하나의 아미노산 또는 아미노산의 조합은 Kabat 잔기 203번과 243번 사이에 존재한다. 추가의 구체예에서, 하나의 아미노산 또는 아미노산의 조합은 Kabat 잔기 222번과 243번 사이에 존재한다. 대안적 구체예에서, 하나의 아미노산 또는 아미노산의 조합은 Kabat 잔기 222번과 256번 사이에 존재한다.

일 구체예에서, 하나의 아미노산 또는 아미노산의 조합은 (i) Kabat 잔기 226번과 243번 사이의 힌지 영역의 하나 이상의 아미노산; 및/또는 (ii) Kabat 잔기 203번; 및/또는 (iii) Kabat 잔기 222번으로 구성된 군으로부터 선택된다.

일 구체예에서, 비변형된 IgG4 항체는 ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 21) 또는 ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 22) (즉, Kabat 위치 226-243)의 힌지 영역 서열을 갖는다.

일 구체예에서, 힌지 영역은 Kabat 잔기 203번과 256번 사이에 존재한다. 일 구체예에서, 힌지 영역은 Kabat 잔기 226번과 243번 사이에 존재한다. 추가의 구체예에서, 힌지 영역은 Kabat 잔기 226번과 238번 사이에 존재한다. 대안적 구체예에서, 힌지 영역은 Kabat 잔기 234번과 250번 사이에 존재한다.

일 구체예에서, 변이체 IgG4 항체는 서열 CPPC(SEQ ID NO: 20) (Kabat 잔기 239번 내지 242번)를 포함한다. 이는 "코어 힌지"로서 공지되어 있다. 대안적 구체예에서, 변이 IgG4 항체는 서열 CPSC(SEQ ID NO: 19) (Kabat 잔기 239번 내지 242번)를 포함한다.

일 구체예에서, 변형은 Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 영역에서 아미노산 중 임의의 하나의 아미노산 또는 아미노산의 조합의 결실을 포함한다.

일 구체예에서, 변형은 Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 영역에서 하나 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다.

일 구체예에서, 변형은 Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 영역에서 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다.

중쇄의 힌지 영역에 존재하거나 그 근처에 존재하는 주요 IgG4 아미노산 잔기는 197번 위치의 세린(S197), 198번 위치의 류신(L198), 203번 위치의 리신(K203), 207번 위치의 트레오닌(T207), 211번 위치의 아스파르테이트(D211), 222번 위치의 아르기닌(R222), 226번 위치의 글루타메이트(E226), 227번 위치의 세린(S227), 229번 위치의 티로신(Y229), 230번 위치의 글리신(G230), 237번 위치의 프롤린(P237), 238번 위치의 프롤린(P238), 246번 위치의 글루타메이트(E246), 247번 위치의 페닐알라닌(F247), 249번 위치의 글리신(G249), 250번 위치의 글리신(G250) 및 251번 위치의 프롤린(P251)이다. 관심 서열은 도 8 및 9에 도시되어 있다.

주요 IgG4 아미노산 잔기는 203번 위치의 리신(K203), 222번 위치의 아르기닌(R222), 226번 위치의 글루타메이트(E226), 227번 위치의 세린(S227), 229번 위치의 티로신(Y229), 230번 위치의 글리신(G230), 237번 위치의 프롤린(P237) 및 238번 위치의 프롤린(P238)이다. IgG4 힌지 영역의 변형은 이들 위치 주위의 하나 이상의 아미노산을 치환하여 PLBL2와 같은 HCP에 대한 감소된 결합 능력을 갖는 변형된 IgG4 분자를 발생시키는 것을 포함할 수 있다.

또한, IgG4 힌지 영역의 변형은 229번 위치의 티로신(Y229) 및/또는 230번 위치의 글리신(G230)을 제거하는 것을 포함할 수 있으며, 특정 구체예에서, 이러한 제거는 적어도 하나의 아미노산 치환 또는 사전 열거된 위치 중 하나에서의 추가의 제거와 조합되어, 모 IgG4 항체와 비교하여 HCP, 예컨대, PLBL2에 대한 감소된 결합 능력을 갖는 변이 IgG4 항체를 발생시킨다.

또 다른 구체예에서, IgG4 힌지 영역의 변형은 적어도 하나의 아미노산 치환 또는 237번 및 238번 위치(P237 및 P238)에서 프롤린 잔기의 추가 제거와 조합된, 229번 위치의 티로신(Y229) 및/또는 230번 위치의 글리신(G230) 제거를 포함하여, 모 IgG4 항체와 비교하여 HCP, 예컨대, PLBL2에 대한 감소된 결합 능력을 갖는 변이 IgG4 항체를 발생시키는 것을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 변형은 YGPP (SEQ ID NO: 23) (Kabat 잔기 229번 내지 238번)의 SCDKTHT (SEQ ID NO: 24), 또는 CCVE (SEQ ID NO: 25)로의 치환을 포함한다.

일 구체예에서, 변형은 IgG1, IgG2 및/또는 IgG3 항체 생식계열 서열에서 동등한 아미노산 서열에 대한 치환을 포함한다. 추가의 구체예에서, IgG1, IgG2 및/또는 IgG3 항체 생식계열 서열은 인간이다. IgG 항체 생식계열 서열은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 203번 및 256번을 포함하는 203번과 256번 사이의 위치의 IgG1 생식계열 서열이 도 8에 SEQ ID NO: 8로서 기재되어 있다. 203번 및 256번을 포함하는 203번과 256번 사이의 위치의 IgG2 생식계열 서열은 도 8에 SEQ ID NO: 9에 기재되어 있다.

일 구체예에서, IgG4 힌지 영역의 변형은 주요 아미노산 잔기 203번 위치의 리신(K203), 222번 위치의 아르기닌(R222), 226번 위치의 글루타메이트(E226), 227번 위치의 세린(S227), 229번 위치의 티로신(Y229), 230번 위치의 글리신(G230), 237번 위치의 프롤린(P237) 및 238번 위치의 프롤린(P238) 중 하나 이상을 대안적 아이소형의 인간 항체의 생식계열 서열로부터의 상응하는 위치의 아미노산 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 대안적 아이소형은 IgG1, IgG2 또는 IgG3일 수 있다. 하나 초과의 치환이 이루어지는 이러한 구체예에서, 치환은 반드시 단지 하나의 대안적 IgG 아이소형에 기초하여 선택될 필요는 없으나, 대신에 하나 초과의 대안적 인간 항체 아이소형으로부터의 잔기의 조합일 수 있다. 따라서, 이러한 구체예의 변이 IgG4는 예견할 수 있게도, 이들 주요 위치에서 IgG1 생식계열 서열 및 IgG2 생식계열 서열, 또는 IgG1 생식계열 서열 및 IgG3 생식계열 서열, 또는 IgG2 생식계열 서열 및 IgG3 생식계열 서열, 또는 IgG1, IgG2 및 IgG3 생식계열 서열로부터의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다.

대안적 아이소형의 생식계열 서열이 IgG4 생식계열 서열에서 상기 언급된 주요 잔기에 상응하는 위치에서의 아미노산을 함유하지 않는 구체예에서, 이러한 구체예의 변이 IgG4는 단백질 서열로부터 제거된, 상기 위치(들)에서의 아미노산 잔기 또는 잔기들을 갖는다.

일 구체예에서, 변형은 하기 중 임의의 하나 또는 조합을 포함한다:

(i) K203의 R, E 또는 Q; R222의 T, K 또는 Q; E226의 L 또는 I; S227의 R, P, A, N 또는 T; Y229의 S, C, F, W 또는 H; G230의 C, A, N 또는 S; P237의 H, E, D 또는 V; 및/또는 P238의 T, K 또는 E로의 치환을 포함하는 하나 이상의 아미노산의 치환; 및/또는

(ii) ESKYGPP (SEQ ID NO: 26) (Kabat 잔기 226번 내지 238번)의 EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 27), 또는 ERKYGPP (SEQ ID NO: 28), 또는 ERKCCVE (SEQ ID NO: 29), 또는 ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 30)로의 대체; 및/또는

(iii) YGPP (SEQ ID NO: 23) (Kabat 잔기 229번 내지 238번)의 SCDKTHT (SEQ ID NO: 24), 또는 CCVE (SEQ ID NO: 25)로의 대체. 이러한 변형은 표 1에 요약되어 있다.

일 구체예에서, 변이 IgG4 분자는 생식계열 서열에서 글루타민으로 치환되는 203번 위치의 리신을 갖는다(K203Q).

일 구체예에서, 변이 IgG4 분자는 리신, 트레오닌, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 시스테인, 글루타메이트, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신 및 발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 잔기로 치환되는 생식계열 서열의 222번 위치의 아르기닌을 갖는다. 추가의 구체예에서, 변이 IgG4 분자는 리신 및 트레오닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 잔기로 치환되는 생식계열 서열에서 222번 위치의 아르기닌을 갖는다. 더욱 추가의 구체예에서, 변이 IgG4 분자는 트레오닌으로 치환된, 생식계열 서열의 222번 위치의 아르기닌을 갖는다(R222T). 더욱 추가의 구체예에서, 변이 IgG4 분자는 리신으로 치환되는 생식계열 서열의 222번 위치의 아르기닌을 갖는다(R222K). 본원에 기술된 실시예에 제시된 바와 같이, 이 위치에서 변형은 PLBL2 결합에서 가장 큰 감소를 보여주었다.

일 구체예에서, 변이 IgG4 분자는 이소류신 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택되는 잔기로 치환되는 생식계열 서열의 226번 위치의 글루타메이트를 갖는다. 예를 들어, 치환은 E226L이다.

일 구체예에서, 변이 IgG4 분자는 프롤린 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 잔기로 치환되는 227번 위치의 세린을 갖는다. 예를 들어, 치환은 S227P이다.

일 구체예에서, 변이 IgG4 분자는 생식계열 인간 IgG4 서열의 229번 위치에 존재하는 티로신을 함유하지 않는다.

일 구체예에서, 변이 IgG4 분자는 생식계열 인간 IgG4 서열의 230번 위치에 존재하는 글리신을 함유하지 않는다.

일 구체예에서, 변이 IGg4 분자는 생식계열 인간 IgG4 서열의 237번 위치에 존재하는 프롤린을 함유하지 않는다.

일 구체예에서, 변이 IgG4 분자는 생식계열 인간 IgG4 서열의 238번 위치에 존재하는 프롤린을 함유하지 않는다.

일 구체예에서, 변이 IgG4 분자는 리신, 아스파라긴, 트레오닌, 아르기닌, 메티오닌, 이소류신, 글루타민, 히스티딘, 프롤린, 글루타메이트, 아스파르테이트, 알라닌, 글리신, 발린, 티로신, 세린, 트립토판, 시스테인, 류신 및 페닐알라닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 잔기로 치환되는 229번 위치에서의 티로신을 갖는다.

일 구체예에서, 변이 IgG4 분자는 리신, 아스파라긴, 트레오닌, 아르기닌, 메티오닌, 이소류신, 글루타민, 히스티딘, 프롤린, 글루타메이트, 아스파르테이트, 알라닌, 글리신, 발린, 티로신, 세린, 트립토판, 시스테인, 류신 및 페닐알라닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 잔기로 치환되는 230번 위치에서의 글리신을 갖는다.

일 구체예에서, 변이 IgG4 분자는 리신, 아스파라긴, 트레오닌, 아르기닌, 메티오닌, 이소류신, 글루타민, 히스티딘, 프롤린, 글루타메이트, 아스파르테이트, 알라닌, 글리신, 발린, 티로신, 세린, 트립토판, 시스테인, 류신 및 페닐알라닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 잔기로 치환되는 237번 위치에서의 프롤린을 갖는다.

일 구체예에서, 변이 IgG4 분자는 리신, 아스파라긴, 트레오닌, 아르기닌, 메티오닌, 이소류신, 글루타민, 히스티딘, 프롤린, 글루타메이트, 아스파르테이트, 알라닌, 글리신, 발린, 티로신, 세린, 트립토판, 시스테인, 류신 및 페닐알라닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 잔기로 치환되는 238번 위치에서의 프롤린을 갖는다.

일 구체예에서, 변이 IgG4 분자는 229번 위치의 티로신, 230번 위치의 글리신, 237번 위치의 프롤린 및 238번 위치의 프롤린을 함유하지 않으며, 대신 하기 펩티드 서열을 함유한다: SCDKTHT (SEQ ID NO: 24). 대안적 구체예에서, 변이 IgG4 분자는 229번 위치의 티로신, 230번 위치의 글리신, 237번 위치의 프롤린 및 238번 위치의 프롤린을 함유하지 않으며, 대신 하기 펩티드 서열을 함유한다: CCVE (SEQ ID NO: 25). 예를 들어, 변이 IgG4는 Kabat 229-238 YGPP (SEQ ID NO: 23)의 결실 및 CCVE (SEQ ID NO: 25)의 삽입을 포함한다. 예를 들어, 변이 IgG4는 Kabat 229-238 YGPP (SEQ ID NO: 23)의 CCVE (SEQ ID NO: 25)로의 대체를 포함한다. 본원에 기술된 실시예에 제시된 바와 같이, 이들 위치에서의 변형은 PLBL2 결합에서 가장 큰 감소를 보여주었다.

일 구체예에서, 변이 IgG4 분자는 류신으로 치환되는 247번 위치의 페닐알라닌을 갖는다.

일 구체예에서, 변형은 EFLGGP (SEQ ID NO: 31) (Kabat 잔기 246번 내지 251번)의 PAAAS (SEQ ID NO: 32) 또는 PAAAP (SEQ ID NO:33)로의 대체를 포함한다.

표 1에 요약되어 있는 특정 Kabat 잔기에서 가능한 아미노산 변형(예를 들어, 치환 및/또는 삽입 및/또는 결실)의 예가 IgG4 항체에 가해져 HCP 예컨대, PLBL2에 대한 결합 능력이 감소된 변형된 IgG4 항체를 생성시킬 수 있다. 이들 변형은 아미노산 중 임의의 하나 이상(즉, 조합)에서 이루어질 수 있다.

표 1: IgG4 중쇄 내의 아미노산 변형의 예

일부 구체예에서, 변이 IgG4 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다.

또 다른 구체예에서, IgG1, IgG2 및/또는 IgG3 항체 생식계열 서열에서 동등한 아미노산 서열에 대한 치환은 인간 항체 생식계열 서열을 포함한다.

일 구체예에서, 변형은 변이 IgG4 분자의 중쇄 둘 모두에 대해 이루어진다. 대안적 구체예에서, 변형은 변이 IgG4 분자의 중쇄 중 단지 하나에만 이루어진다.

일 구체예에서, 비변형된 IgG4 항체 대비 중쇄 불변 영역에서 추가의 변형이 이루어지지 않는다.

일 구체예에서, IgG4 이펙터 기능에 필요한 아미노산 잔기에 대한 변형은 이루어지지 않는다. 예를 들어, 야생형 IgG4 F247 (Kabat) (EU F234)는 약화된 ADCC 및 CDC 활성에 중요하다. 추가로, 변형된 E248 (Kabat)는 이펙터 기능 특히, FcγRI에 대한 결합 감소를 약화시킬 수 있다.

일 구체예에서, 변이 IgG4 항체는 S241의 P로 및/또는 L248의 E로의 추가 치환을 포함한다. 일 구체예에서, 변이 IgG4 항체는 S241의 P로의 추가 치환을 포함한다. 이러한 변형은 IgG4 분자의 안정성 향상을 돕는다. 일 구체예에서, 변이 IgG4 항체는 EFLGGP 서열(SEQ ID NO: 31) (Kabat 잔기 246-251)의 서열 PAAAP (SEQ ID NO: 33)로의 추가 치환을 포함한다.

본 발명의 추가의 양태에 따르면, 본원에 정의된 바와 같이 변이 IgG4 항체를 인코딩하는 핵산 작제물이 제공된다.

핵산 작제물은 숙주 세포주 내로 형질감염될 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가의 양태에 따르면, 본원에 정의된 바와 같이 변이 IgG4 항체를 인코딩하는 세포주가 제공된다.

추가 서열 변형

본 발명의 추가 양태에 따르면, 중쇄 불변 영역에서 Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 영역의 아미노산 중 임의의 하나의 아미노산 또는 아미노산의 조합에서 변형된 변이 IgG 항체로서, 비변형된 IgG 항체와 비교하여 숙주 세포 단백질(HCP)에 대한 감소된 결합 수준을 갖는 변이 IgG 항체가 제공된다. 예를 들어, 변이 IgG 항체는 중쇄 불변 영역에서 Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 1 내지 25개 아미노산에서 변형되었다. 예를 들어, 변이 IgG 항체는 중쇄 불변 영역에서 Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개 아미노산에서 변형되었다. 예를 들어, 변이 IgG 항체는 중쇄 불변 영역에서 Kabat 위치 197, 198, 203, 207, 211, 222, 226, 227, 229, 230, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 246, 247, 248, 249, 250 또는 251번 중 어느 하나 또는 조합에서 변형되었다. 예를 들어, 변이 IgG 항체는 중쇄 불변 영역에서 Kabat 위치 203, 222, 226, 227, 229, 230, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 247, 248 또는 251번 중 어느 하나 또는 조합에서 변형되었다.

숙주 세포 단백질

숙주 세포 단백질 또는 "HCP"는 세포 배양 또는 발효 동안 숙주 세포에 의해 생성된 관심 단백질(즉, 재조합 단백질/변이 IgG4)과 관련되지 않은 단백질로서, 세포내 및/또는 분비된 단백질을 포함하는 단백질을 나타낸다. 숙주 세포 단백질의 예는 프로테아제이며, 이는 정제 동안 및 후에 여전히 존재하는 경우 관심 단백질에 손상을 초래할 수 있다. 예를 들어, 프로테아제가 관심 단백질을 포함하는 샘플에 잔존하는 경우, 이는 원래 존재하지 않았던 생성물-관련 물질 또는 불순물을 생성할 수 있다. 프로테아제의 존재는 정제 공정 동안 및/또는 최종 제형 중에서 시간에 걸쳐 관심 단백질의 분해를 초래할 수 있다.

일 구체예에서, 숙주 세포 단백질은 포유동물 세포 또는 박테리아 세포로부터 생성/유도된다. 추가의 구체예에서, 포유동물 세포는 인간 또는 설치류(예컨대, 햄스터 또는 마우스) 세포로부터 선택된다.

특정 구체예에서, 항체를 발현하는데 사용되는 숙주 세포는 CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, COS 세포, K562 세포, BHK 세포, PER.C6 세포 및 HEK 세포(즉, 숙주 세포 단백질은 이러한 숙주 세포로부터 유래됨)로 구성된 군으로부터 선택된다. 대안적으로, 숙주 세포는 E. 콜라이(예를 들어, W3110, BL21), B. 서브틸리스 및/또는 기타 적합한 박테리아; 진핵생물 세포 예컨대, 진균 또는 효모 세포(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 아스퍼길루스 종(Aspergillus sp.), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼브(Schizosaccharomyces pombe), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))로 구성된 군으로부터 선택되는 박테리아 세포일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 CHO 세포이다. 대안적으로, 숙주 세포는 HEK 세포이다.

일 구체예에서, 숙주 세포 단백질은 추정 포스포리파제 B-유사 2(PLBL2)이다. PLBL2는 또한 포스포리파제 B 도메인 함유 단백질 2(PLBD2)로서 공지되어 있다.

HCP, 예컨대, PLBL2에 대한 IgG4 분자의 결합 감소는 이러한 공정 관련 불순물과 생성물 IgG4의 공동-정제 수준의 동시 감소를 발생시킨다. 이는 결국, 특정 정제 전략 예컨대, 약물 생성물로부터 HCP를 제거하기 위한 팩 베드 컬럼 크로마토그래피 동안 엄격한 세척 조건에 대한 필요성을 제거한다. 이렇게 하면 제조 공정의 효율성이 증가하고, 관련 비용이 줄어들며, 잠재적으로 맞춤 면역검정을 사용하는 과도한 제품 시험에 대한 필요성이 완화된다. 궁극적으로, 이러한 변형은 PLBL2와 같은 HCP가 최종 약물 생성물 중에 존재하게 될 위험을 잠재적으로 완화시키는 역할을 하며, 그 결과, 이들이 환자에서 면역원성 반응을 초래할 가능성을 최소화시킨다.

이러한 변형된 IgG4 분자가 HCP 예컨대, PLBL2에 결합하는 능력의 감소는 실시예에 제공된 방법에 기초하여 정량화될 수 있다.

숙주 세포 단백질에 결합하는 수준 감소가 측정될 수 있는 여러 방법이 있다. 예를 들어, 감소된 결합 수준은 일단 예를 들어, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되면 항체와 용액 중에 존재하는 숙주 세포 단백질의 양을 단순히 측정함으로써 평가될 수 있다(비변형된 IgG4 대비 감소된 양은 감소된 숙주 세포 단백질 결합을 나타낸다). 일 구체예에서, IgG4 항체는 비변형된 IgG4 항체 대비 숙주 세포 단백질에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 활성을 갖는다.

일 구체예에서, 변이 IgG4 항체는 비변형된 IgG4 항체 대비 결합 활성에서 적어도 10% 감소 예컨대, 결합 활성에서 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 감소를 갖는다.

일 구체예에서, 변이 IgG4 항체는 비변형된 IgG4 항체 대비 적어도 10배의 결합 친화성 감소 예컨대, 결합 친화성에서 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 감소를 갖는다.

항체 변이체를 포함하는 조성물

본 발명의 조성물은 통상적인 기법에 따라 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는 물론 임의의 다른 공지된 애주번트 및 부형제와 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는 물론 임의의 다른 공지된 애주번트 및 부형제는 본 발명의 선택된 화합물 및 선택된 투여 방식에 적합해야 한다.

일 구체예에서, 변이 IgG4의 농도는 적어도 10 mg/mL 예를 들어, 적어도 20 mg/mL, 25 mg/mL, 30 mg/mL, 35 mg/mL, 40 mg/mL, 45 mg/mL, 50 mg/mL, 55 mg/mL, 60 mg/mL, 65 mg/mL, 70 mg/mL, 75 mg/mL, 80 mg/mL, 85 mg/mL, 90 mg/mL 또는 95 mg/mL 또는 100 mg/mL이다.

본 발명의 약학적 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에 독성이지 않으면서, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대한 요망되는 치료학적 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 변화될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 처리 기간, 사용된 특정 조성물과 조합되어 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적 건강 상태 및 과거 병력 및 의료계에 널리 공지된 기타 인자를 포함하는 다양한 약물동태학적 인자에 의존적일 것이다. 당업계에 통상적인 지식을 갖는 의사 또는 수의사는 요망되는 약학적 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.

일 구체예에서, 조성물 중 추정 포스포리파제 B-유사 2(PLBL2)의 농도는 500 ppm 미만, 예를 들어, 400 ppm, 300 ppm, 200 ppm, 100 ppm, 90 ppm, 80 ppm, 70 ppm, 60 ppm, 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm 또는 10 ppm 미만이다.

일 구체예에서, 조성물 중 추정 포스포리파제 B-유사 2(PLBL2)의 농도는 약 200 ng의 PLBL2/생성물 mg(즉, ng/mg) 미만; 약 150 ng/mg 미만; 약 100 ng/mg 미만; 또는 약 50 ng/mg 미만이다.

일 구체예에서, 조성물은 완충제 및/또는 지방산 에스테르를 추가로 포함한다. 추가의 구체예에서, 지방산 에스테르는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다.

하기에 언급된 바와 같이, PLBL2는 최종 제형에서 생성물 단백질의 안정화에 필요한 폴리소르베이트와 같은 제형 부형제의 분해에 대한 잠재적 원인 제제로 확인되었다. 따라서, 결국 PLBL2 결합 감소는 최종 제형화된 약물 중 PLBL2의 수준을 최소화시켜 생성물의 반감기를 최대화시킬 것이다. 따라서, 본 발명의 추가의 양태에 따르면, 본원에 정의된 바와 같이 변이 IgG4 항체를 포함하는, 확장된/개선된 반감기를 갖는 조성물이 제공된다.

추가로, 본 발명의 추가의 양태에 따르면, 중쇄 불변 영역에서 Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 영역의 아미노산 중 임의의 하나의 아미노산 또는 아미노산의 조합에서 항체 서열을 변형시킴으로써 PLBL2에 대한 감소된 결합을 갖는 IgG4 항체를 생성시키는 것을 포함하는 항체 조성물의 반감기를 확장시키는 방법이 제공된다.

항체 변이체의 용도

본 발명의 추가의 양태에 따르면, 치료법에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같이 변이 IgG4 항체가 제공된다. 본 발명이 다양한 표적으로 안내되는 다양한 IgG4 항체에 적용될 수 있으며, 따라서, 상기 IgG4 변이체가 다양한 질병을 치료하는데 사용될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.

본원에 기술된 항체는 또한 치료 방법에 사용될 수 있다. 치료는 치료학적, 예방학적 또는 예방적 치료일 수 있다. 치료는 질환의 적어도 하나의 양태 또는 증상의 완화, 감소 또는 예방을 포함하며, 본원에 기술된 질병의 예방 또는 치유를 포함한다.

본원에 기술된 항체는 치료학적, 예방학적 또는 예방적 치료를 위한 유효량으로 사용될 수 있다. 본원에 기술된 항체의 치료학적 유효량은 질병의 하나 이상의 증상을 완화시키거나 감소시키거나, 질병을 예방하거나, 치유하기에 효과적인 양이다.

항체 변이체의 제조 방법

공정 불순물 결합 수준을 감소시키기 위해 아미노산 서열 변화를 통해 변형된 상기 항체 변이체를 생성시키는 방법 및 항체 변이체가 본원에 제공된다. 이러한 변형은 생성된 의료 제품에 존재하는 공정 불순물의 양을 감소시키는데 유익한 효과를 갖는다.

따라서, 본 발명의 추가의 양태에 따르면, 하기 단계를 포함하여 IgG 항체를 변형시켜 공정 불순물에 대한 결합을 감소시키는 방법이 제공된다:

본 발명의 추가의 양태에 따르면, 하기 단계를 포함하여 비변형된 IgG 항체와 비교하여 공정 불순물에 대한 감소된 결합을 갖는 IgG 항체의 변이체를 생성시키는 방법이 제공된다:

일 구체예에서, 공정 불순물의 결합에 관련된 아미노산은 단백질-단백질 상호작용을 연구하는데 사용될 수 있는 방법 또는 방법의 조합의 사용을 통해 확인된다. 일 구체예에서, 단백질-단백질 상호작용 연구를 위한 방법은 수소 중수소 교환 질량 분광계(HDX-MS), 크리스탈로그래피, 효모 2-하이브리드 스크리닝, 인 실리코 3D 구조 모델링 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 이러한 구체예는 많은 이러한 방법의 결과 조합을 필요로 할 수 있으며, 적절한 과학적 추론의 적용을 통해, 공정 불순물의 결합에 관련된 아미노산 또는 아미노산들의 확인이 추론될 수 있다.

일 구체예에서, 공정 불순물의 결합에 관련된 것으로서 확인된 아미노산은 불변 영역에 존재한다. 추가의 구체예에서, 공정 불순물의 결합에 관련된 것으로서 확인된 아미노산은 중쇄 불변 영역에 존재한다.

단백질-단백질 상호작용 방법(예를 들어, HDX-MS)에 의해 결정된 영역에서 공정 불순물과 상호작용하지 않은 아이소형 대비 공정 불순물과 상호작용하는 IgG 아이소형의 서열 정렬은 공정 불순물의 결합에 관련된 아미노산(들)이 확인되게 한다. 그 후, 공정 불순물에 결합하지 않는 IgG 아이소형으로부터 공정 불순물에 결합하는 IgG로의 보존적인 생식계열 대 생식계열 치환은 공정 불순물에 결합하지 않은 변이체가 생성되게 할 것이다. 따라서, 일 구체예에서, 공정 불순물과의 결합에 관련되는 것으로 확인된 아미노산은 대안적 IgG 항체 생식계열 서열로부터의 동등한 아미노산으로 치환된다.

일 구체예에서, 공정 불순물과의 결합에 관련되는 것으로서 확인된 아미노산은 항체 서열의 보존된 영역에서 보존적인 동일한 종의 면역글로불린 생식계열-대-생식계열 아미노산 교체를 통해 변형된다.

따라서, 중쇄 불변 영역에서 Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 영역의 아미노산 중 임의의 하나의 아미노산 또는 아미노산의 조합에서 항체 서열을 변형시키는 것을 포함하여, 숙주 세포 단백질(HCP)에 대한 결합이 감소된 IgG4 항체를 생성하는 방법이 제공된다. 일 예에서, 숙주 세포 단백질은 추정 포스포리파제 B-유사 2(PLBL2)이다. 방법은 친화성 크로마토그래피 기법을 이용하여 IgG4 항체를 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 방법은 적어도 하나의 다른 직각 크로마토그래피 기법을 이용하여 IgG4 항체를 추가로 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서, 직각 크로마토그래피 기법은 이온 교환 크로마토그래피이다.

따라서, 본 발명은 결합된 공정 불순물의 수준을 감소시키기 위해 더욱 고전적인 크로마토그래피 방법에 의해 정제되기 보다는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 생성되는 항체 변이체를 제공한다. 본 발명의 추가의 양태에 따르면, 본원에 정의된 방법에 의해 수득된 IgG 항체가 제공된다.

일 구체예에서, IgG 항체는 IgG4 항체이다. 따라서, 이러한 구체예에서, 공정 불순물과의 결합에 관련되는 것으로 확인된 아미노산은 IgG1, IgG2 및/또는 IgG3 항체 생식계열 서열로부터의 동등한 아미노산으로 치환된다.

IgG4 항체 변이체의 제조 방법

항체 생성 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 방법은 상기 IgG4 항체를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 형질감염된 재조합 숙주 세포의 현탁 배양물을 제조하고; 상기 IgG4 항체의 발현을 허용하는 조건하에서 상기 숙주 세포 배양물을 배양하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 친화성 크로마토그래피 기법을 이용하여 IgG4 항체를 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 방법은 적어도 하나의 다른 직각 크로마토그래피 기법을 이용하여 IgG4 항체를 추가로 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서, 직각 크로마토그래피 기법은 이온 교환 크로마토그래피이다.

일 구체예에서, 방법은 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 기법을 사용하여 IgG4 항체(예를 들어, 배양 후)를 정제하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 구체예에서, 친화성 크로마토그래피 기법은 슈퍼항원 친화성 크로마토그래피이다. 일 구체예에서, 슈퍼항원은 단백질 A, 단백질 G 및 단백질 L로부터 선택된다. 따라서, 추가의 구체예에서, 슈퍼항원 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 단백질 G 친화성 크로마토그래피 및 단백질 L 친화성 크로마토그래피로부터 선택된다.

일 구체예에서, 방법은 적어도 하나의 다른 크로마토그래피 기법 예컨대, 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 IgG4 항체를 추가로 정제하는 것을 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 하나 이상의 추가의 크로마토그래피 단계는 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및 혼합식 크로마토그래피, 특히, 음이온 교환 크로마토그래피로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 적어도 하나의 다른 크로마토그래피 기법은 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하지 않는다.

방법은 또한, 여과 단계 예컨대, 심층 여과(세포 및 세포 찌꺼기 제거를 위한) 및 나노여과(바이러스 제거를 위한)를 포함할 수 있다. 정제 단계는 또한, 포유동물 발현 시스템을 이용하여 생성된 물질에 대한 임의의 바이러스 불활성화 단계를 포함하도록 취해질 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에 따르면, 본원에 정의된 바와 같이 변이 IgG4 항체를 생성하는 방법으로서, 숙주 세포에서 상기 항체를 인코딩하는 핵산 작제물을 발현시키고, 임의적으로 상기 항체를 정제하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.

본 발명의 추가의 양태에 따르면, 본원에 정의된 방법에 의해 수득된 IgG4 항체가 제공된다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계(예를 들어, 세포 배양, 분자 유전자, 핵산 화학, 하이브리드화 기법, 단백질 정제 및 생화학에서)에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 표준 기법은 분자, 유전자 및 생화학 방법 및 화학적 방법에 이용된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 항체를 자연적으로 생성하는 임의의 종로부터 유래하든지 재조합 DNA 기법에 의해 생성되든지; 혈청, B-세포, 하이브리도마, 트랜스펙토마, 효모 또는 박테리아로부터 분리되든지 모든 면역글로불린 또는 IgG(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgM, IgA, IgD 또는 IgE 항체를 나타낸다. 항체는 모노클로날, 재조합, 폴리클로날, 키메라(예를 들어, 상이한 공급원(예를 들어, 인간/마우스 키메라 항체) 또는 상이한 항체 유형(예를 들어, IgG2/4 항체)로부터), 인간, 인간화된, 다중특이적(이중특이적 포함) 또는 헤테로컨주게이트 항체일 수 있다. 상기 용어는 또한 단일 가변 도메인(예를 들어, VH, VHH, VL), 도메인 항체(dAb®), 항원 결합 단편, 면역학적으로 효과적인 단편, Fab, F(ab')2, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, 단일 사슬 Fv, 닫힌 형태 다중특이적 항체, 디설파이드-연결된 scFv, 디아바디, TANDABS™, 등을 포함한다. 일 구체예에서, 항체는 IgG4이다. 또 다른 구체예에서, 항체는 재조합 IgG4이다. 또 다른 구체예에서, 항체는 변이 IgG4이다. 또 다른 구체예에서, 항체는 재조합 변이 IgG4이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CDR"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역인 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로서 정의된다. 면역글로불린의 30개 가변 부분에는 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR(또는 CDR 영역)이 있다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 "CDR"은 모두 3개의 중쇄 CDR, 또는 모두 3개의 경쇄 CDR(또는 적절한 경우, 모두 중쇄 및 모두 경쇄 CDR 둘 모두)을 나타낸다. 항체의 구조 및 단백질 폴딩은 다른 잔기가 항원 결합 영역의 일부로 간주되며, 당업자에 의해 이렇게 이해될 것임을 의미할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "도메인"은 단백질의 나머지에 독립적인 3차 구조를 갖는 폴딩된 단백질 구조를 나타낸다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특성을 담당하며, 많은 경우에 단백질 및/또는 도메인의 나머지 기능의 손실 없이 다른 단백질에 첨가되거나 제거되거나 전달될 수 있다.

항체는 단백질 생성물 즉, 관심 단백질이다. 예를 들어, 단백질 생성물은 변이 IgG4이다. 예를 들어, 단백질 생성물은 재조합 IgG4이다. 예를 들어, 단백질 생성물은 재조합 변이 IgG4이다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "힌지 영역" 및/또는 "힌지 서열"은 항체의 힌지 영역으로서 통상적인 공지된 것을 나타내며, 이는 단백질 분자 서열의 226번 및 243번을 포함하는 226번 내지 243번 위치(여기에서, 아미노산 번호는 Kabat 넘버링에 따름) 또는 216번 및 230번을 포함하는 216-230 위치(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 포함하는 IgG 분자의 도메인이다. 이러한 영역은 또한 "유전자 힌지"로서 언급될 수 있다. 이에 더하여, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "힌지 영역" 및 "힌지 서열"은 또한, 단백질 분자 서열의 203번 및 223번을 포함하는 203번 내지 223번 위치(아미노산 번호는 Kabat 넘버링에 따름) 또는 196번 및 215번을 포함하는 196번 내지 215번 위치(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 포함하도록 취해질 수 있다. 게다가, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "힌지 영역" 및 "힌지 서열"은 단백질 분자 서열의 244번 및 256번을 포함하는 244번 내지 256번 위치(아미노산 번호는 Kabat 넘버링에 따름) 또는 231번 및 243번을 포함하는 231번 내지 243번 위치(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 포함하도록 취해질 수 있다.

대안적으로, "구조적 힌지"는 H/L 사슬 디설파이드 뒤의 잔기에서 시작하여 Fc 도메인 앞의 잔기에서 종결되는 힌지를 기반으로 하는, Kabat 234-250 위치(또는 EU 221-237 위치)로서 정의되었다.

힌지는 한번의 헬릭스 턴에 의해 형성된 첫 번째 중쇄간 디설파이드에 대한 Fab 도메인의 말단인 상부 힌지(Kabat 234-238 위치; 또는 EU 221-225 위치); 및 마지막 디설파이드로부터 Fc 도메인의 시작부까지의 하부 힌지(Kabat 243-250 위치 또는 EU 230-237 위치)로 구조적으로 나누어질 수 있다. 중간 또는 코어 힌지는 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 평행한 폴리프롤린 이중 헬릭스를 포함하는 인간 IgG1에서의 "CPPC" (SEQ ID NO: 20) 모티프(Kabat 239-242 위치 또는 EU 226-229 위치)이다.

당업계의 대부분의 넘버링은 인간 IgG1을 기초로 하며, 삽입-결실로 인해 특히, 힌지 서열에서 상이할 것임이 주지되어야 한다. 예를 들어, IgG4에 대한 코어 힌지 옆의 "YGPP" (SEQ ID NO: 23) 모티프는 IgG1에서 "SCDKTHT" (SEQ ID NO: 24) 모티프와 등가이며, 따라서, IgG4의 "YGPP" (SEQ ID NO: 23)가 단순히 229번 내지 232번의 위치보다는 각각 229번, 230번, 237번 및 238번 위치에 있는 이유이다.

본원에 사용된 바와 같이 항체 분자를 기술하는데 있어서 용어 "변형된 힌지"는 단백질 서열의 203번 및 256번을 포함하는 203번 내지 256번 사이의 위치의 아미노산 잔기가 비변형된 및/또는 모 항체의 서열의 것으로부터 변경된 임의의 항체를 나타낸다. 이러한 변경은 대안적 아미노산에 대한 잔기 또는 잔기들의 치환, 또는 대안적 서열에 대한 전체 펩티드 서열의 치환을 포함할 수 있다. 변경은 또한, 단백질로부터의 펩티드 서열 또는 아미노산의 제거를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비변형된"은 공정 불순물에 대한 결합을 감소시키는 변경 전의 항체를 나타낸다. 이는 이의 천연 생식계열 형태의 항체를 포함할 수 있다. 이는 또한, 안정성을 개선시키기 위해 많은 IgG4 항체에서 사용되는 치환 S241P(즉, Kabat 잔기 239번 내지 242번에서 서열 CPPC [SEQ ID NO:20]을 발생시킴)와 같은, 감소되는 숙주 세포 단백질 결합 이외의 특성을 개선시키도록 이미 변형되었던 항체를 포함할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 비변형된 항체는 치환 S241P를 포함한다. 이는 또한, 이펙터 기능을 개선시키기 위해 많은 IgG4 항체에 사용되는 치환 L248E로 이미 변형되었던 항체를 포함할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 비변형된 항체는 치환 L248E를 포함한다.

용어 "변형된"은 중쇄 불변 영역의 Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 영역에서 아미노산 중 하나의 아미노산 또는 아미노산의 조합의 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입 중 어느 하나 또는 조합을 설명하는데 사용된다. 예를 들어, 변형은 하나 이상의 아미노산 치환, 및/또는 하나 이상의 아미노산 삽입 및/또는 하나 이상의 아미노산 결실을 포함할 수 있다. 용어 "결실", "제거", "교체", "삭제"는 본원에 상호교환적으로 사용된다.

예를 들어, 변이 IgG 항체는 Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 중쇄 불변 영역에서 1 내지 25개 아미노산에서 변형되었다. 예를 들어, 변이 IgG 항체는 Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 중쇄 불변 영역에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개 아미노산에서 변형되었다. 예를 들어, 변이 IgG 항체는 중쇄 불변 영역에서 Kabat 위치 197, 198, 203, 207, 211, 222, 226, 227, 229, 230, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 246, 247, 248, 249, 250 또는 251번 중 어느 하나 또는 조합에서 변형되었다. 예를 들어, 변이 IgG 항체는 중쇄 불변 영역의 Kabat 위치 203, 222, 226, 227, 229, 230, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 247, 248 또는 251번 중 어느 하나 또는 조합에서 변형되었다.

본원에 사용되는 바와 같이 용어 "숙주 세포"는 임의의 유기체, 원핵생물 및 진핵생물 둘 모두를 나타내며, 이는 비-조작된 유기체에 의해 발현되지 않는 폴리펩티드를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, COS 세포, K562 세포, BHK 세포, PER C6 세포 및 HEK 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 숙주 세포는 E. 콜라이(예를 들어, W3110, BL21), B. 서브틸리스 및/또는 기타 적합한 진핵생물 세포 예컨대, 진균 또는 효모 세포(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 아스퍼길루스 종(Aspergillus sp .), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼브(Schizosaccharomyces pombe), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))로 구성된 군으로부터 선택되는 박테리아 세포일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포 단백질" 및 약어 "HCP"는 상호교환적으로 사용되며, 숙주 세포가 조작되어 발현하는 조작된 면역글로불린(즉, 관심 단백질) 이외에, 숙주 세포에 의해 발현되는 임의의 폴리펩티드를 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "공정 불순물"은 국제 의약품규제조화위원회(International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH)) 가이드라인(예를 들어, ICH Q6B)에 따라 규정될 수 있으며, 관심 단백질이 생성되는 공정 결과로서 존재하는 불순물을 나타내기 위해 취해진다. 따라서, 이러한 정의는 제조 공정 즉, 세포 기질(예를 들어, 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA/RNA), 세포 배양물(예를 들어, 유도인자, 항생제 또는 배지 성분) 또는 이의 다운스트림 처리로부터 유래되는 불순물을 포함한다. 용어 "공정 불순물"은 생성물 관련 불순물(예를 들어, 항체 응집물 및/또는 단편)을 포함하지 않는다.

본원에 정의된 모든 "아미노산" 잔기는 천연 L-형태로 존재할 수 있다. 표준 폴리펩티드 명명법에 따라, 아미노산 잔기에 대한 약어는 표 2에 제시된 바와 같다:

표 2: 아미노산 약어

모든 아미노산 서열은 왼쪽부터 오른쪽 방향으로 아미노-말단에서 카르복시-말단의 통상적인 방향으로 존재하는 방식에 의해 본원에 상세히 설명된다.

본원에 사용된 바와 같이, 항체의 아미노산 서열을 기술하는데 있어서 사용되는 바와 같은 용어 "생식계열"은 예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자를 수반하는 유전자이식 마우스를 면역화시키거나 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝함으로써 인간 면역글로불린 서열을 사용하는 시스템으로부터 수득되는 임의의 항체의 아미노산 서열을 설명하며, 여기에서 선택된 인간 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 아미노산 서열에서 적어도 90% 동일하다.

본원에 사용된 바와 같이, "보존된 생식계열 대 생식계열 아미노산 교체"에 대해 언급할 경우, 이는 항체의 초기 생식계열 서열의 적어도 하나의 아미노산이 샘플 종의 또 다른 항체 생식계열 서열의 동등하게 위치하여 정렬된 아미노산으로부터 유래된 다른 아미노산으로 변형된 항체에 대한 보존적 교체로서 정의된다.

본원에 사용된 바와 같이, 항체를 기술하는데 있어서 용어 "모" 또는 "모의(parental)"는 자연 발생 생식계열 인간 면역글로불린의 아미노산 서열로 구성된 임의의 면역글로불린을 나타낸다. IgG4 하위부류의 항체를 기술하는데 있어서 용어 "모" 또는 "모의"는 상보성 결정 영역을 포함하는 가변 도메인에서 임의의 아미노산 서열과 함께 인간 IgG4 분자의, 중쇄 및 경쇄 둘 모두에서 보존된 불변 영역의 자연 발생 인간 생식계열 아미노산 서열을 함유하는 임의의 면역글로불린을 지칭하며, 여기에서 힌지 영역은 아미노산 서열; 시스테인-프롤린-프롤린-시스테인 또는 시스테인-프롤린-세린-시스테인을 함유한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "변형된 IgG4" 또는 "변이 IgG4" 또는 "재조합 IgG4"는 상호교환적으로 사용되며, "모" IgG4 항체와 동일한 아미노산 서열을 포함하나, 하나 이상의 아미노산이 상이한 임의의 IgG4 항체를 나타낸다. 특정 구체예에서, 이러한 차이는 본원에 기술된 바와 같은 또는 표 1에 상세히 기술된 변형 중 적어도 하나로 구성될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, PLBL2와 같은 숙주 세포 단백질(HCP)에 대한 항체 결합에 있어서 용어 "결합"은 항체와 상기 숙주 세포 단백질(HCP) 사이의 특이적 및/또는 비특이적인 가역성 및 비가역성 상호작용 둘 모두를 나타낸다. "결합 수준", "결합 능력", "상호작용 성향", "상호작용"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 항체와 HCP 사이의 이러한 결합 상호작용은 당업자에 의해 정량적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 항-PLBL2 웨스턴 블롯인 실시예 2에서와 같이 수행될 수 있다.

이러한 결합 상호작용은 또한, 분석물로서 숙주 세포 단백질 및 리간드로서 항체를 사용하여 예를 들어, BIAcore™ 3000 또는 BIAcore™ T200 기구에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술을 사용하여 정량적으로 결정될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "친화성"은 PLBL2와 같은 HCP에 대한 하나의 분자 예를 들어, 본 발명의 항체의 결합 강도를 나타낸다. 이의 표적 또는 오염물질(예컨대, HCP)에 대한 항체의 결합 친화성은 평형 방법으로 결정될 수 있다. 결합 친화성을 정량화하는 방법은 예를 들어, Octet® RED 384 기구와 조합된 바이오 층 간섭계(BLI)를 포함한다(실시예 6 참조). 기타 방법은 효소-연결된 면역흡수 검정(ELISA) 또는 방사성면역검정(RIA), 또는 역동학(kinetics)(예를 들어, BIACORE^TM 분석)을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 숙주 세포 단백질 예컨대, PLBL2에의 항체 결합에 있어서 용어 "활성"은 항체에 결합하는 HCP의 양을 나타낸다. 예를 들어, PLBL2에 결합되는 항체의 수이다. 결합 활성을 정량화하기 위한 방법은 하기를 포함한다: 얼마나 많은 HCP가 항체에 결합하는지를 측정하기 위한 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA)(예를 들어, PLBL2 2 ng/mg)(실시예 3 참조); 얼마나 많은 HCP가 항체에 결합하는지를 측정하기 위해 BIAcore™ 3000 또는 BIAcore™ T200 기구에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기법(예를 들어, PLBL2 결합(RU))(실시예 4 참조).

본원에 사용된 바와 같이, 숙주 세포 단백질에 대한 한 항체의 결합을 동일한 숙주 세포 단백질에 대한 또 다른 항체의 결합과 비교하여 변화를 기술하는 맥락에 사용될 경우 용어 "감소된"은 상기 숙주 세포 단백질에 대한 두 항체의 결합에서의 상대적 차이를 나타낸다. 친화성 또는 활성에서의 차이는 예를 들어, 리간드로서의 항체 및 분석물로서의 숙주 세포 단백질을 사용하는 BIAcore™ 3000 또는 BIAcore™ T200 기구에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기법을 사용하여 정량적으로 결정될 수 있으며, 이러한 경우, 결합 활성에서 10% 초과 감소 및/또는 결합 친화성에서 10배 초과 감소인 경우, 한 항체는 또 다른 항체와 비교하여 "감소된" 수준의 결합을 갖는 것으로 정의된다. 따라서, 일 구체예에서, 변이 항체는 비변형된 항체와 비교하여 결합 활성에서 적어도 10% 감소 및/또는 결합 친화성에서 적어도 10배 감소를 갖는다.

본원에 사용된 바와 같이, 성분 예컨대, PLBL2의 농도 또는 양을 기술하는데 있어서 용어 "백만분율" 또는 "ppm"은 IgG4 항체와 같은 생성물의 농도 대비 상기 성분의 농도를 나타낸다. "ppm" 값은 본질적으로 성분과 항체 생성물의 몰 비이며, 예를 들어, 성분의 농도(ng/mL로 측정됨)를 항체의 농도(mg/mL로 측정됨)로 나눔으로써 계산될 수 있다. 그 후, 이러한 계산의 결과는 항체 생성물 백만부 당 성분의 부이다. 대안적으로, 검출된 HCP는 pg/mg와 동등한 "ppb"("10억분율")로 측정될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "친화성 크로마토그래피"는 크로마토그래피 분리를 수행하기 위해 등전점, 소수성 또는 크기와 같은 생체분자의 일반적 특성보다는 생체분자 사이의 특이적인 가역적 상호작용을 이용하는 크로마토그래피 방법이다.

"슈퍼항원"은 이들 단백질의 표적 리간드-결합 부위와 구별되는 부위에서 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원과 상호작용하는 유전자 리간드를 나타낸다. 스타필로코커스 내독소는 T-세포 수용체와 상호작용하는 슈퍼항원의 예이다. 항체에 결합하는 슈퍼항원은 비제한적으로, IgG 불변 영역에 결합하는 단백질 G; IgG 불변 영역 및 VH 도메인에 결합하는 단백질 A; 및 VL 도메인에 결합하는 단백질 L을 포함한다. 따라서, 일 구체예에서, 슈퍼항원은 단백질 A, 단백질 G 및 단백질 L로 구성된 군으로부터 선택된다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "단백질 A"는 이의 천연 공급원(예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스의 세포 벽)으로부터 회수된 단백질 A, 합성으로 생성된 단백질 A(예를 들어, 펩티드 합성 또는 재조합 기법에 의해) 및 C_H2/C_H3 영역을 갖는 단백질에 결합하는 능력을 갖는 이의 변이체를 포함한다.

"단백질 A 친화성 크로마토그래피" 또는 "단백질 A 크로마토그래피"는 면역글로불린 분자의 Fc 부분에 대한 단백질 A의 IgG 결합 도메인의 친화성을 이용하는 특이적 친화성 크로마토그래피 방법을 나타낸다. 이러한 Fc 부분은 인간 또는 동물 면역글로불린 불변 도메인 C_H2 및 C_H3 또는 이들에 본질적으로 유사한 면역글로불린 도메인을 포함한다. 실제로, 단백질 A 크로마토그래피는 고형 지지체에 고정화된 단백질 A를 사용하는 것을 포함한다. 단백질 G 및 단백질 L은 또한, 친화성 크로마토그래피에 대해 사용될 수 있다. 고형 지지체는 단백질 A가 부착되는 비-수성 기질(예를 들어, 칼럼, 수지, 매트릭스, 비드, 겔 등)이다. 이러한 지지체는 아가로스, 세파로스, 유리, 실리카, 폴리스티렌, 콜로디온 목탄, 모래, 폴리메타크릴레이트, 가교된 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 및 아가로스와 덱스트란 표면 확장제 및 임의의 다른 적합한 물질을 포함한다. 이러한 물질은 당업계에 잘 공지되어 있다. 임의의 적합한 방법은 고형 지지체에 슈퍼항원을 고정시키는데 사용될 수 있다. 적합한 고형 지지체에 단백질을 부착하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 고정화된 단백질 A 또는 단백질 L을 갖거나 갖지 않는 이러한 고형 지지체는 예컨대, Vector Laboratory (Burlingame, Calif.), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Calif.), BioRad (Hercules, Calif.), Amersham Biosciences (part of GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 및 Millipore (Billerica, Mass.)를 포함하는 많은 시중의 공급원으로부터 용이하게 입수가능하다.

용어 "완충제"는 용액의 pH를 안정화시키는 완충 용액 또는 완충제를 의미한다. 완충제는 일반적으로, 약산 및 이의 컨주게이트 염기, 또는 약염기 및 이의 컨주게이트 산을 포함한다. 최적의 pH에서 또는 이에 근접한 pH에서 단백질 용액의 완충은 적절한 단백질 폴딩 및 기능을 보장하는 것을 돕는다.

용어 "지방산 에스테르"는 에스테르 결합을 통해 헤드 기에 연결된 지방산 사슬을 함유하는 임의의 유기 화합물을 의미한다. 에스테르 결합은 하이드록실 기(예를 들어, 알콜 또는 카르복실산)이 알콕시 기에 의해 대체되는 경우 형성된다. 일반적으로, 지방산 에스테르의 예는 비이온성 세정제인 예를 들어, 폴리소르베이트, 예컨대, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 계면활성제 및 에멀션화제, 인지질, 및 지질(예를 들어, 헤드 기는 모노글리세리드, 디글리세리드 및 트리글리세리드를 포함하는 글리세롤임)을 포함한다. 계면활성제 및 에멀션화제는 공용매 및 안정화제로서 유용하며, 단백질 제형에 첨가되어 기계적 스트레스에 대한 단백질 안정성 예컨대, 공기/액체 계면 및 고체/액체 계면 전단을 향상시킬 수 있다.

본 발명은 하기 비제한적 실시예를 참조로 이제 기술될 것이다.

실시예

실시예 1 - 최종 벌크 mAb의 HCP ELISA 희석 직선성

이전의 연구는 숙주 세포 단백질(HCP) 포스포리파제 B-유사 2(PLBL2)가 포유동물 세포 숙주를 사용하여 발생된 항체 샘플에 존재할 수 있음을 보여주었다. 게다가, PLBL2의 존재는 ELISA에 의해 샘플 중의 총 HCP 수준을 정량화할 경우 희석 비-직선성이 관찰되게 할 수 있다. 최종 벌크 약물 물질에서 PLBL2를 함유할 수 있는 mAb 생성물을 확인하고자 하는 시도에서, HCP ELISA는 샘플의 희석 직선성을 평가하기 위해 수행하였다. 독점적 ELISA를 CHO-유래된 생성물 샘플 중 면역원성 HCP의 총 양을 정량화하기 위해 자체 개발하였다. 이러한 HCP ELISA는 GSK에서 CHO-유래된 생성물에 걸친 다중-생성물 용도에 있어서 맞춤 염소 항-CHO HCP 폴리클로날 항체 및 자체 생산된 HCP 참조 표준을 사용하며, 다중 생물약학적 mAb 생성물에 대한 정제 공정 샘플에 걸친 HCP의 제거를 모니터링하기 위한 플랫폼으로서 이용되었다. 이러한 검정은 2.0 ng/mL의 민감도를 갖는다. 제조 과정 및 최종 벌크 물질 샘플의 매개 정밀도는 5.7 - 14.9% CV 범위이며, 반복성은 3.5 - 8.8% CV 범위이다.

각 샘플의 최소 4개 희석물을 ELISA에 의해 분석하였다. 조절된 HCP 값은 측정된 HCP 농도에 희석 배수를 곱한 후 생성물 농도로 나눔으로써 각 희석에 대해 계산된다. 각 샘플 희석에 대해 조절된 HCP 값은 로그-로그 스케일에서 희석 배수의 함수로서 플롯팅된다. 각 샘플의 희석 기울기는 하기 로그-로그 등식을 이용하여 계산된다.

Log (조절된 HCP) = A + B * Log (희석 배수)

여기에서, A는 y-절편이며, B는 기울기이다. 증가하는 희석에 따른 증가되는 조절된 HCP 값은 희석 비-직선성을 나타내며, PLBL2의 존재를 암시할 수 있다.

IgG1, IgG2, IgG4 및 IgG2/IgG4 키메라를 포함하는 다양한 하위유형의 인간화된 IgG 생성물을 분석하였다. IgG2/IgG4 키메라는 인간 IgG4 생식계열 서열을 갖는 항체로서, 힌지 영역은 인간 IgG2의 힌지 영역으로 교체된 항체이다. 결과는 희석 비-직선성이 희석 배수가 증가함에 따라 증가되는 조절 HCP 값에 의해 측정되는 바와 같은 IgG4 분자인 mAb7에서만 관찰됨을 입증한다(도 1). 하기 표 3은 HCP ELISA에서 이러한 mAb 생성물 각각에 대해 수득된 희석 기울기 값을 갖는다.

표 3: HCP ELISA에서 다양한 mAb 생성물에 대해 수득된 희석 기울기 값

이러한 결과는 ELISA에 사용된 항-CHO HCP 검출 항체를 과도하게 포화시키는 mAb7 최종 벌크 물질에 HCP가 존재함을 시사한다. HCP가 PLBL2인지의 여부를 확인하기 위해, 추가의 실험이 필요하였다.

실시예 2 - 다양한 mAb의 항- PLBL2 웨스턴 블롯

실시예 1은 mAb7이 HCP ELISA에서 희석 비-직선성을 나타냄을 입증하였다. PLBL2가 희석 비-직선성의 원인인지의 여부를 결정하기 위해, 항-PLBL2 웨스턴 블롯을 ELISA에 의해 이전에 분석된 동일한 인간화된 IgG 생성물에 대해 수행하였다(실시예 1).

100 μg의 mAb 생성물을 함유하는 샘플을 2x 샘플 완충액(Novex)으로 1:1 희석하고, 4-20% 구배 겔(Novex) 내로 로딩하였다. SDS-PAGE를 일정 전류 하에 30분 동안 겔당 24 mA에서 이어서, 50분 동안 겔당 36 mA에서 수행하였다. 전기영동 후, 겔을 고정하고, 단백질을 SYPRO® Ruby (Thermo Fisher Scientific)로 염색하였다. Sypro® RUBY 염색된 겔을 FLA-3000 형광 이미지 분석기(Fujifilm Corp.) 상에서 이미지화하였다. Sypro® RUBY 이미지(도 2a)는 겔 상의 생성물 각각의 동등한 로딩을 입증한다.

XCell II™ Blot Module (Novex)을 사용하는 PVDF 막(Bio-Rad)에 겔을 전달하고, 25 V의 일정 전압에서 105분 동안 진행시켜 웨스턴 블롯을 수행하였다. 전달 후, TBST (Sigma)로 1:10 희석시킨 형광 차단 완충액(Rockland Immunochemicals)을 사용하여 막을 차단하였다. 차단 후, 막을 TBST로 세척하고, 실온에서 2시간 동안 1 μg/mL의 항-PLBD2 폴리클로날 항체(Abcam, ab138334)와 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 막을 TBST로 10분 동안 3회 세척하였다. 그 후, 막을 실온에서 1시간 동안 1 μg/mL의 마우스 항-토끼 cy3 컨주게이트(Jackson Immunoresearch)와 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 막을 TBST로 10분 동안 3회 세척하였다. 세척 후, 막을 30분 동안 건조되게 하였다. 건조된 막을 FLA-3000 형광 분석기로 이미지화하였다. 이러한 웨스턴 블롯은 20 ng의 PLBL2의 검출 하한을 갖는다. 웨스턴 블롯 이미지(도 2b)는 PLBL2가 mAb7에 대한 최종 벌크 물질에서 검출되며, 다른 IgG 생성물 어느 것에서도 검출되지 않음을 입증한다. 이러한 결과는 PLBL2가 실시예 1에 기술된 mAb7에 대해 관찰된 희석 비-직선성의 원인임을 지지하며, 샘플 중에 존재하는 PLBL2의 양을 정량화하기 위해 추가의 분석이 수행되어야 한다.

실시예 3 - mAb 샘플 중 PLBL2의 정량화

mAb7 중 PLBL2의 검출을 고려할 경우, ELISA가 샘플 중의 PLBL2의 농도를 정확하게 정량화하기 위해 개발되었다. 이러한 ELISA는 자체 개발되었으며, 표준 물질로서 재조합 햄스터 PLBL2 및 검출을 위한 맞춤형 자체 제조된 폴리클로날 항-PLBL2 항체를 사용한다. 이러한 검정은 2.0 ng/mL의 민감도를 갖는다. 샘플에 대한 매개 정밀도는 3.23% CV이다.

PLBL2 ELISA를 사용하여 이전에 조사한 4가지 상이한 mAb 생성물에 대한 정제 공정에 걸쳐 취해진 샘플 중 PLBL2 농도를 정량화하였다. PLBL2 농도를 채취, 이에 이은 제1 크로마토그래피 단계(단계 1) 및 최종 벌크 약물 물질(최종) 후에 측정하였으며, 하기 표 4에서 찾아볼 수 있다.

표 4: PLBL2 ELISA에 의해 정량화된 mAb 정제 샘플 중 PLBL2 농도

표 4에서 발견된 결과는 상당량의 PLBL2가 mAb7의 최종 벌크 약물 물질 중에 잔존하나, 시험한 다른 mAb 생성물에는 존재하지 않음을 입증한다. 흥미롭게도, mAb7에 있어서 채취 물질 중 단지 52%의 PLBL2가 제1 크로마토그래피 정제 단계 동안 제거된 반면, mAb1으로부터는 99.92%가 이 단계 동안 제거된다. 두 생성물 모두 정제를 위해 동일한 수지를 사용한다는 것을 고려하면, 아마도 PLBL2는 mAb 분자와 직접적으로 상호작용하며, 크로마토그래피 수지와는 그렇지 않다.

실시예 4 - SPR에 의한 다양한 mAb에의 PLBL2의 결합

이전 데이터를 기반으로 하여, 하나의 가능한 설명은 PLBL2가 우선적으로 mAb7에 결합하며, 다른 mAb 생성물에는 결합하지 않는다는 것이다. 이전에 주지된 바와 같이, mAb7은 IgG4 분자이며, 이는 다른 하위유형에는 존재하지 않는 PLBL2에 대한 결합 부위를 제공할 수 있다. 왜 PLBL2가 mAb7에 있어서 정제 동안 제거되지 않는지를 추가로 조사하기 위해, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 결합 실험을 수행하였다. 이러한 실험에서, 항-인간 IgG Fc 항체(GE Healthcare)를 Biacore™ T200 기구(GE Healthcare)를 사용하여 Series S CM5 센서 칩(GE Healthcare)의 2개 플로우 셀(FC4 및 FC3)에 ~7000 반응 단위(RU) 수준으로 고정화시켰다. 고정화된 항체를 사용하여 1x HBS-EP+ 완충액(GE Healthcare) 중의 mAb 생성물을 FC4 상에 ~2500 RU 수준으로 포획하였으며, 여기에서 배경 제거를 위한 인 라인 참조 셀로서 FC3을 사용하였다. 재조합 햄스터 PLBL2를 HBS-EP+ 완충액을 사용하여 5 μM로 희석하고, 60초 동안 30 μL/분으로 주입하였다. PLBL2의 분리는 제조업자의 권고된 프로토콜을 사용하여 표면의 재생 전에 180초 동안 측정하였다.

IgG1, IgG2, IgG4 및 IgG2/IgG4 키메라를 포함하는 다양한 하위유형의 7개의 상이한 인간화된 IgG 생성물을 이러한 프로토콜을 사용하는 SPR에 의해 PLBL2 결합에 대해 분석하였다(하기 표 5 참조). 결과는 PLBL2가 시험한 모든 3개의 IgG4 분자에 결합하고, 센서 칩 상에서 mAb의 거의 동등한 포획에도 불구하고(도 3a) 다른 하위유형의 어느 것에도 결합하지 않음을 입증한다(도 3b, 도 3c). 각 mAb에 대한 PLBL2 결합 수준은 하기 표 5에서 찾을 수 있다.

표 5: SPR에 의한 mAb 생성물에 대한 PLBL2 결합 수준.

표 5의 결과는 PLBL2가 IgG4 하위유형의 항체에 대한 증가된 결합 성향을 가짐을 보여준다. 게다가, mAb 2, 3, 5 및 6이 모두 동일한 가변 영역을 함유하기 때문에, 결과는 PLBL2에 대한 향상된 결합 능력의 원인이 IgG4 분자의 불변 영역임을 나타낼 것이다.

특히, PLBL2는 mAb4에 결합하지 않았는데, 이는 IgG2의 생식계열 힌지 영역을 함유하는 반면, 불변 영역의 나머지는 IgG4의 것으로 구성되는 IgG2/IgG4 키메라이다. 이러한 결과는 PLBL2가 mAb 생성물에의 직접적인 결합으로 인해 mAb7의 정제 동안 제거되지 않음을 암시한다.

이러한 결과는 PLBL2의 결합 구동을 주로 담당하는 IgG4 분자의 불변 도메인 뿐만 아니라, 아마도 PLBL2의 결합을 담당하는 이러한 불변 도메인의 힌지 영역임을 나타낼 것이다.

mAb7에 대한 재조합 PLBL2의 결합 친화성을 계산하기 위해, 제2의 SPR 실험을 수행하였다. 이러한 실험은 동일한 고정화된 항-인간 IgG Fc 칩을 사용하였으나, 단지 mAb7을 ~170 RU 수준으로 포획하였다. 포획 후, PLBL2를 30 μL/분으로 120초 동안 주입하고, 1.25 μM 내지 80 μM 범위 농도로 별도 주입하였다. 결합 친화성(K_D)을 정상 상태의 1:1 결합 모델을 사용하는 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.

결과는 농도 증가에 따라 mAb7에 대한 PLBL2의 증가된 결합을 입증한다(도 4a). 정상 상태의 결합 반응(PLBL2 주입 시작 후 ~110초)을 이용하여 결합 친화성을 계산하였다(도 4b). 40.0 μM의 K_D를 mAb7에 대한 PLBL2 결합에 대해 계산하였다. 이는 비교적 약한 결합이지만, 이러한 결과는 실험에서 mAb7 분자를 PLBL2로 포화시키기 위해 HDX-MS 실험의 설정에 유용하였다.

실시예 5 - PLBL2의 결합에 대한 발현 시스템의 효과

이전 실시예는 PLBL2에 결합하는 IgG4 하위유형의 항체의 증가된 성향을 다른 항체 하위유형(예를 들어, IgG1 및 IgG2)과 비교하여 보여주었다. 이러한 항체를 생성하는데 사용된 숙주 세포 발현 시스템이 PLBL2에 대한 이들의 결합력에 영향을 미칠 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 연구를 수행하였다. mAb6(IgG4) 및 mAb3 (IgG2)를 사용하여 연구를 수행하였으며, 이들 둘 모두는 동일한 가변 도메인을 가지나, 상이한 IgG 하위부류이다. 따라서, 이들 분자의 거동의 차이는 항체 불변 도메인이 직접적인 원인일 수 있다.

간략하게는, mAb3을 발현하는 CHO K1a 세포(IgG2)의 또 다른 별도의 배양물과 함께 IgG4 mAb6을 발현하는 CHO K1a 및 HEK 293 세포(각각 mAb6A 및 mAb6B로 언급됨)를 별도로 배양하였다. 이들 배양물을 표준 mAb 정화 및 다운스트림 정제 공정을 거치기 전에 적절한 시점에서 채취하였다. 그 후, 이들 항체 각각의 정제된 샘플을 분석하고, Biacore™ T200를 사용하는 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 PLBL2에 결합하는 이들의 능력을 비교하였다.

샘플(표 6)을 HBS-EP 완충액 중에 20 μg/mL로 희석하고, 10 μL/min로 60초 동안 사전-고정화된 단백질 A 칩(GE Healthcare)의 활성 플로우 셀 위에 주입하였다. 그 후, HBS-EP 중의 100 μg/mL로 희석된 PLBL2를 5 μL/min로 120초 동안 활성 플로우 셀 및 기준 플로우 셀 둘 모두 위에 주입하였다. 두 플로우 셀 모두를 30 μL/min로 10초 동안 10 mM 글리신 pH 1.5 및 이어서 30 μL/min으로 30초 동안 HBS-EP를 사용하여 재생시켰다.

표 6: 항체를 생성시키는데 사용된 분자 포맷 및 숙주 세포 발현 시스템

결과(도 5)는 두 IgG4 분자 모두가 상이한 세포주에서 발생함에도 불구하고 유사하게 PLBL2와 상호작용함을 입증하였다. 한편, IgG2 분자는 상호작용하지 않는다. 표 7은 각 샘플에 의해 생성된 임의의 값을 입증한다.

표 7: 상이한 숙주 시스템에서 발현된 IgG4 및 IgG2 분자에의 PLBL2의 결합

실시예 6 - IgG2 및 IgG4 하위타입의 항체의 결합 친화성의 정량화

이전 실험은 IgG4 하위부류의 항체의 다른 하위부류(예를 들어, IgG1 및 IgG2) 대비 증가된 PLBL2에 결합하는 능력을 보여주었다. 연구는 또한, PLBL2에 대한 IgG4의 항체의 친화성을 정량화하기 위해 수행되었다.

샘플을 실시예 5에 기술된 바와 같이 생성시켰다. 그 후, 이러한 샘플 중 항체와의 PLBL2 결합 친화성을 Octet® RED 384 기구를 이용하는 바이오 층 간섭계(BLI)에 의해 평가하였다. 샘플(표 6에 언급된 것과 동일)을 PBS-T 중에서 10 μg/mL로 희석하였다. 시중에서 입수가능한 단백질 A 바이오센서(Pall)를 1000 RPM에서 120초 동안 각 샘플에 딥핑시켰다. 그 후, 로딩된 바이오센서를 1000 RPM에서 300초 동안 다양한 농도(1538 nM 일련의 2배 희석으로 16 nM)의 PLBL2 내로 딥핑시켜 결합을 평가한 후, 1000 RPM에서 300초 동안 PBS-T 내로 딥핑시켜 분해를 평가하였다. 바이오센서를 제조업자의 지시에 따라 10 mM 글리신 pH 1.5 및 PBS-T를 사용하여 재생시켰다.

결과(표 8)는 1:1 결합 모델을 지닌 로컬 핏(local fit)을 사용하여 생성시켰다. mAb3에 대해서는 친화성 데이터가 획득되지 못하였는데, 여기에는 상호작용이 없기 때문이었다(도 6a). mAb6A 및 mAb6B 둘 모두는 낮은 친화성을 가졌다; mAb6A는 더 빠른 결합 속도로 인해 mAb6B 대비 대략 14배 높은 친화성을 가졌다. 한편, 분해 속도는 유사하였다. mAb6A 및 mAb6B의 피팅은 각각 도 6b 및 6c에서 입증된다.

이들 결과는 숙주 세포 발현 시스템이 발현된 IgG4의 PLBL2에 대한 결합 능력에 영향을 미치지 않는 반면, 잠재적으로 분자의 결합 친화성에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다.

표 8: IgG2 및 IgG4 분자의 결합 친화성

실시예 7 - HDX -MS에 의해 입증된 mAb7과 PLBL2 사이의 상호작용

mAb7과 PLBL2의 기초적인 과학적 상호작용을 추가로 이해하기 위해, mAb7 및 PLBL2 샘플과 결합된 mAb7의 HDX-MS 분석을 Synapt G2-S 질량 분광계에 결합된 Waters HDX 매니저 시스템을 사용하여 수행하였다. SPR에 의한 40.0 μM의 K_D에 기초하여, ~70%의 mAb가 중수소 라벨링 후 PLBL2와 결합된다. 중수소 라벨링은 0.5분, 5분, 60분, 120분, 180분 및 240분에 측정되었다. Waters DynamX 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, HDX 미분 플롯을 생성시켰다(도 7). 수직 스틱은 6개의 라벨링 시점으로부터 각 펩티드의 총 HDX 차이를 나타낸다. 비결합된 및 PLBL2-결합된 mAb7의 HDX 프로파일의 비교는, 중쇄의 영역 K218-F256이 PLBL2에 결합시 중수소 흡수 감소를 보임을 나타냈다. 이는 mAb7에의 PLBL2 결합으로 인해 이러한 영역의 안정화를 나타내며, 다른 실험 결합 결과와 잘 연관된다.

실시예 8 - 다양한 mAb의 힌지 영역의 서열 정렬

이전 결과는 PLBL2가 생성물에 직접 결합하고 공동-정제됨으로써 mAb7(IgG4 분자)을 오염시킴을 입증한다. 유사하게는, 이전 실시예는 또한 IgG4 하위유형인 mAb5 및 mAb6이 또한, PLBL2에 결합할 수 있음을 보여주었다. 다양한 아이소형의 mAb에 대한 PLBL2 결합의 분석은 결합이 IgG4 분자의 힌지 영역에서 발생할 가능성이 가장 높음을 시사하였으며, 이는 HDX-MS 데이터에 의해 지지되었다. 다른 IgG 아이소형에서 소수의 다른 아미노산을 고려하면, PLBL2 결합에 관련된 개별 아미노산 잔기가 확일된 가능성이 있다. PLBL2 결합에 관련된 IgG4 아미노산 잔기를 결정하기 위해, mAb 생성물의 힌지 영역의 아미노산 서열 정렬을 생성시켰다.

서열 정렬 분석에서, 관심 잔기는 PLBL2가 결합하는 것으로 관찰된 IgG4 분자(mAb5, mAb6 및 mAb7)에서는 보존되며, PLBL2가 결합하지 않은 다른 IgG 하위유형에서는 보존되지 않은(즉, 상이한 잔기) 잔기이다. 이러한 분석은 검정 박스로 윤곽을 나타낸 10개의 이러한 잔기를 생산하였다(도 8). 특히, 관심 잔기는 K203, R222, S227, Y229, G230, P237, P238, E246, F247 및 E248이다.

IgG4에서 발견된 아미노산으로부터 IgG2 또는 IgG1에서 발견된 아미노산으로의 이러한 10개 잔기의 돌연변이는 PLBL2가 IgG4 분자에 결합하는 것을 방지할 것으로 예상되었다.

실시예 9 - PLBL2에의 결합을 완화시키기 위한 IgG4 힌지 영역 잔기의 돌연변이유발

실시예 1 내지 8에 상세히 기술된 연구는 IgG4 분자의 불변 영역이 PLBL2에의 이러한 면역글로불린의 결합을 가능하게 하는 주요 원인임을 보여주었다. 게다가, IgG4와 IgG2/IgG4 키메라 사이에 수행된 비교는 PLBL2와의 이러한 상호작용이 분자의 힌지 영역에 또는 그 근처에 위치하도록 하였다. 연구된 다양한 분자의 아미노산 서열의 정렬은 제거 과정을 통해 PLBL2 결합에 역할을 하는 힌지 영역 내의 특정 아미노산을 확인할 수 있게 하였다. 최종 단계는 IgG4 분자의 힌지 영역의 변형이 PLBL2에의 이러한 면역글로불린의 하위부류의 결합을 완화시킬 수 있는 방법을 보여주는 확인성 돌연변이유발 실험을 수행하는 것이다.

PLBL2의 IgG4 하위부류의 항체로의 결합 유발을 담당하는 것으로 확인된 10개 아미노산 잔기 중 7개를 대안적 아미노산 예컨대, 인간 IgG1 및/또는 IgG2 항체의 생식계열 힌지 서열에서 발견된 아미노산으로 치환하는 연구를 수행하였다. 모델 분자로서 mAb5를 사용하여, HEK293 숙주 세포 발현 시스템이 많은 mAb5 변이체를 인코딩하는 벡터 DNA 즉, 변형된 힌지 영역으로 일시적으로 형질감염된 돌연변이유발 실험을 수행하였다.

mAb5의 힌지영역에 대한 돌연변이는 PLBL2 결합에 어느 정도 영향를 미치는 역할을 갖는 것으로 이전에 확인된 아미노산 서열 위치에서 발생하였다(실시예 8). 돌연변이를 표 1에 기술된 바와 같이 단일 점 돌연변이는 물론 이들의 다양한 조합으로서 도입시켜, 7개의 상이한 힌지 변형된 IgG4 변이 분자(mAb5-1B, 2B, 3B, 4B, 6B 및 7B)의 생성을 발생시켰다. 동시에, 비변형된 모 IgG4(mAb5B)를 일시적으로 발현하도록 배양을 또한 설정하였다. 이에 더하여, 상이한 항원 표적에 대해 유도된 것이지만, mAb7, 또한 IgG4의 힌지 영역에 대한 돌연변이가 또한, 단일 점 돌연변이는 물론 이의 다양한 조합으로서 만들어져, 3개의 상이한 힌지 변형된 변이(mAb7-2B, 4B 및 5B)의 생성을 발생시켰다.

이러한 변이체의 접미사 넘버링은 만들어진 돌연변이를 반영하며, 넘버링은 힌지 변형된 IgG4 변이체의 두 세트 모두에 걸쳐 유지되었다. 따라서, mAb5-2B의 힌지 영역은 mAb7-2B의 것과 동일하다.

또한, 추가적인 대조군으로서 IgG2(mAb3B) 및 IgG4(mAb6B) 뿐만 아니라 힌지 변형된 IgG1 변이체(mAb2-αB)를 발현하도록 배양을 설정하였다. 도 9는 이러한 IgG4 변이체의 변형된 힌지 영역을 예시하며, 이들을 본 연구에 포함된 다른 mAb 분자의 힌지 영역 서열에 대해 정렬한다. 도 9는 평가된 다양한 분자를 상세히 설명한다. 분자 이름에서 접미사 "A" 및 "B"는 항체가 각각 CHO K1 또는 HEK293 세포에서 발현되는지의 여부를 나타낸다.

표 9: 평가된 IgG1 , IgG2 , IgG4 및 IgG4 변이체에 대한 세부 정보

HEK293 세포에 의해 생성된 물질을 표준 mAb 정제 과정을 이용하여 정제하였다. 간략하게는, 생성물 mAb의 충분한 일시적 발현을 위한 적절한 기간 동안의 배양 후, 세포를 제거하고, 정화된 세포 배양 상청액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 단백질 A 용출액을 Tris 용액을 사용하여 중성 pH로 적정하였다. 그 후, 연구하의 다양한 mAb 분자를 함유하는 중성화된 단백질 A 용출물을 실시예 10 내지 12에 기술된 바와 같이 일련의 결합 검정으로 처리하였다.

실시예 10 - IgG2 , IgG4 및 IgG4 변이체 분자에 대한 PLBL2 상호작용 검정

재조합 인간 PLBL2와 실시예 9에 기술되고 생성된 다양한 mAb의 상호작용은 Biacore™ T200 (GE Healthcare) 결합 방법을 사용하는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 평가하였다. 20 μg/mL의 mAb를 10 μL/min으로 60초 동안 시중에서 입수가능한 사전-고정화된 단백질 A 칩(GE Healthcare)의 플로우 셀 4에 주입하고, 10초 동안 HBS-EP+ 진행 완충액에서 안정화되게 하였다. 포획된 항체 수준의 변동률은 10% 미만이었다. 그 후, 100 μg/mL (1538 nM) 재조합 인간 PLBL2를 5 μL/min로 120초 동안 플로우 셀 4 및 3에 주입하였다. 플로우 셀 3은 인-라인 참조 세포로서 작용하며, 저친화성 상호작용을 유도하기 위해 감소된 5 μL/min 유량을 이용하였다. 그 후, 센서를 30 μL/min으로 10초 동안 10 mM 글리신 pH 1.5로 재생시켰다.

이전 실험의 결과에 기초하여, mAb8A (IgG1 임)는 재조합 인간 PLBL2와 상호작용하지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이는 음성 대조군으로서 사용하였으며, 이에 대해 결과를 표준화시켰다.

SPR 분석의 결과(도 10)는 PLBL2의 mAb5-2B 및 mAb5-4B에 대한 RU가 이들의 모 분자(mAb5B) 대비 대략 90% 감소하며, PLBL2의 mAb7-2B 및 mAb7-4B에 대한 RU가 이들의 모 분자(mAb7A) 대비 대략 80% 떨어짐을 나타낸다. mAb5-3B는 결합에 있어서 변화가 없음을 입증하였으며, 이는 이러한 돌연변이 단독은 상호작용 감소에 비성공적이었음을 나타낸다. mAb5-2B는 222번 위치에서 아르기닌으로부터 리신으로의 단일 아미노산 치환을 함유한다. mAb5-3B는 227번 위치에서 세린으로부터 프롤린으로의 단일 아미노산 치환을 함유한다. mAb5-4B는 mAb5-2B 및 mAb5-3B 둘 모두에 존재하는 돌연변이를 함유하며; 이는 227번 위치에서 프롤린 치환이 PLBL2 상호작용을 감소시키지 않으면서, 또한 부작용을 갖지 않으며, 관찰된 PLBL2 결합 감소가 222번 위치에서의 리신 치환으로 인한 것임을 나타낸다. 실제로, mAb2(도 9)에서 222번 위치의 리신을 아르기닌으로 치환하면(이는 이 위치에서 IgG1에서 IgG4로의 생식계열 교체를 나타냄), PLBL2에의 결합을 나타내지 않는 모 분자(mAb2)와 비교할 경우, SPR에 의해 PLBL2에의 증가된 결합을 갖는 돌연변이(mAb2-αB)를 발생시켰다. mAb5(도 9)에서 222번 위치의 아르기닌을 트레오닌으로 교체하면(이는 이 위치에서 IgG4로부터 IgG2로의 생식계열 교체를 나타냄), 모 분자(mAb5)와 비교하여, SPR에 의해 PLBL2에 대한 대략 30% 감소된 결합을 갖는 돌연변이(mAb5-8B)를 발생시켰다.

이러한 데이터는 222번 위치에서 아르기닌이 PLBL2 결합을 촉진하는데 있어서 중요 인자임을 시사하는 반면, 다른 힌지 잔기 또한 이러한 HCP의 결합에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 mAb5-5B에 의해 나타난 감소된 PLBL2 결합에 의해 입증되었다(도 10). mAb8A는 PLBL2와의 상호작용이 존재하지 않음을 입증하는 반면; mAb6B는 가장 많은 양의 결합을 입증하였다.

실시예 11 - IgG2 , IgG4 및 IgG4 변이체 분자에 대한 PLBL2 친화성 검정

실시예 9에 기술되고 생성된 다양한 mAb에 대한 PLBL2의 상호작용의 친화성을 Octet® RED 384 기구(ForteBio)를 사용하는 바이오층 간섭계(BLI)에 의해 실시예 6에 기술된 동일한 방식으로 평가하였다.

시중에서 입수가능한 단백질 A 바이오센서를 1000 RPM에서 120초 동안 10 μg/mL으로 각 샘플에 딥핑시켰다. 바이오센서를 1000 RPM에서 30초 동안 검정 완충액(HBS-EP+) 내에 딥핑시켜 느슨하게 결합된 단백질의 분해를 허용하였다. 그 후, 로딩된 바이오센서를 다양한 농도(1538, 769.2, 384.6, 192.3, 96.15, 48.15, 24, 0 nM)의 재조합 인간 PLBL2 내에 딥핑시키고, 5분 동안 HBS-EP+ 내에 최종적으로 딥핑시켰다.

결합 및 분해 속도를 글로벌 피트(global fit)를 지닌 1:1 결합 모델을 사용하여 측정하였다; 그러나, 빠른 속도로 인해 분해 곡선의 단지 처음 50초만 분석되었다. 결과는 표 10에 입증되어 있다.

표 10: IgG1 , IgG2 , IgG4 및 IgG4 변이체 분자의 결합 친화성

*mAb5B의 KD에 기초하여 계산된 배수 변화

불량한 곡선 핏팅으로 인해 mAb5-2B, mAb5-4B, mAb7-2B, mAb7-4B 및 mAb8A에 대한 운동역학적 값은 계산될 수 없으며, 이는 이들 분자에 있어서 PLBL2에 대한 상호작용이 존재하지 않았음을 나타낸다. 이러한 결과는 실시예 10으로부터의 발견과 일치하며, 이는 또한 이들 샘플에 있어서 PLBL2에 대한 결합에 영향을 미침을 입증한다. mAb5-6B에 대한 K_D에서의 큰 감소(10x 초과)가 모 분자(mAb5B)와 비교하여 관찰되었다. mAb5-1B 및 mAb5-7B는 약간 더 빨라진 분해 속도(k_on)로 인해 PLBL2에 대한 약간 증가된 친화성을 입증하였으며, 이는 바람직하지 않다. 모든 나머지 돌연변이는 모 분자와 비교할 경우 PLBL2에 대한 결합에서 10x 미만의 감소를 입증하였으며, 결합 친화성에서의 이러한 변화는 유의하지 않은 것으로 간주되었다.

실시예 12 - IgG2 , IgG4 및 변이 IgG4 분자의 항원 결합

항체 분자 mAb3, mAb5(힌지 변형된 변이체 모두를 포함) 및 mAb6 모두는 동일한 가변 영역을 포함하는데, 이들 항체가 동일한 항원에 대해 표적화되기 때문이다. 샘플 돌연변이유발이 각 분자의 항원 결합 활성에 해로운 영향을 미치지 않았음을 입증하기 위해, 항원 결합을 Biacore™ T200 (GE Healthcare)을 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 평가하였다. 활성은 리간드를 포획하기 위해 사전-고정화된 단백질 A 센서(GE Healthcare)를 사용함으로써 평가되었다. 사용 전에 센서 표면을 재생시키기 위해 (30 μL/min에서 60초 동안 10 mM 글리신 pH 1.5를 사용함) 5x 시동 사이클을 모든 플로우 셀 위에서 진행시켰다. 각 mAb 샘플을 PBS-T 중에서 10 μg/mL로 희석시키고, 10초의 안정화 기간을 가지면서 10 μL/min으로 60초 동안 플로우 셀 4 상에 주입하였다. 그 후, 10 μg/mL의 표적 항원을 플로우 셀 4 및 3 위에 10 μL/min로 60초 동안 주입한 후, 주입을 중단하고, 검정 완충액을 100초 동안 10 μL/min의 유량으로 주입하여 분해를 허용하였다. 그 후, 센서 표면을 30 μL/min으로 60초 동안 10 mM 글리신 pH 1.5를 사용하여 재생시켰으며, 다음 주입에 준비되게 하였다.

각 분자의 활성을 계산하기 위해, 항원 결합 반응(RU)을 항체 포획 반응(RU)으로 나누고, 백분율로서 보고하였다. 보고된 백분율은 샘플 중에 존재하는 항체로서, 이의 항원에 여전히 결합할 수 있는 항체의 양을 나타낸다. 이러한 실험으로 인한 검정 오차는 10%이다. 표 11은 모든 mAb가 표적 항원에 대한 100±10% 활성을 입증하였음을 보여주며, 이는 결합에 있어서 손실 또는 변화가 없었음을 나타낸다. 모든 돌연변이는 유사하게 수행하였다. 특히, mAb5B 또는 임의의 이의 힌지 변형된 변이체(mAb5-1B 내지 7B)의 결합에서의 차이는 없었다.

표 11: 표적 항원에의 각 mAb의 IgG2 및 IgG4 하위부류의 결합

실시예 13 - 숙주 세포 단백질( HCP ) 로의 IgG4 결합 완화

문제의 숙주 세포 단백질은 생성물과 전형적으로 공동-정제되며, 일반적으로 단지 미량으로 존재하지만, 완전히 정제된 약물 물질 중에 존재하는 수준이 안전성 문제 및 약물 효율성 문제 둘 모두를 제기할 수 있는 경우가 있다. PLBL2의 결합이 이의 중요한 예를 제시하지만, 관심 항체 생성물과 상호작용하는 다른 문제의 숙주 세포 단백질이 보고된 경우가 있다.

그 결과, IgG4 힌지 영역 변형의 효과를 입증하기 위해 연구가 수행되어 다른 HCP의 결합을 완화시킬 수 있다. 제1 단계는 예를 들어, 모델 분자로서 mAb6을 사용하여 IgG4와의 상호작용 성향을 갖는 HCP를 확인하고자 하는 것이다. 이들 HCP는 HCP 부화 방법을 이용하여 확인될 수 있으며, 이에 의해 mAb의 Fc 영역은 시중에서 입수가능한 단백질 A 비드에 결합하여 null CHO K1 정화된 비처리된 벌크(CUB) 물질과 다중의 10분 인큐베이션 기간으로 처리될 것이다. 그 후, 최종 결합된 복합물을 비드로부터 용출시키고, LC-MS/MS를 사용하여 분석하였다. 다중 반응 모니터링(MRM) 방법을 이용하여 본 숙주 세포 단백질을 정량화할 수 있다.

일단 이들 HCP가 성공적으로 확인되면, 이전 실시예에 상세히 설명된 방법을 이용하여 실시예 9에 생성 방법이 기술되어 있는 변형된 mAb5 돌연변이와 함께 원래 mAb5 분자 둘 모두에 대한 이들 HCP의 결합을 평가할 수 있다. 이들 연구는 본 발명의 주제인 힌지 영역 변형을 이용하여 IgG4에의 PLBL2 결합을 완화시킬 뿐만 아니라, 더욱 광범위하게는, 더욱 일반적으로 HCP에 대한 결합 성향을 감소시키는 능력을 예시하기 위해 제공될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited <120> ANTIBODIES WITH REDUCED BINDING TO PROCESS IMPURITIES <130> PB66137 <150> US62/404849 <151> 2016-10-06 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 61 <212> PRT <213> Human <400> 1 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 1 5 10 15 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 20 25 30 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 35 40 45 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 50 55 60 <210> 2 <211> 61 <212> PRT <213> Human <400> 2 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 1 5 10 15 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 20 25 30 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 35 40 45 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 50 55 60 <210> 3 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mAb3 (IgG2) <400> 3 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn 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<400> 15 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr 1 5 10 15 Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 20 25 30 Val Glu Ser Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 35 40 45 Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 50 55 <210> 16 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mAb5-6B (IgG4) <400> 16 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr 1 5 10 15 Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 20 25 30 Val Glu Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 35 40 45 Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 50 55 60 <210> 17 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mAb5-7B (IgG4) <400> 17 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr 1 5 10 15 Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 20 25 30 Val Leu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 35 40 45 Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 50 55 <210> 18 <211> 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Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr 1 5 10 15 Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 20 25 30 Val Glu Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 35 40 45 Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 50 55 <210> 38 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mAb7-5B(IgG4) <400> 38 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr 1 5 10 15 Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 20 25 30 Val Glu Ser Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 35 40 45 Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 50 55

Claims

중쇄 불변 영역에서 Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 영역의 아미노산 중 임의의 하나의 아미노산 또는 아미노산의 조합에서 변형된 변이 IgG4 항체로서, 비변형된 IgG4 항체와 비교하여 숙주 세포 단백질(HCP)에 대한 감소된 결합 수준을 갖는 변이 IgG4 항체.
제1항에 있어서, 변형이
(a) IgG1, IgG2 및/또는 IgG3 항체 생식계열 서열 중 동등한 아미노산 서열로의 하나 이상의 치환(들); 및/또는
(b) Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 영역에서 아미노산 중 임의의 하나의 아미노산 또는 아미노산의 조합의 결실; 및/또는
(c) Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 영역에서 하나 이상의 아미노산의 삽입을 포함하는 변이 IgG4 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 변형이
(a) Kabat 잔기 226번 및 243번을 포함하는 Kabat 잔기 226번과 243번 사이의 힌지 영역의 하나 이상의 아미노산의 변형; 및/또는
(b) Kabat 잔기 203번의 변형; 및/또는
(c) Kabat 잔기 222번의 변형; 및/또는
(d) K203의 R, E 또는 Q; R222의 T, K 또는 Q; E226의 L 또는 I; S227의 R, P, A, N 또는 T; Y229의 S, C, F, W 또는 H; G230의 C, A, N 또는 S; P237의 H, E, D 또는 V; 및/또는 P238의 T, K 또는 E로의 치환을 포함하는 하나 이상의 아미노산의 치환; 및/또는
(e) ESKYGPP (SEQ ID NO: 26) (Kabat 잔기 226번 내지 238번)의 EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 27), 또는 ERKYGPP (SEQ ID NO: 28), 또는 ERKCCVE (SEQ ID NO: 29), 또는 ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 30)로의 대체; 및/또는
(f) YGPP (SEQ ID NO: 23) (Kabat 잔기 229번 내지 238번)의 SCDKTHT (SEQ ID NO: 24) 또는 CCVE (SEQ ID NO: 25)로의 대체를 포함하는 변이 IgG4 항체.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, IgG4 항체가 비변형된 IgG4 항체와 비교하여 숙주 세포 단백질(HCP)에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 결합 활성을 갖는 변이 IgG4 항체.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 변이 IgG4 항체가 S241의 P로의 추가 치환 및/또는 L248의 E로의 추가 치환 및/또는 EFLGGP (SEQ ID NO: 31) (Kabat 잔기 246번 내지 251번)의 PAAAP (SEQ ID NO: 33) 또는 PAAAS (SEQ ID NO: 32)로의 대체를 포함하는 변이 IgG4 항체.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 변이 IgG4 항체가 서열 CPPC (SEQ ID NO: 20) (Kabat 잔기 239번 내지 242번)를 포함하는 변이 IgG4 항체.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 비변형된 IgG4 항체와 비교하여 중쇄 불변 영역에서 추가의 변형이 이루어지지 않은 변이 IgG4 항체.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포 단백질이 추정 포스포리파제 B-유사 2(putative phospholipase B-Like 2: PLBL2)인 변이 IgG4 항체.
제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항의 변이 IgG4 항체를 인코딩하는 세포주.
IgG 항체를 변형시켜 공정 불순물에 대한 결합을 감소시키는 방법으로서,
a) 공정 불순물의 결합에 관련된 적어도 하나의 아미노산을 확인하는 단계; 및
b) 공정 불순물과의 결합에 관련된 것으로 확인된 아미노산을 다른 아미노산으로 치환함으로써 IgG 항체의 변이체를 생성시키는 단계를 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 공정 불순물의 결합에 관련된 아미노산이 단백질-단백질 상호작용 연구를 위한 방법 또는 방법들의 조합을 이용하여 확인되는 방법.
제11항에 있어서, 단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위한 방법이 수소 중수소 교환 질량 분광법(HDX-MS)인 방법.
제10항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 공정 불순물과의 결합에 관련된 것으로서 확인된 아미노산이 중쇄 불변 영역에 존재하는 방법.
제10항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 공정 불순물이 숙주 세포 단백질인 방법.
중쇄 불변 영역에서 Kabat 잔기 203번과 256번 사이의 영역의 아미노산 중 임의의 하나의 아미노산 또는 아미노산의 조합에서 항체 서열을 변형시키는 것을 포함하여, 숙주 세포 단백질(HCP)에 대한 결합이 감소된 IgG4 항체를 생성시키는 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 숙주 세포 단백질이 추정 포스포리파제 B-유사 2(PLBL2)인 방법.
제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따른 변이 IgG4 항체를 포함하는 조성물.
제17항에 있어서, 변이 IgG4 항체의 농도가 적어도 10 mg/mL, 적어도 20 mg/mL, 적어도 50 mg/mL, 적어도 75 mg/mL 또는 적어도 100 mg/mL인 조성물.
제17항 또는 제18항에 있어서, 조성물 중의 추정 포스포리파제 B-유사 2(PLBL2)의 농도가 500 ppm 미만, 100 ppm 미만 또는 10 ppm 미만인 조성물.
제17항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 완충액 및/또는 지방산 에스테르를 추가로 포함하며; 임의적으로, 지방산 에스테르가 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80인 조성물.