JP2019532957A - 工程不純物への結合が低下している抗体 - Google Patents
工程不純物への結合が低下している抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019532957A JP2019532957A JP2019518304A JP2019518304A JP2019532957A JP 2019532957 A JP2019532957 A JP 2019532957A JP 2019518304 A JP2019518304 A JP 2019518304A JP 2019518304 A JP2019518304 A JP 2019518304A JP 2019532957 A JP2019532957 A JP 2019532957A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- binding
- igg4
- plbl2
- antibody
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 170
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 117
- 239000012535 impurity Substances 0.000 title claims abstract description 52
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 47
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 108
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 106
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 82
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical group COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 63
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 111
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 47
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 43
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 43
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 42
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 14
- 102100036164 Putative phospholipase B-like 2 Human genes 0.000 claims description 11
- 101710200837 Putative phospholipase B-like 2 Proteins 0.000 claims description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 8
- -1 fatty acid ester Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 7
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 6
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 6
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 6
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 claims description 6
- WLKSPGHQGFFKGE-UHFFFAOYSA-N 1-chloropropan-2-yl n-(3-chlorophenyl)carbamate Chemical compound ClCC(C)OC(=O)NC1=CC=CC(Cl)=C1 WLKSPGHQGFFKGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004295 calcium sulphite Substances 0.000 claims description 5
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 3
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 claims description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 claims description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 claims 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 98
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 70
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 64
- 239000000047 product Substances 0.000 description 51
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 49
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- 101100075831 Caenorhabditis elegans mab-7 gene Proteins 0.000 description 32
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 29
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 28
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 23
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 23
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 22
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 22
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 21
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 19
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 17
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 16
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 15
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 14
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 14
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 101100075829 Caenorhabditis elegans mab-3 gene Proteins 0.000 description 12
- 101100075830 Caenorhabditis elegans mab-5 gene Proteins 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 12
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 10
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 10
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 10
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 9
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- 238000012855 HCP-ELISA Methods 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 231100000617 superantigen Toxicity 0.000 description 8
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 7
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 7
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 101000686985 Mouse mammary tumor virus (strain C3H) Protein PR73 Proteins 0.000 description 6
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 6
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 6
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 6
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical group C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical group CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Chemical group C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical group CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 5
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 239000004474 valine Chemical group 0.000 description 5
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 4
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 4
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 4
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 4
- 101100476210 Caenorhabditis elegans rnt-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000013590 bulk material Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000010979 ruby Substances 0.000 description 3
- 229910001750 ruby Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 2
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 2
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000012512 bulk drug substance Substances 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 2
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010021468 Fc gamma receptor IIA Proteins 0.000 description 1
- 108010021472 Fc gamma receptor IIB Proteins 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 1
- 102100029205 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Human genes 0.000 description 1
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 1
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 229920000037 Polyproline Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 150000001483 arginine derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N batilol Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCCOCC(O)CO OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000011118 depth filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 238000012434 mixed-mode chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 108010026466 polyproline Proteins 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000011028 process validation Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/522—CH1 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/53—Hinge
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Information Retrieval, Db Structures And Fs Structures Therefor (AREA)
Abstract
Description
a)工程不純物の結合に関与する少なくとも1つのアミノ酸を同定するステップ、及び
b)工程不純物との結合に関与すると同定されたアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することにより、IgG抗体のバリアントを作製するステップ
を含む方法が提供される。
IgG4は、IgGアイソタイプIgG1、IgG2、及びIgG3と重鎖定常領域において95%を超える配列相同性を共有する。IgG4は、IgG1と比べて、活性化Fcガンマ受容体、すなわちFcγRIIa及びFcγRIIIaへの結合親和性が低い。IgG4は、IgG1と比べて、高親和性FcγRIに対する弱から中程度の結合親和性を有する。IgG4は、IgG1と似た抑制性FcγRIIbへの結合親和性を維持している。IgG4は、IgG1と同じようにFcRnにも結合する。IgG4は、C1qタンパク質複合体への結合を示さない、又はごくわずかな結合を示し、古典的補体経路を活性化することができず、これによりCDC活性が低下している。IgG4は、ADCC活性が低下している、又はADCC活性がない。エフェクター結合のこの低下は、エフェクター機能が不要である又は望ましくない、組換え抗体で使用するIgG4重鎖定常ドメインを選択することにつながった。
本発明者らは、IgG分子の保存領域と、PLBL2を含むがこれに限定されないHCPなどの工程不純物を前記分子が結合する能力の間の、予想外の関係を同定した。具体的には、本発明者らは、IgG4サブクラスの抗体の高度に保存されたヒンジ領域の主要なアミノ酸残基及び周囲の配列を同定した。これらは、PLBL2などのHCPにこれらの抗体を結合させることに関与する。これらのアミノ酸残基が修飾される場合、その結果生じる修飾IgG4分子は、前述の修飾がない親IgG4分子と比べて、前記修飾なしに、同じIgG4エフェクター機能(例えば、IgG4分子のFcRn受容体結合挙動)を維持しながら、PLBL2などのHCPを結合する能力の低下を示す。さらに、修飾IgG4分子は、前記修飾がないIgG4の、安定性、剪断挙動などの生物物理学的特性を少なくとも維持(又は増強)する。
(i)K203からR、E、若しくはQ;R222からT、K、若しくはQ;E226からL若しくはI;S227からR、P、A、N、若しくはT;Y229からS、C、F、W、若しくはH;G230からC、A、N、若しくはS;P237からH、E、D、若しくはV;及び/又はP238からT、K、若しくはEを含む1つ以上のアミノ酸の置換、及び/又は
(ii)EPKSCDKTHT(配列番号27)、若しくはERKYGPP(配列番号28)、若しくはERKCCVE(配列番号29)、若しくはELKTPLGDTTHT(配列番号30)によるESKYGPP(配列番号26)(Kabat残基226〜238)の置換、及び/又は
(iii)SCDKTHT(配列番号24)、若しくはCCVE(配列番号25)によるYGPP(配列番号23)(Kabat残基229〜238)の置換のいずれか1つ又は組み合わせを含む。これらの修飾は、表1にまとめられている。
本発明のさらなる態様によれば、重鎖定常領域においてKabat残基203〜256の間の領域のアミノ酸のいずれか1つ又は組み合わせで修飾されているバリアントIgG抗体であって、非修飾IgG抗体と比べて、宿主細胞タンパク質(HCP)への結合レベルが低下しているバリアントIgG4抗体が提供される。例えば、バリアントIgG抗体は、Kabat残基203〜256の間の重鎖定常領域の1〜25個のアミノ酸で修飾されている。例えば、バリアントIgG抗体は、Kabat残基203〜256の間の重鎖定常領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、又は23個のアミノ酸で修飾されている。例えば、バリアントIgG抗体は、重鎖定常領域のKabat 197位、198位、203位、207位、211位、222位、226位、227位、229位、230位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、246位、247位、248位、249位、250位、又は251位のいずれか1つ又は組み合わせで修飾されている。例えば、バリアントIgG抗体は、重鎖定常領域のKabat 203位、222位、226位、227位、229位、230位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、247位、248位、又は251位のいずれか1つ又は組み合わせで修飾されている。
宿主細胞タンパク質、又は「HCP」は、細胞培養又は発酵中に宿主細胞により産生される、細胞内及び/又は分泌タンパク質を含む目的とするタンパク質(すなわち、組換えタンパク質/バリアントIgG4)に関係のないタンパク質を指す。宿主細胞タンパク質の例は、精製中及び精製後に依然として存在するならば、目的とするタンパク質に損害をもたらし得るプロテアーゼである。例えば、プロテアーゼが、目的とするタンパク質を含む試料中に残留しているならば、もともと存在しなかった産物関連物質又は不純物を作り出す可能性がある。プロテアーゼの存在は、精製工程中の時間と共に、及び/又は最終製剤中の目的とするタンパク質の崩壊を引き起こす可能性がある。
本発明のさらなる態様によれば、本明細書に定義されるバリアントIgG4抗体を含む組成物が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、治療において使用するための本明細書に定義されるバリアントIgG4抗体が提供される。本発明は、種々の標的に対する様々なIgG4抗体に適用し得、したがって前記IgG4バリアントは、一連の疾患を処置するのに使用することができることが、当業者によって理解されるであろう。
本明細書に提供されるのは、抗体バリアント、及び工程不純物結合レベルを低下させるために、アミノ酸配列変化により修飾されている前記抗体バリアントを作製する方法である。これらの修飾は、得られた医薬品中に存在する工程不純物の量を低下させる有益な効果がある。
a)工程不純物の結合に関与する少なくとも1つのアミノ酸を同定するステップ、及び
b)工程不純物との結合に関与すると同定されたアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することにより、IgG抗体のバリアントを作出するステップ
を含む方法が提供される。
a)工程不純物の結合に関与する少なくとも1つのアミノ酸を同定するステップ、及び
b)工程不純物との結合に関与すると同定されたアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することにより、IgG抗体のバリアントを作出するステップ
を含む方法が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、宿主細胞タンパク質(HCP)への結合が低下しているIgG4抗体を作製する方法であって、抗体配列を重鎖定常領域においてKabat残基203〜256の間の領域のアミノ酸のいずれか1つ又は組み合わせで修飾することを含む方法が提供される。
特に定義されない限り、本明細書に使用された全ての技術的及び科学的用語は、(例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション法、タンパク質精製及び生化学における)当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。標準的な手法は、分子的、遺伝的、及び生化学的方法、並びに化学的方法に使用される。
最終バルクmAbのHCP ELISA希釈直線性
以前の研究は、宿主細胞タンパク質(HCP)phospholipase B-Like 2(PLBL2)が、哺乳動物細胞宿主を用いて生成された抗体試料中に存在する可能性を示した。さらに、PLBL2の存在は、試料中の合計HCPレベルをELISAにより定量化する場合に観察される希釈非直線性の原因となり得る。最終バルク原体中にPLBL2を含有する可能性があるmAb製品を同定するために、HCP ELISAを行って試料の希釈直線性を評価した。CHO由来製品試料中の免疫原性HCPの合計量を定量化するために、独自のELISAを社内で開発した。このHCP ELISAは、GSKのCHO由来製品間の多品種使用のために、カスタムヤギ抗CHO HCPポリクローナル抗体及び社内作製HCP参照標準を使用し、複数のバイオ医薬品mAb製品の精製工程試料間の、HCPのクリアランスをモニタリングするプラットホーム方法として使用されている。このアッセイは、2.0ng/mLの感度を有する。工程内及び最終バルク物質試料の室内再現精度は5.7〜14.9%CVに及び、繰り返し性は3.5〜8.8%CVに及ぶ。
Log (補正HCP) = A + B×Log (希釈係数)
(式中、Aはy切片であり、Bは勾配である)。希釈が増加するにつれて上昇する補正HCP値は、希釈非直線性を示しており、PLBL2の存在を示唆している可能性がある。
異なるmAbの抗PLBL2ウエスタンブロット
実施例1は、mAb7がHCP ELISAにおいて希釈非直線性を示すことを示した。PLBL2が希釈非直線性に関与し得るかどうかを決定するために、抗PLBL2ウエスタンブロットを、ELISAにより以前に分析した(実施例1)同じヒト化IgG製品で行った。
mAb試料中のPLBL2の定量
mAb7中のPLBL2の検出を前提として、試料中のPLBL2の濃度を正確に定量化するためにELISAを開発した。このELISAは社内で開発され、参照標準として組換えハムスターPLBL2、及び検出用にカスタム社内生成ポリクローナル抗PLBL2抗体を使用する。このアッセイは2.0ng/mLの感度を有する。試料の室内再現精度は3.23%CVである。
SPRによる異なるmAbへのPLBL2の結合
前のデータに基づいて1つの可能性のある説明は、PLBL2が優先的にmAb7に結合し、他のmAb製品にはしないというものである。以前に述べたように、mAb7は、他のサブタイプには存在しないPLBL2の結合部位を提供し得るIgG4分子である。なぜPLBL2がmAb7の精製中に除去されないかをさらに調べるために、表面プラズモン共鳴(SPR)結合実験を行った。この実験では、抗ヒトIgG Fc抗体(GE Healthcare)を、Biacore(商標)T200機器(GE Healthcare)を用いて約7000応答単位(RU)のレベルまでSeries S CM5センサーチップ(GE Healthcare)の2つのフローセル(FC4及びFC3)に固定化した。固定化抗体を使用して、バックグラウンド除去のためのインライン参照セルとしてFC3を用いて、1×HBS-EP+バッファー(GE Healthcare)中のmAb製品を約2500RUのレベルまでFC4に捕捉した。HBS-EP+バッファーを用いて組換えハムスターPLBL2を5μMに希釈し、30μL/分で60秒間注入した。製造者の推奨プロトコルを用いて、表面の再生前にPLBL2の解離を180秒間測定した。
PLBL2の結合に対する発現系の影響
前の例は、他の抗体サブタイプ(例えば、IgG1及びIgG2)と比べて、IgG4サブタイプの抗体がPLBL2を結合する傾向の増加を示した。これらの抗体を生成するのに使用される宿主細胞発現系が、PLBL2を結合する抗体の能力に影響を与え得るかどうかを決定するために試験を行った。試験は、いずれも同じ可変ドメインを有するが、異なるIgGサブクラスのmAb6(IgG4)及びmAb3(IgG2)を用いて行った。したがって、これらの分子の挙動の差は、定常抗体ドメインに直接起因し得る。
IgG2及びIgG4サブタイプの抗体の結合親和性の定量
前の実験は、他のサブクラスの抗体(例えば、IgG1及びIgG2)と比べて、IgG4サブクラスの抗体がPLBL2を結合する能力の増加を示した。PLBL2に対するIgG4の抗体の親和性を定量化する試験も行った。
HDX-MSにより探索されたmAb7とPLBL2の間の相互作用
mAb7及びPLBL2の相互作用の根底にある科学をさらに理解するために、Synapt G2-S質量分析計に連結されたWaters HDXマネージャーシステムを用いて、mAb7試料及びPLBL2と結合したmAb7試料のHDX-MS分析を行った。SPRによる40.0μMのKDに基づくと、重水素標識後、mAbの約70%がPLBL2と結合される。重水素標識を、0.5分、5分、60分、120分、180分、及び240分で測定した。データをWaters DynamXソフトウェアを用いて分析し、HDX差分プロットを生成した(図7)。縦棒は、6つの標識時点からの各ペプチドの合計HDX差を表す。非結合及びPLBL2結合mAb7のHDXプロフィールの比較は、PLBL2に結合すると、重鎖の領域K218-F256が重水素取り込みの低下を示すことを明らかにする。これは、mAb7へのPLBL2結合によるこの領域の安定化を示すものであり、他の実験の結合結果と十分に相関する。
異なるmAbのヒンジ領域の配列アライメント
前の結果は、PLBL2が、製品への直接結合及び同時精製により、mAb7(IgG4分子)を汚染することを示している。同様に、前の例は、同じくIgG4サブタイプであるmAb5及びmAb6も、PLBL2を結合できることを示した。異なるアイソタイプのmAbへのPLBL2結合の分析は、結合がIgG4分子のヒンジ領域で生じる可能性が最も高いことを示唆した。これは、HDX-MSデータによって支持された。異なるIgGアイソタイプにおける少数の異なるアミノ酸を考えると、PLBL2結合に関与する個々のアミノ酸残基を同定し得る可能性がある。PLBL2結合に関与するIgG4アミノ酸残基を決定するために、mAb製品のヒンジ領域のアミノ酸配列アライメントを生成した。
PLBL2への結合を軽減するためのIgG4ヒンジ領域残基の変異誘発
実施例1から8まで詳述した試験は、IgG4分子の定常領域が、PLBL2へのこれらの免疫グロブリンの結合を可能にすることに主に関与することを示した。さらに、IgG4とIgG2/IgG4キメラの間で行われた比較は、PLBL2とのこれらの相互作用を、該分子のヒンジ領域又はその付近に局在化できるようにした。試験した様々な分子のアミノ酸配列のアライメントは、PLBL2結合において役割を果たすヒンジ領域内の特定のアミノ酸を、排除工程を通じて同定できるようにした。最終ステップは、IgG4分子のヒンジ領域の修飾が、PLBL2への免疫グロブリンのこのサブクラスの結合をどれほど軽減することができるかを示す確証的変異誘発実験を行うことである。
IgG2、IgG4及びIgG4バリアント分子におけるPLBL2相互作用アッセイ
実施例9で生成され、記載された様々なmAbの、組換えヒトPLBL2との相互作用を、Biacore(商標)T200(GE Healthcare)結合法を用いて表面プラズモン共鳴(SPR)により評価した。20μg/mLのmAbを、市販の前固定プロテインAチップ(GE Healthcare)のフローセル4に10μL/分で60秒間注入し、HBS-EP+ランニングバッファー中で10秒間安定化させた。捕捉抗体のレベルの変動は、10%未満であった。次いで、100μg/mL(1538nM)組換えヒトPLBL2を、フローセル4及び3に5μL/分で120秒間注入した。フローセル3は、インライン参照セルとして機能し、低下している5μL/分流速を使用して低親和性相互作用を促進した。次いで、センサーを10mMグリシン、pH1.5により30μL/分で10秒間再生した。
IgG2、IgG4及びIgG4バリアント分子におけるPLBL2親和性アッセイ
実施例9で生成され、記載された様々なmAbに対するPLBL2の相互作用の親和性を、Octet(登録商標)RED 384機器(ForteBio)を用いてバイオレイヤー干渉法(BLI)により、実施例6に記載された同じ方法でテストした。
IgG2、IgG4及びバリアントIgG4分子の抗原結合
抗体分子mAb3、mAb5(ヒンジ修飾バリアントの全てを含む)及びmAb6は全て、これらの抗体が同じ抗原に対して標的にされることから、同じ可変領域を含む。試料の変異誘発が、各分子の抗原結合活性に悪影響を与えなかったことを示すために、抗原結合を、Biacore(商標)T200(GE Healthcare)を用いて表面プラズモン共鳴(SPR)により評価した。リガンドを捕捉する前固定したプロテインAセンサー(GE Healthcare)を使用して、活性を評価した。センサー表面を、使用前に再生するために(10mMグリシン、pH1.5を30μL/分で60秒間用いて)、5×スタートアップサイクルを全てのフローセルで実行した。各mAb試料をPBS-T中10μg/mLに希釈し、フローセル4に10μL/分で60秒間注入し、10秒の安定化期間を設けた。10μg/mLの標的抗原を、次いでフローセル4及び3に10μL/分で60秒間注入し、この後注入を停止し、アッセイバッファーを10μL/分の流速で100秒間注入して、解離を可能にした。次いで、センサー表面を次の注入に備えて、10mMグリシン、pH1.5を30μL/分で60秒間用いて再生した。
宿主細胞タンパク質(HCP)へのIgG4結合の軽減
問題のある宿主細胞タンパク質は、典型的には製品と同時精製し、通常はごく微量で存在するが、十分に精製された原体中に存在するレベルが、安全性及び薬効両方の問題を提起し得る場合があった。PLBL2の結合はこの重要な例を示しているが、他の問題のある宿主細胞タンパク質が、目的とする抗体製品と相互作用することが報告される場合があった。
Claims (20)
- 重鎖定常領域においてKabat残基203〜256の間の領域のアミノ酸のいずれか1つ又は組み合わせで修飾されているバリアントIgG4抗体であって、非修飾IgG4抗体と比べて、宿主細胞タンパク質(HCP)への結合レベルが低下している、前記バリアントIgG4抗体。
- 修飾が、
(a)IgG1、IgG2、及び/若しくはIgG3抗体生殖系列配列における同等のアミノ酸配列への1つ以上の置換、並びに/又は
(b)Kabat残基203〜256の間の領域のアミノ酸のいずれか1つ又は組み合わせの欠失、並びに/又は
(c)Kabat残基203〜256の間の領域の1つ以上のアミノ酸の挿入
を含む、請求項1記載のバリアントIgG4抗体。 - 修飾が、
(a)Kabat残基226〜243(両端を含む)の間のヒンジ領域の1つ以上のアミノ酸の修飾、及び/又は
(b)Kabat残基203の修飾、並びに/又は
(c)Kabat残基222の修飾、並びに/又は
(d)K203からR、E、若しくはQ;R222からT、K、若しくはQ;E226からL若しくはI;S227からR、P、A、N、若しくはT;Y229からS、C、F、W、若しくはH;G230からC、A、N、若しくはS;P237からH、E、D、若しくはV;及び/又はP238からT、K、若しくはEを含む1つ以上のアミノ酸の置換、並びに/又は
(e)EPKSCDKTHT(配列番号27)、若しくはERKYGPP(配列番号28)、若しくはERKCCVE(配列番号29)、若しくはELKTPLGDTTHT(配列番号30)によるESKYGPP(配列番号26)(Kabat残基226〜238)の置換、及び/又は
(f)SCDKTHT(配列番号24)、若しくはCCVE(配列番号25)によるYGPP(配列番号23)(Kabat残基229〜238)の置換
を含む、請求項1又は2記載のバリアントIgG4抗体。 - 非修飾IgG4抗体と比較して宿主細胞タンパク質(HCP)への結合親和性及び/又は結合活性が低下している、請求項1〜3のいずれか1項記載のバリアントIgG4抗体。
- S241からP、及び/若しくはL248からEへのさらなる置換、並びに/又はPAAAP(配列番号33)若しくはPAAAS(配列番号32)によるEFLGGP(配列番号31)(Kabat残基246〜251)の置換を含む、請求項1〜4のいずれか1項記載のバリアントIgG4抗体。
- 配列CPPC(配列番号20)(Kabat残基239〜242)を含む、請求項1〜5のいずれか1項記載のバリアントIgG4抗体。
- 非修飾IgG4抗体と比較して重鎖定常領域においてさらなる修飾がない、請求項1〜6のいずれか1項記載のバリアントIgG4抗体。
- 宿主細胞タンパク質が、推定ホスホリパーゼB様2(PLBL2)である、請求項1〜7のいずれか1項記載のバリアントIgG4抗体。
- 請求項1〜8のいずれか1項記載のバリアントIgG4抗体をコードする細胞株。
- 工程不純物への結合を低下させるためにIgG抗体を修飾する方法であって、
a)工程不純物の結合に関与する少なくとも1つのアミノ酸を同定するステップ、及び
b)工程不純物との結合に関与すると同定されたアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することにより、IgG抗体のバリアントを作出するステップ
を含む、前記方法。 - 工程不純物の結合に関与するアミノ酸が、タンパク質間相互作用を試験する方法又はタンパク質間相互作用を試験する方法の組み合わせを使用して同定される、請求項10記載の方法。
- タンパク質間相互作用を試験する方法が、水素重水素交換質量分析(HDX-MS)である、請求項11記載の方法。
- 工程不純物との結合に関与すると同定されたアミノ酸が重鎖定常領域に存在する、請求項10〜12のいずれか1項記載の方法。
- 工程不純物が宿主細胞タンパク質である、請求項10〜13のいずれか1項記載の方法。
- 宿主細胞タンパク質(HCP)への結合が低下しているIgG4抗体を作製する方法であって、 抗体配列を重鎖定常領域においてKabat残基203〜256の間の領域のアミノ酸のいずれか1つ又は組み合わせで修飾するステップ
を含む、前記方法。 - 宿主細胞タンパク質が、推定ホスホリパーゼB様2(PLBL2)である、請求項14又は15記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項記載のバリアントIgG4抗体を含む組成物。
- バリアントIgG4抗体が、少なくとも10mg/mL、少なくとも20mg/mL、少なくとも50mg/mL、少なくとも75mg/mL、又は少なくとも100mg/mLの濃度である、請求項17記載の組成物。
- 組成物中の推定ホスホリパーゼB様2(PLBL2)の濃度が500ppm未満、100ppm未満、又は10ppm未満である、請求項17又は18記載の組成物。
- バッファー及び/又は脂肪酸エステルをさらに含み、場合により脂肪酸エステルがポリソルベート20又はポリソルベート80である、請求項17〜19のいずれか1項記載の組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662404849P | 2016-10-06 | 2016-10-06 | |
US62/404,849 | 2016-10-06 | ||
PCT/EP2017/075038 WO2018065389A1 (en) | 2016-10-06 | 2017-10-03 | Antibodies with reduced binding to process impurities |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019532957A true JP2019532957A (ja) | 2019-11-14 |
JP7471819B2 JP7471819B2 (ja) | 2024-04-22 |
Family
ID=60143674
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019518304A Active JP7471819B2 (ja) | 2016-10-06 | 2017-10-03 | 工程不純物への結合が低下している抗体 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11254753B2 (ja) |
EP (1) | EP3523329A1 (ja) |
JP (1) | JP7471819B2 (ja) |
KR (1) | KR20190057083A (ja) |
CN (1) | CN109790216A (ja) |
AU (1) | AU2017338291A1 (ja) |
BR (1) | BR112019004938A2 (ja) |
CA (1) | CA3037264A1 (ja) |
IL (1) | IL265748A (ja) |
MX (1) | MX2019003890A (ja) |
RU (1) | RU2771330C2 (ja) |
SG (1) | SG11201901468SA (ja) |
TW (1) | TW201829453A (ja) |
WO (1) | WO2018065389A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018217976A1 (en) | 2017-05-25 | 2018-11-29 | Bristol-Myers Squibb Company | Antagonistic cd40 monoclonal antibodies and uses thereof |
AR117091A1 (es) | 2018-11-19 | 2021-07-07 | Bristol Myers Squibb Co | Anticuerpos monoclonales antagonistas contra cd40 y sus usos |
SG11202112349UA (en) * | 2019-05-21 | 2021-12-30 | Regeneron Pharma | Methods for identifying and quantitating host cell protein |
TW202140553A (zh) | 2020-01-13 | 2021-11-01 | 美商威特拉公司 | C5ar1抗體分子及其用途 |
JP2023519602A (ja) * | 2020-03-31 | 2023-05-11 | メディミューン,エルエルシー | 安定化IgG4抗体及びその使用 |
EP4277931A1 (en) | 2021-01-13 | 2023-11-22 | Visterra, Inc. | Humanized complement 5a receptor 1 antibodies and methods of use thereof |
WO2023288182A1 (en) | 2021-07-12 | 2023-01-19 | Genentech, Inc. | Structures for reducing antibody-lipase binding |
US20230303719A1 (en) | 2022-03-03 | 2023-09-28 | Yale University | Humanized 3e10 antibodies, variants, and antigen binding fragments thereof |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013512258A (ja) * | 2009-11-30 | 2013-04-11 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | 除去されたエフェクター機能を伴う抗体Fc突然変異 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TW201030016A (en) * | 2008-10-20 | 2010-08-16 | Abbott Lab | Antibodies that bind to IL-18 and methods of purifying the same |
GB201014033D0 (en) * | 2010-08-20 | 2010-10-06 | Ucb Pharma Sa | Biological products |
GB201203071D0 (en) * | 2012-02-22 | 2012-04-04 | Ucb Pharma Sa | Biological products |
GB201203051D0 (en) * | 2012-02-22 | 2012-04-04 | Ucb Pharma Sa | Biological products |
WO2015038888A1 (en) * | 2013-09-13 | 2015-03-19 | Genentech, Inc. | Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides |
RU2016107435A (ru) | 2013-09-13 | 2017-10-18 | Дженентек, Инк. | Композиции и способы обнаружения и количественного определения белка клеток-хозяев в клеточных линиях и рекомбинантные полипептидные продукты |
AR102198A1 (es) | 2014-10-09 | 2017-02-08 | Regeneron Pharma | Proceso para reducir partículas subvisibles en una formulación farmacéutica |
-
2017
- 2017-10-03 RU RU2019106819A patent/RU2771330C2/ru active
- 2017-10-03 CA CA3037264A patent/CA3037264A1/en not_active Abandoned
- 2017-10-03 WO PCT/EP2017/075038 patent/WO2018065389A1/en unknown
- 2017-10-03 SG SG11201901468SA patent/SG11201901468SA/en unknown
- 2017-10-03 JP JP2019518304A patent/JP7471819B2/ja active Active
- 2017-10-03 TW TW106134267A patent/TW201829453A/zh unknown
- 2017-10-03 AU AU2017338291A patent/AU2017338291A1/en not_active Abandoned
- 2017-10-03 EP EP17787118.3A patent/EP3523329A1/en active Pending
- 2017-10-03 US US16/339,027 patent/US11254753B2/en active Active
- 2017-10-03 BR BR112019004938A patent/BR112019004938A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2017-10-03 MX MX2019003890A patent/MX2019003890A/es unknown
- 2017-10-03 CN CN201780061885.8A patent/CN109790216A/zh active Pending
- 2017-10-03 KR KR1020197010590A patent/KR20190057083A/ko active IP Right Grant
-
2019
- 2019-04-01 IL IL265748A patent/IL265748A/en unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013512258A (ja) * | 2009-11-30 | 2013-04-11 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | 除去されたエフェクター機能を伴う抗体Fc突然変異 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. VOL:287, NR:29, JPN5020000193, 13 July 2012 (2012-07-13), pages 24525 - 24533, ISSN: 0004564101 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20190057083A (ko) | 2019-05-27 |
MX2019003890A (es) | 2019-08-12 |
IL265748A (en) | 2019-06-30 |
JP7471819B2 (ja) | 2024-04-22 |
AU2017338291A1 (en) | 2019-03-14 |
WO2018065389A1 (en) | 2018-04-12 |
US11254753B2 (en) | 2022-02-22 |
CN109790216A (zh) | 2019-05-21 |
RU2019106819A3 (ja) | 2021-06-04 |
RU2019106819A (ru) | 2020-11-06 |
RU2771330C2 (ru) | 2022-04-29 |
TW201829453A (zh) | 2018-08-16 |
SG11201901468SA (en) | 2019-03-28 |
CA3037264A1 (en) | 2018-04-12 |
EP3523329A1 (en) | 2019-08-14 |
BR112019004938A2 (pt) | 2019-06-25 |
US20190225708A1 (en) | 2019-07-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7471819B2 (ja) | 工程不純物への結合が低下している抗体 | |
CN106103478B (zh) | 抗体体内半寿期的体外预测 | |
AU2014318615B2 (en) | Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides | |
JP6147726B2 (ja) | タンパク質精製のためのバッファー系 | |
US20200277330A1 (en) | Methods for purifying antibodies | |
Yan et al. | Coupling mixed-mode size exclusion chromatography with native mass spectrometry for sensitive detection and quantitation of homodimer impurities in bispecific IgG | |
JP2019525925A (ja) | アフィニティークロマトグラフィー洗浄バッファー | |
JP2024037761A (ja) | 生物活性が低下した抗体バリアントおよびアイソフォーム | |
KR20150138273A (ko) | 단백질의 피로글루타민산 형성을 증가시키기 위한 방법 | |
US9193787B2 (en) | Human antibodies that bind human TNF-alpha and methods of preparing the same | |
US20220242902A1 (en) | Methods for enhanced removal of impurities during protein a chromatography | |
CN107849087A (zh) | 在亲和层析中减少宿主细胞蛋白的方法 | |
CA3113797A1 (en) | Improved procoagulant antibodies | |
JP2020517718A (ja) | 抗体の選択方法 | |
RU2773852C2 (ru) | Способы улучшенного удаления примесей при проведении хроматографии на основе связывания с белком а | |
WO2023213779A1 (en) | Novel anti-angptl3 antibodies suitable for high concentration compositions and subcutaneous administration | |
WO2020127864A1 (en) | Method for improving inhibition of vegf-binding to vegf-r1 of an anti-vegf antibody | |
WO2020055832A1 (en) | Systems and methods for affinity capillary electrophoresis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200915 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20210709 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210803 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211026 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20220104 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220502 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20220502 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20220512 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20220517 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20220610 |
|
C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211 Effective date: 20220614 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231030 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240410 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7471819 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |