CN103748110A - 具有增加的FcRn结合的抗原结合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明提供特异性结合TNF-α的抗原结合蛋白。例如抗TNF抗体诸如阿达木单抗的新变体，相比于阿达木单抗，其显示出对FcRn受体增加的结合或增加的半衰期。还提供包含所述抗原结合蛋白的组合物以及此类组合物在治疗病症和疾病中的用途。
Description
领域
本发明涉及抗TNF抗体的新变体。
背景
抗体是包含至少两条重链和两条轻链的异多亚基糖蛋白。除了IgM之外，完整抗体通常为大约150Kda的异多亚基糖蛋白，由两条相同的轻（L）链和两条相同的重（H）链构成。每一条重链在一端具有一个可变结构域（VH），随后为多个恒定区。每一条轻链在它的另一端具有可变结构域（VL）和恒定区；轻链的恒定区与重链的第一恒定区排在一起，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域排在一起。根据重链恒定区的氨基酸序列，可以将人抗体分为不同的五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。可以进一步将IgG和IgA再分为亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；以及IgA1和IgA2。抗体的可变结构域赋予具有被称为互补决定区(CDR)的展示出特定变异性的某些区域的抗体结合特异性。将可变区更保守的部分称为框架区(FR)。完整的重链和轻链的可变结构域各自包含由三个CDR连接的四个FR。恒定区并不直接参与抗体与抗原的结合，但其展示出多种效应子功能，诸如参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、经与Fcγ受体结合的吞噬作用、经新生FC受体（FcRn）的半衰期/清除率和经补体级联的C1q组分的补体依赖性细胞毒性。IgG抗体结构的特性使得存在两种抗原结合位点，这两种对相同表位都是特异的。因此，它们是单特异性的。
在成年哺乳动物中，FcRn也被称为新生Fc受体，通过作为保护性受体而在维持血清抗体水平中起关键作用，所述保护性抗体结合并拯救来自降解的IgG同种型的抗体。IgG分子由内皮细胞进行胞吞，并且如果它们结合FcRn，则再循环进入循环中。相反，未结合FcRn的IgG分子则进入细胞中并且靶向它们在那里降解的溶酶体途径。
认为新生FcRn受体参与抗体清除和跨组织的胞转(见Junghans R.P (1997) Immunol.Res 16. 29-57和Ghetie等 (2000)
Annu.Rev.Immunol. 18, 739-766)。
WO 9734631公开了包含具有增加的血清半衰期以及在Fc铰链区中具有至少一个氨基酸取代的突变体IgG分子的组合物。公开了在选自CH2结构域中编号252、254、256、309、311或315的或CH3结构域中编号433或434的氨基酸的一个或多个的氨基酸取代。
WO
00/42072公开了包含具有改变的FcRn结合亲和力的变体Fc区的多肽，所述多肽在Fc区的氨基酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439和447的一个或多个包含氨基酸修饰。
WO
02/060919公开了修饰的IgG，其包含在位置251、253、255、285-290、308-314、385-389和428-435的一个或多个含有氨基酸修饰的IgG恒定结构域。
WO 2004035752公开了IgG类的修饰抗体，其中来自重链恒定区选自氨基酸残基250、314和428的至少一个氨基酸残基与未修饰的IgG类抗体中存在的氨基酸残基不同。
Shields等 (2001, J Biol Chem ; 276:6591-604)使用丙氨酸扫描诱变来更改人IgG1抗体的Fc区中的残基，并随后评估了与人FcRn的结合。当变为丙氨酸时有效消除了与FcRn的结合的位置包括I253、S254、H435和Y436。以下其他位置显示较不显著的结合降低：E233-G236、R255、K288、L309、S415和H433。几个氨基酸位置当变为丙氨酸时显示出FcRn结合的改善。
Dall'Acqua等(2002, J Immunol.;169:5171-80)描述了人IgG1铰链-Fc片段噬菌体展示文库的随机诱变和针对小鼠FcRn的筛选。它们公开了位置251、252、254-256、308、309、311、312、314、385-387、389、428、433、434和436的随机诱变。
WO2006130834公开了修饰的IgG，其包含在位置252、254、256、433、434和436的一个或多个含有氨基酸修饰的IgG恒定结构域的IgG。
因此，已经讨论了IgG抗体的Fc结构域修饰作为增加治疗抗体的血清半衰期的方法。然而，大量的此类修饰已经暗示了在不同抗体中的不同的结果，并且有时为相反的结果。
施用抗原结合蛋白作为治疗需要具有与蛋白的清除和半衰期特征相关的规定频率的注射。
阿达木单抗（Adalimumab）是针对TNF-α的单克隆抗体，其用于治疗类风湿关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎和克罗恩氏病。它使用哺乳动物细胞表达系统通过重组DNA技术来产生。它由330个氨基酸组成并且具有大约148千道尔顿的分子量。见美国专利6090382。在0.5
mg/kg (~40 mg)的剂量下，据称对阿达木单抗的清除范围为11-15 ml/小时，分布体积(Vss)范围为5-6升，并且平均末期半衰期大约为两周（可从www.medicines.org.uk获得的产品特征概述）。这些半衰期和清除特性表示目前阿达木单抗需要每两周施用一次。在根据疾病的某些患者中，诸如例如在银屑病患者中可能施用负荷剂量是必需的。该剂量可以与维持剂量不同。
发明概述
在一方面，本发明涉及特异性结合TNF-α的抗原结合蛋白，其包含CDRH1 (SEQ ID NO: 27)、CDRH2
(SEQ ID NO: 28)、CDRH3 (SEQ ID
No: 29)、CDRL1 (SEQ ID NO: 30)、CDRL2 (SEQ ID NO: 31)和CDRL3
(SEQ ID NO: 32)或其变体，其中所述变体与CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3相比可以包含1、2、3或4个氨基酸取代、插入或缺失；和人IgG1恒定结构域的新生Fc受体（FcRn）结合部分，其包含一个或多个相对于人IgG1恒定结构域的氨基酸取代，其中与包含SEQ
ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No.12的重链序列的IgG相比，所述抗原结合蛋白在pH 6下具有增加的FcRn亲和力和/或增加的半衰期。
在整个说明书中，术语“人IgG1恒定结构域”包含所有对于本领域技术人员已知的其异型和变体。
在一方面，本发明涉及特异性结合TNF-α的抗原结合蛋白，其包含CDRH1 (SEQ ID
NO: 27)、CDRH2 (SEQ ID NO: 28)、CDRH3 (SEQ ID No: 29)、CDRL1
(SEQ ID NO: 30)、CDRL2 (SEQ ID
NO: 31)和CDRL3 (SEQ ID NO: 32)；或其变体，其中所述变体与CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3相比可以包含1、2、3或4个氨基酸取代、插入或缺失；和人IgG1恒定结构域的新生Fc受体（FcRn）结合部分，其包含一个或多个相对于人IgG1恒定结构域的氨基酸取代，其中与包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No.12的重链序列的IgG相比，所述抗原结合蛋白具有增加的半衰期，并且所述抗原结合蛋白能够每四周施用不多于一次来实现与通过每两周施用一次相同剂量的包含SEQ
ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No.12的重链序列的IgG所实现的相当的平均稳态谷浓度。
在一方面，本发明涉及特异性结合TNF-α的抗原结合蛋白，其包含CDRH1 (SEQ ID
NO: 27)、CDRH2 (SEQ ID NO: 28)、CDRH3 (SEQ ID No: 29)、CDRL1
(SEQ ID NO: 30)、CDRL2 (SEQ ID
NO: 31)和CDRL3 (SEQ ID NO: 32)或其变体，其中所述变体与CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3相比可以包含1、2、3或4个氨基酸取代、插入或缺失；和人IgG1恒定结构域的FcRn结合部分，其包含一个或多个相对于人IgG1恒定结构域的氨基酸取代，其中如同在25℃下通过ProteOn XPR36蛋白相互作用阵列系统所评估，所述抗原结合蛋白在pH 6下相比具有相同CDR但不具有此类修饰的抗TNF抗原结合蛋白具有对于FcRn的2倍、或3倍、或4倍或5倍、或6倍或8倍或更多倍的亲和力，所述阵列系统将抗原结合蛋白固定化在芯片上。
在一方面，本发明涉及抗原结合蛋白，其为包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No.12的重链序列的IgG的变体，其中所述抗原结合蛋白变体包含在IgG恒定结构域的新生Fc受体（FcRn）结合部分中的一个或多个取代，以提高相比于不具有此类取代的IgG的抗原结合蛋白变体的半衰期，其中当所述变体以四至八周的间隔以40 mg的单次剂量向患者施用时，患者群中的平均稳态谷浓度在给药间隔之间不会落入4µg/ml以下或者不会落入5 μg /ml以下。优选地，患者群中的平均血清谷抗体浓度在给药间隔之间不会落入6 μg /ml以下。优选地，当变体以八周的间隔以40 mg的单次剂量向患者施用时，患者群中的平均血清谷抗体浓度在给药间隔之间不会落入5 μg /ml以下。优选地，当变体以八周的间隔以40 mg的单次剂量向患者施用时，患者群中的平均血清谷抗体浓度在给药间隔之间不会落入4 μg /ml以下，同时仍提供最佳效力。优选地，当变体以八周的间隔以40 mg的单次剂量向患者施用时，患者群中的平均血清谷抗体浓度在给药间隔之间不会落入3 μg /ml以下，同时仍提供最佳效力。
在一方面，本发明涉及入本文公开的用于治疗疾病的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白能够每四周向患者施用不多于一次来实现与通过每两周施用一次相同剂量的包含SEQ
ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No.12的重链序列的IgG所实现的相当的平均稳态谷浓度。
在一方面，本发明涉及治疗患有疾病的患者的方法，所述方法包括施用本发明的抗原结合蛋白。
在一方面，本发明涉及编码根据本发明的抗原结合蛋白或其部分诸如重链或轻链的核酸序列。在一方面，本发明涉及编码根据本发明的抗原结合蛋白或其部分诸如重链或轻链的表达载体。
在一方面，本发明涉及包含编码根据本发明的抗原结合蛋白的核酸序列的宿主细胞。在一方面，本发明涉及用于治疗银屑病或类风湿关节炎的根据本发明的抗原结合蛋白。
在一方面，本发明涉及试剂盒，其包含根据本发明的抗原结合蛋白，并且任选包含甲氨蝶呤用于根据本发明的抗原结合蛋白和甲氨蝶呤的伴随递送。
在一方面，本发明涉及如本文公开的用于在已经用甲氨蝶呤治疗的个体中治疗类风湿关节炎的抗原结合蛋白，并且涉及与甲氨蝶呤组合治疗类风湿关节炎的抗原结合蛋白，其中所述组合同时递送，基本上同时递送或者顺序递送。
在一方面，本发明涉及如本文公开的用于在已经用甲氨蝶呤治疗的个体中治疗银屑病的抗原结合蛋白，并且涉及与甲氨蝶呤组合治疗银屑病的抗原结合蛋白，其中所述组合同时递送，基本上同时递送或者顺序递送。
附图简述
图1-抗TNFα抗体与人TNFα的结合
图2-加速应激物研究后抗TNFα 抗体与人TNFα的结合活性的分析
图3-在25%人血清中孵育2周后抗TNFα抗体与人TNFα的结合
图4-冷冻-融解后抗TNFα抗体与人TNFα的结合
图5-抗TNFα抗体与FcγRIIIa受体的分析（a）结合人FcγRIIIa（缬氨酸168变体）（b）结合人FcγRIIIA（苯丙氨酸158变体）
图6-单次静脉内（1小时输注）后雌性食蟹猴中BPC2604的以及雄性食蟹猴中帕考珠单抗（pascolizumab）的平均剂量标准化血浆浓度。
发明详述
本发明涉及特异性结合TNF-α的新抗原结合蛋白。具体而言，本发明涉及抗TNF抗体诸如阿达木单抗的新变体，相比于阿达木单抗，其显示出对FcRn受体增加的结合和/或增加的半衰期。阿达木单抗是包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No.12的重链序列的IgG单克隆抗体。
本发明人已经发现如本文所述对阿达木单抗的特定修饰显示出如下文实施例所示的在FcRn结合中特别的改善。阿达木单抗的亲和力成熟的变体还显示在抗TNF-α结合和/或中和活性中的改善。
本发明的新抗原结合蛋白具有对FcRn受体增加的结合和/或增加的半衰期和/或增加的平均残留时间和/或降低的清除。认为对FcRn的结合导致体内更长的血清保留。为了增加体内Fc蛋白的保留，在约pH 6观察到亲和力中的增加。在一方面，本发明因此提供具有对FcRn的优化结合的抗原结合蛋白。
在一个实施方案中，与包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ
ID No. 12的重链序列的IgG相比，本发明的抗原结合蛋白的半衰期增加2-6倍，诸如2倍、3倍、4倍、5倍或6倍。优选地，与包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG相比，本发明的抗原结合蛋白的半衰期增加3倍、4倍或更多。例如，如果IgG是具有10天的或在10-20天范围内的半衰期的阿达木单抗，则在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白显示出约40-80天的半衰期。例如，抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:9、或SEQ
ID NO:15、或SEQ ID NO:18、或SEQ ID NO:21、或SEQ
ID NO:24、或SEQ ID NO:163、或SEQ ID NO:165、或SEQ
ID NO:167、或SEQ ID NO:169的重链序列。
在一个实施方案中，在患者中每四周施用不多于一次的本发明的抗原结合蛋白实现约2 μg/ml至约7 μg/ml之间的平均稳态谷浓度。优选地，平均稳态谷浓度为约4 μg/ml至约7 μg/ml之间，并且更优选地约5 μg/ml至约6 μg/ml之间。
在一个实施方案中，在患者中每28天施用不多于一次的本发明的抗原结合蛋白实现约2 μg/ml至约7 μg/ml之间的平均稳态谷浓度。优选地，平均稳态谷浓度为约4 μg/ml至约7 μg/ml之间，并且更优选地约5 μg/ml至约6 μg/ml之间。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白可以以每4、5、6、7或8周施用一次来实现与通过阿达木单抗当以相同剂量每两周施用一次时实现的那些相当的平均稳态谷浓度。
在本发明的所有方面的一个优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白可以每7或8周施用一次。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白可以以每25-80天施用一次，例如以每40-60天施用一次，或例如以每28、35、42、49或56天施用一次来实现与通过阿达木单抗当以相同剂量每14天施用一次时实现的那些相当的平均稳态谷浓度。
在本发明的一个实施方案中，抗原结合蛋白可以以每49-60天例如每56天施用一次。
在本发明的所有方面的一个实施方案中，如在25℃下通过ProteOn
XPR36蛋白相互作用阵列系统（其中将抗体固定于芯片上）所评估，抗原结合蛋白在pH 6下对人FcRn具有2倍、或4倍、或6倍、或8倍或更高的亲和力。优选地，抗原结合蛋白对人FcRn具有约100至约500 KD(nM)之间的亲和力，诸如约130至约360 KD(nM)之间，或约140至约250KD(nM)之间，或约140至约210KD(nM)之间。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白的清除率为约2至约10
ml/小时，优选约2至约5 ml/小时，或2至4ml/小时，或2至3ml/小时，诸如约2、约2.5、3、4、或5 ml/小时。在一个实施方案中，根据本发明的抗原结合蛋白显示出比阿达木单抗低2倍、3倍、4倍或5倍的清除率。在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白的清除在上文说明的范围内或者比约40 mg的人剂量的阿达木单抗低2倍、3倍、4倍或5倍。
在一方面，本发明的抗原结合蛋白为阿达木单抗（包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No.12的重链序列的IgG）的变体，所述变体包含在IgG恒定结构域的FcRn结合部分中的一个或多个取代，以增加所述变体相比于阿达木单抗的半衰期，其中当所述变体以四至八周的间隔、优选八周的间隔以40 mg的单次剂量向患者施用时，患者群中的平均稳态谷抗体浓度不会落入5 μg /ml以下。在一个实施方案中，患者群中的平均稳态谷抗体浓度在给药间隔之间不会落入6 μg /ml以下。
在进一步的实施方案中，抗原结合蛋白包含在所述抗原结合蛋白的Fc区中的至少一个氨基酸修饰，其中与阿达木单抗序列中的相同位置相比，所述修饰在位置250、252、254、256、257、259、308、428或434中的一个或多个，其中Fc区中的氨基酸编号为Kabat中EU索引的编号。
野生型人IgG1在位置308-314处具有氨基酸残基Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu，在位置251-256处具有氨基酸残基Leu-Met- Ile-Ser-Arg-Thr，在位置428-436处具有氨基酸残基Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-HisTyr，并且在位置385-389处具有氨基酸残基Gly-Gln-Pro-Glu-Asn。残基编号可以与IgG2-4不同。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含相对于含有SEQ ID No. 13的序列的人IgG1恒定结构域的一个或多个氨基酸取代。
在一个实施方案中，人IgG1重链恒定结构域的FcRn结合部分中的一个或多个氨基酸取代在按照Kabat的EU索引编号的氨基酸残基252、254和256处，并且在残基252处的氨基酸取代是用tyr、phe、tryp或thr取代met；在残基254处的氨基酸取代是用thr取代ser；并且在残基256处的氨基酸取代是用ser、arg、glu、asp或thr取代thr。优选地，在残基252处的氨基酸取代是用tyr取代；在残基254处的氨基酸取代是用thr取代，并且在残基256处的取代是用glu取代。优选地，IgG1恒定结构域如SEQ ID No: 7中所示。
在一个实施方案中，人IgG1重链恒定结构域的FcRn结合部分中的一个或多个氨基酸取代在按照Kabat的EU索引编号的氨基酸残基250和428处，并且在残基250处的氨基酸取代是用glu或gln取代thr；在残基428处的氨基酸取代是用leu或phe取代met。优选地，在残基250处的氨基酸取代是用glu取代，并且在残基428处的氨基酸取代是用leu取代。优选地，IgG1恒定结构域如SEQ ID No: 16中所示。
在一个实施方案中，在人IgG1恒定结构域的FcRn结合部分中的一个或多个氨基酸取代在按照Kabat的EU索引编号的氨基酸残基428和/或434处。优选地，在残基428处的氨基酸取代是用leu取代met，并且在残基434处的氨基酸取代是用ser取代asn。优选地，IgG1恒定结构域如SEQ ID No: 10中所示。
在一个实施方案中，在人IgG1恒定结构域的FcRn结合部分中的一个或多个氨基酸取代在按照Kabat的EU索引编号的氨基酸残基259或308处。优选地，在残基259处的取代是用ile取代val，并且在残基308处的氨基酸取代是用phe取代val。优选地，IgG1恒定结构域如SEQ ID No: 19或SEQ ID No: 22中所示。
在一个实施方案中，如SEQ ID No: 25中所示，在人IgG1重链恒定结构域的FcRn结合部分中的一个或多个氨基酸取代在按照Kabat的EU索引编号的氨基酸残基257或434处。
在一个实施方案中，在人IgG1重链恒定结构域的FcRn结合部分中的一个或多个氨基酸取代在按照Kabat的EU索引编号的氨基酸残基433或434处，例如残基为H433K和N434F。优选地，IgG1恒定结构域如SEQ ID No: 165或SEQ ID No: 167中所示。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含任何表A中列出的IgG1恒定结构域修饰。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白是抗体。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含SEQ ID NO: 6和/或SEQ ID NO: 3的可变结构域或其变体，其含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、插入或缺失并且/或者在SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 3的长度上共享至少90%的同一性。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含如SEQ ID No 5、9或15中所示的重链序列，任选具有如SEQ ID No: 2中所示的轻链序列。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含如SEQ ID NO: 78或80中所示的重链可变结构域（variable heavy
domain）序列。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含如SEQ ID NO: 145或SEQ ID NO: 146中所示的重链序列，任选具有如SEQ
ID Nos. 148、150或152中所示的轻链变体。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含如SEQ ID No 18或21中所示的重链序列，任选具有如SEQ ID No: 2中所示的轻链序列。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含任何表A中说明的可变结构域。在一个实施方案中，根据本发明的抗原结合蛋白包含具有如表A中所示的cb1-3-VH、cb2-44-VH、cb1-39-VH、cb1-31-VH、cb2-11-VH、cb2-40-VH、cb2-35-VH、cb2-28-VH、cb2-38-VH、cb2-20-VH、cb1-8-VL或cb1-43-VL的序列的重链可变结构域。
在一个实施方案中，根据本发明的抗原结合蛋白包含具有如表A中所示的cb1-45-VL、cb1-4-VL、cb1-41-VL、cb1-37-VL、cb1-39-VL、cb1-33-VL、cb1-35-VL、cb1-31-VL、cb1-29-VL、cb1-22-VL、cb1-23-VL、cb1-12-VL、cb1-10-VL、cb2-1-VL、cb2-11-VL、cb2-40-VL、cb2-35-VL、cb2-28-VL、cb2-20-VL、cb1-3-VL、cb2-6-VL或cb2-44-VL的序列的轻链可变结构域（variable light
domain）。
例如，根据本发明的抗原结合蛋白包含具有如表A中所示的cb1-3VH、cb2-44VH或cb2-6VL的序列的可变结构域。
在一个实施方案中，根据本发明的抗原结合蛋白包含任何表A中说明的可变结构域。在一个实施方案中，根据本发明的抗原结合蛋白包含具有选自SEQ
ID NO: 170或SEQ ID NO: 174或SEQ ID NO:178的序列的重链可变结构域。
在一个实施方案中，根据本发明的抗原结合蛋白包含具有选自SEQ ID NO: 171或SEQ ID NO: 175或SEQ
ID NO:179的序列的轻链可变结构域。
在进一步的实施方案中，抗原结合蛋白包含任何表A中列出的IgG1恒定结构域修饰。
所有上述可变结构域或重链序列或轻链序列的变体也在本发明的范围内，所述变体含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、插入或缺失并且/或者在任何这些序列的长度上共享至少90%的同一性。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含CDRH3 (SEQ ID No: 29)的变体，该变体相比于SEQ ID No: 29具有1、2、3或4个氨基酸取代。在一个实施方案中，变体CDRH3可以具有如SEQ ID Nos. 40-49中任一个所示的序列。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含CDRH1 (SEQ ID No: 27)的变体，该变体相比于SEQ ID No: 27具有1或2个氨基酸取代。在一个实施方案中，变体CDRH1可以具有如SEQ ID Nos. 33-38中任一个所示的序列。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含CDRL1 (SEQ ID No: 30)的变体，该变体相比于SEQ ID No: 30具有1、2或3个氨基酸取代。在一个实施方案中，变体CDRL1可以具有如SEQ
ID Nos. 50-61中任一个所示的序列。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含CDRL2 (SEQ ID No: 31)的变体，该变体相比于SEQ ID No: 31具有1、2或3个氨基酸取代。在一个实施方案中，变体CDRL2可以具有如SEQ
ID Nos. 62-72中任一个所示的序列。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含CDRL3 (SEQ ID No: 32)的变体，该变体相比于SEQ ID No: 32具有1、2或3个氨基酸取代。在一个实施方案中，变体CDRL3可以具有如SEQ
ID Nos. 73-76中任一个所示的序列。
在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合TNF-α的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含一种或多种或所有选自以下的CDR：CDRH1 (SEQ ID NO: 27)、CDRH2
(SEQ ID NO: 28)、CDRH3 (SEQ ID
No: 29)、CDRL1 (SEQ ID NO: 30)、CDRL2 (SEQ ID NO: 31)和CDRL3
(SEQ ID NO: 32)；其中任何所述CDR均可以是变体CDR，其相比于CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3含有1、2、3或4个氨基酸取代、插入或缺失。在一方面，本发明的抗原结合蛋白包含CDRH1、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中任何所述CDR均可以是变体CDR，其相比于CDRH1、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3含有1、2、3或4个氨基酸取代、插入或缺失。在一方面，本发明的抗原结合蛋白包含CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中任何所述CDR均能够是变体CDR，其相比于CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3含有1、2、3或4个氨基酸取代、插入或缺失。
在一方面，本发明涉及治疗患有疾病的人患者的方法，所述方法包括施用根据本发明的抗原结合蛋白。
本发明还涉及如本文公开的用于治疗人中的疾病的抗原结合蛋白。
本发明还涉及如本文公开的抗原结合蛋白在制造用于治疗疾病的药物中的用途，和如本文公开的用于治疗疾病的抗原结合蛋白。
在一个实施方案中，由本发明的抗原结合蛋白治疗的疾病是类风湿关节炎、多关节幼年特发性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、脊柱关节病、克罗恩氏病或银屑病。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白与甲氨蝶呤一同施用。甲氨蝶呤可以在抗原结合蛋白之前、之后或者同时、或者基本上同时递送。在优选的实施方案中，本发明的抗原结合蛋白与甲氨蝶呤一同向患有类风湿关节炎的患者施用。在一个实施方案中，将甲氨蝶呤向接受本发明的抗原结合蛋白的患者施用，以降低该抗原结合蛋白的免疫原性作用。在一个实施方案中，将本发明的抗原结合蛋白向已经接受甲氨蝶呤的患者施用。可以用另一种降低对抗原结合蛋白的免疫应答的可接受的化合物例如皮质类固醇来代替甲氨蝶呤。
在一方面，本发明涉及治疗患有疾病的患者的方法，所述方法包括施用本发明的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，方法包括向患者以每四周不多于一次的单次20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80 mg剂量施用抗原结合蛋白，优选每5、6、7或8周一次，并且最优选每8周一次。优选地，该剂量为40-80 mg，例如40 mg。
本发明还提供编码任何本文公开的氨基酸序列，包括任何本文描述的抗原结合构建体的重链的多核苷酸序列，和编码任何本文描述的抗原结合构建体的轻链的多核苷酸。此类多核苷酸代表对应于等效多肽序列的编码序列，然而，将理解可以将此类多核苷酸序列与起始密码子、合适的信号序列和终止密码子一同克隆入表达载体中。多核苷酸可以是DNA或RNA。
本发明还提供宿主细胞，例如重组的、转化的或转染的细胞，其包含一种或多种编码任何本文所述的抗原结合构建体的重链和/或轻链的多核苷酸。
本发明还提供了药物组合物，其包含如本文所述的抗原结合构建体和药学上可接受的载体。
本发明还提供生产任何本文所述的抗原结合构建体的方法，所述方法包括在无血清/化学成分确定的/无动物来源成分的培养基中培养包含第一和第二载体的宿主细胞的步骤，所述第一载体包含编码任何本文所述的抗原结合构建体的重链的多核苷酸，并且所述第二载体包含编码任何本文所述的抗原结合构建体的轻链的多核苷酸。或者，方法可以包括合适地在无血清/化学成分确定的/无动物来源成分的培养基中培养包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码任何本文所述的抗原结合构建体的重链的多核苷酸和编码任何本文所述的抗原结构构建体的轻链的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明包括通过按照本文所述的修饰来修饰Fc从而提高抗体的半衰期的方法。
在另一个实施方案中，本发明包括如本文所述的抗原结合蛋白，其具有增强的FcRn结合并具有一个或多个调节效应子功能的另一特性的额外取代、缺失或插入。
一旦通过期望的方法表达，本发明的抗原结合蛋白随后通过合适的测定来检验体外活性。目前，使用常规ELISA和Biacore测定形式来评估抗原结合构建体与它的目标的定性和定量的结合。此外，还可以使用其他体外测定在随后的人临床研究之前来验证中和效力，尽管通常的清除机制，进行所述人临床研究来评价抗原结合蛋白在体内的持久性。
治疗的剂量和持续时间与本发明的分子在人循环中的相对持续时间有关，并且可以由本领域技术人员根据治疗的病况和患者的一般健康基于本文提供的信息来调整。设想在延长的时间周期（例如四至六个月）中的重复给药（例如每4周、5周、6周、7周或8周一次）对于实现最大治疗效力可能是需要的。
本发明的治疗剂的施用模式可以是任何向宿主递送药剂的合适途径。本发明的抗原结合蛋白和药物组合物尤其用于肠胃外施用，即皮下地(s.c.)、鞘内地、腹膜内地、肌内地(i.m.)、静脉内地(i.v.)或鼻内地。在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白和药物组合物经皮下自动注射器笔或皮下预装填注射器来施用。
可以将本发明的抗原结合蛋白制备为药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的作为活性组分的有效量的本发明的抗原结合蛋白。在本发明的预防药剂中，优选以准备注射（ready
for injection）形式的含有抗原结合构建体的含水悬浮液或水溶液，优选为在生理pH下缓冲的。用于肠胃外施用的组合物通常将包含溶解于药学上可接受的载体（优选含水载体）中的本发明的抗原结合构建体或其混合物的溶液。可以使用多种含水载体，例如0.9%盐水、0.3%甘氨酸等。可将这些溶液制备为无菌的并且通常无颗粒物。这些溶液可以通过常规的、众所周知的灭菌技术（例如过滤）来灭菌。这些组合物可以包含对合适的生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节和缓冲剂等。在此类药物制剂中的本发明的抗原结合蛋白的浓度可以广泛变化，即，从少于约0.5重量%、通常在约1重量%或至少约1重量%至多如15重量%或20重量%，并且将主要根据流体体积、粘度等按照所选的具体施用模式来选择。
已经报道了阿达木单抗难以以高浓度配制。WO2004016286描述了包含柠檬酸盐-磷酸盐缓冲剂和包括多元醇和去污剂在内的其他成分的阿达木单抗制剂。在2005年10月25日在PDA会议上展示的口头介绍“Humira® - from
Development to Commercial Scale Production”报道了包含以下的制剂：（i）柠檬酸盐-磷酸盐缓冲剂；（ii）乙酸盐-磷酸盐缓冲剂；和（iii）磷酸盐缓冲剂。所检测的乙酸盐-磷酸盐缓冲剂展示出对阿达木单抗最差的稳定作用。Curtis等 (2008) Current Medical Research and Opinion, Volume 27,
p71-78报道了使用可注射阿达木单抗在患有类风湿关节炎的患者中发生注射部位灼热和刺痛。灼热和刺痛部分是由于基于柠檬酸盐缓冲剂的制剂(Basic
and Clinical Pharmacology & Toxicology, Volume 98, p218-221, 2006; 和Journal of Pharmaceutical Sciences, Volume 97,
p3051-3066, 2008)。然而，WO20100129469描述了高阿达木单抗浓度制剂，其仍包含柠檬酸盐-磷酸盐缓冲剂和包括多元醇在内的其他成分，而没有氯化钠。更近期的WO2012065072描述了包含表面活性剂和多元醇但无缓冲剂的阿达木单抗制剂，因此可能地避免了注射后的任何柠檬酸盐缓冲剂作用。
在一个实施方案中，提供包含TNF-α抗原结合蛋白和乙酸盐缓冲剂的液体制剂。在进一步的实施方案中，TNF-α结合蛋白包含选自SEQ ID NO:27或SEQ
ID NO:33-38的CDRH1和/或SEQ ID NO:28的CDRH2和/或选自SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:40-49的CDRH3和/或选自SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:50-61的CDRL1和/或选自SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:62-72的CDRL2和/或SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:’s73-76的CDRL3。例如，TNF-α抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:27的CDRH1和SEQ ID NO:28的CDRH2和SEQ ID NO:29的CDRH3和SEQ ID NO:30的CDRL1和选自SEQ ID NO:31的CDRL2和SEQ ID NO:32的CDRL3或其变体。
TNF-α抗原结合蛋白可以是阿达木单抗。TNF-α抗原结合蛋白可以是BPC1494。TNF-α抗原结合蛋白可以是BPC 1496。
在乙酸盐缓冲剂中配制本文描述的TNF-α抗原结合蛋白。制剂可以是液体形式。制剂可以进一步包含以下的一种或多种、其组合、或全部：表面活性剂；螯合剂；盐；和氨基酸。以高浓度配制TNF-α抗原结合蛋白，例如以50 mg/mL。在一个实施方案中，制剂不包含多元醇。在另一个实施方案中，制剂不包含进一步的缓冲剂成分，例如柠檬酸盐。因此，本文描述的制剂解决了在稳定制剂中以高浓度提供TNF-α抗原结合蛋白的问题，具体为如表A中所述的TNF-α抗原结合蛋白，并且避免了基于柠檬酸盐的缓冲剂的灼热和刺痛作用。
在一个实施方案中，乙酸盐缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂和螯合剂。在另一个实施方案中，乙酸盐缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂和盐。在另一个实施方案中，乙酸盐缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂和氨基酸。在另一个实施方案中，乙酸盐缓冲剂制剂进一步包含螯合剂和盐。在另一个实施方案中，乙酸盐缓冲剂制剂进一步包含螯合剂和氨基酸。在另一个实施方案中，乙酸盐缓冲剂制剂进一步包含盐和氨基酸。
在一个实施方案中，乙酸盐缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂、螯合剂和盐。在另一个实施方案中，乙酸盐缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂、螯合剂和氨基酸。在另一个实施方案中，乙酸盐缓冲剂制剂进一步包含表面活性剂、盐和氨基酸。在另一个实施方案中，乙酸盐缓冲剂制剂进一步包含螯合剂、盐和氨基酸。
在一个实施方案中，缓冲剂是三水乙酸钠。这可以是10-100 mM (1.361-13.61mg/mL)浓度的三水乙酸钠。三水乙酸钠可以以20-80 mM、30-70
mM、40-60 mM、或约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、或约60mM的量存在。在一个实施方案中，三水乙酸钠为约50mM (6.80mg/mL)的浓度。
乙酸盐缓冲剂可以是唯一的缓冲剂。换言之，制剂可以不包含另一种缓冲剂成分，诸如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂。由于多种原因，柠檬酸盐缓冲剂可能对制剂是有害的：（i）由于三个解离常数的值太接近以至于无法区分三个质子受体阶段，因此它不可能是良好的缓冲剂；（ii）柠檬酸盐可能会作为金属螯合剂，并从而影响金属离子平衡；（iii）柠檬酸盐是柠檬酸循环的代谢物，并可能影响细胞的新陈代谢。
合适的表面活性剂（也称为去污剂）可以包括例如聚山梨酯（例如，聚山梨酯20或80）、聚氧乙烯烷基醚诸如Brij 35.RTM.、泊洛沙姆（例如泊洛沙姆188、泊洛沙姆407）、吐温20、吐温80、克列莫佛（Cremophor）A25、Sympatens ALM/230和Mirj。在一个实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯80。制剂可以包含0.01-0.1
% (0.1-1mg/mL)浓度的聚山梨酯80。聚山梨酯80可以以0.01-0.05%、或0.01-0.03%;
或约0.015%、约0.02%、或约0.025%的量存在。在一个实施方案中，聚山梨酯80为约0.02% w/v (0.2mg/mL)的浓度。高浓度的聚山梨酯80，例如多于0.1%可能对制剂是有害的，这是由于该表面活性剂可能含有高水平的氧化剂，其可以在制剂储存后提高氧化水平，并因此降低储存期。
合适的螯合剂可以包括EDTA和金属络合物（例如Zn-蛋白络合物）。在一个实施方案中，螯合剂是EDTA。制剂可以包含0.02-0.2
mM (0.00748-0.0748mg/mL)浓度的EDTA。EDTA可以以0.02-0.15 mM、0.02-0.1 mM、0.03-0.08
mM、或0.04-0.06 mM; 或约0.03 mM、约0.04 mM、约0.05 mM、或约0.06 mM的量存在。在一个实施方案中，EDTA为约0.05mM
(0.018mg/mL)的浓度。
合适的盐可以包括任何形成盐的平衡离子，诸如钠。例如，可以使用氯化钠，或者在钠盐中可以使用阴离子乙酸盐代替氯化物作为平衡离子。在一个实施方案中，盐是氯化钠。制剂可以包含25-100
mM (1.461-5.84mg/mL)浓度的氯化钠。氯化钠可以以35-90 mM、45-80 mM、25-70 mM、或45-60mM; 或45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM的量存在。在一个实施方案中，氯化钠为约51mM (2.98mg/mL)的浓度。
合适的氨基酸可以包括精氨酸。制剂可以包含0.5-5% (5-50mg/mL)浓度的精氨酸游离碱。精氨酸游离碱可以以这样的量存在。
在其他实施方案中，精氨酸游离碱可以为0.5-4.0%、0.5-3.5%、0.5-3.0%、0.5-2.5%、或约0.5%、约0.75%、约1%、约1.5%、约2%、或约3%。在一个实施方案中，精氨酸为约1% (10mg/mL)的浓度。
多元醇是具有多个羟基的物质，并且包括糖（还原性和非还原性糖）、糖醇和糖酸。多元醇的实例包括果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、
山梨糖、松三糖、棉子糖、甘露糖醇、木糖醇、赤藓醇、苏糖醇、山梨糖醇、甘油、L-葡糖酸及其金属盐。在一个实施方案中，本发明的制剂不包含多元醇。
在一个实施方案中，乙酸盐缓冲剂制剂进一步包含以下的一种或多种、其组合、或全部：聚山梨酯80、EDTA、氯化钠、和精氨酸游离碱。
可以将制剂的pH调节为pH 5.0-7.0。在一个实施方案中，存在乙酸（约100 mM乙酸）以调节制剂为约pH
5.5。在其他实施方案中，可以将pH调节为pH
5.0、5.5、6.0、6.5或7.0。在本发明仍其他的实施方案中，使用NaOH或HCl来调节pH为5.0、5.5、6.0、6.5或7.0。
本文描述的TNF-α抗原结合蛋白可以以20-300 mg/mL的浓度范围配制。例如，抗原结合蛋白以20-200 mg/mL或50-100 mg/mL; 或约40
mg/mL或约45 mg/mL或约50
mg/mL或约55 mg/mL或约60
mg/mL或约70 mg/mL或约80
mg/mL或约90 mg/mL或约100mg/mL的浓度存在。在一个实施方案中，TNF-α抗原结合蛋白为约50 mg/mL的浓度。
TNF-α抗原结合蛋白可以是阿达木单抗。TNF-α抗原结合蛋白可以是BPC1494。TNF-α抗原结合蛋白可以是BPC 1496。
在一个实施方案中，制剂稳定至少1年、至少18个月、或至少2年。例如，制剂在约5℃的温度下稳定至少1年、至少18个月、或至少2年。在另一个实施方案中，制剂在室温（约25℃）下是稳定的。例如，制剂在约25℃的温度下稳定至少14周、至少2周、至少1周、至少6天、至少5天、至少4天、至少3天、至少2天或至少1天。在另一个实施方案中，制剂在约40℃的温度下是稳定的。例如，制剂在约40℃的温度下稳定至少9周或至少4周。
如下文实施例25和26所示，制剂在室温（约25℃）下是稳定的。因此，在用于注射的预装填设备中存在形成聚集体或低分子量片段的极小风险，所述用于注射的预装填设备可置于室温下超过推荐时间。聚集体是潜在免疫原性的(见The AAPS Journal 2006; 8 (3) Article 59 Themed Issue:
Proceedings of the 2005 AAPS Biotec Open Forum on Aggregation of Protein
Therapeutics, Guest Editor - Steve Shire, Effects of Protein Aggregates: An
Immunologic Perspective)并且低分子量片段可对预先存在的自身抗体是有害的(见J Immunol 2008; 181:3183-3192; Human Anti-IgG1 Hinge
Autoantibodies Reconstitute the Effector Functions of Proteolytically
Inactivated IgG1)。
TNF-α抗原结合蛋白在液体制剂中的稳定性可以通过以下任一种或其组合来评估：通过目测外观、蛋白浓度（A280nm）、尺寸排阻层析（SEC）、毛细管等电聚焦法（c-IEF）、和通过功能结合测定（ELISA）。例如，可以使用单体、聚集体、或片段、或其组合的百分比来确定稳定性。在一个实施方案中，稳定的液体制剂是这样的制剂，其具有少于约10%、或少于约5%的作为聚集体存在于制剂中的TNF-α抗原结合蛋白。制剂可以具有至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%的单体含量。制剂可以在室温（约25℃）下约2周后具有至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%的单体含量。制剂可以在室温（约25℃）下约1周后具有至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%的单体含量。制剂可以在室温（约25℃）下约1天后具有至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%的单体含量。
因此，可以制备用于注射的本发明的药物组合物以包含1 mL无菌缓冲的水、和约1 mg至约100 mg之间、例如约30 mg至约100 mg或更优选地、约35 mg至约80mg、诸如40、50、80或90 mg的本发明的抗原结合构建体。制备肠胃外施用的组合物的实际方法是熟知的或者对于本领域技术人员是显而易见的，并且在例如Remington's
Pharmaceutical Science, 第15版, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania中更详尽地描述。对于制备本发明的静脉内施用的抗原结合构建体制剂，见Lasmar U和Parkins D “The
formulation of Biopharmaceutical products”,
Pharma. Sci.Tech.today, page 129-137, Vol.3 (3rd April 2000), Wang,
W “Instability, stabilisation and
formulation of liquid protein pharmaceuticals”,
Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A
and B ed Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992),
Akers,M.J. “Excipient-Drug interactions in
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of sugar on stabilization of Protein in the dried state”, J Pharm Sci 92 (2003) 266-274,Izutsu, Kkojima, S. “Excipient crystalinity and its
protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying”, J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, “Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for
protein lyophilization”, J. Pharm. Sci,
91 (2002) 914-922。
优选地，本发明的抗原结合蛋白以约40 mg的剂量提供或施用。优选地，抗原结合蛋白适合于皮下递送并且皮下递送。如本文所公开，还可以使用其他给药途径或施用途径。
在一个实施方案中，相比于包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ
ID No. 12的重链序列的IgG，根据本发明的任何方面的抗原结合蛋白显示出增加的平均残留时间。
修饰的IgG和包含IgG恒定结构域或其FcRn结合部分的分子的结合能力可以通过多种体外测定来表征。由Ward的PCT公布WO 97/34631详细地公开了多种方法。例如，为了比较修饰的IgG或其片段结合FcRn的能力与野生型IgG结合FcRn的能力，可以将修饰的IgG或其片段以及野生型IgG进行放射性标记，并且体外与表达FcRn的细胞反应。随后可以对结合细胞部分的放射性计数并比较。用于该测定的表达FcRn的细胞可以是上皮细胞系，包括来源于B10.DBA/2小鼠的肺的小鼠肺毛细血管上皮细胞(B10,
D2.PCE)和来源于C3H/HeJ小鼠的SV40转化的上皮细胞(SVEC) (Kim等, J
Immunol., 40: 457-465,1994)。然而，还可以使用其他类型的表达足够量的FcRn的细胞，包括表达所选物种的重组FcRn的哺乳动物细胞。或者，在对修饰的IgG的或未修饰的IgG的结合级分的放射性计数后，可以随后用去污剂提取结合的分子，并计算每单位数目的细胞的百分比释放并比较。
本发明的抗原结合蛋白对FcRn的亲和力可以通过表面等离子共振（SPR）测量法来测量，如前所述(Popov等,
Mol. Immunol., 33: 493-502,1996; Karlsson等, J
Immunol. Methods, 145: 229-240,1991, 这两者均以其整体通过引用并入本文)使用例如BIAcore 2000 (BIAcore Inc.)。在该方法中，将FcRn分子偶联到BIAcore传感器芯片（例如，Pharmacia的CM5芯片）上，并且使用BIA评价2.1软件以某一流速测量修饰的IgG与固定的FcRn的结合来获得传感图（sensorgrams），基于该传感图能够计算修饰的IgG、恒定结构域、或其片段与FcRn的结合和解离速率（on-and off-rates）。本发明的抗原结合蛋白和未修饰的IgG对FcRn的相对亲和力还可以通过简单的竞争结合测定来测量。此外，修饰的IgG或其片段、和野生型IgG对FcRn的亲和力还可以通过饱和度研究和Scatchard分析来测量。
修饰的IgG或其片段通过FcRn穿过细胞的转移可以通过体外转移测定使用放射性标记的IgG或其片段和表达FcRn的细胞并且比较细胞单层的一侧与另一侧的放射性来测量。或者，此类转移可以体内测量，通过用放射性标记的、修饰的IgG饲喂10-14天龄的乳鼠并且周期性对血液样品中的放射性计数，其表明IgG经肠转移到循环（或任何其他目标组织，例如肺）中。为了测试IgG经肠转移的剂量依赖性抑制，将放射性标记的和未标记的IgG以某一比例的混合物给予小鼠，并且可以周期测量血浆的放射性(Kim等,
Eur. R Immunol., 24: 2429-2434,1994)。
可以按照Kim等所述的方法(Eur. J. of
Immuno. 24: 542,1994)通过药代动力学研究来测量抗原结合蛋白的半衰期，所述方法以其整体通过引用并入本文。按照该方法，将放射性标记的抗原结合蛋白静脉内注入小鼠，并且周期测量它的血浆浓度作为时间的函数，例如在注射后3分钟至72小时。由此获得的清除曲线应为二相性的。对于测定修饰的IgG或其片段的体内半衰期，计算β-相中的清除率并且与未修饰的IgG的进行比较。
可以测定本发明的抗原结合蛋白的免疫特异性结合抗原的能力。此类测定可以在溶液中(例如Houghten, BiolTechniques, 13: 412-421,1992)、在珠上(Lam, Nature, 354: 82-84,1991、在芯片上(Fodor, Nature, 364: 555-556,1993)、在细菌中(美国专利号5,223,409)、在孢子中(美国专利号5,571,698;
5,403,484; 和5,223,409)、在质粒上(Cull等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1865-1869,1992)或在噬菌体上(Scott和Smith, Science,
249: 386-390,1990; Devlin, Science, 249: 404-406,1990; Cwirla等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378-6382, 1990; 和Felici, J : Mol. Biol., 222: 301-310, 1991) 进行（这些文献的每一篇均以其整体通过引用并入本文）。可以随后测定抗体或其片段它们对抗原的特异性亲和力，所述抗体已经鉴定为免疫特异性结合抗原。
可以通过任何本领域已知的方法测定本发明的抗原结合蛋白与抗原的免疫特异性结合和与其他抗原的交叉反应性。可以用于分析免疫特异性结合和交叉反应性的免疫测定包括但不限于：竞争性和非竞争性测定系统，其使用技术略举数例，诸如蛋白质印记、放射性免疫测定、ELISA（酶联免疫吸附测定）、“三明治”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体-固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定。此类测定在本领域中是常规的并且熟知的(例如见, Ausubel等编辑, 1994, Current
Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, 其以其整体通过引用并入本文)。示例性的免疫测定在下文简单描述（但并非意在限定）。
在优选的实施方案中，使用BIAcore动力学分析来测定抗体与抗原的结合和解离速率。BIAcore动力学分析包括分析抗原从其表面上具有固定抗体的芯片上的结合和解离。
抗原结合蛋白：如本文所用的术语“抗原结合蛋白”包括提及抗体、抗体片段和其他蛋白构建体，其能够结合TNF-α。
抗体：术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，并且包括提及具有免疫球蛋白样结构域的分子，并且包括单克隆的、重组的、多克隆的、嵌合的、人源化的、双特异的和异源缀合的抗体。
人IgG1重量恒定结构域：指天然发现的IgG1重链恒定结构域的人氨基酸序列，包括等位变异。
“半衰期(t1/2)”指抗原结合多肽的浓度达到它的起始值的一半所需的时间。可以按照Kim等所述的方法(Eur. J. of Immuno. 24: 542, 1994)通过药代动力学研究来测量蛋白的血清半衰期。按照该方法，将放射性标记的蛋白静脉内注入小鼠，并且周期测量它的血浆浓度作为时间函数，例如在注射后约3分钟至约72小时。用于分子的药代动力学分析和半衰期测定的其他方法对于本领域技术人员是熟知的。详细内容可见于Kenneth,
A等: Chemical Stability of Pharmaceuticals:
A Handbook for Pharmacists和Peters等, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)中。还可以参考“Pharmacokinetics”, M
Gibaldi & D Perron, 由Marcel Dekker出版, 2nd Rev. ex edition (1982), 其描述了药代动力学参数诸如t α和t β半衰期和曲线下面积(AUC), 以及“Clinical
Pharmacokinetics: Concepts and Applications”,
Rowland and Tozer, 第三版 (1995)。
“清除（CL）”指每单位时间蛋白的血浆不可逆清除的体积。将清除计算为剂量/AUC
(AUC : 为曲线下面积或血浆药物浓度时间曲线下面积)。可以通过药物消除速率除以药物的血浆浓度（消除速率= CL*浓度）来计算清除。
“平均残留时间(MRT)”是抗原结合多肽在被不可逆地消除前停留在体内的平均时间。计算为MRT=
AUMC/AUC。
“稳态浓度”（Css）是作为连续药物施用的结果，当药物消除速率与药物施用速率变得相同时所达到的浓度。Css在峰水平和谷水平之间波动，并且以微克/ml测量。“平均稳态谷浓度”指在给定时间下患者群中的谷水平的平均值。
“相当的平均稳态谷浓度”指这样的平均稳态谷浓度，其与状态值相同或在其的约10%至30%之内。可以认为本发明的抗原结合多肽的相当的平均稳态谷浓度是那些平均稳态谷浓度，其是用包含SEQ
ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG实现的平均稳态谷浓度的0.8-1.25倍。
半衰期和AUC可以从药物（例如本发明的抗原结合多肽）的血清浓度对时间的曲线中确定。半衰期可以通过区室化（compartmental）或非区室化分析来测定。可以使用WINNONLIN™分析程序包(可获自Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA)，例如来模拟曲线。在一个实施方案中，“半衰期”指终点半衰期。
特异性结合：如在整个本说明书中所用的与抗原结合蛋白相关的术语“特异性结合”表示抗原结合蛋白结合TNF-α，而与其他不相关蛋白不结合或具有不显著的结合。然而，该术语并不排除抗原结合蛋白还可以与紧密相关的分子交叉反应这一事实。本文所述的抗原结合蛋白可以以大于它们结合紧密相关分子的至少2倍、至少5倍、至少50倍、至少100倍、或至少1000倍的亲和力结合TNF-α。
CDR:
将“CDR”定义为抗原结合蛋白的互补决定区氨基酸序列。这些是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。在免疫球蛋白的可变部分中存在三个重链和三个轻链CDR (或CDR区)。因此，如本文所用的“CDR”指所有三个重链CDR、所有三个轻链CDR、所有重链和轻链CDR、或者至少两个CDR。
在整个本说明书中，可变结构域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基均按照Kabat编号规定进行编号。类似地，实施例中所用的术语“CDR”、“CDRL1”、“CDRL2”、“CDRL3”、“CDRH1”、“CDRH2”、“CDRH3”按照Kabat编号规定。对于进一步信息，见Kabat等,
Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版, U.S. Department of Health and Human Services, National
Institutes of Health (1987)。
变体的%同一性：术语“同一的”或“序列同一性”表示当最优比对且与合适的插入或缺失比较时，两条核酸或两条氨基酸序列之间的同一性程度。本文描述的变体可以与天然CDR或可变结构域序列在氨基酸水平上具有90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性。
将理解本文描述的具体实施方案作为本发明的说明而非限制来显示。本发明的主要特征可以用于多种实施方案中而不背离本发明的范围。本领域技术人员将认可或能够确定使用不超过常规研究、许多本文描述的具体方法的等效物。认为此类等效物处于本发明的范围之内并且被权利要求所覆盖。本说明书中提及的所有出版物和专利申请表示本发明所属的本领域技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请以相同程度通过参考并入本文，就如同每一单个的出版物或专利申请被具体和个别地指示被通过引用并入一样。在权利要求和/或说明书中当与术语“包含（comprising）”结合使用时，词语“一个（a）”或“一个（an）”的用法可以表示“一个（one）”，但它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的意思一致。在权利要求中术语“或者”用于指示“和/或”，除非明确地指示仅指代可供选择的事物或者可供选择的事物是互相排除的，尽管公开内容支持指代仅为可供选择的事物和“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“约”用于指值包括用于测定该值的设备、方法的误差的内在变化、或存在于研究受试者中的变化。
如本说明书和权利要求中使用，词语“包含（comprising）”（以及包含（comprising）的任何形式，如“包含（comprise）”和“包含（comprises）”）、“具有（having）”（以及具有（having）的任何形式，如“具有（have）”和“具有（has）”）、“包括（including）”（以及包括（including）的任何形式如“包括（includes）”和“包括（include）”）或“含有（containing）”（以及含有（containing）的任何形式，如“含有（contains）”和“含有（contain）”）是包含的或末端开放的，并且不排除额外的、未叙述的元素或方法步骤。在一方面，此类末端开放的术语在它们的范围内还包含限制性的或封闭的定义，例如诸如“基本上由……组成”或“由……组成”。
本文使用的术语“或其组合”指在术语前列出项目的所有的排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”意在包括以下至少一种：A、B、C、AB、AC、BC、或ABC，并且如果顺序在具体上下文中是重要的，还为BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、或CAB。还是这个实例，明确包括的是包含一个或多个项目或术语的重复的组合，诸如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB，等等。技术人员将理解除非从上下文中是显而易见的，否则通常不存在对任何组合的项目或术语的数目的限定。
在本公开内容的教导下，本文公开并要求保护的所有组合物和/或方法可以被生产或实行，而不需要过度的实验。尽管本发明的组合物和方法已经以优选的实施方案的形式进行了描述，但对于本领域技术人员显而易见的是可以对组合物和/或方法以及在本文描述的方法的步骤中或步骤的顺序中产生变化而不背离本发明的概念、精神和范围。认为对于本领域技术人员显而易见的所有此类相似的替代和修改处于由所附的权利要求所限定的发明的精神、范围和概念之内。
本文参考的所有文件通过引用以允许的最大范围来并入。
除非另外从本申请的上下文中是显而易见的，明确地将公开内容的所有元素与公开内容的任何其他元素组合来考虑。
通过参考以下实施例进一步描述本发明，而非限制本发明。
实施例
实施例1：抗体表达载体的克隆
之前将编码抗TNFα抗体的重链可变结构域（VH）和轻链可变结构域（VL）的DNA表达构建体从头制备，并且包括用于克隆入哺乳动物表达载体中的限制位点。重链可变结构域和轻链可变结构域序列均为优化用于在哺乳动物细胞中表达的序列(方法学见WO2009024567和Kotsopoulou等, J Biotechnol (2010) 146: 186-193)。描述重链可变区和轻链可变区序列的信息可见于美国专利US6090382中。为了产生用于本研究中的构建体，使用PCR扩增重链可变结构域（VH）序列。PCR引物含有HindIII和SpeI限制位点，以构成含有信号序列的VH结构域，用于克隆入含有人γ1恒定区的pTT哺乳动物表达载体中。类似地，使用引物通过PCR扩增VL结构域序列，所述引物含有HindIII和BsiWI限制位点以利于克隆入含有人kappa恒定区的pTT哺乳动物表达载体中。给定重链表达质粒代号SJC322，并且给定轻链表达质粒质粒代号SJC321。
通过重叠寡核苷酸的组装及与上述那些类似的分子生物学技术，从头制备DNA表达构建体，所述DNA表达构建体编码在CDR区内具有修饰的抗TNFα抗体(如Rajpal等 PNAS (2005) 102(24): pg 8466-8471中所描述)的可选重链可变区和轻链可变区。得到的编码变体cb1-3、cb2-6和cb2-44的重链和轻链的质粒描述于表1中。
实施例2：Fc区的改造
使用Quikchange方案(Promega)用正向和反向引导引物将修饰(M252Y/S254T/T256E和T250Q/M428L)引入编码帕考珠单抗（抗IL-4抗体）的重链的质粒的人γ1恒定区中。
如上文实施例1中所述，使用之前构建的、密码子优化的载体作为模板来产生编码抗TNFα抗体的VH结构域的PCR片段。使用HindIII和SpeI将所获的片段克隆入含有上文段落中所述的修饰的人γ1恒定区的pTT表达载体中。将编码具有M252Y/S254T/T256E修饰的抗TNFα抗体的重链的质粒命名为SJC324。将编码具有T250Q/M428L修饰的重链的质粒命名为SJC323。
使用Quikchange方案(Promega)用正向和反向引导引物将修饰引入抗TNFα重链表达质粒SJC322的人γ1恒定区中。质粒SJC326编码在人γ1恒定区中含有M428L/N434S修饰的抗TNFα重链。质粒SJC328编码在人γ1恒定区中含有V308F修饰的抗TNFα重链。
实施例3：使用pTT5附加型载体在HEK2936E细胞中表达抗体
将上述编码重链和轻链的表达质粒瞬时共转染入HEK 293 6E细胞中。通过亲和层析使用1ml HiTrap蛋白A柱(GE Healthcare)从上清液中纯化表达的抗体。下文表1显示了产生的抗体的列表。
某些抗体使用不同组的表达载体也在CHO细胞中表达。见实施例13、14和15对分子生物学、表达和纯化的描述。
表1：表达的抗体的列表
实施例4：在直接结合ELISA中抗体与肿瘤坏死因子α的结合
进行结合ELISA来测试使用蛋白A纯化的表达的抗体与重组肿瘤坏死因子α(TNFα)的结合。用重组人TNFα以0.1µg/ml包被ELISA板，并且用封闭液（4% BSA）封闭。加入多种稀释度的纯化的抗体（在pH8.0的含0.05%吐温20的Tris缓冲盐水中的4% BSA中稀释），并且在去离子水中洗涤前，将板在室温下孵育1小时。通过在封闭液中加入过氧化物酶标记的抗人kappa轻链抗体(Sigma
A7164)来检测结合。在去离子水中洗涤前，将板在室温下孵育1小时。通过加入OPD底物(Sigma P9187)使板显色，并且通过加入2M HCl终止显色。用板读数器在490nm下测量吸光度，并且将平均吸光度对浓度作图。结果显示于图1中，并且确定所有抗体均具有相似的概况。
实施例5：在L929体外中和测定中分析抗体
使用该测定来测试抗体中和TNF-α并抑制细胞死亡的中和能力。简述之，将L929细胞以10,000/孔接种于96孔平底板的100µl RPMI 1640
(w/o酚红)中，并在37℃、5% CO2下孵育过夜。用1.25µg/ml放线菌素D将细胞致敏1小时。对于中和研究，将0.001-60µg/ml (0.0067- 400 nM) 抗-TNF-α mAb与大约2ng/ml (大约0.05nM) TNF-α以1：1的比例在室温下预孵育1小时。对于对照组，用RPMI代替抗体。与放线菌素D预孵育1小时后，每孔中加入20 µl的抗体-抗原复合物。将10ul培养基单独加入孔中作为阴性对照。将板在37℃、5% CO2下孵育18小时。该处理时期后，通过细胞效价-Glo Luminescent测定试剂盒按照制造商说明书(Promega, Madison USA)测定细胞生存力。对于L929测定，将未知样品的百分比细胞生存力表示为未处理组（取作100%）的百分比，并且通过Graphpad
prism测定IC50。通过单因素ANOVA
(Newman–Keuls事后检验)评估抗体的IC50值的差异，并认为小于0.05的P值为显著的。数据表示为重复测量的n=4实验的平均值± SEM。测定每一抗体的IC50值，并列于下文表2中。结果显示所检测的所有抗体的效价（potency）是相当的。
表2：在L929中和测定中多种抗TNFα抗体的IC50值
表3显示了源于实验的IC50值。结果表明相比于BPC1492和阿达木单抗，改善的抗TNFα 抗体(BPC1499, BPC1500, BPC1501)在该测定中显示出增加的效价。
表3：在L929中和测定中改善抗TNFα抗体的IC50值
实施例6：抗体对体外IL-6释放的作用
通过测量抗体对TNF-α介导的从全血细胞中释放IL-6的抑制作用来测定抗体的中和能力。简述之，将130 µL的全血加入每孔中，并将板在5% CO2调湿培养箱中在37℃下孵育1小时。对于中和研究，将0.001-30µg/ml (0.0067- 200 nM) TNF-α mAb与10ng/ml (大约0.4 nM) TNF-α以1：1的比例在4℃下预孵育1小时。对于对照组，用RPMI代替抗体。该预处理后，每孔加入20 µl的抗原-抗体复合物或RPMI（阴性对照），并将板在37℃、5% CO2下孵育24小时。将100 µL PBS (w/o MgCl2或CaCl2)加入每孔，并置于板振荡器上以500
rpm进行10分钟。随后将板以2000
rpm离心5分钟。将120
µL上清液小心移出并转移至新的96孔圆底板上，并使用基于MSD的测定试剂盒(Meso Scale Diagnostics, Maryland USA)测定IL-6释放。对于全血测定，使用MSD SECTOR®
Imager 2400读取每一样品的MSD信号，并且使用PRISM
4.00软件(GraphPad. San Diego, USA)中的标准数据分析程序包对从细胞中的IL-6释放定量。将由每一抗体的IL-6抑制的百分比表示为单独TNF-α处理组的百分比。因此，获得了每一抗体的剂量应答曲线，并且测定了IC50值。使用IC50值的对数，通过单因素ANOVA (Newman–Keuls事后检验)测定抗体效价的差异，并认为对每一供体(n=3)低于0.05的P值为显著的。数据表示为重复测量的三个供体的平均值± SEM。
下文表4显示了源于这些数据的IC50值。这些结果暗示在所检测的抗体之间效价不存在显著差异。
表4：在TNFα诱导的IL-6释放测定中多种抗TNF抗体的IC50值
IC50值显示于表5中。结果表明改善的抗TNFα 抗体(BPC1499, BPC1500, BPC1501)在该测定中显示出增加的效价。
表5：在TNFα诱导的IL-6释放测定中多种改善的抗TNF抗体的IC50值
实施例7：加速应激物研究
在该研究前，将待检测的抗体在分光光度计上在OD280nm下定量，并在PBS (pH7.4)中稀释至1.1mg/ml。移出一等分试样并加入10%v/v的500mM乙酸钠以产生在pH5.5的1mg/ml的终浓度，并检查样品沉淀。向PBS中的剩余样品中加入10% PBS v/v至pH7.4下1mg/ml的终浓度，并且移出一等分试样的该样品以提供基线聚集水平（如同通过尺寸排阻层析监测）。随后将该样品在培养箱中在37℃下孵育两周，其后将样品在分光光度计上OD280nm下再次定量并（通过尺寸排阻层析）评估聚集。在直接结合ELISA中检测样品的人TNFα结合。结果显示于图2中并且确定了加速应激物研究后所有检测的抗体的结合活性是相当的。
实施例8：在25%人血清中的稳定性研究
在该研究前，将待检测的抗体在分光光度计上在OD280nm下定量，并在PBS (pH7.4)中稀释至1.25mg/ml。移出一等分试样并加入25%v/v的人血清以产生1mg/ml的终浓度。向PBS中的剩余样品中加入25% PBS v/v至1mg/ml的终浓度，并且移出一等分试样的该样品以提供基线水平。随后将该样品在培养箱中37℃下孵育两周，其后在直接结合ELISA中测试该样品的人TNFα结合。结果显示于图3中并且确定了在25%人血清中孵育两周后所有测试的抗体的结合活性是相当的。
实施例9：冷冻-融解后结合人TNFα的分析
将抗体样品在含50mM乙酸盐和150mM
NaCl (pH6.0)的缓冲液中稀释至1mg/ml，在干冰中快速冷冻并随后在4℃下融解过夜。测试抗体与人TNFα的结合，与未进行快速冷冻的抗体比较。为了评估冷冻-融解后的结合活性，将ELISA板用1µg/ml的重组人TNFα进行包被，并用封闭液（Tris缓冲盐水中4% BSA）封闭。将多种浓度加入包被后的板中，在去离子水中洗涤前在室温下孵育1小时。通过在封闭液中加入过氧化物酶标记的抗人kappa轻链抗体(Sigma
A7164)来检测结合。在去离子水中洗涤前，将板在室温下孵育1小时。通过加入OPD底物(Sigma P9187)使板显色，并且通过加入2M HCL终止显色。用板读数器在490nm下测量吸光度，并且将平均吸光度对浓度作图。结果显示于图4中并且确定了冷冻-融解后所有测试的抗体的结合活性是相当的。
实施例10：抗TNFα抗体与FcγRIIIa结合的分析
将ELISA板用1µg/ml的重组人FcγRIIIa (V158和F158变体)包被，并且用封闭液（Tris缓冲盐水中4% BSA）封闭。将多种浓度加入包被后的板中，在去离子水中洗涤前在室温下孵育1小时。通过在封闭液中加入过氧化物酶标记的抗人kappa轻链抗体(Sigma A7164)来检测结合。在去离子水中洗涤前，将板在室温下孵育1小时。通过加入OPD底物(Sigma P9187)使板显色，并且通过加入2M HCl终止显色。用板读数器在490nm下测量吸光度，并且将平均吸光度对浓度作图。结果显示于图5a和5b中并且确定了相比于BPC1492和BPC1496，BPC1494已经降低了结合FcγRIIIa (V158和F158变体)的能力。
实施例11：ProteOn分析:FcRn结合
通过伯胺偶联将用于测试的抗体以相似水平固定于GLC生物传感器芯片(BioRad 176-5011)上。以2048nM、512nM、128nM、32nM和8nM将重组人和食蟹猴FcRn用作分析物，使用单独注射的缓冲液（即0nM）作为结合曲线的双参考。FcRn注射后抗体表面的再生使用pH9.0的HBS-N，测定在25oC下在ProteOn XPR36 蛋白相互作用阵列系统上进行，并且在具有在合适缓冲液中稀释的FcRn的HBS-N pH7.4和HBS-N
pH6.0中进行。使用ProteOn分析软件固有的平衡模型来计算亲和力，对pH6.0下的结合使用“Global R-max”并对pH7.4下的亲和力计算使用来自pH6.0下结合的R-max。由于结合曲线在pH7.4未达到饱和，所获的值不可能是正确的亲和力，但它们能够用于将构建体排序。结果显示于表6中并且确定当与BPC1492相比时，BPC1494和BPC1496在pH6.0对人和食蟹猴FcRn具有改善的亲和力。
表6 抗TNFα构建体结合人和食蟹猴FcRn的亲和力
实施例12：在人FcRn转基因小鼠中的PK研究
在单次剂量药代动力学研究中，将BPC1494和BPC1492静脉内（IV）以1 mg/kg向FcRn人源化小鼠的两种不同品系和一种FcRn缺陷品系施用(Petkova等Int. Immunol (2010) 18(12):1759-1769)。分析BPC1494和BPC1492的血浆样品，合适时使用有效的Gyrolab荧光免疫测定。
该方法使用生物素化的人TNFα作为俘获抗原并使用Alexa标记的抗人IgG（Fc特异性的）抗体作为检测抗体。使用一等分试样的用测定缓冲液1：10稀释的小鼠血浆，定量下限（LLQ）为100 ng/mL并且定量上限（HLQ）为100,000 ng/mL。将低于最低标准品的血浆浓度认为是无法定量的。用每一批次样品对分别制备的校正标准品分析以三种不同浓度制备的且与研究样品储存的QC样品。对于可接受的分析，每一浓度下至少一份QC必须不能偏离名义上的浓度多于20%。该研究的QC结果达到了这些接受标准。
使用WinNonLin版本6.1通过非区室化药代动力学分析进行PK分析。所有计算利用名义上的血液采样次数。使用线性对数梯形计算方法通过计算从给药起始至最后的可定量时间点(AUC0-t)的血浆浓度时间曲线下面积（AUC）来确定BPC1494和BPC1492的全身暴露。由于样品标记中的偏差，进一步PK参数无法来源于数据。
表7-以1 mg/kg的目标剂量向转基因小鼠的单次静脉内施用（推注（bolus））后，BPC1494和BPC1492的药代动力学参数概述
品系 1 = mFcRn-/- hFcRn (32) Tg/Tg
品系 2 = mFcRn-/- hFcRn (276) Tg/Tg Rag1-/-
品系 3 = mFcRn -/-/Rag1-/-。
对于所有组获得了类似的Cmax浓度。在两种人FcRn敲入小鼠品系中，BPC1494均比BPC1492具有更高的暴露(AUC0-t)，尽管该差异并不显著（1.3倍）。在人和小鼠FcRn均不存在的情况下，BPC1492比BPC1494具有更高的暴露。
实施例13：克隆抗体表达载体入pEF载体
在某些情况下，使用标准分子生物学技术用HindIII和EcoRI从实施例3中描述的载体中将编码重链和轻链表达盒的DNA切出并克隆入pEF载体内，其中表达从hEF1a启动子发生(载体描述见Kotsopoulou等 J. Biotechnol (2010) 146:186-193)。
表8
实施例14：使用pEF表达载体在CHO细胞中表达抗体
将编码重链和轻链的表达质粒共转染入CHO DG44细胞中并以产生抗体的规模表达。对于产生BPC1492质粒，使用SJC329和SJC330。对于表达BPC1494质粒，使用SJC329和SJC331。对于BPC1496质粒，使用SJC329和SJC332。
简述之，用Not1限制酶将30µg DNA (15µg 重链和15µg 轻链)线性化过夜。随后将所获的限制酶切DNA乙醇沉淀并重新溶于TE缓冲液中。从培养物中获得6X106 CHO DG44细胞并在10ml的PBS中洗涤。细胞沉淀随后重悬于300µl的Amaxa溶液V中。将100µl上述细胞悬浮液随后加入三个Amaxa比色杯的每一个中，其还含有3µg线性化的DNA。将比色杯插入Amaxa
nucleofector II设备中并用预设程序U-023电穿孔。将电穿孔细胞的三个比色杯的内含物(300µl)加入10ml加温的MR14培养基（包括核苷和BSA）中，并在T75瓶中孵育48小时。在该时期后，将培养基更换为无核苷的MR14（仅含BSA的MR14）。每3-4天，去除条件培养基并用新鲜选择培养基替换。一旦细胞经历恢复，将培养基替换为2X MR14并且通过比浊法（nephlometry）确定IgG表达。用1L 0.6X106/ml的表达IgG的细胞接种2L摇瓶并生长7天。通过离心从上清液中分离细胞并将上清液用于蛋白纯化。
在AKTA Xpress系统上用2步自动处理纯化1升细胞培养上清液。在5ml
MabSelectSure柱上俘获抗体并随后在洗脱前洗涤。随后将洗脱的抗体装载到440ml Superdex
200凝胶过滤柱上，并在96孔模块中收集2ml级分。将纯化的抗体级分合并并进行0.2µm过滤并随后使用Amicon旋转浓缩器浓缩至~5mg/ml。最终材料再次进行0.2µm过滤并随后分液至无菌管中用于递送。将最终材料进行分析SEC以测定聚集，进行内毒素测定、用于精确质量测定的LC-MS（包括PNGaseF和未处理的材料以确定糖基化）、SDS PAGE电泳、用于序列验证的PMF和用于浓度确定的A280。
实施例15：使用pEF表达载体在CHO细胞中表达抗体的可选方法
从哥伦比亚大学的Chasin博士获得DHFR-无效 CHO DG44细胞。随后使这些细胞适应化学成分确定的培养基。将这些已适应的宿主细胞命名为DG44-c并在添加有Glutamax和HT-添加物的专有化学成分确定的培养基中培养。
多克隆库的产生：对于方案的更多细节见WO2009024567和Kotsopoulou等 J.
Biotechnol (2010) 164(4):186-193。简述之，通过电穿孔（使用Amaxa
nucleofector系统）分别用编码重链和轻链和DHFR和neoR的质粒转染DG44-c细胞。转染后48小时，通过加入G418（以400µg/ml的终浓度）并去除HT来开始选择。当生存力和细胞计数充分增加时（在这种情况下为转染后2个月），以5nM的终浓度加入甲氨蝶呤(MTX)。细胞规模增加并且加入MTX后9-16天开始生产曲线。对于这些生产曲线，将细胞以0.6-0.8x106细胞/ml接种于化学成分确定的培养基中并在第6、9或10、12或13和/或16天加入。当生存力下降至大约50%时收集上清液，并且通过以4000g离心30分钟随后经sartobran囊式滤器过滤去除细胞。
使用两步层析程序在室温下纯化抗体：使用50ml MabSelect SuRe柱(GE Healthcare)随后用具有1.5L
Superdex 200 pg SEC (GE Healthcare)的尺寸排阻层析（SEC）进行初始俘获。以9cm/小时的流速将条件培养基装载到预平衡的MabSelect
SuRe柱上。用平衡缓冲液(50mm Tris pH 8.0, 2M NaCl)洗涤至基线后，用低盐缓冲剂缓冲液(50mM NaCl Tris pH 8.0, 150mM NaCl)洗涤柱直至电导率稳定。随后用洗脱缓冲液(25mM 柠檬酸盐 pH
2.5)将柱洗脱。用1/10体积的1.0M
Tris pH 8.0立即中和对应于峰蛋白洗脱液的级分，随后将其合并并经0.2µm瓶顶（bottletop）滤器过滤。将回收的样品以21cm/小时装载到用SEC缓冲液(50mM乙酸钠, 150mM NaCl)预平衡的SEC柱上。将含有主要（单体的）蛋白峰的级分合并并滤器灭菌。
将通过该方法制备的抗体用于以下实施例中概述的分析比较研究中。
实施例16：对应激和对照样品的分析比较
进行尺寸排阻层析来测定到蛋白的聚集水平。优化的方法涉及将样品注射入已经用100
mM磷酸钠、400 mM NaCl、pH 6.8平衡的TOSOH TSK
G3000SWXL柱上。在280nm和214nm下测量吸光度。基于疏水性，反向HPLC分离蛋白和它们的同工型。将蛋白注射入PLRP-S
1000 Å 8µm 柱上并使用由50%甲酸和95%乙腈产生的梯度洗脱。在280nm下测量吸光度。将分子的纯度报道为主峰面积相对于总峰面积的百分比。使用毛细管等电聚焦(cIEF)根据它们的pI值分离mAb的不同同工型。在10cm、UV280透明的盒式毛细管（cartridge capillary）上进行IEF分离。优化的方法涉及含有5% pH 3-10两性电解质、10mM
NaOH、目的蛋白和内部pI标记物(7.05和9.5)的溶液，其通过压力注射装载入毛细管中。
使用MSD测定抗体（阿达木单抗、BPC1494、BPC1496）的特异性活性。简述之，每孔用50µL在PBS中稀释至1 µg/mL的TNFα包被96孔板。将板在工作台上室温下不摇动孵育2小时。去除包被液并且将板每孔用50µL含有0.05%聚山梨酯20的PBS中的1% BSA封闭。将板在24oC下以400
rpm摇动孵育1小时，并随后用洗涤缓冲液洗涤4次。将抗体在含有0.05%聚山梨酯20的PBS中的1% BSA中稀释，并且将30µl的每一样品加入板中。将板在24℃下以400 rpm摇动孵育1小时。随后用洗涤缓冲液将板洗涤4次。将抗人IgG sulfotag在测定缓冲液中以1:5000稀释。将30μL加入板的每孔中，并随后在24℃下以400 rpm摇动孵育1.5小时。随后用洗涤缓冲液将板洗涤4次。用去离子水将4x MSD Read
Buffer浓缩液稀释至1x。随后板的每孔加入100µL。随后使用MSD Sector Imager仪器对板读数。从该测定中获得的信号来计算分子的特异性活性。
脱酰胺作用分析
脱酰胺作用是常见的翻译后修饰，其可以对天冬氨酸和谷氨酰胺残基发生，但最常在天冬氨酸残基中观察到，尤其是当临近甘氨酸残基时。为了检查这些残基易感的程度并且确定脱酰胺作用对效价的作用，将阿达木单抗、BPC1494和BPC1496暴露于应激研究。通过在pH 9.0的1%碳酸氢铵中孵育48小时，即之前已经显示会导致脱酰胺作用的条件进行应激。将应激后的样品与对照（在PBS中）一起孵育，并与它以及未应激的参考比较，并使用c-IEF、SEC和结合ELISA分析。在存在或不存在EDTA的情况下对所有样品还完成受迫的脱酰胺作用。之前已经显示受迫的脱酰胺作用条件除了脱酰胺作用之外还导致断裂。EDTA阻止了断裂并将其降到最低。
氧化分析
多种残基的氧化可以在整个蛋白的处理和储存过程中发生；然而，最常见被氧化的残基是甲硫氨酸，其是该筛选的焦点。通过暴露于在5mM和50 mM H2O2中孵育30分钟的应激条件下来检查这些残基的氧化易感性，并且使用RP-HPLC、SEC和ELISA评估。
结果概述
如对应激的和对照样品的分析比较所显示的，相比于阿达木单抗，BPC1494和BPC1496表现得非常有利。对于所有测试的抗体，如使用的所有分析技术所显示，在受迫的氧化条件下未观察到显著的降解。如同预期的，对于所有测试的抗体，在pH
9.0下均观察到如通过c-IEF测量的显著的脱酰胺作用。此外，如SEC所示，我们看到所有测试的抗体在pH 9.0下在无EDTA的样品中的明显断裂，这也是如所预期的。当与阿达木单抗比较时，存在BPC1494的pI值的降低（大约0.2）。这归因于在BPC1494的重链序列中存在额外的谷氨酸残基，因此使其更为酸性的。受迫的脱酰胺作用和氧化对结合具有极小的影响，并且对BPC1494、BPC1496和阿达木单抗均观察到这一点。
实施例17：通过ELISA分析改善的抗体的结合
如实施例4中所述通过ELISA评估抗体BPC1499、1500和1501的结合活性。使用两种不同的抗原包被浓度(0.1和1.0 µg/ml)，当与BPC1492比较时，抗体在它们的结合概况中没有显示出任何差异。在所检测的条件下，似乎ELISA无法区分具有不同的报道的结合活性的抗体。使用实施例18、5和6中描述的方法学（认为其是更灵敏的测定）评估相同抗体。在这些测定中，当与BPC1492比较时，抗体BPC1499、1500和1501显示出改善的亲和力和改善的效价。
实施例18：使用俘获表面的TNFα结合的Biacore分析
将蛋白A和抗人IgG
(GE Healthcare BR-1008-39)偶联到CM3生物传感器芯片上单独的流通池上。使用这些表面俘获抗体用于结合分析。以64nM、21.33nM、7.11nM、2.37nM、0.79nM将重组人和食蟹猴TNFα用作分析物，使用单独注射的缓冲液（即0nM）作为结合曲线的双参考。使用100mM磷酸和3M
MgCl2进行俘获表面的再生。在37oC下使用HBS-EP作为运行缓冲液在Biacore T100设备上进行运行。构建体BPC1494和BPC1496显示出对蛋白A和抗人IgG表面降低的结合，使得这些表面不适合于对那些分子产生动力学。
表9 人和食蟹猴TNFα结合俘获的抗TNFα抗体的动力学分析
实施例19：ProteOn反向测定结合分析
将生物素化的TNFα与生物素化的BSA以1:49的比例混合，最终总蛋白浓度为20µg/ml (即0.4µg生物素化的TNFα和19.6µg生物素化的BSA)。在NLC生物传感器芯片(单个流通池) (Biorad 176-5021)上俘获该混合物。使芯片表面适应10mM甘氨酸pH3.0直至实现稳定信号。以256nM、64nM、16nM、4nM和1nM和0nM将待检测的抗体用作分析物。结合曲线参考单独用生物素化的BSA包被的流通池。使用10mM 甘氨酸pH3.0实现再生。将数据对ProteOn分析软件固有的1：1模型拟合。
表10 抗TNFα抗体结合Neutravidin俘获的TNFα的表观动力学
该数据是进行的两次实验的一组（第二组未显示）。数据的KD排序代表两个数据组。
实施例20：结合人TNFα的可选抗体的构建
通过重叠寡核苷酸的组装及与实施例1中所述的那些类似的分子生物学技术，从头制备DNA表达构建体，所述DNA表达构建体编码另外的在CDR区内具有修饰的重链可变区(如Rajpal等 PNAS (2005) 102(24): pg 8466-8471中所描述)。编码这些变体抗体的重链可变结构域的DNA序列的实例在SED IQ NO: 81、83、85、87、89、91、93和95中给出。通过重叠寡核苷酸的组装及与实施例1中所述的那些类似的分子生物学技术，从头制备DNA表达构建体，所述DNA表达构建体编码另外的在CDR区内具有修饰的轻链可变结构域区域(如Rajpal等 PNAS (2005) 102(24): pg 8466-8471中所描述)。编码这些变体抗体的轻链可变结构域的DNA序列的实例在SED IQ NO: 97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135和137中给出。一旦构建，将编码重链和轻链的表达质粒瞬时共转染入HEK
293 6E细胞中。使用与实施例6中所述的那些类似的方法从上清液中纯化表达的抗体并评估活性。
实施例21：BPC2604 (帕考珠单抗-YTE)表达载体的构建
使用Quikchange方案(Promega)改造编码帕考珠单抗的重链的基于pTT的DNA表达构建体，以包括以下改变M252Y/S254T/T256E (EU索引编号)。
实施例22：Pasco和Pasco-YTE载体的表达/纯化
将编码BPC2604的重链和轻链的表达质粒瞬时共转染入HEK
293 6E细胞中。使用两步纯化从大量上清液中纯化表达的抗体，所述两步纯化通过亲和层析和SEC在AKTA Xpress上使用5ml
MabSelectSure柱和Superdex 200柱进行。
实施例23：Pasco相比于Pasco YTE对FcRn结合的BIAcore分析
通过伯胺偶联将抗体固定于GLM芯片上（在乙酸盐pH4.5中20µg/ml）。以2048、512、128、32和8nM使用人、食蟹猴、大鼠和小鼠FcRn受体。将0nM用作双参考。在HBS-EP pH7.4和HBS-EP
pH6.0中进行测定（对每一pH在合适的运行缓冲液中稀释FcRn受体）。用200mM Tris pH9.0将表面对FcRn结合进行再生。R-max设置为使用任何构建体获得的最高的R-max，将数据拟合平衡模型。结果显示于下文表11中并且确定了相比于帕考珠单抗，YTE修饰的帕考珠单抗(BPC2604)显示出在pH6.0下对FcRn改善的结合。
表11：抗IL-4抗体构建体对人和食蟹猴FcRn的亲和力（n.a.b.为无可分析的结合）
实施例24：Pasco相对于Pasco-YTE的PK研究
图6显示了以1
mg/kg的目标剂量单次静脉内（1小时输注）施用后雌性食蟹猴中的帕考珠单抗-YTE
(BPC2604))以及雄性食蟹猴中的帕考珠单抗的平均剂量标准化血浆浓度。在单独的研究中产生BPC2604和帕考珠单抗的数据。使用IL-4作为俘获试剂并使用抗人IgG（Fc特异性的）-HRP缀合物作为检测试剂通过化学发光ELISA评估帕考珠单抗和BPC2604的血浆抗体浓度。测定的验证范围为50-5000 ng/mL。结果显示于图6中。两种化合物具有相似的Cmax，但BPC2604具有低于3倍的血浆清除，产生了AUC中3倍的增加和半衰期(T½)中2倍的增加。
实施例25：以5mg/ml的制剂研究
比较了阿达木单抗和TNF-α变体BPC1494在两种制剂中的稳定性。制剂‘A’（柠檬酸盐-磷酸盐缓冲剂）为市售的阿达木单抗制剂，由6.16 mg/ml 氯化钠 + 0.30 mg/ml 柠檬酸二氢钠 +
1.30 mg/mL 一水柠檬酸 + 12 mg/ml 甘露糖醇 + 0.86mg/mL 二水磷酸二氢钠 +
1.53mg/mL 二水磷酸氢二钠 + pH 5.2的1.0
mg/ml PS80构成。
制剂‘B’（乙酸盐缓冲剂）由6.81mg/mL (50mM)
三水乙酸钠 + 10mg/mL (1% w/v) 精氨酸 + 0.0186mg/mL (0.05mM) EDTA + 2.98mg/mL (51mM) 氯化钠 + 0.2mg/mL (0.02% w/v) 聚山梨酯80构成，使用HCl或NaOH调节至pH 5.5。
用于本研究中的TNF-α变体BPC1494材料在中国仓鼠卵巢(CHO DG44)细胞系中制备并使用涉及mAb
Select Sure随后为Superdex column 200pg的两步处理来纯化。使用由Abbott Laboratories制造的阿达木单抗(产品编号NDC 0074-3799-02, 批号91073LX40)。
使用由Thermo Scientific (Rockford, IL ;USA)生产的10KDa Slide – A – Lyzer盒(产品编号66830, 批号LJ150514)在5℃下通过过夜透析将阿达木单抗再配制于制剂‘B’中。该实验在与其他三种制剂不同的时间点进行。使用它们相应的制剂缓冲剂将在制剂‘A’和‘B’中的阿达木单抗稀释为5mg/mL。将TNF-α变体BPC1494分子也以~5mg/mL配制于制剂A和B中。在转移至做了标签的预灭菌的玻璃小瓶中并在5℃、25℃和40℃下孵育直至14周之前，将总计4份样品在清洁层流条件下经MillexGV 0.22um滤器过滤。在选择的时间点上取样并使用SEC-HPLC（表12）、cIEF（表13）分析。还进行下文描述的其他测定以评估抗体的稳定性。
目视观察外观
在日光条件下检视样品的透明度。在5℃、25℃和40℃下储存14周后，每一制剂中的抗体均保持没有变化（澄清的无色溶液）。
蛋白浓度(A280nm)测量
使用nanodrop分光计测量蛋白浓度，其指示了蛋白稳定性。阿达木单抗的消光系数为1.46，并且TNF-α变体BPC1494的消光系数为1.48。在5℃、25℃和40℃下储存14周后，结果中不存在显著区别。
pH
测量在不同储存条件下储存的所有样品的pH以确定是否发生了任何显著的pH偏移。在5℃、25℃和40℃下储存14周后，所有结果保持在测定可变性之内。
尺寸排阻层析（SEC）
该方法基于大小而非分子量来分离溶液中的可溶蛋白分子。理论上，小分子将穿透固定相的每个小孔，并因此将更晚洗脱出。所获的层析图能够确定聚集体、单体和低分子量（MW）片段的百分比面积。聚集体和/或低分子量种类的百分比指示了蛋白降解。增加的稳定性对应于高百分比的单体种类（Mono）以及低百分比的总聚集体（TA）和总低分子量片段（TLMWF）。
SEC-HPLC数据（表12）显示了在25℃和40℃下储存14周后，相比于制剂A，TNF-α变体BPC1494在制剂‘B’中相对更稳定。此外，TNF-α变体BPC1494比在制剂A中的阿达木单抗相对更稳定，或者至少与其同样稳定。制剂B中的阿达木单抗的结果均在5% TA和/或TLMWF之内。因此，对于TNF-α变体BPC1494和阿达木单抗而言，制剂B均比制剂A具有优势。
例如，表12显示了在25℃下储存8周后，制剂A中的TNF-α变体BPC1494具有2.3% TLMWF，而制剂B产生仅1.5%。此外，制剂B中的TNF-α变体BPC1494比制剂A中的阿达木单抗(1.8% TLMWF)相对更稳定。类似地，在25℃下14周时间点上，相比于制剂‘B’中的2.3% TLMWF，对在制剂‘A’中的TNF-α变体BPC1494观察到3.15% TLMWF。此外，‘B’中的TNF-α变体BPC1494比制剂A中的阿达木单抗(3.4% TLMWF)相对更稳定。对于两种分子在40℃下孵育4周观察到了TLMWF的类似趋势（‘A’中阿达木单抗：3.6%；‘A’中TNF-α变体BPC1494：4.1%；‘B’中TNF-α变体BPC1494：2.6%）。
此外，总聚集体（TA）的结果显示在25℃下14周时，TNF-α变体BPC1494在‘B’中(0.3%)比在‘A’中(0.5%)相对更稳定；并且比在制剂A中的阿达木单抗(0.4%)相对更稳定。
毛细管等电聚焦(c-IEF)
使用该技术用于确定分子的电荷概况。宽的pI范围反映了产物更大的电荷异质性，并且此外，宽的pI范围可以指示降解。通常，峰的数目将随增加的降解而增加。表12的C-IEF数据支持表13中的SEC发现。
在25℃下第8周和第14周时，制剂A中的阿达木单抗和制剂B中的TNF-α变体BPC1494之间的主要同工型的%面积(%AMI)是相当的（分别为56.0-57.7和53.2）。在这些时间点和温度下，对于TNF-α变体BPC1494，制剂B显示出比‘A’轻微的优势。
类似地，阿达木单抗在制剂‘B’中比在制剂‘A’中相对更稳定（见第4周的数据）。例如，相比于制剂‘B’，阿达木单抗在制剂‘A’中在40℃下孵育直至4周观察到电荷异质性中的增加的改变（即峰数目的增加）（分别为6个峰和8个峰）。TNF-α变体BPC1494在所有时间点和温度下显示为5个峰的更一致的电荷异质性。
功能结合测定
通过Biacore评估阿达木单抗和TNF-α变体BPC1494在两种制剂中的结合活性。在5℃、25℃和40℃下14周时期的储存后，样品显示出在测定可变性之内的相似的%结合。
因此，可以得出在临床环境中能够将制剂‘B’用作制剂‘A’的替代物，而不会损害蛋白的稳定性并且潜在地消除了与市售阿达木单抗制剂（A）相关的疼痛。
重要的是，该数据显示了相比于柠檬酸盐-磷酸盐制剂（A），乙酸盐制剂（B）不但改善了TNF-α变体BPC1494的稳定性；而且当稳定阿达木单抗时，乙酸盐制剂还与柠檬酸盐-磷酸盐制剂是相当的或者略好一些。
表12：在5℃、25℃和40℃下阿达木单抗和TNF-α变体BPC1494的SEC-HPLC。TLMWF：总低分子量片段；Mono：单体；TA：总聚集体。N = 2
NT= 未测试; pI R:pI范围;
pMI: 主要同工型的pI; % AMI:%面积主要同工型；NoP:峰数目。
实施例26：以50mg/ml的制剂研究
如之前实施例25中所示，在制剂‘B’中以5mg/mL的阿达木单抗和TNF-α变体BPC1494可以用作制剂‘A’的替代物。该实施例聚焦于与制剂‘B’和50mg/ml的其他TNF-α变体相比，比较在它的市售制剂‘A’中的阿达木单抗的稳定性。
分析TNF-α变体BPC1494的两份样品，一份表达于CHO DG44细胞中，并且一份表达于CHOK1细胞中。第二种TNF-α变体BPC1496在CHO-DG44细胞中生产。所有三份样品均表达并用mAb
Select Sure纯化。与实施例25不同，没有进行Superdex柱步骤。如实施例25中，阿达木单抗由Abbott
Laboratories制造(产品编号N 00515-01,
批号02136XH12)。
如上文实施例25中所述，将阿达木单抗配制于制剂‘A’中（如所购买的）和‘B’中（通过缓冲液交换），并将TNF-α变体（BPC1494和1496）配制于‘B’中，均为~50mg/mL（总计5个样品）。在转移至做了标签的预灭菌的玻璃小瓶中并在5℃和40℃下孵育直至9周之前，将样品在清洁层流条件下用MillexGV 0.22um滤器过滤。在选择的时间点上，取样并使用SEC-HPLC（表14）、cIEF（表15）分析。还进行如下文描述的其他测定。
目视观察外观
在日光条件下观察样品的透明度。在5℃和40℃下储存9周后，两种制剂中的抗体均保持没有变化（澄清的无色溶液）。
蛋白浓度(A280nm)测定
使用nanodrop分光计测量蛋白浓度，其指示了蛋白稳定性。在5℃和40℃下储存9周后，结果中不存在显著差异。
尺寸排阻层析（SEC）
SEC-HPLC数据（表13）显示了在40℃下储存9周后，相比于制剂‘A’，50mg/ml的阿达木单抗在制剂‘B’中相对更稳定。而且，TNF-α变体（BPC1494和1496）在‘B’中如阿达木单抗在‘B’中一样稳定或者比其更稳定。没有进行变体在‘A’中和‘B’中的比较。
注意TNF-α变体的初始TA水平比阿达木单抗相对更高。因此，结果包括在右手侧的%变化栏，以比较在40℃下从初始至第9周的变化。例如，表13显示了经过9周的储存后，相比于制剂‘A’中的6.08%，在制剂‘B’中的总低分子量片段(TLMWF)的百分比改变为3.82-4.96%。类似地，对于阿达木单抗，制剂‘A’中的单体百分比变化大于‘B’中的（分别为7.54和4.52%）。‘B’中的TNF-α变体均相对地至少与制剂‘A’中的阿达木单抗一样稳定或比其更稳定（第9周的%变化）。所有样品第4周的结果均在商品化产品的5% TA和/或TLMWF许可范围内。因此，‘B’对于以50 mg/ml的TNF-α变体和阿达木单抗均比‘A’具有优势。
具体而言，TNF-α变体BCP1496在40℃下第9周显示出3.86的低TLMWF值。
毛细管等电聚焦(c-IEF)
c-IEF数据（表15）支持表14中的发现。
相比于制剂A，制剂B在第9周对于阿达木单抗显示出降低的%AMI的%变化（分别为27.57和23.53）。
‘B’中的TNF-α变体在电荷异质性方面（即峰数目的增加）比阿达木单抗更为稳定（在‘A’和‘B’中）。例如，在第9周，对于每一变体存在5个和6个峰；对于阿达木单抗在5℃和40℃下分别存在6个和9个峰。
具体而言，TNF-α变体BCP1496和阿达木单抗在‘B’中第9周分别显示出25.83和23.53的%AMI的低的%变化。TNF-α变体BCP1496 (CHO
DG44)在第9周38.13的相对更高的%AMI的%变化可能是由于75.03的相对高的初始%AMI。
功能结合测定（ELISA）
通过Biacore评估阿达木单抗和TNF-α变体在两种制剂中的生物学活性。经过在5℃和40℃下9周时期的储存后，样品显示出在测定可变性之内的相同的%结合。
因此，可以得出在临床环境中能够将制剂‘B’用作制剂‘A’的替代物，而不会损害在50mg/mL剂量强度的抗体的稳定性。
实施例27：雄性食蟹猴中皮下施用后BPC1494的血浆浓度
在重复剂量药代动力学研究中，将BPC1494以30或100 mg/kg每周或每两周向雄性食蟹猴皮下施用4周。对于组2（n=3），在第1天向动物施用2x 30mg/kg剂量（大约1小时间隔），随后在第8、15和22天施用单次30 mg/kg剂量。对于组3（n=3），在第1天向动物施用2x 30mg/kg剂量（大约1小时间隔），随后在第15天施用单次30 mg/kg剂量。对于组4（n=3），在第1天向动物施用2x 100mg/kg剂量（大约1小时间隔），随后在第15天施用单次100 mg/kg剂量。在研究的整个给药和恢复阶段，间隔取血浆样品。
使用基于样品稀释随后免疫测定分析的合格的分析方法分析血浆样品的BPC1494。分析血浆样品的BPC1494或BPC1492。该方法使用10 µg/ml生物素化的重组人TNF-α作为俘获抗原并使用AlexaFluor 647-标记的抗人IgG（Fc特异性的）抗体的1:100稀释物作为检测抗体(G18-145)。使用50 µL等分试样的100倍稀释的猴血浆，对BPC1494的定量下限（LLQ）为1 µg/mL，定量上限（HLQ）为100 µg/mL。用于该研究中以获取并定量数据的计算机系统包括Gyrolab Workstation版本 5.2.0、Gyrolab
Companion版本1.0和SMS2000版本2.3。使用WinNonlin
Enterprise Pheonix版本6.1通过非区室化药代动力学分析进行PK分析。
药代动力学数据呈现于表16中，参数测定自以下：对于30 mg/kg/周剂量组（2），在第4周接受的最后一次剂量至时间点（t）给药后840小时；对于30和100 mg/kg/两周剂量组（3和4），在第3周接受的最后一次剂量至时间点（t）给药后1008小时。
表16：在4周的调查研究后，以30 mg/kg/周或30和100 mg/kg/两周的BPC1494皮下给药后，雄性食蟹猴中BPC1494的单独和平均药代动力学参数
a）组2动物接受每周30
mg/kg直至4周
b）药代动力学参数测定自以下：对于30 mg/kg/周，在第4周接受的最后一次剂量至时间点（t）给药后840小时；对于30和100 mg/kg/两周，在第3周接受的最后一次剂量至时间点（t）给药后1008小时。
c）由于多种剂量后的消除阶段以及尚未实现稳态，因此Cl_F和Vz_F为估计值。参数估计值已经如下计算：i）使用AUC0-168或336、ii）基于半衰期从第1周的数据外推和iii）使用在确定的AUC0-inf取样后的总剂量
d）基于动物274和277可能展示出抗药物抗体应答这一科学判断，将这些动物从平均药代动力学计算中排除。显示于括号中的平均数据包括这些动物。
实施例28：FcRn与蛋白L俘获的抗TNFα mAbs的SPR结合分析
使用ProteOnTM XPR36 (BioRadTM)生物传感器设备（设计用于无标记动力学/亲和力测量的基于表面等离子的设备）进行该研究。通过伯胺偶联将蛋白L固定于GLM芯片(BioRad, 目录号176-5012)上。该表面随后用于俘获人源化的抗体，随后以2048nM、512nM、128nM、32nM和8nM将人和食蟹猴FcRn（均为内部材料）用作分析物，使用单独注射的缓冲液（即0nM）作为结合曲线的双参考。使用甘氨酸-HCl pH1.5进行蛋白L表面的再生。该测定在25℃下运行，并在具有在合适的缓冲液中稀释的人或食蟹猴FcRn的HBS-EP pH7.4和HBS-EP
pH6.0中运行。使用ProteOn分析软件固有的平衡模型来计算亲和力，对pH6.0下的结合使用“Global R-max”并对pH7.4下的亲和力计算使用来自pH6.0下结合的R-max。由于结合曲线在pH7.4未达到饱和，所获的值不可能是正确的亲和力，但用于将所检测的抗体的结合排序。
使用通过蛋白L的抗体俘获来比较BPC1492、BPC1494和BPC1496的不同批次对人FcRn的亲和力。表17显示了使用该形式的一系列实验的结果。数据确定了相比于BPC1492，BPC1494和BPC1496在pH6.0和pH7.4下对重组人FcRn均具有改善的亲和力。由于蛋白L活性在俘获中的变化，BPC1494相比于BPC1492对FcRn的亲和力中的倍数改善从实验到实验有所不同。然而，在表17中显示的实验中，在pH6.0的亲和力中的倍数改善范围为3.5倍-16.3倍。由于在中性pH下人IgG对FcRn的弱结合活性，因此不可能测定在pH7.4下亲和力中的倍数改善。
也使用蛋白L俘获的抗体来比较BPC1492、BPC1494和BPC1496的不同批次对食蟹猴FcRn的亲和力。表18显示了使用该形式的实验的结果。数据确定了相比于BPC1492，BPC1494在pH6.0和pH7.4下对重组食蟹猴FcRn具有改善的亲和力。在pH6下，BPC1494对食蟹猴FcRn的亲和力（范围41.8-46.8nM）相比于BPC1492（范围394-398nM）的倍数改善大约为9倍。由于BPC1492对FcRn的弱结合活性，因此不可能测定在pH7.4下亲和力中的倍数改善。
表17 使用蛋白L俘获方法的重组人FcRn亲和力
** - 尽管已经报道了数据点，但要小心处理这些值，这是由于这些数据与在该实验过程中对其他批次的相同分子获得的数据不一致
NAB = 无可分析的结合
ND = 在该实验中未测试
## = 高亲和力结合 – 超出设备的灵敏度。
表18 使用蛋白L俘获方法的重组食蟹猴FcRn亲和力
表
A
序列表
SEQ ID NO:1 抗-TNF抗体轻链的多核苷酸序列
SEQ ID NO:2 抗-TNF抗体轻链的蛋白序列
SEQ ID NO:3 抗-TNF抗体可变结构域（VL）的蛋白序列
SEQ ID NO:4 抗-TNF抗体重链加M252Y/S254T/T256E修饰的多核苷酸序列
SEQ ID NO:5 抗-TNF抗体重链加M252Y/S254T/T256E修饰的蛋白序列
SEQ ID NO:6 抗-TNF抗体重链可变结构域（VH）的蛋白序列
SEQ ID NO:7 IgG1恒定结构域加M252Y/S254T/T256E修饰的蛋白序列
SEQ ID NO:8 抗-TNF抗体重链加M428L/N434S修饰的多核苷酸序列
SEQ ID NO:9 抗-TNF抗体重链加M428L/N434S修饰的蛋白序列
SEQ ID NO:10 IgG1恒定结构域加M428L/N434S修饰的蛋白序列
SEQ ID NO:11 抗-TNF抗体重链（野生型IgG1）的多核苷酸序列
SEQ ID NO:12 抗-TNF抗体重链（野生型IgG1）的蛋白序列
SEQ ID NO:13 IgG1恒定结构域（野生型）的蛋白序列
SEQ ID NO:14 抗-TNF抗体重链加T250Q/M428L修饰的多核苷酸序列
SEQ ID NO:15 抗-TNF抗体重链加T250Q/M428L修饰的蛋白序列
SEQ ID NO:16 IgG1恒定结构域加T250Q/M428L修饰的蛋白序列
SEQ ID NO:17 抗-TNF抗体重链加V308F修饰的多核苷酸序列
SEQ ID NO:18 抗-TNF抗体重链加V308F修饰的蛋白序列
SEQ ID NO:19 IgG1恒定结构域加V308F修饰的蛋白序列
SEQ ID NO:20 抗-TNF抗体重链加V259I修饰的多核苷酸序列
SEQ ID NO:21 抗-TNF抗体重链加V259I修饰的蛋白序列
SEQ ID NO:22 IgG1恒定结构域加V259I修饰的蛋白序列
SEQ ID NO:23 抗-TNF抗体重链加P257L和N434Y变体的多核苷酸序列
SEQ ID NO:24 抗-TNF抗体重链加P257L和N434Y修饰的蛋白序列
SEQ ID NO:25 IgG1恒定结构域加P257L和N434Y修饰的蛋白序列
SEQ ID NO:26 信号肽序列
SEQ ID NO:27 抗-TNF抗体CDRH1
SEQ ID NO:28 抗-TNF抗体CDRH2
SEQ ID NO:29 抗-TNF抗体CDRH3
SEQ ID NO:30 抗-TNF抗体CDRL1
SEQ ID NO:31 抗-TNF抗体CDRL2
SEQ ID NO:32 抗-TNF抗体CDRL3
SEQ ID NO:33 抗-TNF抗体CDRH1变体
SEQ ID NO:34 抗-TNF抗体CDRH1变体
SEQ ID NO:35 抗-TNF抗体CDRH1变体
SEQ ID NO:36 抗-TNF抗体CDRH1变体
SEQ ID NO:37 抗-TNF抗体CDRH1变体
SEQ ID NO:38 抗-TNF抗体CDRH1变体
SEQ ID NO:Cimzia (赛妥珠单抗) LC (VL + Ck)
SEQ ID NO:40 抗-TNF抗体CDRH3变体
SEQ ID NO:41 抗-TNF抗体CDRH3变体
SEQ ID NO:42 抗-TNF抗体CDRH3变体
SEQ ID NO:43 抗-TNF抗体CDRH3变体
SEQ ID NO:44 抗-TNF抗体CDRH3变体
SEQ ID NO:45 抗-TNF抗体CDRH3变体
SEQ ID NO:46 抗-TNF抗体CDRH3变体
SEQ ID NO:47 抗-TNF抗体CDRH3变体
SEQ ID NO:48 抗-TNF抗体CDRH3变体
SEQ ID NO:49 抗-TNF抗体CDRH3变体
SEQ ID NO:50 抗-TNF抗体CDRL1变体
SEQ ID NO:51 抗-TNF抗体CDRL1变体
SEQ ID NO:52 抗-TNF抗体CDRL1变体
SEQ ID NO:53 抗-TNF抗体CDRL1变体
SEQ ID NO:54 抗-TNF抗体CDRL1变体
SEQ ID NO:55 抗-TNF抗体CDRL1变体
SEQ ID NO:56 抗-TNF抗体CDRL1变体
SEQ ID NO:57 抗-TNF抗体CDRL1变体
SEQ ID NO:58 抗-TNF抗体CDRL1变体
SEQ ID NO:59 抗-TNF抗体CDRL1变体
SEQ ID NO:60 抗-TNF抗体CDRL1变体
SEQ ID NO:61 抗-TNF抗体CDRL1变体
SEQ ID NO:62 抗-TNF抗体CDRL2变体
SEQ ID NO:63 抗-TNF抗体CDRL2变体
SEQ ID NO:64 抗-TNF抗体CDRL2变体
SEQ ID NO:65 抗-TNF抗体CDRL2变体
SEQ ID NO:66 抗-TNF抗体CDRL2变体
SEQ ID NO:67 抗-TNF抗体CDRL2变体
SEQ ID NO:68 抗-TNF抗体CDRL2变体
SEQ ID NO:69 抗-TNF抗体CDRL2变体
SEQ ID NO:70 抗-TNF抗体CDRL2变体
SEQ ID NO:71 抗-TNF抗体CDRL2变体
SEQ ID NO:72 抗-TNF抗体CDRL2变体
SEQ ID NO:73 抗-TNF抗体CDRL3变体
SEQ ID NO:74 抗-TNF抗体CDRL3变体
SEQ ID NO:75 抗-TNF抗体CDRL3变体
SEQ ID NO:76 抗-TNF抗体CDRL3变体
SEQ ID NO:77 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb1-3-VH (aka cb2-6-VH)的多核苷酸序列
SEQ ID NO:78 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb1-3-VH (aka cb2-6-VH)的蛋白序列
SEQ ID NO:79 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb2-44-VH的多核苷酸序列
SEQ ID NO:80 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb2-44-VH的蛋白序列
SEQ ID NO:81 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb1-39-VH的多核苷酸序列
SEQ ID NO:82 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb1-39-VH的蛋白序列
SEQ ID NO:83 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb1-31-VH的多核苷酸序列
SEQ ID NO:84 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb1-31-VH的蛋白序列
SEQ ID NO:85 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb2-11-VH的多核苷酸序列
SEQ ID NO:86 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb2-11-VH的蛋白序列
SEQ ID NO:87 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb2-40-VH的多核苷酸序列
SEQ ID NO:88 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb2-40-VH的蛋白序列
SEQ ID NO:89 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb2-35-VH的多核苷酸序列
SEQ ID NO:90 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb2-35-VH的蛋白序列
SEQ ID NO:91 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb2-28-VH的多核苷酸序列
SEQ ID NO:92 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb2-28-VH的蛋白序列
SEQ ID NO:93 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb2-38-VH的多核苷酸序列
SEQ ID NO:94 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb2-38-VH的蛋白序列
SEQ ID NO:95 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb2-20-VH的多核苷酸序列
SEQ ID NO:96 抗-TNF抗体重链可变结构域变体cb2-20-VH的蛋白序列
SEQ ID NO:97 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-8-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:98 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-8-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:99 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-43-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:100 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-43-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:101 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-45-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:102 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-45-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:103 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-4-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:104 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-4-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:105 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-41-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:106 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-41-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:107 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-37-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:108 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-37-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:109 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-39-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:110 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-39-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:111 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-33-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:112 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-33-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:113 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-35-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:114 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-35-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:115 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-31-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:116 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-31-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:117 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-29-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:118 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-29-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:119 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-22-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:120 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-22-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:121 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-23-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:122 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-23-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:123 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-12-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:124 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-12-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:125 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-10-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:126 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-10-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:127 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-1-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:128 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb2-1-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:129 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb2-11-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:130 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb2-11-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:131 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb2-40-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:132 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb2-40-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:133 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb2-35-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:134 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb2-35-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:135 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb2-28-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:136 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb2-28-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:137 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb2-20-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:138 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb2-20-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:139 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-3-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:140 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb1-3-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:141 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb2-6-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:142 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb2-6-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:143 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb2-44-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:144 抗-TNF抗体轻链可变结构域变体cb2-44-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:145 抗-TNF抗体重链变体cb1-3-VH加M252Y/S254T/T256E修饰的蛋白序列
SEQ ID NO:146 抗-TNF抗体重链变体cb2-44-VH加M252Y/S254T/T256E修饰的蛋白序列
SEQ ID NO:147 抗-TNF抗体轻链变体cb1-3-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:148 抗-TNF抗体轻链变体cb1-3-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:149 抗-TNF抗体轻链变体cb2-6-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:150 抗-TNF抗体轻链变体cb2-6-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:151 抗-TNF抗体轻链变体cb2-44-VL的多核苷酸序列
SEQ ID NO:152 抗-TNF抗体轻链变体cb2-44-VL的蛋白序列
SEQ ID NO:153 抗-TNF抗体重链变体cb1-3-VH的多核苷酸序列
SEQ ID NO:154 抗-TNF抗体重链变体cb1-3-VH的蛋白序列
SEQ ID NO:155 抗-TNF抗体重链变体cb2-44-VH的多核苷酸序列
SEQ ID NO:156 抗-TNF抗体重链变体cb2-44-VH的蛋白序列
SEQ ID NO:157 含有M252Y/S254T/T256E修饰的帕考珠单抗重链的多核苷酸序列
SEQ ID NO:158 含有M252Y/S254T/T256E修饰的帕考珠单抗重链的蛋白序列
SEQ ID NO:159 帕考珠单抗轻链的多核苷酸序列
SEQ ID NO:160 帕考珠单抗轻链的蛋白序列
SEQ ID NO:161 帕考珠单抗重链的蛋白序列
SEQ ID NO:162 抗-TNF抗体重链加M428L/N434S修饰的可选蛋白序列
SEQ ID NO:163 IgG1恒定结构域加M428L/N434S修饰的可选蛋白序列
SEQ ID NO:164 抗-TNF抗体重链加H433K/N434F修饰的蛋白序列
SEQ ID NO:165 IgG1恒定结构域加H433K/N434F修饰的蛋白序列
SEQ ID NO:166 抗-TNF抗体重链加H433K/N434F修饰的可选蛋白序列
SEQ ID NO:167 IgG1恒定结构域加H433K/N434F修饰的可选蛋白序列
SEQ ID NO:168 抗-TNF抗体重链加M428L/N434S修饰的可选蛋白序列
SEQ ID NO:169 IgG1/2恒定结构域加M428L/N434S修饰的可选蛋白序列
SEQ ID NO:170 戈利木单抗_VH
SEQ ID NO:171 戈利木单抗_VL
SEQ ID NO:172 戈利木单抗_HC
SEQ ID NO:173 戈利木单抗_LC
SEQ ID NO:174 英利昔单抗_VH
SEQ ID NO:175 英利昔单抗_VL
SEQ ID NO:176 英利昔单抗_HC
SEQ ID NO:177 英利昔单抗_LC
SEQ ID NO:178 Cimzia (赛妥珠单抗) VH
SEQ ID NO:179 Cimzia (赛妥珠单抗) VL
SEQ ID NO:180 Cimzia (赛妥珠单抗) HC (VH+CH1)
Claims (44)
1.特异性结合TNF-α的抗原结合蛋白，其包含：
（i）CDRH1
(SEQ ID NO:27)、CDRH2 (SEQ ID NO: 28)、CDRH3 (SEQ ID No: 29)、CDRL1 (SEQ ID NO: 30)、CDRL2 (SEQ ID NO: 31)和CDRL3 (SEQ ID NO:32)；或其CDR变体，所述变体与CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3相比含有1、2、3或4个氨基酸取代、插入或缺失；和
（ii）人IgG1恒定结构域的新生Fc受体（FcRn）结合部分，其包含一个或多个相对于人IgG1恒定结构域的氨基酸取代；
其中与包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG相比，所述抗原结合蛋白具有在pH 6下增加的FcRn亲和力和/或增加的半衰期。
2.特异性结合结合TNF-α的抗原结合蛋白，其包含：
（i）CDRH1
(SEQ ID NO:27)、CDRH2 (SEQ ID NO: 28)、CDRH3 (SEQ ID No: 29)、CDRL1 (SEQ ID NO: 30)、CDRL2 (SEQ ID NO: 31)和CDRL3 (SEQ ID NO:32)；或其CDR变体，所述变体与CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3相比含有1、2、3或4个氨基酸取代、插入或缺失；和
（ii）人IgG1恒定结构域的新生Fc受体（FcRn）结合部分，其包含一个或多个相对于人IgG1恒定结构域的氨基酸取代；
其中与包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No. 12的重链序列的IgG相比，所述抗原结合蛋白具有增加的半衰期，并且所述抗原结合蛋白能够每四周施用不多于一次来实现与通过每两周施用一次相同剂量的包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No.12的重链序列的IgG所实现的相当的平均稳态谷浓度。
3.特异性结合TNF-α的抗原结合蛋白，其包含：
（i）CDRH1
(SEQ ID NO:27)、CDRH2 (SEQ ID NO: 28)、CDRH3 (SEQ ID No: 29)、CDRL1 (SEQ ID NO: 30)、CDRL2 (SEQ ID NO: 31)和CDRL3 (SEQ ID NO: 32)；或其CDR变体，所述变体与CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3相比含有1、2、3或4个氨基酸取代、插入或缺失；和
（ii）人IgG1恒定结构域的新生Fc受体（FcRn）结合部分，其包含一个或多个相对于人IgG1恒定结构域的氨基酸取代；
其中如同在25℃下通过ProteOn
XPR36蛋白相互作用阵列系统所评估，所述阵列系统将抗原结合蛋白固定于芯片上，所述抗原结合蛋白在pH 6下相比具有相同CDR但不具有此类修饰的抗TNF抗原结合蛋白具有对于FcRn的4倍高的亲和力。
4.抗原结合蛋白，其为包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No.12的重链序列的IgG的变体，其中所述抗原结合蛋白变体包含在IgG恒定结构域的新生Fc受体（FcRn）结合部分中的一个或多个取代，以提高相比于IgG的抗原结合蛋白变体的半衰期，其中当所述变体以四至八周的间隔以40 mg的单次剂量向患者施用时，患者群中的平均稳态谷抗体浓度在给药间隔之间不会落入5 µg/ml以下，优选6 μg /ml以下。
5.前述权利要求中任一项的抗原结合蛋白，其包含在按照Kabat的EU索引编号的位置250、252、254、256、257、259、308、428或434的一个或多个处相对于人IgG1恒定结构域的氨基酸取代。
6.前述权利要求中任一项的抗原结合蛋白，其中在引入氨基酸取代之前，所述人IgG1恒定结构域具有SEQ ID No. 13的序列。
7.权利要求1-6中任一项的抗原结合蛋白，其用作用于治疗疾病的药物，其中所述抗原结合蛋白能够每四周向患者施用不多于一次来实现与通过每两周施用一次相同剂量的包含SEQ ID No. 2的轻链序列和SEQ ID No.12的重链序列的IgG所实现的相当的平均稳态谷浓度。
8.前述权利要求中任一项的抗原结合蛋白，其用于治疗疾病，其中所述抗原结合蛋白以四至八周的间隔以约35至约45
mg之间的单次剂量向患者施用。
9.权利要求8的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以每四周不多于一次的单次40 mg剂量向患者皮下施用。
10.权利要求8或权利要求9的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以每八周不多于一次的单次40 mg剂量向患者皮下施用。
11.权利要求1-10中任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白的半衰期与天然IgG相比增加2倍、3倍、4倍或5倍。
12.前述权利要求中任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在患者中每四周不多于一次的施用实现患者群中约4 μg/ml至约7 μg/ml之间的平均稳态谷浓度。
13.权利要求12的抗原结合蛋白，其中所述平均稳态谷浓度为约5
μg/ml至约6 μg/ml之间。
14.权利要求1-13中任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白的清除为约2.ml/小时至约4ml/小时。
15.权利要求1-14中任一项的抗原结合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代在按照Kabat的EU索引编号的氨基酸残基252、254和256处，并且在残基252处的所述取代是用tyr、phe、trp或thr取代；在残基254处的所述取代是用thr取代；并且在残基256处的所述取代是用ser、arg、glu、asp或thr取代。
16.权利要求15的抗原结合蛋白，其中在残基252处的所述取代是用tyr取代met；在残基254处的所述取代是用thr取代ser；并且在残基256处的所述取代是用glu取代thr。
17.前述权利要求中任一项的抗原结合蛋白，其包含如SEQ ID No: 7中所示的恒定结构域。
18.权利要求1-14中任一项的抗原结合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代在按照Kabat的EU索引编号的氨基酸残基250和428处，并且在残基250处的所述取代是用glu或gln取代；在残基428处的所述取代是用leu或phe取代。
19.权利要求18的抗原结合蛋白，其中在残基250处的所述取代是用glu取代thr并且在残基428处的所述取代是用leu取代met。
20.权利要求19的抗原结合蛋白，其包含如SEQ ID
No: 16中所示的恒定结构域。
21.权利要求1-14中任一项的抗原结合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代在按照Kabat的EU索引编号的氨基酸残基428和434处，并且在残基428处的氨基酸取代是用leu取代met，并且在残基434处的氨基酸取代是用ser取代asn。
22.权利要求21的抗原结合蛋白，其包含如SEQ ID
No: 10中所示的恒定结构域。
23.权利要求1-22中任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是抗体。
24.权利要求1-23中任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白与甲氨蝶呤施用，优选地，其中施用所述抗原结合蛋白用于治疗类风湿关节炎。
25.前述权利要求中任一项的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO: 6和/或SEQ ID NO: 3的可变结构域或其变体，所述变体含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、插入或缺失或者在SEQ ID NO: 6或SEQ
ID NO: 3的长度上共享至少90%的同一性。
26.权利要求1-24中任一项的抗原结合蛋白，其包含如SEQ
ID No 5、9或15中所示的重链序列，任选具有如SEQ ID No: 2中所示的轻链序列。
27.权利要求1-24中任一项的抗原结合蛋白，其包含如SEQ
ID No: 78或80中所示的重链可变结构域序列。
28.权利要求1-24中任一项的抗原结合蛋白，其包含如SEQ
ID NO: 145或SEQ ID NO: 146中所示的重链序列。
29.治疗患有疾病的患者的方法，所述方法包括施用前述权利要求中任一项的抗原结合蛋白。
30.治疗患有疾病的患者的方法，所述方法包括以四至八周的间隔以约35至约45
mg的单次剂量向患者皮下施用权利要求1-28中任一项的抗原结合蛋白。
31.权利要求7-10中任一项的抗原结合蛋白或权利要求29或30的方法，其中所述疾病为类风湿关节炎、多关节幼年特发性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩氏病或银屑病。
32.权利要求1-28中任一项的抗原结合蛋白用于制造药物的用途，所述药物用于治疗类风湿关节炎、多关节幼年特发性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩氏病或银屑病。
33.核酸，其包含编码权利要求1-28中任一项的抗原结合蛋白的核苷酸序列。
34.宿主细胞，其包含权利要求33的核酸。
35.试剂盒，其包含权利要求1-28中任一项的抗原结合蛋白，并且任选包含甲氨蝶呤用于所述抗原结合蛋白和甲氨蝶呤的伴随递送。
36.液体制剂，其包含TNF-α抗原结合蛋白和乙酸盐缓冲剂。
37.权利要求36的制剂，其中所述制剂不包含多元醇。
38.权利要求36或37中任一项的制剂，其中所述缓冲剂进一步包含以下的一种或多种、其组合、或全部：表面活性剂；螯合剂；盐；和氨基酸。
39.权利要求36-38中任一项的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白为20-300 mg/mL的浓度。
40.权利要求36-39中任一项的制剂，其中所述制剂包含：
（a）10-100
mM三水乙酸钠；和/或
（b）25-100
mM氯化钠；和/或
（c）0.5-5%精氨酸游离碱；和/或
（d）0.02-0.2
mM EDTA；和/或
（e）0.01-0.1
%聚山梨酯80，
并且调节至pH 5.0-7.0。
41.权利要求40的制剂，其中：
（a）三水乙酸钠为约50mM的浓度；和/或
（b）氯化钠为约51mM的浓度；和/或
（c）精氨酸游离碱为约1%的浓度；和/或
（d）EDTA为约0.05 mM的浓度；和/或
（e）聚山梨酯80为约0.02%的浓度。
42.权利要求36-41中任一项的制剂，其中将所述制剂pH调节为约pH 5.5。
43.权利要求36-42中任一项的制剂，其中所述TNF-α抗原结合蛋白为50 mg/mL的浓度。
44.权利要求36-43中任一项的制剂，其中所述制剂在室温（约25℃）下约1周后具有至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%的单体含量。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140423 |