ES2473623T3 - Procedimiento de producción - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para producir una línea celular de mamífero que produce al menos una proteína terapéutica que comprende las etapas de: a) obtener una primera secuencia de polinucleótidos que codifica dicha al menos una proteínaterapéutica, b) alterar la primera secuencia de polinucleótidos para obtener una segunda secuencia de polinucleótidos, en la que el índice de adaptación de codones de la segunda secuencia de polinucleótidos es mayor que la de la primera secuencia de polinucleótido y el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido codifican la misma proteína terapéutica. c) transformar al menos una primera célula de una línea celular de mamífero con la primera secuencia de polinucleótidos de la etapa (a) y una tercera secuencia de polinucleótidos que codifica un marcador de selección que es capaz de proporcionar la amplificación de la primera secuencia de polinucleótidos dentro de dicha célula; y transformar al menos una segunda célula de dicha línea celular de mamífero con la segunda secuencia de polinucleótidos de la etapa (b) y una tercera secuencia de polinucleótidos que codifica el marcador de selección que es capaz de proporcionar la amplificación de la segunda secuencia de polinucleótidos dentro de dicha célula, d) cultivar al menos una primera célula de la etapa (c) para crear una primera línea celular que comprende una pluralidad de células, en un medio que contiene una concentración o una concentración cada vez mayor de un agente de selección y amplificación que (i) inhibe el crecimiento de células en dicha línea celular que expresa niveles insuficientes del marcador de selección codificado por el tercer polinucleótido de la etapa (c), y (ii) aumenta el número de copias del gen; cultivar al menos una segunda célula de la etapa (c) para crear una segunda línea celular que comprende una pluralidad de células, en un medio que contiene una concentración o una concentración cada vez mayor del agente de selección y amplificación que (i) inhibe el crecimiento de células en dicha línea celular que expresa niveles insuficientes del marcador de selección codificado por el tercer polinucleótido de la etapa (c), y (ii) aumenta el número de copias del gen; y (e) seleccionar dicha segunda línea celular una vez que se alcanza la meseta de producción de la proteína codificada por el segundo polinucleótido en dicha segunda línea celular, en el que dicha concentración del agente de selección y amplificación es menor que la necesaria para alcanzar un rendimiento de producción equivalente de dicha proteína producida en dicha primera línea celular transformada con el primer polinucleótido.

Description

Procedimiento de producción

La presente invención proporciona un procedimiento para producir una línea celular que es capaz de secretar una proteína terapéutica. El procedimiento comprende el uso de secuencias g�nicas adaptadas por codones que tienen como resultado plazos de protocolo reducidos y una dsminuci�n en las concentraciones de antifolato requeridas a la hora de generar, por ejemplo, líneas celulares productoras de anticuerpos mediante un sistema de selección y amplificación.

Las células de mamífero, tales como las células CHO (células de ovario de h�mster chino), NSO y PerC6 se usan de forma rutinaria en la industia farmacéutica para fabricar productos biofarmac�uticos. Estas células est�n modificadas genéticamente y, después, se seleccionan de un modo tal que se garantiza que se observa una expresión elevada de títulos de la proteína deseada cuando las líneas celulares resultantes se cultivan en biorreactores.

Actualmente existen varios proocedimientos para la modificación y, después, la selección de las células mejores para este fin. A menudo, estos procedimientos implican “amplificación" para aumentar el número de copias del vector o vectores de expresión integradas para mejorar los rendimientos observados de la proteína deseada. Estos procedimientos de “amplificación” se han descrito bien en Bebbington and Hentschel (DNA Cloning Volume III (IRL press, 1987)). Los autores explican que una serie de marcadores seleccionables (que a menudo est�n en forma de secuencias de ácido nucleico que codifican enzimas implicadas en el metabolismo y esenciales para la supervivencia de las células huésped en determinadas condiciones del medio de cultivo) se pueden unir de forma operativa a los vectores de expresión diseñados para expresar la proteína deseada de forma que tras la selección del marcador seleccionable, también se selecciona para la expresión de la proteína deseada. No obstante, dado que después de esta selección los títulos resultantes de la proteína deseada normalmente no son lo bastante altos, las células seleccionadas también se someten a regímenes de “amplificación”. Estos regímenes normalmente implicar someter las células a determinados fármacos tóxicos que inhiben el marcador seleccionable. Mediante dicha inhibición, se seleccionarán las poblaciones de células que presenten niveles de expresión aumentados de este marcador. A menudo esto conduce a niveles de expresión aumentados de los casetes de expresión unidos operativamente también. Dicha expresión aumentada o “amplificación” normalmente se produce debido a reorganizaciones gen�micas resultantes en un mayor número de copias del marcador seleccionable y casetes de expresión unidos operativamente. A menudo, mediante dicha "coamplificaci�n", los títulos mejoran suficientemente para usar los mejores clones resultantes para producir niveles adecuadamente elevados de la proteína o proteína deseadas. Cuando el número de copias del vector en células individuales sometidas a regímenes de amplificación se han investigado adicionalmente, se ha observado que hasta alcanzar una “meseta2 de la producción de proteínas, los niveles de producción observados normalmente son proporcionales al aumento del número de copias de los genes (Bebbington y Hentshcel ibid).

Hasta la fecha se han identificado muchos marcadores seleccionables diferentes para amplificar y los denominados marcadores de selección amplificables. Cada uno identificado también tiene un agente de “selección y amplificación” asociado añadido al medio de cultivo celular durante los regímenes de selección y amplificación. Los ejemplos de dichas combinaciones de agentes / marcadores seleccionables incluyen: adenosina desaminasa / desoxicoformicina, aspartato transcarbamilasa/ N (fosfoacetil)-L-aspartato, dihidrofolato reductasa / metotrexato, glutamina sintetasa / metionina sulfoximina, metalltione�na-I / metal pesado, resistencia a múltiples fármacos / adriamicina (véase Bebbington y Hentschel ibid, Kellems 1991; Current Opinion in Biotechnology 2: pp723 -729). Adicionalmente, más recientemente se ha notificado que los marcadores de selección de antibióticos, tales como los que confieren resistencia a neomicina/G418 y ceocina, también se pueden usar a veces para aumentar el número de copias y, por tanto, ha veces se han utilizado como marcadores de selección y amplificación cuando se combinan con el agente seleccionable (a base de antibióticos) de amplificación y selección af�n adecuado (p. ej.,Sauttle y Enenkel: Biotech Bioeng 2004 89 pp530 -538, y Kwaks et al: Nature Biotech 2003; 21; pp553 -558)

Aunque hay una serie de procedimientos para seleccionar las mejores células modificadas genéticamente para este fin, las dos presiones de selección más usadas son los procedimientos de selección basados en la glutamina sintetasa (GS) y dihidrofolato reductasa (DHFR).

El procedimiento de la GS implica la unión operativa de un casete de expresión de glutamina sintetasa al del casete

o casetes de expresión de proteínas terapéuticas. Los vectores unidos operativamente posteriores se liberan a las células y se selecciona a integración cromos�mica en el vector para la depleci�n o eliminación de glutamina del medio en el que se cultivan las células. La adición de los inhibidores de la glutamina sintetasa, tales como metonina sulfoximina (MSX), a menud se añaden a los medios de cultivo con el fin de asegurar que se selecciona la actividad de la glutamina sintetasa por encima y más all� de los niveles de las células huésped end�genos. El procedimiento de selección alternativo de la DHFR implica la unión operativa de una presión de selección de DHFR a la del casete casete o casetes de expresión de proteínas terapéuticas. Los vectores unidos operativamente se liberan a las células y se selecciona la integración cromos�mica en el vector para la depleci�n o eliminación de nucle�sidos (p. ej., hiposantina y timidina). Normalmente para el procedimiento de la DHFR, es habitual usar cepas huésped negativas para la DHFR, tal como CHO DG44 o CHO DUX-B11. También es habitual emplear agentes de selección

y de amplificación, tales como el metotrexato (MTX).

La adición o ajuste gradual de cantidades crecientes de los agentes de selección y amplificación MSX o MTX en los respectivos sistemas de selección con GS y DHFR a menudo se realiza con el fin de aumentar la expresión mediante el aumento de número de copias del gen. Tales procedimientos pueden implicar la adición del agente de selección y amplificación para el cultivo de células directamente. Como alternativa, el agente puede añadirse al medio de crecimiento antes de los medios de comunicación que se utilizan en tal cultivo celular. Esta adición o titulación de tales agentes directos a los cultivos celulares o a los medios usados para los cultvos celulares normalmente se denomina “amplificación”. Por ejemplo, en el sistema de GS se pueden añadir o aumentar los niveles de MSX hasta y más all� de 500 μM, mientras que para el sistema DHFR, se pueden añadir o aumentar los niveles de MTC antifolato hasta y más all� de los niveles de concentración de 1 μM. Mediante el uso de tales agentes de esta manera, seguido de un período de cultivo para permitir la selección de células que crecen en la nueva concentración del agente de selección, (cada etapa de concentración se denomina una "ronda" de la amplificación), se ha demostrado que el área del genoma que alberga la presión de selección también puede amplificarse, aumentando de ese modo el número de copias del marcador seleccionable. En consecuencia, cuando el marcador seleccionable est� unido operativamente a los casetes de expresión de proteínas terapéuticas, estos casetes también pueden amplificarse. Por el uso de agentes de selección y amplificación adecuados cuando se utiliza el sistema de selección de GS y DHFR, los rendimientos de las proteínas deseadas se pueden mejorar significativamente hasta alcanzar una 'meseta de producción' (véase Bebbington y Hentschel (ibid)). Como consecuencia de ello, los clones que crecen a través de tal selección y amplificación se investigan después sobre el título / rendimiento y los mejores clones se seleccionan y se evalúan adicionalmente. A partir de esta titulación y cribado, es t�pico identificar y, después, comprometerse a un clon para la posterior producción de la proteína o proteínas deseadas.

T�picamente, tanto el número de “rondas'' de amplificación como la concentración del agente de selección y amplificación empleado no se establecen o fijan en los protocolos de selección y amplificación. .En cambio, es t�pico que de los regímenes de selección y amplificación qie se conviertan progresivamente en rigurosos hasta un punto en el que se acercan a un umbral de producción o meseta. Específicamente, al expresar anticuerpos, los inventores y otros colegas han observado que los clones que se aproximan a esta meseta producen títulos finales en los modelos de cultivo por lotes sin alimentar extendidos actuales y biorreactores de producción en el intervalo de 0,3 g a 1,5 g por litro. Esto normalmente se traduce en productividades de células (Qp) en el intervalo de 10-100 pg / célula / por día durante tales condiciones de cultivo por lotes sin alimentar. Sin embargo, es bien sabido que aunque las Qp (en términos de pg / célula / día) son importante, no es un determinante exclusivo de la productividad, ya que los clones con la mayor Qp no siempre dan lugar a los títulos volumétricos más altos. Para una revisión reciente véase Wurm 2004; Vol. Nature Biotechnology 22; pp1393-1398.

Los procedimientos de selección y amplificación se han empleado con éxito para generar líneas celulares utilizadas en las campañas de fabricación para fabricar proteínas deseados utilizadas en los ensayos cl�nicos. Sin embargo, mientras que los títulos generados medante la selección y la metodología de amplificación son suficientes, tales procedimientos son todavía indeseables para un número de razones, incluyendo el tiempo, los costes y la seguridad. Por ejemplo, la valoración de los agentes de amplificación y selección en los protocolos de "amplificación" de líneas celulares retrasa la selección de clones y el sobrecrecimiento de colonias, de modo que cada ronda de amplificación requiere un más o más en completarse. En segundo lugar, los agentes de selección y amplificación como metotrexato y sulfoximina de metionina son productos químicos tóxicos que deben ser eliminados si se va a utilizar terapéuticamente. En tercer lugar, se puede producir resistencia a los agentes de selección y amplificación en las células de mamífero que puede porducir una presión de selección menos rigurosos y dar lugar a una inestabilidad de los rendimientos clonal y del producto. En cuarto lugar, en ocasiones, la amplificación se puede producir de forma epis�mica. Tales episomas y cualquier casete de expresión funcionales unidos operativamente no siempre se heredan por igual durante la división celular, que conduce a un aumento de la variación y la inestabilidad en el cultivo. En quinto lugar, los reordenamientos del genoma generados durante los protocolos de amplificación pueden dar lugar a cambios significativos en el genoma de la célula huésped, lo que da lugar a fenotipos variables en los clones resultantes. En sexto lugar, los subproductos del agente de selección y amplificación, tales como el metotrexato poliglutamado, pueden inhibir funciones adicionales de las células (por ejemplo, Allegra et al 1985 J Biological Chem 260;17 pp9720 -9726). En séptimo lugar, muchos de estos agentes de selección y de amplificación también son potencialmente tóxicos para los operadores involucrados en el cultivo de células y la ejecución de los biorreactores si est�n expuestos a niveles altos. En octavo lugar, también se ha observado que aumentando el número de copias de vectores de expresión integrados en células huésped de mamífero puede dar lugar a un aumento de la actividad de silenciaci�n g�nica inducida por repeticiones (RIGS) por la célula huésped que, en última instancia, puede dar lugar a una reducción en los niveles de expresión de cada uno de los vectores de expresión integrados (véase, por ejemplo, McBurney MW et al Exp. Cell Res. 2002 274:1-8).

En consecuencia, sería altamente deseable emplear la metodología de selección y amplificación con niveles reducidos de agente de selección y amplificación en un número reducido de rondas de amplificación, mientras que todavía consigue el mismo rendimiento final de la proteína terapéutica, de tal manera que el tiempo necesario para generar la línea celular final es más rápido y / o el nivel del agente tóxico no deseado necesario para generar la línea final se reduce o se excluye totalmente durante la generación de la línea celular, la selección y el cultivo (M. Celina de la Cruz Edmonds et al (Mol Biotecnolog�a 2006 34:179-190).

Con combinaciones de codones triples de 64 pares de bases pero solo 20 amino�cidos, durante muchas décadas se ha sabido que existe redundancia en el código genético. No obstante, el uso de sesgo de codones para aumentar la expresión no se realizó hasta la década de 1980. Por ejemplo, en 1982 Bennetzen y Hall (J Biol Chem 257 pp3026 3031) observaron un sesgo de codones específico de la especie en genes de expresión fuerte de procariotas y eucariotas. También observaron que este sesgo era taxon�micamente divergente. Como consecuencia, pronto se observ� que se podría modificar el uso de codones de tales marcos de lectura abiertos para aumentar la expresión en sistemas de expresión recombinantes. Por ejemplo, Kotula y Curtis (Biotechnolgy NY (1991) 9: Alcanzaron una expresión significativamente mejorada de la cadena ligera de anticuerpo de mamífero en la levadura mediante la adaptación de codones del marco de lectura abierto como para desviar el uso del cod�n hacia los codones preferidos por los genes de levadura end�genos altamente expresados. Otro ejemplo muy notable fue la adaptación de codones de la proteína verde fluorescente para mejorar la expresión en células de mamífero (Zolotukhin Virol SJ (1996) 70: de codones 4646 -54 y Yang et al Nucleic Acids Res 1996 24:4592 -3).

Los datos recientes sugieren que al elevar la puntuación del índice de adaptación de codones (CAI) de los marcos de lectura abiertos que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos cadenas se puede mejorar marginalmente los rendimientos de producción en las células huésped de mamífero cuando los casetes de expresión adaptados resultantes est�n unidos operativamente a los marcadores seleccionables de glutamina sintetasa y cuando las células se incuban con el agente de selección y amplificación MSX. Estos datos (presentados en la IBC 2005 Cell Line Development and Engineering Conference) sugirieron que mientras que los niveles de expresión no mejoraron significativamente, el clon positivo mediano en un grupo aument� marginalmente (de 37,8 μg/ml a 51,3 μg/ml), pero sólo cuando los marcos de lectura abiertos de las cadenas pesadas y ligeras se adaptaron por codones. Más recientemente, M. Celina de la Cruz Edmonds et al (ibid) también reconoció el deseo de reducir los niveles del agente de selección y amplificación cuando se generan líneas celulares de ingeniería que expresan proteínas deseables con ayuda de regímenes de selección y amplificación. Ellos demostraron que mediante la modificación de la densidad de siembra de las células transfectadas se pueden reducir los niveles de MSX empleados y reducir el número de semanas requeridas para generar y mantener las líneas de células modificdas genéticamente que expresan niveles equivalentes o mayores de la proteína deseada. Un trabajo reciente publicado ha investigado los enfoques de optimización de codones combinado con el uso del marcador seleccionable glutamina sintetasa. Por ejemplo, el trabajo presentado por Kawley et al (Molecular Biotechnology 2006 Vol 34; pp151 -156) evalúa el impacto de la adaptación de codones sobre los niveles de expresión siguientes generados, sin embargo, los resultados presentados sugieren sólo pequeñas mejoras en los niveles de expresión alcanzados.

Incluso más recientemente, Cartón et al (Protein Expression and Purification 55 (2007) pp279-286) también investigaron el impacto de la optimización de codones. Su trabajo consistió la optimización de codones parcial de los marcos de lectura abiertos d elas cadenas epsada y ligera de anticuerpos mediante diversos enfoques. Estas secuencias de codificación modificadas se expresaron después en células de mieloma como formatos de mini-gen (es decir, que contienen intrones) en casetes de expresión unidos operativamente al marcador seleccionable gpt. No se discutieron enfoques de amplificación.

Hay una necesidad en la técnica de reducir los niveles de los agentes de selección y amplificación requeridos cuando se emplean sistemas de expresión unidos operativamente a los marcadores de selección amplificables.

Declaraci�n de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para reducir los niveles de una presión seleccionable titulable requerida, el número de ciclos de amplificación y el tiempo necesario para generar líneas celulares que expresan la proteína mediante la alteración de los codones de los marcos de lectura abiertos deseados. A través de la utilización de la adaptación de codones para este propósito, los procedimientos de la invención proporcionan consistentemente rendimientos suficientes en marcos de tiempo más rápidos, lo que ahorra muchas semanas en las actividades de desarrollo de líneas celulares. Además, los procedimientos de la invención también se generan líneas celulares con concentraciones más bajas del agente de selección y amplificación que las alcanzadas previamente. De acuerdo con lo anterior, se observan niveles más bajos del marcador de selección y amplificación en las líneas de células finales.

La presente invención proporciona un procedimiento para producir una línea celular de mamífero que produce al menos una proteína terapéutica que comprende las etapas de:

a) obtener una primera secuencia de polinucle�tidos que codifica dicha al menos una proteína terapéutica,

b) alterar la primera secuencia de polinucle�tidos para obtener una segunda secuencia de polinucle�tidos, en la que el índice de adaptación de codones de la segunda secuencia de polinucle�tidos es mayor que la de la primera secuencia de polinucle�tido y el primer polinucle�tido y el segundo polinucle�tido codifican la misma proteína terapéutica.

c) transformar al menos una primera célula de una línea celular de mamífero con la primera secuencia de polinucle�tidos de la etapa (a) y una tercera secuencia de polinucle�tidos que codifica un marcador de selección que es capaz de proporcionar la amplificación de la primera secuencia de polinucle�tidos dentro de dicha célula; y

transformar al menos una segunda célula de dicha línea celular de mamífero con la segunda secuencia de polinucle�tidos de la etapa (b) y una tercera secuencia de polinucle�tidos que codifica el marcador de selección que es capaz de proporcionar la amplificación de la segunda secuencia de polinucle�tidos dentro de dicha célula,

d) cultivar dicha al menos una primera célula de la etapa (c) para crear una primera línea celular que comprende

5 una pluralidad de células, en un medio que contiene una concentración o una concentración cada vez mayor de un agente de selección y amplificación que (i) inhibe el crecimiento de células en dicha línea celular que expresa niveles insuficientes del marcador de selección codificado por el tercer polinucle�tido de la etapa (c), y (ii) aumenta el número de copias del gen;

cultivar dicha al menos una segunda célula de la etapa (c) para crear una segunda línea celular que comprende

10 una pluralidad de células, en un medio que contiene una concentración o una concentración cada vez mayor del agente de selección y amplificación que (i) inhibe el crecimiento de células en dicha línea celular que expresa niveles insuficientes del marcador de selección codificado por el tercer polinucle�tido de la etapa (c), y (ii) aumenta el número de copias del gen; y

(e) seleccionar dicha segunda línea celular una vez que se alcanza la meseta de producción de la proteína

15 codificada por el segundo polinucle�tido en dicha segunda línea celular, en el que dicha concentración del agente de selección y amplificación es menor que la necesaria para alcanzar un rendimiento de producción equivalente de dicha proteína producida en dicha primera línea celular transformada con el primer polinucle�tido.

En todos los procedimientos comparativos como se describe en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, todos los otros parámetros tales como protocolos de amplificación o concentraciones de agentes de

20 selección permanecen constantes.

En una realización, la meseta de producción de la proteína codificada por el segundo polinucle�tido producido en dicha segunda línea celular se alcanza con un menor número de rondas de amplificación de lo necesario para alcanzar un rendimiento de producción equivalente de dicha proteína producida en dicha primera línea celular transformada con el primer polinucle�tido.

25 En una realización de la presente invención, la segunda línea celular se cultiva en biorreactores y la proteína terapéutica producida se purifica.

En una realización de la presente invención, el índice de adaptación de codones de la segunda secuencia de polinucle�tidos es igual o mayor que 0,9, en una realización adicional el índice de adaptación de codones de la segunda secuencia de polinucle�tidos que es mayor que 0,91, en una realización adicional el índice de adaptación

30 de codones de la segunda secuencia de polinucle�tidos que es mayor que 0,92, en una realización adicional más el índice de adaptación de codones de la segunda secuencia de polinucle�tidos que es mayor que 0,95.

En otra forma de realización de la presente invención, la concentración del agente de selección y amplificación necesaria para lograr la equivalencia terapéutica aritmética del rendimiento de la producción de proteína se reduce a igual o menos de 50% en comparación con la concentración del agente de selección y amplificación utilizado para el 35 mismo procedimiento utilizando la primera secuencia de polinucle�tidos. En una realización adicional, la concentración del agente de selección y amplificación se reduce a menos del 25% en comparación con la concentración del agente de selección y de amplificación utilizado para el mismo procedimiento que utiliza la primera secuencia de polinucle�tido, en una realización adicional más, la concentración del agente de selección y amplificación agente se reduce a menos del 5% en comparación con la concentración del agente de selección y

40 amplificación utilizado para el mismo procedimiento que utiliza la primera secuencia de polinucle�tidos, en todavía una realización adicional, la concentración del agente de selección y amplificación se reduce a menos del 3% en comparación con los la concentración del agente de selección y amplificación utilizado para el mismo procedimiento que utiliza la primera secuencia de polinucle�tido.

En una forma de realización de la presente invención se proporciona el uso de una secuencia de polinucle�tidos que

45 codifica una proteína terapéutica en la que el índice de adaptación de codones de la secuencia de polinucle�tidos es igual o mayor que 0,9 para reducid (i) los niveles requeridos de un agente de selección y amplificación titulable que aumenta el número de copias del gen, (ii) el número de rondas de amplificación, y (iii) el tiempo necesario en un procedimiento para producir una línea celular de mamífero productora de dicha proteína terapéutica. En otra realización, sólo se requiere una ronda de amplificación.

50 En una forma de realización de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir una línea celular de mamífero que produce al menos una proteína terapéutica que comprende las etapas de:

(a) transformar una línea celular con una secuencia de polinucle�tidos que comprende (i) una secuencia que codifica la proteína terapéutica y tiene un índice de adaptación de codones que es igual o mayor que 0,9, y (ii) una secuencia que codifica un marcador de selección que es capaz de proporcionar la amplificación de la

55 secuencia de polinucle�tidos;

(b)

proporcionar al menos una ronda de amplificación en presencia de un agente de selección y amplificación; y

(c)

seleccionar la línea celular una vez que se alcanza la meseta de la producción de la proteína terapéutica; en el que la concentración del agente de selección y amplificación es 50% o menos de la concentración requerida para alcanzar un rendimiento de producción equivalente, en comparación con una secuencia que codifica la proteína terapéutica y tiene un índice de adaptación cod�n que es menor que 0,9.

5 En una forma de realización, el agente de selección y amplificación es MSX o MTX. En otra realización, se requiere una ronda de amplificación para alcanzar el rendimiento de la producción equivalente. En aún otra realización, el agente de selección y amplificación es MSX o MTX y se requiere una ronda de amplificación para alcanzar el rendimiento de la producción equivalente.

En una realización de la presente invención, la línea celular de mamífero que se va a transformar es 10 metab�licamente deficiente debido a la interrupción o la inhibición de una enzima celular end�gena.

En una forma de realización adicional de la presente invención, la línea celular de mamífero que se va a transformar es deficiente en una vía de síntesis de nucle�sidos.

En una realización de la presente invención, la proteína terapéutica es un anticuerpo, un derivado del mismo o un fragmento de unión a ant�geno.

15 En una realización de la presente invención, la proteína terapéutica es un anticuerpo monoclonal.

En una realización de la presente invención, el marcador de selección es un polinucle�tido que codifica la dihidrofolato reductasa (DHFR) y el agente de selección y amplificación es un antifolato. En una realización adicional, el antifolato es metotrexato (MTX).

En una realización de la presente invención, el marcador de selección es un polinucle�tido que codifica la glutamina 20 sintetasa y el agente de selección y amplificación es metionina sulfoximina (MSX).

En una forma de realización de la presente invención sólo se requiere una ronda de amplificación para alcanzar la meseta de producción de proteínas.

En una realización de la presente invención, el rendimiento final de proteína terapéutica es mayor que 0,5 g / l en un lote sin alimentar, en una realización adicional más el rendimiento final es mayor que 0,8 g / l en un lote sin

25 alimentar.

En otra forma de realización de la presente invención, la concentración de MTX utilizado es igual a o menor que 50 nM o menor que 25 nM o menor que 10 nM. En una forma de realización adicional de la presente invención, la concentración de MTX utilizada es 5 nM.

En otra forma de realización de la invención, sólo una etapa de amplificación, y, por lo tanto, sólo se requiere una

30 concentración del agente de selección y de amplificación en el medio de cultivo celular para alcanzar una meseta de producción de proteínas en las células que se seleccionan en dicho medio de cultivo.

En el presente documento se describe un anticuerpo producido por el procedimiento de la invención. También se describe un anticuerpo producido por este procedimiento en el que el anticuerpo producido comprende al menos una cadena pesada y que tiene menos de o igual a 5% de la cadena pesada no glicosilada. La cadena pesada del 35 anticuerpo puede estar un 95% glicosilada o un 96% glicosilada o un 97% glicosilada o est� un 98% glicosilada o un 99% glicosilada. El anticuerpo puede estar un 100% glicosilado. El anticuerpo altamente glicosilado puede ser un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo altamente glicosilado puede ser un anticuerpo anti--�-amilode. El anticuerpo puede tener una secuencia de la cadena pesada de la SEC ID 18 y una secuencia de la cadena ligera de SEC ID N�

19.

40 En el presente documento se describe un fragmento de unión al ant�geno en el que el fragmento es un Fab, Fab ', F (ab')2, Fv, biespec�ficos, diacuerpos, triacuerpo, tetracuerpos, minianticuerpos, minicuerpos, la región variable de la cadena pesada aislada o la región variable de la cadena ligera aislada, proteínas derivadas de suero (por ejemplo, factores de crecimiento, citocinas, albúminas, etc) o fusión combinatoria de los mismos.

En el presente documento se describe una célula huésped transformada de manera estable que comprende un

45 vector que comprende uno o más casetes de expresión que codifican una cadena pesada y / o una cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a ant�geno del mismo, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, tales células huésped pueden comprender un primer vector que codifica la cadena ligera y un segundo vector que codifica la cadena pesada. Como alternativa, tales casetes de expresión se pueden combinar antes de la liberación.

En el presente documento se describe una célula huésped en la que la célula es de mamífero. Ejemplos de tales

50 líneas celulares incluyen ovarios de h�mster chino, BHK, HEK-293, ONE o PERC6. (para una revisión reciente véase Wurm 2004: Nature Biotechnology 22;11 pp 1393 -1398). Tales células huésped también pueden contener modificaciones genot�picas y / o fenot�picas ventajosas, por ejemplo la cepa huésped CHO-DG44 tiene copias de su gen dhfr inactivadas mientras que otros huéspedes podrían tener los genes de la glutamina sintetasa inactivados.. Modificaciones alternativa pueden ser la maquinaria enzima implicada en la glicosilaci�n de proteínas (por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al, Biotech Bioeng 2004 87: pp 614 -622, Kanda et al, Journal of Biotechnology, 2007 130: pp 300 -310, Imai-Nishiya et al BMC Biotechnol, 2007 7:84). Sin embargo, otros pueden tener modificaciones genot�picas y / o fenot�picas ventajosas de apoptosis del huésped, de expresión y de vías de supervivencia (por ejemplo, vías Tey et al Biotechnol Bioeng 2000 68: 31 -43, Yallop et al Modern Biopharmaceuticals 2005 Chapter 3

5 pp779 -807, Nivitchanyang et al Biotechnol Bioeng 2007 98:825 -41, Figueroa et al Biotechnol Bioeng 2007 97:87 92). Estas y otras modificaciones del huésped solo o en combinación, se pueden generar mediante técnicas convencionales, tales como la sobreexpresi�n de genes no huéspedes o del huésped, enfoques de inactivaci�n de genes. enfoques de silenciamiento de genes (por ejemplo, siRNA) o la evolución y la selección de subcepas con los fenotipos deseados. Dichos técnicas est�n bien establecidas en la técnica.

10 En el presente documento se describe un procedimiento para la producción de una proteína terapéutica, en el que el procedimiento comprende la etapa de cultivar una célula huésped en un medio de cultivo, por ejemplo medio de cultivo sin suero.

En el presente documento se describe un procedimiento en el que dicha proteína terapéutica se purifica adicionalmente a por lo menos un 95% o mayor (por ejemplo, 98% o mayor) con respecto a dicho medio de cultivo

15 sin suero que contiene el anticuerpo.

En el presente documento se describe vectores de expresión de mamíferos que contienen marcos de lectura abiertos que poseen puntuaciones del CAI superiores a 0,9 y que codifican anticuerpos, polip�ptidos relacionados con los anticuerpos o derivados o fusiones de los mismos.

En el presente documento se describe una primera línea celular transformada con una segunda secuencia de

20 polinucle�tidos que tiene un índice de adaptación de codones que es mayor que una primera secuencia de polinucle�tidos en la que el primer polinucle�tido y el segundo polinucle�tido codifican la misma proteína terapéutica y que comprende además una tercera secuencia de polinucle�tidos que codifica un marcador de selección que es capaz de proporcionar la amplificación de la primera secuencia de polinucle�tidos, en el que dicha primera línea celular produce un rendimiento más alto de dicha proteína terapéutica en comparación con una segunda línea

25 celular transformada con dicho primer polinucle�tido que codifica dicha proteína terapéutica cuando se cultivan en un medio seleccionable.

En el presente documento se describe una segunda línea celular transformada con una segunda secuencia de polinucle�tidos que codifica una proteína terapéutica y tiene un índice de adaptación de codones que es mayor que 0,9 y que comprende además una tercera secuencia de polinucle�tidos que codifica un marcador de selección que 30 es capaz de proporcionar amplificación de una segundo secuencia de polinucle�tidos, en el que dicha segunda línea celular produce un mayor rendimiento de dicha proteína terapéutica en comparación con una primera de dicha línea celular transformada con un primer polinucle�tido que codifica dicha proteína terapéutica en el que dicho primer polinucle�tido tiene un índice de adaptación de codones que es menor de 0,9 cuando se cultiva en un medio seleccionable. La puntuación del CAI superior a 0,9 se puede calcular utilizando la puntuación EMBOSS CAI métrica

35 como se describe en la Tabla 6.

En el presente documento se describe una línea celular que comprende un vector o un casete de expresión de acuerdo con los párrafos anteriores.

Tambi�n se describe una línea celular o su progenie que se puede obtener mediante los procedimientos descritos.

En el presente documento se describen células de mamífero con genomas que contienen marcos de lectura abiertos

40 integrados o mantenidos epis�micamente que poseen puntuaciones del CAI superiores a 0,9 (derivados usando la tabla de uso de codones EMBOSS E.human.cut) que codifican anticuerpos, polip�ptidos relacionados con los anticuerpos o derivados de los mismos.

A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, el término "que comprende" y "comprende" incorpora "que consiste en" y “consiste en”. Es decir, se pretende que "que comprende" y "comprende"

45 transmitan la posible inclusión de otros elementos o números enteros no citados específicamente, cuando el contexto lo permita.

A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, el término "meseta de la producción" significa el nivel de expresión alcanzado en cultivos discontinuos sin alimentar extendidos, por el que las rondas adicionales de amplificación típicamente producen un incremento inferior a 2 veces en relación con el clon

50 amplificado de los padres. Cuando los clones se modifican específicamente para producir anticuerpos, los clones que producen entre 0,3 g y 1,5 g por litro en los cultivos estándar de producción sin alimentar extendidos típicamente pueden considerarse como que se aproximan a esta meseta de la producción cuando se utilizan regímenes actuales de cultivos sin alimentar extendidos y recetas de los medios.

La subclonaci�n de una sola célula de los clones finales que se acercan a la meseta de producción puede llevarse a

55 cabo mediante muchos procedimientos estándar, incluyendo la clasificación de flujo (por ejemplo, el depósito de una célula por pocillo en una placa de 96 pocillos), la recolección de colonias en agar blando, o clonaci�n por dilución límite. Para garantizar el sobrecrecimiento de una sola célula en los pocillos receptores, los medios acondicionados a veces o los cultivos de alimentación temporal también deben emplearse como soporte del crecimiento de la célula de otra manera solitaria depositada. Si se requieren cocultivos de alimentación, éstos pueden comprender fácilmente células huésped parentales sin vectores seleccionables integrados, como tales células huésped, pueden seleccionarse en contra una vez que el clon de células individuales depositado comienza a dividirse de forma sana.

5 La expresión marco de lectura abierto (ORF) tal como se utiliza a lo largo de esta memoria descriptiva se refiere a la secuencia de codificación de ácido nucleico que codifica una cadena o cadenas polipept�dicas deseadas. Los codones contenidos dentro de tales secuencias de codificación ORF pueden ser contiguos o, alternativamente, pueden contener intrones. Cuando est�n incluidos, tales intrones o secuencias intermedias normalmente se elimnan mediante reacciones de corte y empalme en la célula huésped antes de la formación del marco de lectura abierto

10 final contigu en el ARNm maduro.

El "rendimiento" como se usa a lo largo de la presente memoria descriptiva se refiere a la concentración de un producto (por ejemplo, un polip�ptido expresado de forma heter�loga) en solución (por ejemplo, caldo de cultivo o mezcla de lisis celular o tampón) y por lo general se expresa como mg / l o g / l. Un incremento en el rendimiento puede referirse a un aumento absoluto o relativo en la concentración de un producto producido en dos conjuntos

15 definidos de condiciones.

El término unido operativamente se refiere al uso de marcadores de selección y de amplificación empleados para seleccionar células huésped que contienen casetes de expresión que expresan los productos de proteína deseados. Esto se puede lograr por clonaci�n del marcador seleccionable y de amplificación en el mismo pl�smido o vector que el que contiene el casete de expresión que expresa la proteína deseada o, alternativamente, se puede liberar en la

20 célula en un pl�smido o vector separado.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Una representación esquemática de los vectores basados en el promotor de RSV utilizados en proyecto 2,3,4,5, 6 (a), 6 (b) y 7 (a). Para las evaluaciones basadas en el promotor de EF-1 alfa (de proyecto 6 y 7), el promotor de RSV se sustituyó con un promotor humano derivado de EF-1 alfa más el primer intr�n (véase Kim

25 DW 1990 Gene 91: 217 -23). Este se obtuvo mediante PCR a partir del ADN gen�mico humano. Este promotor alfa EF-1 se clon� a continuación en estos vectores en lugar de en el promotor basado en RSV.

Figura 2: Cadena pesada no adaptada del proyetco 5 con una puntuación CAI de 0,809 CAI y empleado en el proyecto 5 (a) SEC ID N� 10

Figura 3: Cadena ligera no adaptada del proyecto 5 con una puntuación CAI de 0,761 y empleado en el proyecto 30 5 (a) SEC ID N� 11

Figura 4: ORF de la cadena pesada del proyecto 5 (b) con una puntuación del CAI mayor (0.847). Véase

Tabla 5. Véase la SEC ID 12

Figura 5: ORF de la cadena ligera del proyecto 5 (b) con una puntuación del CAI mayor (0,833). Véase

Tabla 5. Véase la SEC ID 13

35 Figura 6: ORF de la cadena pesada del proyecto 5 con una puntuación del CAI mayor (0,872). ).Esta secuencia se emple� en el proyecto de anticuerpo 5 (c). Véase la SEC ID N� 14.

Figura 7: ORF de la cadena ligera del proyecto 5 con una puntuación del CAI mayor (0,894). Esta secuencia se emple� en el proyecto de anticuerpo 5 (c). Véase la SEC ID N� 15.

Figura 8: ORF de la cadena pesada del proyecto 5 con una puntuación del CAI mayor (0,982). Esta secuencia se 40 emple� en el proyecto de anticuerpo 5 (d). Véase también la SEC ID 16.

Figura 9: ORF de la cadena ligera del proyecto 5 con una puntuación del CAI mayor (0,976). Esta secuencia se emple� en el proyecto de anticuerpo 5 (d). Véase también la SEC ID 17. Figura 10: Niveles de ARN y de proteínas de la cadena pesada y de la cadena ligera para el anticuerpo del proyecto 5.

Figura 11: Metodología de la adaptación de codones con detalles.

45 Figura 12: Datos del producto de ejemplo NGHC obtenidos durante la selección de clones final del proyecto 5.

Figura 13: Título de ejemplo generado de 097-7 (proyecto 5 (d), 5 nM MTX clon elegido CAI HC 0,982, 0,976 LC) con aproximadamente 3 meses de trabajo de desarrollo adicional después de la amplificación y selección de la línea celular final.

Figura 14: Niveles relativos de la proteína y copia del gen de DHFR y la copia del gen Neo observados en células 50 modificadas con ingeniería en diversos proyectos.

Descripci�n detallada

La frecuencia de uso de los codones de los genes que codifican los polip�ptidos terapéuticos producidos de acuerdo con la presente invención se mide y se define por el índice de adaptación de codones (CAI).

La adaptación de codones es la adaptación de los codones de un marco de lectura abierto a los codones sinónimos

5 preferidos en los genes humanos / de mamífero al tiempo que se evita la introducción de funciones de secuencias secundarias no deseadas que impiden la expresión de los marcos de lectura abiertos resultantes. Los inventores han observado que los codones humanos preferidos son también muy adecuados, incluso cuando est� prevista la posterior expresión en células de mamíferos no humanas (por ejemplo, células derivadas de h�mster). Sin embargo, si el cod�n más preferido para un amino�cido dado difiere en una especie de mamífero dada, también se puede usar

10 en lugar de la preferencia humana. La "puntuación del CAI" generada para cada marco de lectura abierto pone de relieve el grado en el que el marco de lectura abierto est� adaptado al uso de codones sinónimos más preferidos por los genes humanos / de mamífero.

En el contexto de la presente invención, una puntuación del CAI de 1 significa que el cod�n más óptimo se utiliza para cada amino�cido en cada posición de cod�n. Para obtener resultados óptimos en los procedimientos de la

15 presente invención, los genes que codifican la proteína terapéutica tienen un CAI que est� suficientemente cercano a 1 de tal manera que el nivel deseado de expresión de la proteína terapéutica se logra con significativamente menos agente de selección y amplificación y / o en un tiempo más rápido respecto a lo observado en la expresión de la secuencia de partida de origen natural, por ejemplo, el CAI es al menos 0,9, o al menos 0,95 o al menos 0,975.

Sin embargo, no es necesario cambiar todos los codones con los codones más preferidos o reemplazar todos los

20 menos preferidos por los codones más preferidos. El único requisito es que la secuencia resultante posee una puntuación del CAI anormalmente alta y que no contiene elementos de alteración de la expresión. Software disponible en el mercado, como Leto 1.0 (Entelechon, Regensburg, Alemania) puede diseñar una secuencia de puntuación del CAI adecuadamente alta. Para mayor guía de ayuda en el diseño de secuencias adaptadas por codones para su utilización en la presente invención, se han analizado las bases de datos 24044 RefSeq de

25 productos de transcripción humanos (números de acceso NM_prefixed) derivados del genoma del NCBI generado con el número 36. Se calcul� el intervalo de puntuación del CAI y fue de 0,593-0,894 con una puntuación media de 0,720. La puntuación más alta (0,894) para un gen conocido y expresado (en lugar de la teórica) en esta base de datos se ha generado con la proteína asociada a queratina 5-8 (KRTAP5-8; NM_021046) y mediante la cubierta cornificada 1A (LCE1A; NM_178348). Además una base de datos de 21182 humana ADNc de IgG revel� que las

30 puntuaciones de IgG van 0,576 hasta 0,878, con un promedio de 0.766.Para ayudar a guiar a los expertos en la técnica, secuencias adecuadas para su uso en la invención podrían poseer puntuaciones del CAI por encima y más all� dea cubierta cronificada tardía 1A (LCE1A; NM_178348). Más preferentemente se deben emplear puntuaciones del CAI de 0,9.

Se observ� que si la adaptación de codones se llevaba a cabo a través de una secuencia más corta (por ejemplo,

35 sólo la región variable), se observa un mayor nivel de clones de alta producción, aunque, cuando la adaptación de codones se lleva a cabo en la totalidad del marco de lectura abierto, la amplitud ( es decir, el número) de clones de alta producción generados se incrementa aún más (véase, la Tabla 5).

Debido a la secuencia de codones preferidos, los enfoques t�picos de adaptación normalmente, por defecto, también evitarán la introducción de secuencias de inestabilidad de ARN con ARE (elementos ricos en AU, véase Akashi et al

40 Blood 1994; Vol 83 pp 3182 -3187)) alta puntuación. Sin embargo, de vez en cuando, después de la adaptación de codones existe el requisito de eliminar elementos de secuencias de alteración de la expresión introducidos accidentalmente. Estos incluyen entre otros:

(i) sitios de corte y empalme funcionales,

(ii) áreas de simetría de díada (por ejemplo, secuencias directas, invertidas o palindr�micas) que reducen 45 notablemente los niveles de expresión y / o aumentan las tasas de recombinación entre las secuencias.

(iii) Secuencias de inestabilidad funcionales.

En las raras ocasiones en las que se crean estos elementos perturbadores no deseados durante la adaptación se recomienda usar un cod�n humano menos preferido, pero no el menos preferido (a menos que la elección sea limitado) para interrumpir la secuencia local para inactivar la función. Las pequeñas desviaciones de las

50 puntuaciones máximas no afectarán significativamente al uso de los marcos de lectura abiertos resultantes en la presente invención.

Tambi�n se reconoce que si las pequeñas áreas de un marco de lectura abierto siguen siendo no adaptadas (por ejemplo, para conservar los sitios de restricción útiles), por lo tanto, esto no afectar� significativamente a la puntuciaci�n global del CAI.

55 Si el marco de lectura abierto codifica para una proteína de fusión, híbrida o quimérica, se fomenta el incremento de la puntuación del CAI del mismo modo que se ha descrito anteriormente. Una vez más, esta adaptación hacia codones sinónimos preferidos por la célula huésped para la expresión de genes end�genos altamente expresados

debe llevarse a cabo para todos y cada uno de los componentes del gen o ADN af�nDNA afin de los marcos de lectura abiertos fusionados o modificados con ingeniería. Para las secuencias de codificación puramente sintéticas presentes en una proteína (es decir, secuencia para la que no existe ninguna secuencia previa), se aconseja introducir las puntuaciones anormalmente altas del CAI del gen humano precisamente de la misma manera. Los marcos de lectura abiertos con puntuaciones de CAI puntuaciones superiores y más altas de gen humano de la cubierta cornificada tardía 1A deberán emplearse en la presente invención.

La presente invención descrita en el presente documento es la primera en describir un procedimiento de reducir los niveles de un agente seleccionable y de amplificación requerido, el tiempo requerido y el número de ciclos de amplificación requeridos para generar líneas celulares modificadas genéticamente que expresan los niveles deseados de la proteína mediante adaptación por codones de los marcos de lectura abiertos. A través de la utilización de la adaptación de codones para este propósito, se observan rendimientos suficientes en marcos de tiempo más rápidos y, por tanto, se ahorran muchas semanas en las actividades de desarrollo de líneas celulares. Además, los inventores también est�n generando líneas celulares equivalentes o mejoradas usando concentraciones más bajas del agente de selección y amplificación que lo que los inventores ya han conseguido previamente. De hecho, es probable que cuando tales mejoras como se describe en el presente documento se combinan con el cultivo de células estándar y mejoras de protocolo de la siembra, como los descritos por Celina de la Cruz Edmonds et al (ibid), se observarán otras reducciones en los niveles de selección y agentes de amplificación y una mayor reducción en el tiempo necesario para generar rendimientos equivalentes o mejoradas de líneas celulares modificadas genéticamente.

La presente invención es adecuada para su uso cuando la proteína terapéutica es una glicoprote�na. Mientras que el trabajo previo divulga el hecho de que uno puede controlar la glicosilaci�n del producto proteico mediante la modificación de la duración del proceso, la temperatura, el pH, la osmolaridad y los constituyentes y aditivos de los medios etc. (por ejemplo, véase el documento WO2002076578y las referencias citadas en el mismo), los inventores han encontrado que la adaptación de codones de los marcos de lectura abiertos que codifican las secuencias de polip�ptidos terapéuticos (en el caso de los polip�ptidos terapéuticos de anticuerpos) es capaz de disminuir los niveles de glicosilaci�n incompleta y los niveles de ocupación reducida del sitio de forma independiente del subtipo de células CHO, los regímenes de selección y amplificación o condiciones de los medios de cultivo.

Esta observación sorprendente es la primera en demostrar que uno puede afectar al perfil de glicosilaci�n de las proteínas a través de la adaptación de codones del marco de lectura abierto. Usando los abordajes de adaptación de codones como se describe en el presente documento, por tanto, se puede asegurar un sólido proceso de fabricación que depende de la secuencia del gen en lugar de las condiciones en las que se ha cultivado la célula huésped. A su vez, esto permite una mayor oportunidad para mejorar las condiciones de cultivo y los regímenes de alimentación a través de los medios tradicionales y repeticiones del desarrollo de la alimentación sin excesivos problemas sobre el impacto resultante sobre el glicoperfil del producto.

El grado de adaptación de codones se puede medir usando el procedimiento descrito por primera por Sharp y Li (Nucleic Acid Res 1987 15:1281 -95). Sharp y Li propusieron la puntuación del índice de adaptación de codones (CAI) que deriva esencialmente de las estadísticas de la preferencia de codones, pero normalizadoa para cada amino�cido a fin de excluir los efectos de la variación en la composición de amino�cidos entre diferentes genes. Esta métrica del CAI est� disponible fácilmente (por ejemplo, a través de EMBOSS La European Molecular Biology Open Software Suite (véase Rice et al 2000: Trends in Genetics 16; pp276 -277)).

Con el fin de puntuar los marcos de lectura abiertos destinados para uso en la presente invención, se debe usar primero la base de datos de referencia adecuada. En primer lugar se debe considerar la célula huésped que se va a usar, después se deber� identificar la tabla de referencia de uso de codones sinónimos relativos (RSCU) para los genes expresados en dicha célula huésped. Normalmente, las bases de datos RSCU humanos son adecuados para referencia al expresar el marco de lectura abieri en cualquier tipo de células de mamíferos. Un ejemplo de una base de datos es que la proporcionada por EMBOSS, que usa como referencia la tabla de uso de codones Ehum.cut para determinar las preferencias de uso de codones en las células humanas. Una tabla de uso de codones de referencia alternativos es la que describen Massaer et al (ibid) en el que se emplea un número más pequeño de genes humanos altamente expresados para determinar la preferencia de codones. Mientras que estas dos tablas de referencia est�n de acuerdo en términos generales en el cod�n más preferido, existe una divergencia notable para un amino�cido (arginina). Por lo tanto, a la hora de diseñar los marcos de lectura abiertos para uso en la presente invención es lógico hacer una referencia cruzada de las mismas tablas de uso de codones para (i) determinar los codones más preferidos para incluir en el marco de lectura abierto y (ii) la puntuación CAI del marco de lectura abierto generado posteriormente para garantizar que la puntuación es suficientemente alta como para ser adecuado para su uso en la presente invención. Por ejemplo, si se usa la base de datos de Massaer et al regularmente para diseñar marcos de lectura abiertos para la expresión en células humanas y de mamíferos y, por tanto, se considera que el cod�n CGC es el más preferido para codificar arginina, es lógico utilizar también estos datos de referencia de preferencia a la hora de determinar la puntuación de CAI de los marcos de lectura abiertos resultantes generados.

La metodología tal como se describe en el presente documento es particularmente adecuada al expresar los anticuerpos o derivados de los mismos y es particularmente eficaz cuando se combina con casetes de expresión dirigidos por el promotor y los elementos de expresión derivados del gen de alfa EF-1. .Los casetes de expresión dirigidos por otros promotores y elementos de expresión (por ejemplo, derivados de la LTR de RSV) también son adecuados. Es bien conocido en la técnica que los elementos de casete de expresión (por ejemplo, promotores, potenciadores, regiones de unión a matriz (MARS), aisladores, regiones no traducidas, secuencias intermedias tales como intrones y sitios de poliadenilaci�n) se pueden combinar en muchas combinaciones diferentes para crear

5 casetes de expresión adecuados para dirigir la expresión de los marcos de lectura abiertos deseados y para dirigir la expresión de los marcadores de selección y de amplificación empleados en la presente invención.

Una vez que los clones en cualquier protocolo de desarrollo de línea celular dado se acercan a una meseta de producción en la producción de lotes sin alimentar extendidos, se observa que las actividades adicionales de laboratorio se enfocan mejor a metodolog�as tales como (i) clonaci�n de una sola célula de los mejores clones, (ii) 10 desarrollo del proceso por lotes con alimentación, (iii) desarrollos de procesos de estilo de perfusi�n, (iv) recetas de medios a medida y alimentos, y regímenes y (v) adaptación posterior del cultivo. Por ejemplo, una vez que se alcanza un umbral de producción para un clon individual, sus subclones de una sola célula derivados son normalmente más estables y de alto rendimiento que los clones hija amplificados generados por otros regímenes de selección y amplificación en niveles más estrictos del agente de selección y amplificación. De hecho, el aumento de 15 la selección y amplificación de los clones finales que ya se acercan a un umbral de producción a menudo conducen a inestabilidad y después de las mejoras iniciales, pueden conducir en última instancia a títulos similares o incluso inferiores en cultivos discontinuos del modelo de producción din alimentar extendidos que el clon parental amplificado. Por lo tanto, mientras que se reconoce que, en ocasiones, un evento de amplificación más raro y fortuito puede aumentar los títulos por encima de 2 veces en algunos casos, una vez que se acerca a un umbral de

20 expresión, hay técnicas más fiables que se pueden emplear en su lugar para aumentar aún más títulos estables.

La presente invención se ilustra a continuación con más detalle con los siguientes ejemplos.

Ejemplos

En el pasado, la metodología de selección de DHFR se ha empleado en más de quince proyectos de anticuerpos. En todos los casos, cuando se utiliza esta metodología han sido necesarias al menos dos rondas de amplificación y

25 un mínimo de MTX 50 nM como una presión de selección y mantenimiento para generar líneas celulares con rendimientos adecuados. Los resultados t�picos generados en este período de tiempo por esta metodología se representan por los anticuerpos 1, 2, 3 y 4 en la Tabla 1. El proyecto 1 del anticuerpo se llev� a cabo utilizando metodolog�as estándar disponibles en el momento. Los proyectos de anticuerpos 2-9 se llevaron a cabo de acuerdo con los materiales y procedimientos siguientes.

30 Se ha estudiado el impacto de la mejora del índice de adaptación de codones (CAI) de los marcos de lectura abiertos.

El primero elegido para la investigación fue el anticuerpo 5. Este estudio involucr� a expresar el producto de anticuerpo de los marcos de lectura abiertos de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos tipo salvaje (es decir, no adaptados por codones) (registrados como anticuerpo 5 (a)), marcos de lectura abiertos de las cadenas pesadas

35 y lugeras con adaptación de codones ampliamente de las secuencias de codificación del dominio variable únicamente (registradas como anticuerpo 5 5 (b) o 5 (c)) o adaptación de codones de los marcos de lectura abiertos de la cadena pesada y ligera (registrado como anticuerpo 5 (d))(d)). Los resultados de este estudio se presentan en las Tablas 1-5.

Ejemplo 1. Materiales y procedimientos

40 1.1 Clonaci�n de ADN y Construcción de vectores.

Toda la clonaci�n del ADN se realizó mediante subclonaci�n basada en enzimas de restricción establecida y metodolog�as de ensamblaje de PCR (véase, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Tercera Edición: Sambrook et al (CSH Laboratory Press)). Se muestran las representaciones esquemáticas de los vectores de expresión y selección (véase la Figura 1). Los vectores mostrados ejemplifican el promotor del RSV, no obstante, se usaron

45 diferentes promotores de acuerdo con la tabla 1. A todos los demás respectos, los vectores permanecieron sin modificar.

1.2 Adaptación de codones

En los proyectos en los que se investigaron las secuencias de ORF adaptadas, estas se generaron usando oligonucle�tidos solapantes deseados combinados con la ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

50 de fusión antes de la clonaci�n y la confirmación de la secuencia; todo mediante metodología estándar (véase: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Tercera Edición: Sambrook et al (CSH Laboratory Press) and Stemmer et al., Gene. 164(1):49 -53, 1995). Las secuencias de las regiones adaptadas de los ORF del proyecto 5 (b) y 5 (c) se diseñaron utilizando la preferencia de uso de codones de Massaer para células humanas / de mamíferos (véase la Figura 11).

55 Para el proyecto del anticuerpo 5 (d), las secuencias del ORF adaptadas por codones se diseñaron y generaron por el proveedor de servicios de contrato 1. Los ORF resultantes poseían una puntuación CAI >0,9. Las secuencias de adaptadas de codones que codifican los dominios variables de anticuerpos para el proyecto del anticuerpo 6 fueron

dise�ados y generados por el proveedor de servicios de contrato 2. Estos dominios variables se combinaron a continuación con las secuencias que codifican los dominios constantes adaptadas por codones del proyecto 5 (d) mediante subclonaci�n estándar con la ayuda de sitios únicos de clonaci�n situados entre las regiones constantes y variables (usando Spel para la cadena pesada, BsiWI para la cadena ligera) (proyectos 6 (b) y 6 (d)). Los ORF resultantes que codifican el anticuerpo de longitud completa para el proyecto 6 (b) y 6 (d) poseían cada uno una puntuación CAI > 0,9. Todos los ORF adaptados por codones del proyecto del anticuerpo 7 fueron diseñados y fabricados por el proveedor de servicios contrato 2 y los ORF resultantes poseían una puntuación CAI > 0,9. Los ORFs de los proyectos 8 y 9 emplearon el algoritmo de software Leto para diseñar la secuencia del dominio variable. Los marcos de lectura abiertos de longitud completa en el marco se generaron después mediante la combinación de estas secuencias con las secuencias de codificación del dominio constante adecuadas (de nuevo, utilizando los sitios SpeI y BsiWI como anteriormente): para el anticuerpo 8, las secuencias que codifican los dominios variables se fusionaron con la respectivas secuencias de codificación de dominio constante de proyecto 7. Para el anticuerpo 9, las secuencias de codificación del dominio variable generadas se fusionaron con las respectivas secuencias de codificación del dominio constante del proyecto 6 (d). Una vez más los ORF resultantes que codifican la totalidad de las cadenas pesadas y ligeras para el proyecto de 8 y 9 poseían cada uno puntuaciones CAI > 0,9.

En la figura 11 (A). la secuencia de la cadena ligera que codifica la CDR1 de proyecto del anticuerpo 5 se muestra como una secuencia de muestra representativa. Se muestra la secuencia de amino�cidos de esta CDR. Se muestra un potencial elemento rico en AU de inestabilidad auuua (ARE) en recuadro y en negrita (véase también Akashi et al Blood 83:pp3182 -3187). También se destaca el cod�n de arginina. En primer lugar, el procedimiento de adaptación codones aumentado tuvo como resultado un aumento de la puntuación de CAI a través del ORF. Este anticuerpo se emple� en proyecto 5 (b). Como se muestra este procedimiento incluye la mayoría de los codones preferidos (por ejemplo, para Tyr), pero no en todas las ocasiones (por ejemplo, Leu). En segundo lugar, la puntuación máxima CAI emple� los codones más preferidos de acuerdo con Massaer et al. Esta secuencia se emple� en el proyecto de anticuerpo 5 (c). La secuencia final proporcionada emple� los codones más preferidos de acuerdo con una base de datos más grande, como la disponible en el sitio web de base de datos de uso de codones. Esta secuencia de anticuerpos se emple� en el proyecto 5 (d). En la figura 11 (B), las tablas de preferencia de codones de genes altamente expresados en los seres humanos adaptados de Massaer et al. En la figura 11 (C) La tabla de preferencia de codones de genes humanos adaptados de la bases de datos de uso de codones (www.kazusa.org.jp / cod�n) para Homo sapiens (que comprenden 89.533 CD (38691091 codones).

Obs�rvese que para los ORF de las cadenas pesada y ligera se usaron de forma rutinaria los sitios Hind III (5 ') y EcoR1 (3') para lanzar los marcos de lectura abiertos en los vectores de expresión. Todas las secuencias se confirmaron antes de su uso en la transfecci�n.

Por ejemplo, secuencias, véanse las figuras 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9, que registran las secuencias del marco de lectura abierto originales y adaptadas del 5. Obsérvese que en el proyecto 5 solo 5 (d) fue suficientemente adaptado por codones en las regiones de los marcos de lectura abiertos para que la puntuación CAI resultante aumente por encima de 0,9.

Para todas las puntuaciones CAI registradas en el presente documento, se us� la tabla de uso de codones Ehum.cut como referencia (disponible a través de EMBOSS).

Estas puntuaciones se calculan utilizando la aplicación del índice de Adaptación de Codones que emplea la metodología descrita por primera vez por Sharp y Li (ibid). Esta aplicación es parte de la suite EMBOSS. Versión

2.8.0 archivos de uso de codones Ehum.cut y los ajustes de los parámetros por defecto se usaron para determinar las puntuaciones de CAI de las secuencias.

Tabla 6

Tabla de uso de codones Ehum.cut derivada de EMBOSS. Columna A: Secuencia de codones; Columna B: amino�cido codificado; Columna C: Proporción de uso de un cod�n dado entre su conjunto redundante; Columna D: Número de codones por 1.000 codones; Columna E: Número de veces que se observ� el cod�n en el conjunto de datos utilizado para derivar la tabla.

(A)

(B) (C) (D) (E)

GCG

A 0,100 6,950 10994

GCA

A 0,220 15,370 24296

GCT

A 0,270 18,750 29645

GCC

A 0,410 28,340 44818

TGT

C 0,440 9,970 15764

TGC

C 0,560 12,630 19971

GAT

D 0,460 22,530 35629

GAC

D 0,540 26,940 42601

GAA

E 0,420 29,040 45923

GAG

E 0,580 40,670 64302

TTT

F 0,450 16,640 26304

TTC

F 0,550 20,620 32611

GGT

G 0,170 11,880 18792

GGG

G 0,240 16,520 26128

GGA

G 0,250 17,710 28000

GGC

G 0,340 23,940 37852

CAT

H 0,400 9,660 15276

CAC

H 0,600 14,350 22687

ATA

I 0,150 6,920 10941

ATT

I 0,350 16,280 25738

ATC

I 0,500 23,380 36976

AAA

K 0,410 24,120 38145

AAG

K 0,590 34,370 54344

CTA

L 0,070 6,320 9990

TTA

L 0,070 6,400 10123

TTG

L 0,120 11,520 18218

CTT

L 0,130 11,740 18564

CTC

L 0,200 18,690 29552

CTG

L 0,420 38,790 61342

ATG

M 1,000 22,230 35143

AAT

N 0,450 17,340 27422

AAC

N 0,550 21,190 33512

CCG

P 0,110 6,700 10588

CCA

P 0,280 16,810 26574

CCT

P 0,280 16,970 26837

CCC

P 0,330 19,900 31463

CAA

Q 0,260 11,930 18863

CAG

Q 0,740 33,220 52535

CGT

R 0,090 4,770 7535

CGA

R 0,110 6,040 9547

CGC

R 0,200 10,750 17002

AGG

R 0,200 10,780 17049

AGA

R 0,200 10,820 17104

CGG

R 0,200 10,830 17126

TCG

S 0,060 4,390 6942

TCA

S 0,140 11,070 17497

AGT

S 0,150 11,180 17681

TCT

S 0,180 14,120 22320

TCC

S 0,230 17,320 27389

AGC

S 0,250 18,890 29874

ACG

T 0,120 6,550 10364

ACT

T 0,240 13,250 20954

ACA

T 0,270 15,220 24071

ACC

T 0,370 20,980 33176

GTA

V 0,110 6,920 10939

GTT

V 0,170 10,880 17196

GTC

V 0,250 15,440 24415

GTG

V 0,470 29,080 45989

TGG

W 1,000 12,430 19658

TAT

Y 0,430 12,320 19479

TAC

Y 0,570 16,510 26110

1.3 Cultivo celular.

Las células CHO DG44 adaptadas a suspensión se pasaron rutinariamente en medios son componentes derivados

5 de animales a los que se habían adaptados previamente. Este medio consistía en una formulación basal que contenía amino�cidos, oligoelementos, vitaminas, glucosa, e hidrolizado de levadura. Este medio también se suplement� con insulina recombinante, lípidos y nucle�sidos. Como también se a�adi� bicarbonato sádico a los medios. En la técnica se conocen muchas recetas de medios sin componentes derivados de animales. La selección inicial de células transformadas con vector se sometió a retirada de nucle�sidos (selección con DHFR) y adición de

10 G418 (para selección con neomicina fosfotransferasa). Para la clasificación del título, los títulos de ensayo de 96 pocillos eran propensos a la variación inducida por el crecimiento celular, los números de siembra, los volúmenes de dispensación de medios de comunicación y la cinética de evaporación a través de una placa. Como consecuencia, los títulos que se generan en los modelos de producción en matraces de agitaci�n fueron más indicativos del orden de clasificación de la línea celular en líneas celulares de alto rendimiento, amplificadas. Para este tipo de modelos,

15 todas las células se sembraron a la misma densidad inicial. En tales modelos, también se monitorizaron la viabilidad y el crecimiento.

1.4 Preparación de ADN antes de la transfecci�n

Cantidades iguales (15 μg) del vector de expresión de la cadena pesada y la expresión de la cadena ligera se linealizaron hasta su finalización (con Not I) en una reacción de Eppendorf con volumen 200 μl y después se

20 precipit� en etanol / acetato de sodio. El sedimento se lav� después en etanol al 70%, se secó al aire y se resuspendi� en 50 μl de agua de calidad para biología molecular.

1.5 Preparación de células CHO DG44 antes de la transfecci�n

.2 x 107c�lulas (por transfecci�n) de las células en crecimiento sanas se centrifugaron (1.000 rpm durante 2-10 minutos) en un tubo de 15 o 50 ml, se lavaron en 15 ml de PBS enfriado con hielo / sacarosa, se centrifugaron de

25 nuevo y después se resuspendieron en 800 μl de PBS enfriado con hielo / sacarosa. A continuación, esta suspensión celular se a�adi� al ADN preparado anteriormente y se dej� en hielo durante 15 minutos antes de ser transferido a una cubeta de electroporaci�n enfriada.

1.6 Electroporaci�n

La cubeta que contenía el ADN preparado y las células se sometió a electroporaci�n en un Gene Pulser fijado a

30 25μF y 0,38 kV y luego de devolvió al hielo durante 10 minutos. Después se extrajeron las células y se añadieron a 240-mls de medio no selectivo y a continuación se introdujeron en placas en medio no selectivo en 40 x placas de 96 pocillos a 2-5x103c�lulas por pocillo (es decir, 50 μl por pocillo). Las placas se envolvieron después n papel de aluminio y se incubaron a 37 � C y 5% de CO2 durante 48 horas.

1.7 Selección, amplificación e identificación del clon

35 48 horas después de la electroporaci�n, se añadieron 150 μl de medios selectivos a cada pocillo. Este medio selectivo contiene G418 y ningún nucle�sido. Una vez a la semana a partir de entonces, 140 μl de medio se intercambiaron cuidadosamente por medio selectivo fresco sin alterar la capa de células sedimentadas y después de 3-4 semanas, todos los clones en crecimiento (normalmente un crecimiento del 0,1 colonias por pocillo, es decir, el crecimiento en 10 pocillos por placa de 96 pocillos ) se titularon para la producción de anticuerpos. Los clones de

40 clasificación superior (normalmente 20-100) identificados se escalaron en el mismo medio selectivo a través de placas de 24 pocillos y a placas de 6 pocillos. Estos clones se sembraron después a 1.000 células / por pocillo en una placa de 96 pocillos (96 pocillos por clon) y a continuación se seleccionan en medios selectivos que también contenían metotrexato 5 nM en un volumen de 200 μl por pocillo. Después de dos a tres semanas de incubaci�n adicional, los mejores clones se escalaron de nuevo y se volvieron a sembrar a 1.000 células por pocillo, pero en

45 MTX 50 nM. Estos clones también se sometieron a detección selectiva en placas de 96 pocillos después de 2-3 semanas de crecimiento y el mejor ampliado y después se sembraron en placas a 1.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos pero con MTX 150 nM. Con el fin de evaluar los clones finales para el potencial de producción, los mejores clones en MTX 150 nM se ampliaron y evaluaron en modelos de producción en matraz de agitaci�n para titulación y calidad del producto generado. El mejor clon para el proyecto 5 (a) era un clon marcado 17-9-6-1. Esto

gener� 0,3 g por litro de título final en los modelos de producción sin alimentar.

NB. Los niveles de metotrexato y el número de rondas de amplificación necesarios en la etapa 1.7 variaba en función del proyecto y de si las secuencias estaban adaptadas por codones.

1.8 Análisis de titulación.

Para las muestras de los medios obtenidas de placas de 96 pocillos, se determin� el título de anticuerpos mediante metodología de estilo ELISA de tipo s�ndwich automatizado en placa de 96 pocillos en un analizador IGEN M-Series M8/384 (BioVeris, Maryland, EE.UU.) con las recomendaciones del fabricante y las metodolog�as estándar. El s�ndwich consistió en fragmentos F(ab)2 marcados con perlas recubiertas magnéticas revestidas con estreptavidina, proteína A biotinilada y rutenio. A continuación, la señal generada por la muestra de ensayo se compar� con una dilución en serie del patrón de referencia del anticuerpo. Mientras que un ensayo altamente sensible, debido a variaciones en el ensayo combinado con variables de crecimiento de células en cultivos de 96 pocillos, la precisión intermedia y la reproducibilidad del ensayo son relativamente bajos para este ensayo de líneas celulares de alto rendimiento, amplificadas. Para las muestras de los medios obtenidas durante la producción en matraz de agitaci�n y biorreactor, el título de anticuerpos se midió con la ayuda de un método nefelom�trico en el que una señal de luz se dispersa por la inmuno-precipitina insoluble en la solución de reacción utilizando un sistema de imagen de Beckman Coulter (Buckinghamshire, Inglaterra) y de las recomendaciones y metodolog�as estándar del fabricante. A continuación, la señal generada por la muestra de ensayo se compar� de nuevo con una dilución en serie del patrón de referencia del anticuerpo. Todos los títulos indicados son aproximados.

1.9 Modelos en matraz de agitaci�n con biorreactor (modelos de producción por lotes sin alimentar extendidos).

T�picamente, las células se sembraron en cultivo tisular de 250 ml estándar en matraces de agitaci�n a 800.000 células por ml con tapas ventiladas que contienen medios sin componentes derivados de animales y hasta un volumen total de 120 ml. Estos matraces se incubaron después con agitaci�n en aire enriquecido con di�xido de carbono y se establecieron temperaturas para alentar y sostener el crecimiento celular. Varias condiciones se analizaron para cada clon, por ejemplo en varias condiciones de temperatura. En los resultados presentados en el presente documento se ejemplifica el título más alto para cada clon (mediante condiciones estándar) analizado. Normalmente los títulos del punto final del modelo de producción como se indican en el presente documento se registraron en el punto en el que la viabilidad celular se reduce a aproximadamente el 50% según se determin� mediante el ensayo de exclusión con de azul trip�n de en un Vi-Cell (Beckman) usando los ajustes de parámetros estándar Vi-celulares CHO y siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Normalmente esta variable título se genera después de 10-20 días de incubaci�n.

1.10 Metodología del cultivo en biorreactor.

En todo momento se usaron metodolog�as de cultivo del biorreactor estándar y equipos. Típicamente, para generar un tren de semillas, las células se ampliaron en volúmenes más grandes y se pasaron dos veces a la semana en un régimen de 3 días repetido, después de 4 días. Para el trabajo que se muestra en la Figura 13, las células de semillas se utilizaron después para inocular en biorreactores de mesa de 3 litros Applikon (volumen de trabajo de 2 litros) se sometieron a las siguientes condiciones de proceso: Temperatura de 34 � C, el punto de pH es 6,95, punto fijado de DO 30%. Al igual que con los modelos de frasco en agitaci�n, los cultivos se extendieron hasta que la viabilidad celular se redujo a aproximadamente el 50%. Estos biorreactores imitan ampliamente el título del punto dinal del matraz en agitaci�n, as� como biorreactores de mayor tamaño que se utilizan para suministrar material de ensayo cl�nico, etc.

1.11 Análisis 1RT-QPCR (para los resultados, véase la Figura 10).

Las extracciones de ARN de CHO y las reacciones de RT-cPCR se llevaron a cabo mediante extracción de sílice automatizada utilizando el kit de aislamiento de ARN de alto rendimiento y ARN y MagNA Pure (Roche) y los protocolos. Después de la transcripción inversa usando hex�meros aleatorios, la reacción de PCR se llev� a cabo usando un ABI-7700 (Applied Biosystems) y se analizaron mediante el algoritmo de cuantificación relativa ΔΔCT utilizando metodología estándar. Las reacciones se multiplexaron (18S + gen diana [cadena pesada / cadena ligera]), siendo 18S la diana más abundante como cebador limitado para evitar la inhibición de las reacciones de destino. Las sondas y los pares de cebadores flanqueantes empleadas para Q-PCR se utilizaron de acuerdo con las SEQ ID. N� 1-9.

Obs�rvese que las sondas/cebadores de la cadena pesada y la cadena ligera anteriores no eran adecuadas para su uso con el proyecto 5 (d) debido al aumento de la adaptación de codones del ORF llevado a cabo en este proyecto, por tanto, su exclusión de la Figura 10 (A).

1.12 Análisis de transferencia de tipo Western (para los resultados, véase la Figura 10).

Se us� metodología estándar y se describe en detalle en otra parte (por ejemplo, véase Sambrook et al ibid). En resumen, los extractos de células equivalentes policlonales se realizaron usando el tampón de extracción de proteínas y lisis celular. Cantidades iguales de cada extracto se incubaron después con calor. Se us� tampón de carga de Laemmli y después se cargó y se pas� por geles de SDS-PAGE con tampón de carrera de Tris-glicina para

separar las fracciones de proteína. Una vez separadas, las proteínas se sometieron después a electrotransferencia sobre membranas de nitrocelulosa y después se sondaron con una IgG anti-humana entera (HRP conjugado). Se gener� una señal mediante incubaci�n con un sustrato de HRP y se registr� con una película de rayos X. Una exposición adicional se requirió para detectar el producto de la cadena ligera de anticuerpos para el proyecto 5 (a).

1.13 Tinción con metotrexato fluorescente para determinar los niveles de DHFR en los clones que producen la proteína recombinante deseada

Cada clon se cultiv� sin metotrexato durante 4-5 días antes de la adición de Alexa-Fluor 488 10μM -Metotrexato (Molecular Probes / Invitrogen, Paisley) durante 18 – 22 horas a 37 � C con 5% de CO2 a 700.000 de células vivas. Las células teñidas se recogieron a continuación y se lavaron con medios y se incubaron a 37 � C, 5% de CO2 durante 30 minutos. Las células cosechadas se lavaron de nuevo con los medios de comunicación y a continuación se volvieron a suspender en los medios, se filtraron y se a�adi� el colorante de exclusión de vivas/muertas yoduro de propidio (Sigma, St Louis) antes de analizar en BD FACS ARIA. Los datos mostrados en la Figura 14 (A) son sólo del conjunto de células vivas.

1.14 Análisis qPCR del ADN gen�mico para determinar los niveles de DHFR y Neo.

La extracción de ADN gen�mico de CHO se realizó usando kits estándar de Qiagen. Después de la cuantificación y normalización del ADN usando una lectura en espectrofotómetro, la reacción de PCR se llev� a cabo usando un ABI-7700 (Applied Biosystems) y se analizaron mediante el algoritmo de cuantificación relativa ΔΔCT utilizando metodología estándar. Las sondas y los pares de cebadores flanqueantes empleadas para Q-PCR se utilizaron de acuerdo con las SEQ ID. N� 20 – 25 se muestran en la Figura 14 (B).

Ejemplo 2.Expresión de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo monoclonal en células CHO

Sorprendentemente, mientras que la alta puntuación CAI de los ORF, pero aún as� puntuación natural (es decir, puntuación inferior a la de los ORF humanos naturales más alta observada, tal como la cubierta cornificada tardía aLCE1A; NM 1783480) de proyecto 5 (c) gener� un título más alto que la puntuación CAI artificialmente alta de los marcos de lectura abiertos del proyecto 5 (d), mejor� la amplitud (número) de los altos productores en 5 (d) (véase la Tabla 5). Los mejores clones de 5 (a), (c) y (d) se amplificaron después y se evaluaron adicionalmente. Para esta nueva evaluación, los clones 5 (a) progresaron como el control y para representar los títulos del proyecto t�pico observado antes de los resultados descritos en el presente documento. Los resultados de este trabajo generaron una alta producción, clon estable (título y el crecimiento observado durante 40 pases) del proyecto 5 (d) en un tiempo inesperadamente rápido y con niveles reducidos de amplificación. De hecho, los niveles de metotrexato requeridos para generar la línea celular final de 5 (d) fueron significativamente menores (97% menos de metotrexato) con respecto a los requeridos para generar líneas celulares equivalentes que expresan niveles equivalentes similares o inferiores de la misma proteína producto de los marcos de lectura abiertos no adaptados por codones del proyecto 5 (a) (véase la Tabla 1). Un análisis más detallado se llev� a cabo -Véanse las Tablas 2-4.

Para investigar si las propiedades de unión de las proteínas recombinantes resultantes generadas por ORF puntuados con CAI modificado se vieron afectados por la adaptación de codones, las características de unión se compararon y analizaron para el anticuerpo de proyecto 5 codificado por cualquier ORF de la puntuación CAI 0,809 (HC) / 0,761 ( LC) o ORF de la puntaci�n CAI 0,982 (HC) / 0,976 (LC). Ambos materiales se generaron en biorreactores y después se purificaron mediante regímenes de purificación equivalentes. Mediante esta comparación se demostr� que las características de unión del anticuerpo no se vieron afectados por las alteraciones del CAI a los ORF que codifican este anticuerpo.

Del proyecto 5 (d), el clon más productor 097-7, como se muestra en la Tabla 1, se clon� en una sola célula para asegurar la clonalidad de la línea celular, con el título resultante del mejor subclon que genera un incremento cercano a por 2 veces en cultivos discontinuos extendidos sin alimentar respecto al parental no clonado. Los títulos mostrados en la Figura 13 se generan a partir de cultivos por lotes sin alimentar en dos biorreactores de mesa de 3litros Applikon como se describe en 1.10.

Tabla 1.

Para cada proyecto, se presenta el clon final elegida para el posterior desarrollo e introducción en el banco. También se destacan los títulos de 96 pocillos (ng / ml) generados para cada clon final en cada etapa de este desarrollo de líneas celulares. Los datos t�picos generados con anterioridad a los resultados como se describe en el presente documento se representan como proyectos de anticuerpos 1, 2, 3 y 4. Obsérvese que el proyecto 2 y el proyecto 4 expresan el mismo producto. Para los proyecto 2 y 4 todas las actividades se llevaron a cabo en dos laboratorios independientes que usan los mismos vectores, células huésped y protocolos, pero operadores de laboratorio y equipos diferentes. Todos los títulos mostrados a continuación a MTX 0, 5, 50 y 150 nM son los generados en la etapa de 96 pocillos. Titulaciones más altas no mostraron una mejor significativa en los modelos de producción por lotes y, por tanto, progres� el clon de MTX menor (véase la Tabla 2). FIO = solo a título indicativo, no necesario. El proyecto 6 (a) se interrumpió antes de llegar a la meseta debido a que se alcanzaron mejores títulos de los proyectos 6 (b) -6 (d).

Tabla 5

Comparaci�n de títulos de los clones no amplificados generados mediante protocolo de transfecci�n y selección estándar y después seleccionados con retirada de nucle�sidos y adición de G418. Todas las líneas celulares contienen los mismos vectores que expresan el mismo anticuerpo (del proyecto 5), pero de los marcos de lectura 5 abiertos que codifican con diferentes puntuaciones del CAI. Para el proyecto 5 (a) (no optimizado) se realizaron tres transfecciones adicionales, pero no se muestran ya que los resultados eran esencialmente los iniciales. En la Figura (A), “% título > 5 ng” hace referencia al % de los pocillos tras el registro de detección selectiva por encima de 5 ng/ml. El “% título > 5 ng” hace referencia al % de los pocillos tras el registro de detección selectiva por encima de 50 ng/ml. “Título superior” se refiere a la puntuación más alta de todos los sometidos a selección. “Valor 50�” se refiere 10 al 50� mejor título sometido a selección. “Valor 20�” se refiere al 20� mejor título sometido a selección. En (B), los resultados promedio para los títulos superiores, 20� y 50� indicados en (A) se representan en formato de histograma.

(A)

Transfecci�n

PUNTUACIÓN HCCAI PUNTUACIÓN LHCCAI % con título > 5 ng/ml % con título > 50 ng/ml Título superior Valor 50� Valor 20�

1

0,809 0,761 23 0 43 6 8

2

0,809 0,761 26 0 16 5 6

3

0,809 0,761 26 0 23 6 7

4

0,847 0,833 43 7 376 2 17

5

0,847 0,833 62 24 778 9 76

6

0,872 0,894 47 20 674 23 105

7

0,872 0,894 63 30 923 12 103

8

0,982 0,976 57 25 706 46 178

9

0,982 0,976 82 61 653 80 171

15 Tabla 3 Tabla 4

An�lisis detallado del título en placas de 96 pocillos de los proyectos que se muestran en la Tabla 1. Título del menor clon y del clon 50 se muestra después de la selección con adición de G418 y retirada nucle�sido pero sin adición de metotrexato.

Proyecto

�Adaptaci�n de codones? Promotor usado para dirigir la expresión de los ORF de anticuerpos Título superior (ng/ml) Título 50 (ng/ml)

2 3 4 5 (a) 5 (d) 6 (a

No No No No Yes No RSV RSV RSV RSV RSV RSV 130 71 152 43 653 116 2 (22nd) 12 22 6 80 14

An�lisis detallado del título en placas de 96 pocillos de los proyectos que se muestran en la Tabla 1. Título del menor clon y del clon 50 se muestra después de la selección con adición de G418 y retirada nucle�sido pero sin adición de metotrexato.

Proyecto

�Adaptaci�n de codones? Promotor usado para dirigir la expresión de los ORF de anticuerpos Título superior (ng/ml) Título 50 (ng/ml)

6 (b) 6 (c) 6 (d) 7 (a) 7 (b) 8 9

Yes No Yes Yes Yes Yes Yes RSV EF-1a EF-1a RSV EF-1a EF-1a EF-1a 840 1153 2499 830 3467 4090 3108 89 87 1426 50 528 739 573

Los mejores 20-100 clones como se observa en los proyectos 5 y 6 se escalaron a las placas de 6 pocillos antes de volver a sembrarse en placas de 96 pocillos en medios que contienen metotrexato 5nM. La media y los títulos altos de los clones en crecimiento observados en los experimentos 5 y 6 a las concentraciones5nM (A1) y 50nM (A2)del metotrexato antifolato en placas de 96 pocillos se muestran a continuación.

A1 MTX 5nm A2 MTX 50nm

Proyecto

Título medio Título máximo Título medio Max Titre

5 (a) 5 (d) 6 (a) 6 (b) 6 (c) 6 (d)

42 626 134 761 593 1012 253 1760 316 6340 2592 5075 137 1130 129 2525 949 3017 452 9500 809 15030 3884 12360

Tabla 2

5 Ejemplos de mesetas de producción; Ejemplo (A), el clon elegido final para el proyecto 5 (d) se amplificó adicionalmente en MTX 50nM. Se muestran los títulos de los modelos de producción sin alimentar (sombreado) y el título más alto resultante de los clones hija “amplificados”. También se muestran ejemplos similares (8, C, 0, E, F, G). Para cada ejemplo se registra el título más alto del clon hija y su amplificación posterior. Esto demuestra que alcanzar títulos más altos es más beneficioso que intentar alcanzar títulos más altos mediante rondas de

10 amplificación.

Ejemplo

Línea celular Niveles de MTX Títulos en 96 pocillos (ng/ml) Títulos finales del modelo de producción (mg/l) % cambios en los títulos finales del modelo de producción tras la amplificación adicional

Ejemplo A: Clon elegido del

097-7 5 nM 880 690

097-7-1

50 nM 6700 550 -20 %

Ejemplo

Línea celular Niveles de MTX Títulos en 96 pocillos (ng/ml) Títulos finales del modelo de producción (mg/l) % cambios en los títulos finales del modelo de producción tras la amplificación adicional

proyecto 5 (d)

097-7-3 50 nM 3300 216 -69 %

097-7-5

50 nM 3100 615 -11 %

097-7-6

50 nM 1900 566 -18 %

Ejemplo B: Clon elegido del proyecto 6 (d)

P100-1 5 nM 2025 901

P100-1-8

50 nM 4570 499 -45 %

Ejemplo C: Clon no elegido del proyecto 6 (d)

P100-6 5 nM 1435 468

P100-6-8

50 nM 5650 125 -73 %

Ejemplo D: Clon no elegido del proyecto 6 (d)

P634-2 5 nM 3205 692

P634-2-4

50 nM 3685 369 -47 %

Ejemplo E: Clon no elegido del proyecto 6 (d)

P502-1 5 nM 2385 357

P502-1-4

50 nM 5325 157 -56 %

Ejemplo F Clon elegido del proyecto 7 (a)

O65-5 5 nM 5700 400

O65-5-7

50 nM 4515 168 -58 %

Ejemplo G: Clon elegido del proyecto 7 (b)

74-3 5 nM 2125 488

74-3-3

50 nM 820 239 -51 %

Ejemplo 3. Anticuerpos 6 y 7 y el promotor de EF-1a

La adaptación de codones de los marcos de lectura abiertos de las cadenas pesada y ligera para el anticuerpo 6 se llev� a cabo, de nuevo para generar puntuaciones finales CAI a través de los ORF > 0,9.(véase la Tabla 1.). Los 5 marcos de lectura abiertos adaptados por codones y de partida/silvestre se expresaron en vectores de expresión del promotor basado en RSV as� como un vector de expresión en base al promotor del factor de elongaci�n humano 1 (EF-1a) en la que el aislante de acción en cis, el potenciado y los elementos de expresión del promotor se suministran en su lugar de una fuente de promotor no viral. Los resultados de este trabajo de nuevo demostraron que era necesario significativamente menos metotrexato para generar una línea celular final de alta producción 10 cuando el marco de lectura abierto de la proteína deseada se adapt� por codones primero. De hecho, la transfecci�n 6 (a) en la que el anticuerpo 6 estaba codificada por ORF no adaptados (es decir, con una puntuación CAI < 0,9) se abandon� en la etapa de MTX 5 nM antes de la generación de las células que se acercan a una meseta de producción. El régimen de la amplificación no se persiguió adicionalmente en la transfecci�n 6 (a), ya que era evidente que se habrán necesitado significativamente más recursos y tiempo para generar líneas celulares capaces 15 de producir rendimientos equivalentes de proteínas en relación a los rendimientos ya obtenidos de las líneas celulares en las que se han empleado ORF > 0,9 habían (es decir, las transfecciones 6 (b) y 6 (d). Por otra parte, al comparar de igual a igual vectores ´m�s o menos adaptación por codones, se observ� que la adaptación por codones siempre reducía los niveles antifolato requeridos. Una vez más, para el proyecto 7, la adaptación por codones se llev� a cabo de una manera similar al proyecto 6 (véase la Tabla 1) y los ORF adaptados por codones

20 (CA > 0,9) se expresaron en un RSV as� como en un vector de expresión basado en el promotor de EF-1a. Una vez más, y con independencia del promotor, se generaron líneas celulares de alto rendimiento equivalentes en un tiempo más rápido y con menos metotrexato de los ORF adaptados por CAI en comparación con todos los proyectos anteriores en los que se emplearon los ORF no adaptados para codificar los productos recombinantes (que se resumen en la Tabla 1).

25 Ejemplo 4. Niveles de mRNA

Para investigar más a fondo esta metodología, el impacto de la adaptación por codones a los niveles de ARNm generados se investigaron en las poblaciones de células policlonales de igual a igual que expresan el mismo producto (el anticuerpo de proyecto 5) a partir de los mismos vectores pero a partir de marcos de lectura abiertos que indican diferentes puntuaciones de CAI.

Las células CHO se cotransfectaron con vectores de expresión que codifican la cadena pesada (HC) y la cadena que codifican el mismo producto de proteína (anticuerpo del proyecto 5). Cada población transfectada se mantuvo como conjuntos policlonales. Cada par de vectores codifica la misma cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC) del

5 anticuerpo pero a partir de marcos de lectura abiertos con diferentes puntuaciones de CAI.

Los resultados de este experimento se capturan en la figura 10 y revelan que se observa un aumento significativo de los niveles de ARNm cuando la puntuación de CAI se eleva para el mensaje de la cadena pesada y ligera respecto a los controles no adaptados. Un aumento equivalente en los niveles de ARN (respecto a la secuencia no adaptada) se produjo en todas las secuencias adaptadas analizadas. Del mismo modo, y dentro de los límites del ensayo de 10 transferencia de tipo Western, se observ� un aumento equivalente en los niveles de proteínas intracelulares para todas las secuencias adaptadas. Sin embargo, mientras que dicha equivalencia se observ� en los niveles de proteínas intracelulares, no había diferencia en los niveles secretados. Se observ� que las células que contienen los marcos de lectura abiertos de puntuación CAI anormalmente alta generaron títulos policlonales más altos. Esto apoya adicionalmente la conclusión de que la amplitud de los clones de producción alta se mejora cuando se usan 15 marcos de lectura abiertos de puntuación CAI anormalmente alta en los protocolos de desarrollo de líneas celulares.

Figura 10

(A): Niveles de ARN intracelulares del mensaje de HC y LC medido mediante RT Q-PCR: Todas las señales normalizadas con respecto al ARN ribos�mico y aumentadas son en relación a las señales generadas para el inicio de los vectores de HC y LC codificados por los marcos de lectura abiertos no adaptados por codones. Eje 20 Y: Los valores aumentan de 0 a 50 veces en la señal de ARN. Eje X: a (h) representa la señal HC del control negativo generada a partir de extractos de ARN extraídos de las células no transfectadas (por duplicado); b (h) representa la señal HC generada a partir de extractos de ARN derivados de las células transfectadas con vectores de expresión de HC y LC no adaptados por codones, tal como se utiliza para el proyecto 5 (a) (las puntuaciones CAI de 0,809 para HC y 0,761 para LC); c (h) representa la señal HC generada a partir de 25 extractos de ARN derivados de las células transfectadas con vectores de expresión de HC y CL adaptados por codones, tal como se utiliza para el proyecto 5 (b) (puntuaciones de CAI de 0,847 para HC y 0.833 para LC); d

(h) representa la señal HC generada a partir de extractos de ARN derivados de las células transfectadas con otros vectores de expresión de HC y CL adaptados por codones, como se usa para el proyecto 5 (c) (puntuaciones CAI de 0,872 para la HC y 0,894 para el LC). Las señales de la cadena ligera generadas a partir

30 de los mismos extractos de ARN como se describe anteriormente se muestran como a(I), b(I), c(l) y d(l) respectivamente.

(B): Análisis de transferencia de tipo Western; los extractos de células equivalentes se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron e interrogaron con anticuerpos anti-producto (conjugados con HRP). El control de las células no transfectadas se muestra en el carril 1. Las células policlonales que expresan los marcos de lectura 35 abiertos de la cadena pesada y ligera del siguiente modo; Carril 2 y 3; HC con una puntuación CAI 0,809 y LC con una puntuación de CAI 0,761 (proteína expresada a partir experimento b (h) y b (i) anterior, los vectores equivalentes a los usados en el proyecto 5 (a).; Carril 4 y 5; HC con una puntuación de CAI de 0,847 y LC con una puntuación de CAI de 0,833 (proteína expresada a partir del experimento c (h) y c (i) anterior, los vectores equivalentes a los utilizados en el proyecto 5 (b); los carriles 6 y 7; HC con una puntuación de CAI de 0,872 CAI y

40 LC con una puntuación de CAI 0,894 (proteína expresada a partir del experimento d (h) y d (l) anterior, los vectores equivalentes a los utilizados en el proyecto 5 (c); carriles 8 y 9; HC con una puntuación de CAI de 0,982 y LC con una puntuación de CAI de 0,976 ( proteína expresada por los vectores equivalentes a los utilizados en el proyecto 5 (d).

(C) Títulos del producto a 24 horas indicados en ng/ml para las células policlonales descritas en la Figura 10 (B).

45 Ejemplo 5. Diferentes procedimientos para alcanzar un CAI elevado. Ejemplo (a) Proyecto 8 y ejemplo (b) Proyecto 9.

a) Para el proyecto 8 se utilizó el software Leto para diseñar los dominios variables. Estos se condensaron después a los dominios constantes idénticos previamente generados para el proyecto 7 con ayuda de digestión con enzimas de restricción estándar y metodología de ligación. Los ORF de la cadena pesada y la cadena ligera

50 resultantes tuvieron una puntuación de 0,954 y 0,919 respectivamente. Estos datos se usaron después en un proyecto de desarrollo de línea celular y una vez más se generaron líneas celulares de alto rendimiento en un marco de tiempo más rápido y con menos metotrexato que lo empleado anteriormente antes de la adaptación de codones (véase la Tabla 1)

a) Para el proyecto 9 se utilizó de nuevo el software Leto para diseñar los dominios variables. Estos se

55 condensaron después a los dominios constantes idénticos previamente generados para el proyecto 6 (d) con ayuda de digestión con enzimas de restricción estándar y metodología de ligación. Los ORF de la cadena pesada y la cadena ligera resultantes tuvieron una puntuación de 0,975 y 0,973 respectivamente. Estos datos se usaron después en un proyecto de desarrollo de línea celular y una vez más se generaron líneas celulares de

alto rendimiento en un marco de tiempo más rápido y con menos metotrexato que lo empleado anteriormente antes de la adaptación de codones (véase la Tabla 1)

Ejemplo 6 Impacto sobre la glicosilaci�n

Se observ� que los niveles de la cadena pesada no glicosilada (NGHC) fueron significativamente más bajos cuando se expresaron a partir de marcos de lectura abiertos adaptados por codones respecto a los niveles generados cuando se expresaron a partir de marcos de lectura abiertos no adaptados a pesar de que se us� el mismo huésped, medios de cultivo y sistema de selección con DHFR y amplificación para la expresión en ambas situaciones. Aún más interesante, también se observaron niveles altos similares de NGHC cuando los mismos marcos de lectura abiertos no adaptados se expresaron lugar en diferentes células huésped que se emplean en diferentes condiciones de cultivo y vectores de diferentes y distintivos regímenes de selección y amplificación (glutamina sintetasa / MSX) (véase la Figura 12). Esta correlación entre la adaptación de codones del marco de lectura abierto y los niveles reducidos de la cadena pesada no glicosilada revela que a través del aumento de la puntuación CAI de un marco de lectura abierto también se puede mejorar la calidad general del producto.

6.1 Desarrollo de la línea celular con el sistema de selección Lonza CHOK1 SV y glutamina sintetasa (Figura 12).

La construcción del vector y el desarrollo de líneas celulares se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos recomendados de Lonza (Slough). Los medios empleados en todo momento fueron CD-CHO (Invitrogen). Los marcos de lectura abiertos usados en el proyecto de anticuerpos 5 (a) que contienen marcos de lectura abiertos no adaptados se subclonaron primero en los vectores pEE14.4 de Lonza (para la cadena ligera) y pEE6.4 (para la cadena pesada). Estos vectores se combinaron a continuación, de acuerdo con el protocolo recomendado de Lonza en un único vector de doble gen que expresa las cadenas pesadas y ligeras. Este vector se liber� después en la cepa CHOK1 de suspensión adaptada de Lonza denominada células huésped CHOK1SV utilizando electroporaci�n según las instrucciones recomendadas por Lonza y se seleccionaron y amplificaron con la retirada de glutamina y con la adición de MSX también como se recomienda

Los clones resultantes se titularon en 96 pocillos y los mejores se pasaron a matraces de agitaci�n y se evaluaron adicionalmente. El mejor clon se seleccion� para hacer el producto en biorreactores a gran escala. Para más detalles generales sobre este enfoque, véase La Cruz Edmonds et al 2006 Biotecnolog�a Molecular 34:179-190).

6.2 Análisis del producto NGHC

La proteína se purificó a partir del sobrenadante del cultivo con la ayuda de las columnas de proteína A. El producto se analizó posteriormente con electroforesis capilar SDS Bioanalyzer, equipo de laboratorio en un chip (Agilent Technologies, Cheshire UK) en condiciones reductoras y de acuerdo con el protocolo del fabricante. La cadena pesada no glicosilada se observa como una especie de migración ligeramente más rápida con respecto a la especie de cadena pesada principal glicosilada (véase la Figura 12B).

Figura 12 -Tabla (A) que muestra los datos representativos de todos los análisis. También se incluye el trabajo adicional realizado para expresar los marcos de lectura abierta no adaptados en un protocolo de selección y amplificación diferente (glutamina sintetasa / metotrexato) empleando una célula huésped, vector, medios y regímenes de cultivo diferentes (véase el ejemplo 6.1 anterior). (B) Trazas del Ejemplo NGHC observados a partir de los ORF no adaptados de partida frente a los ORF de codones adaptados. Este análisis se llev� a cabo en el producto purificado a partir de biorreactores (1.000 litros) de tamaño equivalente. En estas superposiciones de trazas representativas, la cosecha de los cultivos de células biorreactores que expresan el producto de los ORF no adaptados (CAI: HC 0,809, LC 0,761) generaron la cadena pesada con la ocupación del sitio reducida (10% de la cadena pesada no glicosilada) en relación con el producto producido a partir de ORF adaptados (CAI: HC 0,982, LC 0,976) que contenía sólo el 1,5% de la cadena pesada no glicosilada.

Ejemplo 7. Impacto sobre los niveles de agentes de selección y amplificación en las líneas celulares finales+

La adición o ajuste gradual de cantidades crecientes del agente de selección y amplificación MTX en los respectivos sistemas de selección con DHFR se realiza con el fin de aumentar la expresión mediante el aumento de número de copias del gen. Para investigar el impacto de la adaptación de codones sobre el número de copias del ADN plasm�dico transfectado, se emplearon dos metodolog�as semicuantitativas diferentes (véanse las secciones 1.13 y

1.14 para la descripción de los experimentos).

En primer lugar se utilizó el análisis FACS. Para este fin, las líneas celulares finales o clones de células individuales de los mismos para los proyectos de 2, 3, 4, 5 (d), 6 (d) y 7 (b) se tiñeron con metotrexato fluorescente y se analizaron por FACS. Los resultados (mostrados en la Figura 14A) demuestran que los niveles de metotrexato, como se indica por la intensidad de fluorescencia media, y, por lo tanto, los niveles de DHFR, se correlacionan con el nivel de amplificación de la línea celular, es decir, las líneas celulares finales seleccionadas en MTX 5 nM (proyectos 5 (d), 6 (d) y 7 (b)) tienen las líneas celulares más bajas y finales seleccionadas en MTX 150 nM (proyecto 3) tienen los niveles más altos de DHFR. Además, la qPCR para la DHFR y Neo se llev� a cabo sobre el ADN gen�mico extraído de las líneas celulares finales o de clones de células individuales de los mismos para los proyectos de 3, 4, 5 (a), 5 (d), 7 (b) y 9. Los resultados (mostrados en la Figura 14B) demostrar que las líneas seleccionadas en MTX 5 nM (proyectos 5 (d), 7 (b) y 9) tienen niveles significativamente más bajos de ADN de la DHFR y Neo y, por lo tanto, el número de copias inferior, que las líneas seleccionadas en MTX 150 nM (proyectos 3, 4 y 5 (a)).

Los resultados discutidos anteriormente demuestran que las líneas celulares derivadas de los ORF adaptados por

5 codones (proyectos 5 (d), 6 (d), 7 (b) y 9 para este ejemplo) tienen un menor número de copias del gen en comparación con líneas derivadas de los ORF no adaptados (proyectos 2, 3, 4, 5 (a) para este ejemplo). El uso de cod�n de ORF adaptados por codones (CA >0,9), por lo tanto, resulta en la generación de líneas celulares (en comparación con líneas celulares derivadas de los ORF no adaptados) con títulos iguales o mayores, con niveles más bajos de la amplificación y un número de copias menor del ADN transfectado. La generación de clones que

10 hacen los niveles de anticuerpo equivalentes o superiores con respecto al menor número de copias, son deseables vectores de expresión menos amplificadas. Por ejemplo, se ha demostrado que el silenciamiento g�nico inducido de repetición (RIGS) se puede inducir cuando se aumenta el número de copias de un vector de expresión integrado y que dicho RIGS puede resultar en los niveles de expresión reducida de dichos vectores en células de mamífero (por ejemplo, véase McBurney MW et al Exp. Cell Res. 2002 274:1-8).

15 Figura 14 (A). Gráfico de la fluorescencia media observada para la línea celular final para cada uno de los proyectos 2, 3, 4, 5 (d), 6 (d) y 7 (b). Se llev� a cabo la tinción de las células para DHFR como se describe en Materiales y Procedimientos, Ejemplo 1. (B) Niveles de ADN de DHFR y Neo mediante qPCR con el ADN gen�mico de las líneas celulares finales para los proyectos de 3, 4, 5 (a), 5 (d), 7 (b) y 9. La cPCR se realizó como se describe en Materiales y Procedimientos, Ejemplo 1. Para los niveles de referencia observados, los valores más bajos (vistos en el Proyecto

20 7 (b)) para la DHFR y Neo se fijaron en 1, después se representaron todos los demás valores con respecto al incremento por encima de éstos. A continuación también se indica cada valor si la proteína expresada por la línea celular analizada procede de un ORF con CA > 0.9 (S = S� y N = No) y los niveles de MTX requeridos para generar la línea celular (en nM de MTX).

Listado de secuencias

SEC ID N�

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

1

Sonda de ARN 18S -nucleótidos

2

Cebador 1

3

Cebador 2:

4

Sonda de cadena pesada:

5

Cebador 1:

6

Cebador 2:

7

Sonda de cadena ligera:

8

Cebador 1:

9

Cebador 2:

10

Cadena pesada no adaptada del proyecto 5 con una puntuación CAI de 0,809 CAI y empleado en el proyecto 5 (a)

11

Cadena ligera no adaptada del proyecto 5 con una puntuación CAI de 0,761 CAI y empleado en el proyecto 5 (a)

12

ORF de la cadena pesada del proyecto 5 con una puntuación del CAI mayor (0,847): Véase la Tabla 5 y la Figura 6. Esta secuencia se us� en el Proyecto 5 (b)

13

ORF de la cadena ligera del proyecto 5 con una puntuación del CAI mayor (0,833): Véase la Tabla 5 y la Figura 6. Esta secuencia se us� en el Proyecto 5 (b)

14

ORF de la cadena pesada del proyecto 5 con una puntuación del CAI mayor (0,872). Esta secuencia se emple� en el proyecto de anticuerpo 5 (c).

15

ORF de la cadena ligera del proyecto 5 con una puntuación del CAI mayor (0,894). Esta secuencia se emple� en el proyecto de anticuerpo 5 (c).

16

ORF de la cadena pesada del proyecto 5 con una puntuación del CAI mayor (0,982). Esta secuencia se emple� en el proyecto de anticuerpo 5 (d).

17

ORF de la cadena ligera del proyecto 5 con una puntuación del CAI mayor (0,976). Esta secuencia se emple� en el proyecto de anticuerpo 5 (d).

SEC ID N�

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

18

candidato (H2L1) de la cadena pesada

19

candidato (H2L1) de la cadena ligera

20

Cebador 1:

21

Cebador 2:

22

Sonda de DHFR:

23

Cebador 1:

24

Cebador 2

25

Sonda de Neo:

Listado de secuencias

5

<110 > UDEN Mark KOTSOPOULOU, Ekaterina <120 > Procedimiento de producción

<130 > PB62449P

10

<150 > US60/956772 <151 > 2007 -08 -20

<160 > 25

15

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

20

<210 > 1 <211 > 27 <212 > ADN <213> Secuencia artificial

<220 > <223 > Cebador/Sonda

25

<400 > 1

tggctgaacg ccacttgtcc ctctaaa

27

30

<210 > 2 <211 > 20 <212 > ADN <213> Secuencia artificial

35

<220 > <223 > Cebador/Sonda

<400 > 2

40 45

aggaattgac ggaagggcac <210 > 3 <211 > 20 <212 > ADN <213> Secuencia artificial <220 > <223 > Cebador/Sonda 20

50

<400 > 3

ggacatctaa gggcatcaca

20

5

<210 > 4 <211 > 22 <212 > ADN <213> Secuencia artificial

<220 > <223 > Cebador/Sonda

<400 > 4

ctccggctgc ccattgctct cc

22

15

<210 > 5 <211 > 21 <212 > ADN <213> Secuencia artificial

<220 > <223 > Cebador/Sonda

<400 > 5

25

ggaggcgtgg tcttgtagtt g 21

<210 > 6 <211 > 21 <212 > ADN <213> Secuencia artificial

<220 > <223 > Cebador/Sonda

35

<400 > 6

ggcttctatc ccagcgacat c

21

<210 > 7 <211 > 27 <212 > ADN <213> Secuencia artificial

45

<220 > <223 > Cebador/Sonda

<400 > 7

tctcgtagtc tgctttgctc agcgtca

27

55

<210 > 8 <211 > 21 <212 > ADN <213 > Secuencia artificial <220 > <223 > Cebador/Sonda

<400 > 8

cttcgcaggc gtagactttg t

21

65

<210 > 9 <211 > 20 <212 > ADN <213 > Secuencia artificial

<220 > <223 > Cebador/Sonda

5

<400 > 9 gccctccaat cgggtaactc 20

10

<210 > 10 <211 > 1392 <212 > ADN <213 > Secuencia artificial

15

<220 > <223 > Cadena pesada <400 > 10

20 <210> 11

<211 > 717

<212 > ADN

<213 > Secuencia artificial

25 <220 >

<223 > Cadena ligera

<400 > 11

<210 > 12

<211 > 1392

<212 > ADN

<213 > Secuencia artificial

<220 >

<223 > Cadena pesada con codones adaptados

<400 > 12

10

<210 > 13

<211 > 717

<212 > ADN

<213 > Secuencia artificial

15

<220 >

<223 > Cadena ligera con codones adaptados

<400 > 13

20

<210 > 14

<211 > 1392 25 <212 > ADN

<213 > Secuencia artificial

<220 >

<223 > Cadena pesada codones adaptados 30

<400 > 14

<210 > 15 5 <211 > 717

<212 > ADN

<213 > Secuencia artificial

<220 > 10 <223 > Cadena ligera codones adaptados

<400 > 15

15

<210 > 16

<211 > 1392

<212 > ADN

<213 > Secuencia artificial

20

<220 >

<223 > Cadena pesada con codones adaptados

<400 > 16

25

<210 > 17 5 <211 > 717

<212 > ADN

<213 > Secuencia artificial

<220 > 10 <223 > Cadena ligera con codones adaptados

<400 > 17

15

<210 > 18

<211 > 445

<212 > PRT

<213 > Secuencia artificial

20

<220 >

<223 > Cadena pesada H2L1

<400 > 18

25

<210 > 19 5 <211 > 219

<212 > PRT

<213 > Secuencia artificial

<220 > 10 <223 > Cadena ligera H2L1

<400 > 19

5

<210 > 20 <211 > 23 <212 > ADN <213 > Secuencia artificial

10

<220 > <223 > Cebador/Sonda

<400 > 20

15 20

gaggcagttc tgtttaccag gaa <210 > 21 <211 > 21 <212 > ADN <213 > Secuencia artificial <220 > <223 > Cebador/Sonda 23

25

<400 > 21 cctgcatgat ccttgtcaca a 21

30

<210 > 22 <211 > 25 <212 > ADN <213 > Secuencia artificial

35

<220 > <223 > sonda de DHFR <400 > 22

ccatgaatca accaggccac ctcag

25

40

<210 > 23 <211 > 20

<212 > ADN <213 > Secuencia artificial

5

<220 > <223 > Cebador/Sonda

<400 > 23

10 15

gcccggttct ttttgtcaag <210 > 24 <211 > 19 <212 > ADN <213 > Secuencia artificial <220 > <223 > Cebador/Sonda 20

20

<400 > 24 ctgcctcgtc ctgcagttc 19

25

<210 > 25 <211 > 20 <212 > ADN <213 > Secuencia artificial

30

<220 > <223 > Cebador/Sonda <400 > 25

ccgacctgtc cggtgccctg

20

35

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para producir una línea celular de mamífero que produce al menos una proteína terapéutica que comprende las etapas de:

   a) obtener una primera secuencia de polinucle�tidos que codifica dicha al menos una proteína 5 terapéutica,

   b) alterar la primera secuencia de polinucle�tidos para obtener una segunda secuencia de polinucle�tidos, en la que el índice de adaptación de codones de la segunda secuencia de polinucle�tidos es mayor que la de la primera secuencia de polinucle�tido y el primer polinucle�tido y el segundo polinucle�tido codifican la misma proteína terapéutica.

   10 c) transformar al menos una primera célula de una línea celular de mamífero con la primera secuencia de polinucle�tidos de la etapa (a) y una tercera secuencia de polinucle�tidos que codifica un marcador de selección que es capaz de proporcionar la amplificación de la primera secuencia de polinucle�tidos dentro de dicha célula; y

   transformar al menos una segunda célula de dicha línea celular de mamífero con la segunda secuencia

   15 de polinucle�tidos de la etapa (b) y una tercera secuencia de polinucle�tidos que codifica el marcador de selección que es capaz de proporcionar la amplificación de la segunda secuencia de polinucle�tidos dentro de dicha célula,

   d) cultivar al menos una primera célula de la etapa (c) para crear una primera línea celular que comprende una pluralidad de células, en un medio que contiene una concentración o una concentración

   20 cada vez mayor de un agente de selección y amplificación que (i) inhibe el crecimiento de células en dicha línea celular que expresa niveles insuficientes del marcador de selección codificado por el tercer polinucle�tido de la etapa (c), y (ii) aumenta el número de copias del gen;

   cultivar al menos una segunda célula de la etapa (c) para crear una segunda línea celular que comprende una pluralidad de células, en un medio que contiene una concentración o una concentración cada vez

   25 mayor del agente de selección y amplificación que (i) inhibe el crecimiento de células en dicha línea celular que expresa niveles insuficientes del marcador de selección codificado por el tercer polinucle�tido de la etapa (c), y (ii) aumenta el número de copias del gen; y

   (e) seleccionar dicha segunda línea celular una vez que se alcanza la meseta de producción de la proteína codificada por el segundo polinucle�tido en dicha segunda línea celular, en el que dicha

   30 concentración del agente de selección y amplificación es menor que la necesaria para alcanzar un rendimiento de producción equivalente de dicha proteína producida en dicha primera línea celular transformada con el primer polinucle�tido.
2. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la meseta de producción de la proteína codificada por el segundo polinucle�tido producido en dicha segunda línea celular se alcanza con un menor número de rondas

   35 de amplificación de lo necesario para alcanzar un rendimiento de producción equivalente de dicha proteína producida en dicha primera línea celular transformada con el primer polinucle�tido.
3. 3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la segunda línea celular se cultiva en biorreactores y la proteína terapéutica producida se purifica.
4. 4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el índice de adaptación de codones 40 de la segunda secuencia de polinucle�tidos es igual o superior a 0,9.
5. 5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la concentración del agente de selección y amplificación se reduce a igual o menos del 50% o a menos del 25% o a menos del 5% o a menos del 3%, en comparación con la concentración del agente de selección y amplificación usado para el mismo procedimiento usando la primera secuencia de polinucle�tidos.

   45 6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la proteína terapéutica es un anticuerpo, un derivado del mismo o un fragmento de unión a ant�geno.

6. 7.

   El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la proteína terapéutica es un anticuerpo monoclonal.

7. 8.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la línea celular de mamífero que se

   va a transformar es metab�licamente deficiente debido a la interrupción o la inhibición de una enzima celular 50 end�gena.

8. 9.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la línea celular de mamífero que se va a transformar es deficiente en una vía de síntesis de nucle�sidos.

9. 10.

   El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el marcador de selección es un polinucle�tido que codifica la

   dihidrofolato reductasa (DHFR) y el agente de selección y amplificación es un antifolato.

10. 11.

    El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el antifolato es metotrexato (MTX).

11. 12.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el marcador de selección es un

    polinucle�tido que codifica la glutamina sintetasa y el agente de selección y amplificación es metionina 5 sulfoximina (MSX).

12. 13.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que solo se requiere una ronda de amplificación para alcanzar la meseta de producción de proteínas.

13. 14.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el rendimiento final de la proteína terapéutica es superior a 0,5 g/l en un lote sin alimentar.

    10 15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11, 13 or 14, en el que la concentración de MTX usada es:

    (a)

    igual o inferior a 50nM; or

    (b)

    5nM.

14. 16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la línea celular de mamífero es 15 CHO o NSO.
15. 17. Uso de una secuencia de polinucle�tidos que codifica una proteína terapéutica en la que el índice de adaptación de codones de la secuencia de polinucle�tidos es igual o mayor que 0,9 para reducid (i) los niveles requeridos de un agente de selección y amplificación titulable que aumenta el número de copias del gen, (ii) el número de rondas de amplificación, y (iii) el tiempo necesario en un procedimiento para producir una línea

    20 celular de mamífero productora de dicha proteína terapéutica.

16. 18.

    Uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que sólo se requiere una ronda de amplificación.

17. 19.

    Un procedimiento para producir una línea celular de mamífero que produce al menos una proteína terapéutica que comprende las etapas de:

    (a) transformar una línea celular con una secuencia de polinucle�tidos que comprende (i) una secuencia

    25 que codifica la proteína terapéutica y tiene un índice de adaptación de codones que es igual o mayor que 0,9, y (ii) una secuencia que codifica un marcador de selección que es capaz de proporcionar la amplificación de la secuencia de polinucle�tidos;

    (b)

    proporcionar al menos una ronda de amplificación en presencia de un agente de selección; y

    (c)

    seleccionar la línea celular una vez que se alcanza la meseta de la producción de la proteína

    30 terapéutica; en el que la concentración del agente de selección y amplificación es 50% o menos de la concentración requerida para alcanzar un rendimiento de producción equivalente, en comparación con una secuencia que codifica la proteína terapéutica y tiene un índice de adaptación cod�n que es menor que 0,9.
18. 20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que:

    35 (a) el agente de selección y amplificación es MSX o MTX; y/o

    (b) se requiere una ronda de amplificación para alcanzar el rendimiento de la producción equivalente.

    FIGURA 3 FIGURA 4. FIGURA 5 FIGURA 6 FIGURA 7 FIGURA 8 FIGURA 9