RU2813990C2 - Варианты и изоформы антител с пониженной биологической активностью - Google Patents
Варианты и изоформы антител с пониженной биологической активностью Download PDFInfo
- Publication number
- RU2813990C2 RU2813990C2 RU2020117440A RU2020117440A RU2813990C2 RU 2813990 C2 RU2813990 C2 RU 2813990C2 RU 2020117440 A RU2020117440 A RU 2020117440A RU 2020117440 A RU2020117440 A RU 2020117440A RU 2813990 C2 RU2813990 C2 RU 2813990C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- emicizumab
- ser
- antibody
- chain
- val
- Prior art date
Links
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 title description 139
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 title description 139
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 title description 18
- 229950006925 emicizumab Drugs 0.000 claims abstract description 137
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims abstract description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 28
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 57
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 45
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 37
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 33
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 32
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 24
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 20
- 238000002013 hydrophilic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 15
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 10
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 10
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 claims description 9
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 6
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 22
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract description 20
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 abstract description 5
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 67
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 36
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 35
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 27
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 21
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 14
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 14
- 101000840258 Homo sapiens Immunoglobulin J chain Proteins 0.000 description 13
- 102100029571 Immunoglobulin J chain Human genes 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 12
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 12
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 10
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical group [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N Asp-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 6
- OYTPNWYZORARHL-XHNCKOQMSA-N Gln-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N OYTPNWYZORARHL-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 6
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 6
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 6
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 6
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 6
- 238000000235 small-angle X-ray scattering Methods 0.000 description 6
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PRKWBYCXBBSLSK-GUBZILKMSA-N Pro-Ser-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O PRKWBYCXBBSLSK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 5
- YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 5
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QNFRBNZGVVKBNJ-PEFMBERDSA-N Asp-Ile-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N QNFRBNZGVVKBNJ-PEFMBERDSA-N 0.000 description 4
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 4
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 4
- ZFBBMCKQSNJZSN-AUTRQRHGSA-N Gln-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ZFBBMCKQSNJZSN-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 4
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 4
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 4
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 4
- FEHQLKKBVJHSEC-SZMVWBNQSA-N Leu-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 FEHQLKKBVJHSEC-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 4
- PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N Lys-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 4
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N Thr-Val-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 4
- MBLJBGZWLHTJBH-SZMVWBNQSA-N Trp-Val-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 MBLJBGZWLHTJBH-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 4
- 238000004279 X-ray Guinier Methods 0.000 description 4
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 4
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 4
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 3
- UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 3
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 3
- JCLAFVNDBJMLBC-JBDRJPRFSA-N Ser-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JCLAFVNDBJMLBC-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 3
- BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- FYBFTPLPAXZBOY-KKHAAJSZSA-N Thr-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYBFTPLPAXZBOY-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 3
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 108010005652 splenotritin Proteins 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 108010017949 tyrosyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- COEXAQSTZUWMRI-STQMWFEESA-N (2s)-1-[2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 COEXAQSTZUWMRI-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- ARHJJAAWNWOACN-FXQIFTODSA-N Ala-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ARHJJAAWNWOACN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- CREYEAPXISDKSB-FQPOAREZSA-N Ala-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O CREYEAPXISDKSB-FQPOAREZSA-N 0.000 description 2
- VKKYFICVTYKFIO-CIUDSAMLSA-N Arg-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N VKKYFICVTYKFIO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N Arg-Arg-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N Arg-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- NABSCJGZKWSNHX-RCWTZXSCSA-N Arg-Arg-Thr Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N NABSCJGZKWSNHX-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N Arg-Phe-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- ISJWBVIYRBAXEB-CIUDSAMLSA-N Arg-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ISJWBVIYRBAXEB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- SLKLLQWZQHXYSV-CIUDSAMLSA-N Asn-Ala-Lys Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O SLKLLQWZQHXYSV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- BZMWJLLUAKSIMH-FXQIFTODSA-N Asn-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BZMWJLLUAKSIMH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- MDDXKBHIMYYJLW-FXQIFTODSA-N Asn-Met-Asp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N MDDXKBHIMYYJLW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- MKJBPDLENBUHQU-CIUDSAMLSA-N Asn-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MKJBPDLENBUHQU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- UGXYFDQFLVCDFC-CIUDSAMLSA-N Asn-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O UGXYFDQFLVCDFC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- JXMREEPBRANWBY-VEVYYDQMSA-N Asn-Thr-Arg Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JXMREEPBRANWBY-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 2
- JBDLMLZNDRLDIX-HJGDQZAQSA-N Asn-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JBDLMLZNDRLDIX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- XYBJLTKSGFBLCS-QXEWZRGKSA-N Asp-Arg-Val Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O XYBJLTKSGFBLCS-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 2
- GISFCCXBVJKGEO-QEJZJMRPSA-N Asp-Glu-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O GISFCCXBVJKGEO-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 2
- ODNWIBOCFGMRTP-SRVKXCTJSA-N Asp-His-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CN=CN1 ODNWIBOCFGMRTP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N Asp-Pro-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- BKOIIURTQAJHAT-GUBZILKMSA-N Asp-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 BKOIIURTQAJHAT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OZHXXYOHPLLLMI-CIUDSAMLSA-N Cys-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OZHXXYOHPLLLMI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- BTSPOOHJBYJRKO-CIUDSAMLSA-N Gln-Asp-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O BTSPOOHJBYJRKO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- FQCILXROGNOZON-YUMQZZPRSA-N Gln-Pro-Gly Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O FQCILXROGNOZON-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- UBRQJXFDVZNYJP-AVGNSLFASA-N Gln-Tyr-Ser Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O UBRQJXFDVZNYJP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- IESFZVCAVACGPH-PEFMBERDSA-N Glu-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O IESFZVCAVACGPH-PEFMBERDSA-N 0.000 description 2
- HNVFSTLPVJWIDV-CIUDSAMLSA-N Glu-Glu-Gln Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O HNVFSTLPVJWIDV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- IVGJYOOGJLFKQE-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N IVGJYOOGJLFKQE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- ALMBZBOCGSVSAI-ACZMJKKPSA-N Glu-Ser-Asn Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N ALMBZBOCGSVSAI-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N Glu-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- MFYLRRCYBBJYPI-JYJNAYRXSA-N Glu-Tyr-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O MFYLRRCYBBJYPI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- OGCIHJPYKVSMTE-YUMQZZPRSA-N Gly-Arg-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OGCIHJPYKVSMTE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- XBWMTPAIUQIWKA-BYULHYEWSA-N Gly-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CN XBWMTPAIUQIWKA-BYULHYEWSA-N 0.000 description 2
- BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N Gly-Gln-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- GNPVTZJUUBPZKW-WDSKDSINSA-N Gly-Gln-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GNPVTZJUUBPZKW-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N Gly-Glu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N Gly-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 2
- MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N Gly-Leu-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N Gly-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N Gly-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)CN)O WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N 0.000 description 2
- NVTPVQLIZCOJFK-FOHZUACHSA-N Gly-Thr-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NVTPVQLIZCOJFK-FOHZUACHSA-N 0.000 description 2
- ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- IROABALAWGJQGM-OALUTQOASA-N Gly-Trp-Tyr Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CC=C(C=C3)O)C(=O)O)NC(=O)CN IROABALAWGJQGM-OALUTQOASA-N 0.000 description 2
- GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N Gly-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)CN)O GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JDAWAWXGAUZPNJ-ZPFDUUQYSA-N Ile-Glu-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N JDAWAWXGAUZPNJ-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- HXWALXSAVBLTPK-NUTKFTJISA-N Leu-Ala-Trp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N HXWALXSAVBLTPK-NUTKFTJISA-N 0.000 description 2
- PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- AXZGZMGRBDQTEY-SRVKXCTJSA-N Leu-Gln-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O AXZGZMGRBDQTEY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N Leu-Gln-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N1CCCC1C(O)=O CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GPICTNQYKHHHTH-GUBZILKMSA-N Leu-Gln-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GPICTNQYKHHHTH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N Leu-Ser-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- MVJRBCJCRYGCKV-GVXVVHGQSA-N Leu-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MVJRBCJCRYGCKV-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N Leu-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N Lys-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- WQDKIVRHTQYJSN-DCAQKATOSA-N Lys-Ser-Arg Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N WQDKIVRHTQYJSN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- MIFFFXHMAHFACR-KATARQTJSA-N Lys-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN MIFFFXHMAHFACR-KATARQTJSA-N 0.000 description 2
- DLCAXBGXGOVUCD-PPCPHDFISA-N Lys-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O DLCAXBGXGOVUCD-PPCPHDFISA-N 0.000 description 2
- UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N Lys-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- SJDQOYTYNGZZJX-SRVKXCTJSA-N Met-Glu-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SJDQOYTYNGZZJX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- SPSSJSICDYYTQN-HJGDQZAQSA-N Met-Thr-Gln Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O SPSSJSICDYYTQN-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- CUMXHKAOHNWRFQ-BZSNNMDCSA-N Phe-Asp-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CUMXHKAOHNWRFQ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- JDMKQHSHKJHAHR-UHFFFAOYSA-N Phe-Phe-Leu-Tyr Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)CC1=CC=CC=C1 JDMKQHSHKJHAHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XNMYNGDKJNOKHH-BZSNNMDCSA-N Phe-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O XNMYNGDKJNOKHH-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- RAGOJJCBGXARPO-XVSYOHENSA-N Phe-Thr-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RAGOJJCBGXARPO-XVSYOHENSA-N 0.000 description 2
- FGWUALWGCZJQDJ-URLPEUOOSA-N Phe-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FGWUALWGCZJQDJ-URLPEUOOSA-N 0.000 description 2
- KLYYKKGCPOGDPE-OEAJRASXSA-N Phe-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KLYYKKGCPOGDPE-OEAJRASXSA-N 0.000 description 2
- OOLOTUZJUBOMAX-GUBZILKMSA-N Pro-Ala-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OOLOTUZJUBOMAX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N Pro-Arg-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- TUYWCHPXKQTISF-LPEHRKFASA-N Pro-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O TUYWCHPXKQTISF-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- FCRMLGJMPXCAHD-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FCRMLGJMPXCAHD-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- QFBNNYNWKYKVJO-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N QFBNNYNWKYKVJO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- OYEDZGNMSBZCIM-XGEHTFHBSA-N Ser-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OYEDZGNMSBZCIM-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- WXUBSIDKNMFAGS-IHRRRGAJSA-N Ser-Arg-Tyr Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WXUBSIDKNMFAGS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- ZOHGLPQGEHSLPD-FXQIFTODSA-N Ser-Gln-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZOHGLPQGEHSLPD-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- MQQBBLVOUUJKLH-HJPIBITLSA-N Ser-Ile-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MQQBBLVOUUJKLH-HJPIBITLSA-N 0.000 description 2
- QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N Ser-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- GJFYFGOEWLDQGW-GUBZILKMSA-N Ser-Leu-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N GJFYFGOEWLDQGW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N Ser-Tyr-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N Ser-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N Thr-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 2
- ASJDFGOPDCVXTG-KATARQTJSA-N Thr-Cys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ASJDFGOPDCVXTG-KATARQTJSA-N 0.000 description 2
- FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N Thr-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 2
- GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N Thr-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 2
- KZSYAEWQMJEGRZ-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KZSYAEWQMJEGRZ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- BIBYEFRASCNLAA-CDMKHQONSA-N Thr-Phe-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 BIBYEFRASCNLAA-CDMKHQONSA-N 0.000 description 2
- BEZTUFWTPVOROW-KJEVXHAQSA-N Thr-Tyr-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O BEZTUFWTPVOROW-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 2
- ABCLYRRGTZNIFU-BWAGICSOSA-N Thr-Tyr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O ABCLYRRGTZNIFU-BWAGICSOSA-N 0.000 description 2
- YOPQYBJJNSIQGZ-JNPHEJMOSA-N Thr-Tyr-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 YOPQYBJJNSIQGZ-JNPHEJMOSA-N 0.000 description 2
- QNXZCKMXHPULME-ZNSHCXBVSA-N Thr-Val-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O QNXZCKMXHPULME-ZNSHCXBVSA-N 0.000 description 2
- SVGAWGVHFIYAEE-JSGCOSHPSA-N Trp-Gly-Gln Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 SVGAWGVHFIYAEE-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 2
- SCCKSNREWHMKOJ-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asn-Ser Chemical compound N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SCCKSNREWHMKOJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- QOIKZODVIPOPDD-AVGNSLFASA-N Tyr-Cys-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QOIKZODVIPOPDD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- QHEGAOPHISYNDF-XDTLVQLUSA-N Tyr-Gln-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N QHEGAOPHISYNDF-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 2
- QUILOGWWLXMSAT-IHRRRGAJSA-N Tyr-Gln-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QUILOGWWLXMSAT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N Tyr-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- MQGGXGKQSVEQHR-KKUMJFAQSA-N Tyr-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 MQGGXGKQSVEQHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- HZDQUVQEVVYDDA-ACRUOGEOSA-N Tyr-Tyr-Leu Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HZDQUVQEVVYDDA-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 2
- PYXQBKJPHNCTNW-CYDGBPFRSA-N Val-Ile-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N PYXQBKJPHNCTNW-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 2
- ZXYPHBKIZLAQTL-QXEWZRGKSA-N Val-Pro-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N ZXYPHBKIZLAQTL-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 2
- JQTYTBPCSOAZHI-FXQIFTODSA-N Val-Ser-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N JQTYTBPCSOAZHI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- OWFGFHQMSBTKLX-UFYCRDLUSA-N Val-Tyr-Tyr Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O)N OWFGFHQMSBTKLX-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 2
- LLJLBRRXKZTTRD-GUBZILKMSA-N Val-Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N LLJLBRRXKZTTRD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 2
- 108010052670 arginyl-glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000005315 distribution function Methods 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 2
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010050475 glycyl-leucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 2
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- NRNCYVBFPDDJNE-UHFFFAOYSA-N pemoline Chemical compound O1C(N)=NC(=O)C1C1=CC=CC=C1 NRNCYVBFPDDJNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 108010070409 phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010020755 prolyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 2
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 108010048397 seryl-lysyl-leucine Proteins 0.000 description 2
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- IESDGNYHXIOKRW-YXMSTPNBSA-N (2s)-2-[[(2s)-1-[(2s)-6-amino-2-[[(2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanoyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O IESDGNYHXIOKRW-YXMSTPNBSA-N 0.000 description 1
- DIBLBAURNYJYBF-XLXZRNDBSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]hexanoyl]amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 DIBLBAURNYJYBF-XLXZRNDBSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- WCBVQNZTOKJWJS-ACZMJKKPSA-N Ala-Cys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WCBVQNZTOKJWJS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- DYJJJCHDHLEFDW-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N DYJJJCHDHLEFDW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- IORKCNUBHNIMKY-CIUDSAMLSA-N Ala-Pro-Glu Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IORKCNUBHNIMKY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QPOARHANPULOTM-GMOBBJLQSA-N Arg-Asn-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N QPOARHANPULOTM-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- JAYIQMNQDMOBFY-KKUMJFAQSA-N Arg-Glu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JAYIQMNQDMOBFY-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- GOWZVQXTHUCNSQ-NHCYSSNCSA-N Arg-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GOWZVQXTHUCNSQ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- CVXXSWQORBZAAA-SRVKXCTJSA-N Arg-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N CVXXSWQORBZAAA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- NPAVRDPEFVKELR-DCAQKATOSA-N Arg-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NPAVRDPEFVKELR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LRPZJPMQGKGHSG-XGEHTFHBSA-N Arg-Ser-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O LRPZJPMQGKGHSG-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N Arg-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N Asn-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N Asn-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- WQLJRNRLHWJIRW-KKUMJFAQSA-N Asn-His-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O WQLJRNRLHWJIRW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- NYGILGUOUOXGMJ-YUMQZZPRSA-N Asn-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O NYGILGUOUOXGMJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- RBOBTTLFPRSXKZ-BZSNNMDCSA-N Asn-Phe-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O RBOBTTLFPRSXKZ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N Asn-Ser-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- LGCVSPFCFXWUEY-IHPCNDPISA-N Asn-Trp-Tyr Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CC=C(C=C3)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LGCVSPFCFXWUEY-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- KBQOUDLMWYWXNP-YDHLFZDLSA-N Asn-Val-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N KBQOUDLMWYWXNP-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- UQBGYPFHWFZMCD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O UQBGYPFHWFZMCD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- HSWYMWGDMPLTTH-FXQIFTODSA-N Asp-Glu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O HSWYMWGDMPLTTH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WSGVTKZFVJSJOG-RCOVLWMOSA-N Asp-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O WSGVTKZFVJSJOG-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- KTTCQQNRRLCIBC-GHCJXIJMSA-N Asp-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KTTCQQNRRLCIBC-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- CYCKJEFVFNRWEZ-UGYAYLCHSA-N Asp-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CYCKJEFVFNRWEZ-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 1
- UZFHNLYQWMGUHU-DCAQKATOSA-N Asp-Lys-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UZFHNLYQWMGUHU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VNXQRBXEQXLERQ-CIUDSAMLSA-N Asp-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N VNXQRBXEQXLERQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YIDFBWRHIYOYAA-LKXGYXEUSA-N Asp-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O YIDFBWRHIYOYAA-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- YUELDQUPTAYEGM-XIRDDKMYSA-N Asp-Trp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N YUELDQUPTAYEGM-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- SQIARYGNVQWOSB-BZSNNMDCSA-N Asp-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SQIARYGNVQWOSB-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- NDUSUIGBMZCOIL-ZKWXMUAHSA-N Cys-Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CS)N NDUSUIGBMZCOIL-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- ZXCAQANTQWBICD-DCAQKATOSA-N Cys-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CS)N ZXCAQANTQWBICD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- SMEYEQDCCBHTEF-FXQIFTODSA-N Cys-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SMEYEQDCCBHTEF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- KSMSFCBQBQPFAD-GUBZILKMSA-N Cys-Pro-Pro Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 KSMSFCBQBQPFAD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ALTQTAKGRFLRLR-GUBZILKMSA-N Cys-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N ALTQTAKGRFLRLR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHERTACNJPYHAR-ACZMJKKPSA-N Gln-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O SHERTACNJPYHAR-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- DHNWZLGBTPUTQQ-QEJZJMRPSA-N Gln-Asp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N DHNWZLGBTPUTQQ-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N Gln-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- KCJJFESQRXGTGC-BQBZGAKWSA-N Gln-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KCJJFESQRXGTGC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FGYPOQPQTUNESW-IUCAKERBSA-N Gln-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N FGYPOQPQTUNESW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- AQPZYBSRDRZBAG-AVGNSLFASA-N Gln-Phe-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N AQPZYBSRDRZBAG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- HMIXCETWRYDVMO-GUBZILKMSA-N Gln-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HMIXCETWRYDVMO-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JILRMFFFCHUUTJ-ACZMJKKPSA-N Gln-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JILRMFFFCHUUTJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- BYKZWDGMJLNFJY-XKBZYTNZSA-N Gln-Ser-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O BYKZWDGMJLNFJY-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- XKPACHRGOWQHFH-IRIUXVKKSA-N Gln-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O XKPACHRGOWQHFH-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 1
- FITIQFSXXBKFFM-NRPADANISA-N Gln-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FITIQFSXXBKFFM-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- RCCDHXSRMWCOOY-GUBZILKMSA-N Glu-Arg-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O RCCDHXSRMWCOOY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GLWXKFRTOHKGIT-ACZMJKKPSA-N Glu-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GLWXKFRTOHKGIT-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- YLJHCWNDBKKOEB-IHRRRGAJSA-N Glu-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O YLJHCWNDBKKOEB-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- YHOJJFFTSMWVGR-HJGDQZAQSA-N Glu-Met-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O YHOJJFFTSMWVGR-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- AAJHGGDRKHYSDH-GUBZILKMSA-N Glu-Pro-Gln Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O AAJHGGDRKHYSDH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- NNQDRRUXFJYCCJ-NHCYSSNCSA-N Glu-Pro-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NNQDRRUXFJYCCJ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- QOXDAWODGSIDDI-GUBZILKMSA-N Glu-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N QOXDAWODGSIDDI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DMYACXMQUABZIQ-NRPADANISA-N Glu-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DMYACXMQUABZIQ-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- ZALGPUWUVHOGAE-GVXVVHGQSA-N Glu-Val-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZALGPUWUVHOGAE-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N Glu-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- XCLCVBYNGXEVDU-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XCLCVBYNGXEVDU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- GRIRDMVMJJDZKV-RCOVLWMOSA-N Gly-Asn-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GRIRDMVMJJDZKV-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- IXKRSKPKSLXIHN-YUMQZZPRSA-N Gly-Cys-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IXKRSKPKSLXIHN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- PABFFPWEJMEVEC-JGVFFNPUSA-N Gly-Gln-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)CN)C(=O)O PABFFPWEJMEVEC-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- BIRKKBCSAIHDDF-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O BIRKKBCSAIHDDF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- UUYBFNKHOCJCHT-VHSXEESVSA-N Gly-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN UUYBFNKHOCJCHT-VHSXEESVSA-N 0.000 description 1
- AFWYPMDMDYCKMD-KBPBESRZSA-N Gly-Leu-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 AFWYPMDMDYCKMD-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- JSLVAHYTAJJEQH-QWRGUYRKSA-N Gly-Ser-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JSLVAHYTAJJEQH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- CQMFNTVQVLQRLT-JHEQGTHGSA-N Gly-Thr-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O CQMFNTVQVLQRLT-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- QZAFGJNKLMNDEM-DCAQKATOSA-N His-Asn-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 QZAFGJNKLMNDEM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- TVMNTHXFRSXZGR-IHRRRGAJSA-N His-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TVMNTHXFRSXZGR-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ALPXXNRQBMRCPZ-MEYUZBJRSA-N His-Thr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ALPXXNRQBMRCPZ-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- MKWSZEHGHSLNPF-NAKRPEOUSA-N Ile-Ala-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N MKWSZEHGHSLNPF-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- NZGTYCMLUGYMCV-XUXIUFHCSA-N Ile-Lys-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N NZGTYCMLUGYMCV-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- FXJLRZFMKGHYJP-CFMVVWHZSA-N Ile-Tyr-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N FXJLRZFMKGHYJP-CFMVVWHZSA-N 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N Leu-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QJUWBDPGGYVRHY-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N QJUWBDPGGYVRHY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N Leu-Gly-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- HYMLKESRWLZDBR-WEDXCCLWSA-N Leu-Gly-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HYMLKESRWLZDBR-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- BKTXKJMNTSMJDQ-AVGNSLFASA-N Leu-His-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N BKTXKJMNTSMJDQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- IAJFFZORSWOZPQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IAJFFZORSWOZPQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VCHVSKNMTXWIIP-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VCHVSKNMTXWIIP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AUNMOHYWTAPQLA-XUXIUFHCSA-N Leu-Met-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O AUNMOHYWTAPQLA-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- UHNQRAFSEBGZFZ-YESZJQIVSA-N Leu-Phe-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N UHNQRAFSEBGZFZ-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N Leu-Ser-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N Leu-Val-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- MPGHETGWWWUHPY-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN MPGHETGWWWUHPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WSXTWLJHTLRFLW-SRVKXCTJSA-N Lys-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O WSXTWLJHTLRFLW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- NTSPQIONFJUMJV-AVGNSLFASA-N Lys-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NTSPQIONFJUMJV-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- YKIRNDPUWONXQN-GUBZILKMSA-N Lys-Asn-Gln Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N YKIRNDPUWONXQN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KWUKZRFFKPLUPE-HJGDQZAQSA-N Lys-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KWUKZRFFKPLUPE-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- VQXAVLQBQJMENB-SRVKXCTJSA-N Lys-Glu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O VQXAVLQBQJMENB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XNKDCYABMBBEKN-IUCAKERBSA-N Lys-Gly-Gln Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O XNKDCYABMBBEKN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- PBLLTSKBTAHDNA-KBPBESRZSA-N Lys-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PBLLTSKBTAHDNA-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- AFLBTVGQCQLOFJ-AVGNSLFASA-N Lys-Pro-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O AFLBTVGQCQLOFJ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- IOQWIOPSKJOEKI-SRVKXCTJSA-N Lys-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IOQWIOPSKJOEKI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- CAVRAQIDHUPECU-UVOCVTCTSA-N Lys-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CAVRAQIDHUPECU-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- QLFAPXUXEBAWEK-NHCYSSNCSA-N Lys-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QLFAPXUXEBAWEK-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- XABXVVSWUVCZST-GVXVVHGQSA-N Lys-Val-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XABXVVSWUVCZST-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- GILLQRYAWOMHED-DCAQKATOSA-N Lys-Val-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN GILLQRYAWOMHED-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- HXSUFWQYLPKEHF-IHRRRGAJSA-N Phe-Asn-Arg Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N HXSUFWQYLPKEHF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- BWTKUQPNOMMKMA-FIRPJDEBSA-N Phe-Ile-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 BWTKUQPNOMMKMA-FIRPJDEBSA-N 0.000 description 1
- SMFGCTXUBWEPKM-KBPBESRZSA-N Phe-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 SMFGCTXUBWEPKM-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- MSHZERMPZKCODG-ACRUOGEOSA-N Phe-Leu-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 MSHZERMPZKCODG-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- WWPAHTZOWURIMR-ULQDDVLXSA-N Phe-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WWPAHTZOWURIMR-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- IIEOLPMQYRBZCN-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Cys Chemical compound N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O IIEOLPMQYRBZCN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HQVPQXMCQKXARZ-FXQIFTODSA-N Pro-Cys-Ser Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O HQVPQXMCQKXARZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- UAYHMOIGIQZLFR-NHCYSSNCSA-N Pro-Gln-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UAYHMOIGIQZLFR-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- WFHYFCWBLSKEMS-KKUMJFAQSA-N Pro-Glu-Phe Chemical compound N([C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 WFHYFCWBLSKEMS-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- LGSANCBHSMDFDY-GARJFASQSA-N Pro-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O LGSANCBHSMDFDY-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- VPEVBAUSTBWQHN-NHCYSSNCSA-N Pro-Glu-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VPEVBAUSTBWQHN-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ZLXKLMHAMDENIO-DCAQKATOSA-N Pro-Lys-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZLXKLMHAMDENIO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ULWBBFKQBDNGOY-RWMBFGLXSA-N Pro-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O ULWBBFKQBDNGOY-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- CGSOWZUPLOKYOR-AVGNSLFASA-N Pro-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 CGSOWZUPLOKYOR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- PCWLNNZTBJTZRN-AVGNSLFASA-N Pro-Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 PCWLNNZTBJTZRN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KBUAPZAZPWNYSW-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 KBUAPZAZPWNYSW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OWQXAJQZLWHPBH-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OWQXAJQZLWHPBH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- GMJDSFYVTAMIBF-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GMJDSFYVTAMIBF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SEZGGSHLMROBFX-CIUDSAMLSA-N Pro-Ser-Gln Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O SEZGGSHLMROBFX-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BGWKULMLUIUPKY-BQBZGAKWSA-N Pro-Ser-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 BGWKULMLUIUPKY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- UEJYSALTSUZXFV-SRVKXCTJSA-N Rigin Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O UEJYSALTSUZXFV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- QVOGDCQNGLBNCR-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O QVOGDCQNGLBNCR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- VGNYHOBZJKWRGI-CIUDSAMLSA-N Ser-Asn-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO VGNYHOBZJKWRGI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UGJRQLURDVGULT-LKXGYXEUSA-N Ser-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O UGJRQLURDVGULT-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- MOVJSUIKUNCVMG-ZLUOBGJFSA-N Ser-Cys-Ser Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)O MOVJSUIKUNCVMG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- VQBCMLMPEWPUTB-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VQBCMLMPEWPUTB-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N Ser-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- DJACUBDEDBZKLQ-KBIXCLLPSA-N Ser-Ile-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DJACUBDEDBZKLQ-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- GZSZPKSBVAOGIE-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GZSZPKSBVAOGIE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XUDRHBPSPAPDJP-SRVKXCTJSA-N Ser-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CO XUDRHBPSPAPDJP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HHJFMHQYEAAOBM-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HHJFMHQYEAAOBM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- CUXJENOFJXOSOZ-BIIVOSGPSA-N Ser-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O CUXJENOFJXOSOZ-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- VGQVAVQWKJLIRM-FXQIFTODSA-N Ser-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VGQVAVQWKJLIRM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N Ser-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- PCJLFYBAQZQOFE-KATARQTJSA-N Ser-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PCJLFYBAQZQOFE-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- RCOUFINCYASMDN-GUBZILKMSA-N Ser-Val-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O RCOUFINCYASMDN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HSWXBJCBYSWBPT-GUBZILKMSA-N Ser-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)C(O)=O HSWXBJCBYSWBPT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DWYAUVCQDTZIJI-VZFHVOOUSA-N Thr-Ala-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWYAUVCQDTZIJI-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N Thr-Arg-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- ODSAPYVQSLDRSR-LKXGYXEUSA-N Thr-Cys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ODSAPYVQSLDRSR-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- DSLHSTIUAPKERR-XGEHTFHBSA-N Thr-Cys-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DSLHSTIUAPKERR-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- VUVCRYXYUUPGSB-GLLZPBPUSA-N Thr-Gln-Glu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N)O VUVCRYXYUUPGSB-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 1
- GKWNLDNXMMLRMC-GLLZPBPUSA-N Thr-Glu-Gln Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N)O GKWNLDNXMMLRMC-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 1
- FIFDDJFLNVAVMS-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Met Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O FIFDDJFLNVAVMS-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- NCXVJIQMWSGRHY-KXNHARMFSA-N Thr-Leu-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O NCXVJIQMWSGRHY-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N Thr-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- BDGBHYCAZJPLHX-HJGDQZAQSA-N Thr-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BDGBHYCAZJPLHX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- JLNMFGCJODTXDH-WEDXCCLWSA-N Thr-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O JLNMFGCJODTXDH-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- DXPURPNJDFCKKO-RHYQMDGZSA-N Thr-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(O)=O DXPURPNJDFCKKO-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- MROIJTGJGIDEEJ-RCWTZXSCSA-N Thr-Pro-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 MROIJTGJGIDEEJ-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- XHWCDRUPDNSDAZ-XKBZYTNZSA-N Thr-Ser-Glu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N)O XHWCDRUPDNSDAZ-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- SGAOHNPSEPVAFP-ZDLURKLDSA-N Thr-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SGAOHNPSEPVAFP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- LVRFMARKDGGZMX-IZPVPAKOSA-N Thr-Tyr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LVRFMARKDGGZMX-IZPVPAKOSA-N 0.000 description 1
- OGOYMQWIWHGTGH-KZVJFYERSA-N Thr-Val-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OGOYMQWIWHGTGH-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- UKINEYBQXPMOJO-UBHSHLNASA-N Trp-Asn-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N UKINEYBQXPMOJO-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- VTHNLRXALGUDBS-BPUTZDHNSA-N Trp-Gln-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N VTHNLRXALGUDBS-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- NLWCSMOXNKBRLC-WDSOQIARSA-N Trp-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NLWCSMOXNKBRLC-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- UIRVSEPRMWDVEW-RNXOBYDBSA-N Trp-Tyr-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CC3=CNC4=CC=CC=C43)N UIRVSEPRMWDVEW-RNXOBYDBSA-N 0.000 description 1
- SSSDKJMQMZTMJP-BVSLBCMMSA-N Trp-Tyr-Val Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CC=C(O)C=C1 SSSDKJMQMZTMJP-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- SLCSPPCQWUHPPO-JYJNAYRXSA-N Tyr-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 SLCSPPCQWUHPPO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- NMKJPMCEKQHRPD-IRXDYDNUSA-N Tyr-Gly-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 NMKJPMCEKQHRPD-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- BSCBBPKDVOZICB-KKUMJFAQSA-N Tyr-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BSCBBPKDVOZICB-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- SINRIKQYQJRGDQ-MEYUZBJRSA-N Tyr-Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 SINRIKQYQJRGDQ-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- WURLIFOWSMBUAR-SLFFLAALSA-N Tyr-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N)C(=O)O WURLIFOWSMBUAR-SLFFLAALSA-N 0.000 description 1
- YYLHVUCSTXXKBS-IHRRRGAJSA-N Tyr-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYLHVUCSTXXKBS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- GQVZBMROTPEPIF-SRVKXCTJSA-N Tyr-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GQVZBMROTPEPIF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- NHOVZGFNTGMYMI-KKUMJFAQSA-N Tyr-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NHOVZGFNTGMYMI-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- RIVVDNTUSRVTQT-IRIUXVKKSA-N Tyr-Thr-Gln Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O RIVVDNTUSRVTQT-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 1
- GPLTZEMVOCZVAV-UFYCRDLUSA-N Tyr-Tyr-Arg Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 GPLTZEMVOCZVAV-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- OJCISMMNNUNNJA-BZSNNMDCSA-N Tyr-Tyr-Asp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 OJCISMMNNUNNJA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- QHDXUYOYTPWCSK-RCOVLWMOSA-N Val-Asp-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N QHDXUYOYTPWCSK-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- SCBITHMBEJNRHC-LSJOCFKGSA-N Val-Asp-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N SCBITHMBEJNRHC-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- JXGWQYWDUOWQHA-DZKIICNBSA-N Val-Gln-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N JXGWQYWDUOWQHA-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- OQWNEUXPKHIEJO-NRPADANISA-N Val-Glu-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N OQWNEUXPKHIEJO-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- RKIGNDAHUOOIMJ-BQFCYCMXSA-N Val-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 RKIGNDAHUOOIMJ-BQFCYCMXSA-N 0.000 description 1
- UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N Val-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- ZIGZPYJXIWLQFC-QTKMDUPCSA-N Val-His-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O ZIGZPYJXIWLQFC-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- XTDDIVQWDXMRJL-IHRRRGAJSA-N Val-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N XTDDIVQWDXMRJL-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N Val-Leu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- KTEZUXISLQTDDQ-NHCYSSNCSA-N Val-Lys-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N KTEZUXISLQTDDQ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- SBJCTAZFSZXWSR-AVGNSLFASA-N Val-Met-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N SBJCTAZFSZXWSR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- RYHUIHUOYRNNIE-NRPADANISA-N Val-Ser-Gln Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N RYHUIHUOYRNNIE-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N Val-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- TVGWMCTYUFBXAP-QTKMDUPCSA-N Val-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O TVGWMCTYUFBXAP-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- GVNLOVJNNDZUHS-RHYQMDGZSA-N Val-Thr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O GVNLOVJNNDZUHS-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- BGTDGENDNWGMDQ-KJEVXHAQSA-N Val-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O BGTDGENDNWGMDQ-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- ZLNYBMWGPOKSLW-LSJOCFKGSA-N Val-Val-Asp Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZLNYBMWGPOKSLW-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- ZHWZDZFWBXWPDW-GUBZILKMSA-N Val-Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O ZHWZDZFWBXWPDW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010009111 arginyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 238000003705 background correction Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010013768 glutamyl-aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010074027 glycyl-seryl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 108010024654 phenylalanyl-prolyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000020971 positive regulation of blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 108010069117 seryl-lysyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012799 strong cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010071635 tyrosyl-prolyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 108010052774 valyl-lysyl-glycyl-phenylalanyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- FEPMHVLSLDOMQC-UHFFFAOYSA-N virginiamycin-S1 Natural products CC1OC(=O)C(C=2C=CC=CC=2)NC(=O)C2CC(=O)CCN2C(=O)C(CC=2C=CC=CC=2)N(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(CC)NC(=O)C1NC(=O)C1=NC=CC=C1O FEPMHVLSLDOMQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000012784 weak cation exchange Methods 0.000 description 1
- 108010027345 wheylin-1 peptide Proteins 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к вариантам эмицизумаба с пониженной активностью миметика фактора свертывания крови VIII (FVIII), и может быть использовано для снижения содержания примеси при рекомбинантном получении эмицизумаба. Предложенный Q-CDR-усеченный вариант эмицизумаба характеризуется удалением аминокислотного остатка R в положении 12 с N-терминального конца последовательности CDR2 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2 и расщеплением вариабельной области по сайту делеции. Изобретение обеспечивает получение препарата эмицизумаба с низким содержанием указанного варианта в клетках СНО. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 9 ил , 10 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к вариантам и изоформам антител с пониженной биологической активностью. Например, настоящее изобретение относится к вариантам антитела и изоформам эмицизумаба, вариантам и изоформам антител, имеющим пониженную активность в качестве миметиков фактора свертывания крови VIII (FVIII). Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим такой вариант или изоформу антитела, содержание которых находится на низком уровне. Настоящее изобретение также относится к способам обнаружения и способам анализа вариантов и изоформ антител.
Предшествующий уровень техники
Антитела привлекают внимание как фармацевтические препараты, поскольку они высоко стабильны в плазме и имеют мало побочных эффектов. Ряд таких фармацевтических препаратов на основе антител типа IgG есть в продаже, кроме того, в настоящее время также разрабатывают много фармацевтических препаратов на основе антител (см. NPL 1, 2 и 3).
Гемофилия А - это заболевание, связанное с аномальным кровотечением, вызванное наследственным снижением или дефицитом функции VIII. Пациентам с гемофилией А обычно назначают препарат FVIII для лечения кровотечений (введение по необходимости). В последние годы препараты FVIII также вводят профилактически для предотвращения кровотечений (профилактическое введение; см. NPL 1 и 2). Период полураспада препаратов FVIII в крови составляет примерно от 12 до 16 ч. Следовательно, для непрерывной профилактики препараты FVIII вводят пациентам три раза в неделю (NPL 3 и 4). При введении по необходимости препараты FVIII также дополнительно вводят, если это требуется, с интервалами чтобы предотвратить повторное кровотечение. Кроме того, составы FVIII вводят внутривенно. Следовательно, существует острая потребность в фармацевтических агентах с меньшим обременением при введении по сравнению с препаратами FVIII.
Иногда антитела против FVIII (ингибиторы) возникают у пациентов с гемофилией. Такие ингибиторы противодействуют препаратам FVIII. При кровотечениях пациентам, у которых сформировались ингибиторы (пациенты с ингибиторами), вводят шунтирующие агенты. Механизмы их действия не зависят от функции FVIII, то есть от функции катализа активации фактора свертывания крови X (FX) активированным фактором свертывания крови IX (FIXa). Поэтому в некоторых случаях шунтирующие агенты не могут в достаточной степени остановить кровотечение. Соответственно, существует сильная потребность в фармацевтических агентах, которые не подвержены влиянию ингибиторов и которые функционально заменяют FVIII.
В качестве средства решения проблемы сообщают о биспецифических антителах, которые функционально замещают FVIII и которые могут быть применимы (PTL 1, 2, 3 и 4). Биспецифические антитела против FIXa и FX могут функционально заменить FVIII путем расположения двух факторов близко друг к другу для проявления активности в качестве миметика FVIII (NPL 5). Установлено, что активность антител в качестве миметиков FVIII может быть повышена путем оптимизации сродства к FIXa и FX (NPL 6). Было обнаружено, что эмицизумаб (АСЕ910), обладающий высокой активностью в качестве миметика FVIII и являющийся одним из этих антител, проявляет гемостатические эффекты на моделях гемофилии у обезьян (NPL 7 и 8); в связи с этим открытием, клинические испытания начали проводить на пациентах с гемофилией А.
Цитируемые источники
Патентная литература:
[PTL 1] WO 2005/035754
[PTL 2] WO 2005/035756
[PTL 3] WO 2006/109592
[PTL 4] WO 2012/067176
Научные публикации:
[NPL 1] Blood 58, 1981, 1-13.
[NPL 2] Nature 312, 1984, 330-337.
[NPL 3] Nature 312, 1984, 337-342.
[NPL 4] Biochim.Biophys.Acta 871, 1986, 268-278.
[NPL 5] Nat Med. 18(10), 2012, 1570-1574.
[NPL 6] PLoS One. 8(2), 2013e57479.
[NPL 7]J Thromb Haemost 12(2), 2014, 206-213.
[NPL 8] Blood. 124(20), 2014, 3165-3171.
[NPL 9] J. Appl. Cryst. 13, 1980, 577-584.
[NPL 10] IUCrJ. 2, 2015, 9-18.
Краткое описание изобретения
Технические проблемы
Настоящее изобретение было достигнуто с учетом вышеуказанных обстоятельств. Целью настоящего изобретения является предоставление вариантов или изоформ антител с пониженной активностью миметика FVIII.
Решение проблемы
В настоящем изобретении проведено специальное исследование для решения описанных выше проблем, в результате чего были идентифицированы варианты и изоформы антитела, которые включают в фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного ингредиента эмицизумаб. В настоящем изобретении также установлено, что активность этих вариантов и изоформ антитела в качестве миметика FVIII является довольно низкой по сравнению с активностью эмицизумаба.
Настоящее изобретение основано на этих результатах и представлено ниже в п.п. с [1] по [21].
[1] Вариант антитела, содержащий вариабельную область, которая включает аминокислотную последовательность SISPSGQSTYYRREVKG (SEQ ID NO: 2), где
(а) аминокислотный остаток R в 12 м положении с N-конца последовательности (61е положение с N-конца цепи Q эмицизумаба: положение 60 согласно нумерации по Kabat) или
(б) аминокислотные остатки YYR в положениях 10-12 от N-конца последовательности (положения 59-61 с N-конца цепи Q эмицизумаба: положения 59-61 согласно нумерации по Kabat) делетированы и вариабельная область расщеплена по сайту делеции.
[2] Вариант антитела по п. [1], в котором последовательность является последовательностью CDR.
[3] Вариант антитела по п. [1], в котором последовательность является последовательностью CDR2.
[4] Вариант антитела по п. [1], в котором последовательность является последовательностью, входящей в тяжелую цепь.
[5] Вариант антитела по п. [1], который является вариантом биспецифического антитела.
[6] Вариант антитела по п. [1], который является вариантом эмицизумаба.
[7] Способ обнаружения варианта антитела по п.п. [1]-[6], включающий стадию разделения образца, содержащего антитело, которое содержит вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность SISPSGQSTYYRREVKG (SEQ ID NO: 2), с помощью аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, нормально-фазовой хроматографии, хроматографии с обращенной фазой, хроматографии гидрофильных взаимодействия (hydrophilic interaction chromatography, HILIC), хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), на основе заряда, эксклюзионной хроматографии (size exclusion chromatography, SEC), гель-проникающей хроматографии (gel permeation chromatography, GPC) или их комбинаций.
[8] Способ обнаружения по п. [7], в котором применяют вариант антитела по п.п. [1]-[6] в качестве контрольного стандарта.
[8-2] Способ обнаружения по п. [8], включающий стадию проведения одного или нескольких анализов, выбранных из группы, состоящей из количественного анализа, качественного анализа и структурного анализа.
[9] Фармацевтическая композиция, включающий вариант антитела по п.п. [1]-[6], где процент варианта антитела от общего числа молекул антитела в фармацевтической композиции составляет 5% или менее.
[10] Фармацевтическая композиция по п. [9], в которой антителом является эмицизумабом.
[11] Фармацевтическая композиция по п. [9], которую получают в процессе очистки, включающем катионообменную хроматографию (cation exchange chromatography, СЕХ).
[12] Способ подавления выработки варианта антитела по п.п. [1] - [6], включающий стадию культивирования клеток, вырабатывающих антитело, при рН 7,1 или более и/или при температуре культивирования 36°С или менее.
[12-2] Способ по п. [12], в котором условия культивирования клеток, вырабатывающих антитело, изменены до рН 7,1 или более и/или температуру культивирования 36°С или менее.
[13] Изоформа биспецифического антитела, содержащая первую тяжелую цепь (цепь Q, SEQ ID NO: 10) и вторую тяжелую цепь (цепь J, SEQ ID NO: 11), где дисульфидные связи формируются следующим образом:
(1а) между цистеином в положении 144 по нумерации EU первой тяжелой цепи (150е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 200 по нумерации EU второй тяжелой цепи (202е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11); и
(1б) между цистеином в положении 200 по нумерации EU первой тяжелой цепи (206е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 144 по нумерации EU второй тяжелой цепи (146е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11), или где дисульфидные связи формируются следующим образом:
(2а) между цистеином в положении 226 по нумерации EU первой тяжелой цепи (229е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 229 по нумерации EU второй тяжелой цепи (228е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11); и
(2б) между цистеином в положении 229 по нумерации EU первой тяжелой цепи (232е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 226 по нумерации EU второй тяжелой цепи (225е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11).
[14] Изоформа биспецифического антитела по п. [13], в которой дисульфидные связи формируются в (1а) и (16).
[15] Изоформа биспецифического антитела, содержащая первую тяжелую цепь (цепь Q, SEQ ID NO: 10) и вторую тяжелую цепь (цепь J, SEQ ID NO: 11), отличающаяся тем, что при разделении элюированием с помощью катионообменной хроматографии она элюируется в области, более щелочной, чем биспецифическое антитело.
[16] Изоформа биспецифического антитела по п.п. с [13] по [15], которая является изоформой эмицизумаба.
[17] Способ обнаружения изоформы антитела по п.п. [13] - [16], включающий стадию разделения образца, содержащего биспецифическое антитело, методом аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, нормально-фазовой хроматографии, хроматографии с обращенной фазой, хроматографии гидрофильного взаимодействия (hydrophilic interaction chromatography, HILIC), хроматографии гидрофобного взаимодействия (hydrophilic interaction chromatography, HIC), разделения на основе заряда, эксклюзионной хроматографии (size exclusion chromatography, SEC), гель-проникающей хроматографии (GPC) или их комбинацией.
[18] Способ обнаружения по п. [17], в котором в качестве контрольного стандарта используют изоформу биспецифического антитела по п.п. [13] - [16].
[18-2] Способ обнаружения по п. [18], включающий стадию проведения одного или нескольких анализов, выбранных из группы, состоящей из количественного анализа, качественного анализа и структурного анализа.
[19] Фармацевтическая композиция, содержащая изоформу биспецифического антитела по п.п. [13] - [16], причем процентное содержание изоформы антитела от общего содержания молекул антитела в фармацевтической композиции составляет 2% или менее.
[20] Способ снижения процентного содержания изоформы биспецифического антитела по п.п. [13]-[16], включающий стадию очистки методом катионообменной хроматографии.
[21] Изоформа или вариант антитела по п.п. [1], [13] или [15], в которых биологическая активность антитела существенно снижена.
[22] Изоформа антитела, имеющего две вариабельные области, каждая из которых распознает разные эпитопы или их производные, причем изоформа имеет среднее значение Rg, которое меньше на 3% или более, предпочтительно на 4% или более, более предпочтительно на 5% или более или, еще более предпочтительно, на 6% или более по отношению к антителу или его производному, и/или изоформа имеет среднее значение Dmax, которое меньше на 5% или более, предпочтительно, на 6% или более, более предпочтительно, на 7% или более, или, еще более предпочтительно, на 7,5% или более по сравнению с антителом или его производным.
[23] Изоформа антитела, имеющая две вариабельные области, каждая из которых распознает разные эпитопы, или его производного, причем изоформа имеет среднее значение Rg, которое меньше на 0,15 нм или более, предпочтительно на 0,2 нм или более, более предпочтительно на 0,25 нм или более, или еще более предпочтительно на 0,3 нм или более относительно антитела или его производного, и/или изоформа имеет среднее значение Dmax, которое меньше на 0,5 нм или более, предпочтительно на 1,0 нм или более, более предпочтительно на 1,2 нм или более, или, еще более предпочтительно, на 1,4 нм или более относительно антитела или его производного.
[24] Изоформа по п.п. [22] или [23], причем изоформа имеет дисульфидную связь (связи), отличающиеся от связей в антителе или его производном.
[25] Изоформа по п.п. [22]-[24], причем антитело или его производное является эмицизумабом (биспецифическим антителом, которое содержит первую тяжелую цепь (цепь Q, SEQ ID NO: 10), вторую тяжелую цепь (цепь J, SEQ ID NO: 11) и общие легкие цепи, каждая из которых формирует пару с первой тяжелой цепью или со второй тяжелой цепью (SEQ ID NO: 12)).
[26] Изоформа эмицизумаба, которая имеет среднее значение Rg 4,9 нм или менее, или предпочтительно 4,8 нм или менее, и/или изоформа имеет среднее значение Dmax 17,0 нм или менее или предпочтительно 16,5 нм или менее.
[27] Изоформа по п.п. [25] или [26], которая содержит дисульфидные связи между цистеином в положении 144 по нумерации EU в первой тяжелой цепи (в положении 150 с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 200 по нумерации EU во второй тяжелой цепи (в положении 202 с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11) и между цистеином в положении 200 по нумерации EU в первой тяжелой цепи (в положении 206 с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 144 по нумерации EU во второй тяжелой цепи (в положении 146 с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11).
[28] Фармацевтическая композиция, включающая эмицизумаб и изоформу по п.п. [22]-[27], в которой процент изоформы от общего содержания молекул антитела в фармацевтической композиции составляет 2% или менее.
[29] Изоформа биспецифического антитела (Q499-z121/J327-z119/L404-k; эмицизумаб), биспецифическое антитело, содержащее первую тяжелую цепь (цепь Q, SEQ ID NO: 10), вторую тяжелую цепь (цепь J, SEQ ID NO: 11) и общие цепи L, каждая из которых образует пару с первой тяжелой цепью или второй тяжелой цепью (SEQ ID NO: 12), причем изоформа имеет отличие в молекулярной структуре от эмицизумаба в аминокислотных остатках от положения 146 согласно нумерации EU для цепи Q до положения 174 согласно нумерации EU для цепи Q (с положения 152 до положения 180 с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и аминокислотные остатки с положения 146 согласно нумерации EU в цепи J до положения 174 согласно нумерации EU для цепи J (с положения 148 до положения 176 с N-конца SEQ ID NO: 11).
[30] Изоформа по п. [29], причем разницу в молекулярной структуре измеряют как разницу в скорости обмена дейтерия (%D) при измерении HDX-MS.
[31] Фармацевтическая композиция, включающая эмицизумаб и изоформу по п.п. [29] или [30], причем процентное содержание изоформы антитела от общего содержания молекул антитела в фармацевтической композиции составляет 2% или менее.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает п.п. [А1]-[А9], представленные ниже.
[А1] Способ обнаружения по п.п. [7] или [17], включающий стадию, на которой образец, содержащий антитело и/или вариант или изоформу антитела, подвергают реакции восстановления, реакции гидролиза (реакции расщепления), реакции денатурации белка или их комбинации.
[А2] Способ обнаружения [А1], в котором реакцию восстановления проводят в мягких условиях восстановления (например, восстановления с помощью DTT в трис-буфере (рН 7,0) при 37°С).
[A3] Способ обнаружения [А1], в котором реакцию гидролиза проводят с использованием сайт-специфичного фермента расщепления (например, специфичной для последовательности протеазы, такой как протеаза IdeS, Lys-C, папаин и т.д.).
[А4] Способ обнаружения по п.п. [7], [17] и [А1] - [A3], включающий стадию разделения образца, содержащего антитело, вариант или изоформу антитела, продукт реакции или их комбинацию, с помощью аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, нормально-фазовой хроматографии, хроматографии с обращенной фазой, хроматографии гидрофильного взаимодействия (hydrophilic interaction chromatography, HILIC), хроматографии гидрофобного взаимодействия (hydrophilic interaction chromatography, HIC), разделения на основе заряда, эксклюзионной хроматографии (size exclusion chromatography, SEC), гель-проникающей хроматографии (GPC) или их комбинации.
[А5] Способ обнаружения по п.п. [8], [18] и [А1]-[А4], включающий стадию анализа методом SE-HPLC, методом динамического рассеяния света (dynamic light scattering, DLS), измерением SAXS, измерением с помощью электронной микроскопии, 3D-моделированием, анализом SPR, анализом HDX MS или их комбинацией.
[А6] Способ контроля качества фармацевтической композиции, содержащей эмицизумаб, включающий этапы [7], [8], [17], [18] или [А1]-[А5] или этап комбинации этих способов.
[А7] Способ получения фармацевтической композиции, содержащей эмицизумаб, включающий стадию способа по п. [А6].
[А8] Способ очистки композиции, содержащей эмицизумаб, отличающийся тем, что он включает стадию катионообменной хроматографии (cation exchange chromatography, СЕХ) в режиме Bind & Elute (Связывание-и-Элюция).
[А9] Способ получения фармацевтической композиции, содержащей эмицизумаб, включающий стадию способа по п. [А8].
Достижения настоящего изобретения
Достижением настоящего изобретения является идентификация вариантов и изоформ антител, которые присутствуют в фармацевтической композиции, содержащей эмицизумаб в качестве активного ингредиента. Также было установлено, что активность этих вариантов и изоформ антител в качестве миметика FVIII является довольно низкой по сравнению с таковой у эмицизумаба. Следовательно, фармацевтические композиции, содержащие эмицизумаб с таким вариантом и изоформой антитела, только при низком содержании, полезны в качестве средства для лечения гемофилии.
Краткое описание фигур
Фиг. 1-1. Фиг. 1А. Результаты разделения лекарственного соединения эмицизумаба методом CE-HPLC. Пик, отмеченный прямоугольником с жирным контуром, указывает на Q-CDR-усеченные варианты.
Фиг. 1-2. Фиг. 1Б. Диаграмма, показывающая молекулярную структуру Q-CDR-усеченных вариантов. Число и буква алфавита под ним на диаграмме указывают положение аминокислотного остатка, подсчитанного от N-конца цепи Q эмицизумаба, и аминокислотного остатка (однобуквенный код) в этом положении, соответственно.
Фиг. 2-1. Фиг. 2А. Результаты разделения лекарственного соединения эмицизумаба методом CE-HPLC. Пик, отмеченный прямоугольником с жирным контуром, указывает на защищенные дисульфидные изоформы.
Фиг. 2-2. Фиг. 2Б. Диаграмма, показывающая молекулярную структуру защищенных дисульфидных изоформ. Число и буква С алфавита слева от него на диаграмме указывают на положение аминокислотного остатка от N-конца цепи Q эмицизумаба и остатка цистеина в этом положении, соответственно.
Фиг. 2В. Доля защищенных дисульфидных изоформ в лекарственном препарате эмицизумабе. Доли содержания защищенных дисульфидных изоформ в различных условиях (условия культивирования для антитело-продуцирующих клеток) показаны в виде средних значений и их стандартного отклонения для процента площади пика (% площади) по результатам разделения методом CE-HPLC, представленных на фиг. 2А.
Фиг. 3. Результаты разделения эмицизумаба и защищенных дисульфидных изоформ (после обработок IdeS-расщеплением и восстановлением) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой.
Фиг. 3А-Г. Результаты разделения образцов, содержащих эмицизумаб (А и Б) или защищенные дисульфидные изоформы (В и Г), которые были расщеплены IdeS и затем восстановлены в присутствии денатурирующиего агента (А и В: условие полного восстановления), или состояние, при котором денатурирующий агент отсутствует (Б и Г: условие частичного восстановления). Для образцов в условиях полного восстановления (фиг. 3А и В) пики, представляющие цепь Q Fd (Q-Fd), цепь J Fd (J-Fd), цепь Q Fc (Q-Fc), цепь J Fc (J-Fc) и цепь L (LC), обнаружены для эмицизумаба и защищенных дисульфидных изоформ: не было обнаружено различий в характере восстановления между эмицизумабом и защищенными дисульфидными изоформами. С другой стороны, для образцов в условиях частичного восстановления (фиг. 3Б и Г) были обнаружены те же пики, представляющие цепь Q Fd, цепь J Fd, цепь Q Fc, цепь J Fc и цепь L, как и в условиях полного восстановления и, кроме того, уникальный пик, указывающий на гетеродимер дисульфида цепи Q Fd и дисульфида цепи J Fd, связанных вместе (J-Fd-Q-Fd), был обнаружен только в случае защищенных дисульфидных изоформ.
Фиг. 4. Результаты разделения эмицизумаба и защищенных дисульфидных изоформ после расщепления IdeS (и восстановления) с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой.
Фиг. 4А, Б. Результаты разделения защищенных дисульфидных изоформ (A) или эмицизумаба (Б), которые были расщеплены IdeS.
Фиг. 4 В, Г. Результаты разделения защищенных дисульфидных изоформ (B) или эмицизумаба, которые были расщеплены IdeS и затем денатурированы. Независимо от того, была ли денатурации или нет, часть F(ab')2 (LC-J Fab-Q Fab-LC) защищенных дисульфидных изоформ отделялась с более длительным временем удержания, чем основной компонент эмицизумаба.
Фиг. 5. Доля Q-CDR-усеченных вариантов в культуральном супернатанте эмицизумаб-продуцирующих клеток СНО, культивированных в разных условиях. Образцы культурального супернатанта, очищенного с использованием белка А, применяют для измерения доли содержания Q-CDR-усеченных вариантов. Вертикальная ось указывает на долю содержания варианта Q-CDR-усеченного варианта (% площади пика), а горизонтальная ось указывает различные условия культивирования.
Фиг. 6. Доля содержания Q-CDR-усеченных вариантов в культуральном супернатанте клеток-продуцентов эмицизумаба в различных условиях культивирования. Образцы культурального супернатанта, очищенного с использованием белка А, применяют для измерения доли содержания Q-CDR-усеченных вариантов. Вертикальная ось указывает на долю содержания варианта Q-CDR-усеченного варианта (% площади пика), а горизонтальная ось указывает различные условия культивирования.
Фиг.7. Результаты анализа CE-HPLC по каждой фракции раствора антитела эмицизумаба, содержащего Q-CDR-усеченные варианты, причем получаемую во время очистки фракцию подвергают стадиям обработки катионообменной хроматографии Bind & Elute (СЕХ). «Загруженная фракция» показывает результаты анализа CE-HPLC раствора антитела, загруженного в катионообменную колонку. «Промытая фракция» показывает результаты анализа CE-HPLC фракции, адсорбированной на колонке, полученной после пропускания фосфатного буфера с рН 7,2, содержащего 25 ммоль/л хлорида натрия (промывка). «Элюированная фракция» показывает результаты анализа CE-HPLC фракции, адсорбированной на колонке, полученной после пропускания фосфатного буфера с рН 6,5, содержащего 100 ммоль/л хлорида натрия. По сравнению с загруженной фракцией и промытой фракцией пик Q-CDR-усеченного варианта на более кислой стороне, чем пик эмиссии антитела эмицизумаба, исчез из элюированной фракции.
Фиг. 8А-Г. Результаты анализа молекулярной структуры эмицизумаба (Main) и защищенной дисульфидной изоформы (BiAb3) с помощью устройства SAXS. «Функция распределения парных расстояний [p(r)]», «Rg (нм)» и «Dmax (нм)» указывают функцию распределения парных расстояний, радиус вращения и максимальный размер Dmax (нм)соответственно.
Фиг. 9-1. Фиг. 9А. Остаточный график эмицизумаба (основного компонента в катионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии) и изоформ защищенного дисульфида по скорости обмена дейтерия (% D) при измерении HDX-MS (время обмена дейтерия 30 сек, 60 сек, 120 сек, 240 сек, 480 сек, 960 сек, 1920 сек и 3840 сек). Каждый столбец на графике показывает сумму различий в результатах каждого времени обмена дейтерия для Q-цепи, J-цепи и L-цепи. Фиг. 9Б. показывает части, для которых было определено различие в молекулярной структуре в защищенных дисульфидных изоформах эмицизумаба при измерении HDX-MS. Различие в молекулярной структуре в защищенных дисульфидных изоформах и в эмицизумабе отмечено в пептиде, включающем аминокислотные остатки от положения 146 по нумерации EU в цепи Q до положения 174 согласно нумерации EU в цепи Q (от положения 152 до положения 180 с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10), и пептиде, содержащем аминокислотные остатки от положения 146 по нумерации EU в цепи J до положения 174 по нумерации EU в цепи J (от положения 148 до положения 176 с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11). Смотрите части, отмеченные звездочками.
Фиг. 9-2 является продолжением фиг. 9-1.
Описание вариантов осуществления настоящего изобретения
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к вариантам антитела и изоформам с пониженной биологической активностью (например, с пониженной активностью в качестве миметика FVIII). Варианты и изоформы антитела выявляют в настоящем изобретении при анализе лекарственного вещества эмицизумаба в качестве двух типов структурно измененных молекул (Q-CDR-усеченных вариантов и защищенных дисульфидных изоформ). В настоящем изобретении понятия «вариант антитела» и «изоформа антитела» также могут быть отнесены к мутантам или изомерам молекулы антитела.
Эмицизумаб является биспецифическим гуманизированным антителом IgG4, проявляющим активность по функциональной замене FVIII как кофактора и включающим анти-FIX (а) и анти-FX, а также состоящим из двух типов тяжелых цепей (Q499 и J327), каждая из которых распознает FIX(a) и FX, соответственно, и общих цепей L (L404).
Конкретно, эмицизумаб является биспецифическим антителом, в котором первый полипептид и третий полипептид образуют пару, а также второй полипептид и четвертый полипептид образуют пару; причем первый полипептид содержит цепь Н, содержащую аминокислотную последовательность CDR 1, 2 и 3 цепи Н последовательностей SEQ ID NO: 1, 2 и 3 (CDR цепи Н в Q499), соответственно; второй полипептид содержит цепь Н, содержащую аминокислотные последовательности CDR цепи Н 1, 2 и 3 последовательностей SEQ ID NO: 4, 5 и 6 (CDR 1, 2 и 3 цепи Н в J327), соответственно; а третий полипептид и четвертый полипептид содержат общую цепь L, содержащую аминокислотные последовательности CDR 1, 2 и 3 цепи L SEQ ID NO: 7, 8 и 9 (CDR цепей L L404), соответственно (Q499-z121/J327-z119/L404-k).
Точнее, эмицизумаб представляет собой биспецифическое антитело, где первый полипептид и третий полипептид образуют пару, а также второй полипептид и четвертый полипептид образуют пару; причем первый полипептид содержит цепь Н, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, второй полипептид содержит цепь Н, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, а третий полипептид и четвертый полипептид содержат общую цепь L, имеющую последовательность SEQ ID NO: 15.
Точнее, эмицизумаб представляет биспецифическое антитело, где первый полипептид и третий полипептид образуют пару, а также второй полипептид и четвертый полипептид образуют пару; причем первый полипептид содержит цепь Н, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, второй полипептид содержит цепь Н, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, а третий полипептид и четвертый полипептид содержат общую цепь L, имеющую последовательность SEQ ID NO: 12 (Q499-z121/J327-z119/L404-k).
Такие антитела могут быть получены методами, описанными в WO 2005/035756, WO 2006/109592, WO 2012/067176 и других.
Антитела, используемые в настоящем изобретении, конкретно не ограничены при условии, что они связываются с необходимым антигеном, и они могут быть поликлональными или моноклональными антителами. Моноклональные антитела являются предпочтительными в том отношении, что гомогенные антитела могут быть стабильно продуцируемыми.
Аминокислоты, содержащиеся в аминокислотных последовательностях по настоящему изобретению, могут быть пост-трансляционно модифицированы (например, модификация N-концевого глютамина в пироглутаминовую кислоту путем пироглутамилирования известна специалистам в данной области). Естественно, такие посттрансляционно модифицированные аминокислоты включены в антитела, используемые в настоящем изобретении.
В настоящем изобретении биологическая активность антитела или вариантов антитела или изоформ антитела предпочтительно является активностью миметика FVIII. В настоящем изобретении «активность в качестве миметика FVIII» означает активность по функциональной замене FVIII (активность по функциональной замене FVIII в качестве кофактора). В настоящем изобретении фраза «функционально заменяет FVIII» означает распознавание FIX или FIXa и FX и содействие активации FX с помощью FIXa (стимулирование выработки FXa с помощью FIXa). Активность, способствующая выработке FXa, может быть оценена, используя, например, систему измерения, содержащую FIXa, FX, синтетический субстрат S-2222 (синтетический субстрат для FXa) и фосфолипиды. Такая система измерений показывает корреляцию с тяжестью заболевания и клиническими симптомами в случаях гемофилии A (Rosen S. с соавт., Thromb Haemost 54, 1985, 811-823).
Активность антител в качестве миметика FVIII, например, эмицизумаба и вариантов антитела, а также изоформ антитела, могут быть оценены, например, методами, описанными в WO 2005/035756, WO 2006/109592, WO 2012/067176 и других.
В настоящем изобретении антитела или варианты или изоформы антител имеют «пониженную биологическую активность», когда биологическая активность снижена по сравнению с биологической активностью контрольного антитела, и преимущественно снижение статистически значимо. В настоящем изобретении полагают, что антитела или варианты антител или изоформы антител «заметно (или в высокой степени) снижают биологическую активность», когда биологическая активность снижается по сравнению с биологической активностью контрольного антитела на 10% или более, например, на 20% или более, на 30% или более, на 40% или более, на 50% или более, на 60% или более, на 70% или более, на 80% или более, или на 90% или более.
В настоящем изобретении понятия «цепь Q» и «цепь J» относятся к цепи Н (тяжелой цепи), содержащей вариабельную область, которая может проявлять способность к связыванию с FIX(a) и FX, соответственно.
В настоящем изобретении понятие «общая цепь L» относится к L-цепи, которая может образовывать пары с каждой из двух или более разных цепей Н и может проявлять способность к связыванию с их соответствующим антигеном. В настоящем изобретении понятие «разные цепи Н» предпочтительно относится к цепям Н антител против разных антигенов, но не ограничивается ими; оно относится к цепям Н, аминокислотные последовательности которых отличаются друг от друга. Общие цепи L могут быть получены, например, в соответствии со способами, описанными в WO 2006/109592.
Понятие «антитело» применяют в самом широком смысле, и включает моноклональные антитела, поликлональные антитела, димеры, мультимеры, мультиспецифичные антитела (такие как биспецифические антитела), производные антител и модифицированные антитела (Miller K.С соавт., J Immunol. 170(9), 2003, 4854-4861), пока они проявляют требуемую биологическую активность. Антитела могут быть антителами мыши, антителами человека, гуманизированными антитела, химерными антителами или антителами, полученными от других видов, или искусственно синтезированными антителами. Описываемые в настоящем изобретении антитела могут быть какого-либо типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекул иммуноглобулина. Иммуноглобулины могут быть получены от разных видов (например, от человека, мыши или кролика). Понятия «антитело» и «иммуноглобулин» используют взаимозаменяемо в широком смысле.
Понятие «биспецифическое антитело» относится к антителу, имеющему две вариабельные области, каждая из которых распознает разные эпитопы, причем вариабельные области присутствуют в одной и той же молекуле антитела. Биспецифическими антителами могут быть антитела, которые распознают два или более разных антигена, или антитела, которые распознают два или более разных эпитопа на одном и том же антигене. Биспецифические антитела могут включать не только целые антитела, но и производные антител.
Рекомбинантные антитела, полученные с использованием методов генной инженерии, можно использовать в качестве антител. Рекомбинантное антитело может быть получено путем клонирования ДНК, кодирующей антитело, из гибридом или продуцирующих антитело клеток, таких как сенсибилизированные лимфоциты, которые продуцируют антитела; инсерцией в вектор; и затем интродукцией в хозяина (клетки-хозяева) для получения антитела.
Биспецифические антитела не ограничиваются антителами типа IgG; например, биспецифические антитела типа IgG могут секретироваться из гибридной гибридомы (квадромы), получаемой путем слияния двух типов гибридом, которые продуцируют антитела IgG (Milstein С.с соавт., Nature 305, 1983, 537-540). Они также могут секретироваться путем интродукции в клетки генов цепи L и цепи Н, основывая два вида представляющих интерес IgG, то есть всего четыре вида генов, для совместной экспрессии генов.
Антитела по настоящему изобретению могут быть получены методами, известными специалистам в данной области. В частности, ДНК, кодирующую представляющее интерес антитело, встраивают в вектор экспрессии. Инсерцию в вектор экспрессии осуществляют таким образом, что экспрессия будет происходить под контролем областей регуляции экспрессии, таких как энхансер и промотор. Затем клетки-хозяева трансформируют с использованием такого вектора экспрессии для экспрессии антитела. В этом случае можно использовать соответствующие комбинации хозяина и вектора экспрессии.
Полученные таким образом антитела по настоящему изобретению могут быть выделены из клеток-хозяев или их внешней среды (культуральной среды и т.д.), и очищены для получения, по существу, чистых, гомогенных антител. Антитела могут быть отделены и очищены методами, обычно используемыми для разделения и очистки антител, но ими возможные методы никоим образом не ограничиваются. Например, методы, описанные в WO 2013/086448, известны для отделения дисульфидной изоформы IgG2. Для разделения и очистки антител и вариантов антител или изоформ антител в настоящем изобретении, антитела и варианты антител или изоформы антител, например, могут быть разделены и очищены путем соответствующего выбора и сочетания колоночной хроматографии, фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, осаждения растворителем, экстракции растворителем, дистилляции, иммунопреципитации, электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, изоэлектрофокусирования, диализа, перекристаллизации и других методов. Например, при разделении и очистке с использованием хроматографической колонки могут быть применены различные типы матриц, включая сильную катионообменную матрицу, слабую катионообменную матрицу, аффинную матрицу против IgG человека и матрицу белок L.
В одном объекте осуществления настоящее изобретение относится к вариантам антител, имеющим характерные признаки, описанные ниже (иногда называемые в настоящем изобретении «Q-CDR-усеченными вариантами»):
- обладающими крайне низкой биологической активностью (активностью миметика FVIII) по сравнению с эмицизумабом;
- фрагмент на N-конце и другой фрагмент на С-конце удаленного (удаленных) аминокислотного остатка (остатков) соединены посредством дисульфидной связи (фиг. 1Б);
- количество продукции варьирует в зависимости от времени, температуры и рН среды для культивирования клеток, продуцирующих антитело.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Q-CDR-усеченным вариантом является вариант антитела, который содержит вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность SISPSGQSTYYRREVKG (SEQ ID NO: 2), в которой
(а) аминокислотный остаток R в положении 12 с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 (61-е положение с N-конца цепи Q эмицизумаба: положение 60 согласно нумерации Kabat); или
(б) аминокислотные остатки YYR в положениях с 10 по 12 с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 (положения 59-61 с N-конца цепи Q эмицизумаба: положения 58-60 согласно нумерации Kabat), удалены, и вариабельная область расщеплена по сайту делеции.
Q-CDR-усеченные варианты предпочтительно являются вариантами биспецифического антитела, более предпочтительно вариантами эмицизумаба.
Другой объект настоящего изобретения относится также к способам обнаружения и способам анализа Q-CDR-усеченного варианта. В одном варианте осуществления настоящего изобретения способы обнаружения Q-CDR-усеченного варианта включают стадию разделения образца, содержащего антитело, которое содержит вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность SISPSGQSTYYRREVKG (SEQ ID NO: 2), с помощью аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, нормально-фазовой хроматографии, хроматографии с обращенной фазой, хроматографии гидрофильного взаимодействия (hydrophilic interaction chromatography, HILIC), хроматографии гидрофобного взаимодействия (hydrophilic interaction chromatography, HIC), разделения на основе заряда, эксклюзионной хроматографии (size exclusion chromatography, SEC), гель-проникающей хроматографии (GPC) или их комбинации. В одном варианте осуществления способы анализа Q-CDR-усеченного варианта содержат стадию проведения одного или нескольких анализов, выбранных из группы, состоящей из количественного анализа, качественного анализа и структурного анализа, с использованием Q-CDR-усеченного варианта в качестве контрольного стандарта.
В таких методах обнаружения и способах анализа присутствие или отсутствие удаленной части (частей) в Fab, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (Qab Fab), можно использовать в качестве индикатора для обнаружения и анализа. Удаленные части могут быть обнаружены, например, за счет сдвига молекулярной массы, возникающего в результате удаления, в анализе LCMS в качестве индикатора. В Q-CDR-усеченных вариантах фрагмент на N-конце и другой фрагмент на С-конце удаленного (удаленных) аминокислотного остатка (остатков) соединены вместе через дисульфидную связь; следовательно, различие в схемах восстановления, возникающих на основе наличия или отсутствия удаленной части (частей), может быть обнаружено путем анализа образцов после того, как они подвергнуты реакции восстановления дисульфидной связи (связей), с использованием различных аналитических методов, таких как CE-HPLC, LCMS и LC-UV. Также могут быть использованы ЯМР и другие методы.
В другом варианте, разница в разрешении с помощью ионообменной хроматографии может быть использована в качестве индикатора. Например, когда разделение производят катионообменной хроматографией, Q-CDR-усеченные варианты разделяются в области, более кислой, чем основной пик эмицизумаба.
В другом объекте настоящего изобретения выработка и контроль качества фармацевтических композиций, содержащих эмицизумаб, могут быть осуществлены путем реализации одного из описанных выше методов обнаружения и методов анализа или какой-либо их комбинации. Следовательно, настоящее изобретение относится к способам контроля качества фармацевтической композиции, содержащей эмицизумаб, включающим стадию осуществления описанных выше способов обнаружения и способов анализа или стадию объединения каких-либо из них. Настоящее изобретение также относится к получению фармацевтической композиции, содержащей эмицизумаб, включающему стадию осуществления такого способа (способов) для контроля качества.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эмицизумаб и Q-CDR-усеченный вариант (варианты), в которой доля Q-CDR-усеченного варианта (вариантов) от общего количества молекул антител в фармацевтической композиции остается поддерживается на низком уровне. Фармацевтическая композиция может быть получена методом очистки, включающим очистку катионообменной хроматографией (cation exchange chromatography, СЕХ). Например, раствор антител, содержащий эмицизумаб и Q-CDR-усеченные варианты, абсорбируется на катионообменной колонке, и после этого только варианты кислой области, включая Q-CDR-усеченные варианты, могут быть выборочно элюированы и удалены. Пропорцию Q-CDR-усеченных вариантов от общего количества молекул антител в фармацевтической композиции можно оценивать различными методами, включая описанные выше методы обнаружения/анализа Q-CDR-усеченного варианта, и она может быть выражена в виде доли площади пика Q-CDR-усеченных вариантов (пропорции площади пиков), например, по данным анализа фармацевтической композиции методом катионообменной хроматографии (cation exchange chromatography, СЕХ) или CE-HPLC. Содержание Q-CDR-усеченных вариантов от общего количества молекул антител в фармацевтической композиции (например, доля площади пика СЕХ) предпочтительно составляет 5% или меньше и, например, составляет 5,0% или меньше, 4,0% или меньше, 3,0% или меньше, 2,0% или меньше, или 1,0% или меньше.
Настоящее изобретение также относится к методам получения фармацевтической композиции, в которой содержание Q-CDR-усеченного варианта поддерживается на низком уровне, и к методам подавления образования Q-CDR-усеченного варианта. Количество образованного Q-CDR-усеченного варианта может быть уменьшено путем сокращения времени культивирования (например, до 15 дней или менее, предпочтительно до 13 дней или менее) или за счет снижения температуры культивирования (например, до 38°С или менее, предпочтительно до 37°С или менее и более предпочтительно до 36°С или менее), и/или путем повышения рН среды культивирования (например, до 6,7 или выше, предпочтительно до 6,9 или выше и более предпочтительно до 7,1 или выше) для выработки клетками антител (рис. 4). Следовательно, описанные выше методы отличаются тем, что способы включают стадию культивирования клеток, продуцирующих антитело (например, эмицизумаб), при более низкой температуре культивирования (например, около 36°С или менее) и при более высоком рН (например, около 7,1 или выше) чем обычно в течение определенного периода времени (например, около 15 дней или менее). В одном варианте осуществления настоящего изобретения вышеописанные методы включают стадию культивирования клеток, продуцирующих антитела, при рН 7,1 или выше и/или при температуре культивирования 36°С или менее. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вышеописанные методы отличаются тем, что условия культивирования клеток, продуцирующих антитела, изменяют, доводя величину рН до 7,1 или выше и/или при температуре культуры до 36°С или менее в середине культивирования (например, на 2-й день или позже).
Другой объект настоящего изобретения относится к методам очистки композиции, содержащей эмицизумаб, которые отличаются тем, что включают стадию Bind & Elute катионообменной хроматографии (СЕХ). Настоящее изобретение также относится к методам получения фармацевтической композиции, содержащей эмицизумаб, которые включают стадию очистки.
Другой объект настоящего изобретения относится к изоформам антител, имеющим отличительные признаки, описанные ниже (иногда называемым в настоящем изобретении «защищенными дисульфидными изоформами»):
- обладающим чрезвычайно низкой биологической активностью (активность миметика FVIII) по сравнению с эмицизумабом;
- усиленной гидрофобностью по сравнению с эмицизумабом;
- имеющим дисульфидные связи между тяжелыми цепями (фиг. 2Б), которые менее чувствительны к восстановлению в мягких условиях (условия частичного восстановления) по сравнению с эмицизумабом;
- формируемым независимо от условий (параметров продуцирования), таких как концентрация растворенного кислорода и начальный показатель рН культуральной среды для клеток, продуцирующих антитело, и времени культивирования перед добавлением метотрексата (methotrexate, МТХ).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения защищенные дисульфидные изоформы отличаются тем, что они могут связываться с антигенами FIX (а) и FX, но не проявляют биологической активности (активности в качестве миметика FVIII).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения защищенные дисульфидные изоформы являются структурными изомерами, имеющими (нормальные) дисульфидные связи, идентичные связям в эмицизумабе, но имеющими более сильную гидрофобность, чем обычно, из-за структурного изменения (изменений) в части Fab, вследствие чего имеющими дисульфидные связи между тяжелыми цепями, которые становятся менее подверженными сокращению, чем обычно.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения защищенные дисульфидные изоформы являются изоформами биспецифического антитела, которое содержит первую тяжелую цепь (цепь Q, SEQ ID NO: 10) и вторую тяжелую цепь (цепь J, SEQ ID NO: 11), причем в защищенных дисульфидных изоформах дисульфидные связи формируются следующим образом:
(1а) между цистеином в положении 144 согласно нумерации EU в первой тяжелой цепи (150-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 200 согласно нумерации EU во второй тяжелой цепи (202-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11); и
(1б) между цистеином в положении 200 согласно нумерации EU в первой тяжелой цепи (206-е место с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 144 согласно нумерации EU во второй тяжелой цепи (146-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11), или где дисульфидные связи формируются следующим образом:
(2а) между цистеином в положении 226 согласно нумерации EU в первой тяжелой цепи (229-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 229 согласно нумерации EU во второй тяжелой цепи (228-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11); и
(2б) между цистеином в положении 229 согласно нумерации EU в первой тяжелой цепи (232-е место с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 226 согласно нумерации EU во второй тяжелой цепи (225-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения защищенные дисульфидные изоформы являются изоформами эмицизумаба, причем в защищенных дисульфидных изоформах дисульфидные связи формируются следующим образом:
(1а) между цистеином в положении 144 согласно нумерации EU в первой тяжелой цепи (150-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 200 согласно нумерации EU во второй тяжелой цепи (202-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11); и
(1б) между цистеином в положении 200 согласно нумерации EU в первой тяжелой цепи (206-е место с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 144 согласно нумерации EU во второй тяжелой цепи (146-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11);
(1в) между цистеином в положении 226 согласно нумерации EU в первой тяжелой цепи (229-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 226 согласно нумерации EU во второй тяжелой цепи (225-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11); и
(1г) между цистеином в положении 229 согласно нумерации EU в первой тяжелой цепи (232-е место с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 229 согласно нумерации EU во второй тяжелой цепи (228-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11), или где дисульфидные связи формируются следующим образом:
(2а) между цистеином в положении 226 согласно нумерации EU в первой тяжелой цепи (229-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 229 согласно нумерации EU во второй тяжелой цепи (228-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11);
(2б) между цистеином в положении 229 согласно нумерации EU в первой тяжелой цепи (232-е место с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 226 согласно нумерации EU во второй тяжелой цепи (225-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11).
(2в) между цистеином в положении 144 согласно нумерации EU в первой тяжелой цепи (150-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 200 согласно нумерации EU во второй тяжелой цепи (206-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11); и
(2г) между цистеином в положении 1440 согласно нумерации EU в первой тяжелой цепи (146-е место с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и цистеином в положении 200 согласно нумерации EU во второй тяжелой цепи (202-е положение с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11).
Другой объект настоящего изобретения относится к методам обнаружения и методам анализа защищенной дисульфидной изоформы. В другом варианте осуществления настоящего изобретения методы обнаружения защищенной дисульфидной изоформы включают стадию разделения образца, содержащего биспецифическое антитело, с помощью аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, нормально-фазовой хроматографии, хроматографии с обращенной фазой, хроматографии гидрофильного взаимодействия (hydrophilic interaction chromatography, HILIC), хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), на основе заряда, эксклюзионной хроматографии (size exclusion chromatography, SEC), гель-проникающей хроматографии (gel permeation chromatography, GPC) или их комбинации. В одном варианте осуществления настоящего изобретения методы анализа защищенной дисульфидной изоформы включают стадию проведения одного или нескольких анализов, выбранных из группы, состоящей из количественного анализа, качественного анализа и структурного анализа, с использованием защищенной дисульфидной изоформы в качестве контрольного стандарта.
Такие методы обнаружения и методы анализа могут основываться на различии (различиях) между защищенными дисульфидными изоформами и эмицизумабом в структуре участка (участков), образующих дисульфидные связи между тяжелыми цепями и/или областью Fab. Структурное различие (различия) могут быть обнаружены различными аналитическими методами, например, указанными ниже.
Например, пик (пики), отражающие разницу в трехмерной структуре или силе гидрофобности между эмицизумабом и защищенными дисульфидными изоформами, может быть обнаружен путем анализа образца с использованием колонки с обращенной фазой (например, колонки С4) после обработки образца для расщепления протеазой IdeS в условиях, исключающих восстановление (расщепление в одном месте ниже шарнирной области в IgG с получением фрагментов F(ab')2 и Fc).
Пик (пики), отражающие разницу в чувствительности дисульфидных связей к восстановлению между эмицизумабом и защищенными дисульфидными изоформами, может быть обнаружен путем анализа образца с использованием колонки с обращенной фазой, после того, как образец был обработан для расщепления IdeS и после этого для реакции восстановления в условиях мягкого восстановления (например, восстановления с помощью DTT в трис-буферном растворе (рН 7,0) при 37°С).
Не установлено разницы в результатах анализов, полученных с использованием колонки с обращенной фазой для эмицизумаба и защищенных дисульфидных изоформ, когда реакция восстановления проводят в условиях, при которых восстанавливаются все дисульфидные связи, тогда как различие в характере восстановления может быть обнаружено по результатам анализов с использованием колонки с обращенной фазой, когда реакцию восстановления проводят в описанных выше мягких условиях. Не ограничиваясь какой-либо определенной теорией, в настоящем изобретении высказывают предположение, что в описанных выше мягких условиях восстановления дисульфидные связи между тяжелой цепью и легкой цепью и дисульфидные связи между тяжелыми цепями все восстановлены в случае эмицизумаба, тогда как в случае защищенных дисульфидных изоформ восстанавливаются только дисульфидные связи между тяжелой цепью и легкой цепью, а дисульфидные связи между тяжелыми цепями остаются невосстановленными.
Пик (пики), отражающие разницу в характере расщепления Lys-C, обусловленную различием в трехмерной структуре между эмицизумабом и защищенными дисульфидными изоформами, могут быть обнаружены путем анализа образца с использованием колонки с обращенной фазой (например, колонки С4), после обработки образца для ограниченного расщепления Lys-C (например, путем остановки реакции расщепления Lys-C на полпути) в неденатурирующих условиях (например, в трис-буферном растворе). Не ограничиваясь какой-либо определенной теорией, в настоящем изобретении высказывают предположение, что выявленный характер расщепления Lys-C отражает различие в трехмерной структуре и является результатом расщепления, производимым преимущественно в положениях, в которых трехмерная структура сохраняется во время расщепления Lys-C в неденатурирующих условиях.
В другом варианте пик (пики), отражающие разницу в характере расщепления Lys-C, обусловленного различием в трехмерной структуре между эмицизумабом и защищенными дисульфидными изоформами, могут быть обнаружены путем анализа образца с использованием колонки с обращенной фазой, после чего предварительно обработанный для денатурации (например, обработка 5М гуанидином при 37°С в течение 30 мин), но не восстановленный образец (т.е. сохранивший связи SS), обрабатывают для ограниченного расщепления Lys-C. Не ограничиваясь какой-либо определенной теорией, в настоящем изобретении высказывают предположение, что выявлен характер расщепления Lys-C, отражающий различие в связях SS, в результате этого расщепление осуществляется преимущественно в положениях, где Lys-C легко доступен в состоянии, при котором трехмерная структура больше не сохраняется, но связи SS (дисульфидные связи) сохраняются, поскольку расщепление Lys-C проводится для денатурированных, но не восстановленных образцов.
В дополнение к вышеописанной реакции восстановления, помимо расщепления IdeS и ограниченного расщепления Lys-C в неденатурирующих условиях или в денатурирующих условиях могут быть использованы различные другие реакции распада, например, расщепление папаином. В дополнение к обращенно-фазовой хроматографии с использованием колонки С4, возможно использование различных аналитических методов, таких как анализ SE-HPLC, динамическое рассеяние света (DLS), измерение SAXS, измерение с помощью электронной микроскопии, 3D-моделирование, SPR-анализ, анализ HDX MS.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения получение и контроль качества фармацевтических композиций, содержащих эмицизумаб, могут быть реализованы посредством одного из описанных выше методов обнаружения и методов анализа или какой-либо их комбинации. Следовательно, настоящее изобретение относится к методам контроля качества фармацевтической композиции, содержащей эмицизумаб, включающему стадию осуществления описанных выше методов обнаружения и методов анализа или стадию комбинации каких-либо из этих методов. Настоящее изобретение также относится к получению фармацевтической композиции, содержащей эмицизумаб, включающему стадию осуществления такого метода (методов) для контроля качества.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эмицизумаб и защищенную дисульфидную изоформу (изоформы), в которой доля защищенной дисульфидной изоформы (форм) от общего количества молекул антител в фармацевтической композиции поддерживается на низком уровне. Доля защищенной дисульфидной изоформы от общего количества молекул антител в фармацевтической композиции может быть оценена различными методами, включая описанные выше методы обнаружения/анализа защищенной дисульфидной изоформы, и может быть выражена по площади пика защищенной дисульфидной изоформы (по доле площади пика) по результатам анализа фармацевтической композиции с помощью, например, катионообменной хроматографии (СЕХ) или CE-HPLC. Доля защищенной дисульфидной изоформы от общего количества молекул антител в фармацевтической композиции (например, доля площади пика СЕХ) предпочтительно составляет 2% или меньше и, например, составляет 2,0% или меньше, 1,5% или меньше, 1,0% или меньше или 0,5% или меньше.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения описывают методы очистки композиции, содержащей эмицизумаб, которые отличаются тем, что включают стадию Bind & Elute катионообменной хроматографии (СЕХ). Настоящее изобретение также относится к методам получения фармацевтической композиции, содержащей эмицизумаб, которые включают стадию очистки.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения описывают изоформы эмицизумаба (защищенные дисульфидные изоформы), имеющие такие же аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, что и последовательности эмицизумаба, но с молекулярной структурой с меньшим значением Rg (нм) и/или значением Dmax (нм), чем у эмицизумаба. Такие изоформы имеют молекулярную структуру с меньшим расстоянием между N-концами цепи J/цепи Q, чем у эмицизумаба, и, в частности, имеют среднее значение Rg, измеренное с помощью устройства SAXS, которое меньше на 3% или более, предпочтительно на 4% или более, более предпочтительно на 5% или более или еще более предпочтительно на 6% или более относительно эмицизумаба и/или имеют среднее значение Dmax, измеренное с помощью устройства SAXS, которое меньше на 5% или более, предпочтительно на 6% или более, более предпочтительно на 7% или более или еще более предпочтительно на 7,5% или более относительно эмицизумаба. Изоформы могут иметь среднее значение Rg, которое меньше на 0,15 нм или более, предпочтительно на 0,2 нм или более, более предпочтительно на 0,25 нм или более, или еще более предпочтительно на 0,3 нм или более, относительно эмицизумаба, и/или иметь среднее значение Dmax, которое меньше на 0,5 нм или более, предпочтительно на 1,0 нм или более, более предпочтительно на 1,2 нм или более или еще более предпочтительно на 1,4 нм или более относительно эмицизумаба. Эти изоформы могут иметь среднее значение Rg 4,9 нм или менее, или предпочтительно 4,8 нм или менее, и/или иметь среднее значение Dmax 17,0 нм или менее или предпочтительно 16,5 нм или менее.
Величины Rg и Dmax могут быть измерены в описанных ниже условиях:
(1) Концентрация антитела: концентрация антитела 7,54 мг/мл;
(2) Условия растворения: 150 мМ/л аргинина, 20 мМ/л гистидин-аспарагиновая кислота, рН6,0;
(3) Температура: 25°С.
Здесь среднее значение Rg можно получить, рассчитав Rg для каждого показателя на графике Гинье и рассчитав их среднее значение. Среднее значение Dmax может быть получено путем вычисления Dmax для каждого измерения от х-точки пересечения р(r) и последующего расчета среднего значения. По методам анализа графика Гинье и р(r), см. пример 9, описанный ниже.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения описывают изоформы эмицизумаба (защищенные дисульфидные изоформы), имеющие такие же аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, что и у эмицизумаба, но имеющие другую молекулярную структуру по сравнению с эмицизумабом в аминокислотных остатках от положения 146 по нумерации EU цепи Q до положения 174 по нумерации EU цепи Q (от положения 152 до положения 180 от N-конца последовательности SEQ ID NO: 10) и аминокислотных остатков от положения 146 по нумерации EU цепи J до положения 174 по нумерации EU цепи J (от положения 148 до положения 176 от N-конца последовательности SEQ ID NO: 11). Разница в молекулярной структуре может быть измерена как разница в скорости обмена дейтерия (% D) при измерении HDX-MS, и может быть подтверждена как разница во времени обмена дейтерия для пептидов, содержащих аминокислотные остатки этих областей, что показано на фиг. 9А.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения описывают фармацевтические композиции, содержащие эмицизумаб и изоформу, причем процентное содержание изоформы от общего количества молекул антител в фармацевтической композиции составляет 2% или менее.
В описанных выше молекулах антител, вариантах антител, изоформах антител, фармацевтических композициях, включающих вариант или изоформу антитела, методах анализа варианта или изоформы антитела или методах подавления образования варианта или изоформы антитела, антитело предпочтительно является биспецифическим антителом и, более предпочтительно, является эмицизумабом (АСЕ910).
В контексте настоящего изобретения к объектам, о которых написано, что они «содержат», также относятся объекты, которые «по существу состоят из», и объекты, которые «состоят из».
Числовые значения, приведенные в настоящем изобретении, могут варьировать в пределах определенного диапазона, например, в зависимости от приборов или оборудования, условий измерения и процедуры, используемой специалистами в данной области, до тех пор, пока они находятся в пределах диапазона, что позволяет осуществить цели изобретения, отклонение может составлять примерно 10%.
Сущность всех цитируемых патентов и публикаций включена в настоящее изобретение во всей полноте в виде ссылки.
Настоящее изобретение может быть дополнительно проиллюстрировано приведенными ниже примерами, которые, однако, не ограничивают рамок его охвата.
Примеры
Пример 1. Получение генно-инженерного гуманизированного биспецифического моноклонального антитела (антитела эмицизумаб)
Для структурного анализа изомеров эмицизумаба (вариантов антитела и изоформ) получают большое количество антитела эмицизумаба описанным ниже методом. Клетки СНО с интродуцированным геном, кодирующим эмицизумаб, культивируют в качестве клеток - продуцентов эмицизумаба в коммерчески доступной базовой среде (среда basal medium для культивирования клеток животных). Культивирование проводят в условиях, которые соответствуют требованиям для культивирования клеток СНО.
Экспрессированное антитело очищают с применением комбинации стандартной колоночной хроматографии, например, аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии и других методов.
Пример 2. Разделение Q-CDR-усеченных вариантов и защищенных дисульфидных изоформ (катионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография)
Раствор образца, приготовленный путем разбавления образца для анализа раствором А подвижной фазы (его состав описан ниже), вносят в катионообменную колонку (ProPac WCX-10: диаметр частиц 10 мкм; внутренний диаметр 4,0 мм, длина 250 мм). Затем проводят разделение методом жидкостной хроматографии (температура колонки: 30+/-5°С, длина волны измерения: 280 нм, скорость потока: 1,0 мл/мин) с использованием кислой подвижной фазы (раствор А подвижной фазы содержит 9,6 ммоль/л Трис, 6,0 ммоль/л пиперазина, 11,0 ммоль/л имидазольного буфера (рН 6,0)) и щелочной подвижной фазы (раствор Б подвижной фазы содержит 9,6 ммоль/л Трис, 6,0 ммоль/л пиперазина, 11,0 ммоль/л имидазола и 150 ммоль/л хлорида натрия (рН 9,9)). В результате подтверждают, что Q-CDR-усеченные варианты и защищенные дисульфидные изоформы разделяются в более кислых и щелочных областях, соответственно, по сравнению с основным пиком, соответствующим эмицизумабу (фиг. 1А и фиг. 2А).
Пример 3. Разделение защищенных дисульфидных изоформ (расщепление IdeS, частичное восстановление, высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой)
Образцы разбавляют фосфатным буфером, расщепляют протеазой IdeS и PNGase-F, и затем частично восстанавливают DTT в трис-буферном растворе, не содержащем денатурирующего вещества. Образец, разбавленный раствором TFA, вводят в колонку высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой и разделяют. В результате установлено, что основной компонент эмицизумаба отделяется на хроматографе в состоянии, когда дисульфидные связи между тяжелой и легкой цепями восстановлено, тогда как защищенные дисульфидные изоформы обнаруживают по уникальным пикам, представляющими состояние, при котором дисульфидные связи между тяжелыми цепями остаются не восстановленными (фиг. 3Б и фиг. 3Г).
Пример 4. Разделение защищенных дисульфидных изоформ (расщепление IdeS, денатурация, высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой)
Образцы разбавляют буфером, расщепляют протеазой IdeS и PNGase-F, а затем белки денатурируют, используя буфер для денатурации. После этого образец, разбавленный раствором TFA, вводят в колонку для высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой и разделяют. В результате установлено, что часть F(ab')2 защищенных дисульфидных изоформ отделяется после более длительного времени задержки по сравнению с основным компонентом эмицизумаба (фиг. 4В и фиг. 4Г).
Пример 5. Разделение защищенных дисульфидных изоформ (расщепление IdeS, высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой)
Образцы разбавляют буфером и расщепляют протеазой IdeS и PNGase-F. Образец, разведенный раствором TFA, разделяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой. В результате установлено, что часть F(ab')2 защищенных дисульфидных изоформ отделяется после более длительного времени задержки по сравнению с основным компонентом эмицизумаба (фиг. 4А и фиг. 4Б).
Пример 6. Оценка биологической активности Q-CDR-усеченных вариантов и защищенных дисульфидных изоформ
Хромогенной анализ
Количество активированного фактора свертывания крови X (FXa), полученного в реакции эмицизумаба в присутствии FIXa и FX в системе реакции, куда вводили фосфолипид, количественно измеряют с использованием специфического хромогенного субстрата. В частности, растворы эмицизумаба, полученные в результате разбавления в различных концентрациях, готовят путем добавления к образцу раствора (TBSB), содержащего трис-гидроксиметиламинометан, хлорид натрия и БСА. Каждый разбавленный раствор добавляют в соответствующую лунку в 96-луночном микропланшете, туда же вносят раствор фактора свертывания крови, содержащий FIXa, FX, хлорид кальция, хлорид магния, фосфолипид и TBSB, и после встряхивания планшет оставляют на 30 мин. Раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты добавляют в каждую лунку, планшет встряхивают и в каждую лунку вносят раствор хромогенного субстрата (гидрохлорид N-бензоил-L-изолейцил-L-глутамил-глицил-L-аргинин-р-нитроанилина и его метиловый эфир). После встряхивания планшет оставляют на 35 мин. После встряхивания в течение одной-двух мин измеряют поглощение (Abs) при 405 нм в каждой лунке, используя планшетный ридер. На основании значений поглощения, полученных из стандартных растворов и растворов образцов разных концентраций, удельную активность образцов относительно стандартных растворов определяют по кривой регрессии, полученной с использованием программы 4-parameter-parallel-lines-logistics. В результате Q-CDR-усеченные варианты показывают 18+/-1%, защищенные дисульфидные изоформы показывают 8+/-0% биологической активности относительно стандартного раствора эмицизумаба.
Анализ свертывания
В этом анализе измеряют время до образования сгустков из-за формирования фибрина, основываясь на изменении мутности в качестве индикатора, в системе восстановления механизма активации эндогенной коагуляции с использованием плазмы человека с дефицитом фактора VIII. Для этого к образцу добавляют раствор, содержащий трис-гидроксиметиламинометан, хлорид натрия и БСА, для приготовления растворов эмицизумаба, разбавленных до разных концентраций. Используя автоматическое устройство для измерения коагуляции крови, в разбавленные растворы добавляют плазму с дефицитом фактора VIII и инкубируют, затем добавляют реагент АРТТ и инкубируют, и, в конце, добавляют раствор хлорида кальция и измеряют для определения времени свертывания. Активность образцов по сравнению со стандартным веществом рассчитывают методом параллельных линий. В результате Q-CDR-усеченные варианты показывают 18+/-1%, защищенные дисульфидные изоформы показывают 16+/-1% биологической активности относительно стандартного раствора эмицизумаба.
Пример 7. Оценка влияния параметров культивирования на соотношение Q-CDR-усеченных вариантов
Исходная культуральная среда
Растительные гидролизаты, аминокислоты и другие компоненты добавляют и растворяют в коммерчески доступной базовой среде. Затем смесь стерилизуют фильтрацией.
Питательная среда
Глюкозу, аминокислоты и другие компоненты добавляют и растворяют в коммерчески доступной базовой среде. Затем смесь стерилизуют фильтрацией.
Клетки
Применяют клетки СНО, вырабатывающие эмицизумаб (штамм DXB-11, включающий инкорпорированный ген, который кодирует эмицизумаб).
Метод культивирования
Среду для выработки клетками целевого соединения (+/- 10% относительно стандартной концентрации) вводят в устройство для культивирования клеток объемом 1 л и высевают вышеупомянутый штамм клеток СНО в количестве от 2-6×105 клеток/мл. Культуру клеток начинают инкубировать при температуре от 36 до 38°С, концентрации растворенного кислорода 40%, начальном рН 7,20. С 1 до 3 дня культивирования добавляют питательную среду (+/- 10% относительно стандартной концентрации) при постоянной скорости потока, а на 3 день культивирования рН сдвигают до 6,70-7,10. Культуру поддерживают от 13 до 15 дней.
Культивирование проводят в общей сложности при соблюдении 56 параметров в соответствии с планом эксперимента, разработанным на основе композиции, включающей 12 основных точек (6 факторов: концентрация среды для выработки клетками целевого соединения, концентрация питательной среды, начальная плотность клеток, температура, время до начала добавления питательной среды, рН после сдвига). Для контроля всех параметров берут образцы культуральной среды на 13, 14 и 15 сутки культивирования (всего 168 образцов) и центрифугируют (при 3000 об/мин в течение 5 мин). Супернатант очищают с помощью белка А, а затем используют для измерения доли Q-CDR-усеченных вариантов.
Аналитический метод
Количество жизнеспособных клеток и долю жизнеспособных клеток измеряют по окрашиванию трипановым синим. Q-CDR-усеченные варианты обнаруживают в виде пика при измерении методом катионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографией с использованием катионной колонки (ProPac WCX-10).
Результаты
Результаты показаны на фиг.5 и фиг.6. На долю Q-CDR-усеченных вариантов влияет как температура, так и рН после сдвига. В тестируемом диапазоне (температура от 36 до 38°С и рН после сдвига с 6,70 до 7,10) доля Q-CDR-усеченных вариантов снижается больше при культивировании при 36°С и культивировании при сдвиге рН до величины 7,10. Отмечают взаимосвязь между температурой и рН после сдвига. Установлено, что доля Q-CDR-усеченных вариантов может быть уменьшена даже в условиях культивирования при 38°С, если рН снижают до 6,70.
Q-CDR-усеченные варианты успешно снижают до 4% или менее, контролируя температуру культивирования до 36-38°С и рН культивирования на 3-й день или позднее до 6,70-7,10.
Пример 8. Удаление Q-CDR-усеченных вариантов с помощью катионообменной хроматографии
Используя различие в электростатических свойствах Q-CDR-усеченных вариантов и антитела эмицизумаба, был разработан метод их разделения. Пример описан ниже.
Колонку заполняют средой Capto SP ImpRes (фирма GE) или ее допустимым заменителем в качестве катионообменной смолы и уравновешивают. Колонку загружают раствором антитела эмицизумаб, содержащим Q-CDR-усеченные варианты, чтобы позволить им обоим абсорбироваться. После загрузки колонку промывают фосфатным буферным раствором, содержащим хлорид натрия, и затем только варианты, тяготеющие к кислой среде, включая Q-CDR-усеченные варианты, специфически элюируют таким образом, что они отделяются от антитела эмицизумаб и удаляются. Чтобы показать, насколько хорошо прошло удаление, промытую фракцию, элюированную фракцию и загруженную фракцию перед разделением анализируют методом CE-HPLC (фиг. 7).
Условия загрузки, промывки и элюирования такие, как показано ниже.
Загрузка: буферный раствор трис-соляной кислоты, содержащий антитело эмицизумаб, с величиной рН, откорректированной до величины 5,0, загружают в колонку при нагрузке 33 г антитела эмицизумаба на 1 л смолы.
Промывка: раствор фосфатного буфера, содержащий 25 ммоль/л хлорида натрия, рН 7,2, пропускают через колонку в количестве 3,5 объемов колонки при комнатной температуре.
Элюирование: фосфатный буферный раствор, содержащий 100 ммоль/л хлорида натрия, рН 6,5, пропускают через колонку в количестве 6,5 объемов колонки при комнатной температуре.
Пример 9. Анализ молекулярной структуры защищенных дисульфидных изоформ
Получают препараты антител эмицизумаба и защищенной дисульфидной изоформы (антитело в концентрации 7,54 мг/мл, 150 ммоль/л аргинина, 20 ммоль/л гистидин-аспарагиновой кислоты, рН 6,0). Измерение SAXS проводят с использованием линейно-коллимированного рентгеновского пучка (Cu Kα, λ=0.1542 нм), генерируемого с помощью системы SAXSess mc2 (фирма Anton Paar, Грац, Австрия). Температуру для измерения устанавливают на 25°С. Для обнаружения используют двумерные пластины. Время воздействия рентгеновского луча устанавливают на 30 мин. Двумерную интенсивность рассеяния преобразуют в одномерную интенсивность рассеяния I(q) с помощью программного обеспечения SAXSQuant (фирма Anton Paar). Здесь q - вектор рассеяния, выраженный как q=(4π/λ)sin(θ/2) (θ означает угол рассеяния). Кривые рассеяния нормализуют относительно интенсивности рассеяния при q=0 для пучка, прошедшего через ограничитель пучка, а затем обрабатывают для коррекции фона (с буфером и капилляром) и коррекции оптической системы (очистки). Построение графика Гинье проводят на скорректированных кривых рассеяния в условиях, удовлетворяющих q×Rg<1,3, для получения радиуса вращения (radius of gyration, Rg; нм); однако, когда наблюдают падение интенсивности рассеяния при небольшом угле, данные для диапазона q, соответствующего ему, были исключены при построении графика Гинье, чтобы избежать эффектов, вызванных отталкиванием частиц. В системе, предполагающей отсутствие взаимодействия между частицами (структурный фактор S(q)=1), интенсивность рассеяния I(q) задают как преобразование функции Фурье распределения парных расстояний р(r). Применяя метод непрямого преобразования Фурье (NPL 9) к скорректированным кривым рассеяния, получают р(r) для частиц. Максимальный размер Dmax (нм) получают из х-пересечения р(r). Измерение проводят трижды для каждого из препаратов антитела эмицизумаб (основной) и препарата антител защищенных дисульфидных изоформ (BiAb3).
В результате защищенная дисульфидная изоформа имеет среднее значение Rg 4,8 нм или менее (значение 0,3 нм или меньше, чем у эмицизумаба) и среднее значение Dmax 16,5 нм или менее (значение 1,4 нм или менее, чем у эмицизумаба), и показывает на 6% или менее среднее значение Rg и на 7,5% или менее среднее значение Dmax по сравнению с эмцизумабом. Сообщают, что значения Dmax молекул антител IgG4 того же подкласса антител, что и эмицизумаб, соответствуют расстоянию между концами двух доменов Fab (NPL 10); поэтому полагают, что расстояние между концами двух Fab-доменов защищенной дисульфидной изоформы сокращено, что дает меньшие значения Rg, которые представляют собой расстояние от центра массы молекулы. На основании вышеизложенного подтверждают, что защищенная дисульфидная изоформа принимает молекулярную структуру, имеющую укороченное расстояние между N-концами цепи J/цепи Q по сравнению с эмицизумабом (фиг. 8). Для биспецифических антител, обеспечивающих взаимодействие между двумя типами антигенов, расстояние между Fab-доменами должно иметь решающее значение при определении взаимодействий между антигенами с учетом трехмерной структуры. Поэтому, контроль процентного содержания таких изоформ в фармацевтической композиции является важной задачей не только для эмицизумаба, но, в целом, для фармацевтических препаратов на основе антител, содержащих биспецифические антитела.
Пример 10. Анализ молекулярной структуры методом водородно-дейтериевой обменной масс-спектрометрии (HDX-MS, Hydrogen-Deuterium eXchange Mass Spectrometry)
Получают препараты антитела эмицизумаба и каждой из защищенных дисульфидных изоформ (антитела в концентрации 1 мг/мл, 150 ммоль/л аргинина, 20 ммоль/л гистидин-аспарагиновой кислоты, рН 6,0) и измерение HDX-MS (измерения при времени обмена дейтерием 30 сек, 60 сек, 120 сек, 240 сек, 480 сек, 960 сек, 1920 сек и 3840 сек) проводят с использованием устройства HDX-MS (Orbitrap Fusion Lumos (фирма Thermo Fisher Scientific), UltiMate30000RSLCnano (фирма Thermo Fisher Scientific) с HDX-PAL (фирма LEAP Technologies)).
В результате заметную разницу в скорости обмена дейтерия (% D) при измерении HDX-MS наблюдают в пептиде, содержащем аминокислотные остатки от положения 146 по нумерации EU в цепи Q до положения 174 по нумерации EU в цепи Q (от положения 152 до положения 180 с N-конца последовательности SEQ ID NO: 10), ив пептиде, содержащем аминокислотные остатки от положения 146 по нумерации EU в цепи J до положения 174 по нумерации EU в цепи J (от положения 148 до положения 176 с N-конца последовательности SEQ ID NO: 11). На основании этого результата было подтверждено, что защищенные дисульфидные изоформы имеют в этих областях другую структуру по сравнению с эмицизумабом (фиг. 9).
Промышленное применение
Варианты антител и изоформ по настоящему изобретению имеют чрезвычайно пониженную активность в качестве миметиков FVIII по сравнению с эмицизумабом; следовательно, фармацевтические композиции по настоящему изобретению, содержащие эмицизумаб и имеющие пониженную долю таких вариантов антител и изоформ, являются полезными в качестве средства для лечения гемофилии. Методы анализа вариантов и изоформ антител по настоящему изобретению применимы для оценки качества препаратов эмицизумаба, а также для разработки препаратов эмицизумаба с пониженной долей вариантов и изоформ антител или для разработки методов подавления образования вариантов антител и изоформ.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ЧУГАИ СЕЙЯКУ КАБУСИКИ КАЙСЯ
<120> ВАРИАНТЫ И ИЗОФОРМЫ АНТИТЕЛ С ПОНИЖЕННОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТЬЮ
<130> C1-A1719P
<150> JP 2017-212179
<151> 2017-11-01
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain variable region CDR1
<400> 1
Tyr Tyr Asp Ile Gln
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain variable region CDR2
<400> 2
Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain variable region CDR3
<400> 3
Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain variable region CDR1
<400> 4
Asp Asn Asn Met Asp
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain variable region CDR2
<400> 5
Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe Gln
1 5 10 15
Asp
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain variable region CDR3
<400> 6
Arg Lys Ser Tyr Gly Tyr Tyr Leu Asp Glu
1 5 10
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain variable region CDR1
<400> 7
Lys Ala Ser Arg Asn Ile Glu Arg Gln Leu Ala
1 5 10
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain variable region CDR2
<400> 8
Gln Ala Ser Arg Lys Glu Ser
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain variable region CDR3
<400> 9
Gln Gln Tyr Ser Asp Pro Pro Leu Thr
1 5
<210> 10
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 11
<211> 444
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Ile Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Lys Ser Tyr Gly Tyr Tyr Leu Asp Glu Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440
<210> 12
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asn Ile Glu Arg Gln
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Arg Lys Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 13
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain variable region
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain variable region
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Ile Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Lys Ser Tyr Gly Tyr Tyr Leu Asp Glu Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain variable region
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asn Ile Glu Arg Gln
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Arg Lys Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<---
Claims (5)
1. Вариант Эмицизумаба с пониженной активностью миметика фактора свертывания крови VIII (FVIII), где вариант содержит первый полипептид и третий полипептид, образующие пару, и второй полипептид и четвертый полипептид, образующие пару, где первый полипептид содержит H (тяжелую) цепь, содержащую аминокислотные последовательности CDR 1, 2 и 3 H-цепи c SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно; второй полипептид содержит H (тяжелую) цепь, содержащую аминокислотные последовательности CDR 1, 2 и 3 H-цепи c SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно; и третий полипептид, и четвертый полипептид содержат общую L (легкую) цепь, содержащую аминокислотные последовательности CDR 1, 2 и 3 L-цепи c SEQ ID NO: 7, 8 и 9, соответственно, в которой аминокислотный остаток R в положении 12 с N-терминального конца последовательности SEQ ID NO: 2 удален, и вариабельная область расщеплена по сайту делеции.
2. Способ определения варианта по п. 1, включающий стадию разделения образца, содержащего Эмицизумаб и его вариант, с помощью аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, нормально-фазовой хроматографии, хроматографии с обращенной фазой, хроматографии гидрофильного взаимодействия (HILIC), хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), разделения на основе заряда, эксклюзионной хроматографии (SEC), гель-проникающей хроматографии (GPC) или их комбинации.
3. Фармацевтическая композиция для лечения гемофилии, содержащая Эмицизумаб, в качестве действующего активного ингредиента, и вариант по п. 1, в котором процент варианта от общего числа молекул антитела в фармацевтической композиции составляет 5% или менее.
4. Фармацевтическая композиция по п. 3, которую получают в процессе очистки, включающем очистку катионообменной хроматографией (CEX).
5. Способ подавления выработки варианта по п. 1, включающий стадию культивирования клеток CHO, вырабатывающих Эмицизумаб при pH 6,70-7,10, и/или при температуре культивирования от 36°C до 38°C.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017-212179 | 2017-11-01 | ||
JP2017212179 | 2017-11-01 | ||
PCT/JP2018/040436 WO2019088143A1 (ja) | 2017-11-01 | 2018-10-31 | 生物活性が低下した抗体バリアントおよびアイソフォーム |
Related Child Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2024102684A Division RU2024102684A (ru) | 2017-11-01 | 2018-10-31 | Варианты и изоформы антител с пониженной биологической активностью |
RU2024102685A Division RU2024102685A (ru) | 2017-11-01 | 2018-10-31 | Варианты и изоформы антител с пониженной биологической активностью |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2020117440A RU2020117440A (ru) | 2021-12-01 |
RU2020117440A3 RU2020117440A3 (ru) | 2022-04-01 |
RU2813990C2 true RU2813990C2 (ru) | 2024-02-21 |
Family
ID=
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996033208A1 (en) * | 1995-04-20 | 1996-10-24 | Genentech, Inc. | Antibody purification by low-ph hydrophobic interaction chromatoggraphy |
EP2009101A1 (en) * | 2006-03-31 | 2008-12-31 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody modification method for purifying bispecific antibody |
EP2644698A1 (en) * | 2010-11-17 | 2013-10-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii |
RU2586515C2 (ru) * | 2010-12-21 | 2016-06-10 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Препарат антитела, обогащенного изоформами и способ его получения |
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996033208A1 (en) * | 1995-04-20 | 1996-10-24 | Genentech, Inc. | Antibody purification by low-ph hydrophobic interaction chromatoggraphy |
EP2009101A1 (en) * | 2006-03-31 | 2008-12-31 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody modification method for purifying bispecific antibody |
EP2644698A1 (en) * | 2010-11-17 | 2013-10-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii |
RU2586515C2 (ru) * | 2010-12-21 | 2016-06-10 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Препарат антитела, обогащенного изоформами и способ его получения |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MUTO A. ET AL, Anti-factor IXa/X bispecific antibody (ACE910): hemostatic potency against ongoing bleeds in a hemophilia A model and the possibility of routine supplementation, JOURNAL OF THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS, 2014, v. 12, n. 2, p.206 - 213, РОЙТ А. и др., Иммунология, Москва, "Мир", 2000, с. 110-111 BERRY M. J. et al., Substitution of cysteine for selenocysteine in type I iodothyronine deiodinase reduces the catalytic efficiency of the protein but enhances its translation, Endocrinology, 1992, V. 131, N. 4, p.1848-1852, GASSER B. et al., Antibody production with yeasts and filamentous fungi: on the road to large scale?, Biotechnology letters, 2007, v. 29, n. 2, p.201-212, MULLER S. et al., Spliceosomal peptide P140 for immunotherapy of systemic lupus erythematosus: results of an early phase II clinical trial, Arthritis & Rheumatism: Official Journal of the American College of Rheumatology, 2008, V. 58, N. 12, p.3873-3883. * |
ZENJIRO SAMPEI ET AL., Identification and Multidimensional Optimization of an Asymmetric Bispecific IgG Antibody Mimicking the Function of Factor VIII Cofactor Activity, PLOS ONE, 2013, v. 8, n. 2, e57479, * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20200283544A1 (en) | Antibody variant and isoform with lowered biological activity | |
US20240052059A1 (en) | Medicinal composition usable for preventing and/or treating blood coagulation factor ix abnormality, comprising multispecific antigen binding molecule replacing function of blood coagulation factor viii | |
TWI837084B (zh) | 促凝血抗體 | |
RU2534347C1 (ru) | Мультиспецифическая связывающая антиген молекула, которая обладает альтернативной функцией к функции фактора свертывания крови viii | |
CN107207588B (zh) | 针对tau的抗体和其用途 | |
RU2737145C2 (ru) | Антитело, которое обладает способностью нейтрализовать субстанцию, обладающую активностью, альтернативной функции фактора свертывания viii (fviii) | |
JP7277689B2 (ja) | 新規な抗ヒトgpvi抗体およびその使用 | |
Rispens et al. | Fc–Fc interactions of human IgG4 require dissociation of heavy chains and are formed predominantly by the intra-chain hinge isomer | |
US20160297892A1 (en) | Novel Methods and Antibodies for Treating Coagulapathy | |
TWI716059B (zh) | 經改良的促凝血抗體 | |
JP6678111B2 (ja) | Fviiiの反応性を測定する方法 | |
JPWO2017110980A1 (ja) | 増強された活性を有する抗体及びその改変方法 | |
KR20220027825A (ko) | 항-EphA4 항체 | |
US20210355231A1 (en) | Treatment and prevention of hemophilic arthropathy with an antibody against endothelial cell protein c receptor (epcr) | |
CN105473619B (zh) | 能够引起促凝血活性的识别组织因子途径抑制剂的n-末端部分的抗体 | |
TW201839009A (zh) | 使用抗人類gpvi抗體抑制血小板凝集 | |
RU2813990C2 (ru) | Варианты и изоформы антител с пониженной биологической активностью | |
JP6445440B2 (ja) | 抗プロテインc抗体による出血性疾患の治療 | |
RU2810094C2 (ru) | Прокоагулянтные антитела | |
WO2021235537A1 (ja) | 凝固第viii因子(f.viii)機能代替活性を有する物質を中和する抗体 | |
RU2810748C2 (ru) | Усовершенствованные прокоагулянтные антитела | |
KR102687774B1 (ko) | 혈액 응고 제viii 인자의 기능을 대체하는 다중 특이성 항원 결합 분자를 함유하는, 혈액 응고 제ix 인자 이상증의 예방 및/또는 치료에 이용되는 의약 조성물 | |
CN115916836A (zh) | 双特异性抗原结合分子及其相关组合物、用于制备组合物的应用、试剂盒和方法 |