RU2586515C2 - Препарат антитела, обогащенного изоформами и способ его получения - Google Patents

Препарат антитела, обогащенного изоформами и способ его получения Download PDF

Info

Publication number
RU2586515C2
RU2586515C2 RU2013132405/10A RU2013132405A RU2586515C2 RU 2586515 C2 RU2586515 C2 RU 2586515C2 RU 2013132405/10 A RU2013132405/10 A RU 2013132405/10A RU 2013132405 A RU2013132405 A RU 2013132405A RU 2586515 C2 RU2586515 C2 RU 2586515C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
solution
antibody
conductivity
cation exchange
exchange chromatography
Prior art date
Application number
RU2013132405/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2013132405A (ru
Inventor
Роберто ФАЛЬКЕНШТАЙН
Клаус ШВЕНДНЕР
Бернхард ШПЕНСБЕРГЕР
Original Assignee
Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43799680&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2586515(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг filed Critical Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг
Publication of RU2013132405A publication Critical patent/RU2013132405A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2586515C2 publication Critical patent/RU2586515C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретения относятся к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая способ получения обогащенного изоформами препарата антител (варианты). В одном варианте способ получения обогащенного изоформами препарата антител включает этапы: а) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антител на материал катионообменной хроматографии, б) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антител остаются связанными с материалом катионообменной хроматографии, и в) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии и тем самым получение препарата антител, где проводимость первого раствора составляет от 4 мСм/см до 5мСм/см, где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора не более чем на 10%. В другом варианте способ получения изоформами препарата антител включает этапы: а) культивирование клеток млекапитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, и выделение антитела из клеток или культуральной среды, б) очистка антитела по меньшей мере одним этапом колоночной хроматографии. Изобретение расширяет арсенал способов получения препаратов антител. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл, 7 пр.

Description

В данном документе описан способ получения препарата антител, включающий этап способа элюирования на материале катионообменной хроматографии.
Уровень техники.
Хорошо известны и широко используются различные способы очистки белка, такие как аффинная хроматография с микробными белками (например, протеин A или протеин G аффинная хроматография), ионообменная хроматография (например, катионообменная (карбоксиметиловые смолы), анионообменная (аминоэтиловые смолы) и смешанного режима обмена), тиофильная адсорбция (например, с бета-меркаптоэтанолом и другими SH-лигандами), хроматография гидрофобного взаимодействия или ароматическо-адсорбционная хроматография (например, с фенил-сефарозой, аза-аренофильными смолами, или м-аминофенилбороновой кислотой) металл-хелатная аффинная хроматография (например, с Ni (II) - и Cu (II) аффинным материалом), гельфильтрация и электрофоретические методы (например, гель-электрофорез, капиллярный электрофорез) (Vijayalakshmi, М.А., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).
Промышленная очистка фармацевтических антител, особенно развитие, эксплуатация и ратификация процессов хроматографии описаны у Fahrner, R.L., et al., in Biotechnol. Gen. Eng. Rev. 18 (2001) 301-327. Follman, D.K. и Fahrner, R.L. (J. Chrom. A 1024 (2004) 79-85), описывают факториальный скрининг процессов очистки антител, используя три хроматографических этапа без протеина A. Захват человеческих моноклональных антител из супернатанта клеточной культуры ионообменной средой, имеющей высокую плотность заряда, описан Necina, R., et al. (Biotechnol. and Bioeng. 60 (1998) 689-698). Очистка белков с помощью ионообменной хроматографии описана в WO 99/057134. В WO 2004/076485 описана очистка антител путем протеин A и ионообменной хроматографии. В US 5,429,746 описана очистка антител. Очистка белков описана в WO 2003/066662.
WO 2006/125599 описывает способ очистки антител. Очистка антител путем протеин A и ионообменной хроматографии описывается в WO 2004/076485.
Краткое описание изобретения
Было обнаружено, что хроматографическое разделение и/или обогащение изоформами антител возможно при подходящем увеличении проводимости подвижной фазы материала катионообменной хроматографии. Требуемое увеличение проводимости составляет не более 50%, то есть второй раствор имеет проводимость от 101% до 150% от проводимости первого раствора.
Таким образом, одним аспектом, как описано в настоящем документе, является способ изготовления препарата антител, включающий следующие этапы:
а) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антител на материал катионообменной хроматографии,
б) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антител остаются связанными с материалом катионообменной хроматографии, а также
в) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии и тем самым получение препарата антител,
где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора, по крайней мере, на 1%, но не более чем на 50%.
В одном варианте исполнения проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора, по крайней мере, на 1%, но не более чем на 20%.
В одном варианте исполнения проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора, по крайней мере, на 1%, но не более чем на 15%.
В одном варианте исполнения проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора, по крайней мере, на 1%, но не более чем на 10%.
В одном варианте исполнения раствор стадии а) имеет такую же проводимость, как раствор стадии б). В одном варианте исполнения буферный раствор, содержащий различные изоформы антител, имеет первую проводимость и первый раствор имеет ту же (первую) проводимость.
В одном варианте исполнения материал катионообменной хроматографии содержит набухающую матрицу. В одном варианте исполнения набухающей матрицей является агароза.
В одном варианте исполнения материал катионообменной хроматографии является сильным материалом катионообменной хроматографии. В одном варианте исполнения сильным материалом катионообменной хроматографии является материал сульфопропил-катионообменной хроматографии.
В одном варианте исполнения происходит одноступенчатая замена первого раствора на второй раствор. В одном варианте исполнения одна ступень является изменением от 100% по объему первого раствора до 100% по объему второго раствора.
В одном варианте исполнения первый раствор изменяется на второй раствор по линейному градиенту. В одном варианте исполнения линейный градиент составляет приблизительно 30 объемов колонки. В одном варианте исполнения линейный градиент составляет приблизительно 20 объемов колонки.
В одном варианте исполнения первый раствор содержит 20 мМ цитрат натрия.
В одном варианте исполнения второй раствор содержит 20 мМ цитрат натрия и 5 мМ хлорид натрия.
В одном варианте исполнения первый раствор содержит 25 мМ трис-(гидроксиметил)-аминометан и 10 мМ хлорид натрия.
В одном варианте исполнения второй раствор содержит 25 мМ трис-(гидроксиметил)-аминометан и 70 мМ хлорид натрия.
В одном варианте исполнения второй раствор содержит 25 мМ трис-(гидроксиметил)-аминометан и 45 мМ хлорид натрия.
В одном варианте исполнения первый и второй растворы являются водными растворами.
В одном варианте исполнения антитела представляют собой анти-HER2 антитела. В одном варианте анти-HER2 антитела являются анти-HER2 антителами Трастузумаб или анти-HER2 антителами Пертузумаб. В одном варианте анти-HER2 антитела являются гуманизированными анти-HER2 антителами.
В данном документе в качестве другого аспекта описан препарат антител, полученный способом, как описано в данном документе. В одном варианте исполнения антитела представляют собой анти-HER2 антитела.
Другим аспектом, как описано в данном документе, является способ получения препарата антитела, включающий следующие этапы:
а) культивирование клеток млекопитающих, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, и выделение антител из клеток или культуральной среды,
б) очистка антител по крайней мере одной стадией колоночной хроматографии, где по меньшей мере один этап колоночной хроматографии включает следующие этапы:
1) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антител на материал катионообменной хроматографии,
2) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антител остаются связанными с материалом катионообменной хроматографии, а также
3) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии и, таким образом, получение препарата антител,
где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора, по крайней мере, на 1%, но не более чем на 10%.
В одном варианте исполнения всех аспектов, описанных в данном документе, первый раствор имеет проводимость от 4 мСм/см до 5 мСм/см.
Описание изобретения
В данном документе описан способ получения препарата антител, включающий этапы: 1) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антител, на материал катионообменной хроматографии; 2) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антител остаются связанными с материалом катионообменной хроматографии; 3) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии и тем самым получение препарата антител, где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора не более чем на 50%.
В общем, моноклональные антитела (mAb), полученные рекомбинантным способом, выделяют из супернатанта культивируемых продуцирующих клеток, таких как ВНК, или Sp2/0, или CHO, или HEK клетки. Одновременно также выделяют другие белковые соединения, а также различные изоформы антител. Изоформы антител различаются лишь незначительными структурными характеристиками, такими как паттерн гликозилирования, гетерогенность C-концевого лизина тяжелой цепи и частичное деамидирование аспарагиновых или глутаминовых аминокислотных остатков.
Антитело выделяют с колонки/материала катионообменной хроматографии, используя общие хроматографические методы, в одном (симметричном) пике (см., например, Пример 6 и Фиг.5).
Было обнаружено, что изоформы антител могут быть обогащены или частично разделены друг от друга с помощью способа катионообменной хроматографии. Разделение/обогащение достигается хроматографическим способом связывание-элюирование, используя градиент pH или градиент соли и используя градиент с особенно небольшим уклоном.
Было обнаружено, что обогащение препарата антител изоформами антител возможно с помощью колоночной хроматографии с подходящим увеличением проводимости подвижной фазы.
В одном варианте исполнения увеличение проводимости составляет 50% или менее, т.е. проводимость возрастает от 100% по крайней мере до 101% и не более чем до 150%, начиная с первого уровня до второго, более высокого уровня, для того чтобы осуществить элюирование антител.
В одном варианте исполнения увеличение проводимости составляет 10% или менее, т.е. проводимость возрастает от 100% по крайней мере до 101% и не более чем до 110%, начиная с первого уровня до второго, более высокого уровня, для того чтобы осуществить элюирование антител.
Было обнаружено, что матрица материала катионообменной хроматографии должна быть набухающей матрицей.
В одном варианте исполнения матрица представляет собой поперечно-сшитый сахарид. В одном варианте исполнения сахарид представляет собой полисахарид. В одном варианте исполнения полисахарид представляет собой агарозу, т.е. полисахарид, состоящий из гликозидно связанных D-галактозы и 3,6-ангидро-L-галактозы.
Увеличение может быть одноступенчатым. Таким образом, увеличение может быть выполнено путем полной смены элюирующего раствора, то есть со 100% первого буферного раствора до 100% второго (= элюирующего) буферного раствора.
Увеличение может быть в виде линейного градиента. Таким образом, увеличение может быть выполнено с помощью линейной смены элюирующего раствора, то есть со 100% первого буферного раствора до от 50% до 100% второго (= элюирующего) буферного раствора.
В одном варианте исполнения первый раствор сменяется на второй раствор по линейному градиенту. В одном варианте исполнения линейный градиент осуществляется в течение приблизительно 50 объемов колонки. В одном варианте исполнения линейный градиент осуществляется в течение приблизительно 30 объемов колонки. В одном варианте исполнения линейный градиент осуществляется в течение приблизительно 20 объемов колонки.
Общие хроматографические методы и их применение известны специалисту в данной области. См., например, Heftmann, Е., (ed.), Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Deyl, Z., (ed.) Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, vol. 60, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Poole, C.F., and Poole, S.K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, (1982); Sambrook, J., et al., (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989); или Ausubel, F.M., et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, (1998).
В следующей Таблице проводимости некоторых буферных растворов, которые обычно используются, даны как референсные.
Таблица
Буфер NaCl [г/л] буферная соль [г/л] pH проводимость [мСм/см] изменение проводимости [%]
10 мМ цитрат натрия - 1.92 5.5 1.74 -
20 мМ цитрат натрия - 3.84 5.5 3.49 +101
30 мМ цитрат натрия - 5.76 5.5 5.05 +190
40 мМ цитрат натрия - 7.68 5.5 6.45 +271
50 мМ цитрат натрия - 9.60 5.5 8.04 +362
10 мМ цитрат натрия с 25 мМ NaCl 1.46 1.92 5.5 4.87 -
10 мМ цитрат натрия с 50 мМ NaCl 2.92 1.92 5.5 7.34 +51
10 мМ цитрат натрия с 100 мМ NaCl 5.84 1.92 5.5 12.21 +151
10 мМ цитрат натрия с 150 мМ NaCl 8.77 1.92 5.5 17.17 +253
10 мМ цитрат натрия с 200 мМ NaCl 11.69 1.92 5.5 21.70 +346
Буфер NaCl [г/л] буферная соль [г/л] pH проводимость [мСм/см] изменение проводимости [%]
20 мМ цитрат натрия с 25 мМ NaCl 1.46 3.84 5.5 6.65 -
20 мМ цитрат натрия с 50 мМ NaCl 2.92 3.84 5.5 9.12 +37
20 мМ цитрат натрия с 100 мМ NaCl 5.84 3.84 5.5 13.82 +108
20 мМ цитрат натрия с 150 мМ NaCl 8.77 3.84 5.5 18.37 +176
20 мМ цитрат натрия с 200 мМ NaCl 11.69 3.84 5.5 22.80 +243
30 мМ цитрат натрия с 25 мМ NaCl 1.46 5.76 5.5 8.37 -
30 мМ цитрат натрия с 50 мМ NaCl 2.92 5.76 5.5 10.65 +27
30 мМ цитрат натрия с 100 мМ NaCl 5.84 5.76 5.5 15.15 +81
30 мМ цитрат натрия с 150 мМ NaCl 8.77 5.76 5.5 19.69 +135
30 мМ цитрат натрия с 200 мМ NaCl 11.69 5.76 5.5 24.10 +188
40 мМ цитрат натрия с 25 мМ NaCl 1.46 7.68 5.5 9.78 -
40 мМ цитрат натрия с 50 мМ NaCl 2.92 7.68 5.5 12.12 +24
40 мМ цитрат натрия с 100 мМ NaCl 5.84 7.68 5.5 16.71 +71
40 мМ цитрат натрия с 150 мМ NaCl 8.77 7.68 5.5 21.20 +117
40 мМ цитрат натрия с 200 мМ NaCl 11.69 7.68 5.5 25.30 +159
Буфер NaCl [г/л] буферная соль [г/л] pH проводимость [мСм/см] изменение проводимости [%]
50 мМ цитрат натрия с 25 мМ NaCl 1.46 9.60 5.5 11.31 -
50 мМ цитрат натрия с 50 мМ NaCl 2.92 9.60 5.5 13.61 +20
50 мМ цитрат натрия с 100 мМ NaCl 5.84 9.60 5.5 18.19 +61
50 мМ цитрат натрия с 150 мМ NaCl 8.77 9.60 5.5 22.40 +98
50 мМ Цитрат натрия с 200 мМ NaCl 11.69 9.60 5.5 26.70 +136
25 мМ MES c 50 мМ NaCl 2.92 5.53 5.6 7.65 -
25 мМ MES c 95 мМ NaCl 5.55 5.53 5.6 12.15 +59
25 мМ MES с 50 мМ NaCl и 5 г/л Герцептин® - 7.48 5.53 7.66 -
25 мМ MES с 95 мМ NaCl и 5 г/л Герцептин® - 11.26 5.50 12.22 +60
25 мМ MES с 50 мМ NaCl и 15 г/л Герцептин® - 7.11 5.50 7.52 -
25 мМ MES с 95 мМ NaCl и 15 г/л Герцептин® - 9.22 5.50 11.97 +59
20 мМ цитрат натрия - 3.84 6.2 4.22 -
20 мМ цитрат натрия с 5 мМ NaCl 0.29 3.84 6.2 4.62 +9
Термин "нанесение на" означает частичный этап способа очистки, в котором раствор вносится в контакт с материалом хроматографии. Это означает что либо а) раствор добавляют в хроматографическое устройство, в котором содержится материал хроматографии, или б) материал хроматографии добавляют в раствор. В случае а) раствор проходит через устройство, позволяя осуществлять взаимодействие между материалом хроматографии и веществами, содержащимися в растворе. В зависимости от условий, таких как, например, pH, проводимость, концентрация соли, температура и/или скорость потока, некоторые вещества из раствора могут быть связаны с материалом хроматографии, а другие вещества могут быть извлечены с материала хроматографии. Вещества, остающиеся в растворе или извлеченные с материала хроматографии, могут быть найдены в протоке. "Проток" означает раствор, полученный после прохождения через устройство, который может быть либо раствором для нанесения или буферным раствором, который используется для промывки колонки или для элюирования веществ, связанных с материалом хроматографии. В одном варианте исполнения устройство представляет собой колонку или кассету. В случае б) материал хроматографии может быть добавлен, например, в виде твердого вещества к раствору, например, содержащему интересующее вещество, которое должно быть очищено, что позволяет осуществить взаимодействие между материалом хроматографии и веществом в растворе. После взаимодействия материал хроматографии удаляется, например, фильтрацией, и вещество, связанное с материалом хроматографии, также удаляется с ним из раствора, в то время как вещества, не связанные с материалом хроматографии, остаются в растворе.
Термин "режим связывание-элюирование" означает режим работы этапа хроматографии, в котором раствор, содержащий интересующее вещество, которое должно быть очищено, наносят на материал хроматографии, в результате чего интересующее вещество связывается с материалом хроматографии. Таким образом, интересующее вещество удерживается на материале хроматографии, тогда как вещества, не представляющие интереса, удаляются с протоком или супернатантом. Интересующее вещество впоследствии выделяется с материала хроматографии на втором этапе с элюирующим раствором. В одном из вариантов исполнения способ, как описано в данном документе, работает в режиме связывание-элюирование.
Растворы, используемые в способе, как описано в данном документе, являются неочищенными или буферными растворами. Термин "буферный раствор" обозначает раствор, в котором изменения pH в результате добавления или высвобождения кислотных или щелочных веществ выравниваются при помощи растворенного буферного вещества. Любое буферное вещество с такими свойствами может быть использовано. Как правило, используются буферные вещества, фармацевтически приемлемые. В одном варианте исполнения буферный раствор выбирают из фосфатного буферного раствора, состоящего из фосфорной кислоты и/или ее солей, или ацетатного буферного раствора, состоящего из уксусной кислоты и/или ее солей, или цитратного буферного раствора, состоящего из лимонной кислоты и/или ее солей, или морфолин буферного раствора, или 2-(N-морфолино) этансульфонового буферного раствора, или гистидинового буферного раствора, или глицинового буферного раствора, или трис (гидроксиметил) аминометанового (трис) буферного раствора. В другом варианте исполнения буферный раствор выбирают из фосфатного буферного раствора, или ацетатного буферного раствора, или цитратного буферного раствора, или гистидинового буферного раствора. При необходимости буферный раствор может содержать дополнительные соли, такие как, например, хлорид натрия, сульфат натрия, хлорид калия, сульфат калия, цитрат натрия или цитрат калия.
Термины "градиентное элюирование" и "способ градиентного элюирования", которые в этом приложении используются как взаимозаменяемые, означают способ, в котором проводимость раствора, вызывающего элюирование, т.е. высвобождение связанного соединения с материала хроматографии, изменяется, т.е. поднимается или опускается непрерывно, т.е. концентрация изменяется последовательными малыми ступенями, каждая из которых не больше, чем изменение на 2% или на 1% от концентрации вещества, вызывающего элюирование. В этом "непрерывном элюировании" одно или более условий, например pH, ионная сила, концентрация соли, и/или поток хроматографии, могут быть изменены линейно, или экспоненциально, или асимптотически. В одном варианте исполнения изменение является линейным.
Термин "ступенчатое элюирование" означает способ, в котором, например, концентрация вещества, вызывающего элюирование, т.е. высвобождение связанного вещества с материала хроматографии, поднимается или опускается сразу, т.е. непосредственно от одного значения/уровня к следующему значению/уровню. В этом "ступенчатом элюировании" одно или более условий, например, pH, ионная сила, концентрация соли, и/или поток хроматографии, могут быть изменены все сразу от первого, например, начального значения до второго, например, финального значения. Таким образом, условия изменяются постепенно, т.е. ступенчато, в отличие от линейного изменения.
Термин "материал ионообменной хроматографии" означает неподвижную матрицу с высоким молекулярным весом, которая несет ковалентно связанные заряженные замещающие группы, используемые в качестве неподвижной фазы в ионообменной хроматографии. Для полной зарядовой нейтральности не ковалентно связанные противоионы также присоединены к ней. "Материал ионообменной хроматографии" имеет способность обменивать свои не ковалентно связанные противоионы на одинаково заряженные ионы из окружающего раствора. В зависимости от заряда замещающих его противоионов "ионообменные смолы" относятся к катионообменным смолам или анионообменным смолам. В зависимости от характера заряженной группы (замещающей группы) "ионообменная смола" относится, например, в случае катионообменных смол к смолам сульфоновой кислоты (S), или к сульфопропиловым смолам (SP), или к карбоксиметиловым смолам (CM).
Различные типы ионообменных материалов, то есть неподвижных фаз, доступны под разными названиями и разного производства множества компаний, таких как, например, катионообменные материалы Bio-Rex® (например, тип 70), Chelex® (например, тип 100), Macro-Prep® (например, типа CM, High S, 25 S), AG® (например, типа 50W, MP) производства BioRad лаборатории, WCX 2 производства Ciphergen, Dowex® МАС-3 производства Dow chemical company, Mustang C и Mustang S производства Pall Corporation, Cellulose CM (например, типа 23, 52), hyper-D, partisphere производства Whatman pic, Amberlite® IRC (например, типа 76, 747, 748), Amberlite® GT 73, Toyopearl® (например, типа SP, CM, 650M) производства Tosoh Bioscience GmbH, CM 1500 и CM 3000 производства BioChrom Labs, SP-Sepharose™, CM-Sepharose™ производства GE Healthcare, смолы Poros производства PerSeptive Biosystems, Asahipak ES (например, типа 502C), CXpak P, IEC CM (например, тип 825, 2825, 5025, LG), IEC SP (например, тип 420N, 825), IEC QA (например, типа LG, 825), производства Shoko America Inc., 50W катионообменная смола производства Eichrom Technologies Inc. В одном варианте исполнения катионообменный материал является сильным катионообменным материалом, таким как Macro-Prep® High S или 25S, или MacroCap SP, или Toyopearl® SP 650M, или Source S, или SP Sepharose, или POLYCAT A, или Mono S, или Highscreen SP.
Для специалиста в данной области техники хорошо известны процедуры и методы для преобразования аминокислотной последовательности, например полипептида, в соответствующую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эту аминокислотную последовательность. Таким образом, нуклеиновая кислота характеризуется последовательностью ее нуклеиновой кислоты, состоящей из отдельных нуклеотидов, а также аминокислотной последовательностью полипептида, кодируемого ею.
Термин "в условиях, подходящих для связывания» и его грамматические эквиваленты, используемые в этом приложении, означает, что интересующее вещество, например, изоформы антител, связывается с неподвижной фазой при попадании в контакт с ней, например, с ионообменным материалом. Это не обязательно означает, что 100% интересующего вещества связывается, но существенным образом 100% интересующего вещества связывается, т.е. по крайней мере 50% интересующего вещества связывается, предпочтительно по меньшей мере 75% интересующего вещества связывается, предпочтительно по меньшей мере 85% интересующего вещества связывается, более предпочтительно более чем 95% интересующего вещества связывается с неподвижной фазой.
Термин "терапевтическое антитело" означает антитело, которое проходит клинические испытания для утверждения в качестве терапевтического для человека и которое можно вводить индивидууму для лечения заболевания. В одном варианте исполнения антитело является терапевтическим антителом. В другом варианте исполнения терапевтическое антитело представляет собой моноклональное антитело. В еще одном варианте исполнения терапевтическое антитело получено от обезьяны или животного, трансформированного человеческим локусом антитела, или человеческое моноклональное антитело, или гуманизированное моноклональное антитело. В одном варианте исполнения терапевтическое антитело представляет собой человеческое моноклональное антитело. В еще одном варианте исполнения терапевтическое антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело. Терапевтические антитела широко используются для лечения различных заболеваний, таких как онкологические заболевания (например, гематологические и солидные злокачественные опухоли, включая не-Ходжкинскую лимфому, рак молочной железы и колоректальный рак), иммунологические заболевания, заболевания центральной нервной системы, сосудистые заболевания или инфекционные заболевания. Такие антитела являются в одном варианте исполнения антителами против ALK, рецептора киназы, связанной с адгезией (adhesion related kinase receptor) (например, Axl), или ERBB рецепторов (например, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4), или эритропоэтин-продуцирующих гепатоцеллюлярных рецепторов (erythropoietin-producing hepatocellular (EPH) receptors) (например, EphA1; EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4, EphB5, EphB6), или рецепторов фактора роста фибробластов (FGF) (например, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FGFR5), или Fgr, или IGF1R, или инсулинового рецептора, или LTK, или M-CSFR, или MUSK, либо рецепторов тромбоцитарного фактора роста (PDGF) (например, PDGFR-A, PDGFR-В), или RET, или ROR1, или ROR2, или ROS, или RYK, или рецепторов фактора роста эндотелия (VEGF) (например, VEGFR1/FLT1, VEGFR2/FLK1, VEGF3), или рецепторов тирозинкиназы с иммуноглобулин-подобным и EGF-подобным доменом (TIE)(например, TIE-1, TIE-2/TEK), или Тес, или TYRO10, или рецепторов инсулиноподобного фактора роста (IGF) (например, INS-R, IGF-IR, IR-R), или рецепторов дискоидин домена (DD) (например, DDR1, DDR2), либо рецептора c-Met (МЕТ), или recepteur d′origine nantais (RON, так же известный как рецептор, стимулирующий макрофаги-1), либо Flt3 (fins-related tyrosine kinase 3), или рецептора колониестимулирующего фактора 1 (CSF1), или рецептора C-kit (KIT, или SCFR), или рецепторов, связанных с инсулиновыми рецепторами (IRR), или CD19, или CD20, или HLA-DR, или CD33, или CD52, или G250, или GD3, или PSMA, или CD56, или СЕА, или антигена Lewis Y, или рецептора IL-6.
Термин "антитело" охватывает различные формы структур антитела, включая целые антитела и фрагменты антител. Антитела, описанные в данном документе, в одном варианте исполнения являются человеческими антителами, гуманизированными антителами, химерными антителами, или обедненными антителами T-клеточных антигенов. Генная инженерия антител описана, например, в Morrison, S.L, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 и US 5,204,244; Riechmann, L, et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи антитела разделены на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из этих классов делятся на подклассы (изотипы), т.е. IgG на IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, или IgA на IgA1 и IgA2. В соответствии с классом иммуноглобулина, к которому принадлежит антитело, константные области тяжелой цепи иммуноглобулинов называются α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG), and µ(IgM) соответственно. Термин "антитело человека класса IgG1" означает антитело, в котором аминокислотная последовательность константных доменов получена из аминокислотной последовательности человеческого IgG1. Этот термин включает человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела и конъюгаты антител.
"Гуманизированные" формы не человеческих антител (например, грызунов) представляют собой химерные антитела, которые частично содержат последовательности, полученные от не человеческого антитела и от антитела человека. По большей части, гуманизированные антитела получают из человеческих антител (реципиентные антитела), в которых остатки из гипервариабельной области заменены на остатки из гипервариабельной области не человеческого вида (донорские антитела), такого как мышь, крыса, кролик или не человеческие приматы, имеющие желаемую специфичность и аффинность. В некоторых случаях остатки из каркасной области (FR) антитела человека заменены соответствующими не человеческими остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать дополнительные модификации, например аминокислотные остатки, которые не встречаются в реципиентном антителе или в донорском антителе. Такие модификации в результате приводят к вариантам таких реципиентных или донорских антител, которые являются гомологичными, но не идентичными соответствующей последовательности родителя. Эти изменения сделаны для дальнейшего усовершенствования изготовления антител.
В общем, гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного, а обычно из двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют таковым из не человеческих донорских антител, и все или в основном все из FR являются человеческими реципиентными антителами. Гуманизированное антитело необязательно также будет содержать, по меньшей мере, часть константной области антитела, обычно от человеческого антитела.
Способы гуманизации не человеческих антител описаны в литературе. В одном варианте исполнения гуманизированное антитело имеет один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который не является человеком. Эти не человеческие аминокислотные остатки часто называют "импортированными" остатками, которые обычно берут из "импортного" вариабельного домена. Гуманизация может быть выполнена в соответствии со способом Winter и сотрудников, заменяя последовательности гипервариабельной области на соответствующие последовательности не человеческого антитела. Соответственно такие "гуманизированные" антитела представляют собой химерные антитела, в которых по существу меньше, чем интактный человеческий вариабельный домен заменен на соответствующую последовательность из не человеческого вида. На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки гипервариабельной области и, возможно, некоторые остатки FR-регионов заменены остатками из аналогичных участков грызунов или антител не человеческих приматов.
Термин "моноклональное антитело", используемый в данном документе, означает антитело, полученное из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают различные антитела, направленные против различных антигенных сайтов (детерминантов или эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одного антигенного сайта на антигене. В дополнение к их специфичности моноклональные антитела обладают тем преимуществом, что они могут быть синтезированы без загрязнения другими антителами. Определение «моноклональное» указывает на характер антитела, полученного, по существу, из гомогенной популяции антител, и не должно быть истолковано как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом.
Термин "химерное антитело" означает антитело, содержащее вариабельный домен, то есть связывающий участок, от первого вида и, по крайней мере, часть константной области, полученной из другого источника или второго вида, обычно полученное методами рекомбинантных ДНК.
Варианты аминокислотных последовательностей антител могут быть получены путем внесения соответствующих изменений в нуклеотидную последовательность, кодирующую цепи антитела, или пептидным синтезом. Такие модификации включают, например, делеции, и/или инсерции, и/или замены остатков аминокислотной последовательности интерферона. Любая комбинация делеции, инсерции и замены может быть сделана для достижения конечной конструкции, в том случае если конечная конструкция обладает антигенсвязывающими свойствами, как и родительское антитело.
Консервативные замены аминокислот приведены в Таблице 1 под заголовком «предпочтительные замены». Более существенные изменения приведены в последующей таблице под заголовком "примерные замены", и, как описано ниже, со ссылкой на классы боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены могут быть введены в цепи антител и продукты, прошедшие скрининг на сохранение биологической активности родительского антитела.
Таблица 1
Исходный остаток Примерные замены Предпочтительные замены
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucine Leu
Leu (L) Norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucine Leu
Аминокислоты могут быть разделены на группы в соответствии с общими свойствами боковых цепей:
(1) гидрофобные: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) кислые: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Неконсервативные замены повлекут за собой смену члена одного из этих классов на другой класс.
Hudziak, R.M., et al., Mol. Cell. Biol. 9 (1989) 1165-1172 описывают генерацию панели HER2 антител, которые были охарактеризованы с использованием клеточной линии человеческой опухоли молочной железы SK-BR-3. Относительную пролиферацию клеток SK-BR-3 после воздействия антител определяли путем окрашивания монослоя кристаллическим фиолетовым через 72 часа. С помощью этого теста максимальное ингибирование было получено с антителом, называемым 4D5, которое ингибировало клеточную пролиферацию на 56%. В этом анализе другие антитела в панели уменьшали клеточную пролиферацию в меньшей степени. Было также обнаружено, что антитело 4D5 сенсибилизировало HER2-гиперэкспрессирующие клетки из линии опухоли молочной железы к цитотоксической активности TNF-α (см. также US 5,677,171). HER2 антитела обсуждаются в Hudziak, R.M., et al.. дополнительно охарактеризованы в Fendly, В.М., et al., Cancer Research 50 (1990) 1550-1558; Kotts, C.E., et al., In Vitro 26 (1990) 59A; Sarup, J.C., et al., Growth Regulation 1 (1991) 72-82; Shepard, H.M., et al., J. Clin. Immunol. 11 (1991) 117-127; Kumar, R., et al., Mol. Cell. Biol. 11 (1991) 979-986; Lewis, G.D., et al., Cancer Immunol. Immunother. 37 (1993) 255-263; Pietras, R.J., et al., Oncogene 9 (1994) 1829-1838; Vitetta, E.S., et al., Cancer Research 54 (1994) 5301-5309; Sliwkowski, M.X., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665; Scott, G.K., et al., J. Biol. Chem. 266 (1991) 14300-14305; D′souza, В., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91 (1994) 7202-7206; Lewis, G.D., et al., Cancer Research 56 (1996) 1457-1465; и Schaefer, G., et al., Oncogene 15 (1997) 1385-1394.
Рекомбинантная гуманизированная версия мышиного антитела против HER2 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMab HER2, трастузумаб или Герцептин®; см. US 5,821,337) является клинически активной у пациентов с оверэкспрессирующим HER2 метастатическим раком молочной железы, которые получили обширную предшествующую противораковую терапию (Baselga, J., et al., J. Clin. Oncol. 14 (1996) 737-744). Трастузумаб получил предпродажное одобрение Food and Drug Administration (FDA) 25 сентября 1998 для лечения пациентов с метастатическим раком молочной железы, у которых опухоль оверрэкспрессировала белок HER2.
Гуманизированные анти-ErbB2 антитела включают huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 и huMAb4D5-8 (Герцептин®), как описано в Таблице 3 патента US 5,821,337, специально включенного в данный документ в качестве ссылки; гуманизированные 520C9 (WO 93/21319) и гуманизированные антитела 2C4, как описано в WO 01/000245, специально включены в данный документ в качестве ссылки.
Другие HER2 антитела с различными свойствами описаны в Tagliabue, Е., et al., Int. J. Cancer 47 (1991) 933-937; McKenzie, S.J., et al., Oncogene 4 (1989) 543-548; Maier, L.A., et al., Cancer Res. 51 (1991) 5361-5369; Bacus, S.S., et al., Molecular Carcinogenesis 3 (1990) 350-362; Stancovski, I., et al., PNAS USA 88 (1991) 8691-8695; Bacus, S.S., et al., Cancer Research 52 (1992) 2580-2589; Xu, F., et al., Int. J. Cancer 53 (1993) 401-408; WO 94/00136; Kasprzyk, P.G., et al., Cancer Research 52 (1992) 2771-2776; Hancock, M.C., et al., Cancer Res. 51 (1991) 4575-4580; Shawver, L.K., et al., Cancer Res. 54 (1994) 1367-1373; Arteaga, C.L., et al., Cancer Res. 54 (1994) 3758-3765; Harwerth, I.M., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 15160-15167; US 5,783,186; и Klapper, L.N., et al., Oncogene 14 (1997) 2099-2109.
Пертузумаб (см., например, WO 01/000245) является первым из нового класса агентов, известных как ингибиторы димеризации HER (HER dimerization inhibitors (HDIs)). Пертузумаб связывается с HER2 в его домене димеризации, тем самым препятствуя его способности образовывать активные димерные рецепторные комплексы и тем самым блокируя нижележащий сигнальный каскад, что в конечном итоге приводит к влиянию на рост и деление клеток (см. Franklin, М.С., Cancer Cell 5 (2004) 317-328). Пертузумаб является полностью гуманизированным рекомбинантным моноклональным антителом, направленным против внеклеточного домена HER2. Связывание Пертузумаба с HER2 на эпителиальных клетках человека предотвращает формирование комплексов HER2 с другими членами HER-семейства (в том числе EGFR, HER3, HER4) и, вероятно, HER2 гомодимеризацию. Блокируя образование комплексов, Пертузумаб предотвращает стимулирующий эффект на рост и сигналы выживания клеток, активируемые лигандами HER1, HER3 и HER4 (например, EGF, TGF-α амфирегулин и герегулины). Другим названием Пертузумаба является 2C4. Пертузумаб является полностью гуманизированным рекомбинантным моноклональным антителом, основаным на человеческой каркасной последовательности lgG1 (K). Структура Пертузумаба состоит из двух тяжелых цепей (449 остатков) и двух легких цепей (214 остатков). По сравнению с Трастузумабом (Герцептином®) Пертузумаб имеет 12 аминокислотных различий в легкой цепи и 29 аминокислотных различий в тяжелой цепи lgG1.
Термин "гидрофобный" означает соединения, которые преимущественно характеризуются ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями в качестве основных, или даже исключительно межмолекулярные взаимодействия должны быть рассмотрены. Термин "преимущественно" в данном контексте означает, что в принципе, гидрофильные соединения могут также и присутствовать, но они имеют лишь небольшое значение для общей характеристики химических и/или физических свойств соответствующего аналита. Противоположным термином для термина "гидрофобный" в контексте настоящего изобретения является термин "гидрофильный", который обозначает те соединения, которые характеризуются водородными связями и которые имеют сильный полярный и/или протонный характер. В одном варианте исполнения материал матрицы ионо-обменной хроматографии представляет собой гидрофобную матрицу.
Термин "протонный" означает свойство содержания или выделения протона(ов) и/или образования водородной связи(ей), такой как, например, вода, спирты, амины и т.п. Высвобождение протонов из молекулы также известно специалисту в области диссоциации. Простейшим протонным растворителем является вода, которая в упрощенном виде распадается на протон и гидроксилион. Известными протонными растворителями являются, например, спирты, в которых высвобождение протонов обычно происходит на гидроксильной группе, оставляя отрицательно заряженный атом кислорода бывшей гидроксильной группы, поскольку электроотрицательный атом кислорода способен стабилизировать полученный отрицательный заряд. Даже карбоновые кислоты можно рассматривать как протонные растворители, при условии, что выделение протонов с карбоксильной группы не приведет к химической реакции с конкретным веществом, которое, например, растворено в конкретном растворе. Еще одну группу протонных растворителей представляют амины, которые содержат "протоны", строго говоря, атомы водорода, в их аминогруппе, а также свободную пару электронов на соответствующем атоме азота для образования водородной связи.
Термин «подвижная фаза» означает любые смеси воды и/или водных буферов, и органических растворителей, пригодных для элюирования анализируемых веществ с хроматографической колонки. Термин "для элюирования" или "элюирование" соответственно в контексте настоящего изобретения используется, как известно специалисту в данной области техники, и означает растворение, при необходимости перемещение адсорбированного вещества (веществ) с тел или адсорбентов, которые пропитаны жидкостями, т.е. материал колонки, на который вещество (вещества) адсорбировано(ны).
Термин «адсорбция» означает накопление веществ из жидкости, например подвижной фазы на границе фазы, образованной жидкостью с веществом, причем последнее может адсорбировать вещества на своей поверхности. Эта адсорбция приводит к накоплению адсорбированного вещества на конкретной поверхности. Вещество, способное накапливать вещества на своей поверхности, часто называют адсорбентом и адсорбированный материал - адсорбатом. Термин адсорбция, как правило, отличается от термина "поглощение", который подразумевает, что за накоплением на поверхности также следует проникновение накопленных веществ внутрь адсорбирующего тела или жидкости. В общем, адсорбция является физическим процессом, в котором вещества, обычно молекулы, адгезируются на поверхности адсорбента и, таким образом, накапливаются на соответствующей поверхности. Силы, ответственные за это адгезирование, считаются физическими силами, а не химическими связями и, таким образом, адсорбция, как известно специалисту в данной области, является физической адсорбцией или физисорбцией, что не исключает химическое связывание вещества с поверхностью. Физические силы, участвующие в адсорбции веществ на поверхности, являются в большинстве случаев ван-дер-ваальсовыми силами, Лондонскими силами или диполь/дипольным взаимодействием, например, водородными связями, или диполь-индуцированным дипольным взаимодействием, причем эти термины используются либо как объяснено выше либо как обычно используются в контексте с адсорбцией.
В хроматографии (колоночной) обычно используются растворители в качестве элюента, т.е. элюирующего агента, в котором вещество (вещества), которые должны быть элюированы, по крайней мере, достаточно растворимы.
Термин "набухающая матрица" означает любой набухающий полимерный гель на основе мономеров, которые химически или физически связаны друг с другом с образованием трехмерной сети. Химическое соединение осуществляется путем образования связи, в то время как физическая конструкция набухающей матрицы может быть на основе электростатических, гидрофобных или диполь/дипольных взаимодействий между отдельными областями соответствующих сегментов полимера. Термин "набухающая матрица" в одном варианте исполнения означает полимерные гели, в которых трехмерная сеть получается путем образования химических связей. Сама сеть может состоять из одного или нескольких различных компонентов. В присутствии подходящего растворителя сеть набухает при одновременном включении соответствующего растворителя в свою трехмерную сеть до момента, пока равновесный объем включаемого объема не будет достигнут. В другой терминологии набухшее состояние сети известно как гель, и не набухшее состояние известно как гелеобразователь. В контексте настоящего изобретения термин набухающая матрица также включает в себя значение термина гелеобразователь.
Термин "набухающая матрица» означает только те гели, которые построены из гидрофильных, но водонерастворимых полимеров, которые разбухают в присутствии воды в качестве растворителя. Аффинность набухающих матриц к воде можно отнести к энергии взаимодействия с молекулами воды (сальвации) и энтропийным эффектам полимерной сети. Кроме воды чистые гидрофильные органические растворители, такие как, например, метанол, этанол и диметилформамид, а также их соответствующие водные растворы, содержащие органический растворитель в переменных количествах, оказывают эффект набухания на набухающую матрицу, где термин гидрофильный понимается как описано выше. Соответственно, термин «набухающая матрица» больше не ограничивается только теми гелями, которые набухают только при включении воды в их сети, но и ко включению гидрофильных органических растворителей, и/или их водных растворов, и/или смеси переменного состава.
В контексте с набухающей матрицей поперечное сшивание имеет важное значение, поскольку оно приводит к образованию трехмерной структуры, а также к образованию полостей, что позволяет набухать матрице. Кроме того, степень поперечной сшивки обязательно влияет на размер пор, полученных набухшей матрицей.
Таким образом, одним аспектом, как описано в данном документе, является способ для обогащения изоформами антител препарата антител, включающий следующие этапы:
а) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антител на материал катионообменной хроматографии,
б) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антител остаются связанными с материалом катионообменной хроматографии, а также
в) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии, и тем самым получение препарата антител, обогащенного изоформами антител,
где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора не более чем на 50%.
Один вариант исполнения представляет собой способ обогащения изоформами антител препарата антител, содержащий следующие этапы:
а) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антител на материал катионообменной хроматографии,
б) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антител остаются связанными с материалом катионообменной хроматографии, а также
в) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии, и тем самым получение препарата антител, обогащенного изоформами антител,
где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора не более чем на 10%.
Раствор стадии а) в одном варианте исполнения имеет такую же проводимость, как раствор стадии б).
«Изоформы антител» означает версию антитела с небольшими отличиями по отношению к другой изоформе одного и того же антитела. "То же антитело" означает антитело с той же аминокислотной последовательностью, за исключением модификации(ций) конкретной изоформы. Различные формы антител могут получиться во время транскрипции или трансляции последовательности, кодирующей антитело, а также могут быть различия, возникающие при процессинге и секреции антитела клеткой, в результате очистки, в процессе изготовления препарата и деградации во время хранения. Изоформы антител могут варьироваться по аминокислотной последовательности, мультимеризации, гликозилировании и других посттрансляционных модификациях. "Гликоформа" является изоформой, когда различные версии гликопротеинов имеют различные полисахариды, привязанные к ним, посттрансляционными модификациями. Также процессинг остатков лизина C-конеца тяжелой цепи антитела может быть источником структурных вариаций антител.
Было обнаружено, что изоформы антител в препарате антител могут быть обогащены или даже частично отделены с использованием колоночного метода катионообменной хроматографии. Это может быть достигнуто способом связывание-элюирование с использованием градиента pH или соли, линейно либо ступенчато, для выделения антитела с материала хроматографии. Способ особенно эффективен при использовании градиента с небольшим уклоном, т.е. имеющего относительное изменение pH или увеличение проводимости 50% или менее от исходного значения, в частности 10% или менее от исходного значения. Поскольку различные изоформы антител видны, по крайней мере, как полуразделенные пики в соответствующих хроматограммах, состав изоформ препарата антител может быть скорректирован на основе выбранных и сочетанных элюированных фракций, охватывающих соответствующие пики на хроматограмме.
Более конкретно было обнаружено, что обогащение изоформами антител препарата антител может быть достигнуто с подходящим увеличением проводимости подвижной фазы, нанесенной на материал катионообменной хроматографии.
Термин "препарат антител" означает смесь, содержащую различные изоформы одного и того же антитела.
Фиг.1. Хроматограмма элюирования с использованием линейного градиента от 20% об элюирующего буфера до 60% об элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 20 мМ цитрат натрия, элюирующий буфер содержит 20 мМ цитрат натрия и 100 мМ хлорид натрия). Видно, что изоформы антител выделяются в одном пике. Можно увидеть небольшой пре-пик.
Фиг.2. Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения ступенчатым градиентом от 24% об элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 20 мМ цитрат натрия, элюирующий буфер содержит 20 мМ цитрат натрия и 100 мМ хлорид натрия). Видно, что изоформы антител выделяются в виде полуразделенного пика.
Фиг.3. Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения ступенчатым градиентом от 15% об элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 20 мМ цитрат натрия, элюирующий буфер содержит 20 мМ цитрат натрия и 80 мМ хлорид натрия). Видно, что изоформы антител выделяются в виде двух полуразделенных пиков, в котором первый пик показывает пре-пик.
Фиг.4. Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения ступенчатым градиентом от 100% об элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 20 мМ цитрат натрия, элюирующий буфер содержит 20 мМ цитрат натрия и 5 мМ хлорид натрия). Видно, что изоформы антител выделяются в трех полуразделенных пиках.
Фиг.5. Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения, используя способ одноступенчатого элюирования, где проводимость была увеличена от 100% до 159%. Видно, что антитела выделяются в виде одного пика.
Фиг.6. Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения, используя линейный градиент от 100% об первого буферного раствора до 60% об второго буферного раствора (первый буфер содержит 25 мМ Трис и 10 мМ хлорид натрия, второй буфер содержит 25 мМ Трис и 70 мМ хлорид натрия, оба буфера имеют значение pH 7,4). Видно, что изоформы антител выделяются в трех пиках.
В одном варианте осуществления увеличение проводимости составляет 50% или менее, т.е. проводимость возрастает до 150% или меньше. Таким образом, второй раствор имеет проводимость от 101% до 150% от проводимости первого раствора. Увеличение может быть в виде одноступенчатого или линейного градиента. Увеличение может быть выполнено в виде полной замены элюирующего раствора, то есть от 100% первого (= отмывочного) раствора до 100% второго (= элюирующего) раствора.
В одном варианте осуществления увеличение проводимости составляет 10% или менее, т.е. проводимость возрастает до 110% или меньше. Таким образом, второй раствор имеет проводимость от 101% до 110% от проводимости первого раствора. Увеличение может быть выполнено в виде полной замены элюирующего раствора, то есть от 100% первого (= отмывочного) раствора до 100% второго (= элюирующего) раствора.
В одном варианте осуществления линейный градиент включает в себя три линейных градиента, каждый их которых имеет разный уклон.
В одном варианте осуществления первый линейный градиент составляет от 18 до 20 объемов колонки, второй линейный градиент составляет от 2 до 4 объемов колонки, и третий линейный градиент составляет от 6 до 8 объемов колонки. В одном варианте осуществления первый линейный градиент составляет приблизительно до 115% проводимости первого раствора, второй линейный градиент приблизительно до 137% проводимости первого раствора, а третий линейный градиент составляет приблизительно до 150% проводимости первого раствора.
Кроме того, было обнаружено, что матрица материала катионообменной хроматографии должна быть набухающей матрицей. В одном варианте осуществления матрица представляет собой поперечно-сшитый сахарид. В еще одном варианте исполнения сахарид представляет собой полисахарид. В другом варианте осуществления полисахарид представляет собой агарозу, т.е. полисахарид, состоящий из гликозидно связанных D-галактозы и 3,6-ангидро-L-галактозы.
Таким образом, другой аспект, как описано в данном документе, представляет собой способ получения препарата антител, включающий следующие этапы:
а) культивирование клеток млекопитающих, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, и выделение антител из клеток или культуральной среды,
б) очистка антител по крайней мере одним этапом колоночной хроматографии, где по меньшей мере один хроматографический этап включает следующие этапы:
1) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антител на материал катионообменной хроматографии,
2) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антител остаются связанными с материалом катионообменной хроматографии, а также
3) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии, и таким образом, получение препарата антител,
где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора не более чем на 10%.
В одном варианте осуществления способ представляет собой способ получения в больших масштабах. В другом варианте осуществления большие масштабы составляют 1 г или более препарата антител.
Следующие примеры и фигуры предназначены для облегчения понимания настоящего изобретения, полный объем которого изложен в прилагаемой формуле изобретения. Понятно, что могут быть сделаны модификации в изложенных процедурах, без отхода от сути настоящего изобретения.
Описание фигур
Фиг.1. Хроматограмма элюирования с использованием линейного градиента от 20% об. элюирующего буфера до 60% об. элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 20 мМ цитрат натрия, элюирующий буфер содержит 20 мМ цитрат натрия и 100 мМ хлорид натрия).
Фиг.2. Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения ступенчатым градиентом от 24% об. элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 20 мМ цитрат натрия, элюирующий буфер содержит 20 мМ цитрат натрия и 100 мМ хлорид натрия).
Фиг.3. Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения ступенчатым градиентом от 15% об. элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 20 мМ цитрат натрия, элюирующий буфер содержит 20 мМ цитрат натрия и 80 мМ хлорид натрия).
Фиг.4. Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения ступенчатым градиентом от 100% об. элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 20 мМ цитрат натрия, элюирующий буфер содержит 20 мМ цитрат натрия и 5 мМ хлорид натрия).
Фиг.5. Одноступенчатое элюирование анти-HER-2-антител с сильной катионообменной смолы SP-сефарозы; мономерные и агрегированные формы антител не разделены и элюированы в виде одного пика.
Фиг.6 Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения, используя линейный градиент до 60% об. элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 25 мМ Трис и 10 мМ хлорид натрия, элюирующий буфер содержит 25 Трис и 70 мМ хлорид натрия).
Примеры
Материалы и методы
Анти-HER2 антитела, описанные в WO 92/022653, WO 99/057134, WO 97/04801, US 5,677,171 и US 5,821,337 (включенные в данный документ в качестве ссылки), являются иллюстрацией иммуноглобулинов, которые могут быть использованы в способе, как описано в данном документе.
Аналитическая гель-фильтрация:
Смола: TSK 3000 (Tosohaas)
Колонка: 300×7,8 мм
Скорость потока: 0,5 мл/мин
Буферный раствор: 200 мМ фосфат калия, содержащий 250 мМ хлорид калия, подведенный pH 7,0
Длина волны: 220 нм
Аналитическая ИО-ВЭЖХ
Смола: Dionex ProPac™ WCX-10 Analytical Grade
Колонка: 4×250 мм
Скорость потока: 0,8 мл/мин
Буфер А: 10 мМ фосфат натрия, подведенный pH 7,5
Буфер Б: 10 мМ фосфат натрия, подведенный pH 7,5, с добавлением 0,1 М хлорида натрия
Начальные условия: 85% об буфера А и 15% об. буфера Б
Градиент: до 55% об. буфера Б в 9 объемах колонки
Длина волны для детекции: 214 нм
Количество пробы: 50 мкг
Образец и карбоксипептидазу В разводили до конечной концентрации 1 мг/мл буфером для внесения. 1% (весовой процент) разбавленный раствор карбоксипептидазы добавляли в разбавленный раствор для внесения.
Пример 1
Хроматография с комбинированным градиентом элюирования до 60% об. буфера для элюирования на SP-сефарозе.
Условия хроматографии:
Смола: Highscreen SP-Sepharose
Скорость потока: 1,2 мл/мин
Уравновешивание: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2
Нагрузка: 1 г белка/л материала хроматографии
Отмывка: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2
Элюирование: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2, с добавлением 100 мМ хлорида натрия
Способ элюирования:
Сочетание ступенчатого и линейного градиента.
Ступенчатый градиент до 20% элюирующего буфера, а затем линейный градиент до 60% элюирующего буфера.
Хроматограмма элюирования показана на Фиг 1. Видно, что изоформы антител могут быть выделены в одном пике. Можно увидеть небольшой пре-пик.
Пример 2
Хроматография с элюированием ступенчатым градиентом до 24% об. элюирующего буфера на SP-сефарозе.
Условия хроматографии:
Смола: Highscreen SP-Sepharose
Скорость потока: 1,2 мл/мин
Уравновешивание: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2
Нагрузка: 1 г белка/л материала хроматографии
Отмывка: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2
Элюирование: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2, с добавлением 100 мМ хлорида натрия
Способ элюирования:
одноступенчатый градиент
ступенчатый градиент до 24% элюирующего буфера и элюирование в более чем 20 объемах колонки.
Хроматограмма элюирования показана на Фиг 2. Видно, что изоформы антител могут быть выделены в полуразделенном пике.
Пример 3
Хроматография с элюированием ступенчатым градиентом до 15% об элюирующего буфера на SP-сефарозе.
Условия хроматографии:
Смола: Highscreen SP-Sepharose
Скорость потока: 1,2 мл/мин
Уравновешивание: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2
Нагрузка: 1 г белка/л материала хроматографии
Отмывка: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2
Элюирование: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2, с добавлением 80 мМ хлорида натрия
Способ элюирования:
одноступенчатый градиент
ступенчатый градиент до 15% элюирующего буфера и элюирование в более чем 20 объемах колонки.
Хроматограмма элюирования показана на Фиг 3. Видно, что изоформы антител могут быть выделены в двух полуразделенных пиках, где первый пик показывает пре-пик.
Пример 4
Хроматография с элюированием ступенчатым градиентом до 100% об. элюирующего буфера на SP-сефарозе.
Условия хроматографии:
Смола: Highscreen SP-Sepharose
Скорость потока: 1,2 мл/мин
Уравновешивание: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2
Нагрузка: 1 г белка/л материала хроматографии
Отмывка: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2
Элюирование: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2, с добавлением 5 мМ хлорида натрия
Способ элюирования:
одноступенчатый
одноступенчатый градиент до 100% элюирующего буфера и элюирование в более чем 20 объемах колонки.
Хроматограмма элюирования показана на Фиг 4. Видно, что изоформы антител могут быть выделены в трех полуразделенных пиках.
Пример 5
Хроматография элюирования с градиентом pH до 100% об элюирующего буфера на MonoS сильной катионообменной смоле.
Условия хроматографии:
Смола: MonoS
Уравновешивание: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 5,2
Отмывка: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 5,2
Элюирование: 50 мМ фосфат натрия, доведенный pH 7,5
Способ элюирования:
градиентное элюирование
от 0% до 100% элюирующего буфера.
Изоформы могут быть получены в виде трех полуразделенных пиков.
Пример 6
Сравнительный пример - хроматографическое разделения моноклональных анти-HER-2-антител (WO 99/57134) на сильной катионообменной смоле (SP-сефарозе).
Была проведена очистка моноклональных анти-HER2 (Herceptin ®) антител на катионообменной хроматографии с SP-сефарозой, с сильной катионообменной смолой. При стандартных условиях, т.е. этап элюирования, например, с хлоридом натрия, не произошло разделения мономерных и агрегированных форм антител (Фиг 5).
Условия хроматографии:
Смола: SP-Sepharose
Скорость потока: 160 см/ч
Уравновешивание: 25 мМ 2-морфолиноэтансульфоновая кислота, 50 мМ хлорид натрия, доведенный pH 5,6
Нагрузка: максимум 20 г белка/л гелевой матрицы
Отмывка: 25 мМ 2-морфолиноэтансульфоновая кислота, 50 мМ хлорид натрия, доведенный pH 5,6
Элюирование: 25 мМ 2-морфолиноэтансульфоновая кислота, 95 мМ хлорид натрия, доведенный pH 5,6
Моноклональное анти-HER-2-антитела очищали на первом этапе на протеин A аффинной хроматографии. Элюирование с протеин A колонки осуществляли в кислых условиях (10 мМ натрий-цитратный буфер, pH 3,0±0,5). Перед этапом фильтрации значение pH фракции, содержащей антитела, подводили с помощью концентрированного трис-гидроксиметил-амино-метана (трис) буфера, pH 5,6. Элюат с протеина A представляет собой раствор с концентрацией белка в пределах от 5 мг/мл до 15 мг/мл, забуференный цитратом натрия.
Кондиционированный элюат с протеина A наносили на хроматографическую колонку, содержащую сильную катионообменную смолу (SP-сефарозу). После этапа прогона, при скорости потока 160 см/ч колонку промывали уравновешивающим буфером (10 объемов колонки). Связанные иммуноглобулины элюировали одним этапом способа элюирования, где значение pH поддерживали постоянным, и проводимость варьировали путем (ступенчатого) увеличения концентрации хлорида натрия. Хроматограмма элюирования отображена на Фиг 5.
Не было достигнуто разделения мономерных и агрегированных форм антител.
Пример 7
Хроматография с градиентным элюированием до 60% об. элюирующего буфера на Source™ 15S.
Условия хроматографии:
Смола: Source™ 15S
Объем колонки: 1,14 л
Скорость потока: 100 см/ч
Уравновешивание: 25 мМ Трис, 10 мМ хлорид натрия, доведенный pH 7,4 Нагрузка: 0,88 г белка/л материала хроматографии
Отмывка: 25 мМ Трис, 10 мМ хлорид натрия, доведенный pH 7,4
Элюирование: 25 мМ Трис, 70 мМ хлорид натрия, доведенный pH 7,4
Способ элюирования:
градиент
до 33% об. элюирующего буфера в 19 объемах колонки
до 50% об. элюирующего буфера в 3 объемах колонки
до 60% об. элюирующего буфера в 7 объемов колонки
Хроматограмма элюирования показана на Фиг 6. Видно, что изоформы антител могут быть выделены в выраженном пике.

Claims (10)

1. Способ получения обогащенного изоформами препарата антител, включающий следующие этапы:
а) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антитела на материал катионообменной хроматографии,
б) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антитела остаются адсорбированными на материале катионообменной хроматографии,
в) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии и тем самым получение препарата антитела,
где проводимость первого раствора составляет от 4 мСм/см до 5 мСм/см,
где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора не более чем на 10%,
где материал катионообменной хроматографии имеет набухающую матрицу, представляющую собой полимерный гель на основе мономеров, которые химически или физически связаны друг с другом с образованием трехмерной сети и которые в присутствии подходящего растворителя набухают при одновременном включении соответствующего растворителя в свою трехмерную сеть до момента, пока равновесный объем включаемого объема не будет достигнут, и где происходит одноступенчатая замена первого раствора на второй раствор.
2. Способ получения обогащенного изоформами препарата антитела, включающий следующие этапы:
а) культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, и выделение антитела из клеток или культуральной среды,
б) очистка антитела по меньшей мере одним этапом колоночной хроматографии, где этот по меньшей мере один хроматографический этап включает следующие этапы:
1) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антитела на материал катионообменной хроматографии,
2) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антитела остаются связанными с материалом катионообменной хроматографии, а также
3) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии и, таким образом, получение препарата антитела,
где проводимость первого раствора составляет от 4 мСм/см до 5 мСм/см,
где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора не более чем на 10%,
где материал катионообменной хроматографии имеет набухающую матрицу, представляющую собой полимерный гель на основе мономеров, которые химически или физически связаны друг с другом с образованием трехмерной сети, и которые в присутствии подходящего растворителя набухают при одновременном включении соответствующего растворителя в свою трехмерную сеть до момента, пока равновесный объем включаюемого объема не будет достигнут, и
где происходит одноступенчатая замена первого раствора на второй раствор.
3. Способ по любому из пп.1 или 2, где набухающая матрица является агарозой.
4. Способ по любому из пп.1 или 2, где материал катионообменной хроматографии является сильным материалом катионообменной хроматографии.
5. Способ по п.4, где сильным катионообменным материалом хроматографии является сульфопропил-катионообменный материал хроматографии.
6. Способ по любому из пп.1 или 2, где одна ступень является изменением от 100 об.% первого раствора до 100 об.% второго раствора.
7. Способ по любому из пп.1 или 2, где первый раствор содержит 20 мМ цитрат натрия, 10 мМ хлорид натрия или 25 мМ Трис и 10 мМ хлорид натрия.
8. Способ по любому из пп.1 или 2, где второй раствор содержит 20 мМ цитрат натрия и 5 мМ хлорид натрия или 25 мМ Трис и 70 мМ хлорид натрия.
9. Способ по любому из пп.1 или 2, где антителом является анти-HER2 антитело.
10. Способ по п.9, где анти-HER2 антитело является анти-HER2 антителом Трастузумаб или анти-HER2 антителом Пертузумаб.
RU2013132405/10A 2010-12-21 2011-12-19 Препарат антитела, обогащенного изоформами и способ его получения RU2586515C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10196287 2010-12-21
EP10196287.6 2010-12-21
PCT/EP2011/073245 WO2012084829A1 (en) 2010-12-21 2011-12-19 Isoform enriched antibody preparation and method for obtaining it

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2013132405A RU2013132405A (ru) 2015-01-27
RU2586515C2 true RU2586515C2 (ru) 2016-06-10

Family

ID=43799680

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013132405/10A RU2586515C2 (ru) 2010-12-21 2011-12-19 Препарат антитела, обогащенного изоформами и способ его получения

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20140162317A1 (ru)
EP (1) EP2655412B1 (ru)
JP (1) JP5838221B2 (ru)
KR (1) KR101574864B1 (ru)
CN (1) CN103380144B (ru)
BR (1) BR112013012422A2 (ru)
CA (1) CA2820095C (ru)
HK (1) HK1186484A1 (ru)
MX (1) MX357821B (ru)
RU (1) RU2586515C2 (ru)
WO (1) WO2012084829A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2813990C2 (ru) * 2017-11-01 2024-02-21 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Варианты и изоформы антител с пониженной биологической активностью

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8911964B2 (en) 2006-09-13 2014-12-16 Abbvie Inc. Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody
SG10201510384UA (en) 2006-09-13 2016-01-28 Abbvie Inc Cell culture improvements
WO2010048192A2 (en) 2008-10-20 2010-04-29 Abbott Laboratories Viral inactivation during purification of antibodies
MX2011004200A (es) 2008-10-20 2011-05-24 Abbott Lab Aislamento y purificacion de anticuerpos usando la cromatografia de afinidad de proteina a.
US9810670B2 (en) 2012-11-15 2017-11-07 Genentech, Inc. Ionic strength-mediated pH gradient ion exchange chromatography
WO2015064971A1 (ko) * 2013-10-30 2015-05-07 (주)셀트리온 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 항체의 아형 분리 방법
WO2015083853A1 (ko) * 2013-12-05 2015-06-11 한화케미칼 주식회사 이성질 항체의 함량 조절을 통한 항체 제조 방법
JP2021006540A (ja) * 2014-09-10 2021-01-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ガラクトース操作型免疫グロブリン１抗体
CA3010612A1 (en) * 2016-01-08 2017-07-13 Oncobiologics, Inc. Methods for separating isoforms of monoclonal antibodies
TWI679209B (zh) * 2017-04-14 2019-12-11 南韓商Ｃｊ醫藥健康股份有限公司 使用陽離子交換層析法純化同功抗體之方法
CN115728433A (zh) * 2021-08-27 2023-03-03 联邦生物科技(珠海横琴)有限公司 IgG4型单克隆抗体电荷异质性的离子交换色谱检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004024866A2 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Genentech, Inc. Protein purification
WO2008025748A1 (en) * 2006-08-28 2008-03-06 Ares Trading S.A. Process for the purification of fc-containing proteins
US20090105465A1 (en) * 2005-04-11 2009-04-23 Medarex, Inc. Protein Purification Using HCIC and Ion Exchange Chromatography
US20100022757A1 (en) * 2007-01-17 2010-01-28 Merck Serono Sa Process for the Purification of FC-Containing Proteins
RU2389552C2 (ru) * 2004-10-21 2010-05-20 Джи-И Хелткер Байо-Сайенсиз АБ Способ очистки антител

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
WO1993021319A1 (en) 1992-04-08 1993-10-28 Cetus Oncology Corporation HUMANIZED C-erbB-2 SPECIFIC ANTIBODIES
JPH08504172A (ja) 1992-06-30 1996-05-07 オンコロジクス，インコーポレイティド 抗−ｅｒｂＢ−２モノクロナール抗体の組み合わせ物及び使用方法
US5429746A (en) 1994-02-22 1995-07-04 Smith Kline Beecham Corporation Antibody purification
SI2275119T1 (sl) 1995-07-27 2013-12-31 Genentech, Inc. Stabilna izotonična liofilizirana proteinska formulacija
US5783186A (en) 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
DK1308456T3 (da) 1998-05-06 2007-12-27 Genentech Inc Antistofoprensning ved ionbytterkromatografi
IL146954A0 (en) 1999-06-25 2002-08-14 Genentech Inc HUMANIZED ANTI-ErbB2 ANTIBODIES AND TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
AU2003210802B2 (en) 2002-02-05 2009-09-10 Genentech Inc. Protein purification
GB0304576D0 (en) * 2003-02-28 2003-04-02 Lonza Biologics Plc Protein a chromatography
AU2004215653B2 (en) 2003-02-28 2011-03-17 Lonza Biologics Plc. Antibody purification by protein A and ion exchange chromatography
TWI391399B (zh) * 2005-05-25 2013-04-01 Hoffmann La Roche 測定溶離多肽之鹽濃度之方法
KR20150006085A (ko) * 2006-04-05 2015-01-15 애브비 바이오테크놀로지 리미티드 항체 정제
SI2215117T2 (en) * 2007-10-30 2018-04-30 Genentech, Inc. Purification of the antibody by cation exchange chromatography
CA2726823A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Patrys Limited Process for purification of antibodies
AU2010275774B2 (en) * 2009-07-24 2016-03-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Optimizing the production of antibodies

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004024866A2 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Genentech, Inc. Protein purification
RU2389552C2 (ru) * 2004-10-21 2010-05-20 Джи-И Хелткер Байо-Сайенсиз АБ Способ очистки антител
US20090105465A1 (en) * 2005-04-11 2009-04-23 Medarex, Inc. Protein Purification Using HCIC and Ion Exchange Chromatography
WO2008025748A1 (en) * 2006-08-28 2008-03-06 Ares Trading S.A. Process for the purification of fc-containing proteins
US20100022757A1 (en) * 2007-01-17 2010-01-28 Merck Serono Sa Process for the Purification of FC-Containing Proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kaltenbrunner O. et. al., Isoprotein analysis by ion-exchange chromatography using a linear pH gradient combined with a salt gradient, Journal of chromatography, 1993, v. 639, no. 1, p. 41-49. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2813990C2 (ru) * 2017-11-01 2024-02-21 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Варианты и изоформы антител с пониженной биологической активностью

Also Published As

Publication number Publication date
US10087237B2 (en) 2018-10-02
US20170066814A1 (en) 2017-03-09
CA2820095C (en) 2019-02-26
CN103380144A (zh) 2013-10-30
MX2013007095A (es) 2013-07-29
BR112013012422A2 (pt) 2016-08-30
EP2655412A1 (en) 2013-10-30
HK1186484A1 (zh) 2014-03-14
KR20130114209A (ko) 2013-10-16
JP5838221B2 (ja) 2016-01-06
RU2013132405A (ru) 2015-01-27
US20140162317A1 (en) 2014-06-12
JP2014500289A (ja) 2014-01-09
KR101574864B1 (ko) 2015-12-11
EP2655412B1 (en) 2018-01-17
CN103380144B (zh) 2016-03-02
MX357821B (es) 2018-07-25
WO2012084829A1 (en) 2012-06-28
CA2820095A1 (en) 2012-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2586515C2 (ru) Препарат антитела, обогащенного изоформами и способ его получения
US10239951B2 (en) Bispecific HER2 and HER3 antigen binding constructs
JP6273326B2 (ja) 移動相の調整によって、ポリペプチド単量体、凝集物およびフラグメントを分離するための選択性を向上させた、イオン交換クロマトグラフィー
US20210100914A1 (en) Antibodies
AU2020318112C1 (en) Polypeptide complex for conjugation and use thereof