KR20130114209A

KR20130114209A - 이소폼이 농축된 항체 제제 및 그의 제조 방법

Info

Publication number: KR20130114209A
Application number: KR1020137018847A
Authority: KR
Inventors: 로버토 팔켄스타인; 클라우스 슈벤드너; 베른하르트 스펜스버거
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2010-12-21
Filing date: 2011-12-19
Publication date: 2013-10-16
Also published as: RU2013132405A; RU2586515C2; CA2820095A1; HK1186484A1; KR101574864B1; EP2655412B1; CN103380144B; MX357821B; US10087237B2; US20140162317A1; WO2012084829A1; US20170066814A1; CN103380144A; BR112013012422A2; EP2655412A1; JP2014500289A; CA2820095C; JP5838221B2; MX2013007095A

Abstract

본원에는 a) 항체의 상이한 이소폼들을 포함하는 완충 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고, b) 제 1 전도도를 갖는 제 1 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고, 이때, 항체 이소폼은 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 결합된채 유지되며, c) 제 2의 전도도를 갖는 제 2 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하여 항체 제제를 수득하는 단계(이때, 제 2 용액의 전도도는 제 1 용액의 전도도를 10% 이하로 초과한다)를 포함하는, 항체 제제의 제조 방법이 기술되어 있다.

Description

이소폼이 농축된 항체 제제 및 그의 제조 방법{ISOFORM ENRICHED ANTIBODY PREPARATION AND METHOD FOR OBTAINING IT}

본원에는 강 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에서의 단계 용출 방법을 포함하는, 항체 제제를 수득하기 위한 방법이 기술되어 있다.

미생물 단백질을 사용한 친화성 크로마토그래피(예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, 양이온 교환(카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노 에틸 수지) 및 혼합식 교환), 친티오성(thiophilic) 흡착(예를 들면, 베타-머캅토에탄올 및 다른 SH 리간드 사용), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피(예를 들면, 페닐-세파로스, 친아자-아레노성(aza-arenophilic) 수지 또는 m-아미노페닐보론산 사용), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피(예를 들면, Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질 사용), 크기 배제 크로마토그래피, 및 전기영동 방법(예를 들면, 겔 전기영동, 모세관 전기영동)과 같은 다양한 방법들이 단백질 정제에 대해 잘 확립되어 있고 널리 사용되고 있다(문헌 [Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102]).

약학적 항체의 산업적 정제, 특히 크로마토그래피 공정의 개발, 시행 및 검증이 문헌 [Fahrner, R.L., et al., Biotechnol. Gen. Eng. Rev. 18 (2001) 301-327]에 보고되어 있다. 문헌 [Follman, D.K. and Fahrner, R.L., J. Chrom. A 1024 (2004) 79-85]은 단백질 A없이 3개 크로마토그래피 단계를 사용하는 항체 정제 공정의 요인 선별검사를 보고하고 있다. 고 전하밀도를 나타내는 이온 교환 매질에 의한 세포 배양물 상등액으로부터 인간 단클론성 항체의 포획이 문헌 [Necina, R., et al., Biotechnol. and Bioeng. 60 (1998) 689-698]에 보고되어 있다. 이온 교환 크로마토그래피에 의한 단백질 정제는 WO 99/057134 호에 보고되어 있다. WO 2004/076485 호에는 단백질 A 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 항체 정제가 보고되어 있다. US 5,429,746 호에는 항체 정제가 보고되어 있다. 단백질 정제는 WO 2003/066662 호에 보고되어 있다.

WO 2006/125599 호는 항체의 정제 방법을 보고하고 있다. 단백질 A 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 항체 정제는 WO 2004/076485 호에 보고되어 있다.

항체 이소폼(isoform)의 크로마토그래피 분리 및/또는 농축은 양이온 교환 크로마토그래피 물질 상에서 이동상의 적절한 전도도 증가에 의해 가능한 것으로 밝혀졌다. 필요한 전도도 증가는 50% 이하이다, 즉, 제 2 용액은 제 1 용액 전도도의 101 내지 150%의 전도도를 갖는다.

따라서, 본원에 기재된 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는, 항체 제제를 제공하는 방법이다:

a) 항체의 상이한 이소폼을 포함하는 완충 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고,

b) 제 1 전도도를 갖는 제 1 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고, 이때 항체 이소폼은 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 결합되어 유지되며,

c) 제 2 전도도를 갖는 제 2 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용함으로써 항체 제제를 수득한다(이때, 제 2 용액의 전도도는 제 1 용액의 전도도를 1% 이상, 50% 이하로 초과한다).

한 태양에서, 제 2 용액의 전도도는 제 1 용액의 전도도를 1% 이상, 20% 이하로 초과한다.

한 태양에서, 제 2 용액의 전도도는 제 1 용액의 전도도를 1% 이상, 15% 이하로 초과한다.

한 태양에서, 제 2 용액의 전도도는 제 1 용액의 전도도를 1% 이상, 10% 이하로 초과한다.

한 태양에서, 단계 a)의 용액은 단계 b)의 용액과 동일한 전도도를 갖는다. 한 태양에서, 항체의 상이한 이소폼을 포함하는 완충 용액은 제 1 전도도를 가지며, 제 1 용액은 동일한 (제 1) 전도도를 갖는다.

한 태양에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 팽윤성 매트릭스를 포함한다. 한 태양에서, 팽윤성 매트릭스는 아가로스이다.

한 태양에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 강 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 한 태양에서, 강 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설포프로필-양이온 교환 크로마토그래피 물질이다.

한 태양에서, 제 1 용액은 단일 단계에서 제 2 용액으로 교체된다. 한 태양에서, 상기 단일 단계는 100 부피%의 제 1 용액으로부터 100 부피%의 제 2 용액으로의 교체이다.

한 태양에서, 제 1 용액은 선형 구배로 제 2 용액으로 교체된다. 한 태양에서, 상기 선형 구배는 약 30개 컬럼 부피에 걸쳐 이루어진다. 한 태양에서, 선형 구배는 약 20개 컬럼 부피에 걸쳐 이루어진다.

한 태양에서, 제 1 용액은 20 mM 시트르산 나트륨을 포함한다.

한 태양에서, 제 2 용액은 20 mM 시트르산 나트륨 및 5 mM 염화 나트륨을 포함한다.

한 태양에서, 제 1 용액은 25 mM 트리스(하이드록시메틸)아미노 메탄 및 10 mM 염화 나트륨을 포함한다.

한 태양에서, 제 2 용액은 25 mM 트리스(하이드록시메틸)아미노 메탄 및 70 mM 염화 나트륨을 포함한다.

한 태양에서, 제 2 용액은 25 mM 트리스(하이드록시메틸)아미노 메탄 및 45 mM 염화 나트륨을 포함한다.

한 태양에서, 제 1 및 제 2 용액은 수용액이다.

한 태양에서, 항체는 항-HER2 항체이다. 한 태양에서, 항-HER2 항체는 항-HER2 항체 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 항-HER2 항체 퍼투주맙(Pertuzumab)이다. 한 태양에서, 항-HER2 항체는 인간화 항-HER2 항체이다.

본원에는 또 다른 양태로서 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득된 항체 체제가 기재되어 있다. 한 태양에서, 항체는 항-HER2 항체이다.

본원에 기재된 바와 같은 또 다른 양태는 하기 단계를 포함하는, 항체 제제를 수득하는 방법이다:

a) 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하고 상기 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하고,

b) i) 항체의 상이한 이소폼을 포함하는 완충 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고, ii) 제 1 전도도를 갖는 제 1 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고, 이때 항체 이소폼은 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 결합되어 유지되며, iii) 제 2 전도도를 갖는 제 2 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용함으로써 항체 제제를 수득하는 단계(이때, 제 2 용액의 전도도는 제 1 용액의 전도도를 1% 이상, 10% 이하로 초과한다)를 포함하는 하나 이상의 컬럼 크로마토그래피 단계에 의해 항체를 정제한다.

본원에 기재된 바와 같은 모든 양태들의 한 태양에서, 제 1 용액은 4 내지 5 mS/cm의 전도도를 갖는다.

도 1은 20 부피% 용출 완충액으로부터 60 부피% 용출 완충액까지의 선형 구배를 이용한 컬럼 크로마토그래피 분리의 용출 크로마토그램을 나타낸 것이다(세척 완충액은 20 mM 시트르산 나트륨을 포함하고, 용출 완충액은 20 mM 시트르산 나트륨 및 100 mM 염화 나트륨을 포함한다).
도 2는 24 부피% 용출 완충액의 단계 구배를 이용한 컬럼 크로마토그래피 분리의 용출 크로마토그램을 나타낸 것이다(세척 완충액은 20 mM 시트르산 나트륨을 포함하고, 용출 완충액은 20 mM 시트르산 나트륨 및 100 mM 염화 나트륨을 포함한다).
도 3은 15 부피% 용출 완충액의 단계 구배를 이용한 컬럼 크로마토그래피 분리의 용출 크로마토그램을 나타낸 것이다(세척 완충액은 20 mM 시트르산 나트륨을 포함하고, 용출 완충액은 20 mM 시트르산 나트륨 및 80 mM 염화 나트륨을 포함한다).
도 4는 100 부피% 용출 완충액의 단계 구배를 이용한 컬럼 크로마토그래피 분리의 용출 크로마토그램을 나타낸 것이다(세척 완충액은 20 mM 시트르산 나트륨을 포함하고, 용출 완충액은 20 mM 시트르산 나트륨 및 5 mM 염화 나트륨을 포함한다).
도 5는 강 양이온 교환 수지 SP-세파로스로부터의 항-HER2 항체의 단일 단계 용출 결과로서; 항체의 단량체 및 응집 형태는 분리되지 않고 하나의 피크로서 용출된다.
도 6은 60 부피% 용출 완충액의 선형 구배를 이용한 컬럼 크로마토그래피 분리의 용출 크로마토그램을 나타낸 것이다(세척 완충액은 25 mM TRIS 및 10 mM 염화 나트륨을 포함하고, 용출 완충액은 25 mM TRIS 및 70 mM 염화 나트륨을 포함한다).

본원에는 i) 항체의 상이한 이소폼을 포함하는 완충 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고, ii) 제 1 전도도를 갖는 제 1 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고, 이때 항체 이소폼은 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 결합되어 유지되며, iii) 제 2 전도도를 갖는 제 2 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용함으로써 항체 제제를 수득하는 단계(이때, 제 2 용액의 전도도는 제 1 용액의 전도도를 50% 이하로 초과한다)를 포함하는, 항체 제제를 수득하는 방법이 기재되어 있다.

일반적으로, 재조합적으로 생성된 단클론성 항체(mAb)는 생성 세포, 예를 들어, BHK 또는 Sp2/0 또는 CHO 또는 HEK 세포의 배양 상등액으로부터 회수된다. 부수적으로, 또한 다른 단백질성 화합물 및 항체 이소폼들도 회수된다. 항체 이소폼은 글리코실화 패턴, 중쇄 C-말단 라이신 이질성, 및 아스파라긴 또는 글루타민 아미노산 잔기의 부분 탈아미드화와 같은 미미한 구조적 특성에서만 상이하다.

일반적인 크로마토그래피 방법을 사용하여, 항체는 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼/물질로부터 단일(대칭) 피크로 회수된다(예를 들면, 실시예 6 및 도 5 참조).

본 발명에 이르러 항체 이소폼들은 양이온 교환 크로마토그래피 방법을 사용함으로써 농축되거나 또는 서로로부터 부분적으로 분리될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 분리/농축은 pH 구배 또는 염 구배를 사용한 결합-및-용출 크로마토그래피 방법으로 및 특히 근소한 기울기를 갖는 구배를 사용함으로써 달성된다.

항체 제제 중 항체 이소폼의 농축은 이동상의 적절한 전도도 증가를 갖는 컬럼 크로마토그래피에 의해 가능한 것으로 밝혀졌다.

한 태양에서, 항체의 용출을 수행하기 위해, 전도도 증가는 50% 이하이다, 즉, 전도도는 100%로부터 101% 이상 150% 이하까지, 즉, 제 1 수준으로부터 출발하여 제 2의 더 높은 수준까지 증가한다.

한 태양에서, 항체의 용출을 수행하기 위해, 전도도 증가는 10% 이하이다, 즉, 전도도는 100%로부터 101% 이상 110% 이하까지, 즉, 제 1 수준으로부터 출발하여 제 2의 더 높은 수준까지 증가한다.

양이온 교환 크로마토그래피 물질의 매트릭스는 팽윤성 매트릭스이어야 하는 것으로 밝혀졌다.

한 태양에서, 매트릭스는 가교결합된 사카라이드이다. 한 태양에서, 사카라이드는 폴리사카라이드이다. 한 태양에서, 폴리사카라이드는 아가로스, 즉, 글리코시드에 의해 결합된 D-갈락토스 및 3,6-안하이드로-L-갈락토스로 이루어진 폴리사카라이드이다.

증가는 단일 단계의 형태일 수 있다. 따라서, 상기 증가는 용출 용액의 완전한 교체에 의해, 즉 100%의 제 1 완충 용액으로부터 100%의 제 2(= 용출) 완충 용액으로의 교체에 의해 수행될 수 있다.

증가는 선형 구배의 형태일 수 있다. 따라서, 상기 증가는 용출 용액의 선형 교체에 의해, 즉 100%의 제 1 완충 용액으로부터 50 내지 100%의 제 2(= 용출) 완충 용액으로의 선형 교체에 의해 수행될 수 있다.

한 태양에서, 제 1 용액은 선형 구배로 제 2 용액으로 교체된다. 한 태양에서, 선형 구배는 약 50개 컬럼 부피에 걸쳐 이루어진다. 한 태양에서, 선형 구배는 약 30개 컬럼 부피에 걸쳐 이루어진다. 한 태양에서, 선형 구배는 약 20개 컬럼 부피에 걸쳐 이루어진다.

일반적인 크로마토그래피 방법 및 그의 사용은 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Heftmann, E., (ed.), Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Deyl, Z., (ed.) Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, vol. 60, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Poole, C.F., and Poole, S.K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, (1982); Sambrook, J., et al., (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989); or Ausubel, F.M., et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, (1998)]을 참조한다.

하기 표 1에 일반적으로 사용되는 일부 완충 용액의 전도도를 참고로 나타내었다.

용어 "적용하는"은 용액이 크로마토그래피 물질과 접촉하게 되는 정제 방법의 부분 단계를 의미한다. 이것은 a) 용액이 크로마토그래피 물질이 함유된 크로마토그래피 장치에 첨가되거나, 또는 b) 크로마토그래피 물질이 용액에 첨가되는 것을 의미한다. 경우 a)에서, 용액은 크로마토그래피 물질과 용액에 함유된 물질 사이의 상호작용을 허용하는 장치를 통과한다. 예를 들면, pH, 전도도, 염 농도, 온도 및/또는 유량과 같은 조건에 따라서, 용액의 일부 물질은 크로마토그래피 물질에 결합될 수 있고, 다른 물질은 크로마토그래피 물질로부터 회수될 수 있다. 용액에 잔류하거나 또는 크로마토그래피 물질로부터 회수된 물질은 관류에서 찾을 수 있다. "관류(flow-through)"는 장치 통과후 수득되는 용액을 의미하며, 상기 용액은 적용된 용액이거나, 또는 컬럼을 세척하기 위해 또는 크로마토그래피 물질에 결합된 물질의 용출을 야기하기 위해 사용되는 완충 용액일 수 있다. 한 태양에서, 상기 장치는 컬럼 또는 카세트이다. 경우 b)에서, 크로마토그래피 물질은, 예를 들면, 고체로서, 예를 들면, 정제될 해당 물질을 함유하는 용액에 첨가되어, 크로마토그래피 물질과 용액중 물질 사이의 상호작용을 가능하게 할 수 있다. 상호작용 후에, 크로마토그래피 물질을, 예를 들면, 여과에 의해 제거하고, 크로마토그래피 물질에 결합된 물질도 또한 그와 함께 용액으로부터 제거되는 반면, 크로마토그래피 물질에 결합되지 않은 물질은 용액중에 잔류한다.

용어 "결합-및-용출 방식"은 정제될 해당 물질을 함유하는 용액이 크로마토그래피 물질에 적용됨으로써 해당 물질이 크로마토그래피 물질에 결합하는 크로마토그래피 단계의 시행 방식을 의미한다. 따라서, 해당 물질은 크로마토그래피 물질 상에 유지되는 반면, 해당하지 않는 물질은 관류 또는 상등액과 함께 제거된다. 해당 물질은 그 뒤에 제 2 단계에서 용출 용액과 함께 크로마토그래피 물질로부터 회수된다. 한 태양에서, 본원에 기재된 바와 같은 방법은 결합-및-용출 방식으로 시행된다.

본원에 기재된 바와 같은 방법에 사용되는 용액은 조(crude) 또는 완충 용액이다. 용어 "완충 용액"은 산성 또는 알칼리성 물질의 첨가 또는 방출로 인한 pH의 변화가 용해된 완충 물질에 의해 균형을 이루는 용액을 의미한다. 상기 성질을 갖는 임의의 완충 물질을 사용할 수 있다. 일반적으로 약학적으로 허용되는 완충 물질을 사용한다. 한 태양에서, 완충 용액은 인산 및/또는 그의 염으로 이루어진 포스페이트 완충 용액, 또는 아세트산 및/또는 그의 염으로 이루어진 아세테이트 완충 용액, 또는 시트르산 및/또는 그의 염으로 이루어진 시트레이트 완충 용액, 또는 모폴린 완충 용액, 또는 2-(N-모폴리노)에탄설폰산 완충 용액, 또는 히스티딘 완충 용액, 또는 글라이신 완충 용액, 또는 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄(TRIS) 완충 용액으로부터 선택된다. 또 다른 태양에서, 완충 용액은 포스페이트 완충 용액, 또는 아세테이트 완충 용액, 또는 시트레이트 완충 용액, 또는 히스티딘 완충 용액으로부터 선택된다. 선택적으로, 완충 용액은, 예를 들면, 염화 나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 시트르산 나트륨 또는 시트르산 칼륨과 같은 추가의 염을 포함할 수 있다.

본 출원내에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "구배 용출" 및 "구배 용출 방법"은 용출, 즉, 크로마토그래피로 물질로부터 결합 화합물의 회수를 야기하는 용액의 전도도가 연속적으로 변화, 즉, 상승 또는 저하되는, 즉, 농도가 각각 용출 야기 물질 농도의 2% 또는 1%의 변화보다 크지 않은 일련의 소 단계들에 의해 변화되는 방법을 의미한다. 상기 "연속 용출"에서, 하나 이상의 조건, 예를 들면, pH, 이온 강도, 염 농도 및/또는 크로마토그래피의 흐름은 선형으로 또는 지수적으로 또는 점근적으로(asympotically) 변화될 수 있다. 한 태양에서, 변화는 선형적이다.

용어 "단계 용출"은, 예를 들면, 용출, 즉, 크로마토그래피로 물질로부터 결합 물질의 회수를 야기하는 물질의 농도가 한번에, 즉, 한 값/수준에서 다음 값/수준으로 바로 상승 또는 저하되는 방법을 의미한다. 상기 "단계 용출"에서는, 하나 이상의 조건, 예를 들면, pH, 이온 강도, 염 농도 및/또는 크로마토그래피의 흐름이 첫 번째 값, 예를 들면, 출발 값에서 두 번째 값, 예를 들면, 최종 값으로 모두 한번에 변화될 수 있다. 따라서, 조건들은 선형적 변화와 대조적으로, 점증적으로, 즉 단계적으로 변화된다.

용어 "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 이온 교환 크로마토그래피에서 정지상으로 사용되는 공유적으로 결합된 하전된 치환체를 갖는 고정된 고분자량 매트릭스를 의미한다. 전체 전하 중성을 위해, 비-공유 결합된 상대 이온이 그에 결합된다. "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 그의 비-공유 결합된 양이온성 상대 이온과 주위 용액의 유사하게 하전된 이온을 교환시키는 능력을 갖는다. 그의 교환가능한 상대 이온의 전하에 따라서, "이온 교환 수지"는 양이온 교환 수지 또는 음이온 교환 수지로 지칭된다. 하전된 기(치환체)의 성질에 따라서, "이온 교환 수지"는, 예를 들면, 양이온 교환 수지의 경우에, 설폰산 수지(S) 또는 설포프로필 수지(SP) 또는 카복시메틸 수지(CM)로 지칭된다.

다양한 유형의 이온 교환 물질, 즉, 정지상이, 예를 들면, 다음과 같이 다양한 이름으로 많은 회사에서 시판된다: 바이오래드 래보러토리즈(BioRad Laboratories)에서 시판하는 양이온 교환 물질 바이오-렉스(Bio-Rex, 등록상표)(예, 타입 70), 켈렉스(Chelex, 등록상표)(예, 타입 100), 마크로-프레프(Macro-Prep, 등록상표)(예, 타입 CM, 하이 S, 25 S), AG(등록상표)(예, 타입 50W, MP), 시퍼젠(Ciphergen)에서 시판하는 WCX2, 다우 케미칼 캄파니(Dow chemical company)에서 시판하는 다우엑스(Dowex, 등록상표) MAC-3, 폴 코포레이션(Pall Corporation)에서 시판하는 무스탕(Mustang) C 및 무스탕 S, 와트만(Whatman) plc.에서 시판하는 셀룰로스 CM(예, 타입 23, 52), 하이퍼-D, 파티스페어(Partisphere), 토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience) GmbH에서 시판하는 앰버라이트(Amberlite, 등록상표) IRC(예, 타입 76, 747, 748), 앰버라이트(등록상표) GT 73, 토요펄(등록상표)(예, 타입 SP, CM, 650M), 바오이크롬 랩스(BioChrom Labs)에서 시판하는 CM 1500 및 CM 3000, GE 헬쓰케어(GE Healthcare)에서 시판하는 SP-세파로스(SP-Sepharose, 등록상표), CM-세파로스(등록상표), 퍼셉티브 바이오시스템즈(PerSeptive Biosystems)에서 시판하는 다공성 수지, 쇼코 아메리카 인코포레이티드(Shoko America Inc.)에서 시판하는 아사히팩(Asahipak) ES(예, 타입 502C), CXpak P, IEC CM(예, 타입 825, 2825, 5025, LG), IEC SP(예, 타입 420N, 825), IEC QA(예, 타입 LG, 825), 에이크롬 테크놀로지스 인코포레이티드(Eichrom Technologies Inc.)에서 시판하는 50W 양이온 교환 수지. 한 태양에서, 양이온 교환 물질은 마크로-프레프(등록상표) 하이 S 또는 25S, 또는 마크로캡(MacroCap) SP, 또는 토요펄(Toyopearl, 등록상표) SP 650M, 또는 소스(Source) S, 또는 SP 세파로스, 또는 폴리캣(POLYCAT) A, 또는 모노 S, 또는 하이스크린(Highscreen) SP와 같은 강 양이온 교환 물질이다.

당해 분야에 숙련된 자에게, 예를 들면, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 상기 아미노산 서열을 암호화하는 상응하는 핵산 서열로 전환시키는 절차 및 방법은 공지되어 있다. 그러므로, 핵산은 개개 뉴클레오티드로 이루어진 그의 핵산 서열, 및 유사하게 그에 의해 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 의해 특징지어진다.

본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합에 적합한 조건하에서" 및 그의 문자적 동의어는 해당 물질, 예를 들면, 항체 이소폼이 그와 접촉하게 될 때 정지상, 예를 들면, 이온 교환 물질에 결합하는 것을 의미한다. 이것은 반드시 해당 물질 100%가 결합되는 것을 의미하는 것은 아니지만, 기본적으로 해당 물질 100%가 결합된다, 즉, 해당 물질의 50% 이상이 결합되고, 바람직하게는 해당 물질의 75% 이상이 결합되고, 바람직하게는 해당 물질의 85% 이상이 결합되고, 보다 바람직하게는 해당 물질의 95% 이상이 정지상에 결합된다.

용어 "치료 항체"는 인간 치료제로서 승인받기 위한 임상 연구에서 시험되고 질환의 치료를 위해 개인에게 투여될 수 있는 항체를 의미한다. 한 태양에서, 항체는 치료 항체이다. 또 다른 태양에서, 치료 항체는 단클론성 항체이다. 또 다른 태양에서, 치료 항체는 인간 항체 유전자좌 또는 인간 단클론성 항체 또는 인간화 단클론성 항체로 형질전환된 유인원 또는 동물로부터 수득된다. 한 태양에서, 치료 항체는 인간 단클론성 항체이다. 다른 태양에서, 치료 항체는 인간화 단클론성 항체이다. 치료 항체는 종양 질환(예를 들면, 비-호지킨(non-Hodgkin) 림프종, 유방암 및 대장암을 포함한 혈액 및 고형 악성종양), 면역 질환, 중추 신경계 질환, 혈관 질환 또는 감염성 질환과 같은 다양한 질환의 치료에 널리 사용되고 있다. 상기 항체는, 한 태양에서, 다음의 수용체들에 대한 항체이다: ALK, 부착 관련 키나제 수용체(예, Axl), 또는 ERBB 수용체(예, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4), 또는 에리트로포이에틴-생성 간세포(EPH) 수용체(예, EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4, EphB5, EphB6), 또는 섬유아세포 성장 인자(FGF) 수용체(예, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FGFR5), 또는 Fgr 또는 IGF1R 또는 인슐린 수용체, 또는 LTK, 또는 M-CSFR, 또는 MUSK, 또는 혈소판-유도 성장 인자(PDGF) 수용체(예, PDGFR-A, PDGFR-B), 또는 RET, 또는 ROR1, 또는 ROR2, 또는 ROS, 또는 RYK, 또는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체(예, VEGFR1/FLT1, VEGFR2/FLK1, VEGF3), 또는 면역글로불린-유사 및 EGF-유사 영역을 갖는 티로신 키나제(TIE) 수용체(예, TIE-1, TIE-2/TEK), 또는 Tec, 또는 TYRO10, 또는 인슐린-유사 성장 인자(IGF) 수용체(예, INS-R, IGF-IR, IR-R), 또는 디스코이딘 도메인(Discoidin Domain)(DD) 수용체(예, DDR1, DDR2), 또는 c-Met(MET)에 대한 수용체, 또는 수용체 디오리진 난타이스(recepteur d'origine nantais)(RON, 대식세포 자극 1 수용체로도 알려져 있음), 또는 Flt3(핀(fins)-관련 티로신 키나제 3), 또는 콜로니 자극 인자 1(CSF 1) 수용체, 또는 c-kit에 대한 수용체(KIT 또는 SCFR), 또는 인슐린 수용체 관련(IRR) 수용체, 또는 CD19, 또는 CD20, 또는 HLA-DR, 또는 CD33, 또는 CD52, 또는 G250, 또는 GD3, 또는 PSMA, 또는 CD56, 또는 CEA, 또는 루이스(Lewis) Y 항원, 또는 IL-6 수용체.

용어 "항체"는 전체 항체 및 항체 단편을 포함한 다양한 형태의 항체 구조물을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 항체는, 한 태양에서, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 T 세포 항원 결핍 항체이다. 항체의 유전자 조작처리는, 예를 들면, 문헌 [Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]; US 5,202,238 호 및 US 5,204,244 호; 문헌 [Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125]에 기술되어 있다. 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라서, 항체는 다음의 부류로 분류된다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. 이들 부류중 일부는 서브클래스(아형)로, 즉, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로, 또는 IgA는 IgA1 및 IgA2로 더 분류된다. 항체가 속하는 민역글로불린 부류에 따라서, 면역글로불린의 중쇄 불변 영역은 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 및 μ(IgM) 각각으로 불린다. 용어 "인간 IgG1 부류의 항체"는 불변 영역의 아미노산 서열이 인간 IgG1의 아미노산 서열로부터 유도된 항체를 의미한다. 상기 용어들은 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 및 항체 접합체를 포함한다.

비-인간(예를 들면, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 항체로부터 및 인간 항체로부터 유도된 부분 서열들을 함유하는 키메라 항체이다. 대체로, 인간화 항체는, 초가변 영역으로부터의 잔기가 목적하는 특이성 및 친화성을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들면, 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 항체(수용자 항체)로부터 유도된다. 일부 경우에서, 인간 항체의 프레임워크 영역(framework region, FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 추가의 변형, 예를 들면, 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 변형은, 상응하는 모 서열과 동종이지만 동일하지는 않은, 상기 수용자 또는 공여자 항체의 변이체를 야기한다. 이들 변형은 항체 성능을 더 개선하기 위해 이루어진다.

일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 전형적으로는 2개의 가변 영역의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 여기서, 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 공여자 항체와 상응하고, FR의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 수용자 항체의 것이다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 항체 불변 영역, 전형적으로 인간 항체의 항체 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 것이다.

비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당해 분야에 기술되었다. 한 태양에서, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그 중에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 상기 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "도입" 잔기로 지칭되며, 이것은 전형적으로 "도입" 가변 영역으로부터 취해진다. 인간화는 기본적으로 비-인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 치환함으로써 윈터(Winter)와 동료들의 방법에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 상기 "인간화" 항체는, 실질적으로 덜 보존된(intact) 인간 가변 영역이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다. 사실상, 인간화 항체는 전형적으로, 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게 일부 프레임워크 영역 잔기가 설치류 또는 비-인간 영장류 항체내 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단로부터 수득된 항체를 말한다, 즉, 상기 집단을 이루는 개개 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단클론성 항체는 매우 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대해 유도된다. 또한, 상이한 항원 부위들(결정인자 또는 에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체들을 포함하는 다클론성 항체 제제와 대조적으로, 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 항원 부위에 대해 유도된다. 그의 특이성 이외에, 단클론성 항체는 이들이 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 동종 개체군으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 이해하지 않아야 한다.

용어 "키메라 항체"는 통상적으로 재조합 DNA 기술에 의해 제조된, 제 1 종으로부터의 가변 영역, 즉, 결합 영역, 및 상이한 제 2 공급원 또는 종으로부터 유도된 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 항체를 의미한다.

항체의 아미노산 서열 변이체는 항체 쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 내에 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 변형은, 예를 들면, 인터페론의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 삽입 및/또는 상기 서열내 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구조물을 수득할 수 있으나, 단, 최종 구조물은 모 항체로서 항원 결합 성질을 가져야 한다.

보존적 아미노산 치환을 "바람직한 치환"이란 제목하에 표 2에 나타내었다. 하기 표에 "예시적 치환"이란 제목하에, 및 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 하기에 기술하는 바와 같이 보다 실질적인 변화들이 제공되어 있다. 아미노산 치환은 항체 쇄 내에 도입될 수 있으며, 생성물들은 모 항체의 생물 활성의 유지에 대해 선별될 수 있다.

원래 잔기	예시적 치환	바람직한 치환
Ala(A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg(R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn(N)	Gln; His; Asp, Lys; Arg	Gln
Asp(D)	Glu; Asn	Glu
Cys(C)	Ser; Ala	Ser
Gln(Q)	Asn; Glu	Asn
Glu(E)	Asp; Gln	Asp
Gly(G)	Ala	Ala
His(H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile(I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신	Leu
Leu(L)	노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys(K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met(M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe(F)	Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Val; Ser	Ser
Trp(W)	Tyr; Phe	Tyr
Try(Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val(V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신	Leu

아미노산은 통상적인 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Gln;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 상기 부류중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 포함한다.

문헌 [Hudziak, R.M., et al., Mol. Cell. Biol. 9 (1989) 1165-1172]은 인간 유방 종양 세포주 SK-BR-3을 사용하여 특성화된 HER2 항체의 패널의 제조를 기술하고 있다. 항체에 노출후 SK-BR-3 세포의 상대적 세포 증식을 72 시간후 단층의 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 염색에 의해 측정하였다. 상기 분석법을 이용하여, 최대 억제는 세포 증식을 56%까지 억제한 4D5로 불리는 항체에 의해 수득되었다. 패널중 다른 항체는 상기 분석법에서 세포 증식을 보다 적은 정도로 감소시켰다. 항체 4D5는 HER2-과발현 유방 종양 세포주를 TNF-α의 세포독성 효과에 민감화시키는 것으로 또한 밝혀졌다(또한 US 5,677,171 호 참조). 문헌 [Hudziak, R.M., et al., Mol. Cell. Biol. 9 (1989) 1165-1172]에 논의된 HER2 항체는 또한 문헌 [Fendly, B.M., et al., Cancer Research 50 (1990) 1550-1558; Kotts, C.E., et al., In Vitro 26 (1990) 59A; Sarup, J.C., et al., Growth Regulation 1 (1991) 72-82; Shepard, H.M., et al., J. Clin. Immunol. 11 (1991) 117-127; Kumar, R., et al., Mol. Cell. Biol. 11 (1991) 979-986; Lewis, G.D., et al., Cancer Immunol. Immunother. 37 (1993) 255-263; Pietras, R.J., et al., Oncogene 9 (1994) 1829-1838; Vitetta, E.S., et al., Cancer Research 54 (1994) 5301-5309; Sliwkowski, M.X., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665; Scott, G.K., et al., J. Biol. Chem. 266 (1991) 14300-14305; D'souza, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91 (1994) 7202-7206; Lewis, G.D., et al., Cancer Research 56 (1996) 1457-1465; and Schaefer, G., et al., Oncogene 15 (1997) 1385-1394]에 더 특성화되어 있다.

뮤린 HER2 항체 4D5의 재조합 인간화 버전(huMAb4D5-8, rhuMab HER2, 트라스투주맙 또는 허셉틴(HERCEPTIN, 등록상표); US 5,821,337 호 참조)은 포괄적인 이전의 항암 치료를 받은 HER2 과발현 전이성 유방암을 갖는 환자에서 임상적으로 활성이다(문헌 [Baselga, J., et al., J. Clin. Oncol. 14 (1996) 737-744]). 트라스투주맙은 그 종양이 HER2 단백질을 과발현하는 전이성 유방암을 갖는 환자의 치료에 대해, 1998년 9월 25일자로 식품의약국(Food and Drug Administration)으로부터 판매 승인을 받았다.

인간화 항-ErbB2 항체에는 본원에 특별히 참고로 인용된 미국 특허 제 5,821,337 호의 표 3에 기술된 바와 같은 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8(허셉틴(등록상표)); 본원에 특별히 참고로 인용된 WO 01/000245 호에 기술된 바와 같은 인간화 520C9(WO 93/21319 호) 및 인간화 2C4 항체가 포함된다.

다양한 성질을 갖는 다른 HER2 항체들이 문헌 [Tagliabue, E., et al., Int. J. Cancer 47 (1991) 933-937; McKenzie, S.J., et al., Oncogene 4 (1989) 543-548; Maier, L.A., et al., Cancer Res. 51 (1991) 5361-5369; Bacus, S.S., et al., Molecular Carcinogenesis 3 (1990) 350-362; Stancovski, I., et al., PNAS USA 88 (1991) 8691-8695; Bacus, S.S., et al., Cancer Research 52 (1992) 2580-2589; Xu, F., et al., Int. J. Cancer 53 (1993) 401-408]; WO 94/00136 호; [Kasprzyk, P.G., et al., Cancer Research 52 (1992) 2771-2776; Hancock, M.C., et al., Cancer Res. 51 (1991) 4575-4580; Shawver, L.K., et al., Cancer Res. 54 (1994) 1367-1373; Arteaga, C.L., et al., Cancer Res. 54 (1994) 3758-3765; Harwerth, I.M., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 15160-15167]; US 5,783,186 호; 및 문헌 [Klapper, L.N., et al., Oncogene 14 (1997) 2099-2109]에 기술되었다.

퍼투주맙(예를 들면, WO 01/000245 호 참조)은 HER 이량체화 억제제(HDI)로 알려진 새로운 부류의 약제 중 첫번째이다. 퍼투주맙은 그의 이량체화 영역에서 HER2에 결합함으로써, 활성 이량체 수용체 복합체를 형성하는 그의 능력을 억제하며, 따라서 궁극적으로 세포 성장 및 분열을 야기하는 하향 신호 흐름을 차단한다(문헌 [Franklin, M.C., Cancer Cell 5 (2004) 317-328] 참조). 퍼투주맙은 HER2의 세포외 영역에 대해 유도된 완전 인간화 재조합 단클론성 항체이다. 인간 상피 세포상에서 HER2에 대한 퍼투주맙의 결합은 HER2가 HER 부류(EGFR, HER3, HER4 포함)의 다른 구성원과 복합체를 형성하는 것 및 아마도 또한 HER2 동종이량체화(homodimerization)를 방지한다. 복합체 형성을 차단함으로써, 퍼투주맙은 HER1, HER3 및 HER4의 리간드(예를 들면, EGF, TGFα, 암피레귤린 및 헤레귤린)에 의해 활성화된 성장 자극 효과 및 세포 생존 신호를 방지한다. 퍼투주맙에 대한 또 다른 명칭은 2C4이다. 퍼투주맙은 인간 IgG1(K) 프레임워크 서열을 기초로 한 완전 인간화 재조합 단클론성 항체이다. 퍼투주맙의 구조는 2개의 중쇄(449개 잔기) 및 2개의 경쇄(214개 잔기)로 이루어진다. 트라스투주맙(허셉틴(등록상표))과 비교하여, 퍼투주맙은 경쇄에 12개 아미노산 차이 및 IgG1 중쇄에 29개 아미노산 차이를 갖는다.

용어 "소수성"은 고려될 주요한 또는 유일한 분자간 상호작용으로서 반 데어 발스(van der Waals) 상호작용을 주로 특징으로 하는 화합물을 의미한다. 이와 관련하여 용어 "주로"는 원칙적으로 친수성 화합물도 또한 가능하고 존재할 수 있지만 각각의 분석물의 화학적 및/또는 물리적 성질의 일반적 특성화에 단지 미미한 중요성을 갖는 것을 나타낸다. 본 발명의 맥락에서 용어 "소수성"에 반대되는 것이 용어 "친수성"으로, 상기 용어는 상기 화합물들이 수소 결합을 특징으로 하며 강한 극성 및/또는 양성자성 특성을 갖는 것을 의미한다. 한 태양에서, 이온 교환 크로마토그래피 물질 매트릭스는 소수성 매트릭스이다.

용어 "양성자성"은 양성자(들)를 함유하거나 방출하고/하거나, 예를 들면, 물, 알콜, 아민 등과 같은 수소 결합(들)을 형성하는 성질을 의미한다. 분자로부터 양성자의 방출은 또한 숙련된 자에게 해리로서 알려져 있다. 가장 단순한 양성자성 용매는 단순화된 방식으로 양성자와 하이드록실 이온으로 해리되는 물이다. 공지된 양성자성 용매는, 예를 들면, 음전기성(electronegative) 산소 원자가 생성된 음전하를 안정화시킬 수 있기 때문에 하이드록실기의 음으로 하전된 산소 원자를 제공하는 하이드록실기에서 양성자의 방출이 일어나는 알콜이다. 탄산도 양성자성 용매로 간주될 수 있으나, 단 카복실 작용기로부터 양성자의 방출이 예를 들면 특정 용액중에 용해될 특정 물질과의 화학 반응을 야기하지 않아야 한다. 양성자 용매의 또 다른 군은, 그의 아미노기에, 엄밀히 말해 수소 원자인 "양성자"를 함유하고 수소 결합 형성을 위해 상응하는 질소 원자에 유리 전자쌍을 함유하는 아민으로 대표된다.

용어 "이동상"은 크로마토그래피 컬럼으로부터 분석물을 용출시키기에 적합한 물 및/또는 수성 완충액 및 유기 용매의 임의의 혼합물을 의미한다. 용어 "용출시키는" 또는 "용출"은 각각 본 발명에 있어서, 당해 분야에 숙련된 전문가에게 알려진 바와 같이 사용되며, 유체, 즉, 물질(들)이 흡착될 컬럼 물질에 함침된 고체 또는 흡착제로부터 흡착 물질(들)의 해리, 선택적으로 변위를 의미한다.

용어 "흡착"은 물질을 함유한 유체로 이루어진 경계상(boundary phase)에서 유체, 예를 들면, 이동상으로부터 물질의 축적을 의미하며, 이때 상기 경계상은 그 표면에서 물질을 흡착할 수 있다. 상기 흡착은 특정 표면에서 흡착 물질의 축적을 야기한다. 그 표면에 물질을 축적할 수 있는 물질은 종종 흡착제로 지칭되며, 흡착된 물질은 흡착물로 지칭된다. 용어 흡착은 통상적으로, 표면에서의 축적을 넘어 또한 흡착 고체 또는 유체의 내부로의 축적 물질의 침투를 말하는 용어 "흡수"와 구별된다. 일반적으로, 흡착은, 물질, 통상적으로 분자가 흡착제의 표면에 부착되므로 각각의 표면에서 축적되는 물리적 과정이다. 상기 부착의 원인이 되는 힘은 화학적 결합보다는 물리적 힘으로 간주되므로, 흡착은 또한 당해 분야에서 물리적 흡착 또는 물리흡착(physisorption)으로 알려져 있으며, 이것은 표면에 물질의 화학적 결합을 반드시 배제하는 것은 아니다. 표면에 물질의 흡착에 수반되는 물리적 힘은 대부분의 경우에 반 데어 발스 힘, 런던힘(London force) 또는 쌍극자/쌍극자 상호작용, 예를 들면, 수소 결합, 또는 쌍극자-유도된 쌍극자 상호작용이며, 이때 상기 용어들은 상기 설명한 바와 같이 또는 흡착과 관련하여 통상적으로 사용되는 바와 같이 사용된다.

(컬럼) 크로마토그래피에서, 통상적으로 용매는 용출제, 즉 용출되는 물질(들)이 적어도 충분히 용해되는 용출 약제로 사용된다.

용어 "팽윤성 매트릭스"는 3차원 망상조직의 형성하에 서로와 화학적 또는 물리적으로 연결되는 단량체를 기본으로 하는 임의의 팽윤성 중합체 겔을 의미한다. 화학적 연결은 결합 형성을 통해 이루어지는 반면, 팽윤성 매트릭스의 물리적 구성은 각각의 중합체 단편들의 단일 영역들 사이에 정전기, 소수성 또는 쌍극자/쌍극자 상호작용을 기초로 할 수 있다. 용어 "팽윤성 매트릭스"는 한 태양에서, 3차원 망상조직이 화학적 결합 형성을 통해 수득되는 중합체 겔을 의미한다. 망상조직은 자체로 하나 이상의 상이한 성분들로 이루어질 수 있다. 적합한 용매의 존재하에서 망상조직은, 혼입된 부피의 평형 부피에 도달할 때까지 그 3차원 망상조직 내로 각 용매의 동시 혼입하에 팽윤된다. 또 다른 용어로, 망상조직의 팽윤된 상태는 겔로 알려져 있고 비-팽윤 상태는 겔화제(gelator)로 알려져 있다. 본 발명에 있어서, 용어 팽윤성 매트릭스는 또한 용어 겔화제의 의미를 포함한다.

용어 "팽윤성 매트릭스"는 용매로서 물의 존재하에 팽윤되는, 친수성이지만 수-불용성인 중합체로 구성된 겔 만을 의미한다. 팽윤성 매트릭스의 물에 대한 친화성은 중합체 망상조직의 용매화 및 엔트로피 효과에 기인한다. 물 이외에, 또한 예를 들면, 메탄올, 에탄올 및 다이메틸 폼아미드와 같은 순수한 친수성 유기 용매 및 다양한 양으로 상기 유기 용매를 함유하는 각각의 수용액도 팽윤성 매트릭스의 팽윤에 영향을 미치며, 이때 용어 친수성은 상기 설명한 바와 같이 이해된다. 따라서, 용어 팽윤성 매트릭스는 더 이상 그의 망상조직 내로의 물의 혼입하에서 뿐 아니라 친수성 유기 용매 및/또는 다양한 조성의 그 각각의 수용액 및/또는 혼합물의 혼입하에서 팽윤되는 겔로만 한정되지 않는다.

팽윤성 매트릭스와 관련하여, 가교-결합은 3차원 구조의 형성 및 또한 매트릭스의 팽윤 양태를 가능하게 하는 공동(cavity)의 형성을 야기하기 때문에 매우 중요하다. 또한, 가교-결합도는 필수적으로, 수득된 팽윤성 매트릭스의 기공의 크기에 영향을 미친다.

따라서, 본원에 기재된 바와 같은 한 양태는 다음 단계를 포함하는, 항체 제제 내에 항체 이소폼을 농축하는 방법이다:

c) 제 2 전도도를 갖는 제 2 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용함으로써 항체 제제를 수득한다(이때, 제 2 용액의 전도도는 제 1 용액의 전도도를 50% 이하로 초과한다).

한 태양은 하기 단계를 포함하는, 항체 제제 내에 항체 이소폼을 농축하는 방법이다:

c) 제 2 전도도를 갖는 제 2 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용함으로써 농축된 항체 이소폼을 갖는 항체 제제를 수득한다(이때, 제 2 용액의 전도도는 제 1 용액의 전도도를 10% 이하로 초과한다).

단계 a)의 용액은, 한 태양에서, 단계 b)의 용액과 동일한 전도도를 갖는다.

"항체 이소폼"은 동일 항체의 또 다른 이소폼에 대해 약간의 차이를 갖는 항체의 이형(version)을 의미한다. "동일 항체"는 특정 이소폼의 변형(들)을 제외하고 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 항체의 상이한 형태들은 항체를 암호화하는 서열의 전사 또는 번역시에 야기될 수 있을 뿐 아니라, 차이들은 세포로부터 항체의 처리 및 분비로부터, 정제로부터, 제형화로부터 및 저장시 분해로부터 발생된다. 항체 이소폼은 아미노산 서열, 다량체화, 글리코실화 및 다른 번역후 변형에서 달라질 수 있다. "글리코폼(glycoform)"은 당단백질의 상이한 이형들이 번역후 변형에 의해, 그에 결합된 상이한 폴리사카라이드를 갖는 이소폼이다. 또한, 라이신 잔기의 항체 중쇄 C-말단 처리도 항체 구조 변이의 원인일 수 있다.

항체 제제중 항체 이소폼은 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 방법을 이용하여 농축되거나 부분적으로 분리될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이것은 크로마토그래피 물질로부터 항체를 회수하기 위해 선형 또는 단계적 pH 또는 염 구배를 사용한 결합-및-용출 방법으로 달성될 수 있다. 상기 방법은, 근소한 기울기를 갖는, 즉, pH 값의 상대적 변화, 또는 출발값의 50% 이하, 특히 출발값의 10% 이하의 전도도의 증가를 갖는 구배를 사용함으로써 특히 효과적이다. 상이한 항체 이소폼은 상응하는 크로마토그램에서 적어도 반-분리된 피크로서 가시화되므로, 항체 제제의 이소폼 조성은 크로마토그램에서 각각의 피크를 포괄하는, 선택되고 혼합된 용출 분획들을 기준으로 조정될 수 있다.

보다 상세하게, 항체 제제 중 항체 이소폼의 농축은 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용되는 이동상의 전도도의 적절한 증가에 의해 달성될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

용어 "항체 제제"는 동일 항체의 상이한 이소폼들을 포함하는 혼합물을 의미한다.

도 1에는, 20 부피% 용출 완충액으로부터 60 부피% 용출 완충액의 선형 구배를 이용한 컬럼 크로마토그래피 분리의 용출 크로마토그램을 나타내었다(세척 완충액은 20 mM 시트르산 나트륨을 포함하고, 용출 완충액은 20 mM 시트르산 나트륨 및 100 mM 염화 나트륨을 포함한다). 항체 이소폼은 단일 피크로 회수됨을 알 수 있다. 약간의 프리-피크도 볼 수 있다.

도 2에는, 24 부피% 용출 완충액의 단계 구배를 이용한 컬럼 크로마토그래피 분리의 용출 크로마토그램을 나타내었다(세척 완충액은 20 mM 시트르산 나트륨을 포함하고, 용출 완충액은 20 mM 시트르산 나트륨 및 100 mM 염화 나트륨을 포함한다). 항체 이소폼은 반-분리된 피크로 회수됨을 알 수 있다.

도 3에는, 15 부피% 용출 완충액의 단계 구배를 이용한 컬럼 크로마토그래피 분리의 용출 크로마토그램을 나타내었다(세척 완충액은 20 mM 시트르산 나트륨을 포함하고, 용출 완충액은 20 mM 시트르산 나트륨 및 80 mM 염화 나트륨을 포함한다). 항체 이소폼은 2개의 반-분리 피크로 회수되며, 첫번째 피크는 프리-피크를 나타냄을 볼 수 있다.

도 4에는, 100 부피% 용출 완충액의 단계 구배를 이용한 컬럼 크로마토그래피 분리의 용출 크로마토그램을 나타내었다(세척 완충액은 20 mM 시트르산 나트륨을 포함하고, 용출 완충액은 20 mM 시트르산 나트륨 및 5 mM 염화 나트륨을 포함한다). 항체 이소폼은 3개의 반-분리 피크로 회수됨을 알 수 있다.

도 5에는, 전도도가 100%에서 159%로 증가된 단일 단계 용출 방법을 이용한 컬럼 크로마토그래피 분리의 용출 크로마토그램을 나타내었다. 항체가 단일 피크로 회수됨을 알 수 있다.

도 6에는, 100 부피%의 제 1 완충 용액으로부터 60 부피%의 제 2 완충 용액까지의 선형 구배를 이용한 컬럼 크로마토그래피 분리의 용출 크로마토그램을 나타내었다(제 1 완충액은 25 mM TRIS 및 10 mM 염화 나트륨을 포함하고, 제 2 완충액은 25 mM TRIS 및 70 mM 염화 나트륨을 포함하며; 둘 다 pH 7.4의 pH 값을 갖는다). 항체 이소폼은 3개의 피크에서 회수됨을 알 수 있다.

한 태양에서, 전도도 증가는 50% 이하이다, 즉, 전도도는 150% 이하까지 증가된다. 따라서, 제 2 용액은 제 1 용액 전도도의 101 내지 150%인 전도도를 갖는다. 상기 증가는 단일 단계 또는 선형 구배의 형태일 수 있다. 증가는, 용출 용액의 완전한 교체, 즉, 100%의 제 1(= 세척) 용액으로부터 100%의 제 2(= 용출) 용액으로의 교체에 의해 수행될 수 있다.

한 태양에서, 전도도 증가는 10% 이하이다, 즉, 전도도는 110% 이하까지 증가된다. 따라서, 제 2 용액은 제 1 용액 전도도의 101 내지 110%인 전도도를 갖는다. 상기 증가는 단일 단계 또는 선형 구배의 형태일 수 있다. 증가는, 용출 용액의 완전한 교체, 즉, 100%의 제 1(= 세척) 용액으로부터 100%의 제 2(= 용출) 용액으로의 교체에 의해 수행될 수 있다.

한 태양에서, 선형 구배는 각각 상이한 기울기를 갖는 3개의 선형 구배를 포함한다.

한 태양에서, 제 1 선형 구배는 18 내지 20개 컬럼 부피에 해당하고, 제 2 선형 구배는 2 내지 4개 컬럼 부피에, 제 3 선형 구배는 6 내지 8개 컬럼 부피에 해당한다. 한 태양에서, 제 1 선형 구배는 제 1 용액 전도도의 약 115%까지이고, 제 2 선형 구배는 제 1 용액 전도도의 약 137%까지이고, 제 3 선형 구배는 제 1 용액 전도도의 약 150%까지이다.

또한, 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 매트릭스는 팽윤성 매트릭스이어야 하는 것으로 밝혀졌다. 한 태양에서, 매트릭스는 가교결합 사카라이드이다. 다른 태양에서, 상기 사카라이드는 폴리사카라이드이다. 또 다른 태양에서, 상기 폴리사카라이드는 아가로스, 즉, 글리코시드에 의해 결합된 D-갈락토스 및 3,6-안하이드로-L-갈락토스로 이루어진 폴리사카라이드이다.

따라서, 본원에 기재된 바와 같은 또 다른 양태는 하기 단계를 포함하는, 항체 제제의 제조 방법이다:

b) i) 항체의 상이한 이소폼을 포함하는 완충 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고, ii) 제 1 전도도를 갖는 제 1 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고, 이때 항체 이소폼은 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 결합되어 유지되며, iii) 제 2 전도도를 갖는 제 2 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용함으로써 항체 제제를 수득하는 단계(이때, 제 2 용액의 전도도는 제 1 용액의 전도도를 10% 이하로 초과한다)를 포함하는 하나 이상의 컬럼 크로마토그래피 단계에 의해 항체를 정제한다.

한 태양에서, 상기 방법은 대규모로 생산하기 위한 방법이다. 또 다른 태양에서, 대규모는 1 g 이상의 항체 제제를 위한 것이다.

하기의 실시예 및 도면은, 첨부된 특허청구범위에 확실한 범위가 나타나 있는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다. 본 발명의 진의로부터 벗어나지 않고, 나타낸 절차들에 변형이 이루어질 수 있음을 주지해야 한다.

실시예

재료 및 방법

본원에 기재된 바와 같은 방법에 사용될 수 있는 예시적인 면역글로불린은 (본원에 참고로 인용된) WO 92/022653 호, WO 99/057134 호, WO 97/04801 호, US 5,677,171 호, US 5,821,337 호에 보고된 항-HER2 항체이다.

분석용 크기 배제 크로마토그래피:

수지: TSK 3000(토소하스(Tosohaas))

컬럼: 300 x 7.8 mm

유량: 0.5 ml/분

완충용액: 250 mM 염화칼륨을 함유하는 200 mM 인산칼륨, pH 7.0으로 조정

파장: 220 nm

분석용 IE - HPLC

수지: 디오넥스 프로팩(Dionex ProPac, 등록상표) WCX-10 분석용 등급

컬럼: 4 x 250 mm

유량: 0.8 ml/분

완충액 A: 10 mM 인산나트륨, pH 7.5로 조정

완충액 B: pH 7.5로 조정되고 0.1 M 염화 나트륨 보충된 10 mM 인산나트륨

출발 조건: 85 부피% 완충액 A 및 15 부피% 완충액 B

구배: 9개 컬럼 부피 중 55 부피% 완충액 B까지

검출 파장: 214 nm

샘플량: 50 ㎍

샘플 및 카복시펩티다제 B를 동일 완충액으로 1 mg/ml의 최종 농도로 희석하였다. 희석된 샘플 용액에 1%(w/w)의 희석된 카복시펩티다제 용액을 첨가하였다.

실시예 1

SP - 세파로스 상에서 60 부피% 용출 완충액까지의 복합 구배 용출에 의한 크로마토그래피

크로마토그래피 조건:

수지: 하이스크린(Highscreen) SP-세파로스

유량: 1.2 ml/분

평형: 20 mM 시트르산 나트륨, pH 6.2로 조정

로딩: 1 g 단백질/l 크로마토그래피 물질

세척: 20 mM 시트르산 나트륨, pH 6.2로 조정

용출: pH 6.2로 조정되고 100 mM 염화 나트륨 보충된 20 mM 시트르산나트륨

용출 방법:

단계 및 선형 구배의 복합;

20% 용출 완충액까지의 단계 구배 및 이어서 60% 용출 완충액까지의 선형 구배

용출 크로마토그램은 도 1에 나타내었다. 항체 이소폼은 단일 피크로 회수될 수 있음을 볼 수 있다. 약간의 프리-피크도 볼 수 있다.

실시예 2

SP - 세파로스 상에서 24 부피% 용출 완충액까지의 단계 구배 용출에 의한 크로마토그래피

크로마토그래피 조건:

수지: 하이스크린 SP-세파로스

유량: 1.2 ml/분

평형: 20 mM 시트르산 나트륨, pH 6.2로 조정

로딩: 1 g 단백질/l 크로마토그래피 물질

세척: 20 mM 시트르산 나트륨, pH 6.2로 조정

용출 방법:

단일 단계 구배;

24% 용출 완충액까지의 단계 구배 및 20개 컬럼 부피에 걸친 용출

용출 크로마토그램은 도 2에 나타내었다. 항체 이소폼은 반-분리된 피크로 회수될 수 있음을 볼 수 있다.

실시예 3

SP - 세파로스 상에서 15 부피% 용출 완충액까지의 단계 구배 용출에 의한 크로마토그래피

크로마토그래피 조건:

수지: 하이스크린 SP-세파로스

유량: 1.2 ml/분

평형: 20 mM 시트르산 나트륨, pH 6.2로 조정

로딩: 1 g 단백질/l 크로마토그래피 물질

세척: 20 mM 시트르산 나트륨, pH 6.2로 조정

용출: pH 6.2로 조정되고 80 mM 염화 나트륨 보충된 20 mM 시트르산나트륨

용출 방법:

단일 단계 구배;

15% 용출 완충액까지의 단계 구배 및 20개 컬럼 부피에 걸친 용출

용출 크로마토그램은 도 3에 나타내었다. 항체 이소폼은 2개의 반-분리된 피크에서 회수될 수 있으며, 첫번째 피크는 프리-피크를 나타냄을 볼 수 있다.

실시예 4

SP - 세파로스 상에서 100 부피% 용출 완충액까지의 단계 구배 용출에 의한 크로마토그래피

크로마토그래피 조건:

수지: 하이스크린 SP-세파로스

유량: 1.2 ml/분

평형: 20 mM 시트르산 나트륨, pH 6.2로 조정

로딩: 1 g 단백질/l 크로마토그래피 물질

세척: 20 mM 시트르산 나트륨, pH 6.2로 조정

용출: pH 6.2로 조정되고 5 mM 염화 나트륨 보충된 20 mM 시트르산나트륨

용출 방법:

단일 단계;

100% 용출 완충액까지의 단일 단계 및 20개 컬럼 부피에 걸친 용출

용출 크로마토그램은 도 4에 나타내었다. 항체 이소폼은 3개의 반-분리된 피크에서 회수될 수 있음을 볼 수 있다.

실시예 5

모노S 강 양이온 교환 수지상에서 100 부피% 용출 완충액까지의 pH 구배 용출에 의한 크로마토그래피

크로마토그래피 조건:

수지: 모노S

평형: 20 mM 시트르산 나트륨, pH 5.2로 조정

세척: 20 mM 시트르산 나트륨, pH 5.2로 조정

용출: 50 mM 인산나트륨, pH 7.5로 조정

용출 방법:

구배 용출;

0%로부터 100%까지의 용출 완충액.

이소폼은 3개의 반-분리된 피크로 회수될 수 있다.

실시예 6

비교 실시예 - 강 양이온 교환 수지( SP - 세파로스 )를 사용한 단클론성 항-HER2 항체( WO 99/57134 호)의 크로마토그래피 분리

강 양이온 교환 수지인 SP-세파로스 상에서의 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 단클론성 항-HER2 항체(허셉틴(등록상표))의 정제를 수행하였다. 표준 조건하에, 즉, 예를 들면, 염화 나트륨을 사용한 단계 용출하에, 항체의 단량체 및 응집 형태의 분리는 수행되지 않았다(도 5).

크로마토그래피 조건:

수지: SP-세파로스

유량: 160 cm/h

평형: 25 mM 2-모폴리노에탄설폰산, 50 mM 염화 나트륨, pH 5.6으로 조정

로딩: 최대 20 g 단백질/l 겔 매트릭스

세척: 25 mM 2-모폴리노에탄설폰산, 50 mM 염화 나트륨, pH 5.6으로 조정

용출: 25 mM 2-모폴리노에탄설폰산, 95 mM 염화 나트륨, pH 5.6으로 조정

단클론성 항-HER2 항체를 제 1 단계에서 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 단백질 A 컬럼으로부터의 용출은 산성 조건(10 mM 시트르산나트륨 완충액, 3.0 ± 5.0의 pH 값)하에서 수행하였다. 여과 단계에 앞서, 항체를 함유하는 분획의 pH 값을 진한 트리스-하이드록시메틸-아미노-메탄(TRIS) 완충액을 사용해 pH 5.6으로 조정하였다. 단백질 A 용출물은 5 내지 15 mg/ml의 단백질 농도를 갖는 용액이었으며, 시트르산나트륨으로 완충시켰다.

조절된 단백질 A 용출물을 강 양이온 교환 수지(SP-세파로스)를 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다. 160 cm/h의 유량에서 로딩 단계후, 컬럼을 평형 완충액(10개 컬럼 부피)으로 세척하였다. 결합된 면역글로불린을 단일 단계 용출 방법으로 용출하였으며, 이때 pH 값은 일정하게 유지시켰고 전도도는 염화 나트륨 농도의 (단계적) 증가에 의해 변화시켰다. 용출 크로마토그램을 도 5에 나타내었다.

항체의 단량체 및 응집 형태의 분리는 달성되지 않았다.

실시예 7

소스(등록상표) 15S 상에서 60 부피% 용출 완충액까지의 구배 용출에 의한 크로마토그래피

크로마토그래피 조건:

수지: 소스(등록상표) 15S

컬럼 부피: 1.14 l

유량: 100 cm/h

평형: 25 mM TRIS, 10 mM 염화 나트륨, pH 7.4로 조정

로딩: 0.88 g 단백질/l 크로마토그래피 물질

세척: 25 mM TRIS, 10 mM 염화 나트륨, pH 7.4로 조정

용출: 25 mM TRIS, 70 mM 염화 나트륨, pH 7.4로 조정

용출 방법:

19개 컬럼 부피에서 33 부피% 용출 완충액까지,

3개 컬럼 부피에서 50 부피% 용출 완충액까지,

7개 컬럼 부피에서 60 부피% 용출 완충액까지의 구배

용출 크로마토그램은 도 6에 나타내었다. 항체 이소폼은 한정된 피크에서 회수될 수 있음을 볼 수 있다.

Claims

(a) 항체의 상이한 이소폼을 포함하는 완충 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계;
(b) 제 1 전도도를 갖는 제 1 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하되, 항체 이소폼은 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 흡착되어 유지되게 하는 단계;
(c) 제 2 전도도를 갖는 제 2 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용함으로써 항체 제제를 수득하되, 상기 제 2 용액의 전도도는 제 1 용액의 전도도를 50% 이하로 초과하는 단계를 포함하는,
항체 제제의 제조 방법.
(a) 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하고, 상기 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계;
(b) (i) 항체의 상이한 이소폼을 포함하는 완충 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계, (ii) 제 1 전도도를 갖는 제 1 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하되, 항체 이소폼은 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 결합되어 유지되게 하는 단계, 및 (iii) 제 2 전도도를 갖는 제 2 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용함으로써 항체 제제를 수득하되, 상기 제 2 용액의 전도도는 제 1 용액의 전도도를 50% 이하로 초과하는 단계를 포함하는 하나 이상의 컬럼 크로마토그래피 단계에 의해 항체를 정제하는 단계를 포함하는,
항체 제제의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
제 2 용액의 전도도가 제 1 용액의 전도도를 15% 이하로 초과하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서,
제 2 용액의 전도도가 제 1 용액의 전도도를 10% 이하로 초과하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
양이온 교환 크로마토그래피 물질이 팽윤성 매트릭스를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서,
팽윤성 매트릭스가 아가로스인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
양이온 교환 크로마토그래피 물질이 강 양이온 교환 크로마토그래피 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서,
강 양이온 교환 크로마토그래피 물질이 설포프로필-양이온 교환 크로마토그래피 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
제 1 용액이 단일 단계에서 또는 선형 구배로 제 2 용액으로 교체되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서,
단일 단계가 100 부피%의 제 1 용액으로부터 100 부피%의 제 2 용액으로의 교체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
제 1 용액이 20 mM 시트르산 나트륨 및 10 mM 염화 나트륨 또는 25 mM TRIS 및 10 mM 염화 나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
제 2 용액이 20 mM 시트르산 나트륨 및 5 mM 염화 나트륨 또는 25 mM TRIS 및 70 mM 염화 나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
항체가 항-HER2 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서,
항-HER2 항체가 항-HER2 항체 트라스투주맙 또는 항-HER2 항체 퍼투주맙인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
제 1 용액의 전도도가 4 내지 5 mS/cm인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 항-HER2 항체.