CN103380144A - 同等型富集的抗体制备物及其获得方法 - Google Patents

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Abstract

本文中报告了一种用于生成抗体制备物的方法，包括以下步骤：a)将包含抗体的不同同等型的缓冲溶液施加到阳离子交换层析材料，b)将具有第一电导率的第一溶液施加到所述阳离子交换层析材料，由此所述抗体同等型保持与所述阳离子交换层析材料结合，并c)将具有第二电导率的第二溶液施加到所述阳离子交换层析材料，并由此获得抗体制备物，其中所述第二溶液的电导率超出所述第一溶液的电导率不超过10%。

Description

同等型富集的抗体制备物及其获得方法
本文中报告了一种用于获得抗体制备物的方法，包括在强阳离子交换层析材料上的步式洗脱方法。
发明背景
完善确立并广泛使用用于蛋白质纯化的不同方法，如用微生物蛋白质的亲和层析（例如蛋白A或蛋白G亲和层析）、离子交换层析（例如阳离子交换（羧甲基树脂）、阴离子交换（氨乙基树脂）和混合模式交换）、亲硫吸附（例如用β-巯基乙醇和其它SH配体进行）、疏水性相互作用或芳香族吸附层析（例如用苯基-Sepharose、亲氮杂芳烃(aza-arenophilic)树脂、或间氨基苯基硼酸进行）、金属螯合物亲和层析（例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料进行）、大小排阻层析和电泳方法（如凝胶电泳、毛细管电泳）(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
Fahrner,R.L.等，于Biotechnol.Gen.Eng.Rev.18(2001)301-327报告了药用抗体的产业纯化，尤其是层析工艺的开发、操作和确认。Follman,D.K.和Fahrner,R.L.(J.Chrom.A1024(2004)79-85)报告了抗体纯化工艺的因素筛选，其使用无蛋白A的三个层析步骤进行。Necina,R.等(Biotechnol.and Bioeng.60(1998)689-698)报告了通过展现高电荷密度的离子交换介质从细胞培养物上清液捕捉人单克隆抗体。在WO99/057134中报告了通过离子交换层析进行蛋白质纯化。在WO2004/076485中报告了通过蛋白A和离子交换层析进行抗体纯化。在US5,429,746中报告了抗体纯化。在WO2003/066662中报告了蛋白质纯化。
WO2006/125599报告了一种用于纯化抗体的方法。在WO2004/076485中报告了通过蛋白A和离子交换层析进行抗体纯化。
发明概述
已经发现了抗体同等型的层析分离和/或富集在阳离子交换层析材料上在流动相的适当电导率增加的情况中是有可能的。需要的电导率增加是至多50%，即第二溶液具有的电导率为第一溶液的电导率的101%至150%。
如此，如本文中报告的一个方面是用于提供抗体制备物的方法，包括以下步骤：
a)将包含抗体的不同同等型的缓冲溶液施加到阳离子交换层析材料，
b)将具有第一电导率的第一溶液施加到所述阳离子交换层析材料，由此所述抗体同等型保持与所述阳离子交换层析材料结合，并
c)将具有第二电导率的第二溶液施加到所述阳离子交换层析材料，并由此获得抗体制备物，
其中所述第二溶液的电导率超出所述第一溶液的电导率至少1%但不超过50%。
在一个实施方案中，所述第二溶液的电导率超出所述第一溶液的电导率至少1%但不超过20%。
在一个实施方案中，所述第二溶液的电导率超出所述第一溶液的电导率至少1%但不超过15%。
在一个实施方案中，所述第二溶液的电导率超出所述第一溶液的电导率至少1%但不超过10%。
在一个实施方案中，步骤a)的溶液与步骤b)的溶液具有相同的电导率。在一个实施方案中，所述包含抗体的不同同等型的缓冲溶液具有第一电导率，且所述第一溶液具有相同的（第一）电导率。
在一个实施方案中，所述阳离子交换层析材料包含可膨胀基质。在一个实施方案中，所述可膨胀基质是琼脂糖。
在一个实施方案中，所述阳离子交换层析材料是强阳离子交换层析材料。在一个实施方案中，所述强阳离子交换层析材料是磺丙基阳离子交换层析材料。
在一个实施方案中，在单一步骤中将所述第一溶液改变成所述第二溶液。在一个实施方案中，所述单一步骤是从100vol%第一溶液至100vol%第二溶液的变化。
在一个实施方案中，在线性梯度中将所述第一溶液改变成所述第二溶液。在一个实施方案中，所述线性梯度是在约30个柱体积上。在一个实施方案中，所述线性梯度是在约20个柱体积上。
在一个实施方案中，所述第一溶液包含20mM柠檬酸钠。
在一个实施方案中，所述第二溶液包含20mM柠檬酸钠和5mM氯化钠。
在一个实施方案中，所述第一溶液包含25mM三（羟甲基）氨基甲烷和10mM氯化钠。
在一个实施方案中，所述第二溶液包含25mM三（羟甲基）氨基甲烷和70mM氯化钠。
在一个实施方案中，所述第二溶液包含25mM三（羟甲基）氨基甲烷和45mM氯化钠。
在一个实施方案中，所述第一和第二溶液是水性溶液。
在一个实施方案中，所述抗体是抗HER2抗体。在一个实施方案中，所述抗HER2抗体是抗HER2抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)或抗HER2抗体培妥珠单抗(Pertuzumab)。在一个实施方案中，所述抗HER2抗体是人源化抗HER2抗体。
本文中作为另一个方面报告的是通过如本文中报告的方法获得的抗体制备物。在一个实施方案中，所述抗体是抗HER2抗体。
如本文中报告的另一个方面是一种用于生成抗体制备物的方法，包括以下步骤：
a)培养包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞，并从所述细胞或培养液回收所述抗体，
b)通过至少一个柱层析步骤纯化所述抗体，其中所述至少一个柱层析步骤包括以下步骤：
i)将包含所述抗体的不同同等型的缓冲溶液施加到阳离子交换层析材料，
ii)将具有第一电导率的第一溶液施加到所述阳离子交换层析材料，由此所述抗体同等型保持与所述阳离子交换层析材料结合，并
iii)将具有第二电导率的第二溶液施加到所述阳离子交换层析材料，并由此生成抗体制备物，
其中所述第二溶液的电导率超出所述第一溶液的电导率至少1%但不超过10%。
在如本文中报告的所有方面的一个实施方案中，第一溶液具有4mS/cm至5mS/cm的电导率。
发明详述
本文中报告了用于获得抗体制备物的方法，包括以下步骤：i)将包含抗体的不同同等型的缓冲溶液施加到阳离子交换层析材料，ii)将具有第一电导率的第一溶液施加到阳离子交换层析材料，由此抗体同等型保持与强离子交换层析材料结合，并iii)将具有第二电导率的第二溶液施加到阳离子交换层析材料，并由此获得抗体制备物，其中所述第二溶液的电导率超出所述第一溶液的电导率不超过50%。
一般而言，从生产细胞如BHK或Sp2/0或CHO或HEK细胞的培养上清液回收重组生成的单克隆抗体（单抗）。伴随地，也回收其它蛋白质性化合物以及不同抗体同等型。抗体同等型仅在次要结构性特征如糖基化模式、重链C端赖氨酸异质性、和天冬酰胺或谷氨酰胺氨基酸残基的部分脱酰胺化中有所不同。
通过使用通用层析方法，从阳离子交换层析柱/材料在单个（对称）峰中回收抗体（见例如实施例6和图5）。
现在已经发现了，可以通过使用阳离子交换层析方法富集或彼此部分分离抗体同等型。在结合-和-洗脱层析方法中使用pH梯度或盐梯度及通过使用具有特别微小的斜率的梯度实现所述分离/富集。
已经发现了抗体制备物中的抗体同等型富集在流动相的适当电导率增加的情况中通过柱层析是有可能的。
在一个实施方案中，电导率增加是50%或更小，即电导率从100%增加到至少101%且至多150%，即从第一水平开始到更高的第二水平，以实现抗体的洗脱。
在一个实施方案中，电导率增加是10%或更小，即电导率从100%增加到至少101%且至多110%，即从第一水平开始到更高的第二水平，以实现抗体的洗脱。
已经发现了阳离子交换层析材料的基质必须是可膨胀基质。
在一个实施方案中，所述基质是交联的糖类。在一个实施方案中，所述糖类是多糖。在一个实施方案中，所述多糖是琼脂糖，即由糖苷结合的D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖组成的多糖。
所述增加可以以单一步式的形式。如此，可以通过洗脱溶液的完全变化，即从100%第一缓冲溶液至100%第二（=洗脱）缓冲溶液来实施所述增加。
所述增加可以以线性梯度的形式。如此，可以通过洗脱溶液的线性变化，即从100%第一缓冲溶液至50%至100%第二（=洗脱）缓冲溶液来实施所述增加。
在一个实施方案中，在线性梯度中将第一溶液改变成第二溶液。在一个实施方案中，所述线性梯度是在约50个柱体积上。在一个实施方案中，所述线性梯度是在约30个柱体积上。在一个实施方案中，线性梯度是在约20个柱体积上。
通用层析方法及其用途是本领域中技术人员已知的。参见例如Heftmann,E.（编）,Chromatography,第5版,部分A:Fundamentals and Techniques,Elsevier Science Publishing Company,New York,(1992);Deyl,Z.（编）Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences,第60卷,Elsevier Science BV,Amsterdam,The Netherlands,(1998);Poole,C.F.,和Poole,S.K.,Chromatography Today,Elsevier Science Publishing Company,NewYork,(1991);Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,SpringerVerlag,(1982);Sambrook,J.等,（编）,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989);或Ausubel,F.M.等（编）,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York,(1998)。
在下表中给出了一些通常使用的缓冲溶液的电导率作为参照。
表
Figure BDA00003376979900051
Figure BDA00003376979900061
Figure BDA00003376979900071
术语“施加”指纯化方法中使溶液与层析材料接触的部分步骤。这表示a)将溶液添加到含有层析材料的层析装置，或b)将层析材料添加到溶液。在情况a)中，溶液流过装置，从而允许层析材料和溶液中含有的物质相互作用。根据条件如例如pH、电导率、盐浓度、温度和/或流速，溶液中的一些物质可以结合至层析材料，而其它物质可以自层析材料回收。可以在流过物中找到溶液中保留的或从层析材料回收的物质。“流过物”指在流过装置后获得的溶液，其可以是施加的溶液或用于清洗柱或引起与层析材料结合的物质洗脱的缓冲溶液。在一个实施方案中，所述装置是柱或盒。在b)情况中，可以将层析材料例如以固体添加到例如含有待纯化的感兴趣物质的溶液，从而允许层析材料和溶液中物质之间的相互作用。在相互作用后，例如通过过滤取出层析材料，并且与层析材料结合的物质也从溶液中与其一起取出，而没有与层析材料结合的物质保留在溶液中。
术语“结合-和-洗脱模式”指层析步骤的操作模式，其中将含有待纯化的感兴趣物质的溶液施加到层析材料，由此感兴趣的物质结合至层析材料。如此，感兴趣的物质在层析材料上保留，而不感兴趣的物质随流过物或上清液除去。然后，在第二步中用洗脱溶液从层析材料回收感兴趣的物质。在一个实施方案中，如本文中报告的方法以结合-和-洗脱模式操作。
在如本文中报告的方法中采用的溶液是粗制或缓冲溶液。术语“缓冲溶液”指通过溶解的缓冲物质调节由于酸性或碱性物质的添加或释放导致的pH变化的溶液。可以使用任何具有这类特性的缓冲物质。一般地，使用药学可接受缓冲物质。在一个实施方案中，所述缓冲溶液选自由磷酸和/或其盐组成的磷酸盐缓冲溶液，或由醋酸和其盐组成的醋酸盐缓冲溶液，或由柠檬酸和/或其盐组成的柠檬酸盐缓冲液，或吗啉缓冲溶液，或2-（N-吗啉代）乙磺酸(ethanesulfonic)缓冲溶液，或组氨酸缓冲溶液，或甘氨酸缓冲溶液，或三（羟甲基）氨基甲烷(TRIS)缓冲溶液。在另一个实施方案中，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液，或醋酸盐缓冲溶液，或柠檬酸盐缓冲溶液，或组氨酸缓冲溶液。任选地，所述缓冲溶液可以包含另外的盐，如例如氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、柠檬酸钠、或柠檬酸钾。
术语“梯度洗脱”和“梯度洗脱方法”，在本申请内可互换使用，指如下的方法，其中连续改变（即提高或降低）引起洗脱（即从层析材料回收结合的化合物）的溶液的电导率，即通过一系列小步骤改变浓度，每个步骤不大于引起洗脱的物质的浓度的2%或1%变化。在此“连续洗脱”中，可以线性或指数性或渐近性改变一种或多种条件，例如pH、离子强度、盐浓度、和/或层析流动。在一个实施方案中，所述改变是线性的。
术语“步式洗脱”指如下的方法，其中例如一次性（即从一个数值/水平直接到下一个数值/水平）提高或降低引起洗脱（即从层析材料回收结合的物质）的物质的浓度。在此“步式洗脱”中，可以将一种或多种条件，例如pH、离子强度、盐浓度、和/或层析流动从第一（例如起始）数值至第二（例如最终）数值一次性全部改变。如此，与线性变化形成对比，条件是增量（即逐步）变化的。
术语“离子交换层析材料”指固定的高分子量基质，其携带在离子交换层析中作为固定相使用的、共价结合的、带电荷的取代基。为了总体电荷中性，对其结合非共价结合的反荷离子。“离子交换层析材料”具有用其非共价结合的反荷离子交换周围溶液的带类似电荷的离子的能力。根据其可交换的反荷离子的电荷，“离子交换树脂”称为阳离子交换树脂或阴离子交换树脂。根据带电荷的基团（取代基）的性质，“离子交换树脂”称为，例如在阳离子交换树脂的情况下，磺酸树脂(S)、或磺丙基树脂(SP)、或羧甲基树脂(CM)。
不同类型的离子交换材料（即固定相）以不同名称且从多家公司可获得，如例如阳离子交换材料
Figure BDA00003376979900081
（例如70型）、
Figure BDA00003376979900082
（例如100型）、
Figure BDA00003376979900083
（例如CM,高S,25S型）、（例如50W,MP型）均可购自BioRad Laboratories，WCX2可购自Ciphergen，
Figure BDA00003376979900085
MAC-3可购自Dow化学公司，Mustang C和Mustang S可购自Pall Corporation，Cellulose CM（例如23,52型）、Hyper-D、Partisphere可购自Whatman plc.，IRC（例如76,747,748型）、
Figure BDA00003376979900087
GT73、（例如SP,CM,650M型）均可购自Tosoh Bioscience GmbH，CM1500和CM3000可购自BioChromLabs，SP-SepharoseTM、CM-SepharoseTM可购自GE Healthcare，Poros树脂可购自PerSeptive Biosystems，Asahipak ES（例如502C型)、CXpak P、IEC CM（例如825,2825,5025,LG型）、IEC SP（例如420N,825型）、IEC QA（例如LG,825型）可购自Shoko America Inc.，50W阳离子交换树脂可购自EichromTechnologies Inc。在一个实施方案中，所述阳离子交换材料是强阳离子交换材料如
Figure BDA00003376979900091
高S或25S、或MacroCap SP、或
Figure BDA00003376979900092
SP650M、或Source S、或SP Sepharose、或POLYCAT A、或Mono S、或Highscreen SP。
对于本领域技术人员来说，将氨基酸序列（例如多肽的氨基酸序列）转化成编码此氨基酸序列的相应核酸序列的规程和方法是公知的。因此，核酸以由个别核苷酸组成的其核酸序列以及同样地以由其编码的多肽的氨基酸序列为特征。
如本申请内使用的，术语“在适合于结合的条件下”及其语法等同物指感兴趣的物质（例如抗体同等型）在与固定相（例如离子交换材料）接触时与其结合。这并不必然表示100%的感兴趣物质与固定相是结合的，而是基本上100%的感兴趣物质是结合的，即至少50%的感兴趣物质是结合的，优选地至少75%的感兴趣物质是结合的，优选地至少85%的感兴趣物质是结合的，更优选地至少95%的感兴趣物质是结合的。
术语“治疗性抗体”指在临床研究中测试以批准作为人治疗剂且可以对个体施用以治疗疾病的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是治疗性抗体。在另一个实施方案中，所述治疗性抗体是单克隆抗体。在又一个实施方案中，所述治疗性抗体是从用人抗体基因座转化的类人猿(great ape)或动物获得的或者是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。在一个实施方案中，所述治疗性抗体是人单克隆抗体。在另一个实施方案中，所述治疗性抗体是人源化单克隆抗体。治疗性抗体广泛用于治疗各种疾病如肿瘤学疾病（例如血液学和实体恶性肿瘤，包括非霍奇金氏淋巴瘤、乳腺癌、和结肠直肠癌）、免疫学疾病、中枢神经疾病、血管疾病、或传染病。在一个实施方案中，这类抗体是针对下列各项的抗体：ALK、粘附相关激酶受体（例如Axl）、或ERBB受体（例如EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4）、或产生红细胞生成素的肝细胞(EPH)受体（例如EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB5、EphB6）、或成纤维细胞生长因子(FGF)受体（例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5）、或Fgr、或IGF1R、或胰岛素受体、或LTK、或M-CSFR、或MUSK、或血小板衍生的生长因子(PDGF)受体（例如PDGFR-A、PDGFR-B)、或RET、或ROR1、或ROR2、或ROS、或RYK、或血管内皮生长因子(VEGF)受体（例如VEGFR1/FLT1、VEGFR2/FLK1、VEGF3）、或具有免疫球蛋白样和EGF样域的酪氨酸激酶(TIE)受体（例如TIE-1、TIE-2/TEK）、或Tec、或TYRO10、或胰岛素样生长因子(IGF)受体（例如INS-R、IGF-IR、IR-R）、或盘基菌蛋白域(DiscoidinDomain)(DD)受体（例如DDR1、DDR2）、或c-Met（MET）的受体、或recepteurd’origine nantais（RON，也称为巨噬细胞刺激1受体）、或Flt3（fins相关酪氨酸激酶3）、或集落刺激因子1(CSF1)受体、或c-kit（KIT、或SCFR）的受体、或胰岛素受体相关(IRR)受体、或CD19、或CD20、或HLA-DR、或CD33、或CD52、或G250、或GD3、或PSMA、或CD56、或CEA、或Lewis Y抗原、或IL-6受体。
术语“抗体”涵盖了各种形式的抗体结构，包括全抗体和抗体片段。在一个实施方案中，如本文中报告的抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、或T细胞抗原消减的抗体。抗体的遗传工程例如记载于Morrison,S.L.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855;US5,202,238和US5,204,244;Riechmann,L.等,Nature332(1988)323-327;Neuberger,M.S.等,Nature314(1985)268-270;Lonberg,N.,Nat.Biotechnol.23(2005)1117-1125。根据重链恒定区的氨基酸序列，抗体分为类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些中的一些类进一步分为亚类（同种型），即IgG分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，或IgA分为IgA1和IgA2。依照抗体所属的免疫球蛋白类，免疫球蛋白的重链恒定区分别称作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)和μ(IgM)。术语“人IgG1类的抗体”指其中的恒定域的氨基酸序列自人IgG1氨基酸序列衍生的抗体。该术语包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和抗体缀合物。
非人（例如啮齿类）抗体的“人源化”形式指含有自非人抗体和自人抗体衍生的部分序列的嵌合抗体。在很大程度上，人源化抗体自人抗体（受体抗体）衍生，其中来自高变区的残基用具有期望特异性和亲和力的非人物种（供体抗体）（如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类）的高变区残基替换。在有些情况中，将人抗体的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以含有其它修饰，例如在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的氨基酸残基。这类修饰产生这类受体或供体抗体的变体，其与相应的亲本序列是同源但并不相同的。做出这些修饰以进一步改进抗体性能。
一般而言，人源化抗体会包含至少一个，且通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人供体抗体的高变环，且所有或基本上所有FR是人受体抗体的FR。任选地，人源化抗体还会包含抗体恒定区，通常是人抗体的恒定区的至少一部分。
用于人源化非人抗体的方法已经记载于本领域中。在一个实施方案中，人源化抗体具有从非人来源导入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。人源化可以基本上遵循Winter及同事的方法通过用高变区序列取代非人抗体的相应序列实施。因而，此类“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上小于完整的人可变域已经用来自非人物种的相应序列替换。实际上，人源化抗体通常是其中的一些高变区残基和可能一些框架区残基用来自啮齿类或非人灵长类抗体中类似位点的残基替换的人抗体。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即构成群体的个别抗体是相同的，除了可以以少量存在的可能的天然存在的突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与多克隆抗体制备物（其包含针对不同抗原性位点（决定簇或表位）的不同抗体）形成对比，每种单克隆抗体针对抗原上的单一抗原性位点。在它们的特异性外，单克隆抗体的优点在于它们可以不受到其它抗体污染而合成。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群体获得的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法生成抗体。
术语“嵌合抗体”指包含来自第一物种的可变域（即结合区）和自不同的第二来源或物种衍生的恒定区的至少一部分的抗体，其通常通过重组DNA技术制备。
可以通过将合适的修饰引入到编码抗体链的核苷酸序列，或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任意组合以获得最终的构建体，只要最终的构建体拥有与亲本抗体一样的抗原结合特性。
在下表中在标题“优选的取代”下显示保守氨基酸取代。在下表中在标题“例示性取代”下，并且如下文参照氨基酸侧链类描述的那样提供更多的实质性变化。可以将氨基酸取代引入到抗体链中，并针对亲本抗体的生物学活性的保留对产物进行筛选。
表
初始残基 例示性取代 优选的取代
Ala(A) Val;Leu;Ile Val
Arg(R) Lys;Gln;Asn Lys
Asn(N) Gln;His;Asp,Lys;Arg Gln
Asp(D) Glu;Asn Glu
Cys(C) Ser;Ala Ser
Gln(Q) Asn;Glu Asn
Glu(E) Asp;Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn;Gln;Lys;Arg Arg
Ile(I) Leu;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸;Ile;Val;Met;Ala;Phe Ile
Lys(K) Arg;Gln;Asn Arg
Met(M) Leu;Phe;Ile Leu
Phe(F) Trp;Leu;Val;Ile;Ala;Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val;Ser Ser
Trp(W) Tyr;Phe Tyr
Tyr(Y) Trp;Phe;Thr;Ser Phe
Val(V) Ile;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸 Leu
可以依照共同的侧链特性对氨基酸进行分组：
（1）疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
（2）中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
（3）酸性：Asp、Glu；
（4）碱性：His、Lys、Arg；
（5）影响链取向的残基：Gly、Pro；
（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代会需要用这些类之一的成员交换另一类。
Hudziak,R.M.等,Mol.Cell.Biol.9(1989)1165-1172描述了生成一组HER2抗体，其使用人乳腺肿瘤细胞系SK-BR-3表征。暴露于抗体后SK-BR-3细胞的相对细胞增殖通过72小时后单层的结晶紫染色测定。使用此测定法，用称作4D5的抗体获得了最大抑制，其将细胞增殖抑制56%。所述组中的其它抗体在此测定法中以较小的程度降低细胞增殖。还发现抗体4D5使过表达HER2的乳腺肿瘤细胞系对TNF-α的细胞毒性效应敏化（亦参见US5,677,171）。Hudziak,R.M.等中讨论的HER2抗体进一步在以下文献中表征：Fendly,B.M.等,Cancer Research50(1990)1550-1558;Kotts,C.E.等,In Vitro26(1990)59A;Sarup,J.C.等,Growth Regulation1(1991)72-82;Shepard,H.M.等,J.Clin.Immunol.11(1991)117-127;Kumar,R.等,Mol.Cell.Biol.11(1991)979-986;Lewis,G.D.等,Cancer Immunol.Immunother.37(1993)255-263;Pietras,R.J.等,Oncogene9(1994)1829-1838;Vitetta,E.S.等,Cancer Research54(1994)5301-5309;Sliwkowski,M.X.等,J.Biol.Chem.269(1994)14661-14665;Scott,G.K.等,J.Biol.Chem.266(1991)14300-14305;D’souza,B.等,Proc.Natl.Acad.Sci.91(1994)7202-7206;Lewis,G.D.等,Cancer Research56(1996)1457-1465;和Schaefer,G.等,Oncogene15(1997)1385-1394。
鼠HER2抗体4D5的重组人源化型式（huMAb4D5-8，rhuMab HER2，曲妥珠单抗或赫赛汀
Figure BDA00003376979900131
参见US5,821,337）在已经接受广泛在先抗癌疗法的、患有过表达HER2的转移性乳腺癌的患者中是有临床活性的（Baselga,J.等,J.Clin.Oncol.14(1996)737-744）。曲妥珠单抗在1998年9月25日从食品和药品管理局(Food and Drug Administration)收到上市批准，用于治疗其肿瘤过表达HER2蛋白的转移性乳腺癌患者。
人源化抗ErbB2抗体包括huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8
Figure BDA00003376979900132
如记载于美国专利5,821,337（其通过提述明确并入本文）的表3中的；人源化520C9（W093/21319）和人源化2C4抗体，如记载于WO01/000245（其通过提述明确并入本文）中的。
其它具有各种特性的HER2抗体已经记载于Tagliabue,E.等,Int.J.Cancer47(1991)933-937;McKenzie,S.J.等,Oncogene4(1989)543-548;Maier,L.A.等,Cancer Res.51(1991)5361-5369;Bacus,S.S.等,Molecular Carcinogenesis3(1990)350-362;Stancovski,I.等,PNAS USA88(1991)8691-8695;Bacus,S.S.等,Cancer Research52(1992)2580-2589;Xu,F.等,Int.J.Cancer53(1993)401-408;WO94/00136;Kasprzyk,P.G.等,Cancer Research52(1992)2771-2776;Hancock,M.C.等,Cancer Res.51(1991)4575-4580;Shawver,L.K.等,Cancer Res.54(1994)1367-1373;Arteaga,C.L.等,Cancer Res.54(1994)3758-3765;Harwerth,I.M.等,J.Biol.Chem.267(1992)15160-15167;US5,783,186;及Klapper,L.N.等,Oncogene14(1997)2099-2109。
培妥珠单抗（参见例如WO01/000245）是称为HER二聚化抑制剂(HDI)的一类新药剂之第一种。培妥珠单抗在HER2的二聚化域处与其结合，由此抑制其形成活性二聚体受体复合物的能力，并且如此阻断下游信号级联，其最终导致细胞生长和分裂（参见Franklin,M.C.,Cancer Cell5(2004)317-328）。培妥珠单抗是一种针对HER2的胞外域的完全人源化的重组单克隆抗体。培妥珠单抗对人上皮细胞上的HER2的结合阻止HER2与HER家族的其它成员（包括EGFR、HER3、HER4）形成复合物，且可能还阻止HER2同二聚化。通过阻断复合物形成，培妥珠单抗阻止由HER1、HER3和HER4的配体（例如EGF、TGFα、双调蛋白和调蛋白）激活的生长刺激效果和细胞存活信号。培妥珠单抗的另一名称为2C4。培妥珠单抗是一种基于人IgG1(K)框架序列的完全人源化的重组单克隆抗体。培妥珠单抗的结构由两条重链（449个残基）和两条轻链（214个残基）组成。与曲妥珠单抗
Figure BDA00003376979900141
相比，培妥珠单抗具有轻链中的12处氨基酸差异和IgG1重链中的29处氨基酸差异。
术语“疏水性”指主要特征在于范德华(van der Waals)相互作用为主要的或甚至唯一要考虑的分子间相互作用的化合物。术语“主要”在此背景中指原则上，亲水性化合物也可以是可能的且存在的，但是对各分析物的化学和/或物理特性的一般性表征仅具有次要的意义。术语“疏水性”的反义词在本发明的背景中为术语“亲水性”，其指那些以氢键键合表征且具有强极性和/或质子性特征的化合物。在一个实施方案中，所述离子交换层析材料基质是疏水性基质。
术语“质子性”指含有或释放质子和/或形成氢键的特性，如例如水、醇、胺等。从分子释放质子也以解离为技术人员所知。最简单的质子性溶剂是水，其以简化的方式解离成质子和氢氧根离子。公知的质子性溶剂是例如醇，其中质子的释放一般在羟基基团处发生，从而留下前述羟基基团的带负电荷的氧原子，因为电负性氧原子能够使所得的负电荷稳定化。甚至可以认为碳酸是质子性溶剂，只要从羧基官能释放质子不导致与特定物质（其例如要在特定溶液中溶解）的化学反应。另一组质子性溶剂以胺代表，所述胺含有其氨基基团中的“质子”（严格来讲是氢原子）和相应的氮原子处的自由电子对以形成氢键。
术语“流动相”指水和/或水性缓冲液的任意混合物，以及适合于从层析柱洗脱分析物的有机溶剂。术语“洗脱”在本上下文中如本领域熟练技术人员已知的那样使用，并且指吸附的物质从充满流体的固体或吸附剂（即吸附有所述物质的柱材料）的溶解（任选地置换）。
术语“吸附”指在由流体与物体形成的边界相处从流体（例如流动相）积累物质，其中后者能够在其表面吸附物质。此吸附导致吸附的物质在特定表面的积累。能够在其表面积累物质的物体经常称为吸附剂，而吸附的材料称为被吸附物。术语吸附通常与术语吸收区分开来，术语吸收除了在表面的积累外还指累积的物质穿透吸附固体或流体的内部。一般而言，吸附是其中物质（通常为分子）粘附于吸附剂表面并如此在相应表面积累的物理过程。负责此粘附的力视为物理力而非化学键，且如此吸附在本领域中还称为物理吸附或物理吸着，其并不必然排除物质对表面的化学键合。涉及物质对表面吸附的物理力在大多数情况下为范德华力、伦敦力(London force)或偶极子/偶极子相互作用，例如氢键，或偶极子诱导的偶极子相互作用，其中这些术语如上文解释的那样或如在吸附的上下文中通常使用的那样使用。
在（柱）层析中，通常使用溶剂作为洗脱液，即要洗脱的物质在其中至少充分可溶的洗脱剂。
术语“可膨胀基质”指基于单体的任何可膨胀的聚合物凝胶，所述单体在三维网络的形成下彼此化学或物理相连。通过键形成实现化学连接性，而可膨胀基质的物理构建可以基于相应聚合物区段的单一区域间的静电的、疏水的或偶极子/偶极子相互作用。在一个实施方案中，术语“可膨胀基质”指其中三维网络经由化学键形成获得的聚合物凝胶。该网络自身可以由一种或多种不同组分组成。在存在合适的溶剂的情况下，该网络在同时掺入相应溶剂下膨胀成其三维网络，直到达到掺入体积的平衡体积。在另一项术语中，网络的膨胀状态称为凝胶，而非膨胀状态称为凝胶材料(gelator)。在本发明的背景中，术语可膨胀基质还涵盖术语凝胶材料的意义。
术语“可膨胀基质”仅指那些由在存在水作为溶剂的情况下膨胀的亲水性但水不溶性聚合物构建的凝胶。可膨胀基质对水的亲和力归结于聚合网络的拯救(salvation)和熵效应。除了水之外，纯的亲水性有机溶剂，如例如甲醇、乙醇和二甲基甲酰胺以及它们相应的含有可变量有机溶剂的水性溶液也实现可膨胀基质的膨胀，其中术语亲水性如上文解释的那样理解。因而，术语可膨胀基质不再仅限于那些在将水掺入到其网络中下，而且还有在掺入亲水性有机溶剂和/或其相应的水性溶液和/或可变组成的混合物下膨胀的凝胶。
在可膨胀基质的背景中，交联具有主要的意义，因为其导致三维结构的形成以及还形成空穴，其允许基质的膨胀行为。此外，交联程度必然地影响获得的可膨胀基质的孔径。
如此，如本文中报告的一个方面是用于在抗体制备物中富集抗体同等型的方法，包括以下步骤：
a)将包含抗体的不同同等型的缓冲溶液施加到阳离子交换层析材料，
b)将具有第一电导率的第一溶液施加到阳离子交换层析材料，由此抗体同等型保持与阳离子交换层析材料结合，并
c)将具有第二电导率的第二溶液施加到阳离子交换层析材料，并且由此获得具有富集的抗体同等型的抗体制备物，
其中所述第二溶液的电导率超出所述第一溶液的电导率不超过50%。
一个实施方案是用于在抗体制备物中富集抗体同等型的方法，包括以下步骤：
a)将包含抗体的不同同等型的缓冲溶液施加到阳离子交换层析材料，
b)将具有第一电导率的第一溶液施加到阳离子交换层析材料，由此抗体同等型保持与阳离子交换层析材料结合，并
c)将具有第二电导率的第二溶液施加到阳离子交换层析材料，并且由此获得具有富集的抗体同等型的抗体制备物，
其中所述第二溶液的电导率超出所述第一溶液的电导率不超过10%。
在一个实施方案中，步骤a)的溶液与步骤b)的溶液具有相同的电导率。
“抗体同等型”指相对于同一抗体的其它同等型具有较小差异的抗体型式。“同一抗体”是除了对特定同等型的修饰外具有相同的氨基酸序列的抗体。抗体的不同形式可以在编码该抗体的序列的转录或翻译期间，以及源自抗体自细胞的加工和分泌、纯化、配制和贮存期间的降解的差异产生。抗体同等型可以在氨基酸序列、多聚化、糖基化和其它翻译后修饰中变化。“糖形(glycoform)”是糖蛋白的不同型式通过翻译后修饰而具有与其附接的不同多糖的同等型。还有，抗体重链C端的赖氨酸残基加工可以是抗体结构变化的来源。
已经发现了可以使用阳离子交换柱层析方法富集或甚至部分分离抗体制备物中的抗体同等型。对于从层析材料回收抗体，这可以在结合-和-洗脱方法中使用线性或步式的pH或盐梯度来实现。通过使用具有微小斜率的梯度，即具有的pH值的相对变化或电导率的增加为起始值的50%或更小，特别是起始值的10%或更小，该方法是特别有效的。由于不同抗体同等型作为相应层析谱中的至少半分离的峰是可见的，可以基于选择和组合的跨越层析谱中相应峰的洗脱级分来调节抗体制备物的同等型组成。
更详细地，已经发现了抗体制备物中抗体同等型的富集可以通过适当的增加施加到阳离子交换层析材料的流动相的电导率来实现。
术语“抗体制备物”指包含同一抗体的不同同等型的混合物。
在图1中显示了柱层析分离的洗脱层析谱，所述柱层析分离使用从20vol%洗脱缓冲液至60vol%洗脱缓冲液的线性梯度进行（清洗缓冲液包含20mM柠檬酸钠，洗脱缓冲液包含20mM柠檬酸钠和100mM氯化钠）。可以看到抗体同等型在单个峰中回收。可以看到一个微小的前峰。
在图2中显示了柱层析分离的洗脱层析谱，所述柱层析分离使用24vol%洗脱缓冲液的步式梯度进行（清洗缓冲液包含20mM柠檬酸钠，洗脱缓冲液包含20mM柠檬酸钠和100mM氯化钠）。可以看到抗体同等型在一个半分离的峰中回收。
在图3中显示了柱层析分离的洗脱层析谱，所述柱层析分离使用15vol%洗脱缓冲液的步式梯度进行（清洗缓冲液包含20mM柠檬酸钠，洗脱缓冲液包含20mM柠檬酸钠和80mM氯化钠）。可以看到抗体同等型在两个半分离的峰中回收，其中第一个峰显示前峰。
在图4中显示了柱层析分离的洗脱层析谱，所述柱层析分离使用100vol%洗脱缓冲液的步式梯度进行（清洗缓冲液包含20mM柠檬酸钠，洗脱缓冲液包含20mM柠檬酸钠和5mM氯化钠）。可以看到抗体同等型在三个半分离的峰中回收。
在图5中显示了使用单一步式洗脱方法的柱层析分离的洗脱层析谱，其中电导率从100%增加到159%。可以看到抗体作为单个峰回收。
在图6中显示了柱层析分离的洗脱层析谱，所述柱层析分离使用从100vol%第一缓冲溶液至60vol%第二缓冲溶液的线性梯度进行（第一缓冲液包含25mM TRIS和10mM氯化钠；第二缓冲液包含25mM TRIS和70mM氯化钠；这两种缓冲液都具有pH7.4的pH值）。可以看到抗体同等型在三个峰中回收。
在一个实施方案中，电导率增加是50%或更小，即电导率增加至150%或更小。如此，第二溶液具有的电导率为第一溶液的电导率的101%至150%。增加可以以单一步式或线性梯度的形式。所述增加可以通过洗脱溶液的完全变化，即从100%第一（=清洗）溶液到100%第二（=洗脱）溶液实施。
在一个实施方案中，电导率增加是10%或更小，即电导率增加至110%或更小。如此，第二溶液具有的电导率为第一溶液的电导率的101%至110%。增加可以以单一步式或线性梯度的形式。所述增加可以通过洗脱溶液的完全变化，即从100%第一（=清洗）溶液到100%第二（=洗脱）溶液实施。
在一个实施方案中，所述线性梯度包含三种各具有不同斜率的线性梯度。
在一个实施方案中，第一线性梯度达18至20个柱体积，第二线性梯度达2至4个柱体积，且第三线性梯度达6至8个柱体积。在一个实施方案中，第一线性梯度至第一溶液电导率的约115%，第二线性梯度是至第一溶液电导率的约137%，且第三线性梯度至第一溶液电导率的约150%。
还已经发现了阳离子交换层析材料的基质必须是可膨胀基质。在一个实施方案中，所述基质是交联的糖类。在另一个实施方案中，所述糖类是多糖。在另一个实施方案中，所述多糖是琼脂糖，即由糖苷结合的D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖组成的多糖。
如此，如本文中报告的另一个方面是用于生成抗体制备物的方法，包括以下步骤：
a)培养包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞，并从所述细胞或培养液回收所述抗体，
b)通过至少一个柱层析步骤纯化所述抗体，其中所述至少一个层析步骤包括以下步骤：
i)将包含所述抗体的不同同等型的缓冲溶液施加到阳离子交换层析材料，
ii)将具有第一电导率的第一溶液施加到所述阳离子交换层析材料，由此所述抗体同等型保持与所述阳离子交换层析材料结合，并
iii)将具有第二电导率的第二溶液施加到所述阳离子交换层析材料，并由此生成所述抗体制备物，
其中所述第二溶液的电导率超出所述第一溶液的电导率不超过10%。
在一个实施方案中，所述方法是用于大规模生产的方法。在另一个实施方案中，大规模是1g或更多的抗体制备物的。
提供下列实施例和附图以帮助理解本发明，其真实范围在所附权利要求书中列出。理解的是，可以在不背离本发明精神的前提下对所列规程做出修改。
附图简述
图1显示了柱层析分离的洗脱层析谱，所述柱层析分离使用从20vol%洗脱缓冲液至60vol%洗脱缓冲液的线性梯度进行（清洗缓冲液包含20mM柠檬酸钠，洗脱缓冲液包含20mM柠檬酸钠和100mM氯化钠）。
图2显示了柱层析分离的洗脱层析谱，所述柱层析分离使用24vol%洗脱缓冲液的步式梯度进行（清洗缓冲液包含20mM柠檬酸钠，洗脱缓冲液包含20mM柠檬酸钠和100mM氯化钠）。
图3显示了柱层析分离的洗脱层析谱，所述柱层析分离使用15vol%洗脱缓冲液的步式梯度进行（清洗缓冲液包含20mM柠檬酸钠，洗脱缓冲液包含20mM柠檬酸钠和80mM氯化钠）。
图4显示了柱层析分离的洗脱层析谱，所述柱层析分离使用100vol%洗脱缓冲液的步式梯度进行（清洗缓冲液包含20mM柠檬酸钠，洗脱缓冲液包含20mM柠檬酸钠和5mM氯化钠）。
图5抗HER-2抗体从强阳离子交换树脂SP-Sepharose的单一步式洗脱；抗体的单体和聚集形式未分开，并且作为一个峰洗脱。
图6显示了柱层析分离的洗脱层析谱，其使用至60vol%洗脱缓冲液的线性梯度进行（清洗缓冲液包含25mM TRIS和10mM氯化钠，洗脱缓冲液包含25nM TRIS和70mM氯化钠）。
实施例
材料和方法
可以在如本文中报告的方法中使用的一种例示性免疫球蛋白是在WO92/022653、WO99/057134、WO97/04801、US5,677,171和US5,821,337（其通过提述并入本文）中报告的抗HER2抗体。
分析性大小排阻层析：
树脂：      TSK3000(Tosohaas)
柱：        300x7.8mm
流速：      0.5ml/分钟
缓冲溶液：  含有250mM氯化钾的200mM磷酸钾，调节至pH7.0
波长：      220nm
分析性IE-HPLC：
树脂：      DionexProPacTM WCX-10分析级
柱：        4x250mm
流速：      0.8ml/分钟
缓冲液A：   10mM磷酸钠，调节至pH7.5
缓冲液B：   10mM磷酸钠，其调节至pH7.5且补充有0.1M氯化钠
起始条件：  85vol%缓冲液A和15vol%缓冲液B
梯度：      在9个柱体积中至55vol%缓冲液B
检测波长：  214nm
样品量：    50μg
将样品和羧肽酶B用样品缓冲液稀释至终浓度1mg/ml。向稀释的样品溶液添加1%(w/w)稀释的羧肽酶溶液。
实施例1
在SP-Sepharose上用至60vol%洗脱缓冲液的组合梯度洗脱的层析
层析条件：
树脂：      Highscreen SP-Sepharose
流速：      1.2ml/分钟
平衡：      20mM柠檬酸钠，调节至pH6.2
加载：      1g蛋白质/l层析材料
清洗：      20mM柠檬酸钠，调节至pH6.2
洗脱：      20mM柠檬酸钠，其调节至pH6.2且补充有100mM氯化钠
洗脱方法：
步式和线性梯度的组合
步式至20%洗脱缓冲液，然后线性梯度至60%洗脱缓冲液
在图1中显示了洗脱层析谱。可以看到抗体同等型可以在单个峰中回收。可以看到微小的前峰。
实施例2
在SP-Sepharose上用至24vol%洗脱缓冲液的步式梯度洗脱的层析
层析条件：
树脂：      Highscreen SP-Sepharose
流速：      1.2ml/分钟
平衡：      20mM柠檬酸钠，调节至pH6.2
加载：      1g蛋白质/l层析材料
清洗：      20mM柠檬酸钠，调节至pH6.2
洗脱：      20mM柠檬酸钠，其调节至pH6.2且补充有100mM氯化钠
洗脱方法：
单一步式梯度
步式至24%洗脱缓冲液，并且在20个柱体积里洗脱
在图2中显示了洗脱层析谱。可以看到抗体同等型可以在一个半分离的峰中回收。
实施例3
在SP-Sepharose上用至15vol%洗脱缓冲液的步式梯度洗脱的层析
层析条件：
树脂：      Highscreen SP-Sepharose
流速：      1.2ml/分钟
平衡：      20mM柠檬酸钠，调节至pH6.2
加载：      1g蛋白质/l层析材料
清洗：      20mM柠檬酸钠，调节至pH6.2
洗脱：      20mM柠檬酸钠，其调节至pH6.2且补充有80mM氯化钠
洗脱方法：
单一步式梯度
步式至15%洗脱缓冲液，并且在20个柱体积里洗脱
在图3中显示了洗脱层析谱。可以看到抗体同等型可以在两个半分离的峰中回收，其中第一个峰显示前峰。
实施例4
在SP-Sepharose上用至100vol%洗脱缓冲液的步式梯度洗脱的层析
层析条件：
树脂：      Highscreen SP-Sepharose
流速：      1.2ml/分钟
平衡：      20mM柠檬酸钠，调节至pH6.2
加载：      1g蛋白质/l层析材料
清洗：      20mM柠檬酸钠，调节至pH6.2
洗脱：      20mM柠檬酸钠，其调节至pH6.2且补充有5mM氯化钠
洗脱方法：
单一步式
单步至100%洗脱缓冲液且在20个柱体积里洗脱
在图4中显示了洗脱层析谱。可以看到抗体同等型可以在三个半分离的峰中回收。
实施例5
在MonoS强阳离子交换树脂上用至100vol%洗脱缓冲液的pH梯度洗脱的层析
层析条件：
树脂：      MonoS
平衡：      20mM柠檬酸钠，调节至pH5.2
清洗：      20mM柠檬酸钠，调节至pH5.2
洗脱：      50mM磷酸钠，调节至pH7.5
洗脱方法：
梯度洗脱
从0%至100%洗脱缓冲液。
同等型可以作为三个半分离的峰获得。
实施例6
比较例：用强阳离子交换树脂(SP-Sepharose)对单克隆抗HER-2抗体的层析分离(WO99/57134)
在SP-Sepharose（一种强阳离子交换树脂）上用阳离子交换层析实施单克隆抗HER2抗体
Figure BDA00003376979900231
的纯化。在标准条件，即用例如氯化钠的步式洗脱下，没有实现抗体的单体和聚集形式的分离（图5）。
层析条件：
树脂：      SP-Sepharose
流速：      160cm/h
平衡：      25mM2-吗啉代乙磺酸，50mM氯化钠，调节至pH5.6
加载：      最大20g蛋白质/L凝胶基质
清洗：      25mM2-吗啉代乙磺酸，50mM氯化钠，调节至pH5.6
洗脱：      25mM2-吗啉代乙磺酸，95mM氯化钠，调节至pH5.6
在第一步中用蛋白A亲和层析纯化单克隆抗HER-2抗体。在酸性条件（10mM柠檬酸钠缓冲液，pH值为3.0±0.5）下实施从蛋白A柱的洗脱。在过滤步骤前，用浓缩的三羟甲基氨基甲烷(TRIS)缓冲液将含有抗体的级分的pH值调节至pH5.6。蛋白A洗脱物是具有介于5mg/ml和15mg/ml之间的蛋白质浓度的溶液，并且用柠檬酸钠缓冲。
将条件化的蛋白A洗脱物施加到含有强阳离子交换树脂(SP-Sepharose)的层析柱。在以160cm/h流速的加载步骤后，用平衡缓冲液（10个柱体积）清洗该柱。用单一步式洗脱方法洗脱结合的免疫球蛋白，其中使pH值保持恒定，并通过（逐步）增加氯化钠浓度改变电导率。在图5中展示洗脱层析谱。
没有实现抗体的单体和聚集形式的分离。
实施例7
在SourceTM15S上用至60vol%洗脱缓冲液的梯度洗脱的层析
层析条件：
树脂：      SourceTM15S
柱体积：    1.14l
流速：      100cm/h
平衡：      25mM TRIS，10mM氯化钠，调节至pH7.4
加载：      0.88g蛋白质/l层析材料
清洗：      25mM TRIS，10mM氯化钠，调节至pH7.4
洗脱：      25mM TRIS，70mM氯化钠，调节至pH7.4
洗脱方法：
           梯度
           在19个柱体积中至33vol%洗脱缓冲液
           在3个柱体积中至50vol%洗脱缓冲液
           在7个柱体积中至60vol%洗脱缓冲液
在图6中显示了洗脱层析谱。可以看到抗体同等型可以从明确的峰回收。

Claims (16)

1.一种用于生成抗体制备物的方法，该方法包括以下步骤：
a)将包含抗体的不同同等型的缓冲溶液施加到阳离子交换层析材料，
b)将具有第一电导率的第一溶液施加到所述阳离子交换层析材料，由此所述抗体同等型保持吸附于所述阳离子交换层析材料，
c)将具有第二电导率的第二溶液施加到所述阳离子交换层析材料，并由此获得抗体制备物，
其中所述第二溶液的电导率超出所述第一溶液的电导率不超过50%。
2.一种用于生成抗体制备物的方法，该方法包括以下步骤：
a)培养包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞，并从所述细胞或培养液回收所述抗体，
b)通过至少一个柱层析步骤纯化所述抗体，其中所述至少一个层析步骤包括以下步骤：
i)将包含所述抗体的不同同等型的缓冲溶液施加到阳离子交换层析材料，
ii)将具有第一电导率的第一溶液施加到所述阳离子交换层析材料，由此所述抗体同等型保持与所述阳离子交换层析材料结合，并
iii)将具有第二电导率的第二溶液施加到所述阳离子交换层析材料，并由此生成抗体制备物，
其中所述第二溶液的电导率超出所述第一溶液的电导率不超过50%。
3.依照前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述第二溶液的电导率超出所述第一溶液的电导率不超过15%。
4.依照权利要求3的方法，其特征在于所述第二溶液的电导率超出所述第一溶液的电导率不超过10%。
5.依照前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述阳离子交换层析材料具有可膨胀基质。
6.依照权利要求5的方法，其特征在于所述可膨胀基质是琼脂糖。
7.依照前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述阳离子交换层析材料是强阳离子交换层析材料。
8.依照权利要求7的方法，其特征在于所述强阳离子交换层析材料是磺丙基阳离子交换层析材料。
9.依照前述权利要求中任一项的方法，其特征在于在单一步骤中或在线性梯度中将所述第一溶液改变成所述第二溶液。
10.依照权利要求9的方法，其特征在于所述单一步骤是从100vol%所述第一溶液至100vol%所述第二溶液的变化。
11.依照前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述第一溶液包含20mM柠檬酸钠和10mM氯化钠或25mM TRIS和10mM氯化钠。
12.依照前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述第二溶液包含20mM柠檬酸钠和5mM氯化钠或25mM TRIS和70mM氯化钠。
13.依照前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述抗体是抗HER2抗体。
14.依照权利要求13的方法，其特征在于所述抗HER2抗体是抗HER2抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)或抗HER2抗体培妥珠单抗(Pertuzumab)。
15.依照前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述第一溶液的电导率是4mS/cm至5mS/cm的。
16.通过依照权利要求1至15中任一项的方法获得的抗HER2抗体。
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