JP2022525478A - クローディン６二重特異性抗体 - Google Patents

Abstract

本開示は、クローディン６（ＣＬＤＮ６）と第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質を提供する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６の細胞外ドメインの細胞外ループ２（ＥＬ２）に結合する。関連するポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、及び複合体が、本明細書でさらに提供される。そのような実体を含むキット及び医薬組成物がさらに提供される。また、抗原結合タンパク質を作製する方法及びがんを有する対象を治療する方法も提供される。【選択図】図６１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月２０日に出願された米国仮出願第６２／８２１，３９９号の利益を主張するものであり、前記出願の全内容は、この参照によりその全体が組み込まれる。

電子的に提出された資料の参照による組み込み
参照によりその全体が組み込まれるのは、出願時に同時に提出された、２０１９年３月２０日作成の「５４０８６Ｐ２＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」というファイル名の３４４，０６４ＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルとして識別される、コンピュータ読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸の配列表である。

抗体は、それらが持つ、細胞、細菌、ウイルス、または毒素上の異なる抗原を特異的に標的とする能力のために副作用が限られていることを特徴とする、強力な治療剤を構成する。１９８６年、初の治療用モノクローナル抗体であるＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３が市場に導入された。それ以来、このクラスのバイオ医薬品は大きく成長している。２０１４年後半、がん、ならびに炎症性疾患、心血管疾患、呼吸疾患、及び感染症を含む様々な疾患の治療について４７品のモノクローナル抗体製品が米国または欧州で承認を受けた。

１２品を超えるモノクローナル抗体が現在がんを治療するために米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）により承認されている。これらの薬剤の中には、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）に適応となるアレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、及び乳癌を治療するために使用されるトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））がある。一部の抗体は、例えば、ブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標））及びトラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））等、化学療法薬で標識されている。ブリナツモマブ（ビーリンサイト）等の他の抗体製品は、２つの異なる抗原を認識して結合するよう設計されている。そのような抗体製品が市販されているにもかかわらず、現在のがん発生率及びがん死亡は依然として高い。がん発生率は、男女１００，０００人・年あたり４５０人超、及びがん死亡率は、男女１００，０００人・年あたり１７０人強であることが報告されている。

本明細書では、クローディン６（ＣＬＤＮ６）に結合する抗原結合タンパク質及びその二重特異性型が提供される。様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ６に結合し、任意選択でマウスＣＬＤＮ６に結合する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合する。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６のＥＣＤの細胞外ループ２（ＥＬ２）に結合する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＥＬ２に結合し、ＣＬＤＮ６のＥＣＤの細胞外ループ１（ＥＬ１）には結合しない。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、ヒトクローディンファミリーの追加のメンバー、例えば、クローディン３（ＣＬＤＮ３）、クローディン４（ＣＬＤＮ４）、及びクローディン９（ＣＬＤＮ９）等に結合する。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６、及びＣＬＤＮ４とＣＬＤＮ９のうちの少なくとも１つに結合する。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６に結合し、クローディンファミリーのいかなる他のメンバーとも結合しない。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ヒト卵巣癌細胞、例えば、ＯＶＣＡ４２９細胞により内因的に発現されるＣＬＤＮ６に結合し、ＯＶＣＡ４２９細胞を用いたＦＡＣＳ親和性アッセイでは、約１２００ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。様々な場合には、本開示の抗原結合タンパク質は、この抗原結合タンパク質に結合しているいかなる他の部分も含まずに、対象、例えば、ヒトにおける腫瘍増殖を阻害する。

本明細書では、対象、例えば、ヒトにおける腫瘍増殖を阻害する、異種部分に結合させた（例えば、任意の化学療法薬、薬物または毒性部分に結合させた）抗原結合タンパク質がさらに提供される。様々な場合には、結合させた抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体である。様々な場合には、抗体を、微小管動態を変化させる薬剤、例えば、ＭＭＡＥに結合させる。様々な場合には、複合体は、切断可能なリンカー、例えば、ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢを含む。様々な態様では、複合体は、均一複合体または不均一複合体である。様々な態様では、異種部分を、抗原結合タンパク質の特定の部位にて結合させる。様々な場合には、結合させた抗原結合タンパク質は、二重特異性抗原結合タンパク質である。

様々な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、ヒトがん細胞により発現されるＣＬＤＮ６に結合する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ６と抗ＣＬＤＮ６参照抗体との結合相互作用を阻害する。特定の理論に拘束されることなく、本明細書で提供される抗原結合タンパク質の阻害作用により、そのような実体が、腫瘍増殖を抑制し、腫瘍またはがんのある対象を治療する方法において有用となる。本明細書でさらに考察されるように、様々な態様では、抗原結合タンパク質は、抗体、その抗原結合性抗体断片、または抗体タンパク質産物である。

本開示は、特定のアミノ酸配列群のうちの少なくとも３つ、４つ、５つ、またはすべてのアミノ酸配列を含む二重特異性抗原結合タンパク質も提供する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、本明細書に開示されるＣＬＤＮ６抗体の少なくとも３つ、４つ、５つ、または６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む。

関連するポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、及び複合体が、本明細書でさらに提供される。そのような実体を含むキット及び医薬組成物がさらに意図される。

また、二重特異性抗原結合タンパク質を作製する方法も提供される。様々な実施形態では、方法は、本明細書に記載されるような二重特異性抗原結合タンパク質またはポリペプチドを発現するように、かかる二重特異性抗原結合タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含む。

がんを有する対象を治療する方法が本明細書でさらに提供される。様々な実施形態では、方法は、本開示の医薬組成物を、対象におけるがんを治療するのに有効な量で対象に投与することを含む。

また、本明細書に記載される医薬組成物を対象に投与することを含む、ＣＬＤＮ６発現がんを有する対象を治療する方法も提供される。さらに、本明細書に記載される医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における腫瘍増殖を阻害する方法が意図される。

本明細書に記載される医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における腫瘍サイズを縮小させるか、または対象におけるがんの再発を予防する方法。

また、本明細書では、ＣＬＤＮ６の低過剰発現個体であると診断された対象におけるがんを治療する方法も提供され、本明細書に記載される医薬組成物を対象に投与することを含む。

様々な実施形態では、投与することにより、腫瘍細胞、例えば、ＣＬＤＮ６発現細胞にアポトーシスが誘導される。様々な実施形態では、投与により、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）もしくは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、腫瘍壊死及び細胞の死もしくは除去、及び／または腫瘍細胞接着の破壊が誘導され、その各々が腫瘍の退縮または腫瘍増殖の減速をもたらす。

正常（非がん性）組織におけるＣＬＤＮ６発現のグラフを表す。 Ａｇｉｌｅｎｔ４４Ｋの方法で決定されたがん細胞株におけるＣＬＤＮ６発現のグラフを表す。 ＲＮＡＳｅｑで決定されたがん細胞株におけるＣＬＤＮ６発現のグラフを表す。 異なる細胞モデルにおけるＣＬＤＮ６－ＧＦＰの局在を示す一連の蛍光画像を表す。 ヒトＣＬＤＮ６、ヒトＣＬＤＮ３、ヒトＣＬＤＮ４、ヒトＣＬＤＮ９、及びマウスＣＬＤＮ６の配列アラインメントを表す。ＥＬ１及びＥＬ２の配列が示されている。 Ａは、対照ＩｇＧ２抗体、ＡＢ３、参照Ａｂ１、参照Ａｂ２、参照Ａｂ３、ＡＢ２、及びＡＢ３による処置後の時間（日数）に応じた、子宮内膜腫瘍担がんマウスの腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ^３）のグラフを表す。Ｂは、対照ＩｇＧ２抗体、ＡＢ３、参照Ａｂ１、参照Ａｂ２、参照Ａｂ３、ＡＢ２、またはＡＢ３により処置された子宮内膜腫瘍担がんマウスの腫瘍の１４日目における腫瘍体積（ｍｍ^３）の平均変化のグラフを表す。 Ａは、対照ＩｇＧ２抗体、ＡＢ３、参照Ａｂ１、参照Ａｂ２、及びＡＢ３による処置後の時間（日数）に応じた、膀胱腫瘍担がんマウスの腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ^３）のグラフを表す。Ｂは、対照ＩｇＧ２抗体、ＡＢ３、参照Ａｂ１、参照Ａｂ２、またはＡＢ３により処置された膀胱腫瘍担がんマウスの腫瘍の３５日目における腫瘍体積（ｍｍ^３）の平均変化のグラフを表す。 Ａは、対照ＩｇＧ２抗体、ＡＢ３、参照Ａｂ１、ＡＢ２、及びＡＢ３による処置後の時間（日数）に応じた、卵巣腫瘍担がんマウスの腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ^３）のグラフを表す。Ｂは、対照ＩｇＧ２抗体、ＡＢ３、参照Ａｂ１、ＡＢ２、またはＡＢ３により処置された卵巣腫瘍担がんマウスの腫瘍の２０日目における腫瘍体積（ｍｍ^３）の平均変化のグラフを表す。 Ａは、対照ＩｇＧ２抗体、ＡＢ３、参照Ａｂ１、参照Ａｂ２、参照Ａｂ３、及びＡＢ３による処置後の時間（日数）に応じた、メラノーマ腫瘍担がんマウスの腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ^３）のグラフを表す。Ｂは、対照ＩｇＧ２抗体、ＡＢ３、参照Ａｂ１、参照Ａｂ２、参照Ａｂ３、またはＡＢ３により処置されたメラノーマ腫瘍担がんマウスの腫瘍の２１日目における腫瘍体積（ｍｍ^３）の平均変化のグラフを表す。 Ａは、対照抗体により処置されたマウスと比べて、ＡＢ３により処置された担がんマウスで達成された腫瘍増殖抑制（％）のグラフを表す。Ｂは、子宮内膜癌細胞株（ＡＲＫ２）、膀胱癌細胞株（ＵＭＵＣ４）、卵巣癌細胞株（ＯＶ９０）及びメラノーマ細胞株（Ｍ２０２）及び対照細胞で異なるレベルのＣＬＤＮ６ ｉｄを示すウエスタンブロットの画像を表す。α－チューブリンのレベルはほぼ同じであったことから、ロードしたタンパク質は同等であることが示される。 ビヒクル対照、対照抗体、参照Ａｂ１、参照Ａｂ２、参照Ａｂ３、及びＡＢ３により処置された担がんマウスの時間（日数）に応じた体重変化（％）のグラフを表す。 ビヒクル対照、対照ＩｇＧ２抗体、ＡＢ３、参照Ａｂ１、または示されている抗ＣＬＤＮ６抗体のうちの１つによる処置後の時間（日数）に応じた、卵巣腫瘍担がんマウスの腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ^３）のグラフを表す。 ビヒクル対照、対照ＩｇＧ２抗体、ＡＢ３、参照Ａｂ１、または示されている抗ＣＬＤＮ６抗体のうちの１つにより処置された卵巣腫瘍担がんマウスの腫瘍の２８日目における腫瘍体積（ｍｍ^３）の平均変化のグラフを表す。 ビヒクル対照、対照抗体、参照Ａｂ１、及び示されている抗ＣＬＤＮ６抗体により処置された担がんマウスの時間（日数）に応じた体重変化（％）のグラフを表す。 本発明のいくつかの抗ＣＬＤＮ６抗体ならびに参照Ａｂ１及び参照２の一連の用量反応曲線を表す。マウスＩｇＧは、対照として使用した。 Ａは、ビヒクル対照、対照ＩｇＧ抗体、ＡＢ３のマウス型、ＡＢ３の第１のヒト化型、及びＡＢ３の第２のヒト化型により処置された膀胱腫瘍担がんマウスの腫瘍の３５日目における腫瘍体積（ｍｍ^３）の平均変化のグラフを表す。Ｂは、図１５Ａの各群についての腫瘍体積（ｍｍ^３）の変化のグラフを表す。 Ａは、ビヒクル対照、対照ＩｇＧ抗体、ＡＢ３のマウス型、ＡＢ３の第１のヒト化型、及びＡＢ３の第２のヒト化型により処置された膀胱腫瘍担がんマウスの腫瘍の３５日目における腫瘍体積（ｍｍ^３）の平均変化のグラフを表す。２つの対照抗体（１つはマウス、１つはキメラ）もまた本実験で試験される。Ｂは、図１６Ａの各群についての腫瘍体積（ｍｍ^３）の変化のグラフを表す。 Ａは、ビヒクル対照、対照ＩｇＧ抗体、ＡＢ１のマウス型、及びＡＢ１のヒト化型により処置された膀胱腫瘍担がんマウスの腫瘍の３５日目における腫瘍体積（ｍｍ^３）の平均変化のグラフを表す。Ｂは、図１７Ａの各群についての腫瘍体積（ｍｍ^３）の変化のグラフを表す。 Ａは、ビヒクル対照、対照ＩｇＧ抗体、ＡＢ４のマウス型、及びＡＢ４のヒト化型により処置された膀胱腫瘍担がんマウスの腫瘍の３５日目における腫瘍体積（ｍｍ^３）の平均変化のグラフを表す。Ｂは、図１８Ａの各群についての腫瘍体積（ｍｍ^３）の変化のグラフを表す。 Ａは、ビヒクル対照、対照ＩｇＧ抗体、ＡＢ３のマウス型、ＡＢ３のキメラ型、ＡＢ３の第１のヒト化型、ＡＢ３の第２のヒト化型、Ａｂ１のマウス型、ＡＢ１のヒト化型、ＡＢ４のマウス型、ＡＢ４のヒト化型により処置された膀胱腫瘍担がんマウスの腫瘍の３５日目における腫瘍体積（ｍｍ^３）の平均変化のグラフを表し、４つの対照抗体（１つの抗体はマウス型またはキメラ型を有し、１つの抗体はマウス型またはヒト型を有する）もまた本実験で試験される。Ｂは、図１９Ａの各群についての腫瘍体積（ｍｍ^３）の変化のグラフを表す。 図１９Ａに記載のように処置された膀胱腫瘍担がんマウスの腫瘍の５５日目における腫瘍体積（ｍｍ^３）の平均変化のグラフを表す。 図１９Ａに記載のように処置された３２日目における処置された担がんマウスの体重変化（％）のグラフを表す。 作製され、特徴付けされた、１２のＣＬＤＮ６抗体（名称Ｓ１～Ｓ１２）の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列の一覧である。Ｓ１～Ｓ６は、ＡＢ３のヒト化バージョン（ヒト化ＡＢ３－７）に基づき、Ｓ７～Ｓ１２は、ＡＢ１のヒト化バージョン（ヒト化ＡＢ１－１１）に基づいた。 次世代シーケンシング（ＮＧＳ）で同定された、本開示のＣＬＤＮ６抗体の例示的な体細胞超変異（ＳＨＭ）の概略図である。ＡＢ－３系抗体及び重鎖におけるＮＧＳで同定されたＳＨＭの例である。変異は、Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けで記載されている。 次世代シーケンシング（ＮＧＳ）で同定された、本開示のＣＬＤＮ６抗体の例示的な体細胞超変異（ＳＨＭ）の概略図である。ＡＢ－３系抗体及び軽鎖におけるＮＧＳで同定されたＳＨＭの例である。変異は、Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けで記載されている。 次世代シーケンシング（ＮＧＳ）で同定された、本開示のＣＬＤＮ６抗体の例示的な体細胞超変異（ＳＨＭ）の概略図である。ＡＢ－１系抗体及び重鎖におけるＮＧＳで同定されたＳＨＭの例である。変異は、Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けで記載されている。 次世代シーケンシング（ＮＧＳ）で同定された、本開示のＣＬＤＮ６抗体の例示的な体細胞超変異（ＳＨＭ）の概略図である。ＡＢ－１系抗体及び軽鎖におけるＮＧＳで同定されたＳＨＭの例である。変異は、Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けで記載されている。 ヒト化ＡＢ３－７（ＡＢＳ１～Ｓ６）またはヒト化ＡＢ１－１１（ＡＢＳ７～Ｓ１２）に基づいたＳ１～Ｓ１２の抗体のＦＡＣＳ結合アッセイの結果の表である。試験した濃度は列Ｄに示されている。 様々な細胞株における異なる濃度でのＳ１～Ｓ１２の抗体のＦＡＣＳ結合アッセイの結果の表である。 Ａは、３種のＮ－グリカン（オリゴマンノース、複合体及びハイブリッド）及びそのような糖で一般的に使用される符号の例である。Ｂは、フコース代謝のサルベージ経路及びデノボ経路の線図である。サルベージ経路では、遊離のＬ－フコースがＧＤＰ－フコースに変換されるが、デノボ経路では、ＧＭＤ及びＦＸにより触媒される３つの反応を介してＧＤＰ－フコースが合成される。ＧＤＰ－フコースはその後、ＧＤＰ－Ｆｕｃトランスフェラーゼによってサイトゾルからゴルジ体内腔へ輸送され、アクセプターオリゴ糖及びタンパク質に転移される。他の反応生成物であるＧＤＰは、内腔のヌクレオチドジホスファターゼによりグアノシン５－一リン酸（ＧＭＰ）と無機リン酸塩（Ｐｉ）に変換される。前者は、サイトゾルへ（ＧＤＰ－フコースの輸送と併せた対抗輸送系を介して）搬出され、後者は、ゴルジ体アニオンチャネルＧＯＬＡＣを介してゴルジ体内腔を離れると考えられている。例えば、Ｎｏｒｄｅｅｎ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２００１を参照のこと。 ヒトがん細胞の皮下注射に続いて本明細書に記載される処置を受けたマウスにおける腫瘍体積のグラフである。 ヒトがん細胞の皮下注射に続いて本明細書に記載される処置を受けたマウスにおける腫瘍体積のグラフである。 ヒトがん細胞の皮下注射に続いて本明細書に記載される処置を受けたマウスにおける腫瘍体積のグラフである。 ヒトがん細胞の皮下注射に続いて本明細書に記載される処置を受けたマウスにおける腫瘍体積のグラフである。 本明細書に記載されるように、二次抗体のみ（黒線）、または完全長抗体（赤、青、緑の線）と共にインキュベートしたＯＶＣＡ４２９細胞のシグナルのＦＡＣＳプロットである。赤、青、及び緑の線は、二次抗体の前及び／または後の洗浄ステップが異なるという点で異っている。 本明細書に記載されるように、二次抗体のみ（黒線）、またはＦａｂ（赤、青、緑の線）と共にインキュベートしたＯＶＣＡ４２９細胞のシグナルのＦＡＣＳプロットである。赤、青、及び緑の線は、二次抗体の前及び／または後の洗浄ステップが異なるという点で異っている。 本明細書に記載されるように、二次抗体のみ（黒線）、またはＦａｂ（赤、青、緑の線）と共にインキュベートしたＯＶＣＡ４２９細胞のシグナルのＦＡＣＳプロットである。赤、青、及び緑の線は、二次抗体の前及び／または後の洗浄ステップが異なるという点で異っている。 本明細書に記載されるように、二次抗体のみ（黒線）、またはＦａｂ（赤、青、緑の線）と共にインキュベートしたＯＶＣＡ４２９細胞のシグナルのＦＡＣＳプロットである。赤、青、及び緑の線は、二次抗体の前及び／または後の洗浄ステップが異なるという点で異っている。 本明細書に記載されるように、二次抗体のみ（黒線）、または完全長抗体及びＦａｂの混合（赤、青、緑及び紫の線）と共にインキュベートしたＯＶＣＡ４２９細胞のシグナルのＦＡＣＳプロットである。赤、青、緑及び紫の線は、二次抗体の前及び／または後の洗浄ステップが異なるという点で異っている。 ＦＡＣＳプロットの定量化したシグナルの一覧表である。 Ａは、二次抗体のみで免疫染色した細胞の画像である。Ｂは、Ｆａｂ（一次抗体として作用する）のみで免疫染色した細胞の画像である。Ｃは、Ｆａｂ及び二次抗体で免疫染色した細胞の画像である。 Ａは、ヒト化ＡＢ３－７及びヒト化ＡＢ１－１１のｓｃＦｖを発現させるために使用した発現ベクターの例である。Ｂは、スペーサーが間にある、ＬＣ可変領域及びＨＣ可変領域をコードする配列が示されている。 二次抗体のみ（黒色）またはＡＢ３－７ｓｃＦｖと二次抗体（赤）と共にインキュベートしたＡＲＫ２細胞からのシグナルのＦＡＣＳプロットである。 二次抗体のみ（黒色）またはＡＢ３－７ｓｃＦｖと二次抗体（赤）と共にインキュベートしたＭ２０２細胞からのシグナルのＦＡＣＳプロットである。 （Ａ）二次抗体のみ（青の棒）、（Ｂ）ＡＢ３－７ ｓｃＦＶとそれに続く二次抗体（オレンジの棒）、または（Ｃ）ＡＢ１－１１ ｓｃＦＶとそれに続く二次抗体（灰色の棒）と共にインキュベートしたＣＬＤＮ６ ＧＦＰを過剰発現する２９３Ｔ細胞、Ｍ２０２細胞またはＡＲＫ２細胞からのシグナルの棒グラフである。 （Ａ）二次抗体のみ（青の棒）、（Ｂ）ＡＢ３－７ ｓｃＦＶとそれに続く二次抗体（オレンジの棒）、または（Ｃ）ＡＢ１－１１ ｓｃＦＶとそれに続く二次抗体（灰色の棒）と共にインキュベートしたＣＬＤＮ６ ＧＦＰを過剰発現する２９３Ｔ細胞、Ｍ２０２細胞またはＡＲＫ２細胞からのＧＦＰシグナルの棒グラフである。 二次抗体のみ（黒線）またはＡＢ３－７ ｓｃＦＶとそれに続く二次抗体（赤線）またはＡＢ１－１１ ｓｃＦＶとそれに続く二次抗体（青線）と共にインキュベートした、ＣＬＤＮ６ ＧＦＰを過剰発現する２９３Ｔ細胞により生成されたシグナルのＦＡＣＳプロットである。 二次抗体のみ（黒線）またはＡＢ３－７ ｓｃＦＶとそれに続く二次抗体（赤線）またはＡＢ１－１１ ｓｃＦＶとそれに続く二次抗体（青線）と共にインキュベートした、ＣＬＤＮ６ ＧＦＰを過剰発現するＭ２０２細胞により生成されたシグナルのＦＡＣＳプロットである。 二次抗体のみ（黒線）またはＡＢ３－７ ｓｃＦＶとそれに続く二次抗体（赤線）またはＡＢ１－１１ ｓｃＦＶとそれに続く二次抗体（青線）と共にインキュベートした、ＣＬＤＮ６ ＧＦＰを過剰発現するＡＲＫ２細胞により生成されたシグナルのＦＡＣＳプロットである。 図４０Ａの群の各々の細胞数を示すＦＡＣＳプロットである。 ＡＢ３－７（ＡＢ２３とも呼ぶ）を含むＣＬＤＮ６抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の生化学的特性解析を示す。Ａは、ＣＬＤＮ６ ＡＤＣの生化学的性質をまとめた表である。 ＡＢ３－７（ＡＢ２３とも呼ぶ）を含むＣＬＤＮ６抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の生化学的特性解析を示す。Ｂ－Ｈは、異なる数の薬物と結合させた抗体の相対存在量を示すＨＩＣ－ＨＰＬＣのクロマトグラムを表す。 Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥにより分析した、ＡＢ３－７を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣの分子完全性を示す。 天然ＣＬＤＮ６陽性細胞またはＣＬＤＮ６を人工的に過剰発現させた細胞に対する、ＡＢ３－７を含むＣＬＤＮ６抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の結合活性（フローサイトメトリー）を示す。 ＡＢ３－７を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣのＣＬＤＮ６発現細胞に対する結合親和性を示す。ＫＤ（解離定数）測定は、ＨＥＫ２９３Ｔ ＣＬＤＮ６－ｍＧＦＰ Ａ１１細胞を使用してＫｉｎＥｘＡ ４０００（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）により行われた。 ＡＢ３－７を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビトロ特性解析を示す。パネルは、ＣＬＤＮ６ ＡＤＣの細胞内部移行を示す。Ｈ２３－７はＡＢ３－７を指す。 ＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビトロでの抗がん活性を示す。ＡＢ－３－７を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣ、すなわち、ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（従来型）のがん細胞に対する二次元（２Ｄ）増殖抑制作用を示す。 ＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビトロでの抗がん活性を示す。ＡＢ－３－７を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣ、すなわち、ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（Ｄ４技術）のがん細胞に対する二次元（２Ｄ）増殖抑制作用を示す。 ＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビトロでの抗がん活性を示す。ＡＢ－３－７を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣ、すなわち、ＭＣ－ＧＧＦＧ－ＭＭＡＥ（Ｄ４技術）のがん細胞に対する二次元（２Ｄ）増殖抑制作用を示す。 ＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビトロでの抗がん活性を示す。ＡＢ－３－７を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣ、すなわち、ＣＬ２Ａ－ＳＮ３８（従来型）のがん細胞に対する二次元（２Ｄ）増殖抑制作用を示す。 ＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビトロでの抗がん活性を示す。ＡＢ－３－７を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣ、すなわち、ＣＬ２Ａ－ＳＮ３８（Ｄ４技術）のがん細胞に対する二次元（２Ｄ）増殖抑制作用を示す。 ＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビトロでの抗がん活性を示す。ＡＢ－３－７を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣ、すなわち、ＭＣ－ＧＧＦＧ－ＤＸＤのがん細胞に対する二次元（２Ｄ）増殖抑制作用を示す。 ＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビトロでの抗がん活性を示す。ＡＢ－３－７を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣ、すなわち、ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＤＸＤのがん細胞に対する二次元（２Ｄ）増殖抑制作用を示す。 ＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビトロでの抗がん活性を示す。がん細胞株、すなわち、ＡＲＫ２に対する、ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－１１（ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥと結合させたＡＢ１－１１）の２Ｄ増殖抑制作用を示す。 ＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビトロでの抗がん活性を示す。がん細胞株、すなわち、ＯＶＣＡ４２９に対する、ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－１１（ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥと結合させたＡＢ１－１１）の２Ｄ増殖抑制作用を示す。 ＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビトロでの抗がん活性を示す。がん細胞株、すなわち、Ｈ８４１に対する、ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－１１（ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥと結合させたＡＢ１－１１）の２Ｄ増殖抑制作用を示す。 ＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビトロでの抗がん活性を示す。がん細胞株、すなわち、ＯＶ９０に対する、ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－１１（ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥと結合させたＡＢ１－１１）の２Ｄ増殖抑制作用を示す。 ＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビトロでの抗がん活性を示す。がん細胞株、すなわち、Ｈ１６９３に対する、ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－１１（ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥと結合させたＡＢ１－１１）の２Ｄ増殖抑制作用を示す。 ＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビトロでの抗がん活性を示す。がん細胞株、すなわち、Ｍ２０２に対する、ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－１１（ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥと結合させたＡＢ１－１１）の２Ｄ増殖抑制作用を示す。 ＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビトロでの抗がん活性を示す。がん細胞株、すなわち、ＭＣＦ７に対する、ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－１１（ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥと結合させたＡＢ１－１１）の２Ｄ増殖抑制作用を示す。 ＣＬＤＮ６陽性卵巣癌細胞株（ＯＶ９０）異種移植片に対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－１１のインビボ抗がん効果を示す。 Ａは、ＣＬＤＮ６陰性メラノーマがん細胞株（Ｍ２０２）異種移植片に対し、ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－１１は抗がん活性がないことを示す。Ｂは、ＣＬＤＮ６陰性メラノーマがん細胞株（Ｍ２０２）異種移植片に対し、ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－１１は抗がん活性がないことを示す。 Ａは、がん細胞株異種移植片に対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３（ＡＢ３－７－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）のインビボ抗がん効果を示す。ＣＬＤＮ６陽性膀胱細胞株（ＵＭＵＣ４）異種移植片に対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３の抗がん活性を示す。Ｂは、がん細胞株異種移植片に対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３（ＡＢ３－７－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）のインビボ抗がん効果を示す。対照抗体または５ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ－２３による処置後の示されている時点に採取した異種移植片組織のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す。 卵巣癌患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）に対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３のインビボ抗がん効果を示す。Ａは、ウエスタンブロット法によりＣＬＤＮ６発現についてスクリーニングを行った卵巣ＰＤＸ試料のパネルを示す。Ｂは、免疫不全マウス（ＮＳＧ）の腹腔内への、ルシフェラーゼ酵素をトランスフェクトしたＰＤＸ卵巣癌細胞の注射を示す概略図である。 卵巣癌患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）に対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３のインビボ抗がん効果を示す。Ｃ－Ｅは、本明細書に記載されるＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３により処置されたマウスの生存率を示す。 Ａは、ＣＬＤＮ６陽性卵巣癌細胞株（ＯＶ９０）異種移植片に対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３の用量依存性の抗がん効果を示す。示されている用量及び時間での腫瘍サイズの縮小を示す。Ｂは、ＣＬＤＮ６陽性卵巣癌細胞株（ＯＶ９０）異種移植片に対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３の用量依存性の抗がん効果を示す。示されている用量及び時間での腫瘍サイズの縮小を示す。Ｃは、ＣＬＤＮ６陽性卵巣癌細胞株（ＯＶ９０）異種移植片に対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３の用量依存性の抗がん効果を示す。ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３を投与されたマウスの体重の変化（％）を示す。 Ａは、ＣＬＤＮ６陰性メラノーマがん細胞株（Ｍ２０２）異種移植片においてＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３のオフターゲット活性はないことを示す。腫瘍体積の変化を示す。Ｂは、ＣＬＤＮ６陰性メラノーマがん細胞株（Ｍ２０２）異種移植片においてＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３のオフターゲット活性はないことを示す。腫瘍体積の変化を示す。腫瘍体積は２１日目に測定された。Ｃは、ＣＬＤＮ６陰性メラノーマがん細胞株（Ｍ２０２）異種移植片においてＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３のオフターゲット活性はないことを示す。ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３を投与されたマウスの体重の変化（％）を示す。 Ａは、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）の精製及びバリデーションを示す。ＢｉＴＥコンストラクトの概略図を示す。Ｂは、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）の精製及びバリデーションを示す。ＢｉＴＥ－２３（ＡＢ３－７のＶＬ及びＶＨと、ＣＤ３ＥのＶＨ及びＶＬとを融合）の精製ＢｉＴＥタンパク質を示す。Ｃは、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）の精製及びバリデーションを示す。ＢｉＴＥ－１１（ＡＢ１－１１のＶＬ及びＶＨと、ＣＤ３ＥのＶＨ及びＶＬとを融合）の精製ＢｉＴＥタンパク質を示す。 Ａは、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質の、天然ＣＬＤＮ６陽性細胞（ＡＲＫ２）及びＣＬＤＮ６を過剰発現するよう操作された細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ ＣＬＤＮ６－ｍＧＦＰ ＨＩＳ２０細胞）への効率的結合を示す。ＢｉＴＥ－１１（１１－１ＢｉＴＥ及び１１－２ＢｉＴＥ；ＢｉＴＥ－１１の独立生産ロット）またはＢｉｔｅ－２３（２３ＢｉＴＥ）が結合した細胞のフローサイトメトリーを示す。Ｂは、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質の、天然ＣＬＤＮ６陽性細胞（ＡＲＫ２）及びＣＬＤＮ６を過剰発現するよう操作された細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ ＣＬＤＮ６－ｍＧＦＰ ＨＩＳ２０細胞）への効率的結合を示す。ＢｉＴＥ－１１（１１－１ＢｉＴＥ及び１１－２ＢｉＴＥ；ＢｉＴＥ－１１の独立生産ロット）またはＢｉｔｅ－２３（２３ＢｉＴＥ）が結合した細胞のフローサイトメトリーを示す。Ｃは、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質の、天然ＣＬＤＮ６陽性細胞（ＡＲＫ２）及びＣＬＤＮ６を過剰発現するよう操作された細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ ＣＬＤＮ６－ｍＧＦＰ ＨＩＳ２０細胞）への効率的結合を示す。ＢｉＴＥ－１１（１１－１ＢｉＴＥ及び１１－２ＢｉＴＥ；ＢｉＴＥ－１１の独立生産ロット）またはＢｉｔｅ－２３（２３ＢｉＴＥ）が結合した細胞のフローサイトメトリーを示す。Ｄは、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質の、天然ＣＬＤＮ６陽性細胞（ＡＲＫ２）及びＣＬＤＮ６を過剰発現するよう操作された細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ ＣＬＤＮ６－ｍＧＦＰ ＨＩＳ２０細胞）への効率的結合を示す。ＢｉＴＥ－１１が染色されたＡＲＫ２細胞を示す。Ｅは、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質の、天然ＣＬＤＮ６陽性細胞（ＡＲＫ２）及びＣＬＤＮ６を過剰発現するよう操作された細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ ＣＬＤＮ６－ｍＧＦＰ ＨＩＳ２０細胞）への効率的結合を示す。ＢｉＴＥ－２３が染色されたＡＲＫ２細胞を示す。 Ａは、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質がＴ細胞活性化を誘導することを示す。ＢｉＴＥ－１１。Ｂは、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質がＴ細胞活性化を誘導することを示す。ＢｉＴＥ－２３。 ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質が、ＣＬＤＮ６陽性細胞とのインキュベーション時にＴ細胞クラスター形成を誘導することを示す。ＢｉＴＥ－１１（中央パネル；ｐ１１ ＢｉＴＥ）。ＢｉＴＥ－２３（右パネル（ｐ２３ ＢｉＴＥ）。 ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質が、がん細胞に対する標的特異的かつ用量依存性の細胞毒性を誘導することを示す。ＢｉＴＥ－１１（上のパネル；ｐ１１－１１）。ＢｉＴＥ－２３（下のパネル；ｐ２３－７）。ブリナツモマブ（対照）。 ＣＤ１６Ａ結合性のＶＨドメイン及びＶＬドメインと融合させた、ＣＬＤＮ６結合性のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む、例示的なＣＬＤＮ６－ＣＤ１６Ａ二重特異性タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）の概略図を示す。 Ａは、ＣＬＤＮ６陽性細胞（ＡＲＫ２）には結合するがＣＬＤＮ６陰性細胞（ＨＵＰＴ４）には結合しない、ＣＬＤＮ６－ＣＤ１６Ａ ＴａｎｄＡｂの効率的結合を示す。ＴａｎｄＡｂ－１１（Ｔａｎｄａｂ－１１－ｈｉｓまたはＴａｎｄａｂ １１－ＣＤ１６Ａ－ｈｉｓとして表示）。ＴａｎｄＡｂ－２３（Ｔａｎｄａｂ－２３－ｈｉｓまたはＴａｎｄａｂ ２３－ＣＤ１６Ａ－ｈｉｓとして表示）。Ｂは、ＣＬＤＮ６陽性細胞（ＡＲＫ２）には結合するがＣＬＤＮ６陰性細胞（ＨＵＰＴ４）には結合しない、ＣＬＤＮ６－ＣＤ１６Ａ ＴａｎｄＡｂの効率的結合を示す。ＴａｎｄＡｂ－１１（Ｔａｎｄａｂ－１１－ｈｉｓまたはＴａｎｄａｂ １１－ＣＤ１６Ａ－ｈｉｓとして表示）。ＴａｎｄＡｂ－２３（Ｔａｎｄａｂ－２３－ｈｉｓまたはＴａｎｄａｂ ２３－ＣＤ１６Ａ－ｈｉｓとして表示）。Ｃは、ＣＬＤＮ６陽性細胞（ＡＲＫ２）には結合するがＣＬＤＮ６陰性細胞（ＨＵＰＴ４）には結合しない、ＣＬＤＮ６－ＣＤ１６Ａ ＴａｎｄＡｂの効率的結合を示す。ＴａｎｄＡｂ－１１（Ｔａｎｄａｂ－１１－ｈｉｓまたはＴａｎｄａｂ １１－ＣＤ１６Ａ－ｈｉｓとして表示）。Ｄは、ＣＬＤＮ６陽性細胞（ＡＲＫ２）には結合するがＣＬＤＮ６陰性細胞（ＨＵＰＴ４）には結合しない、ＣＬＤＮ６－ＣＤ１６Ａ ＴａｎｄＡｂの効率的結合を示す。ＴａｎｄＡｂ－２３（Ｔａｎｄａｂ－２３－ｈｉｓまたはＴａｎｄａｂ ２３－ＣＤ１６Ａ－ｈｉｓとして表示）。 ＣＬＤＮ６－ＣＤ３ＢｉＴＥのインビボ抗がん活性を示す。試料には、ビーリンサイト（対照）、ＡＦＭ１３（非標的指向性ＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂ対照）；ＢｉＴＥ－２３（ＢｉＴＥ ＃２３として表示）；ＢｉＴＥ－１１（ＢｉＴＥ ＃１１として表示）；ＡＢ３－７（ｍＡｂ ＃２３として表示）；ＴａｎｄＡｂ－１１（ＣＤ１６－ＴａｎｄＡｂ ＃１１として表示）；及びＴａｎｄＡｂ－２３（ＣＤ１６－ＴａｎｄＡｂ＃２３として表示）が含まれる。 ＣＬＤＮ６－ＣＤ３ＢｉＴＥのインビボ抗がん活性を示す。試料には、ＩｇＧ対照、ＢｉＴＥ－２３（ＢｉＴＥ ＃２３として表示）、及びＴａｎｄＡｂ－２３（ＣＤ１６－ＴａｎｄＡｂｓ ＃２３として表示）が含まれる。 ＣＬＤＮ６－ＣＤ３ＢｉＴＥのアミノ酸配列を示す。ＢｉＴＥ－１１のアミノ酸配列及び核酸配列を示す。 ＣＬＤＮ６－ＣＤ３ＢｉＴＥの核酸配列を示す。ＢｉＴＥ－１１のアミノ酸配列及び核酸配列を示す。 ＣＬＤＮ６－ＣＤ３ＢｉＴＥのアミノ酸配列を示す。ＢｉＴＥ－２３のアミノ酸配列及び核酸配列を示す。 ＣＬＤＮ６－ＣＤ３ＢｉＴＥの核酸配列を示す。ＢｉＴＥ－２３のアミノ酸配列及び核酸配列を示す。 ＣＬＤＮ６－ＣＤ１６Ａ ＴａｎｄＡｂのアミノ酸配列を示す。ＴａｎｄＡｂ－１１のアミノ酸配列を示す。 ＣＬＤＮ６－ＣＤ１６Ａ ＴａｎｄＡｂの核酸配列を示す。ＴａｎｄＡｂ－１１の核酸配列を示す。 ＣＬＤＮ６－ＣＤ１６Ａ ＴａｎｄＡｂのアミノ酸配列を示す。ＴａｎｄＡｂ－２３のアミノ酸配列を示す。 ＣＬＤＮ６－ＣＤ１６Ａ ＴａｎｄＡｂの核酸配列を示す。ＴａｎｄＡｂ－２３の核酸配列を示す。

クローディンファミリー

タイトジャンクションは、閉鎖結合（ｏｃｃｌｕｄｉｎｇ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）または閉鎖帯（ｚｏｎｕｌａｅ ｏｃｃｌｕｄｅｎｔｅｓ）としても知られ、傍細胞透過性を制御し、上皮細胞シート及び内皮細胞シートでの細胞極性を維持する隣接する２つの細胞の間に位置する脊椎動物の構造である。クローディン（ＣＬＤＮ）ファミリーの遺伝子は、タイトジャンクションの重要構成成分である膜タンパク質をコードする。

ＣＬＤＮタンパク質は、４つの膜貫通（ＴＭ）ヘリックス（ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、及びＴＭ４）及び２つの細胞外ループ（ＥＬ１及びＥＬ２）を含む。隣接する細胞のＣＬＤＮタンパク質の細胞外ループは、互いに相互作用して細胞シートを密着させ、内腔と側底間隙の間の傍細胞輸送を制御する。

ＣＬＤＮタンパク質は、ヒトの様々な疾患及び病理に関与している。例えば、ＣＬＤＮ１遺伝子の変異は、胆管の閉塞と共に皮膚の進行性鱗屑を引き起こすことが示されている。ＣＬＤＮ１６遺伝子の変異体は、マグネシウム消耗障害を引き起こす。ＣＬＤＮ１９の変異は、黄斑コロボマータ（ｍａｃｕｌａｒ ｃｏｌｏｂｏｍａｔａ）及び近視等の眼疾患をもたらし、ＣＬＤＮ１４の変異は非症候性劣性難聴をもたらし得る。ＣＬＤＮ３及びＣＬＤＮ４は、腸管内のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓエンテロトキシンの表面受容体であることが知られており、ＣＬＤＮ１、ＣＬＤＮ６、及びＣＬＤＮ９は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の侵入に帯する共受容体である。いくつかのＣＬＤＮタンパク質は、がんで異常に発現されることが示されている。例えば、ＣＬＤＮ１は、乳癌及び結腸癌で下方制御されているが、ＣＬＤＮ３及びＣＬＤＮ４は多発性癌で高度に上方制御されている。

クローディン６（ＣＬＤＮ６）はＣＬＤＮファミリーのメンバーである。ヒトＣＬＤＮ６タンパク質をコードする遺伝子は、ヒトの１６番染色体短腕上１６ｐ１３．３に位置し、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、及びカエルで保存されている。ＣＬＤＮ６は一般に、ヒトではアミノ酸が２２０個の前駆体タンパク質として発現され、そのうち最初の２１番目までのアミノ酸はシグナルペプチドを構成する。ＣＬＤＮ６前駆体タンパク質のアミノ酸配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトにてＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＰ＿０６７０１８．２として公的に利用可能であり、本明細書では、配列番号１として提供されている。配列番号１の１４３位のアミノ酸はＩｌｅである。場合によっては、ＣＬＤＮ６をコードするＤＮＡ配列での一塩基多型（ＳＮＰ）のため、１４３位のアミノ酸はＶａｌである。１４３位にＶａｌを有するヒトＣＬＤＮ６のアミノ酸配列は、本明細書では、配列番号１７８として提供されている。

抗原結合タンパク質

本明細書では、クローディン６（ＣＬＤＮ６）に結合する抗原結合タンパク質が提供される。本開示の抗原結合タンパク質は、当該技術分野で公知の抗原結合タンパク質の数ある形態のうちのいずれか１つの形態を取り得る。様々な実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、抗体、もしくは抗原結合性抗体断片、または抗体タンパク質産物の形態を取る。

本開示の様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本明細書で使用される場合、用語「抗体」とは、通常型免疫グロブリンフォーマットを有するタンパク質を指し、重鎖及び軽鎖を含み、かつ可変領域及び定常領域を含む。例えば、抗体は、同一の２対のポリペプチド鎖が「Ｙ字形」構造をし、各対が１本の「軽」鎖（典型的には分子量が約２５ｋＤａである）と１本の「重」鎖（典型的にが分子量が約５０～７０ｋＤａである）を有するＩｇＧであり得る。抗体は、可変領域及び定常領域を有する。ＩｇＧフォーマットでは、可変領域は一般に、アミノ酸が約１００～１１０個以上であり、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、主に抗原認識に関与し、異なる抗原に結合する他の抗体と実質的に異なる。定常領域は、抗体が免疫系の細胞及び分子を動員するのを可能にする。可変領域は、軽鎖及び重鎖それぞれのＮ末端領域でできており、定常領域は、重鎖及び軽鎖のそれぞれのＣ末端部分でできている。（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，４^ｔｈ ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（１９９９））。

抗体のＣＤＲの一般構造及び特性は当該技術分野で報告されている。簡単に言えば、抗体足場では、ＣＤＲは、重鎖及び軽鎖の可変領域のフレームワーク内に埋め込まれて、抗原の結合と認識に大きく関与する領域を構成する。可変領域は典型的には、重鎖または軽鎖の少なくとも３つのＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．、またＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３も参照のこと）を、フレームワーク領域内（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１による指定フレームワーク領域１～４のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４；上掲Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７も参照のこと）に含む。

抗体は、当該技術分野で公知のいずれの定常領域でも含むことができる。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖とラムダ軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンに分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧにはいくつかのサブクラスがあり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が挙げられるが、これらに限定されない。ＩｇＭにはサブクラスがあり、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の実施形態には、抗体のそのようなクラスまたはアイソタイプすべてが含まれる。軽鎖定常領域は、例えば、カッパ型またはラムダ型の軽鎖定常領域、例えば、ヒトのカッパ型またはラムダ型の軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、またはミュー型の重鎖定常領域、例えば、ヒトのアルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、またはミュー型の重鎖定常領域であり得る。したがって、様々な実施形態では、抗体は、アイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭの抗体であり、これにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の任意の１つが含まれる。様々な態様では、抗体は、半減期／安定性を改善するため、または抗体を発現／製造性についてより好適なものにするために、天然に存在するアミノ酸と比べて１つ以上のアミノ酸修飾を含む定常領域を含む。様々な場合には、抗体は、天然に存在する定常領域には存在するＣ末端Ｌｙｓ残基が除去またはクリッピングされている定常領域を含む。

抗体はモノクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、哺乳類、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒト等により産生される、天然に存在する抗体と実質的に同様の配列を含む。これに関し、抗体は、哺乳類の抗体、例えば、マウス抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ウマ抗体、ニワトリ抗体、ハムスター抗体、ヒト抗体等と見なされ得る。特定の態様では、抗原結合タンパク質は、ヒト抗体等の抗体である。特定の態様では、抗原結合タンパク質は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。用語「キメラ抗体」とは、２つ以上の異なる抗体からのドメインを含有する抗体を指す。キメラ抗体は、例えば、ある種からの定常ドメインと第２の種からの可変ドメインを含有することができるか、またはより一般的には、少なくとも２つの種からのアミノ酸配列の区間を含有することができる。キメラ抗体はまた、同じ種内の２つ以上の異なる抗体のドメインを含有することができる。抗体との関連で使用される用語「ヒト化」とは、非ヒト材料からのＣＤＲ領域を少なくとも有する抗体であって、元の供給源抗体よりも、真のヒト抗体に似ている構造及び免疫学的機能を有するよう操作されているものを指す。例えば、ヒト化させることには、マウス抗体等の非ヒト抗体からのＣＤＲをヒト抗体に移植することを伴い得る。ヒト化させることにはまた、よりヒト配列に似た非ヒト配列を作るためにアミノ酸置換を選択することを伴い得る。ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の定常領域についての配列情報等の情報は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース及び抗体工学と生産の分野の当業者に周知の他のデータベースから公的に入手可能である。例えば、ＩｇＧ２定常領域は、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースからＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０１８５９として入手可能であり、参照により本明細書に組み込まれる。

抗体は、酵素、例えば、パパイン及びペプシン等により断片に切断され得る。パパインは、抗体を切断して２つのＦａｂ断片と単一Ｆｃ断片を生成する。ペプシンは、抗体を切断してＦ（ａｂ’）_２断片とｐＦｃ’断片を生成する。本開示の様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、抗体の抗原結合断片（抗原結合性抗体断片、抗原結合断片、抗原結合部分としても知られる）である。様々な場合には、抗原結合性抗体断片は、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）_２断片である。

抗体の構造は、分子量の範囲が少なくとも約１２～１５０ｋＤａに及び、結合価（ｎ）の範囲が単量体（ｎ＝１）をはじめ、二量体（ｎ＝２）、三量体（ｎ＝３）、四量体（ｎ＝４）、また可能性としてさらに高いものに至るまで、広がりつつある範囲の代替的抗体フォーマットを作製するために利用されてきており、そのような代替的抗体フォーマットは本明細書では「抗体タンパク質産物」と呼ばれる。抗体タンパク質産物には、完全な抗体構造に基づいたもの、ならびに完全な抗原結合能を保持する抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＶＨＨ／ＶＨ（以下で考察）を模倣するものが含まれる。抗原結合断片で、その完全な抗原結合部位を保持する最小の抗原結合断片はＦｖ断片であり、可変（Ｖ）領域のみからなる。分子の安定化のために可溶性で可動性のアミノ酸ペプチドリンカーを使用してＶ領域をｓｃＦｖ（単鎖可変領域）断片に接続するか、または定常（Ｃ）ドメインをＶ領域に付加してＦａｂ断片［断片、抗原結合］を生成する。ｓｃＦｖ及びＦａｂのいずれの断片も、宿主細胞、例えば、原核生物の宿主細胞中で容易に産生させることができる。他の抗体タンパク質産物としては、ジスルフィド結合で安定化されたｓｃＦｖ（ｄｓ－ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、ならびにオリゴマー形成ドメインに連結されたｓｃＦｖからなる各種フォーマットを含むダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディ、またはミニボディ（ｍｉｎｉＡｂ）のような、二量体及び多量体の抗体フォーマットが含まれる。最小断片は、ラクダ類重鎖ＡｂのＶＨＨ／ＶＨ、及び単一ドメインＡｂ（ｓｄＡｂ）である。新規抗体フォーマットを作るために最も頻用される構成要素は一本鎖可変（Ｖ）ドメイン抗体断片（ｓｃＦｖ）であり、約１５アミノ酸残基のペプチドリンカーで連結された、重鎖及び軽鎖からのＶドメイン（ＶＨドメイン及びＶＬドメイン）を含む。ペプチボディまたはペプチド－Ｆｃ融合体は、さらに別の抗体タンパク質産物である。ペプチボディの構造は、Ｆｃドメインに移植された生物活性ペプチドからなる。ペプチボディは、当該技術分野で十分に記載されている。例えば、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ４（５）：５８６－５９１（２０１２）を参照のこと。

他の抗体タンパク質産物には、一本鎖抗体（ＳＣＡ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二重特異性または三重特異性抗体等が含まれる。二重特異性抗体は、５つの主要クラス、すなわち、ＢｓＩｇＧ、付加のあるＩｇＧ、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）断片、二重特異性融合タンパク質、及びＢｓＡｂ複合体に分けられる。例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２）Ｐａｒｔ Ａ：９７－１０６（２０１５）を参照のこと。

様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、これらの抗体タンパク質産物のうちのいずれか１つを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ ＶＨＨ／ＶＨ、Ｆｖ断片、ｄｓ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、二量体抗体、多量体抗体（例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ）、ｍｉｎｉＡｂ、ラクダ類重鎖抗体のペプチボディＶＨＨ／ＶＨ、ｓｄＡｂ、ダイアボディ；トリアボディ；テトラボディ；二重特異性または三重特異性抗体、ＢｓＩｇＧ、付加のあるＩｇＧ、ＢｓＡｂ断片、二重特異性融合タンパク質、及びＢｓＡｂ複合体のうちのいずれか１つを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。

様々な場合には、本開示の抗原結合タンパク質は、単量体形態、または重合体、オリゴマー、もしくは多量体の形態にある抗体タンパク質産物である。抗体が、２つ以上の別個の抗原結合領域の断片を含む特定の実施形態では、抗体は、抗体が認識して結合する別個のエピトープの数に応じて、二重特異性、三重特異性、もしくは多重特異性、または二価、三価、または多価とされる。

様々な実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはその変異抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合性抗体断片、一本鎖抗体、単量体抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ断片、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、及びＩｇＧ４抗体からなる群から選択される。

様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、治療剤に連結されている。以下に記載のように、治療剤は、当該技術分野で公知のいずれであってもよく、これには化学療法薬、サイトカイン及び成長因子、細胞傷害性薬物等が含まれるが、これらに限定されない。下記「複合体」を参照のこと。

二重特異性フォーマット

例示的態様では、抗原結合タンパク質は二重特異性であり、そのため、２つの異なる別個の抗原と結合することができる。例示的な実施形態では、抗原結合タンパク質は二重特異性であり、ＣＬＤＮ６及び第２の抗原に結合する。

例示的場合には、第２の抗原は、Ｔ細胞により発現される細胞表面タンパク質である。例示的態様では、細胞表面タンパク質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成成分、例えば、ＣＤ３である。例示的場合には、第２の抗原は、Ｔ細胞活性化を助ける共刺激分子、例えば、ＣＤ４０または４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）である。例示的態様では、第２の抗原は、Ｆｃ受容体である。様々な態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃガンマ受容体、Ｆｃ－アルファ受容体、Ｆｃ－イプシロン受容体である。例示的態様では、Ｆｃ受容体は、ＣＤ６４（Ｆｃ－ガンマＲＩ）、ＣＤ３２（Ｆｃ－ガンマＲＩＩＡ）、ＣＤ１６Ａ（Ｆｃ－ガンマＲＩＩＩＡ）、ＣＤ１６ｂ（Ｆｃ－ガンマＲＩＩＩｂ）、ＦｃεＲＩ、ＣＤ２３（Ｆｃ－イプシロンＲＩＩ）、ＣＤ８９（Ｆｃ－イプシロンＲＩ）、Ｆｃα／μＲ、またはＦｃＲｎである。例示的態様では、Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６Ａである。例示的場合には、第２の抗原は、免疫チェックポイント分子、例えば、免疫チェックポイント経路に関与するタンパク質である。免疫チェックポイント経路及び経路内で機能する分子またはタンパク質は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １２（４）：２５２－２６４（２０１２）を参照のこと。例示的場合には、免疫チェックポイント分子は、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、またはＳＩＧＬＥＣ７である。任意選択で、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＣＴＬＡ４である。

二重特異性抗原結合タンパク質の５０超のフォーマットが当該技術分野で知られており、そのうちのいくつかは、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２０（７）：８３８～８４７（２０１５）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ６：１２（２０１７）、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．；６７（２ Ｐｔ Ａ）：９５－１０６（２０１５）に記載されている。例示的態様では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、化学工学、遺伝子工学、またはクアドローマ技術により作製される。

例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、抗体の定常ドメインの一部または全部を用いて構築される。例示的態様では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質はＦｃポリペプチドを含み、Ｆｃによるエフェクター機能を保持している。様々な場合には、二重特異性抗原結合タンパク質は、例えば、２つのモノクローナル抗体（ｍａｂ）の化学的架橋によるか、またはｋｎｏｂ ａｎｄ ｈｏｌｄ技術により形成される、二重特異性モノクローナル抗体である。例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、「ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ」技術により作製され、この場合、２つのＣＨ３ドメインに異なる変異を導入して非対称の抗体を生じさせることにより、Ｈ鎖ヘテロ二量体化が強制される。一方のＨＣに「ｋｎｏｂ」変異を作り、もう一方のＨＣに「ｈｏｌｅ」変異を作ってヘテロ二量体化を促進する。例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、所望の特異性を有するモノクローナル抗体を生成する２つの異なるハイブリドーマ細胞の体細胞融合に基づくクアドローマ技術により作製される二重特異性抗体である。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７、上記参照。例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、ｃｒｏｓｓＭａｂ、ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ ＩｇＧ、ＤＶＤ－Ｉｇ、ｔｗｏ ｉｎ ｏｎｅ ＩｇＧ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ_２－Ｆｃ（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＢｒｉｎｋｍａｎｎ，２０１５、上記参照。様々な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質はＩｇ－ｓｃＦｖ融合体であり、完全長ＩｇＧに新たな抗原結合部分を付加して、２つの別個の抗原に対する４価の融合タンパク質、例えば、ＩｇＧＣ末端ｓｃＦｖ融合体及びＩｇＧＮ末端ｓｃＦｖ融合体を生じさせる。例示的場合には、二重特異性抗原結合タンパク質は二重可変ドメインＩｇＧ（ＤＶＤ－ＩｇＧ）であり、ある抗原に特異的なＩｇＧのＬＣ及びＨＣの可変領域と、第２の抗原に対して特異的なＩｇＧのＬＣ及びＨＣの可変領域Ｎ末端とがリンカーを介して融合し、ＤＶＤ－ＩｇＧを形成している。例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、二重特異性ダイアボディでのＩｇＧのＦａｂ断片の置き換えを伴うダイアボディ－Ｆｃ融合体である。

代替的例では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｆｃポリペプチドを含まない。例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、親モノクローナル抗体各々の可変ドメインを含み、リンカーはクローニングされ、一本鎖二重特異性抗体を形成するよう連結される。例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディフォーマット、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、二重親和性リターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、ｄｏｃｋ－ａｎｄ－ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）、及びナノボディ（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１５；８：１３０）である。様々な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、二重特異性Ｆ（ｍａｂ^１）_２、ｓｃＦｖ、二重特異性ダイアボディ（ＢｓＤｂ）、一本鎖二重特異性ダイアボディ（ｓｃＢｓＤｂ）、一本鎖二重特異性タンデム可変ドメイン（ｓｃＢｓＴａＦｖ）、ｄｏｃｋ－ａｎｄ－ｌｏｃｋ３価Ｆａｂ（ＤＮＬ－（Ｆａｂ）３）、単一－ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、または二重特異性単一－ドメイン抗体（ＢｓｓｄＡｂ）である。例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、グリシン－セリン反復モチーフ等の追加のペプチドリンカーにより連結された２つのｓｃＦｖ断片を含むタンデムｓｃＦｖである。任意選択で、タンデムｓｃＦｖは、ＶＬ_Ａ－リンカー１－ＶＨ_Ａ－リンカー２－ＶＨ_Ｂ－リンカー３－ＶＬ_Ｂ、という構造を含む（ＶＬ及びＶＨは一本鎖抗体断片に由来し、Ａ及びＢは、親モノクローナル抗体Ａ及び親モノクローナル抗体Ｂを表す）。例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質はＴａｎｄＡｂであり、接続されて一本のポリペプチド鎖になっている２対のＶＬドメインとＶＨドメインを含有する（Ｒｅｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．２０１５；７（３）：５８４－６０４）。２つのポリペプチド産物は、ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ式に二量体化し、発現時、分子量の大きい（約１０５ｋＤａ）ホモ二量体を形成する。例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、ＰＮＡＳ １０８（２７）：１１１８７－９２（２０１１）に記載のｃｒｏｓｓＭａｂ技術を使用して作製されるものである。ＣｒｏｓｓＭａｂは、いかなる化学リンカーも接続体も有しておらず、二重特異性ヘテロ二量体ＩｇＧ抗体において正しい軽鎖会合を強いる方法によって作製される。例示的態様では、ＣｒｏｓｓＭａｂは、２価（１＋１）、３価（２＋１）及び４価（２＋２）の二重特異性ｃｒｏｓｓＭａｂであるか、または非Ｆｃタンデム抗原結合断片（Ｆａｂ）を用いるｃｒｏｓｓＭａｂである。例示的場合には、ｃｒｏｓｓＭａｂは、ｃｒｏｓｓＭａｂ^Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＭａｂ^{ＶＨ－ＶＬ}、またはｃｒｏｓｓＭａｂ^{ＣＨ１－ＣＬ}である。

例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、単一の単量体可変抗体ドメインを含む、単一－ドメイン抗体またはナノボディを含む。任意選択で、可変ドメインは、重鎖可変ドメインに基づく。代替的態様では、可変ドメインは、軽鎖可変ドメインに基づく。

例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、二重特異性Ｔ細胞誘導またはＢｉＴＥ（登録商標）である。ＢｉＴＥは、抗体の可変領域のみを含む二価の小分子であり、ｓｃＦｖが可動性ペプチドリンカーで接続された形態にある。例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、本願で開示されるＣＬＤＮ６抗体のＬＣ可変領域とＨＣ可変領域を含むｓｃＦＶ、及び第２の抗原に対して特異的な第２の抗体のＬＣ可変領域とＨＣ可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＢｉＴＥは、ＣＤ３に対して特異的な第２の抗体のＬＣ可変領域とＨＣ可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３は、ＣＤ３Ｅである。

例示的場合には、二重特異性抗原結合タンパク質は二重親和性リターゲティング（ＤＡＲＴ）であり、ＢｉＴＥｓ（登録商標）とは異なって、ＤＡＲＴの２本の鎖間の共有結合が抗原結合部位の自由を制限する。したがって、ＤＡＲＴは構造的に小型であり、標的とエフェクター細胞の間に安定な接触を形成することができる。ＤＡＲＴは、操作された２つのＦｖ断片を含み、そのＶＨが他方のＶＨと交換されている。相互に交換されたＦｖドメインは、短い連結ペプチドによる立体構造的制約から変異断片を有利に放出する。

例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、修飾ＨＳＡに融合させた２つのｓｃＦｖを含むＨＳＡＢｏｄｙである。ＨＳＡＢｏｄｙは、ＭｃＤｏｎａｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１２；１１（３）：５８２－９３に記載されている。

したがって、例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、本願で開示されるＣＬＤＮ６抗体のいずれかの抗原結合性断片を含む。例示的態様では、抗原結合性断片はＦａｂである。例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、本願で開示されるＣＬＤＮ６抗体のいずれかのＦ（ａｂ）^２’を含む。例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、本願で開示されるＣＬＤＮ６抗体のいずれかのＬＣ可変領域とＨＣ可変領域を含むｓｃＦｖを含む。例示的態様では、ｓｃＦｖは、配列番号５１４または５１５のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合性断片は重鎖可変領域に基づき、他の態様では、抗原結合性断片は軽鎖可変領域に基づく。例示的態様では、抗原結合性断片は、ＨＣ可変領域及びＬＣ可変領域の両方の少なくとも一部を含む。例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、本願で開示されるＣＬＤＮ６抗体のＬＣ可変領域またはＨＣ可変領域の両方でなくともそのうちの少なくとも１つと、第２の抗原に対して特異的な第２の抗体のＬＣ可変領域とＨＣ可変領域の両方でくともそのうちの少なくとも１つとを含む。例示的場合には、二重特異性抗原結合タンパク質は、本願で開示されるＣＬＤＮ６抗体のＬＣ可変領域とＨＣ可変領域を含むｓｃＦＶ、及び第２の抗原に対して特異的な第２の抗体のＬＣ可変領域とＨＣ可変領域を含む。

ＣＬＤＮ６及びエピトープ

本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６に結合する。様々な態様では、ＣＬＤＮ６は、以下のアミノ酸配列を有するヒトＣＬＤＮ６である。

ここで、Ｘは、ＩｌｅまたはＶａｌである（配列番号２０２）。

様々な態様では、ヒトＣＬＤＮ６は、配列番号１、１７８、及び２００～２０２のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６のアミノ酸配列内のエピトープに結合する。様々な態様では、ＣＬＤＮ６はヒトＣＬＤＮ６であり、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ６のアミノ酸配列内、例えば、配列番号１、１７８、及び２００～２０２内のエピトープに結合する。「エピトープ」とは、抗原結合タンパク質が結合する、ＣＬＤＮ６の領域またはＣＬＤＮ６内の領域を意味する。いくつかの実施形態では、エピトープは、線状エピトープである。「線状エピトープ」とは、抗原結合タンパク質が結合する、ＣＬＤＮ６の領域またはＣＬＤＮ６内の領域であって、その領域が、ＣＬＤＮ６のアミノ酸配列の連続するアミノ酸で構成されるものを指す。線状エピトープのアミノ酸は、ＣＬＤＮ６の一次構造において互いに隣接している。したがって、線状エピトープは、抗原、すなわち、ＣＬＤＮ６のアミノ酸配列の断片または部分である。他の様々な実施形態では、エピトープは、立体構造エピトープまたは構造エピトープである。「立体構造エピトープ」または「構造エピトープ」とは、ＣＬＤＮ６がその適切に折り畳まれた状態にある場合にのみ互いに近接して位置するアミノ酸で構成されるエピトープを意味する。線状エピトープとは異なり、立体構造エピトープまたは構造エピトープのアミノ酸は、ＣＬＤＮ６の一次構造（すなわち、アミノ酸配列）において互いに隣接していない。立体構造エピトープまたは構造エピトープは、抗原（ＣＬＤＮ６）のアミノ酸配列の連続するアミノ酸で作られていない。

様々な態様では、エピトープは、ＣＬＤＮ６、例えば、ヒトＣＬＤＮ６の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）内に位置する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＷＴＡＨＡＩＩＲＤＦＹＮＰＬＶＡＥＡＱＫＲＥＬのアミノ酸配列（配列番号２）を有する、ＣＬＤＮ６のＥＣＤの細胞外ループ２（ＥＬ２）に結合する。様々な態様では、抗原結合タンパク質が結合するエピトープは、配列番号２内にある。様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、配列番号２のＮ末端部分、例えば、ＴＡＨＡＩＩＲＤＦＹＮＰＬ（配列番号３）に結合する。様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、配列番号２のＣ末端部分、例えば、ＬＶＡＥＡＱＫＲＥＬ（配列番号４）に結合する。様々な場合には、本開示の抗原結合タンパク質は、ＥＬ２に結合するが、ＣＬＤＮ６の細胞外ループ１（ＥＬ１）には結合しない。様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質が結合するエピトープ（複数可）は、配列番号１８５の配列を含む軽鎖可変領域と配列番号１８６の配列を含む重鎖可変領域とを含む抗ＣＬＤＮ６抗体が結合するエピトープとは異なる。様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質が結合するエピトープ（複数可）は、配列番号１８１の配列を含む軽鎖可変領域と配列番号１８２の配列を含む重鎖可変領域とを含む抗ＣＬＤＮ６抗体が結合するエピトープとは異なる。

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ６及び非ヒトＣＬＤＮ６に結合する。様々な場合には、非ヒトＣＬＤＮ６は、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、またはカエルのＣＬＤＮ６である。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ６及びマウスＣＬＤＮ６に結合する。

親和性及び結合力

本明細書で提供される抗原結合タンパク質は、非共有結合及び可逆的様態でＣＬＤＮ６に結合する。様々な実施形態では、ＣＬＤＮ６に対する抗原結合タンパク質の結合強度は、抗原結合タンパク質の結合部位とエピトープ間の相互作用の強さの尺度である、その親和性で表され得る。様々な態様では、本明細書で提供される抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６に対する高親和性を有しているため低親和性の抗原結合タンパク質よりも短期間で大量のＣＬＤＮ６と結合する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、平衡会合定数Ｋ_Ａが少なくとも１０^５ｍｏｌ^－１、少なくとも１０^６ｍｏｌ^－１、少なくとも１０^７ｍｏｌ^－１、少なくとも１０^８ｍｏｌ^－１、少なくとも１０^９ｍｏｌ^－１であるか、または少なくとも１０^１０ｍｏｌ^－１であるか、または少なくとも１０^１０ｍｏｌ^－１であるか、または最低でも１０^１０ｍｏｌ^－１である。当業者には理解されるように、Ｋ_Ａは、ｐＨ、温度及び緩衝液組成等の因子により影響され得る。

様々な実施形態では、ＣＬＤＮ６に対する抗原結合タンパク質の結合強度は、その感受性で表され得る。Ｋ_Ｄは、抗原結合タンパク質とＣＬＤＮ６間のｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの比である平衡解離定数である。Ｋ_Ｄ及びＫ_Ａは逆相関する。Ｋ_Ｄ値は、抗原結合タンパク質の濃度（特定の実験に必要とされる抗原結合タンパク質の量）と関連するため、Ｋ_Ｄ値が低いほど（低い濃度）抗原結合タンパク質の親和性は高い。様々な態様では、ＣＬＤＮ６に対する抗原結合タンパク質の結合強度は、Ｋ_Ｄで表され得る。様々な態様では、本明細書で提供される抗原結合タンパク質のＫ_Ｄは、約１０^－１、約１０^－２、約１０^－３、約１０^－４、約１０^－５、約１０^－６、またはそれ以下である。様々な態様では、本明細書で提供される抗原結合タンパク質のＫ_Ｄは、マイクロモル、ナノモル、ピコモルまたはフェムトモルである。様々な態様では、本明細書で提供される抗原結合タンパク質のＫ_Ｄは、約１０^－４～１０^－６または１０^－７～１０^－９または１０^－１０～１０^－１２または１０^－１３～１０^－１５の範囲内である。様々な態様では、本明細書で提供される抗原結合タンパク質のＫ_Ｄは、約１．０×１０^－１２Ｍ～約１．０×１０^－８Ｍの範囲内である。様々な態様では、抗原結合タンパク質のＫ_Ｄは、約１．０×１０^－１１Ｍ～約１．０×１０^－９Ｍの範囲内である。

様々な態様では、抗原結合タンパク質の親和性は、フローサイトメトリー－または蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）に基づくアッセイを使用して測定または順位付けが行われる。フローサイトメトリー系の結合アッセイは当該技術分野で公知である。例えば、Ｃｅｄｅｎｏ－Ａｒｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｐｈａｒｍ ７９（３）：５６９－５８１（２０１１）、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３７３：５２－６０（２００８）、及びＧｅｕｉｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０２（１－２）：６８－７７（２００５）を参照のこと。様々な態様では、抗原結合タンパク質の親和性は、Ｔｒｉｋｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１０：３２６－３３５（２００４）及びＴａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９８（１１）：１０８５－１０９１（１９９８）、ならびに以下に記載の競合アッセイを使用して測定または順位付けが行われる。下記「競合アッセイ」と題された項を参照のこと。Ｔｒｉｋｈ ｅｔ ａｌ．では、抗原を発現する細胞がラジオアッセイで使用された。^１２５Ｉ標識した抗原結合タンパク質（例えば、抗体）の細胞表面抗原への結合は、浮遊状態の細胞を用いて測定される。様々な態様では、ＣＬＤＮ６抗体の相対親和性はＦＡＣＳに基づくアッセイにより決定され、その場合、フルオロフォアに結合させた様々な濃度のＣＬＤＮ６抗体をＣＬＤＮ６発現細胞と共にインキュベートし、放たれる蛍光（抗体－抗原結合の直接の尺度である）を決定する。それぞれの用量または濃度をプロットする曲線を作成する。最大値は、蛍光が横ばいになるかまたは最大に達する際、すなわち、結合飽和が起こっている時の最低濃度濃度である。最大値の半分をＥＣ５０またはＩＣ５０と見なし、ＥＣ５０／ＩＣ５０が最も低い抗体は、同じ方法で試験した他の抗体と比べて最も高い親和性を有すると見なされる。そのようなアッセイは、本明細書で実施例５において記載されている。

様々な態様では、競合的結合阻害アッセイで決定されたＩＣ_５０値は、抗原結合タンパク質のＫ_Ｄに近似する。様々な場合には、以下に考察するように、競合アッセイは、参照抗体、フルオロフォア結合済み二次抗体、及びＣＬＤＮ６を発現する細胞を用いて行われるＦＡＣＳに基づくアッセイである。様々な態様では、細胞は、ＣＬＤＮ６を過剰発現するよう遺伝子操作される。いくつかの態様では、細胞は、ＣＬＤＮ６を発現するようウイルスベクターで形質導入されているＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。代替的態様では、細胞は、ＣＬＤＮ６を内因的に発現する。ＦＡＣＳに基づくアッセイを行う前に、いくつかの態様では、ＣＬＤＮ６を内因的に発現する細胞は、ＣＬＤＮ６低発現細胞またはＣＬＤＮ６高発現細胞であるとして事前に決定される。いくつかの態様では、細胞は、がんまたは腫瘍細胞である。様々な態様では、細胞は、細胞株、例えば、卵巣細胞株、子宮内膜細胞株、膀胱細胞株、肺細胞株、上部消化管（ＧＩ）細胞株、肝細胞株、肺細胞株等からの細胞である。様々な態様では、ＣＬＤＮ６を内因的に発現する細胞は、ＯＶＣＡ４２９卵巣細胞、ＡＲＫ２子宮内膜細胞、ＯＡＷ２８卵巣細胞、ＵＭＵＣ－４膀胱細胞、ＰＥＯ１４卵巣細胞、ＯＶ１７７卵巣細胞、Ｈ１６９３肺細胞、ＭＫＮ７上部消化管細胞、ＯＶ－９０卵巣細胞、ＨＵＨ－７肝細胞、ＪＨＯＳ－４卵巣細胞、Ｈ１４３５肺細胞、及びＮＵＧＣ３上部消化管細胞からなる群から選択される。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、細胞により発現されるヒトＣＬＤＮ６と参照抗体との結合相互作用を阻害し、ここで、参照抗体はＣＬＤＮ６に結合することが既知であるが、本開示の抗原結合タンパク質ではない。様々な場合には、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ６への結合を参照抗体と競合し、それにより、インビトロ競合結合アッセイで決定される、参照抗体に結合しているヒトＣＬＤＮ６の量を減少させる。様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ６と参照抗体との結合相互作用を阻害し、その阻害は、ＩＣ_５０により特徴付けられる。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ６と参照抗体との結合相互作用を阻害する場合に約２５００ｎＭ未満のＩＣ_５０を示す。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、約２０００ｎＭ未満、約１５００ｎＭ未満、約１０００ｎＭ未満、約９００ｎｍ未満、約８００ｎｍ未満、約７００ｎｍ未満、約６００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約４００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、または１００ｎｍ未満のＩＣ_５０を示す。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、または１０ｎＭ未満のＩＣ_５０を示す。様々な場合には、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６に結合することが既知の参照抗体に対し（参照抗体は、本開示の抗原結合タンパク質のいずれとも異なる）、ＣＬＤＮ６への結合を競合する。詳細は、「競合アッセイ」下を参照のこと。

結合力から、抗体－抗原複合体の全体的強さの尺度が得られる。これは、３つの主要パラメータ、すなわち、抗原結合タンパク質のエピトープに対する親和性、抗原結合タンパク質とＣＬＤＮ６の両方の結合価、及び相互作用する部分の構造配置に応じて異なる。抗原結合タンパク質の結合価（抗原結合部位の数）が大きいほど、それが結合できる抗原（ＣＬＤＮ６）の量は多くなる。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６に対する結合力が強い。様々な態様では、抗原結合タンパク質は多価である。様々な態様では、抗原結合タンパク質は二価である。様々な場合には、抗原抗原結合タンパク質は一価である。

交差反応性

様々な実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６に結合し、ＣＬＤＮファミリーのいかなる他のメンバーとも結合しない、例えば、ＣＬＤＮファミリーのいかなる他のメンバーとも交差反応しない。様々な場合には、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６特異的である。様々な実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質はＣＬＤＮ６に対する選択性を有し、抗原結合タンパク質のＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ９、またはその組み合わせに対する選択性よりも少なくとも１０倍、５倍、４倍、３倍、２倍大きい。様々な実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質はＣＬＤＮ６に対する選択性を有し、抗原結合タンパク質のＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、及びＣＬＤＮ９それぞれに対する選択性よりも少なくとも１０倍、５倍、４倍、３倍、２倍大きい。選択性は、ＣＬＤＮ６またはＣＬＤＮファミリーメンバーに対して抗原結合タンパク質が示すＫ_Ｄに基づいてよく、Ｋ_Ｄは、当該技術分野で公知の技術、例えば、表面プラズモン共鳴、ＦＡＣＳに基づく親和性アッセイにより決定され得る。

様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質はＣＬＤＮ６に結合し、クローディン３（ＣＬＤＮ３）、クローディン４（ＣＬＤＮ４）、及びクローディン９（ＣＬＤＮ９）のいずれにも結合しない。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、及びＣＬＤＮ９のいずれにも結合せず、ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＯＶＣＡ４２９細胞を用いたＦＡＣＳに基づくアッセイにおいて約１２００ｎＭ未満（例えば、約１０００ｎＭ未満、約７５０ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満）のＩＣ_５０を示す。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、及びＣＬＤＮ９のいずれにも結合せず、ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＯＶＣＡ４２９細胞で結合飽和の５０％が達成される濃度は約１２００ｎＭ未満（例えば、約１０００ｎＭ未満、約７５０ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満）である。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、及びＣＬＤＮ９に対する選択性よりも少なくとも５倍大きい選択性をＣＬＤＮ６に対して示し、ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＯＶＣＡ４２９細胞で結合飽和の５０％が達成される濃度は約１２００ｎＭ未満（例えば、約１０００ｎＭ未満、約７５０ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満）である。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６の人工モデル及び内在性モデルに対して約１２００ｎＭ未満（例えば、約１０００ｎＭ未満、約７５０ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満）のＩＣ５０を示し、ＣＬＤＮ６のＩＣ５０と、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４及び／またはＣＬＤＮ９とを区別する約５倍超の比を示す。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６に対して約１２００ｎＭ未満（例えば、約１０００ｎＭ未満、約７５０ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満）のＩＣ５０を示し、そのＩＣ５０より少なくとも５倍大きいＩＣ５０をＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、及びＣＬＤＮ９のいずれか１つに対して示す。

様々な実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質はＣＬＤＮ６に結合し、ＣＬＤＮファミリーの少なくとも１つの他のメンバーと交差反応する（例えば、結合する）。様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６、ならびにＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、及びＣＬＤＮ９のうちの１つ以上に結合する。様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ４またはＣＬＤＮ９に結合するが、ＣＬＤＮ３には結合しない。様々な場合には、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ４に結合するが、ＣＬＤＮ３にもＣＬＤＮ９にも結合しない。様々な場合には、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９に結合するが、ＣＬＤＮ３またはＣＬＤＮ４のいずれにも結合しない。

競合アッセイ

様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ６と参照抗体との結合相互作用を阻害し、ここで、参照抗体はＣＬＤＮ６に結合することが既知であるが、本開示の抗原結合タンパク質ではない。様々な場合には、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ６への結合を参照抗体と競合し、それにより、インビトロ競合結合アッセイで決定される、参照抗体に結合しているヒトＣＬＤＮ６の量を減少させる。様々な実施形態では、参照抗体は、ヒトＣＬＤＮ６の細胞外ドメインのアミノ酸配列内、任意選択で、ＥＬ２またはＥＬ１内のエピトープに結合する。様々な態様では、参照抗体は、配列番号１７９によりコードされる軽鎖可変配列、及び配列番号１８０によりコードされる重鎖可変配列を含む。様々な態様では、参照抗体は、配列番号１８１の軽鎖可変配列、及び配列番号１８２の重鎖可変配列を含む。様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ６と参照抗体との結合相互作用を阻害し、その阻害は、ＩＣ_５０により特徴付けられる。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ６と参照抗体との結合相互作用を阻害する場合に約２５００ｎＭ未満のＩＣ_５０を示す。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、約２０００ｎＭ未満、約１５００ｎＭ未満、約１０００ｎＭ未満、約９００ｎｍ未満、約８００ｎｍ未満、約７００ｎｍ未満、約６００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約４００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、または１００ｎｍ未満のＩＣ_５０を示す。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、または１０ｎＭ未満のＩＣ_５０を示す。

様々な場合には、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ６への結合を参照抗体と競合し、それにより、インビトロ競合結合アッセイで決定される、参照抗体に結合しているヒトＣＬＤＮ６の量を減少させる。様々な態様では、インビトロでの競合結合アッセイはＦＡＣＳに基づくアッセイであり、参照抗体のＦｃに結合するフルオロフォア結合済み二次抗体の蛍光を、特定量の本開示の抗原結合タンパク質の非存在下または存在下で測定する。そのようなＦＡＣＳに基づくアッセイは、本明細書において実施例で記載されている。様々な態様では、ＦＡＣＳに基づくアッセイは、参照抗体、フルオロフォア結合済み二次抗体及びＣＬＤＮ６を発現する細胞を用いて行われる。様々な態様では、細胞は、ＣＬＤＮ６を過剰発現するよう遺伝子操作される。いくつかの態様では、細胞は、ＣＬＤＮ６を発現するようウイルスベクターで形質導入されているＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。代替的態様では、細胞は、ＣＬＤＮ６を内因的に発現する。ＦＡＣＳに基づくアッセイを行う前に、いくつかの態様では、ＣＬＤＮ６を内因的に発現する細胞は、ＣＬＤＮ６低発現細胞またはＣＬＤＮ６高発現細胞であるとして事前に決定される。いくつかの態様では、細胞は、がんまたは腫瘍細胞である。様々な態様では、細胞は、細胞株、例えば、卵巣細胞株、子宮内膜細胞株、膀胱細胞株、肺細胞株、上部消化管（ＧＩ）細胞株、肝細胞株、肺細胞株等からの細胞である。様々な態様では、ＣＬＤＮ６を内因的に発現する細胞は、ＯＶＣＡ４２９卵巣細胞、ＡＲＫ２子宮内膜細胞、ＯＡＷ２８卵巣細胞、ＵＭＵＣ－４膀胱細胞、ＰＥＯ１４卵巣細胞、ＯＶ１７７卵巣細胞、Ｈ１６９３肺細胞、ＭＫＮ７上部消化管細胞、ＯＶ－９０卵巣細胞、ＨＵＨ－７肝細胞、ＪＨＯＳ－４卵巣細胞、Ｈ１４３５肺細胞、及びＮＵＧＣ３上部消化管細胞からなる群から選択される。様々な場合には、本開示の抗原結合タンパク質は、ＡＲＫ２細胞、ＯＶＣＡ４２９細胞、ＬＳ５１３細胞、またはＭＣＦ７細胞のうちの１つ以上により内因的に発現されるＣＬＤＮ６に高い親和性で結合する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＡＲＫ２細胞、ＯＶＣＡ４２９細胞、ＬＳ５１３細胞、またはＭＣＦ７細胞のうちの１つ以上を使用したＦＡＣＳに基づく競合的結合阻害アッセイで決定されるＩＣ_５０が約３０００ｎＭ未満を示す。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＡＲＫ２細胞、ＯＶＣＡ４２９細胞、ＬＳ５１３細胞、またはＭＣＦ７細胞のうちの１つ以上を使用したＦＡＣＳに基づく競合的結合阻害アッセイで決定されるＩＣ_５０が約２５００ｎＭ未満、約２０００ｎＭ未満、約１７５０ｎＭ未満、約１５００ｎＭ未満、約１２５０ｎＭ未満、約１０００ｎＭ未満、約７５０ｎＭ未満、または約５００ｎＭ未満を示す。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＡＲＫ２細胞、ＯＶＣＡ４２９細胞、ＬＳ５１３細胞、またはＭＣＦ７細胞のうちの１つ以上を使用したＦＡＣＳに基づく競合的結合阻害アッセイで決定されるＩＣ_５０が約４００ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満を示す。

抗体が、抗原またはそのエピトープへの結合を第２の抗体と競合する能力を試験する他の結合アッセイ、例えば、競合結合アッセイまたは競合アッセイは、当該技術分野で公知である。例えば、Ｔｒｉｋｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１０：３２６－３３５（２００４）、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９８（１１）：１０８５－１０９１（１９９８）を参照のこと。米国特許出願公開第ＵＳ２０１４０１７８９０５号、Ｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ４６：１６８－１７１（２０１７）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５２５：８９－９１（２０１７）、及びＧｏｏｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２９（２）：２５０－２５３（２０１７）。また、２つの抗体を比較する他の方法も当該技術分野で公知であり、これには、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が含まれる。ＳＰＲは、抗体及び第２の抗体の結合定数を決定するために使用することができ、その２つの結合定数を比較することができる。

抗体作製方法及び関連方法

抗原結合タンパク質（例えば、抗体、抗原結合性抗体断片、及び抗体タンパク質産物）を作製する好適な方法は当該技術分野で公知である。例えば、抗体を作製するための標準的ハイブリドーマ法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、及びＣＡ．Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５^ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００１））に記載されている。本開示のＣＬＤＮ６モノクローナル抗体を調製する様々な方法は、本明細書において実施例で提供されている。

宿主種に応じて、宿主による大量の抗体産生をもたらす免疫学的応答を増大させるために様々なアジュバントを使用することができる。そのようなアジュバントとしては、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、ならびにリゾレシチン、プルロニック系ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、及びジニトロフェノール等の界面活性物質が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍは、有用なヒトアジュバントである可能性がある。

他の抗体作製方法を表１にまとめている。

抗体がどのように産生されるかにかかわらず、抗体をＣＬＤＮ６のエピトープに結合する能力について試験する方法は当該技術分野で公知であり、これには、任意の抗体－抗原結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降法、ＳＰＲ、及び競合的阻害アッセイ等（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，下記、及び米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号、ならびに競合アッセイに関連する上記の項を参照のこと）が含まれる。

配列／構造

本明細書では、（ａ）表Ａに記載の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１のアミノ酸配列、もしくは配列番号１１、１７、２３、２９、３５、４１、４７、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、及び１３１からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するもの、（ｂ）表Ａに記載のＨＣ ＣＤＲ２のアミノ酸配列、もしくは配列番号１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、８６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、及び１３２からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するもの、（ｃ）表Ａに記載のＨＣ ＣＤＲ３のアミノ酸配列、もしくは配列番号１３、１９、２５、３１、３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、及び１３３からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するもの、（ｄ）表Ａに記載の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列、もしくは配列番号８、１４、２０、３２、３８、４４、５０、５６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、及び１２８からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するもの、（ｅ）表Ａに記載のＬＣ ＣＤＲ２のアミノ酸配列、もしくは配列番号９、１５、２１、２７、３３、３９、４５、５１、５７、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、及び１２９からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するもの、（ｆ）表Ａに記載のＬＣ ＣＤＲ３のアミノ酸配列、もしくは配列番号１０、１６、２２、２８、３４、４０、４６、５２、５８、６４、７０、７６、８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、及び１３０からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するもの、あるいは（ｇ）（ａ）～（ｆ）のうちいずれか２つ以上の組み合わせを含む抗原結合タンパク質が提供される。

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表Ａに記載のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列と、表Ａに記載のＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうち少なくとも１つまたは２つとを含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表Ａに記載のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列と、表Ａに記載のＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうち少なくとも１つまたは２つとを含む。

様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、表Ａで横１列にある配列番号により指定されるアミノ酸配列のうち少なくとも３つ、４つ、または５つを含む。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、表Ａの横１列にある配列番号により指定されるＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列の各々と、表Ａの横１列内の配列番号により指定されるＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうち少なくとも１つまたは２つとを含む。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、表Ａの横１列にある配列番号により指定されるＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列の各々と、表Ａの横１列にある配列番号により指定されるＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうち少なくとも１つまたは２つとを含む。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、表Ａの横１列にある配列番号により指定されるＣＤＲアミノ酸配列の全６配列を含む。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）配列番号７４～７９、（ｂ）配列番号５０～５５、（ｃ）配列番号１２２～１２７、（ｄ）配列番号２６～３１、（ｅ）配列番号１２８～１３３、（ｆ）配列番号３８～４３、（ｇ）配列番号６２～６７、（ｈ）配列番号８０～８５、（ｉ）配列番号４４～４９、（ｊ）配列番号８６～９１、（ｋ）配列番号１０４～１０９、（ｌ）配列番号５６～６１、（ｍ）配列番号３２～３７、（ｎ）配列番号１１０～１１５、（ｏ）配列番号９８～１０３、（ｐ）配列番号９２～９７、（ｑ）配列番号１１６～１２１、（ｒ）配列番号８～１３、（ｓ）配列番号６８～７３、（ｔ）配列番号１４～１９、及び（ｕ）配列番号２０～２５からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む。

様々な場合には、表Ａのアミノ酸配列は、少なくとも１個以上（例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上）の介在アミノ酸（複数可）によって区切られる。様々な場合には、ＬＣ ＣＤＲ１とＬＣ ＣＤＲ２の配列の間には約１０～約２０個のアミノ酸があり、ＬＣ ＣＤＲ２とＬＣ ＣＤＲ３の配列の間には約２５～約４０個のアミノ酸がある。様々な場合には、ＬＣ ＣＤＲ１とＬＣ ＣＤＲ２の配列の間には約１４～約１６個のアミノ酸があり、ＬＣ ＣＤＲ２とＬＣ ＣＤＲ３の配列の間には約３０～約３５個のアミノ酸がある。様々な場合には、ＨＣ ＣＤＲ１とＨＣ ＣＤＲ２の配列の間には約１０～約２０個のアミノ酸があり、ＨＣ ＣＤＲ２とＨＣ ＣＤＲ３の配列の間には約２５～約４０個のアミノ酸がある。様々な場合には、ＨＣ ＣＤＲ１とＨＣ ＣＤＲ２の配列の間には約１４～約１６個のアミノ酸があり、ＨＣ ＣＤＲ２とＨＣ ＣＤＲ３の配列の間には約３０～約３５個のアミノ酸がある。

様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）表Ｂに記載の重鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは配列番号１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、及び１７５からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するもの、あるいは（ｂ）表Ｂに記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは配列番号１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、及び１７６からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するもの、あるいは（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方、を含む。

様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）配列番号１５６と１５７、（ｂ）配列番号１４８と１４９、（ｃ）配列番号１７２と１７３、（ｄ）配列番号１４０と１４１、（ｅ）配列番号１７４と１７５、（ｆ）配列番号１４４と１４５、（ｇ）配列番号１５２と１５３、（ｈ）配列番号１５８と１５９、（ｉ）配列番号１４６と１４７、（ｊ）配列番号１６０と１６１、（ｋ）配列番号１６６と１６７、（ｌ）配列番号１５０と１５１、（ｍ）配列番号１４２と１４３、（ｎ）配列番号１６８と１６９、（ｏ）配列番号１６４と１６５、（ｐ）配列番号１６２と１６３、（ｑ）配列番号１７０と１７１、（ｒ）配列番号１３４と１３５、（ｓ）配列番号１５４と１５５、（ｔ）配列番号１３６と１３７、及び（ｕ）配列番号１３８と１３９からなる群から選択される１対のアミノ酸配列を含む。

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１７９と１８０の配列によりコードされる１対のアミノ酸配列を含まない。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１８１と１８２の１対のアミノ酸配列を含まない。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１８３と１８４の配列によりコードされる１対のアミノ酸配列を含まない。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１８５と１８６の１対のアミノ酸配列を含まない。

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、前述のアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列を含むが、抗原結合タンパク質はなおも、その生物学的機能、例えば、ヒトＣＬＤＮ６に結合し、腫瘍増殖を低下させ、がんを治療するその能力を実質的に保持する。

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、前述のアミノ酸配列（複数可）と比べて１個、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上のアミノ酸のみが異なるアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、言及されている配列の変異配列を含み、その変異配列は、言及されている配列と比べて１個か２個のアミノ酸のみが異なる。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＣＤＲの外側で生じる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、重鎖または軽鎖のフレームワーク領域（複数可）内部で生じる１つ以上のアミノ酸置換を含んでいる。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸置換を含んでいるが、抗原結合タンパク質はなおも６つのＣＤＲのアミノ酸配列を保持する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、前述のアミノ酸配列（複数可）と比べて１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換のみを有するアミノ酸配列を含む。本明細書で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸の、同様の特性、例えば、サイズ、電荷、疎水性、親水性、及び／または芳香族性を有する別のアミノ酸での置換を指し、これには、以下の５群のうちの１群の内部での交換が含まれる。

様々な態様では、保存的アミノ酸置換は、以下のアミノ酸群のうちの１群の内部での交換である。

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、前述のアミノ酸配列に対する約３０％もしくはそれより高い、約５０％もしくはそれより高い、または約７０％もしくはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、前述のアミノ酸配列に対する少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは９０％より高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、前述のアミノ酸配列の全長に沿って少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは９０％より高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、前述のアミノ酸配列の全長に沿って少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、言及されている配列の変異配列を含み、その変異配列は、前述の配列に対する約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、言及されている配列の変異配列を含み、その変異配列は、前述の配列に対する約もしくは少なくとも８０％の配列同一性を有する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、言及されている配列の変異配列を含み、その変異配列は、前述の配列に対する約もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、言及されている配列の変異配列を含み、その変異配列は、前述の配列に対する約もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。

様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、表Ａの横１列内の配列番号のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの配列、及び配列番号８～１３３のいずれかに対する約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有する少なくとも１つの変異配列を含む。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は（ａ）配列番号７４～７９、（ｂ）配列番号５０～５５、（ｃ）配列番号１２２～１２７、（ｄ）配列番号２６～３１、（ｅ）配列番号１２８～１３３、（ｆ）配列番号３８～４３、（ｇ）配列番号６２～６７、（ｈ）配列番号８０～８５、（ｉ）配列番号４４～４９、（ｊ）配列番号８６～９１、（ｋ）配列番号１０４～１０９、（ｌ）配列番号５６～６１、（ｍ）配列番号３２～３７、（ｎ）配列番号１１０～１１５、（ｏ）配列番号９８～１０３、（ｐ）配列番号９２～９７、（ｑ）配列番号１１６～１２１、（ｒ）配列番号８～１３、（ｓ）配列番号６８～７３、（ｔ）配列番号１４～１９、及び（ｕ）配列番号２０～２５から選択される配列セットのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの配列を含み、かかる抗原結合タンパク質はさらに、そのセットの配列のうちの少なくとも１つに対する約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有する少なくとも１つの変異配列を含む。例えば、様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号７４～７９のうち４つの配列、すなわち、配列番号７４～７７を含み、ここで、抗原結合タンパク質は２つの変異配列を含み、１つは、配列番号７８に対する約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有する変異配列、もう１つは、配列番号７９に対する約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有する変異配列である。

様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１３４～１７５のいずれかに対する約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有する１対の変異配列を含む。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、（ａ）配列番号１５６と１５７、（ｂ）配列番号１４８と１４９、（ｃ）配列番号１７２と１７３、（ｄ）配列番号１４０と１４１、（ｅ）配列番号１７４と１７５、（ｆ）配列番号１４４と１４５、（ｇ）配列番号１５２と１５３、（ｈ）配列番号１５８と１５９、（ｉ）配列番号１４６と１４７、（ｊ）配列番号１６０と１６１、（ｋ）配列番号１６６と１６７、（ｌ）配列番号１５０と１５１、（ｍ）配列番号１４２と１４３、（ｎ）配列番号１６８と１６９、（ｏ）配列番号１６４と１６５、（ｐ）配列番号１６２と１６３、（ｑ）配列番号１７０と１７１、（ｒ）配列番号１３４と１３５、（ｓ）配列番号１５４と１５５、（ｔ）配列番号１３６と１３７、及び（ｕ）配列番号１３８と１３９に対する約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有する１対の変異配列を含む。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は１対の配列を含み、１つは表Ｂの配列であり、もう１つの配列は、配列番号１３４～１７５のいずれかに対する約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有する変異配列である。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は１対の配列を含み、１つは、（ａ）配列番号１５６と１５７、（ｂ）配列番号１４８と１４９、（ｃ）配列番号１７２と１７３、（ｄ）配列番号１４０と１４１、（ｅ）配列番号１７４と１７５、（ｆ）配列番号１４４と１４５、（ｇ）配列番号１５２と１５３、（ｈ）配列番号１５８と１５９、（ｉ）配列番号１４６と１４７、（ｊ）配列番号１６０と１６１、（ｋ）配列番号１６６と１６７、（ｌ）配列番号１５０と１５１、（ｍ）配列番号１４２と１４３、（ｎ）配列番号１６８と１６９、（ｏ）配列番号１６４と１６５、（ｐ）配列番号１６２と１６３、（ｑ）配列番号１７０と１７１、（ｒ）配列番号１３４と１３５、（ｓ）配列番号１５４と１５５、（ｔ）配列番号１３６と１３７、及び（ｕ）配列番号１３８と１３９から選択される配列であり、もう１つの配列は、（ａ）～（ｕ）の配列に対する約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有する変異配列である。例えば、様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１３４の配列を含み、かかる抗原結合タンパク質はさらに、配列番号１３５に対する約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有する変異配列を含む。

様々な場合には、抗原結合タンパク質は、前述のアミノ酸配列のアミノ酸配列を含み、望ましくない側鎖反応を低下させるかまたは防ぐよう、反応性アミノ酸を減少させるかまたは除去するための１つ以上のアミノ酸置換を持つ。例えば、抗原結合タンパク質は、前述のアミノ酸配列のアミノ酸配列を含み、１つ以上の、（ｉ）Ｔｒｐ残基がＨｉｓ、Ｔｙｒ、またはＰｈｅで置換されている、（ｉｉ）Ａｓｎ残基がＧｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＡｓｐで置換されている、（ｉｉｉ）Ｐｒｏ残基の直前にあるＡｓｐ残基がＡｌａ、Ｓｅｒ、またはＧｌｕで置換されている、（ｉｖ）Ａｓｎ残基がＧｌｎ、Ｓｅｒ、またはＡｌａで置換されている、及び／または（ｖ）Ｃｙｓ残基がＴｙｒ、Ｓｅｒ、またはＡｌａで置換されている。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、前述のアミノ酸配列のアミノ酸配列を含み、より高い結合親和性、より高い安定性、またはＳＨＭ事象に基づくかもしくは他の同様の多数の抗体配列の統計解析に基づく他の有益な特性を有することが予測されるアミノ酸置換を持つ。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、（ａ）表Ａ１に記載のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、もしくは配列番号４５２、４５５、４６１、４６５、７１、及び４７２からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するもの、（ｂ）表Ａ１に記載のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、もしくは配列番号４７５、４５６、４６２、４６６、４６８、及び４７３からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するもの、（ｃ）表Ａ１に記載のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、もしくは配列番号４５３、４５７、４６３、４６７、４６９、及び４７４からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するもの、（ｄ）表Ａ１に記載のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、もしくは配列番号４４９、４７６、４５８、４６４、６８、及び４７０からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するもの、（ｅ）表Ａ１に記載のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、もしくは配列番号４５０、４７７、４５９、５７、６９、及び４７１からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するもの、（ｆ）表Ａ１に記載のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、もしくは配列番号４５１、４５４、４６０、５８、７０、及び１１２からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するもの、あるいは（ｇ）（ａ）～（ｆ）のうちいずれか２つ以上の組み合わせ、を含む。

いくつかの態様では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号４５２のＮ末端のすぐ隣にＧｌｙを含み、任意選択で、いくつかの態様では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号４５２のＣ末端のすぐ隣にＭＸを含み、ここで、Ｘは、Ｈ、Ｎ、またはＳである。様々な態様では、ＨＣ ＣＤＲ３は、配列番号４５３のＮ末端のすぐ隣にＡｌａを含む。様々な態様では、ＬＣ ＣＤＲ１はさらに、配列番号４４９のＮ末端のすぐ隣にＴＡＳを含み、任意選択で、配列番号４４９のＣ末端のすぐ隣にＸＨを含み、ここで、Ｘは、Ｈ、Ｓ、Ｙ、またはＱである。いくつかの態様では、以下に記載されるように、配列番号４４９の第１のアミノ酸は、ＳまたはＱである。いくつかの態様では、以下に記載されるように、配列番号４５１の第１のアミノ酸は、ＳまたはＱである。

様々な態様では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号４５５のＮ末端のすぐ隣にＧｌｙを含み、任意選択で、様々な態様では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号４５５のＣ末端のすぐ隣にＭＸを含み、ここで、Ｘは、Ｎ、Ｓ、またはＨである。いくつかの態様では、ＨＣ ＣＤＲ２は、配列番号４５６のＮ末端のすぐ隣にＧｌｎを、また任意選択で、配列番号４５６のＣ末端のすぐ隣にＨを含む。様々な態様では、ＬＣ ＣＤＲ１は、配列番号４７６のＮ末端のすぐ隣にＲＩＳを含み、任意選択で、配列番号４７６のＣ末端のすぐ隣にＬＡを含む。様々な態様では、ＬＣ ＣＤＲ２は、配列番号４７７のＣ末端のすぐ隣にＸＬＶＥを含み、ここで、Ｘは、ＩまたはＳである。

様々な態様では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号４６１のＣ末端のすぐ隣にＭＨを含む。様々な態様では、ＨＣ ＣＤＲ２は、配列番号４６２のＮ末端のすぐ隣にＴｙｒを、また任意選択で、配列番号４６２のＣ末端のすぐ隣にＴＨを含む。例示的態様では、ＨＣ ＣＤＲ３は、配列番号４６３の最初の２つのアミノ酸を含まない。様々な態様では、ＬＣ ＣＤＲ１は、配列番号４５８のＮ末端のすぐ隣にＲＳＳを、また任意選択で、配列番号４５８のＣ末端のすぐ隣にＬＮを含む。様々な態様では、ＬＣ ＣＤＲ２は、配列番号４５９のＣ末端のすぐ隣にＸＲＦＳを含み、ここで、Ｘは、Ｑ、Ｓ、Ａ、またはＤである。

様々な態様では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号４６５のＣ末端のすぐ隣にＭＨを含む。様々な態様では、ＨＣ ＣＤＲ２は、配列番号４６６のＮ末端のすぐ隣にＹＩを、また任意選択で、配列番号４６６のＣ末端のすぐ隣にＸａａを含み、ここで、Ｘａａは、Ｎ、Ｓ、Ｑ、またはＡである。様々な態様では、ＬＣ ＣＤＲ１は、配列番号４６４のＮ末端のすぐ隣にＬＡＳを、また任意選択で、配列番号４６４のＣ末端のすぐ隣にＬＡを含む。様々な態様では、ＬＣ ＣＤＲ２は、配列番号５７のＣ末端のすぐ隣にＳＬＡＤを含む。

様々な態様では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号７１のＣ末端のすぐ隣にＭＨを含む。様々な態様では、ＨＣ ＣＤＲ２は、配列番号４６８のＮ末端のすぐ隣にＴｙｒを、また任意選択で、配列番号４６８のＣ末端のすぐ隣にＩＹを含む。様々な態様では、ＬＣ ＣＤＲ１は、配列番号６８のＮ末端のすぐ隣にＲＡＳを、また任意選択で、配列番号６８のＣ末端のすぐ隣にＳＹＩＨを含む。様々な態様では、ＬＣ ＣＤＲ２は、配列番号６９のＣ末端のすぐ隣にＸＬＥＳを含み、ここで、Ｘは、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ａ、またはＤである。

様々な態様では、ＬＣ ＣＤＲ１は、配列番号４７０のＮ末端のすぐ隣にＫＳＳを、また任意選択で、配列番号４７０のＣ末端のすぐ隣にＹＬＡを含む。様々な態様では、ＬＣ ＣＤＲ２は、配列番号４７１のＣ末端のすぐ隣にＴＲＥＳを含む。様々な態様では、ＨＣ ＣＤＲ１は、配列番号４７２のＣ末端のすぐ隣にＭＮを含む。様々な態様では、ＨＣ ＣＤＲ２は、配列番号４７３のＮ末端のすぐ隣にＸａａを含み、ここで、Ｘａａは、Ｎ、Ｑ、Ｓ、またはＡであり、また任意選択で、配列番号４７３のＣ末端のすぐ隣にＴｈｒを含む。

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表Ａ１に記載のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列と、表Ａ１に記載のＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうち少なくとも１つまたは２つとを含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表Ａ１に記載のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列と、表Ａ１に記載のＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうち少なくとも１つまたは２つとを含む。

様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、表Ａ１で横１列にある配列番号により指定されるアミノ酸配列のうち少なくとも３つ、４つ、または５つ、を含む。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、表Ａ１の横１列にある配列番号により指定されるＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列の各々と、表Ａ１の横１列内の配列番号により指定されるＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうち少なくとも１つまたは２つとを含む。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、表Ａ１の横１列にある配列番号により指定されるＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列の各々と、表Ａ１の横１列にある配列番号により指定されるＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうち少なくとも１つまたは２つとを含む。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、表Ａ１の横１列にある配列番号により指定されるＣＤＲアミノ酸配列の全６配列を含む。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）配列番号４４９～４５３及び４７５、（ｂ）配列番号４７６～４７７、４５４～４５７、（ｃ）配列番号４５８～４６３、（ｄ）配列番号５７、５８、４６４～４６７、（ｅ）配列番号６８～７１及び４６８～４６９、ならびに（ｆ）配列番号１１２、及び４７０～４７４からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む。

様々な場合には、表Ａ１のアミノ酸配列は、少なくとも１個以上（例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上）の介在アミノ酸（複数可）によって区切られる。様々な場合には、ＬＣ ＣＤＲ１とＬＣ ＣＤＲ２の配列の間には約１０～約２０個のアミノ酸があり、ＬＣ ＣＤＲ２とＬＣ ＣＤＲ３の配列の間には約２５～約４０個のアミノ酸がある。様々な場合には、ＬＣ ＣＤＲ１とＬＣ ＣＤＲ２の配列の間には約１４～約１６個のアミノ酸があり、ＬＣ ＣＤＲ２とＬＣ ＣＤＲ３の配列の間には約３０～約３５個のアミノ酸がある。様々な場合には、ＨＣ ＣＤＲ１とＨＣ ＣＤＲ２の配列の間には約１０～約２０個のアミノ酸があり、ＨＣ ＣＤＲ２とＨＣ ＣＤＲ３の配列の間には約２５～約４０個のアミノ酸がある。様々な場合には、ＨＣ ＣＤＲ１とＨＣ ＣＤＲ２の配列の間には約１４～約１６個のアミノ酸があり、ＨＣ ＣＤＲ２とＨＣ ＣＤＲ３の配列の間には約３０～約３５個のアミノ酸がある。

様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）表Ｂ１に記載の重鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは配列番号４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、及び４８８からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するもの、あるいは（ｂ）表Ｂ１に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは配列番号４７９、４８１、４８３、４８５、４８７、及び４８９からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するもの、あるいは（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方、を含む。

様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）配列番号４７８と４７９、（ｂ）配列番号４８０と４８１、（ｃ）配列番号４８２と４８３、（ｄ）配列番号４８４と４８５、（ｅ）配列番号４８６と４８７、及び（ｆ）配列番号４８８と４８９からなる群から選択される１対のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表Ｂ１に記載されている配列番号を有する配列の変異配列を含み、これは、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有し、ここで、異なっているアミノ酸（複数可）は、以下の「ヒト化抗体」で記載されている位置に存在する。

ヒト化抗体

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表Ａ、表Ａ１、表Ｂ、または表Ｂ１に記載の抗原結合タンパク質のヒト化バージョンである。

ヒト化ＡＢ１

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ１のヒト化バージョンであり、重鎖可変領域内に以下の位置：５、８、１１、１２、１３、２０、３１、３３、３５、３８、４０、４８、５０、５５、５７、５９、６１、６５、６６、６７、６８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８２、８７、９０、９１、９８、１０１、及び１１６のうちの１つ以上における１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５）のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４２８のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ１のヒト化バージョンであり、重鎖可変領域内に以下の位置：２０、３１、３５、４８、５０、５９、６７、７０、７４、７９、９８、１０１のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）における１つ以上のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４２９のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、上記で列挙されている位置におけるアミノ酸は、下表に従ったアミノ酸から選択される。

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ１のヒト化バージョンであり、軽鎖可変領域内に以下の位置：１、３、４、９、１０、１１、１５、１７、２１、２４、２７、２９、３２、３４、３５、４３、４４、４８、５１、５２、５３、５４、５５、５６、６１、６７、７１、７２、７３、７９、８０、８１、８４、９０、９２、９３、９４、９５、９６、１０１、１０７のうちの１つ以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１）における１つ以上のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４３０のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ１のヒト化バージョンであり、軽鎖可変領域内に以下の位置：４、２１、３２、３４、４８、５１、５３、６１、６７、７９、８４、９１、及び９３のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３）における１つ以上のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４３１のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、上記で列挙されている位置におけるアミノ酸は、下表に従ったアミノ酸から選択される。

ヒト化ＡＢ３

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ３のヒト化バージョンであり、重鎖可変領域内に以下の位置：３、５、１８、１９、２３、３１、３３、３５、４０、４２、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６１、６４、７６、７９、８０、８１、８７、９４、９５、９９、１０６、１１２、１１４のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３）における１つ以上のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４３２のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ３のヒト化バージョンであり、重鎖可変領域内に以下の位置：３１、３５、５０、５５、７９、９９、１０６のうちの１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７）における１つ以上のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４３３のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、上記で列挙されている位置におけるアミノ酸は、下表に従ったアミノ酸から選択される。

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ３のヒト化バージョンであり、軽鎖可変領域内に以下の位置：９、１７、１８、２５、２７、２８、３０、３４、４０、４３、４５、４８、５０、５２、５３、５５、５６、７０、７２、７４、７６、８４、８５、９０、９１、９３、９４、９７、及び１００のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９）における１つ以上のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４３４のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ３のヒト化バージョンであり、軽鎖可変領域内に以下の位置：２５、３４、４８、５３、５５、８４、８５、９０、及び９３のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）における１つ以上のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４３５のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、上記で列挙されている位置におけるアミノ酸は、下表に従ったアミノ酸から選択される。

ヒト化ＡＢ４

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ４のヒト化バージョンであり、重鎖可変領域内に以下の位置：５、１１、１２、１３、２０、２９、３１、３３、３７、３８、４０、４５、４８、５０、５５、５６、５７、５９、６１、６２、６５、６６、６７、６８、７０、７２、７４、７６、７９、８２、８４、８７、９１、９７、１０１、１１７のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６）における１つ以上のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４３６のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ４のヒト化バージョンであり、重鎖可変領域内に以下の位置：２０、２９、３１、３７、４５、４８、５６、５９、６１、６２、６５、６６、６８、７０、７４、７９、８４、９７、及び１０１のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９）における１つ以上のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４３７のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、上記で列挙されている位置におけるアミノ酸は、下表に従ったアミノ酸から選択される。

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ４のヒト化バージョンであり、軽鎖可変領域内に以下の位置：７、１４、１７、１８、３１、３３、３９、４１、４２、４４、５０、５１、５５、５７、６０、８１、８８、９２、９４、９５、９６、９９、１００、１０５のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４）における１つ以上のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４３８のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ４のヒト化バージョンであり、軽鎖可変領域内に以下の位置：３３、３９、５５、５７、８１、９５、及び９６のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、または７）における１つ以上のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４３９のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、上記で列挙されている位置におけるアミノ酸は、下表に従ったアミノ酸から選択される。

ヒト化ＡＢ１８

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ１８のヒト化バージョンであり、重鎖可変領域内に以下の位置：５、９、１１、１２、２０、３８、４０、４１、４３、４４、４８、６１、６５、６７、６８、７０、７２、７４、７６、７９、８２、８４、８７、９１、及び１１６のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）、任意選択で、以下の位置：２０、４８、６８、７０、７９のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、または５）における１つ以上のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４４０または４４１のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、上記で列挙されている位置におけるアミノ酸は、下表に従ったアミノ酸から選択される。

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ１８のヒト化バージョンであり、軽鎖可変領域内に以下の位置：１、３、９、１５、１８、１９、２１、２２、４９、５１、６９、９３、８４、７８、１０５、及び１１１のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６）、任意選択で、以下の位置：１９、２１、または８４のうちの１つ以上（例えば、１、２、または３）における１つ以上のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４４２または４４３のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、上記で列挙されている位置におけるアミノ酸は、下表に従ったアミノ酸から選択される。

ヒト化ＡＢ９

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ９のヒト化バージョンであり、重鎖可変領域内に以下の位置：１、５、９、１１、１２、２０、３８、４０、４１、４３、４４、４８、６１、６３、６５、６７、６９、７０、７２、７３、７４、７６、７９、８４、８７、９１、９３、１１２、及び１１３のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９）における１つ以上のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４４４のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、上記で列挙されている位置におけるアミノ酸は、下表に従ったアミノ酸から選択される。

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ９のヒト化バージョンであり、軽鎖可変領域内に以下の位置：９、１１、１５、１７、１８、４３、４５、７０、７２、７３、７４、８０、８４、８５、及び１００のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５）における１つ以上のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４４５のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、上記で列挙されている位置におけるアミノ酸は、下表に従ったアミノ酸から選択される。

ヒト化ＡＢ１１

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ１１のヒト化バージョンであり、重鎖可変領域内に以下の位置：１、１５、１８、１９、４２、４９、６３、７５、７６、７８、８０、８４、８８、及び９３のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５）における１つ以上のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４４６のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、上記で列挙されている位置におけるアミノ酸は、下表に従ったアミノ酸から選択される。

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表ＢまたはＢ１に記載されているＡＢ１１のヒト化バージョンであり、軽鎖可変領域内に以下の位置：４、９、１７、２２、６４、７８、８０、８１、８２、８３、８４、８７、８９、１０４、及び１１０のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５）、任意選択で、以下の位置：４、８２、１１０のうちの１つ以上における１つ以上のアミノ酸置換を持つ。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４４７または４４８のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、上記で列挙されている位置におけるアミノ酸は、下表に従ったアミノ酸から選択される。

様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）表Ｃに記載の重鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは３７６～３７９、３８４～３８７、３９１～３９６、４０３～４０８、４１２、４１３、４１６～４１９、及び４２２～４２７からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％、もしくは約８０％、もしくは約８５％、もしくは約９０％、もしくは約９５％の配列同一性を有するもの、あるいは（ｂ）表Ｃに記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは３８０～３８３、３８８～３９０、３９７～４０２、４０９～４１１、４１４、４１５、４２０、及び４２１からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％、もしくは約８０％、もしくは約８５％、もしくは約９０％、もしくは約９５％の配列同一性を有するもの、あるいは（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方、を含む。

様々な実施形態では、ヒト化抗原結合タンパク質は、表Ｄに示される１対のアミノ酸配列を含む。

様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は１対の変異配列を含み、それぞれ表Ｃに記載されている配列番号に対する約または少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有する。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は１対の配列を含み、１つは、表Ｃに記載されている配列番号から選択される配列であり、もう１つの配列は、表Ｄに記載されている配列番号を有する配列、表Ｃに記載されている配列番号を有する配列に対する約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有する変異配列である。

様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は１対の配列を含み、１つは、表Ｄに記載されている配列番号から選択される配列であり、もう１つの配列は、表Ｄに記載されている配列番号を有する配列に対する約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有する変異配列である。例えば、様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号４１９の配列を含み、かかる抗原結合タンパク質はさらに、配列番号４２１に対する約もしくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有する変異配列を含む。

様々な場合には、抗原結合タンパク質は、表Ｄに記載されている、重鎖（ＨＣ）可変領域内もしくは軽鎖（ＬＣ）可変領域内、または両方に１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５）のアミノ酸置換を持つヒト化抗原結合タンパク質である。例示的態様では、抗原結合タンパク質は、ＨＣ可変領域、ＬＣ可変領域、または両方に１つ以上のアミノ酸置換を持つＡＢ１－１１というヒト化抗原結合タンパク質である。例示的態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号３７９のＨＣを含み、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのアミノ酸置換を持つ。例示的態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号５０４のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号５０５のＨＣ ＣＤＲ２、配列番号５０６のＨＣ ＣＤＲ３、またはそれらの組み合わせを含む。例示的場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号５０３のＨＣを含む。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号４９６～５０１のいずれか１つのＨＣを含む。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、図２２でＳ７～Ｓ１２として表示されているＨＣ配列を含む。様々な場合には、軽鎖可変領域は、配列番号４４９のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号４５０のＬＣ ＣＤＲ２、配列番号４５１のＬＣ ＣＤＲ３、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号３８０～３８３、及び４７９のいずれか１つのＬＣを含む。例示的場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号３８３のＬＣを含む。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、図２２でＳ７～Ｓ１２として表示されているＬＣ配列を含む。例示的態様では、抗原結合タンパク質は、ＨＣ可変領域、ＬＣ可変領域、または両方に１つ以上のアミノ酸置換を持つＡＢ３－７というヒト化抗原結合タンパク質である。例示的態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号３８７のＨＣを含み、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸置換を持つ。例示的態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号５０７のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号５０８のＨＣ ＣＤＲ２、配列番号５０９のＨＣ ＣＤＲ３、またはそれらの組み合わせを含む。例示的場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号５０２のＨＣを含む。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号４９０～４９５のいずれか１つのＨＣを含む。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、図２２でＳ１～Ｓ６として表示されているＨＣ配列を含む。様々な場合には、軽鎖可変領域は、配列番号４７６のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号４７７のＬＣ ＣＤＲ２、配列番号４５４のＬＣ ＣＤＲ３、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号３８８～３９０、及び４８１のいずれか１つのＬＣを含む。例示的場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号３８９のＬＣを含む。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、図２２でＳ１～Ｓ６として表示されているＬＣ配列を含む。例示的態様では、抗原結合タンパク質は、ＡＢ３のヒト化抗原結合タンパク質であり、ＨＣ可変領域、ＬＣ可変領域、または両方に１つ以上のアミノ酸置換を持つ。例示的態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１３９のＨＣを含み、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ（またはそれ以上）のアミノ酸置換を持つ。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号５１０のいずれか１つのＨＣを含む。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号５１０のＨＣ配列を含み、図２３に示されるようなアミノ酸置換を１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ（またはそれ以上）持つ。例示的態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１３８のＨＣを含み、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ（またはそれ以上）のアミノ酸置換を持つ。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号５１１のいずれか１つのＨＣを含む。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号５１１のＨＣ配列を含み、図２４に示されるようなアミノ酸置換を１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ（またはそれ以上）持つ。例示的態様では、抗原結合タンパク質は、ＡＢ１のヒト化抗原結合タンパク質であり、ＨＣ可変領域、ＬＣ可変領域、または両方に１つ以上のアミノ酸置換を持つ。例示的態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１３５のＨＣを含み、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ（またはそれ以上）のアミノ酸置換を持つ。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号５１３のいずれか１つのＨＣを含む。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号５１３のＨＣ配列を含み、図２５に示されるようなアミノ酸置換を１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ（またはそれ以上）持つ。例示的態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１３４のＨＣを含み、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ（またはそれ以上）のアミノ酸置換を持つ。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号５１２のいずれか１つのＨＣを含む。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号５１２のＨＣ配列を含み、図２６に示されるようなアミノ酸置換を１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ（またはそれ以上）持つ。

脱フコシル化抗体

多くの分泌タンパク質は、タンパク質の特定のアミノ酸に糖部分（例えば、グリカン、糖）が共有結合で結合される過程である翻訳後グリコシル化を受ける。真核細胞では、２つの型のグリコシル化反応、すなわち、（１）グリカンが、「Ｘ」がプロリン以外の任意のアミノ酸である認識配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒのアスパラギンに結合しているＮ－結合型グリコシル化、及び（２）グリカンが、セリンまたはトレオニンに結合しているＯ－結合型グリコシル化が起こる。グリコシル化の型（Ｎ－結合型［グリコシル化］またはＯ－結合型［グリコシル化］）にかかわらず、各部位（ＯまたはＮ）と会合するグリカン構造の範囲が大きいためにタンパク質のグリコフォームの微小不均一性が存在する。

すべてのＮ－グリカンは、共通のコア糖配列：Ｍａｎα１－６（Ｍａｎα１－３）Ｍａｎβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ａｓｎ）を有し、３つの型、すなわち、（Ａ）２つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分と多数（例えば、５、６、７、８または９）のマンノース（Ｍａｎ）残基とからなる高マンノース（ＨＭ）またはオリゴマンノース（ＯＭ）型、（Ｂ）２つを超えるＧｌｃＮＡｃ部分と任意の数の他の種類の糖とを含む複合型、または（Ｃ）一方の分岐にＭａｎ残基を、また複合分岐の基部にＧｌｃＮＡｃを含むハイブリッド型のうちの１つに分類される。図１Ａ（Ｓｔａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ８：Ｎ－Ｇｌｙｃａｎｓ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２^ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；２００９より入手）は、３つの型のＮ－グリカンを示す。

Ｎ－結合型グリカンは典型的には、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、ガラクトサミン（ＧａｌＮ）、グルコース（ＧＬｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＣｌｃＮＡｃ）、グルコサミン（ＧｌｃＮ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ－アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）、マンノサミン（ＭａｎＮ）、キシロース（Ｘｙｌ）、Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、２－ケト－３－ドキシノノン酸（２－ｋｅｔｏ－３－ｄｏｘｙｎｏｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（Ｋｄｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、グルクロン酸（ＧＬｃＡ）、イズロン酸（ＩｄｏＡ）、ガラクツロン酸（Ｇａｌ Ａ）、マンヌロン酸（Ｍａｎ Ａ）の１つ以上の単糖を含む。そのような糖に一般に使用される符号を図２９Ａに示す。

Ｎ－結合型グリコシル化は小胞体（ＥＲ）で始まり、複雑な一連の反応により、本質的に２つのＧｌｃＮＡｃ残基と３つのＭａｎ残基でできているコアグリカン構造の結合がもたらされる。ＥＲで形成されたグリカン複合体は、ゴルジ装置内の酵素の作用により修飾される。糖が、酵素にとって相対的に接近不可能である場合、糖は典型的には元のＨＭ形態のまま留まる。酵素が糖に接近することができる場合には、Ｍａｎ残基の多くが切断され、糖がさらに修飾されて、複合型Ｎ－グリカン構造が生じる。例えば、シスゴルジに位置するマンノシダーゼ－１はＨＭグリカンを切断または加水分解することができ、メディアルゴジルに位置するフコシルトランスフェラーゼＦＵＴ－８はグリカンをフコシル化する（Ｈａｎｒｕｅ Ｉｍａｉ－Ｎｉｓｈｉｙａ（２００７），ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：８４）。

したがって、グリカン構造の糖組成及び構造的立体配置は、他の要因の中でも特に、ＥＲ内のグリコシル化機構とゴルジ装置、機構の酵素のグリカン構造への接近可能性、各酵素の作用順序、及びタンパク質がグリコシル化機構から放出される段階に応じて異なる。

本開示の例示的な実施形態では、抗原結合タンパク質はＦｃポリペプチドを含む。本明細書で使用される用語「Ｆｃポリペプチド」には、抗体のＦｃ領域に由来する天然形態及び変異タンパク質形態のポリペプチドが含まれる。例示的態様では、本願で開示される抗原結合タンパク質のＦｃポリペプチドは、グリカンを含む。様々な場合には、グリカンは、フコースを欠くかまたは脱フコシル化されている。例示的態様では、抗原結合タンパク質は、脱フコシル化グリカンを含む。本明細書で使用される場合、用語「脱フコシル化グリカン」または「ａｆｕｃｏグリカン」または「脱フコシル化グリコフォーム」または「Ａｆｕｃ」とは、コアフコース、例えば、Ｎ－グリコシル化部位のＡｓｎとのアミド結合に関与するＧｌｃＮＡｃ残基上のα１，６結合フコースを欠くグリコフォームを指す。脱フコシル化グリコフォームとしては、Ａ１Ｇ０、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ、Ａ２Ｇ２、及びＡ１Ｇ１Ｍ５が挙げられるが、これらに限定されない。追加の脱フコシル化グリカンとしては、例えば、Ａ１Ｇ１ａ、Ｇ０［Ｈ３Ｎ４］、Ｇ０［Ｈ４Ｎ４］、Ｇ０［Ｈ５Ｎ４］、ＦＯ－Ｎ［Ｈ３Ｎ３］が挙げられる。例えば、Ｒｅｕｓｃｈ ａｎｄ Ｔｅｊａｄａ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２５（１２）：１３２５－１３３４（２０１５）を参照のこと。

本開示は、脱フコシル化グリカンを含むＦｃポリペプチドを含む抗原結合タンパク質を含む組成物、例えば、医薬組成物も提供する。例示的態様では、組成物中に存在する抗原結合タンパク質の約もしくは少なくとも２５％は、脱フコシル化グリカンを含むＦｃポリペプチドを含む抗原結合タンパク質である。例示的態様では、組成物中に存在する抗原結合タンパク質の約もしくは少なくとも２５％は、脱フコシル化されている。任意選択で、組成物中に存在する抗原結合タンパク質の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％またはそれ以上は、脱フコシル化されている。特定の糖プロファイル（ｇｌｙｃｏｐｒｏｆｉｌｅ）の抗原結合タンパク質を含む組成物を製造する方法は当該技術分野で公知である。例示的な実施形態では、抗原結合タンパク質は、デノボ経路またはサルベージ経路の酵素の活性を変化させるよう遺伝子が組み換えられている細胞で産生される組換え型である。これらの２つのフコース代謝経路を図２９Ｂに示す。例示的な実施形態では、細胞は、フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ、例えば、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、ＦＵＴ８、ＦＵＴ９）、フコースキナーゼ、ＧＤＰ－フコースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、及びＧＤＰ－ケト－６－デオキシマンノース－３，５－エピメラーゼ、４－レダクターゼ（ＦＸ）のうちのいずれか１つ以上の活性を変化させるよう遺伝子が組み換えられている。例示的な実施形態では、細胞は、ＦＸをコードする遺伝子をノックアウトするよう遺伝子が組み換えられている。例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１７／０７９１６５Ａ１号、Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３０，２００７，３００－３１０、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｕｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７，２００４，６１４－６２２、Ｍａｌｐｈｅｔｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０６，２０１０，７７４－７８３を参照のこと。

核酸

本開示はさらに、本開示の抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本明細書で使用される場合、「核酸」には、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸分子」が含まれ、一般に、ＤＮＡもしくはＲＮＡのポリマー、またはその修飾された形態を意味し、一本鎖もしくは二本鎖、合成、もしくは天然由来物質から得られた（例えば、単離及び／または精製された）ものであり得、天然、非天然または改変されたヌクレオチドを含有し得、また未修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見られるホスホジエステルの代わりに天然、非天然または改変されたヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロアミダート結合もしくはホスホロチオアート結合等を含有し得る。核酸は、本開示の抗原結合タンパク質のいずれかをコードするあらゆるヌクレオチド配列を含むことができる。様々な態様では、核酸は、（ａ）表ＡまたはＡ１に記載の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１のアミノ酸配列、もしくは配列番号１１、１７、２３、２９、３５、４１、４７、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、４５２、４５５、４６１、４６５、及び４７２からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、約または少なくとも８０％、約もしくは少なくとも８５％、約もしくは少なくとも９０％、約もしくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するもの、（ｂ）表ＡまたはＡ１に記載のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、もしくは配列番号１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、８６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、４７５、４５６、４６２、４６６、４６８、及び４７３からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、約または少なくとも８０％、約もしくは少なくとも８５％、約もしくは少なくとも９０％、約もしくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するもの、（ｃ）表ＡまたはＡ１に記載のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、もしくは配列番号１３、１９、２５、３１、３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、４５３、４５７、４６３、４６７、４６９、及び４７４からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、約または少なくとも８０％、約もしくは少なくとも８５％、約もしくは少なくとも９０％、約もしくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するもの、（ｄ）表ＡまたはＡ１に記載の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列、もしくは配列番号８、１４、２０、３２、３８、４４、５０、５６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、４４９、４７６、４５８、４６４、及び４７０からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、約または少なくとも８０％、約もしくは少なくとも８５％、約もしくは少なくとも９０％、約もしくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するもの、（ｅ）表ＡまたはＡ１に記載のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、もしくは配列番号９、１５、２１、２７、３３、３９、４５、５１、５７、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、４５０、４７７、４５９、及び４７１からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、約または少なくとも８０％、約もしくは少なくとも８５％、約もしくは少なくとも９０％、約もしくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するもの、（ｆ）表Ａに記載のＬＣ ＣＤＲ３のアミノ酸配列、もしくは配列番号１０、１６、２２、２８、３４、４０、４６、５２、５８、６４、７０、７６、８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、４５１、４５４、及び４６０からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、約または少なくとも８０％、約もしくは少なくとも８５％、約もしくは少なくとも９０％、約もしくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するもの、あるいは（ｇ）（ａ）～（ｆ）のうちいずれか２つ以上の組み合わせ、を含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な態様では、核酸は、表ＡまたはＡ１に記載のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列と、表ＡまたはＡ１に記載のＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうち少なくとも１つまたは２つとを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な態様では、核酸は、表ＡまたはＡ１に記載のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列と、表ＡまたはＡ１に記載のＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうち少なくとも１つまたは２つとを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な実施形態では、核酸は、（ａ）表ＡまたはＡ１で横１列にある配列番号により指定されるアミノ酸配列のうち少なくとも３つ、４つ、もしくは５つ、（ｂ）表ＡまたはＡ１の横１列にある配列番号により指定されるＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列の各々と、表ＡまたはＡ１の横１列内の配列番号により指定されるＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうち少なくとも１つもしくは２つ、（ｃ）表ＡまたはＡ１の横１列にある配列番号により指定されるＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列の各々と、表ＡまたはＡ１の横１列にある配列番号により指定されるＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうち少なくとも１つもしくは２つ、（ｄ）表Ａの横１列にある配列番号により指定されるＣＤＲアミノ酸配列の全６配列、及び／または（ｅ）（ａ）配列番号７４～７９、（ｂ）配列番号５０～５５、（ｃ）配列番号１２２～１２７、（ｄ）配列番号２６～３１、（ｅ）配列番号１２８～１３３、（ｆ）配列番号３８～４３、（ｇ）配列番号６２～６７、（ｈ）配列番号８０～８５、（ｉ）配列番号４４～４９、（ｊ）配列番号８６～９１、（ｋ）配列番号１０４～１０９、（ｌ）配列番号５６～６１、（ｍ）配列番号３２～３７、（ｎ）配列番号１１０～１１５、（ｏ）配列番号９８～１０３、（ｐ）配列番号９２～９７、（ｑ）配列番号１１６～１２１、（ｒ）配列番号８～１３、（ｓ）配列番号６８～７３、（ｔ）配列番号１４～１９、（ｕ）配列番号２０～２５、（ｖ）配列番号４４９～４５３及び４７５、（ｗ）配列番号４７６～４７７、４５４～４５７、（ｘ）配列番号４５８～４６３、（ｙ）配列番号５７、５８、４６４～４６７、（ｚ）配列番号６８～７１及び４６８～４６９、ならびに（ａａ）配列番号１１２、及び４７０～４７４からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な実施形態では、核酸は、（ａ）表ＢまたはＢ１に記載の重鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６及び４８８からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、約または少なくとも８０％、約もしくは少なくとも８５％、約もしくは少なくとも９０％、約もしくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するもの、あるいは（ｂ）表ＢまたはＢ１に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、４７９、４８１、４８３、４８５、４８７、及び４８９からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、約または少なくとも８０％、約もしくは少なくとも８５％、約もしくは少なくとも９０％、約もしくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するもの、あるいは（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方、を含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な実施形態では、核酸は、（ａ）配列番号１５６と１５７、（ｂ）配列番号１４８と１４９、（ｃ）配列番号１７２と１７３、（ｄ）配列番号１４０と１４１、（ｅ）配列番号１７４と１７５、（ｆ）配列番号１４４と１４５、（ｇ）配列番号１５２と１５３、（ｈ）配列番号１５８と１５９、（ｉ）配列番号１４６と１４７、（ｊ）配列番号１６０と１６１、（ｋ）配列番号１６６と１６７、（ｌ）配列番号１５０と１５１、（ｍ）配列番号１４２と１４３、（ｎ）配列番号１６８と１６９、（ｏ）配列番号１６４と１６５、（ｐ）配列番号１６２と１６３、（ｑ）配列番号１７０と１７１、（ｒ）配列番号１３４と１３５、（ｓ）配列番号１５４と１５５、（ｔ）配列番号１３６と１３７、及び（ｕ）配列番号１３８と１３９からなる群から選択される１対のアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な実施形態では、核酸は、表Ｄに記載されている対からなる群から選択される１対のアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な態様では、核酸は、配列番号２０８～３７５のうちのいずれか１つ以上のうちの配列を含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、いかなる挿入、欠失、逆位、及び／または置換も含まない。他の実施形態では、核酸は、１つ以上の挿入、欠失、逆位、及び／または置換を含む。

様々な態様では、核酸は、表Ｄに記載されている、重鎖（ＨＣ）可変領域内もしくは軽鎖（ＬＣ）可変領域内、または両方に１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５）のアミノ酸置換を持つヒト化抗原結合タンパク質である抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。例示的態様では、核酸は、ＨＣ可変領域、ＬＣ可変領域、または両方に１つ以上のアミノ酸置換を持つＡＢ１－１１というヒト化抗原結合タンパク質である抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。例示的態様では、核酸は、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのアミノ酸置換を持つ配列番号３７９のＨＣを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。例示的態様では、核酸は、配列番号５０４のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号５０５のＨＣ ＣＤＲ２、配列番号５０６のＨＣ ＣＤＲ３、またはそれらの組み合わせを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。例示的場合には、核酸は、配列番号５０３のＨＣを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、配列番号４９６～５０１のうちいずれか１つのＨＣを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、図２２でＳ７～Ｓ１２として表示されているＨＣ配列を含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な場合には、核酸は、配列番号４４９のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号４５０のＬＣ ＣＤＲ２、配列番号４５１のＬＣ ＣＤＲ３、またはそれらの組み合わせを含む軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、配列番号３８０～３８３、及び４７９のうちいずれか１つのＬＣを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。例示的場合には、核酸は、配列番号３８３のＬＣを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、図２２でＳ７～Ｓ１２として表示されているＬＣ配列を含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。例示的態様では、核酸は、ＨＣ可変領域、ＬＣ可変領域、または両方に１つ以上のアミノ酸置換を持つＡＢ３－７というヒト化抗原結合タンパク質である抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。例示的態様では、核酸は、配列番号３８７のＨＣを含む、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸置換を持つ抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。例示的態様では、核酸は、配列番号５０７のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号５０８のＨＣ ＣＤＲ２、配列番号５０９のＨＣ ＣＤＲ３、またはそれらの組み合わせを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。例示的場合には、核酸は、配列番号５０２のＨＣを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、配列番号４９０～４９５のうちいずれか１つのＨＣを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、図２２でＳ１～Ｓ６として表示されているＨＣ配列を含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な場合には、核酸は、配列番号４７６のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号４７７のＬＣ ＣＤＲ２、配列番号４５４のＬＣ ＣＤＲ３、またはそれらの組み合わせを含む軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、配列番号３８８～３９０、及び４８１のうちいずれか１つのＬＣを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。例示的場合には、核酸は、配列番号３８９のＬＣを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、図２２でＳ１～Ｓ６として表示されているＬＣ配列を含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。

例示的態様では、核酸は、ＨＣ可変領域、ＬＣ可変領域、または両方に１つ以上のアミノ酸置換を持つ、ＡＢ３のヒト化抗原結合タンパク質である抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。例示的態様では、核酸は、配列番号１３９のＨＣを含む、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ（またはそれ以上）のアミノ酸置換を持つ抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、配列番号５１０のうちいずれか１つのＨＣを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、配列番号５１０のＨＣ配列を含む、図２３に示されるようなアミノ酸置換を１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ（またはそれ以上）持つ抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。例示的態様では、核酸は、配列番号１３８のＨＣを含む、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ（またはそれ以上）のアミノ酸置換を持つ抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、配列番号５１１のうちいずれか１つのＨＣを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、配列番号５１１のＨＣ配列を含む、図２４に示されるようなアミノ酸置換を１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ（またはそれ以上）持つ抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。例示的態様では、核酸は、ＨＣ可変領域、ＬＣ可変領域、または両方に１つ以上のアミノ酸置換を持つ、ＡＢ１のヒト化抗原結合タンパク質である抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。例示的態様では、核酸は、配列番号１３５のＨＣを含む、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ（またはそれ以上）のアミノ酸置換を持つ抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、配列番号５１３のうちいずれか１つのＨＣを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、配列番号５１３のＨＣ配列を含む、図２５に示されるようなアミノ酸置換を１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ（またはそれ以上）持つ抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。例示的態様では、核酸は、配列番号１３４のＨＣを含む、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ（またはそれ以上）のアミノ酸置換を持つ抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、配列番号５１２のうちいずれか１つのＨＣを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、配列番号５１２のＨＣ配列を含む、図２６に示されるようなアミノ酸置換を１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ（またはそれ以上）持つ抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、いかなる挿入、欠失、逆位、及び／または置換も含まない。他の実施形態では、核酸は、１つ以上の挿入、欠失、逆位、及び／または置換を含む。

いくつかの態様では、本開示の核酸は組換え型である。本明細書で使用される場合、用語「組換え型」とは、（ｉ）生細胞の外側で、天然または合成の核酸セグメントを、生細胞内で複製することができる核酸分子につなぎ合わせることによって構築される分子、または（ｉｉ）上記（ｉ）で記載される分子の複製から得られる分子を指す。ここでの目的の場合、複製は、インビトロでの複製またはインビボでの複製いずれでもあり得る。

いくつかの態様での核酸は、当該技術分野で公知の手順を使用する化学合成及び／または酵素的ライゲーション反応に基づいて構築される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上掲）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（上掲）を参照のこと。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を高めるよう、もしくはハイブリダイゼーション時に形成される二重鎖の物理的安定性を高めるよう設計された様々な修飾ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオアート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して化学合成することができる。核酸を生成させるために使用することができる修飾ヌクレオチドの例としては、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキュエオシン、イノシン、Ｎ^６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ－置換アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアンモメチルウラシル（５－ｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｍｅｔｈｙｌｕｒａｃｉｌ）、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキュエオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ^６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュエオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６－ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、本開示の核酸のうち１つ以上は、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ） ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）等の企業から購入することができる。

ベクター

いくつかの態様での本開示の核酸はベクターに組み込まれる。これに関し、本開示は、本願で開示される核酸のいずれかを含むベクターを提供する。様々な態様では、ベクターは、組換え発現ベクターである。ここでの目的の場合、用語「組換え発現ベクター」とは、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現を可能にする、遺伝子が組み換えられているオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのコンストラクトを意味し、その場合、コンストラクトは、かかるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ベクターは、細胞内でｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを発現させるのに十分な条件下で細胞と接触する。本開示のベクターは、概して天然に存在しない。ただし、ベクターの部分は天然に存在し得る。本願で開示されるベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれるがこれらに限定されない、いかなる種類のヌクレオチドでも含むことができ、それらは、一本鎖もしくは二本鎖、合成、または天然由来物質から部分的に取得されたものであり得、また天然、非天然または改変されたヌクレオチドを含有することができる。ベクターは、天然に存在するヌクレオチド間結合もしくは天然には存在しないヌクレオチド間結合、または両方の型の結合を含むことができる。いくつかの態様では、改変ヌクレオチドまたは天然には存在しないヌクレオチド間結合は、ベクターの転写または複製を妨げない。

本開示のベクターは、あらゆる好適なベクターであってよく、また任意の好適な宿主の形質導入、形質転換またはトランスフェクトを行うために使用することができる。好適なベクターには、増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）と増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）のため、もしくは発現のため、またはその両方のために設計されているもの、例えば、プラスミド及びウイルス等が含まれる。ベクターは、プラスミドを用いる発現ベクターであり得る。様々な態様では、ベクターは、ｐＵＣ系（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏＩＩａ，ＣＡ）、ｐＥＴ系（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸ系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）からなる群から選択される。バクテリオファージベクター、例えば、λＧＴＩＯ、λＧＴｌ１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭｌ１４９等もまた使用することができる。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩＯｌ、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭ及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。いくつかの態様では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターである。様々な態様では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。例えば、Ｈｏｗａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２６（１）：１－２０（２０１０）を参照のこと。様々な態様では、ベクターは、節足動物、例えば、昆虫類に感染させるバキュロウイルスベクターである。様々な態様では、バキュロウイルスベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｎｕｃｌｅａｒウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）またはＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ（ＢｍＮＰＶ）である。例えば、Ｋｈａｎ，Ａｄｖ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ ３（２）：２５７－２６３（２０１３）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １１（４）：９１－９６（１９８９）、Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｓｔｉｃ Ｓｃｉ ２８：２１５－２２４（１９９０）を参照のこと。

本開示のベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上掲）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（上掲）に記載される、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して調製することができる。環状または線状である発現ベクターのコンストラクトは、宿主原核細胞または宿主真核細胞で機能する複製系を含有するよう調製することができる。複製系は、例えば、ＣｏＩＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス等に由来し得る。

いくつかの態様では、ベクターは、ベクター導入対象の宿主の種類（例えば、バクテリア、真菌、植物、または動物）に特異的な、転写と翻訳の開始コドン及び終止コドン等の制御配列を含み、必要に応じてそのベクターがＤＮＡ系なのかＲＮＡ系なのかが考慮されている。

ベクターには、形質転換またはトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする１つ以上のマーカー遺伝子を含めることができる。マーカー遺伝子には、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属等への耐性、原栄養性を与えるための栄養要求性宿主における相補性等が含まれる。本願で開示される発現ベクター用の好適なマーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。

ベクターは、ポリペプチド（その機能性部分及び機能性変異型を含む）をコードするヌクレオチド配列、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的であるかもしくはそれにハイブリダイズするヌクレオチド配列に機能的に連結されている、天然もしくは標準的なプロモーターを含むことができる。プロモーターの選択、例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的及び発生特異的等は、当業者の通常の技能の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターを合わせることもまた当業者の技能の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、及びｍｕｒｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｖｉｒｕｓの長い末端反復に見られるプロモーターであり得る。

宿主細胞

本明細書では、本開示の核酸またはベクターを含む宿主細胞が提供される。本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」とは、本願で開示されるベクターを含有することができ、また核酸（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質）によりコードされる発現産物を産生することができる、いかなる種類の細胞も指す。いくつかの態様での宿主細胞は、接着細胞であるかまたは浮遊細胞、すなわち、浮遊状態で生育する細胞である。様々な態様では宿主細胞は、培養細胞であるかまたは初代細胞、すなわち、生物、例えば、ヒトから直接分離された細胞である。宿主細胞はどの細胞型であってもよく、あらゆる種類の組織に由来し得、またどの発生段階のものでもよい。

様々な態様では、抗原結合タンパク質はグリコシル化タンパク質であり、宿主細胞はグリコシル化能を有する細胞である。様々な態様では、グリコシル化能を有する細胞は真核細胞であり、これには、酵母細胞、糸状菌細胞、原虫類細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞が含まれるが、これらに限定されない。そのような宿主細胞は当該技術分野で報告されている。例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：２１７（２０１３）を参照のこと。様々な態様では、真核細胞は、哺乳類細胞である。様々な態様では、哺乳類細胞は、非ヒト哺乳類細胞である。いくつかの態様では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞とそれに由来する細胞（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ ｐｒｏ－３）、マウス骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０、ＧＳ－ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）活性が欠損するよう操作されている細胞（例えば、ＤＵＫＸ－Ｘ１１、ＤＧ４４）、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞またはそれに由来する細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨｅＬａ）、ヒト骨骨肉腫上皮細胞Ｕ２－ＯＳ、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞Ａ５４９、ヒト線維肉腫細胞ＨＴ１０８０、マウス脳腫瘍細胞ＣＡＤ、胚性癌腫細胞Ｐ１９、マウス胚線維芽細胞ＮＩＨ ３Ｔ３、マウス線維芽細胞Ｌ９２９、マウス神経芽細胞腫細胞Ｎ２ａ、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ－７、網膜芽細胞腫細胞Ｙ７９、ヒト網膜芽細胞腫細胞ＳＯ－Ｒｂ５０、ヒト肝癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２、マウス骨髄腫Ｂ細胞Ｊ５５８Ｌ、またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（Ｇａｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｋｈａｎ，Ａｄｖ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ ３（２）：２５７－２６３（２０１３））である。

ベクターを増幅させるかまたは複製させる目的の場合、いくつかの態様での宿主細胞は、原核細胞、例えば、細菌細胞である。

また本開示では、本明細書に記載される少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞集団が提供される。いくつかの態様での細胞集団は、ベクターのうちいずれをも含まない少なくとも１つの他の細胞に加え、記載されているベクターを含む宿主細胞を含む不均一な集団である。別法として、いくつかの態様では、細胞集団は、実質的に均一な集団であり、集団は、ベクターを含む宿主細胞を主に含む（例えば、本質的にそれらからなる）。いくつかの態様での集団は、細胞のクローン集団であり、その集団の細胞はすべて、ベクターを含む単一宿主細胞のクローンであり、集団のすべての細胞がベクターを含む。本開示の様々な実施形態では、細胞集団は、本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。

製造方法

また、本明細書では、ＣＬＤＮ６に結合する抗原結合タンパク質を生産する方法も提供される。様々な実施形態では、方法は、抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む宿主細胞を、本明細書に記載されるように細胞培養培地中で培養すること、及び細胞培養培地から抗原結合タンパク質を回収することを含む。宿主細胞は、本明細書に記載される宿主細胞のいずれでもあり得る。様々な態様では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、及びＢＨＫ細胞からなる群から選択される。様々な態様では、宿主細胞を培養するステップは、宿主細胞の生育と増殖を支持するため増殖培地中で宿主細胞を培養することを含む。様々な態様では、増殖培地により、細胞の密度、培養時生存率と生産性が適切な時機に増大する。様々な態様では、増殖培地は、成長因子、ホルモン、及び接着因子の供給源としてアミノ酸、ビタミン、無機塩類、グルコース、及び血清を含む。様々な態様では、増殖培地は、アミノ酸、ビタミン、微量元素、無機塩類、脂質及びインスリンまたはインスリン様成長因子からなる完全合成培地である。栄養に加え、増殖培地はまた、ｐＨ及び浸透圧の維持にも役立つ。いくつかの増殖培地は市販されており、当該技術分野で報告されている。例えば、Ａｒｏｒａ，“Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ” ＭＡＴＥＲ ＭＥＴＨＯＤＳ ３：１７５（２０１３）を参照のこと。

様々な態様では、方法は、宿主細胞を流加培地中で培養することを含む。様々な態様では、方法は、流加培養法で流加培地中にて培養することを含む。組換えタンパク質生産の方法は当該技術分野で公知である。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ” ＭＡｂｓ ２（５）：４６６－４７７（２０１０）を参照のこと。

抗原結合タンパク質の作製方法は、細胞培養物またはその上清からタンパク質を精製し、好ましくは精製したタンパク質を回収するための１つ以上のステップを含むことができる。様々な態様では、方法は、１つ以上のクロマトグラフィーステップ、例えば、アフィニティクロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。様々な態様では、方法は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー樹脂を使用してタンパク質を精製することを含む。

様々な実施形態では、方法はさらに、精製タンパク質等を製剤化し、それにより精製タンパク質を含む製剤を得るためのステップを含む。そのようなステップは、Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｊａｍｅｅｌ ａｎｄ Ｈｅｒｓｈｅｎｓｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ），２０１０に記載されている。

様々な態様では、ポリペプチドに連結された抗原結合タンパク質及び抗原結合タンパク質は、融合タンパク質の一部である。したがって、本開示はさらに、ＣＬＤＮ６に結合する抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質を生産する方法を提供する。様々な実施形態では、方法は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む宿主細胞を、本明細書に記載されるように細胞培養培地中で培養すること、及び細胞培養培地から融合タンパク質を回収することを含む。

複合体

本開示は、抗原結合タンパク質であって、第２の部分（例えば、異種部分、複合体部分）に結合（ａｔｔａｃｈｅｄ）、連結または結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）されている抗原結合タンパク質も提供する。したがって、本開示は、抗原結合タンパク質と異種部分とを含む複合体を提供する。本明細書で使用される場合、用語「異種部分」は、「複合体部分」と同義であり、本開示の抗原結合タンパク質とは異なるあらゆる分子（化学的もしくは生化学的分子、天然に存在する分子、またはコードされていない分子）を指す。様々な異種部分としては、ポリマー、炭水化物、脂質、核酸、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、治療剤、（例えば、細胞傷害性薬物、サイトカイン）、または診断用薬が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、異種部分はポリマーである。ポリマーは、分岐であっても非分岐であってもよい。ポリマーは、あらゆる分子量であり得る。いくつかの実施形態でのポリマーは、平均分子量が約２ｋＤａ～約１００ｋＤａである（用語「約」は、水溶性ポリマーの調製物において、記述されている分子量よりも多い分子もあれば、それより少ない分子もあることを示す）。ポリマーの平均分子量は、いくつかの態様では、約５ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約１２ｋＤａ～約４０ｋＤａまたは約２０ｋＤａ～約３５ｋＤａである。

いくつかの実施形態では、ポリマーは、重合度を制御することができるよう、単一反応性基、例えば、アシル化用の活性エステルまたはアルキル化用のアルデヒド等を有するよう修飾される。いくつかの実施形態でのポリマーは、それが結合するタンパク質が生理学的環境等の水性環境において沈殿しないよう、水溶性である。いくつかの実施形態では、例えば、組成物が治療用に用いられる場合、ポリマーは薬学的に許容される。さらに、いくつかの態様では、ポリマーは、ポリマーの混合物、例えば、共重合体、ブロック共重合体である。

いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリアミド、ポリカルボナート、ポリアルキレンとその誘導体（ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタラートを含む）、アクリル酸エステル及びメタクリル酸エステルのポリマー（ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、及びポリ（アクリル酸オクタデシル）を含む）、ポリビニルポリマー（ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル、ポリ（酢酸ビニル）、及びポルビニルピロリドンを含む）、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンとその共重合体、セルロース（アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ－プロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシルエチルセルロース、三酢酸セルロース、及び硫酸セルロースナトリウム塩を含む）、ポリプロピレン、ポリエチレン（ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、及びポリ（エチレンテレフタレート）を含む）、及びポリスチレンからなる群から選択される。

本明細書での使用に特に好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書で使用される場合、ポリエチレングリコールは、モノ－（Ｃ１－Ｃ１０）アルコキシ－またはアリールオキシ－のポリエチレングリコール等、他のタンパク質を誘導体化するために使用することができるＰＥＧの形態のいずれも包含されることが意図される。ＰＥＧは、広範な分子量で利用可能な直鎖または分岐の中性ポリエーテルであり、水及び大部分の有機溶媒に可溶性である。

いくつかの実施形態では、異種部分は、炭水化物である。いくつかの実施形態では、炭水化物は、単糖（例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース）、二糖（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース）、オリゴ糖（例えば、ラフィノース、スタキオース）、多糖（デンプン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナンである。

いくつかの実施形態では、異種部分は、脂質である。いくつかの実施形態では、脂質は、脂肪酸、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、Ｎ－アシルエタノールアミン）、グリセロ脂質（例えば、一置換、二置換、三置換のグリセロール）、グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴシン、セラミド）、ステロール脂質（例えば、ステロイド、コレステロール）、プレノール脂質、糖脂質、またはポリケチド、油、ワックス、コレステロール、ステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質である。

いくつかの実施形態では、異種部分は、治療剤である。治療剤は、当該技術分野で公知の治療剤のいずれでもあり得る。本明細書で意図される治療剤の例としては、天然酵素、天然由来物質に由来するタンパク質、組換えタンパク質、天然ペプチド、合成ペプチド、環状ペプチド、抗体、受容体作動薬、細胞傷害性薬物、イムノグロビン、ベータ－アドレナリン遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、冠血管拡張薬、強心配糖体、抗不整脈薬、心臓支配交感神経作用薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、利尿薬、強心薬、コレステロール及びトリグリセリドの低下薬、胆汁酸捕捉薬、フィブラート、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル（ＨＭＧ）－ＣｏＡ還元酵素阻害剤、ナイアシン誘導体、抗アドレナリン作動薬、アルファ－アドレナリン遮断薬、中枢性抗アドレナリン作動薬、血管拡張薬、カリウム保持性薬剤、チアジド系薬と関連薬剤、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、末梢血管拡張薬、抗アンドロゲン薬、エストロゲン、抗生物質、レチノイド、インスリンと類似体、アルファ－グルコシダーゼ阻害薬、ビグアナイド系薬剤、メグリチニド、スルホニル尿素、チオアゾリジンジオン、アンドロゲン、プロゲストゲン、骨代謝調節物質、下垂体前葉ホルモン、視床下部ホルモン、下垂体後葉ホルモン、ゴナドトロピン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン拮抗薬、排卵刺激剤、選択的エストロゲン受容体調節薬、抗甲状腺薬、甲状腺ホルモン、膨張性薬剤、下剤、嬬動抑制薬、細菌叢修飾物質、腸内吸着剤、腸管抗感染薬、食欲不振用薬剤（ａｎｔｉａｎｏｒｅｘｉｃｓ）、悪液質用薬剤（ａｎｔｉｃａｃｈｅｘｉｃｓ）、過食症用薬剤（ａｎｔｉｂｕｌｉｍｉｃｓ）、食欲抑制剤、抗肥満薬、制酸剤、上部消化管用薬剤、抗コリン剤、アミノサリチル酸誘導体、生体応答調節剤、コルチコステロイド、鎮痙剤、５－ＨＴ_４部分作動薬、抗ヒスタミン薬、カンナビノイド、ドーパミン拮抗薬、セロトニン拮抗薬、細胞保護剤、ヒスタミンＨ２－受容体拮抗薬、粘膜保護剤、プロトンポンプ阻害薬、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ除菌療法、赤血球生成促進剤、造血剤、貧血用薬剤、ヘパリン、抗線溶薬、止血剤、血液凝固因子、アデノシン二リン酸阻害剤、糖タンパク質受容体阻害剤、フィブリノゲン－血小板結合阻害剤、トロンボキサン－Ａ_２阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子、抗血栓薬、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、コルチコステロイド、選択的免疫抑制剤、抗真菌薬、予防治療に伴う薬物、ＡＩＤＳ関連感染症、サイトメガロウイルス、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害薬、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害薬、プロテアーゼ阻害薬、貧血、カポジ肉腫（特発性多発性出血性肉腫）、アミノグリコシド系薬剤、カルバペネム系薬剤、セファロスポリン系薬剤、グリコペプチド、リンコサミド系薬剤、マクロライド系薬剤、オキサゾリジノン系薬剤、ペニシリン系薬剤、ストレプトグラミン系薬剤、スルホンアミド、トリメトプリムと誘導体、テトラサイクリン系薬剤、駆虫薬、抗アメーバ薬、ビグアナイド系薬剤、キナアルカロイド、葉酸拮抗薬、キノリン誘導体、ニューモシスチス－カリニ治療薬、ヒドラジド、イミダゾール、トリアゾール、ニトロイミダゾール、環状アミン、ノイラミニダーゼ阻害薬、ヌクレオシド、リン吸着剤、抗コリンエステラーゼ薬、補助療法薬、バルビツール酸系と誘導体、ベンゾジアゼピン、ガンマアミノ酪酸誘導体、ヒダントイン誘導体、イミノスチルベン誘導体、スクシンイミド誘導体、抗痙攣薬、麦角系アルカロイド、抗片頭痛薬調製物、生体応答調節剤、カルバミン酸イーター（ｃａｒｂａｍｉｃ ａｃｉｄ ｅａｔｅｒ）、三環式誘導体、脱分極薬、非脱分極薬、神経筋麻痺性薬、中枢神経刺激薬、ドーパミン作動薬、モノアミン酸化酵素阻害薬、ＣＯＭＴ阻害薬、スルホン酸アルキル、エチレンイミン、イミダゾテトラジン、ナイトロジェンマスタード類似体、ニトロソウレア、白金含有化合物、代謝拮抗剤、プリン類似体、ピリミジン類似体、尿素誘導体、アントラサイクリン系薬剤、アクチノマイシンｄ、カンプトテシン誘導体、エピポドフィロトキシン、タキサン、ビンカアルカロイドと類似体、抗アンドロゲン薬、抗エストロゲン薬、非ステロイド性アロマターゼ阻害薬、プロテインキナーゼ阻害剤抗悪性腫瘍薬、アザスピロデカンジオン誘導体、抗不安薬、覚せい剤、モノアミン再取り込み阻害薬、選択的セロトニン再取り込み阻害薬、抗うつ薬、ベンゾイソオキサゾール誘導体、ブチロフェノン系誘導体、ジベンゾジアゼピン誘導体、ジベンゾチアゼピン誘導体、ジフェニルブチルピペラジン誘導体、フェノチアジン、チエノベンゾジアゼピン誘導体、チオキサンテン誘導体、アレルゲン抽出物、非ステロイド薬、ロイコトリエン受容体拮抗薬、キサンチン、エンドセリン受容体拮抗薬、プロスタグランジン、肺サーファクタント、粘液溶解薬、抗有糸分裂薬、尿酸排泄薬、キサンチンオキシダーゼ阻害薬、ホスホジエステラーゼ阻害薬、メテアミン（ｍｅｔｈｅａｍｉｎｅ）塩、ニトロフラン誘導体、キノロン系薬剤、平滑筋弛緩薬、副交感神経作動薬、ハロゲン化炭化水素、アミノ安息香酸のエステル、アミド（例えば、リドカイン、アルチカイン塩酸塩、ブピバカイン塩酸塩）、解熱薬、催眠薬と鎮静剤、シクロピロロン、ピラゾロピリミジン、非ステロイド性抗炎症薬、オピオイド、パラ－アミノフェノール誘導体、アルコール脱水素酵素阻害剤、ヘパリン拮抗薬、吸着剤、催吐薬、オピオイド拮抗薬、コリンエステラーゼ再賦活薬、ニコチン補充療法薬、ビタミンＡ類似体と拮抗薬、ビタミンＢ類似体と拮抗薬、ビタミンＣ類似体と拮抗薬、ビタミンＤ類似体と拮抗薬、ビタミンＥ類似体と拮抗薬、ビタミンＫ類似体と拮抗薬が挙げられるが、これらに限定されない。

本開示の抗原結合タンパク質は、腫瘍転移の阻害に有効である１つ以上のサイトカイン及び成長因子に結合させることができ、ここで、サイトカインまたは成長因子は、少なくとも１つの細胞集団に対する抗増殖作用を有することが示されているものである。そのようなサイトカイン、リンホカイン、成長因子、または他の造血因子としては、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＦＮ、ＴＮＦα、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍｅｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、及びエリスロポエチンが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書での使用のための追加の成長因子には、アンジオゲニン、骨形成タンパク質－１、骨形成タンパク質－２、骨形成タンパク質－３、骨形成タンパク質－４、骨形成タンパク質－５、骨形成タンパク質－６、骨形成タンパク質－７、骨形成タンパク質－８、骨形成タンパク質－９、骨形成タンパク質－１０、骨形成タンパク質－１１、骨形成タンパク質－１２、骨形成タンパク質－１３、骨形成タンパク質－１４、骨形成タンパク質－１５、骨形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形成タンパク質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体α、サイトカイン誘導性好中球走化性因子１、サイトカイン誘導性好中球、走化性因子２α、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２β、β内皮細胞成長因子、エンドセリン１、上皮由来好中球誘引物質、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α２、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質α、成長関連タンパク質β、成長関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮成長因子、肝細胞成長因子、肝細胞成長因子受容体、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子受容体、インスリン様成長因子ＩＩ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経成長因子 神経成長因子受容体、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、プレＢ細胞成長刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、トランスフォーミング成長因子α、トランスフォーミング成長因子β、トランスフォーミング成長因子β１、トランスフォーミング成長因子β１．２、トランスフォーミング成長因子β２、トランスフォーミング成長因子β３、トランスフォーミング成長因子β５、潜在型トランスフォーミング成長因子β１、トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質Ｉ、トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質ＩＩ、トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型、ウロキナーゼ－型プラスミノーゲン活性化因子受容体、及びキメラタンパク質とその生物学または免疫学的活性断片が含まれる。

いくつかの実施形態では、複合体は、本明細書に記載される化合物と細胞毒性薬とを含む。細胞毒性薬は、細胞に対して毒性を示すあらゆる分子（化学的または生化学的）である。いくつかの態様では、本発明の化合物に細胞毒性薬を結合させる場合、得られる結果は相乗的である。換言すると、化合物と細胞毒性薬の併用療法の有効性は相乗的である、すなわち、有効性は、それぞれの個別の相加的作用から予測される有効性よりも大きい。したがって、細胞毒性薬の投与量を減量することができ、そのため、毒性上の問題及び他の副作用というリスクが同時に低減される。いくつかの実施形態では、細胞毒性薬は、化学療法薬である。化学療法薬は当該技術分野で公知であり、米国特許第６，６３０，１２４号に記載されるような白金配位化合物、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生物質、抗有糸分裂アルカロイド及びジフルオロヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、化学療法薬は、白金配位化合物である。用語「白金配位化合物」とは、白金をイオンの形態で与える、腫瘍細胞増殖を阻害するあらゆる白金配位化合物を指す。いくつかの実施形態では、白金配位化合物は、シス－ジアンミンジアコ白金（ＩＩ）－イオン；クロロ（ジエチレントリアミン）－白金（ＩＩ）塩化物；ジクロロ（エチレンジアミン）－白金（ＩＩ）、ジアンミン（１，１－シクロブタンジカルボキシラト）白金（ＩＩ）（カルボプラチン）；スピロプラチン；イプロプラチン；ジアンミン（２－エチルマロナト）－白金（ＩＩ）；エチレンジアミンマロナト白金（ＩＩ）；アクア（１，２－ジアミノシクロヘキサン）－スルファト白金（ＩＩ）；（１，２－ジアミノシクロヘキサン）マロナト白金（ＩＩ）；（４－カロキシフタラート）（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）；（１，２－ジアミノシクロヘキサン）－（イソシトラト）白金（ＩＩ）；（１，２－ジアミノシクロヘキサン）シス（ピルバト）白金（ＩＩ）；（１，２－ジアミノシクロヘキサン）オキサラト白金（ＩＩ）；オルマプラチン；及びテトラプラチンである。

いくつかの実施形態では、シスプラチンは、本発明の組成物及び方法で用いられる白金配位化合物である。シスプラチンは、ＰＬＡＴＩＮＯＬ（商標）の一般名でＢｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ－Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されており、水、滅菌生理食塩水または他の好適なビヒクルを用いた構成用の粉末として入手可能である。本発明での使用に好適な他の白金配位化合物は公知であり、市販のものを利用すること、及び／または従来の技術により調製することができる。シスプラチン、またはシス－ジクロロジアンミン白金ＩＩは、様々なヒト悪性固形腫瘍の治療において化学療法薬として長年使用されており、好成績を収めている。より最近では、他のジアミノ－白金錯体もまた、様々なヒト悪性固形腫瘍の治療における化学療法薬として有効性が示されている。そのようなジアミノ－白金錯体としては、スピロ白金及びカルボ白金が挙げられるが、これらに限定されない。シスプラチン及び他のジアミノ－白金錯体はヒトでの化学療法薬として広く使用されているが、腎障害等の毒性の問題をもたらし得る高投与量での送達が必要であった。

いくつかの実施形態では、化学療法薬は、トポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼは、真核細胞のＤＮＡトポロジーを変化させることができる酵素である。それらは、細胞の機能及び細胞増殖にとって重要である。一般に、真核細胞では、Ｉ型とＩＩ型の２つのクラスのトポイソメラーゼがある。トポイソメラーゼＩは、分子量が約１００，０００の単量体酵素である。この酵素は、ＤＮＡに結合し、一過性の一本鎖切断を導入して、二重らせんを巻き戻し（または巻き戻すのを可能にし）、その後、切断部を、ＤＮＡ鎖から解離しないうちに再結合させる。様々なトポイソメラーゼ阻害剤で、最近、卵巣、がん、食道癌または非小細胞肺癌で苦しむヒトの治療における臨床的有効性が示されている。

いくつかの態様では、トポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシンまたはカンプトテシン類似体である。カンプトテシンは、中国在来種Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ ａｃｃｕｍｉｎａｔａの木、及びインド在来種Ｎｏｔｈａｐｏｄｙｔｅｓ ｆｏｅｔｉｄａの木により産生される水不溶性の細胞傷害性アルカロイドである。カンプトテシンは、いくつかの腫瘍細胞に対して腫瘍細胞増殖阻害活性を示す。カンプトテシン類似体クラス化合物は典型的に、ＤＮＡトポイソメラーゼＩの特異的阻害剤である。「トポイソメラーゼ阻害剤」という用語は、カンプトテシンに構造的に関連した、あらゆる腫瘍細胞増殖阻害化合物を意味する。カンプトテシン類似体クラス化合物としては、トポテカン、イリノテカン及び９－アミノ－カンプトテシンが挙げられるが、これらに限定されない。

追加の実施形態では、細胞毒性薬は、１９９１年４月２日に交付された米国特許第５，００４，７５８号及び２０’公開第ＥＰ０ ３２１ １２２号として１９８９年６月２１日に公開された欧州特許出願第８８３１１３６６．４号；１９８６年８月５日に交付された米国特許第４，６０４，４６３号及び１９８５年４月１７日に公開された欧州特許出願公開第ＥＰ０ １３７ １４５号；１９８４年９月２５日に交付された米国特許第４，４７３，６９２号及び１９８３年３月１６日に公開された欧州特許出願公開第ＥＰ０ ０７４ ２５６号；１９８５年１０月８日に交付された米国特許第４，５４５，８８０号及び１９８３年３月１６日に公開された欧州特許出願公開第ＥＰ０ ０７４ ２５６号；１９８３年９月１４日に公開された欧州特許出願公開第ＥＰ０ ０８８ ６４２号；Ｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２９，２３５８－２３６３（１９８６）、Ｎｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．１４ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｋｙｏｔｏ，１９８５，Ｔｏｋｙｏ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｓｅｃｔｉｏｎ １，ｐ．２８－３０（特にＣＰＴ－１１と呼ばれる化合物）において特許請求または記載されている、任意の腫瘍細胞増殖阻害カンプトテシン類似体である。ＣＰＴ－１１は、１０－ヒドロキシ－７－エチルカンプトテシンのＣ－１０におけるカルバマート結合を介して連結されている４－（ピペリジノ）－ピペリジン側鎖を持つカンプトテシン類似体である。ＣＰＴ－１１は現在、ヒトでの臨床試験が行われており、イリノテカンとも呼ばれる。Ｗａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２３，５５４（１９８０）、Ｗａｎｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０，１７７４（１９８７）、１９８２年８月３日に交付された米国特許第４，３４２，７７６号；１９９０年９月１３日に出願された米国特許出願第５８１，９１６号及び１９９１年３月２０日に公開された欧州特許出願公開第ＥＰ４１８ ０９９号；１９８５年４月２３日に交付された米国特許第４，５１３，１３８号及び１９８３年３月２３日に公開された欧州特許出願公開第ＥＰ０ ０７４ ７７０号；１９８３年８月１６日に交付された米国特許第４，３９９，２７６号及び１９８２年７月２８日に公開された欧州特許出願公開第０ ０５６ ６９２号；その各々の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。上記で挙げたカンプトテシン類似体クラス化合物のいずれも、市販のものを利用すること、及び／または上記で挙げた参考文献に記載のものを含めた従来の技術により調製することができる。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポテカン、イリノテカン及び９－アミノカンプトテシンからなる群から選択され得る。

いくつかの実施形態では、カンプトテシン類似体は、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）の活性代謝物である。そのようないくつかの実施形態では、カンプトテシン類似体は、７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ－３８）である。代謝物として、ＳＮ－３８は、カルボキシルエステラーゼによるイリノテカンの加水分解により形成される。いくつかの実施形態では、ＳＮ－３８は、以下の構造のうちの１つを有する。

ＳＮ－３８は、米国特許出願第７，９９９，０８３号、米国特許出願第８，０８０，２５０号、米国特許出願第８，７５９，４９６号、米国特許出願第８，９９９，３４４号、米国特許出願第１０，１９５，２８８号、及び米国特許出願第９，８０８，５３７号に記載されている。

いくつかの実施形態では、カンプトテシン類似体は、エキサテカンメタンスルホン酸である。エキサテカンメタンスルホン酸は、水溶性カンプトテシン（ＣＰＴ）、他のＣＰＴ類似体よりもさらに強力なトポイソメラーゼＩ阻害活性及び抗腫瘍活性を示す。さらに、エキサテカンは、ｐ－糖タンパク（Ｐ－ｇｐ）媒介性の多剤耐性細胞に対して有効である。

いくつかの実施形態では、カンプトテシン類似体は、エキサテカンの強力な誘導体であるデルクステカン（Ｄｘｄ）であり、ＳＮ－３８よりも１０倍高いトポイソメラーゼＩ阻害能を有する。いくつかの実施形態では、Ｄｘｄは、以下の構造を有する。

Ｄｘｄは、米国特許出願第６，４０７，１１５号、米国特許出願第１０，１９５，２８８号、米国特許出願第９，８０８，５３７号、及び米国特許出願第６，４０７，１１５号に記載されている。

多数のカンプトテシン類似体クラス化合物の調製物（薬学的に許容される塩、その水和物と溶媒和物を含む）ならびにそのようなカンプトテシン類似体クラス化合物と不活性な薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む経口及び非経口の医薬組成物の調製物は、１９９１年４月２日に交付された米国特許第５，００４，７５８号及び１９８９年６月２１日に公開第ＥＰ０ ３２１ １２２号として公開された欧州特許出願第８８３１１３６６．４号に詳しく記載されており、それらの教示は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明のなおさらなる他の実施形態では、化学療法薬は、複合抗生物質である。好適な抗生物質としては、ドキソルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン及びストレプトゾシンが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、化学療法薬は、抗有糸分裂アルカロイドである。一般に、抗有糸分裂アルカロイドは、Ｃａｎｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓから抽出することができ、また、抗がん化学療法剤として有効であることことが示されている。多数の半合成誘導体が化学的にも薬理学的にも研究されている（Ｏ．Ｖａｎ Ｔｅｌｌｉｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，１６９９－１７１６（１９９２）を参照のこと）。本発明の抗有糸分裂アルカロイドとしては、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール及びビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない。後の２つの抗有糸分裂アルカロイドはそれぞれ、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、及びＰｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されている（米国特許第５，６２０，９８５号を参照のこと）。一実施形態では、抗有糸分裂アルカロイドは、ビノレルビンである。

本発明の他の実施形態では、化学療法薬は、ジフルオロヌクレオシドである。２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロヌクレオシドは、抗ウイルス活性を有するとして当該技術分野で知られている。そのような化合物は、米国特許第４，５２６，９８８号及び第４，８０８６１４号に開示及び教示されている。欧州特許出願公開第１８４，３６５号には、これらの同じジフルオロヌクレオシドが腫瘍溶解活性を有することが開示されている。特定の態様では、本発明の組成物及び方法に使用される２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロヌクレオシドは、ゲムシタビン塩酸塩としても知られる２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロシチジン塩酸塩である。ゲムシタビンは、市販のものを利用するか、またはその教示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５２６，９８８号、第４，８０８，６１４号及び第５，２２３，６０８号に開示及び教示されているように多段階過程で合成することができる。

様々な態様では、化学療法薬は、チューブリンの重合を遮断すること、微小管を不安定化させること、または微小管動態を変化させることにより細胞分裂を阻害する抗有糸分裂剤であり、例えば、メイタンシノイドまたはその誘導体（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、アウリスタチンまたはその誘導体である。様々な場合には、化学療法薬は、アウリスタチンである。例えば、いくつかの態様では、アウリスタチンは、ドラスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、またはＰＦ－０６３８０１０１である。アウリスタチンは、当該技術分野で報告されている。例えば、Ｍａｄｅｒｎａ，Ａ．；ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １２（６）：１７９８－１８１２（２０１５）を参照のこと。様々な態様では、複合体は、本開示の抗体をＭＭＡＥと組み合わせて含む。任意選択で、複合体は、リンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーは、切断可能な連結部分を含む。様々な場合には、複合体は、カテプシンで切断可能なリンカーに連結されている結合基に連結された本開示の抗体であって、ＭＭＡＥに連結されているスペーサーに連結されているものを含む。態様では、結合基は、抗体のＦｃ領域のＣｙｓ残基を介して抗体に結合している。例示的態様では、結合基は、式Ｉの構造を含む。

例示的態様では、カテプシンで切断可能なリンカーは、式ＩＩの構造を含む。

例示的な態様では、スペーサーは、式ＩＩＩの構造を含む。

いくつかの実施形態では、ＭＭＡＥは、以下の構造を有する。

本開示は、ポリペプチドに連結された本開示の抗原結合タンパク質を含む複合体も提供し、複合体が融合タンパク質であるようにしている。したがって、本開示は、ポリペプチドに連結された本開示の抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。様々な実施形態では、ポリペプチドは、診断的標識、例えば、緑色蛍光タンパク質等の蛍光タンパク質、または他のタグ、例えば、Ｍｙｃタグである。様々な態様では、ポリペプチドは、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、または上記で挙げた他の造血因子のうちの１つである。

リンカー

いくつかの実施形態では、複合体は、異種部分に直接連結されている。代替的実施形態では、複合体は、本開示の化合物を異種部分に連結するリンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーは、原子が１～約６０個、または１～３０個の原子もしくはそれ以上、２～５個の原子、２～１０個の原子、５～１０個の原子、または１０～２０個の原子長の鎖を含む。いくつかの実施形態では、鎖原子はすべて炭素原子である。いくつかの実施形態では、リンカー骨格内の鎖原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される。鎖原子及びリンカーは、より可溶性の複合体が提供されるよう、それらの予測溶解度（親水性）に従って選択することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、酵素もしくは他の触媒による切断、または標的とする組織もしくは器官もしくは細胞において見られる加水分解条件による切断を受ける官能基を提供する。いくつかの実施形態では、リンカーの長さは、立体障害の可能性を低減するのに十分な長さである。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸またはペプチジルリンカーである。そのようなペプチジルリンカーは、いかなる長さであってもよい。様々なリンカーは、約１～５０のアミノ酸長であり、５～５０、３～５、５～１０、５～１５、または１０～３０のアミノ酸長である。

多種多様な好適なリンカーが当該技術分野で公知である。リンカーは、例えば、生理学的条件下、例えば、細胞内条件下で切断可能であり得（切断可能リンカー）、リンカーの切断により細胞内環境に薬物が放出されるようにする。別法として、リンカーは、細胞外条件、例えば、腫瘍細胞外側または腫瘤近傍で切断可能であり得、リンカーの切断により、腫瘍細胞内側に選択的に透過する薬物が放出されるようにする。他の実施形態では、リンカーは、切断可能ではなく（切断不可能リンカー）、薬物が放出されるのは、例えば、抗体の分解によってである。

リンカーは、抗体部分上の化学的反応性基、例えば、遊離のアミノ基、イミノ基、ヒドロキシル基、チオール基、またはカルボキシル基に（例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端、１つ以上のリジン残基のイプシロンアミノ基、１つ以上のグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基、１つ以上のシステイニル残基のスルフヒドリル基、または１つ以上のセリン残基もしくはトレオニン残基のヒドロキシル基に）結合させることができる。リンカーを結合させる部位は、抗体部分のアミノ酸配列内の天然残基であり得、また、抗体部分内に、例えば、ＤＮＡ組換え技術により導入する（例えば、アミノ酸配列内にシステインまたはプロテアーゼ切断部位を導入することによる）かまたはタンパク質生化学（例えば、還元、ｐＨ調節、またはタンパク質分解）により導入することもできる。リンカーを結合させる部位は、非天然型アミノ酸でもあり得る。リンカーを結合させる部位は、抗体上のグリカンでもあり得る。

典型的には、リンカーは、それが接続している２つの基が連結されている条件下で実質的に不活性である。用語「二官能性架橋剤」、「二官能性リンカー」または「架橋剤」とは、２つの反応性基をリンカーの各末端で有する修飾剤であって、１つの反応性基を最初に細胞傷害性化合物と反応させてリンカー部分担持化合物を提供することができるようにし、その後、第２の反応性基が抗体と反応することができるようにしたものを指す。別法として、二官能性架橋剤の一端を最初に抗体と反応させてリンカー部分と第２の反応性基とを担持する抗体を提供することができ、その後、これが細胞傷害性化合物と反応することができる。連結部分は、特定の部位での細胞傷害性部分の放出を可能にする化学結合を含有し得る。好適な化学結合は当該技術分野において周知であり、これには、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、酸不安定結合、光不安定結合、プロテアーゼ／ペプチダーゼ不安定結合、及びエステラーゼ不安定結合が含まれる。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４７５，０９２号、第６，４４１，１６３号、第６，７１６，８２１号、第６，９１３，７４８号、第７，２７６，４９７号、第７，２７６，４９９号、第７，３６８，５６５号、第７，３８８，０２６号、及び第７，４１４，０７３号を参照のこと。いくつかの実施形態では、結合は、ジスルフィド結合、チオエーテル、及び／またはプロテアーゼ／ペプチダーゼ不安定結合である。本発明で使用できる他のリンカーには、その各々が参照により明白に本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００５０１６９９３３に詳述されているもの等の切断不可能リンカー、ＵＳ２００９／０２７４７１３、ＵＳ２０１０／０１２９３１４、及びＷＯ２００９／１３４９７６に記載されているもの等の荷電リンカーまたは親水性リンカーが含まれる。

いくつかの実施形態では、リンカーは、複合体に親水性を付与する親水性リンカーである。いくつかの実施形態では、親水性リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、親水性リンカーは、ＣＬＡ２である。いくつかの実施形態では、ＣＬＡ２リンカーは、以下の構造を有する。

ＣＬＡ２は、米国特許第８，０８０，２５０号、第８，７５９，４９６号、及び第１０，１９５，２８８号に記載されている。

いくつかの実施形態では、親水性リンカーは、ＣＬ２Ｅである。いくつかの実施形態では、ＣＬ２Ｅは、以下の構造を有する。

ＣＬ２Ｅは、米国特許第８，０８０，２５０号、第８，７５９，４９６号、及び第１０，１９５，２８８号に記載されている。

いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソームもしくはエンドソームまたはカベオラの内部）中に存在する切断物質により切断可能である。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームのプロテアーゼが含まれるがこれらに限定されない細胞内または細胞外のペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチドリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２アミノ酸長、少なくとも３アミノ酸長、少なくとも４アミノ酸長、または少なくとも５アミノ酸長を含む。

いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、バリン残基とシトルリン残基とを含むＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢである。いくつかの実施形態では、ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢリンカーは、以下の構造を有する。

ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢは、米国特許第７，６５９，２４１号、第７，８２９，５３１号、第６，８８４，８６９号、第６，２１４，３４５号、及び第６，２１４，３４５号に記載されている。

いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、マレイミドカプロイル グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン（ＭＣ－ＧＧＦＧ）である。いくつかの実施形態では、ＭＣ－ＧＧＦＧリンカーは、以下の構造を有する。

ＭＣ－ＧＧＦＧは、米国特許第９，８０８，５３７号及び第１０，１９５，２８８号に記載されている。

他の実施形態では、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性、すなわち、特定のｐＨ値において加水分解に感受性である。いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解性である。例えば、リソソーム内で加水分解性の酸不安定リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス－アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタール等）を使用することができる（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号、第５，８２４，８０５号、第５，６２２，９２９号、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７－１２３、Ｎｅｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６５３－１４６６１を参照のこと）。そのようなリンカーは、血液中等の中性ｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームの近似ｐＨである５．５または５．０を下回るｐＨでは不安定である。特定の実施形態では、加水分解性リンカーは、チオエーテルリンカーである（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に結合しているチオエーテル等（例えば、米国特許第５，６２２，９２９号を参照のこと）。

他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。ジスルフィド結合を介して抗体と細胞傷害性化合物との結合を可能にする二官能性架橋剤としては、Ｎ－スクシンイミジル－４－（４－ニトロピリジル－２－ジチオ）ブタノアート、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）－２－スルホブタノアート（スルホ－ＳＰＤＢ）が挙げられるが、これらに限定されない。スルホ－ＳＰＤＢは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，２３６，３１９号に記載されている。別法として、２－イミノチオラン、ホモシステインチオラクトン、または無水Ｓ－アセチルコハク酸等のチオール基を導入する架橋剤を使用することができる。他の実施形態では、リンカーは、前述のペプチドリンカー、ｐＨ感受性リンカー、またはジスルフィドリンカーのうちの１つ以上の組み合わせを含有し得る。

「ヘテロ二官能性架橋剤」は、２つの異なる反応性基を有する二官能性架橋剤である。アミン反応性Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）とカルボニル反応性ヒドラジン基の両方を含有するヘテロ二官能性架橋剤もまた、細胞傷害性化合物と抗体を連結させるために使用することができる。そのような市販のヘテロ二官能性架橋剤の例としては、スクシンイミジル６－ヒドラジノニコチンアミドアセトンヒドラゾン（ＳＡＮＨ）、スクシンイミジル４－ヒドラジドテレフタラート塩酸塩（ＳＨＴＨ）及びスクシンイミジルヒドラジニウムニコチナート塩酸塩（ＳＨＮＨ）が挙げられる。酸不安定結合を持つ複合体はまた、本発明のヒドラジン担持ベンゾジアゼピン誘導体を使用して調製することもできる。使用することができる二官能性架橋剤の例としては、スクシンイミジル－ｐ－ホルミルベンゾアート（ＳＦＢ）及びスクシンイミジル－ｐ－ホルミルフェノキシアセタート（ＳＦＰＡ）が挙げられる。

本明細書に記載されるリンカーは、本明細書に記載される異種部分と任意の組み合わせで使用してよい。上記で挙げた本明細書に記載のリンカー及び異種部分はいずれも、市販のものを利用すること、及び／または上記で挙げた参考文献に記載のものを含めた従来の技術により調製することができる。

複合体化

異種部分と抗原結合タンパク質の比（ＨＡＲ）は、抗原結合分子あたりの連結されている異種部分数を表す。いくつかの実施形態では、ＨＡＲは、１～１５、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、または１～２の範囲である。いくつかの実施形態では、ＨＡＲは、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４または２～３の範囲である。他の実施形態では、ＨＡＲは、約２、約２．５、約３、約４、約５、または約６である。いくつかの実施形態では、ＨＡＲは、約２～約４の範囲である。ＨＡＲは、質量分析、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法、ＥＬＩＳＡアッセイ、及び／またはＨＰＬＣ等の従来の手段により特徴付けられ得る。

いくつかの実施形態では、複合体は、不均一複合体（「従来型」とも呼ばれる）であり、抗原結合タンパク質は、異なる数の異種部分に結合される。いくつかの実施形態では、不均一複合体は、複合体のガウス分布または準ガウス分布（ｑｕａｓｉ－Ｇａｕｓｓｉａｎ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）に従っており、その場合、一部の抗原結合タンパク質は平均より高値で結合し、一部の抗原結合タンパク質は平均より低値で結合している、異種部分搭載平均値に分布の中心がくる。

いくつかの実施形態では、複合体は、均一複合体であり、その場合、かなりの割合の抗原結合タンパク質が所定の数の異種部分に結合されている。いくつかの実施形態では、均一複合体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のＨＡＲを含む。いくつかの実施形態では、均一複合体は、２、４、６、または８のＨＡＲを含む。好ましい実施形態では、均一複合体は、４のＨＡＲを含む。他の好ましい実施形態では、均一複合体は、２のＨＡＲを含む。いくつかの実施形態では、均一複合体は、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント以上の、定義されたＨＡＲを有する複合体を含む。いくつかの実施形態では、均一複合体は、約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの、定義されたＨＡＲを有する複合体を含む。いくつかの実施形態では、均一複合体は、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの、定義されたＨＡＲを有する複合体を含む。いくつかの実施形態では、均一複合体は、ガウス分布でも準ガウス分布（ｑｕａｓｉ－Ｇａｕｓｓｉａｎ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）でもないＨＡＲ分布を含む。いくつかの実施形態では、均一複合体の均一性は、クロマトグラム、例えば、ＨＰＬＣまたは好適な任意のクロマトグラフィーにより決定される。いくつかの実施形態では、クロマトグラムは、ＨＩＣクロマトグラムである。均一複合体は、部位特異的な複合体化により生成され得る。

いくつかの実施形態では、異種部分を、部位特異的に抗原結合タンパク質（例えば、抗体）に結合させる。部位特異的な複合体化の様々な方法が当該技術分野で公知であり、例えば、チオマブ（ｔｈｉｏｍａｂ）またはＴＤＣまたは不対システイン残基での複合体化（Ｊｕｎｕｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：９２５－９３２、Ｄｉｍａｓｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．１４：１５０１－１５１６、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：１８４－９）、チオール架橋リンカー（Ｂｅｈｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．１２：３９８６－９８）、トランスグルタミナーゼを使用したグルタミンでの複合体化（Ｄｅｎｎｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．１０４５：２０５－１５、Ｄｅｎｎｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２５：５６９－７８）、操作された非天然アミノ酸残基での複合体化（Ａｘｕｐ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４－１６１０１－６、Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１：１７６６－７１、ＶａｎＢｒｕｎｔ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２６：２２４９－６０、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２５：３５１－６１）、セレノシステイン複合体化（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２４：４３３－４４２）、グリカン媒介性の複合体化（Ｏｋｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２４：１６５０－５）、ガラクトースまたはＧａｌＮＡｃアナログでの複合体化（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ ａｎｄ Ｑａｓｂａ（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２０８３３－９、ｖａｎ Ｇｅｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２６：２２３３－４２）、糖鎖工学によるものＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２５：５１０－２０、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １２：１７０２－１７２１）、グルタミンタグの操作もしくはソルターゼＡ媒介性ペプチド転移等の短鎖ペプチドタグによるもの（Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２０：１６１－７、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０：ｅ０１３１１７７）、及びアルデヒドタグによるもの（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６：３０００－５）がある。

複合体（例えば、ＡＤＣ）の予測不可能性

抗体プロファイル、または薬物ペイロードプロファイルに基づくだけでは、臨床応用にどの抗体薬物複合体が十分に安全かつ有効であるかを事前に予測することは不可能である。例えば、特定の薬物ペイロードは、１つの標的に指向させる抗体に結合させた場合には完全にうまく機能し得るが、異なる標的に指向させる抗体に結合させた場合、または同じ標的に指向させる異なる抗体に結合させた場合はほぼ、作用するとは言えない場合がある。異なる抗体薬物複合体がインビボで異なる抗腫瘍活性を示す理由は十分に解明されていないため、新たな抗体薬物複合体の設計において正確な予測ができない。多くの因子の予測不可能な相互作用が影響していることが推測される。これらの因子には、例えば、標的抗原に対する抗体薬物複合体の結合親和性、複合体の固形腫瘍浸透能、及び毒性を引き起こさない、腫瘍への適切な曝露のための循環血中半減期が含まれ得る。

複雑さ及び予測不可能性は、抗体の親和性単独により十分に示される。親和性の高い抗体または抗体薬物複合体は、細胞内へより良好に取り込まれて、より高レベルの細胞傷害性ペイロードを細胞内部で放出させるという跡を残す。高親和性はまた、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増強させることが知られている。これらすべての属性が、抗体薬物複合体の殺細胞特性に好都合である。しかしながら、抗体または抗体薬物複合体の高親和性は、効率的な腫瘍浸透を「抗原障壁効果」により妨げ得ることもまた知られており、このことは、インビボでの強い抗腫瘍活性を達成するためには、抗体薬物複合体の親和性は、高過ぎも低過ぎもせず、ちょうど良い親和性でなければならないことを示唆している。現在までのところ、ある抗体薬物複合体について、最も効率的または有効なレベルの親和性はどれなのかを予測する方法はわかっていない。

さらに、インビボでの抗腫瘍活性は、リンカー及びペイロードの機序単独からでは予測することができない。例えば、Ｏ．Ａｂ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１４（＆）：１６０５－１６１３（２０１５）では、前臨床がんモデルで試験した際、同じ抗体を同じ抗チューブリン毒素に異なるリンカーにより結合させたところ、劇的に異なる抗腫瘍活性が示されることを実証した。２つのリンカーの化学構造は非常に類似しているため、この例は特に驚くべきことである。さらに、優位な複合体中に存在するリンカーには、親水性部分が含有されていた。親水性代謝物は一般に膜透過性が低く、リソソーム（複合体が分解される部位）からの流出がより緩徐であり、放出されるペイロードの抗チューブリン活性の遅延をもたらすと考えられている。この知見は、ペイロード送達の「理想的な」動態を主張するものであるが、現在のところ、何がそのような動態を構成するのかということに関する洞察はない。これをさらに複雑にしているのが、ペイロード送達の理想的な動態は、特定の細胞型については定義されても、それがすべての細胞型に適用されるのかという未解決の問題である。したがって、単にリンカーまたはペイロードの化学組成から最も有効なインビボ抗腫瘍活性を予測することは不可能である。

組成物、医薬組成物及び製剤

本願で開示されているような抗原結合タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、または複合体を含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの態様での組成物は、抗原結合タンパク質を単離及び／または精製された形態で含む。いくつかの態様では、組成物は、本開示の抗原結合タンパク質の単一種類（例えば、構造）を含むか、または、２つ以上の本開示の抗原結合タンパク質の組み合わせを含み、かかる組み合わせは、種類（例えば、構造）の異なる２つ以上の抗原結合タンパク質を含む。

いくつかの態様では、組成物は、抗原結合タンパク質の化学物理的特徴を増強させる薬剤を含み、例えば、特定の温度、例えば、室温で抗原結合タンパク質を安定化させること、有効期間を延長すること、分解、例えば、酸化プロテアーゼによる分解を低下させること、抗原結合タンパク質の半減期を延長させること等により増強させる。いくつかの態様では、組成物は、本明細書に開示される薬剤のいずれかを異種部分または複合体部分として含み、任意選択で、本開示の抗原結合タンパク質との混合剤にするか、またはかかる抗原結合タンパク質に結合させて含む。

本開示の様々な態様では、組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または添加剤を追加で含む。いくつかの実施形態では、本願で開示されているような抗原結合タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、または複合体は（以下、「活性物質と呼ぶ」）、薬学的に許容される担体、希釈剤、または添加剤と共に活性物質を含む医薬組成物に製剤化される。これに関し、本開示はさらに、対象、例えば、哺乳類への投与が意図される活性物質を含む医薬組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、活性物質は、患者への投与に好適な純度レベルで医薬組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、活性物質は、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の純度レベル、及び薬学的に許容される希釈剤、担体または添加剤を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、活性物質を約０．００１～約３０．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する。

様々な態様では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」には、リン酸緩衝食塩液、水、油／水型または水／油型エマルジョン等のエマルジョン、及び各種の湿潤剤等、いずれの標準的医薬担体も含まれる。用語はまた、米国連邦政府の規制当局により承認されている薬剤、またはヒトを含めた動物での使用のための米国薬局方収載の薬剤のいずれをも包含する。

医薬組成物は、薬学的に許容されるいかなる成分も含むことができ、それらには、例えば、酸性化剤、添加物、吸着剤、エアロゾル噴霧剤、空気置換剤、アルカリ化剤、凝結防止剤、抗凝固剤、抗菌性保存剤、抗酸化剤、消毒剤、基剤、結合剤、緩衝剤、キレート剤、コーティング剤、着色剤、乾燥剤、洗浄剤、希釈剤、殺菌剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、色素、軟化剤、乳化剤、エマルジョン安定化剤、賦形剤、膜形成剤、調味料、香味剤、流動促進剤、ゲル化剤、造粒剤、保潤剤、滑沢剤、粘膜付着剤、軟膏基剤、軟膏、油脂性ビヒクル、有機基剤、香錠基剤、色素、可塑剤、光沢剤、保存剤、封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定化剤、坐剤基材、表面活性剤、界面活性剤、懸濁剤、甘味剤、治療剤、濃稠化剤、等張化剤、毒性薬剤、増粘剤、吸水性薬剤、水混和性共溶媒、水軟化剤、または湿潤剤が挙げられる。例えば、参照によりその全体が組み込まれるＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２０００）を参照のこと。参照によりその全体が組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）。

様々な態様では、医薬組成物は、用いられる投与量及び濃度にてレシピエントに無毒性である製剤材料を含む。具体的な実施形態では、活性物質、及び１つ以上の薬学的に許容される塩、ポリオール、界面活性剤、浸透圧平衡維持剤、等張化剤、抗酸化剤、抗生物質、抗真菌剤、増量剤、凍結乾燥保護剤、消泡剤、キレート剤、保存剤、着色剤、鎮痛薬、または追加の医薬剤を含む医薬組成物。様々な態様では、医薬組成物は、１つ以上のポリオール及び／または１つ以上の界面活性剤を含み、任意選択で、その他に１つ以上の添加剤を含み、これには、薬学的に許容される塩、浸透圧平衡維持剤（等張化剤）、抗酸化剤、抗生物質、抗真菌剤、増量剤、凍結乾燥保護剤、消泡剤、キレート剤、保存剤、着色剤、及び鎮痛薬が含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、医薬組成物は、組成物の、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、澄明性、色、等張性、臭い、無菌性、安定性、溶出もしくは放出の速度、吸着、または浸透を、変更、維持もしくは保存するための製剤材料を含有することができる。そのような実施形態では、好適な製剤材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン等）；抗菌薬；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム等）；緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸等）；増量剤（マンニトールまたはグリシン等）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等）；錯化剤（カフェイン、ポルビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリン等）；賦形剤；単糖；二糖；及び他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリン等）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン等）；着色剤、矯味剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポルビニルピロリドン等）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウム等）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素等）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトール等）；懸濁剤；界面活性剤もしくは湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０等のポリソルベート、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）等）；安定性向上物質（スクロースまたはソルビトール等）；等張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール等）；送達ビヒクル；希釈剤；添加剤及び／または医薬アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ‘Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８″ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと。

医薬組成物は、生理学的に適合性のあるｐＨを達成するよう製剤化することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物のｐＨは、例えば、約４もしくは約５から約８．０の間、または約４．５から約７．５の間、または約５．０から約７．５の間であり得る。様々な実施形態では、医薬組成物のｐＨは５．５～７．５である。

本開示は、医薬組成物を生産する方法を提供する。様々な態様では、方法は、抗原結合タンパク質、複合体、融合タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、またはそれらの組み合わせと、薬学的に許容される担体、希釈剤、もしくは添加剤とを合わせることを含む。

投与経路

本開示に関して、活性物質、またはそれを含む医薬組成物は、任意の好適な投与経路を介して対象に投与され得る。例えば、活性物質は、非経口投与、経鼻投与、経口投与、経肺投与、局所投与、膣内投与、または直腸内投与で対象に投与され得る。投与経路に関する以下の考察は、様々な実施形態を例示するために提供されるにすぎず、どのような形でも範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

非経口投与に好適な製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び意図されるレシピエントの血液と等張性の製剤にする溶質を含有することができる、水性及び非水性の等張性無菌注射液、ならびに、懸濁剤、可溶化剤、濃稠化剤、安定化剤、及び保存剤が含まれ得る、水性及び非水性無菌懸濁剤が含まれる。用語「非経口」とは、消化管を介してではなく、皮下、筋肉内、脊髄内、または静脈内等の何らかの他の経路を介することを意味する。本開示の活性物質は、無菌の液体または液体混合物等の生理学的に許容される希釈剤の入った医薬担体を用いて投与することができ、これには、水、生理食塩水、水性デキストロースと関連糖溶液、エタノールもしくはヘキサデシルアルコール等のアルコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール等のグリコール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、２，２－ジメチル－ｌ５３－ジオキソラン－４－メタノール等のケタール、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステルもしくはグリセリド、もしくはアセチル化脂肪酸グリセリド（石けんもしくは洗浄剤等の薬学的に許容される界面活性剤の付加の有無を問わない）、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、もしくはカルボキシルメチルセルロース等の懸濁剤、または乳化剤、及び他の医薬アジュバントが含まれる。

非経口製剤に使用することができる油としては、石油、動物、植物、または合成油が挙げられる。油の具体例としては、ピーナツ、大豆、ゴマ、綿実、トウモロコシ、オリーブ、ワセリン、及びミネラルが挙げられる。非経口製剤での使用のための好適な脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは、好適な脂肪酸エステルの例である。

非経口製剤での使用のための好適な石けんとしては、脂肪族のアルカリ金属、アンモニウム、及びトリエタノールアミンの塩が挙げられ、好適な洗浄剤としては、（ａ）陽イオン洗浄剤、例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハロゲン化物及びアルキルピリジニウムハロゲン化物等、（ｂ）陰イオン洗浄剤、例えば、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、オレフィン硫酸塩、エーテル硫酸塩、モノグリセリド硫酸塩、及びスルホコハク酸塩等、（ｃ）非イオン性洗浄剤、例えば、脂肪族アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、及びポリオキシエチレンとポリプロピレンの共重合体等、（ｄ）両性洗浄剤、例えば、アルキル－β－アミノプロピオン酸塩、及び２－アルキル－イミダゾリン第四級アンモニウム塩等、ならびに（ｅ）それらの混合物が挙げられる。

いくつかの実施形態での非経口製剤は、約０．５重量％～約２５重量％の本開示の活性物質溶液を含有する。保存剤及び緩衝剤を使用することができる。注射部位の刺激を最小限に抑えるかまたは消失させるために、そのような組成物は、約１２～約１７の親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１つ以上の非イオン性界面活性剤を含有することができる。そのような製剤中の界面活性剤の量は、典型的には約５重量％～約１５重量％の範囲である。好適な界面活性剤としては、ソルビタンモノオレアート等のポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、及びプロピレンオキシドとプロピレングリコールの縮合により形成される、疎水性塩基を持つエチレンオキシドの高分子量付加物が挙げられる。いくつかの態様での非経口製剤は、アンプル及びバイアル等の単回用量または多回用量の密封容器に入っており、注射用の無菌液体添加剤、例えば、水を使用直前に加えるだけで済むフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。いくつかの態様での用時注射用の溶液及び懸濁液は、先に記載した種類の無菌粉末、顆粒及び錠剤から調製される。

注射用製剤は本願開示に従っている。注射用組成物用の有効な医薬担体のための要件は、当業者に周知である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ ２３８－２５０（１９８２）、及びＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ．，ｐａｇｅｓ ６２２－６３０（１９８６）を参照のこと）。

投与量

開示の活性物質は、腫瘍増殖を阻害する方法、ならびにがんを治療または予防する方法を含めた、本明細書で詳述されるような他の方法において有用であると考えられている。開示に関する目的の場合、投与される活性物質の量または用量は、妥当な時間枠にわたり、対象または動物における効果、例えば、治療反応もしくは予防的反応にとって十分であるべきである。例えば、本開示の活性物質の用量は、投与時から、約１～４分、１～４時間、または１～４週間、またはそれ以上の期間、例えば、５～２０週間、もしくはそれ以上の週の期間に、本明細書に記載されるがんを治療するのに十分であるべきである。特定の実施形態では、時間的期間はより長くなる場合もあり得る。用量は、特定の活性物質の有効性及び動物（例えば、ヒト）の状態、ならびに処置されるべき動物（例えば、ヒト）の体重により決定される。

投与用量を決定するための多くのアッセイが当該技術分野で公知である。ここでの目的の場合、群ごとに異なる用量の活性物質が投与される哺乳類の群間で、哺乳類に対する所定用量の本開示の活性物質投与時にがんが治療される程度を比較することを含むアッセイであれば、哺乳類に投与されるべき開始用量を決定するために使用可能と考えられる。特定用量の投与時にがんが治療される程度は、例えば、マウス異種移植モデルでの活性物質により達成された腫瘍退縮の程度により表すことができる。腫瘍退縮を評価する方法は当該技術分野で公知であり、本明細書において実施例で記載されている。

本開示の活性物質の用量はまた、本開示の特定の活性物質の投与に伴い得ると考えられる任意の有害な副作用の存在、性質及び程度により決定される。典型的には、年齢、体重、全体的健康状態、食事、性別、投与されるべき本開示の活性物質、投与経路、及び治療される状態の重症度等、様々な因子を考慮に入れて、主治医が、各個々の患者を治療するための本開示の活性物質の投与量を決定する。本開示を制限することは意図せずに、例としては、本開示の活性物質の用量は、約０．０００１～約１ｇ／ｋｇ体重（治療される対象の体重）／日、約０．０００１～約０．００１ｇ／ｋｇ体重／日、または約０．０１ｍｇ～約１ｇ／ｋｇ体重／日であり得る。

放出制御製剤

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性物質は、デポ形態に変更して、本開示の活性物質が、それを投与した体内に放出される様式が時間及び体内の位置に関して制御されるようにすることができる（例えば、米国特許第４，４５０，１５０号を参照のこと）。本開示の活性物質のデポ形態は、例えば、活性物質と、ポリマー等の多孔性または非多孔性材料とを含む植え込み型組成物であり得、活性物質は、かかる材料により封入されるか、あるいは材料全体にわたり拡散される、及び／または非多孔性材料の分解を通じて拡散される。次いで、デポは、対象の体内の所望の位置に植え込まれ、植え込み錠から活性物質が所定の速度で放出される。

特定の態様での、活性物質を含む医薬組成物は、任意の種類のインビボ放出プロファイル有するよう修飾される。いくつかの態様では、医薬組成物は、速放型放出、制御放出、徐放、持続放出、遅延放出、または二相性放出の製剤である。放出制御用ペプチドを製剤化する方法は当該技術分野で公知である。例えば、Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ ３７４：４６－５２（２００９）ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２００８／１３０１５８号、第ＷＯ２００４／０３３０３６号、第ＷＯ２０００／０３２２１８号、及び第ＷＯ１９９９／０４０９４２号を参照のこと。

本組成物はさらに、例えば、ミセルもしくはリポソーム、または他の一部の封入形態を含むことができ、また、長期の貯蔵及び／または送達効果が得られるよう持続放出形態で投与することもできる。

使用

本開示の抗原結合タンパク質は、腫瘍増殖を阻害するのに有用である。特定の理論に拘束されることなく、本明細書で提供される抗原結合タンパク質の阻害作用により、そのような実体ががんを治療する方法において有用となる。

したがって、本明細書では、対象における腫瘍増殖を阻害する方法及び対象における腫瘍サイズを縮小する方法を提供する。様々な実施形態では、方法は、本開示の医薬組成物を、対象における腫瘍増殖を阻害するかまたは腫瘍サイズを縮小するのに有効な量で対象に投与することを含む。様々な態様では、卵巣腫瘍、メラノーマ腫瘍、膀胱腫瘍、または子宮内膜腫瘍の増殖が阻害される。様々な態様では、卵巣腫瘍、メラノーマ腫瘍、膀胱腫瘍、または子宮内膜腫瘍のサイズが縮小される。

本明細書で使用される場合、用語「阻害する」または「縮小」及びそこから生じる語は、１００％または完全な阻害または低減でない場合がある。むしろ、潜在的な有益性または治療効果を有するとして当業者が認識する阻害または縮小の程度は様々である。これに関し、本開示の抗原結合タンパク質は、任意の量またはレベルまで腫瘍増殖を阻害するかまたは腫瘍サイズを縮小し得る。様々な実施形態では、本開示の方法により提供される阻害は、約または少なくとも１０％阻害（例えば、約または少なくとも２０％阻害、約または少なくとも３０％阻害、約または少なくとも４０％阻害、約または少なくとも５０％阻害、約または少なくとも６０％阻害、約または少なくとも７０％阻害、約または少なくとも８０％阻害、約または少なくとも９０％阻害、約または少なくとも９５％阻害、約または少なくとも９８％阻害）である。様々な実施形態では、本開示の方法により提供される低減は、約または少なくとも１０％縮小（例えば、約または少なくとも２０％縮小、約または少なくとも３０％縮小、約または少なくとも４０％縮小、約または少なくとも５０％縮小、約または少なくとも６０％縮小、約または少なくとも７０％縮小、約または少なくとも８０％縮小、約または少なくとも９０％縮小、約または少なくとも９５％縮小、約または少なくとも９８％縮小）である。

本明細書ではさらに、がん、例えば、ＣＬＤＮ６発現がんを有する対象を治療する方法を提供する。様々な実施形態では、方法は、本開示の医薬組成物を、対象におけるがんを治療するのに有効な量で対象に投与することを含む。

ここでの目的の場合、本明細書に開示される方法のがんは、例えば、リンパ系または血流を介して体の他の部分に広がり得る異常かつ制御されない細胞分裂によって生じる任意の悪性増殖または腫瘍等、あらゆるがんであり得る。いくつかの態様でのがんは、急性リンパ性癌、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨癌、脳腫瘍、乳癌、肛門、肛門管、または肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢、または胸膜のがん、鼻、鼻腔、または中耳のがん、口腔のがん、外陰のがん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性のがん、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、肝癌、肺癌、悪性中皮腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵癌、腹膜、大網、及び腸間膜のがん、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌（例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ））、小腸癌、軟組織のがん、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、及び膀胱癌からなる群から選択されるがんである。特定の態様では、がんは、頭頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌及び食道癌、膵臓癌、消化管癌、胃癌、乳癌、子宮内膜癌及び大腸癌、肝細胞癌、膠芽腫、膀胱癌、肺癌、例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、細気管支肺胞上皮癌からなる群から選択される。様々な態様では、がんは、卵巣癌、メラノーマ、膀胱癌、肺癌、肝癌、子宮内膜癌である。様々な態様では、がんは、ＣＬＤＮ６の中～高発現により特徴付けられる任意のがんである。例えば、図１～図３を参照のこと。様々な態様では、がんは、急性骨髄性白血病、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、胃癌、前立腺癌、メラノーマ、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌、乳癌、腎明細胞癌、頭頸部癌、肉腫、腎臓の嫌色素性のがん、低悪性度神経膠腫、副腎皮質癌、膠芽腫、乳頭状腎細胞癌、肺扁平上皮癌、甲状腺癌、肺腺癌、膵癌、卵巣類内膜癌、子宮癌肉腫、または卵巣癌である。様々な態様では、がんは、卵巣癌、類内膜癌、子宮癌、肺癌、胃癌、乳癌頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、子宮頸癌、及び膀胱癌から選択される。

本明細書で使用される場合、用語「治療する」、及びそれに関連する語は、必ずしも１００％または完全な治療を意味しない。むしろ、潜在的な有益性または治療効果を有するとして当業者が認識する治療の程度は様々である。これに関し、本開示のがんを治療する方法では、いかなる量またはいかなるレベルの治療も提供することができる。さらに、本開示の方法により提供される治療には、治療されるがんの１つ以上の状態または症状または徴候の治療が含まれ得る。また、本開示の方法により提供される治療は、がんの進行を減速させることも包含し得る。例えば、方法は、Ｔ細胞活性またはがんに対する免疫応答を増強させる、腫瘍またはがんの増殖を抑制する、腫瘍細胞の転移を低減する、腫瘍またはがんの細胞の細胞死を増大させる等の点で、がんを治療することができる。様々な態様では、方法は、がんの発症または再発を少なくとも１日、２日、４日、６日、８日、１０日、１５日、３０日、２か月、３か月、４か月、６か月、１年、２年、３年、４年、またはそれ以上遅延させることにより治療する。様々な態様では、方法は、対象の生存を延長させることにより治療する。

本開示の抗原結合タンパク質はまた、試料中のＣＬＤＮ６を検出するため、またはＣＬＤＮ６陽性がんを診断するためにも使用され得る。したがって、本開示は、試料中のクローディン６（ＣＬＤＮ６）を検出する方法を提供する。様々な実施形態では、方法は、試料と、抗原結合タンパク質、複合体、または融合タンパク質とを本明細書に記載されるように接触させること、及びＣＬＤＮ６に結合している抗原結合タンパク質、複合体または融合タンパク質を含む免疫複合体について評価することを含む。本開示はまた、対象のクローディン６（ＣＬＤＮ６）陽性のがんを診断する方法も提供する。様々な実施形態では、方法は、対象から取得した細胞または組織を含む生体試料と、抗原結合タンパク質、複合体、または融合タンパク質とを本明細書に記載されるように接触させること、及びＣＬＤＮ６に結合している抗原結合タンパク質、複合体または融合タンパク質を含む免疫複合体について評価することを含む。

対象

本開示のいくつかの実施形態では、対象は哺乳類であり、これには、マウス及びハムスター等のげっ歯目の哺乳類、ならびにウサギ等のウサギ目の哺乳類、ネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ）を含む食肉目からの哺乳類、ウシ科（雌ウシ）及びイノシシ科（ブタ）偶蹄目からの哺乳類、またはウマ科（ウマ）を含む奇蹄目の哺乳類が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、哺乳類は、霊長目の哺乳類、オマキザル上科、もしくはＳｉｍｏｉｄ（サル）または真猿亜目の哺乳類（ヒト及び類人猿）である。いくつかの態様では、哺乳類はヒトである。

キット

いくつかの実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質はキットで提供される。様々な態様では、キットは、抗原結合タンパク質（複数可）を単位用量として含む。ここでの目的の場合、「単位用量」とは、好適な担体中に分散されている個別の量を指す。様々な態様では、単位用量は、対象に所望の効果、例えば、腫瘍増殖の阻害、腫瘍サイズの縮小、がんの治療を提供するのに十分な量である。したがって、本明細書では、任意選択で単位用量で提供される本開示の抗原結合タンパク質を含むキットを提供する。様々な態様では、キットは、いくつかの単位用量、例えば、単位用量の１週間分または１か月分を含み、任意選択で、その各々が個包装されているか、そうでなければ他の単位用量と区別されているものを含む。いくつかの実施形態では、キット／単位用量の構成要素は、患者への投与のための指示書と共に包装されている。いくつかの実施形態では、キットは、患者への投与用の１つ以上のデバイス、例えば、針及びシリンジ等を含む。いくつかの態様では、本開示の抗原結合タンパク質、その薬学的に許容される塩、抗原結合タンパク質を含む複合体、または抗原結合タンパク質を含む多量体もしくは二量体は、即時使用形態、例えば、シリンジ、静注用バッグ等に包装済みである。いくつかの態様では、キットはさらに、本明細書に記載されているものを含め、他の治療用もしくは診断用薬または薬学的に許容される担体（例えば、溶媒、緩衝液、希釈液等）を含む。特定の態様では、キットは、本開示の抗原結合タンパク質を、化学療法または放射線療法で使用される薬剤、例えば、治療剤と共に含む。

様々な実施形態

本開示の様々な実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質（配列番号２００）及び第２の抗原に結合し、（ａ）抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の細胞外ループ２（ＥＬ２）に結合し、ＣＬＤＮ６のＥＣＤの細胞外ループ１（ＥＬ１）には結合しないか、または（ｂ）クローディン３（ＣＬＤＮ３）、クローディン４（ＣＬＤＮ４）、及びクローディン９（ＣＬＤＮ９）のいずれにも結合せず、ＯＶＣＡ４２９細胞により内因的に発現されるＣＬＤＮ６への参照抗体の結合を約１２００ｎＭ未満で阻害するか、または（ｃ）その組み合わせである。様々な場合には、二重特異性抗原結合タンパク質は、ＷＴＡＨＡＩＩＲＤＦＹＮＰＬＶＡＥＡＱＫＲＥＬのアミノ酸配列（配列番号２）内のエピトープに結合するか、またはＣＬＤＮ６のＴＡＨＡＩＩＲＤＦＹＮＰＬのアミノ酸配列（配列番号３）もしくはＬＶＡＥＡＱＫＲＥＬのアミノ酸配列（配列番号４）に結合する。様々な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、クローディン３（ＣＬＤＮ３）、クローディン４（ＣＬＤＮ４）、及びクローディン９（ＣＬＤＮ９）のうちの１つにも複数にも結合しない。様々な場合には、二重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ３に結合しない。様々な場合には、二重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ４、及びＣＬＤＮ９に結合するが、ＣＬＤＮ３には結合しない。様々な場合には、二重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ４に結合するが、ＣＬＤＮ３またはＣＬＤＮ９には結合しない。様々な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９に結合するが、ＣＬＤＮ３またはＣＬＤＮ４には結合しない。

様々な場合には、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、ＯＶＣＡ４２９細胞により内因的に発現されるＣＬＤＮ６への参照抗体の結合を約１２００ｎＭ未満で阻害し、参照抗体は、配列番号１８１の軽鎖可変配列及び配列番号１８２の重鎖可変配列または配列番号１８５の軽鎖可変配列及び配列番号１８６の重鎖可変配列を含む。様々な態様では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、ＯＶＣＡ４２９細胞により内因的に発現されるＣＬＤＮ６への参照抗体の結合を１０００ｎＭ未満もしくは７５０ｎＭ未満（例えば、５００ｎＭ未満、２５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満）で阻害し、参照抗体は、配列番号１８１の軽鎖可変配列及び配列番号１８２の重鎖可変配列または配列番号１８５の軽鎖可変配列及び配列番号１８６の重鎖可変配列を含む。

様々な実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、（ａ）表ＡまたはＡ１に記載の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、もしくは配列番号１１、１７、２３、２９、３５、４１、４７、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、４５２、４５５、４６１、４６５、及び４７２からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、約または少なくとも８５％、約または少なくとも９０％）の配列同一性を有するもの、（ｂ）表ＡまたはＡ１に記載の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、もしくは配列番号１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、８６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、４７５、４５６、４６２、４６６、４６８、及び４７３からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、約または少なくとも８５％、約または少なくとも９０％）の配列同一性を有するもの、（ｃ）表ＡまたはＡ１に記載の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、もしくは配列番号１３、１９、２５、３１、３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、４５３、４５７、４６３、４６７、４６９、及び４７４からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、約または少なくとも８５％、約または少なくとも９０％）の配列同一性を有するもの、（ｄ）表ＡまたはＡ１に記載の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、もしくは配列番号８、１４、２０、３２、３８、４４、５０、５６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、４４９、４７６、４５８、４６４、及び４７０からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、約または少なくとも８５％、約または少なくとも９０％）の配列同一性を有するもの、（ｅ）表ＡまたはＡ１に記載の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、もしくは配列番号９、１５、２１、２７、３３、３９、４５、５１、５７、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、４５０、４７７、４５９、及び４７１からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、約または少なくとも８５％、約または少なくとも９０％）の配列同一性を有するもの、（ｆ）表ＡまたはＡ１に記載の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、もしくは配列番号１０、１６、２２、２８、３４、４０、４６、５２、５８、６４、７０、７６、８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、４５１、４５４、及び４６０からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、約または少なくとも８５％、約または少なくとも９０％）の配列同一性を有するもの、（ｇ）（ａ）～（ｆ）のうちいずれか２つ以上の組み合わせ、を含む。

様々な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、表ＡまたはＡ１に記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列と、表ＡまたはＡ１に記載の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの１つまたは２つとを含む。場合によっては、二重特異性抗原結合タンパク質は、表ＡまたはＡ１に記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列と、表ＡまたはＡ１に記載の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの１つまたは２つとを含む。様々な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、（ａ）配列番号７４～７９、（ｂ）配列番号５０～５５、（ｃ）配列番号１２２～１２７、（ｄ）配列番号２６～３１、（ｅ）配列番号１２８～１３３、（ｆ）配列番号３８～４３、（ｇ）配列番号６２～６７、（ｈ）配列番号８０～８５、（ｉ）配列番号４４～４９、（ｊ）配列番号８６～９１、（ｋ）配列番号１０４～１０９、（ｌ）配列番号５６～６１、（ｍ）配列番号３２～３７、（ｎ）配列番号１１０～１１５、（ｏ）配列番号９８～１０３、（ｐ）配列番号９２～９７、（ｑ）配列番号１１６～１２１、（ｒ）配列番号８～１３、（ｔ）配列番号６８～７３、（ｕ）配列番号１４～１９、（ｖ）配列番号２０～２５、（ｖ）配列番号４４９～４５３及び４７５、（ｗ）配列番号４７６～４７７、４５４～４５７、（ｘ）配列番号４５８～４６３、（ｙ）配列番号５７、５８、４６４～４６７、（ｚ）配列番号６８～７１及び４６８～４６９、ならびに（ａａ）配列番号１１２、及び４７０～４７４からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む。様々な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、（ａ）表Ｂに記載の重鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは配列番号１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、及び１７５からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、約または少なくとも８５％、約または少なくとも９０％）の配列同一性を有するもの、または（ｂ）表Ｂに記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは配列番号１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、及び１７６からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％（例えば、約または少なくとも８５％、約または少なくとも９０％）の配列同一性を有するもの、または（ａ）と（ｂ）の両方、を含む。様々な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、（ａ）配列番号１５６と１５７、（ｂ）配列番号１４８と１４９、（ｃ）配列番号１７２と１７３、（ｄ）配列番号１４０と１４１、（ｅ）配列番号１７４と１７５、（ｆ）配列番号１４４と１４５、（ｇ）配列番号１５２と１５３、（ｈ）配列番号１５８と１５９、（ｉ）配列番号１４６と１４７、（ｊ）配列番号１６０と１６１、（ｋ）配列番号１６６と１６７、（ｌ）配列番号１５０と１５１、（ｍ）配列番号１４２と１４３、（ｎ）配列番号１６８と１６９、（ｏ）配列番号１６４と１６５、（ｐ）配列番号１６２と１６３、（ｑ）配列番号１７０と１７１、（ｒ）配列番号１３４と１３５、（ｓ）配列番号１５４と１５５、（ｔ）配列番号１３６と１３７、及び（ｕ）配列番号１３８と１３９からなる群から選択される１対のアミノ酸配列を含む。

様々な実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、（ａ）表Ｂ１またはＣに記載の重鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは配列番号３７６～３７９、３８４～３８７、３９１－３９６、４０３～４０８、４１２、４１３、４１６～４１９、４２２～４２７、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、及び４８８からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％、もしくは約８０％、もしくは約９０％、もしくは約９５％の配列同一性を有するもの、または（ｂ）表Ｂ１またはＣに記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは配列番号３８０～３８３、３８８～３９０、３９７～４０２、４０９～４１１、４１４、４１５、４２０、４２１、及び４７９、４８１、４８３、４８５、４８７、及び４８９からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％、もしくは約８０％、もしくは約９０％、もしくは約９５％の配列同一性を有するもの、または（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方、を含む。様々な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、表Ｄに記載されている１対のアミノ酸配列を含む。

本開示は、（Ａ）ＨＣ ＣＤＲ１であって、ＹＴＦＴＸＹＴのアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘは、Ｔ、Ｖ、Ｄ、またはＳ（配列番号４５２）であり、任意選択で、ＹＴＦＴＴＹＴのアミノ酸配列（配列番号１１）を含む、ＨＣ ＣＤＲ１、（Ｂ）ＨＣ ＣＤＲ２であって、ＩＸＰＳＳＧＹＴのアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘは、Ｑ、Ｓ、Ａ、またはＮ（配列番号４７５）であり、任意選択で、ＩＮＰＳＳＧＹＴのアミノ酸配列（配列番号１２）配列を含む、ＨＣ ＣＤＲ２、（Ｃ）ＨＣ ＣＤＲ３であって、ＡＸＧＤＹＹＶＡＹのアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘは、Ｎ、Ｑ、Ｈ、またはＤ（配列番号４５３）であり、任意選択で、ＡＮＧＤＹＹＶＡＹのアミノ酸配列（配列番号１３）を含む、ＨＣ ＣＤＲ３、（Ｄ）ＬＣ ＣＤＲ１であって、ＳＳＶＳＳＸＹのアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘは、Ｔ、Ｖ、Ｆ、またはＤ（配列番号４４９）であり、任意選択で、ＳＳＶＳＳＴＹのアミノ酸配列（配列番号８）を含む、ＬＣ ＣＤＲ１、（Ｅ）ＬＣ ＣＤＲ２であって、ＸＴＸのアミノ酸配列を含み、ここで、１位のＸは、Ｓ、Ｔ、Ｑ、またはＡであり、３位のＸは、Ｓ、Ｔ、Ｄ、またはＱであり（配列番号４５０）、任意選択で、ＳＴＳのアミノ酸配列（配列番号９）を含む、ＬＣ ＣＤＲ２、及び（Ｆ）ＬＣ ＣＤＲ３であって、ＨＸＹＸＲＳＰＬＴのアミノ酸配列を含み、ここで、２位のＸは、Ｑ、Ｈ、またはＳであり、４位のＸは、Ｈ、Ｙ、Ｑ、またはＳであり（配列番号４５１）、任意選択で、ＨＱＹＨＲＳＰＬＴのアミノ酸配列（配列番号１０）を含む、ＬＣ ＣＤＲ３、を含む二重特異性抗原結合タンパク質を提供する。

二重特異性抗原結合タンパク質が提供され、これは、（Ａ）ＨＣ ＣＤＲ１であって、ＦＴＦＳＸＹＸのアミノ酸配列を含み、ここで、５位のＸは、Ｎ、Ｓ、Ｒ、Ｑ、またはＡであり、７位のＸは、Ｗ、Ｈ、Ｙ、Ｆであり（配列番号４５５）、任意選択で、ＦＴＦＳＮＹＷのアミノ酸配列（配列番号２３）を含む、ＨＣ ＣＤＲ１、（Ｂ）ＨＣ ＣＤＲ２であって、ＩＲＬＫＸＤＸＹＡＴのアミノ酸配列を含み、ここで、５位のＸは、Ｓ、Ｎ、Ａ、またはＴであり、７位のＸは、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｎであり（配列番号４５６）、任意選択で、ＩＲＬＫＳＤＮＹＡＴのアミノ酸配列（配列番号２４）を含む、ＨＣ ＣＤＲ２、（Ｃ）ＨＣ ＣＤＲ３であって、ＸＤＧＰＰＳＧＸのアミノ酸配列を含み、ここで、１位のＸは、Ｎ、Ｄ、またはＴであり、８位のＸは、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｃ、またはＹであり（配列番号４５７）、任意選択で、ＮＤＧＰＰＳＧＣのアミノ酸配列（配列番号２５）を含む、ＨＣ ＣＤＲ３、（Ｄ）ＬＣ ＣＤＲ１であって、ＥＸＩＹＳＹのアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘは、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｄ、またはＮ（配列番号４７６）であり、任意選択で、ＥＮＩＹＳＹのアミノ酸配列（配列番号２０）を含む、ＬＣ ＣＤＲ１、（Ｅ）ＬＣ ＣＤＲ２であって、ＸＡＫのアミノ酸配列を含み、ここで、１位のＸは、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｄ、またはＮであり（配列番号４７７）、任意選択で、ＮＡＫのアミノ酸配列（配列番号２１）を含む、ＬＣ ＣＤＲ２、及び（Ｆ）ＬＣ ＣＤＲ３であって、ＱＸＨＹＸＶＰＷＴのアミノ酸配列を含み、ここで、２位のＸは、Ｈ、Ｑ、Ｓ、またはＴであり、５位のＸは、Ｔ、Ｓ、Ｎ、またはＧであり（配列番号４５４）、任意選択で、ＱＨＨＹＴＶＰＷＴのアミノ酸配列（配列番号２２）を含む、ＬＣ ＣＤＲ３、を含む。

二重特異性抗原結合タンパク質が提供され、これは、（Ａ）ＨＣ ＣＤＲ１であって、ＹＴＸＴＸＹＴのアミノ酸配列を含み、ここで、３位のＸは、Ｆ、Ｙ、Ｓ、またはＴであり、５位のＸは、Ｓ、Ｔ、Ｙ、またはＤであり（配列番号４６１）、任意選択で、ＹＴＦＴＳＹＴのアミノ酸配列（配列番号２９）を含む、ＨＣ ＣＤＲ１、（Ｂ）ＨＣ ＣＤＲ２であって、ＩＸＰＳＳＸＹＴのアミノ酸配列を含み、ここで、２位のＸは、Ｑ、Ｓ、Ａ、またはＮであり、６位のＸは、Ｔ、Ｓ、Ｖ、Ｄ、またはＧであり（配列番号４６２）、任意選択で、ＩＮＰＳＳＴＹＴのアミノ酸配列（配列番号３０）を含む、ＨＣ ＣＤＲ２、（Ｃ）ＨＣ ＣＤＲ３であって、ＸＲＧＥＸＧＧＦＡＹのアミノ酸配列を含み、ここで、１位のＸは、Ｓ、Ａ、Ｔ、またはＶであり、５位のＸは、Ｌ、Ｖ、またはＦであり（配列番号４６３）、任意選択で、ＳＲＧＥＬＧＧＦＡＹのアミノ酸配列（配列番号３１）を含む、ＨＣ ＣＤＲ３、（Ｄ）ＬＣ ＣＤＲ１であって、ＱＳＬＶＨＳＸＧＸＴＹのアミノ酸配列を含み、ここで、７位のＸは、Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ、Ｓ、またはＡであり、９位のＸは、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｄ、またはＮであり（配列番号４５８）、任意選択で、ＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹのアミノ酸配列（配列番号２６）を含む、ＬＣ ＣＤＲ１、（Ｅ）ＬＣ ＣＤＲ２であって、ＸＶＸのアミノ酸配列を含み、ここで、１位のＸは、Ｋ、Ｑ、またはＲであり、３位のＸは、Ｓ、Ｔ、またはＶであり（配列番号４５９）、任意選択で、ＫＶＳのアミノ酸配列（配列番号２７）を含む、ＬＣ ＣＤＲ２、及び（Ｆ）ＬＣ ＣＤＲ３であって、ＳＸＸＴＨＶＰＹＴのアミノ酸配列を含み、ここで、２位のＸは、Ｑ、Ｈ、またはＴであり、３位のＸは、Ｓ、Ｇ、Ｔ、またはＤであり（配列番号４６０）、任意選択で、ＳＱＳＴＨＶＰＹＴのアミノ酸配列（配列番号２８）を含む、ＬＣ ＣＤＲ３、を含む。

様々な実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、以下を含む。
（ａ）配列番号５０４もしくは配列番号５０７の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
（ｂ）配列番号５０５もしくは配列番号５０８の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
（ｃ）配列番号５０６もしくは配列番号５０９の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
（ｄ）配列番号４４９もしくは配列番号４７６の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
（ｅ）配列番号４５０もしくは配列番号４７７の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
（ｆ）配列番号４５１もしくは配列番号４５４の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
（ｇ）（ａ）～（ｆ）のうちいずれか２つ以上の組み合わせ。

任意選択で、変異配列は、少なくとも約８０％、約もしくは少なくとも８５％、約もしくは少なくとも９０％または約もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。

例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、配列番号４４９の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号４５０、及び軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号４５１と、配列番号５０４の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号５０５、及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号５０６のうちの１つまたは２つとを含む。様々な場合には、抗原結合タンパク質は、配列番号４７６の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号４７７、及び軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号４５４と、配列番号５０７の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号５０８、及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号５０９のうちの１つまたは２つとを含む。任意選択で、抗原結合タンパク質は、配列番号４４９～４５１及び５０４～５０６、ならびに配列番号４７６、４７７、４５４及び５０７～５０９からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む。

例示的態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、（ａ）配列番号４９０～５０３のうちのいずれか１つの重鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは図２２でＳ１～Ｓ１２として表示されている重鎖可変領域アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または（ｂ）配列番号３８０～３８３、３８８～３９０、４７９、及び４８１のうちのいずれか１つの軽鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは図２２でＳ１～Ｓ１２として表示されている軽鎖可変領域アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方、を含む。いくつかの態様では、変異配列は少なくとも約８０％もしくは少なくとも約８５％の配列同一性を有するか、または変異配列は少なくとも約９０％もしくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する。

例示的場合には、二重特異性抗原結合タンパク質は、以下の１対のアミノ酸配列を含む。
配列番号３８９と４９０、
配列番号３８９と４９１、
配列番号３８９と４９２、
配列番号３８９と４９３、
配列番号３８９と４９４、
配列番号３８９と４９５、
配列番号３８３と４９６、
配列番号３８３と４９７、
配列番号３８３と４９８、
配列番号３８３と４９９、
配列番号３８３と５００、
配列番号３８３と５０１、
配列番号３８３と５０３、
配列番号３８９と５０２、
図２２でＳ１として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ１として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ２として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ２として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ３として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ３として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ４として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ４として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ５として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ５として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ６として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ６として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ７として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ７として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ８として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ８として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ９として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ９として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ１０として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ１０として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ１１として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ１１として表示されている軽鎖可変領域の配列、または
図２２でＳ１２として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ１２として表示されている軽鎖可変領域の配列。

いくつかの態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、抗体、例えば、モノクローナル抗体である。様々な態様では、抗体は、ＩｇＧである。任意選択で、抗原結合タンパク質は、軟寒天３Ｄ増殖アッセイにおいて少なくとも約５０％のコロニー増殖を阻害するか、ヒトがん細胞を注射された異種移植マウスにおいて腫瘍増殖を阻害するか、卵巣癌細胞、メラノーマがん細胞、膀胱癌細胞、もしくは子宮内膜癌細胞を注射された異種移植マウスにおいて腫瘍増殖を阻害するか、または卵巣癌細胞、膀胱癌細胞、もしくは子宮内膜癌細胞を注射された異種移植マウスにおいて少なくとも５０％の腫瘍増殖を阻害する。

したがって、様々な実施形態では、本開示は、以下を含む二重特異性抗原結合タンパク質を提供する。
（ａ）配列番号５０４もしくは配列番号５０７の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
（ｂ）配列番号５０５もしくは配列番号５０８の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
（ｃ）配列番号５０６もしくは配列番号５０９の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
（ｄ）配列番号４４９もしくは配列番号４７６の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
（ｅ）配列番号４５０もしくは配列番号４７７の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
（ｆ）配列番号４５１もしくは配列番号４５４の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
（ｇ）（ａ）～（ｆ）のうちいずれか２つ以上の組み合わせ。

また、配列番号４４９～４５１及び５０４～５０６、ならびに配列番号４７６、４７７、４５４及び５０７～５０９からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む二重特異性抗原結合タンパク質も提供される。

本開示は、以下を含む二重特異性抗原結合タンパク質を提供する。
（ａ）配列番号４９０～５０３のうちのいずれか１つの重鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは図２２でＳ１～Ｓ１２として表示されている重鎖可変領域アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
（ｂ）配列番号３８０～３８３、３８８～３９０、４７９、及び４８１のうちのいずれか１つの軽鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは図２２でＳ１～Ｓ１２として表示されている軽鎖可変領域アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方。

様々な態様では、変異配列は、少なくとも約８５％の配列同一性または約９０％もしくは約９５％の配列同一性を有する。

本開示は、以下からなる群から選択される、１対のアミノ酸配列を含む二重特異性抗原結合タンパク質も提供する。
配列番号３８９と４９０、
配列番号３８９と４９１、
配列番号３８９と４９２、
配列番号３８９と４９３、
配列番号３８９と４９４、
配列番号３８９と４９５、
配列番号３８３と４９６、
配列番号３８３と４９７、
配列番号３８３と４９８、
配列番号３８３と４９９、
配列番号３８３と５００、
配列番号３８３と５０１、
配列番号３８３と５０３、
配列番号３８９と５０２、
図２２でＳ１として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ１として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ２として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ２として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ３として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ３として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ４として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ４として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ５として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ５として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ６として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ６として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ７として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ７として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ８として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ８として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ９として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ９として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ１０として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ１０として表示されている軽鎖可変領域の配列、
図２２でＳ１１として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ１１として表示されている軽鎖可変領域の配列、または
図２２でＳ１２として表示されている重鎖可変領域の配列と図２２でＳ１２として表示されている軽鎖可変領域の配列。

本明細書では、以下を含む二重特異性抗原結合タンパク質を提供する。
（ａ）配列番号５１０もしくは５１３として記載されるかまたは図２３もしくは図２５に記載の重鎖可変領域アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
（ｂ）配列番号５１１もしくは５１２として記載されるかまたは図２４もしくは図２６に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方。

本開示は、１対のアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質も提供し、かかる対は以下を含む。
（ａ）配列番号５１０として記載の重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号５１１として記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１～５個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有し、任意選択で、異なっている１～５個のアミノ酸が、重鎖の場合は図２３に示されているか、もしくは軽鎖の場合は図２４に示されているもの、または
（ｂ）配列番号５１３として記載の重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号５１２として記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１～５個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または任意選択で、異なっている１～５個のアミノ酸が、重鎖の場合は図２５に示されているか、もしくは軽鎖の場合は図２６に示されているもの。

様々な態様では、本願で開示される抗原結合タンパク質は、脱フコシル化グリカンを含むＦｃポリペプチドを含む。

様々な態様では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、抗体、例えば、モノクローナル抗体、例えば、ＩｇＧに基づく。様々な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、軟寒天３Ｄ増殖アッセイにおいて少なくとも約５０％のコロニー増殖を阻害するか、またはヒトがん細胞を注射された異種移植マウスにおいて腫瘍増殖を阻害する。様々な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、卵巣癌細胞、メラノーマがん細胞、膀胱癌細胞、または子宮内膜癌細胞を注射された異種移植マウスにおいて腫瘍増殖を阻害する。様々な場合には、二重特異性抗原結合タンパク質は、卵巣癌細胞、膀胱癌細胞、または子宮内膜癌細胞を注射された異種移植マウスにおいて少なくとも５０％の腫瘍増殖を阻害する。

本開示は、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質と異種部分とを含む複合体を提供する。例示的態様では、複合体は、例えば、本明細書に記載される任意のもの等、細胞毒性薬または化学療法薬を含む。様々な態様での化学療法薬は、チューブリン重合を遮断することにより細胞分裂を阻害する抗有糸分裂剤である。場合によっては、抗有糸分裂剤は、アウリスタチンであり、任意選択でＭＭＡＥである。

本開示は、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質も提供する。本開示はさらに、本開示の抗原結合タンパク質、複合体、または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本開示は、本開示の抗原結合タンパク質、複合体、または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むベクターを提供する。本開示は、本開示の核酸またはベクターを含む宿主細胞を追加で提供する。

本開示は、クローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質に結合する二重特異性抗原結合タンパク質を生産する方法を提供し、（ｉ）細胞培養培地中の本開示の宿主細胞を培養することであって、宿主細胞が、先行請求項のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、培養すること、及び（ｉｉ）細胞培養培地から抗原結合タンパク質を採取すること、を含む。また、クローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質に結合する二重特異性抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質を生産する方法も提供し、（ｉ）細胞培養培地中の本開示の宿主細胞を培養することであって、宿主細胞が、本開示の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、培養すること、及び（ｉｉ）細胞培養培地から融合タンパク質を採取すること、を含む。

本開示はさらに、本開示の、二重特異性抗原結合タンパク質、複合体、融合タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、またはそれらの組み合わせ、及び薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは添加剤を合わせることを含む、医薬組成物を生産する方法を提供する。また、本開示の、二重特異性抗原結合タンパク質、複合体、融合タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、またはそれらの組み合わせと、薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは添加剤とを含む医薬組成物も提供される。

本明細書では、本明細書に記載される医薬組成物を、がんを治療するのに有効な量で対象に投与することを含む、ＣＬＤＮ６発現がんを有する対象を治療する方法が提供される。また、本明細書に記載される医薬組成物を、腫瘍増殖を阻害するのに有効な量で対象に投与することを含む、対象における腫瘍増殖を阻害する方法も提供される。本開示は、対象における腫瘍サイズを縮小させる方法を提供し、本明細書に記載される医薬組成物を、腫瘍サイズを縮小するのに有効な量で対象に投与することを含む。さらに、対象におけるがんの再発を予防する方法を提供し、本明細書に記載される医薬組成物を、がんの再発を予防するのに有効な量で対象に投与することを含む。

本開示は、試料中のクローディン６（ＣＬＤＮ６）を検出する方法を提供し、試料と、本開示の、抗原結合タンパク質、複合体、または融合タンパク質とを接触させること、及びＣＬＤＮ６に結合している抗原結合タンパク質、複合体または融合タンパク質を含む免疫複合体について評価することを含む。また、本明細書では、対象におけるクローディン６（ＣＬＤＮ６）陽性のがんを診断する方法も提供され、対象から取得した細胞または組織を含む生体試料と、本開示の、抗原結合タンパク質、複合体、または融合タンパク質とを接触させること、及びＣＬＤＮ６に結合している抗原結合タンパク質、複合体または融合タンパク質を含む免疫複合体について評価することを含む。

本開示は、ＣＬＤＮ６の低過剰発現個体であると診断された対象におけるがんを治療する方法も提供する。様々な実施形態では、方法は、本願で開示されている医薬組成物を、がんの再発を予防するのに有効な量で対象に投与することを含む。いくつかの態様では、投与することにより、腫瘍細胞にアポトーシスが誘導され、任意選択で、投与することにより、ＣＬＤＮ６発現細胞にアポトーシスが誘導される。様々な態様では、対象は腫瘍を有し、腫瘍は、半定量的に４つの群、すなわち、高発現個体、中程度の発現個体、低発現個体、及び非発現個体のうちの１つに分類される。様々な場合には、高発現個体は、１２ｌｏｇ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ Ｍｉｌｌｉｏｎ（ＦＰＫＭ）を超えるＣＬＤＮ６ ＲＮＡと定義され、ＣＬＤＮ６ ＲＮＡはＲＮＡＳｅｑにより測定されるか、またはＣＬＤＮ６タンパク質レベルが、免疫組織染色（ＩＨＣ）により測定した場合に３＋を超える。様々な場合には、中程度の発現個体は、１０ｌｏｇ ＦＰＫＭより大きいＣＬＤＮ６ ＲＮＡと定義され、ＣＬＤＮ６ ＲＮＡはＲＮＡＳｅｑにより測定されるか、またはＣＬＤＮ６タンパク質レベルが、ＩＨＣにより測定した場合に２＋を超える。様々な場合には、低発現個体は、６ｌｏｇ ＦＰＫＭより大きいＣＬＤＮ６ ＲＮＡと定義され、ＣＬＤＮ６ ＲＮＡはＲＮＡＳｅｑにより測定されるか、またはＣＬＤＮ６タンパク質レベルが、ＩＨＣにより測定した場合に１＋を超える。様々な場合には、非発現個体は、６ｌｏｇ ＦＰＫＭ未満のＣＬＤＮ６ ＲＮＡと定義され、ＣＬＤＮ６ ＲＮＡはＲＮＡＳｅｑにより測定されるか、またはＣＬＤＮ６タンパク質レベルがＩＨＣ検出限界を下回る。様々な態様では、前記腫瘍を有する対象は、ＣＬＤＮ６の高発現個体、中程度の発現個体、低発現個体、または非発現個体として同様に説明される。

以下の実施例は、単に本開示を例示するためだけに提供され、どのような形でもその範囲を制限するためのものではない。

実施例１
本実施例は、各種の細胞供給源及び組織供給源でのＣＬＤＮ６ ＲＮＡレベルの分析を示す。

各種供給源材料でのＣＬＤＮ６の発現についてベースラインを確立するため、患者試料、正常組織、及びＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＴＯＲＬ）により創製された細胞株におけるＣＬＤＮ６発現の発現レベルをアッセイした。

患者試料のＣＬＤＮ６ ＲＮＡのレベルを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）が管理するＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベースに含まれる情報を使用して測定した。正常組織のＣＬＤＮ６レベルを、Ｃｏｍｍｏｎ Ｆｕｎｄが維持するＧｅｎｏｔｙｐｅ－Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥＸ）データベースの情報を使用して測定した。ＧＴＥＸデータベースからの組織分析では、ＣＬＤＮ６が、組織の中でも特に、脳、下垂体、膵臓、腎臓、肺、甲状腺、及び頸部を含めた様々な部位で検出可能であることを示した（図１）。

Ａｇｉｌｅｎｔ ４４Ｋマイクロアレイ（４ｘ４４Ｋアレイチップ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）及びＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）アッセイを使用してＴＯＲＬがん細胞株でＣＬＤＮ６発現レベルを測定した。ＲＮＡＳｅｑは、ＢＧＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）による「定量化のためのＲＮＡＳｅｑ（ＲＮＡＳｅｑ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」サービスを利用し、同社により実施された。図２及び図３に示されるように、卵巣癌、頭頸部癌、肺癌、及び膀胱癌の細胞は、最も高いレベルのＣＬＤＮ６を発現していたが、ＣＬＤＮ６発現レベルは、乳癌、腎臓癌、結腸癌、肉腫及び肝癌の細胞で検出可能であった。

実施例２
本実施例は、ＣＬＤＮ６を過剰発現するよう操作された細胞の生産を示す。

ＣＬＤＮ６を過剰発現するよう操作されたモデルを樹立した。これらのモデルは、実施例５に記載のＣＬＤＮ６抗体の有効性を決定するために使用した。簡単に言えば、ＣＭＶプロモーター、及び脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の減弱化させた配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有するバイシストロン性ベクター内にＣＬＤＮ６をコードするヌクレオチド配列を操作した。ＩＲＥＳは、目的遺伝子（ＧＯＩ）ｃＤＮＡ（ＣＬＤＮ６）とピューロマイシンｃＤＮＡの間に位置させた。ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をピューロマイシンｃＤＮＡの下流に位置させた。ベクターはまた、ＧＦＰマーカー配列またはＭｙｃＤＤＫタグも発現した。ＧＦＰを含有する発現ベクターの配列は、本明細書では配列番号１８９として提供されている。

発現ベクターは、ウイルスによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞（スクリーニング用）及びＮＩＨ３Ｔ３細胞（免疫化用）に形質導入された。正の形質導入細胞を、ピューロマイシン含有培地（１μｇ／ｍｌ）での生存に基づいて選択した。正選択された細胞をサブクローニングして、安定した均一な、ＣＬＤＮ６過剰発現細胞のクローン集団を得た。

サブクローンＣＬＤＮ６の発現は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｃｃｕｒｉ（商標）フローサイトメーター（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で、参照ＣＬＤＮ６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用したフローサイトメトリーにより確認された。二次抗体及び複合体：ヤギ抗マウスＩｇＧ（最小限の交差反応性）抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；カタログ番号４０５３２２）を使用して、参照ＣＬＤＮ６ ｍＡｂとサブクローンにより発現されるＣＬＤＮ６間の結合活性を検出した。

ＣＬＤＮ６の細胞内局在は、ＣＬＤＮ６－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合タンパク質を発現する細胞を用いてＣｅｌｌａｖｉｓｔａ（登録商標）イメージングシステム（Ｓｙｎｅｎｔｅｃ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して蛍光顕微鏡で決定した。図４に示されるように、細胞膜でＧＦＰの蛍光が検出され、ＣＬＤＮ６が細胞膜に局在することを証明している。

実験例３
本実施例は、参照抗体及び対照抗体の生産を示す。

ベンチマーク（基準）のＣＬＤＮ６特異的抗体及び対照抗体は、組換え型マウスＩｇＧ２Ａキメラ抗体を産生するよう抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域をＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）にクローニングすることにより作製した。これらの抗体を、実施例５に記載の新たに作製したＣＬＤＮ６特異的抗体と並行して試験した。

簡単に言えば、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系（カタログ番号：Ａ２９１３３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を製造者の操作手順に従って使用して対照抗体の配列及びベンチマーク抗体の配列を含有するプラスミドをトランスフェクトした。細胞を３７℃、８％ＣＯ_２にて１日目に培養し、次いで、トランスフェクション後はキットで提供されている培地で３２℃、５％ＣＯ_２にて培養した。抗体を、１，０００ｇにて１０分間、次いで５，０００ｇにて３０分間の遠心分離にかけてＥｘｐｉＣＨＯ（商標）培地を清澄にすることにより精製した。その後、上清を、０．４５μｍフィルター、次いで０．２２μｍフィルターを使用してろ過した。続いて、上清を、プロテインＡ／Ｇ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；カタログ番号２０４２４）を製造者の操作手順に従って使用したアフィニティ精製に供した。ＥＬＩＳＡ精製に先立ち、投入培地量が占めているのが樹脂の結合容量の８０％未満であることを保証するため、培地中の抗体価を大まかに決定した。インキュベーション後、樹脂をＰＢＳで洗浄し、溶出緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２１００４）で溶出させた。溶出画分は、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ緩衝液を加えて生理学的ｐＨに直ちに調整した。精製した抗体はその後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心式フィルターユニット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＵＦＣ９００３２４）をＰＢＳ緩衝液中で使用して緩衝液交換及びタンパク質濃縮に供した。ＢＣＡタンパク質アッセイで抗体濃度を決定した。抗体純度を試験するためＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクマシー－染色を行った。精製タンパク質を等量分割し、長期保存用に－８０℃で保存するか、または即時使用のために４℃で維持した。

抗体の完全性を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、続くクマシー染色により非還元条件下と還元条件下を対比させて評価し、非還元条件下では、支配的なバンドが１５０ｋＤａ付近に１本、還元条件下では、２本のバンドが５０ｋＤａと２５ｋＤａで観察された。

配列類似性を有する他のＣＬＤＮファミリーメンバー（図５）、すなわち、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、及びＣＬＤＮ９に特異的な抗体は、プラスミドに含有された抗体配列がＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、またはＣＬＤＮ９に特異的な抗体配列であることを除いては、本質的に同様に作製された。

実施例４
本実施例は、内因的ＣＬＤＮ６発現の高い細胞株の特性解析を示す。

がん細胞株パネルをその内因的なＣＬＤＮ６発現についてＦＡＣＳ及びウエスタンブロットにより分析した。簡単に言えば、標的に対する抗体の結合を、ＣＬＤＮ６を過剰発現する細胞（例えば、実施例２に記載の、ＣＬＤＮ６を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、及び実施例１で決定された、ＣＬＤＮ６を高レベルまたは低レベルで内因的に発現する細胞株を使用してＦＡＣＳにより評価した。ＣＬＤＮ６発現細胞を、参照抗体または対照抗体（実施例３に記載）と共に、氷上で３０分間インキュベートし、洗浄後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（最小限の交差反応性）抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号４０５３２２）と共に氷上で３０分間インキュベートした。蛍光をＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｃｃｕｒｉ（商標）フローサイトメーター（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で読み取った。

参照抗体及び対照抗体を用いてニトロセルロースでウエスタンブロットを行った。簡単に言えば、細胞ライセートからの試料を沸騰させ、タンパク質含有物を変性させた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を使用して、変性タンパク質をポリペプチド長により分離した。分離されたタンパク質をその後、アクリルアミドゲルからニトロセルロースメンブレンに転写した。２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を使用してメンブレンをブロックし、非特異的抗体結合を最小限に抑えた。メンブレンを参照抗体または対照抗体と共にインキュベートした。メンブレンを、参照抗体または対照抗体を認識するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合済み二次抗体で染色し、二次抗体の検出を化学発光により行った。

過剰発現株を使用して対照抗体及び参照抗体を評価し、評価された時点で、その対照抗体及び参照抗体を使用して内因的細胞株の特徴付けを行った。ＣＬＤＮ６を過剰発現する細胞は、陽性対照としてこれらのアッセイに含めた。

ＦＡＣＳアッセイでは、子宮内膜癌細胞株に加え、４つの卵巣癌細胞株、膀胱癌細胞株、肺癌細胞株、及び上部消化管がん細胞株が、ＣＬＤＮ６を表面に高レベルで発現することが示された。高レベルのＣＬＤＮ６発現はウエスタンブロットでも検出された。追加の２つの卵巣癌細胞株、追加の肝癌細胞株、追加の肺癌細胞株、及び追加の上部消化管がん細胞株では、ウエスタンブロットで検出した際、ＣＬＤＮ６を表面に中程度レベルで発現することが示された。子宮内膜腫瘍細胞及び膀胱腫瘍細胞はまた、インビボでの異種移植片としても高レベルのＣＬＤＮ６を発現していた。試験したがん細胞株によるＣＬＤＮ６の内因的発現レベルを表２にまとめている。

実施例５
本実施例は、ＣＬＤＮ６特異的抗体を産生させるためのマウスの免疫化を示す。

Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒの手法に従って３つの異なるペプチド免疫原の混合物を用いてＢａｌｂ／ｃ及びＣＤ１マウスを免疫することによりＣＬＤＮ６特異的抗体を産生させた。３つのペプチドは、ＣＬＤＮ６細胞外ドメインの第２ループ（すなわち、ＥＬ２）に及んでいた。ペプチドには、ＥＬ２の全長、ＥＬ２の最初の（Ｎ末端）半分までのペプチド、及びＥＬ２の残りの（Ｃ末端）半分までのペプチドが含まれる。表３に３つのペプチドの配列を記載する。

マウスはまた、ヒトＣＬＤＮ６－ｍｙｃ－ＤＤＫ発現ベクターを含むプラスミドを使用して、完全長ＣＬＤＮ６を過剰発現する３Ｔ３細胞で免疫された。

免疫したマウスから脾細胞を採取し、ＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ（ＢＴＸ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）で骨髄腫株と融合させてハイブリドーマを作製した。７６８０の初代ハイブリドーマ培養物を作製し、３８４ウェルプレートで培養した。抗体がペプチドと結合する能力を、３つの異なるペプチド標的を発現しているビーズを使用したビーズアレイにより評価した。１９２０の潜在的抗体を再度９６ウェルプレートに整列させ、内因的細胞株モデルと人工細胞株モデルに対してフローサイトメトリーでさらにスクリーニングを行った。

その後、陽性ハイブリドーマの上清を、標的領域との配列類似性を有するタンパク質（例えば、他のＣＬＤＮタンパク質）の内因的モデルと人工モデルに対してフローサイトメトリーでカウンタースクリーニングを行った。二次スクリーニング及びカウンタースクリーニングから、約２０のＣＬＤＮ６特異的抗体が追加試験用に選択された。これらの抗体をサブクローニングし、可変重鎖配列及び可変軽鎖配列を決定した。表Ｂ及び配列表を参照のこと。

ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現を使用してＣＬＤＮ６抗体を完全長ＩｇＧ抗体としてフォーマットした。抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を、ｐｃＤＮＡ（商標）３．４－ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（カタログ番号：Ａ１４６９７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に基づいて研究室で操作された抗体発現ベクター内にクローニングし、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした（キット（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号：Ａ２９１３３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）で提供された操作手順に従った）。抗体を精製し、抗体のＣＬＤＮ６への細胞表面結合及び抗体のＩＣ５０をＦＡＣＳにより決定し、ＣＬＤＮ６抗体と、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＮＨＳエステル（スクシンイミジルエステル）、カタログ番号Ａ２０１０６（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とを製造者の操作手順に従って直接結合させた。ＣＬＤＮ６抗体を、１５０，０００細胞の系を用いた５０μｌの体積で０．３２ｎＭから１０００ｎＭまで（系列希釈１：５、６段階）試験した。

ＣＬＤＮ６抗体が細胞表面のＣＬＤＮ６に結合し、他のＣＬＤＮファミリーメンバーと交差反応する能力を決定するため、ＣＬＤＮ６発現細胞をＦＡＣＳアッセイで使用した。ＧＦＰと融合したヒトＣＬＤＮ６、ＧＦＰと融合したマウスＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ９－ＧＦＰ、ＣＬＤＮ４－ＧＦＰ、もしくはＣＬＤＮ３－ＧＦＰ、またはＧＦＰ単独（ＣＬＤＮ６なし）を発現するよう操作されているＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＣＬＤＮ６発現の人工モデルとして使用した。ＡＲＫ２、ＯＶＣＡ４２９、ＬＳ５１３及びＭＣＦ７の細胞をＣＬＤＮ６発現の内因的モデル、ならびにＣＬＤＮ３／４発現のモデルとして使用した。

試験したそれぞれの細胞型及びそれぞれのｍＡｂについて、細胞表面タンパク質を保護するために、ＥＤＴＡ（トリプシンの代わり）で細胞を培養フラスコ表面から剥離させた。その後、剥離した細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）で標識したＣＬＤＮ６ ｍＡｂと共に予め設定した濃度にて暗所、氷上で３０分間インキュベートした。ＣＬＤＮ６ ｍＡｂは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＮＨＳエステル（スクシンイミジルエステル）で直接標識した。洗浄後、チャネルＦＬ４Ｈでの抗体－抗原タンパク質の結合を検出するため、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）フローサイトメーターＣ６で細胞を読み取った。各抗体を様々な濃度で試験し、用量－蛍光曲線を作成した。生物学的用量反応データをプロットして曲線の種類に適合させ、ＥＣ５０／ＩＣ５０を得ることができる、オンラインで利用可能なＶｅｒｙ Ｓｉｍｐｌｅ ＩＣ５０ Ｔｏｏｌキットを使用して、ＦＬ４Ｈの値（一重項の生細胞でゲーティング）に基づいて抗体のＥＣ５０／ＩＣ５０（最大値の半分の抗体濃度）を計算した。最大値は、蛍光が最大限に達する、抗体の最低濃度とした。抗体はまた、それらがＣＬＤＮ９、ＣＬＤＮ３、及びＣＬＤＮ４等の他のＣＬＤＮタンパク質と交差反応する能力についてスクリーニングが行われた。これらの値を使用して、試験した一連の抗体の各抗体の相対親和性を決定した。交差反応性データは同様の方法を使用してを取得されたが、細胞は、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４及びＣＬＤＮ９に対する発現プロファイルが異なるものを用いた。

このようにして決定された相対親和性データ及び交差反応性データを表４及び表５に記載する。

ＡＢ番号は、表Ａ及び表Ｂに記載のＡＢ番号に対応している。

ＡＢ番号は、表Ａ及び表Ｂに記載のＡＢ番号に対応している。

実施例６
本実施例は、キメラマウスのＩｇＧ ｍＡｂの特性解析を示す。

実施例５に記載のｍＡｂの特徴をさらに明らかにするため、軟寒天３Ｄ増殖アッセイ及び異種移植結合アッセイを行った。簡単に言えば、４８ウェルプレートの各ウェルについて、０．６％ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロース含有１×ＲＰＭＩ培地中に１０，０００細胞が含有された２５０μＬの上層混合液を、凝固した０．６％ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロース含有１×ＲＰＭＩ培地である２５０ｕＬの底層の上部にプレーティングした。１×ＲＰＭＩ培地を含有する２５０ｕＬの液体フィーダーレイヤーを凝固した上層の上に入れた。軟寒天アッセイの全３層とも、トラスツズマブ、Ｃｌｄｎ６ ｍＡｂ、もしくはマウスＩｇＧ２ａ対照を含むかまたは含まない場合で調製し、１５０ｎｇ／ｍＬ（１ｕＭ）で開始し、１．５ｎｇ／ｍＬで終了した（１：１０で希釈）。各試験条件は二連で実施した。細胞は、３週間コロニーを形成させてから、０．０５％ニュートラルレッドで染色し、ＥＶＯＳ ＸＬ倒立光学顕微鏡で画像化した。処理した場合と対照との対比においてコロニー数の減少が２０％以上の細胞株を感受性とした。

表６に示すように、示されている抗体で処理した場合、細胞株の多くがコロニー数の減少を示した。

ヒトがん細胞株を注射された異種移植マウスでインビボ結合試験を行った。簡単に言えば、ヒトがん細胞株の異種移植モデルを、６週齢のＣＤ－１胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で樹立した。各細胞株の皮下注射では以下の条件に従った：ＡＲＫ２ ０．７５×１０^７細胞、ＵＭＵＣ４ １．０×１０^７細胞、ＯＶ９０ １．０×１０^７細胞及びＭ２０２ ０．５×１０^７細胞で、いずれも５０％マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。処置群あたりのマウスが８匹になるよう十分な数のマウスに注射した。腫瘍が１５０～３００ｍｍ^３の平均サイズに達した時点で、マウスを処置群に無作為に分けた。処置のため、各治療用抗体（ＡＢ３、ＡＢ２、参照Ａｂ１、参照Ａｂ２、参照Ａｂ３（トラスツズマブ）及び非標的指向性ＩｇＧ２対照を、尾静脈の静脈内（ＩＶ）注射用に滅菌生理食塩水で作業濃度の１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。Ｍ２０２試験では、トラメチニブ（ＤＭＳＯ溶媒和物、ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ）を、５日投与、２日休薬というスケジュールで週サイクルの１週目に１．０ｍｇ／ｋｇ（１０％のＣｒｅｍａｐｈｏｒ、１０％のＰＥＧ４００）で経口投与し、その後、残り２週間の投与では、０．５ｍｇ／ｋｇまで減量した。腫瘍異種移植片をキャリパーで週３回測定し、高さ×幅×長さで乗算して腫瘍体積をｍｍ^３単位で求めた。マウスを２～７週間処置した。試験終了時、動物を安楽死させ、腫瘍組織を切除して、バイオマーカー分析用の瞬間凍結組織またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織として保存するために分割した。動物での作業はすべて、ＩＡＣＵＣ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されている操作手順を基に行われた。ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）製ＳｔｕｄｙＬｏｇソフトウェアを使用してデータを分析した。結果は、各群の平均体積として表される。エラーバーは、その平均の標準誤差（ＳＥ）を表す。

異種移植片アッセイの結果を図６～図１０に示す。図６Ａ及び図６Ｂに示されるように、子宮内膜腫瘍担がんマウスにおいて、ＡＢ２及びＡＢ３のそれぞれは１４日目に、対照ＩｇＧ２抗体に対して腫瘍体積の実質的な平均変化をもたらした。図７Ａ及び図７Ｂに示されるように、膀胱腫瘍担がんマウスにおいて、ＡＢ３は３５日目に、対照ＩｇＧ２抗体に対して腫瘍体積の実質的な平均変化をもたらした。図８Ａ及び図８Ｂは、卵巣腫瘍担がんマウスにおいて、ＡＢ２及びＡＢ３のそれぞれは２０日目に、対照ＩｇＧ２抗体に対して腫瘍体積の実質的な平均変化をもたらしたことを示す。図９Ａ及び図９Ｂは、図９Ａ及び図９Ｂで使用したモデルがＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、及びＣＬＤＮ９のいずれも発現せず、そのために、陰性対照として使用されたことから、ＡＢ３がＣＬＤＮ特異的に機能することを示している。図９Ａ及び図９Ｂのデータはまた、ＡＢ３が、参照Ａｂ１及び参照Ａｂ２よりもオフターゲット活性が少ないことを示唆している。図１０Ａでは図６～図９の結果をまとめている。図１０Ａに示されるように、ＡＢ３は、それぞれＣＬＤＮ６を発現する子宮内膜腫瘍、膀胱腫瘍、及び卵巣腫瘍の担がんマウスにおいて、腫瘍増殖を顕著に抑制したが、ＣＬＤＮ６を発現していなかったメラノーマ腫瘍担がんマウスでは腫瘍増殖を抑制しなかった（図１０Ｂ）。図１１に示されるように、処置中のマウスの平均的な体重変化には顕著な変化はなく、処置の安全性を示唆している。

ヒト卵巣癌細胞株ＯＶ９０の異種移植モデルにおいて第２のセットの実験を行った。実施例５に記載の１０のｍＡｂのうちの１つか、もしくは対照抗体（マウスＩｇＧ２ａ抗体、参照ＣＬＤＮ６ ａｂ）、またはＰＢＳビヒクル対照をマウスに注射した。マウスは群あたり８匹で、各動物に１０ｍｇ／ｋｇの抗体を４日ごとに静脈内注射した。図１２Ａ及び図１２Ｂに示されるように、実施例５に記載のいくつかの抗体は卵巣腫瘍担がんマウスの腫瘍体積を減少させた。そのうち成績が最も良好だったのはＡＢ３、ＡＢ４、ＡＢ７、及びＡＢ１０であるが、試験した抗体はいずれも、ビヒクル対照と比べて腫瘍体積を減少させた。図１３に示されるように、ＡＢ３、ＡＢ４、ＡＢ７、またはＡＢ１０により処置された動物の体重には顕著な変化はなく、それらの安全性を示唆している。

実施例７
本実施例は、キメラマウスのＩｇＧ ｍＡｂのさらなる特性解析を示す。

内部移行の定量化アッセイを行った。簡単に言えば、参照Ａｂ１、ＡＢ３、またはＡＢ４の結合により誘発されるＣＬＤＮ６タンパク質の内部移行の試験を実施し、その際、抗体結合後に内部移行する既知の細胞表面受容体であり、いたるところで発現しているトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を陽性対照に用いた。

ＴｆＲ及びＣＬＤＮ６抗体をＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標）－Ｘ、スクシンイミジルエステル、混合異性体、カタログ番号Ｔ６１３４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識した。抗体処理の前日、μ－スライド８ウェルチャンバー（カタログ番号８０８２６、ｉｂｉｄｉ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎ Ｆｏｃｕｓ Ｉｎｃ．）に細胞を播種し、細胞を接着及び増殖させた。細胞を、標識した抗体と共に暗所、氷上で３０分間インキュベートした。その後、ＣＬＤＮ６またはＴｆＲで標識された細胞の入ったチャンバーをＥｃｈｏ ｌａｂ蛍光顕微鏡で読み取り、内部移行前の画像を収集した。その後、チャンバーを３７℃で４０分間インキュベートして内部移行を進行させ、再度Ｅｃｈｏ ｌａｂ蛍光顕微鏡で画像を収集した。ＡＢ３及びＡＢ４では、ＣＬＤＮ６内部移行の程度は、参照Ａｂ１でもたらされたものと比較して大きかった（データ図示せず）。

実施例８
本実施例は、キメラマウスのＩｇＧ ｍＡｂのさらなる特性解析を示す。

実施例５に記載の選択抗体を用いて二次元（２Ｄ）増殖アッセイを以下のように行った：細胞を２４ウェルプレートの１ウェルあたり５，０００～２０，０００細胞で二連にて播種した。翌日、細胞を、１～５の６回希釈のｍＡｂ（１００ｎＭのトラスツズマブ、Ｃｌｄｎ６ ｍＡｂ、またはマウスＩｇＧ２Ａ対照のいずれかで開始）、１ｎｇ／μＬの固定濃度のモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）結合済み抗マウス二次抗体（Ｍｏｒａｄｅｃ，ＬＬＣ）で処理し、用量反応曲線を作成した。細胞増殖の範囲を決定するため、未処理ウェルの細胞を、抗体処理日である１日目と、その後の６日目に定量した。ｍＡｂで処理したウェルを６日目に定量し、各処理条件での増殖を、未処理細胞の増殖に対する正規化されたパーセント比として決定した。Ｚ１ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ）で定量を実施した。

結果を図１４に示す。ＡＢ２、ＡＢ３、ＡＢ４、及びＡＢ５は、増殖阻害での最も高い有効性を示した。これらの抗体の各々のＩＣ５０は、０．１ｎＭ～１ｎＭであった。ＡＢ７、ＡＢ１０、ＡＢ１１、及びＡＢ１５の各々もまた、ＡＢ２、ＡＢ３、ＡＢ４、及びＡＢ５より程度は低いが本アッセイで増殖阻害能を示した。

実施例９
本実施例は、本開示の抗体のヒト化を示す。

表Ａに記載の抗体のサブセットをヒト化分析用に選択した。ＡＢ１抗体、ＡＢ３抗体、ＡＢ４抗体、ＡＢ９抗体、ＡＢ１１抗体及びＡＢ１８抗体の重鎖可変（ＶＨ）配列及び軽鎖可変（ＶＬ）配列を、ヒトＶＨ遺伝子及びヒトＶＬカッパ遺伝子からの既知のヒト生殖細胞系列配列（ＩＭＧＴ（登録商標）ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ；創設及び管理責任者：Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）のライブラリーと比較した（使用したデータベースはＩＭＧＴのヒトＶＨ遺伝子（Ｆ＋ＯＲＦ、２７３生殖細胞系列配列）及びＩＭＧＴのヒトＶＬカッパ遺伝子（Ｆ＋ＯＲＦ、７４生殖細胞系列配列）であった）。親抗体に配列が最も近いものの中からアクセプターヒト生殖細胞系列を選択した。

表７では、各抗体のＶＨ及びＶＬそれぞれについて、アクセプター配列として選択したヒト生殖細胞系列配列及び選択したヒト重鎖連結領域（Ｊ遺伝子）に関する情報を提供する。連結領域（Ｊ遺伝子）は、ＩＭＧＴ（登録商標）ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ（創設及び管理責任者：Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）に蓄積されているヒト連結領域配列から選択した。

ＣＤＲは、ＡｂＭ定義に従って定義した（Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎのウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／のＣＤＲ定義対照表を参照のこと）。

対応するマウス親配列に対するヒト生殖細胞系列のフレームワーク（すなわち、ＶＨ及びＶＬの非ＣＤＲ残基）位置の変化が、ヒト化抗体の結合を最適化するために必要となる場合がある。ヒト化抗体のバージョンの配列は配列番号３７６～４２１として提供される。

ＡＢ１の場合、ＨＣのＣＤＲ２のＡｓｎ５２（連続的番号付け）及びＬＣのＣＤＲ２のＡｓｎ５４のそれぞれは、配列とコンホメーションに基づいて脱アミド化の可能性が低いと決定された。

ＡＢ３の場合、ＨＣのＣＤＲ１のＡｓｎ３１（連続的番号付け）、ＨＣのＣＤＲ２のＡｓｎ５７、ＬＣのＣＤＲ１のＡｓｎ２８、及びＬＣのＣＤＲ２のＡｓｎ５０のそれぞれは、配列とコンホメーションに基づいて脱アミド化の可能性が低いと決定された。ＨＣのＣＤＲ１のＴｒｐ３３は、溶媒曝露の可能性があり、特にストレス条件下で、酸化の可能性があると決定された。ＨＣのＣＤＲ３では、溶媒曝露の可能性があることから抗体製造時に問題となり得るＣＤＲ内部の遊離Ｃｙｓ１０６があると決定された。このＣｙｓ残基は、Ｔｙｒ、ＳｅｒまたはＡｌａへの改変が推奨された。これらの改変抗体の結合維持を試験した。ＬＣのＣＤＲ２のＩｌｅ５３は、溶媒曝露の可能性があると決定され、非特異的結合を引き起こす可能性があった。このＩｌｅ残基は、Ｓｅｒに改変することが提案された。この改変抗体の結合維持を試験する。

ＡＢ４の場合、ＨＣのＣＤＲ２のＡｓｎ５２（連続的番号付け）及びＬＣのＣＤＲ２のＡｓｎ５８のそれぞれは、配列とコンホメーションに基づいて脱アミド化の可能性が低いと決定された。ＬＣのＣＤＲ１内の配列ＤＧＮＴは、イソアルパラギン酸塩形成の可能性が高いこと（配列ＤＧ）ならびに脱アミド化の可能性があること（配列ＮＴ）が決定されたことから、問題となると決定された。この配列は改変が推奨された。

ＡＢ９の場合、ＨＣのＣＤＲ１内のＡｓｎ３３（連続的番号付け）、及びＨＣのＣＤＲ２内のＡｓｎ５２とＡｓｎ５９は、配列とコンホメーションに基づいて脱アミド化の可能性が低いと判断された。Ａｓｎ５４は、配列及びコンホメーションに基づいて脱アミド化の可能性が中程度あると決定された。ＨＣのＣＤＲ２内のＮＧＧ配列は、イソアルパラギン酸塩形成に続く脱アミド化の可能性が高／中程度あると決定された。したがって、このアミノ酸配列が改変されることが推奨された。ＨＣのＣＤＲ３内の遊離Ｃｙｓ１０６は、溶媒曝露の可能性があると決定されているたことから抗体製造時に問題となり得る。このＣｙｓ残基は、Ｔｙｒ、ＳｅｒまたはＡｌａへの改変が提案される。これらの改変抗体の結合維持を試験する。ＨＣのＣＤＲ１内のＡｒｇ２８は、ヒト抗体で見られることはあまりない。この残基はＴｈｒに改変し、結合維持を試験する。ＡＢ９の場合、ＬＣのＣＤＲ１内のＴｒｐ３２（連続的番号付け）は、溶媒曝露の可能性があり、特にストレス条件下で、酸化を受け得ると決定された。同ＣＤＲのＬｅｕ２４は、ヒト抗体で見られることはあまりない。この残基をＡｒｇに改変し、結合維持を試験する。

ＡＢ１１の場合、ＨＣのＣＤＲ２内のＡｓｐ５４－Ｓｅｒ５５（連続的番号付け）は、イソアルパラギン酸塩形成の可能性が低いと決定された。ＬＣのＣＤＲ２内のＡｓｎ５７は、配列及びコンホメーションに基づいて脱アミド化の可能性が低いと決定された。

ＡＢ１８の場合、ＨＣのＣＤＲ１内のＡｓｎ３３及びＣＤＲ－Ｈ２ Ａｓｎ５０（連続的番号付け）は、配列及びコンホメーションに基づいて脱アミド化の可能性が低いと決定された。ＨＣのＣＤＲ２では、Ａｓｐ－Ｐｒｏ（ＤＰ）配列は、酸性条件下で断片化を受ける可能性があると決定された。ＶＬドメインでは、ＬＣのＣＤＲ１内のＡｓｎ３４及びＡｓｎ３７は、配列及びコンホメーションに基づいて脱アミド化の可能性が低いと決定された。ＬＣのＣＤＲ３では、Ｔｒｐ５６は、溶媒曝露の可能性があり、特にストレス条件下で、酸化を受け得ると決定された。

表８は、ヒト化されたＶＨとＶＬを合わせるためのスキームを示す。ヒト化バージョンのいずれもキメラｍＡｂと同等ではない場合。好ましい対は下線付き太字のテキストで示されている。

表８に記載のヒト化抗体を構築し、本質的には実施例５に記載のように表した。ヒト化抗体の相対的抗原結合強度を決定するため、ＦＡＣＳアッセイを本質的には実施例５に記載のように行った。ヒト化抗体の２つの用量（１．５μｇまたは０．３μｇ）を、操作された２９３Ｔクローンにより発現されたタンパク質のヒトＣＬＤＮ６またはマウスＣＬＤＮ６への結合について試験した。アッセイの結果を表９に記載する。

また、示されているがん細胞株により発現されるＣＬＤＮ６への結合についてヒト化抗体の相対的抗原結合強度を決定するため（１．５μｇまたは０．３μｇ）ＦＡＣＳアッセイを行った。アッセイの結果を表１０に記載する。「第２のＡｂのみ」は陰性対照として使用した。６４Ａ－ｃｈｉｍ、ｈ６４Ａ、及びＳＣ２７－１０８－ｃｈｉｍは参照抗体として使用した。対応する親抗体（ヒト化前の抗体）は対照として使用し、「ｃｈｉｍ」で併記した。

インビトロでの抗原結合データに基づき、３つのヒト化抗体をさらなる試験及び開発用に選択した。抗体は、ＡＢ１、ＡＢ３、及びＡＢ４に由来した。

本質的には実施例６に記載のように、膀胱癌細胞株ＵＭＵＣ４を注射された異種移植マウスにおいてＡＢ１、ＡＢ３、及びＡＢ４のヒト化バージョンのインビボ結合試験を行った。簡単に言えば、ＵＭＵＣ４の異種移植モデルを６週齢のＣＤ－１胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で樹立した。腫瘍が１５０～３００ｍｍ^３の平均サイズに達した後、マウスを処置群に無作為に分けた。ヒト化抗体を、尾静脈の静脈内（ＩＶ）注射用に滅菌生理食塩水で作業濃度の１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。腫瘍異種移植片をキャリパーで週３回測定し、高さ×幅×長さで乗算して腫瘍体積をｍｍ^３単位で求めた。マウスを２～７週間処置した。試験終了時、動物を安楽死させ、腫瘍組織を切除して、バイオマーカー分析用の瞬間凍結組織またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織として保存するために分割した。

異種移植片アッセイの結果を図１５～図２１に示す。図１５は、ヒト化ＡＢ３の２つのバージョン（ＡＢ３－２及びＡＢ３－４）の異種移植片アッセイの結果を示し、その際、処置には１０ｍｇ／ｋｇの４日に１回の投与を伴った。対照には、ビヒクル対照（ＰＢＳ）、ヒトＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇを４日に１回）、及びＡＢ３のマウスバージョン（１０ｍｇ／ｋｇを４日に１回）を含めた。この図に示すように、ヒト化ＡＢ３－４は、３５日間の処置期間にわたり腫瘍体積の減少を示した。図１６は、追加で２つの対照（６４Ａ ＭＳＥ及びそのキメラバージョン（６４Ａ－ＣＨＩＭ））に行ったこと以外は図１５で示した実験の場合と同じ処置での異種移植片アッセイの結果を示す。図１５での場合と同様、図１６では、ヒト化ＡＢ３－４による処置時の腫瘍体積の顕著な減少を示す。

図１７は、ヒト化ＡＢ１－５の異種移植片アッセイの結果を示す。対照には、ビヒクル対照（ＰＢＳ）、ヒトＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇを４日に１回）、及びＡＢ１のマウスバージョン（１０ｍｇ／ｋｇを４日に１回）を含めた。図１７に示されるように、ヒト化ＡＢ１－５により処置されたマウスは腫瘍体積の顕著な減少を示した。

図１８は、ヒト化ＡＢ４－３の異種移植片アッセイの結果を示す。対照には、ビヒクル対照（ＰＢＳ）、ヒトＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇを４日に１回）、及びＡＢ４のマウスバージョン（１０ｍｇ／ｋｇを４日に１回）を含めた。ヒト化ＡＢ４－３により処置されたマウスは、腫瘍体積の顕著な減少は示さなかった。

図１９～図２１は、図１５～図１８の４つのヒト化抗体すべてを試験した異種移植片アッセイの結果を示す。参照ＣＬＤＮ６抗体のマウス及びキメラバージョンは対照として使用した。図１９に示されるように、ヒト化のＡＢ３－４及びＡＢ１－５により処置されたマウスは腫瘍体積の減少を示した。図２０は、５５日目までの経時的な腫瘍体積を示す。アッセイでのマウスの体重を図２１に示す。

実施例１０
ＡＢ１、ＡＢ３、及びＡＢ４の異なる配列を用いてインシリコでの分析を行った。詳しくは、各抗体について、（ａ）元の親クローンの配列、（ｂ）最も近いマウス生殖細胞系列配列、（ｃ）最も近いヒト生殖細胞系列配列、及び（ｄ）ヒト化配列を整列させた。親和性成熟を受けたと考えられるアミノ酸にはアスタリスクで印を付け、抗体データベース情報に従ったその位置でのアミノ酸とは異なるアミノ酸にはハッシュタグで印を付けた。各配列のＣＤＲは四角で囲まれている。この分析に基づき、いくつかのヒト化抗体は、表１０に記載されている配列を含んで作製される。

これらのコンセンサス配列により定義される配列を有する抗体を、本質的には実施例５に記載のように倍数作製し、抗原結合についてはＦＡＣＳによりインビトロで（本質的には実施例５に記載のように）、またマウスで腫瘍体積を減少させる能力についてはインビボで（本質的には実施例６に記載のように）試験した。

実施例１１
この実施例では、本開示のＣＬＤＮ６抗体の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析を記載する。

ＡＢ１及びＡＢ３の配列は、各抗体について重鎖及び軽鎖の体細胞超変異（ＳＨＭ）関連変異型を同定するため、ＮＧＳ分析に供した。ＮＧＳ分析により、各抗体の重鎖配列及び軽鎖配列の両方におけるＳＨＭ点が同定された。分析により、ＡＢ３では、１４５２の異なる重鎖配列及び３２６の異なる軽鎖配列が、またＡＢ１では、３７２の異なる重鎖配列及び３０８１の異なる軽鎖配列が明らかにされた。例としての結果を図２３～図２６に示す。図２３及び図２４はそれぞれ、変異型ＡＢ３の重鎖及び軽鎖に対して同定された変更を示し、図２５及び図２６はそれぞれ、変異型ＡＢ１の重鎖及び軽鎖に対して同定された変更を示す。変異は各図下部にＣｈｏｔｈｉａの番号付けにより記載されている。

ＮＧＳで同定されたＳＨＭを重鎖に持つ抗体を、結合関与の可能性に基づいて選択した。ヒト化ＡＢ３－７（ＡＢ Ｓ１～Ｓ６）に基づいて６つの抗体を製造し、ヒト化ＡＢ１－１１（ＡＢ Ｓ７～Ｓ１２）に基づいて６つの抗体を作製した後、表現型を評価した。図２２は、軽鎖配列と対形成する親重鎖配列及び１２の変異重鎖配列の一覧である。１２の抗体（ＡＢ Ｓ１～Ｓ１２）のＦＡＣＳ結合試験は本質的には本明細書に記載されるように行われ、その結果を図２７に示す。

ＦＡＣＳ結合アッセイはまた、異なる量のＡＢ Ｓ１～Ｓ１２を用いて行われた。この限界希釈アッセイで試験された抗体濃度は、０．３２ｎＭ、１．６ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭ、及び１０００ｎＭであり、異なる細胞株の発現ＣＬＤＮ６を使用した。結果を図２８に示す。

これらのデータは、新たに同定された抗体（Ｓ１～Ｓ１２）が、対応する親のヒト化抗体に対して結合増大を示すことを支持している。

実施例１２
本実施例は、本明細書に記載されるヒト化抗体のインビボ分析を示す。

インビボ試験は、ヒトがん細胞株を注射された異種移植マウスにおいて本質的には実施例６に記載のように行った。本試験では、ＣＬＤＮ６を強く発現する膀胱癌細胞株であるＵＭＵＣ４細胞株の細胞、及びＣＬＤＮ６を発現する卵巣癌細胞株であるＯＶ－９０細胞株の細胞を使用した。両細胞株は、マウスに皮下投与した場合に造腫瘍性である。簡単に言えば、ヒトがん細胞株の異種移植モデルを、６週齢のＣＤ－１胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で樹立した。各細胞株の皮下注射では以下の条件に従った：ＵＭＵＣ４ １．０×１０^７及びＯＶ９０ １．０×１０^７で、いずれも５０％マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。ＣＤ－１ヌードマウス（群あたりマウス８匹）は、右側腹にＵＭＵＣ４またはＯＶ－９０細胞株の皮下注射を受けた。腫瘍が１５０～３００ｍｍ^３の平均サイズに達した時点で、マウスを処置群に無作為に分けた。処置のため、各治療用抗体（ヒト化ＡＢ１－１１、ヒト化ＡＢ３－７）及びヒトＩｇＧ対照抗体を滅菌生理食塩水で希釈し、１０ｍｇ／ｋｇを４日に１回（Ｑ４Ｄ－図３０）または週１回（ＱＷ－図３１）、尾静脈（ＩＶ）注射により静脈内投与した。腫瘍異種移植片をキャリパーで週３回測定し、高さ×幅×長さで乗算して腫瘍体積をｍｍ^３単位で求めた。マウスを２１～３６日間処置した。試験終了時、動物を安楽死させ、腫瘍組織を切除して、バイオマーカー分析用の瞬間凍結組織またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織として保存するために分割した。動物での作業はすべて、ＩＡＣＵＣ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されている操作手順を基に行われた。ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）製ＳｔｕｄｙＬｏｇソフトウェアを使用してデータを分析した。結果は、各群の平均体積として表される。エラーバーは、その平均の標準誤差（ＳＥ）を表す。

異種移植片アッセイの結果を図３０及び図３１に示す。図３０に示されるように、ＡＢ１－１１またはＡＢ３－７による４日に１回の処置は、対照処置マウスと比べ腫瘍体積またはＵＭＵＣ４腫瘍の減少をもたらした。両ヒト化抗体とも、試験期間終了までに、対照マウスと比べて６０％の腫瘍体積減少を達成した。

図３１に示されるように、いずれかのヒト化抗体により処置されたマウスのＯＶ－９０の腫瘍体積は、対照処置マウスの腫瘍体積よりも小さかった。試験終了までに、ＡＢ１－１１は、対照マウスと比べて３３％の腫瘍体積減少を達成し、ＡＢ３－７は１６％の減少を達成した。

これらのデータは、ヒト化抗体が、対応するマウス抗体で最初に観察された治療有効性を維持することを支持している。

実施例１３
本実施例は、インビボで試験した抗体薬物複合体を示す。

ＭＭＡＥ及びヒト化ＡＢ１－１１を含む複合体を作製し、ＯＶ－９０卵巣癌細胞株発現ＣＬＤＮ６を注射された異種移植マウスを使用して、本質的には実施例６に記載のようにインビボで試験した。本実験では、ＣＤ－１ヌードマウス（群あたりマウス８匹）は、右側腹内にＯＶ－９０細胞の皮下注射を受けた。腫瘍が１５０～３００ｍｍ^３の平均サイズに達した時点で、マウスを処置群に無作為に分けた。処置のため、マウスには、（１）１０ｍｇ／ｋｇのヒト化ＡＢ１－１１抗体、（２）１０ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ対照抗体、（３）ＡＢ１－１１を用いずにＭＭＡＥを含む５ｍｇ／ｋｇの非標的化複合体、及び（４）ＭＭＡＥとＡＢ１－１１を含む１０ｍｇ／ｋｇの標的化抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を尾静脈注射により週に１回投与した。非標的化複合体は、非標的指向性ヒトＩｇＧ対照抗体に結合させたＭＭＡＥを含んだ。腫瘍異種移植片をキャリパーで週３回測定し、高さ×幅×長さで乗算して腫瘍体積をｍｍ^３単位で求めた。マウスを２０～３６日間処置した。試験終了時、動物を安楽死させ、腫瘍組織を切除して、バイオマーカー分析用の瞬間凍結組織またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織として保存するために分割した。動物での作業はすべて、ＩＡＣＵＣ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されている操作手順を基に行われた。ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）製ＳｔｕｄｙＬｏｇソフトウェアを使用してデータを分析した。結果は、各群の平均体積として表される。エラーバーは、その平均の標準誤差（ＳＥ）を表す。

図３２に示されるように、標的化ＡＤＣの投与により、腫瘍体積の実質的な減少がもたらされた。試験終了までに、標的化ＡＤＣにより処置されたマウスの腫瘍体積は、対照処置マウスと比べて７０％より大きい減少を示した。

同じインビボ分析を、ＯＶ－９０細胞の代わりにＵＭＵＣ４膀胱癌細胞を皮下注射されたマウスを用いて行い、治療剤は、（１）１０ｍｇ／ｋｇのヒト化ＡＢ１－１１抗体、（２）１０ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ対照抗体、（３）ＡＢ１－１１なしでＭＭＡＥを含む５ｍｇ／ｋｇの非標的化複合体、及び（４）ＭＭＡＥとＡＢ１－１１とを含む１０ｍｇ／ｋｇの標的化抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を、尾静脈注射により週１回投与した。非標的化複合体は、非標的指向性ヒトＩｇＧ対照抗体に結合させたＭＭＡＥを含んだ。標的化複合体は合計３回投与され、他の治療剤は週１回、合計５回投与された。腫瘍体積測定を上記のように行ったが、標的化ＡＤＣ処置マウスの測定は最高で８０日まで測定された。

図３３に示されるように、標的化ＡＤＣの投与は、ほぼ２００ｍｍ^３から、ほぼ０ｍｍ^３まで腫瘍体積が減少することを実証している。効果は、試験の８０日目または最終ＡＤＣ処置後の約６０日を超えて持続した。

これらのデータは、本開示の抗体を含む抗体薬物複合体は、腫瘍サイズを縮小するのに、またがんを治療するのに有効であることを支持している。

実施例１４
本実施例は、ＣＬＤＮ－６ Ｆａｂ断片の作製及び特性解析を示す。

Ｐｉｅｒｃｅ Ｆａｂ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号４４９８５）を製造者の指示書に従って使用し、ヒト化ＣＬＤＮ６抗体ＡＢ１－１１のＦａｂ抗体断片を作製した。簡単に言えば、分注量のヒト化ＡＢ１－１１を固定化パパインを含むカラムに加えた。溶出画分には、２つのＦａｂ断片とＦｃポリペプチドを含有されていた。プロテインＡ－樹脂を含むカラムに混合物を充填することにより、Ｆｃ含有画分からＦａｂ断片を分離した。プロテインＡカラムから溶出した画分にはＦａｂ断片のみが含有され、結合画分にはＦｃが含有された。

その後、ＦＡＣＳによりＡＢ１－１１のＦａｂ断片を抗原結合について、本質的には本明細書に記載されるように試験した。本ＦＡＣＳアッセイでは、ＯＶＣＡ４２９細胞を、完全長ＡＢ１－１１（図３４Ａ）、ＡＢ１－１１ Ｆａｂ（図３４Ｂ～図３４Ｄ）、または完全長ＡＢ１－１１とＡＢ１－１１ Ｆａｂの混合物（図３４Ｅ）と共にインキュベートした。ＦＡＣＳ結合アッセイの操作手順は、Ｆａｂ断片の解離速度高値のため若干（上記説明と比べて）の変更を行った。一次抗体（完全長ＡＢ１－１１またはそのＦａｂ断片）とのインキュベーションに続く洗浄ステップ、及び／または、二次抗体（ヤギＦ（ａｂ）_２抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体［Ｄｙｌｉｇｈｔ ６４９］（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；カタログ番号ＮＢＰ１－５１９０２）とのインキュベーション後の洗浄ステップを変えた。Ｄｙｌｉｇｈｔ ６４９シグナルの例示的ＦＡＣＳプロットを図３４Ａ～図３４Ｅに示し、結果を図３５に定量した。

図３４Ａにおいて、黒線は、二次抗体のみ（及び一次抗体なし）とインキュベートした後、２回洗浄した細胞を表し、赤線は、完全長ＡＢ１－１１と共にインキュベートして１回洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした後、二次抗体インキュベーション後の洗浄ステップなしの細胞を表し、青線は、完全長ＡＢ１－１１と共にインキュベートして１回洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした後、１回洗浄した細胞を表し、緑色の線は、完全長ＡＢ１－１１と共にインキュベートして１回洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした後、２回洗浄した細胞を表す。

図３４Ｂにおいて、黒線は、二次抗体のみ（及びＡＢ１－１１ Ｆａｂなし）とインキュベートした後、２回洗浄した細胞を表し、赤線は、ＡＢ１－１１ Ｆａｂと共にインキュベートし、インキュベーション間に洗浄ステップを入れずに二次抗体と共にインキュベートし、その後の二次抗体インキュベーション後の洗浄ステップなしの細胞を表し、青線は、ＡＢ１－１１ Ｆａｂと共にインキュベートし、インキュベーション間に洗浄ステップを入れずに二次抗体と共にインキュベートした後、１回洗浄した細胞を表し、緑色の線は、ＡＢ１－１１ Ｆａｂと共にインキュベートし、インキュベーション間に洗浄ステップを入れずに二次抗体と共にインキュベートした後、２回洗浄した細胞を表す。

図３４Ｃにおいて、黒線は、二次抗体のみ（及びＡＢ１－１１ Ｆａｂなし）とインキュベートした後、２回洗浄した細胞を表し、赤線は、ＡＢ１－１１ Ｆａｂと共にインキュベートして１回洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした後、二次抗体インキュベーション後の洗浄ステップなしの細胞を表し、青線は、ＡＢ１－１１ Ｆａｂと共にインキュベートして１回洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした後、１回洗浄した細胞を表し、緑色の線は、ＡＢ１－１１ Ｆａｂと共にインキュベートして１回洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした後、２回洗浄した細胞を表す。

図３４Ｄにおいて、黒線は、二次抗体のみ（及びＡＢ１－１１ Ｆａｂなし）とインキュベートした後、２回洗浄した細胞を表し、赤線は、ＡＢ１－１１ Ｆａｂと共にインキュベートして２回洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした後、二次抗体インキュベーション後の洗浄ステップなしの細胞を表し、青線は、ＡＢ１－１１ Ｆａｂと共にインキュベートして２回洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした後、１回洗浄した細胞を表し、緑色の線は、ＡＢ１－１１ Ｆａｂと共にインキュベートして２回洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした後、２回洗浄した細胞を表す。

図３４Ｅにおいて、黒線は、二次抗体のみ（及びＡＢ１－１１ Ｆａｂなし）とインキュベートした後、２回洗浄した細胞を表し、赤線は、完全長ＡＢ１－１１とＡＢ１－１１ Ｆａｂの混合物と共にインキュベートして１回洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした後、２回洗浄した細胞を表し、青線は、完全長ＡＢ１－１１とＡＢ１－１１ Ｆａｂの混合物と共にインキュベートし、インキュベーション間に洗浄ステップを入れずに二次抗体と共にインキュベートした後、２回洗浄した細胞を表し、緑色の線は、完全長ＡＢ１－１１とＡＢ１－１１ Ｆａｂの混合物と共にインキュベートして１回洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした後、２回洗浄した細胞を表し、紫色の線は、完全長ＡＢ１－１１とＡＢ１－１１ Ｆａｂの混合物と共にインキュベートして２回洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした後、２回洗浄した細胞を表す。

これらの図に示されるように、ＡＢ１－１１のＦａｂ断片は、抗原への強い結合を示した。

その後、ＡＢ１－１１のＦａｂ断片を、ＣＬＤＮ６を発現するＯＶＣＡ４２９細胞を免疫染色するための一次抗体として使用した。この試験における二次抗体は、ヤギＦ（ａｂ）_２抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体［Ｄｙｌｉｇｈｔ ６４９］（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；カタログ番号ＮＢＰ１－５１９０２）であった。結果を図３６Ａ～図３６Ｃに示す。図３６Ａでは、ＯＶＣＡ４２９細胞を、ＡＢ１－１１ Ｆａｂなしで（二次抗体のみと）インキュベートした。図３６Ｂでは、細胞は、ＡＢ１－１１ Ｆａｂのみ（二次抗体なし）が染色された。図３６Ｃでは、細胞を、ＡＢ１－１１ Ｆａｂ断片と共にインキュベートし、２回洗浄した後、二次抗体と共にインキュベートした。二次抗体とのインキュベーションに続き、細胞を２回洗浄し、その後、Ｃ６に９秒間曝露した。

これらの試験でのデータは、ＡＢ１－１１の一価バージョンが良好な抗原結合を示すことを示している。

実施例１５
本実施例は、ＣＬＤＮ－６ ｓｃＦｖの作製及び特性解析を示す。

軽鎖可変領域の配列及び重鎖可変配列に隣接させたエレメントであるＣＭＶプロモーターとウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）とを含むウイルス発現ベクターを使用して、ヒト化ＡＢ３－７及びＡＢ１－１１の一本鎖Ｆｖ断片を作製した（図３７Ａ）。（Ｇ４Ｓ）_３スペーサーをコードする配列は、ＬＣ及びＨＣの可変配列の間に位置させた。ＬＣ可変領域、スペーサー及びＨＣ可変領域の配列を図３７Ｂに記載する。ウイルスベクターを細胞で発現させ、得られたｓｃＦｖを採取し、その後、抗原結合についてＦＡＣＳで試験した。ＦＡＣＳの反応あたり、ＡＲＫ２またはＭ２０２細胞（０．２５×１０^６）を使用した。一次抗体はｓｃＦｖであり、反応あたり５μｇで使用した。二次抗体はＢｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号６５２５１３であり、反応あたり０．５μｇ／μＬストックの２μＬを使用した。各インキュベーション（一次抗体及び二次抗体を含む）を４℃で３０分間行った。インキュベーション後、ＦＡＣＳ解析前に洗浄ステップを１回行った。未使用の任意の細胞を画像検査に使用した。

例示的ＦＡＣＳプロットを図３８Ａ及び図３８Ｂに示す。図３８Ａにおいて、黒線は、二次抗体のみとインキュベートしたＡＲＫ２細胞によるシグナルを表し、赤線は、ＡＢ３－７のｓｃＦｖと共にインキュベートしたＡＲＫ２細胞によるシグナルを表す。図３８Ｂにおいて、黒線は、二次抗体のみとインキュベートしたＭ２０２細胞によるシグナルを表し、赤線は、ＡＢ３－７のｓｃＦｖと共にインキュベートしたＭ２０２細胞によるシグナルを表す。

上記と同じＦＡＣＳ実験をＡＢ１－１１ ｓｃＦｖを用いて行った。一次抗体はｓｃＦｖであり、反応あたり２μｇで使用した。二次抗体はＢｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号６５２５１３であり、反応あたり０．５μｇ／μＬストックの１μＬを使用した。各インキュベーション（一次抗体及び二次抗体を含む）を４℃で３０分間行った。インキュベーション後、ＦＡＣＳ解析前に洗浄ステップを１回行った。結果を図３９Ａ及び図３９Ｂに示す。図３９Ａに示されるように、ＣＬＤＮ６及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を過剰発現する２９３Ｔ細胞は、細胞をｓｃＦｖとインキュベーションしてから二次抗体と共にインキュベートした場合にのみ、ＦＡＣＳで検出されるシグナルを生成し、細胞を二次抗体のみ（ｓｃＦｖなし）とインキュベートした場合には生成しなかった。ＡＲＫ２細胞は、ＦＡＣＳで検出される同様のパターンを示した。図３９Ｂに示されるように、ＧＦＰを発現する２９３Ｔ細胞のみがＧＦＰ特異的シグナルを生成し、Ｍ２０２細胞及びＡＲＫ２細胞（ＧＦＰを発現しない）では生成されなかった。図４０Ａ～図４０Ｃに、本実験による例示的ＦＡＣＳプロットを示す。図４０Ａにおいて、黒線は、二次抗体のみとのインキュベーション時の、ＣＬＤＮ６及びＧＦＰを発現する２９３Ｔ細胞のシグナルであり、赤線は、これらの細胞の、ＡＢ３－７ ｓｃＦｖとのインキュベーション、それに続く二次抗体とのインキュベーション時のシグナルであり、青線は、これらの細胞の、ＡＢ１－１１ ｓｃＦｖとのインキュベーション、それに続く二次抗体とのインキュベーション時のシグナルである。図４０Ｂ及び図４０Ｃは、色付き線を用いてこれと同じスキームに従ったものであるが、図４０ＢがＭ２０２細胞からのシグナルであり、図４０ＣがＡＲＫ２細胞からのシグナルである点が異なる。図４０Ｄ～図４０Ｆは、図４０Ａで試験した２９３Ｔ細胞の各群が、量においてほぼ同数であったことを示す。

これらのデータは、ヒト化ＣＬＤＮ６抗体のｓｃＦｖが抗原に強く結合することを示す。

実施例１６
本実施例は、ＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビトロ特性解析を示す。

ヒト化ＡＢ３－７抗体（ＡＢ２３とも呼び、例えば、表８を参照のこと）を用いて、リンカー－薬物の様々な組み合わせを含むＡＤＣ、すなわち、（ａ）ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ、（ｂ）ＧＧＦＧ－ＭＭＡＥ、（ｃ）ＣＬ２Ａ－ＳＮ３８、（ｄ）ＧＧＦＧ－Ｄｘｄ、及び（ｅ）ＶＣ－ＰＡＢ－Ｄｘｄを作製した。ＡＤＣは、ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）にて調製された。

図４１Ａ～図４１Ｈは、ＡＢ３－７を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣの生化学的特性解析を示す。図４１Ａは、ＡＢ３－７を含む７つのＣＬＤＮ６ ＡＤＣの生化学的性質をまとめた表である。Ｄ４として表示されているＡＤＣは、抗体あたり４つの薬物が結合される（Ｄ４技術、ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの技術）相当数の抗体を含む、実質的に均一な複合体を指す。ＣＴＲＬとして表示されているＡＤＣは、抗体あたりガウス分布の薬物数を含む、従来型の不均一複合体（従来型）を指す。ＡＤＣは、低い割合の非複合体型抗体、高分子量（ＨＭＷ）種、及び非複合体型遊離薬物を含んだ。ＡＤＣはまた、低レベルのエンドトキシンも含み、それらがインビボ試験に好適となるようにした。図４１Ｂ～図４１Ｈは、各ＡＤＣについて、異なる数の薬物と結合させた抗体の相対存在量を示すＨＩＣ－ＨＰＬＣクロマトグラムを表す。例えば、Ｄ０下のピーク面積は、非複合体型ＡＢ３－７の相対存在量を示す。同様に、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３・・・Ｄ８の下のピーク面積は、抗体あたり１つ、２つ、３つ・・・８つの薬物に結合させたＡＢ３－７抗体の相対存在量を示す。

図４２は、ＡＢ３－７を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣの分子の完全性は複合体化により変化することがなかったことを示す。ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ及び非複合体型ＡＢ３－７抗体の分子の完全性を、ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ ４～１６％ビス－Ｔｒｉｓタンパク質ゲル（カタログ番号ＢＮ１００２ＢＯＸ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により評価した。Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥは、タンパク質の天然構造の実効電荷、サイズ、及び形状に従ってタンパク質を分離する。天然条件下、７つの全ＣＬＤＮ６ ＡＤＣは構造的に無傷のままであり、非複合体型ＡＢ３－７抗体と比較して分解の兆候を何ら示さなかった。したがって、複合体化がＡＢ３－７抗体の分子の完全性を変化させることはない。

図４３は、複合体化が、ＡＢ３－７抗体の結合親和性に影響を与えることはないことを示す。フローサイトメトリーは、ＡＢ３－７を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣが、ＣＬＤＮ６に対する特異的かつ高い結合親和性を保持することを示す。ＡＤＣ結合活性を、（ａ）ＵＭＵＣ４膀胱癌細胞株（ＣＬＤＮ６を天然に発現する）、（ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ ＣＬＤＮ６－ｍＧＦＰ Ａ１１（ＣＬＤＮ６を人工的に過剰発現（ＯＥ）するよう操作されている）、及び（ｃ）Ｍ２０２メラノーマ細胞株（ＣＬＤＮ６陰性細胞）の３つの細胞株についてフローサイトメトリーにより分析した。具体的には、ＡＤＣを、５０μｌの２％ＦＢＳ／ＰＢＳ中で約１５０，０００細胞と共に４℃にて３０分間インキュベートし、その後、２％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄した。その後、ＡＤＣをＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（４０９３２０）製Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６フローサイトメーターで結合を測定した。７つの異なるＣＬＤＮ６ ＡＤＣでは、それらの非複合体型抗体ＡＢ３－７とＣＬＤＮ６陽性細胞株（ＵＭＵＣ４細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ ＣＬＤＮ６－ｍＧＦＰ Ａ１１）の場合と比較して、同様の結合親和性がフローサイトメトリーにより示されたが、ＣＬＤＮ６陰性細胞株（Ｍ２０２）では結合は示されなかった。

図４４はさらに、複合体化が、ＡＢ３－７抗体の結合親和性に影響を与えることはないことを示す。解離定数（ＫＤ）の測定値から、ＡＢ３－７を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣは、ＣＬＤＮ６に対する特異的かつ高い結合親和性を保持することが示された。ＣＬＤＮ６ ＡＤＣの細胞ベースの抗体親和性（ＫＤ）をＫｉｎＥｘＡ ４０００（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）により測定した。簡単に言えば、ＨＥＫ２９３Ｔ ＣＬＤＮ６－ｍＧＦＰ Ａ１１細胞をｖｅｒｓｅｎｅを使用して剥離させ、５００ｐＭまたは１０ｎＭの抗体含有２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで４℃にて一晩平衡化した。細胞濃度は、５ｘ１０^６細胞／ｍｌで開始し、２倍系列希釈を最高１０段階まで実施した。翌日、細胞を１５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離にかけ、上清を保存した。ＰＭＭＡビーズ（Ｓａｐｉｄｙｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、カタログ番号４４０１７６）を、３０μｇ／ｍｌのヤギ－抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ（カタログ番号１０９－００５－００３）でプレコートした。蛍光二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、カタログ番号１０９－６０５－０８８）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌにて希釈した。抗体溶液のみ（シグナル、１００％）及び非特異的結合（ＮＳＢ、緩衝液のみ）対照群も測定値に含めた。ｎ－曲線分析で分析した２つの抗体の曲線を使用してＫＤを計算した。図４４で示されるように、結合親和性（ＫＤ）は、すべてのＡＤＣ及び非複合体型ＡＢ３－７全体を通して同様である。したがって、リンカー－薬物の様々な組み合わせへの複合体化が、ＨＥＫ２９３Ｔ ＣＬＤＮ６－ｍＧＦＰ Ａ１１細胞上に発現されたＣＬＤＮ６に対する抗体結合親和性を変化させることはなかった。

図４５は、ＡＢ３－７を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣが、ＡＤＣの活性化において重要なステップであるがん細胞による内部移行を効率的に受けることを示す。具体的には、ＡＲＫ２細胞（ＣＬＤＮ６を発現する子宮癌肉腫）は、核（青色）、リソソーム（緑）及びＣＬＤＮ６ ＡＤＣ（赤）が染色された。上段パネルの画像は初期段階（ＡＤＣ／抗体染色後３０分以内）で取得され、下段パネルの画像は後期段階（ＡＤＣ／抗体染色後５～６時間）で取得されたものであり、ＡＤＣまたは非複合体型抗体と複合体を形成したＣＬＤＮ６の内部移行を示している。図４５で示されるように、複合体化により、抗体の非複合体型抗体ＡＢ３－７の場合の内部移行速度と比較して、抗体の内部移行速度を変化させることはなかった。

実施例１７
本実施例は、がん細胞に対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビトロでの抗がん活性を示す。

図４６Ａ～図４６Ｇは、ＡＢ３－７を含む異なるＣＬＤＮ６ ＡＤＣのがん細胞に対する２Ｄ増殖抑制作用を示す。ＣＬＤＮ６ ＡＤＣの抗増殖活性を、４つのがん細胞株、すなわち、ＣＬＤＮ６陽性細胞株（ＵＭＵＣ４、ＯＶ９０）及びＣＬＤＮ６陰性細胞株（ＭＣＦ７、Ｍ２０２）に対して試験した。各細胞株を、４８ウェルプレートのウェル内にウェルあたり３００～１０００細胞の範囲で均一に播種した。４８時間後、細胞株あたりのウェルあたり細胞数のベースライン値を測定した。残りのウェルの細胞を６つの薬物濃度の１：５の系列希釈で処理し、最終処理濃度を２００ｎＭ（３０ｎｇ／ｍＬ）～０．０６４ｎｍ（０．００９６ｎｇ／ｍＬ）の範囲とした。７日後、抗増殖活性を、処理した場合と未処理の場合の細胞数を比較することにより評価した。

図４６Ａ～図４６Ｇで示されるように、ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（従来型）を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣ及びＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（Ｄ４技術）を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣは、ＣＬＤＮ６陽性細胞（ＵＭＵＣ４）に対し、最も大きな抗増殖効力と特異性を示す点で比較可能であった。ＣＬ２Ａ－ＳＮ３８（従来型）を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣ及びＣＬ２Ａ－ＳＮ３８（Ｄ４技術）を含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣは、同等に類似した抗増殖効力を示したが、非特異的であり、ＣＬＤＮ６陽性細胞とＣＬＤＮ６陰性細胞とで区別せずに死滅させた。ＭＣ－ＧＧＦＧ－ＭＭＡＥを含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣは、ＣＬＤＮ６陽性細胞（ＵＭＵＣ４）に対して特異性を伴う低い抗増殖効力を示した。ＭＣ－ＧＧＦＧ－ＤＸＤを含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣ及びＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＤＸＤを含むＣＬＤＮ６ ＡＤＣは、どの細胞株に対しても増殖抑制作用を示さなかった。

図４６Ｈ～図４６Ｎは、ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥと結合させたＡＢ１－１１（ＡＤＣ－１１）を含むＣＬＤＮ６の、様々な細胞株に対する２Ｄ増殖抑制作用を示す。具体的には、４つの細胞株、すなわち、ＣＬＤＮ６陽性細胞株（ＡＲＫ２、ＯＶＣＡ４２９、Ｈ８４１、ＯＶ９０、Ｈ１６９３）及びＣＬＤＮ６陰性細胞株（ＭＣＦ７、Ｍ２０２）を試験した。各細胞株を、４８ウェルプレートのウェル内にウェルあたり３００～１０００細胞の範囲で均一に播種した。４８時間後、細胞株あたりのウェルあたり細胞数のベースライン値を測定した。残りのウェルの細胞を（ａ）ＣＬＤＮ６指向性ＡＤＣ－１１、（ｂ）対照ＡＤＣ（ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥに結合させた非標的指向性ＩｇＧ）、（ｃ）非複合体型非標的指向性ＩｇＧ、及び（ｄ）非複合体型ＡＢ１－１１の１：５の系列希釈で処理し、最終処理濃度を１０００ｎＭ（１５０ｎｇ／ｍＬ）～０．３２ｎＭ（０．００４８ｎｇ／ｍＬ）の範囲とした。７日後、抗増殖活性を、処理した対照の場合と未処理対照の場合とで細胞数を比較することにより評価した。

図４６Ｈ～図４６Ｎで示されるように、ＡＤＣ－１１は、ＣＬＤＮ６陽性細胞株（ＡＲＫ２、ＯＶＣＡ４２９、Ｈ８４１、ＯＶ９０、Ｈ１６９３）に対して強い抗増殖活性を示し、ＣＬＤＮ６陰性細胞株（Ｍ２０２及びＭＣＦ７）に対しては活性を示さなかった。

実施例１８
この実施例は、がん細胞株異種移植片に対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣのインビボ抗がん効果を示す。

インビボ試験ではいずれも、腫瘍異種移植片をキャリパーで週３回測定し、高さ×幅×長さで乗算して腫瘍体積をｍｍ^３単位で求めた。動物での作業はすべて、ＩＡＣＵＣ及びＵＣＬＡ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されている操作手順を基に行われた。ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）製ＳｔｕｄｙＬｏｇソフトウェアを使用してデータを分析した。

図４７は、ＣＬＤＮ６陽性卵巣癌細胞株（ＯＶ９０）異種移植片に対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣの抗がん効果を示す。ここで試験したＣＬＤＮ６ ＡＤＣは、ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥと結合させたヒト化ＡＢ１－１１（ＡＤＣ－１１；従来型）を含む。ＯＶ９０卵巣癌細胞株異種移植片は、６週齢のＣＤ－１胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において、５０％マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた１．０×１０^７細胞の動物右側背への皮下注射により樹立した。腫瘍が１００～２００ｍｍ^３の平均サイズに達した時点で、マウス（ｎ＝８）を、１）非標的指向性ヒトＩｇＧ１対照抗体を１０ｍｇ／ｋｇ、ＱＷ、ＩＶで４週間、２）ヒト化ＣＬＤＮ６－ＡＢ１－１１（ＨＵ－１１）を１０ｍｇ／ｋｇ、ＱＷ、ＩＶ（静脈内注射）で４週間、３）ＡＤＣ－１１を５ｍｇ／ｋｇ、ＱＷ、ＩＶで３週間、及び４）非標的指向性対照ＡＤＣを５ｍｇ／ｋｇ、ＱＷ、ＩＶで３週間、のいずれかの処置群に無作為に分けた。異種移植片は、投与後、腫瘍の進行まで追跡された。ＣＬＤＮ６ ＡＤＣによる処置は、異種移植腫瘍の退縮をもたらした。ＣＬＤＮ６ ＡＤＣの活性は、非複合体型ＣＬＤＮ６ ｍＡｂまたは非標的指向性対照ＡＤＣで観察されたものより優っている。

図４８Ａ及び図４８Ｂは、ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－１１（従来型）がＣＬＤＮ６陰性メラノーマがん細胞株（Ｍ２０２）異種移植片に対して抗がん活性がないことを示す。ＡＤＣ－１１は、ＣＬＤＮ６を発現しないＭ２０２細胞株異種移植片では何の抗がん活性も示さなかった。Ｍ２０２メラノーマがん細胞株異種移植片は、６週齢のＣＤ－１胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において、５０％マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた１．０×１０^７細胞の動物右側背への皮下注射により樹立した。腫瘍が１００～３００ｍｍ^３の平均サイズに達した時点で、マウス（ｎ＝８）を、１）非標的指向性ヒトＩｇＧ１対照抗体を１０ｍｇ／ｋｇ、ＱＷ、ＩＶで４週間、または２）ＡＤＣ－１１を５ｍｇ／ｋｇ、ＱＷ、ＩＶで３週間、のいずれかの処置群に無作為に分けた。ＣＬＤＮ６陰性異種移植片に対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣの抗がん活性欠如は、ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ活性の特異性を示している。

図４９Ａ及び図４９Ｂは、がん細胞株異種移植片に対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３のインビボ抗がん効果を示す。ここで試験したＣＬＤＮ６ ＡＤＣは、ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥと結合させたヒト化ＡＢ３－７（ＡＤＣ－２３；従来型）を含む。図４９Ａは、ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３が、ＣＬＤＮ６陽性膀胱細胞株（ＵＭＵＣ４）異種移植片に対して有効であることを示す。具体的には、ＵＭＵＣ４膀胱癌細胞株異種移植片は、６週齢のＣＤ－１胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において、５０％マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた１．０×１０^７細胞の動物右側背への皮下注射により樹立した。腫瘍が１００～２００ｍｍ^３の平均サイズに達した時点で、マウス（ｎ＝８）を、１）非標的指向性ヒトＩｇＧ１（Ｈｕ－ＩｇＧ１）対照抗体を１０ｍｇ／ｋｇ、週１回（ＱＷ、ＩＶ）で４週間、２）ヒト化ＣＬＤＮ６ ＡＢ３－７抗体（Ｈｕ２３）を１０ｍｇ／ｋｇ、ＱＷ、ＩＶで４週間、３）ＡＤＣ－２３を５ｍｇ／ｋｇ、ＱＷ、ＩＶで３週間、のいずれかの処置群に無作為に分けた。異種移植片は、投与後、腫瘍の進行まで、または処置開始後６０日まで追跡された。図４９Ｂは、Ｈｕ－ＩｇＧ１対照抗体または５ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ－２３による処置後の示されている時点で採取された異種移植片組織のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す。試験中に採取された異種移植片組織の組織病理学的分析では、上皮腫瘍細胞含有物がＡＤＣ－２３での処置マウスで消失したことが示された（図４９Ｂ）。

ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３による処置は、ＵＭＵＣ４ ＣＬＤＮ６陽性細胞株異種移植片において異種移植腫瘍の退縮をもたらした。図４９Ａ及び図４９Ｂに示されたデータ及び上記で示されたデータは、両ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ（ＡＤＣ－１１及びＡＤＣ－２３）ともＣＬＤＮ６陽性細胞株異種移植片に指向させるのに有効であることを示す。

実施例１９
この実施例は、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）に対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３のインビボ抗がん活性を示す。

図５０Ａ～図５０Ｅは、卵巣癌ＰＤＸモデルに対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３（従来型）のインビボ抗がん効果を示す。具体的には、卵巣ＰＤＸ試料のパネルを、ＣＬＤＮ６タンパク質発現についてウエスタンブロット法でスクリーニングした（図５０Ａ）。２つのＣＬＤＮ６陽性（ＤＦ１８９ ＆ ＤＦ１８１）及び１つのＣＬＤＮ６陰性（ＤＦ２０）試料を試験用に選択した。各ＰＤＸからの卵巣癌細胞にルシフェラーゼ酵素をトランスフェクトしてから免疫不全マウス（ＮＳＧ）の腹腔内への注射を行った（図５０Ｂ）。図５０Ｃ～図５０Ｅは、（１）非標的指向性Ｈｕ－ＩｇＧ１対照抗体を１０ｍｇ／ｋｇ、ＱＷ、ＩＶで４週間、（２）ヒト化ＣＬＤＮ６ ＡＢ３－７を１０ｍｇ／ｋｇ、ＱＷ、ＩＶで４週間、または（３）ＡＤＣ－２３を５ｍｇ／ｋｇ、ＱＷ、ＩＶで３週間、により処置されたマウスで週１回測定されたルシフェラーゼ活性の結果を示す。Ｈｕ－ＩｇＧ１対照またはＣＬＤＮ６ ＡＢ３－７ ｍＡｂにより処置されたマウスは、試験したＰＤＸモデルのそれぞれの場合で、マウスを安楽死させなければならないがん細胞移植後約５０日目まで腹腔内での継続的な腫瘍量増加を示した。しかしながら、ＡＤＣ－２３により処置されたマウスでは、腫瘍量の顕著な減少及び全生存の顕著な改善が示された。これらの反応は、ＣＬＤＮ６陽性卵巣癌細胞を注射されたマウスに限定されていた（図５０Ｃ及び図５０Ｄ）。ＤＦ２０ ＣＬＤＮ６陰性モデルでは、処置に対するわずかな有益性しか示されず、全生存に対する影響はなかった（図５０Ｅ）。

実施例２０
この実施例は、ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３の用量依存性の活性を示す。

図５１Ａ～図５１Ｃは、ＣＬＤＮ６陽性卵巣癌細胞株（ＯＶ９０）異種移植片に対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３（Ｄ４技術）の用量依存性抗がん活性を示す。ＯＶ９０卵巣癌細胞株異種移植片は、６週齢のＣＤ－１胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において、５０％マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた１．０×１０^７細胞の動物右側背への皮下注射により樹立した。腫瘍が約２００ｍｍ^３の平均サイズに達した時点で、マウス（ｎ＝６）を処置群に無作為に分けた。ＯＶ９０異種移植片を持つマウスを、０．１ｍｇ／ｋｇ～２．５ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ、ＱＷで３週間）の範囲の様々な用量で処置した。投与濃度の減少に伴い、抗腫瘍活性の低下が観察された。２．５ｍｇ／ｋｇのＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３による処置で、均一な異種移植片の縮小が誘導された（図５１Ａ及び図５１Ｂ）。ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３による処置に反応したマウス体重への影響は、投与したいずれの用量においても観察されなかった（図５１Ｃ）。したがって、新規ＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３の選択的かつ用量依存性の活性が、ＣＬＤＮ６陽性卵巣癌細胞株異種移植片で確認された。

図５２Ａ～図５２Ｃは、ＣＬＤＮ６陰性メラノーマがん細胞株（Ｍ２０２）異種移植片においてＣＬＤＮ６ ＡＤＣ－２３（Ｄ４技術）のオフターゲット活性はないことを示す。Ｍ２０２メラノーマがん細胞株異種移植片は、６週齢のＣＤ－１胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において、５０％マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた１．０×１０^７細胞の動物右側背への皮下注射により樹立した。腫瘍が約２００ｍｍ^３の平均サイズに達した時点で、マウス（ｎ＝６）を処置群に無作為に分けた。Ｍ２０２メラノーマ異種移植片担持マウスを、０．１ｍｇ／ｋｇ～２．５ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ、ＱＷで３週間）の範囲の様々な用量により処置した。ＣＬＤＮ６陰性Ｍ２０２異種移植片に対するＣＬＤＮ６ ＡＤＣの抗がん活性は、投与したいずれの用量においても観察されなかった（図５２Ａ及び図５２Ｂ）。ＣＬＤＮ６ ＡＤＣによる処置に反応したマウス体重への影響は、投与したいずれの用量においても観察されなかった（図５２Ｃ）。

実施例２１
この実施例は、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質の生産を示す。

ここでは、２つのＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）、すなわち、（ａ）ＣＤ３結合部分に融合させた、ＡＢ１－１１のＣＬＤＮ６結合部分（ＢｉＴＥ－１１）、及び（ｂ）ＣＤ３結合部分に融合させた、ＡＢ３－７のＣＬＤＮ６結合部分（ＢｉＴＥ－２３）を調製し、特徴付けを行った。

図５３Ａは、ＣＤ３Ｅ結合性のＶＨドメイン及びＶＬドメインと融合させたＣＬＤＮ６結合性のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む例示的な二重特異性タンパク質の概略図を示す。融合タンパク質は、精製と検出を容易にするため、６つのヒスチジン残基を含むＨＩＳタグでタグ付けされる。

図５３Ｂ及び図５３Ｃはそれぞれ、ＢｉＴＥ－２３及びＢｉＴＥ－１１の精製及びバリデーションを示す。ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質は、ＥｘｐｉＣＨＯ発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発現させ、Ｔａｌｏｎ ｍｅｔａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，カタログ番号６３５５０３）またはタンパク質Ｌアガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２０５１２）を使用して精製した。

実施例２２
この実施例は、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質のインビトロ特性解析を示す。

図５４Ａ～図５４Ｅは、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質の、天然ＣＬＤＮ６陽性細胞（ＡＲＫ２）及びＣＬＤＮ６を過剰発現するよう操作された細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ ＣＬＤＮ６－ｍＧＦＰ ＨＩＳ２０細胞）への効率的結合を示す。具体的には、ＣＬＤＮ６陽性細胞（ＡＲＫ２及びＨＥＫ２９３Ｔ ＣＬＤＮ６－ｍＧＦＰ ＨＩＳ２０細胞）及びＣＬＤＮ６陰性細胞（ＨＵＰＴ４）をそれぞれ、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質及び検出用の抗ＨＩＳ二次抗体と共にインキュベートした。フローサイトメトリーアッセイを実施し（図５４Ａ～図５４Ｃ）、細胞の画像を取得した（図５４Ｄ及び図５４Ｅ）。ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質は、ＣＬＤＮ６陽性細胞株に結合するが、ＣＬＤＮ６陰性細胞株には結合しないため、ＣＬＤＮ６に対する二重特異性タンパク質の特異的かつ効率的な結合を示している。

図５５Ａ及び図５５Ｂは、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質がＴ細胞活性化を誘導することを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＮＦＡＴ－ＲＥレポーター及びＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質と共にを使用してＴ細胞活性化アッセイを実施した。具体的には、Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｂｉｏａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号ＮＦＡＴ－ＲＥ Ｊ１６２１）を使用してＴ細胞活性化を測定した。複数の細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ－ＣＬＤＮ６陽性、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＣＬＤＮ６陰性、ＡＲＫ２、ＵＭＵＣ４及びＯＫＴ３）を白色９６ウェルプレートのウェルに４０，０００細胞／ウェルの密度で播種して３７℃で一晩インキュベートし、その後、アッセイキットに同梱されているｔｈａｗ－ａｎｄ－ｕｓｅ式のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を播種細胞に加え（１：１の細胞比）、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質で処理した。処理したプレートを３７℃で６～２４時間インキュベートし、その後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬（キットに同梱）を加え、直ちにＶｉｃｔｏｒ ３Ｖ発光光度計で秒あたりカウント（ＣＰＳ）の単位で読み取った。ＣＬＤＮ６を過剰発現する細胞株（内因的な株及び操作株）は、ＢｉＴＥ－１１及びＢｉＴＥ－２３で処理した場合にＴ細胞の活性化を誘導したが、ＣＬＤＮ６陰性細胞株は大幅に低レベルの活性化が誘導された。

図５６は、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質が、ＣＬＤＮ６陽性細胞とのインキュベーション時にＴ細胞クラスター形成を誘導することを示す。具体的には、図５６は、処理後３日目のＣＬＤＮ６－ＣＤ３細胞毒性アッセイの代表的画像を示す。Ｐａｎ ＣＤ３＋ヒトＰＢＭＣを、ＣＬＤＮ６陽性細胞株のＡＲＫ２と共に異なるエフェクター：標的比で共培養し、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質またはブリナツモマブ（陰性対照）で処理した。１２５ｎｇ／ｍｌのＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質による処理の３日後のＴ細胞クラスタリングを示す代表的画像を、ブリナツモマブ対照と比較した（図５６）。

図５７は、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質が、がん細胞に対する標的特異的かつ用量依存性の細胞毒性を誘導することを示す。具体的には、図５７は、処理後３日目の、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質により誘導されたＬＤＨ活性を示す。図５５Ａ及び図５５Ｂのアッセイ概要と同じアッセイ概要で、ＬＤＨ活性を細胞損傷マーカーとして評価した。培地を回収し、１４，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。上清を保存し、ＬＤＨ活性アッセイ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＭＡＫ０６６）に６μｌを使用した。１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩは陰性対照として使用した。アッセイを３７℃で実施し、マイクロプレートリーダー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ）を使用して、１５分ごとに３０秒の間隔を挟んでＯＤ４５０ｎＭを測定した。

図５７で示されるように、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３二重特異性タンパク質は、標的特異的細胞毒性を用量依存的に誘導する。ＣＤ３陽性ヒトＰＢＭＣ共培養し、ＢｉＴＥ－１１（ｐ１１－１１）またはＢｉＴＥ－２３（ｐ２３－７）のいずれかで処理されたＡＲＫ２細胞は、ブリナツモマブで処理された細胞と比較して著しく高いレベルのＬＤＨを放出した。エフェクター細胞と標的細胞の比に依存性の反応もまた観察され、細胞毒性作用にはＣＤ３陽性細胞が必要であることを示している。

実施例２３
この実施例は、ＣＬＤＮ６指向性タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）作製及びインビトロ特性解析を示す。

ここでは、２つのＣＬＤＮ６－ＣＤ１６二重特異性ＴａｎｄＡｂ、すなわち、（ａ）ＣＤ１６Ａ結合部分に融合させた、ＡＢ１－１１のＣＬＤＮ６結合部分（ＴａｎｄＡｂ１１）、及び（ｂ）ＣＤ１６Ａ結合部分に融合させた、ＡＢ３－７のＣＬＤＮ６結合部分（ＴａｎｄＡｂ ２３）を調製し、試験した。

図５８は、ＣＤ１６Ａ結合性のＶＨドメイン及びＶＬドメインと融合させたＣＬＤＮ６結合性のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む例示的な二重特異性タンパク質の概略図を示す。融合タンパク質は、精製と検出を容易にするため、６つのヒスチジン残基を含むＨＩＳタグでタグ付けされる。

図５９Ａ～図５９Ｄは、ＣＬＤＮ６－ＣＤ１６Ａ二重特異性タンパク質が、天然ＣＬＤＮ６陽性細胞（ＡＲＫ２）には効率的に結合するが、ＣＬＤＮ６陰性細胞（ＨＵＰＴ４）には効率的に結合しないことを示す。具体的には、ＣＬＤＮ６陽性細胞（ＡＲＫ２）及びＣＬＤＮ６陰性細胞（ＨＵＰＴ４）をそれぞれＣＬＤＮ６－ＣＤ１６Ａ ＴａｎｄＡｂ及び検出用の抗ＨＩＳ二次抗体と共にインキュベートした。フローサイトメトリーアッセイを実施し（図５９Ａ及び図５９Ｂ）、細胞の画像を取得した（図５９Ｃ及び図５９Ｄ）。ＣＬＤＮ６－ＣＤ１６Ａ ＴａｎｄＡｂは、ＣＬＤＮ６陽性細胞と結合したが、ＣＬＤＮ６陰性細胞とは結合しなかったため、ＣＬＤＮ６に対するＴａｎｄＡｂの特異的かつ効率的な結合を示している。

実施例２４
本実施例は、免疫応答を調節するＣＬＤＮ６二重特異性タンパク質のインビボ抗がん活性を示す。

図６０は、ヒトＰＢＭＣを注射されたマウスのＣＬＤＮ６陽性がん細胞株異種移植片（ＵＭＵＣ４）におけるＣＬＤＮ６－ＣＤ３ ＢｉＴＥの強いインビボ抗がん活性を示す。具体的には、免疫不全状態（ＮＳＧ）マウスに、（ａ）１．０×１０^７のヒトドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、（ｂ）ＩＬ－２で刺激されたドナーＰＢＭＣ、または（ｃ）ヒトドナーＰＢＭＣから分離されたＮＫ細胞の腹腔内注射の１２日前に１．０×１０^７のＵＭＵＣ４膀胱細胞を注射した。ＰＢＭＣ／ＮＫ細胞の注射翌日、マウスを（ａ）１ｍｇ／ｋｇのＢｌｉｎｃｙｔｏｍａｂ（非標的指向性対照）、（ｂ）２ｍｇ／ｋｇのＡＦＭ１３（非標的指向性ＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂ）、（ｃ）１ｍｇ／ｋｇのＢｉＴＥ－１１、（ｄ）１ｍｇ／ｋｇのＢｉＴＥ－２３、（ｅ）２０ｍｇ／ｋｇのＴａｎｄＡｂ－１１、または（ｆ）２０ｍｇ／ｋｇのＴａｎｄＡｂ－２３により継続的に７日間処置した。対照として、追加群のマウスを１０ｍｇ／ｋｇのＡＢ３－７（ＩＶ、ＱＷ）で処置した。ＢｉＴＥ－１１またはＢｉＴＥ－２３により処置されたマウスで顕著な腫瘍退縮が観察された。したがって、ＣＬＤＮ６－ＣＤ３ ＢｉＴＥは強い抗腫瘍活性を有する。

図６１は、ＢＬＴマウスでのＣＬＤＮ６陽性がん細胞株異種移植片（ＵＭＵＣ４）に対するＣＬＤＮ６－ＣＤ３ ＢｉＴＥのインビボ抗がん活性を示す。具体的には、免疫不全状態（ＮＳＧ）マウスに、完全ヒト化免疫系を発生させるため、胎児ドナーＣＤ３８＋幹細胞及びドナー肝臓と胸腺の断片を移植した。１．０×１０^７のＵＭＵＣ４膀胱癌細胞を用いた注射の前に、これらのＢＬＴ（骨髄・肝臓・胸腺）マウスでヒト免疫細胞の再構成が確認された。腫瘍が２００～３００ｍｍ^３の平均体積に達した時点で、マウスを（ａ）１ｍｇ／ｋｇの非標的指向性Ｈｕ－ＩｇＧ１対照、（ｂ）１ｍｇ／ｋｇのＢｉＴＥ－２３、または（ｃ）２ｍｇ／ｋｇのＴａｎｄＡｂ－２３によりＩＶ注射で５日連続処置した。ＢｉＴＥ－２３により処置されたマウスで顕著な腫瘍退縮が観察された。これらのデータは、ＣＬＤＮ６指向性ＢｉＴＥが極めて有効であり、顕著な抗腫瘍活性を付与することを示している。

刊行物、特許出願、及び特許を含めて、本明細書で引用されるすべての参考文献は、各々の参考文献が参照により組み込まれることが個々に具体的に示されているかの如く、また、その全体が本明細書に記載されているかの如く同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

本開示を説明する文脈において（特に以下の請求項の文脈において）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の指示語の使用は、本明細書で他の意味が示されるか、または明らかに文脈と矛盾しない限り、単数及び複数の両方が含まれると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する」は、特に明記しない限り、非限定的用語（すなわち、「含まれるが、それらに限定されない」ことを意味する）として解釈されるべきである。

本明細書における数値範囲の詳述は、本明細書中で特に明記しない限り、その範囲内に該当する別個の値及び端点それぞれに個々に言及する簡略な方法として使用されるものであり、別個の値及び端点それぞれは、それが個々に本明細書で引用されているかの如く明細書に組み込まれる。

本明細書に記載される方法はすべて、本明細書で他の意味が示されるか、または明らかに文脈と矛盾しない限り、あらゆる好適な順序で実施可能である。本明細書に記載されるすべての例、または様々な言語（例えば、「等（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本開示をより明確にすることのみを意図しており、特許請求の範囲に別段の記載がない限り、開示の範囲に制限を設けるものではない。本明細書内のいかなる言語も、特許請求されていない任意の要素を本開示の実施に不可欠な要素として示していると解釈されるべきではない。

本明細書では本開示の好ましい実施形態が記載されており、開示を実施するための、本発明者らが知っている最良の方法が含まれる。それらの好ましい実施形態の変形は、前述の説明を一読した時点で、当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がそのような変形を適宜採用することを予想しており、また本発明者らは、本開示が、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施されることを意図している。したがって、本開示には、適用法令により許可されているように、本明細書に添付の特許請求の範囲で記述される主題のあらゆる変更及び均等物が含まれる。さらに、本明細書で他の意味が示されるか、または明らかに文脈と矛盾しない限り、上記要素について、その考えられるあらゆる変形のいかなる組み合わせも本開示に包含される。

Claims (105)

1. ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質（配列番号２００）と、第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、
   ａ．前記抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ６の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の細胞外ループ２（ＥＬ２）に結合し、ＣＬＤＮ６の前記ＥＣＤの細胞外ループ１（ＥＬ１）には結合しないか、または
   ｂ．クローディン３（ＣＬＤＮ３）、クローディン４（ＣＬＤＮ４）、及びクローディン９（ＣＬＤＮ９）のいずれにも結合せず、ＯＶＣＡ４２９細胞により内因的に発現されるＣＬＤＮ６への参照抗体の結合を約１２００ｎＭ未満で阻害するか、または
   ｃ．その組み合わせ、である、前記二重特異性抗原結合タンパク質。
2. ＷＴＡＨＡＩＩＲＤＦＹＮＰＬＶＡＥＡＱＫＲＥＬ（配列番号２）のアミノ酸配列内のエピトープに結合する、請求項１に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
3. ＣＬＤＮ６のＴＡＨＡＩＩＲＤＦＹＮＰＬ（配列番号３）またはＬＶＡＥＡＱＫＲＥＬ（配列番号４）のアミノ酸配列に結合する、請求項２に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
4. クローディン３（ＣＬＤＮ３）、クローディン４（ＣＬＤＮ４）、及びクローディン９（ＣＬＤＮ９）のうちの１つにも複数にも結合しない、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
5. ＣＬＤＮ３に結合しない、請求項４に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
6. ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ４、及びＣＬＤＮ９に結合する、請求項５に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
7. ＣＬＤＮ９に結合しない、請求項５に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
8. ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ４に結合する、請求項７に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
9. ＣＬＤＮ４に結合しない、請求項５に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
10. ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９に結合する、請求項９に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
11. 前記参照抗体は、配列番号１８１の軽鎖可変配列と配列番号１８２の重鎖可変配列、または配列番号１８５の軽鎖可変配列と配列番号１８６の重鎖可変配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
12. ａ．表Ａに記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、もしくは配列番号１１、１７、２３、２９、３５、４１、４７、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、及び１３１からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
    ｂ．表Ａに記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、もしくは配列番号１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、８６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、及び１３２からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
    ｃ．表Ａに記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、もしくは配列番号１３、１９、２５、３１、３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、及び１３３からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
    ｄ．表Ａに記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、もしくは配列番号８、１４、２０、３２、３８、４４、５０、５６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、及び１２８からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
    ｅ．表Ａに記載の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、もしくは配列番号９、１５、２１、２７、３３、３９、４５、５１、５７、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、及び１２９からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
    ｆ．表Ａに記載の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、もしくは配列番号１０、１６、２２、２８、３４、４０、４６、５２、５８、６４、７０、７６、８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、及び１３０からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
    ｇ．（ａ）～（ｆ）のうちいずれか２つ以上の組み合わせ
    を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
13. 前記変異配列は、少なくとも約８０％または約もしくは少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１２に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
14. 前記変異配列は、少なくとも約９０％の配列同一性または約もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１３に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
15. 表Ａに記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列と、表Ａに記載の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの１つまたは２つとを含む、請求項１２に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
16. 表Ａに記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列と、表Ａに記載の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの１つまたは２つとを含む、請求項１２に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
17. ａ．配列番号７４～７９、
    ｂ．配列番号５０～５５、
    ｃ．配列番号１２２～１２７、
    ｄ．配列番号２６～３１、
    ｅ．配列番号１２８～１３３、
    ｆ．配列番号３８～４３、
    ｇ．配列番号６２～６７、
    ｈ．配列番号８０～８５、
    ｉ．配列番号４４～４９、
    ｊ．配列番号８６～９１、
    ｋ．配列番号１０４～１０９、
    ｌ．配列番号５６～６１、
    ｍ．配列番号３２～３７、
    ｎ．配列番号１１０～１１５、
    ｏ．配列番号９８～１０３、
    ｐ．配列番号９２～９７、
    ｑ．配列番号１１６～１２１、
    ｒ．配列番号８～１３、
    ｓ．配列番号６８～７３、
    ｔ．配列番号１４～１９、及び
    ｕ．配列番号２０～２５
    からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
18. ａ．表Ｂに記載の重鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、及び１７５からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
    ｂ．表Ｂに記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、及び１７６からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
    ｃ．（ａ）と（ｂ）の両方
    を含む、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
19. 前記変異配列は、少なくとも約８０％または少なくとも約８５％の配列同一性を有する、請求項１８に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
20. 前記変異配列は、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％の配列同一性を有する、請求項１９に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
21. ａ．配列番号１５６と１５７、
    ｂ．配列番号１４８と１４９、
    ｃ．配列番号１７２と１７３、
    ｄ．配列番号１４０と１４１、
    ｅ．配列番号１７４と１７５、
    ｆ．配列番号１４４と１４５、
    ｇ．配列番号１５２と１５３、
    ｈ．配列番号１５８と１５９、
    ｉ．配列番号１４６と１４７、
    ｊ．配列番号１６０と１６１、
    ｋ．配列番号１６６と１６７、
    ｌ．配列番号１５０と１５１、
    ｍ．配列番号１４２と１４３、
    ｎ．配列番号１６８と１６９、
    ｏ．配列番号１６４と１６５、
    ｐ．配列番号１６２と１６３、
    ｑ．配列番号１７０と１７１、
    ｒ．配列番号１３４と１３５、
    ｓ．配列番号１５４と１５５、
    ｔ．配列番号１３６と１３７、及び
    ｕ．配列番号１３８及び１３９
    からなる群から選択される１対のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
22. ａ．配列番号５０４もしくは配列番号５０７の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
    ｂ．配列番号５０５もしくは配列番号５０８の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
    ｃ．配列番号５０６もしくは配列番号５０９の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
    ｄ．配列番号４４９もしくは配列番号４７６の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
    ｅ．配列番号４５０もしくは配列番号４７７の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
    ｆ．配列番号４５１もしくは配列番号４５４の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
    ｇ．（ａ）～（ｆ）のうちいずれか２つ以上の組み合わせ
    を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
23. 前記変異配列は、少なくとも約８０％または約もしくは少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項２２に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
24. 前記変異配列は、少なくとも約９０％の配列同一性または約もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項２３に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
25. 配列番号４４９の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号４５０、及び軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号４５１と、配列番号５０４の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号５０５、及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号５０６のうちの１つまたは２つとを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
26. 配列番号４７６の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号４７７、及び軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号４５４と、配列番号５０７の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号５０８、及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号５０９のうちの１つまたは２つとを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
27. ａ．配列番号４４９～４５１及び５０４～５０６、及び
    ｂ．配列番号４７６、４７７、４５４及び５０７～５０９
    からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
28. ａ．配列番号４９０～５０３のうちのいずれか１つの重鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは図２２でＳ１～Ｓ１２として表示されている重鎖可変領域アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
    ｂ．配列番号３８０～３８３、３８８～３９０、４７９、及び４８１のうちのいずれか１つの軽鎖可変領域アミノ酸配列、または図２２でＳ１～Ｓ１２として表示されている軽鎖可変領域アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
    ｃ．（ａ）と（ｂ）の両方
    を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
29. 前記変異配列は、少なくとも約８０％または少なくとも約８５％の配列同一性を有する、請求項２８に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
30. 前記変異配列は、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％の配列同一性を有する、請求項２９に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
31. １対のアミノ酸配列、すなわち、
    ａ．配列番号３８９と４９０、
    ｂ．配列番号３８９と４９１、
    ｃ．配列番号３８９と４９２、
    ｄ．配列番号３８９と４９３、
    ｅ．配列番号３８９と４９４、
    ｆ．配列番号３８９と４９５、
    ｇ．配列番号３８３と４９６、
    ｈ．配列番号３８３と４９７、
    ｉ．配列番号３８３と４９８、
    ｊ．配列番号３８３と４９９、
    ｋ．配列番号３８３と５００、
    ｌ．配列番号３８３と５０１、
    ｍ．配列番号３８３と５０３、
    ｎ．配列番号３８９と５０２、
    ｏ．前記図２２でＳ１として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ１として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｐ．前記図２２でＳ２として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ２として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｑ．前記図２２でＳ３として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ３として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｒ．前記図２２でＳ４として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ４として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｓ．前記図２２でＳ５として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ５として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｔ．前記図２２でＳ６として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ６として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｕ．前記図２２でＳ７として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ７として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｖ．前記図２２でＳ８として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ８として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｗ．前記図２２でＳ９として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ９として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｘ．前記図２２でＳ１０として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ１０として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｙ．前記図２２でＳ１１として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ１１として表示されている軽鎖可変領域の配列、または
    ｚ．前記図２２でＳ１２として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ１２として表示されている軽鎖可変領域の配列
    を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
32. ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質（配列番号２００）と、第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、（ａ）表ＡまたはＡ１に記載のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列または配列番号１１、１７、２３、２９、３５、４１、４７、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、４５２、４５５、４６１、４６５、及び４７２からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、（ｂ）表ＡまたはＡ１に記載のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、もしくは配列番号１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、８６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、４７５、４５６、４６２、４６６、４６８、及び４７３からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、（ｃ）表ＡまたはＡ１に記載のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、もしくは配列番号１３、１９、２５、３１、３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、４５３、４５７、４６３、４６７、４６９、及び４７４からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、（ｄ）表ＡまたはＡ１に記載のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、もしくは配列番号８、１４、２０、３２、３８、４４、５０、５６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、４４９、４７６、４５８、４６４、及び４７０からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、（ｅ）表ＡまたはＡ１に記載のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、もしくは配列番号９、１５、２１、２７、３３、３９、４５、５１、５７、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、４５０、４７７、４５９、及び４７１からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、（ｆ）表ＡまたはＡ１に記載のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、もしくは配列番号１０、１６、２２、２８、３４、４０、４６、５２、５８、６４、７０、７６、８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、４５１、４５４、及び４６０からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、あるいは（ｇ）（ａ）～（ｆ）のうちいずれか２つ以上の組み合わせ、を含む、前記二重特異性抗原結合タンパク質。
33. ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質（配列番号２００）と、第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、
    ａ．配列番号７４～７９、
    ｂ．配列番号５０～５５、
    ｃ．配列番号１２２～１２７、
    ｄ．配列番号２６～３１、
    ｅ．配列番号１２８～１３３、
    ｆ．配列番号３８～４３、
    ｇ．配列番号６２～６７、
    ｈ．配列番号８０～８５、
    ｉ．配列番号４４～４９、
    ｊ．配列番号８６～９１、
    ｋ．配列番号１０４～１０９、
    ｌ．配列番号５６～６１、
    ｍ．配列番号３２～３７、
    ｎ．配列番号１１０～１１５、
    ｏ．配列番号９８～１０３、
    ｐ．配列番号９２～９７、
    ｑ．配列番号１１６～１２１、
    ｒ．配列番号８～１３、
    ｓ．配列番号６８～７３、
    ｔ．配列番号１４～１９、
    ｕ．配列番号２０～２５、
    ｖ．配列番号４４９～４５３及び４７５、
    ｗ．配列番号４７６～４７７、４５４～４５７、
    ｘ．配列番号４５８～４６３、
    ｙ．配列番号５７、５８、４６４～４６７、
    ｚ．配列番号６８～７１及び４６８～４６９、及び
    ａａ．配列番号１１２、及び４７０～４７４
    からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む、前記二重特異性抗原結合タンパク質。
34. ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質（配列番号２００）と、第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、
    ａ．表Ｂに記載の重鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは配列番号１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、及び１７５からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
    ｂ．表Ｂに記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは配列番号１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、及び１７６からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
    ｃ．（ａ）と（ｂ）の両方
    を含む、前記二重特異性抗原結合タンパク質。
35. 前記変異配列は、少なくとも約８５％の配列同一性または約９０％もしくは約９５％の配列同一性を有する、請求項３４に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
36. ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質（配列番号２００）と、第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、
    ａ．配列番号１５６と１５７、
    ｂ．配列番号１４８と１４９、
    ｃ．配列番号１７２と１７３、
    ｄ．配列番号１４０と１４１、
    ｅ．配列番号１７４と１７５、
    ｆ．配列番号１４４と１４５、
    ｇ．配列番号１５２と１５３、
    ｈ．配列番号１５８と１５９、
    ｉ．配列番号１４６と１４７、
    ｊ．配列番号１６０と１６１、
    ｋ．配列番号１６６と１６７、
    ｌ．配列番号１５０と１５１、
    ｍ．配列番号１４２と１４３、
    ｎ．配列番号１６８と１６９、
    ｏ．配列番号１６４と１６５、
    ｐ．配列番号１６２と１６３、
    ｑ．配列番号１７０と１７１、
    ｒ．配列番号１３４と１３５、
    ｓ．配列番号１５４と１５５、
    ｔ．配列番号１３６と１３７、及び
    ｕ．配列番号１３８及び１３９
    からなる群から選択される１対のアミノ酸配列を含む、前記二重特異性抗原結合タンパク質。
37. ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質（配列番号２００）と、第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、
    ａ．表Ｃに記載の重鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは配列番号３７６～３７９、３８４～３８７、３９１－３９６、４０３～４０８、４１２～４１３、４１６～４１９、及び４２２～４２７からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
    ｂ．表Ｃに記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列もしくは配列番号３８０～３８３、３８８～３９０、３９７～４０２、４０９～４１１、４１４～４１５、及び４２０－４２１からなる群から選択される配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
    ｃ．（ａ）と（ｂ）の両方
    を含む、前記二重特異性抗原結合タンパク質。
38. 前記変異配列は、少なくとも約８５％の配列同一性を有する、請求項３７に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
39. 前記変異配列は、少なくとも約９０％または約９５％の配列同一性を有する、請求項３８に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
40. ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質（配列番号２００）と、第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、
    ａ．配列番号３７６と３８０、
    ｂ．配列番号３７７と３８０、
    ｃ．配列番号３７７と３８１、
    ｄ．配列番号３７７と３８２、
    ｅ．配列番号３７７と３８３、
    ｆ．配列番号３７８と３８１、
    ｇ．配列番号３７８と３８２、
    ｈ．配列番号３７８と３８３、
    ｉ．配列番号３７９と３８１、
    ｊ．配列番号３７９と３８２、
    ｋ．配列番号３７９と３８３、
    ｌ．配列番号３８４と３８８、
    ｍ．配列番号３８５と３８８、
    ｎ．配列番号３８５と３８９、
    ｏ．配列番号３８６と３８８、
    ｐ．配列番号３８６と３８９、
    ｑ．配列番号３８７と３８９、
    ｒ．配列番号４２２と３８９、
    ｓ．配列番号３９１と３９７、
    ｔ．配列番号３９２と３９７、
    ｕ．配列番号３９３と３９８、
    ｖ．配列番号３９４と３９８、
    ｗ．配列番号３９５と３９８、
    ｘ．配列番号３９６と３９８、
    ｙ．配列番号４２３と３９８、
    ｚ．配列番号４２４と３９８、
    ａａ．配列番号４２５と３９８、
    ｂｂ．配列番号４２６と３９８、
    ｃｃ．配列番号４２７と３９８、
    ｄｄ．配列番号４０３と４０９、
    ｅｅ．配列番号４０４と４０９、
    ｆｆ．配列番号４０５と４１０、
    ｇｇ．配列番号４０５と４１１、
    ｈｈ．配列番号４０６と４１０、
    ｉｉ．配列番号４０６と４１１、
    ｊｊ．配列番号４０７と４１０、
    ｋｋ．配列番号４０７と４１１、
    ｌｌ．配列番号４０８と４１０、
    ｍｍ．配列番号４０８と４１１、
    ｎｎ．配列番号４１２と４１４、
    ｏｏ．配列番号４１３と４１４、
    ｐｐ．配列番号４１６と４２０、
    ｑｑ．配列番号４１７と４２０、
    ｒｒ．配列番号４１７と４２１、
    ｓｓ．配列番号４１８と４２０、
    ｔｔ．配列番号４１８と４２１、
    ｕｕ．配列番号４１９と４２０、及び
    ｖｖ．配列番号４１９と４２１、
    からなる群から選択される１対のアミノ酸配列を含む、前記二重特異性抗原結合タンパク質。
41. ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質（配列番号２００）と、第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、
    （Ａ）ＨＣ ＣＤＲ１であって、ＹＴＦＴＸＹＴのアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘは、Ｔ、Ｖ、Ｄ、またはＳ（配列番号４５２）であり、任意選択で、ＹＴＦＴＴＹＴのアミノ酸配列（配列番号１１）を含む、前記ＨＣ ＣＤＲ１、
    （Ｂ）ＨＣ ＣＤＲ２であって、ＩＸＰＳＳＧＹＴのアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘは、Ｑ、Ｓ、Ａ、またはＮ（配列番号４７５）であり、任意選択で、ＩＮＰＳＳＧＹＴのアミノ酸配列（配列番号１２）を含む、前記ＨＣ ＣＤＲ２、
    （Ｃ）ＨＣ ＣＤＲ３であって、ＡＸＧＤＹＹＶＡＹのアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘは、Ｎ、Ｑ、Ｈ、またはＤ（配列番号４５３）であり、任意選択で、ＡＮＧＤＹＹＶＡＹのアミノ酸配列（配列番号１３）を含む、前記ＨＣ ＣＤＲ３、
    （Ｄ）ＬＣ ＣＤＲ１であって、ＳＳＶＳＳＸＹのアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘは、Ｔ、Ｖ、Ｆ、またはＤ（配列番号４４９）であり、任意選択で、ＳＳＶＳＳＴＹのアミノ酸配列（配列番号８）を含む、前記ＬＣ ＣＤＲ１、
    （Ｅ）ＬＣ ＣＤＲ２であって、ＸＴＸのアミノ酸配列を含み、ここで、１位のＸは、Ｓ、Ｔ、Ｑ、またはＡであり、３位のＸは、Ｓ、Ｔ、Ｄ、またはＱであり（配列番号４５０）、任意選択で、ＳＴＳのアミノ酸配列（配列番号９）を含む、前記ＬＣ ＣＤＲ２、及び
    （Ｆ）ＬＣ ＣＤＲ３であって、ＨＸＹＸＲＳＰＬＴのアミノ酸配列を含み、ここで、２位のＸは、Ｑ、Ｈ、またはＳであり、４位のＸは、Ｈ、Ｙ、Ｑ、またはＳであり（配列番号４５１）、任意選択で、ＨＱＹＨＲＳＰＬＴのアミノ酸配列（配列番号１０）を含む、前記ＬＣ ＣＤＲ３
    を含む、前記二重特異性抗原結合タンパク質。
42. ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質（配列番号２００）と、第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、
    （Ａ）ＨＣ ＣＤＲ１であって、ＦＴＦＳＸＹＸのアミノ酸配列を含み、ここで、５位のＸは、Ｎ、Ｓ、Ｒ、Ｑ、またはＡであり、７位のＸは、Ｗ、Ｈ、Ｙ、Ｆであり（配列番号４５５）、任意選択で、ＦＴＦＳＮＹＷのアミノ酸配列（配列番号２３）を含む、前記ＨＣ ＣＤＲ１、
    （Ｂ）ＨＣ ＣＤＲ２であって、ＩＲＬＫＸＤＸＹＡＴのアミノ酸配列を含み、ここで、５位のＸは、Ｓ、Ｎ、Ａ、またはＴであり、７位のＸは、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｎであり（配列番号４５６）、任意選択で、ＩＲＬＫＳＤＮＹＡＴのアミノ酸配列（配列番号２４）を含む、前記ＨＣ ＣＤＲ２、
    （Ｃ）ＨＣ ＣＤＲ３であって、ＸＤＧＰＰＳＧＸのアミノ酸配列を含み、ここで、１位のＸは、Ｎ、Ｄ、またはＴであり、８位のＸは、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｃ、またはＹであり（配列番号４５７）、任意選択で、ＮＤＧＰＰＳＧＣのアミノ酸配列（配列番号２５）を含む、前記ＨＣ ＣＤＲ３、
    （Ｄ）ＬＣ ＣＤＲ１であって、ＥＸＩＹＳＹのアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘは、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｄ、またはＮ（配列番号４７６）であり、任意選択で、ＥＮＩＹＳＹのアミノ酸配列（配列番号２０）を含む、前記ＬＣ ＣＤＲ１、
    （Ｅ）ＬＣ ＣＤＲ２であって、ＸＡＫのアミノ酸配列を含み、ここで、１位のＸは、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｄ、またはＮ（配列番号４７７）であり、任意選択で、ＮＡＫのアミノ酸配列（配列番号２１）を含む、前記ＬＣ ＣＤＲ２、及び
    （Ｆ）ＬＣ ＣＤＲ３であって、ＱＸＨＹＸＶＰＷＴのアミノ酸配列を含み、ここで、２位のＸは、Ｈ、Ｑ、Ｓ、またはＴであり、５位のＸは、Ｔ、Ｓ、Ｎ、またはＧであり（配列番号４５４）、任意選択で、ＱＨＨＹＴＶＰＷＴのアミノ酸配列（配列番号２２）を含む、前記ＬＣ ＣＤＲ３
    を含む、前記二重特異性抗原結合タンパク質。
43. ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質（配列番号２００）と、第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、
    （Ａ）ＨＣ ＣＤＲ１であって、ＹＴＸＴＸＹＴのアミノ酸配列を含み、ここで、３位のＸは、Ｆ、Ｙ、Ｓ、またはＴであり、５位のＸは、Ｓ、Ｔ、Ｙ、またはＤであり（配列番号４６１）、任意選択で、ＹＴＦＴＳＹＴのアミノ酸配列（配列番号２９）を含む、前記ＨＣ ＣＤＲ１、
    （Ｂ）ＨＣ ＣＤＲ２であって、ＩＸＰＳＳＸＹＴのアミノ酸配列を含み、ここで、２位のＸは、Ｑ、Ｓ、Ａ、またはＮであり、６位のＸは、Ｔ、Ｓ、Ｖ、Ｄ、またはＧであり（配列番号４６２）、任意選択で、ＩＮＰＳＳＴＹＴのアミノ酸配列（配列番号３０）を含む、前記ＨＣ ＣＤＲ２、
    （Ｃ）ＨＣ ＣＤＲ３であって、ＸＲＧＥＸＧＧＦＡＹのアミノ酸配列を含み、ここで、１位のＸは、Ｓ、Ａ、Ｔ、またはＶであり、５位のＸは、Ｌ、Ｖ、またはＦであり（配列番号４６３）、任意選択で、ＳＲＧＥＬＧＧＦＡＹのアミノ酸配列（配列番号３１）を含む、前記ＨＣ ＣＤＲ３、
    （Ｄ）ＬＣ ＣＤＲ１であって、ＱＳＬＶＨＳＸＧＸＴＹのアミノ酸配列を含み、ここで、７位のＸは、Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ、Ｓ、またはＡであり、９位のＸは、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｄ、またはＮであり（配列番号４５８）、任意選択で、ＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹのアミノ酸配列（配列番号２６）を含む、前記ＬＣ ＣＤＲ１、
    （Ｅ）ＬＣ ＣＤＲ２であって、ＸＶＸのアミノ酸配列を含み、ここで、１位のＸは、Ｋ、Ｑ、またはＲであり、３位のＸは、Ｓ、Ｔ、またはＶであり（配列番号４５９）、任意選択で、ＫＶＳのアミノ酸配列（配列番号２７）を含む、前記ＬＣ ＣＤＲ２、及び
    （Ｆ）ＬＣ ＣＤＲ３であって、ＳＸＸＴＨＶＰＹＴのアミノ酸配列を含み、ここで、２位のＸは、Ｑ、Ｈ、またはＴであり、３位のＸは、Ｓ、Ｇ、Ｔ、またはＤであり（配列番号４６０）、任意選択で、ＳＱＳＴＨＶＰＹＴのアミノ酸配列（配列番号２８）を含む、前記ＬＣ ＣＤＲ３
    を含む、前記二重特異性抗原結合タンパク質。
44. ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質（配列番号２００）と、第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、
    ａ．配列番号５０４もしくは配列番号５０７の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
    ｂ．配列番号５０５もしくは配列番号５０８の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
    ｃ．配列番号５０６もしくは配列番号５０９の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
    ｄ．配列番号４４９もしくは配列番号４７６の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
    ｅ．配列番号４５０もしくは配列番号４７７の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、
    ｆ．配列番号４５１もしくは配列番号４５４の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
    ｇ．（ａ）～（ｆ）のうちいずれか２つ以上の組み合わせ
    を含む、前記二重特異性抗原結合タンパク質。
45. ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質（配列番号２００）と、第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、
    ａ．配列番号４４９～４５１及び５０４～５０６、及び
    ｂ．配列番号４７６、４７７、４５４及び５０７～５０９
    からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む、前記二重特異性抗原結合タンパク質。
46. ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質（配列番号２００）と、第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、
    ａ．配列番号４９０～５０３のうちのいずれか１つの重鎖可変領域アミノ酸配列、もしくは図２２でＳ１～Ｓ１２として表示されている重鎖可変領域アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
    ｂ．配列番号３８０～３８３、３８８～３９０、４７９、及び４８１のうちのいずれか１つの軽鎖可変領域アミノ酸配列、または図２２でＳ１～Ｓ１２として表示されている軽鎖可変領域アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
    ｃ．（ａ）と（ｂ）の両方
    を含む、前記二重特異性抗原結合タンパク質。
47. 前記変異配列は、少なくとも約８５％の配列同一性または約９０％もしくは約９５％の配列同一性を有する、請求項４６に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
48. ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質（配列番号２００）と、第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、
    ａ．配列番号３８９と４９０、
    ｂ．配列番号３８９と４９１、
    ｃ．配列番号３８９と４９２、
    ｄ．配列番号３８９と４９３、
    ｅ．配列番号３８９と４９４、
    ｆ．配列番号３８９と４９５、
    ｇ．配列番号３８３と４９６、
    ｈ．配列番号３８３と４９７、
    ｉ．配列番号３８３と４９８、
    ｊ．配列番号３８３と４９９、
    ｋ．配列番号３８３と５００、
    ｌ．配列番号３８３と５０１、
    ｍ．配列番号３８３と５０３、
    ｎ．配列番号３８９と５０２、
    ｏ．前記図２２でＳ１として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ１として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｐ．前記図２２でＳ２として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ２として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｑ．前記図２２でＳ３として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ３として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｒ．前記図２２でＳ４として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ４として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｓ．前記図２２でＳ５として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ５として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｔ．前記図２２でＳ６として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ６として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｕ．前記図２２でＳ７として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ７として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｖ．前記図２２でＳ８として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ８として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｗ．前記図２２でＳ９として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ９として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｘ．前記図２２でＳ１０として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ１０として表示されている軽鎖可変領域の配列、
    ｙ．前記図２２でＳ１１として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ１１として表示されている軽鎖可変領域の配列、または
    ｚ．前記図２２でＳ１２として表示されている重鎖可変領域の配列と前記図２２でＳ１２として表示されている軽鎖可変領域の配列
    からなる群から選択される１対のアミノ酸配列を含む、前記二重特異性抗原結合タンパク質。
49. ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質（配列番号２００）と、第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、
    ａ．配列番号５１０もしくは５１３として記載されるかまたは図２３もしくは図２５に記載の重鎖可変領域アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
    ｂ．配列番号５１１もしくは５１２として記載されるかまたは図２４もしくは図２６に記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１個か２個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または
    ｃ．（ａ）と（ｂ）の両方
    を含む、前記二重特異性抗原結合タンパク質。
50. 前記変異配列は、少なくとも約８５％の配列同一性を有する、請求項４９に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
51. 前記変異配列は、少なくとも約９０％または約９５％の配列同一性を有する、請求項５０に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
52. ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質（配列番号２００）と、第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、１対のアミノ酸配列を含み、前記対が、
    ａ．配列番号５１０として記載の重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号５１１として記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１～５個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有し、任意選択で、異なっている前記１～５個のアミノ酸が、前記重鎖の場合は図２３に示されているか、もしくは前記軽鎖の場合は図２４に示されているもの、または
    ｂ．配列番号５１３として記載の重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号５１２として記載の軽鎖可変領域アミノ酸配列、またはその変異配列であって、１～５個のアミノ酸のみが異なっているか、もしくは約もしくは少なくとも７０％の配列同一性を有するもの、または任意選択で、異なっている前記１～５個のアミノ酸が、前記重鎖の場合は図２５に示されているか、もしくは前記軽鎖の場合は図２６に示されているもの
    を含む、前記二重特異性抗原結合タンパク質。
53. 脱フコシル化グリカンを含むＦｃポリペプチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
54. 軟寒天３Ｄ増殖アッセイにおいて少なくとも約５０％のコロニー増殖を阻害する、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
55. ヒトがん細胞を注射された異種移植マウスにおいて腫瘍増殖を阻害する、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
56. 卵巣癌細胞、メラノーマがん細胞、膀胱癌細胞、または子宮内膜癌細胞を注射された異種移植マウスにおいて腫瘍増殖を阻害する、請求項５５に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
57. 卵巣癌細胞、膀胱癌細胞、または子宮内膜癌細胞を注射された異種移植マウスにおいて少なくとも５０％の腫瘍増殖を阻害する、請求項５６に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
58. 前記第２の抗原に対して特異的な抗体の抗原結合性断片を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
59. 前記第２の抗原は、Ｔ細胞により発現される細胞表面タンパク質であり、任意選択で、前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成成分、例えば、ＣＤ３である、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
60. 前記第２の抗原は、Ｔ細胞活性化を助ける共刺激分子、例えば、ＣＤ４０または４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）である、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
61. 前記第２の抗原は、Ｆｃ受容体であり、任意選択で、Ｆｃガンマ受容体、Ｆｃ－アルファ受容体、またはＦｃ－イプシロン受容体である、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
62. 前記Ｆｃ受容体は、ＣＤ６４（Ｆｃ－ガンマＲＩ）、ＣＤ３２（Ｆｃ－ガンマＲＩＩＡ）、ＣＤ１６Ａ（Ｆｃ－ガンマＲＩＩＩＡ）、ＣＤ１６ｂ（Ｆｃ－ガンマＲＩＩＩｂ）、ＦｃεＲＩ、ＣＤ２３（Ｆｃ－イプシロンＲＩＩ）、ＣＤ８９（Ｆｃ－イプシロンＲＩ）、Ｆｃα／μＲ、またはＦｃＲｎである、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
63. 前記Ｆｃ受容体はＣＤ１６Ａである、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
64. 前記第２の抗原は、免疫チェックポイント分子、例えば、免疫チェックポイント経路に関与するタンパク質であり、任意選択で、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、またはＳＩＧＬＥＣ７である、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
65. 前記免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＣＴＬＡ４である、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
66. 本願開示のＣＬＤＮ６抗体のいずれかのｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ）_２’を含み、任意選択で、前記ｓｃＦｖが、配列番号５１４もしくは５１５の配列または図３７Ｂに示される配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
67. ナノボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、またはＨＳＡｂｏｄｙの構造を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
68. 前記第２の抗原はＣＤ３である、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
69. 前記第２の抗原はＣＤ３Ｅである、先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
70. 前記ＢｉＴＥは、
    ａ．配列番号５１６に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
    ｂ．配列番号５１７に記載の核酸配列を含む核酸によりコードされるポリペプチド、
    ｃ．配列番号５１８に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
    ｄ．配列番号５１９に記載の核酸配列を含む核酸によりコードされるポリペプチド
    を含む、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
71. 前記ＴａｎｄＡｂは、
    ａ．配列番号５２０に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
    ｂ．配列番号５２１に記載の核酸配列を含む核酸によりコードされるポリペプチド、
    ｃ．配列番号５２２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
    ｄ．配列番号５２３に記載の核酸配列を含む核酸によりコードされるポリペプチド
    を含む、請求項６７に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
72. 先行請求項のいずれか一項に記載されるかまたは本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質を含む、複合体。
73. 前記抗原結合タンパク質は、配列番号３８７及び配列番号３８９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の複合体。
74. 前記抗原結合タンパク質は、配列番号３７９及び配列番号３８３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の複合体。
75. 細胞毒性薬または化学療法薬を含む、請求項７２～７４のいずれか一項に記載の複合体。
76. 前記化学療法薬は、チューブリン重合を遮断することにより細胞分裂を阻害する抗有糸分裂剤である、請求項７５に記載の複合体。
77. 前記抗有糸分裂剤はアウリスタチンである、請求項７６に記載の複合体。
78. 前記アウリスタチンはＭＭＡＥである、請求項７７に記載の複合体。
79. 前記薬剤は、切断可能なリンカーを介して前記抗原結合タンパク質に結合されている、請求項７２～７８のいずれか一項に記載の複合体。
80. 前記切断可能なリンカーは、ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥである、請求項７９に記載の複合体。
81. 前記抗原結合タンパク質は抗体である、請求項７２～８０のいずれか一項に記載の複合体。
82. 前記抗体はモノクローナル抗体であり、任意選択で、前記モノクローナル抗体はＩｇＧ抗体である、請求項８１に記載の複合体。
83. 前記抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項８１または８２に記載の複合体。
84. 抗体あたりの結合されている前記薬剤のユニットの平均数は１～８の範囲であり、好ましくは、抗体あたりの結合されている前記薬剤のユニットの前記平均数は３～８の範囲である、請求項８１～８３のいずれか一項に記載の複合体。
85. 前記複合体は、不均一複合体である、請求項７２～８４のいずれか一項に記載の複合体。
86. 前記複合体は、均一複合体である、請求項７２～８４のいずれか一項に記載の複合体。
87. 前記薬剤を前記抗原結合タンパク質の特定の部位にて結合させる、請求項７２～８４及び８６のいずれか一項に記載の複合体。
88. 前記特異的部位は、不対システイン残基である、請求項８７に記載の複合体。
89. 前記複合体は、ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥに結合された配列番号３８７及び配列番号３８９に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項７２～８８のいずれか一項に記載の複合体。
90. 前記複合体は、ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥに結合された配列番号３７９及び配列番号３８３に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項７２～８８のいずれか一項に記載の複合体。
91. 先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質を含む、融合タンパク質。
92. 先行請求項のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、請求項６８～８６に記載の複合体、または請求項９１に記載の融合タンパク質を含む、核酸。
93. 請求項９２に記載の核酸を含む、ベクター。
94. 請求項９２に記載の核酸または請求項９３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
95. クローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質と第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質を生産する方法であって、（ｉ）請求項９４に記載の宿主細胞を細胞培養培地で培養することであって、前記宿主細胞が、先行請求項のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、前記培養すること、及び（ｉｉ）前記細胞培養培地から前記抗原結合タンパク質を採取すること、を含む、前記方法。
96. クローディン６（ＣＬＤＮ６）タンパク質と第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質を生産する方法であって、（ｉ）請求項９４に記載の宿主細胞を細胞培養培地で培養することであって、前記宿主細胞が、請求項９１に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、前記培養すること、及び（ｉｉ）前記細胞培養培地から前記融合タンパク質を採取すること、を含む、前記方法。
97. 請求項１～７１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質、請求項７２～９０のいずれか一項に記載の複合体、請求項９１に記載の融合タンパク質、請求項９２に記載の核酸、請求項９３に記載のベクター、請求項９４に記載の宿主細胞、またはそれらの組み合わせ、及び薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは添加剤を合わせることを含む、医薬組成物を生産する方法。
98. 請求項１～７１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質、請求項７２～９０のいずれか一項に記載の複合体、請求項９１に記載の融合タンパク質、請求項９２に記載の核酸、請求項９３に記載のベクター、請求項９４に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容される担体、希釈剤または添加剤を含む、医薬組成物。
99. ＣＬＤＮ６発現がんを有する対象を治療する方法であって、請求項９８に記載の医薬組成物を、前記がんを治療するのに有効な量で前記対象に投与することを含む、前記方法。
100. 対象における腫瘍増殖を阻害する方法であって、請求項９８に記載の医薬組成物を、腫瘍増殖を阻害するのに有効な量で前記対象に投与することを含む、前記方法。
101. 対象における腫瘍サイズを縮小させる方法であって、請求項９８に記載の医薬組成物を、腫瘍サイズを縮小するのに有効な量で前記対象に投与することを含む、前記方法。
102. 対象におけるがんの再発を予防する方法であって、請求項９８に記載の医薬組成物を、がんの再発を予防するのに有効な量で前記対象に投与することを含む、前記方法。
103. ＣＬＤＮ６の低過剰発現個体であると診断された対象におけるがんを治療する方法であって、請求項９８に記載の医薬組成物を、がんの再発を予防するのに有効な量で前記対象に投与することを含む、前記方法。
104. 前記投与することにより、腫瘍細胞にアポトーシスが誘導される、請求項９９～１０３のいずれか一項に記載の方法。
105. 前記投与することにより、ＣＬＤＮ６発現細胞にアポトーシスが誘導される、請求項９９～１０４のいずれか一項に記載の方法。

Images