CN105051528A - 离子强度介导的pH梯度离子交换色谱 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于通过离子强度介导的pH梯度离子交换色谱来分析多肽如抗体组合物的方法。在一些方面，所述方法使用pH梯度与离子强度梯度的组合来从多肽的电荷变体分离多肽。在一些方面，所述方法使用稳定的离子强度来优化pH梯度分离窗从而从电荷变体分离多肽。这样的方法可用于分析pI大于9或pI小于7的多肽如抗体。在一些方面，本发明提供了用于分析具有多种pI的多肽的多产物方法。

Description

离子强度介导的pH梯度离子交换色谱

发明领域

本发明提供了用于使用离子强度介导的pH梯度离子交换色谱来分析多肽制备物的方法。

发明背景

在水性环境中，蛋白质如单克隆抗体(mAb)大多在表面上具有带电的极性氨基酸(Barlow,DJ和Thornton,JM(1986)Biopolymers25:1717)。由于分子与溶液组分的相互作用，表面残基可经历多种化学修饰和酶修饰，导致在其静电表面上具有些微差异的蛋白质变体异质混合物(Dick,LW等，(2009)J.Chromatogr.B877:3841；Liu,HW等，(2008)RapidCommun.MassSpectrom.22:4081；Miller,AK等，(2011)J.Pharm.Sci.100:2543；Wang,WR等，(2011)Mol.Immunol.48:860)。根据Vlasak,J和Ionescu,R(2008Curr.Pharm.Biotechnol.9:468)的最近回顾，阳离子交换色谱(CEC)被认为是描述蛋白治疗剂电荷异质性的金标准。一些监管机构通常要求该电荷灵敏的分离方法来确保产品制造期间的一致性，以及监测蛋白治疗剂的降解水平(Miller,AK等，(2011)J.Pharm.Sci.100:2543；He,XPZ(2009)Electrophoresis30:714；Sosic,Z等，(2008)Electrophoresis29:4368；Kim,J等，(2010)J.Chromatogr.B878:1973；Teshima,G等，(2010)J.Chromatogr.A1218:2091)。

使用pH梯度的分析型离子交换色谱(IEC)法作为常规的盐梯度IEC的替选技术应运而生，用于描述治疗性蛋白质的电荷异质性(Farnan,D和Moreno,GTTsonev,(2009)Anal.Chem.81:8846；Tsonev,LI和Hirsh,AG(2008)J.Chromatogr.A1200:166；Nordborg,A等，(2009)J.Sep.Sci.32:2668；Rozhkova,A(2009)J.Chromatogr.A1216:5989；Rea,JC等(2010)J.Pharm.Biomed.Anal.54:317)。在该技术中，通过提高流动相的pH来洗脱通常上载于阳离子固定相的蛋白质。最近已经证实，具有6.0至9.5的较宽pH窗的pH梯度IEC(pH-IEC)法不仅提供了比传统盐梯度IEC更佳的分辨率，还通过分析pI为7.3至9.0的12种单克隆抗体(mAb)提供了多产物能力(Farnan,D和Moreno,GT(2009)Anal.Chem.81:8846)。该pH-IEC法还对具有不同离子强度(0至250mMNaCl)和pH值(5.0至8.5)的样品基质是高度耐受的(Farnan,D和Moreno,GT(2009)Anal.Chem.81:8846)。此外，所报道的pH-IEC法没有明显受到柱长度和化学成分的影响，并且可用较短的柱实现快速分离以改进蛋白变体分析的通量。根据最近的验证报告(Rea,JC等(2010)J.Pharm.Biomed.Anal.54:317)，所开发的pH-IEC法已显示出在不同色谱条件下的优异精密性以及在不同柱负载的良好线性。因此，所报道的pH-IEC法适用于在生物技术产业中进行日常测试。

虽然有许多优点，但是所报道的pH-IEC法主要倾向于pI值介于7.3至9.0的研究范围内的mAb。mAb的洗脱曲线可随着不同的缓冲组合物和浓度以及mAb洗脱时的pH值而不同，该事实说明，pH-梯度IEC涉及组合的离子强度和pH-梯度洗脱机制(Farnan,D和Moreno,GT(2009)Anal.Chem.81:8846)。这也与Anderson和coworkers关于pH-梯度阴离子-交换色谱(pH-AIEC)的报告一致(Anderson,DJ和Shan,L(2001)Clin.Chem.47:128；Shan,L和Anderson,DJ(2001)J.Chromatogr.A909:191；Shan,L和Anderson,DJ(2002)Anal.Chem.74:5641)。随着生物技术产业中研发阶段的mAb的数量增加，尤其是基于动物研究(Igawa,T.(2010)ProteinEng.Des.Sel.23:385)显示潜在更长半衰期的更多较低-pI的mAb，需要将pH-IEC法的可应用性扩展至更宽范围的治疗性mAb。

本文引用的所有文献，包括专利申请和出版物，都通过引用整体并入。

简述

本发明提供了用于分析包含多肽以及一种或多种污染物的组合物的方法，所述方法包括：a)使用加样缓冲剂使所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，其中所述加样缓冲剂处于第一pH，并且包含第一离子强度；b)使用洗脱缓冲剂从所述离子交换色谱材料洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中所述洗脱缓冲剂的pH在pH梯度中改变，并且所述洗脱缓冲剂的离子强度在离子强度梯度中改变，其中通过所述pH梯度和离子强度梯度的组合来分离所述多肽以及所述一种或多种污染物；c)检测所述多肽和所述一种或多种污染物。在本发明的一些实施方案中，可使用相同方法来分析pI介于6.0至9.5范围的多肽。

在一些实施方案中，所述多肽是抗体或免疫粘附素，或其片段。在另一些实施方案中，所述多肽是单克隆抗体或其片段。在另一些实施方案中，所述抗体是人抗体。在其他实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在其他实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗体片段。

在上述实施方案的一些实施方案中，所述污染物是所述多肽的变体。在另一些实施方案中，所述污染物是所述多肽的降解产物。

在一些实施方案中，所述多肽具有大于约9.0的pI。在另一些实施方案中，所述色谱材料是阳离子交换色谱材料。在另一些实施方案中，所述阳离子交换色谱材料是磺化的色谱材料或羧基化的色谱材料。

在任意上述实施方案的另一些实施方案中，所述pH梯度是线性梯度。在任意上述实施方案中另一些实施方案中，所述pH梯度是阶跃梯度(stepgradient)。在另一些实施方案中，所述pH梯度包含从约pH5至约pH11的升高。在上述实施方案的一些实施方案中，所述pH梯度通过使用一种或多种缓冲剂来产生。在另一些实施方案中，所述一种或多种缓冲剂是哌嗪、咪唑、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸盐或CAPS。

在任一实施方案的一些实施方案中，所述离子强度梯度是线性梯度。在另一些实施方案中，所述离子强度梯度是阶跃梯度。在一些实施方案中，所述离子强度梯度包含从约0mM至约200mM的盐浓度升高。在另一些实施方案中，所述离子强度梯度是NaCl梯度、KCl梯度或Na₂SO₄梯度。

在上述实施方案的一些实施方案中，所述多肽具有小于约7.0的pI。在另一些实施方案中，所述色谱材料是阴离子交换色谱材料。在另一些实施方案中，所述阴离子交换色谱材料是季胺色谱材料或叔胺色谱材料。在一些实施方案中，所述pH梯度是线性梯度。在另一些实施方案中，所述pH梯度是阶跃梯度。在一些实施方案中，所述pH梯度包含从约pH8至约pH5的降低。在一些实施方案中，所述pH梯度通过使用一种或多种缓冲剂来产生。在另一些实施方案中，所述一种或多种缓冲剂是哌嗪、咪唑或Tris。在一些实施方案中，所述离子强度梯度是线性梯度。在另一些实施方案中，所述离子强度梯度是阶跃梯度。在再另一些实施方案中，所述离子强度梯度包含从约0mM至约200mM的盐浓度升高。在一些实施方案中，所述离子强度梯度是NaCl梯度、KCl梯度或Na₂SO₄梯度。

在一些方面中，本发明提供了用于分析包含多肽以及一种或多种污染物的组合物的方法，所述方法包括a)使用加样缓冲剂使所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，其中所述加样缓冲剂处于初始pH，并且包含初始离子强度；b)使用洗脱缓冲剂从所述离子交换色谱材料洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中所述洗脱缓冲剂的pH在pH梯度中改变，并且其中所述洗脱缓冲剂的离子强度与所述加样缓冲剂的初始离子强度基本相同，其中通过在约所述初始离子强度下的pH梯度来分离所述多肽以及所述一种或多种污染物；c)检测所述多肽和所述一种或多种污染物。在本发明的一些实施方案中，可使用基本相同的方法来分析pI介于6.0至9.5范围的多肽。

在上述方面的一些实施方案中，所述多肽是抗体或免疫粘附素，或其片段。在另一些实施方案中，所述多肽是单克隆抗体或其片段。在实施方案的另一些实施方案中，所述抗体是人抗体。在其他实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在再另一些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗体片段。

在上述方面的一些实施方案中，所述污染物是所述多肽的变体。在一些实施方案中，所述污染物是所述多肽的降解产物。

在上述方面的一些实施方案中，所述多肽具有大于约9.0的pI。在另一些实施方案中，所述色谱材料是阳离子交换色谱材料。在再另一些实施方案中，所述阳离子交换色谱材料是磺化的色谱材料或羧基化的色谱材料。

在上述方面的一些实施方案中，所述pH梯度是线性梯度。在其他实施方案中，所述pH梯度是阶跃梯度。在一些实施方案中，所述pH梯度包含从约pH5至约pH11的升高。在一些实施方案中，所述pH梯度通过使用一种或多种缓冲剂来产生。在另一些实施方案中，所述一种或多种缓冲剂是哌嗪、咪唑、tris、磷酸盐或CAPS。

在上述实施方案的一些实施方案中，所述洗脱缓冲剂的离子强度为约0mM至约100mM。在另一些实施方案中，所述洗脱缓冲剂包含约0mMNaCl至约100mMNaCl、约0mMKCl至约100mMKCl，或约0mMNa₂SO₄至约100mMNa₂SO₄。

在上述方面的一些实施方案中，所述多肽具有小于约7.0的pI。在另一些实施方案中，所述色谱材料是阴离子交换色谱材料。在再另一些实施方案中，所述阴离子交换色谱材料是季胺色谱材料或叔胺色谱材料。在上述实施方案的一些实施方案中，所述pH梯度是线性梯度。在其他实施方案中，所述pH梯度是阶跃梯度。在上述实施方案的一些实施方案中，所述pH梯度包含从约pH8至约pH5的降低。在一些实施方案中，所述pH梯度通过使用一种或多种缓冲剂来产生。在另一些实施方案中，所述一种或多种缓冲剂是哌嗪、咪唑或Tris。在一些实施方案中，所述洗脱缓冲剂的离子强度为约0mM至约100mM。在另一些实施方案中，所述洗脱缓冲剂包含约10mMNaCl至约100mMNaCl。

在任一上述实施方案的一些实施方案中，所述分析通过高效液相色谱来进行。

在一些方面中，本发明提供了确定组合物中多肽的纯度的方法，其包括根据上述实施方案的任一种方法来分析所述组合物，并确定所述组合物中多肽与污染物的比率。

在一些方面中，本发明提供了确定包含多肽的组合物中所述多肽的稳定性的方法，所述方法包括：a)将所述包含多肽的组合物于0℃至40℃孵育一周或六周，b)通过实施方案1至63的任一方法来分析步骤a)的组合物，以及c)确定所述组合物中变体与多肽的比率，其中，与未进行孵育的组合物相比，所述组合物中变体与多肽的比率的升高指示所述组合物中多肽的降解。

附图简述

图1示出了用pH梯度离子交换色谱(IEC)法得到的具有不同pI的三种单克隆抗体(mAb1、mAb2和mAb3)的电荷异质性曲线。

图2示出了优化前柱出口处的离子强度和pH曲线(图A)以及pH梯度中的柱背压(图B)，以及优化后出口处的离子强度和pH曲线(图C)以及pH梯度中的柱背压(图D)。图A和图C示出了模型pH曲线和电导率以及实验pH曲线和电导率。

图3示出了以四种不同的缓冲剂浓度得到的mAb1(图A)和mAb2(图B)的离子强度介导的pHIEC色谱图。将色谱图中主峰的半峰全宽(FWHM)相对缓冲剂浓度(图C)和盐浓度(图C)作图。

图4示出了对pI介于6.2至9.4范围的十六种单克隆抗体进行离子强度介导的pH梯度IEC而得到的电荷异质性曲线。插图示出了标称pI值相对洗脱pH绘制的图。

图5示出了对天然mAb1(0周)和热应激mAb1(40℃3周和6周)进行离子强度介导的pH梯度IEC而得到的色谱图。

图6示出了用离子强度介导的pH梯度IEC而得到的柱负荷为10μg、20μg、50μg、100μg和200μg的mAb1的色谱图。

图7示出了pH6至pH9.5的半线性pH梯度中通过哌嗪、咪唑、Tris(PIT)缓冲溶液的氨基官能团的缓冲。

图8示出了使用离子强度介导的IEC、pI介于pI6.2至pI9.4范围的mAb的色谱图。柱为PropacWCX-10，4×250mm。

图9示出，当使用4×250mm柱时，在初始pH-IEC和离子强度介导的pH-IEC之间观察到相似的曲线。

图10示出了使用磷酸盐的pH6至pH11的模型线性pH梯度，以随着pH增加维持电导率。

图11的图示出了所观察到的pH(图A)和电导率(图C)曲线与模型预测(图B和D)一致。

图12示出，使用TPP缓冲剂可进行较短的运行。顶部的色谱图示出了使用16分钟梯度、4×50mmPropacWCX-10HT柱的结果，底部色谱图示出使用58分钟梯度、4×250mm柱的结果。

图13的图显示了使用造模工具、计算具有不同pI的单克隆抗体的电荷、在不同pH下的不同分子的电荷状态。当其跨越X轴时，单克隆抗体上的电荷呈中性。合适的pH-IEC分离窗与曲线相对较平的pH范围相对应。

图14的图示出在高pI下，随着pH增加分子具有更短的解析时间。

图15示出了确定对于pI>9.0抗体的最佳电荷屏蔽效应的最优盐浓度的研究结果。测试了以下盐浓度：0mM、10mM、20mM、30mM、40mM和50mM。

图16示出了确定对于pI介于范围8.9至9.1的抗体的最佳电荷屏蔽效应的最优盐浓度的研究结果。

图17示出了确定对于pI介于范围7.6至8.7的抗体的最佳电荷屏蔽效应的最优盐浓度的研究结果。

图18的图示出：为了屏蔽额外的电荷而添加盐使电荷状态移动至合适的分离窗。

图19的图示出：使用浅pH梯度可改进使用pI为7.6的MAb的峰分辨率。测试的梯度如下：PIT(2.4mMTris、1.5mM咪唑、11.6mM哌嗪、pH6至11)；盐介导的PIT(4mMTris、4mM咪唑、4mM哌嗪、pH6至11、0mM至16mMNaCl梯度)；盐介导的TPP(5mMTris、5mM哌嗪、5mM磷酸盐、pH6至11、0mM至30mMNaCl梯度)；混合pHIEC、TPP(5mMTris、5mM哌嗪、5mM磷酸盐、pH6至9、0mMNaCl)；TIC(5mMTris、5mM哌嗪、5mMCAPS、pH6至9、10mMNaCl)。运行20至22分钟。

图20的图示出：使用浅的pH梯度可改进使用pI为8.6至9.3的MAb的峰分辨率。测试的梯度如下：PIT(2.4mMTris、1.5mM咪唑、11.6mM哌嗪，pH6至11)；盐介导的PIT(4mMTris、4mM咪唑、4mM哌嗪，pH5至11，16mMNaCl)；盐介导的TPP(5mMTris、5mM哌嗪、5mM磷酸盐，pH6至11，20mMNaCl梯度)；TPP(5mMTris、5mM哌嗪、5mM磷酸盐，pH6至9，20mMNaCl)；TIC(5mMTris、5mM哌嗪、5mMCAPS，pH7至10、30mMNaCl)。运行20至22分钟。

图21的图示出：使用浅的pH梯度可改进使用pI为9.0的MAb的峰分辨率。测试的梯度如下：PIT(2.4mMTris、1.5mM咪唑、11.6mM哌嗪，pH6至11)；盐介导的PIT(4mMTris、4mM咪唑、4mM哌嗪、pH5至11、16mMNaCl)；TPP(5mMTris、5mM哌嗪、5mM磷酸盐，pH6至11，30mMNaCl梯度)；TPP(5mMTris、5mM哌嗪、5mM磷酸盐，pH7至10，20mMNaCl)；TIC(5mMTris、5mM哌嗪、5mMCAPS，pH7至10，30mMNaCl)。运行20至22分钟。

图22的图示出十五分钟运行时间是可行的。Mab具有8.8的pI。示出了两个色谱图，一个为6至10的pH梯度，于20mMNaCl中22分钟；一个为7至10的pH梯度，于20mMNaCl中15分钟。

图23的图示出十五分钟运行时间是可行的。Mab具有9.0的pI。示出了两个色谱图，一个为6至10的pH梯度，于20mMNaCl中22分钟；一个为7至10的pH梯度，于20mMNaCl中15分钟。

图24的图示出在靶条件下对三种单克隆抗体进行重复分析的重叠色谱图。

图25的图示出不同色谱条件下MAb3的重叠色谱图。将主峰对齐。

图26的分布图示出盐浓度对色谱性能的影响。圈表示主峰的百分率，菱形表示酸性变体百分率，×表示碱性变体百分率，三角形表示分辨率1，且*表示分辨率2。

图27的分布图示出另一些参数对色谱性能的影响。左上图示出缓冲剂浓度(mM)的影响。右上图示出起始pH的影响。左下图示出以℃计的柱温的影响。右下图示出流量(ml/分钟)的影响。

发明详述

本发明提供了分析包含多肽以及一种或多种污染物、例如多肽变体的组合物的方法，其包括使用具有初始pH和初始离子强度的加样缓冲剂(loadingbuffer)使所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，使用洗脱缓冲剂从所述离子交换柱洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中通过pH梯度改变所述洗脱缓冲剂的pH，并且通过离子强度梯度改变所述洗脱缓冲剂的离子强度，从而使所述多肽和所述一种或多种污染物作为不同的分离实体从色谱材料洗脱。本发明的方法可用于分析等电点不处于中性pH范围的多肽。在一些实施方案中，所述方法可用于有效地从污染物分离pI大于9的多肽。在其他实施方案中，所述方法可用于有效地从污染物分离pI小于7的多肽。在一些实施方案中，所述方法有效地从多肽分离一种或多种污染物，其中所述多肽具有范围介于约7.0至约12的pI。在一些实施方案中，所述方法可用于有效地从多肽分离一种或多种污染物，其中所述多肽具有范围介于约7.0至约12的pI。多肽的例子包括但不限于抗体和抗体片段。污染物的例子包括但不限于抗体变体，例如抗体电荷变体。

在其他方面，本发明提供了分析包含多肽以及一种或多种污染物、例如多肽变体的组合物的方法，其包括使用具有初始pH和初始离子强度的加样缓冲剂使所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，使用洗脱缓冲剂从所述离子交换柱洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中通过pH梯度改变所述洗脱缓冲剂的pH，并且所述离子强度基本保持相同，从而使所述多肽和所述一种或多种污染物作为不同的分离实体从色谱材料洗脱。本发明的方法可用于分析等电点不处于中性pH范围的多肽。在一些实施方案中，所述方法可用于有效地从污染物分离pI大于9的多肽。在其他实施方案中，所述方法可用于有效地从污染物分离pI小于7的多肽。多肽的例子包括但不限于抗体和抗体片段。污染物的例子包括但不限于抗体变体，例如抗体电荷变体。

在一些方面中，本发明提供了分析包含多肽以及一种或多种污染物、例如多肽变体的组合物的方法，其包括使用具有初始pH和初始离子强度的加样缓冲剂使所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，使溶液中多肽的电荷状态落在最优pH梯度离子交换分离窗内。然后将所述多肽和所述一种或多种污染物作为不同的分离实体从色谱材料洗脱。

在本发明的一些实施方案中，所述污染物是多肽电荷变体，包括酸性变体，即阳离子交换模式中保留时间小于主峰的变体。酸性变体的例子包括但不限于其中一个或多个谷氨酰胺和/或天冬酰胺残基已经被脱酰胺化的多肽。在本发明的一些实施方案中，所述污染物是多肽电荷变体，包括碱性变体，即阳离子交换模式中保留时间大于主峰的变体。例子包括但不限于其中天冬氨酸残基已被修饰成琥珀酰亚胺部分的变体。

在一些实施方案中，本发明提供了分析包含多肽以及一种或多种污染物的组合物的方法，其中基本相同的方法可用于分析具有不同pI的多肽。例如，所述方法可用于分析pI介于6.0至9.5范围的多肽。在一些实施方案中，所述多肽是抗体或其片段。在一些实施方案中，所述污染物是抗体变体或抗体片段的变体。在一些实施方案中，所述污染物是抗体电荷变体或抗体片段的电荷变体。在一些实施方案中，本发明提供了用于分析抗体或抗体片段的组合物中电荷变体(例如酸性变体和/或碱性变体)的存在的方法，其中所述方法可用于分析包含抗体的不同组合物，其中所述抗体具有范围介于6.0至9.5的pI。

I.定义

术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可交换用于表示任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可为直链的或支化的，其可包含修饰的氨基酸，并且其可由非氨基酸中断。该术语还涵盖经过天然修饰或通过干涉修饰的氨基酸聚合物；所述修饰例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如用标记性组分缀合。还包含于该定义内的是例如包含一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。本文所用术语“多肽”和“蛋白质”特别涵盖抗体。

本文所用术语“多肽电荷变体”是指从其天然状态修饰成使多肽的电荷发生改变的多肽。在一些例子中，电荷变体比母多肽更具酸性；即具有比母多肽更低的pI。在其他例子中，电荷变体比母多肽更具碱性；即具有比母多肽更高的pI。这样的修饰可为工程化的，或者是天然过程的结果，例如氧化、脱酰胺化、赖氨酸残基C端加工、N端焦谷氨酸形成和糖基化。在一些例子中，多肽电荷变体是糖蛋白，其中附接至蛋白质的多糖被修饰成该糖蛋白的电荷与母糖蛋白相比发生改变，例如，通过添加唾液酸或其衍生物。本文所用的“抗体电荷变体”是抗体或其片段，其中所述抗体或其片段已从其天然状态修饰成所述抗体或其片段的电荷发生改变。

“纯化的”多肽(例如抗体或免疫粘附素)意为多肽的纯度升高，使其以比其存在于天然环境中和/或比其当在实验室条件下初始合成和/或扩增时更纯的形式存在。纯度是相对性的术语，并且不一定是指绝对纯度。

术语“拮抗剂”以最广含义使用，并且包括部分或完全阻断、抑制或中和天然多肽的生物活性的任何分子。以相似的方式，术语“激动剂”以最广含义使用，并且包括任何模拟天然多肽的生物活性的任何分子。合适的激动剂或拮抗剂分子具体包括天然多肽的激动剂或拮抗剂抗体或抗体片段、片段或氨基酸序列变体等。用于鉴定多肽的激动剂或拮抗剂的方法可包括使多肽与候选激动剂或拮抗剂分子接触，并测量通常与所述多肽相关的一种或多种生物学活性的可检测变化。

“结合”感兴趣抗原、例如肿瘤相关多肽抗原标靶的多肽是这样一种多肽，其以充分亲和力结合抗原，使得该多肽可用作靶向表达所述抗原的细胞或组织的诊断剂或治疗剂，并且不显著地与其他多肽交叉反应。在这样的实施方案中，通过荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)确定，多肽结合“非标靶”多肽的程度将小于该多肽结合其特定靶多肽的约10％。

关于多肽与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”特定多肽或特定多肽标靶上的表位，意为可测量地不同于非特异性相互作用的结合。例如，特异性结合可通过确定分子的结合与对照分子的结合的比较来测量，所述对照分子一般是不具有结合活性的相似结构的分子。例如，特异性结合可通过与和标靶相似的对照分子、例如过量的非标记标靶进行竞争来确定。在这种情况下，如果标记的标靶对探针的结合被过量的未标记标靶竞争性抑制，则表示存在特异性结合。

本文的术语“抗体”以最广的含义使用，并且具体涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，以及抗体片段，只要表现出期望生物学活性即可。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中可与抗体互换使用。

抗体是天然存在的免疫球蛋白分子，其具有多种结构，所有结构都基于免疫球蛋白折叠。例如，IgG抗体具有两条“重”链和两条“轻”链，其通过二硫键形成有功能的抗体。每条重链和轻链本身都包含“恒定”(C)区和“可变”(V)区。V区确定抗体的抗原结合特异性，而C区提供结构支撑以及与免疫效应子的非抗原特异性相互作用中的功能。抗体或抗体的抗原结合片段的抗原结合特异性是抗体特异性结合特定抗原的能力。

抗体的抗原结合特异性通过V区的结构特征来确定。变异性在可变结构域的110个氨基酸范围之间不是平均分布的。相反，V区由被各为9至12个氨基酸长的称为“高变区”的极具变异性的较短区域分隔的、15至30个氨基酸的相对不变的延伸(称为构架区，FR)组成。天然的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，大多采取β-叠片构型，由三个高变区连接，高变区形成环，连接β-叠片结构且在一些情况下形成β-叠片结构的部分。各链中的高变区被FR维持紧邻在一起，并且与来自其他链的高变区一起促进形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接涉及使抗体结合至抗原，但表现出多种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。

每个V区通常包含三个互补决定区(“CDR”，每一个都包含“高变环”)，以及四个构架区。抗体结合位点——以高亲和力结合至特定期望抗原所需的最小结构单元——因此将通常包含三个CDR和至少三个、优选四个穿插其间从而将以适当构象维持和呈递CDR的构架区。典型的四链抗体具有由VH和VL结构域协同限定的抗原结合位点。某些抗体如骆驼抗体或鲨鱼抗体，没有轻链，并且依靠由仅重链形成的结合位点。可制备单一结构域工程化免疫球蛋白，其中结合位点由仅重链或轻链形成，没有VH和VL之间的协同作用。

术语“可变”是指这样的事实，即可变结构域某些部分的序列在抗体之间广泛不同，并且用于各特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性。然而，该变异性不是平均遍布于抗体的可变结构域。无论是在轻链可变结构域还是在重链可变结构域中，其都浓缩于三个被称为高变区的区段中。可变结构域的更高保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链可变结构域各自包含四个FR，大多采取β-叠片构型，由三个高变区连接，高变区形成环，连接β-叠片结构且在一些情况下形成β-叠片结构的部分。各链中的高变区被FR维持紧邻在一起，并且与来自其他链的高变区一起促进形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域不直接涉及使抗体结合至抗原，但表现出多种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。

用于本文时，术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区可包含来自“互补决定区”或“CDR”(例如VL中的大约第24至34位(L1)、第50至56位(L2)和第89至97位(L3)残基，以及VH中的大约第31至35B位(H1)、第50至65位(H2)和第95至102位(H3)残基(Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991)))，和/或来自“高变环”的那些残基(例如VL中的第26至32位(L1)、第50至52位(L2)和第91至96位(L3)残基，以VH中的第26至32位(H1)、第52A至55位(H2)和第96至101位(H3)残基(Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987)))。

如本文定义，“骨架”或“FR”残基是除了高变区残基外的可变结构域残基。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段例子包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双抗体；串联双抗体(taDb)、线性抗体(例如美国专利No.5,641,870，实施例2；Zapata等，ProteinEng.8(10):1057-1062(1995))；单臂抗体、单一可变结构域抗体、微型抗体、单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体(例如包括但不限于Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH₃、(scFV)4-Fc、二-scFv、bi-scFv或串联(双,三)-scFv)；以及双特异性T细胞衔接物(BiTE)。

抗体木瓜蛋白酶消化产生两个相同的、被称为“Fab”片段的抗原结合片段(每个片段具有单一的抗原结合位点)，以及残余的“Fc”片段(其名称反映了其易于结晶的能力)。胃蛋白酶处理产生了具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的F(ab')2片段。

“Fv”是包含完全抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由一条重链和一条轻链可变结构域以紧密的非共价结合形成的二聚物组成。正是该构型使各可变结构域的三个高变区相互作用从而限定V_H-V_L二聚物表面上的抗原结合位点。这六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单一的可变结构域(或Fv的包含仅三个对抗原具有特异性的高变区的一半)亦具有识别和结合抗原的能力，尽管比全结合位点具有更低的亲和力。

Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于，添加了处于重链CH1结构域羧基末端的一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文对Fab'的定义，其中恒定结构域的半胱氨酸残基(多个)带有至少一个游离巯基。F(ab')₂抗体片段初始产生为其间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对。抗体片段的其他化学耦合也是已知的。

来自任何脊椎动物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可基于其恒定结构域的氨基酸序列分为两种明显不同的类型中的一种，分别称为kappa(κ)和lambda(λ)。

根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，抗体可分为不同类型。存在五个完整抗体的主要类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些可进一步分为亚类(亚型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。与这些不同抗体类型相对应的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于单一的多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽还包含VH结构域与VL结构域之间的多肽接头，这使scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。scFv的综述参见PlückthuninThePharmacologyofMonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag,NewYork,第269-315页(1994)。

术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在相同多肽链(V_H-V_L)中连接至轻链可变结构域(V_L)的重链可变结构域(V_H)。通过使用短至不能使相同链上的两个结构域配对的接头来迫使结构域与另一链上的互补结构域配对，并创造出两个抗原结合位点。在例如以下文献中更完整地描述了双抗体：EP404,097；WO93/11161；以及Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。

术语“多特异性抗体”以最广含义使用，并且特别涵盖具有多表位特异性的抗体。这样的多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L)、其中所述V_HV_L单元具有多表位特异性的抗体；具有两个或多个V_L和V_H结构域、各V_HV_L单元结合不同表位的抗体；具有两个或多个单一可变结构域、各单一可变结构域结合不同表位的抗体；全长抗体；抗体片段如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体、双特异性双抗体、三抗体、三功能抗体，已经被共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”是指特异性结合相同或不同标靶(多种)上的两个或更多个不同表位的能力。“单特异性”是指结合仅一个表位的能力。根据一个实施方案，所述多特异抗体是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力结合各表位的IgG抗体。

表述“单一结构域抗体”(sdAb)或“单一可变结构域(SVD)抗体”一般是指其中单一可变结构域(VH或VL)可赋予抗原结合的抗体。换言之，单一可变结构域不需要为了识别靶抗原而与另一可变结构域相互作用。单一结构域抗体的例子包含来源于骆驼科(camelids)(驼羊(lamas)和骆驼)和软骨鱼(例如护士鲨)的那些和通过重组方法衍生自人抗体和小鼠抗体的那些(Nature(1989)341:544-546；DevCompImmunol(2006)30:43-56；TrendBiochemSci(2001)26:230-235；TrendsBiotechnol(2003):21:484-490；WO2005/035572；WO03/035694；FebsLett(1994)339:285-290；WO00/29004；WO02/051870)。

本文所用术语“单克隆抗体”是指得自基本同质的抗体群的抗体，即组成群体的单个抗体是相同的和/或结合相同表位，除非在单克隆抗体的生产期间可产生可能的变体，这样的变体一般以少量存在。与通常包含针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体相比，每种单克隆抗体都针对抗原上单一的决定子。除了其特异性外，单克隆抗体的优点还在于，它们未被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示这样的抗体特征，即得自基本同质的抗体群，并且其不应解释为需要通过任何特定的方法来产生该抗体。例如，根据本文提供的方法使用的单克隆抗体可通过由Kohler等Nature256:495(1975)首次描述的杂交瘤法来制成，或者可通过重组DNA法来制成(参见例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可通过使用例如Clackson等Nature352:624-628(1991)和Marks等J.Mol.Biol.222:581-597(1991)描述的技术分离自噬菌体抗体文库。

在本文中，单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的部分与来源于特定种的或者属于特定抗体类型或亚类型的抗体的对应序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与来源于另一种或者属于另一抗体类型或亚类型的抗体的对应序列相同或同源，以及这样的抗体的片段，只有它们表现出期望的生物学活性即可(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含来源于非人灵长类(例如旧大陆猴(OldWorldMonkey)，如狒狒、恒河猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化的(primatized)”抗体(USPatNo.5,693,780)。

非人(例如鼠科)抗体的“人源化”形式是包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔子或非人灵长类、具有期望特异性、亲和力和能力的高变区的残基替换。在一些例子中，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被对应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包括未在受体抗体或供体抗体中发现的残基。进行这些改造是为了进一步改善抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含几乎所有的至少一个(通常两个)可变结构域，其中所有或几乎所有高变环与非人免疫球蛋白的高变环对应，并且除了上述FR取代之外，所有或几乎所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体还将任选包含免疫球蛋白恒定区的至少部分，通常为人免疫球蛋白恒定区。另一些细节参见Jones等，Nature321:522-525(1986)；Riechmann等Nature332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。

出于本文的目的，“完整抗体”是包含重链和轻链可变结构域以及Fc区的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体可具有一种或多种效应子功能。

“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链都通过一个共价二硫键连接至重链，而不同的免疫球蛋白亚型的重链之间，二硫连接的数量不同。每条重链和轻链还都有规律地间隔着链内二硫桥。每条重链在其一端具有可变结构域(V_H)继之以一些恒定结构域。每条轻链的一端具有可变结构域(V_L)并且另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。特定的氨基酸残基被认为形成处于轻链与重链可变结构域之间的界面。

“裸抗体”是(如本文所定义)未缀合至例如细胞毒性部分或放射性标记等异源分子的抗体。

在一些实施方案中，抗体“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性，并且随着抗体亚型而变化。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调。

“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并随后引起靶细胞裂解。用于介导ADCC的主要细胞是NK细胞，其仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)第464页的表3概述了造血细胞上的FcR表达。为了评价感兴趣分子的ADCC活性，进行了例如在美国专利No.5,500,362或5,821,337中描述的体外ADCC测定。用于这样的测定的可用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。作为另一选择或此外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如如Clynes等Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656(1998)公开的在动物模型内进行。

“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。在一些实施方案中，所述细胞表达至少FcγRIII，并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中PBMC和NK细胞是优选的。

“补体依赖的细胞毒性”或“CDC”是指分子在补体的存在下裂解标靶的能力。补体活化途径由补体系统的第一组分(C1q)结合与同源抗原复合的分子(例如多肽(例如抗体))而引发。为了评价补体活化，可进行CDC测定，例如如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202:163(1996)中所描述。

术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。在一些实施方案中，FcR是天然序列人FcR。此外，优选FcR是结合IgG抗体(γ受体)的FcR，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括等位基因变体以及这些受体的可选剪切形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，其具有相似的氨基酸序列，区别主要在其胞质结构域。活化性受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)。(参见Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR在以下文献中有综述，Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)；Capel等，Immunomethods4:25-34(1994)；以及deHaas等，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括未来将鉴定的FcR在内。该术语还包括新生儿受体FcRn，该受体负责将母体IgG传递至胎儿(Guyer等，J.Immunol.117:587(1976)，以及Kim等，J.Immunol.24:249(1994))。

“污染物”是指与期望多肽产物不同的材料。在本发明的一些实施方案中，污染物包括多肽的电荷变体。在本发明的一些实施方案中，污染物包括抗体或抗体片段的电荷变体。在本发明的另一些实施方案中，污染物包括而不限于：宿主细胞材料，如CHOP；浸沥的(leached)蛋白A；核酸；期望多肽的变体、片段、聚集物或衍生物；另一种多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基组分等。在一些例子中，污染物可为来自例如但不限于细菌细胞(例如大肠杆菌细胞)、昆虫细胞、原核细胞、真核细胞、酵母菌细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞、真菌细胞的宿主细胞蛋白(HCP)。

本文所用术语“免疫粘附素”表示组合了异源多肽的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能的类抗体分子。从结构上而言，免疫粘附素包含氨基酸序列与免疫球蛋白恒定结构域序列的融合物，所述氨基酸序列具有期望的结合特异性，其不同于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源的”)。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的连续的氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可得自任何免疫球蛋白，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。

本文所用的“基本相同”表示，值或参数未以显著效果变化。例如，如果离子强度未显著变化，则柱出口处的色谱流动相的离子强度与流动相的初始离子强度基本相同。例如，柱出口处的离子强度处于初始离子强度的10％、5％或1％以内，其与初始离子强度基本相同。

关于“约”，本文的值或参数包括(或描述)针对该值或参数本身的变体。例如，关于“约X”的描述包括“X”的描述。

除非上下文另有清楚指明，否则本文以及所附权利要求中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数引用。应理解，本文中描述的本发明方面和变体包括“由”和/或“基本由”方面和变体“组成”。

II.色谱方法

在一些方面中，本发明提供了分析包含多肽以及一种或多种污染物如多肽电荷变体的组合物的方法，其包括使用具有初始pH和初始离子强度的加样缓冲剂使所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，使用洗脱缓冲剂从所述离子交换柱洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中通过pH梯度改变所述洗脱缓冲剂的pH，并且通过离子强度梯度改变所述洗脱缓冲剂的离子强度，从而使所述多肽和所述一种或多种污染物作为不同的分离实体从色谱材料洗脱。

在其他方面，本发明提供了分析包含多肽以及一种或多种污染物如多肽变体的组合物的方法，其包括使用具有初始pH和初始离子强度的加样缓冲剂使所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，使用洗脱缓冲剂从所述离子交换柱洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中通过pH梯度改变所述洗脱缓冲剂的pH，并且通过离子强度梯度改变所述洗脱缓冲剂的离子强度，从而使所述多肽和所述一种或多种污染物作为不同的分离实体从色谱材料洗脱。

在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述色谱材料是阳离子交换材料。在一些实施方案中，所述阳离子交换材料是带负电的固相，并且具有自由阳离子用于与跨过或通过所述固相的水性溶液中的阳离子交换。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述阳离子交换材料可为膜、整料(monolith)或树脂。在一些实施方案中，所述阳离子交换材料可为树脂。所述阳离子交换材料可包含羧酸官能团或磺酸官能团，例如但不限于磺酸根、羧酸、羧甲基磺酸、磺基异丁基、磺基乙基、羧基、磺基丙基、磺酰基、次硫酸乙基(sulphoxyethyl)或正磷酸根。在上文的一些实施方案中，所述阳离子交换色谱材料是阳离子交换色谱柱。在一些实施方案中，阳离子交换色谱材料用于pI大于约9的多肽，例如抗体或其片段。例如，抗体或其片段可具有9至10、9至11、10至11、9至12、10至12或11至12的pI。

在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述色谱材料是阴离子交换材料。在一些实施方案中，所述阴离子交换色谱材料是带正电的固相，并且具有自由阴离子用于与跨过或通过所述固相的水性溶液中的阴离子交换。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述阴离子交换材料可为膜、整料或树脂。在一个实施方案中，所述阴离子交换材料可为树脂。在一些实施方案中，所述阴离子交换材料可包含伯胺、仲胺、叔胺或季铵离子官能团、多胺官能团或二乙基氨基乙基官能团。在上文的一些实施方案中，所述阴离子交换色谱材料是阴离子交换色谱柱。在一些实施方案中，阴离子交换色谱材料用于具有小于约7的pI的多肽，例如抗体或其片段。例如，抗体或其片段可具有6至7、5至7、5至6、4至7、4至6或4至5的pI。

在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述离子交换材料可利用常规色谱材料或对流色谱材料。所述常规色谱材料包括例如灌注性材料(例如聚(苯乙烯-二乙烯基苯)树脂)和扩散性材料(例如交联的琼脂糖树脂)。在一些实施方案中，所述聚(苯乙烯-二乙烯基苯)树脂可为Poros树脂。在一些实施方案中，所述交联的琼脂糖树脂可为磺基丙基-琼脂糖快流(sulphopropyl-SepharoseFastFlow，“SPSFF”)树脂。所述对流色谱材料可为膜(例如聚醚砜)或整体式材料(例如交联聚合物)。所述聚醚砜膜可为Mustang。所述交联的聚合物整体式材料可为交联的聚(缩水甘油基甲基丙烯酸酯-共-乙烯二甲基丙烯酸酯)。

在本发明的方法的一些实施方案中，所述色谱材料处于色谱柱中；例如阳离子交换色谱柱或阴离子交换色谱柱。在一些实施方案中，所述色谱柱用于液相色谱。在一些实施方案中，所述色谱柱用于高效液相色谱(HPLC)。在一些实施方案中，所述色谱柱是HPLC色谱柱；例如，阳离子交换HPLC柱或阴离子交换HPLC柱。

阳离子交换材料的例子是本领域已知的，包括但不限于：MustangS、SartobindS、SO3Monolith、SCeramicHyperD、PorosXS、PorosHS50、PorosHS20、SPSFF、SP-SepharoseXL(SPXL)、CMSepharoseFastFlow、CaptoS、FractogelSeHiCap、FractogelSO3或FractogelCOO。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述阳离子交换材料是PorosHS50。在一些实施方案中，所述PorosHS树脂可为PorosHS50μm或PorosHS20μm颗粒。用于本发明方法的阳离子交换色谱柱的例子包括但不限于ProPacWCX-10和ProPacWCX-10HT。

阴离子交换材料的例子是本领域已知，并且包括但不限于PorosHQ50、PorosPI50、PorosD、MustangQ、QSepharoseFF和DEAESepharose。用于本发明方法的阴离子交换色谱柱的例子包括但不限于DionexProPac10SAX和TosohGSKgelQSTAT7μMWAX。

一种可用于本发明方法的示例性HPLC方法如下；但是，本发明的方法不应解释为受这些方法的限制。将样品添加至自动进样器，并冷藏(5±3℃)。将柱放置于柱室中，并在分析期间可采用温度控制特征来使柱室温度处于设定值的窄范围(±1℃)内。在280nm监测柱流出物。

用流动相将样品稀释至约1mg/mL至2mg/mL的目标多肽浓度。在一些实施方案中，可用以1:100(w/w)的比率添加的羧肽酶B(CpB)消化多肽，并于37℃孵育20分钟。样品可在5℃储存直至分析。

仪器可包括低压四元梯度泵、具有温度动控制能力的快速分离自动进样器、热控柱室和二极管阵列UV检测器。在检测器的出口处，可连接PCM-3000pH和电导率监测器，以实时收集pH和电导率数据。可进行仪器控制、数据获取和数据分析；例如通过使用ThermoScientificDionexChromeleon软件，6.8版来进行。

流动相制备物的非限制性例子如下。tris和咪唑的单独的储备缓冲剂溶液制备为1.0M，CAPS溶液制备为0.1M浓度，不调节pH值，并储存于室温。使用去离子水将单独的组分稀释至约90％目标体积中的10mM终浓度，并使其混合。当溶液稀释(quench)至最终体积后，将混合物分成两等份。

将缓冲剂的pH值用盐酸调节至6.0(缓冲剂A)，以及用氢氧化钠调节至11.0(缓冲剂B)。用去离子水将氯化钠制备为0.1M溶液(缓冲剂C)。将MilliQ水(18MOhms)分配于单独的容器中(缓冲剂D)。然后，在使用前通过0.2μm尼龙过滤器单独过滤所有流动相。

阳离子交换色谱的一个非限制性例子如下。用缓冲剂A与D的1:1混合物将单克隆抗体样品稀释至1mg/mL，并于5±3℃保存于自动进样器中。将PropacWCX-10HT，4×50mm柱放置于温度设置为40±1℃的柱室中。每次色谱运行注射20μL蛋白(20μg)。流动相流速为1.0ml/分钟。通过280nm的紫外(UV)吸光度来检测蛋白质。

在一些例子中，通过使用缓冲剂A、B、C和D、使用四元泵上形成的四元梯度来建立混合pH梯度。该布置提供了调节以下的灵活性：1)起始pH和终止pH，使用缓冲剂A和B调节，以及2)用于各梯度的盐的量，使用缓冲剂C和D调节。例如，通过将缓冲剂B从0增加至40％、同时保持缓冲剂C和D分别为10％和40％来建立6至10的pH梯度以及恒定的10mM盐浓度。下面实施例的表2提供了混合梯度的例子。

可根据例如期望的缓冲剂pH、期望的缓冲剂电导率、感兴趣的蛋白质的性质以及分析方法来采用多种缓冲剂。

本文所用的洗脱是从色谱材料移除产物，例如多肽和/或污染物。洗脱缓冲剂是从色谱材料洗脱多肽或其他感兴趣的产物所使用的缓冲剂。在一些实施方案中，所述洗脱缓冲剂是色谱流动相的部分。在一些实施方案中，将包含多肽和污染物的组合物作为流动相的部分施加至色谱材料。然后改变流动相，以随着多肽和污染物从色谱材料洗脱而使多肽从污染物分离。在许多情况下，洗脱缓冲剂具有与加样缓冲剂不同的物理特征。例如，洗脱缓冲剂可具有与加样缓冲剂不同的pH和/或与加样缓冲剂不同的离子强度。在一些实施方案中，通过改变洗脱缓冲剂的pH和离子强度来从色谱材料洗脱多肽和污染物。在一些实施方案中，在洗脱过程中，相对于加样缓冲剂，提高洗脱缓冲剂的pH和洗脱缓冲剂的离子强度。在一些实施方案中，在洗脱过程中相对于加样缓冲剂提高洗脱缓冲剂的pH，并使洗脱缓冲剂的离子强度保持基本相同。

在本发明的一些实施方案中，将pI>9的多肽施用至阳离子交换色谱材料，并且通过提高色谱流动相的pH和离子强度来从阳离子交换色谱材料洗脱多肽。在本发明的一些实施方案中，将pI>9的多肽施用至阳离子交换色谱材料，并且通过提高色谱流动相的pH同时维持流动相的离子强度来从阳离子交换色谱材料洗脱多肽。

在本发明的一些实施方案中，将pI<7的多肽施用至阴离子交换色谱材料，并且通过降低色谱流动相的pH并且提高色谱流动相的离子强度来从阴离子交换色谱材料洗脱多肽。在本发明的一些实施方案中，将pI<7的多肽施用至阴离子交换色谱材料，并且通过降低色谱流动相的pH同时维持色谱流动相的离子强度来从阴离子交换色谱材料洗脱多肽。

在任意上述实施方案的一些方面中，通过线性梯度或阶跃梯度将洗脱缓冲剂的pH相对于加样缓冲剂改变。

在本发明的一些实施方案中，通过提高流动相中洗脱缓冲剂的pH来从色谱材料洗脱多肽。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH5升高至约pH11。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH6升高至约pH9。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH6升高至约pH10。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH6升高至约pH11。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH7升高至约pH9。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH7升高至约pH10。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH7升高至约pH11。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH8升高至约pH9。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH8升高至约pH10。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH8升高至约pH11。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH9升高至约pH11。在任何上述实施方案中，将洗脱缓冲剂的pH升高与洗脱缓冲剂的离子强度升高组合。在任何上述实施方案的其他实施方案中，提高洗脱缓冲剂的pH，但是洗脱缓冲剂的离子强度保持基本相同。在任何上述实施方案中，在多于约10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟或60分钟内建立pH梯度。在任何上述实施方案中，所述色谱材料是阳离子交换色谱材料。在任何上述实施方案中，所述多肽的pI>9。在任何上述实施方案中，所述多肽是抗体或其片段。

在本发明的一些实施方案中，通过降低流动相中洗脱缓冲剂的pH来从色谱材料洗脱多肽。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH9降低至约pH5。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH9降低至约pH6。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH9降低至约pH7。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH8降低至约pH5。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH8降低至约pH6。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH8降低至约pH7。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂的pH从约pH7降低至约pH5。在任何上述实施方案中，将洗脱缓冲剂的pH降低与洗脱缓冲剂的离子强度升高组合。在任何上述实施方案的其他实施方案中，降低洗脱缓冲剂的pH，但是洗脱缓冲剂的离子强度保持基本相同。在任何上述实施方案中，在多于约10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟或60分钟内建立pH梯度。在任何上述实施方案中，所述色谱材料是阴离子交换色谱材料。在任何上述实施方案中，所述多肽的pI<7。在任何上述实施方案中，所述多肽是抗体或其片段。

可使用本领域已知的缓冲剂制备具有特定pH的洗脱缓冲剂。缓冲剂的例子包括但不限于哌嗪、咪唑、Tris、磷酸盐和N-环己基-3-氨基丙烷磺酸(CAPS)。在一些实施方案中，缓冲剂的pH可通过例如添加HCl使缓冲剂更酸性或添加NaOH使缓冲剂更碱性来调节。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂包含缓冲剂的组合。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂包含哌嗪、咪唑和Tris的组合(例如PIT缓冲剂)。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂包含11.6mM哌嗪、1.5mM咪唑和2.4mMTris。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂包含4mM哌嗪、4mM咪唑和4mMTris。在本发明的一些实施方案中，包含哌嗪、咪唑和Tris的组合的洗脱缓冲剂用于多肽的阳离子交换色谱的流动相中。在本发明的一些实施方案中，包含哌嗪、咪唑和Tris的组合的洗脱缓冲剂用于pI>9的多肽的阳离子交换色谱的流动相中。在本发明的一些实施方案中，包含哌嗪、咪唑和Tris的组合的洗脱缓冲剂用于抗体的阳离子交换色谱的流动相中。在本发明的一些实施方案中，包含哌嗪、咪唑和Tris的组合的洗脱缓冲剂用于pI>9的抗体的阳离子交换色谱的流动相中。在本发明的一些实施方案中，包含哌嗪、咪唑和Tris的组合的洗脱缓冲剂用于多肽的阴离子交换色谱的流动相中。在本发明的一些实施方案中，包含哌嗪、咪唑和Tris的组合的洗脱缓冲剂用于pI<7的多肽的阴离子交换色谱的流动相中。在本发明的一些实施方案中，包含哌嗪、咪唑和Tris的组合的洗脱缓冲剂用于抗体的阴离子交换色谱的流动相中。在本发明的一些实施方案中，包含哌嗪、咪唑和Tris的组合的洗脱缓冲剂用于pI<7的抗体的阴离子交换色谱的流动相中。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂包含Tris、哌嗪和磷酸盐的组合(例如TPP缓冲剂)。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂包含5mMTris、5mM哌嗪和5mM磷酸盐。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂包含10mMTris、10mM哌嗪和10mM磷酸盐。在本发明的一些实施方案中，包含Tris、哌嗪和磷酸盐的组合的洗脱缓冲剂用于多肽的阳离子交换色谱的流动相中。在本发明的一些实施方案中，包含Tris、哌嗪和磷酸盐的组合的洗脱缓冲剂用于pI>9的多肽的阳离子交换色谱的流动相中。在本发明的一些实施方案中，包含Tris、哌嗪和磷酸盐的组合的洗脱缓冲剂用于抗体的阳离子交换色谱的流动相中。在本发明的一些实施方案中，包含Tris、哌嗪和磷酸盐的组合的洗脱缓冲剂用于pI>9的抗体的阳离子交换色谱的流动相中。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂包含Tris、咪唑和CAPS的组合(例如TIC缓冲剂)。在一些实施方案中，洗脱缓冲剂包含5mMTris、5mM咪唑和5mMCAPS。在本发明的一些实施方案中，包含Tris、咪唑和CAPS的组合的洗脱缓冲剂用于多肽的阳离子交换色谱的流动相中。在本发明的一些实施方案中，包含Tris、咪唑和CAPS的组合的洗脱缓冲剂用于pI>9的多肽的阳离子交换色谱的流动相中。在本发明的一些实施方案中，包含Tris、咪唑和CAPS的组合的洗脱缓冲剂用于抗体的阳离子交换色谱的流动相中。在本发明的一些实施方案中，包含Tris、咪唑和CAPS的组合的洗脱缓冲剂用于pI>9的抗体的阳离子交换色谱的流动相中。

在本发明的一些实施方案中，通过如上文所述的提高流动相中洗脱缓冲剂的pH并且通过提高流动相中洗脱缓冲液的离子强度来形成pH梯度和离子强度梯度，从而从色谱材料洗脱多肽。在一些实施方案中，通过提高色谱流动相的浓度来提高洗脱缓冲剂的离子强度。在本发明的其他实施方案中，通过提高洗脱缓冲剂的pH来从色谱材料洗脱多肽，在所述洗脱缓冲液中，通过在洗脱过程中维持盐浓度而使洗脱缓冲剂的离子强度在洗脱过程中维持基本相同。在一些实施方案中，所述盐浓度选择为使多肽的电荷状态提供最优的pH梯度离子交换色谱分离窗。可通过本领域已知的造模方法来确定多肽的电荷状态。盐的例子包括但不限于NaCl、KCl和Na₂SO₄。

在一些实施方案中，所述离子强度梯度是盐梯度。在一些实施方案中，所述盐梯度是约0mM盐至约200mM盐的梯度。在一些实施方案中，所述盐梯度是以下任意梯度：约0mM至约100mM、0mM至约60mM、0mM至约50mM、0mM至约40mM、0mM至约30mM、0mM至约20mM、0mM至约10mM、10mM至约200mM、10mM至约100mM、10mM至约50mM、10mM至约40mM、10mM至约30mM、10mM至约20mM、20mM至约200mM、20mM至约100mM、20mM至约50mM、20mM至约30mM、30mM至约200mM、30mM至约100mM，以及30mM至约50mM。

在上述实施方案的一些实施方案中，通过pH梯度和离子强度梯度的组合来从色谱材料洗脱多肽和/或一种或多种污染物。在一些实施方案中，pH梯度为pH5至pH10.8，且离子强度梯度为0mM盐至16mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH6至pH11，且离子强度梯度为0mM盐至60mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH5至pH9.5，且离子强度梯度为0mM盐至16mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH5至pH9.5，且离子强度梯度为0mM盐至30mM盐。在任何上述实施方案中，所述盐是NaCl、KCl或Na₂SO₄。在任何上述实施方案中，所述色谱材料是阳离子交换色谱材料。在任何上述实施方案中，所述多肽的pI>9。在任何上述实施方案中，所述多肽是pI>9的抗体。

在本发明的一些实施方案中，通过离子交换色谱来分析多肽和/或一种或多种污染物，其中通过pH梯度和离子强度梯度的组合来从色谱材料洗脱多肽和/或一种或多种污染物。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH5，且离子强度梯度为0mM盐至25mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH5，且离子强度梯度为0mM盐至100mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH5，且离子强度梯度为0mM盐至200mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH5，且离子强度梯度为0mM盐至300mM盐。在任何上述实施方案中，所述盐是NaCl、KCl或Na₂SO₄。在任何上述实施方案中，所述色谱材料是阴离子交换色谱材料。在任何上述实施方案中，所述多肽的pI<7。在任何上述实施方案中，所述多肽是pI<7的抗体。

在本发明的一些实施方案中，通过离子交换色谱来分析多肽和/或一种或多种污染物，其中通过在洗脱期间流动相的离子强度保持基本相同的情况下的pH梯度来从色谱材料洗脱多肽和/或一种或多种污染物。在一些实施方案中，pH梯度为pH6至pH11，且流动相的离子强度为约10mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH6至pH11，且流动相的离子强度为约20mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH6至pH11，且流动相的离子强度为约30mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH6至pH11，且流动相的离子强度为约40mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH6至pH11，且流动相的离子强度为约50mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH6至pH10，且流动相的离子强度为约10mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH6至pH10，且流动相的离子强度为约20mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH6至pH10，且流动相的离子强度为约30mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH6至pH10，且流动相的离子强度为约40mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH6至pH10，且流动相的离子强度为约50mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH6至pH9，且流动相的离子强度为约10mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH6至pH9，且流动相的离子强度为约20mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH6至pH9，且流动相的离子强度为约30mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH6至pH9，且流动相的离子强度为约40mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH6至pH9，且流动相的离子强度为约50mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH11，且流动相的离子强度为约10mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH11，且流动相的离子强度为约20mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH11，且流动相的离子强度为约30mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH11，且流动相的离子强度为约40mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH11，且流动相的离子强度为约50mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH10，且流动相的离子强度为约10mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH10，且流动相的离子强度为约20mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH10，且流动相的离子强度为约30mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH10，且流动相的离子强度为约40mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH10，且流动相的离子强度为约50mM盐。在任何上述实施方案中，所述盐是NaCl、KCl或Na₂SO₄。在任何上述实施方案中，所述色谱材料是阳离子交换色谱材料。在任何上述实施方案中，所述多肽的pI>9。在任何上述实施方案中，所述多肽是pI>9的抗体。

在本发明的一些实施方案中，通过离子交换色谱来分析多肽和/或一种或多种污染物，其中通过在洗脱期间流动相的离子强度保持基本相同的情况下的pH梯度组合来从色谱材料洗脱多肽和/或一种或多种污染物。在一些实施方案中，pH梯度为pH8至pH5，且流动相的离子强度为约10mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH8至pH5，且流动相的离子强度为约20mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH8至pH5，且流动相的离子强度为约30mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH8至pH5，且流动相的离子强度为约40mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH8至pH5，且流动相的离子强度为约50mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH8至pH5，且流动相的离子强度为约100mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH8至pH5，且流动相的离子强度为约200mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH5，且流动相的离子强度为约10mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH5，且流动相的离子强度为约20mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH5，且流动相的离子强度为约30mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH5，且流动相的离子强度为约40mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH5，且流动相的离子强度为约50mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH5，且流动相的离子强度为约100mM盐。在一些实施方案中，pH梯度为pH7至pH5，且流动相的离子强度为约200mM盐。在任何上述实施方案中，所述盐是NaCl、KCl或Na₂SO₄。在任何上述实施方案中，所述色谱材料是阴离子交换色谱材料。在任何上述实施方案中，所述多肽的pI<7。在任何上述实施方案中，所述多肽是pI<7的抗体。

在本发明的一些实施方案中，由流动相的电导率来度量例如洗脱缓冲剂等流动相的离子强度。电导率是指水溶液在两个电极之间的导电能力。在溶液中，电流通过离子迁移来流动。因此，通过提高水溶液中存在的离子的量，溶液将具有更高的电导率。电导率的基本度量单位是Siemen(或mho)、mho(mS/cm)，并且可通过使用电导率计来测量，例如多种型号的Orion电导率计。因为电解电导率是溶液中离子运载电流的能力，所以溶液的电导率可通过改变其中的离子浓度来改变。例如，可改变缓冲剂浓度和/或溶液中的盐(例如氯化钠、醋酸钠或氯化钾)浓度从而达到期望的电导率。优选地，改变多种缓冲剂的盐浓度来达到期望的电导率。

在一些实施方案中，色谱流动相具有大于约任何以下的初始电导率：0.0mS/cm、0.5mS/cm、1.0mS/cm、1.5mS/cm、2.0mS/cm、2.5mS/cm、3.0mS/cm、3.5mS/cm、4.0mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm、11mS/cm、12mS/cm、13mS/cm、14mS/cm、15mS/cm、16mS/cm、17.0mS/cm、18.0mS/cm、19.0mS/cm或20.0mS/cm。在一些实施方案中，例如通过离子强度梯度来在色谱过程期间提高流动相的电导率。在一些实施方案中，在完成洗脱时流动相的电导率大于约任何以下电导率：1.0mS/cm、1.5mS/cm、2.0mS/cm、2.5mS/cm、3.0mS/cm、3.5mS/cm、4.0mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm、11mS/cm、12mS/cm、13mS/cm、14mS/cm、15mS/cm、16mS/cm、17.0mS/cm、18.0mS/cm、19.0mS/cm或20.0mS/cm。在一些实施方案中，通过线性梯度来提高流动相的电导率。在一些实施方案中，通过包含一个或多个跨度的阶跃梯度来提高流动相的电导率。

在一些实施方案中，洗脱多肽时色谱流动相的初始电导率和流动相的最终电导率基本相同。在一些实施方案中，流动相的电导率保持基本为大于约任何以下电导率：0.0mS/cm、0.5mS/cm、1.0mS/cm、1.5mS/cm、2.0mS/cm、2.5mS/cm、3.0mS/cm、3.5mS/cm、4.0mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm、11mS/cm、12mS/cm、13mS/cm、14mS/cm、15mS/cm、16mS/cm、17.0mS/cm、18.0mS/cm、19.0mS/cm或20.0mS/cm。

在本文描述的任何方法的一些实施方案中，以多于任何以下的量将包含多肽和一种或多种污染物的组合物上载至色谱材料上：约1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、15μg、20μg、25μg或50μg。在一些实施方案中，以多于任何以下的浓度将组合物上载至色谱材料上：约0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL和5.0mg/mL。在一些实施方案中，在上载至色谱材料上之前稀释组合物；例如，稀释1:1、1:2、1:5、1:10或大于1:10。在一些实施方案中，将组合物稀释至色谱的流动相中。在一些实施方案中，将组合物稀释至加样缓冲剂中。

在本文描述的任何方法的一些实施方案中，流速为大于约任何以下的流速：0.5mL/分钟、0.6mL/分钟、0.7mL/分钟、0.8mL/分钟、0.9mL/分钟、1.0mL/分钟、1.1mL/分钟、1.2mL/分钟、1.3mL/分钟、1.4mL/分钟、1.5mL/分钟、1.75mL/分钟和2.0mL/分钟。

在本文描述的方法的一些实施方案中，色谱材料处于柱中。在一些实施方案中，所述柱是HPLC柱。在一些实施方案中，所述柱具有任一以下尺寸：4×50mm、4×100mm、4×150mm、4×200mm、4×250mm或2×250mm。

在本发明的一些实施方案中，所述方法是稳健的；即可干扰一个或多个运行参数而不影响分析结果(例如主峰与污染物峰的相对百分比)。在一些实施方案中，加样缓冲剂和/或洗脱缓冲剂中的缓冲剂浓度在任一以下范围中变化：约10mM至50mM、10mM至40mM、10mM至30mM、10mM至20mM、20mM至50mM、20mM至40mM、20mM至30mM、30mM至50mM、30mM至40mM，或40mM至50mM。在一些实施方案中，所述加样缓冲剂和/或所述洗脱缓冲剂中的缓冲剂浓度在约10mM至约50mM之间变化。在一些实施方案中，第一pH在任一以下范围中变化:约pH5.0至pH7.0、pH5.0至pH6.5、pH5.0至pH6.0、pH5.0至pH5.5、pH5.5至pH7.0、pH5.5至pH6.5、pH5.5至pH6.0、pH6.0至pH7.0、pH6.0至pH6.5，或pH6.5至pH7.0。在一些实施方案中，第一pH在约pH5.7至约pH6.3变化。在一些实施方案中，色谱材料的温度在任一以下范围中变化：约20℃至50℃、25℃至50℃、30℃至50℃、35℃至50℃、40℃至50℃、45℃至50℃、20℃至45℃、25℃至45℃、30℃至45℃、35℃至45℃、40℃至45℃、20℃至40℃、25℃至40℃、30℃至40℃、35℃至40℃、20℃至35℃、25℃至35℃、30℃至35℃、20℃至30℃、25℃至30℃，或20℃至25℃。在一些实施方案中，色谱材料的温度在约36℃至约44℃变化。在一些实施方案中，加样和洗脱在这样的流速下进行，所述流速在任一以下范围中变化：约0.5ml/分钟至2.0ml/分钟、0.8ml/分钟至2.0ml/分钟、1.0ml/分钟至2.0ml/分钟、1.2ml/分钟至2.0ml/分钟、1.5ml/分钟至2.0ml/分钟、1.8ml/分钟至2.0ml/分钟、0.5ml/分钟至1.8ml/分钟、0.8ml/分钟至1.8ml/分钟、1.0ml/分钟至1.8ml/分钟、1.2ml/分钟至1.8ml/分钟、1.5ml/分钟至1.8ml/分钟、0.5ml/分钟至1.5ml/分钟、0.8ml/分钟至1.5ml/分钟、1.0ml/分钟至1.5ml/分钟、1.2ml/分钟至1.5ml/分钟、0.5ml/分钟至1.2ml/分钟、0.8ml/分钟至1.2ml/分钟、1.0ml/分钟至1.2ml/分钟、0.5ml/分钟至1.0ml/分钟、0.8ml/分钟至1.0ml/分钟，或0.5ml/分钟至0.8ml/分钟。在一些实施方案中，加样和洗脱在约0.8ml/分钟至约1.2ml/分钟的流速进行。在一些实施方案中，加样和洗脱在约1.5ml/分钟至约2.0ml/分钟的流速进行。在另一些实施方案中，缓冲剂浓度、起始pH、色谱材料的温度和/或流速的任何组合可根据上述实施方案而不同。

电荷变体的检测

在一些方面，本发明提供了检测包含多肽和一种或多种多肽组合物中的变体的组合物中的多肽变体的方法。所述方法包括使用具有初始pH和初始离子强度的加样缓冲剂使所述多肽以及一种或多种变体结合至离子交换色谱材料，使用洗脱缓冲剂从所述离子交换柱洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中通过pH梯度改变所述洗脱缓冲剂的pH，且通过离子强度梯度改变所述洗脱缓冲剂的离子强度，从而使所述多肽和所述一种或多种污染物作为不同的分离实体从色谱材料洗脱。然后对色谱洗脱物分析母多肽以及变体的存在。多肽变体可包括多肽的酸性变体和母多肽的碱性变体。酸性变体即pI小于母多肽pI的变体，其例子包括但不限于其中一个或多个谷氨酰胺和/或天冬酰胺残基已被脱酰胺化的多肽。碱性多肽变体即pI大于母多肽的pI的变体，其例子包括但不限于其中天冬氨酸残基被修饰成琥珀酰亚胺部分的变体。在一些实施方案中，本发明的方法用于检测包含等电点不在中性pH范围内的多肽的组合物中的多肽变体。在一些实施方案中，所述方法可用于有效地从污染物中检测包含pI大于9的多肽组合物中的电荷变体。在一些实施方案中，阳离子交换色谱材料用于有效地检测包含pI大于9的多肽的组合物中的电荷变体。在其他实施方案中，所述方法可用于有效地从污染物中检测包含pI小于7的多肽组合物中的电荷变体。在一些实施方案中，阴离子交换色谱材料用于有效地检测包含pI小于7的多肽的组合物中的电荷变体。多肽的例子包括但不限于抗体和抗体片段。

在一些方面，本发明提供了检测包含多肽和一种或多种多肽变体的组合物中的多肽变体的方法。所述方法包括使用具有初始pH和初始离子强度的加样缓冲剂使所述多肽以及一种或多种变体结合至离子交换色谱材料，使用洗脱缓冲剂从所述离子交换柱洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中通过pH梯度改变所述洗脱缓冲剂的pH，且维持所述洗脱缓冲剂的离子强度与初始离子强度基本相同，从而使所述多肽和所述一种或多种污染物作为不同的分离实体从色谱材料洗脱。然后对色谱洗脱物分析母多肽的存在以及变体的存在。多肽变体可包括多肽的酸性变体和母多肽的碱性变体。酸性变体即pI小于母多肽pI的变体，其例子包括但不限于其中一个或多个谷氨酰胺和/或天冬酰胺残基已经脱酰胺化的多肽。碱性多肽变体即pI大于母多肽pI的变体，其例子包括但不限于其中天冬氨酸残基被修饰成琥珀酰亚胺部分的变体。在一些实施方案中，本发明的方法用于检测包含等电点不在中性pH范围内的多肽的组合物中的多肽变体。在一些实施方案中，所述方法可用于有效地检测包含pI大于9的多肽组合物中的电荷变体。在一些实施方案中，阳离子交换色谱材料用于有效地检测包含pI大于9的多肽的组合物中的电荷变体。在其他实施方案中，所述方法可用于有效地检测包含pI小于7的多肽组合物中的电荷变体。在一些实施方案中，阴离子交换色谱材料用于有效地检测包含pI小于7的多肽的组合物中的电荷变体。多肽的例子包括但不限于抗体和抗体片段。

确定组合物中多肽的纯度

在一些方面，本发明提供确定包含多肽的组合物中多肽纯度的方法。所述方法包括使用具有初始pH和初始离子强度的加样缓冲剂使所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，使用洗脱缓冲剂从所述离子交换柱洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中通过pH梯度改变所述洗脱缓冲剂的pH，且通过离子强度梯度改变所述洗脱缓冲剂的离子强度，从而使所述多肽和所述一种或多种污染物作为不同的分离实体从色谱材料洗脱。多肽的纯度可通过确定从色谱材料洗脱的多肽的量与从色谱材料洗脱的污染物如电荷变体的总量的比率来确定。在一些实施方案中，本发明的方法用于确定包含等电点不在中性pH范围内的多肽的组合物中的多肽的纯度。在一些实施方案中，所述方法可用于有效地从污染物中确定包含pI大于9的多肽组合物中多肽的纯度。在一些实施方案中，阳离子交换色谱材料用于有效地确定包含pI大于9的多肽的组合物中多肽的纯度。在其他实施方案中，所述方法可用于有效地从污染物中确定包含pI小于7的多肽组合物中多肽的纯度。在一些实施方案中，阴离子交换色谱材料用于有效地确定包含pI小于7的多肽的组合物中多肽的纯度。多肽的例子包括但不限于抗体和抗体片段。

在一些方面，本发明提供确定包含多肽的组合物中多肽纯度的方法。所述方法包括使用具有初始pH和初始离子强度的加样缓冲剂使所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，使用洗脱缓冲剂从所述离子交换柱洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中通过pH梯度改变所述洗脱缓冲剂的pH，且维持所述洗脱缓冲剂的离子强度与初始离子强度基本相同，从而使所述多肽和所述一种或多种污染物作为不同的分离实体从色谱材料洗脱。多肽的纯度可通过确定从色谱材料洗脱的多肽的量与从色谱材料洗脱的污染物如电荷变体的总量的比率来确定。在一些实施方案中，本发明的方法用于确定包含等电点不在中性pH范围内的多肽的组合物中的多肽的纯度。在一些实施方案中，所述方法可用于有效地从污染物中确定包含pI大于9的多肽组合物中多肽的纯度。在一些实施方案中，阳离子交换色谱材料用于有效地确定包含pI大于9的多肽的组合物中多肽的纯度。在其他实施方案中，所述方法可用于有效地从污染物中确定包含pI小于7的多肽组合物中多肽的纯度。在一些实施方案中，阴离子交换色谱材料用于有效地确定包含pI小于7的多肽的组合物中多肽的纯度。多肽的例子包括但不限于抗体和抗体片段。

确定组合物中多肽的稳定性

在一些方面，本发明提供了用于确定包含多肽的组合物中多肽稳定性的方法。在一些实施方案中，随着时间的进行分析包含多肽的组合物的样品。在一些实施方案中，在分析前将组合物温育不同的时间。在一些实施方案中，在分析前，在多于任一以下温度孵育组合物：约0℃、20℃、37℃或40℃。在一些实施方案中，在分析前，将组合物温育以下一个或多个时间：1天、2天、3天、5天、1周、2周、3周、4周、6周、2个月、3个月、6个月、1年。然后如下分析组合物：使用具有初始pH和初始离子强度的加样缓冲剂使组合物中的所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，使用洗脱缓冲剂从所述离子交换柱洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中通过pH梯度改变所述洗脱缓冲剂的pH，且通过离子强度梯度改变所述洗脱缓冲剂的离子强度，从而使所述多肽和所述一种或多种污染物作为不同的分离实体从色谱材料洗脱。在其他实施方案中，如下分析组合物：使用具有初始pH和初始离子强度的加样缓冲剂使组合物中的所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，使用洗脱缓冲剂从所述离子交换柱洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中通过pH梯度改变所述洗脱缓冲剂的pH，且维持所述洗脱缓冲剂的离子强度与初始离子强度基本相同，从而使所述多肽和所述一种或多种污染物作为不同的分离实体从色谱材料洗脱。对于任一上述实施方案，多肽与污染物比率的变化指示组合物中多肽的稳定性。例如，如果多肽与污染物的比率不随时间而变化，则多肽可视为稳定的，而组合物中污染物的快速积累以及所伴随的蛋白质量的降低指示组合物中的多肽不那么稳定。在一些实施方案中，本发明的方法用于确定包含等电点不在中性pH范围内的多肽的组合物中的多肽的稳定性。在一些实施方案中，所述方法可用于有效地从污染物中确定包含pI大于9的多肽组合物中多肽的稳定性。在一些实施方案中，阳离子交换色谱材料用于确定包含pI大于9的多肽的组合物中多肽的稳定性。在其他实施方案中，所述方法可用于从污染物中确定包含pI小于7的多肽组合物中多肽的稳定性。在一些实施方案中，阴离子交换色谱材料用于确定包含pI小于7的多肽的组合物中多肽的稳定性。多肽的例子包括但不限于抗体和抗体片段。

多肽的纯化

在一些方面，本发明提供了从包含多肽和一种或多种多肽变体的组合物中纯化多肽的方法。所述方法包括使用具有初始pH和初始离子强度的加样缓冲剂使所述多肽以及一种或多种变体结合至离子交换色谱材料，使用洗脱缓冲剂从所述离子交换柱洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中通过pH梯度改变所述洗脱缓冲剂的pH，且通过离子强度梯度改变所述洗脱缓冲剂的离子强度，从而使所述多肽和所述一种或多种污染物作为不同的分离实体从色谱材料洗脱。在色谱洗脱阶段收集级分，将包含多肽并且没有污染物或污染物极少的级分合并，用于进一步处理或用于药物配制。在一些实施方案中，本发明的方法用于纯化包含等电点不在中性pH范围内的多肽的组合物中的多肽。在一些实施方案中，所述方法可用于纯化pI大于9的多肽。在一些实施方案中，使用阳离子交换色谱材料来纯化pI大于9的多肽。在其他实施方案中，所述方法可用于从污染物纯化pI小于7的多肽。在一些实施方案中，使用阴离子交换色谱材料来纯化pI小于7的多肽。多肽的例子包括但不限于抗体和抗体片段。

在一些方面，本发明提供了从包含多肽和一种或多种多肽变体的组合物中纯化多肽的方法。所述方法包括使用具有初始pH和初始离子强度的加样缓冲剂使所述多肽以及一种或多种变体结合至离子交换色谱材料，使用洗脱缓冲剂从所述离子交换柱洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中通过pH梯度改变所述洗脱缓冲剂的pH，且所述洗脱缓冲剂的离子强度与初始离子强度基本相同，从而使所述多肽和所述一种或多种污染物作为不同的分离实体从色谱材料洗脱。在色谱洗脱阶段收集级分，将包含多肽但是不含污染物的级分合并，用于进一步处理或用于药物配制。在一些实施方案中，本发明的方法用于纯化包含等电点不在中性pH范围内的多肽的组合物中的多肽。在一些实施方案中，所述方法可用于纯化pI大于9的多肽。在一些实施方案中，使用阳离子交换色谱材料来纯化pI大于9的多肽。在其他实施方案中，所述方法可用于从污染物纯化pI小于7的多肽。在一些实施方案中，使用阴离子交换色谱材料来纯化pI小于7的多肽。多肽的例子包括但不限于抗体和抗体片段。

III.多肽

提供了用于本文描述的任何离子强度介导的pH梯度离子交换色谱方法的多肽。在本发明的一些实施方案中，通过离子强度介导的pH梯度离子交换色谱来分析多肽的组合物。这样的方法可用于鉴定组合物中多肽的电荷变体。在一些实施方案中，所述多肽是抗体或其片段。

在一些实施方案中，所述多肽是治疗性多肽。所述治疗性多肽可抑制肿瘤细胞生长、诱导凋亡和/或诱导细胞死亡。在一些实施方案中，所述多肽是拮抗剂。在一些实施方案中，所述多肽是激动剂。在一些实施方案中，所述多肽是抗体。在一些实施方案中，所述多肽是免疫粘附素。

在一些实施方案中，所述多肽的分子量大于约任何以下：5,000道尔顿、10,000道尔顿、15,000道尔顿、25,000道尔顿、50,000道尔顿、75,000道尔顿、100,000道尔顿、125,000道尔顿或150,000道尔顿。所述多肽可具有任何以下范围的分子量：50,000道尔顿至200,000道尔顿，或者100,000道尔顿至200,000道尔顿。作为另一选择，用于本文的多肽可具有约120,000道尔顿或约25,000道尔顿的分子量。

pI是等电点，是特定分子或表面不带静电荷时的pH。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，多肽如抗体的pI可大于约9。在一些实施方案中，所述多肽具有约任何以下的pI：9、9.5、10、10.5、11、11.5或12。在一些实施方案中，所述多肽具有约9至12的pI。在一些实施方案中，所述多肽具有约9至11的pI。在一些实施方案中，所述多肽具有约9至10的pI。在一些实施方案中，所述多肽具有约10至12的pI。在一些实施方案中，所述多肽具有约10至11的pI。在一些实施方案中，所述多肽具有约11至12的pI。

在本文描述的任何方法的一些实施方案中，多肽如抗体的pI可小于约7。在一些实施方案中，所述多肽具有约任何以下的pI：7、6.5、6、5.5、5、4.5或4。在一些实施方案中，所述多肽具有约4至7的pI。在一些实施方案中，所述多肽具有约4至6的pI。在一些实施方案中，所述多肽具有约4至5的pI。在一些实施方案中，所述多肽具有约5至7的pI。在一些实施方案中，所述多肽具有约5至6的pI。

在本文描述的任何方法的一些实施方案中，包含多肽和一种或多种污染物的组合物中的一种或多种污染物是多肽电荷变体。在一些实施方案中，所述多肽电荷变体是从其天然状态修饰成使多肽的电荷发生改变的多肽。在一些实施方案中，电荷变体比母多肽更具酸性；即具有比母多肽更低的pI。在其他实施方案中，电荷变体比母多肽更具碱性；即具有比母多肽更高的pI。在一些实施方案中，所述多肽电荷变体是工程化的。在一些实施方案中，所述多肽电荷变体是天然过程的结果；例如氧化、脱酰胺化、赖氨酸残基C端加工、N端焦谷氨酸形成和糖基化。在一些实施方案中，多肽电荷变体是糖蛋白，其中附接至蛋白质的多糖被修饰成该糖蛋白的电荷与母糖蛋白相比发生改变，例如通过添加唾液酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述多肽电荷变体是抗体电荷变体。

将使用本文描述的方法来分析的多肽一般使用重组技术产生。用于产生重组蛋白质的方法在U.S.PatNo.5,534,615和4,816,567中有描述，其通过引用特别并入本文。在一些实施方案中，在CHO细胞中产生感兴趣的蛋白质(参见例如WO94/11026)。当使用重组技术时，多肽可产生于细胞内、周质空间中或直接分泌至培养基中。

可从培养基或宿主细胞裂解物中回收多肽。可通过多种物理或化学方法来破裂用于表达多肽的细胞，例如冻融循环、超声、机械破裂或细胞裂解剂。如果多肽产生于细胞内，则第一步是，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片，所述碎片是宿主细胞或者裂解的片段。Carter等Bio/Technology10:163-167(1992)描述了用于分离分泌至大肠杆菌周质空间的多肽的方法。简略而言，在醋酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下，用约30分钟溶解细胞糊状物。通过离心去除细胞碎片。在多肽分泌至培养基中的情况下，一般首先使用市售的多肽浓缩过滤器(例如Amicon或MilliporePellicon超滤装置)浓缩来自这样的表达系统的上清液。任何前述步骤都可包含例如PMSF等蛋白酶抑制剂以抑制蛋白质水解，且可包含抗生素以防止外来污染物的生长。

在一些实施方案中，在通过本发明的方法分析之前已经纯化或部分纯化了包含多肽和一种或多种污染物的组合物中的多肽。例如，所述方法的多肽处于来自亲和色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、混合模式色谱和疏水性相互作用色谱的洗脱剂中。在一些实施方案中，所述多肽处于来自蛋白A色谱的洗脱剂中。

可通过本发明方法分析的多肽的例子包括但不限于：免疫球蛋白、免疫粘附素、抗体、酶、激素、融合蛋白、包含Fc的蛋白质、免疫缀合物、细胞因子和白细胞介素。

在一些实施方案中，所述多肽处于药物组合物中。在一些实施方案中，所述多肽是处于药物组合物中的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述药物组合物包含所述多肽和可药用载体，所述可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包含抗体或其抗原结合片段，以及可药用载体，所述可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

(A)抗体

在本文描述的任何方法的一些实施方案中，用于通过本文描述的方法来分析多肽和包含多肽的制剂的任何方法的多肽是抗体。

抗体的分子标靶包括CD蛋白质及其配体，例如但不限于：(i)CD3、CD4、CD8、CD19、CD11a、CD20、CD22、CD34、CD40、CD79α(CD79a)和CD79β(CD79b)；(ii)ErbB受体家族的成员，例如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；(iii)细胞粘合分子，例如LFA-1、Mac1、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整联蛋白，包括其α亚基或β亚基(例如抗-CD11a、抗-CD18或抗-CD11b抗体)；(iv)生长因子，例如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖症(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C、BR3、c-met、组织因子、β7等；以及(v)细胞表面的和跨膜的肿瘤相关抗原(TAA)，例如美国专利No.7,521,541中描述的那些。

其他示例性的抗体包括但不限于选自以下的那些：抗-雌激素受体抗体、抗-孕酮受体抗体、抗-p53抗体、抗-HER-2/neu抗体、抗-EGFR抗体、抗-组织蛋白酶D抗体、抗-Bcl-2抗体、抗-E-钙粘着蛋白抗体、抗-CA125抗体、抗-CA15-3抗体、抗-CA19-9抗体、抗-c-erbB-2抗体、抗-P-糖蛋白抗体、抗-CEA抗体、抗-成视网膜细胞瘤蛋白抗体、抗-ras癌蛋白抗体、抗-LewisX抗体、抗-Ki-67抗体、抗-PCNA抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD5抗体、抗-CD7抗体、抗-CD8抗体、抗-CD9/p24抗体、抗-CD10抗体、抗-CD11a抗体、抗-CD11c抗体、抗-CD13抗体、抗-CD14抗体、抗-CD15抗体、抗-CD19抗体、抗-CD20抗体、抗-CD22抗体、抗-CD23抗体、抗-CD30抗体、抗-CD31抗体、抗-CD33抗体、抗-CD34抗体、抗-CD35抗体、抗-CD38抗体、抗-CD41抗体、抗-LCA/CD45抗体、抗-CD45RO抗体、抗-CD45RA抗体、抗-CD39抗体、抗-CD100抗体、抗-CD95/Fas抗体、抗-CD99抗体、抗-CD106抗体、抗-泛素抗体、抗-CD71抗体、抗-c-myc抗体、抗-细胞角蛋白抗体、抗-波形蛋白抗体、抗-HPV蛋白抗体、抗-κ轻链抗体、抗-λ轻链抗体、抗-黑素体抗体、抗-前列腺特异性抗原抗体、抗-S-100抗体、抗-tau抗原抗体、抗-纤维蛋白抗体、抗-角蛋白抗体和抗-Tn-抗原抗体。

(i)单克隆抗体

在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。单克隆抗体得自基本同质的抗体群的抗体，即组成群体的单个抗体是相同的和/或结合相同表位，除非在单克隆抗体的生产期间可产生可能的变体，这样的变体一般以少量存在。因此，修饰语“单克隆”表示抗体不是独立离散抗体或多克隆抗体的混合物的特征。

例如，单克隆抗体可使用Kohler等Nature256:495(1975)首次描述的杂交瘤法来制成，或可通过重组DNA法(美国专利No.4,816,567)制成。

在杂交瘤法中，如本文所描述来免疫小鼠或例如仓鼠等其他合适的宿主动物，以诱导产生或能够产生将特异性结合至用于免疫的多肽的淋巴细胞。作为另一选择，可体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，从而形成杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice，第59-103页(Academic出版社，1986))。

将由此制备的杂交瘤细胞接种并使其生长于优选包含一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或生存的合适培养基中。例如，若亲代骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。

在一些实施方案中，骨髓瘤细胞是有效融合的细胞，其支持由所选择的抗体产生性细胞稳定地高水平生产抗体，并且对培养基如HAT培养基敏感。在一些实施方案中，其中，骨髓瘤细胞系是鼠科骨髓瘤系，例如衍生自可得自SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,CaliforniaUSA的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤，和可得自AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MarylandUSA的SP-2或X63-Ag8-653细胞的那些。还描述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于产生人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984)；Brodeur等，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications，第51-63页(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987))。

对杂交瘤细胞在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的产生。在一些实施方案中，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或体外结合测定如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。

单克隆抗体的结合亲和力可例如通过Munson等Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来确定。

在鉴定杂交瘤细胞产生期望特异性、亲和力和/或活性的抗体后，可通过有限的稀释方法对该克隆进行亚克隆，并通过标准方法使其生长(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice，第59-103页(Academic出版社，1986))。用于该目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可使杂交瘤细胞体内生长为动物中的腹水肿瘤。

通过例如多肽A-琼脂糖、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱等常规免疫球蛋白纯化方法适当地将由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清分离。

使用常规方法(例如通过使用能够特异性结合至编码鼠科抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序编码单克隆抗体的DNA。在一些实施方案中，杂交瘤细胞充当这样的DNA来源。在分离后，可将DNA放置于表达载体中，然后将其转染至宿主细胞中以实现在重组宿主细胞中合成单克隆抗体，所述宿主细胞例如大肠杆菌细胞、类人猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白多肽的骨髓瘤细胞等。关于编码抗体的DNA在细菌中进行重组表达的综述文章包括Skerra等，Curr.OpinioninImmunol.5:256-262(1993)，以及Plückthun,Immunol.Revs.,130:151-188(1992)。

在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等Nature348:552-554(1990)中描述的技术生产的抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等Nature352:624-628(1991)和Marks等J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库来分离鼠科抗体和人抗体。后续的出版物描述了通过链改组(chainshuffling)(Marks等，Bio/Technology10:779-783(1992))以及作为用于构建非常大的噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.21:2265-2266(1993))来产生高亲和力(nM范围)的人抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行的替选方案。

还可例如通过以下来对DNA进行改造：将同源的鼠科序列替换为人重链和轻链恒定结构域的编码序列(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.NatlAcad.Sci.USA81:6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与全部或部分的非免疫球蛋白多肽编码序列共价结合。

通常来说，这样的非免疫球蛋白多肽替换抗体的恒定结构域，或者它们替换抗体的抗原组合位点的可变结构域，以创造嵌合二价抗体，其包含一个具有对抗原的特异性的抗原结合位点和另一个具有对不同抗原的特异性的抗原结合位点。

在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些实施方案中，所述抗体是IgG单克隆抗体。

(ii)人源化抗体

在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。本领域中已经描述了用于人源化非人抗体的方法。在一些实施方案中，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常被称为“输入的”残基，其通常取自“输入的”可变结构域。人源化可基本按照Winter及其同事的方法(Jones等，Nature321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature332:323-327(1988)；Verhoeyen等，Science239:1534-1536(1988))、通过用高变区序列来替换相应的人抗体序列来进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上小于完整的人可变结构域被来自非人种的相应序列替换。事实上，人源化抗体通常是其中一些高变区残基以及可能的一些FR残基被来自啮齿类抗体类似位点的残基所取代的人抗体。

对用于制造人源化抗体的人可变结构域——无论是轻链还是重链——的选择对降低抗原性非常重要。根据所谓“最佳配合”法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库来筛选啮齿类抗体可变结构域的序列。然后将最接近啮齿类序列的人序列接受为用于人源化抗体的人构架区(FR)(Sims等，J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一方法使用衍生自轻链或重链可变区的特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定构架区。相同的骨架可用于若干不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151:2623(1993))。

在保留对抗原的高亲和力和其他良好生物性质的情况下来人源化抗体也是重要的。为了达到该目的标，在所述方法的一些实施方案中，通过使用母序列和人源化序列的三维模型来分析母序列以及多种概念化的人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可得到的，并且对于本领域技术人员而言是熟悉的。描述和展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可得到的。对这些展示的观察使得能够分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。通过此方式，可从接受序列和输入序列选择并组合FR残基，以得到期望的抗体特征，例如提高对靶抗原(多种)的亲和力。一般而言，高变区残基直接并最大程度地涉及影响抗原结合。

(iii)人抗体

在一些实施方案中，所述抗体是人抗体。作为人源化的一个替选方案，可生成人抗体。例如，现在能够产生能够基于免疫在不产生内源免疫球蛋白的情况下产生全谱(fullrepertoire)人抗体的转基因动物(例如小鼠)。例如，据描述，在嵌合的种系突变小鼠中纯合缺失抗体重链结合区(JH)基因，导致完全抑制内源抗体产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转入这样的种系突变小鼠中将导致基于抗体激发产生人抗体。参见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993)；Jakobovits等，Nature362:255-258(1993)；Bruggermann等，YearinImmuno.7:33(1993)；以及美国专利No.5,591,669；5,589,369；和5,545,807。

作为另一选择，可使用噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature348:552-553(1990))在体外由来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因谱来产生抗体和抗体片段。根据该技术，将抗体V结构域基因框内克隆至例如M13或fd等丝状噬菌体的主要外壳多肽或次要外壳多肽基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为所述丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体功能性质的选择还导致对编码表现出那些性质的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模拟了B细胞的一些性质。可以以多种格式来进行噬菌体展示，其综述参见例如Johnson,KevinS.和Chiswell,DavidJ.,CurrentOpinioninStructuralBiology3:564-571(1993)。V-基因区段的一些来源可用于噬菌体展示。Clackson等Nature352:624-628(1991)从来源于免疫小鼠的脾的小的V基因随机组合文库分离了多样的抗-噁唑酮抗体阵列。可基本依照Marks等J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等EMBOJ.12:725-734(1993)描述的技术来构建来自未免疫的人供体的V基因谱以及分离多样抗原(包括自体抗原)阵列的抗体。还参见美国专利No.5,565,332和5,573,905。

人抗体还可通过体外活化的B细胞来生成(参见美国专利5,567,610和5,229,275)。

(iv)抗体片段

在一些实施方案中，所述抗体是抗体片段。已经开发了多种技术用于产生抗体片段。在传统上，通过对完整抗体进行蛋白水解消化来衍生这些片段(参见例如Morimoto等JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992)，以及Brennan等，Science229:81(1985))。但是，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可从上文描述的抗体噬菌体文库分离抗体片段。作为另一选择，可从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段，并将其化学耦合以形成F(ab')2片段(Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992))。根据另一方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。用于产生抗体片段的其他技术对熟练的从业者将是显而易见的。在另一些实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利No.5,571,894；以及美国专利No.5,587,458。所述抗体片段还可为“线性抗体”，例如，如在美国专利5,641,870中所述。这样的线性抗体片段可为单特异性或双特异性的。

在一些实施方案中，提供了本文描述的抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体片段是抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自下组：Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段、scFv、Fv和双抗体。

(v)双特异性抗体

在一些实施方案中，所述抗体是双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。示例性的双特异性抗体可结合两个不同表位。作为另一选择，双特异性抗体结合臂可与结合白细胞上触发分子的臂组合，以将细胞防御机制聚焦至细胞，所述触发分子例如T-细胞受体分子(例如CD2或CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)，例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')₂双特异性抗体)。

用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统制备基于两条免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中该两条链具有不同的特异性(Millstein等，Nature305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四重杂交瘤)产生了潜在的10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种是正确的双特异性结构。通常由亲和色谱步骤进行的对正确分子的纯化十分繁琐，并且产率低。WO93/08829和Traunecker等EMBOJ.,10:3655-3659(1991)中公开了类似方法。

根据不同的方法，将具有期望结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原组合位点)融合至免疫球蛋白恒定结构域序列。在一些实施方案中，该融合由具有包含至少部分铰链区、CH2区和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域来进行。在一些实施方案中，包含用于轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)存在于至少一种融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果期望的话)免疫球蛋白轻链的DNA插入单独的表达载体中，并将其共转染至合适的宿主生物体中。在构建中使用三种多肽链的不等比率提供最优产率的实施方案中，这在调节三种多肽片段的相互比率方面提供了巨大的灵活性。但是，当以相等比率表达至少两条多肽链导致高产率时，或当该比率没有特别的显著意义时，可将两种或三种多肽链的编码序列插入一个表达载体中。

在该方法的一些实施方案中，所述双特异性抗体由在一个臂中的具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链和在另一臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。发现，该不对称结构促进期望的双特异性化合物从不需要的免疫球蛋白链组合分离，因为免疫球蛋白轻链存在于仅双特异性分子的一半中提供了容易的分离方法。WO94/04690中公开了该方法。产生双特异性抗体的另一些细节参见例如Suresh等，MethodsinEnzymology121:210(1986)。

根据美国专利No.5,731,168中描述的另一方法，可工程化抗体分子对之间的界面以使从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。在一些实施方案中，所述界面包含抗体恒定结构域的至少部分CH3结构域。在该方法中，用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)来替换第一抗体分子的界面的一条或多条小氨基酸侧链。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上创造出与一个或多个大侧链相同或相似尺寸的补偿性的“腔”。这提供了提高异二聚物相对于例如同二聚物等其他不需要终产物的产率的机制。

双特异性抗体包括交联的抗体或“异源缀合的”抗体。例如，在异源缀合物中，一个抗体耦合至抗生物素蛋白，其他抗体耦合至生物素。已经提出了这样的抗体来使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利No.4,676,980)，以及用于治疗HIV感染(WO91/00360、WO92/200373和EP03089)。异源缀合抗体可通过使用任何方便的交联法来制备。合适的交联剂是本领域公知，并且在美国专利No.4,676,980中公开了交联剂以及一些交联技术。

在一些文献中还描述了用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，双特异性抗体可使用化学键合来制备。Brennan等Science229:81(1985)描述了其中以蛋白水解方式切割完整抗体以生成F(ab')2片段的方法。在二硫络合剂亚砷酸钠存在下还原这些片段，以稳定邻位的二硫醇，并防止形成分子间二硫化物。生成Fab'片段，然后将其转化成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将Fab'-TNB衍生物中的一种重转化成Fab'-巯基，并将其与等摩尔量的另一Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作选择性固定化酶的试剂。

也已经描述了多种用于直接从重组细胞培养物制造和分离双特异性抗体的技术。例如，已经使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合将Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接至两种不同抗体的Fab'部分。在铰链区处还原抗体同二聚物以形成单体，然后再氧化以形成抗体异二聚物。该方法还可用于产生抗体同二聚物。Hollinger等Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了用于制备双特异性抗体片段的可选机制。该片段包含由短至不允许相同链上的两个结构域之间配对的接头连接至轻链可变结构域(V_L)的重链可变结构域(V_H)。因此，迫使一个片段的V_H和V_L结构域与另一片段上的互补V_L和V_H结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了用于通过使用单链Fv(sFv)二聚物来制备双特异性抗体片段的另一策略。参见Gruber等，J.Immunol.152:5368(1994)。

还包括多于二价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147:60(1991)。

(v)多价抗体

在一些实施方案中，所述抗体是多价抗体。多价抗体可被表达该抗体所结合的抗原的细胞更快地内化(和/或同化)。本文提供的抗体可为具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如三价抗体)(其为除了IgM类以外的抗体)，其可通过重组表达编码抗体多肽链的核酸容易地产生。所述多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含Fc区或铰链区(或由Fc区或铰链区组成)。在该情况下，所述抗体将包含Fc区以及Fc区氨基末端的三个或更多个抗原结合位点。本文的优选多价抗体包含三个至八个、但优选四个抗原结合位点(或由这些抗原结合位点组成)。多价抗体包含至少一条多肽链(并且优选两条多肽链)，其中所述多肽链(多条)包含两个或更多个可变结构域。例如，所述多肽链(多个)可包含VD1-(X1)_n-VD2-(X2)_n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是一条Fc区多肽链，X1和X2表示氨基酸或多肽，并且n为0或1。例如，所述多肽链(多条)可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体优选还包含至少两条(并且优选四条)轻链可变结构域多肽。例如，本文的多价抗体可包含约两条至约八条轻链可变结构域多肽。此处预期的所述轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，并且任选还包含CL结构域。

在一些实施方案中，所述抗体是多特异抗体。多特异性抗体的例子包括但不限于：包含重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L)的、其中所述V_HV_L单元具有多表位特异性的抗体；具有两个或更多个VL和VH结构域且各V_HV_L单元结合不同表位的抗体；具有两个或更多个单一可变结构域且各单一可变结构域结合不同表位的抗体；全长抗体；抗体片段，如Fab、Fv、dsFv、scFv；双抗体、双特异性双抗体、三抗体、三功能抗体、已经被共价或非共价连接的抗体片段。在一些实施方案中，抗体具有多表位特异性；例如，特异性结合相同或不同标靶(多种)上的两个或更多个不同表位的能力。在一些实施方案中，所述抗体是单特异性的；例如，结合仅一个表位的抗体。根据一个实施方案，所述多特异抗体是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力结合各表位的IgG抗体。

(vi)其他抗体修饰

可期望针对效应子功能来修饰本文提供的抗体，例如以此来增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过将一个或多个氨基酸替换引入抗体的Fc区中来实现。作为另一选择或此外，可将半胱氨酸残基(多个)引入Fc区中，从而使得能够在该区中形成链间二硫键。由此生成的同二聚物抗体可改进内化能力和/或提高补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.ExpMed.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.,Immunol.148:2918-2922(1992)。如Wolff等CancerResearch53:2560-2565(1993)中所述，还可使用异源双功能交联子来制备抗肿瘤活性增强的同二聚物抗体。作为另一选择，可工程化具有双Fc区的抗体，并因此可增强补体介导的裂解和ADCC能力。参见Stevenson等，Anti-CancerDrugDesign3:219-230(1989)。

为了提高抗体的血清半衰期，如US2006/0067930所述，可在抗体中进行氨基酸改变，通过引用整体并入本文。

(B)多肽变体和修饰

本文描述的对包括抗体在内的多肽的氨基酸序列修饰(多种)可用于本文描述的纯化多肽(例如抗体)的方法。

(i)变体多肽

如本文定义，“多肽变体”意为具有与以下序列至少约80％氨基酸序列同一性的多肽，优选活性多肽：全长的天然多肽序列、不含信号肽的多肽序列、多肽的具有或不具有信号肽的胞外结构域。这样的多肽变体包括例如其中在全长天然氨基酸序列的N端或C端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。一般而言，TAT多肽变体将具有与以下序列至少约80％氨基酸序列同一性，或者至少约任意85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性：全长天然多肽序列、不含信号肽的多肽、具有或不具有多肽的细胞外结构域。任选地，相比于天然多肽序列，变体多肽将具有不多于一个保守氨基酸替换，或者相比于天然多肽序列具有不多于约任意2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸替换。

所述变体多肽可在N端或C端处截短，或可缺失内部残基，例如，当与全长天然多肽相比时。某些变体多肽可缺失不是期望生物学活性必需的氨基酸残基。这些具有截短、缺失和插入的变体可通过任意一些常规技术制备。期望的变体多肽可进行化学合成。另一合适的技术包括通过聚合酶链式反应(PCR)，分离并扩增编码期望变体多肽的核酸片段。将限定所述核酸片段的期望末端的寡核苷酸用作PCR中的5'和3'引物。优选地，变体多肽与本文公开的天然多肽共有至少一种生物学活性和/或免疫性活性。

氨基酸序列插入物包括长度范围介于一个残基至包含一百或更多个残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入物。末端插入物的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体或融合至细胞毒性多肽的抗体。其他抗体分子插入变体包括抗体的N端或C端融合至提高抗体的血清半衰期的酶或多肽的融合物。

例如，可期望改进多肽的结合亲和力和/或其他生物学性质。多肽的氨基酸序列变体通过将合适的核苷酸变化引入抗体核酸中来制备，或通过肽合成来制备。这样的改造包括例如从多肽的氨基酸序列中缺失残基，和/或向其中插入残基，和/或替换其中的残基。可进行任何缺失、插入和替换的组合来实现最终构建体，只要最终构建体拥有期望的性质即可。氨基酸变化还可改变多肽(例如抗体)的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数量或位置。

可通过比较多肽序列与同源的已知多肽分子的序列并最小化高同源性区域中的氨基酸序列变化的数量，来指导确定在不有害地影响期望活性的情况下可插入、替换或缺失哪些氨基酸残基。

可用于鉴定作为多肽(例如抗体)的优选诱变位置的某些残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和WellsScience244:1081-1085(1989)所述。此处，鉴定残基或一组靶残基(例如带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性氨基酸或带负电的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后，通过在替换位点处进一步引入变体或对替换位点引入其他变体来改善对替换显示出功能敏感性的这些氨基酸位置。因此，虽然引入氨基酸序列变化的位点是预先确定的，但是突变本身的性质不需要预先确定。例如，为了分析指定位点处的突变性能，在靶密码子或靶区域处进行ala扫描或随机诱变，并且针对期望的活性筛选表达的抗体变体。

另一类型的变体是氨基酸替换变体。这些变体的抗体分子中的至少一个氨基酸残基由不同残基替换。替换诱变的最感兴趣的位点包括高变区，但是还预期了FR改变。标题为“优选替换”的下表1示出了保守替换。如果这样的替换导致生物学活性的改变，则可引入更大量的变化，在表1中命名为“示例性替换”，或如下文中引用氨基酸种类所进一步描述，并且筛选产物。

表1.

初始残基	示例性替换	优选替换
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Asp,Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu；Asn	Glu
			Cys(C)	Ser；Ala	Ser
Gln(Q)	Asn；Glu	Asn
			Glu(E)	Asp；Gln	Asp
Gly(G)	Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸	Leu
			Leu(L)	正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Tyr
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Val；Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸	Leu

对多肽生物学性质的大量修饰通过选择其对维持以下具有显著不同效果的替换来实现：(a)替换区域中多肽骨架的结构，例如，作为叠片或螺旋构象，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小。氨基酸可根据其侧链性质的相似性来分类(A.L.Lehninger,Biochemistry第二版，第73-75页,WorthPublishers,NewYork(1975))：

(1)非极性：Ala(a)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)

(2)不带电的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)

(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)

(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)

作为另一选择，可基于共同的侧链性质来对天然存在的残基进行分类：

(1)疏水：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链朝向的残基：Gly、Pro；

(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守替换将使这些种类的一种氨基酸换成另一种类。

任何不涉及维持抗体正确构象的半胱氨酸残基也可被取代，一般取代为丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可向多肽添加半胱氨酸键(多个)来改进其稳定性(特别是在抗体是例如Fv片段等抗体片段的情况下)。

特别优选的替换变体类型涉及替换母抗体(例如人源化抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，所得的选择用于进一步开发的变体(多个)将在生物学性质方面相对于生成它们的母抗体有所改进。用于生成这样的替换性变体的方便方法涉及使用噬菌体展示的亲和成熟。简略而言，突变一些高变区位点(例如6至7个位点)以生成各位点处的所有可能的氨基酸替换。由此生成的抗体变体作为与颗粒内包装的M13的基因III产物的融合物、以单价方式展示于丝状噬菌体颗粒。然后，如本文公开，对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。作为另一选择或此外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构对鉴定抗体与标靶之间的接触点可为有益的。这样的接触残基以及相邻残基是用于根据本文详述的技术的替换候选物。当生成这样的变体后，使该批变体经历如本文描述的筛选，并将在一个或多个相关测定中具有优异性质的抗体用于进一步开发。

另一类型的多肽氨基酸变体改变抗体的初始糖基化模式。多肽可包含非氨基酸部分。例如，多肽可被糖基化。这样的糖基化可在宿主细胞或宿主生物体中的多肽表达期间天然发生，或者可通过人为干预来有意修饰。改变意为缺失一个或多个多肽中发现的碳水化合物部分，和/或添加一个或多个多肽中不存在的糖基化位点。

多肽的糖基化通常是N-连接或O-连接。N-连接是指碳水化合物部分附接至天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸，是用于将碳水化合物部分酶促附接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中存在任意这些三肽序列都将创造出潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种附接至羟基氨基酸，最通常为丝氨酸或苏氨酸，但是还可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。

通过改变氨基酸序列以使其包含一个或多个上述三肽序列来实现将糖基化位点添加至多肽(针对N-连接的糖基化位点)。还可通过添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基至初始抗体的序列，或通过用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基替换初始抗体序列来进行该改变(针对O-连接的糖基化位点)。

去除存在于多肽上的碳水化合物部分可通过化学方式或酶方式或通过突变替换编码充当糖基化标靶的氨基酸残基的密码子来实现。对多肽上碳水化合物部分的酶切割可通过使用多种内-糖苷酶和外-糖苷酶来实现。

其他修饰包括：将谷氨酰胺和天冬酰胺残基脱酰氨成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基，羟化脯氨酸和赖氨酸，对丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，对赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化，对N端胺的乙酰化，以及对任何C端羧基的酰胺化。

(ii)嵌合多肽

可以以形成包含融合至另一异源多肽或氨基酸序列的多肽的嵌合分子的方式来修饰本文描述的多肽。在一些实施方案中，嵌合分子包含这样的多肽融合物，其具有提供可被抗标签抗体选择性结合的表位的标签多肽。所述表位标签一般位于多肽的氨基端或羧基端。可通过使用标签多肽的抗体来检测这样的表位标记形式的多肽的存在。此外，提供表位标签使能够容易地通过使用抗标签抗体或结合表位标签的另一类型亲和基质的亲和纯化来纯化多肽。

在一个可选实施方案中，所述嵌合分子可包含多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区的融合物。二价形式的嵌合分子称为“免疫粘附素”。

本文所用术语“免疫粘附素”表示组合了异源多肽的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能的类抗体分子。从结构上而言，免疫粘附素包含氨基酸序列与免疫球蛋白恒定结构域序列的融合物，所述氨基酸序列具有期望的结合特异性，其不同于抗体的抗原识别，和结合位点(即是“异源的”)。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的连续的氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可得自任何免疫球蛋白，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。

Ig融合优选包括可溶性形式(缺失或失活跨膜结构域)的多肽替换Ig分子内的至少一个可变区。在一个特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合物包含IgG1分子的铰链区、CH₂区和CH₃区，或者铰链区、CH₁区、CH₂区和CH₃区。

(iii)多肽缀合物

用于多肽制剂的多肽可缀合至细胞毒性试剂，例如化疗剂、生长抑制剂、毒素(细菌、真菌、植物或动物来源的酶活化毒素或其片段)，或放射性同位素(即放射性缀合物)。

可使用可用于生产这样的缀合物的化疗剂。此外，可使用的酶活化毒素及其片段包括：白喉A链、白喉毒素的非结合活化片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素A链、红豆因(abrin)A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)蛋白、香石竹毒(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAP1、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、新霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射性缀合的抗体。例子包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。使用多种双官能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒性剂的缀合物，所述双管能偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯(例如盐酸二甲基己二亚胺酸酯)、活性酯类(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮鎓衍生物(例如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双官能衍生物。例如，可如Vitetta等Science238:1098(1987)中所述来制备蓖麻毒素免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的示例性螯合剂。

本文还预期了多肽与一种或多种小分子毒素的缀合物，所述小分子毒素例如卡里奇霉素(calicheamicin)、类美登素(maytansinoids)、单端孢霉烯(trichothene)和CC1065，以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的缀合物。

类美登素是通过抑制微管蛋白聚合来起作用的有丝分裂抑制剂。美登素首次分离于东非灌木齿叶美登木(Maytenusserrata)。随后，发现某些微生物也产生类美登素，例如美登醇(maytansinol)和C-3美登醇酯。还预期了合成美登醇及其衍生物和类似物。存在许多本领域已知的用于制备多肽-类美登素缀合物的连接基团，包括例如美国专利No.5,208,020中公开的那些。如上文指定的专利所公开，所述连接基团包括：二硫基、硫醚基、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，优选二硫基和硫醚基。

接头可根据连接的类型在多种位置附接于类美登素分子。例如，可使用常规的耦合技术、通过与羟基的反应来形成酯链接。反应可发生于具有羟基的C-3位、被羟甲基修饰的C-14位、被羟基修饰的C-15位和具有羟基的C-20位。在一个优选实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位形成连接。

另一感兴趣的缀合物包含缀合至一个或多个卡里奇霉素分子的多肽。抗生素的卡里奇霉素家族能够在皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂。卡里奇霉素家族的缀合物的制备参见例如美国专利No.5,712,374。可使用的卡里奇霉素的结构类似物包括但不限于γ₁ ^I、α₂ ^I、α₃ ^I、N-乙酰基-γ₁ ^I、PSAG和θ₁ ^I。抗体可缀合的另一抗肿瘤药物是抗叶酸剂QFA。卡里奇霉素和QFA二者都具有细胞内作用部位，并且不容易穿过质膜。因此，通过多肽(例如抗体)介导的内化作用来细胞内摄入这些试剂大大地增强了它们的细胞毒性。

可缀合至本文描述的多肽的其他抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星、长春新碱和5-氟尿嘧啶、已知的统称为LL-E33288复合物的药剂家族，以及埃斯波霉素(esperamicins)。

在一些实施方案中，所述多肽可为多肽与具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸内切酶如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)的缀合物。

在另一个实施方案中，可将多肽(例如抗体)缀合至“受体”(例如链霉亲和素)用于肿瘤预靶向，其中将多肽受体缀合物施用至患者，接着使用清除剂从循环系统去除未结合的缀合物，然后施用缀合至细胞毒性剂(例如放射性核苷酸)的“配体”(例如抗生物素蛋白)。

在一些实施方案中，所述多肽可缀合至前药活化性酶，后者可将前药(例如肽基化疗剂)转化成活性抗癌药物。免疫缀合物的酶组分包括能够以将前药转化成其更高活性、细胞毒性形式的方式来作用于前药的任何酶。

可用的酶包括但不限于：可用于将包含磷酸盐的前药转化成游离药物的碱性磷酸酶；可用于将包含硫酸盐的前药转化成游离药物的芳基硫酸酶；可用于将无毒5-氟胞嘧啶转化成抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可用于将包含肽的前药转化成游离药物的蛋白酶，例如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilism)、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)；可用于转化包含D-氨基酸取代基的前药的D-丙氨酰基羧肽酶；可用于将糖基化的前药转化成游离药物的碳水化合物切割性酶，例如β-半乳糖苷酶和神经酰胺酶；可用于将用β-内酰胺衍生的前药转化成游离药物的β-内酰胺酶；以及可用于将分别用苯氧基乙酰基或苯基乙酰基在其胺氮处衍生的药物转化成游离药物的青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。作为另一选择，可使用具有酶活性的抗体——在本领域也称为“抗体酶”——来将前药转化成活性药物。

(iv)其他

对多肽的另一类型的共价修饰包括将多肽连接至多种非蛋白聚合物中的一种，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。多肽还可以包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别地羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米-颗粒和纳米胶囊)中，或粗乳液中。Remington'sPharmaceuticalSciences，第18版，Gennaro,A.R.,编(1990)中公开了这样的技术。

IV.得到用于制剂和方法的多肽

可通过使用包括重组法在内的本领域公知方法来得到用于本文描述的分析方法中的多肽。以下部分提供了关于这些方法的指导。

(A)多核苷酸

“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。

编码多肽的多核苷酸可得自任何来源，包括但不限于被视为拥有多肽mRNA并且以可检测水平进行表达的组织制备的cDNA文库。因此，编码多核苷酸的多肽可方便地得自从人组织制备的cDNA文库。编码多肽的基因还可得自基因组文库或通过已知的合成方法得到(例如自动核酸合成)。

例如，多核苷酸可编码完整的免疫球蛋白分子链，例如轻链或重链。完整的重链不仅包含重链可变区(V_H)，还包含通常包含三个恒定结构域C_H1、C_H2和C_H3的重链恒定区(C_H)；以及“铰链”区。在一些情况下，期望存在恒定区。

可通过多核苷酸来编码的其他多肽，包括抗原结合性的抗体片段，例如单一结构域抗体(“dAb”)、Fv、scFv、Fab'和F(ab')2，以及“微型抗体”。微型抗体(通常)是已将C_H1和C_K或C_L结构域结构域从其切离的二价抗体片段。因为微型抗体小于常规抗体，所以它们将在临床/诊断用途中实现更佳的组织渗透性，但是由于是二价的，所以它们将保留比一价抗体片段更高的结合亲和力，例如dAb。因此，除非上下文另有指明，否则本文所用术语“抗体”不仅涵盖完整的抗体分子，还涵盖上述类型的抗原结合性的抗体片段。优选地，编码多肽中存在的各构架区都将包含相对于相应的人受体构架的至少一个氨基酸替换。因此，例如，构架区可包含相对于受体构架区的总共三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸替换。

VI.示例性实施方案

1.在一个实施方案中，本发明提供了用于分析包含多肽以及一种或多种污染物的组合物的方法，所述方法包括a)使用加样缓冲剂使所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，其中所述加样缓冲剂处于第一pH，且包含第一离子强度；b)使用洗脱缓冲剂从所述离子交换色谱材料洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中在pH梯度中改变所述洗脱缓冲剂的pH，并且在离子强度梯度中改变所述洗脱缓冲剂的离子强度，其中通过所述pH梯度和离子强度梯度的组合分离所述多肽以及所述一种或多种污染物；c)检测所述多肽和所述一种或多种污染物。在该实施方案的一些方面，本发明提供用于分析包含多肽以及一种或多种污染物的组合物中的所述多肽的方法，其中所述方法将一种或多种污染物从所述多肽分离，所述方法包括a)使用加样缓冲剂使所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，其中所述加样缓冲剂处于第一pH，且包含第一离子强度；b)使用洗脱缓冲剂从所述离子交换色谱材料洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中在pH梯度中改变所述洗脱缓冲剂的pH，且在离子强度梯度中改变所述洗脱缓冲剂的离子强度，其中通过所述pH梯度和离子强度梯度的组合分离所述多肽以及所述一种或多种污染物；c)检测所述多肽和所述一种或多种污染物，其中所述方法用于分析pI介于约7.0至约9.5范围的多肽。

2.在实施方案1的另一实施方案中，所述多肽是抗体或免疫粘附素，或其片段。

3.在实施方案1或2的另一实施方案中，所述多肽是单克隆抗体或其片段。

4.在实施方案2或3的另一实施方案中，所述抗体是人抗体。

5.在实施方案2或3的另一实施方案中，所述抗体是人源化抗体。

6.在实施方案2或3的另一实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。

7.在实施方案2至6中任一项的另一实施方案中，所述抗体是抗体片段。

8.在实施方案1至7中任一项的另一实施方案中，所述污染物是多肽的变体。

9.在实施方案1至7中任一项的另一实施方案中，所述污染物是多肽的降解产物。例如，电荷变体。

10.在实施方案1至9中任一项的另一实施方案中，所述多肽具有大于约9.0的pI。

11.在实施方案1至10中任一项的另一实施方案中，所述色谱材料是阳离子交换色谱材料。

12.在实施方案11的另一实施方案中，所述阳离子交换色谱材料是磺化色谱材料或羧基化色谱材料。

13.在实施方案1至12中任一项的另一实施方案中，所述pH梯度是线性梯度。

14.在实施方案1至12中任一项的另一实施方案中，所述pH梯度是阶跃梯度。

15.在实施方案13或14的另一实施方案中，所述pH梯度包含从约pH5至约pH11的升高。

16.在实施方案1至15中任一项的另一实施方案中，所述pH梯度通过使用一种或多种缓冲剂来产生。

]17.在实施方案15的另一实施方案中，所述一种或多种缓冲剂选自哌嗪、咪唑、tris、磷酸盐或CAPS。

18.在实施方案1至17中任一项的另一实施方案中，所述离子强度梯度是线性梯度。

19.在实施方案1至17中任一项的另一实施方案中，所述离子强度梯度是阶跃梯度。

20.在实施方案18或19的另一实施方案中，所述离子强度梯度包含从约0mM至约200mM的盐浓度升高。

21.在实施方案18至20中任一项的另一实施方案中，所述离子强度梯度是NaCl梯度、KCl梯度或Na₂SO₄梯度。

22.在实施方案1至9中任一项的另一实施方案中，所述多肽具有小于约7.0的pI。

23.在实施方案22的另一实施方案中，所述色谱材料是阴离子交换色谱材料。

24.在实施方案23的另一实施方案中，所述阴离子交换色谱材料是季胺色谱材料或叔胺色谱材料。

25.在实施方案22至24中任一项的另一实施方案中，所述pH梯度是线性梯度。

26.在实施方案22至24中任一项的另一实施方案中，所述pH梯度是阶跃梯度。

27.在实施方案25或26的另一实施方案中，所述pH梯度包含从约pH8至约pH5的降低。

28.在实施方案22至27中任一项的另一实施方案中，所述pH梯度通过使用一种或多种缓冲剂来产生。

29.在实施方案28的另一实施方案中，所述一种或多种缓冲剂选自哌嗪、咪唑或Tris。

30.在实施方案22至29中任一项的另一实施方案中，所述离子强度梯度是线性梯度。

31.在实施方案22至29中任一项的另一实施方案中，所述离子强度梯度是阶跃梯度。

32.在实施方案30或31的另一实施方案中，所述离子强度梯度包含从约0mM至约200mM的盐浓度升高。

33.在实施方案30至32中任一项的另一实施方案中，所述离子强度梯度是NaCl梯度、KCl梯度或Na₂SO₄梯度。

34.在一个实施方案中，本发明提供了用于分析包含多肽以及一种或多种污染物的组合物的方法，所述方法包括a)使用加样缓冲剂使所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，其中所述加样缓冲剂处于初始pH，且包含初始离子强度；b)使用洗脱缓冲剂从所述离子交换色谱材料洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中在pH梯度中改变所述洗脱缓冲剂的pH，且其中所述洗脱缓冲剂的离子强度基本与所述加样缓冲剂的初始离子强度相同，其中通过在约所述初始离子强度下的pH梯度来分离所述多肽以及所述一种或多种污染物；c)检测所述多肽和所述一种或多种污染物。在该实施方案的一些方面中，本发明提供了用于分析包含多肽以及一种或多种污染物的组合物中的多肽的方法，所述方法包括a)使用加样缓冲剂使所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，其中所述加样缓冲剂处于初始pH，且包含初始离子强度；b)使用洗脱缓冲剂从所述离子交换色谱材料洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中在pH梯度中改变所述洗脱缓冲剂的pH，且其中所述洗脱缓冲剂的离子强度基本与所述加样缓冲剂的初始离子强度相同，其中通过在约所述初始离子强度下的pH梯度来分离所述多肽以及所述一种或多种污染物；c)检测所述多肽和所述一种或多种污染物，其中所述方法用于分析pI介于约7.0至约9.5范围的多肽。

35.在实施方案34的另一实施方案中，所述多肽是抗体或免疫粘附素，或其片段。

36.在实施方案34或35的另一实施方案中，所述多肽是单克隆抗体或其片段。

37.在实施方案35或36的另一实施方案中，所述抗体是人抗体。

38.在实施方案35或36的另一实施方案中，所述抗体是人源化抗体。

39.在实施方案35或36的另一实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。

40.在实施方案35至39中任一项的另一实施方案中，所述抗体是抗体片段。

41.在实施方案34至40中任一项的另一实施方案中，所述污染物是多肽的变体。

42.在实施方案34至40中任一项的另一实施方案中，所述污染物是多肽的降解产物。

43.在实施方案34至42中任一项的另一实施方案中，所述多肽具有大于约9.0的pI。

44.在实施方案34至43中任一项的另一实施方案中，所述色谱材料是阳离子交换色谱材料。

45.在实施方案44的另一实施方案中，所述阳离子交换色谱材料是磺化的色谱材料或羧基化的色谱材料。

46.在实施方案34至45中任一项的另一实施方案中，所述pH梯度是线性梯度。

47.在实施方案34至45中任一项的另一实施方案中，所述pH梯度是阶跃梯度。

48.在实施方案46或47的另一实施方案中，所述pH梯度包含从约pH5至约pH11的升高。

49.在实施方案34至48中任一项的另一实施方案中，所述pH梯度通过使用一种或多种缓冲剂来产生。

50.在实施方案49的另一实施方案中，所述一种或多种缓冲剂选自哌嗪、咪唑、tris、磷酸盐或CAPS。

51.在实施方案34至50中任一项的另一实施方案中，所述洗脱缓冲剂的离子强度为约0mM至约100mM。

52.在实施方案51的另一实施方案中，所述洗脱缓冲剂包含约0mMNaCl至约100mMNaCl、约0mMKCl至约100mMKCl，或约0mMNa₂SO₄至约100mMNa₂SO₄。

53.在实施方案34至42中任一项的另一实施方案中，所述多肽具有小于约7.0的pI。

54.在实施方案53的另一实施方案中，所述色谱材料是阴离子交换色谱材料。

55.在实施方案54的另一实施方案中，所述阴离子交换色谱材料是季胺色谱材料或叔胺色谱材料。

56.在实施方案53至55中任一项的另一实施方案中，所述pH梯度是线性梯度。

57.在实施方案53至55中任一项的另一实施方案中，所述pH梯度是阶跃梯度。

58.在实施方案56或57的另一实施方案中，所述pH梯度包含从约pH8至约pH5的降低。

59.在实施方案53至58中任一项的另一实施方案中，所述pH梯度通过使用一种或多种缓冲剂来产生。

60.在实施方案59的另一实施方案中，所述一种或多种缓冲剂选自哌嗪、咪唑或Tris。

61.在实施方案53至60中任一项的另一实施方案中，所述洗脱缓冲剂的离子强度为约0mM至约100mM。

62.在实施方案61的另一实施方案中，所述洗脱缓冲剂包含约10mMNaCl至约100mMNaCl。

63.在实施方案1至62中任一项的另一实施方案中，所述分析通过高效液相色谱来进行。

64.在实施方案1至63中任一项的另一实施方案中，所述加样缓冲剂和/或所述洗脱缓冲剂中的缓冲剂浓度为10mM至约50mM。

65.在实施方案1至64中任一项的另一实施方案中，所述第一pH为约pH5.0至约pH7.0。

66.在实施方案1至65中任一项的另一实施方案中，所述色谱材料的温度为约20℃至约50℃。

67.在实施方案1至66中任一项的另一实施方案中，所述加样和洗脱在约0.5ml/分钟至约2.0ml/分钟的流速进行。

68.在另一实施方案中，本发明提供了一种确定组合物中多肽的纯度的方法，其包括根据实施方案1至67的方法中的任一种来分析所述组合物，并确定所述组合物中多肽与污染物的比率。

69.在另一实施方案中，本发明提供了一种确定包含多肽的组合物中所述多肽的稳定性的方法，所述方法包括：a)将所述包含多肽的组合物于0℃至40℃温育一周至六周，b)通过实施方案1至67所述的方法中的任一方法来分析步骤a)的所述组合物，以及c)确定所述组合物中变体与多肽的比率，其中，与未进行温育的组合物相比，所述组合物中变体与多肽的比率的升高指示所述组合物所述多肽的降解。

在本说明书中公开的所有特征可以任意组合。在本说明书中公开的各特征可由服务于相同、等效或相似目的的替选特征来代替。因此，除非另有说明，公开的各特征仅为一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

本发明的进一步细节由下面的非限制性实施例来描述。说明书中的所有文献的公开内容都清楚地通过引用并入本文。

实施例

以下实施例旨在纯粹示范本发明，并且因此不应当以任何方式视为对本发明的限制。以下实施例和详述是以举例说明的方式而不是以限制的方式给出。

实施例的材料和方法

除非另有说明，否则以下材料和方法用于实施例。

材料

所有mAb都使用稳定的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系于Genentech(SouthSanFrancisco,CA)内部制造。通过使用来自仪器制造商的icIEF方案(Wu,J和Huang,T(2006)Electrophoresis27:3584)、使用七个pI标志物来以实验确定所使用mAb的pI值。通过在40℃分别温育mAb3周和6周来得到热胁迫的样品。在色谱分析前将胁迫的mAb储存于-80℃。

PropacWCX-10柱购自Dionex。咪唑得自EMDBiosciences或Fluka。哌嗪(无水)得自TokyoChemicalIndustryCo.LTD。Trisma(Tris)得自MallinckrodtBakerInc.或Sigma(St.Louis,MO)。Trizma碱和CAPS得自Sigma。氯化钠、氢氧化钠(10N)和盐酸(12N)得自MallinckrodtBakerInc.。磷酸(85％)得自EMDMillipore。

HPLC设置

阳离子交换色谱实验主要在Waters2796BioAlliance液相色谱仪或UltiMate3000QuaternaryRapidSeparationLC(ThermoScientificDionex)上进行。该仪器包括低压四元梯度泵、具有温度动控制能力的自动进样器、用于精确控制温度的热柱室和双波长二极管阵列UV检测器。在柱的出口处，以串联方式连接在线pH传感器(Sensorex的ModelS450CD)和电导率传感器(AmberSicence,Eugene,OR的Model529)。pH传感器由MettlerToledo的模型SevenMultipH计控制；电导率传感器由AmberScience的模型1056数字电导计来控制。将来自这两个仪表的pH和电导率读数通过DionexUCI50类似物/数字转换器收集进Chromeleon中。用6.8版的DionexChromeleon软件来进行仪器控制、数据获取和数据分析。

流动相制备

tris和咪唑的单独的储存缓冲剂溶液制备为1.0M，且CAPS溶液制备为0.1M的浓度，不调节pH值，并储存于室温。首先在不调节pH值的情况下制备包含40mM哌嗪、40mM咪唑和40mMTris(都为游离碱)缓冲剂储液，并储存于室温。在色谱实验之前，通过用去离子水稀释缓冲剂储液来分别制备包含等摩尔浓度的1、2mM、4mM或8mM哌嗪、咪唑和Tris的系列流动相缓冲剂。然后，分别使用盐酸将缓冲剂的pH值分别调节至5.0(缓冲剂A)和10.8(缓冲剂B)。用去离子水制备0.5M的氯化钠溶液(盐溶液)。然后，在使用前通过0.2μM尼龙过滤器单独过滤流动相。

如文献报道制备具有11.6mM哌嗪、1.5mM咪唑和2.4mMTris的流动相缓冲剂(Farnan,D和Moreno,GT(2009)Anal.Chem.81:8846；Rea,JC等，(2010)J.Pharm.Biomed.Anal.54:317)。首先制备包含116mM哌嗪、15mM咪唑和24mMTris的十倍浓缩储备液，并储存于室温。在每个实验之前，用去离子水将两等份储液稀释10倍，然后使用盐酸将其pH调节为5.0(缓冲剂C)和9.5(缓冲剂D)。然后，在使用前通过0.2μM尼龙过滤器单独过滤流动相。

阳离子交换色谱

除非另有说明，否则色谱条件如下。用去离子水将mAb样品(对照样品和胁迫样品)稀释至2mg/mL，并于5±3℃保存于自动进样器中。作为另一选择，用缓冲剂A与D的1:1混合物将mAb样品稀释至1mg/mL，并在5±3℃保存于自动进样器中。将PropacWCX-10HT，4×50mm柱放置于温度设置为40±1℃的柱室中。使用4×250mmDionexPropacWCX柱来进行色谱分离，并将其放置于温度设置为40±1℃的柱室中。每次色谱运行注射10μL蛋白(20μg)。

通过使用在四元泵上以缓冲剂A、B和盐溶液(0.5MNaCl)形成的三元梯度来建立盐介导的pH梯度。用58分钟来递送100％的A至96.8％的B的线性梯度和3.2％的盐溶液，以建立5.0至10.8的pH梯度(0.1pH单位/分钟)以及0mMNaCl至16mMNaCl的介导盐梯度(0.28mM/分钟)。最终梯度(分钟，％B和C)如下：0，100％A；2，100％A；60，96.8％B和3.2％C；64，96.8％B和3.2％C；65，100％A；75，100％A。流动相流速为1.0ml/分钟。

用缓冲剂C和D建立5.0至9.5的报道pH梯度(Farnan,D和Moreno,GT(2009)Anal.Chem.81:8846)。用45分钟递送0至100％的缓冲剂D线性升高，以建立5.0至9.5的pH梯度(0.1pH单位/分钟)。流动相流速为1.0ml/分钟。通过280nm的紫外(UV)吸光度来检测蛋白质。

通过使用以缓冲剂A、B、C和D的四元泵上形成的四元梯度来建立混合pH梯度。该布置提供了调节以下的灵活性：1)起始pH和终止pH，使用缓冲剂A和B调节，以及2)用于各梯度的盐的量，使用缓冲剂C和D调节。作为这些实验中使用的一个例子，通过将缓冲剂B从0增加至40％，同时保持缓冲剂C和D分别为10％和40％来建立6至10的pH梯度以及恒定的10mM盐浓度。使用的梯度列于表2中。

pH-IEC造模

基于理想溶液模型、使用Henderson–Hasselbalch，H-H方程对各组分估计两种pH缓冲剂的线性混合梯度的pH。首先对各起始缓冲剂确定可获得/可解离质子的数量，然后对以0.1pH单位跨度的两种pH缓冲剂之间的各pH值确定可获得/可解离质子的数量。基于需要的质子数量，导出两种缓冲剂的摩尔比。得到获得梯度中pH点的各缓冲剂的百分比。在各pH点，使用估计的离子组分来计算离子强度。

实施例1.pH-IEC法的评估

评估pH-IEC法的性能。虽然所报道的pH-IEC法示出了描述多种mAb的电荷不均匀性的能力，但是主要旨在用于pI值为约7至9的mAb。对于超出该范围(pI<7或pI>9，也称为极限pI值)的mAb，该pH-IEC法常常得到不可接受的电荷不均匀性分布。为了评估该方法，依照以前报道的方法来产生5.0至9.5的pH梯度(Farnan,D和Moreno,GT(2009)Anal.Chem.81:8846；Rea,JC等，(2010)J.Pharm.Biomed.Anal.54:317)。所述缓冲剂由11.4mM哌嗪、1.5mM咪唑和2.4mMTris构成，其pH分别调节至5.0和9.5。分析横跨宽范围pI(6.2、8.2和9.4)的三种mAb，图1示出了所得色谱图。这些mAb中，仅mAb2(pI8.2)示出了以良好电荷变体分离为特征的可接受的电荷不均匀性分布。低pImAb1(pI＝6.2)的电荷变体分离不良；高pImAb3(pI9.4)在pH梯度期间不洗脱。即使当将pH梯度扩展至pH10.8时洗脱了mAb3，柱背压也接近柱的压力上限，且色谱图在不同的运行之间不一致。该实验清楚地证实，虽然所报道的pH-IEC法对pI值介于7至9之间的mAb很有效，但是其不能描述具有极限pI值的mAb的电荷不均匀性。

表2.样品梯度

pI值7.2-8.3的样品

pI值8.3-9.0的样品

pI值9.0-9.2的样品

pI值9.3-9.4的样品

柱出口处的pH从5.0升高至9.5，溶剂的电导率以近线性的方式从2700μS/m降低至800μS/m(注意，5mMKCl的电导率为720μS/m，而去离子水的电导率为5.5μS/m)。三种pH缓冲剂组分都是pK_a跨越宽范围的胺类：哌嗪pK_a1＝5.68且pK_a2＝9.82，咪唑pK_a＝6.95且TrispK_a＝8.10(室温)。当溶液pH低于其pK_a时，这些化合物被质子化(或带正电)，而当pH高于其pKa时变为中性。当溶剂pH升高时，缓冲剂组分逐渐从质子化变为中性，因此缓冲剂的电导率降低。值得注意的是，pH6附近的pH分布是凹的，因为哌嗪是缓冲剂中最丰富的组分，使pH曲线在其两个pK_a5.68和9.82附近相对较平。

还基于如图2A中虚线所示的理想溶液模型计算了pH梯度的pH和离子强度分布。模型pH曲线与实验pH分布非常相似，不同之处在于实验分布因系统保压体积(systemdwellvolume)和柱体积而延迟5分钟。同样地，模型离子强度曲线示出了与实验观察到的电导率分布相似的形状。模型数据和实验数据之间的一致性提示，基于胺的缓冲剂组分的混合遵循理想溶液模型。因此，建立的模型可用于在其他色谱条件下估计实验pH和离子强度分布。

此外，pH-IEC期间的柱背压随着流动相的pH显著升高(图2B)。鉴于在pH梯度期间流动相的组分是恒定的，所以这归因于离子强度的降低。根据双层模型，当流动相离子强度低时，固定相表面的静电势变高(Staahlberg,J(1994)Anal.Chem.66:440；Stahlberg,J(1999)J.Chromatogr.A855:3)。该高的静电势可改变树脂的构象(例如使树脂膨胀从而降低表面电荷密度)，这很可能提高柱背压(ProductManualforPropacWCX-10andPropacSCX-10，第7版，DionexIncorporation,Sunnyvale,CA,2007)。

实验电导率和模型离子强度分布可用于解释具有极限pI值的mAb的不良电荷不均匀性分布。低pImAb于低pH区中洗脱，其中缓冲剂组分被质子化，且流动相具有相对较高的离子强度。因为pH梯度IEC分离似乎涉及离子强度基洗脱机制与pH基洗脱机制的组合(Anderson,DJ和Shan,L(2001)Clin.Chem.47:128；Shan,LAnderson,DJ(2001)J.Chromatogr.A909:191；Shan,L和Anderson,DJ(2002)Anal.Chem.74:5641)，所以高离子强度基洗脱可干扰pH基洗脱，导致这些低pI电荷变体拆分不良。另一方面，高pImAb通常在高pH区中洗脱，其中缓冲剂组分变成中性。由于流动相中的低离子强度，这些高pImAb难以从阳离子交换柱洗脱。为了证实离子强度显著影响pH-IEC分离，并且为了改进用于具有极限pI值的pH-IEC法，如下文描述来调节pH梯度IEC法中的pH缓冲剂的离子强度。

实施例3.通过控制离子强度来改进pH-梯度IEC法

pH梯度过程期间，以两种方式调节离子强度。第一种，通过使用不同浓度的缓冲剂来控制低pH区的离子强度。如下文描述，测试一系列缓冲剂浓度以评估其对pH梯度IEC的影响。第二种，通过将盐梯度添加至pH梯度来调节高pH区的离子浓度。还研究了盐浓度的影响。因此，该新方法称为“离子强度介导的pH-IEC”法。

缓冲剂浓度：在该方法中，使用等摩尔的pH-梯度而不是所报道方法中使用的混合比率pH梯度(Farnan,D和Moreno,GT(2009)Anal.Chem.81:8846)这基于两点考虑：首先，近线性的pH梯度可通过使用等摩尔浓度的哌嗪、咪唑和Tris来得到(图2C)。建立的pH的跨越宽范围的线性梯度将不牺牲指定pH区域的分离(Tsonev,LIandHirsh,AG(2008)J.Chromatogr.A1200:166)。其次，其提供对梯度斜率的优化。

研究了由1mM、2mM、4mM和8mM的等摩尔浓度的哌嗪、咪唑和tris的四种缓冲剂。这些缓冲剂被称为1mM、2mM、4mM和8mM缓冲剂，每种缓冲剂都用pH5.0至10.8的pH梯度和0mMNaCl至16mMNaCl的线性盐梯度来介导。图3A中展示了使用这四种缓冲剂的mAb1(pI＝6.2)的色谱图。电荷变体之间的分辨率明显依赖于缓冲剂浓度。使用1mM缓冲剂，电荷变体分离不良。使用2mM缓冲剂分辨率改进，且使用4mM缓冲剂分辨率达到峰值。然而，使用8mM缓冲剂，分辨率显著降低。相反，mAb2(pI＝8.2)的分辨率对缓冲剂浓度没有mAb1那么敏感(图3B)。使用所有四种缓冲剂都达到对mAb2(pI＝8.2)的良好分辨率，尽管4mM缓冲剂比其他三种缓冲剂提供了稍微更好的分辨率。基于目视检查，4mM缓冲剂似乎提供了对mAb1和mAb2的最佳分辨率。

为了更好地显示缓冲剂浓度对pH-IEC的影响，图3C示出了mAb的主峰的半峰全宽(FWHM)作为缓冲剂浓度的函数。主峰的FWHM一般与pH-IEC的分辨率相关，因为FWHM越低表示分辨率越高。对于mAb1和mAb2二者而言，在四种缓冲剂中，使用4mM缓冲剂的主峰FWHM最低，这提示，4mM缓冲剂提供了最窄的峰宽，因此提供了良好的分辨率。对mAb3(pI＝9.4)而言相反，当缓冲剂浓度从1mM升高至8mM时，主峰的FWHM稍微降低。因此，8mM缓冲剂很可能提供了对mAb3的最佳分辨率。

缓冲剂浓度对mAbpH-IEC的影响取决于mAb的pI值。具有低pI(6.2)和中pI(8.2)值的mAb示出使用4mM缓冲剂的最优分离，而具有高pI值(9.4)的mAb似乎倾向更高浓度的缓冲剂。这是有道理的，因为高pImAb强结合至柱，并因此可能需要比低pI和中pImAb更高的离子强度基洗脱以达到最优分辨率。因为在pH梯度IEC中缓冲剂浓度和电导率明显影响mAb的分辨率，所以每当期望高分辨率的时候都应当对每种单独的mAb进行优化。开发了可对跨越宽pI范围的mAb从主峰解析酸性变体和碱性变体的IEC法。4mM缓冲剂似乎满足了该要求，并因此选择用于多产物盐介导的pH-IEC法。

盐浓度：为了研究离子强度如何影响pH-IEC分离，通过pH5.0至10.8的线性梯度，将五种不同的氯化钠水平(0mM、8mM、16mM、32mM和64mM)添加至pH梯度(由4mM缓冲剂建立)。平行分析mAb1、mAb2和mAb3。如图3D所示，将mAb的主峰FWHM作为盐浓度的函数进行作图。对于mAb1，主峰的FWHM对盐浓度高度敏感，并且使用8mMNaCl其达到最小值。这提示，8mMNaCl提供了对mAb1最佳的分辨率。对于mAb2，主峰的FWHM在整个盐浓度范围内是基本平的，这提示，盐浓度不明显影响mAb2的分辨率。对mAb3而言相反，主峰的FWHM随着盐浓度从8mM升高至32mM而降低，且在32mM至64mM盐之间保持不变。这提示，mAb3需要32mM的盐来达到最优分辨率。

离子强度对mAb的pH梯度IEC的影响还与mAb的pI相关。使用8mM的盐，低pImAb显示分离；高pImAb示出在更高盐浓度下的分离，而中pImAb的分辨率不依赖于盐浓度。由于对分辨率的明显影响，每当期望高分辨率时，可针对每种单独的mAb来优化盐浓度。在五种盐浓度中，使用16mMNaCl盐梯度的pH-IEC法提供了对pI值跨越从6.2至9.2的宽范围的mAb的可接受分辨率，并因此在本文中将其选为多产物盐介导的pH-IEC法。

优化的离子强度介导的pH-IEC法：优化的盐介导的pH-IEC法使用4mM哌嗪、4mM咪唑和4mMTris来建立pH梯度，并用0mM至16mMNaCl的线性盐梯度来介导。该方法的pH和电导率分布在图2C中示出为实线。为了比较，将模型pH和离子强度示出为虚线。除8.5至9.0的pH处的小凹外，柱出口处的实验pH以大致线性的方式随保留时间而升高，这与模型pH一致，不同之处在于因系统空隙体积导致的5分钟延时。通过用盐介导，流动相的实验电导率在pH梯度期间示出稍微升高(1570μS至1800μS)。相似地，模型离子强度在pH梯度期间基本一致。通过降低缓冲剂浓度和添加线性盐梯度，成功地控制了基于胺的pH梯度的离子强度。通过使用受控的离子强度，在高pH区将柱背压维持低于95巴(图2D)。所得的mAb1-3色谱图(未示出)是可重现的，说明阳离子交换柱在该压力范围内是稳定的。

实施例4.描述16种mAb的电荷不均匀性

为了进一步该新的盐介导的pH-IEC法的多产物能力，分析了pI值从6.2至9.4的16种mAb，并在图4中示出了它们的色谱图。用pH5至pH10.8的pH梯度和0mMNaCl至16mMNaCl的盐梯度从柱洗脱抗体。对于低pImAb1(6.2)和高pImAb3(9.4)二者，电荷变体分离良好，得到可接受的电荷不均匀性分布。相比于所报道的pH-IEC法(图1)，这是大幅的改进。所有16种mAb的电荷变体分离良好，这说明所开发的盐介导的pH-IEC法能够在无需任何附加方法开发努力的情况下描述多种mAb产物的电荷不均匀性。

除了更宽的适用性外，盐介导的pH梯度还提供了比所报道的pH-IEC法更好的分辨率。对于mAb2(pI＝8.2)，盐介导的pH-IEC法提供了电荷变体之间的基线分辨率(图4)。但是，由以前的pH-IEC法得到的分辨率低得多(图1)。虽然所述盐介导的pH梯度(58分钟)比以前的pH梯度(45分钟)更长，但是两种方法的梯度斜率相同(0.1pH单位/分钟)。因此，由盐介导的pH-IEC法得到的改进的分辨率不是梯度长度变化的结果，而是控制离子强度的影响的结果。

实施例5.监测mAb的热稳定性

通常使用阳离子交换色谱来评估生物药物蛋白质在制备期间的降解和批与批之间的变化(Vlasak,J和Ionescu,R(2008)Curr.Pharm.Biotechnol.9:468)。为了显示监视蛋白降解的能力，将所开发的离子强度介导的pH-IEC法用于描述mAb1在热胁迫后的电荷不均匀性。在该研究中选择mAb1，因为在这些mAb中其具有最低的保留，并且其pH-IEC分布最易受色谱参数变化的影响。用pH5至pH10.8的pH梯度和0mMNaCl至16mMNaCl的盐梯度从柱洗脱抗体。

用主峰归一化mAb1的对照材料和胁迫材料的色谱图(图5)。在热胁迫后，酸性变体和碱性变体二者都升高。胁迫样品主峰的右边还出现了肩。这些分布变化明显说明，mAb1于40℃温育3周和6周后降解。相似地，mAb2和mAb3在热胁迫下的降解也通过所述盐介导的pH-IEC法来检测(数据未示出)。

实施例6.离子强度介导的pH-IEC的稳健性测试

由于所述盐介导的pH-IEC法的复杂洗脱过程，需要确保其用于日常样品测试的稳健性。如上所述，我们知道，pH缓冲剂组成和盐浓度影响对mAb的保留和分辨率。此处进一步研究的目的是研究当使用最优pH缓冲剂组成和盐浓度时来源于柱、缓冲剂批次和仪器的变异性。在四个不同的天中测试了三根柱、三个缓冲剂批次、两个仪器。表3示出了实验设计。在该研究中再次选择mAb1，因为其pH-IEC分布最易受色谱参数变化的影响。

使用不同的柱和缓冲剂批次得到的mAb1色谱图是相当的，但是使用不同的仪器得到的色谱图示出了稍微不同的保留时间。仪器之间预期的延迟体积方面的差异导致了保留时间的变化，但其不影响该方法的性能。表4中总结了对mAb1电荷变体的定量。对于使用两个不同的仪器、三根柱和三种缓冲剂制备物得到的16个色谱图，电荷变体的定量是一致的，这说明，盐介导的pH-IEC在这些色谱条件下是强健的。

表3.使用mAb1的盐介导的pH-IEC的强健性测试的实验设计

表4.针对mAb1得到的盐介导的pH梯度的强健性数据(n＝16)的总结

盐介导的pH梯度IEC在上载至柱上的宽范围的样品质量范围内也是强健的。如图6所示，当将5μg至200μg的mAb1上载至柱上时，观察到一致的洗脱分布。虽然当柱加样超过50μg时主峰稍微变宽，但是在所有测试的柱加样中，电荷变体的定量是一致的(表5)。

在强健性研究过程中，得到足够的数据以覆盖典型HPLC实验中经历的大多数变量。盐介导的pH-IEC法针对典型mAb提供了相当的色谱图和一致的电荷变体定量结果，这说明该方法在此处研究的所有色谱条件下是强健的。

表5.在不同柱加样下mAb1的电荷不均匀性的强健性

实施例7.减少离子强度介导的pH-IEC的运行时间

以前，pH介导的IEC法使用哌嗪、咪唑、tris(PIT)作为缓冲剂(Farnan,D和Moreno),GT2009Anal.Chem.81:884-8857)。为了生成pH梯度，生成pH6至9.5的半线性pH曲线。如图7所示，当流动相pH小于试剂的pKa时，各缓冲剂的氨基官能团维持正电，当流动相pH更大时，各缓冲剂的氨基官能团为中性。使用缓冲剂A(pH5.0)和缓冲剂B(pH9.5)生成35分钟内的梯度为pH5至pH9.5的pH梯度。柱为PropacWCX-10，4×250mM。该缓冲剂体系pH梯度对具有7至8.5的pI值的大范围分子有效。但是，超出该工作范围的分子的电荷变体没有得到同样的解析。前期的工作揭示，缓冲剂的浓度和离子强度影响pH曲线的线性和样品的保留时间。如实施例2中所示，离子强度随着pH随时间的升高而大大降低。调节缓冲剂浓度并引入同时的盐梯度提供了十分稳定的贯穿pH梯度的离子强度。通过使用同时的盐梯度，pH梯度分离现在可解析pI值为6.2至9.4的分子变体。如图8中所示，通过使用58分钟的长梯度，其中在PIT缓冲剂(4mM哌嗪、4mN咪唑和4mMTris)中pH以0.1pH单位/分钟的斜率从pH5升高至pH10.8并且盐浓度从0mMNaCl升高至16mMNaCl，解析了pI值为6.2(Mab1)、8.2(Mab2)和9.4(Mab3)的单克隆抗体。该改进的方法称为“离子强度介导的pH梯度”或“盐介导的pH梯度”。

为了减少运行时间和提高通量，评价了更短柱上的盐介导的pH梯度。Farnan,D和Moreno,GT(2009)Anal.Chem.81:8846-8857指出，无论柱长度是多少，只要其是相同的pH-IEC分离模式(WCX或SCX)，则使用pH-IEC得到相似的洗脱谱。为了确定更短的柱是否可减少洗脱时间，对比了使用WCX-10，4×50mm柱、使用初始pH-IEC和盐介导的pH-IEC流动相二者对具有不同pI值的三种Mab的分离。所述mAb是Mab1，pI7.6；Mab2，pI8.6至9.3；以及Mab3，pI9.1。pH梯度为0至16分钟内pH6至11，在pH11保持2分钟，然后于pH6重平衡4分钟，总运行时间22分钟。用于初始pH-IEC的缓冲剂为2.4mMTris、1.5mM咪唑和11.6mM哌嗪。用于离子强度介导的pH-IEC的缓冲剂为4mMTris、4mM咪唑和4mM哌嗪，以及16mMNaCl。如在图9中所见，虽然对这三种Mab得到相似的峰分布，但是电荷变体的分辨率随着分子pI的升高而降低。为了实现在更短运行时间内对具有宽pI范围的分子的充分分离，启动了对变体分离机制和不同缓冲体系的研究。

为了协助缓冲剂筛选，使用pH和电导率预测工具。可计算常用的不同组合、pH范围和梯度时间的缓冲剂和NaCl盐的pH和电导率曲线，并基于缓冲剂的pKa作图。该形象化预测工具使得能够快速优化具有例如线性pH曲线、随着时间稳定或升高的离子强度和更低的缓冲剂毒性等期望性质的缓冲体系。使用该模型筛选了多种缓冲剂组合。据发现，Tris、哌嗪和磷酸盐(TPP)缓冲剂的组合形成跨越16分钟梯度的pH梯度(图10)。缓冲剂包括具有5.33pKa(范围5.0至6.0)的哌嗪pK1、具有7.20pKa(范围5.8至8.0)的磷酸盐pK2、具有8.06pKa(范围7.5至9.0)的Tris碱、具有9.73pKa(范围9.5至9.8)的哌嗪pK2和具有12.33pKa的磷酸盐pK3。图10中的表显示，磷酸盐分子贯穿pH范围都保持带电，并且在一定程度上弥补了因Tris和哌嗪中的氨基官能团随着pH升高去质子化而导致的离子强度损失。色谱条件如下：

柱：PropacWCX-10HT，4×50mm

pH梯度：5.0mMTris、哌嗪、磷酸盐(TPP)

缓冲剂A＝pH6.0

缓冲剂B＝pH11.0梯度：16分钟内6至11

缓冲剂C＝60mMNaCl

缓冲剂D＝MilliQ水

预测的pH和电导率曲线(图11的右图)与通过实验得到的曲线一致(左图)。缓冲体系包含5mMTris、哌嗪和磷酸盐，并且NaCl浓度为10mM、20mM或30mM(模型中使用)。实验流速为1ml/分钟或2ml/分钟。

实施例8.确定优化的离子强度范围

使用16分钟梯度盐介导的TPP法分析多种样品。图12中示出了分别来自4×50和4×250PropacWCX-10柱的22分钟和58分钟之间的一致分布的例子。用4×50柱的洗脱使用跨越16分钟的盐介导的Tris/哌嗪/磷酸盐(TPP)、pH6至11和0mMNaCl至30mMNaCl。用4×250柱的洗脱使用跨越58分钟的盐介导的哌嗪/咪唑/Tris(PIT)、pH5至10.8和0-16mMNaCl。据确定，盐介导的TPP法对主要处于7至8.5的pI范围内的分子是足够的，所述pI范围是用初始PIT法得到的相似范围。得出结论，缓冲剂和离子强度在分离中起作用，但是可涉及其他因素。

对跨越pH范围的MAb的静电荷状态进行造模。图13示出了对于具有不同pI的mAb随pH的静电荷叠加。在阳离子交换模式中，mAb带有正电荷直至pH降低至其pI(x-截距)，然后从柱洗脱。随着pH升高，mAb变得带负电。对于指定蛋白质分子的电荷变体分布由主峰、酸性区和碱性区组成(如底图所示)。通常来说，电荷变体和主峰差一个或一些电荷，从最酸性变体到最碱性变体的整个电荷包(chargeenvelop)跨越5至7个电荷。最优的pH梯度分离窗可能处于曲线的pH6.5至pH8.5的平区域(图13)；例如，对于pI值小于约8.5的分子，紧低于其理论pI的静电荷变化非常小，曲线在pH6.5至8.5之间相对较平。在pH梯度运行中，有足够的时间让电荷变体随着pH随时间的升高来以不同保留时间分别从柱洗脱。

相反地，对于pI值大于8.5和小于6.5的分子，在其理论pI处，静电荷变化大(图14)。在平台线性pH梯度运行期间，在这些pH下，电荷每分钟的斜率太陡使得不能充分分离，并且观察到一个峰(插图)。

因为在电荷对pH曲线的相对较平部分中实现了更好的峰分离和强健性，所以问题是，如何在该区域中洗脱蛋白质电荷变体而不管其pI。对于较高pI的分子，这需要使用除pH以外的因素来预先修饰电荷状态。该因素是缓冲剂离子强度。通过流动相中的更高的离子强度，从固定性屏蔽了分子表面上的更多电荷。因此，表观静电荷降低，使得变体能够在低于其pI的pH下进行洗脱。

在实施例1至6示出的工作中，通过校正PIT流动相中离子强度缺陷并组合盐梯度(盐介导的pH梯度)，良好分离了pI值大于9(阳离子交换模式)和小于7(阴离子交换模式)的分子的电荷变体。与单独的pH梯度相比，组合的pH与盐梯度的驱动力使分子的表观电荷状态随时间降低得更快。这可描述为电荷对于pH曲线得到垂向的拉伸，更窄的pH7至8之间的平区域，以及在大于9的pH下更浅的斜率。因此，对于具有更高pI的分子，该分离发生于稍低于其pI的pH下。通过使用较长的柱(250mm)和长运行时间(60分钟)，有足够的时间用于电荷变体洗脱。但是，盐介导的pH梯度法未能在较短的柱(50mm)上在短时间(20min)内解析高pI分子的电荷变体。

因为短的运行时间是关键的，所以不是使用跨越60分钟的盐梯度来逐渐降低表观电荷，而是可通过早期引入盐并保持全程恒定从而在运行的开始时达到期望的电荷状态。

图15是在不同浓度的NaCl盐存在下对高pImAb(pI9.2)的pH梯度分离的叠加。通过使用四元体系，使用A线和B线制造pH6至11的pH梯度，并且使用C线和D线来维持0mM、10mM、20mM、30mM、40mM或50mM的NaCl盐浓度。梯度条件和运行时间如下：仪器：U30002DLC；流动相：10mMTris、哌嗪、磷酸盐，A)pH6.0，B)pH11.0；C)100mMNaCl，D)milliQ水；柱：PropacWCX-10，4×50mm，10μm；柱温度：40℃；流速：1ml/分钟；pH梯度：10％至50％B；盐常数：0mM＝0％C，50％D；10mM＝10％C，40％D；20mM＝20％C，30％D，30mM＝30％C，20％D，40mM＝40％C，10％D，50mM＝50％C，0％D；样品浓度：1μg/μL；加样体积：20μL。

在较低的盐浓度下，观察到非常小的分离。在随后较高的盐浓度下，分离得到改进，同时洗脱时间减少。洗脱时间随着盐浓度升高而减少，支持了以下：分子表面上的额外电荷被从固定相屏蔽，导致表观电荷降低，从而使得能够在低于其pI的pH进行变体分离。在这种情况下，于40-50mMNaCl实现最优分离，在该盐浓度下，推测该mAb的表观电荷处于电荷对pH曲线的相对较平部分。

在不同的恒定盐浓度下但是施加相同的pH梯度来进行对具有不同pI的多种mAb的分析。一般而言，在使表观电荷状态落在电荷对pH曲线的平部分中的恒定盐浓度下实现了最优分离。例如，处于7至8.3的pI范围的mAb不需要盐，处于8.3至8.8的pI范围中的mAb需要20mM盐，并且处于8.8至9.0的pI范围中的mAb需要50mM盐(图16和17)。在电荷对pH曲线上，盐的添加基本使x轴向上移动至分子的期望电荷状态，这使得能够在曲线的平区域中进行最优分离。该类型的分离成为“混合”pH梯度(图18)。

改进的分离通过改变梯度条件来实现。无论是与初始pH-IEC法还是与盐介导的pH-IEC法相比，浅的混合pH-IEC梯度(使用TPP流动相)都导致改进的峰分离(图19和20)。通过使用TIC缓冲剂(Tris、咪唑、CAPS)，用10mMNaCl替代哌嗪(出于有害处理的担心)以及通用生物缓冲剂磷酸盐(其可因缓冲剂催化的翻译后修饰而有害地引起测定伪象)，实现了相似的分离(图21)。

可进一步挑战短的混合pH-IEC法以确定更快的分析时间是否可行。将pH梯度设置为10分钟内pH7至10，在pH10保持2分钟，且平衡时间3分钟，总运行时间15分钟。

色谱条件如下：仪器：U30002DLC；流动相：10mMTris、哌嗪、磷酸盐，A)pH6.0，B)pH11.0；C)100mMNaCl，D)milliQ水；柱：PropacWCX-10，4×50mm，10μm；柱温度：40℃；流速：1ml/分钟；pH梯度：0％至30％B；盐常数：0mM＝0％C，50％D；10mM＝10％C，40％D；20mM＝20％C，30％D，30mM＝30％C，20％D，40mM＝40％C，10％D，50mM＝50％C，0％D；样品浓度：1μg/μL；加样体积：20μL。

如图22和23所示，对于具有8.8和9.0的pI值的两种不同MAb而言，15分钟和22分钟运行之间的分布相似。但是，由于运行时间变得更短，需要更具产物特异性的起始/终止pH值和盐浓度。

当开发产物特异性方法时，可通过小心地基于分子pI选择合适的pH梯度斜率和盐浓度来实现最优分辨率。如果在序列中只分析仅一种产物，则产物特异性方法将是有益的。对于分析多种mAb、每种都具有不同pI的实验室而言，期望使用可递送pH梯度同时维持某些盐浓度的四元体系。否则，可能需要更长的22分钟的运行时间，如平台方法使用在固定盐浓度下递送pH梯度的二元体系。

实施例9.离子强度介导的pH梯度离子交换色谱的强健性

为了显示离子强度介导的pH梯度离子交换色谱的强健性窗口和标靶运行条件适于使用实验设计(DOE)方法来分析具有跨越宽范围的pI的多种单克隆抗体产物。如果在包括主峰(主峰％)、酸性变体峰(AV％)和碱性变体(BV％)峰的相对峰面积在内的可报道值方面没有显著变化，则该方法是适当强健的。此外，一般峰分布通过峰值分辨率来度量(Rs1和Rs2)。为了测试强健性，故意扰动运行参数，例如盐浓度、缓冲剂浓度、pH、柱温度和流速。

材料与方法

测试了以下三种抗体：

mAb1，pI＝8.2

mAb2，pI＝8.5

mAb3，pI＝9.0

使用配备有通向柱的8接口3通转换阀、用于线C和D的6接口溶剂选择阀以及Waters2487DualλUV检测器的Waters2796BioseparationsModule来进行色谱。

色谱柱为DionexProPacWCX-10HT，4×50mm柱。

缓冲体系如下：对于缓冲剂A和B，等摩尔的咪唑、Tris和CAPS。缓冲剂C为100mMNaCl，并且缓冲剂D是水。

缓冲剂A的pH如实验设计表(表6)之规定，缓冲剂B的pH为10.0。实验设计表中示出了所使用的总缓冲剂强度和盐浓度。

梯度如下：0-2分钟，处于起始pH；2-16分钟，从起始pH至pH10；16-18分钟，处于pH10；18-22分钟，处于起始pH。选择的盐浓度在梯度中维持恒定。

所使用的柱温度和流速如表6中所指定。

3种mAb：

mAb1，pI＝8.2

mAb2，pI＝8.5

mAb3，pI＝9.0

Waters2796BioseparationsModule配备有通向柱的8接口3通转换阀、用于线C和D的6接口溶剂选择阀以及Waters2487DualλUV检测器。

DionexProPacWCX-10HT，4×50mm柱

缓冲体系：对于缓冲剂A和B，等摩尔的咪唑、Tris和CAPS。缓冲剂C为100mMNaCl，并且缓冲剂D是水。

实验设计表规定了缓冲剂A的pH，缓冲剂B的pH为10.0。实验设计表中示出了总缓冲剂强度和盐浓度。

梯度：0-2分钟，处于起始pH；2-16分钟，从起始pH至10；16-18分钟，处于pH10；18-22分钟，处于起始pH。选择的盐浓度在梯度中维持恒定。

柱温度和流速：参见实验设计表

表6.实验设计(运行参数)

模式	盐(mM)	缓冲剂(mM)	起始pH	柱温度(℃)	流量(ml/分钟)
						+++––	25	20	6.3	36	0.8
––+––	15	10	6.3	36	0.8
						–+–––	15	20	5.7	36	0.8
+–+–+	25	10	6.3	36	1.2
						–++–+	15	20	6.3	36	1.2
+––++	25	10	5.7	44	1.2
						––––+	15	10	5.7	36	1.2
0	20	15	6.0	40	1
						+++++	25	20	6.3	44	1.2
++–+–	25	20	5.7	44	0.8
						––+++	15	10	6.3	44	1.2
–––+–	15	10	5.7	44	0.8
						–+–++	15	20	5.7	44	1.2
+–++–	25	10	6.3	44	0.8
						–+++–	15	20	6.3	44	0.8
++––+	25	20	5.7	36	1.2
						+––––	25	10	5.7	36	0.8
0	20	15	6.0	40	1

通过系统地从标靶运行条件扰动参数来测试用于分析多种单克隆抗体产物的色谱法的强健性，所述标靶运行条件为20mM盐、15mM缓冲剂、起始pH6.0、柱温度40℃以及1.0ml/分钟的流速(在表6中命名为0)。测试了pI为8.2、8.5和9.0的三种不同MAb。图24中示出了在标靶运行条件下进行的两次重复色谱所得的色谱图。图25中示出了通过根据表6扰动运行条件来测试标靶运行条件针对MAb3的强健性的例子。虽然在分辨率方面有一些小差异，但是保持了一般峰分布，尤其是三个区域(酸性峰、主峰和碱性峰)的峰分布，并且使得能够定量。

运行参数对方法性能的影响可通过使用分布表制图来显示(图26)。在该表制图中，用于在不同条件下分析的可报道值(主峰％、AV％和BV％)接近地分布于标靶条件的值(处于每个图的中心，即20mM盐)周围。该结果示出，盐浓度对可报道值没有显著影响。但是，在分辨率上，随着盐浓度的升高存在这样的趋势：MAb1(pI＝8.2)和MAb2(pI＝8.5)的稍微下降的趋势，以及MAb3(pI＝9)的上升趋势。这提示，对于产物特异性的方法而言，随着分子的pI升高，可通过提高盐浓度来进一步改进分辨率。作为多产物方法，将盐浓度优化用于具有跨越宽范围pI的mAb。这些研究的结果示出，20mM是可用于分析具有范围介于7.0至9.5的pI的抗体的盐浓度。

还对其他运行参数的影响进行了作图，并在图27中示出。在这些表制图中，用于在不同条件下分析的可报道值(主峰％、AV％和BV％)也围绕标靶条件下的值周围。这些结果显示，运行条件的故意扰动对可报道值没有显著影响。因此，所述多产物方法在标靶运行条件下是适当稳健的。

Claims (80)

1.用于分析包含多肽以及一种或多种污染物的组合物的方法，所述方法包括

a)使用加样缓冲剂、使所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，其中所述加样缓冲剂处于第一pH，且包含第一离子强度；

b)使用洗脱缓冲剂从所述离子交换色谱材料洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中所述洗脱缓冲剂的pH在pH梯度中改变，且所述洗脱缓冲剂的离子强度在离子强度梯度中改变，其中通过所述pH梯度和离子强度梯度的组合来分离所述多肽以及所述一种或多种污染物；以及

c)检测所述多肽和所述一种或多种污染物。

2.权利要求1的方法，其中所述多肽是抗体或免疫粘附素，或其片段。

3.权利要求1或2的方法，其中所述多肽是单克隆抗体或其片段。

4.权利要求2或3的方法，其中所述抗体是人抗体。

5.权利要求2或3的方法，其中所述抗体是人源化抗体。

6.权利要求2或3的方法，其中所述抗体是嵌合抗体。

7.权利要求2至6中任一项的方法，其中所述抗体是抗体片段。

8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述污染物是多肽的变体。

9.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述污染物是所述多肽的降解产物。

10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述多肽具有大于约9.0的pI。

11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述色谱材料是阳离子交换色谱材料。

12.权利要求11的方法，其中所述阳离子交换色谱材料是磺化的色谱材料或羧基化的色谱材料。

13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述pH梯度是线性梯度。

14.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述pH梯度是阶跃梯度。

15.权利要求13或14的方法，其中所述pH梯度包含从约pH5至约pH11的升高。

16.权利要求1至15中任一项的方法，其中所述pH梯度通过使用一种或多种缓冲剂来产生。

17.权利要求16的方法，其中所述一种或多种缓冲剂选自哌嗪、咪唑、Tris、磷酸盐或CAPS。

18.权利要求1至17中任一项的方法，其中所述离子强度梯度是线性梯度。

19.权利要求1至17中任一项的方法，其中所述离子强度梯度是阶跃梯度。

20.权利要求18或19的方法，其中所述离子强度梯度包含从约0mM至约200mM的盐浓度升高。

21.权利要求18至20中任一项的方法，其中所述离子强度梯度是NaCl梯度、KCl梯度或Na₂SO₄梯度。

22.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述多肽具有小于约7.0的pI。

23.权利要求22的方法，其中所述色谱材料是阴离子交换色谱材料。

24.权利要求23的方法，其中所述阴离子交换色谱材料是季胺色谱材料或叔胺色谱材料。

25.权利要求22至24中任一项的方法，其中所述pH梯度是线性梯度。

26.权利要求22至24中任一项的方法，其中所述pH梯度是阶跃梯度。

27.权利要求25或26的方法，其中所述pH梯度包含从约pH8至约pH5的降低。

28.权利要求22至27中任一项的方法，其中所述pH梯度通过使用一种或多种缓冲剂来产生。

29.权利要求28的方法，其中所述一种或多种缓冲剂选自哌嗪、咪唑或Tris。

30.权利要求22至29中任一项的方法，其中所述离子强度梯度是线性梯度。

31.权利要求22至29中任一项的方法，其中所述离子强度梯度是阶跃梯度。

32.权利要求30或31的方法，其中所述离子强度梯度包含从约0mM至约200mM的盐浓度升高。

33.权利要求30至32中任一项的方法，其中所述离子强度梯度是NaCl梯度、KCl梯度或Na₂SO₄梯度。

34.用于分析包含多肽以及一种或多种污染物的组合物的方法，所述方法包括

a)使用加样缓冲剂、使所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，其中所述加样缓冲剂处于初始pH，并且包含初始离子强度；

b)使用洗脱缓冲剂从所述离子交换色谱材料洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中所述洗脱缓冲剂的pH在pH梯度中改变，且其中所述洗脱缓冲剂的离子强度与所述加样缓冲剂的初始离子强度基本相同，其中通过在约所述初始离子强度下的pH梯度来分离所述多肽以及所述一种或多种污染物；以及

c)检测所述多肽和所述一种或多种污染物。

35.权利要求34的方法，其中所述多肽是抗体或免疫粘附素，或其片段。

36.权利要求34或35的方法，其中所述多肽是单克隆抗体或其片段。

37.权利要求35或36的方法，其中所述抗体是人抗体。

38.权利要求35或36的方法，其中所述抗体是人源化抗体。

39.权利要求35或36的方法，其中所述抗体是嵌合抗体。

40.权利要求35至39中任一项的方法，其中所述抗体是抗体片段。

41.权利要求34至40中任一项的方法，其中所述污染物是多肽的变体。

42.权利要求34至40中任一项的方法，其中所述污染物是所述多肽的降解产物。

43.权利要求34至42中任一项的方法，其中所述多肽具有大于约9.0的pI。

44.权利要求34至43中任一项的方法，其中所述色谱材料是阳离子交换色谱材料。

45.权利要求44的方法，其中所述阳离子交换色谱材料是磺化的色谱材料或羧基化的色谱材料。

46.权利要求34至45中任一项的方法，其中所述pH梯度是线性梯度。

47.权利要求34至45中任一项的方法，其中所述pH梯度是阶跃梯度。

48.权利要求46或47的方法，其中所述pH梯度包含从约pH5至约pH11的升高。

49.权利要求34至48中任一项的方法，其中所述pH梯度通过使用一种或多种缓冲剂来产生。

50.权利要求49的方法，其中所述一种或多种缓冲剂选自哌嗪、咪唑、Tris、磷酸盐或CAPS。

51.权利要求34至50中任一项的方法，其中所述洗脱缓冲剂的离子强度为约0mM至约100mM。

52.权利要求51的方法，其中所述洗脱缓冲剂包含约0mMNaCl至约100mMNaCl、约0mMKCl至约100mMKCl，或约0mMNa₂SO₄至约100mMNa₂SO₄。

53.权利要求34至42中任一项的方法，其中所述多肽具有小于约7.0的pI。

54.权利要求53的方法，其中所述色谱材料是阴离子交换色谱材料。

55.权利要求54的方法，其中所述阴离子交换色谱材料是季胺色谱材料或叔胺色谱材料。

56.权利要求53至55中任一项的方法，其中所述pH梯度是线性梯度。

57.权利要求53至55中任一项的方法，其中所述pH梯度是阶跃梯度。

58.权利要求56或57的方法，其中所述pH梯度包含从约pH8至约pH5的降低。

59.权利要求53至58中任一项的方法，其中所述pH梯度通过使用一种或多种缓冲剂来产生。

60.权利要求59的方法，其中所述一种或多种缓冲剂选自哌嗪、咪唑或Tris。

61.权利要求53至60中任一项的方法，其中所述洗脱缓冲剂的离子强度为约0mM至约100mM。

62.权利要求61的方法，其中所述洗脱缓冲剂包含约0mMNaCl至约100mMNaCl。

63.权利要求1至62中任一项的方法，其中所述分析通过高效液相色谱来进行。

64.用于分析包含多肽以及一种或多种污染物的组合物中的所述多肽的方法，其中所述方法将一种或多种污染物从所述多肽分离，所述方法包括

a)使用加样缓冲剂、使所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，其中所述加样缓冲剂处于第一pH，并且包含第一离子强度；

b)使用洗脱缓冲剂从所述离子交换色谱材料洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中所述洗脱缓冲剂的pH在pH梯度中改变，且所述洗脱缓冲剂的离子强度在离子强度梯度中改变，其中通过所述pH梯度和离子强度梯度的组合来分离所述多肽以及所述一种或多种污染物；以及

c)检测所述多肽和所述一种或多种污染物，

其中所述方法用于分析pI介于约7.0至约9.5范围的多肽。

65.用于分析包含多肽以及一种或多种污染物的组合物中的多肽的方法，所述方法包括

a)使用加样缓冲剂、使所述多肽以及一种或多种污染物结合至离子交换色谱材料，其中所述加样缓冲剂处于初始pH，并且包含初始离子强度；

b)使用洗脱缓冲剂从所述离子交换色谱材料洗脱所述多肽以及一种或多种污染物，其中所述洗脱缓冲剂的pH在pH梯度中改变，且其中所述洗脱缓冲剂的离子强度与所述加样缓冲剂的初始离子强度基本相同，其中通过在约所述初始离子强度下的pH梯度来分离所述多肽以及所述一种或多种污染物；以及

c)检测所述多肽和所述一种或多种污染物，

其中所述方法用于分析pI介于约7.0至约9.5范围的多肽。

66.权利要求65或66的方法，其中所述多肽是抗体或免疫粘附素，或其片段。

67.权利要求64至66中任一项的方法，其中所述多肽是单克隆抗体或其片段。

68.权利要求66或67的方法，其中所述抗体是人抗体。

69.权利要求66或67的方法，其中所述抗体是人源化抗体。

70.权利要求66或67的方法，其中所述抗体是嵌合抗体。

71.权利要求65至70中任一项的方法，其中所述抗体是抗体片段。

72.权利要求64至71中任一项的方法，其中所述污染物是多肽的变体。

73.权利要求64至72中任一项的方法，其中所述污染物是所述多肽的降解产物。

74.权利要求64至73中任一项的方法，其中所述污染物是多肽的电荷变体。

75.权利要求1至74中任一项的方法，其中所述加样缓冲剂和/或所述洗脱缓冲剂中的缓冲剂浓度为约10mM至约50mM。

76.权利要求1至75中任一项的方法，其中所述第一pH为约pH5.0至约pH7.0。

77.权利要求1至76中任一项的方法，其中所述色谱材料的温度为约20℃至约50℃。

78.权利要求1至77中任一项的方法，其中所述上样和洗脱在约0.5ml/分钟至约2.0ml/分钟的流速进行。

79.确定组合物中多肽的纯度的方法，其包括根据权利要求1至78的方法中的任一种来分析所述组合物，并确定所述组合物中多肽与污染物的比率。

80.确定包含多肽的组合物中所述多肽的稳定性的方法，所述方法包括：

a)将所述包含多肽的组合物于40℃孵育三周或六周，

b)通过权利要求1至79的任一方法来分析步骤a)的组合物，以及

c)确定所述组合物中变体与多肽的比率，其中，与未进行孵育的组合物相比，所述组合物中变体与多肽的比率的升高指示所述组合物多肽的降解。