CN111024883B - 一种奥马珠单抗的电荷异质体的分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种奥马珠单抗的电荷异质体的分离方法。所述分离方法包括如下步骤：用羧肽酶对奥马珠单抗样品进行酶切；用离子交换高效液相色谱对奥马珠单抗样品，或者羧肽酶酶切后的奥马珠单抗样品进行分离。本发明提供的分离方法检测时间适宜，40min即可完成检测，酸峰、主峰和碱峰的出峰时间适宜，各峰的分离度高，该分离方法具有较高的专属性、准确度及精密度，稳定可行。

Description

一种奥马珠单抗的电荷异质体的分离方法
技术领域
本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种奥马珠单抗的电荷异质体的分离方法。
背景技术
奥马珠单抗(Xolair)是选择性结合人类免疫球蛋白E(IgE)的一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，具有约149kD的分子量。奥马珠单抗目前适用于治疗皮肤测试呈阳性或在体外对长期气源性致敏原具有反应性且具有吸入性皮质类固醇不充分控制的症状的患者中的中度至重度持久性哮喘。是全球首个批准治疗中至重度哮喘的靶向治疗药物，该产品于2003年首次在全球上市，已在96个国家获得批准，包括美国、欧盟、日本等。
用奥马珠单抗的问题在于：1)其在药学相关剂量下靶向游离IgE，但不靶向(或不能有效靶向)IgE/FcεRI复合物的致病性种类；2)可能由于IgE/FcεRI复合物的的致病性种类不被靶向；3)其不应当用于具有高IgE水平的患者(例如，因为IgE/FcεRI复合物的致病性种类不被靶向，且鉴于患者中的高游离IgE水平而不会随时间耗散)；4)“当服用奥马珠单抗时可以发生I型局部或全身反应，包括过敏反应和过敏性休克”；5)其对IgE的亲和力并不是特别好。
奥马珠单抗作为复杂的大分子物质，在细胞培养、纯化、运输、存储过程中，可能在组成氨基酸、二硫键、糖基化等层面发生不同程度的变化，进而引起电荷变化。电荷异质体的修饰微店、种类可能影响奥马珠单抗的功能和稳定性，因此对奥马珠单抗的电荷异质体的分析具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种奥马珠单抗的电荷异质体的分离方法。该分离方法稳定可行，具有较高的专属性和准确度。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种奥马珠单抗的电荷异质体的分离方法，所述分离方法包括如下步骤：
(1)用羧肽酶对奥马珠单抗样品进行酶切；
(2)用离子交换高效液相色谱对奥马珠单抗样品，或者羧肽酶酶切后的奥马珠单抗样品进行分离。
本发明利用离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)柱对不同离子的分离能力，即带电荷的单抗与固定相之间发生离子交换能力的差异，从而分离单抗的电荷异质体。通过对得到的色谱图中各峰进行积分分析，可以得出电荷异质体的含量；通过分析羧肽酶(CPB酶)酶切前后奥马珠单抗样品的色谱图的变化，可以得知奥马珠单抗样品中电荷异质体的种类。
作为本发明的优选技术方案，步骤(1)中所述羧肽酶与所述奥马珠单抗样品的质量比为(1-5):100，例如可以是1:100、1.5:100、2:100、2.5:100、3:100、3.5:100、4:100、4.5:100或5:100等；进一步优选为1:100。
作为本发明的优选技术方案，步骤(1)中所述酶切的反应温度为35-40℃，例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃等；进一步优选为37℃。
优选地，步骤(1)中所述酶解的反应时间为3-6.5h，例如可以是3h、3.2h、3.5h、3.8h、4h、4.2h、4.5h、4.8h、5h、5.2h、5.5h、5.8h、6h、6.2h或6.5h等；进一步优选为3h。
作为本发明的优选技术方案，所述离子交换高效液相色谱的进样浓度为0.5-1.5mg/mL，例如可以是0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL或1.5mg/mL等；进一步优选为1mg/mL。
需要说明的是，本发明中所述进样浓度是指离子交换高效液相色谱试样中酶切前后奥马珠单抗样品的浓度。
作为本发明的优选技术方案，所述离子交换高效液相色谱采用的色谱柱的固定相为带羧基官能团弱阳离子键合相。
优选地，所述离子交换高效液相色谱采用的色谱柱的温度为30-40℃，例如可以是30℃、30.5℃、31℃、31.5℃、32℃、32.5℃、33℃、33.5℃、34℃、34.5℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃等；进一步优选为32℃。
作为本发明的优选技术方案，所述离子交换高效液相色谱的检测波长为275-285nm，例如可以是275nm、276nm、277nm、278nm、279nm、280nm、281nm、282nm、283nm、284nm或285nm等；进一步优选为280nm。
作为本发明的优选技术方案，所述离子交换高效液相色谱采用的流动相中含有Tris和硫酸铵。
优选地，所述流动相的流速为0.8-1.2mL/min，例如可以是0.8mL/min、0.85mL/min、0.9mL/min、0.95mL/min、1mL/min、1.05mL/min、1.1mL/min、1.15mL/min或1.2mL/min等；进一步优选为1mL/min。
作为本发明的优选技术方案，所述离子交换高效液相色谱采用流动相进行梯度洗脱。
优选地，所述梯度洗脱使用的流动相的pH随洗脱时间先增大后减小。
作为本发明的优选技术方案，所述梯度洗脱使用的流动相由如下体积百分比的流动相A和流动相B组成：0-30min：75-85％流动相A和15-25％流动相B；30-36min：100％流动相B；36-40min：75-85％流动相A和15-25％流动相B；所述流动相A的包括11.6mM哌嗪、15mM咪唑和2.4mM Tris，pH为5.0-6.0；所述流动相B包括11.6mM哌嗪、15mM咪唑和2.4mM Tris，pH为9.2-9.8；。
优选地，所述梯度洗脱使用的流动相由如下体积百分比的流动相A和流动相B组成：0-30min：80％流动相A和20％流动相B；30-36min：100％流动相B；36-40min：80％流动相A和20％流动相B；所述流动相A的包括11.6mM哌嗪、15mM咪唑和2.4mM Tris，pH为6.0；所述流动相B包括11.6mM哌嗪、15mM咪唑和2.4mM Tris，pH为9.5。
作为本发明的优选技术方案，所述离子交换高效液相色谱的进样体积为15-25μL，例如可以是15μL、16μL、17μL、18μL、19μL、20μL、21μL、22μL、23μL、24μL或25μL等；进一步优选为20μL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的分离方法检测时间适宜，40min即可完成检测，酸峰、主峰和碱峰的出峰时间适宜，各峰的分离度高，该分离方法具有较高的专属性、准确度及精密度，稳定可行。
附图说明
图1为实施例1中奥马珠单抗和酶切后的奥马珠单抗的色谱图。
图2为超纯水、5mM组氨酸/盐酸组氨酸缓冲液、原研药MV166-INV、166制剂超滤换液和高温破坏的166制剂超滤换液样品的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明实施例中使用的样品、试剂及仪器信息如下表1-3所示：
表1 样品信息
Figure BDA0002351659320000051
表2 试剂信息
Figure BDA0002351659320000052
表3 仪器设备信息
Figure BDA0002351659320000053
实施例1
本实施例提供一种奥马珠单抗的电荷异质体的分离方法，包括如下步骤：
(1)试样制备：将奥马珠单抗样品用超纯水稀释至1mg/mL，转移至液相小瓶中，等待上机分析；
取100μg奥马珠单抗样品，用50mM Tirs-HCl缓冲液稀释至1mg/mL，加入1μL CPB酶(1mg/mL)，CPB酶:奥马珠单抗＝1:100(w:w)，混匀，37℃孵育3h，取出后离心，转移至液相小瓶中，等待上机分析；
(2)将步骤(1)得到的试样加入HPLC色谱仪中，进行梯度洗脱，色谱条件如下表4所示：
表4 色谱条件
Figure BDA0002351659320000061
未酶切的奥马珠单抗(Xoliar)和酶切后的奥马珠单抗(Xoliar-CPB)的色谱图如图1所示。色谱图的数据分析结果如下表5所示。
表5 数据分析结果
Figure BDA0002351659320000062
Figure BDA0002351659320000071
从图1和表5可以看出出峰良好，出峰时间合理，理论塔板数与分离度满足要求，CPB酶切后的Xoliar纯度达到87.7％，与Xoliar结果基本一致。
实施例2
本实施例提供一种奥马珠单抗的电荷异质体的分离方法，与实施例1的区别在于，步骤(1)中加酶量不同。加酶量和数据分析结果如下表6所示：
表6
Figure BDA0002351659320000072
由表6可以看出，添加1、2、3μL CPB酶并没有显著影响其主峰、酸峰、碱峰纯度和主峰保留时间结果，表明添加1μL CPB酶已满足检测要求。经CPB酶酶切与未酶切结果相比，样品CPB酶切后，对应的碱性峰变低。
实施例3
本实施例提供一种奥马珠单抗的电荷异质体的分离方法，与实施例1的区别在于，步骤(1)中加酶量和孵育时间不同。加酶量、孵育时间和数据分析结果如下表7所示：
表7
Figure BDA0002351659320000073
由表7可以看出，添加1和5μL CPB酶并没有显著影响主峰、酸峰、碱峰纯度和主峰保留时间结果，表明添加1μL CPB酶已满足检测要求。添加2μL CPB酶分别孵育5h和6.5h并没有显著影响主峰、酸峰、碱峰纯度结果，表明添加1μL CPB酶和孵育3h已满足检测要求。
流动相稳定性研究
对实施例1的流动相分别在配制1天、2天、3天、6天和7天的时候测pH，并按照与实施例1相同的方法，对奥马珠单抗样品进行测试，pH变化如下表8所示，色谱数据测试结果如下表9所示：
表8
配制天数 流动相A pH值 流动相B pH值
1天 6.00 9.52
2天 5.98 9.49
3天 5.97 9.48
6天 5.90 9.40
7天 5.92 9.40
表9
流动相天数 主峰％ 酸峰％ 碱峰％ 主峰出峰时间min
1天 83.3 8.2 8.5 20.876
2天 83.5 7.9 8.7 20.863
3天 83.2 8.1 8.7 20.856
6天 83.6 7.8 8.6 20.936
7天 83.6 7.8 8.6 21.047
平均 83.44 7.96 8.62 20.916
STDV 0.18 0.18 0.08 0.08
RSD％ 0.22 2.3 0.9 0.4
由表8和表9可以看出，流动相7天内pH值变化前三天在±0.05内，而一周扩大到±0.1的范围，而对各个峰纯度和出峰时间的影响不大，主峰、碱峰及主峰出峰时间RSD(相对标准偏差)＜2％，而酸峰RSD＜5％。说明7天内，此流动相稳定性较好，所以可将流动相的有效期定为7天。
线性及准确度确认
分别调节奥马珠单抗样品(酶切)的上样浓度为0.50mg/mL、0.75mg/mL、1.00mg/mL、1.25mg/mL、1.50mg/mL，按照与实施例1相同的方法进行分离检测，计算上样浓度与主峰面积之间的线性R2，计算主峰回收率(主峰峰面积的拟合值相对实际值的百分含量)，结果如下表10所示：
表10
Figure BDA0002351659320000091
经拟合得到，主峰峰面积(y1)、酸峰峰面积(y2)、碱峰峰面积(y3)与上样浓度(x)的关系曲线分别为：
y1＝1451928x-169657.8，R2＝0.9973；
y2＝149728x-28973，R2＝0.9947；
y3＝168505x-34992，R2＝0.9904。
由表10可知，样品的上样浓度从0.50mg/mL递增到1.50mg/mL，相同的上样体积，峰面积与上样量的线性状态良好，R2＞0.99，主峰纯度回收率分布在95％～105％之间，说明上样量对分析检测结果无显著影响，表明本发明提供的分离方法具有较高的准确度。
重复性确认
按照实施例1的方法，平行测试6份奥马珠单抗样品(酶切)，计算主峰出峰时间、峰面积和峰纯度的RSD，考察本发明提供的分离方法的重复性。数据结果如下表11所示：
表11
平行样品 酸峰％ 主峰％ 碱峰％ 主峰出峰时间
1 83.6 7.8 8.7 19.997
2 83.2 7.8 9.1 20.009
3 83.2 7.9 9.0 20.004
4 83.3 8.0 8.7 20.042
5 83.0 8.1 9.0 20.036
6 83.1 8.0 8.9 20.033
平均 83.23 7.93 8.90 20.02
STDV 0.21 0.12 0.17 0.02
RSD％ 0.25 1.5 1.9 0.10
从表11可知，6份平行样品，主峰出峰时间和纯度的RSD均小于2.0％，酸峰和碱峰的RSD均小于2.0％，表明本发明提供的方法对电荷异质体的检测结果重复性好。
耐用性确认
按照实施例1的方法处理得到奥马珠单抗样品后，分别在0h、6h、18h进样检测，计算主峰出峰时间、峰面积和峰纯度的RSD，考察本发明提供的分离方法的耐用性。数据结果如下表12所示：
表12
Figure BDA0002351659320000101
Figure BDA0002351659320000111
从表12可知，0h、6h、18h进样的主峰出峰时间和纯度的RSD均小于3.0％，酸峰和碱峰的RSD均小于3.0％，表明本发明提供的方法对电荷异质体的检测结果耐用性好。
专属性确认
按照实施例1的方法检测超纯水、5mM组氨酸/盐酸组氨酸缓冲液、原研药MV166-INV、166制剂超滤换液(奥马珠单抗生物类似药)和高温(65℃，18h)破坏的166制剂超滤换液样品，确认方法的专属性。
表13
Figure BDA0002351659320000112
其中，分离度R的计算方法：R＝与主峰相邻峰的峰高/主峰与相邻峰的谷高。
从图2和表13可知，超纯水和5mM组氨酸/盐酸组氨酸缓冲液在166制剂超滤换液的主峰、酸峰、碱峰出峰位置的附近不出峰，MV166-INV和166制剂超滤换液的图谱保持一致，主峰保留时间无显著变化，高温破坏的166制剂超滤换液主峰保留时间无显著变化，其主峰与相邻峰的分离度≥1.0，完成方法专属性的确认。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (16)

1.一种奥马珠单抗的电荷异质体的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括如下步骤：
（1）用羧肽酶对奥马珠单抗样品进行酶切；
（2）用离子交换高效液相色谱对奥马珠单抗样品，或者羧肽酶酶切后的奥马珠单抗样品进行分离；
所述离子交换高效液相色谱采用流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱使用的流动相的pH随洗脱时间先增大后减小，所述梯度洗脱使用的流动相由如下体积百分比的流动相A和流动相B组成：0-5 min：80%流动相A和20%流动相B；30-32 min：100%流动相B；36-40 min：80%流动相A和20%流动相B；所述流动相A为11.6 mM哌嗪、15 mM咪唑和2.4 mM Tris，pH为6.0；所述流动相B为11.6 mM哌嗪、15 mM咪唑和2.4 mM Tris，pH为9.5；所述离子交换高效液相色谱采用的色谱柱的固定相为带羧基官能团的弱阳离子键合相；所述离子交换高效液相色谱的检测波长为275-285 nm。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤（1）中所述羧肽酶与所述奥马珠单抗样品的质量比为(1-5):100。
3.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，步骤（1）中所述羧肽酶与所述奥马珠单抗样品的质量比为1:100。
4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤（1）中所述酶切的反应温度为35-40℃。
5.根据权利要求4所述的分离方法，其特征在于，步骤（1）中所述酶切的反应温度为37℃。
6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤（1）中所述酶切的反应时间为3-6.5 h。
7.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于，步骤（1）中所述酶切的反应时间为3h。
8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述离子交换高效液相色谱的进样浓度为0.5-1.5 mg/mL。
9.根据权利要求8所述的分离方法，其特征在于，所述离子交换高效液相色谱的进样浓度为1 mg/mL。
10.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述离子交换高效液相色谱采用的色谱柱的温度为30-40℃。
11.根据权利要求10所述的分离方法，其特征在于，所述离子交换高效液相色谱采用的色谱柱的温度为32℃。
12.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述离子交换高效液相色谱的检测波长为280 nm。
13.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8-1.2 mL/min。
14.根据权利要求13所述的分离方法，其特征在于，所述流动相的流速为1 mL/min。
15.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述离子交换高效液相色谱的进样体积为15-25μL。
16.根据权利要求15所述的分离方法，其特征在于，所述离子交换高效液相色谱的进样体积为20μL。
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