MX2015006149A

MX2015006149A - Cromatografia de intercambio ionico de gradiente de ph mediada por concentracion ionica.

Info

Publication number: MX2015006149A
Application number: MX2015006149A
Authority: MX
Inventors: Yajun Wang; George T Moreno; Boyan Zhang; Liangyi Zhang; Dell Farnan; Tom Patapoff
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2012-11-15
Filing date: 2013-11-15
Publication date: 2015-08-05
Also published as: JP2015537212A; US20180120273A1; KR20150084046A; RU2015122726A; US10712322B2; US20150285771A1; CN105051528A; WO2014078729A1; EP2920586A4; CA2890979A1; HK1217232A1; US9810670B2; EP2920586A1; BR112015011011A2

Abstract

La presente invención proporciona métodos para analizar composiciones de polipéptidos tal como anticuerpos por cromatografía de intercambio iónico de gradiente de pH mediada por concentración iónica. En algunos aspectos, los métodos usan una combinación de gradientes de pH y gradientes de concentración iónica para separar el polipéptido de las variantes de carga del polipéptido. En algunos aspectos, los métodos usan una concentración iónica estable para optimizar la ventana de separación por gradiente de pH para separar el polipéptido de las variantes de carga. Estos métodos son útiles para analizar el polipéptido, por ejemplo, anticuerpos, con un pI mayor de 9 o un pI menos de 7. En algunos aspectos, la invención proporciona un método de múltiples productos para el análisis de polipéptidos de pI variables.

Description

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO DE GRADIENTE DE pH MEDIADA POR CONCENTRACIÓN IÓNICA Campo de la Invención

[0001] La presente invención proporciona métodos para analizar preparaciones de polipéptidos usando cromatografía de intercambio iónico de gradiente de pH mediada por concentración iónica.

Antecedentes de la Invención

[0002] Las proteínas tal como anticuerpos monoclonales (mAb) tienen principalmente aminoácidos cargados y polares en la superficie en un ambiente acuoso (Barlow, DJ y Thornton, JM (1986) Biopolymers 25:1717). Debido a la interacción molecular con los componentes de solución, los residuos superficiales pueden experimentar múltiples modificaciones químicas y enzimáticas, conduciendo a una mezcla heterogénea de variantes de proteína con ligeras diferencias en su superficie electrostática (Dick, LW et al . , (2009) J. Chromatogr. B 877:3841; Liu, HW et al . , (2008) Rapid Com un. Mases Spectrom. 22:4081; Miller, AK, et al., (2011) J. Pharm. Sci . 100:2543; Wang, WR et al., (2011) Mol . Immunol . 48:860). Se considera que la cromatografía de intercambio catiónico (CEC) es la norma dorada para perfilar la heterogeneidad de carga de productos terapéuticos de proteína de acuerdo a una reciente revisión por Vlasak, J y Ionescu, R (2008 Curr . Pharm. Biotechnol . 9:468). Se requiere el método de separación sensible a carga por las agencias regulatorias para asegurar la consistencia de producción durante la elaboración y el monitorizar el grado de degradación de los productos terapéuticos de proteína (Miller, AK, et al . , (2011) J. Pharm. Sci . 100:2543; He, XPZ (2009) Electrophoresis 30:714; Sosic, Z et al . , (2008) Electrophoresis 29:4368; Kim, J et al.,(2010) J. Chromatogr. B 878:1973: Teshima, G et al . , (2010) J. Chromatogr. A 1218:2091).

[0003] Los métodos analíticos de cromatografía de 0 intercambio iónico (IEC) que usan un gradiente de pH han emergido como téenicas alternativas a la IEC convencional de gradiente de sal para perfilar la heterogeneidad de cargas de proteínas terapéuticas (Farnan, D y Moreno, GT (2009) Anal . Chem. 81:8846; Tsonev, LI y Hirsh, AG (2008) J. 5 Chromatogr. A 1200:166; Nordborg, A et al . , (2009) J. Sep. Sci . 32:2668; Rozhkova, A (2009) J. Chromatogr. A 1216:5989; Rea, JC et al . (2010) J. Pharm. Biomed. Anal . 54:317). En esta técnica, las proteínas que se cargan típicamente en una fase estacionaria de intercambio catiónico se eluyen al 0 incrementar el pH de la fase móvil. Recientemente se ha demostrado que un método de IEC de gradiente de pH (pH-IEC) con una ventana de pH relativamente amplia desde 6.0 a 9.5 no solo proporcionó mejor resolución que la IEC tradicional de gradiente de sal, sino también ofreció capacidad de 5 múltiples productos a través del análisis de 12 anticuerpos monoclonales (mAb) con ml de 7.3 a 9.0 (Farnan, D y Moreno, GT (2009) Anal . Chem. 81:8846). Que el método de pH-IEC también es altamente tolerante a la matriz de muestra con concentraciones iónicas variadas (NaCl 0 a 250 mM) y valores de pH (5.0 a 8.5) (Farnan, D y Moreno, GT (2009) Anal . Che . 81:8846). Adicionalmente, el método reportado de pH-IEC no se impactó evidentemente por la longitud de columna ni la química ni la separación rápida con una columna más corta se puede lograr para mejorar el rendimiento del análisis variante de proteínas. De acuerdo a un reporte reciente de validación (Rea, JC et al . (2010) J. Pharm. Biomed. Anal . 54:317), el método desarrollado de pH-IEC ha mostrado excelente precisión a diferentes concentraciones de cromatografía y buena linealidad a diferentes cargas de columna. De esta manera, el método reportado de pH-IEC es adecuado para la prueba de rutina en la industria de bioteenología.

[0004] A pesar de las muchas ventajas, el método reportado de pH-IEC se propuso principalmente para los mAbs con valores de pl en el intervalo estudiado de 7.3 a 9.0. El hecho que el perfil de elución de un mAb puede variar con diferentes composiciones y concentraciones de amortiguador, los valores de pH a los cuales los mAb eluyen indican que la IEC de gradiente de pH comprende un mecanismo de elución de gradiente de pH y concentración iónica, combinado (Farnan, D y Moreno, GT (2009) Anal . Chem. 81:8846). Esto también es consistente con el reporte de Anderson y colaboradores de la cromatografía de intercambio aniónico de gradiente de pH (pH-AIEC) (Anderson, DJ y Shan, L (2001) Clin. Chem. 47:128; Shan, L y Anderson, DJ (2001) J. Chromatogr. A 909:191; Shan, L y Anderson, DJ (2002) Anal . Chem. 74:5641). Con un número creciente de mAb en la fase de desarrollo en la industria bioteenológica, especialmente los mAb de ml más bajo que muestran vida media potencialmente más prolongada en base a estudios animales (Igawa, T. (2010) Protein Eng. Des. Sel . 23:385) existe la necesidad de expandir la aplicabilidad de los métodos de pH-IEC a un intervalo más amplio de los mAb terapéuticos.

[0005] Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo solicitudes y publicaciones de patente, se incorporan como referencia en su totalidad.

Breve Descripción de la Invención

[0006] La invención proporciona un método para analizar una composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes, el método que comprende a) unir el polipéptido y uno o más contaminantes a un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga, en donde el amortiguador de carga está a un primer pH y comprende una primera concentración iónica; b) eluir el polipéptido y uno o más contaminantes del material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se alteran en un gradiente de pH y la concentración iónica del amortiguador de elución se altera en gradiente de concentración iónica, donde el polipéptido y el uno o más contaminantes se separa por la combinación de gradiente de pH y gradiente de concentración iónica; c) detectar el polipéptido y el uno o más contaminantes. En algunas modalidades de la invención, se pueden analizar polipéptidos con ml que varían de 6.0 a 9.5 usando los mismos métodos.

[0007] En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo o inmunoadesina o fragmento de estos. En modalidades adicionales, el polipéptido es un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo. En aún modalidades adicionales, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En otras modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En otras modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. En algunas modalidades, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

[0008] En algunas modalidades de las modalidades anteriores, el contaminante es una variante del polipéptido. En modalidades adicionales, el contaminante es un producto de degradación del polipéptido.

[0009] En algunas modalidades, el polipéptido tiene un pl mayor de aproximadamente 9.0. En modalidades adicionales, el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio catiónico. En aún modalidades adicionales, el material de cromatografía de intercambio catiónico es un material de cromatografía sulfonado o un material de cromatografí carboxilado. [00010] En modalidades adicionales de cualquiera de las modalidades anteriores, el gradiente de pH es un gradiente lineal. En otras modalidades de cualquiera de las modalidades anteriores, el gradiente de pH es un gradiente gradual. En modalidades adicionales, el gradiente de pH comprende un incremento de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 11. En algunas modalidades de las modalidades anteriores, el gradiente de pH se genera usando uno o más amortiguadores. En modalidades adicionales, el uno o más amortiguadores es piperazina, imidazol, tris, fosfato, o CAPS. [00011] En algunas modalidades de cualquiera de las modalidades, el gradiente de concentración iónica es un gradiente lineal. En otras modalidades, el gradiente de concentración iónica es un gradiente gradu l. En algunas modalidades, el gradiente de concentración iónica comprende un incremento en la concentración de sal de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 200 mM. En modalidades adicionales, el gradiente de concentración iónica es un gradiente de NaCl, un gradiente de KC1, o un gradiente de Na2SO4. [00012] En algunas modalidades de las modalidades anteriores, el polipéptido tiene un ml menor de aproximadamente 7.0. En modalidades adicionales, el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio aniónico. En aún modalidades adicionales, el material de cromatografía de intercambio aniónico es un material de cromatografía de amina cuaternaria o un material de cromatografía de amina terciaria. En algunas modalidades, el gradiente de pH es un gradiente lineal. En otras modalidades, el gradiente de pH es un gradiente gradual. En algunas modalidades, el gradiente de pH comprende una disminución de aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH 5. En algunas modalidades, el gradiente de pH se genera usando uno o más amortiguadores. En aún modalidades adicionales, el uno o más amortiguadores es piperazina, imidazol o Tris. En algunas modalidades, el gradiente de concentración iónica es un gradiente lineal. En otras modalidades, el gradiente de concentración iónica es un gradiente gradual. En aún modalidades adicionales, el gradiente de concentración iónica comprende un incremento en la concentración de sal de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 200 mM. En algunas modalidades, el gradiente de concentración iónica es un gradiente de NaCl, un gradiente de KC1, o un gradiente de Na2SO4. [00013] En algunos aspectos, la invención proporciona un método para analizar una composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes, el método que comprende a) unir el polipéptido y uno o más contaminantes a un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga, en donde el amortiguador de carga está a un pH inicial y comprende una concentración iónica inicial; b) eluir el polipeptido y uno o más contaminantes del material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se altera en un gradiente de pH y en donde la concentración iónica del amortiguador de elución es esencialmente la misma como la concentración iónica inicial del amortiguador de carga, donde el polipéptido y el uno o más contaminantes se separan por la combinación de gradiente de pH a aproximadamente la concentración iónica inicial; c) detectar el polipéptido y el uno o más contaminantes. En algunas modalidades de la invención, los polipéptidos con pl que varían de 6.0 a 9.5 se pueden analizar usando esencialmente los mismos métodos. [00014] En algunas modalidades del aspecto anterior, el polipéptido es un anticuerpo o inmunoadesina o fragmento de esto. En modalidades adicionales, el polipéptido es un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo. En modalidades adicionales de las modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En otras modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En aún otras modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. En algunas modalidades, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. [00015] En algunas modalidades del aspecto anterior, el contaminante es una variante del polipéptido. En algunas modalidades, el contaminante es un producto de degradación del polipéptido. [00016] En algunas modalidades del aspecto anterior, el polipéptido tiene un ml mayor de aproximadamente 9.0. En modalidades adicionales, el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio catiónico. En aún modalidades adicionales, el material de cromatografía de intercambio catiónico es un material de cromatografía sulfonado o un material de cromatografía carboxilado. [00017] En algunas modalidades del aspecto anterior, el gradiente de pH es un gradiente lineal. En otras modalidades, el gradiente de pH es un gradiente gradual. En algunas modalidades, el gradiente de pH comprende un incremento de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 11. En algunas modalidades, el gradiente de pH se genera usando uno o más amortiguadores. En modalidades adicionales, el uno o más amortiguadores es piperazina, imidazol, tris, fosfato, o CAPS. [00018] En algunas modalidades de las modalidades anteriores, la concentración iónica del amortiguador de elución es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 100 mM. En modalidades adicionales, el amortiguador de elución comprende aproximadamente NaCl 0 mM a aproximadamente NaCl 100 mM, aproximadamente KCl 0 mM a aproximadamente KCl 100 mM, o aproximadamente Na2SO40 mM a aproximadamente Na2S04100 mM. [00019] En algunas modalidades del aspecto anterior, el polipéptido tiene un ml menor de aproximadamente 7.0. En modalidades adicionales, el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio aniónico. En aún modalidades adicionales, el material de cromatografía de intercambio aniónico es un material de cromatografía de amina cuaternaria o un material de cromatografía de amina terciaria. En algunas modalidades de las modalidades anteriores, el gradiente de pH es un gradiente lineal. En otras modalidades, el gradiente de pH es un gradiente gradual. En algunas modalidades de las modalidades 0 anteriores, el gradiente de pH comprende una disminución de aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH 5. En algunas modalidades, el gradiente de pH se genera usando uno o más amortiguadores. En modalidades adicionales, el uno o más amortiguadores es piperazina, imidazol o Tris. En algunas 5 modalidades, la concentración iónica del amortiguador de elución es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 100 mM. En modalidades adicionales, el amortiguador de elución comprende aproximadamente NaCl 10 M a aproximadamente NaCl 100 mM. 0 [00020] En algunas modalidades de cualquiera de las modalidades anteriores, el análisis es por cromatografía líquida de alto desempeño. [00021] En algunos aspectos, la invención proporciona un método para determinar la pureza de un polipéptido en una 5 composición que comprende analizar la composición de acuerdo con cualquiera de los métodos de las modalidades anteriores y determinar la relación del polipéptido a los contaminantes en la composición. [00022] En algunos aspectos, la invención proporciona un método para determinar la estabilidad de un polipéptido en una composición que comprende el polipéptido, el método que comprende, a) incubar la composición que comprende el polipéptido de 0°C a 40°C durante una a seis semanas, b) analizar la composición del paso a) por cualquiera de los métodos de las modalidades 1 a 63, y e) determinar la relación de variantes a polipéptido en la composición, en donde un incremento en la relación de variantes al polipéptido en la composición en comparación a una composición que no se incubó indica la degradación del polipéptido en la composición.

Breve Descripción de las Figuras [00023] La Figura 1 muestra los perfiles de heterogeneidad de carga en tres anticuerpos monoclonales con diferentes pl (mAbl, mAb2 y mAb3) obtenidos con un método de cromatografía de intercambio iónico (IEC) de gradiente de pH. [00024] La Figura 2A-2D muestra los perfiles de pH y concentración iónica a la salida de la columna (fig.2A) y la retro-presión de columna en el gradiente de pH (fig.2B) antes de la optimización y los perfiles de pH y concentración iónica a la salida de la columna (fig.2C) la retro-presión de columna en el gradiente de pH (fig.2D) después de la optimización. Los perfiles de pH modelados y experimentales y los perfiles de conductividad se muestran en las figuras 2A y 2C. [00025] La Figura 3A-3D muestra los cromatogramas de pH- IEC mediados por concentración iónica de mAbl (fig.3A) y mAb2 (fig.3B) obtenidos con cuatro diferentes concentraciones de amortiguador. El ancho completo a medio máximo (FWHM) del pico principal en los cromatogramas se grafican contra la concentración de amortiguador (fig.3C) y concentración de sal (fig.3D). 0 [00026] La Figura 4 muestra los perfiles de heterogeneidad de carga obtenidos con IEC de gradiente de pH mediada por concentración iónica de dieciséis anticuerpos monoclonales con ml que varían de 6.2 a 9.4. La inserción muestra una gráfica de los valores nominales de pl graficados contra pH 5 de elución. [00027] La Figura 5 muestra los cromatogramas obtenidos con la IEC de gradiente de pH mediada por concentración iónica de mAbl nativo (0 semanas) y mAbl térmicamente estresado (3 semanas y 6 semanas a 40°C). 0 [00028] La Figura 6 muestra los cromatogramas de mAbl con 10, 20, 50, 100 y 200 mg de carga de columna obtenidos con la IEC de gradiente de pH mediada por concentración iónica. [00029] La Figura 7 muestra el amortiguamiento a través de grupos funcionales amino de una solución amortiguadora de de 5 una solución amortiguadora de piperazina, imidazol, Tris (PIT) en un gradiente de pH semi-lineal de pH 6 a pH 9.5. [00030] La Figura 8 muestra cromatogramas de los mAb con ml que varían de pl 6.2 a pl 9.4 usando la IEC mediada por concentración iónica. La columna fue una Propac WCX-10, 4 x 250 mm. [00031] La Figura 9 muestra que se observan perfiles similares entre pH-IEC original y pH-IEC mediada por concentración iónica cuando se usa una columna de 4 x 250 mm. [00032] La Figura 10 muestra un gradiente de pH lineal 0 modelo de pH 6 a pH 11 usando fosfato para mantener la conductividad conforme incrementa el pH. [00033] La Figura 11A-11D son gráficas que muestran que los perfiles observados de pH (fig.llA) y conductividad (fig.llC) son consistentes con las predicciones modelo 5 (fig.HB y 11D). [00034] La Figura 12 muestra que son posibles corridas más cortas usando amortiguadores TPP. El cromatograma superior muestra resultados con una columna 4 x 50 mm Propac WCX-10HT con un gradiente de 16 minutos y el cromatograma de fondo 0 muestra resultados con una columna de 4 x 250 mm con un gradiente de 58 minutos. [00035] La Figura 13 es una gráfica que muestra el estado de carga de diferentes moléculas a diferente pH usando una herramienta de modelado que calcula la carga de anticuerpos 5 monoclonales con diferente pl. La carga en un anticuerpo monoclonal es neutral cuando cruza el eje X. La ventana de separación de pH-IEC adecuada corresponde a un intervalo de pH donde la curva es relativamente plana. [00036] La Figura 14 es una gráfica que muestra que un pl alta, las moléculas tienen menos tiempo para resolverse conforme se incrementa el pH. [00037] La Figura 15 muestra los resultados de un estudio para determinar la concentración óptima de sal para el efecto de protección de mejor carga de un anticuerpo con un ml > 9.0. Se probaron concentraciones de sal de 0 mM, 10 mM, 0 20 mM, 30 mM, 40 mM y 50 mM. [00038] La Figura 16 muestra los resultados de un estudio para determinar las concentraciones óptimas de sal para los efectos de protección de mejor carga para anticuerpos con pl que varían de 8.9 a 9.1. 5 [00039] La Figura 17 muestra los resultados de un estudio para determinar las concentraciones óptimas de sal para los efectos de protección de mejor carga para anticuerpos con un pl que varía de 7.6 a 8.7. [00040] La Figura 18 es una gráfica que muestra que la 0 adición de sal para proteger cargas adicionales mueve el estado de carga en una ventana adecuada de separación. [00041] La Figura 19 es una gráfica que muestra que el uso de un gradiente de pH poco profundo puede mejorar la resolución pico usando un MAb con un pl de 7.6. los 5 gradientes probados fueron como sigue: PIT (Tris 2.4 mM, imidazol 1.5 mM, piperazina 11.6 mM, pH 6-11); PIT mediada por sal (Tris 4 mM, imidazol 4 mM, piperazina 4 mM, pH 6-11, gradiente de NaCl 0-16 mM); TPP mediada por sal (Tris 5 mM, piperazina 5 mM, fosfato 5 mM, pH 6-11, gradiente de NaCl 0-30 mM); pH-IEC, TPP híbrida (Tris 5 mM, piperazina 5 mM, fosfato 5 mM, pH 6-9, NaCl 0 mM); TIC (Tris 5 mM , piperazina 5 mM, CAPS 5 mM, pH 6-9, NaCl 10 mM). Las corridas fueron de 20-22 minutos. [00042] La Figura 20 es una gráfica que muestra que el uso de un gradiente de pH poco profundo puede mejorar la resolución pico usando un MAb con un ml de 8.6-9.3. Los gradientes probados fueron como sigue: PIT (Tris 2.4 mM, imidazol 1.5 mM, piperazina 11.6 mM, pH 6-11); PIT mediada por sal (Tris 4 mM, imidazol 4 mM, piperazina 4 mM, pH 5-11, NaCl 16 mM); TPP mediada por sal (Tris 5 mM, piperazina 5 mM, fosfato 5 mM, pH 6-11, gradiente de NaCl 20 mM); TPP (Tris 5 mM, piperazina 5 mM, fosfato 5 mM, pH 6-9, NaCl 20 mM); TIC (Tris 5 mM, piperazina 5 mM, CAPS 5 mM, pH 7-10, NaCl 30 mM). Las corridas fueron de 20-22 minutos. [00043] La Figura 21 es una gráfica que muestra el uso de un gradiente de pH poco profundo puede mejorar la resolución pico usando un MAb con un pl de 9.0. Los gradientes probados fueron como sigue: PIT (Tris 2.4 mM, imidazol 1.5 mM, piperazina 11.6 mM, pH 6-11); PIT mediada por sal (Tris 4 mM, imidazol 4 mM, piperazina, 4 mM pH 5-11, NaCl 16 mM); TPP (Tris 5 mM, piperazina 5 mM, fosfato 5 mM , pH 6-11, gradiente de NaCl 30 mM); TPP (Tris 5 mM, piperazina 5 mM, fosfato 5 mM, pH 7-10, NaCl 20 mM); TIC (Tris 5 mM, piperazina 5 mM, CAPS 5 mM, pH 7-10, NaCl 30 mM). Las corridas fueron de 20-22 minutos. [00044] La Figura 22 es una gráfica que muestra que los tiempos de corrida de quince minutos son posibles. El Mab tuvo un ml de 8.8. Se muestran dos cromatogramas, uno con un gradiente de pH de 6 a 10 en NaCl 20 mM en 22 minutos, y uno con un gradiente de pH de 7 a 10 en NaCl 20 mM en 15 minutos. 0 [00045] La Figura 23 es una gráfica que muestra que los tiempos de corrida de quince minutos son posibles. El Mab tiene un pl de 9.0. Se muestran dos cromatogramas, uno con un gradiente de pH de 6 a 10 en NaCl 20 mM en 22 minutos, y uno con un gradiente de pH de 7 a 10 en NaCl 20 mM en 15 5 minutos. [00046] La Figura 24 es una gráfica que muestra cromatogramas traslapados de análisis duplicados de tres anticuerpos monoclonales a la condición diana. [00047] La Figura 25 es una gráfica que muestra 0 cromatogramas traslapados de MAb3 a diferentes condiciones de cromatografía. Se alinean picos principales. [00048] La Figura 26 es una gráfica de distribución que muestra el efecto de la concentración de sal en el desempeño de la cromatografía. Los círculos representan porcentaje de 5 pico principal, los diamantes representan porcentaje de variantes ácidas, x representa porcentaje de variantes básicos, los triángulos representan la resolución 1, y * representa la resolución 2. [00049] La Figura 27A-27D muestra gráficas de distribución que muestran los efectos de otros parámetros en el desempeño de la cromatografía. La parte superior izquierda muestra el efecto de la concentración de amortiguador (mM). La parte superior derecha muestra el efecto del pH de inicio. La parte izquierda de fondo muestra el efecto de la temperatura de columna en °C. La parte derecha de fondo muestra el efecto de la velocidad de flujo (ml/min).

Descripción Detallada de la Invención [00050] La invención proporciona métodos para analizar una composición que comprende un polipéptido y uno o más contaminantes, por ejemplo, variantes de polipéptido que comprende unir el polipéptido y uno o más contaminantes a un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga con un pH inicial y una concentración iónica inicial, eluir el polipéptido y uno o más contaminantes de la columna de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se altera por un gradiente de pH y la concentración iónica del amortiguador de elución se altera por un gradiente de concentración iónica tal que los polipéptidos y el uno o más contaminantes se eluyan del material de cromatografía como distintas entidades separadas. Los métodos de la invención se pueden usar para analizar polipéptidos con puntos isoeléctricos que no están en el intervalo de pH neutral. En algunas modalidades, los métodos se pueden usar para separar de manera efectiva polipéptidos con un ml mayor de 9 de los contaminantes. En otras modalidades, los métodos se pueden usar para la separación efectiva de polipéptidos con un pl menor de 7 de los contaminantes. En algunas modalidades, el método separa de manera efectiva uno o más contaminantes del polipéptido, en donde el polipéptido tiene un pl que varía de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 12 . En algunas modalidades, el método se puede usar para separar de manera efectiva uno o más contaminantes del polipéptido, en donde el polipéptido tiene un pl que varía de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 12. Los ejemplos de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. Los ejemplos de contaminantes incluyen, pero no se limitan a, variantes de anticuerpo tal como variantes de carga de anticuerpo. [00051] En otros aspectos, la invención proporciona métodos para analizar una composición que comprende un polipéptido o uno o más contaminantes, por ejemplo, variantes de polipéptido, que comprende unir el polipéptido y uno o más contaminantes a un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga con un pH inicial y una concentración iónica inicial, eluir el polipeptido y una o más contaminantes de la columna de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se altera por un gradiente de pH y la concentración iónica permanece esencialmente igual tal que los polipéptidos y el uno o más contaminantes eluyen del material de cromatografía como entidades separadas distintas. Los métodos de la invención se pueden usar para analizar polipéptidos con puntos isoeléctricos que no están en el intervalo de pH neutral. En algunas modalidades, los métodos se pueden usar para separar 0 de manera efectiva polipéptidos con un ml mayor de 9 con los contaminantes. En otras modalidades, los métodos se pueden usar para separar de manera efectiva polipéptidos con un pl menor de 7 de los contaminantes. Los ejemplos de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a anticuerpos y 5 fragmentos de anticuerpo. Los ejemplos de contaminantes incluyen pero no se limitan a, variantes de anticuerpo tal como variantes de carga de anticuerpo. [00052] En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para analizar composiciones que comprenden un 0 polipéptido y uno o más contaminantes, por ejemplo, variantes de polipéptido que comprende unir el polipéptido y uno o más contaminantes a un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga con un pH inicial y una concentración iónica inicial tal que el estado 5 de carga del polipéptido en la solución cae dentro de una ventana óptima de separación de intercambio iónico con gradiente de pH. El polipéptido y el uno o más contaminantes entonces se eluyen del material de cromatografía como distintas entidades separadas. [00053] En algunas modalidades de la invención, los contaminantes son variantes de carga de polipéptido que incluyen variantes ácidas, es decir, variantes con un tiempo de retención menor que aquel del pico principal en el modo de intercambio catiónico. Los ejemplos de variantes ácidas incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos donde se han 0 desamidado uno o más residuos de glutamina y/o asparagina. En algunas modalidades de la invención, los contaminantes son variantes de carga de polipéptido incluyendo variantes básicas, es decir, variantes con un tiempo de retención mayor que aquel del pico principal en el modo de intercambio 5 catiónico. Los ejemplos incluyen pero no se limitan a, variantes donde un residuo de ácido aspártico ha experimentado modificación a una porción de succinimida. [00054] En algunas modalidades, la invención proporciona métodos de para analizar una composición que comprende un 0 polipéptido y uno o más contaminantes, en donde esencialmente se pueden usar los mismos métodos para analizar polipéptidos con diferente ml. Por ejemplo, el método se puede usar para analizar polipéptidos con pl que varían de 6.0 a 9.5. En algunas modalidades, los 5 polipéptidos son anticuerpos, o fragmentos de estos. En algunas modalidades, los contaminantes son variantes de anticuerpo o variantes de fragmento de anticuerpo. En algunas modalidades, los contaminantes son variantes de carga de anticuerpo o variantes de carga de fragmentos de anticuerpo. En algunas modalidades, la invención proporciona un método para analizar composiciones de anticuerpo o fragmentos de anticuerpo para la presencia de variantes de carga [por ejemplo variantes ácidas y/o variantes ácidas) en donde el método se puede usar para analizar diferentes composiciones que comprenden un anticuerpo en donde el 0 anticuerpo tiene un ml que varía de 6.0 a 9.5.

I. Definiciones [00055] Los términos "polipéptido" o "proteína" se usan de manera indistinta en la presente para referirse a polipéptidos de aminoácidos de cualquier longitud. El 5 polipéptido puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácido que se ha modificado de manera natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces de 0 disulfuro, glicosilación, lipidación, cetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente marcador. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido 5 (incluyendo, por ejemplo aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la téenica. Los términos "polipéptido" y "proteína" como se usan en la presente abarcan específicamente anticuerpos. [00056] El término "variante de carga de polipéptido" como se usa en la presente se refiere a un polipéptido que se ha modificado de su estado nativo tal que se altera la carga del polipéptido. En algunos ejemplos, las variantes de carga con más ácidas que el polipéptido de origen; es decir, tienen un ml menor que el polipéptido de origen. En otros ejemplos, las variantes de carga son más básicas que el polipéptido de origen; es decir, tienen un pl mayor que el polipéptido de origen. Estas modificaciones se pueden manejar o ser el resultado de procesos naturales tal como oxidación, desamidación, procesamientos C-terminal de residuos de lisina, formación de piroglutamato N-terminal, y glicación. En algunos ejemplos, una variante de carga de polipéptido es una glicoproteína donde el glicano unido a la proteína se modifica tal que la carga de la glicoproteína se altera en comparación a la glicoproteína de origen, por ejemplo, por la adición de ácido siálico o sus derivados. Una "variante de carga de anticuerpo" como se usa en la presente es un anticuerpo o fragmento del mismo en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se ha modificado de su estado nativo tal que se altera la carga del anticuerpo o fragmento del mismo. [00057] Polipéptido "purificado" ( por ejemplo, anticuerpo o inmunoadhesina) significa que el polipéptido se ha incrementado en pureza, tal que existe en una forma que es más pura que la que existe en su ambiente natural y/o cuando inicialmente se sintetizó y/o amplificó bajo condiciones de laboratorio. La pureza es un término relativo y no significa necesariamente pureza absoluta. [00058] El término "antagonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe o neutraliza parcialmente o de manera completa una actividad biológica de un polipéptido nativo. De una manera similar, 0 el término "agonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica de un polipéptido nativo. Las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas incluyen específicamente anticuerpos agonistas o antagonistas o fragmentos de anticuerpo, 5 fragmentos o variaciones de secuencia de aminoácidos de polipéptidos nativos, etc. Los métodos para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido pueden comprender poner en contacto un polipéptido con una molécula agonista o antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o 0 más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido. [00059] Un polipéptido "que se une" a un antígeno de interés, por ejemplo una diana de antígeno de polipéptido asociado a tumor, es uno que se une al antígeno con 5 suficiente afinidad tal que el polipéptido es útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico al seleccionar como objetivo una célula o tejido que expresa el antígeno, y no reacciona de manera cruzada significativamente con otros polipéptidos. En estas modalidades, el grado de unión del polipéptido a un polipéptido "no objetivo" será menor de aproximadamente 10% de la unión del polipéptido a su polipéptido diana u objetivo particular como se determina por análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA). [00060] Con respecto a la unión de un polipéptido a su 0 molécula diana, el término "unión específica" o "se une e manera específica a" o es "específico par a" un polipéptido particular o un epítopo en una diana de polipéptido particular significa la unión que es medido diferente de una interacción no específica. La unión específica se puede 5 medir, por ejemplo, al determinar la unión de una molécula en comparación a la unión de una molécula de control, que en general es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión. Por ejemplo, la unión específica se puede determinar por competición con una molécula de control 0 que es similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana no marcada. En este caso, la unión específica se indica si la unión de la diana marcada a una sonda se inhibe completamente por la diana no marcada en exceso. [00061] El término "anticuerpo" en la presente se usa en 5 el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecífíeos (por ejemplo, anticuerpos biespecífíeos) formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo en tanto que exhiban la actividad biológica deseada. El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa de manera indistinta con anticuerpo en la presente. [00062] Los anticuerpos son moléculas de inmunoglobulina que se presentan de manera natural que tienen estructuras variables, todo en base al pliegue de inmunoglobulina. Por ejemplo, los anticuerpos tipo IgG tienen dos cadenas "pesadas" y dos cadenas "ligera" que están unidas por disulfuro para formar un anticuerpo funcional. Cada cadena pesada y ligera comprende por sí misma una región "constante" (C) y "variable" (V). Las regiones V determinan la especificidad de unión a antígeno del anticuerpo, en tanto que las regiones C proporcionan soporte estructural y función en interacciones no específicas al antígeno con efectores inmunitarios. La especificidad de unión al antígeno de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo es la capacidad de un anticuerpo para unirse de manera específica a un antígeno particular. [00063] La especificidad de unión a antígeno de un anticuerpo se determina por las características estructurales de la región V. La variabilidad no se distribuye de manera uniforme a través del intervalo de 110 aminoácidos de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten de tramos relativamente invariantes llamados regiones menores variables (FR) de 15-30 aminoácidos separadas por regiones más cortas de variabilidad extrema llamadas "regiones hipervariables" que son cada una de 9-12 aminoácidos de largo. Los dominios variables de las cadena pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro FR, que adoptan en su mayor parte una configuración de b-hoja, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman asas que se conectan a, y en algunos casos forman parte de, la estructura de b-hoja. Las 0 regiones hipervariables en cada cadena se mantienen conjuntamente en proximidad cercana por las FR, y con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological 5 Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Las regiones constantes no están comprendidos directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero reciben varias funciones efectoras, tal como participación del anticuerpo en la citotoxicidad 0 celular dependiente de anticuerpo (ADCC). [00064] Cada región V comprende típicamente tres regiones determinantes de complementariedad ( "CDR", cada una de las cuales contiene una "asa hipervariable"), y cuatro regiones menores variables. Un sitio de unión a anticuerpo, la unidad 5 estructural mínima requerida para unirse con afinidad sustancial a un antígeno particular deseado, por lo tanto incluirá típicamente las tres CDR, y al menos tres, preferentemente cuatro, regiones menos variables intercaladas entre para retener y presentar las CDR en la conformación apropiada. Cuatro anticuerpos de cadena, clásicos tiene sitios de unión a antígeno que se definen por los dominios VH y VL en cooperación. Ciertos anticuerpos, tal como anticuerpos de camello y tiburón, carecen de cadenas ligeras y dependen de los sitios de unión formados por solo cadenas pesadas. Las inmunoglobulinas manejadas de dominio individual se pueden preparar en las cuales los sitios de unión se forman por cadenas pesadas o cadenas ligeras solas, en ausencia de cooperación entre VH y VL. [00065] El término "variable" se refiere al hecho que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensivamente en secuencia entre los anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está uniformemente distribuida a todo lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables tanto en la cadena ligera como en los dominios variables de cadena pesada. Las regiones más altamente conservadas de los dominios variables se llaman las regiones menos variables (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativa pueden comprende cuatro FR, que adoptan principalmente una configuración de b-hoja, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman asas que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de b-hoja. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen conjuntamente en proximidad cercana por las FR y con la regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no están comprendidos directamente en la unión de un anticuerpo o un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tal como participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). [00066] El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables para la unión al antígeno. La región hipervariable puede comprender residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, de alrededor de aproximadamente los residuos 24-34(Ll), 50-56(L2) y 89-97(L3) en la VL, y alrededor de aproximadamente los residuos 31-35B(Hl), 50-65(H2) y 95-102(H3) en la VH (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- Edición. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos residuos de una "asa hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32(Ll), 50- 52(L2) y 91-96(L3) en la VL, y 26-32(Hl), 52A-55(H2) y 96- 101(H3) en la VH (Chothia y Lesk J. Mol Biol 196:901-917 (1987)). . [00067] "Menos variable" o de "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable como se definen en la presente. [00068] Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende de manera preferente la región de unión al antígeno del mismo. Los 10 ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; diacuerpos en tándem (taDb), anticuerpos lineales (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5,641,870, Ejemplo 2; Zapata et al, Protein Eng 8 (10):1057-1062 (1995)); anticuerpos de un 15 brazo, anticuerpos variables de dominio individual, minicuerpos, moléculas de anticuerpo de cadena individual; anticuerpos multiespecífíeos formados de fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, que incluyen pero no se limitan a, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFv) 4-Fc, di-scFv, bi-scFv, o 20 en tándem (di, tri)-scFv); y cogedores de células T bi- específicos de (BiTE). [00069] La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio individual 25 de unión al antígeno, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión al antígeno y aun es capaz de reticular el antígeno. [00070] "Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento de antígeno y de unión al antígeno. Esta región consiste de un dímero de una cadena pesada y dominio variable de cadena ligera en asociación estrecha no covalente. Es en esta configuración es que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero de VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, cada dominio variable individual (o la mitad de un Fv que comprende solo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y unirse al antígeno, aunque a una menor afinidad que el sitio completo de unión. [00071] El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el dominio constante de (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el término carboxi del dominio de cadena pasada CH1 que incluye una o más cisteínas de la región de bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab1 en el cual los residuos de cisteína de los dominios constantes tienen al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisternas de bisagra entre estos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo. [00072] Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (K) y lambda (l), en base a la secuencia de aminoácidos de sus dominios constantes. [00073] Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de estos se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponde a las diferentes clases de anticuerpos se llaman a, d, e, g, y m, respectivamente. Las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. [00074] Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena individual" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptido individual. En algunas modalidades, el polipáptido Fv comprende además un ligador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv ver Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994). [00075] El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos pequeños de anticuerpo con dos sitios de unión al antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera 0 (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH - VL). Al usar un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerzan a los dominios aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los 5 diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . EUA, 90:6444-6448 (1993). [00076] El término "anticuerpo multiespecífico" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente un anticuerpo 0 que tiene especificidad poliepitópica. Estos anticuerpos multiespecífíeos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL), en donde la unidad VHVL tiene especificidad polihepitópica, los 5 anticuerpos que tienen dos o más dominios VL y VH con cada unidad VHVL que se une a un epítopo diferente, los anticuerpos que tienen dos o más dominios variables individuales con cada dominio variable individual que se une a un diferente epítopo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo tal como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos biespecífíeos, triacuerpos, anticuerpos tri-funcionales, fragmentos de anticuerpo que se han enlazado de manera covalente o de manera no covalente. "Especificidad poliepitópica" se refiere a la capacidad para unirse de manera específica a dos o más diferentes epítopos 0 en la misma o diferente diana. "Monoespecífico" se refiere a la capacidad para unirse a solo un epítopo. De acuerdo a una modalidad, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo tipo IgG que se une a cada epítopo con una afinidad de 5 mM a 0.001 pM, 3 m a 0.001 pM, 1 mM a 0.001 M, 0.5 mM a 0.001 5 pM, o 0.1 mM a 0.001 pM. [00077] La expresión "anticuerpos de dominio individual" (sdAbs) o "anticuerpos de dominio variable individual (SVD)" se refiere en general a anticuerpos en los cuales un dominio variable individual (VH o VL) puede conferir unión al 0 antígeno. En otras palabras, el dominio variable individual no necesita interactuar con otro dominio variable a fin de reconocer el antígeno diana. Los ejemplos de anticuerpos de dominio individual incluyen aquellos derivados de camellos, (llamas y camellos) y peces cartilaginosos (por ejemplo, 5 tiburones nodrizas) y aquellos derivados de métodos recombinantes de humanos y anticuerpos de ratón (Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490; WO 2005/035572; WO 03/035694; Febs Lett (1994) 339:285-290; WO00/29004; WO 02/051870). [00078] El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, 0 excepto por posibles variantes que pueden surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, estas variantes que en general están presentes en cantidades menores. En contraste a preparaciones de anticuerpo policlonales que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra 5 diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante individual en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que no están contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificados "monoclonal" indica 0 el carácter del anticuerpo como que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no se va a considerar como que requiere la producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con 5 los métodos proporcionados en la presente se pueden elaborar por el método de hibridoma descrito primero por Kohler efc al . , Nature 256:495 (1975), o se pueden elaborar por métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las téenicas descritas en Clackson et al . , Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al . , J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991), a manera de ejemplo. [00079] Los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente en la presente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que corresponden a una clase o subclase particular de anticuerpo, en tanto que el resto de la cadena es idéntica con u homologa con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que corresponden a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de estos anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; Morrison et al . , Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés incluyen en la presente anticuerpos "primatizados" que comprende secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo Monos del Viejo Mundo, tal como babuinos, rhesus o cynomolgus) y secuencias de regiones constantes humanas (Patente de los Estados Unidos No.5,693,780). [00080] Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los cuales los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad, y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de regiones menos variables (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Adicionalmente, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las asas hipervariables corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana, excepto por las sustituciones de FR como se señala anteriormente. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales ver Jones et al . , Nature 321:522-525 (1986); Riech ann et al . , Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992). [00081] Los propósitos de la presente, un "anticuerpo intacto" es uno que comprende dominios variables pesados y ligeros así como una región Fe. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo dominios constantes de secuencia nativa humana) o una variante de secuencia de aminoácidos de los mismos. De manera preferente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras. [00082] Los "anticuerpos nativos" usualmente son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltones, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está enlazada a una cadena pesada por un enlace covalente de disulfuro, en tanto que el número de enlace de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro, intracadena, regularmente separados. Cada cadena pesada tiene un extremo un dominio variable (VH) seguido por varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada; y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos de aminoácido particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. [00083] Un "anticuerpo desnudo" es un anticuerpo (como se define en la presente) que no está conjugado a una molécula heteróloga, tal como una porción citotóxica o radiomarca. [00084] En algunas modalidades, las "funciones efectoras" del anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o región Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras el anticuerpo incluyen: citotoxicidad dependiente de complemento y unión a Clq; unión al receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; reducción de la expresión de receptores de superficie celular. [00085] La "citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo" y "ADCC" se refiere a una reacción mediada por células en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fe (FcRs) (por ejemplo células Aniquiladoras Naturales (NK), neutrófilos, y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y provocan subsiguientemente la lisis de la célula diana. Las células primarias para mediar la ADCC, las células NK, expresan solo FcyRIII, en donde los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en las células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para valorar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo in vitro de ADCC, tal como aquel descrito en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,500,362 o 5,821,337. Las células efectoras útiles 0 para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células Aniquiladoras Naturales (NK). De manera alternativa o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede valorar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como aquel descrito en 5 Clynes et al., Proc. Nati . Acad. Sci . (EUA) 95:652-656 (1998). [00086] Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan una o más FcR y realizan funciones efectoras. En algunas modalidades, las células expresan al menos FcyRIII y 0 llevan a cabo la función efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células Aniquiladoras Naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; con las PBMC y las células NK que 5 son las preferidas. [00087] La "citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula para lisar una diana en la presencia de complemento. La ruta de activación de complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema de complemento (Clq) a una molécula ( por ejemplo polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo)) vuelto complejo con un antígeno cognado. Para valorar la activación de complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al . , J. Immunol . Methods 202:163 (1996). [00088] Los términos "receptor Fe" o "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. En algunas modalidades, el FcR es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno que se une al anticuerpo tipo IgG (un receptor gamma) e incluye los receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, ynd FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente empalmadas de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activador") y FcyRIIB (un receptor "inhibidor"), que tiene secuencias similares de aminoácido que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activación a base de tirosina de inmunoreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina de inmunoreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico. (ver Daeron, Annu . Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al . , Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al . , J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo aquellos que se identifiquen en el futuro, se abarcan en la presente por el término "FcR". El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternales al feto (Guyer et al . , J. I munol . 117:587 (1976) y Kim et al . , J. Immunol . 24:249 (1994)). 0 [00089] Los "contaminantes" se refieren a materiales que son diferentes del producto de polipéptido deseado. En algunas modalidades de la invención, los contaminantes incluyen variantes de carga del polipéptido. En algunas modalidades de la invención, los contaminantes incluyen 5 variantes de carga de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En otras modalidades de la invención, el contaminante incluye, sin limitación: materiales de célula hospedadora, tal como CHOP; proteína A blanqueada; ácido nucleico; una variante, fragmento, agregado o derivado del 0 polipéptido deseado; otro polipéptido; endotoxina; contaminante viral; componente de medio de cultivo celular, etc. En algunos ejemplos, el contaminante puede ser una proteína de célula hospedadora (HCP) de, por ejemplo pero no limitado a, una célula bacteriana tal como una célula de E. 5 coli , una célula insectil, una célula procariótica, una célula eucariótica, una célula de levadura, una célula de mamífero, una célula aviar, una célula fúngica. [00090] Como se usa en la presente, el término "inmunoadhesina" designa moléculas tipo anticuerpo que combinan la especificidad de unión de un polipéptido heterólogo con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es diferente del sitio de unión y reconocimiento de antígeno de 0 un anticuerpo (es decir, es "heterólogo"), y un secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina es típicamente una secuencia contigua de aminoácidos que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina se puede obtener de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3, o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e lgA-2), igE, igD o igM. [00091] Como se usa en la presente "esencialmente el 0 mismo" indica que un valor o parámetro no se ha alterado por un efecto significativo. Por ejemplo, una concentración iónica de una fase móvil de cromatografía a la salida de la columna es esencialmente la misma como la concentración iónica inicial de la fase móvil si la concentración iónica 5 no ha cambiado de manera significativa. Por ejemplo, una concentración iónica a la salida de la columna que está dentro de 10%, 5% o 1% de la concentración iónica inicial es esencialmente la misma como la concentración iónica inicial. [00092] La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro incluye en la presente (y describe) variaciones que se dirigen a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X". [00093] Como se usa en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "o", y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Se entiende que los aspectos y variaciones de la invención descrita en la presente incluyen "que consiste" y/o "que consiste esencialmente de" aspectos y variaciones.

II. Metodos de Cromatografía [00094] En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para analizar composiciones que comprenden un polipéptido y uno o más contaminantes, por ejemplo variantes de carga de polipéptido, que comprende unir el polipéptido y uno o más contaminantes a un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga con un pH inicial y con una concentración iónica inicial, eluir el polipéptido y uno o más contaminantes de la columna de intercambio iónico usando un amortiguador de elusión en donde el pH del amortiguador de elusión se altera por un gradiente de pH y la concentración iónica del amortiguador de elución se altera por un gradiente de concentración iónica tal que los polipéptido y el uno o más contaminantes eluyen del material de cromatografía como distintas entidades separadas. [00095] En otros aspectos, la invención proporciona métodos para analizar composiciones que comprenden un polipéptido y uno o más contaminantes, por ejemplo variantes de polipéptido, que comprende unir el polipéptido y uno o más contaminantes a un material de cromatografía de 0 intercambio iónico usando un amortiguador de carga con un pH inicial y una concentración iónica inicial, eluir el polipéptido y el uno o más contaminantes de la columna de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se altera por un 5 gradiente de pH y la concentración iónica del amortiguador de elución se altera por un gradiente de concentración iónica tal que los polipéptidos y el uno o más contaminantes eluyen del material de cromatografía como distintas entidades separadas. 0 [00096] En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el material de cromatografía es un material de intercambio catiónico. En algunas modalidades, el material de intercambio catiónico es una fase sólida que está cargada de manera negativa y tiene 5 cationes libres para intercambio con cationes en una solución acuosa basada sobre o a través de la fase sólida.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el material de intercambio catiónico puede ser una membrana, un monolito o una resina. En algunas modalidades, el material de intercambio catiónico puede ser una resina. El material de intercambio catiónico puede comprender un grupo funcional de ácido carboxílico o un grupo funcional de ácido sulfónico tal como, pero no limitado a, sulfonato, carboxílico, ácido carboxilmetilsulfónico, sulfoisobutilo, sulfoetilo, 0 carboxilo, sulfopropilo, sulfonilo, sulfoxietilo, u ortofosfato. En algunas modalidades de lo anterior, el material de cromatografía de intercambio catiónico es una columna de cromatografía de intercambio catiónico. En algunas modalidades, un material de cromatografía de 5 intercambio catiónico se usa para un polipéptido, por ejemplo y el anticuerpo o fragmento del mismo, con un pl mayor de aproximadamente 9. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento del mismo puede tener un ml de 9-10, 9-11, 10-11, 9-12, 10-12, u 11-12. 0 [00097] En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el material de cromatografía es un material de intercambio aniónico. En algunas modalidades, el material de cromatografía de intercambio aniónico es una fase sólida que está cargada de 5 manera positiva y tiene aniones libres para intercambio con aniones en una solución acuosa basada sobre o a través de la fase sólida. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el material de intercambio aniónico puede ser una membrana, un monolito, o resina. En una modalidad, el material de intercambio aniónico puede ser una resina. En algunas modalidades, el material de intercambio aniónico puede comprender una amina primaria, una amina secundaria, una amina terciaria o una amina cuaternaria un grupo funcional de ion de amonio cuaternario, un grupo funcional de poliamina, o un grupo funcional de dietilaminoetilo. En algunas modalidades de lo anterior, el material de cromatografía de intercambio aniónico es una columna de cromatografía de intercambio aniónico. En algunas modalidades, un material de cromatografía de intercambio aniónico se usa para un polipéptido, por ejemplo y anticuerpo o fragmento del mismo, con un ml menor de aproximadamente 7. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento del mismo puede tener un pl de 6-7, 5-7, 5-6, 4-7, 4-6, o 4-5. [00098] En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el material de intercambio iónico puede utilizar un material convencional de cromatografía o un material de cromatografía convectiva. Los materiales de cromatografía convencionales incluyen, por ejemplo, materiales perfusivos ( por ejemplo, resina de poli(estireno-divinilbenceno)) y materiales difusivos ( por ejemplo, resina de agarosa reticulada). En algunas modalidades, la resina de poli(estireno-divinilbenceno) puede ser resina Porosa. En algunas modalidades, la resina de agorosa reticulada puede ser resina de flujo rápido de sulfopropil-Sefarosa ("SPSFF"). El material de cromatografía convectiva puede ser una membrana ( por ejemplo, poliétersulfona) o material monolítico ( por ejemplo polímero reticulado). La membrana de poliétersulfona puede ser Mustang. El material monolítico de polímero reticulado puede ser poli(dimetacrilato de glicidil- metacrilato-co-etileno-dimetacrulato) reticulado. [00099] En algunas modalidades de cualquiera de los métodos de la invención, el material de cromatografía es una columna de cromatografía; por ejemplo una columna de cromatografía de intercambio catiónico o una columna de cromatografía de intercambio aniónico. En algunas modalidades, la columna de cromatografía se usa para cromatografía líquida. En algunas modalidades, la columna de cromatografía se usa para cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC). En algunas modalidades, la columna de cromatografía es una columna de cromatografía de HPLC; por ejemplo, una columna de HPLC de intercambio catiónico o una columna de HPLC de intercambio aniónico. [000100] Los ejemplos de materiales de intercambio catiónico se conocen en la téenica e incluyen, pero no se limitan a, Mustang S, Sartobind S, S03 Monolith, S Ceramic HyperD, Poros XS, Poros HS50, Poros HS20, SPSFF, SP- Sepharose XL (SPXL), CM Sepharose Fast Flow, Capto S, Fractogel Se HiCap, Fractogel S03, o Fractogel C00. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el material de intercambio catiónico es Poros HS50. En algunas modalidades, la resina Poros HS puede ser partículas de Poros HS 50 mm o Poros HS 20 pm. Los ejemplos de columna de cromatografía de intercambio catiónico para el uso en los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a ProPac WCX-10 y ProPac WCX-10HT. [000101] Los ejemplos de materiales de intercambio aniónico se conocen en la téenica e incluyen, pero no se limitan a Poros HQ 50, Poros PI 50, Poros D, Mustang Q, Q Sepharose FF, y DEAE Sepharose. Los ejemplos de columnas de cromatografía de intercambio aniónico para el uso en los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a Dionex ProPac 10 SAX y Tosoh GSKgel Q STAT 7 mM WAX. [000102] Un procedimiento de HPLC de ejemplo que puede usarse para los métodos de la invención es como sigue; sin embargo, los métodos de la invención no se considera que están unidos por estos procedimientos. Se adicionan muestras al automuestreador y se refrigeran (5 ± 3°C). Las columnas se colocan en el compartimiento de columna y se puede emplear una característica de control de temperatura para mantener la temperatura del compartimiento dentro de un intervalo estrecho (±1°C) del punto de ajuste durante el análisis. El efluente de columna se monitorea a 280 nm. [000103] Las muestras se diluyen con fase móvil a una concentración objetivo de polipéptido de aproximadamente 1-2 mg/mL. En algunas modalidades, el polipéptido se puede digerir con carboxipeptidasa B (CpB), adicionar en una relación de 1:100 (p/p) e incubar a 37°C durante 20 min. Las muestras se pueden almacenar a 5°C hasta el análisis. [000104] El instrumento puede incluir una bomba de gradiente cuaternario de baja presión, un auto-muestreador 0 de separación rápida con capacidad de control de temperatura, un compartimiento de columna térmico-controlado y un detector UV de arreglo de diodos. A la salida del detector, se puede conectar un monitor de conductividad y pH PCM-3000 para recolectar los datos de pH conductividad en 5 tiempo real. Se puede realizar el análisis de datos, la adquisición de datos y control de instrumentos; por ejemplo, al usar el software Thermo Scientific Dionex Chromeleon, versión 6.8. [000105] Los ejemplos no limitantes de preparaciones de 0 fase móvil son como sigue. Las soluciones amortiguadoras concentradas individuales de tris e imidazol se preparan a 1.0 M y una solución de CAPS se prepara a una concentración de 0.1 M, sin ajustar el valor de pH y almacenar a temperatura ambiente. Los componentes individuales se 5 diluyen a una concentración final de 10 mM en aproximadamente 90% del volumen objetivo usando agua desionizada y dejando mezclar. Una vez que la solución se extingue al volumen final, la mezcla se divide en dos alícuotas iguales. [000106] Los valores de pH de los amortiguadores se ajustan por ácido clorhídrico a 6.0 (Amortiguador A) e hidróxido de sodio a 11.0 (Amortiguador B). El cloruro de sodio se prepara como una solución 0.1 M con agua desionizada (Amortiguador C). Se dispensa agua MilliQ (18 MOhms) en un recipiente separado (Amortiguador D). Todas las fases 0 móviles entonces se filtran individualmente a través de un filtro de nailon de 0.2 mm antes del uso. [000107] Un ejemplo no limitante de la cromatografía de intercambio catiónico es como sigue. Las muestras de anticuerpo monoclonal se diluyen a 1 mg/mL con una mezcla 5 1:1 de los amortiguadores A y D y se mantienen a 5±3°C en el auto-muestreador. Se coloca una columna Propac WCX-10HT, 4 x 50 mm en el compartimiento de columna con el ajuste de temperatura a 40±l°C. Para cada corrida cromatográfica, se inyectan 20 mL de proteína (20 pg). La velocidad de flujo de 0 fase móvil es 1.0 mL/min. Las proteínas se detectan por absorbancia ultravioleta (UV) a 280 nm. [000108] En algunos ejemplos, se establece un gradiente híbrido de pH al usar un gradiente cuaternario formado en la bomba cuaternaria usando los amortiguadores A, B, C y D. 5 Este arreglo ofrece la flexibilidad de ajustar 1) el pH de inicio y final, usando los amortiguadores A y B y 2) la cantidad de sal para cada gradiente, usando los amortiguadores C y D. Por ejemplo, un gradiente de pH de 6 a 10, con una concentración constante de sal de 10 mM, se establece por un incremento del amortiguador B desde 0 a 40%, en tanto que se mantienen los amortiguadores C y D a 10% y 40%, respectivamente. Los ejemplos de gradientes híbridos se proporcionan en la Tabla 2 en los ejemplos posteriores. [000109] Los varios amortiguadores que se pueden emplear dependiendo, por ejemplo, del pH deseado del amortiguador, la conductividad deseada del amortiguador, las características de la proteína de interés, y el método analítico. [000110] La elución, como se usa en la presente, es la remoción del producto, por ejemplo polipéptido, y/o contaminantes del material de cromatografía. El amortiguador de elución es el amortiguador usado para eluir el polipéptido u otros productos de interés de un material de cromatografía. En algunas modalidades, el amortiguador de elución es parte de la fase móvil de la cromatografía. En algunas modalidades, la composición que comprende el polipéptido y los contaminantes se aplica al material de cromatografía como parte de la fase móvil. La fase móvil entonces se altera para permitir la separación del polipéptido de los contaminantes conforme al polipéptido y los contaminantes se eluyen del material de cromatografía. En muchos casos, un amortiguador de elución tiene diferentes características físicas que el amortiguador de carga. Por ejemplo, el amortiguador de elución puede tener un pH diferente que el amortiguador de carga y/o una concentración iónica diferente el amortiguador de carga. En algunas modalidades, los polipéptidos y contaminantes eluyen del material de cromatografía al alterar el pH y la concentración iónica del amortiguador de elución. En algunas modalidades el pH del amortiguador de elución y la concentración iónica del amortiguador de elución se incrementan durante el transcurso de la elución en comparación al amortiguador de carga. En algunas modalidades el pH del amortiguador de elución se incrementa durante el transcurso de la elución en comparación al amortiguador de carga y la concentración iónica del amortiguador de elución permanece esencialmente igual. [000111] En algunas modalidades de la invención, se aplica un polipéptido con un ml > 9 a un material de cromatografía de intercambio catiónico y el polipéptido se eluye del material de cromatografía de intercambio catiónico al incrementar el pH y la concentración iónica de la fase móvil de la cromatografía. En algunas modalidades de la invención, se aplica un polipéptido con un l > 9 a un material de cromatografía de intercambio catiónico y el polipéptido se eluye del material de cromatografía de intercambio catiónico al incrementar el pH de la fase móvil de la cromatografía en tanto que se mantiene la concentración iónica de la fase móvil. [000112] En algunas modalidades de la invención, se aplica un polipéptido con un ml <7 a un material de cromatografía de intercambio aniónico y el polipéptido se eluye del material de cromatografía de intercambio aniónico al disminuir el pH de la fase móvil de la cromatografía y al incrementar la concentración iónica de la fase móvil de la cromatografía. En algunas modalidades de la invención, se aplica un polipéptido con un pl <7 a un material de cromatografía de intercambio aniónico y el polipéptido se eluye del material de cromatografía de intercambio aniónico al disminuir el pH de la fase móvil de la cromatografía en tanto que se mantiene la concentración iónica de la fase móvil. [000113] En algunos aspectos de cualquiera de las modalidades anteriores, el pH del amortiguador de elución cambió del amortiguador de carga por gradiente lineal o por gradiente*gradual. [000114] En algunas modalidades de la invención, el polipéptido se eluye del material de cromatografía al incrementar el pH del amortiguador de elución en la fase móvil. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución se incrementa desde aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 11. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución se incrementa desde aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 9. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución se incrementa desde aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 10. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución se incrementa desde aproximadamente pH 6 a aproximadamente H 11. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución se incrementa desde aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 9. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución se incrementa desde aproximadamente pH 7 a aproximadamente 0 pH 10. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución se incrementa desde aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 11. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución se incrementa desde aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH 9. En algunas modalidades, el pH 5 del amortiguador de elución se incrementa desde aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH 10. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución se incrementa desde aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH 11. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución se 0 incrementa desde aproximadamente pH 9 a aproximadamente pH 11. En cualquiera de las modalidades anteriores, el incremento del pH del amortiguador de elución se combina con un incremento en la concentración iónica del amortiguador de elución. En otras modalidades de cualquiera de las 5 modalidades anteriores, el pH del amortiguador de elución se incrementa pero la concentración iónica del amortiguador de elución permanece esencialmente igual. En cualquiera de las modalidades anteriores, el gradiente de pH se establece durante más de cualquiera de aproximadamente 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 40 min, 45 min, 50 min, 55 min, o 60 min. En cualquiera de las modalidades anteriores, el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio catiónico. En cualquiera de las modalidades anteriores, el polipéptido tiene un ml >9. En cualquiera de las modalidades anteriores, el polipéptido es un anticuerpo o fragmento del mismo. [000115] En algunas modalidades de la invención, el polipéptido se eluye del material de cromatografía al disminuir el pH del amortiguador de elución en la fase móvil. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución disminuye de aproximadamente pH 9 a aproximadamente pH 5. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución disminuye de aproximadamente pH 9 a aproximadamente pH 6. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución disminuye desde aproximadamente pH 9 a aproximadamente pH 7. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución disminuye desde aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH 5. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución disminuye desde aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH 6. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución disminuye desde aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH 7. En algunas modalidades, el pH del amortiguador de elución disminuye desde aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 5. En cualquiera de las modalidades anteriores, la disminución en el pH del amortiguador de elución se combina con un incremento en la concentración iónica del amortiguador de elución. En otras modalidades de cualquiera de las modalidades anteriores, el pH del amortiguador de elución se disminuye pero la concentración iónica del amortiguador de elución permanece esencialmente igual. En cualquiera de las modalidades anteriores, el gradiente de pH se establece durante más de cualquiera de aproximadamente 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 40 min, 45 min, 50 min, 55 min, o 60 min. En cualquiera de las modalidades anteriores, el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio aniónico. En cualquiera de las modalidades anteriores, el polipéptido tiene un ml <7. En cualquiera de las modalidades anteriores, el polipéptido es un anticuerpo o fragmento del mismo. [000116] Se puede preparar un amortiguador de elución con un pH específico usando amortiguadores conocidos en la téenica. Los ejemplos de amortiguadores incluyen pero no se limitan a piparazina, imidazol, Tris, fosfato, y ácido N-ciclohexil-3-aminopropanosulfónico (CAPS). En algunas modalidades, se puede ajustar el pH del amortiguador, por ejemplo, al adicionar HCl para hacer más ácido al amortiguador o adicionar NaOH para hacer más básico al amortiguador. En algunas modalidades, el amortiguador de elución comprende una combinación de amortiguadores. En algunas modalidades, el amortiguador de elución comprende una combinación de piperazina, imidazol y Tris (por ejemplo, un amortiguador PIT). En algunas modalidades, el amortiguador de elución comprende piperazina 11.6 mM, imidazol 1.5 mM y Tris 2.4 mM. En algunas modalidades, el amortiguador de elución comprende piperazina 4 mM, imidazol 4 mM y Tris 4 mM. En algunas modalidades de la invención, un amortiguador de elución que comprende una combinación de piperazina, imidazol y Tris se usa en la fase móvil de la cromatografía de intercambio catiónico de un polipéptido. En algunas modalidades de la invención, un amortiguador de elución que comprende una combinación de piperazina, imidazol y Tris se usa en la fase móvil de la cromatografía de intercambio catiónico de un polipéptido con un ml >9. En algunas modalidades de la invención, un amortiguador de elución que comprende una combinación de piperazina, imidazol y Tris se usa en la fase móvil de la cromatografía de intercambio catiónico de un anticuerpo. En algunas modalidades de la invención, un amortiguador de elución que comprende una combinación de piperazina, imidazol y Tris se usa en la fase móvil de cromatografía de intercambio catiónico de un anticuerpo con un pl > 9. En algunas modalidades de la invención, un amortiguador de elución que comprende una combinación de piperazina, imidazol y Tris se usa en la fase móvil de la cromatografía de intercambio aniónico de un polipéptido. En algunas modalidades de la invención, un amortiguador de elución que comprende una combinación de piperazina, imidazol y Tris se usa en la fase móvil de cromatografía de intercambio aniónico de un polipéptido con un ml <7. En algunas modalidades de la invención, un amortiguador de elución que comprende una combinación de piperazina, imidazol y Tris se usa en la fase móvil de la cromatografía de intercambio aniónico de un anticuerpo. En algunas modalidades de la invención, un 0 amortiguador de elución que comprende una combinación de piperazina, imidazol y Tris se us en la fase móvil de la cromatografía de intercambio aniónico de un anticuerpo con un pl <7. En algunas modalidades, el amortiguador de elución comprende una combinación de Tris, piperazina y fosfato (por 5 ejemplo, un amortiguador TPP). En algunas modalidades, el amortiguador de elución comprende Tris 5 mM, piperazina 5 mM y fosfato 5 mM. En algunas modalidades, el amortiguador de elución comprende Tris 10 mM, piperazina 10 mM y fosfato 10 mM. En algunas modalidades de la invención, un amortiguador 0 de elución que comprende una combinación de Tris,piperazina y fosfato se usa en la fase móvil de la cromatografía de intercambio catiónico de un polipéptido. En algunas modalidades de la invención, un amortiguador de elución que comprende una combinación de Tris, piperazina y fosfato se 5 usa en la fase móvil de la cromatografía de intercambio catiónico de un polipéptido con un ml >9. En algunas modalidades de la invención, un amortiguador de elución que comprende una combinación de Tris, piperazina y fosfato se usa en la fase móvil de la cromatografía de intercambio catiónico de un anticuerpo. En algunas modalidades de la invención, un amortiguador de elución que comprende una combinación de Tris, piperazina y fosfato se usa en la fase móvil de la cromatografía de intercambio catiónico de un anticuerpo con un pl >9. En algunas modalidades, el amortiguador de elución comprende una combinación de Tris, imidazol y CAPS (por ejemplo, un amortiguador TIC). En algunas modalidades, el amortiguador de elución comprende Tris 5 mM, imidazol 5 mM y CAPS 5 mM. En algunas modalidades de la invención, un amortiguador de elución que comprende una combinación de Tris, imidazol y CAPS se usa en la fase móvil de la cromatografía de intercambio catiónico de un polipéptido. En algunas modalidades de la invención, un amortiguador de elución que comprende una combinación de Tris, imidazol y CAPS se usa en la fase móvil de la cromatografía de intercambio catiónico de un polipéptido con un pl >9. En algunas modalidades de la invención, un amortiguador de elución que comprende una combinación de Tris, imidazol y CAPS se usa en la fase móvil de la cromatografía de intercambio catiónico de un anticuerpo. En algunas modalidades de la invención, un amortiguador de elución que comprende una combinación de Tris, imidazol y CAPS se usa en la fase móvil de la cromatografía de intercambio catiónico de un anticuerpo con un ml >9. [000117] En algunas modalidades de la invención, el polipéptido se eluye del material de cromatografía al incrementar el pH del amortiguador de elución como se describe anteriormente, y al incrementar la concentración iónica del amortiguador de elución en la fase móvil, formando de este modo un gradiente de pH y un gradiente de concentración iónica. En algunas modalidades, la concentración iónica del amortiguador de elución se incrementa al incrementar la concentración de sal de la fase móvil de la cromatografía. En otras modalidades de la invención, el polipéptido se eluye del material de cromatografía al incrementar del pH del amortiguador de elución donde la concentración iónica del amortiguador de elución permanece esencialmente igual durante el transcurso de la elución al mantener la concentración de sal durante el transcurso de la elución. En algunas modalidades, la concentración de sal se elige tal que el estado de carga del polipéptido proporciona una ventana óptima de separación por cromatografía de intercambio iónico por gradiente de pH. El estado de carga del polipéptido se puede determinar al modelar procedimientos conocidos en la téenica. Los ejemplos de sales incluyen, pero no se limitan a NaCl, KC1 y Na2SO4. [000118] En algunas modalidades, el gradiente de concentración iónica es un gradiente de sal. En algunas modalidades, el gradiente de sal es un gradiente de aproximadamente sal 0 mM a aproximadamente sal 200 mM. En algunas modalidades, el gradiente de sal es cualquiera de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 100 mM, 0 mM a aproximadamente 60 mM, 0 mM a aproximadamente 50 mM, 0 mM a aproximadamente 40 mM, 0 mM a aproximadamente 30 mM, 0 mM a aproximadamente 20 mM, 0 mM a aproximadamente 10 mM, 10 mM a aproximadamente 200 mM, 10 M a aproximadamente 100 mM, 10 mM a aproximadamente 50 mM, 10 mM a aproximadamente 40 M, 10 mM a aproximadamente 30 mM, 10 mM a aproximadamente 20 0 mM, 20 mM a aproximadamente 200 mM, 20 mM a aproximadamente 100 mM, 20 mM a aproximadamente 50 mM, 20 mM a aproximadamente 30 mM, 30 mM a aproximadamente 200 mM, 30 mM a aproximadamente 100 mM, y 30 mM a aproximadamente 50 mm. [000119] En algunas modalidades de las modalidades 5 anteriores, el polipéptido y/o el uno o más contaminantes se eluyen del material de cromatografía por una combinación de gradiente de pH y gradiente de concentración iónica. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 5 a pH 10.8 y el gradiente de concentración iónica es de sal 0 mM a sal 0 16 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 6 a pH 11 y el gradiente de concentración iónica es de sal 0 mM a sal 60 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 5 a pH 9.5 y el gradiente de concentración iónica es de sal 0 mM a sal 16 mM. En algunas modalidades, el 5 gradiente de pH es de pH 5 a pH 9.5 y el gradiente de concentración iónica es de sal 0 mM a sal 30 mM. En cualquiera de las modalidades anteriores, la sal es NaCl, KC1 o Na2SO4. En cualquiera de las modalidades anteriores, el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio catiónico. En cualquiera de las modalidades anteriores, el polipéptido tiene un ml >9. En cualquiera de las modalidades anteriores, el polipéptido es un anticuerpo con un pl >9. [000120] En algunas modalidades de la invención, un polipéptido y/o uno o más contaminantes se analizan por cromatografía de intercambio iónico donde el polipéptido y/o uno o más contaminantes se eluyen del material de cromatografía por una combinación de gradiente de pH y gradiente de concentración iónica. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 5 y el gradiente de concentración iónica es de sal 0 mM a sal 25 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 5 y el gradiente de concentración iónica es de sal 0 mM a sal 100 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 5 y el gradiente de concentración iónica es de sal 0 mM a sal 200 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 5 y el gradiente de concentración iónica es de sal 0 mM a sal 300 mM. En cualquiera de las modalidades anteriores, la sal es NaCl, KCl o Na2S0. En cualquiera de las modalidades anteriores, el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio aniónico. En cualquiera de las modalidades anteriores, el polipeptido tiene un ml <7. En cualquiera de las modalidades anteriores, el polipéptido es un anticuerpo con un pl <7. [000121] En algunas modalidades de la invención, un polipéptido y/o uno o más contaminantes se analizan por cromatografía de intercambio iónico donde el polipéptido y/o uno o más contaminantes se eluyen del material de cromatografía por gradiente de pH donde la concentración iónica de la fase móvil permanece esencialmente igual durante la elución. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 6 a pH 11 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 10 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 6 a pH 11 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 20 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 6 a pH 11 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 30 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 6 a pH 11 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 40 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 6 a pH 11 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 50 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 6 a pH 10 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 10 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 6 a pH 10 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 20 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 6 a pH 10 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 30 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 6 a pH 10 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 40 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 6 a pH 10 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 50 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 6 a pH 9 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 10 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 6 a pH 9 y la 0 concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 20 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 6 a pH 9 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 30 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 6 a pH 9 y la concentración iónica 5 de la fase móvil es aproximadamente sal 40 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 6 a pH 9 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 50 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 11 y la concentración iónica de la fase móvil es 0 aproximadamente sal 10 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 11 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 20 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 11 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 5 30 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 11 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 40 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 11 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 50 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 10 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 10 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 10 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 20 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 10 y la concentración iónica 0 de la fase móvil es aproximadamente sal 30 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 10 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 40 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 10 y la concentración iónica de la fase móvil es 5 aproximadamente sal 50 mM. En cualquiera de las modalidades anteriores, la sal es NaCl, KC1 o Na2SO4. En cualquiera de las modalidades anteriores, el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio catiónico. En cualquiera de las modalidades anteriores, el polipéptido 0 tiene un pl> 9. En cualquiera de las modalidades anteriores, el polipéptido es un anticuerpo con un ml >9 . [000122] En algunas modalidades de la invención, un polipéptido y/o uno o más contaminantes se analizan por cromatografía de intercambio iónico donde el polipéptido y/o 5 uno o más contaminantes se eluyen del material de cromatografía por una combinación de gradiente de pH donde la concentración iónica de la fase móvil permanece esencialmente igual durante la elución. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 8 a pH 5 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 10 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 8 a pH 5 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 20 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 8 a pH 5 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 30 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 8 a pH 5 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 40 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 8 a pH 5 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 50 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 8 a pH 5 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 100 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 8 a pH 5 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 200 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 5 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 10 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 5 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 20 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 5 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 30 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 5 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 40 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 5 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 50 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 5 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 100 mM. En algunas modalidades, el gradiente de pH es de pH 7 a pH 5 y la concentración iónica de la fase móvil es aproximadamente sal 200 mM. En cualquiera de las modalidades 0 anteriores, la sal es NaCl, KC1 o Na2SO4. En cualquiera de las modalidades anteriores, el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio aniónico. En cualquiera de las modalidades anteriores, el polipéptido tiene un ml <7. En cualquiera de las modalidades anteriores, 5 el polipéptido es un anticuerpo con un pl <7. [000123] En algunas modalidades de la invención, la concentración iónica de la fase móvil, por ejemplo, el amortiguador de elución, se mide por conductividad de la fase móvil. La conductividad se refiere a la capacidad de 0 una solución acuosa para conducir una corriente eléctrica a través de dos electrodos. En solución, la corriente fluye por transporte iónico. Por lo tanto, con una cantidad creciente de iones presentes en la solución acuosa, la solución tendrá una mayor conductividad. La unidad básica de 5 medición para la conductividad es Siemen (o mho), mho (mS/cm), y se puede medir usando un medidor de conductividad, tal como varios modelos de medidores de conductividad Orion. Puesto que la conductividad electrolítica es la capacidad de los iones en una solución para transportar corriente electrica, la conductividad de una solución se puede alterar al cambiar la concentración de los iones en la misma. Por ejemplo, la concentración de un agente amortiguador y/o la concentración de una sal (por ejemplo cloruro de sodio, acetato de sodio, o cloruro de potasio) en la solución se puede alterar a fin de lograr la 0 conductividad deseada. De manera preferente, la concentración de sal de los varios amortiguadores se modifica para lograr la conductividad deseada. [000124] En algunas modalidades, la fase móvil de la cromatografía tiene una conductividad inicial de más de 5 aproximadamente cualquiera de 0.0 mS/cm, 0.5 mS/cm, 1.0 mS/cm, 1.5 mS/cm, 2.0 mS/cm, 2.5 mS/cm, 3.0 mS/cm, 3.5 mS/cm, 4.0 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 0 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17.0 mS/cm, 18.0 mS/cm, 19.0 mS/cm, o 20.0 mS/cm. En algunas modalidades, la conductividad de la fase móvil se incrementa durante el transcurso de la cromatografía, por ejemplo, por un gradiente de concentración iónica. En algunas modalidades, 5 la conductividad de la fase móvil en el término de la elución es más de aproximadamente cualquiera de 1.0 mS/cm, 1.5 mS/cm, 2.0 mS/cm, 2.5 mS/cm, 3.0 mS/cm, 3.5 mS/cm, 4.0 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17.0 mS/cm, 18.0 mS/cm, 19.0 mS/cm, o 20.0 mS/cm. En algunas modalidades, la conductividad de la fase móvil se incrementa por un gradiente lineal. En algunas modalidades, la conductividad de la fase móvil se incrementa por un gradiente gradual que comprende uno o más pasos. [000125] En algunas modalidades, la conductividad inicial de la fase móvil y la conductividad final de la fase móvil de la cromatografía en elución del polipéptido es esencialmente la misma. En algunas modalidades, la conductividad de la fase móvil permanece esencialmente a más de aproximadamente cualquiera de 0.0 mS/cm, 0.5 mS/cm, 1.0 mS/cm, 1.5 mS/cm, 2.0 mS/cm, 2.5 mS/cm, 3.0 mS/cm, 3.5 mS/cm, 4.0 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17.0 mS/cm, 18.0 mS/cm, 19.0 mS/cm, o 20.0 mS/cm. [000126] En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, la composición que comprende un polipéptido y uno o más contaminantes se carga en el material de cromatografía a una cantidad de no más de cualquiera de aproximadamente 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 g, 5 g, 6 g, 7 g 8 g, 9 g, 10 g, 15 g, 20 g, 25 g, o 50 g. En algunas modalidades, la composición se carga en el material de cromatografía a una concentración de no más de aproximadamente 0.5 mg/mL, 1.0 mg/mL, 1.5 mg/mL, 2.0 mg/mL, 2.5 mg/mL, y 5.0 mg/mL. En algunas modalidades, la composición se diluye antes de la carga sobre el material de cromatografía; por ejemplo, diluido 1:1.1:2.1:5.1:10 o mayor de 1:10. En algunas modalidades, la composición se diluye en la fase móvil de la cromatografía. En algunas modalidades, la composición se diluye en un amortiguador de carga. [000127] En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, la velocidad de flujo es más de aproximadamente cualquiera de 0.5 mL/min, 0.6 mL/min, 0.7 mL/min, 0.8 mL/min, 0.9 mL/min, 1.0 ml/min, 1.1 mL/min, 1.2 mL/min, 1.3 mL/min, 1.4 mL/min, 1.5 mL/min, 1.75 ml/min y 2.0 mL/min. [000128] En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente, el material de cromatografía es una columna. En algunas modalidades, la columna es una columna de HPLC. En algunas modalidades, la columna tiene cualquiera de las siguientes dimensiones: 4 x 50 mm, 4 x 100 mm, 4 x 150 mm, 4 x 200 mm, 4 x 250 mm, o 2 x 250 mm. [000129] En algunas modalidades de la invención, los métodos son fuertes; es decir, uno o más de los parámetros de corridas pueden perturbar sin afectar los resultados analíticos (por ejemplo, porcentajes relativos del pico principal y los picos contaminantes). En algunas modalidades, la concentración del amortiguador en el amortiguador de carga y/o el amortiguador de elución varía de cualquiera de aproximadamente 10 ni a 50 mM, 10 mM a 40 mM, 10 mM a 30 mM, 10 mM a 20 mM, 20 mM a 50 mM, 20 ni a 40 mM, 20 mM a 30 mM, 30 mM a 50 m , 30 mM a 40 mM, o 40 mM a 50 mM. En algunas modalidades, la concentración del amortiguador en el amortiguador de carga y/o el amortiguador de elución varía de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM. En algunas modalidades, la primera pH varía de cualquiera de aproximadamente pH 5.0 a pH 7.0, pH 5.0 a pH 6.5, pH 5.0 a pH 6.0, pH 5.0 a pH 5.5, pH 5.5 a pH 7.0, pH 5.5 a pH 6.5, pH 5.5 a pH 6.0, pH 6.0 a pH 7.0, pH 6.0 a pH 6.5 o pH 6.5 a pH 7.0. En algunas modalidades, el primer pH varía desde aproximadamente pH 5.7 a aproximadamente pH 6.3. En algunas modalidades, la temperatura del material de cromatografía varía de cualquiera de aproximadamente 20°C a 50°C, 25°C a 50°C, 30°C a 50°C, 35°C a 50°C, 40°C a 50°C, 45°C a 50°C, 20°C a 45°C, 25°C a 45°C, 30°C a 45°C, 35°C a 45°C, 40°C a 45°C, 20°C a 40°C, 25°C a 40°C, 30°C a 40°C, 35°C a 40°C, 20°C a 35°C, 25°C a 35°C, 30°C a 35°C, 20°C a 30°C, 25°C a 30°C o 20°C a 25°C. En algunas modalidades, la temperatura del material de cromatografía varía de aproximadamente 36°C a aproximadamente 44°C. En algunas modalidades, la carga y elución se llevan a cabo a una velocidad de flujo que varía de cualquiera de aproximadamente 0.5 ml/min a 2.0 ml/min, 0.8 ml/min a 2.0 ml/min, 1.0 ml/min a 2.0 ml/min, 1.2 ml/min a 2.0 ml/min, 1.5 ml/min a 2.0 ml/min, 1.8 ml/min a 2.0 ml/min, 0.5 ml/min a 1.8 ml/min, 0.8 ml/min a 1.8 ml/min, 1.0 ml/min a 1.8 ml/min, 1.2 ml/min a 1.8 ml/min, 1.5 ml/min a 1.8 ml/min, 0.5 ml/min a 1.5 ml/min, 0.8 ml/min a 1.5 ml/min, 1.0 ml/min a 1.5 ml/min, 1.2 ml/min a 1.5 ml/min, 0.5 ml/min a 1.2 ml/min, 0.8 ml/min a 1.2 ml/min, 1.0 ml/min a 1.2 ml/min, 0 0.5 ml/min a 1.0 ml/min, 0.8 ml/min a 1.0 ml/min, o 0.5 ml/min a 0.8 ml/min. En algunas modalidades, la carga y elución se llevan a cabo a una velocidad de flujo que varía de aproximadamente 0.8 ml/min a aproximadamente 1.2 ml/min. En algunas modalidades, la carga y elución se llevan a cabo 5 a una velocidad de flujo que varía de aproximadamente 1.5 ml/min a aproximadamente 2.0 ml/min. En modalidades adicionales, cualquier combinación de concentración de amortiguador, pH de inicio, temperatura del material de cromatografía y/o velocidad de flujo puede variar de acuerdo 0 a las modalidades anteriores.

Detección de variantes de carga [000130] En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para detectar variantes de un polipéptido en una composición que comprende el polipéptido y una o más 5 variantes en la composición del polipéptido. El método que comprende unir el polipéptido y uno o más variantes a un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga con un pH inicial y una concentración iónica inicial, eluir el polipéptido y uno o más contaminantes de la columna de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se altera por un gradiente de pH y la concentración iónica del amortiguador de elución se altera por un gradiente de concentración iónica tal que los polipéptidos y el uno o más contaminantes eluyen del material de 0 cromatografía como distintas entidades separadas. Los eluyentes de la cromatografía entonces se analizan para el polipéptido de origen y la presencia de variantes. Las variantes de polipéptido pueden incluir variantes ácidas del polipéptido y variantes básicas del polipéptido de origen. 5 Los ejemplos de variantes ácidas, es decir, variantes con un ml menor que el pl del polipéptido de origen, incluyen pero no se limitan a polipéptidos donde se han desamidado uno o más residuos de glutamina y/o asparagina. Los ejemplos de variantes básicas de polipéptidos, es decir, variantes con 0 un pl mayor que el pl del polipéptido de origen, incluyen pero no se limitan a variantes donde un residuo de ácido aspártico ha experimentado modificación a una porción de succinimida. En algunas modalidades, los métodos de la invención se usan para detectar variantes de un polipéptido 5 en una composición que comprende un polipéptido con un punto isoeléctrico que no está en el intervalo de pH neutral. En algunas modalidades, los métodos se pueden usar para detectar de manera efectiva las variantes de carga en una composición que comprende un polipéptido con un ml mayor de 9 de los contaminantes. En algunas modalidades, un material de cromatografía de intercambio catiónico se usa para detectar de manera efectiva las variantes de carga en una composición que comprende un polipéptido con un pl mayor de 9. En otras modalidades, los métodos se pueden usar para detectar de manera efectiva variantes de carga en una 0 composición que comprende un polipéptido con un pl menor de 7 de los contaminantes. En algunas modalidades, un material de cromatografía de intercambio aniónico se usa para detectar de manera efectiva las variantes de carga en una composición que comprende un polipéptido con un pl menor de 7. Los ejemplos de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. [000131] En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para detectar variantes de un polipéptido en una composición que comprende el polipéptido y una o más 0 variantes del polipéptido. El método que comprende unir el polipéptido y uno o más variantes a un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga con un pH inicial y una concentración iónica inicial, eluir el polipéptido y uno o más contaminantes de 5 la columna de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se altera por un gradiente de pH y la concentración iónica del amortiguador de elución permanece esencialmente igual como la concentración iónica inicial tal que los polipéptidos y el uno o más contaminantes se eluyen del material de cromatografía como distintas entidades separadas. Los eluyentes de la cromatografía entonces se analizan para la presencia del polipéptido de origen y la presencia de las variantes. Las variantes de polipéptido pueden incluir variantes ácidas del polipéptido y variantes básicas del polipéptido de origen. Los ejemplos de variantes ácidas, es decir, variantes con un ml menor que el pl del polipéptido de origen, incluyen pero no se limitan a, polipéptidos donde se han desamidado uno o más residuos de glutamina y/o asparagina. Los ejemplos de variantes básicas de polipéptido, es decir, variantes con un pl mayor que el pl del polipéptido de origen, incluyen pero no se limitan a, variantes donde un residuo de ácido aspártico ha experimentado modificación a una porción de succinimida. En algunas modalidades, los métodos de la invención se usan para detectar variantes de un polipéptido en una composición que comprende un polipéptido con un punto isoeléctrico que no está en el intervalo de pH neutral. En algunas modalidades, los métodos se pueden usar para detectar de manera efectiva variantes de carga en una composición que comprende un polipéptido con un pl mayor de 9. En algunas modalidades, se usa un material de cromatografía de intercambio catiónico para detectar de manera efectiva variantes de carga en una composición que comprende un polipéptido con un ml mayor de 9. En otras modalidades, los métodos se pueden usar para detectar de manera efectiva variantes de carga en una composición que comprende un polipéptido con un pl menor de 7. En algunas modalidades, se usa un material de cromatografía de intercambio aniónico para detectar de manera efectiva variantes de varga en una composición que comprende un polipéptido con un pl menor de 0 7. Los ejemplos de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo.

Determinación la pureza de un polipéptido en una composición [000132] En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para determinar la pureza de un polipéptido en una 5 composición que comprende el polipéptido. El método que comprende unir el polipéptido y uno o más contaminantes a un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga con un pH inicial y una concentración iónica inicial, eluir el polipéptido y uno o más 0 contaminantes de la columna de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se altera por un gradiente de pH y la concentración iónica del amortiguador de elución se altera por un gradiente de concentración iónica tal que los polipéptidos y 5 el uno o más contaminantes se eluyen del material de cromatografía como distintas entidades separadas. La pureza del polipéptido se puede valorar al determinar la relación de la cantidad de polipéptido que eluye del material de cromatografía a la cantidad total de contaminantes, por ejemplo, variantes de carga, que eluyen el material de cromatografía. En algunas modalidades, los métodos de la invención se usan para determinar la pureza de un polipéptido en una composición que comprende un polipéptido con un punto isoeléctrico que no está en el intervalo de pH neutral. En algunas modalidades, los métodos se pueden usar para determinar de manera efectiva la pureza de un polipéptido en una composición que comprende un polipéptido con un ml mayor de 9 de los contaminantes. En algunas modalidades, se usa un material de cromatografía de intercambio catiónico para determinar de manera efectiva la pureza de un polipéptido en una composición que comprende un polipéptido con un pl mayor de 9. En otras modalidades, los métodos se pueden usar para determinar de manera efectiva la pureza de un polipéptido en una composición que comprende un polipéptido con un pl menor de 7 de los contaminantes. En algunas modalidades, se usa un material de cromatografía de intercambio aniónico para determinar de manera efectiva la pureza de un polipéptido en una composición que comprende un polipéptido con un pl menor de 7. Los ejemplos de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. [000133] En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para determinar la pureza de un polipéptido en una composición que comprende el polipéptido. El método que comprende unir el polipéptido y uno o más contaminantes a un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga con un pH inicial y una concentración iónica inicial, eluir el polipéptido y uno o más contaminantes de la columna de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se altera por un gradiente de pH y la concentración iónica del amortiguador de elución permanece esencialmente igual como la concentración iónica inicial tal que los polipéptidos y el uno o más contaminantes eluyen del material de cromatografía como distintas entidades separadas. La pureza del polipéptido se puede valorar al determinar la relación de la cantidad de polipéptido que eluye del material de cromatografía a la cantidad total de contaminantes, por ejemplo, variantes de carga, que eluyen el material de cromatografía. En algunas modalidades, los métodos de la invención se usan para determinar la pureza de un polipéptido en una composición que comprende un polipéptido con un punto isoeléctrico que no está en el intervalo de pH neutral. En algunas modalidades, los métodos se pueden usar para determinar de manera efectiva la pureza de un polipéptido en una composición que comprende un polipéptido con un ml mayor de 9 de los contaminantes. En algunas modalidades, un material de cromatografía de intercambio catiónico se usa para determinar de manera efectiva la pureza de un polipéptido en una composición que comprende un polipéptido con un ml mayor de 9. En otras modalidades, los métodos se pueden usar para determinar de manera efectiva la pureza de un polipéptido en una composición que comprende un polipéptido con un pl menor de 7 de los contaminantes. En algunas modalidades, se usa un material de cromatografía de intercambio aniónico para determinar de manera efectiva la pureza de un polipéptido en 0 una composición que comprende un polipéptido con un pl menor de 7. Los ejemplos de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo.

Determinar la estabilidad de un polipéptido en una composición 5 [000134] En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para determinar la estabilidad de un polipéptido en una composición que comprende el polipéptido. En algunas modalidades, las muestras de la composición que comprende el polipéptido se analizan con el paso del tiempo. En algunas 0 modalidades, la composición se incuba en varios momentos antes del análisis. En algunas modalidades, la composición se incuba a no más que cualquiera de aproximadamente 0°C, 20°C, 37°C o 40°C antes del análisis. En algunas modalidades, la composición se incuba durante uno o más de 1 5 día, 2 días, 3 días, 5 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 año antes del análisis. La composición entonces se analiza al unir el polipéptido y uno o más contaminantes en la composición a un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga con un pH inicial y una concentración iónica inicial, eluyendo el polipéptido y uno o más contaminantes de la columna de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se altera por un gradiente de pH y la concentración iónica del amortiguador de elución se altera por un 0 gradiente de concentración iónica tal que los polipéptidos y el uno o más contaminantes se eluyen del material de cromatografía como distintas entidades separadas. En otras modalidades, la composición se analiza al unir el polipéptido y uno o más contaminantes en la composición a un 5 material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga con un pH inicial y una concentración iónica inicial, eluir el polipéptido y uno o más contaminantes de la columna de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de 0 elución se altera por un gradiente de pH y la concentración iónica del amortiguador de elución permanece esencialmente igual como la concentración iónica inicial tal que los polipéptidos y el uno o más contaminantes se eluyen del material de cromatografía como distintas entidades 5 separadas. Para cualquiera de las modalidades anteriores, el cambio en la relación de polipéptido a contaminantes indica la estabilidad del polipéptido en la composición. Por ejemplo, si la relación de polipéptido a contaminantes no cambia con el paso del tiempo, el polipéptido se puede considerar estable, en tanto la acumulación rápida de contaminantes con una disminución concomitante en la cantidad de proteína en la composición indica que es menos estable el polipéptido en la composición. En algunas modalidades, los métodos de la invención se usan para determinar la estabilidad de un polipéptido en una 0 composición que comprende un polipéptido con un punto isoeléctrico que no está en el intervalo de pH neutral. En algunas modalidades, los métodos se pueden usar para determinar de manera efectiva la estabilidad de un polipéptido en una composición que comprende un polipéptido 5 con un ml mayor de 9 de los contaminantes. En algunas modalidades, se usa un material de cromatografía de intercambio catiónico para determinar la estabilidad de un polipéptido en una composición que comprende un polipéptido con un pl mayor de 9. En otras modalidades, los métodos se 0 pueden usar para determinar la estabilidad de un polipéptido en una composición que comprende un polipéptido con un pl menor de 7 de los contaminantes. En algunas modalidades, se usa un material de cromatografía de intercambio aniónico para determinar la estabilidad de un polipéptido en una 5 composición que comprende un polipéptido con un pl menor de 7. Los ejemplos de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo.

Purificación de polipéptidos [000135] En algunos aspectos, la invención proporciona . métodos para purificar un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y una o más variantes del polipéptido. El método que comprende unir el polipéptido y una o más variantes a un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga con un pH inicial y una concentración iónica inicial, eluir el 10 polipéptido y uno o más contaminantes de la columna de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se altera por un gradiente de pH y la concentración iónica del amortiguador de elución se altera por un gradiente de concentración 15 iónica tal que los polipéptidos y el uno o mas contaminantes se eluyen del material de cromatografía as como distintas entidades separadas. Se recolectan fracciones durante la fase de elución de la cromatografía y las fracciones que contienen el polipéptido con ningún contaminante o 20 contaminantes mínimos se mezclan para procesamiento adicional o para formulación farmacéutica. En algunas modalidades, los métodos de la invención se usan para purificar un polipéptido en una composición que comprende un polipéptido con un punto isoeléctrico que no está en el 25 intervalo pH neutral. En algunas modalidades, los métodos se pueden usar para purificar un polipéptido con un ml mayor de 9. En algunas modalidades, se usa un material de cromatografía de intercambio catiónico para purificar un polipéptido con un pl mayor de 9. En otras modalidades, los métodos se pueden usar para purificar un polipéptido con un pl menor de 7 de contaminantes. En algunas modalidades, se usa un material de cromatografía de intercambio aniónico para purificar un polipéptido con un pl menor de 7. Los ejemplos de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. [000136] En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para purificar un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y una o más variantes del polipéptido. El método que comprende unir el polipéptido y una o más variantes a un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga con un pH inicial y una concentración iónica inicial, eluir el polipéptido y uno o más contaminantes de la columna de intercambio iónica usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se altera por un gradiente de pH y la concentración iónica del amortiguador de elución es esencialmente la misma como la concentración iónica inicial tal que los polipéptidos y el uno o más contaminantes se eluyen del material de cromatografía como distintas entidades separadas. Las fracciones se recolectan durante la fase de elución de la cromatografía y las fracciones que contienen el polipéptido pero no los contaminantes se mezclan para procesamiento adicional o formulación farmacéutica. En algunas modalidades, los métodos de la invención se usan para purificar un polipéptido en una composición que comprende un polipéptido con un punto isoeléctrico que no está en el intervalo de pH neutral. En algunas modalidades, los métodos se pueden usar para purificar un polipéptido con un ml mayor de 9. En algunas modalidades, se usa un material de cromatografía de intercambio catiónico para purificar un polipéptido con un 0 pl mayor de 9. En otras modalidades, los métodos se pueden usar para purificar un polipéptido con un pl menor de 7 con los contaminantes. En algunas modalidades, se usa un material de cromatografía de intercambio aniónico para purificar un polipéptido con un pl menor de 7. Los ejemplos 5 de polipéptidos se incluyen pero no se limitan a, anticuerpo y fragmentos de anticuerpo.

III. Polipéptidos [000137] Se proporcionan polipéptidos para el uso en cualquiera de los métodos de la cromatografía de intercambio 0 iónica de gradiente de pH mediada por concentración iónica, descrita en la presente. En algunas modalidades de la invención, las composiciones de un polipéptido se analizan por cromatografía de intercambio iónico de gradiente de pH mediada por concentración iónica. Estos métodos son útiles 5 en la identificación de variantes de carga del polipéptido dentro de la composición. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo o fragmento del mismo. [000138] En algunas modalidades, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. El polipéptido terapéutico puede inhibir el crecimiento de células tumorales, inducir apoptosis y/o inducir muerte celular. En algunas modalidades, el polipéptido es un antagonista. En algunas modalidades, el polipéptido es un agonista. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo. En algunas modalidades, el polipéptido es una inmunoadhesina 0 [000139] En algunas modalidades, el polipéptido tiene un peso molecular mayor de aproximadamente cualquiera de 5,000 Daltones, 10,000 Daltones, 15,000 Daltones, 25,000 Daltones, 50,000 Daltones, 75,000 Daltones, 100,000 Dalton, 125,000 Daltones, o 150,000 Daltones. El polipéptido puede tener un 5 peso molecular entre aproximadamente cualquiera de 50,000 Daltones a 200,000 Daltones o 100,000 Daltones a 200,000 Daltones. De manera alternativa, el polipéptido para el uso en la presente puede tener un peso molecular de aproximadamente 120,000 Daltones o aproximadamente 25,000 0 Daltones. [000140] El ml es el punto isoeléctrico y es el pH al cual una molécula particular o superficie particular no tiene carga eléctrica neta. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el pl del 5 polipéptido, por ejemplo un anticuerpo, puede ser mayor de aproximadamente 9. En algunas modalidades, el polipéptido tiene un ml de aproximadamente cualquiera de 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, o 12. En algunas modalidades, el polipéptido tiene un pl entre aproximadamente 9 y 12. En algunas modalidades, el polipéptido tiene un pl entre aproximadamente 9 y 11. En algunas modalidades, el polipéptido tiene un pl entre aproximadamente 9 y 10. En algunas modalidades, el polipéptido tiene un pl entre aproximadamente 10 y 12. En algunas modalidades, el polipéptido tiene un pl entre aproximadamente 10 y 11. En 0 algunas modalidades, el polipéptido tiene un pl entre aproximadamente 11 y 12. [000141] En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el pl del polipéptido, por ejemplo un anticuerpo, puede ser menor de aproximadamente 7. 5 En algunas modalidades, el polipéptido tiene un pl de aproximadamente cualquiera de 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, o 4.

En algunas modalidades, el polipéptido tiene un pl entre aproximadamente 4 y 7. En algunas modalidades, el polipéptido tiene un pl entre aproximadamente 4 y 6. En 0 algunas modalidades, el polipéptido tiene un pl entre aproximadamente 4 y 5. En algunas modalidades, el polipéptido tiene un pl entre aproximadamente 5 y 7. En algunas modalidades, el polipéptido tiene un pl entre aproximadamente 5 y 6. 5 [000142] En modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el uno o más contaminantes en una composición que comprende un polipéptido y uno o más contaminantes son variantes de carga de polipéptido. En algunas modalidades, la variante de carga de polipéptido es un polipéptido que se ha modificado de su estado nativo tal que se altera la carga del polipéptido. En algunas modalidades, las variantes de carga son más ácidas que el polipéptido de origen; es decir tienen un menor ml que el polipéptido de origen. En otras modalidades, las variantes de carga son más básicas que el polipéptido de origen; es decir, tiene un pl mayor que el polipéptido de origen. En algunas modalidades, las variantes de carga de polipéptido están manejadas. En algunas modalidades, la variante de carga de polipéptido es el resultado de procesos naturales; por ejemplo, oxidación, desamidación, procesamiento C-terminal de residuos de lisina, formación de piroglutamato N-terminal, y glicación. En algunas modalidades, la variante de carga de polipéptido es una glicoproteína donde el glicano unido a la proteína se modifica tal que la carga de la glicoproteína se altera en comparación a la glicoproteína de origen; por ejemplo, por la adición de ácido siálico o sus derivados. En algunas modalidades, la variante de carga de polipéptido es una variante de carga de anticuerpo. [000143] Los polipéptidos que se van a analizar usando los métodos descritos en la presente se producen en general usando téenicas recombinantes. Los métodos para producir proteínas recombinantes se describen, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos.5,534,615 y 4,816,567, específicamente incorporadas en la presente como referencia. En algunas modalidades, la proteína de interés se produce por una célula CHO (ver, por ejemplo WO 94/11026). Cuando se usan téenicas recombinantes, los polipéptidos se pueden producir de manera intracelular, en el espacio periplásmico, o se segregan directamente en el medio. [000144] Los polipéptidos se pueden recuperar del medio de cultivo o de lisados de células hospedadoras. Las células empleadas en la expresión de los polipéptidos se pueden romper por varios medios químicos o físicos, tal como ciclos de congelación-descongelación, tratamiento con ultrasonido, rompimiento mecánico o agentes de lisis celular. Si el polipéptido se produce de manea intracelular, como un primer paso, se remueven los desechos en partículas ya sea células hospedadoras o fragmentos lisados, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar polipéptidos que se segregan al espacio periplásmico de E. coli . Brevemente, se descongela la pasta celular en la presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los desechos celulares se pueden remover por centrifugación. Donde el polipéptido se segrega en el medio, los sobrenadantes de estos sistemas de presión se concentran 83 en general primero usando un filtro de concentración de polipéptido comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de los pasos anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para impedir el crecimiento de contaminantes inesperados. [000145] En algunas modalidades, el polipéptido en la composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes se ha purificado o purificado parcialmente antes del análisis por los métodos de la invención. Por ejemplo, el polipéptido de los métodos está en un eluyente de una cromatografía de afinidad, una cromatografía de intercambio catiónico, una cromatografía de intercambio aniónico, una cromatografía de modo mezclado y una cromatografía de interacción hidrófoba. En algunas modalidades, el polipéptido está en un eluyente de una cromatografía de Proteína A. [000146] Los ejemplos de polipéptidos que se pueden analizar por los métodos de la invención incluyen pero no se limitan a inmunoglobulinas, inmunoadhesinas, anticuerpos, enzimas, hormonas, proteínas de fusión, proteínas que contienen Fe, inmunoconjugados, citocinas e interleucinas. [000147] En algunas modalidades, el polipéptido está en una composición farmacéutica. En algunas modalidades el polipéptido es un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en una composición farmacéutica. En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende el polipéptido y un portador farmacéuticamente aceptable que incluye, pero no se limita a, un amortiguador, excipiente, estabilizador, o conservador. En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable que incluye, pero no se limita a, un amortiguador, excipiente, estabilizador o conservador. (A) Anticuerpos 0 [000148] En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el polipéptido para el uso en cualquiera de los métodos para analizar polipéptidos y formulaciones que comprenden los polipéptidos por los métodos descritos en la presente es un anticuerpo. 5 [000149] Las dianas moleculares para los anticuerpos incluyen proteínas CD y sus ligandos, tal como, pero no limitado a: (i) CD3, CD4, CD8, CD19, CDlla, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79a (CD79a), y O?79b (CD79b); (ii) miembros de la familia de receptores ErbB tal como el receptor EGF, el 0 receptor HER2, HER3 o HER4; (iii) moléculas de adhesión celular tal como LFA-1, Macl, pl50,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM y an/b3 integrina, incluyendo ya sea subunidades alfa o beta de estas (por ejemplo, anticuerpos anti-CDlla, anti-CD18 o anti-CDllb); (iv) factores de crecimiento tal como VEGF; 5 igE; antígenos de grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor mpl ; CTLA-4; proteína C, BR3, c-met, factor de tejido, b7 etc; y (v) antígenos asociados a tumor transmembrana y superficie celular (TAA), tal como aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos No.7,521,541. [000150] Otros anticuerpos de ejemplo incluyen aquellos seleccionados de, y sin limitación, anticuerpo anti-receptor de estrógeno, anticuerpo anti-receptor de progesterona, anticuerpo anti-p53, anticuerpo anti-HER-2/neu, anticuerpo anti-EGFR, anticuerpo anti-cathepsina D, anticuerpo anti-0 Bcl-2, anticuerpo anti-E-cadherina, anticuerpo anti-CA125, anticuerpo anti-CA15-3, anticuerpo anti-CA19-9, anticuerpo anti-c-erbB-2, anticuerpo anti-P-glicoproteína, anticuerpo anti-CEA, anticuerpo proteína de anti-retinoblastoma, anticuerpo oncoproteína anti-ras, anticuerpo anti-Lewis X, 5 anticuerpo anti-Ki-67, anticuerpo anti-PCNA, anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD4, anticuerpo anti-CD5, anticuerpo anti-CD7, anticuerpo anti-CD8, anticuerpo anti- CD9/p24, anticuerpo anti-CD10, anticuerpo anti-CDlla, anticuerpo anti-CDllc, anticuerpo anti-CD13, anticuerpo 0 anti-CD14, anticuerpo anti-CD15, anticuerpo anti-CD19, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-CD22, anticuerpo anti- CD23, anticuerpo anti-CD30, anticuerpo anti-CD31, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-CD34, anticuerpo anti-CD35, anticuerpo anti-CD38, anticuerpo anti-CD41, anticuerpo anti-5 LCA/CD45, anticuerpo anti-CD45RO, anticuerpo anti-CD45RA, anti-CD39, anticuerpo anti-CD100, anticuerpo anti-CD95/Fas, anticuerpo anti-CD99, anticuerpo anti-CD106, anticuerpo anti-ubiquitina, anticuerpo anti-CD71, anticuerpo anti-c-myc, anticuerpo anti-citoqueratinas, anticuerpo anti-vimentinas, anticuerpo de proteínas anti-HPV, anticuerpo anti-kappa de cadena ligera, anticuerpo anti-lambda de cadenas ligeras, anticuerpo anti-melanosomas, anticuerpo anti-antígeno específico de próstata, anticuerpo anti-S-100, anticuerpo de anti-antígeno tau, anticuerpo anti-fibrina, anticuerpo anti-queratinas y anticuerpo anti-antígeno Tn. (i) Anticuerpos Monoclonales [000151] En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Se obtienen anticuerpos monoclonales en una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo excepto por posibles variantes que surgen durante la producción del anticuerpo monoclonal, estas variantes que en general están presentes en cantidades menores. De esta manera, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que no es una mezcla de anticuerpos discretos o policlonales. [000152] Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden elaborar usando el método de hibridoma descrito primero por Kohler efc al., Nature 256:495 (1975), o se pueden elaborar por métodos de ADN recombinante (Patente de los Estados Unidos No.4,816,567). [000153] En el método de hibridoma, un ratón u otro animal hospedador apropiado, tal como un hámster, se inmuniza como se describe en la presente para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán de manera específica al polipéptido usado para inmunización. De manera alternativa, se pueden inmunizar in vitro linfocitos. Los linfocitos entonces se fusionan con células de mieloma usando un agente adecuado de fusión, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Anticuerpos : Principies and Practice , pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). [000154] Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma, parentales, no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT. [000155] En algunas modalidades, las células de mieloma son aquellas que se fusionan de manera eficiente, soportan producción estable a alto nivel de anticuerpos por las células seleccionadas productoras de anticuerpos, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, en algunas modalidades, las líneas de células de mieloma son líneas de mieloma murino, tal como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EUA. También se han descrito líneas de células de mieloma humano y heteromieloma de humano-ratón para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Im unol . 0 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). [000156] El medio de cultivo en el cual se hacen crecer las células de hibridoma se valora para la producción de 5 anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. En algunas modalidades, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo 0 inmunosorbente enlazado a enzimas (ELISA). [000157] La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, por análisis Scatchard de unson et al . , Anal . Biochem. 107:220 (1980). [000158] Después de que las células de hibridoma se 5 identifican por producir anticuerpos de la especificidad deseada, afinidad deseada y/o actividad deseada, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución limitante y hacer crecer por métodos normales (Goding, Monoclonal Anticuerpos : Principies and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios adecuados de cultivo para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden hacer crecer in vivo como tumores de ascitis en un animal. [000159] Los anticuerpos monoclonales segregados por los sub-clones se separan de manera adecuada del medio de 0 cultivo, fluido de ascitis, o suero por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina, tal como por ejemplo, polipéptido-A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad. 5 [000160] El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, al usar sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse de manera específica a genes que codifican para las cadenas pesada y 0 ligera de anticuerpos murinos). En algunas modalidades, las células de hibridoma sirven como una fuente de este ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que entonces se transfectan en células hospedadoras tal como células E. coli, células COS 5 simiescas, células de Ovario de Hámster Chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otro modo el polipéptido de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. La revisión de los artículos de la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica para el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opini n in Inmuno 1. 5:256-262 (1993) and Plückthun, I munol . Revs., 130:151-188 (1992). [000161] En una modalidad adicional, se pueden aislar anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de las bibliotecas de 0 fagos de anticuerpos generadas usando las téenicas descritas en McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de 5 fagos. Las publicaciones subsiguientes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo de nM) por transposición de cadena (Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia 0 para construir bibliotecas muy grandes de fagos (Waterhouse et al., Nuc . Acids . Res. 21:2265-2266 (1993)). De esta manera, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos 5 monoclonales. [000162] El ADN también se pueden modificar, por ejemplo, al sustituir la secuencia codificadora para los dominios constantes de cadena pesada y ligera humana en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nati Acad. Sci . USA 81:6851 (1984)), o al unir covalentemente a la secuencia codificadora de inmunoglobulina todo o parte de la secuencia codificadora para un polipéptido no de inmunoglobulina. [000163] Típicamente, estos polipéptidos no de inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen para los dominios variables de un sitio de combinación a antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación a antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación a antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente. [000164] En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el anticuerpo es IgA, IgD, IgE, IgG, o Ig . En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal tipo IgG. (ii) Anticuerpos Humanizados [000165] En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. Se han descrito en la téenica métodos para inmunizar anticuerpos no humanos. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en el mismo de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos frecuentemente se refieren como residuos de "importación", que se toman típicamente de un dominio variable de "importación". Se puede realizar esencialmente la humanización siguiendo el método descrito por Winter y colaboradores (Jones et al . , Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al . , Nature 332:323-327 (1988); Verhocyen et al . , Science 239:1534-1536 (1988)), al sustituir secuencias de regiones hipervariables por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, estos 0 anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567) en donde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos 5 humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de regiones hipervariables y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de ratón. [000166] La elección de los dominios variables humanos, 0 tanto ligeros como pesados, que se van a usar en la elaboración de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo al llamado método de "mejor ajuste", la secuencia de dominio variable de un anticuerpo de roedor se examina contra la biblioteca 5 completa de secuencias conocidas de dominios variables humanos. La secuencia humana que está más cerca de aquella del roedor entonces se acepta como la región menos variable (FR) humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al . , J. Inmuno 1. 151:2296 (1993); Chothia et al . , J. Mol . Biol . . 196:901 (1987)). Otro método usa una región menos variable particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada. Las mismas regiones é menos variables se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al . , Proc . Nati . Acad. 10 Sci . USA 89:4285 (1992); Presta et al . , J. Inmuno 1. 151:2623 (1993)). [000167] Adicionalmente es importante que los anticuerpos se humanizen con retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este 15 objetivo, en algunas modalidades de los métodos, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias parentales si varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Comúnmente están 20 disponibles modelos tridimensionales de inmunoglobulina y son familiares para los expertos en la téenica. están disponibles programas de computadora que ilustran y presentan las probables estructuras tridimensionales de conformación de las secuencias candidatas seleccionadas de 25 inmunoglobulina. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata de inmunoglobulina, es decir, el análisis de residuos que tienen influencia en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, se pueden seleccionar y combinar residuos de FR de las secuencias de receptor y de importación de modo que se logre la característica deseada del anticuerpo, tal como afinidad incrementada para el antígeno diana. En general, los residuos de regiones hipervariables están comprendidos directamente y más sustancialmente en la influencia de la unión al antígeno. (iii)_ Anticuerpos Humanos [000168] En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano. Como una alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, en la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigota del gen de la región de unión (JH) de cadena pesada de anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da por resultado la inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia del arreglo de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en estos ratones mutantes de línea germinal dará por resultado la producción de anticuerpos humanos en el estímulo con el antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al . , Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al . , Year in Immuno. 7:33 (1993); y Patentes de los Estados Unidos Nos.5,591,669; 5,589,369; y 5,545,807. [000169] De manea alternativa, la teenología de visualización en fagos (McCafferty et al . , Nature 348:552-553 (1990)) se puede usar para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donadores no inmunizados. De acuerdo a esta técnica, los genes del dominio V de anticuerpo se clonan en cuadro en ya sea un gen de polipéptido de cubierta principal o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como 13 o fd, y se visualizan como fragmentos funcionales de anticuerpo en la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de hebra individual del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también darán por resultado la selección del gen que codifica para el anticuerpo que exhibe esta propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. la visualización en fagos se puede realizar en una variedad de formatos; para su revisión, ver, por ejemplo Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Se pueden usar varias fuentes de segmentos del gen V para la visualización en fagos. Clackson et al . , Nature 352:624-628 (1991) aislaron un arreglo diverso de anticuerpos anti-oxazolona de una pequeña b biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donadores humanos inmunizados se puede construir y los anticuerpos a un arreglo diverso de antígenos (incluyendo auto-antígenos) se pueden aislar esencialmente siguiendo las téenicas descritas por Marks et al . , J. Mol . Biol . 222:581- 10 597 (1991), o Griffith et al . , EMBO J. 12:725-734 (1993).

Ver también, Patentes de los Estados Unidos Nos.5,565,332 y 5,573,905. [000170] También se pueden generar anticuerpos humanos por células B activadas in vitro (ver Patentes de los Estados 15 Unidos 5,567,610 y 5,229,275). (iv) Fragmentos de Anticuerpo [000171] En algunas modalidades, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. 20 Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al . , Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora 25 se pueden producir directamente por células hospedadoras recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de las bibliotecas de fagos de anticuerpo analizadas anteriormente. De manera alternativa, se pueden recuperar fragmentos Fab'-SH de E. coli y acoplar químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio /Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo a otro planteamiento se pueden aislar directamente fragmentos F(ab')2 de cultivo de células hospedadores recombinantes. Otras téenicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para los expertos en la técnica. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena individual (scFv). Ver WO 93/16185; Patente de los Estados Unidos No. 5,571,894; y Patente de los Estados Unidos No. 5,587,458. El fragmento de anticuerpo también puede ser una "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No.5,641,870 a manera de ejemplo. Estos fragmentos lineales de anticuerpo pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. [000172] En algunas modalidades, se proporcionan fragmentos de los anticuerpos descritos en la presente. En algunas modalidades, el fragmento de anticuerpo es un fragmento de unión a antígeno. En algunas modalidades, el fragmento de unió a antígeno se selecciona del grupo que consiste de un fragmento Fab, fragmento Fab', un fragmento F(ab')2 un scFv, un Fv, y un diacuerpo. (v) Anticuerpos Biespecífíeos [000173] En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecífíeos de ejemplo pueden unirse a dos diferentes epítopos. De manera alternativa, un brazo de unión de anticuerpo biespecífico se puede combinar con un brazo que se une a una molécula activadora en un leucocito tal como una molécula receptora de célula T (por ejemplo CD2 o CD3), o receptores 0 Fe para IgG (FCYR), tal como FCYRI (CD64), FCYRII (CD32) y FCYRIII (CD16) para enfocar los mecanismos de defensa celular a la célula. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos biespecíficos F(ab')2). [000174] En la téenica se conocen los métodos para elaborar anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecífíeos de longitud completa se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de 0 inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al . , Na ture 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes 5 moléculas de anticuerpo, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que usualmente se hace por pasos de cromatografía de afinidad, es algo engorrosa, y son bajos los rendimientos de producto. Se describen procedimientos similares en WO 93/08829, y en Traunecker et al . , EMBO J. , 10:3655-3659 (1991). [000175] De acuerdo a un planteamiento diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades deseadas de unión (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan a las secuencias de dominios constantes de inmunoglobulina. En algunas modalidades, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende regiones de bisagra CH2 y CH3. En algunas modalidades, la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican para las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina, y si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores separados de expresión, y se co-transfectan en un organismo hospedador adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en modalidades cuando las relaciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificadoras para dos o las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en relaciones iguales da por resultado altos rendimientos o cuando las relaciones no son de significado particular. [000176] En algunas modalidades este planteamiento, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en otro 0 brazo. Se encontró que esta estructura simétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones indeseadas de cadenas de inmunoglobulina, puesto que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula 5 biespecífica proporciona una manera fácil de separación. Este planteamiento se describe en WO 94/04690. Para detalles adicionales de la generación de anticuerpos biespecífíeos, ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986). 0 [000177] De acuerdo a otro planteamiento descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5,731,168, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo se puede manejar para aumentar al máximo el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de cultivo de células recombinantes. En algunas 5 modalidades, la interfaz comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grande (por ejemplo tirosina o triptóifano). Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico similar a las cadenas laterales grandes se crean en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar cadenas laterales grandes de aminoácidos con más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del 0 heterodímero con respecto a otros productos finales indeseados tal como homodímeros. [000178] Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a 5 avidina, el otro a biotina. Estos anticuerpos se han propuesto por ejemplo, para dirigir las células del sistema inmunitario a células indeseadas (Patente de los Estados Unidos No. 4,676,980), y para el tratamiento de infección por V1H (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089). Los 0 anticuerpos heteroconjugados se pueden elaborar usando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes reticuladores adecuados son bien conocidos en la téenica y se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 4,676,980, junto con varias técnicas de reticulación. 5 [000179] También se han descrito en la literatura técnicas para generar anticuerpos biespecífíeos de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecífíeos usando enlace químico. Brennan et al . , Science 229: 81 (1985) describe un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se escinden de manera proteolítica para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente formador de complejos de ditiol arsenita de sodio para esterilizar los ditioles vecinales e impedir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab1 generados entonces se convierten a derivados 0 de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB entonces se reconvierte al Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecífíeos producidos se 5 pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. [000180] También se han descrito varias téenicas para elaborar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivo de células recombinantes. Por 0 ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immuno 1. 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de la cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos por fusión 5 génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región de bisagra para formar monómeros y luego se re- oxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. El método también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La teenología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para producir fragmentos de anticuerpos biespecífíeos. Los fragmentos comprenden un dominio variable (VH) de cadena pesada conectado a un dominio variable (VL) de cadena ligera por un ligador que es demasiado corto para 0 permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan aparearse con los dominios VL y VH complementarios del otro fragmento, formando de este modo dos sitios de unión a antígeno. Otra estrategia para 5 elaborar fragmentos de anticuerpos biespecífíeos por el uso de dímeros de Fv de cadena individual (sFv) también se ha reportado. Ver Gruber et al . , J. Immunol . 152:5368 (1994). [000181] Los anticuerpos con dos o más valencias se contemplan. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos 0 triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol . 147: 60 (1991). (v) Anticuerpos Multivalentes [000182] En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos multivalentes. Un anticuerpo multivalente se puede internalizar (y/o catabolizar) más rápido que un 5 anticuerpo bivalente por una células que expresa un antígeno al cual se unen los anticuerpos. Los anticuerpos proporcionados en la presente pueden ser anticuerpos multivalentes (que son diferentes de la clase de IgM) con tres o más sitios de unión al antígeno ( por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que se pueden producir fácilmente por expresión recombinante de ácido nucleico que codifica para las cadenas de polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión al antígeno. El dominio preferido de dimerización comprende (o consiste de) 0 una región Fe o una región de bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de unión al antígeno amino-terminales a la región Fe. El anticuerpo multivalente preferido comprende en la presente o consiste de (o consiste de) tres a aproximadamente ocho, 5 pero de manera preferente cuatro sitios de unión al antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena de polipéptido (y de manera preferente dos cadenas de polipéptido), en donde las cadenas de polipéptido comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, las cadenas de 0 polipéptido pueden comprender VD1-(XI)n-VD2-(X2) n-Fc, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena de polipéptido de una región Fe, XI y X2 representan un aminoácido polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, las cadenas de polipéptido pueden 5 comprender: VH-CHl-ligador flexible -VH-CH1- y cadena de región Fe; o VH-CHl-VH-CHl-cadena de región Fe. El anticuerpo multivalente de manera preferente en la presente comprende además al menos dos (y de manera preferente) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente en la presente puede comprender, por ejemplo, de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados en la presente comprenden un dominio variable de cadena ligera, y opcionalmente, comprenden además un 0 dominio CL. [000183] En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico. El ejemplo de anticuerpo multiespecífíeos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena 5 pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL), donde la unidad VHVL tiene actividad poliepitópica, moléculas que tienen dos o más dominios VL y VH con cada unidad VHVL que se une a un epítopo diferente, anticuerpos que tienen dos o más dominios variables individuales con cada dominio 0 variable individual que se une a un epítopo diferente, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo tal como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos biespecíficos, triacuerpos, anticuerpos tri-funcionales, fragmentos de anticuerpo que se han enlazado covalentemente 5 o de manera no covalente. En algunas modalidades, el anticuerpo tiene especificidad poliepitópica; por ejemplo, la capacidad para unirse de manera especifica a dos o más epítopos diferentes en la misma o diferente diana. En algunas modalidades, los anticuerpos son monoespecífíeos; por ejemplo, un anticuerpo que se une a solo un epítopo. De acuerdo a una modalidad, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo tipo IgG que se une a cada epítopo con una afinidad de 5 mM a 0.001 pM, 3 mM a 0.001 pM, 1 mM a 0.001 pM, 0.5 mM a 0.001 M, o 0.1 mM a 0.001 pM. (vi) Otras Modificaciones de Anticuerpo 0 [000184] Puede ser deseable modificar el anticuerpo proporcionado en la presente con respectos a la función efectora, por ejemplo, para mejorar la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) del 5 anticuerpo. Esto se puede lograr al introducir una o más sustituciones de aminoácido en una región Fe del anticuerpo. De manera alternativa o adicionalmente, se pueden introducir residuos de cisteína en la región Fe, permitiendo de este modo formación de enlaces de disulfuro intercadena en esta 0 región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede tener capacidad mejorada de internalización y/o aniquilación celular incrementada mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Ver Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. 5 J., Inmuno 1. 148:2918-2922 (1992). También se pueden preparar anticuerpos homodiméricos con actividad anti- tumoral mejorada usando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al . , Cáncer Research 53:2560- 2565 (1993). De manera alternativa, se puede manejar un anticuerpo que tiene regiones Fe duales y puede tener de este modo lisis mejorada mediada por complemento y capacidades de ADCC. Ver Stevenson et al . , Antí -Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). [000185] Para incrementar la vida media en suero del anticuerpo, se pueden hacer alteraciones de aminoácidos en 0 el anticuerpo como se describe en US 2006/0067930, que se incorpora de este modo como referencia en su totalidad.

(B) Modificaciones y Variantes de Polipéptidos [000186] Se pueden usar modificaciones de secuencia de aminoácidos de los polipéptidos, incluyendo anticuerpos, 5 descritos en la presente, en los métodos para purificar polipéptidos {por ejemplo, anticuerpos) descritos en la presente. (i) Polipéptidos Variantes [000187] La "variante de polipéptido" significa un 0 polipéptido, preferentemente un polipéptido activo, como se define en la presente que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia nativa de longitud completa del polipéptido, una secuencia de polipéptido que carece del péptido de señal, un dominio 5 extracelular de un polipéptido, con o sin él péptido de señal. Estas variantes de polipéptido incluyen, por ejemplo, polipéptidos en donde se adicionan o se suprimen uno o más residuos de aminoácido en el N o C-término de la secuencia nativa de aminoácidos de longitud completa. Ordinariamente, una variante de polipéptido TAT tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, de manera alternativa al menos aproximadamente cualquiera de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% identidad de secuencia de aminoácidos, a una secuencia nativa de polipéptido de longitud completa, una secuencia de 0 polipéptido que carece del péptido de señal, un dominio extracelular de un polipéptido, con o sin él péptido de señal. Opcionalmente, los polipéptidos variante no tendrán más de una sustitución conservadora de aminoácido en comparación a la secuencia nativa de polipéptido, de manera alternativa no más de aproximadamente cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones conservadoras de aminoácido en comparación a la secuencia nativa de polipéptido. [000188] El polipéptido variante se puede truncar en el N-0 término o C-término o puede carecer por ejemplo de residuos internos, en comparación a un polipéptido nativo de longitud completa. Ciertos polipéptidos variantes pueden carecer de residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada. Estos polipéptidos variantes 5 con truncamientos, supresiones, inserciones se pueden preparar por cualquiera de varias téenicas convencionales. Los polipéptidos variantes deseados se pueden sintetizar químicamente. Otras técnicas adecuadas comprenden aislar y amplificar un fragmento de ácido nucleico que codifica para un polipéptido variante deseado, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen los términos deseados del fragmento de ácido nucleico se emplean en los cebadores 5' y 3' en la PCR. De manera preferente, los polipéptidos variantes comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido nativo descrito en la presente. [000189] Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxil-terminales que varían en longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen un ciento o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácido individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo N-terminal de metionilo o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al N- o C-término del anticuerpo a una enzima o un polipéptido que incrementa la vida media en suero del anticuerpo. [000190] Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del polipéptido. Se preparan variantes de secuencia de aminoácidos del polipéptido al introducir cambios apropiados de nucleótidos en el ácido nucleico de anticuerpo, o por síntesis peptídica. Estas modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencia de aminoácidos del polipeptido. Cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución se hace para arribar a la construcción final, con la condición que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos pos-traduccionales del polipéptido (por ejemplo, anticuerpo), tal como el cambio del número o posición de sitios de glicosilación. [000191] La guía en la determinación de que residuo de aminoácido se puede insertar, sustituir o suprimir sin afectar de manera adversa a la actividad deseada, se puede encontrar al comparar la secuencia del polipéptido con aquella de moléculas conocidas homologas de polipéptido y al reducir al mínimo el número de cambios de secuencia de aminoácidos hechos en las regiones de alta homología. [000192] Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) que son ubicaciones preferidas para mutagénesis se llama "mutagénesis de exploración de alanina" descrito por Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos diana se identifican (por ejemplo, residuos cargados tal como Arg, Asp, His, Lys, y Glu) y se reemplazan por un aminoácido neutral o negativamente cargado (más preferentemente, Alanina o Polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Estas ubicaciones de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones entonces se refinan al introducir adicionalmente u otras variantes en, para, los sitios de sustitución. De esta manera, en tanto que el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, no se necesita predeterminar la naturaleza de la mutación per se. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en 0 un sitio dado, se lleva a cabo la mutagénesis aleatoria o de exploración de alanina en el codón o región diana y las variantes expresadas de anticuerpo se examinan para la actividad deseada. [000193] Otro tipo de variante es una variante de 5 sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan 0 alteraciones de FR. En la Tabla 1 posterior se muestran las sustituciones conservadoras bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si estas sustituciones dan por resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir más cambios sustitucionales, denominados 5 "sustituciones de ejemplo" en la Tabla 1, o como se describe adicionalmente más adelante con referencia a las clases de aminoácidos, y los productos se examinan.

Tabla 1 [000194] Se logran modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del polipéptido al seleccionar sustituciones que difieren ligeramente en su efecto al mantener (a) la estructura del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Se pueden agrupar aminoácidos de acuerdo a similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, Bíochemístry second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) no polar: Ala (A), Val (V), Leu (L), lie (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) polares no cargados: Gly (G), Ser (S ), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) (3) ácidos: Asp (D), Glu (E) (4) básicos: Lys (K), Arg (R), His(H) [000195] De manera alternativa, se pueden dividir los residuos que se presentan de manera natural en grupos en base a las en propiedades comunes de cadena lateral (1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrófilos neutrales: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que tienen influencia en la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. [000196] Las sustituciones no conservadoras conllevaran el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. [000197] También se puede sustituir cualquier residuo de cisteína no comprendido en el manteniendo de la conformación apropiada del anticuerpo, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y para impedir la reticulación anormal. Por el contrario, se pueden 0 adicionar enlaces de cisteína al polipéptido para mejorar su estabilidad (particularmente donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv). [000198] Un tipo particularmente preferido de variante sustitucional comprende sustituir uno o más residuos de 5 región hipervariable de un anticuerpo de origen (por ejemplo, un anticuerpo humanizado). En general, las variantes resultantes seleccionadas para desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas con relación al anticuerpo de origen del cual se generan. Una 0 manera conveniente para generar estas variantes sustitucionales comprende maduración por afinidad usando visualización en fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de amino en cada 5 sitio. Las variantes de anticuerpo generadas de esta manera se visualizan de una manera monovalente de partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 empacada dentro de cada partícula. Las variantes visualizadas con fagos entonces se examinan para su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se describe en la presente. A fin de identificar los sitios candidatos de región hipervariable para modificación, se puede realizar la mutagénesis de exploración de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyen de manera significativa a la unión al antígeno. De manera alternativa, o adicionalmente, se puede beneficiar para analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y la diana. Estos residuos de contacto y los residuos vecinos son candidatos para sustitución de acuerdo a las téenicas elaboradas en la presente. Una vez que se generan estas variantes, el panel de variantes se somete a examen como se describe en la presente y para desarrollo adicional se pueden seleccionar los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos pertinentes. [000199] Otro tipo de variante de aminoácido del polipéptido altera el patrón original de glicosilación del anticuerpo. El polipéptido puede comprender porciones no de aminoácido. Por ejemplo, el polipéptido puede estar glicosilado. Esta glicosilación puede presentarse de manera natural durante la expresión del polipéptido en la célula hospedadora u organismo hospedador, o puede ser una modificación deliberada que surge de intervención humana. Por alteración se quiere decir supresión de una o más porciones de carbohidratos encontradas en el polipéptido, y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el polipéptido. [000200] La glicosilación del polipéptido es ya sea típicamente N-enlazadas u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para unión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptíficas en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación. La glicosilación O-enlazada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. [000201] La adición de sitios de glicosilación al polipéptido se logra convenientemente al alterar la secuencia de aminoácidos tal que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación N-enlazados). La alteración también se puede hacer por la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación O- enlazados). [000202] La remoción de porciones de carbohidrato presentes en el polipéptido se puede lograr de manera química o enzimáticamente o por sustitución mutacional de codones que codifican para residuos de aminoácido que sirven como diana para glicosilación. La escisión enzimática de las porciones de carbohidrato en el polipéptido se puede lograr por el uso 0 de una variedad de endo- y exo-glicosidasas. [000203] Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos de glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, 5 fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilación de los grupos aa -amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina, acetilación de la amina N-terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal. 0 (ii) Polipéptidos quiméricos [000204] El polipéptido descrito en la presente se puede modificar de una manera para formar moléculas quiméricas que comprenden el polipéptido fusionado a otro polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos. En algunas 5 modalidades, una molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido con un polipéptido de marca que proporciona un epitopo al cual puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-marca. La marca de epitopo se coloca en general en el amino- o carboxil-término del polipéptido. La presencia de estas formas de polipéptido marcadas con epitopo se puede detectar usando un anticuerpo contra el polipéptido de marca. También, la provisión de la marca de epitopo permite que el polipéptido se purifique fácilmente por purificación de afinidad usando un anticuerpo anti-marca u otro tipo de matriz de afinidad que se une a la marca de epitopo. [000205] En una modalidad alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Una forma bivalente de la molécula quimérica se refiere como una "inmunoadhesina". [000206] Como se usa en la presente, el término "inmunoadhesina" designa moléculas tipo anticuerpos que combinan la especificidad de unión de un polipéptido heterólogo con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad deseada de unión que es diferente del reconocimiento de antígeno y el sitio de unión de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga"), y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia contigua de aminoácidos que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina se puede obtener de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3, o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 y IgA-2), IgE, IgD o IgM. [000207] Las fusiones de Ig incluyen preferentemente la sustitución de una forma soluble (inactivada o suprimida de dominio transmembrana) de un polipéptido en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En 0 una modalidad particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones de bisagra, CH2 y CH3, o las regiones de bisagra CHi, C¾ y CH3 de una molécula de IgGl. (iii) Conjugados de polipéptido 5 [000208] El polipéptido para el uso en las formulaciones de polipéptido se puede conjugar a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, 0 vegetal, o animal, o fragmentos de esto), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado). [000209] Se pueden usar agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de estos conjugados. Además, se pueden usar toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas 5 para incluir cadena de difteria A, fragmentos activos no de unión de toxina de difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosas), cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Están disponibles una variedad de radionucleidos para la producción de polipéptidos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 0 131I, 131In, 90Y y 186Re. Los conjugados del polipéptido y agente citotóxico se elaboran usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tal como N- succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como dimetil-adipimidato HCL), ásteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tal como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tal como bis(p- azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos 0 (tal como tolueno-2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricino como se describe en Vitetta et al, Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen-triamino-5 pentaacético marcado con carbono-14 (MX-DTPA) es un agente quelador de ejemplo para la conjugación del radionucleótido al polipéptido. [000210] Los conjugados de un polipéptido y una o más toxinas de molécula pequeña, tal como caliqueamicina, maitansinoides, un tricoteno, y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se contemplan en la presente. [000211] Los maitansinoides son inhibidores mitotóticos que actúan al inhibir la polimerización de tubulina. Se aisló primero la maitansina del arbusto Africano del Este aytenus 0 serrata. Subsiguientemente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tal como maitansinol y ésteres de maitansinol C-3. También se contemplan maitansinol sintético y derivados y análogos del mismo. Hay muchos grupos de enlace conocidos en la téenica 5 para elaborar conjugados de polipéptido-maitansinoide, incluyendo, por ejemplo, aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos, No. 5,208,020. Los grupos de enlace incluyen grupos de disufuro, grupos de tioéter, grupos lábiles ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles de 0 peptidasa o grupos lábiles de esterasa, como se describe en las patentes identificadas anteriormente, que se prefieren grupos de disulfuro y tioéter. [000212] El ligador se puede unir a la molécula de maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo del 5 enlace. Por ejemplo, se puede formar un enlace éster por reacción con un grupo hidroxilo usando téenicas convencionales de acoplamiento. La reacción puede presentarse en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol. [000213] Otro conjugado de interés comprende un polipéptido conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de calicheamicina son capaces de producir rupturas de ADN de doble hebra a concentraciones sub-picomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de caliqueamicina, ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No.5,712,374. Los análogos estructurales de caliqueamicina que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, g?1, a2I, 0Í31, N-acetil-yl1, PSAG y Q11. Otro fármaco anti-tumor con el cual se puede conjugar el anticuerpo es QFA que es un antifolato. Tanto calicheamicina como QFA tienen sitios intracelulares de acción y no cruzan fácilmente la membrana de plasma. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) mejora bastante sus efectos citotóxicos. [000214] Otros agentes antitumorales que se pueden conjugar a los polipéptidos descritos en la presente incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288, así como esperamicinas. [000215] En algunas modalidades, el polipéptido puede ser un conjugado entre un polipéptido y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, ribonucleasa o una ADN- endonucleasa tal como una desoxirribonucleasa; DNasa). [000216] En aun otra modalidad, el polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) se puede conjugar a un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en la pre-dirección 0 a diana tumoral en donde el conjugado de polipéptido- receptor se administra al paciente, seguido por remoción del conjugado no unido de la circulación usando un agente depurador y luego la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido). [000217] En algunas modalidades, el polipéptido se puede conjugar con una enzima activadora de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo) a un fármaco anti-cáncer 0 activo. El componente enzimático del inmunoconjugado incluye cualquier enzima capaz de actuar en un profármaco de una manera tal para convertirlo en su forma citotóxica más activa. [000218] Las enzimas que son útiles incluyen, pero no se 5 limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citocina-desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anti cáncer, 5-fluorouracilo; proteasas, tal como proteasa de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tal como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptido en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácidos; enzimas que escinden carbohidratos, tal como b-galactosidasa y neuraminidasa útil para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; b-lactamasa útil para convertir fármacos derivatizados con b-lactamas en fármacos libres; y penicilina-amidasas, tal como penicilina V-amidasa o penicilina G-amidasa, útil para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. De manera alternativa, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la téenica como "abzimas", se pueden usar para convertir los profármacos en fármacos libres activos. (iv) Otros [000219] Otro tipo de modificación cova lente del polipéptido comprende enlazar el polipéptido a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos, o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El polipéptido también puede ser atrapado en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por téenicas de coacervación o por polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetil- celulosa o microcápsulas de gelatina u microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente), en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano- partículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Estas 0 técnicas se describen en Remington Pharmaceutical Sciences, 18- edición, Gennaro, AR, Ed., (1990).

IV. Obtención de polipéptidos para el uso en las formulaciones y métodos [000220] Los polipéptidos usados en los métodos de análisis 5 descrito en la presente se obtienen usando métodos bien conocidos en la técnica, que incluye los métodos de recombinación. Las siguientes secciones proporcionan guía con respecto a estos métodos.

(A) Polinucleótidos 0 [000221] "Polinucleótido", o "ácido nucleico", como se usa de manera indistinta en la presente, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluye ADN y ARN. [000222] Se pueden obtener polinucleótidos que codifican para los polipéptidos a partir de cualquier fuente 5 incluyendo, pero no limitado a, una biblioteca de ADNc preparada de tejido que se cree que posee el ARNm de polipéptido y los expresa a un nivel detectable. Por consiguiente, los polinucleótidos que codifican para polipéptidos se pueden obtener de manera conveniente de una biblioteca de ADNc preparada de tejido humano. El gen que codifica para polipéptido también se puede obtener de una biblioteca genómica o por procedimientos conocidos de síntesis (por ejemplo, síntesis automatizada de ácidos nucleicos). [000223] Por ejemplo, el polinucleótido puede codificar 0 para una cadena completa de molécula de inmunoglobulina, tal como una cadena ligera o una cadena pesada. Una cadena pesada completa incluye solo una región variable de cadena pesada (VH), sino también una región constante de cadena pesada (CH), que típicamente comprenderá tres dominios 5 constantes: CH1, CH2 y CH3; y una región de "bisagra". En algunas situaciones, es deseable la presencia de una región constante. [000224] Otros polipéptidos que se pueden codificar por el polinucleótido incluyen fragmentos de anticuerpo de unión al 0 antígeno tal como anticuerpos de dominio individual ("cLAbs"), Fv, scFv, Fab' y F(ab')2 y "minicuerpos". Los minicuerpos son fragmentos de anticuerpo (típicamente) bivalentes de los cuales se ha escindido el domino CH1 y CK o CL. Puesto que los minicuerpos son más pequeños que los 5 anticuerpos convencionales deben lograr mejor penetración en tejido en el uso clínico/diagnóstico, pero al ser bivalentes deben retener mayor afinidad de unión que los fragmentos de anticuerpos monovalentes, tal como dAb. Por consiguiente, a menos que el contexto indique lo contrario, el término "anticuerpo" como se usa en la presente abarca no solo moléculas enteras de anticuerpo, sino también fragmentos de anticuerpo de unión al antígeno del tipo analizado anteriormente. De manera preferente, cada región menos variable presente en el polipéptido codificado comprenderá al menos una sustitución de aminoácido con relación a la correspondiente estructura de aceptador humano. De esta manera, por ejemplo, las regiones menos variables pueden comprender, en total, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, o quince sustituciones de aminoácido con relación a las regiones menos variables de aceptador.

VI. Modalidades de ejemplo [000225] 1. En una modalidad, la invención proporciona un método para analizar una composición que comprende un polipéptido y uno o más contaminantes, el método que comprende a) unir el polipéptido y uno o más contaminantes a un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga, en donde el amortiguador de carga está a un primer pH y comprende una primera concentración iónica; b) eluir el polipéptido y uno o más contaminantes del material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se altera en un gradiente de pH y la concentración iónica del amortiguador de elución se altera en un gradiente de concentración iónica, en donde el polipeptido y el uno o más contaminantes se separan por la combinación de gradiente de pH y gradiente de concentración iónica; c) detectar el polipéptido y el uno o más contaminantes. En algunos aspectos de esta modalidad, la invención proporciona métodos para analizar polipéptidos en composiciones que comprenden un polipéptido y uno o más contaminantes, en donde el método separa uno o más contaminantes del polipéptido, el método que comprende a) unir el polipéptido y el uno o más contaminantes a un material de cromatografía de intercambio iónico usado un amortiguador de carga, en donde el amortiguador de carga está a un primer pH y comprende una primera concentración iónica; b) eluir el polipéptido y el uno o más contaminantes del material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se altera en un gradiente de pH y la concentración iónica del amortiguador de elución se altera en un gradiente de concentración iónica, en donde el polipéptido y el uno o más contaminantes se separan por la combinación de gradiente de pH y gradiente de concentración iónica; c) detectar el polipéptido y el uno o más contaminantes, en donde el método se usa para analizar polipéptidos que tienen un ml que varía de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 9.5. [000226] 2. En una modalidad adicional de la modalidad 1, el polipéptido es un anticuerpo o inmunoadhesina o fragmento del mismo. [000227] 3. En una modalidad adicional de las modalidades 1 o 2, el polipéptido es un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo. [000228] . En una modalidad adicional de las modalidades 2 o 3, el anticuerpo es un anticuerpo humano. [000229] 5. En una modalidad adicional de las modalidades 2 o 3, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. [000230] 6. En una modalidad adicional de las modalidades 2 o 3, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. [000231] 7. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 2-6, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. [000232] 8. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 1-7, el contaminante es una variante del polipéptido. [000233] 9. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 1-7, el contaminante es un producto de degradación del polipéptido. Por ejemplo, una variante de carga. [000234] 10. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 1-9, el polipéptido tiene un pl mayor de aproximadamente 9.0. [000235] 11. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 1-10, el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio catiónico. [000236] 12. En una modalidad adicional de la modalidad 11, el material de cromatografía de intercambio catiónico es un material de cromatografía sulfonado o un material de cromatografía carboxilado. [000237] 13. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 1-12, el gradiente de pH es un gradiente 0 lineal. [000238] 14. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 1-12, el gradiente de pH es un gradiente gradual. [000239] 15. En una modalidad adicional de las modalidades 13 o 14, el gradiente de pH comprende un incremento de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 11. [000240] 16. En otra modalidad de cualquiera de las modalidades 1-15, el gradiente de pH se genera usando uno o más amortiguadores. 0 [000241] 17. En una modalidad adicional de la modalidad 15, el uno o más amortiguadores se seleccionan de piperazina, imidazol, tris, fosfato, o CAPS. [000242] 18. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 1-17, el gradiente de concentración iónica 5 es un gradiente lineal. [000243] 19. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 1-17, el gradiente de concentración iónica es un gradiente gradual. [000244] 20. En una modalidad adicional de las modalidades 18 o 19, el gradiente de concentración iónica comprende un incremento en la concentración de sal de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 200 mM. [000245] 21. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 18-20, el gradiente de concentración iónica es un gradiente de NaCl, un gradiente de KC1, o un gradiente de Na2SO4. [000246] 22. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 1-9, el polipéptido tiene un ml menor de aproximadamente 7.0. [000247] 23. En una modalidad adicional de la modalidad 22, el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio aniónico. [000248] 24. En una modalidad adicional de la modalidad 23, el material de cromatografía de intercambio aniónico es un material de cromatografía de amina cuaternaria o un material de cromatografía de amina terciaria. [000249] 25. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 22-24, el gradiente de pH es un gradiente lineal. [000250] 26. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 22-24, el gradiente de pH es un gradiente gradual. [000251] 27. En una modalidad adicional de las modalidades 25 o 26, el gradiente de pH comprende una disminución de aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH 5. [000252] 28. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 22-27, el gradiente de pH se genera usando uno o más amortiguadores. [000253] 29. En una modalidad adicional de la modalidad 28, el uno o más amortiguadores se seleccionan de piperazina, imidazol o Tris. 0 [000254] 30. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 22-29, el gradiente de concentración iónica es un gradiente lineal. [000255] 31. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 22-29, el gradiente de concentración iónica es un gradiente gradual. [000256] 32. En una modalidad adicional de la modalidad 30 o 31, el gradiente de concentración iónica comprende un incremento en la concentración de sal de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 200 mM. 0 [000257] 33. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 30-32, el gradiente de concentración iónica es un gradiente de NaCl, un gradiente de KC1, o un gradiente de Na2SO4. [000258] 34. En una modalidad, la invención proporciona un 5 método para analizar una composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes, el método que comprende a) unir el polipéptido y uno o más contaminantes a un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga, en donde el amortiguador de carga está a un pH inicial y comprende una concentración iónica inicial; b) eluir el polipéptido y uno o más contaminantes del material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se altera en un gradiente de pH y en donde la concentración iónica del amortiguador de elución es 0 esencialmente el mismo como la concentración iónica inicial del amortiguador de carga, en donde el polipéptido y el uno o más contaminantes se separan por gradiente de pH a aproximadamente la concentración iónica inicial; c) detectar el polipéptido y el uno o más contaminantes. En algunos 5 aspectos de esta modalidad, la invención proporciona un método para analizar polipéptidos en composiciones que comprenden un polipéptido y uno o más contaminantes, el método que comprende a) unir el polipéptido y uno o más contaminantes a un material de cromatografía de intercambio 0 iónico usando un amortiguador de carga, en donde el amortiguador de carga está a un pH inicial y comprende una concentración iónica inicial; b) eluir el polipéptido y uno o más contaminantes del material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en 5 donde el pH del amortiguador de elución se altera en un gradiente de pH y en donde la concentración iónica del amortiguador de elución es esencialmente la misma como la concentración iónica inicial del amortiguador de carga, en donde el polipéptido y el uno o más contaminantes se separan por gradiente de pH a aproximadamente la concentración iónica inicial; c) detectar el polipéptido y el uno o más contaminantes, en donde el método se usa para analizar polipéptidos que tienen un ml que varía de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 9.5. [000259] 35. En una modalidad adicional de la modalidad 34, el polipéptido es un anticuerpo o inmunoadhesina o fragmento de esto. [000260] 36. En una modalidad adicional de las modalidades 34 o 35, el polipéptido es un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo. [000261] 37. En una modalidad adicional de las modalidades 35 o 36, el anticuerpo es un anticuerpo humano. [000262] 38. En una modalidad adicional de la modalidad 35 o 36, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. [000263] 39. En una modalidad adicional de las modalidades 35 o 36, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. [000264] 40. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 35-39, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. [000265] 41. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 34-40, el contaminante es una variante del polipéptido. [000266] 42. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 34-40, el contaminante es un producto de degradación del polipéptido. [000267] 43. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 34-42, el polipéptido tiene un ml mayor de aproximadamente 9.0. [000268] 44. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 34-43, el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio catiónico. 0 [000269] 45. En una modalidad adicional de la modalidad 44, el material de cromatografía de intercambio catiónico es un material de cromatografía sulfonado o un material de cromatografía carboxilado. [000270] 46. En una modalidad adicional de cualquiera de 5 las modalidades 34-45, el gradiente de pH es un gradiente lineal. [000271] 47. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 34-45, el gradiente de pH es un gradiente gradual. 0 [000272] 48. En una modalidad adicional de la modalidad 46 o 47, el gradiente de pH comprende un incremento de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 11. [000273] 49. En otra modalidad de cualquiera de las modalidades 34-48, el gradiente de pH se genera usando uno o 5 más amortiguadores. [000274] 50. En una modalidad adicional de la modalidad 49, el uno o más amortiguadores se seleccionam de piperazina, imidazol, tris, fosfato, o CAPS. [000275] 51. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 34-50, la concentración iónica del amortiguador de elución es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 100 mM. [000276] 52. En una modalidad adicional de la modalidad 51, el amortiguador de elución comprende aproximadamente NaCl 0 mM a aproximadamente NaCl 100 mM, aproximadamente KC10 mM a 0 aproximadamente KC1100 mM, o aproximadamente Na2SO40 mM a aproximadamente Na2S04100 mM. [000277] 53. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 34-42, el polipéptido tiene un ml menor de aproximadamente 7.0. 5 [000278] 54. En una modalidad adicional de la modalidad 53, el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio aniónico. [000279] 55. En una modalidad adicional de la modalidad 54, el material de cromatografía de intercambio aniónico es un 0 material de cromatografía de amina cuaternaria o un material de cromatografía de amina terciaria. [000280] 56. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 53-55, el gradiente de pH es un gradiente lineal. 5 [000281] 57. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 53-55, el gradiente de pH es un gradiente gradual. [000282] 58. En una modalidad adicional de las modalidades 56 o 57, el gradiente de pH comprende una disminución de aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH 5. [000283] 59. En otra modalidad de cualquiera de las modalidades 53-58, el gradiente de pH se genera usando uno o más amortiguadores. [000284] 60. En una modalidad adicional de la modalidad 59, el uno o más amortiguadores se seleccionan de piperazina, 0 imidazol o Tris. [000285] 61. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 53-60, la concentración iónica del amortiguador de elución es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 100 mM. 5 [000286] 62. En una modalidad adicional de la modalidad 61, el amortiguador de elución comprende aproximadamente NaCl 10 mM a aproximadamente NaCl 100 mM. [000287] 63. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 1-62, el análisis es por cromatografía 0 líquida de alto desempeño. [000288] 64. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 1-63, la concentración del amortiguador en el amortiguador de carga y/o el amortiguador de elución varía de 10 mM a aproximadamente 50 mM. 5 [000289] 65. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 1-64, el primer pH varía de aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 7.0. [000290] 66. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 1-65, la temperatura del material de cromatografía varía de aproximadamente 20°C a aproximadamente 50°C. [000291] 67. En una modalidad adicional de cualquiera de las modalidades 1-66, la carga y elución se llevan a cabo a una velocidad de flujo que varía de aproximadamente 0.5 ml/min a aproximadamente 2.0 ml/min. 0 [000292] 68. En otra modalidad, la invención proporciona un método para determinar la pureza de un polipéptido en una composición que comprende analizar la composición de acuerdo con cualquiera de los métodos de las modalidades 1 a 67 y determinar la relación del polipéptido a los contaminantes 5 en la composición. [000293] 69. En otra modalidad, la invención proporciona un método para determinar la estabilidad de un polipéptido en una composición que comprende el polipéptido, el método comprende, a) incubar la composición que comprende el 0 polipéptido a 0°C a 40°C durante unas seis semanas, b) analizar la composición del paso a) por cualquiera de los métodos de las modalidades 1 a 67, y c) determinar la relación de variantes al polipéptido en la composición, en donde un incremento en la relación de variantes al 5 polipéptido en la composición en comparación a una composición que no se incubó indica la degradación del polipéptido en la composición. [000294] Todas las características descritas en esta especificación se pueden combinar en cualquier combinación. Cada característica descrita en esta especificación se puede reemplazar por una característica alternativa que sirve para el mismo, equivalente, o similar propósito. De esta manera, a menos que se señale expresamente de otro modo, cada característica descrita es solo un ejemplo de una serie genérica de equivalentes o características similares. 0 [000295] En los siguientes ejemplos no limitantes se ilustran detalles adicionales de la invención. Las descripciones de todas las referencias en la especificación se incorporan expresamente en la presente como referencia.

Ejemplos 5 [000296] Los siguientes ejemplos se proponen para ser puramente ejemplares de la invención y por lo tanto no se deben considerar para limitar la invención de ninguna manea. Los siguientes ejemplos y descripción detallada se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación. 0 Materiales y Métodos para los ejemplos [000297] Se usaron los siguientes materiales y métodos para los ejemplos a menos que se indique de otra manera.

Materiales [000298] Todos los mAb se fabricaron internamente en 5 Genentech (South San Francisco, CA) usando líneas de células de Ovario de Hámster Chino (CHO) estables. Los valores de pl para los mAb usados se determinaron experimentalmente usando un protocolo icIEF del fabricante de instrumentos (Wu, J ynd Huang, T (2006) Electrophoresis 27:3584) que emplea siete marcadores de ml. Se obtuvieron muestras en estrés térmico al incubar mAb a 40°C durante 3 y 6 semanas, respectivamente. Los mAb estresados se almacenaron a -80°C antes del análisis cromatográfico. [000299] Las columnas Propac WCX-10 se adquirieron de Dionex. El imidazol se obtuvo de EMD Biosciences o de Fluka. 0 La piperazina (anhidra) se adquirió de Tokyo Chemical Industry Co. LTD. Trisma (Tris) se obtuvo de Mallinckrodt Baker Inc. o Sigma (St. Louis, MO)., la base Trizma y CAPS se obtuvieron de Sigma. El cloruro de sodio, hidróxido de sodio (10 N) y ácido clorhídrico (12 N) se obtuvieron de 5 Mallinckrodt Baker Inc. El ácido fosfórico (85%) se obtuvo de EMD Millipore.

Configuración de la HPLC [000300] Los experimentos de cromatografía de intercambio catiónico se llevaron a cabo principalmente en un 0 instrumento de cromatografía líquida Waters 2796 BioAlliance o un UltiMate 3000 Quaternary Rapid Separation LC (Thermo Scientific Dionex). El instrumento incluyó una bomba gradiente cuaternaria de baja presión, un auto-muestreador con capacidad de control de temperatura, un compartimiento 5 térmico de columna para el control de temperatura preciso, y un detector UV de arreglo de diodo de longitud de onda doble. En la salida de la columna, un sensor de pH en línea (Modelo S450CD de Sensorex) y un sensor de conductividad (Modelo 529 de Amber Sicence, Eugene, OR) se conectaron en tándem. El sensor de pH se controló por un medidor modelo Seven Multi pH de Mettler Toledo; el sensor de conductividad se controló por un medidor de conductividad digital modelo 1056 de Amber Science. Las lecturas de pH y conductividad de los dos medidores se recolectaron en Chromeleon a través de un convertidor análogo/digital Dionex UCI 50. El control del 0 instrumento, la adquisición de datos, y el análisis de los datos se llevaron a cabo con el software Dionex Chromeleon, versión 6.8.

Preparación de la Fase Móvil [000301] Las soluciones amortiguadoras concentradas 5 individuales de tris e imidazol se prepararon a 1.0 M y una solución de CAPS se preparó en la concentración de 0.1 M, sin ajustar el valor de pH y se almacenó a temperatura ambiente. Una solución amortiguadora concentrada que contiene piperazina 40 mM, imidazol 40 mM, y Tris 40 mM 0 (todas bases libres) primero se preparó sin ajustar el valor de pH y se almacenó a temperatura ambiente. Antes de los experimentos cromatográficos, una serie de amortiguadores de fase móvil que contienen una concentración equimolar de piperazina, imidazol y Tris a l, 2, 4 o 8 mM, se fabricaron 5 cada uno al diluir la solución amortiguadora concentrada con agua desionizada. Los valores de pH de los amortiguadores después se ajustaron usando ácido clorhídrico a 5.0 (Amortiguador A) y 10.8 (Amortiguador B), respectivamente. La solución de cloruro de sodio de 0.5 M se preparó con agua desionizada (Solución Salina). Las fases móviles después se filtraron individualmente a través de un filtro de nailon de 0.2 mM antes del uso. [000302] Los amortiguadores de fase móvil con piperazina 11.6 mM, imidazol 1.5 mM y Tris 2.4 mM se prepararon como se reporta en la literatura (Farnan, D y Moreno, GT (2009) 0 Anal . Chem. 81:8846; Rea, JC et al . (2010) J. Pharm. Biomed. Anal . 54:317). Una solución diez veces concentrada que contiene piperazina 116 mM, imidazol 15 mM y Tris 24 mM primero se prepararon y se almacenaron a temperatura ambiente. Antes de cada experimento, dos alícuotas de la solución concentrada se diluyeron 10 veces con agua desionizada y sus valores de pH se ajustaron subsecuentemente usando ácido clorhídrico a 5.0 (Amortiguador C) y 9.5 (Amortiguador D). Las fases móviles después se filtraron individualmente a través de un filtro 0 de nailon de 0.2 mM antes del uso.

Cromatografía de Intercambio catiónico [000303] A menos que se establezca de otra manera, las condiciones cromatográficas fueron como sigue. Las muestras de mAb (control y estresadas) se diluyeron a 2 mg/mL con 5 agua desionizada y se mantuvieron a 5±3°C en el auto- muestreador. De manera alternativa, las muestras de mAb se diluyeron a 1 mg/mL con una mezcla de 1:1 de amortiguadores A y D y se mantuvieron a 5±3°C en el auto-muestreador. La columna Propac WCX-10HT, 4 x 50 mm se colocó en el compartimiento de columna con el ajuste de temperatura a 40±1°C. Una columna Dionex Propac WCX 4x250 mm se utilizó para la separación cromatográfica y se colocó en el compartimiento de columna con el ajuste de temperatura a 40+l°C. Para cada corrida cromatográfica, se inyectaron 10 mL de proteína (20 pg). 0 [000304] Se estableció el gradiente de pH mediado con sal al usar un gradiente ternario formado en la bomba cuaternaria usando los amortiguadores A, B y la Solución Salina (NaCl 0.5 M). Se suministró un gradiente lineal de 100% de A a 96.8% de B y 3.2% de solución salina en 58 minutos para establecer un gradiente de pH de 5.0 a 10.8 (unidad/min de pH 0.1) y un gradiente salino de mediación de NaCl 0 a 16 mM (0.28 mM/min). El gradiente final (min, %B y C) fue como sigue: 0, 100% de A; 2, 100% de A; 60, 96.8% de B y 3.2% de C; 64, 96.8% de B y 3.2% de C; 65, 100% de A; 0 75, 100% de A. La velocidad de flujo de fase móvil fue 1.0 mL/min. [000305] El gradiente de pH reportado de 5.0 a 9.5 (Farnan, D y Moreno, GT (2009) Anal . Chem. 81:8846) se estableció por el amortiguador C y D. Se suministró un incremento lineal 5 del amortiguador D de 0 a 100% en 45 minutos para establecer un gradiente de pH de 5.0 a 9.5 (unidad/min de pH 0.1). La velocidad de flujo de fase móvil fue 1.0 mL/min. Las proteínas se detectaron por absorbancia ultravioleta (UV) a 280 nm. [000306] Se estableció un gradiente de pH híbrido al utilizar un gradiente cuaternario formado en la bomba cuaternaria usando los amortiguadores A, B, C y D. Este arreglo ofreció la flexibilidad de ajustar 1) el pH de partida y terminación, usando los amortiguadores A y B y 2) la cantidad de sal para cada gradiente, usando los 0 amortiguadores C y D. Un ejemplo de los métodos utilizados en estos experimentos, un gradiente de pH de 6 a 10, con una concentración de sal constante de 10 mM, se estableció por un incremento del amortiguador B de 0 a 40%, mientras que se mantienen los amortiguadores C y D a 10% y 40%, 5 respectivamente. Los gradientes utilizados se utilizan en la Tabla 2.

Modelación de pH-IEC [000307] El pH del gradiente de mezclado lineal de dos amortiguadores de pH se estimó usando la ecuación de 0 Henderson-Hasselbalch (H-H) para cada uno de los componentes basados en el modelo de solución ideal. El número de protones/disociables primera se determinó para cada amortiguador de partida y subsecuentemente para cada valor de pH entre los dos amortiguadores en un paso de unidad de 5 pH de 0.1. Basado en el número de protones requeridos, se derivó la relación molar de los dos amortiguadores. Se obtuvo el porcentaje de cada amortiguador para lograr un punto de pH en el gradiente. En cada punto de pH, se calculó la concentración iónica usando los componentes iónicos estimados.

Ejemplo 1. Evaluación de un Metodo pH-IEC [000308] Se evaluó el desempeño de un método pH-IEC. Aunque el método pH-IEC reportado muestra la capacidad para perfilar la heterogeneidad de carga de múltiples mAb, se propone principalmente para los mAb con valores de ml de 0 aproximadamente 7 a 9. Para los mAb más allá de este intervalo (pl<7 o pl>9, también referido como valores de pl extremos), el método pH-IEC produce frecuentemente perfiles de heterogeneidad de carga inaceptables. Para evaluar el método, se produjo un gradiente de pH de 5.0 a 9.5 siguiendo el procedimiento que se reportó previamente (Farnan, D y Moreno, GT (2009) Anal . Chem. 81:8846; Rea, JC et al . (2010) J. Pharm. Biomed. Anal . 54:317). Los amortiguadores estuvieron compuestos de piperazina 11.4 mM, imidazol 1.5 mM y Tris 2.4 mM y el pH se ajustó a 5.0 y 9.5, 0 respectivamente. Se analizaron tres mAb que abarcan un amplio intervalo de pl (6.2, 8.2 y 9.4) y los cromatogramas resultantes se muestran en la Figura 1. De estos mAb, solo el mAb2 (pl 8.2) mostró un perfil de heterogeneidad de carga aceptable caracterizado por una buena separación de las 5 variantes de carga. Las variantes de carga de mAbl de pl bajo (pl=6.2) no se separaron bien; el mAb3 de ml alto (pl 9.4) no se eluyó durante el gradiente de pH. Aún que el mAb3 se eluyó cuando el gradiente de pH se extendió a pH 10.8, la presión posterior de la columna se cerró al límite de presión superior de la columna y los perfiles de cromatografía fueron inconsistentes entre las diferentes corridas. Este experimentó mostró claramente que aunque el método pH-IEC reportado funcionó bien para los mAb con valores de pl entre 7 y 9, no fue capaz de perfilar la heterogeneidad de carga de los mAb con valores de pl extremos.

Tabla 2. Gradientes de Muestra Para muestras con valores de ml entre 7.2-8.3 - I ; , i , . . . “ . . . . . . . . . . . . . . . . . l . . - i . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l . . - , ; i . . . . . . . . . . . . . . . : . . - . - , i i - i . i . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [000309] El pH en la salida de la columna se incrementó de 5.0 a 9.5, la conductividad del solvente disminuyó en una forma casi lineal de 2700 a 800 pS/m (cabe destacar que la conductividad de KC1 5 mM es 720 pS/m mientras que la conductividad del agua desionizada es 5.5 pS/m). Los tres componentes del amortiguador de pH todos son aminas con pKa sobre un amplio intervalo: piperazina con pKal = 5.68 y pKa2 = 9.82, imidazol con pKa = 6.95 y Tris con pKa = 8.10 (a temperatura ambiente). Estos compuestos se protonaron (o se cargaron) cuando el pH de solución es menor que su pKa, pero es neutro cuando el pH está por arriba de su pKa. Cuando el pH de solvente se incrementa, los componentes de amortiguador se vuelven gradualmente neutros del protonado y de esta manera se disminuye la conductividad del 0 amortiguador. Hay que destacar que el perfil de pH fue cóncavo al pH de aproximadamente 6 debido a que la piperazina fue el componente más abundante en el amortiguador de modo que la curva de pH fue relativamente plana a aproximadamente sus dos pKa de 5.68 y 9.82. 5 [000310] Los perfiles de pH y concentración iónica del gradiente de pH también se calcularon basado en un modelo de solución ideal mostrado como líneas punteadas en la Figura 2A. La curva de pH modelado es muy similar al perfil de pH experimental excepto porque el perfil experimental se 0 retrasó por 5 minutos debido al volumen de permanencia y volumen de columna del sistema. Del mismo modo, la curva de concentración iónica modelada mostró una forma similar como el perfil de conductividad observado experimentalmente. El acuerdo entre los datos de modelación y experimentales 5 suguiere que el mezclado de los componentes del amortiguador basado en amina siguió el modelo de solución ideal. El modelo establecido se puede utilizar de esta manera para estimar los perfiles de pH y concentración iónica experimentales en otras condiciones de cromatografía. [000311] Adicionalmente, la presión posterior de la columna durante pH-lEC se incrementó significativamente con el pH de la fase móvil (Figura 2B). Esto se atribuye a la disminución de la concentración iónica, considerando que la composición de la fase móvil fue constante durante el gradiente de pH. Cuando la concentración iónica de la fase móvil es baja, el potencial electrostático en la superficie de fase estacionaria se vuelve alta, de acuerdo con el modelo de doble capa (Staahlberg, J (1994) Anal . Chem. 66:440; Stahlberg, J (1999) J. Chromatogr. A 855:3). El potencial electrostático alto puede cambiar la conformación de la resina (por ejemplo el hinchamiento de la resina para reducir la densidad de carga superficial), que incrementa probablemente la presión posterior de la columna (Product Manual for Propac WCX-10 y Propac SCX-10, 7th ed., Dionex Incorporation, Sunnyvale, CA, 2007). [000312] La conductividad experimental y los perfiles de concentración iónica modelados se pueden utilizar para explicar los perfiles de heterogeneidad de carga deficientes para los mAb con valores de ml extremos. Los mAb de pl bajo se eluyen en la región de pH bajo donde los componentes del amortiguador se protonan y la fase móvil tiene una concentración iónica relativamente alta. Puesto que la separación de IEC del gradiente de pH parece que implica una combinación de mecanismo de elución basados en concentración iónica y basados en pH (Anderson, DJ y Shan, L (2001) Clin . Chem. 47:128; Shan, L y Anderson, DJ (2001) J. Chromatogr . A 909:191; Shan, L y Anderson, DJ (2002) Anal . Chem. 74:5641), la elución basada en concentración iónica alta puede mezclarse con la elución basada en pH, conduciendo a una resolución deficiente de estas variantes de carga de mAb de ml bajo. Por otra parte, los mAb de pl alto se eluyen 0 típicamente en la región de pH alto donde los componentes del amortiguador son neutros. Debido que la concentración iónica baja en la fase móvil, estos mAb de pl altos son difíciles de eluir de las columnas de intercambio catiónico. A fin de confirmar que la concentración iónica afecta 5 significativamente la separación de pH-IEC y mejora el método de pH- IEC para los mAb con valores de pl extremos, la concentración iónica del amortiguador de pH en el método de IEC de gradiente de pH se moduló como se describe a continuación. 0 Ejemplo 3. Mejorar el Método IEC de Gradiente de pH al Controlar la Concentración iónica [000313] La concentración iónica durante el curso de un gradiente de pH se moduló en dos formas. Primero, la concentración iónica en la región de pH bajo se controló a 5 diferentes concentraciones de amortiguadores. Se sometió a prueba una serie de amortiguador para evaluar su impacto en el IEC de gradiente de pH como se plantea a continuación. Segundo, la concentración iónica en la región de pH alto se moduló al agregar un gradiente salino al gradiente de pH. Se investigó el impacto de la concentración de sal tambien. El nuevo método de esta manera es referido como un método de pH-IEC" mediado por concentración iónica. [000314] Concentración de Amortiguador: En este método, un gradiente de pH equimolar se usa en lugar de un gradiente de pH de relación mezclada utilizado en el método reportado (Farnan, D y Moreno, GT (2009) Anal . Chem. 81:8846) basado en dos consideraciones: Primero, se puede obtener un gradiente de pH casi lineal al usar concentraciones equimolares de piperazina, imidazol y Tris (Figura 2C). El gradiente lineal establecido sobre un amplio intervalo de pH no sacrificaría la separación de una región de pH dada Tsonev, LI y Hirsh, AG (2008) J. Chromatogr. A 1200:166). Segundo, proporciona optimización de la inclinación del gradiente. [000315] Se investigaron cuatro amortiguadores que consisten de concentraciones equimolares de piperazina, imidazol y tris a l, 2, 4 y 8 m . Estos amortiguadores fueron referidos como amortiguadores 1, 2, 4 y 8 mM en cada una fue mediada co un gradiente de pH de pH 5.0 a 10.8 y un gradiente salino lineal de NaCl 0 a 16 mM. Los cromatogramas de mAbl (pl=6.2) con los cuatro amortiguadores se muestran en la Figura 3A. La resolución entre las variantes de carga dependió evidentemente en la concentración del amortiguador. Con el amortiguador 1 mM, las variantes de carga se separaron deficientemente. La resolución se mejoró con el amortiguador 2 mM y llegó al máximo con el amortiguador 4 mM. Sin embargo, la resolución disminuyó significativamente con el amortiguador 8 mM. Por el contrario, las resoluciones para mAb2 (pl=8.2) fueron menos sensibles a la concentración del amortiguador que Abl (Figura 3B). Se logró una buena resolución para el mAb2 (pl = 8.2) con los cuatro amortiguadores aunque el amortiguador 4 mM ofreció ligeramente una mejor resolución que las otras tres resoluciones de amortiguadores. Basado en la inspección visual anterior, el amortiguador 4 mM pareció que proporciona la mejor resolución para mAbl y mAb2. [000316] Para visualizar mejor el efecto de la concentración del amortiguador en pH-IEC, el ancho completo en el máximo medio (FWHM) del pico principal de los mAb graficado como una función de la concentración del amortiguador se muestra en la Figura 3C. El FWHM del pico principal se correlaciona generalmente con la resolución de pH-IEC en que lo más bajo del FWHM representa la resolución más alta. Para tanto mAbl como mAb2, el FWHM del pico principal con el amortiguador 4 mM fue más bajo entre los cuatro amortiguadores, sugiriendo que el amortiguador 4 mM proporcionó el ancho de pico más reducido, de esta manera buena resolución. Por el contrario para el mAb3 (pl=9.4), el FWHM del pico principal disminuyó ligeramente cuando la concentración del amortiguador se incrementó de 1 a 8 mM. De esta manea, el amortiguador 8 mM proporcionó probablemente la mejor resolución para mAb3. [000317] El efecto de la concentración del amortiguador en pH-IEC de los mAb depende del valor de ml de un mAb. Los mAb con valores de pl bajo (6.2) y medios (8.2) mostraron separación óptima con el amortiguador 4 mM, mientras que los mAb con valor de pl alto (9.4) pareció que prefiere amortiguadores de concentración más alta. Esto es razonable puesto que los mAb de pl alto se enlaza fuertemente a la columna y de esta manera puede requerir más elución basada en concentración iónica que los mAb de pl bajo y medio para lograr una resolución óptima. Puesto que la concentración de amortiguador y conductividad impactan evidentemente la resolución de los mAb en el IEC de gradiente de pH, esto se debe optimizar para cada mAb individual siempre que se desee una resolución alta. Se desarrolló un método IEC que puede resolver las variantes ácidas y básicas del pico principal para los mAb sobre un amplio intervalo de pl . El amortiguador 4 M pareció que cumple este requisito y de esta manera se eligió para el método pH-IEC mediada con sal multiproducto. [000318] Concentración de Sal: Para investigar como la concentración iónica afecta la separación de pH-IEC, se agregaron cinco niveles diferentes (0, 8, 16, 32 y 64 mM) de cloruro de sodio al gradiente de pH (establecido por el amortiguador 4 mM) a través de un gradiente lineal de pH 5.0 a 10.8. El mAbl, mAb2 y mAb3 se analizaron en paralelo. El FWHM del pico principal de los mAb se gr fico como una función de la concentración de sal como se muestra en la Figura 3D. Para el Abl, el FWHM del pico principal fue sumamente sensible a la concentración de sal y alcanzó el mínimo con NaCl 8 mM. Esto sugiere que el NaCl 8 mM proporcionó la mejor resolución para el mA l. Para el mA 2, el FWHM de pico principal fue esencialmente plano a través del intervalo completo de concentraciones de sal, sugiriendo que la concentración de sal no impactó evidentemente la resolución de mAb2. Por el contrario para el mAb3, el FWHM de pico principal disminuyó con la concentración de sal que .. . . se incrementa de 8 a 32 mM y permaneció sin cambio entre 32 mM y 64 mM de sal. Esto siguiere que el mAb3 requirió 32 mM de sal para lograr una resolución óptima. [000319] El efecto de la concentración iónica en el IEC de gradiente de pH de los mAb también se correlacionó con el Pi de mAb. Los mAb de ml bajo mostraron separación con 8 mM de sal; los mAb de pl alto mostraron separación de concentración más alta de sal, mientras que la resolución de los mAb de pl medio fue independiente de la concentración de sal. Debido al impacto evidente en la resolución, la concentración de sal se puede optimizar para cada mAb individual siempre que se desee una resolución alta. Entre las cinco concentraciones de sal, el método de pH-lEC con un gradiente salino de NaCl 16 mM proporcionó una resolución aceptable para los mAb con valores de ml sobre un amplio intervalo de 6.2 a 9.2 y de esta manera se eligió como el método de pH-IEC mediada con sal de multiproducto en este trabajo. [000320] Método de pH-IEC Mediado con Concentración iónica Optimizado: El método de pH-IEC mediada con sal optimizado empleó piperazina 4 mM, imidazol 4 mM, y Tris 4 mM para 0 establecer el gradiente de pH y fue mediado con un gradiente salino lineal de 0 a 16 mM de NaCl. El pH y los perfiles de conductividad del método se muestran como líneas sólidas en la Figura 2C. Para comparación, el pH modelado y la concentración iónica se muestran como línea punteadas. El pH 5 experimental en la salida de la columna se incrementó con el tiempo de retención en una forma aproximadamente lineal, excepto para un pequeño cóncavo en el pH de 8.5 a 9.0 y es consistente con el pH modelado excepto para un tiempo de retraso de 5 minutos debido al volumen de espacio del 0 sistema. Con la mediación de sal, la conductividad experimental de la fase móvil mostró un ligero incremento durante el gradiente de pH (de 1570 a 1800 pS). Del mismo modo, la concentración iónica modelada fue esencialmente consistente durante el gradiente de pH. La concentración 5 iónica del gradiente de pH basado en amina se controló exitosamente al reducir la concentración de amortiguador y al agregar un gradiente salino lineal. Con la concentración iónica controlada, la presión posterior de la columna se mantuvo por debajo de 95 bar en la región de pH alto (Figura 2D). Los cromatogramas resultantes de mAbl-3 (no mostrado) fueron reproducibles, indicando que la columna de intercambio iónico fue estable en este intervalo de presión. Ejemplo 4. Perfil de la Heterogeneidad de Carga de 16 mAbs [000321] Para mostrar adicionalmente la capacidad del multiproducto del método de pH-IEC mediada con sal nuevo, se 0 analizaron 16 mAb con valores de ml de 6.2 a 9.4 y sus cromatogramas se muestran en la Figura 4. Los anticuerpos se eluyeron de la columna con un gradiente de pH de pH 5 a pH 10.8 y un gradiente de sal de NaCl 0 mM a NaCl 16 mM. Para tanto el mAbl de pl bajo (6.2) como el mAb3 de pl alto (9.4), las variantes de carga se separaron bien para producir perfiles de heterogeneidad de carga aceptables. Esto es una mejora sustancial comparada con el método de pH- IEC reportado (Figura 1). Las variantes de carga de los 16 mAb se separaron bien, indicando que el método de pH-IEC 0 mediada con sal desarrollado fue capaz de perfilar la heterogeneidad de carga de múltiples productos de mAb sin ningún esfuerzo de desarrollo de método adicional. [000322] Además de la aplicabilidad más amplia, el gradiente de pH mediado con sal ofreció mejor resolución que 5 el método de pH-IEC reportado. Para el mAb2 (pl=8.2), el método de pH-IEC mediado con sal proporcionó una resolución de línea base entre las variantes de carga (Figura 4). Sin embargo, la resolución por el método de pH-IEC previo fue mucho más bajo (Figura 1). Aunque el gradiente de pH mediado con sal fue más prolongado (58 minutos) que el gradiente de pH previo (45 minutos), las inclinaciones del gradiente en los dos métodos fueron idénticas (unidad/min de pH 0.1). La resolución mejorada por el método de pH-IEC mediado con sal de esta manera no fue un resultado de un cambio en la longitud del gradiente, sino más bien del efecto de 0 controlar la concentración iónica.

Ejemplo 5. Monitoreo de la Estabilidad Térmica de los mAb [000323] Se usa comúnmente la cromatografía de intercambio catiónico para evaluar la degradación y la variación de lote a lote de las proteínas biofarmacéuticas durante la 5 fabricación (Vlasak, J y Ionescu, R(2008) Curr. Phar . Biotechnol . 9:468). Para mostrar la capacidad para monitorear la degradación de la proteína, se utilizó el método de pH-IEC mediado con concentración iónica desarrollado para perfilar la heterogeneidad de carga del 0 mAbl después del estrés térmico. El mAbl se eligió en este estudio debido a que tiene la retención más baja entre los mAb y su perfil de pH-IEC fue más susceptible a los cambios en los parámetros de la cromatografía. El anticuerpo se eluyó de la columna con un gradiente de pH de pH 5 a pH 10.8 5 y un gradiente salino de NaCl 0 mM a NaCl 16 mM. [000324] Los cromatogramas de los materiales de control y estresados del mAbl se normalizan con el pico principal (Figura 5). Después de los estreses térmicos, se incrementaron tanto las variantes ácidas como básicas. Un reborde también apareció a la derecha del pico principal para las muestras estresadas. Estos cambios de perfil indican evidentemente que el mAbl se degradó después de la incubación a 40°C durante 3 y 6 semanas. Del mismo modo, la degradación de mAb2 y mAb3 bajo estreses térmicos también se detectó por el método de pH-IEC mediado con sal (datos no mostrados).

Ejemplo 6. Prueba de Robustez del pH-IEC mediada con concentración iónica [000325] Debido al proceso de elución complejo del método de pH-IEC mediada con sal, es necesario asegurar su robustez para prueba de muestra de rutina. Como se plantea en lo anterior, los inventores saben que la composición amortiguadora de pH y la concentración salina afectaron la retención y resolución de los mAb. El propósito de los estudios adicionales en este punto fue investigar la variabilidad originada de la columna, lote de amortiguador, e instrumento cuando se utilizaron la composición amortiguador de pH optimizado y la concentración de sal. Las tres columnas, tres lotes de amortiguadores, dos instrumentos se sometieron a prueba en cuatro diferentes días. El diseño experimental se muestra en la Tabla 3. El mAbl se eligió de nuevo en los estudios debido a que su perfil de pH-IEC más susceptible a los cambios en los parámetros de cromatografía. [000326] Los cromatogramas del mAbl obtenidos con diferentes columnas y lotes de amortiguador fueron comparables, pero aquellos obtenidos con diferentes instrumentos mostraron un tiempo de retención ligeramente diferente. La diferencia en los volúmenes de retraso esperados entre los instrumentos representó la variación en el tiempo de retención, pero no impacta el desempeño del método. La cuantificación de las variantes de carga del mAbl se resume en la Tabla 4. Para los 16 cromatogramas obtenidos con dos diferentes instrumentos, tres columnas y tres preparaciones amortiguadoras, la cuantificación de las variantes fue consistente, indicando que pH-IEC mediada con sal fue robusto en estas tres condiciones de cromatografía.

Tabla 3. El diseño experimental para la prueba de robustez de pH-IEC mediada con sal usando el mAbl Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Waters 2796 X X X Dionex U3000 X Columna 1 X Columna 2 X X Columna 3 X Amortiguador 1 X X Amortiguador 2 X Amortiguador 3 X Tabla 4 Resumen de los datos de robustez (n=16) del gradiente de pH mediado con sal obtenido para el mAbl Variantes Pico Variantes Acidas Principal Básicas Promedio 12.32 78.99 8.69 Más alto 13.20 79.92 9.54 Más bajo 10.54 77.91 8.14 Desviación estándar 0.78 0.56 0.55 % de RSD 6.3 0.7 6.4 [000327] La IEC de gradiente de pH mediada con sal también fue robusto a través de un amplio intervalo de cargas de masa de muestra en la columna. Como se muestra en la Figura 6, se observaron perfiles de elución consistentes cuando 5-200 mg de mAbl se cargaron en la columna. Aunque el pico principal se amplió ligeramente cuando la carga de la columna fue más de 50 mg, la cuantificación de las variantes de carga fue consistente entre todas las cargas de columna sometidas a prueba. (Tabla 5). [000328] Durante el curso de los estudios de robustez, se obtuvieron datos suficientes para cubrir la mayoría de las variables que son experimentadas en el experimento HPLC típico. El método de pH-IEC mediada con sal proporciona cromatogramas comparables y resultados de cuantificación consistentes de las variantes de carga para un mAb típico, mostrando que el método robusto en toda las condiciones de cromatografía estudiados en este punto.

Tabla 5. La robustez de la heterogeneidad de carga del mAbl en diferentes cargas de columna_ Carga de la Variantes Pico Variantes Columna (pg) Acidas Principal Básicas 5 12.66 79.04 8.30 10 13.04 78.84 8.12 50 13.27 78.14 8.59 100 13.58 77.80 8.62 200 13.55 77.86 8.59 Promedio 13.22 78.34 8.44 Desviación Estándar 0.38 0.57 0.22 % de RSD 2.9 0.7 2.6 Ejemplo 7. Tiempo de corrida de reducción para el pH-IEC mediado con concentración iónica [000329] Previamente, los métodos de IEC mediados con pH usan piperazina, imidazol, tris (PIT) como reactivos amortiguadores (Farnan, D y Moreno), GT 2009 Anal. Chem. 81:884-8857). Para generar un gradiente de pH, se generó una curva de pH semi-lineal de pH 6 a 9.5. El grupo funcional amino de cada agente amortiguador mantiene una carga positiva cuando el pH de fase móvil es menor que la pKa del reactivo y neutra cuando el pH de fase móvil es mayor, como se muestra en la Figura 7. El gradiente de pH se generó usando el Amortiguador A (pH 5.0) y Amortiguador B (pH 9.5) en un gradiente de pH 5 a pH 9.5 en 35 minutos. La columna fue una Propac WCX-10, 4 x 250 mM. Este gradiente de pH del sistema de reactivo amortiguador funciona bien para una gamma grande de moléculas con valores de ml entre 7 y 8.5. Sin embargo, las variantes de carga para las moléculas fuera de este intervalo de trabajo no se resuelven también. El trabajo preliminar reveló que la concentración y la concentración iónica de los reactivos amortiguadores influyeron en la linealidad de la curva de pH y los tiempos de retención de la muestra. Como se muestra en el Ejemplo 2, la concentración iónica disminuye notablemente conforme el pH se incrementa a través del tiempo. Los ajustes a las concentraciones de amortiguador y la introducción de un gradiente salino simultáneo proporcionaron una concentración iónica más bien estable por todo el gradiente de pH. Con un gradiente salino simultáneo, la separación de pH-gradiente ahora puede resolver las variantes moleculares con los valores de pl de 6.2-9.4. Como se muestra en la Figura 8 usando un gradiente prolongado de 58 min, donde el pH se incremento de pH 5 a pH 10.8 en una inclinación de unidad/min de pH 0.1 y la concentración de sal se incrementó de NaCl 0 mM a NaCl 16 mM en un amortiguador de PIT (piperazina 4 mM, imidazol 4 mM, y Tris 4 mM) se resolvieron los anticuerpos monoclonales con los valores de pl de 6.2 (Mabl), 8.2 (Mab 2) y 9.4 (Mab3). El método mejorado es referido como un "gradiente de pH mediado con concentración iónica" o un "gradiente de pH mediado con sal". [000330] Para reducir el tiempo de corrida y el rendimiento de incremento, se evaluó el gradiente de pH mediado con sal en una columna más corta (4 x 50 m ). Farnan, D y Moreno, GT (2009) Anal . Chem. 81:8846-8857 indicó que se obtuvieron perfiles de elusión similares usando el pH-IEC sin considerar la longitud de la columna, con la condición de que fuera el mismo modo de separación de pH-IEC (WCX o SCX). Para determinar si las columnas más cortas podrían reducir los tiempos de elusión, se compararon la separación de los 0 tres Mab con diferentes valores de ml usando tanto las fases móviles de pH-IEC originales y de pH-IEC mediadas con sal usando una columna de WCX-10, 4 x 50 mm. Los mAb fueron Mab 1, pl 7.6; Mab 2, pl 8.6-9.3; y Mab 3, pl 9.1. El gradiente de pH fue pH 6-11 en 0-16 min, mantenido a pH 11 durante 2 5 min, y seguido por una re-equilibrio de 4 min en pH 6 para un tiempo de corrida total de 22 minutos. El amortiguador para el pH-IEC original fue Tris 2.4 mM, imidazol 1.5 mM, y piperazina 11.6 mM. El amortiguador del pH-IEC mediado con concentración iónica fue Tris 4 mM, imidazol 4 mM, y 0 piperazina 4 mM con Cacl 16 mM. Como se observa en la Figura 9, aunque se obtuvieron perfiles pico similares para estos tres Mab, la resolución de las variantes de carga disminuyó conforme se incrementó el pl de la molécula. A fin de lograr una separación adecuada para las moléculas con un amplio 5 intervalo de pl en menos tiempo de corrida, se inició una investigación en el mecanismo de separación variante y el sistema amortiguador diferente. [000331] Para ayudar en la clasificación del amortiguador, se puede utilizar una herramienta de predicción de pH y conductividad. En las curvas de pH y conductividad de los amortiguadores comúnmente usados y la sal de NaCl en diferentes combinaciones, el intervalo de pH y los tiempos de gradientes se pueden calcular y graficar basado en la pKa del amortiguador. La herramienta de predicción de visualización permite una rápida optimización del sistema 0 amortiguador que tiene propiedades deseadas, tales como una curva de pH lineal, concentración iónica estable o de incremento a través del tiempo, y toxicidad amortiguadora más baja. Usando este modelo, se clasificaron varias combinaciones amortiguadoras. La combinación de 5 amortiguadores Tris, piperazina y fosfato (TPP) se encontró que forma un gradiente de pH lineal sobre un gradiente de 16 minutos (Figura 10). Los amortiguadores incluyeron piperazina pKl con una pKa de 5.33 (intervalo 5.0-6.0), fosfato pK2 con una pKa de 7.20 (intervalo 5.8-8.0), base de 0 Tris con una pKa de 8.06 (intervalo 7.5-9.0), piperazina pK2 con una pKa de 9.73 (intervalo 9.5 a 9.8) y fosfato pK3 con una pKa de 12.33. La gráfica en la Figura 10 aclara que la molécula de fosfato permanece cargada por todo el intervalo de pH, y compensa, un cierto grado, la pérdida de 5 concentración iónica debido a la desprotonación de los grupos funcionales amino en Tris y piperazina como conforme el pH se incrementa. Las condiciones de cromatografía fueron como sigue: Columna: Propac WCX-10HT, 4 x 50 mm Gradiente de pH: Tris 5.0 mM, piperazina, fosfato (TPP) Amortiguador A = pH 6.0 Amortiguador B = Gradiente de pH 11.0: 6-11 en 16 minutos Amortiguador C = NaCl 60 mM Amortiguador D = Agua MilliQ [000332] Las curvas de pH y conductividad predichas (Figura 11A y 11C) fueron consistentes con aquellas obtenidas experimentalmente (Figura 11B y 11D). El sistema amortiguador contuvo 5 mM de Tris, piperazina, y fosfato, y una concentración constante de NaCl en ya sea 10 mM, 20 mM o 30 mM (usado en el modelo). La velocidad de flujo experimental fue 1 mL/min o 2 mL/min.

Ejemplo 8. Determinación de los intervalos de concentración iónica óptimos. [000333] Se analizaron varias muestras usando el método de TPP mediada con sal de gradiente de 16 minutos. Un ejemplo de perfiles consistentes entre los métodos de 22 y 58 minutos de columnas Propac WCX-10 de 4 x 50 y 4 x 250, respectivamente se muestra en la Figura 12. La elusión con la columna de 4 x 50 fue con Tris/Piperazina/Fosfato (TPP), pH 6-11 y NaCl 0-30 mM durante 16 minutos. La elusión con la columna de 4 x 250 fue con Piperazina/lmidazol/Tris mediada con sal (PIT) pH 5-10.8 y NaCl 0-16 mM durante 58 minutos. Se determinó que el método de TPP mediada con sal fue suficiente para las moléculas principalmente en el intervalo de ml de 7-8.5, que fue el intervalo similar obtenido con el método de PIT original. Se concluyó que los reactivos amortiguadores y la concentración iónica desempeñan una parte en la separación pero se pueden implicar otros factores. [000334] Se modeló el estado de carga neta de los MAb sobre un intervalo de pH. La Figura 13 muestra una súper posición de cargas netas sobre el pH para los mAb con diferente pl.

En el modo de intercambio catiónico, un mAb lleva una carga positiva hasta que el pH disminuye para alcanzar su pl (intersección x), y después se eluye de la columna. Conforme el pH se incrementa, el mAb se carga negativamente. El perfil de variante de carga para una molécula de proteína dada consiste de un pico principal, una región ácida y básica (como se muestra en el panel de fondo). Usualmente, una variante de carga es una o algunas cargas separadas del pico principal, con la envoltura de carga completa de la variante más ácida a la más básica que abarca 5-7 cargas. La ventana de separación del gradiente de pH óptimo puede colocarse a través de la región plana de la curva entre pH 6.5 a pH 8.5 (Figura 13); por ejemplo para las moléculas con valores de ml menores de aproximadamente 8.5, la carga neta inmediatamente por debajo de su pl teórico cambia muy poco y la curva es relativamente plana entre pH 6.5 y 8.5. En una corrida de gradiente de pH, hay suficiente tiempo para que las variantes de carga se eluyan de la columna separadamente en diferentes tiempos de retención conforme el pH se incrementa a través del tiempo. [000335] La inversa, para las moléculas con valores de pl mayores que 8.5 y menores que 6.5, la carga neta cambia notablemente en su pl teórico (Figura 14). Durante una corrida de gradiente de pH lineal de plataforma, la carga por minuto de inclinación es demasiado inclinada en estos pH para permitir una separación adecuada y se observa un pico (recuadro). [000336] Puesto que la mejor separación y robustez del pico se logró en la porción relativamente plana de la curva de carga vs. pH, la cuestión es como eluir las variantes de carga de proteína en esta región sin considerar su pl. Esto requiere una pre-modificación del estado de carga para las moléculas de pl más alta usando el factor diferente a pH. Este factor es concentración iónica amortiguadora. Con la concentración iónica más alta en la fase móvil, más carga en la superficie de las moléculas es cubierta de la fase estacionaria. Por lo tanto, la carga neta evidente disminuye para permitir que las variantes se eluyan en pH por abajo de su pl. [000337] En el trabajo presentado en los Ejemplos 1-6, las variantes de carga de las moléculas con valores de pl mayores que 9 (modo de intercambio catiónico) y menor que 7 (modo de intercambio aniónico) se separaron bien al corregir las deficiencias de concentración iónica en las fases móviles de PIT combinadas con un gradiente salino (gradiente de pH mediado con sal). La fuerza de conducción combinada de pH y la gradiente de sal permiten que el estado de carga evidente la molécula disminuya más rápido a través del tiempo como se compara con el gradiente de pH solo. Esto se 0 puede ilustrar como la curva de carga vs. pH evidente que se estira verticalmente, con una región plana más reducida entre pH 7-8, y una inclinación más superficial en el pH mayor que 9. Por lo tanto, para las moléculas con ml más altos, la separación se lleva a cabo en un pH ligeramente 5 por debajo de su pl. Usando una columna más larga (250 mm) y un tiempo de corrida prolongado (60 min), hubo tiempo suficiente para que se eluyan las variantes de carga. Sin embargo, el método de gradiente de pH mediado con sal no logró resolver las gradientes de carga para moléculas de pl 0 alto en una columna más corta (50 mm) en un tiempo de corrida corto (20 min). [000338] Puesto que el tiempo de corrida corto es crítico, en lugar de disminuir gradualmente la carga evidente con un gradiente de sal durante 60 minutos, el estado de carga 5 deseado se puede alcanzar en el inicio de la corrida al introducir sal temprano y mantenerla constante de principio a fin. [000339] La Figura 15 es una súper posición de las separaciones de gradiente de pH de un mAb de ml alto (pl c- 9.2) en presencia de NaCl en diferentes concentraciones.

Usando un sistema cuaternario, se creó un gradiente de pH de pH 6-11 usando las líneas A y B y se mantuvieron las concentraciones de sal NaCl de 0, 10, 20, 30, 40 o 50 mM usando las líneas C y D. Las condiciones de gradiente y los tiempos de corrida fueron como sigue: Instrumento: U3000 10 2DLC; Fases móviles: Tris 10 mM, piperazina, fosfato, A) pH 6.0, B) pH 11.0; C) NaCl 100 mM, D) agua milliQ; Columna: Propac WCX-10, 4 x 50 mm, 10 pm; temperatura de la Columna: 40°C; Velocidad de flujo:: 1 mL/min; Gradiente de pH: 10-50% de B; constante de sal: 0 mM=0% de C, 50% de D; 10 mM=10% de 15 C, 40% de D; 20 mM=20% de C, 30% de D, 30 mM=30% de C, 20% de D, 40 mM=40% de C, 10% de D, 50 mM=50% de C, 0% de D; Concentración de la muestra: 1 mg/pL; Volumen cargado: 20 pL. [000340] En una concentración de sal más baja, se observó 20 muy copa separación. En concentraciones de sal subsecuentemente más altas, las separaciones mejoraron mientras que disminuyó el tiempo de elusión. La disminución del tiempo de elusión con el incremento de la concentración de sal apoya las cargas extras en la superficie de la 25 molécula son cubiertas de la fase estacionaria para que la carga evidente disminuya para permitir una separación variante del pH por debajo de su ml. En este caso, logró una separación óptima en NaCl 40-50 mM, en la cual la carga evidente de este mAb residió presumiblemente en la porción relativamente plana de la curva de carga vs. pH. [000341] El análisis de varios mAb con diferente pl se llevó a cabo en diferentes concentraciones de sal constantes mientras que se aplica en el mismo gradiente de pH. Generalmente, la separación óptima se logró en una concentración de sal constate tal que el estado de carga 0 evidente falla en la porción plana de la curva de carga vs. pH. Por ejemplo, los mAb en el intervalo de pl de 7-8.3 no necesitan sal, aquellos en el intervalo de pl de 8.3-8.8 necesitan sal 20 mM y aquellos en el intervalo de pl de 8.8- 9.0 necesitan sal 50 mM (Figuras 16 y 17). En la curva de carga vs. pH, la adición de sal mueve esencialmente el eje x hasta el estado de carga deseado de la molécula para permitir la separación óptima en la región plana de la curva. Este tipo de separación es referida como un gradiente de pH "híbrido" (Figura 18). 0 [000342] Se lograron separaciones mejoradas al alterar las condiciones de gradiente. Un gradiente de pH-IEC híbrido superficial (utilizando las fases móviles TPP) dieron por resultado una separación pico mejorada comparada con ya sea los métodos de pH-IEC originales y mediados con sal (Figuras 5 19 y 20). Se logró la separación similar al usar el amortiguador de TIC (Tris, Imidazol, CAPS) con NaCl 10 mM para reemplazar la piperazina, una preocupación de eliminación peligrosa, y fosfato, un amortiguador biológico versátil que puede inducir adversamente el artefacto de ensayo debido a la modificación pos-traduccional catalizada con amortiguador (Figura 21). [000343] El método de pH-IEC híbrido corto se estimuló adicionalmente para determinar si los tiempos de análisis más rápidos serían posibles. El gradiente de pH se ajustó de pH 7-10 en 10 minutos, con un mantenimiento de 2 minutos en 0 pH 10 y un tiempo de equilibrio de 3 minutos para un tiempo de corrida total de 15 minutos. [000344] Las condiciones de cromatografía fueron como sigue: Instrumento: U3000 2DLC; Fases móviles: Tris 10 mM, piperazina, fosfato, A) pH 6.0, B) pH 11.0; C) NaCl 100 mM, 5 D) agua illiQ; Columna: Propac WCX-10HT, 4 x 50 mm, 10 pm; Temperatura de la columna: 40°C; Velocidad de flujo: 1 mL/min; Gradiente de pH: 0-30% de B; constante de sal: 0 mM=0% de C, 50% de D; 10 mM=l0% de C, 40% de D; 20 mM=20% de C, 30% de D, 30 mM=30% de C, 20% de D, 40 mM=40% de C, 10% 0 de D, 50 mM=50% de C, 0% de D; Concentración de la muestra: 1 mg/pL; Volumen cargado: 20 mL. [000345] Como se muestra en las Figuras 22 y 23, los perfiles fueron similares entre las corridas de 15 y 22 minutos para dos MAb diferentes con valores de ml de 8.8 y 5 9.0, respectivamente. Sin embargo, ya que los tiempos de corrida se volvieron más cortos, fueron necesarios más valores de pH de inicio/terminación específicos de producto y concentraciones de sal. [000346] Al desarrollar el método específico del producto, se puede lograr una resolución óptima al seleccionar cuidadosamente la inclinación de gradiente de pH apropiada y la concentración de sal basad en el ml de la molécula. Los métodos específicos del producto serían benéficos si solo un producto se analiza exclusivamente en una secuencia. Para los laboratorios que analizaron una variedad de mAb, es deseable cada uno con un pl diferente, que usa un sistema cuaternario que puede suministrar un gradiente de pH mientras que mantiene una cierta concentración de sal. De otra manera, se puede requerir un tiempo de corrida más prolongado de 22 minutos como un método de plataforma que usa un sistema binario que suministra el gradiente de pH en una concentración de sal fija.

Ejemplo 9_._ Robustez de la cromatografía de intercambio iónico de gradiente de pH mediado con concentración iónica [000347] Para mostrar la ventana de robustez y las condiciones de corrida objetivo de una cromatografía de intercambio iónico de gradiente de pH mediado con concentración iónica adecuada para el análisis de productos de anticuerpo monoclonales múltiples con pl a través de un amplio intervalo usando un diseño del procedimiento experimental (DOE). El método es adecuadamente robusto si no existe un cambio significativo para los valores reportables incluyendo las áreas pico relativas de los picos de la variante principal (% Principal), variante ácida (% de AV) y variante básica (% de BV). Además, el perfil pico general como es medido por las resoluciones pico (Rsl y Rs2). Para probar la robustez, se alteran intencionalmente los parámetros de corrida tales como concentración de sal, concentraciones de amortiguador, pH, temperatura de la columna y velocidad de flujo.

Materiales y Métodos [000348] Se sometieron a prueba los siguientes tres anticuerpos : mAbl, ml = 8.2 mAb2, l = 8.5 mAb3, pl = 9.0 [000349] Un Módulo Waters 2796 Bioseparations equipado con una válvula de conmutación de 3 vías, 8 orificios a la columna, válvulas selectoras de solvente de 6 orificios para la línea C y D y el detector Waters 2487 Dual l UV se utilizó para la cromatografía. [000350] La columna de cromatografía fue una columna Dionex ProPac WCX-10 HT, 4 x 50 mm. [000351] El sistema amortiguador fue como sigue: molar de Imidazol igual, Tris, y CAPS para los amortiguadores A y B. El Amortiguador C fue NaCl 100 mM y el amortiguador D fue agua. [000352] Para el Amortiguador A el pH fue como es especificado en la tabla de diseño experimental (Tabla 6), el pH para el amortiguador B fue 10.0. La resistencia total del amortiguador y la concentración de sal que se usaron se muestran en la tabla de diseño experimental. [000353] El gradiente fue como sigue: 0-2 minutos, en pH de partida; 2-16 minutos para pH de partida a pH 10; 16-18 minutos, a pH 10; 18-22 minutos, en pH de partida. Las concentraciones de sal seleccionadas permanecieron constantes a través de gradiente. [000354] La temperatura de la columna y la velocidad de flujo se usaron como se indica en la Tabla 6. [000355] 3 mAb: mAbl, ml = 8.2 mAb2, pl = 8.5 mAb3, pl = 9.0 [000356] El Módulo Waters 2796 Bioseparations equipado con una válvula de conmutación de 3 vías - 8 orificios a la columna, válvulas de selector de solvente de 6 orificios para las líneas C y D y el detector Waters 2487 Dual l UV. [000357] Columna Dionex ProPac WCX-10 HT, 4x50mm [000358] Sistema amortiguador: molar de Imidazol igual, Tris, y CAPS para los amortiguadores A y B. El Amortiguador C es NaCl 100 mM y el amortiguador D es agua. [000359] El pH del amortiguador A se específica en la tabla de diseño experimental, el pH para el amortiguador B es 10.0. La resistencia total del amortiguador y la concentración de sal se muestran en la tabla de diseño experimental. [000360] Gradiente: 0-2 minutos, en pH de partida; 2-16 minutos de pH de partida a 10; 16-18 minutos, a pH 10, 18-22 minutos, en pH de partida. La concentración de sal seleccionada permanece constante a través de gradiente. [000361] Temperatura de Columna y velocidad de flujo: ver la tabla de diseño experimental.

Tabla 6. Diseño Experimental (Parámetros de Corrida) 0 5 0 5 [000362] La robustez del procedimiento de cromatografía para el análisis de múltiples productos de anticuerpo monoclonales se sometió a prueba al alterar sistemáticamente los parámetros de las condiciones de corrida objetivo de la sal 20 mM, amortiguador 15 mM, pH 6.0 de partida, temperatura de la columna 40°C, y una velocidad de flujo de 1.0 ml/min (designado como 0 en la Tabla 6). Se sometieron a prueba tres MAb diferentes, con ml de 8.2, 8.5 y 9.0. Los cromatogramas resultantes de las cromatografías en duplicado en la condición de corrida objetivo se presentan en la Figura 24. Un ejemplo para una prueba para la robustez de la condición de corrida objetivo para el MAb3 al alterar las condiciones de corrida de acuerdo en la Tabla 6 se presenta en la Figura 25. Aunque hubo algunas diferencias menores en la resolución, los perfiles pico generales, especialmente para las tres regiones (acidas, principales y básicas) se mantienen y permiten en la cuantificación. [000363] Los efectos de los parámetros de corrida en el desempeño del método se pueden visualizar usando una gráfica de distribución (Figura 26). En esta gráfica, los valores reportables (% de Principal, % de AV y % de BV) para los análisis en diferentes condiciones se distribuyeron estrechamente alrededor de aquellas en la condición objetivo (en el centro de cada panel, es decir sal 20 mM). Los resultados muestran que no hubo efecto significativo en los valores reportables debido a la concentración de sal. Sin embargo, hubo tendencia en las resoluciones con el incremento de la concentración de sal: una tendencia hacia abajo ligera para MAbl (pl=8.2) y MAb2 (pl=8.5), y una tendencia hacia arriba para MAb3 (pl=9). Sugirió que con el incremento en el ml de la molecula, la resolución se puede mejorar adicionalmente al incrementar la concentración de sal, para un método específico del producto. Como un método multiproducto, la concentración de sal se optimizó para los mAb con pl a través de un amplio intervalo. Los resultados de estos estudios mostraron que 20 mM es la concentración de sal útil para el análisis de los anticuerpos con un pl que varía de 7.0 a 9.5. [000364] Los efectos de los otros parámetros de corrida también se graficaron y se presentan en la Figura 27A-27D. En estas gráficas, los valores reportables (% de Principal, ¾ de AV y % de BVj para los análisis en diferente condición también se centraron alrededor de aquellos en las condiciones objetivo. Los resultados mostraron que no hubo un efecto significativo en los valores reportables debido a la perturbación intencional de las condiciones de corrida. De esta manera, el método multiproducto es adecuadamente robusto en la condición de corrida objetivo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para analizar una composición que comprende un polipéptido y uno o más contaminantes, el método que comprende a) unir el polipéptido y uno o más contaminantes a un material de cromatografía de intercambio iónico utilizando un amortiguador de carga, en donde el amortiguador de carga está a un primer pH y comprende una primera concentración iónica; b) eluir el polipéptido y uno o más contaminantes 0 del material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se altera en un gradiente de pH y la concentración iónica del amortiguador de elución se altera en un gradiente de concentración iónica, en donde el 5 polipéptido y el uno o más contaminantes se separan por la combinación de gradiente de pH y gradiente de concentración iónica; y c) detectar el polipéptido y el uno o más contaminantes. 0

2. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido es un anticuerpo o inmunoadhesina o fragmento de los mismos.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el polipéptido es un anticuerpo monoclonal o fragmento del 5 mismo.

4. El método de la reivindicación 2 o 3, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano.

5. El método de la reivindicación 2 o 3, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

6. El método de la reivindicación 2 o 3, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el contaminante es una variante del polipéptido.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el contaminante es un producto de degradación del polipéptido.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el polipéptido tiene un pl mayor de aproximadamente 9.0.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio catiónico.

12. El método de la reivindicación 11, en donde el material de cromatografía de intercambio catiónico es un material sulfonado de cromatografía o un material carboxilado de cromatografía.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el gradiente de pH es un gradiente lineal.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el gradiente de pH es un gradiente gradual.

15. El método de la reivindicación 13 o 14, en donde el gradiente de pH comprende un incremento de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 11.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde el gradiente de pH se genera usando uno o más amortiguadores. 0

17. El método de la reivindicación 16, en donde el uno o más amortiguadores se seleccionan de piperazina, imidazol, tris, fosfato o CAPS.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde el gradiente de 5 concentración iónica es un gradiente lineal.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde el gradiente de concentración iónica es un gradiente gradual.

20. El método de la reivindicación 18 o 19, en 0 donde el gradiente de concentración iónica comprende un incremento en la concentración de sal de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 200 m .

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 18-20, en donde el gradiente de 5 concentración iónica es un gradiente de NaCl, un gradiente de KCl, o un gradiente de Na2SO4.

22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el polipéptido tiene un pl menor de aproximadamente 7.0.

23. El método de la reivindicación 22, en donde el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio aniónico.

24. El método de la reivindicación 23, en donde el material de cromatografía de intercambio aniónico es un material de cromatografía de amina cuaternaria o un material 0 de cromatografía de amina terciaria.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22-24, en donde el gradiente de pH es un gradiente lineal.

26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22-24, en donde el gradiente de pH es un gradiente gradual.

27. El método de la reivindicación 25 o 26, en donde el gradiente de pH comprende una disminución de aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH 5. 0

28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22-27 en donde el gradiente de pH se genera usando uno o más amortiguadores.

29. El método de la reivindicación 28, en donde el uno o más amortiguadores se seleccionan de piperazina, 5 imidazol o Tris.

30. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22-29, en donde el gradiente de concentración iónica es un gradiente lineal.

31. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22-29, en donde el gradiente de concentración iónica es un gradiente gradual.

32. El método de la reivindicación 30 o 31, en donde el gradiente de concentración iónica comprende un incremento en la concentración de sal de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 200 mM. 0

33. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30-32, en donde el gradiente de concentración iónica es un gradiente de NaCl, un gradiente de KC1, o un gradiente de Na2SO4.

34. Un método para analizar una composición que 5 comprende el polipéptido y uno o más contaminantes, el método que comprende a) unir el polipéptido y el uno o más contaminantes a un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga, en donde el 0 amortiguador de carga está a un pH inicial y comprende una concentración iónica inicial,- b) eluir el polipéptido y el uno o más contaminantes del material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del 5 amortiguador de elución se altera en un gradiente de pH y en donde la concentración iónica del amortiguador de elución es esencialmente la misma como la concentración iónica del amortiguador de carga, en donde el polipéptido y el uno o más contaminantes se separan por gradiente de pH a aproximadamente la concentración iónica inicial; y c) detectar el polipéptido y el uno o más contaminantes.

35. El método de la reivindicación 34, en donde el polipéptido es un anticuerpo o inmunoadhesina o fragmento de esto. 0

36. El método de la reivindicación 34 o 35, en donde el polipéptido es un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo.

37. El método de la reivindicación 35 o 36, donde el anticuerpo es un anticuerpo humano.

38. El método de la reivindicación 35 o 36, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

39. El método de la reivindicación 35 o 36, donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

40. El método de cualquiera de las 0 reivindicaciones 35-39, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

41. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34-40, en donde el contaminante es una variante del polipéptido. 5

42. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34-40, en donde el contaminante es un producto de degradación del polipéptido.

43. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34-42, en donde el polipéptido tiene un pl mayor de aproximadamente 9.0.

4 . El método de cualquiera de las reivindicaciones 34-43, en donde el material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio catiónico.

45. El método de la reivindicación 44, en donde el 0 material de cromatografía de intercambio catiónico es un material sulfonado de cromatografía o un material carboxilado de cromatografía.

46. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34-45, en donde el gradiente de pH es un 5 gradiente lineal.

47. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34-45, en donde el gradiente de pH es un gradiente gradual.

48. El método de la reivindicación 46 o 47, en 0 donde el gradiente de pH comprende un incremento de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 11.

49. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34-48, en donde el gradiente de pH se genera usando uno o más amortiguadores. 5

50. El método de la reivindicación 49, en donde el uno o más amortiguadores se seleccionan de piperazina, imidazol, tris, fosfato o CAPS.

51. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34-50, en donde la concentración iónica del amortiguador de elución es de aproximadamente 0 mM a b aproximadamente 100 mM.

52. El método de la reivindicación 51, en donde el amortiguador de elución comprende aproximadamente NaCl 0 mM a aproximadamente NaCl 100 mM, aproximadamente KCl 0 mM a aproximadamente KCl 100 mM, o aproximadamente Na2SO40 mM a 10 aproximadamente Na2S04100 mM.

53. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34-42, en donde el polipéptido tiene un pl de menor de aproximadamente 7.0.

54. El método de la reivindicación 53, en donde el 15 material de cromatografía es un material de cromatografía de intercambio aniónico.

55. El método de la reivindicación 54, en donde el material de cromatografía de intercambio aniónico es un material de cromatografía de amina cuaternaria o un material 20 de cromatografía de amina terciaria.

56. El método de cualquiera de las reivindicaciones 53-55, en donde el gradiente de pH es un gradiente lineal.

57. El método de cualquiera de las 25 reivindicaciones 53-55, en donde el gradiente de pH es un gradiente gradual.

58. El método de la reivindicación 56 o 57, en donde el gradiente de pH comprende una disminución de aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH 5.

59. El método de cualquiera de las reivindicaciones 53-58, en donde el gradiente de pH se genera usando uno o más amortiguadores.

60. El método de la reivindicación 59, en donde el uno o más amortiguadores se seleccionan de piperazina, imidazol o Tris. 0

61. El método de cualquiera de las reivindicaciones 53-60, en donde la concentración iónica del amortiguador de elución es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 100 mM.

62. El método de la reivindicación 61, en donde el 5 amortiguador de elución comprende aproximadamente NaCl 0 mM a aproximadamente NaCl 100 mM.

63. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-62, en donde el análisis es por cromatografía líquida de alto desempeño. 0

64. Un método para analizar un polipéptido en una composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes, en donde el método separa uno o más contaminantes del polipéptido, el método que comprende a) unir el polipéptido y uno o más contaminantes a 5 un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga, en donde el amortiguador de carga está a un primer pH y comprende una primera concentración iónica; b) eluir el polipéptido y uno o más contaminantes del material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se altera en un gradiente de pH y la concentración iónica del amortiguador de elución se alterado en un gradiente de concentración iónica, en donde el polipéptido y el uno o más contaminantes se separan por la 0 combinación de gradiente de pH y gradiente de concentración iónica; y c) detectar el polipéptido y el uno o más contaminantes, en donde el método se usa para analizar 5 polipéptidos que tienen un ml que varía de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 9.5.

65. Un método para analizar un polipéptido en una composición que comprende un polipéptido y uno o más contaminantes, el método que comprende 0 a) unir el polipéptido y el uno o más contaminantes a un material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de carga, en donde el amortiguador de carga está a un pH inicial y comprende una concentración iónica inicial; 5 b) eluir el polipéptido y uno o más contaminantes del material de cromatografía de intercambio iónico usando un amortiguador de elución en donde el pH del amortiguador de elución se altera en un gradiente de pH y en donde la concentración iónica del amortiguador de elución es esencialmente la misma como la concentración iónica inicial del amortiguador de carga, en donde el polipéptido y el uno o más contaminantes se separan por el gradiente de pH a aproximadamente la concentración iónica inicial; y c) detectar el polipéptido y el uno o más contaminantes, 0 en donde el método se usa para analizar polipéptidos que tienen un ml que varía de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 9.5.

66. El método de la reivindicación 64 o 65, en donde el polipéptido es un anticuerpo o inmunoadhesina o 5 fragmento de estos.

67. El método de cualquiera de las reivindicaciones 64-66, en donde el polipéptido es un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo.

68. El método de la reivindicación 66 o 67, donde 0 el anticuerpo es un anticuerpo humano.

69. El método de la reivindicación 66 o 67, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

70. El método de la reivindicación 66 o 67, donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. 5

71. El método de cualquiera de las reivindicaciones 65-70, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

72. El método de cualquiera de las reivindicaciones 64-71, en donde el contaminante es una variante del polipéptido.

73. El método de cualquiera de las reivindicaciones 64-72, en donde el contaminante es un producto de degradación del polipéptido.

74. El método de cualquiera de las reivindicaciones 64-73, en donde el contaminante es una 0 variante de carga del polipéptido.

75. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-74, en donde la concentración del amortiguador en el amortiguador de carga y/o el amortiguador de elución varía de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 5 50 mM.

76. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-75, en donde el primer pH varía de aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 7.0.

77. El método de cualquiera de las 0 reivindicaciones 1-76, en donde la temperatura del material de cromatografía varía de aproximadamente 20°C a aproximadamente 50°C.

78. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-77, en donde la carga y elución se llevan 5 a cabo a una velocidad de flujo que varía de aproximadamente 0.5 ml/min a aproximadamente 2.0 ml/min.

79. Un método para determinar la pureza de un polipéptido en una composición, que comprende analizar la composición de acuerdo con uno cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 1 a 78 y determinar la relación del polipéptido a los contaminantes en la composición.

80. Un método para determinar la estabilidad de un polipéptido en una composición que comprende el polipéptido, el método que comprende, a) incubar la composición que comprende el 0 polipéptido a 40°C durante tres o seis semanas, b) analizar la composición del paso a) por cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 1 a 79, y c) determinar la relación de variantes al polipéptido en la composición, en donde un incremento en la 5 relación de variantes al polipéptido en la composición en comparación a una composición que no se incubó indica la degradación del polipéptido en la composición. 0 5