JPS63102682A

JPS63102682A - 真核細胞内へのｄｎａ導入法

Info

Publication number: JPS63102682A
Application number: JP61249277A
Authority: JP
Inventors: Keiichi Hosokawa; 桂一細川; Takayoshi Kato; 敬香加藤
Original assignee: MEDEISA SHINYAKU KK
Current assignee: MEDEISA SHINYAKU KK
Priority date: 1986-10-20
Filing date: 1986-10-20
Publication date: 1988-05-07

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、真核細胞内に、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）
を導入する新しい方法に関するものである。

［従来の技術］遺伝子操作によって形質転換体を得るためには、ＤＮＡ
を細胞内へ導入する技術が重要である。

従来、培養細胞へのＤＮＡ導入法としては、細胞のもつ
貧食作用を利用するリン酸カルシウム法、畑胞内に微細
ガラス管を用いて直接物質を注入する微注入法（ミクロ
インジェクション法）、細胞質膜の融合能を利用するも
ので、細胞どうしの融合・リボゾームとの融合法、さら
に細胞に浸透圧変化を与え、その時の可溶性物質の出入
りを利用する方法等がある。

［発明が解決しようとする問題点］しかし、そのいずれの方法でもＤ　Ｎ　Ａの導入率が低
く、特に核への導入率が低いうえ、染色体ＤＮＡの導入
に間しては、染色体ＤＮＡが巨大な分子であるため、リ
ン酸カルシウム法以外の方法では必ずしも満足のいく結
果が得られていない。　　また、リン酸カルシウム法で
は、その毒性が細胞内に残るという問題があり、さらに
、微注入法や融合法では操作が非常に煩雑で熟練を要す
という欠点があった。　　そのため、操作がより簡単で
、毒性面でも安全で、導入率の高い細胞内へのＤＮＡ導
入法の開発が要望されている。

［問題点を解決するための手段］本発明者らは、これらの観点にかんがみ鋭意研究を行っ
ていたところ、ＤＮＡをブロタミンとの複合体として培
８１Ｂ胞と接触させろことにより、きわめて効率よ＜Ｄ
ＮＡが細胞内に、しかも特に核内に多く取り込まれるこ
とを見い出し、これらの知見に基づいて本発明を完成し
た。

従って、本発明はＤＮＡとプロタミンの複合体により、
操作が簡単でしかも効率よ＜ＤＮＡを細胞内に導入する
新規な方法を提供するものである。

以下に、本発明について詳細に説明を行う。

本発明に適用される細胞としては、動物又は植物に由来
する細胞と酵母細胞とを含む種々のタイプの真核細胞を
用いることができるが、動物細胞が特に適していると思
われ、−例としてヒトＫＢ葡胞、ヒトＨｅＬａ細胞、ス
ボドプテラ・フルギベルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆ
ｒｕｇｉｐ−ｅｒｄａ　）昆虫細胞、ハムスターＢ’Ｈ
Ｋ２１細胞等が挙げられる。

本発明において用いられるＤＮＡとしては、環状又は線
状プラスミド、プラスミド断片、染色体、染色体断片等
、その構造や形状に制限はない。　　また、このときの
プラスミドとしては、菌体から分離されたままのプラス
ミド、またプラスミドから誘導した各種キメラプラスミ
ド等いずれも使用することができ、−例としてｐＳＶ２
−ＣＡＴＳｐＡｄ　１２Ｅ　ＩＡ−ＣＡＴｐｓＶ２−ｎ
ｅｏ等が挙げられる。　　なお、染色体としては、本発
明においてはヒトアデノウィルス２型（Ａｄ２）ＤＮＡ
が使用されたが、これに限定されるものではない。　　
さらに、プラスミド断片や染色体断片としては、溶菌や
機械的処理によって生成した断片等を使用することがで
きる。

本発明に用いるプロタミンとしては、サケ、゛ニシン、
ボラ、チョウザメ、ヒト等、種々の精子由来のものいず
れても使用することができ、サケ精子由来のプロタミン
は市販されており、容易に人手可能である。　　なお、
プロタミンは、主として動物の精子中に核酸と結合して
存在しているタンパク質の一種で塩基性の強いタンパク
質て特にアルギニンの含有量が高いものてあり、これは
硫酸塩の形で好適に存在する。

次に、ＤＮＡとプロタミンの複合体形成は、水性媒質中
にＤＮＡ：プロタミン（重量比）を１：０．５〜１：１
５０の割合で、好適には１：１００の割合で混合し、３
０分間程度０℃付近に保った後、３０〜４０°Ｃて１０
分間程度保ち、再度０°Ｃ付近に冷却することで複合体
が形成される。

水性媒質のｐｌ（は、約７．５〜８．５が好適である。

　　このようにして得られたＤ　Ｎ　Ａ−プロタミン複
合体をいったん単離するか、またはこのＤＮＡ−プロタ
ミン複合体を含む水性媒質をそのまま細胞培養培地に直
接加えることにより、ＤＮＡ−プロタミン複合体と細胞
との接触を行う。　　接触時間は特に制限はないが通常
２０分〜５時間程度行う。　　なお、接触後、グリセロ
ールにより処理することが好ましい。

形質転換した細胞の回収法とこれらの細胞の　かクロー
ニング法及びサブクローニング法と、表現型形質又は遺
伝子型形質に基づく形質転換細胞の退択又は識別法は、
公知の技術により行うことができる。　　本発明の方法
で、細胞内に取り込まれたＤＮＡは、核にも高率で取り
込まれ、少なくとも４８時間は安定に存在し、発現する
。

なお、導入２４時間後の細胞質ＲＮＡを抽出し、ウィル
スＤＮＡをプローブとして、ハイブリダイゼーションを
調べることにより、導入した複合体の少なくとも一部が
転写されていることがわかる。

本発明の導入法を用いると、毒性もないことから、卵細
胞との人工受精、発生初期の卵の欠損遺伝子を補うこと
も可能であり、遺伝子治療等への応用も期待できる。

［実施例コ以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

艶考例１）オ　　　　　　　　　　　　　　　　　　ロ　　　費　
ゝ　の；　　１（ア）細胞ヒトＨｅＬａ細胞及びハムスターＢＨＫ２１細胞（サプ
ラインＢ３．アルヒーフ・フユア・ジ・ゲザンテ・ヴイ
ルスフォルシュング（Ａｒ−ｃｈ、　Ｇｅｓ、　Ｖｉｒ
ｕｓｆｏｒｓｃｈ、　）　ｒ皿＋　９３　１１２（１９
７０）、参照）はダヘルッコの改良イーグル培地（Ｄ　
Ｍ　Ｅ　Ｍ　）で培養し、スボドブテラ・フルギベルダ
（５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）昆
虫細胞はヴイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　＋ｆｌｆ
Ｌ＋３９９−４０９　（１９７９）記載の条件で培養し
た。

（イ）染色体ＤＮＡ及びブラスミＦ’　Ｄ　Ｎ　Ａヒ）
Ａｄ２は、標準条件下（ヴイロロジ−（Ｖｉｒｏ　ｌｏ
ｇｙ　）　、　皿、　５８７−６０６　（１９６９）　
、’２３照）において、ヒトＨｅＬａ！胞で複製し、ジ
ャーナル・オン・ヴイロロジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　
）旦、　２９７−３０８　（１９７２）に記載しである
ようにＣｓＣ１−精製ビリオンから精製した。

シミアンウィルス４０　（５Ｖ４０−）の初期プロモー
ターの支配下及びＡｄ　１２　ＤＮＡのＥＩＡプロモー
ターの支配下にクロラムフェニコールアセチル転移酵素
（ＣＡＴ）遺伝子あるいはネオマイシンホスホ転移酵素
（ｎ　ｅ　ｏ）遺伝子を含むプラスミドｐＳＶ２−ＣＡ
Ｔ　（モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Ｍｏ　１．　Ｃｅ　ｌ　１゜Ｂｉｏｌ、　）　、　２
．１０４４−１０５１　（１９Ｂ２）　、参照）、ｐＳ
Ｖ２−ｎｅｏ（ジャーナル・オン・モレキュラー・アン
ド・アプライド・ジエネティクス（Ｊ、Ｍｏ１．　Ａｐ
ｐｌ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、　１．３２７−３４１
（１９Ｂ２）、参照）　、ｐＡｄ　１２Ｅ　ＩＡ−ＣＡ
Ｔ（プロシーディング・オン・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オン・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ）　、　８
０　。

７５８６−７５９０　（１９８３）　、参照）は常法に
より作製し、精製した。（コールド・スプリング・ハー
バ−・シンボジア・オン・クアンティテイティブ・バイ
オロジー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｂｏｒＳｙｍ
ｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　）　、　Ｊ４　　、
５５１−５６４（１９７９）、参照）なお、Ａ　ｄ　２　Ｄ　Ｎ　Ａは１０　ｊ４ｃｉ／ｍｌ
の［３８］　−チミジンを含む培地で培養することによ
り［３Ｈ］の標識化を行い、プラスミドＤＮＡは、制限
酵素でＤＮＡを切断した後、α−［３２Ｐ］−デオキシ
リボヌクレオシドトリホスフェートとＥ、ｃｏｌｉＤＮ
ＡポリメラーゼＩのフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オン・バイオケミストリー（
Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　＋　２２＋３
７１−３８１　（１９７１）、参照）を用いて３′末端
に連結することにより［３２ｐ］の標識化を行った。

（つ）プロタミンサケ精子由来のプロタミン硫酸塩は、シグマ社より購入
したものを用い、［：３Ｈ］プロタミンは、常法により
［３Ｈ］で標識化した。

実施例１）緩衝液（０，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１Ｍトリス
−塩酸、ｐＨ＝　７．５．０．５ｍＭ塩化マググネシウ
ム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸ＤＴＡ）、０．
１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド）中、［
３ＨコーＡｄ２ＤＮＡと［３Ｈ］−プロタミンを１　：
　１００　（重量比）の割合で混合し、０℃で３０分間
、３７℃で１０分間保ち、その後再び０℃にした。

ところで、このようにして形成される［３ＨコーＡ　ｄ
　２　Ｄ　Ｎ　Ａ　−［３Ｈコ一プロタミン複合体を確
認するには、ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により
、０．５　Ｘ　Ｔ　Ｅ　Ｂ緩衝液（０，１Ｍ　）リス−
塩酸、０．０７７　Ｍホウ酸、２．５ｍＭＥＤＴＡ。

ｐ　Ｈ８，０）で泳動じ、ゲル乾燥後、フリ一体又は複
合体として標識化したＤＮＡ分子の移動率をコダック＠
ＸＲ−５フィルムを用いてオートラジオグラフィー（Ａ
ｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ）により測定することに
より行うことができる。

さて、上記にようにして得られる複合体の溶液をヒ）Ｈ
ｅＬａ細胞（ＤＭＥＭで培養）の培養培地に直接加えた
くフラスコ表面積７５　ｃ　ｍ２あたり５ｍｌ、平面直
径６ｃｍにつき２ｍ１）。

複合体を加えた後、２．４．６時間口にＨＢＳ溶液（０
，１４Ｍ塩化ナトリウム、０．７５ｍＭリン酸二水嚢ナ
トリウム、２５ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７，１３）中、１
５％グリセロールで細胞を２分閘処理した。　　次に、
２５　ｃ　ｍ２フラスコ上の細胞をダルベツコの培地（
ＤＭＥＭ）で１〜３回、総量１　ｍ　ｌで洗浄しＭ　ｇ
　２”について６　ｍＭにしたダルベツコの培地中、Ｄ
Ｎａｓｅ　（５０μｇ／ｍｌ）で３７℃、３０分間処理
し、ＰＢＳｄで５回、総量２ｍｌで洗浄し、これについ
て取り込みＤＮＡの細胞内分布について分析した。

核と細胞質（サイトプラズマ）は非イオン性界面活性剤
Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０で処理し、ジャーナル・オン
・ヴイロロジー（Ｊ、　Ｖｔｒｏｌ、）＋皿。

２０９−２１９　（１９７９）に記載の方法に従い低速
遠沈して分離した。　　その後、核は分析前に再度洗浄
し、［３Ｈ］て標識化したＤＮＡの分布はジャーナル・
オン・ヴイロロジ−（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　）旦、　６
５２−６６６　（１９７０）に従い、水・シンチレータ
−システムを用いて、Ｐａｃｋａｒｄ　３８５　［体シ
ンチレーションスペクトロメーターで、シンチレーショ
ンを計測することにより測定した。

その結果を第１表に示す。

第１表なお、リン酸カルシウム法の６時間口では、大部分は細
胞表面に留っており、核内に取り込まれるＤＮＡは少な
く５％以下にすぎなかった。

実施例２）実施例１）と同様に操作し、導入率を分析したところ、
実施例１）とほぼ同様の結果が得られた。

実施例３）へ実施例１）と同様に操作し、導入率を分析したところ、
実施例１）とほぼ同様の結果が得られた。

実施例４）実施例１〉と同様に操作し、導入率を分析したところ、
実施例１）とほぼ同様の結果が得られた。

実施例５）実施例１）と同様に操作し、導入率を分析したところ、
実施例１）とほぼ同様の結果が得られた。

実施例６）実施例１）と同様に操作し、導入率を分析したところ、
実施例１）とほぼ同様の結果が得られた。

参考例２）（ア）ｎｅｏ遺伝子の発現ハムスターＢＨＫ２１．ｉｌ胞１０７個あたりに、種々
の量のプラスミドｐｓＶ２−ｎｅｏをプロタミン−ＤＮ
Ａ法、リン酸カルシウム法により組み込み、グリセロー
ルショックを与え、ジャーナル・オン・モレキュラー・
アンド・アプライド・ジエネティクス（Ｊ、　Ｍｏ１．
　Ａｐｐｌ、　Ｇ　−ｅｎｅｔｉｃｓ　）　＋　ＪＬ、
　３２７−３４１　（１９８２）の方法に従い、７５０
　Ｂ　ｇ　／　ｍ　１の濃度のＧ４１８（アミノ配糖体
ネオマイシンの類似物）でセレクションした結果、生存
する細胞の個数は、第２表に示すとおりであった。

第　　　２　　　表（イ）ＣＡＴ遺伝子の発現ヒトＨｅＬａ細胞に、プラスミドｐＳＶ２−ＣＡＴを直
径６ｃｍ培養皿あたり２５μｇの量を種々の方法で導入
し、グリセロールショックを与え、４８時間後、ＣＡＴ
遺伝子の発現量をモレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジー　（Ｍｏ１．　Ｃｅｌ　１．　Ｂｉｏｌ、）
　、　、；ｌ　、　１０４４−１０５１（１９Ｂ２）の
方法に従い測定した。

その結果を第３表に示す。

第　　　３　　　表［発明の効果］以上のように、ＤＮＡ−プロタミン複合体を用いると、
操作が簡単で非常に効率よく真核細胞内にＤＮＡを導入
することができ、しかも核内移行率及び形質発現率もす
ぐれていることがわかる。　　さらに、リン酸カルシウ
ム法と比較して毒性が無いことから、遺伝子工学的手法
としてきわめて有用である。

（以上）

Claims

【特許請求の範囲】

デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とプロタミンの複合体を真
核細胞に接触させることを特徴とする真核細胞内へのＤ
ＮＡ導入法。