WO2006123817A1 - 核酸デリバリー方法および核酸デリバリーデバイス - Google Patents

核酸デリバリー方法および核酸デリバリーデバイス Download PDF

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WO2006123817A1
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nucleic acid
solid substrate
cell
acid delivery
complex
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French (fr)
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Takuro Niidome
Fumio Wada
Yoshiki Katayama
Kosuke Yakumaru
Takahito Kawano
Shuzo Yamashita
Original Assignee
Kyushu University, National University Corporation
Japan Stent Technology Co, Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a method for delivering (introducing) a nucleic acid into a cell and a device for performing the method. More specifically, the present invention relates to a method for delivering a nucleic acid into a cell for the purpose of treatment, diagnosis, molecular biology operation, etc. The present invention relates to a nucleic acid delivery method and a nucleic acid delivery device to be introduced into a cell.
  • the electroporation method has been used as a method for introducing a low molecular weight functional nucleic acid into a cell in order to control gene expression in the cell or into the cell.
  • References 1 and 2 As such nucleic acid delivery technology, in References 1 and 2, a mixture of gelatin and DNA is spotted on a glass substrate, cells are seeded and cultured, and then DNA is spontaneously introduced on the glass substrate. Techniques for incorporation into cultured cells are disclosed, and References 3 and 4 disclose gene transfer devices that use such principles. Reference 5 also developed the methods of References 1 and 2, and produced a glass substrate that had been subjected to a hydrophilic treatment by alternately stacking DNA and a basic lipid-DNA complex. A method has been proposed in which a cultured cell is seeded and DNA is taken into the cell.
  • an object of the present invention is to provide a nucleic acid delivery method and a nucleic acid delivery device (for example, a nucleic acid for gene therapy) having three elements of low cost and simplicity, low burden on cells, and high nucleic acid delivery efficiency.
  • the object is to provide a supported gene therapy device.
  • nucleic acids of a type that have been considered difficult to be taken up are also taken into cells.
  • nucleic acid when a complex of a nucleic acid and a cationic lipid or polyamine is similarly supported on the surface of a solid substrate and pressed against a cell, when the nucleic acid is supported alone and pressed, or the complex is simply brought into contact with the cell. It was found that the nucleic acid was taken up into the cells more efficiently than in the case of the treatment.
  • nucleic acid delivery method characterized in that a nucleic acid supported on the surface of a solid substrate is pressed against a cell, thereby placing the nucleic acid into the cell.
  • the nucleic acid is complexed with a cationic lipid or polyamine
  • nucleic acid forms a complex with protamine or dendritic polylysine
  • the nucleic acid is a nucleic acid useful for gene therapy
  • nucleic acid delivery method of the present invention not only efficiently delivers nucleic acids into cells, but also has good reproducibility and is easy to operate.
  • temporary stress is applied to the cells when the nucleic acid-carrying solid substrate is pressed against the cells, but if the solid substrate is removed after pressing, basically no chemical substance remains after the treatment. Therefore, the burden on the cells is low compared to conventional chemical methods. Therefore, the nucleic acid delivery method of the present invention is not limited to prokaryotic cells such as bacteria, and other eukaryotic cells isolated from plants or animal individuals, but also remains in a state existing in tissues of plants or animal individuals. It can be preferably applied to cells.
  • the nucleic acid to be inserted into the cell is not supported on the surface of the solid substrate, and the nucleic acid is transferred to the cell by pressing the solid substrate surface on which the nucleic acid is supported against the cell.
  • a nucleic acid delivery device is provided for inclusion therein.
  • the surface of the solid substrate is modified with a cationic functional group
  • the surface of the solid substrate is modified with an anionic functional group, and the nucleic acid supported on the surface modified with an anionic functional group forms a complex with a cationic lipid or a polyamine. That
  • nucleic acid supported on the surface of the solid substrate forms a complex with protamine or dendritic polylysine
  • the nucleic acid is a nucleic acid useful for gene therapy,-
  • the amount of the nucleic acid is 20 nanograms to 10 micrograms per 1 cm 2 Being carried by the
  • nucleic acid delivery device of the present invention can be produced inexpensively and easily, and the nucleic acid can be efficiently delivered into cells by pressing the nucleic acid carrying surface against the cells.
  • nucleic acid complex a nucleic acid is formed into a complex with a cationic lipid or poly.ammine (hereinafter sometimes abbreviated as “nucleic acid complex”) and adsorbed on the surface of the solid substrate, the cationic lipid is obtained.
  • polyamines increase the efficiency of nucleic acid delivery into cells by the endocytotic uptake mechanism.
  • the binding force of the nucleic acid or nucleic acid complex to the surface of the solid substrate is increased.
  • the nucleic acid delivery performance is stabilized. be able to.
  • the nucleic acid delivery device of the present invention for example, carries a nucleic acid useful for gene therapy as a device for gene therapy, and screens for gene expression by spotting (dispersing) a plurality of known or unknown genes. Alternatively, it can be put to practical use as a gene transfer device for analyzing gene functions. More specifically, the nucleic acid delivery device of the present invention comprises:
  • a device for carrying out gene therapy by supporting a nucleic acid for gene therapy, pressing it against a cell taken out of the body, putting the nucleic acid (gene) into the cell, and returning it to the body,
  • a nucleic acid for gene therapy is carried on the stent surface, and the stent is carried into a body cavity such as a blood vessel to expand the stenosis site.
  • a device that achieves gene transfer into cells at the same site ie, a stent carrying a gene therapy nucleic acid on its surface. Therefore, according to the present invention, the above-described nucleic acid delivery method or screening method using a nucleic acid delivery device, for example, a plurality of known genes or unknown genes are spotted on the surface of a solid substrate and spotted.
  • a gene screening method characterized by pressing the known gene or unknown gene against cultured cells or animal organs and screening the gene expression.
  • a plurality of known genes or unknown genes are spotted on a solid substrate, and the spotted known genes or unknown genes are pressed against cultured cells or animal organs to express the genes.
  • a gene transfer device is provided for screening or analyzing gene function.
  • a gene therapy device comprising the nucleic acid delivery device.
  • FIG. 1 is a graph showing the efficiency of lance transfer from a nucleic acid-carrying SEAMF-coated substrate of the present invention into CHO cells.
  • FIG. 2 is a graph showing the efficiency of sputum run from a glass substrate carrying protamine-plasmid DNA complexes with different mixing ratios into C H O cells.
  • FIG. 4 is a graph showing the transfection effect from a glass substrate adsorbed with plasmid DNA solutions having different concentrations into C 3 H 3 O cells.
  • the solid substrate for supporting the nucleic acid is not particularly limited as long as it can support the nucleic acid.
  • a solid substrate having an appropriate material and shape can be selected and used depending on the case.
  • a solid substrate made of glass, various ceramics, metal, natural or synthetic polymer can be used.
  • the shape of the solid substrate is a plate (sheet), a sheet, a film, a rod, a hollow cylinder, a string, a line, a network structure, a woven cloth, a non-woven cloth, etc.
  • a solid substrate having a shape that facilitates carrying a required amount of nucleic acid on the surface and that can be easily pressed against cells may be selected according to the purpose of use and form of use.
  • the above-mentioned solid substrate may be coated with various polymers as required. Particularly when a glass solid substrate is used, the surface thereof may be coated with a polymer. preferable.
  • polymers include, for example, biocompatible polymers having a microdomain structure such as hydroxyethyl methacrylate-styrene block copolymer, polyether z nylon 6-10 block copolymer, polyether polyurethane; polypropylene And polymers generally used as medical materials such as polyethylene, polyurethane, polysulfone, and nylon; polymers in which an anionic functional group is introduced into these polymers; and the like.
  • S EAM-F is particularly suitable.
  • This S EAM— F is trimethysilylpropyl methacrylate (TMS PMA) methyl methacrylate (MM A) Z butyl methacrylate (BMA) 2-hydroxymethyl methacrylate (H EMA) styrene (S t) 5 It is produced by blending a terpolymer, polyurethane having trimethysilyl groups at both ends, and TMS PMAZMMA perfluorodecylethyl methacrylate (P FD EMA) ZS t quaternary copolymer.
  • TMS PMA trimethysilylpropyl methacrylate
  • MM A Z butyl methacrylate
  • H EMA 2-hydroxymethyl methacrylate
  • S t styrene
  • the above-mentioned solid base material may be a material obtained by chemically modifying the surface on which the nuclear acid is to be supported within a range that does not impair the object and effect of the present invention. That is, by chemically modifying the surface of the solid substrate, the solid substrate surface and nucleic acid or a complex of nucleic acid and polyamine The binding power of can be increased.
  • modification with a force thione functional group is effective for increasing the binding force to nucleic acid
  • modification with an anionic functional group is effective for increasing the binding force to a complex of nucleic acid and polyamine. is there.
  • Modification with a cationic functional group can be achieved by coating the surface of a solid substrate with a substance having a cationic functional group such as an amino group or a guanidinium group.
  • modification with an anionic functional group involves introducing an anionic functional group such as a carboxyl group, a phosphoric acid group, or a sulfuric acid group onto the surface of a solid substrate, or coating a substance having these anionic functional groups. Is achieved.
  • the amount of the nucleic acid carried on the surface of the solid substrate can be arbitrarily selected according to the purpose of use of the device.
  • the range of 20 nanograms to 10 micrograms per cm 2 preferably 100 nanograms to 5 micrograms, more preferably 300 nanograms to 2.5 micrograms, based on the surface in contact with the surface.
  • nucleic acid used in the present invention can generally have a size as described below.
  • RNA For double-stranded RNA, from 10 base pairs to 5,000 base pairs in length, preferably from 10 base pairs to 50 base pairs in length.
  • RNA For single-stranded RNA, a length of 10 to 50,000 bases, preferably 10 to 5,000 bases, particularly preferably 20 to 1,000 bases in length.
  • any nucleic acid having the size as described above can be used according to the purpose of delivering the nucleic acid into the cell.
  • the nucleic acid to be used is not particularly limited as long as it is a functional nucleic acid used for gene therapy, but a suitable example is a plasmid. Examples thereof include DNA, antisense oligonucleotide, Abutama, lipozyme, siRNA and the like.
  • a low-functional nucleic acid such as s ⁇ RNA is particularly preferable in that it can be artificially synthesized and does not directly act on the genome.
  • the nucleic acid described above can be supported on the surface of a solid substrate in the form of a complex with a polyamine or a cationic lipid.
  • polyamines examples include protamine, polylysine, polyethyleneimine, dendritic polylysine, and polyamidoamine dendrimer.
  • protamine is particularly preferable in terms of easy availability and low cytotoxicity.
  • Cationic lipids include dioleoyloxypropyl monotrimethylammonium (DOTMA), dioleoyltrimethylammonium propane (DOTA P), dimethylaminoethane-powered rubermoylcholesterol (DC—Cho I), and others. Can be used.
  • DOTMA dioleoyloxypropyl monotrimethylammonium
  • DOTA P dioleoyltrimethylammonium propane
  • DC—Cho I dimethylaminoethane-powered rubermoylcholesterol
  • the amount ratio between the nucleic acid and the polyamine or the cationic lipid may be selected so as to obtain an appropriate nucleic acid delivery efficiency depending on the kind.
  • C / A ratio the cationic Z-anion ratio
  • a complex in which polyamine and nucleic acid are mixed in such a quantitative ratio is most preferable. If the CZA ratio is lower than the above range, the nucleic acid delivery efficiency may decrease.
  • the nucleic acid or the nucleic acid complex is a solid group. It can be fixed on the surface of the material There is no particular limitation, and any method can be applied. In general, a solid substrate is immersed in a solution or dispersion containing a nucleic acid or a nucleic acid complex and pulled up to dry, or the solution or dispersion is sprayed onto the solid substrate and dried. .
  • the solution or dispersion is dropped onto a solid substrate, and then the excess solution or dispersion that has not been adsorbed and retained is removed.
  • the solvent used here is not particularly limited with respect to the solution concentration and the like, and may be appropriately selected within the range in which the above operation can be performed.
  • the concentration of the nucleic acid in the solution or dispersion is 100 nanograms Zm I to 50 g / m I, preferably 500 nanograms Zm I to 25 ⁇ g / m 2, depending on the type of nucleic acid and dilution medium used. I, more preferably 1.5 to 12.5 gZm I is used.
  • the solution or dispersion may contain auxiliary components such as a polymer or a micellar agent for assisting in supporting and fixing the nucleic acid or nucleic acid complex to the solid substrate, if necessary. .
  • the nucleic acid carrying surface of the device needs only to be brought into contact with the cell and pressed.
  • the pressing force may be any force as long as a predetermined delivery efficiency can be secured within a range not destroying the cells, and is generally 5 to 500 g / cm 2 , preferably 10 to 100 g cm 2 , Preferably it is 15 to 50 gZcm 2 .
  • the pressing time is generally about 10 minutes to 3 hours, preferably 20 to 40 minutes. However, it does not prevent the nucleic acid delivery device from being placed in the living body for a long time.
  • the nucleic acid delivery device of the present invention can be produced inexpensively and easily.
  • the nucleic acid delivery method of the present invention using such a device is excellent in reproducibility and easy to operate.
  • the load on the cell is reduced.
  • Nucleic acids can be delivered into cells efficiently with less.
  • plasmid DNA, antisense oligonucleotide, si DNA Or the like carried on a solid substrate can easily deliver such nucleic acid into cells with high reproducibility.
  • a glass plate can be used as it is for a solid substrate, which does not require special equipment or reagents as in the conventional gene delivery technology. If the solid substrate pressed against the cell is removed, no chemical substance remains, so the load on the cell is low and high nucleic acid delivery efficiency can be obtained.
  • the nucleic acid delivery device of the present invention is a basic technique for delivering nucleic acid into cells, and leads to the practical use of a highly functional nucleic acid delivery device that has not been available so far.
  • the slide glass was cut into a size of 10 X 1 Omm and washed with methanol. On this glass substrate, 100 L of 10% S EAM—F / toluene solution was applied and heated on a heat block at 50 ° C. for 5 hours to perform S EAM—F coating.
  • the S EAM-F used was TMS PMA (1 0.6 wt%) / MM A (52.8%) / BM A (1 5.5 wt%) / H EMA (5.3 wt%) / S t (1 5. 8 wt%) Pentane copolymer and polyuretane having poly (methylsilyl) groups at both ends (urethane 88.6 wt% and aminoprovir trimethoxysilane 1 1.
  • the plasmid DNA was prepared as follows.
  • PGL 3 Control vector (Promega, Madison, W1, USA) sylferase cDNA was excised with the restriction enzyme Hindlll / Xbal and the fragment was cloned into the pc DNA3 vector (Invitrogen, Carlsbad, GA, USA). Incorporated.
  • This plasmid (pGMV-Luc) was grown in E. coli DH5alpha and purified with the Qiagen plasmid 'Giga' kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany).
  • nucleic acid-carrying SEAMF-coated substrate was pressed from the top of the cultured cells (Chinese hamster ovary-derived cells; CHO) for 30 minutes (pressing force: 40 gZcm 2 ), and then the substrate was removed.
  • the horizontal axis is the expression level of the lucifer Iase gene, and the amount of the gene that has entered the cell is shown.
  • the vertical axis is the mixed protamine cation and the phosphate group of DNA.
  • CZA ratio This is the ratio (CZA ratio) to (anion). High gene expression was observed at a CZA ratio of 4 or more, and stable expression was observed as the CZA ratio increased.
  • the nucleic acid-carrying glass substrate was pressed from the top of the CHO cells for 30 minutes (pressing force: 30 gZcm 2 ), and then the substrate was removed.
  • the nucleic acid-carrying glass substrate was pressed from the upper part of the C H 2 O cells for 30 minutes in the same manner as described above, and then the substrate was removed.
  • the gene expression from plasmid DNA incorporated into the cells after 24 hours was evaluated. The results are shown in Figure 3.
  • the horizontal axis shows the expression level of the luciferase gene
  • the vertical axis shows the amount of DNA added per culture dish and well. From the results in Fig. 3, it was found that high gene expression was already observed at 0.31 3 ⁇ g, and that sufficient gene delivery could be achieved by using at least 0.31 3 jt g of DNA.
  • the obtained nucleic acid-carrying glass substrate was pressed from above the CHO cells for 30 minutes in the same manner as described above, and then the substrate was removed. Gene expression from plasmid DNA incorporated into the cells after 24 hours was evaluated. The results are shown in Fig. 4.

Abstract

本発明の核酸デリバリー方法は、固体基材表面に担持された核酸を細胞に押しつけることによって該核酸を該細胞内に入れる。この方法によれば、安価にかつ簡便に、細胞に対して大きな負荷をかけることなく、高い核酸デリバリー効率で核酸を細胞内にデリバリーすることができる。また、核酸とポリアミン或いはカチオン性脂質との複合体の形で固体基材表面に担持させ、これを細胞に押し付けることにより、細胞内への導入効率をさらに高めることができる。本発明においては、核酸として、遺伝子治療に有用な核酸を用いることにより、効率のよい遺伝子治療用デバイスが得られる。

Description

明細書 核酸デリバリ一方法およぴ核酸デリパリーデバイス <発明の分野 >
本発明は、 細胞内へ核酸をデリバリー （導入） する方法および該方法を実行す るためのデバイスに関するものであり、 さらに詳しくは、 治療、 診断、 分子生物 学操作等の目的で核酸を細胞内に導入する核酸デリバリ一方法および核酸デリバ リーデバイスに関する。
<背景技術 >
従来、 細胞内の遺伝子あるいは細胞内への遺伝子発現を制御するために、 低分 子機能性核酸を細胞内に導入する方法として、 エレクト ΰポレーシヨン法
(electroporation) などの物理的な方法や、 塩基性脂質、 塩基性ポリマーなど を利用した化学的手法が知られている。 しかし、 これらの物理的あるいは化学的 手法は、 細胞に与えるダメージが大きく、 さらに、 特殊な装置や試薬が必要であ リ、 コストがかかる。 このため、 安価で簡便、 そして、 細胞に対して付加の少な い細胞内への核酸デリバリ一技術が求められている。
このような核酸デリバリー技術として、 文献 1及び 2には、 ガラス基板上にゼ ラチンと DN Aの混合物をスポットし、 それに細胞を播種して培養し、 ガラス基 板上において DN Aを自発的に培養細胞内へ取り込ませる手法が開示されており、 文献 3及び 4には、 このような原理を利用した遺伝子導入装置が開示されている。 また、 文献 5には、 文献 1及び 2の手法を発展させ、 親水処理を施したガラス 基板上に D N Aと塩基性脂質一 D N A複合体を交互積層させたものを作製し、 こ の積層体上に培養細胞を播種して、 D N Aを細胞内へ取リ込ませる手法が提案さ れている。
文献 1 ： 米国特許第 6, 544, 790号
文献 2·: Junaid Ziauddin, David . Sabat ini , Nature vol. 411,
107-110(2001) 文献 3 ： 米国特許第 6, 670, 1 29号
文献 4 ： 米国特許第 6， 652, 878号
文献 5 ： Fumio Yamauchi, Koichi Kato, Hiroo Iwata, Biochimica et Byophysica Acta vol. 1672, 138-147 (2004)
上記の文献に開示されているいずれの手法も、 多種遺伝子をスポットし、 その 培養鲷胞内で 機能解析へ発展できると期待される。 しかし、 機能解析のための デバイスであり、 動物臓器への適用はできない。
<発明の開示 > 前述のような問題点を抱える物理的あるいは化学的手法をベースとする核酸デ リパリ一技術は、 その成功が強く期待されているにもかかわらず、 大きなブレー クスルーは未だ成し遂げられてはいないのが現状である。 核酸デリバリー技術に は、 安価で簡便であること、 細胞への負担が少ないこと、 及び高い核酸デリバリ 一効率の 3つの要素が要求される。 3つの要素を同時に高いレベルで実現する核 酸デリバリ一技術の構築は、 遺伝子治療及び分子生物学的に一般に広く用いられ る基礎技術の開発につながる。
従って、 本発明の目的は、 安価で簡便であること、 細胞への負担が少ないこと、 及び高い核酸デリバリー効率の 3つの要素を備えた核酸デリバリー方法及び核酸 デリバリーデバイス （たとえば、 遺伝子治療用核酸を担持させた遺伝治療用デバ ' イス） を提供することにある。
本発明者らは、 上記目的を達成するために鋭意研究した結果、 固体基材表面に 核酸を担持させたものを、 培養細胞上部から押し付けることで、 単に細胞と接触 させるだけでは細胞内への取り込みが困難であるとされてきた種類の核酸も細胞 内へ取り込まれることを見出した。 また、 核酸とカチオン性脂質またはポリアミ ンとの複合体を同様に固体基材表面に担持させて細胞に押しつけるときには、 核 酸を単独で担持して押し付けた場合或いは該複合体を単に細胞と接触させた場合 に比較して、 より効率的に核酸が細胞内に取り込まれることを見出した。 本発明 は、 このような新規知見に基づいてなされたものである。 本発明によれば、 固体基材表面に担持された核酸を細胞に押しつけることによ リ該核酸を該細胞内に入れることを特徴とする核酸デリバリー方法が提供される。 かかる核酸デリバリー方法においては、
( 1 ) 前記核酸が、 カチオン性脂質またはポリアミンと複合体を形成している こと、
( 2 ) 前記核酸が、 プロタミンまたはデンドリティックポリリジンと複合体を 形成していること、
( 3 ) 前記核酸が遺伝子治療に有用な核酸であること、
が好ましい。
このような本発明の核酸デリバリ一方法は、 細胞内へ効率よく核酸をデリバリ 一するのみならず、 再現性もよく、 操作も簡単である。 さらに、 核酸担持固体基 材を細胞に押し付けたときに一時的なス卜レスは細胞にかかるが、 押しつけた後 の固体基材を取り除けば、 基本的に処置後には何も化学物質は残らないため、 細 胞への負担は従来の化学的手法に比べれば低い。 したがって、 本発明の核酸デリ バリー方法は、 細菌などの原核細胞、 その他、 植物あるいは動物個体から分離し た真核細胞に対してのみならず、 植物あるいは動物個体の組織に存在する状態の ままの細胞に対しても好ましく適用することができる。
本発明によれば、 また、 細胞内に入れるための核酸が固体基材表面に担持され てなリ、 該核酸が担持されている該固体基材表面を細胞に押しつけることにより 該核酸が該細胞内に入れられる核酸デリバリーデバイスが提供される。
本発明のデバイスにおいては、
( 4 ) 前記固体基材表面が、 カチオン性官能基で修飾されていること、
( 5 ) 前記固体基材表面がァニオン性官能基で修飾されており、 ァニオン性官 能基で修飾された該表面に担持されている核酸が、 カチオン性脂質またはポリア ミンと複合体を形成していること、
( 6 ) 前記固体基材表面に担持されている核酸が、 プロタミンまたはデンドリ スティックポリリジンとの複合体を形成していること、
( 7 ) 前記核酸が遺伝子治療に有用な核酸であること、 -
( 8 ) 前記核酸が、 1 c m 2当り 2 0ナノグラム乃至 1 0マイクログラムの量 で担持されていること、
が好適である。
このような本発明の核酸デリバリーデバイスは、 安価かつ簡便に製作すること ができ、 かつ、 その核酸担持表面を細胞に押しつけることによリ該核酸を細胞内 へ効率よくデリバリーすることができる。 この場合、 核酸をカチオン性脂質また はポリ..ァミンと複合体 （以下、 「核酸複合体」 と略記することがある） を形成さ せて固体基材表面に吸着担持させると、 カチオン性脂質またはポリアミンが、 ェ ンドサイトーシスの取リ込み機構によリ細胞内への核酸デリバリ一効率をよリ高 くする。 また、 固体基材表面をカチオン性官能基またはァニオン性官能基で修飾 することにより、 固体基材表面への核酸または核酸複合体の結合力が増し、 この 結果、 核酸デリバリ一性能を安定化することができる。
本発明の核酸デリバリーデバイスは、 例えば、 遺伝子治療に有用な核酸を担持 させて遺伝子治療のためのデバイスとして、 及び、 複数の既知遺伝子または未知 遺伝子をスポット （点在配置） して遺伝子発現のスクリーニングまたは遺伝子機 能の解析のための遺伝子導入デバイスなどとして、 実用に供することができる。 よリ具体的には、 本発明の核酸デリバリーデバイスは、
( a ) 遺伝子治療用核酸を担持させ、 体内臓器に押しつけることによる遺伝子 を細胞内に入れるデバイス、
( b ) 遺伝子治療用核酸を担持させ、 体外に取り出した細胞に押し付けて該核 酸 （遺伝子） を細胞内に入れ、 それを体内に戻すことにより遺伝子治療を行うデ バイス、
( c ) 固体基板上に複数の既知遺伝子もしくは未知遺伝子をスポットし、 それ を培養細胞もしくは動物臓器に押しつけ、 その遺伝子発現をスクリーニングする ためのデバイス、 または、 その遺伝子機能を解析するための遺伝子導入デバイス、 などとして実用することができる。
例えば、 上記 （a ) の遺伝子を細胞内に入れるデバイスの具体例の一つとして、 ステント表面に遺伝子治療用核酸を担持させ、 このステントを血管等の体腔内に 搬入し狭窄部位の拡張治療と同時に同部位の細胞への遺伝子導入を達成するデバ イス （すなわち表面に遺伝子治療用核酸を担持させたステント） が挙げられる。 従って、 本発明によれば、 上記の核酸デリバリー方法或いは、 核酸デリバリー デバイスを利用したスクリーニング法、 例えば、 固体基材の表面に複数の既知遺 伝子もしくは未知遺伝子をスポッ卜し、 スポッ卜された該既知遺伝子もしくは未 知遺伝子を、 培養細胞もしくは動物臓器に押しつけ、 その遺伝子発現をスクリー ニングすることを特徴とする遺伝子のスクリーニング法が提供される。
さらに、 本発明によれば、 固体基板上に複数の既知遺伝子もしくは未知遺伝子 をスポットしてなリ、 スポットされた該既知遺伝子もしくは未知遺伝子を、 培養 細胞もしくは動物臓器に押しつけることにより、 その遺伝子発現をスクリ一ニン グしまたは遺伝子機能の解析が行われる遺伝子導入デバイスが提供される。 本発明によれば、 さらに、 前記核酸デリバリーデバイスからなる遺伝子治療用 デバイスが提供される。
<図面の説明 > 図 1は、 本発明の核酸担持 S E A M— Fコーティング基板から C H O細胞内へ の卜ランスフエクシヨン効率を示すグラフである。
図 2は、 混合比の異なるプロタミンープラスミド D N A複合体を担持したガラ ス基板から C H O細胞内への卜ランフエクシヨン効率を示すグラフである。 図 3は、 D N A量の異なるプロタミン一プラスミ ド D N A複合体 （。 比= 4 ) 溶液を吸着させたガラス基板から C H O細胞内へのトランスフエクシヨン効 率を示すグラフである。
図 4は、 濃度の異なるプラスミド D N A溶液を吸着させたガラス基板から C H O細胞内へのトランスフエクシヨン効果を示すグラフである。
<発明を実施するための最良の形態 >
(固体基材）
本発明において、 核酸を担持する固体基材としては、 核酸を担持しうるもので ある限り、 格別の制限はなく、 核酸デリバリーデバイスの使用目的、 使用環境な どに応じて適当な材質、 形状を有する固体基材を選択使用することができる。 例 えば、 ガラス、 各種セラミック、 金属、 天然または合成高分子等からなる固体基 材を用いることができる。 また、 固体基材の形状は、 板状体 （プレート） 、 シー ト、 フイルム、 棒状体、 中空筒状体、 ひも状物、 線状物、 網目構造物、 織布、 不 織布などであってよく、 所要量の核酸を表面に担持させ易く、 かつ、 細胞へ押し つける操作を行い易い形状を有する固体基材を、 使用目的、 使用形態に応じて選 択すればよい。
上記の固体基材は、 必要に応じて、 各種のポリマーでコーティングされていて もよく、 特にガラス製の固体基材を用いる場合には、 その表面が、 ポリマーでコ 一ティングされていることが好ましい。 このようなポリマーとしては、 例えば、 ヒドロキシェチルメタクリレー卜 スチレンブロック共重合体、 ポリエーテル z ナイロン 6— 1 0ブロック共重合体、 ポリエーテルポリウレタン等のミクロドメ イン構造を有する生体適合性ポリマー；ポリプロピレン、 ポリエチレン、 ポリウ レタン、 ポリスルホン、 ナイロン等の医用材料として汎用されているポリマー； これらのポリマーにァニオン性官能基が導入されたポリマー； などを例示するこ とができる。
また、 上記の生体適合性ポリマーの中では、 特に S E AM— Fと呼ばれている ものが好適である。 この S EAM— Fは、 トリメ トキシシリルプロピルメタクリ レート （TMS PMA) メチルメタクリレー (MM A) Zブチルメタクリレ —ト （BMA) 2—ヒドロキシメチルメタクリレー卜 （H EMA) スチレン (S t ) 五元共重合体と、 両末端にトリメ トキシシリル基を有するポリウレタン と、 TMS PMAZMMA パーフルォロデシルェチルメタクリレー卜 （P FD EMA) ZS t四元共重合体とをプレンドすることにより製造されるものであり、 親水性と疎水性のミクロドメイン構造を有する共重合体材料である。 このような 5 1\1ー「は、 例えば、 Kawahito et al. , Artificial Organs, 19(8)； 857 - 863に F A S U Sコポリマーとして記載されている。
また、 上記の固体基材は、 本発明の目的、 作用効果を阻害しない範囲内で、 核 酸を担持すべき表面を化学修飾したものであってもよい。 即ち、 固体基材表面を 化学修飾することにより、 固体基材表面と核酸や核酸とポリアミンとの複合体と の結合力を高めることができる。 特に、 核酸に対する結合力を高めるためには、 力チオン性官能基による修飾が有効であり、 核酸とポリアミンとの複合体に対す る結合力を高めるためにはァニオン性官能基による修飾が有効である。 カチオン 性官能基による修飾は、 固体基材表面に、 アミノ基ゃグァニジゥム基などのカチ オン性官能基を有する物質をコーティングすることにより達成することができる。 一方、 .ァニオン性官能基による修飾は、 固体基材表面に、 カルボキシル基やリン 酸基、 硫酸基などのァニオン性官能基を導入し、 またはこれらのァニオン性官能 基を有する物質をコーティングすることにより達成される。
(核酸）
本発明の核酸デリバリーデバイスにおいて、 上述した固体基材表面に担持させ る核酸の量は、 該デバイスの使用目的に応じて任意に選択することができるが、 一般に、 固体基材がその使用時に細胞と接触する表面を基準にし、 1 cm2当り 20ナノグラム乃至 1 0マイクログラム、 好ましくは 1 00ナノグラム乃至 5マ イクログラム、 より好ましくは 300ナノグラム乃至 2. 5マイクログラムの範 囲がよい。
また、 本発明において使用する核酸は、 一般に、 次に記載するような大きさを 有するものであることができる。
( i ) 2本鎖 DN Aに関して、 直鎖^、 環状を問わず、 長さ 1 0塩基対から 200, 000塩基対、 好ましくは、 長さ 1 0塩基対から 50, 000塩基 対、 とくに好ましくは、 長さ 1 , 000塩基対から 1 0, 000塩基対のも の。
( Π ) 1本鎖 DN A (フォスホロチォエート型も含めて） に関して、 長さ 1 0 塩基から 1 , 000塩基、 好ましくは、 長さ 1 0塩基から 50塩基対のもの。
(iii) 2本鎖 RN Aに関して、 長さ 1 0塩基対から 5, 000塩基対、 好まし くは、 長さ 1 0塩基対から 50塩基対のもの。
(iv) 1本鎖 RN Aに関して、 長さ 1 0塩基から 50, 000塩基、 好ましく は長さ 1 0塩基から 5, 000塩基、 とくに好ましくは、 長さ 20塩基から 1 , 000塩基のもの。 本発明においては、 細胞内への核酸をデリバリ一する目的に応じ、 上記のごと き大きさを有する任意の核酸を用いることができる。 たとえば、 ヒトまたはその 他の動物の疾病の治療を目的とする場合、 用いる核酸としては、 遺伝子治療に用 いられる機能性核酸であればとくに制限はないが、 その適当な例としては、 ブラ スミド DNA、 アンチセンスオリゴヌクレオチド、 アブタマ一、 リポザィム、 s i R.N A等を例示することができる。 これらの中でも、 たとえば s ί RNAの ごとき低分子機能性核酸が人工的に合成しうる点、 ゲノムに直接作用しない点で 特に好ましい。
また、 本発明においては、 上述した核酸は、 ポリアミンまたはカチオン性脂質 との複合体の形で固体基材表面に担持させることができる。
このようなポリアミンとしては、 プロタミン、 ポリリジン、 ポリエチレンイミ ン、 デンドリティックポリリジン、 ポリアミドアミンデンドリマーを例示するこ とができる。 これらの中でも、 プロタミンが、 容易に入手しうる点、 細胞毒性が 低い点で特に好ましい。 カチオン性脂質としては、 ジォレオイルォキシプロピル 一トリメチルアンモニゥム (DOTMA) 、 ジォレオイル一トリメチルアンモニ ゥムプロパン （DOTA P) 、 ジメチルアミノエタン力ルバモイルコレステロ一 ル （DC— C h o I ) などを用いることができる。
上記のような複合体において、 核酸とポリアミン或いはカチオン性脂質との量 比は、 その種類に応じて、 適切な核酸デリバリー効率が得られるように選択すれ ぱよい。 本発明においては、 特に核酸とポリアミンとの複合体を担持させること が好適であり、 特に良好な核酸デリバリー効率を確保できるという点で、 カチォ ン Zァニオン比 （C/A比） が 4以上となるような量比でポリアミンと核酸とが 混合された複合体が最も好適である。 CZA比が上記範囲よリも低い場合には、 核酸デリバリ一効率が低下する場合がある。
(核酸の担持）
本発明の核酸デリバリーデバイスにおいて、 核酸或いは核酸とポリアミンもし くはカチオン性脂質との複合体 （核酸複合体） を固体基材表面に担持する方法と しては、 核酸或いは核酸複合体を固体基材表面に固定することができる方法であ れぱ特に制限はなく、 任意の方法を適用することができる。 一般的には、 核酸ま たは核酸複合体を含む溶液または分散液に固体基材を浸潰し、 引き上げて乾燥す るか、 固体基材に前記溶液または分散液を噴霧し、 乾燥すればよい。 また、 前記 溶液もしくは分散液を固体基材上に滴下し、 その後、 吸着保持されなかった過剰 の溶液もしくは分散液を除去する方法を採用することもできる。 ここで用いる溶 媒ゃ溶液濃度等に関しては特別の制限はなく、 上記操作を行うことができる範囲 内で適宜選択すればよい。 例えば、 前記溶液または分散液における核酸の濃度は、 用いる核酸および希釈用媒体の種類にもよるが、 1 00ナノグラム Zm I乃至 50 g/m I . 好ましくは 500ナノグラム Zm I乃至 25 μ g/m I、 さら に好ましくは 1. 5〃 gZm l乃至 1 2. 5 gZm Iが用いられる。 また、 前 記溶液または分散液には、 必要に応じ、 固体基材への核酸または核酸複合体の担 持固定化を助けるためのポリマーまたはミセル化剤等の補助的成分を含有させる ことができる。
(核酸のデリバリ一）
上記のようにして作製された本発明の核酸デリバリーデバイスを使用して核酸 を細胞内へデリバリーするためには、 該デバイスの核酸担持表面を細胞に接触さ せて押し付けるだけでよい。 押し付け力は、 細胞を破壊しない範囲内で所定のデ リバリー効率が確保できるようなものであればよく、 一般には、 5乃至 500 g /cm2, 好ましくは 1 0乃至 1 00 g cm2、 より好ましくは 1 5乃至 50 gZcm2である。 また、 押しつけておく時間は、 一般に、 約 1 0分乃至 3時間、 好ましくは 20乃至 40分である。 ただし、 核酸デリバリ一デバイスをその使用 目的さらに長時間生体内等に留置することを妨げない。 本発明の核酸デリバリ一デバイスは、 安価、 且つ簡便に作製できる。 また、 こ のようなデバイスを利用した本発明の核酸デリバリー方法は、 再現性に優れ、 操 作も簡単であり、 このデバイスの核酸担持表面を細胞に押し付けることで、 細胞 に対しての負荷を少なくして効率よく、 核酸を細胞内にデリバリーすることがで きる。 例えばプラスミ ド DNA、 アンチセンスオリゴヌクレオチド、 s i D N A などを固体基板に担持させたものは、 このような核酸の細胞内へのデリバリーを 再現性よく、 簡便に実現することができる。 さらに、 固体基板にはガラス板をそ のまま利用することもでき、 これまでの遺伝子デリバリー技術のように特殊な装 置や試薬を必要としない上に、 一時的なストレスが細胞にかかるものの、 細胞に 押し当てられた固体基板を取り除けば、 何の化学物質も残らないため、 細胞への 負荷が低く、 高い核酸デリパリ一効率を得ることができる。
本発明の核酸デリバリーデバイスは、 細胞内への核酸デリバリ一の基礎的技術 となるものであり、 従来に無い高機能性核酸デリバリーデバイスの実用化につな がるものである。
<実施例 > 以下、 実施例により本発明を拠り具体的に説明するが、 本発明はこれらの例示 に限定されるものではない。
(実施例 1 )
[S E AM— Fコーティング基板に担持された核酸の細胞内取り込み]
スライドガラスを 1 0 X 1 Ommの大きさに切り、 メタノールで洗浄した。 こ のガラス基板上に、 1 0%S E AM— F/トルエン溶液を 1 00 L塗布し、 ヒ 一トブロック上で 50°C、 5時間加熱することで S E AM— Fコーティングを行 つた。
尚、 用いた S EAM— Fは、 TMS PMA (1 0. 6 w t %) /MM A (52. 8 %) /BM A ( 1 5. 5w t %) /H EMA (5. 3 w t %) /S t (1 5. 8 w t %) 五元共重合体と、 両末端に卜リメ 卜キシシリル基を有するポリウレタ ン （ウレタン 88. 6 w t %とァミノプロビルトリメ トキシシラン 1 1. 4w t %からなる） と、 TMS PMA (38. 9 w t %) /MM A (2. 5 w t %) ZP F D EMA (30. 3w t %) ZS t (28. 3 w t %) 四元共重合体とを、 重量比 54 ： 43 ： 3でブレンドすることにより製造されたものである。
2. 5 rgのプラスミ ド D N Aに対して、 プロタミンを CZA比 = 0, 1， 2, 4, 8， 1 6となるように、 200 Lの滅菌水中で混合し、 軽く撹拌後、 1 5 分間静置することでプロタミンープラスミド DN A複合体を形成させた。
尚、 プラスミ ド DNAは、 次のように作製したものを用いた。
P G L 3—コントロールベクター （Promega, Madison, W1, USA) のシルフェ ラーゼ c DNAを、 制限酵素 Hindlll/Xbalで切り出し、 その断片を p c DNA3 ベクタ一 （Invitrogen, Carlsbad, GA, USA) のマルチクローニングサイ トに組 み込んだ。 このプラスミド （pGMV - Luc) を大腸菌 DH5alphaにより増殖させ、 キア ゲン■ プラスミド 'ギガ'キット （QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) にて精製し た。
プロタミン一 DN A複合体溶液 200〃 Lを、 S E AM— Fコ一ティングガラ ス上にのせ、 1時間吸着させた後、 滅菌水ですすいだ。 得られた核酸担持 S EA M— Fコーティング基板を、 培養細胞 （チャイニーズハムスター卵巣由来細胞； CHO) 上部から 30分間押し当てた後 （押し付け力： 40 gZcm2) 、 基板 を除去した。 24時間後の細胞内に取り込まれたプラスミ ド DN Aからの遺伝子
(ルシフェラーゼ） 発現を評価した。 結果を図 1に示す。
図 1において、 横軸はルシフ Iラーゼ遺伝子の発現量で、 遺伝子が細胞内に入 リ機能した量を示し、 縦軸は混合したプロタミンのカチオンと DN Aのリン酸基
(ァニオン） との比 （CZA比） を表す。 CZA比 =4以上において高い遺伝子 発現が認められ、 CZ A比が大きいほど安定した発現が認められた。
(実施例 2)
[ガラス基板に担持された核酸の細胞内取り込み]
2. 5 gのプラスミド D N Aに対して、 CZA比 =0， 1， 2, 4, 8, 1 6となるように、 プロタミンを 200/ Lの滅菌水中で混合し、 軽く撹拌後、 1 5分間静置した。 得られたプロタミンープラスミ ド DN A複合体 200 Lを、 1 0 X 1 Ommガラス上にのせ、 1時間吸着させた後、 滅菌水ですすいで核酸担 持ガラス基板を作製した。
この核酸担持ガラス基板を CHO細胞上部から 30分間押し当てた後 （押し付 け力 ： 30 gZcm2) 、 基板を除去した。 24時間後の細胞内に取り込まれた プラスミ ド D N Aからの遺伝子発現を評価した。 結果を図 2に示す。 図 2の結果から、 ガラス基板に DN Aのみを吸着させても （C/A比 =0の場 合） 、 遺伝子発現が認められ、 また DN Aとプロタミンとの複合体を吸着させる と安定して高い発現効率を示すことが判る。
また、 5 μ g, 2. 5 μ s, 1. 25 μ s, 0. 625 i g、 及び 0. 3 1 3 // gのプラスミド DN Aに対して、 それぞれ CZA比 =4となるように、 プロタ ミンを、 20.0 Lの滅菌水中で混合し、 軽く撹拌した後、 1 5分間静置した。
1 0 X 1 Ommガラス上に、 上記で得られたプロタミン一 D N A複合体溶液 200 Lをのせ、 1時間吸着させた後、 滅菌水ですすいで核酸担持ガラス基板 作製した。
この核酸担持ガラス基板を C H O細胞上部から、 上記と同様にして 30分間押 し当てた後、 基板を除去した。 24時間後の細胞内に取り込まれたプラスミ ド D N Aからの遺伝子発現を評価した。 結果を図 3に示す。
図 3において、 横軸はルシフェラーゼ遺伝子の発現量を示し、 縦軸は培養シャ ーレ、 1ゥエルあたりの添加した DN A量を表す。 図 3の結果から、 0. 3 1 3 μ gで既に高い遺伝子発現が認められ、 少なくとも 0. 3 1 3 jt gの DNAを利 用すれば十分な遺伝子デリバリーが実現することがわかつた。
さらに、 5 μ g， 2. 5 μ g, 1. 25 μ g, 0. 625 i g及び 0. 3 1 3 jU gのプラスミド DNAを、 200 i Lの滅菌水中に混合しプロタミンー D N A 複合体溶液を得た。 1 0 X 1 Ommガラス上に、 得られたプロタミンー D N A複 合体溶液 200 Lをのせ、 1時間吸着させた後、 滅菌水ですすいで核酸担持ガ ラス基板を作製した。
得られた核酸担持ガラス基板を CHO細胞上部から上記と同様にして 30分間 押し当てた後、 基板を除去した。 24時間後の細胞内に取り込まれたプラスミド DN Aからの遺伝子発現を評価した。 結果を図 4に示す。

Claims

請求の範囲
1 . 固体基材表面に担持された核酸を細胞に押しつけることによリ該核酸 を該細胞内に入れることを特徴とする核酸デリバリ一方法。
2 . 前記核酸が、 カチオン性脂質またはポリアミンと複合体を形成してい る請求の範囲.1に記載の核酸デリバリー方法。
3 . 前記核酸が、 プロタミンまたはデンドリティックポリリジンと複合体 を形成している請求の範囲 2に記載の核酸デリバリ一方法。
4 . 前記核酸が遺伝子治療に有用な核酸である請求の範囲 1に記載の核酸 デリバリー方法。
5 . 細胞内に入れるための核酸が固体基材表面に担持されてなリ、 該核酸 が担持されている該固体基材表面を細胞に押しつけることにより該核酸が該細胞 内に入れられる核酸デリバリーデバイス。
6 . 前記固体基材表面が、 カチオン性官能基で修飾されている請求の範囲 5に記載の核酸デリバリ一デバイス。
7 . 前記固体基材表面がァニオン性官能基で修飾されており、 ァニオン性 官能基で修飾された該表面に担持されている核酸が、 カチオン性脂質またはポリ ァミンと複合体を形成している請求の範囲 5に記載の核酸デリバリ一デバイス。
8 . 前記固体基材表面に担持されている核酸が、 プロタミンまたはデンド リスティックポリリジンとの複合体を形成している請求の範囲 5に記載の核酸デ リバリ一デバイス。
9 . 前記核酸が遺伝子治療に有用な核酸である請求の範囲 5に記載の核酸 デリバリーデバイス。
1 0 . 前記核酸が、 1 c m 2当り 2 0ナノグラム乃至 1 0マイクログラムの 量で担持されている請求の範囲 5に記載の核酸デリバリーデバイス。
1 1 . 固体基材の表面に複数の既知遺伝子もしくは未知遺伝子をスポッ卜し、 スポッ卜された該既知遺伝子もしくは未知遺伝子を、 培養細胞もしくは動物臓器 に押しつけ、 その遺伝子発現をスクリーニングすることを特徴とする遺伝子のス クリーニング法。
1 2 . 固体基板上に複数の既知遺伝子もしくは未知遺伝子をスポットしてな リ、 スポットされた該既知遺伝子もしくは未知遺伝子を、 培養細胞もしくは動物 臓器に押しつけることにより、 その遺伝子発現をスクリーニングしまたは遺伝子 機能の解析が行われる遺伝子導入デバイス。
1 3 . 請求の範囲 9に記載の核酸デリバリーデバイスからなる遺伝子治療用 デバイス。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63102682A (ja) * 1986-10-20 1988-05-07 Medeisa Shinyaku Kk 真核細胞内へのｄｎａ導入法
JP2002340775A (ja) * 2001-05-18 2002-11-27 Olympus Optical Co Ltd 吸着力測定用カンチレバー、この吸着力測定用カンチレバーを有する吸着力検出装置、及びこの吸着力測定用カンチレバーを用いた物質注入方法
JP2003509060A (ja) * 1999-09-17 2003-03-11 ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ 逆トランスフェクション方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5688233A (en) * 1992-08-17 1997-11-18 Genetronics, Inc. Electronincorporation enhanced transdermal delivery of molecules
JP2003009859A (ja) * 2001-05-23 2003-01-14 Nippon Sheet Glass Co Ltd 核酸固定用基板、核酸固定用基板の製造方法、及びガラスプレート、並びに核酸の解析方法
US6670129B2 (en) * 2001-09-24 2003-12-30 Corning Incorporated Cell transfection apparatus and methods for making and using the cell transfection apparatus
JP4091823B2 (ja) * 2002-10-30 2008-05-28 独立行政法人科学技術振興機構 環状ｄｎａの伸長固定化法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63102682A (ja) * 1986-10-20 1988-05-07 Medeisa Shinyaku Kk 真核細胞内へのｄｎａ導入法
JP2003509060A (ja) * 1999-09-17 2003-03-11 ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ 逆トランスフェクション方法
JP2002340775A (ja) * 2001-05-18 2002-11-27 Olympus Optical Co Ltd 吸着力測定用カンチレバー、この吸着力測定用カンチレバーを有する吸着力検出装置、及びこの吸着力測定用カンチレバーを用いた物質注入方法

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