JP4580764B2 - 生体分子送達用固体表面およびハイスループットアッセイ - Google Patents
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Description
Polysciences Inc.(米国ペンシルベニア州ワリントン市)より、分岐型PEI25K(Mw 25KDaのポリエチレンイミン)および直鎖PEI25K(Mw 25KDa)を購入した。Superfect(登録商標)(Qiagen、カリフォルニア州バレンシア市)の溶液を、製造者の指示に基づいて使用した。Life Technologies(メリーランド州ゲイサースバーグ市)より購入したトランスフェクション試薬LipofectAMINE(登録商標)を、製造者の指示に基づいて使用した。NDT-CP-B-1(分解性)およびNDT-CP-1(非分解性)は、PEI600(Mw 600 Da)を用いてポリマー性トランスフェクション試薬で異なるリンカーと合成した。NDT-LP-1は、ポリマーと脂質構造を同一分子上に持つ脂質−ポリマーである。NDTポリマー性トランスフェクション試薬の構造は、図35に示す通りである。
ゼラチン系トランスフェクション混合液で調製したトランスフェクション可能表面
0.2%ゼラチン調製物
ゼラチン粉タイプB:225 Bloom(Sigma、カタログ#G-9391)を滅菌MilliQ水に加え、溶液を60°Cの湯浴で15分間静かに撹拌して溶解させた。続いて、0.2%ゼラチン液を室温で冷まし、まだ暖かい間(37〜40℃)に0.45 μmの細胞アセテート膜(CA)を通して濾過した。この溶液を100 ml調製し、濾過したゼラチン液を50 mlに分注して4℃で保管した。
すべてのトランスフェクション試薬を0.2%ゼラチン液で稀釈した。直鎖PEI25Kと特別に合成したポリマーサンプルの濃度は320.0 μg/mlから40.0 μg/ml、分岐型PEI25Kの濃度は160.0 μg/mlから20.0 μg/mlの範囲にあった。Superfect濃度は600.0 μg/mlから75.0 μg/ml、リポフェクタミン濃度は200.0 μg/mlから25.0 μg/mlの範囲にあった。ポリマーと脂質−ポリマー合成物(NDT)の濃度は、320.0 μg/mlから40.0 μg/mlの範囲にあった。
96ウエルプレートの各ウエルに25 μlのトランスフェクション/ゼラチン液を添加した。プレートを数秒間振って、底面全体がトランスフェクション/ゼラチン液で覆われるようにした。続いて、プレートを組織培養フード内で数時間(約5〜6時間)空気乾燥させた。乾いたプレートを4℃で保管したものを使用した(図2〜7)。
1〜4 μlのトランスフェクション/ゼラチン液を、PLLを塗布したスライドに斑点状に塗布した。スライドを清浄なフードに約1時間放置して完全に乾燥させた。乾いたプレートを4℃で保管したものを使用した(図20、21)。
ラミニン(Sigma、カタログ#L2020)を最終濃度が40.0 μg/mlとなるまでPBSで稀釈し、4℃で保管した。
すべてのトランスフェクション試薬を40.0 μg/mlラミニン液で稀釈した。直鎖PEI25Kと特別に合成したポリマーサンプルの濃度は320.0 μg/mlから40.0 μg/ml、分岐型PEI25Kの濃度は160.0 μg/mlから20.0 μg/mlの範囲にあった。Superfect濃度は600.0 μg/mlから75.0 μg/ml、リポフェクタミン濃度は200.0 μg/mlから25.0 μg/mlの範囲にあった。ポリマーと脂質−ポリマー合成物(NDT)の濃度は、320.0 μg/mlから40.0 μg/mlの範囲にあった。
96ウエルプレートの各ウエルに25 μlのトランスフェクション/ラミニン液を添加した。プレートを数秒間振って、底面全体がトランスフェクション/ゼラチン液で覆われるようにした。続いて、プレートを組織培養フード内で数時間(約5〜6時間)空気乾燥させた。乾いたプレートを4℃で保管したものを使用した(図8〜13)。
1〜4 μlのトランスフェクション/ゼラチン液を、PLLを塗布したスライドに斑点状に塗布した。スライドを清浄なフードに約1時間放置して完全に乾燥させた。乾いたプレートを4℃で保管したものを使用した(図22、23)。
コラーゲン(Sigma、カタログ#C8919)を最終濃度が120.0 μg/mlとなるまでPBSで稀釈し、4℃で保管した。
すべてのトランスフェクション試薬を120.0 μg/mlのコラーゲン液で稀釈した。直鎖PEI25Kと特別に合成したポリマーサンプルの濃度は320.0 μg/mlから40.0 μg/ml、分岐型PEI25Kの濃度は160.0 μg/mlから20.0 μg/mlの範囲にあった。Superfect濃度は600.0 μg/mlから75.0 μg/ml、リポフェクタミン濃度は200.0 μg/mlから25.0 μg/mlの範囲にあった。ポリマーと脂質−ポリマー合成物(NDT)の濃度は、320.0 μg/mlから40.0 μg/mlの範囲にあった。
96ウエルプレートの各ウエルに25 μlのトランスフェクション/コラーゲン液を添加した。プレートを数秒間振って、底面全体がトランスフェクション/コラーゲン液で覆われるようにした。続いて、プレートを組織培養フード内で数時間(約5〜6時間)空気乾燥させた。乾いたプレートを4℃で保管したものを使用した(図14〜16)。
ラミニン(Sigma、カタログ#L2020)を最終濃度が40.0 μg/mlとなるまで0.2%ゼラチンで稀釈し、4℃で保管した。
すべてのトランスフェクション試薬を40.0 μg/mlのラミニン/0.2%ゼラチン液で稀釈した。直鎖PEI25Kと特別に合成したポリマーサンプルの濃度は320.0 μg/mlから40.0 μg/ml、分岐型PEI25Kの濃度は160.0 μg/mlから20.0 μg/mlの範囲にあった。Superfect濃度は600.0 μg/mlから75.0 μg/ml、リポフェクタミン濃度は200.0 μg/mlから25.0 μg/mlの範囲にあった。ポリマーと脂質−ポリマー合成物(NDT)の濃度は、320.0 μg/mlから40.0 μg/mlの範囲にあった。
96ウエルプレートの各ウエルに25 μlのトランスフェクション/ゼラチン/ラミニン液を添加した。プレートを数秒間振って、底面全体がトランスフェクション/ゼラチン液で覆われるようにした。続いて、プレートを組織培養フード内で数時間(約5〜6時間)空気乾燥させた。乾いたプレートを4℃で保管したものを使用した(図17〜19)。
標準的なDNA組換えプロトコルに従って、プラスミドpCMV-GFPとpCMV-lucを作製した。緑色蛍光タンパク質(GFP)とホタルルシフェラーゼ遺伝子cDNAをヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターで制御し、遺伝子発現促進剤であるニワトリβ−グロブリン・イントロンで転写物を安定化させた。プラスミドをDH5α大腸菌で増幅し、Qiagen Plasmid Max調製キットを製造者の指示に従って操作して純化した。純化プラスミドDNAの量と質を、260および280 nmでの分光学的分析、ならびに0.8%アガロースゲルでの電気泳動法を用いて評価した。純化プラスミドDNAは、滅菌ddH2Oに溶解し、-20℃で保管した。
pCMV-GFPまたはpCMV-lucプラスミドを、最終濃度が10 μg/ml になるようにDMEMで稀釈した。96ウエルプレートまたはガラススライドのトランスフェクション可能表面に30 μlのDNA液を添加し、室温で20〜30分培養した。
ノーザンカロライナ大学のコール博士が開発したルシフェラーゼ705リポーター遺伝子系(Kang SHら Biochemistry 1998; 37 (18): 6235-9)を用いた。この系は、ヒトβ−グロブリンを705で変異させたものを、ルシフェラーゼcDNA配列内に挿入したものである。このプラスミドをHeLa細胞内に導入し、安定した遺伝子発現を起こさせた。この細胞株を、HeLa luc705と称する。スプライシングを誤った遺伝子生成物(ルシフェラーゼ)は活性を示さないため、通常これらの細胞のルシフェラーゼ活性は低い。しかし、705配列に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって誤スプライシング・サイトが遮断されるため、生物学的活性を持つルシフェラーゼタンパク質が生成される。ルシフェラーゼ705は、アンチセンスオリゴヌクレオチド送達効率を評価するための機能モデルとして用いられる。ルシフェラーゼ活性が高いことは、アンチセンス送達効率がより高いことを示す。
siRNAは21〜25 bpの二本鎖RNA断片であり、標的mRNAと結合してmRNAを破壊することで遺伝子発現レベルのダウンレギュレーションを行う機能を持つ。この実験では、ルシフェラーゼプラスミド、ならびにルシフェラーゼ遺伝子を標的とするsiRNA合成カセットをopti-MEMを用いて調製し、前述したトランスフェクション可能プレートに添加して25分培養した。ルシフェラーゼプラスミドの量は一ウエル当たり0.5 μg、siRNA合成カセットの量は一ウエル当たり約0.5 μgであった(図25)。
0.2%ゼラチン液を用いて様々な濃度(一ウエル当たり50、25、12.5、6.3 μg)のビオチン標識Tatペプチドを調製し、96ウエルプレートの異なるウエルにそれぞれ塗布した。続いて、プレートを細胞培養フード内に数時間放置して乾燥させた。ペプチドを塗布したプレートに一ウエル当たり1.5 x 104個のHeLa細胞を播種し、37℃で4時間培養した。細胞は、0.2%グルタルアルデヒド/PBSに5分間晒して固定させた後、10%メタノールで処理した。10%血清を添加して37℃で30分遮断した後、細胞をストレプトアビジン−FITCとともに37℃で30分培養した。続いて、細胞をPBSで洗浄し、蛍光顕微鏡で蛍光信号を観察した。ペプチドが細胞内にうまく送達されていれば、ビオチン共役ペプチドがストレプトアビジン−FITCと結合し、ペプチドが蛍光信号を生成できるようになる。細胞内のFITC信号の増加は、細胞内により多くのペプチドが運ばれたことを示す(図26)。
トランスフェリン共役ポリ−L−リジンの調製
トランスフェリンは、トランスフェリンレセプターの媒介によるエンドサイトーシス経路において肝細胞に吸収され得る。トランスフェリンは、肝細胞内への遺伝子送達効率を向上させる有効な細胞標的分子としての機能が報告されている(Wagner E, Ogris M, Zauner W. Adv Drug Deliv Rev 1998; 30 (1-3): 97-113)。
この実験では、トランスフェリンと共役させたポリ−L−リジン(PLL-T)を25 μl取り、40.0 μg/mlのラミニンを塗布した96ウエルプレートに塗布した。対照物として、ポリ−L−リジン(PLL)を用いた。PLL-TとPLLの濃度は、320.0 μg/mlから40.0 μg/mlの範囲にあった。プレートを空気乾燥させた後、25 μlのルシフェラーゼプラスミド液(20.0 μg/ml、ポリマーとDNAの比率は16:1から2:1)をプレートに添加し、室温で25分培養した。乾いたプレートを関連実験に使用した(図27)。
VSVGは膜不安定化作用を持つウイルスエンベロープタンパク質であり、細胞の膜融合および膜破壊を起こす。VSVGは、陽イオン性ポリマー(PLL)の媒介による遺伝子トランスフェクションを大幅に増加することができる遺伝子トランスフェクション促進剤として用いられている。VSVGタンパク質の細胞融合ドメイン内からペプチドを合成した。このペプチドの配列はRRRQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDARRRで、ペプチドの可溶性を向上させるために、CとNの各終端にアミノ酸アルギニンが付加されている。
グルタミンは、アンモニアによる細胞毒性から細胞を保護する細胞減少性試薬である(Nakamura E, Hagen S J. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol 283 G1264-1275, (2002))。ほぼすべての陽イオン性ポリマーまたは陽イオン性脂質にはアミン基が含まれているため、トランスフェクション可能表面の調製用にグルタミンをトランスフェクション混合液に添加することで、トランスフェクションによる細胞毒性が防止できる。グルタミン(100 mmol/L)と各種トランスフェクション試薬(NDT-CP-B-1、NDT-CP-1、Superfect、リポフェクタミン2000)を0.2%ゼラチン液で稀釈し、グルタミン/トランスフェクション試薬/ゼラチンを含む溶液25 μlを96ウエルプレート内に添加した後、プレートを空気乾燥させた。続いて、opti-MEM(20.0 μg/ml)中のGFPプラスミド液25μlを各ウエルに添加し、室温で25分培養した。乾いたプレートを使用した(図32)。
ラミニンは、細胞の増殖と分化を支えるマトリックスである。ラミニンは、細胞付着試薬として一般に用いられている。この実験では、0.2%ゼラチン、または0.2%ゼラチンと40.0 μg/mlラミニンの混合液を用いてNDT-CP-B-1、NDT-CP-1、NDT-LP-1、NDT-LP-2、Superfectおよびリポフェクタミン2000の各トランスフェクション試薬を稀釈し、得られた溶液25 μlを96ウエルプレート内に添加した。各ウエル内のNDTポリマーの量は、それぞれ8、4、または2 μgであった。Superfectの量は、一ウエル当たりそれぞれ15、7.5、3.8 μgであった。リポフェクタミン2000の量は、一ウエル当たりそれぞれ2.5、1.25、0.63 μgであった。プレートを空気乾燥させた後、Opti MEM(20.0 μg/ml)中のGFPプラスミド液25μlを各ウエルに添加し、室温で25分培養した。その後、プレートの各ウエルに5 x 104個の293細胞を播種した。これらの細胞は、さらに37°Cで24時間培養された。トランスフェクション効率および細胞毒性を蛍光顕微鏡とMTTアッセイを用いて分析した(図33)。
10%ウシ胎仔血清、100単位/mlのペニシリン、および100 μg/ml のストレプトマイシンを含むDMEM(Gibco)中にHEK 293T細胞を維持した。この培地中の細胞の倍加時間は約20時間であり、過度の密集を避けるために細胞を3〜4日間ごとに分けた。
ヒト初代内皮細胞であるHUV-EC細胞株を、10%ウシ胎仔血清、100単位/mlのペニシリン、100 μg/ml のストレプトマイシン、ならびに製造業者の指示に基づく各種成長因子を含むEBM培地(Cambrex Corp.)中で成長させ、維持した(図29、30)。
トランスフェクションを実施する直前に、次の手順に従って細胞培養フード内で10 cmのディッシュから細胞を採取した。
a. 培地を除去し、細胞を2 mlのPBSですすぎ、溶液をプレート上に展着させた後、溶液を直ちに除去した。
b. 0.5 mlのトリプシン−EDTAを細胞に添加し、プレート上に均一に展着させた後、トリプシン−EDTAを直ちに除去した。
c. 細胞をフード内に3〜5分放置した。続いてプレートを攪拌し、プレート表面から細胞を分離させた。
d. 細胞が付着したプレートに37℃の完全培地6 mlを添加し、10 mlのピペットを用いて過剰な泡立ちを抑えながら溶液の吸い取りと吐き出しを12〜15回繰り返し、単細胞浮遊液を得た。さらに培地を14 ml添加し、細胞を溶液中に完全に浮遊させた。
e. 血球計数器を用いて細胞を定量化した。
f. HEK 293TとHepG2細胞を滅菌深皿内で稀釈して最終濃度が一ウエル当たり4〜5 x 105個となるようにし、100 μl(細胞4〜5 x 104個に相当)を96ウエルプレートの各ウエル内に播種した。HeLa 705とHUV-EC細胞の最適濃度は、1〜2 x 105個/mlであった。
緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を初期スクリーニングに使用した。トランスフェクション実施後、細胞内のGFP信号を蛍光顕微鏡(オリンパス、フィルター520 nm)で観察した。10倍の対物レンズを用いて細胞の顕微鏡写真を撮影した。最適な陽イオン性ポリマーの量を求めるために、トランスフェクション後の培養液中のGFP信号を有する細胞の割合を3つの領域の計数値から決定した。
ルシフェラーゼ活性の測定は、製造者の指示に基づく化学蛍光アッセイによって行った(Luciferase Assay System: Promega、米国ウィスコンシン州マディソン市)。遺伝子搬送から30時間後、細胞をPBSで2回すすぎ、続いて細胞溶解緩衝剤(1% Triton X-100、100 mM K3PO4、2 mMジチオスレイトール、10%グリセロール、2 mM EDTA pH 7.8)を用いて室温で15分溶解した。次に、10 μlの細胞溶解物と50 μlのルシフェラーゼアッセイ試薬を光度計内でインジェクターを用いて室温で混合した。10秒間の光の放射を3回測定し、RLU(相対光量単位)で示した。相対光量単位(RLU)は、BSAタンパク質アッセイ(Pierce、イリノイ州ロックフォード市)で決定した各サンプルのタンパク質含有量に基づいて正規化した。すべての実験は、それぞれ3回実施した。
哺乳類の細胞に対するトランスフェクション試薬の細胞毒性を、3−[4,5ジメチルチアゾール−2−イル]−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)法を用いて評価した。トランスフェクションから40時間後、10 μlのMTT液(5.0 mg/ml、Sigma)を各ウエルに添加し、3時間培養した。続いて培地を除去し、200 μlのDMSOを添加してホルマザン結晶を溶解した。この溶液の吸光度を570 nmで測定した。細胞生存度を、次の式を用いて計算した:生存度(%)={Abs570(サンプル)/Abs570(対照物)}x 100(図31)。
LPEI、BPEI、NDT-CP-B-1、NDT-CP-1、Superfect、およびリポフェクタミンを含んだ0.2%ゼラチン液を、前述の方法で96ウエルプレートに塗布した。プレートを空気乾燥させた後、37℃で9日間培養した。培養後のプレートを使用した。プレートに一ウエル当たり25 μlのルシフェラーゼプラスミド(最適MEM中、20.0 μg/ml)を(37℃での培養期間の前後に)添加し、25分培養した。5 x 104個の293細胞をプレート内に播種し、37℃で48時間培養した。フラッシュプレート、または37℃で9日間培養したプレートのトランスフェクション可能表面について、その遺伝子トランスフェクション効率を比較した(図34)。
Claims (27)
- (a)分解性リンカーに結合した、分子量が600Daのポリエチレンイミン(PEI)オリゴマーを含むトランスフェクション試薬を部分的にまたは全体的に塗布した固体表面を作製する工程、(b) 真核細胞に導入するDNAを前記固体表面上に添加する工程、および (c) 十分な濃度と適切な条件下で前記固体表面上に細胞を播種することで前記DNAを前記真核細胞内に導入する工程を有する、インビトロでのDNAの真核細胞への導入方法。
- 前記固体表面がフラスコ、ディッシュ、マルチウエルプレート、スライド、および植え込み型装置からなる群より選択される請求項1の方法。
- 前記トランスフェクション試薬が、さらに、細胞標的部分、細胞内標的部分、膜不安定化成分、および一以上のトランスフェクション促進剤からなる群より選択される追加試薬を含む請求項1または2に記載の方法。
- 前記トランスフェクション試薬を前記固体表面上に均一に展着させる、あるいは前記表面上の不連続の部位に前記トランスフェクション試薬を斑点状に塗布することで前記表面に固定させる請求項1から3までのいずれかに記載の方法。
- 前記トランスフェクション試薬が、さらに、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、多糖類、ポリマー、およびこれらの混合物からなる群より選択されるマトリックス試薬を含む請求項1から4までのいずれかに記載の方法。
- 前記タンパク質が、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ウシ血清アルブミン、およびそれらの混合物から選択される請求項5の方法。
- 前記ポリマーが、ヒドロゲル、生物分解性ポリマー、および生物適合性物質から選択される請求項5の方法。
- 前記トランスフェクション試薬が、さらに、細胞減少性試薬、細胞結合試薬、細胞成長試薬、細胞刺激試薬、および細胞抑制試薬からなる群より選択される細胞培養試薬を含む請求項1から7までのいずれかに記載の方法。
- 前記真核細胞が哺乳類の細胞である請求項1から8までのいずれかに記載の方法。
- 前記哺乳類の細胞が分裂細胞または非分裂細胞である請求項9の方法。
- 前記哺乳類の細胞が形質転換細胞または初代細胞である請求項9の方法。
- 前記哺乳類の細胞が体細胞または幹細胞である請求項9の方法。
- 前記真核細胞が植物の細胞または昆虫の細胞である請求項1から8までのいずれかに記載の方法。
- 前記トランスフェクション試薬を手動でまたは自動機構を用いて前記固体表面上に展着させる、請求項4の方法。
- 前記DNAが、直鎖状またはプラスミドである請求項1から14までのいずれかに記載の方法。
- (a) 請求項1から15のいずれかの方法を用いて前記DNAを前記細胞内に導入する工程、および (b) 前記DNAが前記細胞に送達されたかどうかを検出する工程を有する、DNAが細胞内に進入できるかどうかを決定する方法。
- 前記細胞が、植物細胞、昆虫細胞、および細菌細胞からなる群より選択される請求項16の方法。
- 前記検出が、前記DNA、前記DNAの生成物、前記DNAの生成物の活性を検出することで実現される請求項16の方法。
- 前記分解性リンカーが、1,6−ヘキサンジオールジアクリレートである、請求項1から18までのいずれかに記載の方法。
- 真核細胞およびDNAの両方を受け入れ得るトランスフェクションの為の装置であって、
支持体、および
分解性リンカーに結合した分子量が600Daのポリエチレンイミン(PEI)オリゴマーを含むトランスフェクション試薬を含む、装置。 - 前記分解性リンカーが、1,6−ヘキサンジオールジアクリレートである、請求項20の装置。
- 前記支持体が、フラスコ、ディッシュ、マルチ−ウェルプレート、スライド、および植え込み型装置である請求項20の装置。
- 前記トランスフェクション試薬が、さらに、細胞標的部分、細胞内標的部分、膜不安定化成分、および一以上のトランスフェクション促進剤からなる群より選択される追加試薬を含む請求項20の装置。
- 前記トランスフェクション試薬が、さらに、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、多糖類、ポリマー、およびこれらの混合物からなる群より選択されるマトリックス試薬を含む請求項20の装置。
- 前記タンパク質が、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ウシ血清アルブミン、およびそれらの混合物から選択される請求項20の装置。
- 前記ポリマーが、ヒドロゲル、生物分解性ポリマー、および生物適合性物質から選択される請求項20の装置。
- 前記トランスフェクション試薬が、さらに、細胞減少性試薬、細胞結合試薬、細胞成長試薬、細胞刺激試薬、および細胞抑制試薬からなる群より選択される細胞培養試薬を含む請求項20の装置。
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