KR20050096130A - 생물분자 전달용 고형 표면 및 처리효율이 높은 분석 방법 - Google Patents

생물분자 전달용 고형 표면 및 처리효율이 높은 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포를 형질전환 시약 및 생물분자가 코팅된 고형의 표면 위에 배양하여, 핵산과 같은 생물분자를 세포내로 도입하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

생물분자 전달용 고형 표면 및 처리효율이 높은 분석 방법 {SOLID SURFACE FOR BIOMOLECULE DELIVERY AND HIGH-THROUGHPUT ASSAY}
본 발명은, 일반적인 형질전환 분석과 처리효율이 높은 형질전환 분석 방법에 있어서, 형질전환 시약과 생물분자로 코팅된 고형의 표면 위에 세포를 배양함으로써 핵산과 같은 생물분자를 세포내로 도입하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 분석 방법에 있어서 형질전환성 표면의 이용방법 및 제조방법에 관한 것이다.
유전자 형질전환 방법은 핵산을 세포에 도입하는데 사용되며, 유전자 조절과 유전자 기능을 연구하는데 유용하다. 특히 대량의 DNA를 스크리닝하여 목적한 특성을 갖는 코딩 산물을 동정할 수 있는, 처리효율이 높은 분석 방법이 유용하다. 유전자 형질전환은 생물학적 기능을 갖는 핵산을 세포, 예컨대 진핵 세포에 핵산의 기능이 유지되는 방식으로 전달하고 도입하는 것이다. 유전자 형질전환은 유전자 조절, 유전자 기능, 분자 치료법, 신호 전이, 약물 스크리닝 및 유전자 치료법과 관련된 연구에 널리 적용되고 있다. 고등 생물로부터 유전자가 계속적으로 클로닝되고 분류됨에 따라, 연구자들은 유전자의 기능을 파악하고 목적한 특성을 갖는 유전자 산물을 동정하고자 하고 있다. 유전자 서열의 수집 증대를 위해서는, 유전자 산물의 특징을 파악하고 유전자 기능을 분석하는 것 뿐만 아니라 세포 생물학과 분자 생물학의 다른 연구 분야들에서도 체계적이고 처리효율이 높은 접근법의 개발이 요구되고 있다.
바이러스성 유전자 운반체 및 비-바이러스성 유전자 운반체 모두 유전자 전달에 이용되고 있다. 바이러스 벡터는 비-바이러스성 운반체에 비해 보다 우수한 형질전환 효과가 있는 것으로 알려져 있지만, 바이러스 벡터의 안전성이 그것의 활용에 장애로 작용하고 있다(Verma I. M and Somia N. Nature 389 (1997), pp. 239-242; Marhsall E. Science 286 (2000), pp. 2244-2245). 비록 비-바이러스성 형질전환 시스템의 효율성이 바이러스 벡터의 효율성에 미치지는 않지만, 바이러스 벡터와 비교할때 이들의 이론적 안전성 때문에 상당한 주목을 받아오고 있다. 또한, 바이러스 벡터의 제조는 복잡하고 비용이 많이 드는 공정이므로, 바이러스 벡터의 생체외 적용에는 한계가 있다. 비-바이러스성 운반체의 제조는 바이러스 운반체를 제조하는 것에 비하여 보다 더 간단하고 비용면에서도 효율적이므로, 생체외 연구에서 형질전환 시약으로서 적합한 합성 유전자 운반체로 제조된다.
대부분의 비-바이러스성 벡터는 외부 유전 물질의 침투를 방지하는 세포 장벽을 극복하기 위하여, 바이러스 유입시의 주된 특성을 모방한다. 비-바이러스성 유전자 벡터는, 유전자 운반체의 벡본(backbone)을 기준으로, a) 리포플렉스(lipoplexe), b) 폴리플렉스(polyplexe) 및 c) 리포폴리플렉스(lipopolyplexe)로 분류될 수 있다. 리포플렉스는 핵산과 지질 성분의 조합으로, 통상 양전하를 띈다. 리포플렉스에 의한 유전자 이동은 리포펙션(lipofection)이라고 한다. 폴리플렉스는 핵산과 양이온성 폴리머의 조합이다. 리포폴리플렉스는 지질과 폴리머 성분을 모두 포함한 것이다. 종종 이러한 DNA 복합체들은 추가적으로 변경되어, 세포 표적화 모이어티, 세포내 표적화 모이어티 및/또는 멤브레인-불안정화성 성분, 예컨대 바이러스 단백질 또는 바이러스 펩타이드 또는 멤브레인 교란성 합성 펩타이드를 포함한다. 최근, 박테리아와 파지(phage) 역시 핵산을 세포내로 이동시키는 운반체(shuttle)로서 기재되고 있다.
대부분의 비-바이러스성 형질전환 시약들은 양이온성 합성 분자이며, 양이온 분자의 양이온성 부위와 핵산의 음이온성 부위의 상호작용에 의해 핵산이 '코팅'되는 것으로 보고되고 있다. 양전하로 하전된 DNA-양이온성 분자 복합체는 음전하로 하전된 세포 멤브레인과 상호작용하여, DNA가 비특이적 엔도사이토시스에 의해 세포 멤브레인을 용이하게 통과되도록 한다(Schofield, Brit. Microencapsulated. Bull, 51(1):56-71 (1995)). 가장 일반적인 유전자 형질전환 프로토콜은, 세포를 세포 배양 장치에서 형질전환 이전에 16 내지 24시간 배양하는 것이다. 형질전환 시약(예컨대 양이온성 폴리머 운반체)와 DNA는 통상 별도의 튜브에 준비하고, 각각의 시약 용액을 배지(소태아혈청 또는 항생제가 무첨가된 배지)로 희석시킨다. 이후 하나의 용액을 다른 용액에 조심스럽게 서서히 첨가하고, 이때 혼합물을 계속 교반하여 혼합한다. 상기 혼합물을 상온에서 14 내지 45분간 두어, 형질전환 시약-DNA 복합체가 형성되도록 하고, 혈청 및 항생제 잔류물은 제거한다. 형질전환 이전에, 세포 배양 배지를 제거하고, 세포는 완충액으로 세척한다. DNA-형질전환 시약 복합체를 포함하는 용액을 세포에 가하여, 약 3-4시간 배양한다. 상기 형질전환 시약을 함유한 배지는 이후 새로운 배지로 교체한다. 상기 세포를 최종적으로 1회 이상의 특정 시점에서 분석한다. 이러한 과정은 특히 형질전환시키고자하는 샘플의 수가 많을때 시간이 많이 소모된다.
기존의 형질전환 공정에는 중요한 몇가지 문제점들이 있다. 첫째, 기존 공정은 특히 형질전환 실험에 사용되는 세포나 유전자 샘플의 수가 많은 경우, 시간이 많이 소요된다. 또한 일반적인 형질전환 공정으로부터 도출된 결과는 재현하기 어려운데, 이는 수많은 단계를 거치기 때문이다. 예를들면, 상기 복합체의 DNA-형질전환 시약 복합체 형태의 형성에는, 핵산 및 시약의 농도, 부피, pH, 온도, 완충액 종류, 교반 시간, 교반 속도, 배양 시간 및 그외 요소들이 영향을 미친다. 비록 동일한 시약과 공정을 이용하더라도, 다른 결과를 얻을 수 있다. 여러 단계로 이루어진 공정에 의한 결과는, 종종 인간의 실수, 기계적 오류 또는 각 단계에서의 다양한 변수들에 의해 영향을 받는다. 또한 형질전환에 이어지는 세포 배양 배지의 교체는 세포를 혼란스럽게 하여, 배양된 표면에서 세포의 탈착을 초래하고, 따라서 최종 결과에 변화와 비예측성을 발생시킬 수 있다. 언급한 모든 요소들로 인해, 기존의 형질전환 방법에는 형질전환 실험이나 분석을 수행할 수 있는 고도로 숙련된 기술자가 요구된다.
연구자들은 더 쉽고, 보다 경제적인 세포 형질전환 방법을 필요로 하며, 다수 샘플의 효율적인 형질전환을 위해 처리효율이 높은 세포 형질전환 방법이 요구되고 있다.
도 1은 형질전환 가능한 세포 배양 장치 또는 슬라이드를 이용한 형질전환 분석의 개략도이다.
도 2는 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 GFP 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 다양한 양이온성 폴리머-젤라틴 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. 직선형상 PEI, NDT-CP-B-1 및 NDT-CP-1의 함량은 도에 나타내었다. Superfect의 함량은 각각 15, 7.5 및 3.75 ㎍/웰이다. GFP 유전자 형질전환 효율 범위는 약 30-35%이고, NDT-CP-1이 가장 우수한 효율을 보였다.
도 3은 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 루시퍼라제 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 다양한 양이온성 폴리머-젤라틴 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. 직선형상 PEI, NDT-CP-B-1 및 NDT-CP-1의 함량은 8, 4, 2 및 1 ㎍/웰이다. Superfect의 함량은 각각 15, 7.5 및 3.75 ㎍/웰이다. 모든 샘플의 루시퍼라제 활성은 5 x107 RLU/mg 단백질보다 높았다.
도 4는 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 GFP 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 다양한 양이온성 지질-폴리머-젤라틴 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. 지질-폴리머의 함량은 8, 4 및 2 ㎍/웰이다. 테스트한 지질-폴리머 형질전환 시약에서 GFP 형질전환 효율은 20-25%이다.
도 5는 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 루시퍼라제 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 다양한 양이온성 지질-폴리머-젤라틴 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. 지질-폴리머-젤라틴 형질전환 혼합물 시스템에서, NDT-LP-2의 루시퍼라제 활성은 106 RLU/mg 단백질이었다.
도 6은 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 GFP 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 양이온성 지질-젤라틴 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. 96웰 플레이트 시스템에서 리포펙타민2000(lipofectamine 2000)-젤라틴 형질전환 혼합물에 의한 형질전환 효율은 30%에 이른다.
도 7은 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 루시퍼라제 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 양이온성 지질-젤라틴 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. 지질-젤라틴 형질전환 혼합물 시스템에서, 리포펙타민2000에 의한 루시퍼라제 활성은 거의 107 RLU/mg 단백질에 이른다.
도 8은 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 GFP 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 양이온성 폴리머-라미닌 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. NDT-CP-B-1 및 NDT-CP-1의 함량은 도에 나타나있다. Superfect의 함량은 각각 15 및 7.5 ㎍/웰이다. 양이온성 폴리머-라미닌 시스템에 의한 GFP 유전자 형질전환 효율은 거의 50%에 이른다.
도 9는 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 루시퍼라제 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 양이온성 폴리머-라미닌 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. NDT-CP-B-1 및 NDT-CP-1의 함량은 도에 나타내었다. Superfect의 함량은 각각 15, 7.5 및 3.75 ㎍/웰이다. 양이온성 폴리머-라미닌 시스템에 의한 루시퍼라제 활성은 거의 108 RLU/mg 단백질에 이른다.
도 10은 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 GFP 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 양이온성 지질-폴리머-라미닌 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. 지질-폴리머의 함량은 8, 4 및 2 ㎍/웰이다. 지질-폴리머-라미닌 시스템에 의한 GFP 유전자 형질전환 효율은 거의 45%에 이른다.
도 11은 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 루시퍼라제 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 양이온성 지질-폴리머-라미닌 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. 지질-폴리머의 함량은 도에 나타나 있다. 지질-폴리머-라미닌 시스템에 의한 루시퍼라제 활성은 거의 8 x107 RLU/mg 단백질에 이른다.
도 12는 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 GFP 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 양이온성 지질-라미닌 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. 리포펙타민-라미닌 형질전환 혼합물 시스템에 의한 형질전환 효율은 45%에 이른다.
도 13은 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 루시퍼라제 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 양이온성 지질-라미닌 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. 리포펙타민 2000-라미닌 형질전환 혼합물 시스템에 의한 루시퍼라제 활성은 1.5 x107 RLU/mg 단백질에 이른다.
도 14는 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 GFP 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 양이온성 폴리머-콜라겐 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. NDT-CP-B-1 및 NDT-CP-1의 함량은 도에 나타나있다. Superfect의 함량은 각각 15 및 7.5 ㎍/웰이다. 양이온성 폴리머-콜라겐 시스템에 의한 GFP 유전자 형질전환 효율은 40%에 이른다.
도 15는 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 GFP 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 양이온성 지질-폴리머-콜라겐 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. 지질-폴리머의 함량은 각각 8, 4 및 2 ㎍/웰이다. 양이온성 지질-폴리머-콜라겐 형질전환 혼합물 시스템에 의한 형질전환 효율은 35%에 이른다.
도 16은 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 GFP 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 양이온성 지질-콜라겐 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. 양이온성 지질-콜라겐 형질전환 혼합물 시스템에 의한 형질전환 효율은 35%로, 이는 리포펙타민2000-젤라틴 형질전환 혼합물 시스템에 의한 효율과 유사하였다.
도 17은 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 GFP 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 양이온성 폴리머-젤라틴-라미닌 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. NDT-CP-B-1 및 NDT-CP-1의 함량은 도에 나타나있다. Superfect의 함량은 각각 15 및 7.5 ㎍/웰이다. 양이온성 폴리머-젤라틴-라미닌 형질전환 혼합물 시스템에 의한 GFP 형질전환 효율은 42%에 이른다.
도 18은 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 GFP 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 양이온성 지질-폴리머-젤라틴-라미닌 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. 지질-폴리머의 함량은 각각 8, 4 및 2 ㎍/웰이다. 양이온성 지질-폴리머-젤라틴-라미닌 형질전환 혼합물 시스템에 의한 GFP 형질전환 효율은 40%에 이른다.
도 19는 96웰 플레이트 세포 배양 장치 시스템에서 923 세포로의 GFP 리포터 유전자 형질전환에 있어서, 양이온성 지질-젤라틴-라미닌 형질전환 혼합물로 코팅된 형질전환성 표면의 사용 효과를 나타낸 것이다. 양이온성 지질-젤라틴-라미닌 형질전환 혼합물 시스템에 의한 형질전환 효율은 30%에 이른다.
도 20은 양이온성 폴리머(NDT-CP-1)-젤라틴 또는 양이온성 지질(리포펙타민2000)-젤라틴 형질전환 혼합물로 점적된 형질전환성 글라스 슬라이드를 이용한 923 세포에 대한 GFP 리포터 유전자 형질전환 분석 결과를 나타낸 것이다. 형질전환성 슬라이드는 GFP 플라스미드 용액에 함침하였다. 슬라이드 전체가 GFP 플라스미드 용액으로 도포되지만, 형질전환 혼합물이 처리된 스팟 위의 세포만이 GFP 신호를 나타내었다. 이는 형질전환 시약이 확산되지 않고 글라스 슬라이드 위에 잘 부착되어 있음을 나타내는 것이다. 이 결과는 현 기술을 형질전환 어레이에 적용하는 것이 유용하며, 게놈 기능 연구나 유전자 의약품 개발(안티센스 ODN 또는 siRNA)시 형질전환 분석을 토대로 세포에서 수천개의 표적 유전자 또는 유전자 의약품을 스크리닝 할 수 있음을 나타내는 것이다.
도 21은 양이온성 폴리머(NDT-CP-1)-젤라틴 또는 양이온성 지질(리포펙타민2000)-젤라틴 형질전환 혼합물로 코딩된 형질전환성 글라스 슬라이드를 이용한, 923 세포에 대한 GFP 리포터 유전자 형질전환 분석 결과를 나타낸 것이다. 상기 형질전환성 슬라이드에는 1-4 ㎕의 GFP 플라스미드(20 ㎍/㎖)를 점적하고 공기중에 건조시킴으로써 GFP 플라스미드 DNA가 올려진 것이다. 상기 글라스 슬라이드는 이후 6웰 플레이트의 바닥에 놓고, 이에 293 세포를 접종하였다. GFP 신호는 형광 현미경으로 분석하였다. GFP 플라스미드 DNA가 점적된 부위에서만 푸른 형광 신호가 나타났고, 이는 플라스미드 DNA가 형질전환 혼합물로 점적된 부위의 글라스 표면 위에 잘 부착되었음을 의미한다. 현 기술을 형질전환 어레이에 적용하는 것이 유용하며, 게놈 기능 연구나 유전자 의약품 개발(안티센스 ODN 또는 siRNA)시 형질전환 분석을 토대로, 세포에서 수천개의 표적 유전자 또는 유전자 의약품을 스크리닝 할 수 있다.
도 22는 양이온성 폴리머(NDT-CP-1)-라미닌 또는 양이온성 지질(리포펙타민2000)-라미닌 형질전환 혼합물로 코딩된 형질전환성 글라스 슬라이드를 이용한, 923 세포에 대한 GFP 리포터 유전자 형질전환 분석 결과를 나타낸 것이다. 형질전환성 슬라이드는 GFP 플라스미드 용액에 함침하였다. 슬라이드 전체가 GFP 플라스미드 용액으로 도포되었만, 형질전환 혼합물이 처리된 스팟 위의 세포에서만 GFP 신호가 확인되었다. 이는 형질전환 시약이 확산되지 않고 글라스 슬라이드 위에 잘 부착되어 있음을 의미한다. 이러한 결과는, 현 기술을 형질전환 어레이에 적용하는 것이 유용하며, 게놈 기능 연구나 유전자 의약품 개발(안티센스 ODN 또는 siRNA)시 형질전환 분석을 토대로 세포에서 수천개의 표적 유전자 또는 유전자 의약품을 스크리닝 할 수 있음을 나타내는 것이다.
도 23은 양이온성 폴리머(NDT-CP-1)-라미닌 또는 양이온성 지질(리포펙타민2000)-라미닌 형질전환 혼합물로 코딩된 형질전환성 글라스 슬라이드를 이용한 923 세포에 대한 GFP 리포터 유전자 형질전환 분석을 나타낸 것이다. 상기 형질전환성 슬라이드는, 1-4 ㎕의 GFP 플라스미드(20 ㎍/㎖)를 점적하고 공기중에 건조시킴으로써 GFP 플라스미드 DNA가 올려진 것이다. 상기 글라스 슬라이드는 이후 6웰 플레이트의 바닥에 놓고, 이에 293 세포를 접종하였다. GFP 신호는 형광 현미경으로 분석하였다. GFP 플라스미드 DNA가 점적된 부위에서만 푸른 형광 신호가 나타났고, 이는 플라스미드 DNA가 형질전환 혼합물로 점적된 부위의 글라스 표면 위에 잘 부착되었음을 의미한다. 현 기술은 형질전환 어레이 적용에 유용하며, 게놈 기능 연구나 유전자 의약품 개발(안티센스 ODN 또는 siRNA)시 형질전환 분석을 토대로 수천개의 표적 유전자 또는 유전자 의약품을 스크리닝 할 수 있다.
도 24는 96웰 플레이트 세포 배양 장치에서 Hela 705 Luc세포에 안티센스 ODN의 형질전환에 있어서, 형질전환 시약-라미닌 혼합물의 사용 효과를 나타낸 것이다. 그 결과는, 양이온성 폴리머-라미닌 형질전환 혼합물, 지질-폴리머-라미닌 혼합물 또는 지질-라미닌 형질전환 혼합물 시스템으로 구성된 형질전환성 표면이 표적 RNA를 현저히 차단하는 것으로 나타났으며, 이는 플라스미드와 올리고뉴클레오티드가 이러한 방법으로 포유류 세포에 성공적으로 전달될 수 있음을 보인 것이다.
도 25는 96웰 플레이트 세포 배양 장치에서 293 세포에 siRNA의 전달에 있어서, 형질전환 시약-라미닌 혼합물의 사용 효과를 나타낸 것이다. 비-siRNA 대조군에 비하여, 양이온성 폴리머-라미닌 형질전환 혼합물, 지질-폴리머-라미닌 혼합물 또는 지질-라미닌 형질전환 혼합물 시스템으로 구성된 형질전환성 표면이, 표적 RNA을 현저히 차단하는 것으로 나타났으며, 이는 플라스미드와 올리고뉴클레오티드를 이러한 방법으로 포유류 세포로 성공적으로 전달시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
도 26은 HeLa 세포에서 Tat 펩타이드 신호의 전형적인 결과를 나타낸 것이다. 도 26A에서, Tat는 젤라틴 기질과 함께 고형의 표면에 코팅된다. 도 26B는 비-Tat 대조군을 나타낸다. Tat-코팅된 군에서 약 60-80% 세포가 FITC 신호를 보였다. 이는 핵산뿐만 아니라 펩타이드도 본 발명의 양태에 따라 세포에 전달될 수 있음을 의미한다.
도 27은 96웰 플레이트 세포 배양 장치에서 양이온성 폴리머(PLL)-라미닌 형질전환 혼합물에 의한 HepG2 세포에 대한 유전자 이동에 있어서, 표적화 분자(이동)의 효과를 나타낸 것이다. 그 결과, PLL-라미닌을 주성분으로한 형질전환성 표면 시스템에서, 표적화 분자의 도입으로 형질전환 효율을 현저히 증강시킬수 있는 것으로 확인되었다.
도 28은 96웰 플레이트 세포 배양 장치에서 형질전환성 표면 기술을 이용한, 293 세포에서의 양이온성 폴리머(PLL)-라미닌 형질전환 혼합물에 의해 매개된 유전자 이동에 있어서, 멤브레인 교란성 펩타이드(VSVG 펩타이드)의 효과를 나타낸 것이다. 그 결과, PLL-라미닌을 주성분으로한 형질전환성 표면 시스템에서 멤브레인 교란성 펩타이드(VSVG 펩타이드)의 도입이 형질전환 효율을 현저히 증강시킬수 는 것으로 확인되었다.
도 29는 96웰 플레이트 세포 배양 장치에서 HUV-EC 세포로의 GFP 리포터 유전자 전달에 있어서, 형질전환 시약-라미닌 혼합물의 사용 효과를 나타낸 것이다. NDT-CP-1의 GFP 형질전환 효율은 약 20%였고, Superfect의 GFP 형질전환 효율은 약 15%였다. 리포펙타민은 매우 낮은 형질전환 효율(<1.0%)를 나타내었다. 이는 293, HeLa, HepG2와 같은 형질전환된 세포 주 뿐만 아니라 원시 세포도 양이온성 폴리머-라미닌 형질전환 혼합물 시스템에 의해 형질전환될 수 있음을 나타낸다.
도 30은 96웰 세포 배양 장치에서 HUV-EC로의 루시퍼라제 리포터 유전자 전달에 대한 형질전환 시약-라미닌 혼합물의 효과를 나타낸 것이다. NDT-CP-1과 Superfect의 형질전환 효율은 각각 1.26 x 107 및 8.26 x 106 RLU/mg 단백질이었다. 리포펙타민2000은 양이온성 폴리머-라미닌 혼합물 시스템에 비해 매우 효율을 나타내었다. 이로써, 원시 세포가 본 발명의 양태에 따라 여러가지 유전자로 형질전환될 수 있음을 재확인하였다.
도 31은 형질전환 시약-젤라틴으로 코팅된 96웰 플레이트에서 형질전환 후 293 세포의 생존비율을 나타낸 것이다. 모든 샘플은 높은 생존비율을 나타내었다(> 65%). 이는 사용한 형질전환 시약의 세포독성이 허용가능한 것임을 나타낸다.
도 32는 형질전환 시약-라미닌이 주성분인 형질전환 표면에 세포환원성 시약(글루타민)의 도입으로 인한 293 세포에서의 세포독성 개선 효과를 나타낸 것이다. "Non"은 글루타민이 함유되지 않은 샘플을 나타내며, "G"는 글루타민이 함유된 샘플을 나타낸다. 그 결과 글루타민(세포환원성 시약)이 글루타민이 함유되지 않는 군에 비하여 형질전환 세포독성을 현저히 개선하는 것으로 확인되었으며, 이는 세포환원성 시약이 형질전환 시약 및 형질전환 공정에 의해 야기되는 세포독성을 감소시키는 탁월한 후보물질임을 의미한다.
도 33은 형질전환 시약-젤라틴이 주성분인 형질전환 표면에 세포 부착 시약 및 세포 자극 시약의 도입으로 인한 293 세포에서의 세포독성 개선 효과를 나타낸 것이다. "L"은 라미닌이 있는 샘플이고 "Non"은 라미닌이 함유되지 않은 샘플이다. 그 결과, 라미닌과 같은 세포 부착 시약은 형질전환성 표면 시스템에서 형질전환 시약과 형질전환 공정에 의해 야기되는 세포독성을 상당히 개선시키는 것으로 나타났다.
도 34는 안정성 연구에서 형질전환성 표면의 층-수명을 평가한 것이다. 그 결과, 신규 제조한 형질전환성 표면 또는 37 ℃에서 9일간 처리한 표면에서의 형질전환 수행시 유의할만한 차이가 나타나지 않았으며, 이는 형질전환성 표면의 층 수명은 4 ℃에서 보관하는 경우 1.5년일 수 있음을 알 수 있다.
도 35는 NDT 합성 폴리머와 지질-폴리머의 구조를 나타낸 표이다.
발명의 개요
생물분자를 진핵세포내로 도입하는 방법은 (a) 고형 표면을 생물분자 전달 시약으로 코팅하는 단계, (b) 진핵세포에 도입될 생물분자를 상기 고형 표면 위에 가하는 단계, (c) 상기 진핵세포에 생물분자가 도입되기에 적절한 조건하에서 상기 고형 표면 위에 충분한 밀도로 세포를 접종하는 단계를 포함한다. 본 발명의 양태들에 있어서, 상기 표면은 플라스크, 접시, 멀티웰 플레이트(multi-well plate), 글라스 슬라이드 및 임플란트 소자(implanted device)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 생물분자 전달 시약 또는 형질전환 시약은 폴리머, 지질, 지질-폴리머 및/또는 그것들의 조합, 및/또는 그것의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 세포 표적화 모이어티 또는 세포성 표적화 모이어티 및/또는 멤브레인-불안정화 성분 및 1종이상의 전달 증강제를 포함한다.
본 발명의 양태들에서, 상기 생물분자 전달 시약은 상기 표면의 특정 부위에 균등하게 도말되거나 또는 점적됨으로써 표면에 부착될 수 있다. 생물분자 전달 시약으로 코팅된 고형 표면은, 단백질, 펩타이드, 다당류 및 폴리머로 이루어진 군으로부터 선택되는 매트릭스 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 단백질은 젤라틴, 소 혈청 알부민 및 세포외 기질 성분으로 선택될 수 있으며, 세포외 기질 성분으로는 콜라겐, 라미닌 및 파이브로넥틴이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 폴리머는 하이드로겔, 생분해성 폴리머 및 생물적합성 물질로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 양태들에 있어서, 상기 고형 표면은 세포환원성 시약(cytoreductive reagent), 세포 결합성/부착성 시약, 세포 증식성 시약, 세포 자극성 시약 및 세포 저해성 시약으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 배양 시약을 더 포함하는 생물분자 전달 시약으로 코팅된다.
생물분자는, 뉴클레오티드, 단백질, 펩타이드, 당, 다당류 및 유기 화합물로부터 선택될 수 있다. 바람직하기로는 상기 생물분자는 DNA, RNA, 및 DNA/RNA 하이브리드로부터 선택된다. 상기 뉴클레오티드는 원형(플라스미드), 직선형 또는 단일가닥 올리고데옥시뉴클레오티드일 수 있다. RNA는 단일가닥(라이보자임) 또는 이중가닥(siRNA)일 수 있다.
본원에서 기재된 방법으로 사용되는 고형 표면은, 슬라이드 또는 멀티웰 플레이트로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 양태에서 사용된 진핵 세포는 포유류 세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 포유류 세포는 분열성 세포 또는 비-분열성 세포일 수 있다. 상기 포유류 세포는 형질전환된 세포 또는 원시 세포(primary cell)일 수 있다. 상기 포유류 세포는 체세포(somatic dell) 또는 줄기 세포일 수 있다. 상기 진핵 세포는 식물, 효모 또는 곤충 세포일 수 있다.
고성능 약물 스크리닝 분석 방법은, (a) 전달 시약을 고형 표면에 부착하는 단계, (b) 진핵 세포내로 도입될 생물분자를 상기 전달 시약에 부착하는 단계, (c) 전달 시약 및 생물분자가 있는 표면 위에 진핵 세포내로 생물분자를 도입하기에 적절한 조건하에서 충분한 밀도로 세포를 접종하는 단계 및 (d) 생물분자가 전달되어진 진핵 세포를 검출하는 단계를 포함한다.
상기 생물분자는 뉴클레오티드, 단백질, 펩타이드, 당, 다당류 및 유기 화합물로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 뉴클레오티드는 DNA, RNA, 및 DNA/RNA 하이브리드로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 DNA는 원형(플라스미드), 직선형 또는 단일가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)일 수 있다. RNA는 단일가닥(라이보자임) 또는 이중가닥(siRNA)일 수 있다.
진핵 세포는, 포유류 세포가 바람직하다. 상기 포유류 세포는 분열성 세포 또는 비-분열성 세포일 수 있으며, 상기 세포는 형질전환된 세포 또는 원시 세포일 수 있다. 상기 포유류 세포는 체세포 또는 줄기 세포일 수 있다. 상기 진핵 세포는 식물, 효모 또는 곤충 세포로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생물분자가 전달된 세포의 검출은 생물분자 자체, 그것의 표적 분자, 그것에 의해 촉매화된 생성물 또는 그것에 의해 조절된 생성물을 검출함으로써 실시할 수 있다.
상세한 설명
본원에 개시된 신규한 형질전환 장치 및 방법은, 기존의 형질전환 분석에 비하여 간단하고, 편리하고, 효율적이다. 형질전환 장치는 형질전환 시약을 세포 배양 장치의 고형의 표면 위에 부착함으로써 본원의 방법에 따라 제조된다. 이 장치를 이용함으로써, 연구자들은 단지 핵산 또는 그외 생물분자 운반 시스템을 상기 세포 배양 장치의 표면에 첨가하기만 하면 된다. DNA 또는 생물분자를 형질전환 시약과 전-혼합할 필요가 없다. 이로써, 기존의 형질전환 공정에서 요구되는, 시간이 소요되는 주 단계가 생략된다. 과학자들이 10개의 샘플로 형질전환 전 단계를 완료하는데 단지 약 40분이 요구되지만, 기존 방법으로는 2-5 시간 이상이 소요된다. 이는 수백개의 샘플을 한번에 검사할 수 있다는 점에서 처리효율이 높은 형질전환 분석으로 가장 적합하다.
기존 형질전환에 비해, 본 발명의 신규 방법은 몇가지 이점을 갖는다. 본 발명은 보관이 매우 용이한 형질전환 장치를 제공하며, 생물물질/형질전환 시약의 혼합 단계가 필요하지 않는, 간단한 생물분자 전달 또는 유전자 형질전환 방법을 제공한다. 본 발명의 형질전환 공정은 단기간내에 완료될 수 있으며, 예컨대 약 40분이 소요되며, 많은 샘플을 한번에 형질전환시킬 수 있는 처리효율이 높은 형질전환 방법 또는 약물 전달 방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 유전자 전달 방법 및 유전자 전달 장치는, 전술한 기존의 형질전환 분석에서 확인되는 공통적인 문제점들을 해결한 것이다. 형질전환 시약은 세포 배양 장치의 표면 위에 간단히 코팅되므로, 상업화 및 대량 생산이 용이할 수 있다. 소비자, 예컨대 연구자들은 형질전환 이전에 장치를 준비하기 위하여 단지 목적 핵산과 같은 생물분자를 세포 배양 장치의 표면에 직접 첨가하기만 하면 된다. 이후 세포를 상기 세포 배양 장치의 표면 위에 배지 접종하여 배지를 교체하지 않은 상태에서 배양하고, 세포를 분석한다. 형질전환 과정중에 배지가 교체될 필요가 없다. 본 발명의 방법은 실시 단계이 수를 줄이므로써 에러 위험도를 급격하게 감소시키며, 따라서 시스템의 일관성 및 정확성을 증가시킨다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 형질전환 시약은 슬라이드, 멀티웰 플레이트 또는 형질전환 장치를 형성하는 그외 표면 위에 부착된다. 이러한 장치를 이용함으로써, 사람은 상기 표면에 DNA 또는 그외 생물분자를 단지 첨가하기만 하면 되고, 형질전환 시약이 DNA 또는 생물분자와 복합체를 형성하도록 한다. 이러한 반응은 약 30동안 이루어지며, 이후 상기 표면 위에 세포를 접종하고 상기 생물분자(들)가 세포내로 도입될 수 있는 적합한 조건에서 배양한다.
표면에 핵산/생물분자 함유성 혼합물을 부착하기 위해 사용될 수 있는 모든 적절한 표면이 사용될 수 있다. 예를들면, 상기 표면은, 유리, 플라스틱(예컨대 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐리덴디플루오라이드, 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 폴리프로필렌), 실리콘, 금속(예컨대 금), 멤브레인(예컨대 니트로셀룰로스, 메틸셀룰로스, PTFE 또는 셀룰로스), 종이, 생물물질(예컨대 단백질, 젤라틴, 한천), 조직(예컨대 피부, 내피조직, 뼈, 연골), 미네랄(예컨대 하이드록실아파티트, 그래피트)일 수 있다. 바람직한 양태로서, 상기 표면은 슬라이드(유리 또는 폴리-L-라이신으로 코팅된 슬라이드) 또는 멀티웰 플레이트의 웰일 수 있다.
슬라이드, 예컨대 폴리-L-라이신이 코팅된 글라스 슬라이드(예, Sigma,Inc.)의 경우, 형질전환 시약은 표면 위에 부착 및 건조된 다음 세포내로 도입될 목적한 핵산 또는 핵산, 단백질, 펩타이드 또는 작은 약물 분자가 도입된다. 상기 슬라이드는 상온에서 30분간 두어 생물분자/형질전환 시약 복합체가 상기 형질전환 장치의 표면 위에 형성된다. 생물분자/형질전환 시약 복합체는 처리효율이 높은 마이크로어레이에 사용되는 매체를 형성하며, 이는 수백 내지 수천개의 핵산, 단백질, 펩타이드 및 그외 작은 약물 분자를 동시에 연구하기 위해 사용될 수 있다. 다른 양태에 있어서, 상기 형질전환 시약 또는 약물 전달 시약은, 특정 한정된 부위의 상기 형질전환 장치의 표면 위에 부착되어 형질전환 시약 또는 약물 전달 시약의 마이크로어레이를 형성할 수 있다. 상기 양태에서, 분자, 예컨대 세포내로 도입될 핵산은 형질전환 시약 또는 전달 시약과 함께 형질전환 장치의 표면 위에 도말된다. 이러한 방법은 형질전환 시약 또는 그외 전달 시약을 수천개의 화합물로부터 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이러한 스크리닝 방법의 결과는 컴퓨터 분석을 통해 평가할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 멀티웰 플레이트의 1개 이상의 웰은 형질전환 시약 또는 약물 전달 시약으로 코팅될 수 있다. 형질전환 및 약물 스크리닝에 일반적으로 사용되는 플레이트는 96-웰 플레이트 및 384-웰 플레이트이다. 형질전환 시약 또는 생물분자 전달 시약은 플레이트의 바닥에 균등하게 적용될 수 있다. 수백개의 핵산, 단백질, 펩타이드 또는 그외 생물분자들은 상기 웰(들)에 예컨대 멀티채널 파이펫 또는 자동화 장치에 의해 넣어진다. 형질전환의 결과는 이후 마이크로플레이트 리더를 이용함으로써 확인된다. 대부분의 생체의약 연구소에서는 일반적으로 마이크로플레이트 리더가 사용되기 때문에 이는 형질전환된 세포를 분석하는 매우 편리한 방법이다. 형질전환 시약 또는 생물분자 전달 시약으로 코팅된 멀티웰 플레이트는, 유전자 조절, 유전자 기능, 분자 치료법 및 신호 전이 뿐만 아니라 약물 스크리닝을 연구하기 위해 대부분의 연구소에서 널리 사용될 수 있다. 또한, 여러 종류의 형질전환 시약을 멀티웰 플레이트의 각 웰 상에 코팅하는 경우, 플레이트를 사용하여 다수의 형질전환 시약 또는 전달 시약을 비교적 효율적으로 스크리닝할 수 있다. 최근, 본 발명의 방법에 따라 사용가능한 1,536 및 3,456 웰 플레이트가 개발되었다.
형질전환 시약 또는 전달 시약은 생물분자, 예컨대 핵산, 단백질, 펩타이드, 당, 다당류, 유기 화합물 및 그외 생물분자를 세포내로 도입할 수 있는 양이온성 화합물이 바람직하다. 바람직한 양태에서는 양이온성 올리고머, 예컨대 저분자량 폴리에틸렌이민(PEI), 저분자량의 폴리(L-라이신)(PLL), 저분자량의 키토산 또는 저분자량의 덴드리머가 사용된다. 이들의 모듈 조성물에 있어서, 시약은 지질, 폴리머, 지질-폴리머, 이들의 조합 및/또는 이들의 유도체로 분류될 수 있으며, 이들은 세포 표적화 모이어티, 세포내 표적화 모이어티 및/또는 멤브레인 불안정화 성분 뿐만 아니라 전달 증강제를 포함한다.
일 양태에 있어서, 상기 전달 시약은 단백질, 펩타이드, 다당류 및 그외 폴리머와 같은 기질과 혼합될 수 있다. 상기 단백질은 젤라틴, 콜라겐, 소 혈청 알부민 또는 그외 단백질을 표면에 부착하는데 사용될 수 있는 모든 단백질일 수 있다. 상기 폴리머는 하이드로겔, 공중합체, 비분해성 폴리머, 생분해성 폴리머 및 생물친화성 물질일 수 있다. 상기 다당류는 멤브레인을 형성하거나 키토산과 같은 전달 시약을 코팅할 수 있는 모든 화합물일 수 있다. 그외 예컨대 세포독성 경감성 시약, 세포 결합 시약, 세포 증식 시약, 세포 자극 시약 또는 세포 저해 시약과 같은 시약 및 특정 세포를 배양하기 위한 화합물, 역시 형질전환 시약 또는 전달 시약과 함께 형질전환 장치에 부착될 수 있다.
다른 양태에 있어서, 젤라틴-형질전환 시약 혼합물은 형질전환 시약(예, 지질, 폴리머, 지질-폴리머 또는 멤브레인 불안정화 펩타이드) 및 적절한 용매 예컨대 물 또는 탈이온화 중수내에 존재하는 젤라틴을 포함하는 것으로서, 상기 형질전환 장치에 부착될 수 있다. 다른 양태로서, 세포 배양 시약은 또한 젤라킨-형질전환 시약 혼합물내에 존재할 수 있다. 상기 혼합물은 슬라이드 및 멀티웰 플레이트와 같은 표면 위에 균등하게 도말되어, 젤라틴-형질전환 시약 혼합물이 있는 형질전환 표면을 형성시킨다. 다른 양태로서, 여러가지 형질전환 시약-젤라틴 혼합물은 또한 형질전환 장치의 표면의 특정 부위 위에 점적될 수 있다. 제조된 생성물은 적절한 온도에서 완전히 건조되도록 하여, 젤라틴-형질전환 시약 혼합물이 혼합물이 적용된 부위에 부착되게 한다. 예를들면, 제조된 생성물은 특정 온도 또는 흡도 또는 진공-건조기에서 건조될 수 있다.
혼합물내 형질전환 시약의 농도는, 형질전환 효율과 시약의 세포독성에 의존적이다. 일반적으로 형질전환 효율과 세포독성 사이에는 균형이 있다. 세포독성이 허용가능한 수준을 유지하면서 형질전환 시약이 가장 효과적인 농도에서의, 형질전환 시약의 농도가 최적 수치이다. 형질전환 시약의 농도는 일반적으로 약 1.0 ㎍/㎖ 내지 1000 ㎍/㎖의 범위이다. 바람직한 양태에서, 상기 농도는 약 40 ㎍/㎖ 내지 약 600 ㎍/㎖이다. 유사하게 젤라틴 또는 다른 기질의 농도는 수행되는 실험 또는 분석에 의존적이지만, 상기 농도는 일반적으로 형질전환 시약의 0.01% 내지 0.5%의 범위일 것이다. 실시예에서 나타낸 양태에 있어서, 젤라틴의 농도는 형질전환 시약의 약 0.2%이다.
세포내로 도입될 분자는 핵산, 단백질, 펩타이드, 펩타이드 핵산(PNA) 및 그외 생물분자일 수 있다. 상기 핵산은 DNA, RNA 및 DNA/RNA 하이브리드 등이다. 사용된 DNA가 벡터내에 존재하는 경우, 상기 벡터는 플라스미드(예컨대 pCMV-GFP, pCMV-luc) 또는 바이러스에서 유래한 벡터(예, pLXSN)와 같은 모든 종류의 벡터일 수 있다. 또한 DNA는 발현되는 cDNA의 5'말단에 프로모터 서열(예컨대 CMV 프로모터)이 있으며, 3' 말단에는 폴리 A 부위가 있는 직선형의 절편일 수 있다. 이러한 유전자 발현 요소들은 목적한 cDNA가 포유류 세포에서 일시적으로 발현되도록 한다. DNA가 단일가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), 예컨대 안티센스 ODN인 경우, 세포내로 도입되어 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있다. RNA를 이용한 양태에서는, 핵산은 단일가닥(안티센스 RNA 및 라이보자임) 또는 이중가닥(RNA 간섭, SiRNA)일 수 있다. 대부분의 경우들에서, RNA는 RNA의 안정성을 증가시키고 유전자 발현의 하향 조절에 대한 기능을 개선하기 위하여 변형된다. 펩타이드 핵산(PNA)에서, 핵산 벡본(backbone)은 펩타이드로 대체되어, 분자를 보다 더 안정하게 만든다. 특정 양태에서, 본 발명의 방법은 단백질, 펩타이드 및 그외 분자들을 다양한 목적으로, 예컨대 분자 치료법, 단백질 기능 연구 또는 분자 기작 연구를 위해 세포내로 도입하는데 사용될 수 있다.
적절한 조건하에서, 생물분자는 형질전환 시약 또는 전달 시약으로 코팅된 형질전환 장치로 첨가되어, 생물분자/전달 시약 복합체가 형성된다. 생물분자는 바람직하기로는 소태아 혈성 및 항생제가 무첨가된 세포 배양 배지, 예컨대 Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)에 용해된다. 형질전환 시약 또는 전달 시약이 슬라이드상에 균등하게 부착되는 경우, 생물분자는 슬라이드상에 특정 위치에 점적될 수 있다. 대안적으로는, 형질전환 시약 또는 전달 시약이 슬라이드의 특정 위치 상에 점적될 수 있으며, 생물분자는 간단하게 첨가되어 형질전환 장치의 전표면을 덮을 수 있다. 형질전환 시약 또는 전달 시약이 멀티웰 플레이트의 바닥에 부착된 경우, 생물분자는 멀티채널 파이펫, 자동화 장치 또는 그외 방법에 의해 여러 웰에 간단하게 첨가된다. 제조된 생성물(형질전환 시약 또는 전달 시약, 및 생물분자로 코팅된 형질전환 장치)은 약 25분간 상온에 두면, 생물분자/형질전환 시약(또는 전달 시약) 복합체가 형성된다. 일부 경우에서는, 예컨대 여러가지 종류의 생물분자들이 슬라이드의 특정 위치상에 점적되고, DNA 용액은 제거되어, 형질전환 시약과 복합체 형태를 이룬 생물분자가 있는 효면이 형성될 것이다. 다른 경우로, 생물분자 용액을 상온에서 보관할 수 있다. 이후, 적절한 배지내의 적절합 밀도를 갖는 세포가 상기 표면에 도말된다. 제조된 생성물(생물분자 및 도말된 세포가 있는 표면)은, 생물분자가 도말된 세포에 도입되는 조건으로 유지된다.
본 발명의 방법에 있어서, 사용가능한 적합한 세포는 원핵 생물, 효모 또는 식물 세포 및 동물 세포, 특히 포유류 세포를 포함하는 고등 진핵생물의 세포이다. 포유류 세포(예, 인간, 원숭이, 개과 동물, 고양이과 동물, 소 또는 쥐과 동물의 세포)와 같이 진핵 세포, 박테리아, 곤충 세포 또는 식물 세포는, 형질전환 시약 또는 전달 시약 및 생물분자로 코팅된 형질전환 장치 상에, 상기 생물분자가 진핵세포내로 도입/유입되어 DNA를 발현하거나 또는 상기 생물분자와 세포내 성분이 상호작용할 수 있는, 충분한 밀도와 적절한 조건으로 도말된다. 특정 양태에서, 세포는 조혈 세포, 신경 세포, 이자 세포, 간 세포, 연골 세포, 골 세포 또는 근육 세포로부터 선택될 수 있다. 세포는 완전히 분화된 세포이거나 또는 전구체(progenitor)/ 줄기 세포일 수 있다.
바람직한 양태로서, 진핵세포는 열에 의해-비활성화된 소태아 혈청(FBS) 10%, L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신(pen/strep)을 함유하는 Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)에서 배양된다. 대부분의 세포는 특별한 영양분, 예컨대 성장 인자 및 아미노산이 필요하므로, 당업자라면 특정 세포가 특별한 배지에서 배양되어야 함을 인지할 것이다. 세포의 최적 밀도는 세포의 종류와 실험 목적에 의존적이다. 예를들어, 70-80% 컨플루언시(confluency)인 세포 집단이 유전자 형질전환에 바람직하지만, 올리고뉴클레오티드 전달에는 30-50% 컨플루언시를 갖는 세포가 바람직하다. 예시적인 양태에서, 5 x 104의 293 세포/웰이 96웰 플레이트에 접종되면, 세포는 접종후 18-24시간에 90%의 컨플루언시를 이룰 것이다. HeLa 705 세포의 경우, 96웰 플레이트에서 동일한 컨플루언시를 이루기 위해선 1 x 104의 세포가 필요하다.
세포는 생물분자/전달 시약을 함유하는 표면 위에 접종된 후, 세포는 세포 종류에 따라 최적의 조건(예 37℃, 5-10% CO2)에서 배양된다. 배양 시간은 실험 목적에 의존적이다. 일반적으로 유전자 형질전환 실험의 경우, 표적 유전자를 발현하기 위하여 세포는 24-48시간 배양된다. 세포에서 생물분자의 세포내 이동(trafficking)을 분석하는 경우, 수분 내지 수시간의 배양이 요구될 수 있으며, 세포는 제한된 시기에 관찰될 수 있다.
생물분자 전달의 결과는, 여러가지 방법으로 분석될 수 있다. 유전자 형질전환과 안티센스 핵산 전달에 있어서, 표적 유전자의 발현 수준은 푸른 형광 단백질 유전자(GFP), 루시퍼라제 유전자, β-갈락토시데이즈 유전자 발현과 같은 리포터 유전자에 의해 검출될 수 있다. GFP의 신호는 현미경에서 직접적으로 관찰될 수 있으며, 루시퍼라제의 활성은 루미노미터(luminometer)에서 검출될 수 있으며, β-갈락토시데이즈에 의해 촉매화된 블루 산물은 현미경하에성 관찰되거나 마이크로플레이트 리더에서 검출될 수 있다. 본 발명의 당업자는 이러한 리포터 유전자가 어떻게 작용하는지, 이들이 유전자 전달 시스템내로 어떻게 도입될 수 있는지는 잘 알고 있다. 핵산 및 그것의 생성물, 단백질, 펩타이드 또는 본 발명의 방법에 따른 전달된 그외 생물분자 및 이러한 생물분자에 의해 모듈화된 표적 물질은 다양한 방법, 예컨대 면역형광, 효소 면역세포화학, 자동방사그래피 또는 인 시츄(in situ) 혼성화 검출방법으로 검출될 수 있다. 면역형광을 코딩된 단백질의 발현을 검출하는데 사용하는 경우, 표적 단백질에 결합하는 형광 표지된 항체를 사용한다(예, 항체가 단백질에 결합되기에 적합한 조건하에서 슬라이드에 첨가됨). 이후 형광 신호를 검출하여, 상기 단백질을 함유한 세포를 동정한다. 전달된 분자가 유전자 발현을 모듈레이션할 수 있는 경우, 표적 유전자의 발현 수준 또한 자동방사그래피, 인 시츄 혼성화 및 인 시츄 PCR과 같은 방법에 의해 검출할 수 있다. 그러나, 동정 방법은 전달된 생물분자의 특성, 발현 산물의 특성 및 그로 인해 모듈화된 표적 물질의 특성 및/또는 상기 생물분자의 전달로부터 발생되는 최종 생성물의 특성에 의존적이다.
형질전환 시약
분지형(Branched) PEI25k(폴리에틸렌이민, Mw 25KDa)과 직선형 PEI25K(Mw 25KDa)를 (주)폴리사이언스(Polysciences Inc., Warrington, PA, USA)에서 구입하였다. Superfect™(Qiagen, Valencia, CA) 용액은 제조사에서 제공받은 것으로 사용하였다. 형질전환 시약 LipofectAMINE™은 라이프 테크놀러지(Life Technologies, Gaithersburg, MD)에서 구입하였고 제조사로부터 제공받은 것으로 사용하였다. NDT-CP-B-1(분해성)와 NDT-CP-1(비-분해성)은 다른 링커를 사용하여 PEI600(Mw 600 Da)에 의해 합성한 폴리머성 형질전환 시약이다. NDT-LP-1는 동일 분자에 폴리머와 지질 구조를 함유하고 있는 지질-폴리머이다. NDT 폴리머 형질전환 시약의 구조는 도 35에 나타나 있다.
형질전환성 표면 제조
젤라틴이 주성분인 형질전환 혼합물로 형질전환 표면을 제조하였다.
0.2% 젤라틴 제조
젤라틴 분말 타입 B: 225 Bloom (Sigma, catalog ;G-9391)을 60 ℃의 수조에서 15분간 용액을 서서히 흔들면서 살균한 MilliQ 물에 용해하였다. 0.2% 젤라틴 용액은 이후 상온에서 냉각시킨 다음 따듯한 상태(~37-40 ℃)에서 0.45 ㎛의 세포의 아세테이트 멤브레인(CA)으로 여과하였다. 100 ㎖의 용액을 제조하고 여과한 젤라틴 용액을 50 ㎖씩 분주하여 4 ℃에서 보관하였다.
젤라틴이 함유된 형질전환 혼합물의 제조
모든 형질전환 시약은 0.2% 젤라틴 용액으로 희석하였다. 직선형 PEI25k의 농도와 특별히 합성한 폴리머 샘플의 농도는 320.0 ㎍/㎖ 내지 40.0 ㎍/㎖이고, 분지형 PEI25k의 농도는 160.0 ㎍/㎖ 내지 20.0 ㎍/㎖이다. Superfect의 농도는 600.0 ㎍/㎖ 내지 75.0 ㎍/㎖이고, 리포펙타민 농도는 200.0 ㎍/㎖ 내지 25.0 ㎍/㎖이다. 폴리머와 합성한 지질-폴리머(NDT)의 농도는 320.0 ㎍/㎖ 내지 40.0 ㎍/㎖이다.
96웰 플레이트와 형질전환 시약-젤라틴 혼합물을 이용한 형질전환성 표면 형성
형질전환/젤라틴 용액 25 ㎕을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트는 수 초간 교반하여 표면의 바닥 전체가 형질전환/젤라틴 용액으로 도포되도록 하였다. 이후 상기 플레이트는 조직 배양 후드에서 수시간(약 5-6시간) 공기중 건조시켰다. 건조된 플레이트는 4 ℃에 보관하여 준비하였다(도 2-7).
형질전환 시약-젤라틴 혼합물을 점적에 의한 글라스 슬라이드의 형질전환성 표면 형성
형질전환/젤라틴 용액 1-4 ㎕을 PLL로 코팅된 슬라이드위에 점적하였다. 상기 슬라이드는 완전히 건조될때까지 약 1시간동안 깨끗한 후드안에 두었다. 건조된 슬라이드는 4 ℃에 보관하여 준비하였다(도 20, 21).
형질전환 표면은 라미닌이 주성분인 형질전환 혼합물에 의해 제조되었다.
라미닌(Sigma, catalog # L2020)을 최종 농도 40.0 ㎍/㎖으로 PBS에 희석하고 4 ℃에 보관하였다.
라미닌을 함유한 형질전환 혼합물의 제조
모든 형질전환 시약은 40.0 ㎍/㎖로 희석하였다. 직선형 PEI25k의 농도와 특별히 합성한 폴리머 샘플의 농도는 320.0 ㎍/㎖ 내지 40.0 ㎍/㎖이고, 분지형 PEI25k의 농도는 160.0 ㎍/㎖ 내지 20.0 ㎍/㎖이다. Superfect의 농도는 600.0 ㎍/㎖ 내지 75.0 ㎍/㎖이고, 리포펙타민 농도는 200.0 ㎍/㎖ 내지 25.0 ㎍/㎖이다. 폴리머와 합성한 지질-폴리머(NDT)의 농도는 320.0 ㎍/㎖ 내지 40.0 ㎍/㎖이다.
96웰 플레이트와 형질전환 시약-라미닌 혼합물을 이용한 형질전환 표면 형성
형질전환/라미닌 용액 25 ㎕을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트는 수초간 교반하여 표면의 바닥 전체가 형질전환/라미닌 용액으로 도포되도록 하였다. 이후 상기 플레이트는 조직 배양 후드에서 수시간(약 5-6시간) 공기중 건조시켰다. 건조된 플레이트는 4 ℃에 보관하여 준비하였다(도 8-13).
형질전환 시약-라미닌 혼합물 점적에 의한 글라스 슬라이드의 형질전환성 표면 형성
형질전환/라미닌 용액 1-4 ㎕을 PLL로 코팅된 슬라이드 위에 점적하였다. 상기 슬라이드는 완전히 건조될때까지 약 1시간동안 깨끗한 후드안에 두었다. 건조된 슬라이드는 4 ℃에 보관하여 준비하였다(도 22-23).
형질전환 표면은 콜라겐이 주성분인 형질전환 혼합물에 의해 제조되었다.
콜라겐(Sigma, catalog # C8919)을 최종 농도 120.0 ㎍/㎖으로 PBS에 희석하고 4 ℃에 보관하였다.
라미닌을 함유한 형질전환 혼합물의 제조
모든 형질전환 시약은 콜라겐 용액 120.0 ㎍/㎖로 희석하였다. 직선형 PEI25k의 농도와 특별히 합성한 폴리머 샘플의 농도는 320.0 ㎍/㎖ 내지 40.0 ㎍/㎖이고, 분지형 PEI25k의 농도는 160.0 ㎍/㎖ 내지 20.0 ㎍/㎖이다. Superfect의 농도는 600.0 ㎍/㎖ 내지 75.0 ㎍/㎖이고, 리포펙타민 농도는 200.0 ㎍/㎖ 내지 25.0 ㎍/㎖이다. 폴리머와 합성한 지질-폴리머(NDT)의 농도는 320.0 ㎍/㎖ 내지 40.0 ㎍/㎖이다.
96웰 플레이트와 형질전환 시약-콜라겐 혼합물을 이용한 형질전환 표면 형성
형질전환/콜라겐 용액 25 ㎕을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트는 수초간 교반하여 표면의 바닥 전체가 형질전환/콜라겐 용액으로 도포되도록 하였다. 이후 상기 플레이트는 조직 배양 후드에서 수시간(약 5-6시간) 공기중 건조시켰다. 건조된 플레이트는 4 ℃에 보관하여 준비하였다(도 14-16).
형질전환 표면은 젤라틴/라미닌이 주성분인 형질전환 혼합물에 의해 제조되었다.
라미닌(Sigma, catalog # L2020)을 최종 농도 40.0 ㎍/㎖으로 0.2% 젤라틴에 희석하고 4 ℃에 보관하였다.
젤라틴과 라미닌을 함유한 형질전환 혼합물의 제조
모든 형질전환 시약은 라미닌 40.0 ㎍/㎖의 라미닌/0.2% 젤라틴 용액에 희석하였다. 직선형 PEI25k의 농도와 특별히 합성한 폴리머 샘플의 농도는 320.0 ㎍/㎖ 내지 40.0 ㎍/㎖이고, 분지형 PEI25k의 농도는 160.0 ㎍/㎖ 내지 20.0 ㎍/㎖이다. Superfect의 농도는 600.0 ㎍/㎖ 내지 75.0 ㎍/㎖이고, 리포펙타민 농도는 200.0 ㎍/㎖ 내지 25.0 ㎍/㎖이다. 폴리머와 합성한 지질-폴리머(NDT)의 농도는 320.0 ㎍/㎖ 내지 40.0 ㎍/㎖이다.
96웰 플레이트와 형질전환 시약-젤라틴-라미닌 혼합물을 이용한 형질전환 표면 형성
형질전환/젤라틴/라미닌 용액 25 ㎕을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트는 수 초간 교반하여 표면의 바닥 전체가 형질전환/젤라틴 용액으로 도포되도록 하였다. 이후 상기 플레이트는 조직 배양 후드에서 수시간(약 5-6시간) 공기중 건조시켰다. 건조된 플레이트는 4 ℃에 보관하여 준비하였다(도 17-19).
플라스미드 DNA 제조
플라스미드 pCMV-GFP와 pCMV-luc를 표준적인 DNA 재조합 프로토콜에 따라 구축하였다. 푸른 형광 단백질(GFP)과 반딧불이의 루시퍼라제 유전자 cDNA의 발현은 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 의해 조절되며, 전사체는 유전자 발현 인핸서, 닭 β-글로불린 인트론에 의해 안정화되었다. 상기 플라스미드는 DH5α E. coli에서 증폭시켰고 퀴아젠사의 플라스미드 맥스 준비 키트를 이용하여 제조사의 지침서에 따라 정제하였다. 정제된 플라스미드 DNA의 정량 및 정성 분석은 260 및 280 nm에서의 스펙트로포토미터 분석과 0.8% 아가로즈 겔상의 전기영동으로 평가하였다. 정제한 플라스미드 DNA를 멸균한 ddH2O에 용해시키고 -20 ℃에 보관하였다.
DMEM이 함유된 DNA 용액 준비
pCMV-GFP 또는 pCMV-luc 플라스미드는 최종 농도 10 ㎍/㎖로 DMEM에 희석하였다. DNA 용액 30 ㎕을 96웰 플레이트 또는 글라스 슬라이드의 형질전환성 표면에 첨가하고, 상온에 20-30분간 두었다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드 준비
루시퍼라제 705 리포터 유전자 시스템은 노오스 캐롤리나 대학의 콜 박사(Kang SH et al. Biochemistry 1998; 37 (18): 6235-9)에 의해 개발된 것이다. 이 시스템에서, 705 부위에 돌연변이가 있는 인간 베타-글로빈이 루시퍼라제 cDNA 서열 사이에 삽입되어 있다. 상기 플라스미드는 안정적인 유전자 발현을 위해 HeLa 세포에 도입하였다; 세포주는 HeLa luc705이다. 잘못된 스플라이싱을 갖는 유전자 산물(루시퍼라제)은 활성을 나타내지 않기 때문에, 통상 세포는 낮은 루시라제 활성을 나타낸다. 그러나 705 서열에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 잘못된 스플라이싱 부위를 봉쇄하여 생물학적 활성을 갖는 루시퍼라제가 생산될 것이다. 루시퍼라제 705는 안티센스 올리고뉴클레오티드 전달 효율성을 평가하기 위한 작용 모델로서 사용된다. 증가된 루시퍼라제 활성은 안티센스의 전달 효율의 증가를 의미한다.
본 실험에서, luc705 서열에 결합하는 18nt 2'-O-메틸-포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 서열은 CCUCUUACCUCAGUUACA이다. 안티센스 올리고를 최적 MEM에 최종농도 0.6 μmol/L로 희석하였다. 안티센스 올리고 30 ㎕를 이전에 설명한 각 웰의 형질전환성 표면에 첨가하고 25분간 상온에 두었다(도 24).
siRNA 준비
siRNA는 21-25 bp의 이중가닥 RNA 절편으로, 표적 mRNA에 결합하여 파괴하며, 유전자 발현 수준을 하향 조절한다. 본 실험에서, 루시퍼라제 플라스미드와 루시퍼라제 유전자를 표적으로 하는 siRNA 합성 카세트를 최적 MEM내로 준비하였고, 이전에 설명한 형질전환성 플레이트에 첨가하여 25분간 두었다. 루시퍼라제 플라스미드의 함량은 0.5 ㎍/웰이고, siRNA 합성 카세트의 함량은 0.5 ㎍/웰이다(도 25).
Tat 펩타이드 전달
다양한 농도(50, 25, 12.5 및 6.3 ㎍/웰)의 비오틴으로 표지된 Tat 펩타이드를 0.2% 젤라틴 용액으로 준비하고, 각각 96웰 플레이트 상에 코팅하였다. 플레이트는 세포 배양 후드에 수시간 두어 건조시켰다. 1.5 x 104 HeLa 세포/웰을 펩타이드가 코팅된 플레이트상에 접종하고 4시간동안 37 ℃에서 배양하였다. 세포는 5분간 0.2% 글루타르알데하이드/PBS로 부착하고, 10% 메탄올을 처리하였다. 10% 혈청으로 37 ℃에서 30분간 블롯킹한 후, 상기 세포는 스트렙타비딘-FITC와 37 ℃에서 30분간 반응시켰다. 상기 세포는 PBS로 세척하고 형광 신호는 형광현미경에서 관찰하였다. 펩타이드가 성공적으로 세포내로 전달되면, 비오틴이 접합된 펩타이드가 스트렙타비딘-FITC에 특이적으로 결합할 수 있으며 펩타이드가 형광 신호를 형성시킬 수 있게 된다. 상기 세포에서 FITC 신호 증가는 더 많은 펩타이드가 세포내로 전달되었음을 의미한다(도 26).
형질전환성 표면 시스템에 의해 매개된 유전자 이동에 있어서 형질전환 혼합물에서의 표적화 모이어티의 효과
폴리-L-라이신이 접합된 트랜스페린 준비
트랜스페린은, 트랜스페린 리셉터 매개성 엔도사이토시스 경로에서 간 세포에 의해 흡수될 수 있다. 트랜스페린은 간 세포에서 유전자 전달 효율을 향상시킬 수 있는 세포 표적 분자로 보고되고 있다(Wagner E, Ogris M, Zauner W. Adv Drug Deliv Rev 1998; 30 (1-3): 97-113).
라미닌이 주성분인 형질전환 혼합 시스템에서 양이온성 폴리머 형질전환 시약에 의해 매개된 유전자 전달에 대한 표적 분자(트랜스페린)의 효과
본 실험에서, 트랜스페린(PLL-T)이 접합된 폴리-L-라이신 25 ㎕와 라미닌 40.0 ㎍/㎖로 96웰 플레이트를 코팅하였다. 폴리-L-라이신(PLL)은 대조군으로 사용하였다. PLL-T와 PLL의 농도 범위는 320.0 ㎍/㎖ 내지 40.0 ㎍/㎖이다. 공기중에 건조한 다음 루시퍼라제 플라스미드 용액(20.0 ㎍/㎖, 폴리머/DNA 비율은 16:1 내지 2:1)을 상기 플레이트에 첨가하였고, 상온에서 25분간 두었다. 건조된 플레이트는 관련 실험에 사용하기 위해 준비하였다(도 27).
형질전환성 표면 시스템에 의해 매개된 유전자 전달에 있어서 형질전환 혼합물에 함유된 멤브레인 불안정화 화합물의 효과
VSVG는 멤브레인 불안정화 특성을 갖고 있는 바이러스 외피 단백질이며, 멤브레인 융합과 세포 멤브레인의 교란을 발생시킨다. VSVG는 양이온성 폴리머(PLL)에 의해 매개된 유전자 전달을 월등히 증가시키는 유전자 형질전환 증강제로 사용되고 있다. VSVG 단백질의 세포 융합 도메인의 펩타이드를 합성하였다. 상기 펩타이드의 서열은 RRRQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDARRR이며, 펩타이드의 가용성을 향상시키기 위해 C 말단과 N 말단에 아르기닌 아미노산이 있다.
VSVG 펩타이드와 폴리-L-라이신을 라미닌 40.0 ㎍/㎖에 희석하였다. VSVG 펩타이드의 농도는 1.0 ㎎/㎖이고, PLL의 농도는 640 ㎍/㎖ 내지 160.0 ㎍/㎖이다. 대조군은 PLL만을 동일 농도로 라미닌 용액에 희석하였다. PLL 또는 PLL+VSVG 펩타이드 용액을 96웰 플레이트에 가하고 공기중에 건조시켰다. PLL의 함량은 각각 16.0 8.0 및 4.0 ㎍/웰이다(도 28).
형질전환성 표면 시스템에 의해 매개되는 유전자 전달에 있어서 형질전환 혼합물에 함유된 세포환원성 시약의 효과
글루타민은 암모니아에 의해 유발되는 세포독성에 대해 세포를 보호할 수 있는 세포환원성 시약이다(Nakamura E and Hagen S J. Am J Physiol Gastointest liver Physiol 283 G1264-1275, (2002)). 거의 모든 양이온성 폴리머 또는 양이온성 지질은 아민기를 포함하고 있으므로, 형질전환성 표면 준비시 형질전환 혼합물에 글루타민의 첨가는 형질전환의 세포독성을 방지한다. 글루타민(100 mmol/L)과 여러가지 형질전환 시약(NDT-CP-B-1, NDT-CP-1, Superfect 및 리포펙타민 2000)을 0.2% 젤라틴 용액에 희석하고, 글루타민/형질전환 시약/젤라틴을 함유한 용액 25 ㎕를 96웰 플레이트에 첨가하여 공기중에 건조시켰다. 최적 MEM(20.0 ㎍/㎖)에 용해된 GFP 플라스미드 용액 25 ㎕를 각 웰에 가하였고 25분간 상온에 두었다. 건조된 플레이트는 사용을 위해 준비하였다(도 32).
형질전환성 표면 시스템에 의해 매개되는 유전자 전달에 있어서 형질전환 혼합물에 함유된 세포 부착 시약의 효과
라미닌은 세포의 성장과 분화를 지탱하기 위한 기질이다. 라미닌은 일반적으로 세포 부착 시약으로 사용된다. 본 실험에서 0.2% 젤라틴 또는 0.2% 젤라틴과 40.0 ㎍/㎖ 라미닌 혼합물을 형질전환 시약 NDT-CP-B-1, NDT-CP-1, NDT-LP-1 NDT-LP-2, Superfect와 리포펙타민 2000의 희석에 사용하였고, 25 ㎕ 용액을 96 플레이트에 첨가하였다. 각 웰에 사용한 NDT 폴리머의 함량은 각각 8, 4 및 2 ㎍이고, Superfect의 함량은 15, 7.5 및 3.8 ㎍/웰이고, 리포펙타민 2000의 함량은 각각 2.5, 1.25 및 0.63 ㎍/웰이다. 공기 중에 건조시키 다음, 최적 MEM(20 ㎍/㎖)에 용해된 GFP 플라스미드 용액 25 ㎕을 각 웰에 첨가하고 상온에서 25분간 두었고, 플레이트에 293 세포를 5 x 104 세포/웰로 접종하였다. 상기 세포는 37 ℃에서 24시간 배양하였다. 형질전환 효율과 세포독성은 형광 현미경과 MTT 분석으로 확인하였다(도 33).
세포 배양
HEK 293T 세포를 10% 소 태아 혈청, 페니실린 10 units/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖을 함유하는 DMEM(Gibco)에서 유지시켰다. 상기 배지에서 세포가 2배로 증식되는 시간은 약 20시간이고, 세포는 과도한 컨플루언시를 피하기 위해 3-4일마다 분주하였다.
HeLa 705 세포 주는, 돌연변이 베타-글로빈 인트론(705 위치에 돌연변이)을 갖는 반디불이 루시퍼라제의 도입에 의해 루시퍼라제 돌연변이 단백질이 발현되는, 인간의 자궁경부 암종 HeLa 세포로부터 유래된 것이다. 그러나, 돌연변이 인트론은 이후 잘못된 스플라이싱 부위를 봉쇄하는 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드에 의해 정정될 수 있다(Kang SH et al. Biochemistry 1998; 37 (18): 6235-9). 상기 세포는 10% 소 태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖을 함유하는 DMEM(Gibco)에서 유지시켰다. 상기 배지에 하이그로마이신 200 ㎍/㎖을 첨가하여 luc-705 플라스미드를 유지시켰다. 상기 배지에서 세포가 2배로 증식되는 시간은 약 20시간이고, 과도한 컨플루언시를 피하기 위해 세포를 3-4일마다 분주하였다.
인간 간 암 세포주 HepG2는 10% 소 태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖을 함유하는 α-MEM(Gibco) 배지에서 유지시켰다. 상기 배지에서 세포가 2배로 증식되는 시간은 약 20시간이고, 과도한 컨플루언시를 피하기 위해 세포를 3-4일마다 분주하였다.
인간의 내피 원시 세포 HUV-EC를 10% 소 태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖, 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖ 및 제조사의 지침서에 따른 여러가지 성장 인자를 함유하는 EBM 배지(Cambrex Corp.)에서 증식 및 유지시켰다(도 29-30).
세포 준비 및 형질전환성 표면 위에 접종
형질전환 직전에, 아래와 같이 조직 배양 후드에서 10 cm의 접시로부터 세포를 회수하였다:
a. 배지를 제거하고 세포는 PBS 2 ㎖로 세척하고, 용액으로 플레이트를 도포한 다음, 상기 용액을 즉시 제거하였다.
b. 0.5 ㎖의 트립신-EDTA를 세포에 첨가하고 플레이트에 균등하게 도말한 다음 즉시 트립신-EDTA을 제거하였다.
c. 상기 세포는 3-5분간 후드에 두었다. 이후 플레이트를 흔들어 플레이트의 표면에서 세포를 탈착시켰다.
d. 37 ℃의 완전 배지 6 ㎖을 플레이트의 세포에 첨가하였고, 단일 세포 현탁액을 수득할때까지 10 ㎖의 파이펫으로 용액을 12-15회간 아래 위로 파이펫팅하였고 지나치게 거품이 생기지 않게 하였다. 다른 배지 14 ㎖을 첨가하고, 세포를 완전히 현탁시켰다.
e. 세포는 혈구 계산기(hemocytometer)로 정량하였다.
f. HEK 293T, HepG2 세포를 멸균된 바신(basin)에 4-5 x l05 세포/웰로 희석하고, 100 ㎕(4-5 x l04)를 96웰 플레이트의 각 웰에 접종하였다. HeLa 705와 HUV-EC 세포의 최적 농도는 1-2 x 105 세포/㎖이었다.
GFP 리포터 유전자의 형질전환 분석
푸른 형광 단백질(GFP) 유전자를 초기 스크리닝에 사용하였다. 형질전환 후 세포내 GFP 신호를 형광 현미경(Olympus, filter 520nm)으로 관찰하였다. 세포는 10X 대물렌즈로 사진 촬영하였다. 최적 양이온성 폴리머 함량에 대한, 형질전환된 배양액에서 GFP 신호를 갖는 세포 퍼센트를, 3가지 필드의 카운트로 결정하였다.
루시퍼라제 분석
루시퍼라제 활성 측정은 화학발광 분석으로 실시하였으며, 제조사의 지침서를 따랐다(Luciferase Assay System; Promega, Madison, WI, USA). 간략하게는, 유전자 전이 후 30시간 경과시, 세포를 PBS로 2회 세척하고 라이시스 완충액(1% 트리톤 X-100, 100 mM K3P04, 2 mM 디티오트레이톨, 10% 글리세롤 및 2 mM EDTA pH 7.8)으로 상온에서 15분간 라이시스하였다. 세포 라이세이트 10 ㎕를 루미노미터의 주입기에서 루시퍼라제 분석 시약 50 ㎕과 상온에서 혼합하였다. 광 방사는 10초간 3회 측정하였고, RLUs(relative light units)로 나타내었다. 상대 광 단위(RLU)는 BSA 단백질 분석(Pierce,Rockford, Illinois)으로 확인된 각 샘플의 단백질 함량으로 표준화하였다. 모든 실험은 3배수로 실시하였다.
세포독성 분석-MTT 분석
포유류 세포에 대한 형질전환 시약의 세포독성을, 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT) 방법으로 조사하였다. 형질전환 후 40시간 경과시 MTT 용액(5.0 ㎎/㎖, Sigma) 10 ㎕를 각 웰에 첨가하고 3시간 두었다. 이후 배지를 제거하여 DMSO 200 ㎕을 첨가하여 포르마잔 결정을 용해시켰다. 상기 용액의 흡광도는 570 nm에서 측정하였다. 세포 생존력은 식 : 생존율(%) - {Abs570(샘플)/Abs570(대조군)} x 100으로 계산하였다(도 31).
안정성 조사
0.2% 젤라틴에 용해된 LPEI, BPEI, NDT-CP-B-1, NDT-CP-1, Superfect 및 리포펙타민으로 96웰 플레이트를 전술한 바와 같이 코팅하였다. 공기중에 건조한 다음, 플레이트는 37 ℃에 9일간 두었다. 상기 플레이트는 사용 준비가 되었다. 루시퍼라제 플라스미드(최적 MEM내 20.0 ㎍/㎖) 25 ㎕/웰을 상기 플레이트(37 ℃에서 배양 전 및 후)에 첨가하고 25분간 두었다. 상기 플레이트에 293 세포 5 x 104를 접종하고 37 ℃에서 48시간동안 배양하였다. 신선한 플레이트 또는 37 ℃에서 9일간 배양한 플레이트간의 형질전환성 표면의 유전자 형질전환 효율을 비교하였다(도 34).
본 발명은 바람직한 실시예를 참조하여 자세히 표시되고 설명되어 있지만, 본 발명의 범위내에서 형태나 구체적인 사항이 다양하게 변경될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 본원에 원용된 참조문헌들은 본 발명에 포함된다.

Claims (26)

  1. (a) 양이온성 폴리머 또는 지질로 적어도 부분적으로 코팅된 고형의 표면을 제공하는 단계;
    (b) 진핵 세포내로 도입될 생물분자를 상기 고형의 표면 위에 첨가하는 단계; 및
    (c) 상기 진핵 세포내로 상기 생물분자가 도입되기에 적합한 조건에서 상기 고형의 표면 위에 세포를 충분한 밀도로 접종하는 단계
    를 포함하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 표면은 플라스크, 접시, 멀티웰 플레이트, 글라스 슬라이드 및 임플란트 소자(implanted device)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 고형의 표면은 지질-폴리머로 코팅된 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 폴리머 또는 지질은 세포 표적화 모이어티, 세포내 표적화 모이어티, 멤브레인 불안정화성 성분 및 1종 이상의 형질전환 증강제로 이루어진 군으로부터 선택된 부가적인 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 양이온성 폴리머 또는 지질은 상기 표면 위에 양이온성 폴리머 또는 지질을 균등하게 도말하거나 또는 점적하여 상기 표면에 부착되는 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 양이온성 폴리머 또는 지질은 단백질, 당단백질, 펩타이드, 다당류, 폴리머 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 매트릭스(matrix) 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 단백질은 젤라틴, 콜라겐, 라미닌, 파이브로넥틴, 소혈청 알부민 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 폴리머는 하이드로젤, 생분해성 폴리머 및 생물적합성 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 양이온성 폴리머 또는 지질은 세포환원성 시약(cytoreductive reagent), 세포 결합성 시약, 세포 증식성 시약, 세포 자극성 시약 및 세포 저해성 시약으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 배양 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 고형의 표면은 슬라이드 또는 멀티웰 플레이트로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 진핵 세포는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 포유류 세포는 분열성 세포 또는 비-분열성 세포인 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 포유류 세포는 형질전환된 세포 또는 원시 세포(primary cell)인 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  14. 제 11항에 있어서, 상기 포유류 세포는 체세포 또는 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 진핵 세포는 식물 세포인 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 양이온성 폴리머 또는 지질은 상기 고형의 표면 위에 균등하게 도말되거나, 점적되거나, 또는 자동화 기계에 의해 표면에 부착되는 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 상기 생물분자는 DNA, RNA, 및 DNA/RNA 하이브리드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 상기 생물분자는 직선형 분자, 플라스미드 및 단일 가닥 올리고데옥신뉴클레오티드(ODN)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 생물분자는 단일 가닥 RNA(라이보자임) 또는 이중 가닥 RNA(siRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 상기 진핵 세포는 곤충 세포인 것을 특징으로 하는, 진핵 세포에 생물분자를 도입하기 위한 생체외 방법.
  21. (a) 제 1항 내지 20항중 어느 한항에 따른 방법에 의해 생물분자를 세포에 도입하는 단계; 및
    (b) 상기 생물분자가 상기 세포로 전달되었는지 여부를 검출하는 단계;
    를 포함하는, 세포내에 생물분자의 도입 여부를 확인하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 생물분자는 뉴클레오티드, 단백질, 펩타이드, 당, 다당류 및 유기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포내에 생물분자의 도입 여부를 확인하는 방법.
  23. 제 21항에 있어서, 상기 세포는 식물 세포, 곤충 세포 및 박테리아 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포내에 생물분자의 도입 여부를 확인하는 방법.
  24. 제 1항에 있어서, 상기 양이온성 폴리머 또는 지질은 수동으로 상기 표면에 부착되거나 또는 자동화 기계에 의해 표면에 부착되는 것을 특징으로 하는, 세포내에 생물분자의 도입 여부를 확인하는 방법.
  25. 제 21항에 있어서, 상기 검출은 생물분자, 생물분자의 생성물, 생물분자의 활성, 생물분자 생성물의 활성, 표적 분자, 생물분자에 의해 촉매화된 생성물 또는 생물분자에 의해 조절된 생성물을 검출함으로써 실시되는 것을 특징으로 하는, 세포내에 생물분자의 도입 여부를 확인하는 방법.
  26. 제 1항에 있어서, 상기 생물분자는 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 당, 다당류 및 유기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포내에 생물분자의 도입 여부를 확인하는 방법.
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