JP2006513703A - 生体分子送達用固体表面およびハイスループットアッセイ - Google Patents

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Abstract

本発明は、トランスフェクション試薬および生体分子を塗布した固体表面上で細胞を培養することで核酸などの生体分子を細胞内に導入するための方法に関する。

Description

本発明は、定型的トランスフェクションアッセイおよびハイスループットトランスフェクションアッセイを実現するために、トランスフェクション試薬および生体分子を塗布した固体表面上で細胞を培養することにより核酸などの生体分子を細胞内に導入する方法に関するものである。また本発明は、これらのアッセイに用いるトランスフェクション可能表面の使用方法ならびに製作方法に関するものである。
遺伝子トランスフェクション法は核酸の細胞内への導入に用いることができ、遺伝子制御および遺伝子機能の研究において有効である。中でも、大量のDNA群をスクリーニングして目的の物性を持つコードされた生成物を特定できるような、ハイスループットアッセイは特に有効である。遺伝子トランスフェクションとは、生物学的機能を持つ核酸を細胞、例えば真核細胞内に、核酸が細胞内でその機能を維持できるような形で送達・導入することである。遺伝子トランスフェクションは、遺伝子制御、遺伝子機能、分子療法、生体情報伝達、薬物スクリーニング、および遺伝子療法に関する研究において広く応用されている。高生命体からの遺伝子のクローニングおよびカタログ化の研究が続いているが、研究者たちは、遺伝子の機能を明らかにし、また好ましい物性を持つ遺伝子生成物を特定しようと努力している。遺伝子配列に関し益々多くのデータが収集される中、遺伝子生成物の特性付けと遺伝子機能の分析、ならびに細胞／分子生物学の他の研究分野にも応用できる、体系的なハイスループット手法の開発が求められている。
遺伝子の送達には、ウイルス性遺伝子キャリアと非ウイルス性遺伝子キャリアの両方が用いられている。ウイルス性ベクターは、非ウイルス性キャリアよりも高いトランスフェクション効率が得られることが分かっている（Verma I.M, Somia N. Nature 389 (1997), pp.239-242; Marhsall E. Science 286 (2000), pp.2244-2245）。非ウイルス性トランスフェクション系ではウイルス性ベクターと同様の効率はまだ報告されていないが、ウイルス性ベクターよりも論理上安全性が高いことから非ウイルス性トランスフェクション系は大きな注目を浴びている。また、ウイルス性ベクターの調製は複雑かつ高価なプロセスであることから、生体外でのウイルス性ベクターの適用が制限される。非ウイルス性キャリアの調製プロセスは、ウイルス性キャリアの調製と比べてより簡単で、コスト効果も高い。このため、生体外研究におけるトランスフェクション試薬としては、合成遺伝子キャリアが好まれている。
大部分の非ウイルス性ベクターは、外来遺伝子物質による侵入を防ぐために設けられている細胞バリヤを突破するためのウイルス細胞進入挙動の重要な特徴を真似る。非ウイルス性遺伝子ベクターは遺伝子キャリアの基本構造に基づいて、a) リポプレックス、b) ポリプレックス、およびc) リポポリプレックスの3種類に大別される。リポプレックスは、核酸と脂質成分が組み合わされたもので、通常は陽イオン性を持つ。リポプレックスによる遺伝子搬送は、リポフェクションと呼ばれる。ポリプレックスは、核酸と陽イオン性ポリマーの複合体である。リポポリプレックスは、脂質とポリマー成分の両方から構成される。これらのDNA複合体は、細胞標的または細胞内標的部分および／または膜不安定化成分、例えばウイルスタンパク質またはペプチドあるいは膜破壊合成ペプチドなどを含有させるために、さらに調整されることがしばしばある。最近では、細菌およびファージも核酸を細胞内へ搬送するシャトルの役割を果たすと考えられている。
大部分の非ウイルス性トランスフェクション試薬は合成陽イオン性分子で、陽イオン上の陽イオン性サイトと核酸上の陰イオン性サイトの相互作用によって核酸を「被覆」する機能が報告されている。正電荷を帯びたDNA−陽イオン性分子複合体は、負電荷を帯びた細胞膜と相互作用を起こすことで、不特定のエンドサイトーシスによるDNAの細胞膜通過を助長する（Schofield, Brit. Microencapsulated. Bull, 51 (1): 56-71 (1995)）。従来の遺伝子トランスフェクション手法の大部分では、トランスフェクション実施の16〜24時間前に細胞を細胞培養装置上に播種する。トランスフェクション試薬（例えば陽イオン性ポリマーキャリアなど）とDNAは、通常異なる試験管内で調製され、得られた各溶液を培地（ウシ胎仔血清または抗生物質を含まない）で稀釈する。続いて、稀釈した各溶液の一方を他方にゆっくりと注意深く添加する。両溶液の全量が混ぜ合わされるまで、混合液を引き続き攪拌する。こうして得られた混合液を室温で15〜45分培養してトランスフェクション試薬−DNA複合体を生成し、血清および抗生物質の残留物を除去する。トランスフェクションの実施前に細胞培養培地を除去し、細胞を緩衝剤で洗浄する。DNA−トランスフェクション試薬複合体を含んだ溶液を細胞に加え、この状態で細胞を約3〜4時間培養する。続いて、トランスフェクション試薬を含む培地を新しい培地と置換する。最後に、指定のタイミングで細胞を一回または複数回に渡って分析する。これは、明らかに時間のかかる実施手順であり、特に、トランスフェクション対象サンプル数が非常に多いときは多大な時間を要する。
従来のトランスフェクション手順には、複数の重要な問題が存在する。まず、従来の手順は時間がかかり、特に、トランスフェクション実験で多くの細胞または遺伝子サンプルを用いるときは多大な時間を要する。また、一般的なトランスフェクション手順で得られる結果は、必要な工程数が多いことから再現が困難である。例えば、DNA−トランスフェクション試薬複合体の生成においては、複合体の組成は核酸および試薬の濃度と容量、pH、温度、緩衝剤の種類、攪拌の時間と速度、培養時間、およびその他の要素による影響を受ける。つまり、同じ試薬と手順を用いても、得られる結果が異なる場合があるということである。複数工程から成る手順で得られた結果は、各工程における人的または機械的誤差あるいはその他のばらつきによる影響を受ける。さらに、トランスフェクション後に細胞培養液を新しい液と交換することで細胞がかく乱され、培養表面から細胞が分離し、これによって最終的な結果にばらつきと予測不可能性が生じることがある。こうしたすべての因子を考慮すれば、従来のトランスフェクション法を用いる場合には、高い技量を持つ研究者によってトランスフェクション実験またはアッセイを実行する必要がある。
研究者たちは、細胞トランスフェクションを実現するためのより簡単でコスト効果の高い方法を求めている。多数のサンプルの効率的なトランスフェクションを実現するためには、ハイスループットの細胞トランスフェクション法が必要である。
本発明は、定型的トランスフェクションアッセイおよびハイスループットトランスフェクションアッセイを実現するために、トランスフェクション試薬および生体分子を塗布した固体表面上で細胞を培養することにより核酸などの生体分子を細胞内に導入する方法に関する。また本発明は、これらのアッセイに用いるトランスフェクション可能表面の使用方法ならびに製作方法に関する。
本発明が提供する生体分子の真核細胞への導入方法は、(a) 固体表面に生体分子送達試薬を塗布する工程、(b) 真核細胞に導入される生体分子を固体表面に添加する工程、および (c) 前記固体表面上で細胞を十分な濃度と適切な条件下で播種することで真核細胞内に生体分子を導入する工程を含む。本発明の実施の形態によると、この表面はフラスコ、ディッシュ、マルチウエルプレート、ガラススライド、および植え込み型装置からなる群より選択することができる。生体分子送達試薬またはトランスフェクション試薬は、ポリマー、脂質、脂質ポリマー、および／またはそれらの組み合わせおよび／または派生物に、細胞標的または細胞内標的部分および／または膜不安定化成分、ならびに一つまたは複数の送達促進剤を含有させたものからなる群より選択することができる。
本発明の実施の形態によると、生体分子送達試薬は、試薬を表面に均一に展着させる、あるいは表面上の不連続の部位に斑点状に塗布することによって、固体表面に固定させることができる。こうして生体分子送達試薬を塗布した固体表面には、タンパク質、ペプチド、多糖類、およびポリマーからなる群より選択されるマトリックス試薬をさらに含有させることができる。タンパク質は、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、および細胞外マトリックス成分（例えば、コラーゲン、ラミニン、およびフィブロネクチンを含むが、これらだけに限定されない）の中から選択することができる。ポリマーは、ヒドロゲル、生物分解性ポリマー、および生物適合性物質の中から選択することができる。
本発明の実施の形態によると、固体表面に塗布する生体分子送達試薬には、細胞減少性試薬、細胞結合／付着試薬、細胞成長試薬、細胞刺激試薬、および細胞抑制試薬からなる群から選択される細胞培養試薬をさらに含有させることができる。
生体分子は、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、糖類、多糖類、および有機化合物の中から選択することができる。特に、生体分子はDNA、RNA、およびDNA/RNAハイブリッドの中から選択することが望ましい。ヌクレオチドには、環状（プラスミド）、直鎖、または一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを用いることができる。RNAには、一本鎖型（リボザイム）または二本鎖型（siRNA）を用いることができる。
本書で説明する方法で用いる固体表面は、スライドまたはマルチウエルプレートのいずれかを選択することができるが、これらに限定されない。
本発明の実施の形態で用いる真核細胞には、哺乳類の細胞を用いることができるが、これらに限定されない。この哺乳類の細胞には、分裂細胞と非分裂細胞のいずれを用いてもよい。また、この哺乳類の細胞には形質転換細胞と初代細胞のいずれを用いてもよい。さらに、この哺乳類の細胞には体細胞と幹細胞のいずれを用いてもよい。真核細胞には、植物、酵母または昆虫の細胞を用いることができる。
ハイスループット薬剤スクリーニングアッセイ法は、(a) 送達試薬を固体表面に固定する工程、(b) 真核細胞に導入される生体分子を前記の送達試薬に固定する工程、(c) 送達試薬および生体分子を塗布した表面に十分な濃度および適切な条件下で細胞を播種することで生体分子を真核細胞に導入する工程、および(d) 生体分子が送達された真核細胞を検出する工程を含む。
生体分子は、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、糖類、多糖類、および有機化合物の中から選択することができるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、DNA、RNA、およびDNA/RNAハイブリッドの中から選択することができるが、これらに限定されない。DNAは、環状（プラスミド）、直鎖、または一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）を用いることができる。RNAには、一本鎖型（リボザイム）または二本鎖型（siRNA）を用いることができる。
真核細胞は、哺乳類の細胞であることが望ましい。この哺乳類の細胞には、分裂細胞と非分裂細胞のいずれを用いてもよい。また、この哺乳類の細胞には形質転換細胞と初代細胞のいずれを用いてもよい。さらに、この哺乳類の細胞には体細胞と幹細胞のいずれを用いてもよい。真核細胞は、植物、細菌または昆虫の細胞から選択されてもよいが、これらに限定されない。生体分子が送達された細胞の検出は、生体分子自体の検出、生体分子の生成物の検出、生体分子の標的分子の検出、生体分子の触媒作用による生成物、あるいは生体分子が制御する生成物の検出という形で実現することができる。
本書には、従来のトランスフェクションアッセイと比べて簡単、便利かつ効率性の高い新規なトランスフェクション装置および方法が説明されている。トランスフェクション装置は、本書に説明するように、トランスフェクション試薬を細胞培養装置の固体表面に固定することで作製される。この装置を用いれば、研究者は細胞培養装置の表面に核酸またはその他の生体分子キャリア系を添加するだけでよい。DNAまたは生体分子をトランスフェクション試薬と事前に混合する必要はない。このため、従来のトランスフェクション手順で必要であった、多大な時間を要する工程が省略できる。科学者たちは、従来の方法では2〜5時間またはそれ以上の時間が必要であったサンプル10個のトランスフェクションを約40分で完了できるようになる。これは、数百個ものサンプルを一度に試験するハイスループットトランスフェクションアッセイには特に好適である。
従来型トランスフェクションと比較して、本書で説明する新しい方法には幾つかの利点がある。まず、トランスフェクション装置は保管が極めて簡単であり、さらに生体材料／トランスフェクション試薬の混合を必要としない簡単な生体分子送達または遺伝子トランスフェクションが可能になる。本書で説明するトランスフェクション手順は、例えば上記の例では約40分などの短時間で終了できるため、多数のサンプルを一度に処理できるハイスループットのトランスフェクションまたは薬剤送達が可能になる。
本書で説明する新規な遺伝子送達方法および装置は、前述した従来のトランスフェクションアッセイに共通する諸々の問題を解決するものである。単にトランスフェクション試薬を細胞培養装置の表面に塗布すればよいだけなので、商業化および量産が簡単に実現できる。顧客、例えば研究者は、トランスフェクション実行前の装置の準備として、単に核酸などの目的生体分子を細胞培養装置の表面に直接添加すればよい。続いて、細胞培養装置の表面に細胞を播種して、培地の交換なしに培養し、細胞を分析する。トランスフェクション手順実施中に培地を交換する必要はない。本書で説明する方法は、必要な工程数を減らすことでミスの発生リスクを大幅に低減するため、システムの一貫性と精度が向上することになる。
本書で説明する方法によれば、トランスフェクション試薬をスライド、マルチウエルプレート、またはトランスフェクション装置を構成するその他の表面に固定する。この装置を利用すれば、DNAまたはその他の生体分子を表面に添加するだけで、トランスフェクション試薬とDNAまたは生体分子との複合体が生成される。この反応には約30分かかる。その後、細胞を表面に播種し、適切な条件下で培養して生体分子を細胞内に導入する。
核酸／生体分子を含む混合液が固定できる適切な表面であれば、どのような材料でできていてもよい。例えば、その表面は、ガラス、プラスチック（ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオライド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレンなど）、シリコン、金属（金など）、膜（ニトロセルロース、メチルセルロース、PTFE、セルロースなど）、紙、生体材料（タンパク質、ゼラチン、寒天など）、細胞組織（皮膚、内皮組織、骨、軟骨など）、鉱物（ヒドロキシルアパタイト、黒鉛など）を用いることができる。中でも、スライド（ガラス製、またはポリ−L−リジンを塗布したスライド）、あるいはマルチウエルプレートのウエルがより好適である。
スライド、例えばポリ−L−リジンを塗布したガラス・スライド（Sigma, Inc.）では、トランスフェクション試薬を表面に固定して乾燥させた後、目的の核酸または細胞内に導入される核酸、タンパク質、ペプチド、または小分子薬剤を導入する。その後、スライドを室温で30分培養し、トランスフェクション装置の表面に生体分子／トランスフェクション試薬複合体を生成する。この生体分子／トランスフェクション試薬複合体は、核酸、タンパク質、ペプチド、およびその他の小分子薬剤のサンプル数百個を一度に分析できるハイスループットマイクロアレイで用いる培地となる。これとは別の実施形態として、トランスフェクション試薬または薬剤送達試薬をトランスフェクション装置の表面の指定した領域に不連続に固定することでトランスフェクション試薬または薬剤送達試薬のマイクロアレイを形成することもできる。この実施形態では、細胞内に導入する核酸などの分子を、トランスフェクション試薬または送達試薬と共にトランスフェクション装置の表面に展着させる。この方法は、数千個の化合物の中からトランスフェクション試薬またはその他の送達試薬を選別する場合に利用できる。このようなスクリーニングの実行結果は、コンピュータ分析により検討できる。
本発明のさらに別の実施形態として、マルチウエルプレートの一つまたは複数のウエルにトランスフェクション試薬または薬剤送達試薬を塗布することができる。トランスフェクションおよび薬剤スクリーニングで通常用いられるプレートは、96ウエルプレートと384ウエルプレートである。続いて、プレートの底にトランスフェクション試薬または生体分子送達試薬を均一に塗布する。その後、例えばマルチチャンネルピペットあるいは自動装置などを用いることで、数百個の核酸、タンパク質、ペプチド、またはその他の生体分子をウエル内に添加する。トランスフェクションの結果は、マイクロプレートリーダーを用いて判断する。大部分の生物医学研究施設には一般にマイクロプレートリーダーが装備されているため、これは、トランスフェクション後の細胞を分析する上で極めて便利な方法である。トランスフェクション試薬または生体分子送達試薬を塗布したマルチウエルプレートは、大部分の研究施設で遺伝子制御、遺伝子機能、分子療法、生体情報伝達、さらには薬剤スクリーニングなどに利用できる。また、マルチウエルプレートの各ウエルに異なるトランスフェクション試薬を塗布すれば、複数のトランスフェクション試薬または送達試薬のスクリーニングが比較的効率良く実現できる。最近では、1,536個、3,456個のウエルを持つプレートがそれぞれ開発されているが、本書で説明する方法に応じてこれらのプレートを利用することもできる。
トランスフェクション試薬または送達試薬は、核酸、タンパク質、ペプチド、糖類、多糖類、有機化合物などの生体分子、ならびにその他の生体分子を細胞内に導入できるような陽イオン性化合物であることが望ましい。好ましい実施形態としては、低分子量ポリエチレンイミン（PEI）、低分子量ポリ（L−リジン）（PLL）、低分子量キトサン、または低分子量デンドリマーなどの陽イオン性オリゴマーが用いられる。これらの分子構成に応じて、試薬は脂質、ポリマー、脂質−ポリマー、および／またはこれらの組み合わせおよび／またはこれらの派生物に細胞標的または細胞内標的部分および／または膜不安定化成分、ならびに送達促進剤を含有させたものに分類できる。
ある実施形態によると、送達試薬をタンパク質、ペプチド、多糖類、またはその他のポリマーなどのマトリックスと混合してもよい。タンパク質としては、ゼラチン、コラーゲン、ウシ血清アルブミン、または表面への固定が可能なその他のタンパク質を用いることができる。ポリマーとしては、ヒドロゲル、コポリマー、非分解性または生物分解性ポリマー、および生物適合性物質を用いることができる。多糖類は、膜を形成して送達試薬を被覆できる化合物であれば何でもよく、例えばキトサンが挙げられる。その他の試薬、例えば細胞毒性減少試薬、細胞結合試薬、細胞成長試薬、細胞刺激試薬、または細胞抑制試薬、ならびに特定の細胞を培養するための化合物を、トランスフェクション試薬または送達試薬と共にトランスフェクション装置に固定してもよい。
これとは別の実施形態として、トランスフェクション試薬（脂質、ポリマー、脂質−ポリマー、または膜不安定化ペプチドなど）、ならびに水または二重脱イオン水などの適切な溶媒中に存在するゼラチンから構成されるゼラチン−トランスフェクション試薬混合液をトランスフェクション装置に固定してもよい。さらに別の実施形態では、上記のゼラチン−トランスフェクション試薬混合液中に細胞培養試薬を存在させることもできる。この混合液をスライド、マルチウエルプレートなどの表面に均一に展着させることで、ゼラチン−トランスフェクション試薬混合液を支持するトランスフェクション可能表面を生成する。これらに代わる実施形態として、異なるトランスフェクション試薬−ゼラチン混合液をトランスフェクション装置表面の不連続の部位に斑点状に塗布してもよい。その後、得られたトランスフェクション可能表面を適切な条件下で完全に乾燥させ、ゼラチン−トランスフェクション試薬混合液が塗布部に固定されるようにする。例えば、得られたトランスフェクション可能表面を特定の温度または湿度で、または真空乾燥器中で乾燥させてもよい。
混合液中のトランスフェクション試薬の濃度は、試薬のトランスフェクション効率と細胞毒性によって異なる。通常、試薬のトランスフェクション効率と細胞毒性は釣り合いが取れている。トランスフェクション試薬が最も効率的で、かつ細胞毒性が容認可能なレベルである濃度は、トランスフェクション試薬の最適濃度と言える。トランスフェクション試薬の濃度は、一般に約1.0 μg/mlから1000 μg/mlの範囲にある。好ましい実施形態では、この濃度は約40 μg/mlから600 μg/mlである。同様に、ゼラチンまたは他のマトリックスの濃度も実施する実験またはアッセイによって異なるが、その濃度は一般にトランスフェクション試薬の0.01%から0.5%の範囲にある。実施例に示す実施形態によると、ゼラチン濃度はトランスフェクション試薬の約0.2%である。
細胞内に導入する分子としては、核酸、タンパク質、ペプチド、ペプチド核酸（PNA）、およびその他の生体分子を用いることができる。核酸としては、DNA、RNA、およびDNA／ハイブリッド等を用いることができる。DNAを使用する際のDNA含有ベクターは、プラスミド（例えばpCMV-GFP、pCMV-luc）、あるいはウイルス系ベクター（例えばpLXSN）など、任意の種類のものを用いることができる。またDNAは、cDNAの5’末端にプロモーター配列（例えばCMVプロモーター）が発現し、かつ3’末端にポリAサイトがあるような直鎖断片であってもよい。これらの遺伝子発現要素は、目的のcDNAを哺乳類の細胞内で過渡的に発現させることができる。DNAが一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）、例えばアンチセンスODNである場合には、ODNを細胞内に導入することで標的遺伝子発現を制御できる。RNAを用いた実施形態では、核酸は一本鎖型（アンチセンスRNA、リボザイム）、または二本鎖型（RNA干渉、siRNA）であってもよい。ほとんどの場合、RNAは、RNAの安定性を増して遺伝子発現のダウンレギュレーションにおける機能を向上させるために、さらに調整される。ペプチド核酸（PNA）では、核酸バックボーンをペプチドと置換するが、これによって分子がより安定する。具体的な実施形態として、本書で説明する方法を用いてタンパク質、ペプチド、およびその他の分子を様々な目的で、例えば分子療法、タンパク質機能研究、あるいは分子機構研究のために、細胞内に導入することができる。
トランスフェクション試薬または送達試薬を塗布したトランスフェクション装置に適切な条件下で生体分子を添加することで、生体分子／送達試薬複合体が生成される。生体分子は、ウシ胎仔血清や抗生物質を含まない細胞培養培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）に溶解することが望ましい。トランスフェクション試薬または送達試薬をスライドに均一に固定する場合には、スライド上の不連続の部位に生体分子を斑点状に塗布してもよい。あるいは、スライド上の不連続の部位にトランスフェクション試薬または送達試薬を斑点状に塗布し、その後生体分子を単にトランスフェクション装置の表面全体を覆うように添加してもよい。トランスフェクション試薬または送達試薬をマルチウエルプレートの底に固定する場合には、マルチチャンネルピペット、自動装置、またはその他の方法を用いて生体分子を単に各ウエルに添加すればよい。こうして得られたもの（トランスフェクション試薬または送達試薬と生体分子を塗布したトランスフェクション装置）を約２５分室温で培養し、生体分子／トランスフェクション試薬（または送達試薬）複合体を生成する。場合によっては、例えば異なる生体分子をスライド上の不連続な部位に斑点状に塗布する場合には、DNA液を除去することで、生体分子をトランスフェクション試薬との複合体として支持する表面を生成できる。あるいは、生体分子液を表面上に維持することもできる。続いて、適切な培地中に適切な濃度で存在する細胞をこの表面に塗布する。こうして得られたもの（生体分子および塗布した細胞を支持する面）を適切な条件下で維持することで、生体分子を細胞内へ進入させる。
本書で説明する方法で好適に使用できる細胞には、原核細胞、酵母、あるいは植物や動物の細胞、特に哺乳類の細胞などの高等真核細胞がある。哺乳類の細胞（ヒト、サル、イヌ科、ネコ科、ウシ科、ネズミ科の細胞）、細菌、昆虫、または植物の細胞を含む真核細胞を、十分な濃度のトランスフェクション試薬または送達試薬と生体分子を適切な条件下で塗布されたトランスフェクション装置の上に塗布することで、生体分子を真核細胞内に導入／進入させ、DNA発現または生体分子と細胞構成要素の相互作用を起こす。具体的な実施形態として、この細胞は造血細胞、神経細胞、膵細胞、肝細胞、軟骨細胞、骨細胞、または筋細胞の中から選択することができる。これらの細胞は、完全分化細胞であっても、あるいは前駆細胞／幹細胞であってもよい。
好ましい実施形態では、10%熱不活性ウシ胎仔血清（FBS）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で、Lグルタミンとペニシリン／ストレプトマイシン（ペン／ストレップ）を用いて真核細胞を成長させる。当業者にとって、特定の細胞を専用の培地中で培養することは当然のことだが、これは、一部の細胞は成長因子およびアミノ酸などの特殊な栄養物を必要とするからである。
細胞の最適密度は、細胞の種類および実験の目的によって異なる。例えば、遺伝子トランスフェクションでは70〜80%コンフルエントな細胞が好ましいが、オリゴヌクレオチドの送達のための最適な状態は、30〜50%コンフルエントな細胞である。一つの実施例として、96ウエルプレートに一ウエル当たり5 x 104個の293細胞を播種したとすれば、これらの細胞は播種後18〜24時間で90%の密集度に達する。HeLa 705細胞では、96ウエルプレート内で同様の密集度を得るためには、一ウエル当たり1 x 104個の細胞しか必要ない。
生体分子／送達試薬を含む表面に細胞を播種したら、続いてその細胞の種類に最適な条件下（例えば37°C、5〜10%CO2）で細胞を培養する。培養時間は、実験の目的によって異なる。通常遺伝子トランスフェクション実験では、細胞が標的遺伝子を発現するまでには24〜48時間の培養時間が必要となる。細胞内での生体分子の移動を分析するのであれば、培養時間は数分から数時間でよく、その後は細胞を指定の時間に観察すればよい。
生体分子の送達結果は、異なる方法を用いて分析できる。遺伝子のトランスフェクションとアンチセンス核酸の送達では、緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、またはβガラクトシダーゼ遺伝子などのリポーター遺伝子の発現を用いて標的遺伝子の発現レベルを検出できる。GFPの信号は、顕微鏡で直接観察できる。ルシフェラーゼ活性は、光度計により検出できる。また、βガラクトシダーゼの触媒作用による青色生成物は、顕微鏡で観察することも、マイクロプレートリーダーで測定することもできる。当業者は、これらのリポーター遺伝子がどのように機能し、それらが遺伝子送達系にどのように導入できるかを熟知している。本書で説明する方法に基づき送達される核酸とその生成物、タンパク質、ペプチド、またはその他の生体分子、ならびにこれらの生体分子により変調された標的は、免疫蛍光性の検出または酵素免疫細胞学、オートラジオグラフィー、あるいはin situハイブリダイゼーションなど、様々な方法を用いて測定できる。免疫蛍光法を用いてコードされたタンパク質の発現を検出する場合には、標的タンパク質と結合する蛍光標識抗体が用いられる（例えば、タンパク質への抗体の結合に適した条件下で蛍光標識抗体をスライドに添加する）。続いて、蛍光信号を検出することで、タンパク質を含有する細胞が特定される。送達された分子に遺伝子発現の変調機能があれば、標的遺伝子の発現レベルをオートラジオグラフィー、in situハイブリダイゼーション、およびin situ PCRなどの方法によっても測定できる。しかし、具体的な同定方法は、送達された生体分子、それらの発現生成物、生体分子によって変調された標的、および／または生体分子の送達の結果得られる最終生成物によって異なる。
トランスフェクション試薬
Polysciences Inc.（米国ペンシルベニア州ワリントン市）より、分岐型PEI25K（Mw 25KDaのポリエチレンイミン）および直鎖PEI25K（Mw 25KDa）を購入した。Superfect（登録商標）（Qiagen、カリフォルニア州バレンシア市）の溶液を、製造者の指示に基づいて使用した。Life Technologies（メリーランド州ゲイサースバーグ市）より購入したトランスフェクション試薬LipofectAMINE（登録商標）を、製造者の指示に基づいて使用した。NDT-CP-B-1（分解性）およびNDT-CP-1（非分解性）は、PEI600（Mw 600 Da）を用いてポリマー性トランスフェクション試薬で異なるリンカーと合成した。NDT-LP-1は、ポリマーと脂質構造を同一分子上に持つ脂質−ポリマーである。NDTポリマー性トランスフェクション試薬の構造は、図35に示す通りである。
トランスフェクション可能表面の調製
ゼラチン系トランスフェクション混合液で調製したトランスフェクション可能表面
0.2%ゼラチン調製物
ゼラチン粉タイプB：225 Bloom（Sigma、カタログ#G-9391）を滅菌MilliQ水に加え、溶液を60°Cの湯浴で15分間静かに撹拌して溶解させた。続いて、0.2%ゼラチン液を室温で冷まし、まだ暖かい間（37〜40℃）に0.45 μmの細胞アセテート膜（CA）を通して濾過した。この溶液を100 ml調製し、濾過したゼラチン液を50 mlに分注して4℃で保管した。
ゼラチンを用いたトランスフェクション混合液の調製
すべてのトランスフェクション試薬を0.2%ゼラチン液で稀釈した。直鎖PEI25Kと特別に合成したポリマーサンプルの濃度は320.0 μg/mlから40.0 μg/ml、分岐型PEI25Kの濃度は160.0 μg/mlから20.0 μg/mlの範囲にあった。Superfect濃度は600.0 μg/mlから75.0 μg/ml、リポフェクタミン濃度は200.0 μg/mlから25.0 μg/mlの範囲にあった。ポリマーと脂質−ポリマー合成物（NDT）の濃度は、320.0 μg/mlから40.0 μg/mlの範囲にあった。
96ウエルプレートとトランスフェクション試薬−ゼラチン混合液を用いたトランスフェクション可能表面の作製
96ウエルプレートの各ウエルに25 μlのトランスフェクション／ゼラチン液を添加した。プレートを数秒間振って、底面全体がトランスフェクション／ゼラチン液で覆われるようにした。続いて、プレートを組織培養フード内で数時間（約5〜6時間）空気乾燥させた。乾いたプレートを4℃で保管したものを使用した（図2〜7）。
トランスフェクション試薬−ゼラチン混合液をガラススライド上に斑点状に塗布することによるトランスフェクション可能表面の作製
1〜4 μlのトランスフェクション／ゼラチン液を、PLLを塗布したスライドに斑点状に塗布した。スライドを清浄なフードに約1時間放置して完全に乾燥させた。乾いたプレートを4℃で保管したものを使用した（図20、21）。
ラミニン系トランスフェクション混合液を用いたトランスフェクション表面の調製
ラミニン（Sigma、カタログ#L2020）を最終濃度が40.0 μg/mlとなるまでPBSで稀釈し、4℃で保管した。
ラミニンを用いたトランスフェクション混合液の調製
すべてのトランスフェクション試薬を40.0 μg/mlラミニン液で稀釈した。直鎖PEI25Kと特別に合成したポリマーサンプルの濃度は320.0 μg/mlから40.0 μg/ml、分岐型PEI25Kの濃度は160.0 μg/mlから20.0 μg/mlの範囲にあった。Superfect濃度は600.0 μg/mlから75.0 μg/ml、リポフェクタミン濃度は200.0 μg/mlから25.0 μg/mlの範囲にあった。ポリマーと脂質−ポリマー合成物（NDT）の濃度は、320.0 μg/mlから40.0 μg/mlの範囲にあった。
96ウエルプレートとトランスフェクション試薬−ラミニン混合液を用いたトランスフェクション可能表面の作製
96ウエルプレートの各ウエルに25 μlのトランスフェクション／ラミニン液を添加した。プレートを数秒間振って、底面全体がトランスフェクション／ゼラチン液で覆われるようにした。続いて、プレートを組織培養フード内で数時間（約5〜6時間）空気乾燥させた。乾いたプレートを4℃で保管したものを使用した（図8〜13）。
トランスフェクション試薬−ラミニン混合液をガラススライド上に斑点状に塗布することによるトランスフェクション可能表面の作製
1〜4 μlのトランスフェクション／ゼラチン液を、PLLを塗布したスライドに斑点状に塗布した。スライドを清浄なフードに約1時間放置して完全に乾燥させた。乾いたプレートを4℃で保管したものを使用した（図22、23）。
コラーゲン系トランスフェクション混合液を用いたトランスフェクション表面の調製
コラーゲン（Sigma、カタログ#C8919）を最終濃度が120.0 μg/mlとなるまでPBSで稀釈し、4℃で保管した。
ラミニンを用いたトランスフェクション混合液の調製
すべてのトランスフェクション試薬を120.0 μg/mlのコラーゲン液で稀釈した。直鎖PEI25Kと特別に合成したポリマーサンプルの濃度は320.0 μg/mlから40.0 μg/ml、分岐型PEI25Kの濃度は160.0 μg/mlから20.0 μg/mlの範囲にあった。Superfect濃度は600.0 μg/mlから75.0 μg/ml、リポフェクタミン濃度は200.0 μg/mlから25.0 μg/mlの範囲にあった。ポリマーと脂質−ポリマー合成物（NDT）の濃度は、320.0 μg/mlから40.0 μg/mlの範囲にあった。
96ウエルプレートとトランスフェクション試薬−コラーゲン混合液を用いたトランスフェクション可能表面の作製
96ウエルプレートの各ウエルに25 μlのトランスフェクション／コラーゲン液を添加した。プレートを数秒間振って、底面全体がトランスフェクション／コラーゲン液で覆われるようにした。続いて、プレートを組織培養フード内で数時間（約5〜6時間）空気乾燥させた。乾いたプレートを4℃で保管したものを使用した（図14〜16）。
ゼラチン／ラミニン系トランスフェクション混合液を用いたトランスフェクション表面の調製
ラミニン（Sigma、カタログ#L2020）を最終濃度が40.0 μg/mlとなるまで0.2%ゼラチンで稀釈し、4℃で保管した。
ゼラチンとラミニンを用いたトランスフェクション混合液の調製
すべてのトランスフェクション試薬を40.0 μg/mlのラミニン／0.2%ゼラチン液で稀釈した。直鎖PEI25Kと特別に合成したポリマーサンプルの濃度は320.0 μg/mlから40.0 μg/ml、分岐型PEI25Kの濃度は160.0 μg/mlから20.0 μg/mlの範囲にあった。Superfect濃度は600.0 μg/mlから75.0 μg/ml、リポフェクタミン濃度は200.0 μg/mlから25.0 μg/mlの範囲にあった。ポリマーと脂質−ポリマー合成物（NDT）の濃度は、320.0 μg/mlから40.0 μg/mlの範囲にあった。
96ウエルプレートとトランスフェクション試薬−ゼラチン−ラミニン混合液を用いたトランスフェクション可能表面の作製
96ウエルプレートの各ウエルに25 μlのトランスフェクション／ゼラチン／ラミニン液を添加した。プレートを数秒間振って、底面全体がトランスフェクション／ゼラチン液で覆われるようにした。続いて、プレートを組織培養フード内で数時間（約5〜6時間）空気乾燥させた。乾いたプレートを4℃で保管したものを使用した（図17〜19）。
プラスミドDNAの調製
標準的なDNA組換えプロトコルに従って、プラスミドpCMV-GFPとpCMV-lucを作製した。緑色蛍光タンパク質（GFP）とホタルルシフェラーゼ遺伝子cDNAをヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターで制御し、遺伝子発現促進剤であるニワトリβ−グロブリン・イントロンで転写物を安定化させた。プラスミドをDH5α大腸菌で増幅し、Qiagen Plasmid Max調製キットを製造者の指示に従って操作して純化した。純化プラスミドDNAの量と質を、260および280 nmでの分光学的分析、ならびに0.8%アガロースゲルでの電気泳動法を用いて評価した。純化プラスミドDNAは、滅菌ddH2Oに溶解し、-20℃で保管した。
DMEMを用いたDNA液の調製
pCMV-GFPまたはpCMV-lucプラスミドを、最終濃度が10 μg/ml になるようにDMEMで稀釈した。96ウエルプレートまたはガラススライドのトランスフェクション可能表面に30 μlのDNA液を添加し、室温で20〜30分培養した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製
ノーザンカロライナ大学のコール博士が開発したルシフェラーゼ705リポーター遺伝子系（Kang SHら Biochemistry 1998; 37 (18): 6235-9）を用いた。この系は、ヒトβ−グロブリンを705で変異させたものを、ルシフェラーゼcDNA配列内に挿入したものである。このプラスミドをHeLa細胞内に導入し、安定した遺伝子発現を起こさせた。この細胞株を、HeLa luc705と称する。スプライシングを誤った遺伝子生成物（ルシフェラーゼ）は活性を示さないため、通常これらの細胞のルシフェラーゼ活性は低い。しかし、705配列に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって誤スプライシング・サイトが遮断されるため、生物学的活性を持つルシフェラーゼタンパク質が生成される。ルシフェラーゼ705は、アンチセンスオリゴヌクレオチド送達効率を評価するための機能モデルとして用いられる。ルシフェラーゼ活性が高いことは、アンチセンス送達効率がより高いことを示す。
本研究では、luc705配列と結合する18nt 2’−O−メチル−ホスホロチオエート オリゴヌクレオチドを合成した。この配列は、CCUCUUACCUCAGUUACAである。アンチセンスオリゴをopti-MEMで稀釈し、最終濃度を0.6 μmol/Lに調製した。30 μlのアンチセンスオリゴを前述した各ウエルのトランスフェクション可能表面に添加し、室温で25分培養した（図24）。
siRNAの調製
siRNAは21〜25 bpの二本鎖RNA断片であり、標的mRNAと結合してmRNAを破壊することで遺伝子発現レベルのダウンレギュレーションを行う機能を持つ。この実験では、ルシフェラーゼプラスミド、ならびにルシフェラーゼ遺伝子を標的とするsiRNA合成カセットをopti-MEMを用いて調製し、前述したトランスフェクション可能プレートに添加して２５分培養した。ルシフェラーゼプラスミドの量は一ウエル当たり0.5 μg、siRNA合成カセットの量は一ウエル当たり約0.5 μgであった（図25）。
Tatペプチドの送達
0.2%ゼラチン液を用いて様々な濃度（一ウエル当たり50、25、12.5、6.3 μg）のビオチン標識Tatペプチドを調製し、96ウエルプレートの異なるウエルにそれぞれ塗布した。続いて、プレートを細胞培養フード内に数時間放置して乾燥させた。ペプチドを塗布したプレートに一ウエル当たり1.5 x 104個のHeLa細胞を播種し、37℃で4時間培養した。細胞は、0.2%グルタルアルデヒド／PBSに5分間晒して固定させた後、10%メタノールで処理した。10%血清を添加して37℃で30分遮断した後、細胞をストレプトアビジン−FITCとともに37℃で30分培養した。続いて、細胞をPBSで洗浄し、蛍光顕微鏡で蛍光信号を観察した。ペプチドが細胞内にうまく送達されていれば、ビオチン共役ペプチドがストレプトアビジン−FITCと結合し、ペプチドが蛍光信号を生成できるようになる。細胞内のFITC信号の増加は、細胞内により多くのペプチドが運ばれたことを示す（図26）。
トランスフェクション混合液中の標的部分がトランスフェクション可能表面系の媒介による遺伝子搬送に与える影響
トランスフェリン共役ポリ−L−リジンの調製
トランスフェリンは、トランスフェリンレセプターの媒介によるエンドサイトーシス経路において肝細胞に吸収され得る。トランスフェリンは、肝細胞内への遺伝子送達効率を向上させる有効な細胞標的分子としての機能が報告されている（Wagner E, Ogris M, Zauner W. Adv Drug Deliv Rev 1998; 30 (1-3): 97-113）。
標的分子（トランスフェリン）がラミニン系トランスフェクション混合液系における陽イオン性ポリマートランスフェクション試薬の媒介による遺伝子搬送に与える影響
この実験では、トランスフェリンと共役させたポリ−L−リジン（PLL-T）を25 μl取り、40.0 μg/mlのラミニンを塗布した96ウエルプレートに塗布した。対照物として、ポリ−L−リジン（PLL）を用いた。PLL-TとPLLの濃度は、320.0 μg/mlから40.0 μg/mlの範囲にあった。プレートを空気乾燥させた後、25 μlのルシフェラーゼプラスミド液（20.0 μg/ml、ポリマーとDNAの比率は16:1から2:1）をプレートに添加し、室温で25分培養した。乾いたプレートを関連実験に使用した（図27）。
トランスフェクション混合液中の膜不安定化成分がトランスフェクション可能表面系の媒介による遺伝子搬送に与える影響
VSVGは膜不安定化作用を持つウイルスエンベロープタンパク質であり、細胞の膜融合および膜破壊を起こす。VSVGは、陽イオン性ポリマー（PLL）の媒介による遺伝子トランスフェクションを大幅に増加することができる遺伝子トランスフェクション促進剤として用いられている。VSVGタンパク質の細胞融合ドメイン内からペプチドを合成した。このペプチドの配列はRRRQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDARRRで、ペプチドの可溶性を向上させるために、CとNの各終端にアミノ酸アルギニンが付加されている。
VSVGペプチドとポリ−L−リジンを40.0 μg/mlのラミニンで稀釈した。VSVGペプチドの濃度は1.0 mg/ml、PLLの濃度は640 μg/mlから160.0 μg/mlの範囲にあった。対照グループとして、PLLだけをラミニン液で任意の濃度に稀釈したものを用いた。PLLまたはPLL+VSVGペプチド液25 μlを96ウエルプレート内に添加し、空気乾燥させた。PLLの量は、一ウエル当たりそれぞれ16.0、8.0、4.0 μgであった（図28）。
トランスフェクション混合液中の細胞減少性試薬がトランスフェクション可能表面系の媒介による遺伝子搬送に与える影響
グルタミンは、アンモニアによる細胞毒性から細胞を保護する細胞減少性試薬である（Nakamura E, Hagen S J. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol 283 G1264-1275, (2002)）。ほぼすべての陽イオン性ポリマーまたは陽イオン性脂質にはアミン基が含まれているため、トランスフェクション可能表面の調製用にグルタミンをトランスフェクション混合液に添加することで、トランスフェクションによる細胞毒性が防止できる。グルタミン（100 mmol/L）と各種トランスフェクション試薬（NDT-CP-B-1、NDT-CP-1、Superfect、リポフェクタミン2000）を0.2%ゼラチン液で稀釈し、グルタミン／トランスフェクション試薬／ゼラチンを含む溶液25 μlを96ウエルプレート内に添加した後、プレートを空気乾燥させた。続いて、opti-MEM（20.0 μg/ml）中のGFPプラスミド液25μlを各ウエルに添加し、室温で25分培養した。乾いたプレートを使用した（図32）。
トランスフェクション混合液中の細胞付着試薬がトランスフェクション可能表面系の媒介による遺伝子搬送に与える影響
ラミニンは、細胞の増殖と分化を支えるマトリックスである。ラミニンは、細胞付着試薬として一般に用いられている。この実験では、0.2%ゼラチン、または0.2%ゼラチンと40.0 μg/mlラミニンの混合液を用いてNDT-CP-B-1、NDT-CP-1、NDT-LP-1、NDT-LP-2、Superfectおよびリポフェクタミン2000の各トランスフェクション試薬を稀釈し、得られた溶液25 μlを96ウエルプレート内に添加した。各ウエル内のNDTポリマーの量は、それぞれ8、4、または2 μgであった。Superfectの量は、一ウエル当たりそれぞれ15、7.5、3.8 μgであった。リポフェクタミン2000の量は、一ウエル当たりそれぞれ2.5、1.25、0.63 μgであった。プレートを空気乾燥させた後、Opti MEM（20.0 μg/ml）中のGFPプラスミド液25μlを各ウエルに添加し、室温で25分培養した。その後、プレートの各ウエルに5 x 104個の293細胞を播種した。これらの細胞は、さらに37°Cで24時間培養された。トランスフェクション効率および細胞毒性を蛍光顕微鏡とMTTアッセイを用いて分析した（図33）。
細胞の培養
10%ウシ胎仔血清、100単位/mlのペニシリン、および100 μg/ml のストレプトマイシンを含むDMEM（Gibco）中にHEK 293T細胞を維持した。この培地中の細胞の倍加時間は約20時間であり、過度の密集を避けるために細胞を3〜4日間ごとに分けた。
HeLa 705細胞株は、突然変異β−グロブリンイントロンを持つホタルルシフェラーゼ遺伝子（705位で変異させたもの）を導入したヒト子宮頚癌HeLa細胞からのものである。突然変異β−グロブリンイントロンは、間違ったスプライシングにより突然変異ルシフェラーゼタンパク質を生成する。ただし、誤スプライシングサイトが遮断された後は、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドによって、突然変異イントロンを修正してもよい（Kang SHら Biochemistry 1998; 37 (18): 6235-9）。この細胞株を、10%ウシ胎仔血清、100単位/mlのペニシリン、および100 μg/ml のストレプトマイシンを含むDMEM（Gibco）中に維持した。luc-705プラスミドを維持するために、培地中に200 μg/ml のハイグロマイシンを添加した。この培地中の細胞の倍加時間は約20時間であり、過度の密集を避けるために細胞を3〜4日間ごとに分けた。
ヒト肝腫瘍細胞株であるHepG2を、10%ウシ胎仔血清、100単位/mlのペニシリン、および100 μg/ml のストレプトマイシンを含むαMEM培地（Gibco）中に維持した。この培地中の細胞の倍加時間は約20時間であり、過度の密集を避けるために細胞を3〜4日間ごとに分けた。
ヒト初代内皮細胞であるHUV-EC細胞株を、10%ウシ胎仔血清、100単位/mlのペニシリン、100 μg/ml のストレプトマイシン、ならびに製造業者の指示に基づく各種成長因子を含むEBM培地（Cambrex Corp.）中で成長させ、維持した（図29、30）。
細胞の調製とトランスフェクション可能表面への播種
トランスフェクションを実施する直前に、次の手順に従って細胞培養フード内で10 cmのディッシュから細胞を採取した。
a. 培地を除去し、細胞を2 mlのPBSですすぎ、溶液をプレート上に展着させた後、溶液を直ちに除去した。
b. 0.5 mlのトリプシン−EDTAを細胞に添加し、プレート上に均一に展着させた後、トリプシン−EDTAを直ちに除去した。
c. 細胞をフード内に3〜5分放置した。続いてプレートを攪拌し、プレート表面から細胞を分離させた。
d. 細胞が付着したプレートに37℃の完全培地6 mlを添加し、10 mlのピペットを用いて過剰な泡立ちを抑えながら溶液の吸い取りと吐き出しを12〜15回繰り返し、単細胞浮遊液を得た。さらに培地を14 ml添加し、細胞を溶液中に完全に浮遊させた。
e. 血球計数器を用いて細胞を定量化した。
f. HEK 293TとHepG2細胞を滅菌深皿内で稀釈して最終濃度が一ウエル当たり4〜5 x 105個となるようにし、100 μl（細胞4〜5 x 104個に相当）を96ウエルプレートの各ウエル内に播種した。HeLa 705とHUV-EC細胞の最適濃度は、1〜2 x 105個/mlであった。
GFPリポーター遺伝子トランスフェクション・アッセイ
緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を初期スクリーニングに使用した。トランスフェクション実施後、細胞内のGFP信号を蛍光顕微鏡（オリンパス、フィルター520 nm）で観察した。10倍の対物レンズを用いて細胞の顕微鏡写真を撮影した。最適な陽イオン性ポリマーの量を求めるために、トランスフェクション後の培養液中のGFP信号を有する細胞の割合を3つの領域の計数値から決定した。
ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼ活性の測定は、製造者の指示に基づく化学蛍光アッセイによって行った（Luciferase Assay System: Promega、米国ウィスコンシン州マディソン市）。遺伝子搬送から30時間後、細胞をPBSで2回すすぎ、続いて細胞溶解緩衝剤（1% Triton X-100、100 mM K3PO4、2 mMジチオスレイトール、10%グリセロール、2 mM EDTA pH 7.8）を用いて室温で15分溶解した。次に、10 μlの細胞溶解物と50 μlのルシフェラーゼアッセイ試薬を光度計内でインジェクターを用いて室温で混合した。10秒間の光の放射を3回測定し、RLU（相対光量単位）で示した。相対光量単位（RLU）は、BSAタンパク質アッセイ（Pierce、イリノイ州ロックフォード市）で決定した各サンプルのタンパク質含有量に基づいて正規化した。すべての実験は、それぞれ3回実施した。
細胞毒性アッセイ−MTTアッセイ
哺乳類の細胞に対するトランスフェクション試薬の細胞毒性を、3−[4,5ジメチルチアゾール−2−イル]−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）法を用いて評価した。トランスフェクションから40時間後、10 μlのMTT液（5.0 mg/ml、Sigma）を各ウエルに添加し、3時間培養した。続いて培地を除去し、200 μlのDMSOを添加してホルマザン結晶を溶解した。この溶液の吸光度を570 nmで測定した。細胞生存度を、次の式を用いて計算した：生存度（%）＝｛Abs570（サンプル）/Abs570（対照物）｝x 100（図31）。
安定性試験
LPEI、BPEI、NDT-CP-B-1、NDT-CP-1、Superfect、およびリポフェクタミンを含んだ0.2%ゼラチン液を、前述の方法で96ウエルプレートに塗布した。プレートを空気乾燥させた後、37℃で9日間培養した。培養後のプレートを使用した。プレートに一ウエル当たり25 μlのルシフェラーゼプラスミド（最適MEM中、20.0 μg/ml）を（37℃での培養期間の前後に）添加し、25分培養した。5 x 104個の293細胞をプレート内に播種し、37℃で48時間培養した。フラッシュプレート、または37℃で9日間培養したプレートのトランスフェクション可能表面について、その遺伝子トランスフェクション効率を比較した（図34）。
本発明は、特に好ましい実施形態に言及しながら示し、説明したが、当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなくその形態または細部に様々な変更を加えることが可能であることを理解するであろう。本書中のすべての引用文献は、参照により本書に取り込まれるものとする。
図1は、トランスフェクション可能細胞培養装置またはスライドを用いたトランスフェクションアッセイの概略図である。 図2は、様々な陽イオン性ポリマー−ゼラチン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのGFPリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。図には、直鎖PEI、NDT-CP-B-1、およびNDT-CP-1の量が示されている。Superfectの量は、一ウエル当たりそれぞれ15、7.5、3.75 μgである。GFP遺伝子トランスフェクション効率の範囲は約30〜35%で、NDT-CP-1が一番高い効率を示した。 図3は、様々な陽イオン性ポリマー−ゼラチン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのルシフェラーゼリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。直鎖PEI、NDT-CP-B-1、およびNDT-CP-1の量は、一ウエル当たりそれぞれ8、4、2、1 μgである。Superfectの量は、一ウエル当たりそれぞれ15、7.5、3.75 μgである。すべてのサンプルにおいて、ルシフェラーゼ活性はタンパク質一ミリグラム当たり5 x 107 RLUを上回った。 図4は、様々な陽イオン性脂質−ポリマー−ゼラチン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのGFPリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。脂質−ポリマーの量は、一ウエル当たりそれぞれ8、4、2 μgである。試験で用いた脂質−ポリマー・トランスフェクション試薬でのGFPトランスフェクション効率は、20〜25%に達した。 図5は、様々な陽イオン性脂質−ポリマー−ゼラチン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのルシフェラーゼリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。脂質−ポリマー−ゼラチン・トランスフェクション混合液系でのNDT-LP-2のルシフェラーゼ活性は、タンパク質一ミリグラム当たり106RLUを上回った。 図6は、陽イオン性脂質−ゼラチン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのGFPリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。96ウエルプレート式システムにおけるリポフェクタミン2000−ゼラチン・トランスフェクション混合液の媒介によるトランスフェクション効率は、最高30%に達した。 図7は、陽イオン性脂質−ゼラチン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのルシフェラーゼリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。脂質−ゼラチン・トランスフェクション混合液系におけるリポフェクタミン2000のルシフェラーゼ活性は、タンパク質一ミリグラム当たり最高107RLU近くに達した。 図8は、陽イオン性ポリマー−ラミニン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのGFPリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。図には、NDT-CP-1とNDT-CP-B-1の量が示されている。Superfectの量は、一ウエル当たりそれぞれ15、7.5 μgである。陽イオン性ポリマー−ラミニン系より媒介されるGFPトランスフェクション効率は、最高50%に達している。 図9は、陽イオン性ポリマー−ラミニン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのルシフェラーゼリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。図には、NDT-CP-1とNDT-CP-B-1の量が示されている。Superfectの量は、一ウエル当たりそれぞれ15、7.5、3.75 μgである。陽イオン性ポリマー−ラミニン系におけるルシフェラーゼ活性は、タンパク質一ミリグラム当たり最高108 RLUに達した。 図10は、陽イオン性脂質−ポリマー−ラミニン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのGFPリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。脂質ポリマーの量は、それぞれ8、4、2 μgである。脂質−ポリマー−ラミニン・トランスフェクション混合液系により媒介されたGFPトランスフェクション効率は、最高45%に達した。 図11は、陽イオン性脂質−ポリマー−ラミニン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのルシフェラーゼリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。図には、脂質−ポリマーの量が示されている。脂質−ポリマー−ラミニン・トランスフェクション混合液系におけるルシフェラーゼ活性は、タンパク質一ミリグラム当たり最高8 x 107 RLUに達した。 図12は、陽イオン性脂質−ラミニン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのGFPリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。リポフェクタミン−ラミニン・トランスフェクション混合液系の媒介によるトランスフェクション効率は、最高45%に達した。 図13は、陽イオン性脂質−ラミニン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのルシフェラーゼリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。リポフェクタミン2000−ラミニン・トランスフェクション混合液系におけるルシフェラーゼ活性は、タンパク質一ミリグラム当たり最高1.5 x 107 RLUに達した。 図14は、陽イオン性ポリマー−コラーゲン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのGFPリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。図には、NDT-CP-1とNDT-CP-B-1の量が示されている。Superfectの量は、一ウエル当たりそれぞれ15、7.5 μgである。陽イオン性ポリマー−コラーゲン・トランスフェクション混合液系の媒介によるGFPトランスフェクション効率は、最高40%に達した。 図15は、陽イオン性脂質−ポリマー−コラーゲン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのGFPリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。脂質−ポリマーの量は、一ウエル当たりそれぞれ8、4、2 μgである。陽イオン性脂質−ポリマー−コラーゲン・トランスフェクション混合液系の媒介によるトランスフェクション効率は、最高35%に達した。 図16は、陽イオン性脂質−コラーゲン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのGFPリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。リポフェクタミン2000−ゼラチン・トランスフェクション混合液系の媒介によるときと同様に、陽イオン性脂質−コラーゲン・トランスフェクション混合液系の媒介によるトランスフェクション効率も最高35%に達した。 図17は、陽イオン性ポリマー−ゼラチン−ラミニン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのGFPリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。図には、NDT-CP-1とNDT-CP-B-1の量が示されている。Superfectの量は、一ウエル当たりそれぞれ15、7.5 μgである。陽イオン性ポリマー−ゼラチン−ラミニン・トランスフェクション混合液系の媒介によるGFPトランスフェクション効率は、最高42%に達した。 図18は、陽イオン性脂質−ポリマー−ゼラチン−ラミニン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのGFPリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。脂質−ポリマーの量は、一ウエル当たりそれぞれ8、4、2 μgである。陽イオン性脂質−ポリマー−ゼラチン−ラミニン・トランスフェクション混合液系の媒介によるGFPトランスフェクション効率は、最高40%に達した。 図19は、陽イオン性脂質−ゼラチン−ラミニン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能表面の使用が96ウエルプレート式細胞培養装置システム内における923細胞へのGFPリポーター遺伝子のトランスフェクションに与える影響を示したものである。陽イオン性脂質−ゼラチン−ラミニン・トランスフェクション混合液系の媒介によるトランスフェクション効率は、最高30%に達した。 図20は、陽イオン性ポリマー（NDT-CP-1）−ゼラチンまたは陽イオン性脂質（リポフェクタミン2000）−ゼラチン・トランスフェクション混合液を斑点状に塗布したトランスフェクション可能ガラススライドシステムを用いた923細胞へのGFPリポーター遺伝子のトランスフェクションアッセイを示したものである。トランスフェクション可能スライドは、GFPプラスミド液内に水没させた。スライド全体がGFPプラスミド液で覆われたが、トランスフェクション混合液を塗布した斑点部分の細胞だけがGFP信号を示した。これは、トランスフェクション試薬がガラススライド上に拡散せずに確実に固定されたことを示している。これらの結果は、本技術がトランスフェクションアレイ用途に有効であることを示しており、この技術を用いれば、ゲノム機能研究用または遺伝子薬剤開発（アンチセンスODNまたはsiRNA）用の細胞系トランスフェクションアッセイによる数千個もの標的遺伝子または遺伝子薬剤のスクリーニングが可能になる。 図21は、陽イオン性ポリマー（NDT-CP-1）−ゼラチンまたは陽イオン性脂質（リポフェクタミン2000）−ゼラチン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能ガラススライドシステムを用いた923細胞へのGFPリポーター遺伝子のトランスフェクションアッセイを示したものである。トランスフェクション可能スライドには、1〜4 μlのGFPプラスミド（20 μg/ml）液を斑点状に塗布してスライドを空気乾燥させることで、GFPプラスミドDNAを装填した。続いて、ガラススライドを6ウエルプレートの底に置き、293細胞を播種した。GFP信号は、蛍光顕微鏡を用いて分析した。GFPプラスミドDNAの斑点がある部分のみが緑色の蛍光信号を示したが、これは、トランスフェクション混合液を斑点状に塗布したガラス表面にプラスミドDNAが確実に固定されたことを示している。これは、本技術がトランスフェクションアレイ用途に有効であることを示しており、この技術を用いれば、ゲノム機能研究（cDNAライブラリのスクリーニング）または遺伝子薬剤開発（アンチセンスODNまたはsiRNA）用の細胞系トランスフェクションアッセイによる数千個もの標的遺伝子または遺伝子薬剤のスクリーニングが可能になる。 図22は、陽イオン性ポリマー（NDT-CP-1）−ラミニンまたは陽イオン性脂質（リポフェクタミン2000）−ラミニン・トランスフェクション混合液を斑点状に塗布したトランスフェクション可能ガラススライドシステムを用いた923細胞へのGFPリポーター遺伝子のトランスフェクションアッセイを示したものである。トランスフェクション可能スライドは、GFPプラスミド液内に水没させた。スライド全体がGFPプラスミド液で覆われたが、トランスフェクション混合液を塗布した斑点部分の細胞だけがGFP信号を示した。これは、トランスフェクション試薬がガラススライド上に拡散せずに確実に固定されたことを示している。これらの結果は、本技術がトランスフェクションアレイ用途に有効であることを示しており、この技術を用いれば、ゲノム機能研究用または遺伝子薬剤開発（アンチセンスODNまたはsiRNA）用の細胞系トランスフェクションアッセイによる数千個もの標的遺伝子または遺伝子薬剤のスクリーニングが可能になる。 図23は、陽イオン性ポリマー（NDT-CP-1）−ラミニンまたは陽イオン性脂質（リポフェクタミン2000）−ラミニン・トランスフェクション混合液を塗布したトランスフェクション可能ガラススライドシステムを用いた923細胞へのGFPリポーター遺伝子のトランスフェクションアッセイを示したものである。トランスフェクション可能スライドには、1〜4 μlのGFPプラスミド（20 μg/ml）液を斑点状に塗布してスライドを空気乾燥させることで、GFPプラスミドDNAを装填した。続いて、ガラススライドを6ウエルプレートの底に置き、293細胞を播種した。GFP信号は、蛍光顕微鏡を用いて分析した。GFPプラスミドDNAの斑点がある部分のみが緑色の蛍光信号を示したが、これは、トランスフェクション混合液を斑点状に塗布したガラス表面にプラスミドDNAが確実に固定されたことを示している。これは、本技術がトランスフェクションアレイ用途に有効であることを示しており、この技術を用いれば、ゲノム機能研究（cDNAライブラリのスクリーニング）または遺伝子薬剤開発（アンチセンスODNまたはsiRNA）用の細胞系トランスフェクションアッセイによる数千個もの標的遺伝子または遺伝子薬剤のスクリーニングが可能になる。 図24は、トランスフェクション試薬−ラミニン混合液の使用が96ウエル式細胞培養装置内におけるHeLa 705 Luc細胞へのアンチセンスODNのトランスフェクションに与える影響を示したものである。この結果から、陽イオン性ポリマー−ラミニン・トランスフェクション混合液、脂質−ポリマー−ラミニン混合液、または脂質−ラミニン・トランスフェクション混合液系から構成されるトランスフェクション可能表面は、標的RNAに対する顕著な遮断効果を持つことが分かる。これは、この方法を用いればプラスミドだけでなくオリゴヌクレオチドも哺乳類の細胞内へ効果的に送達できることを示唆している。 図25は、トランスフェクション試薬−ラミニン混合液の使用が96ウエル式細胞培養装置内における293細胞へのsiRNAの送達に与える影響を示したものである。非siRNA対照グループと比較すると、陽イオン性ポリマー−ラミニン・トランスフェクション混合液、脂質−ポリマー−ラミニン混合液、または脂質−ラミニン・トランスフェクション混合液系から構成されるトランスフェクション可能表面は、標的RNAに対する顕著な遮断効果を持つことが分かる。これは、この方法を用いればプラスミドだけでなくsiRNAも哺乳類の細胞内へ効果的に送達できることを示唆している。 図26は、HeLa細胞内におけるTatペプチド信号分析の代表的な結果を示したものである。図26Aでは、ゼラチンマトリックスを用いてTatを固体表面に塗布した場合を示している。図26Bは、非Tat対照グループを示す。Tatを塗布したグループでは、約60〜80%の細胞がFITC信号を示した。これは、本発明の実施の形態によれば、核酸だけでなくペプチドも細胞内へ送達できることを示している。 図27は、陽イオン性ポリマー（PLL）−ラミニン・トランスフェクション混合液の媒介によるトランスフェクション可能表面技術を用いた96ウエル式細胞培養装置システム内でのHepG2細胞への遺伝子搬送に標的分子（トランスフェリン）が与える影響を示したものである。この結果は、標的分子（トランスフェリン）をPLL−ラミニン系トランスフェクション可能表面系に導入することで、トランスフェクション効率が大きく向上することを示している。 図28は、陽イオン性ポリマー（PLL）−ラミニン・トランスフェクション混合液の媒介によるトランスフェクション可能表面技術を用いた96ウエル式細胞培養装置システムでの293細胞への遺伝子搬送に膜撹乱ペプチド（VSVGペプチド）が与える影響を示したものである。この結果は、膜撹乱ペプチド（VSVGペプチド）をPLL−ラミニン系トランスフェクション可能表面系に導入することで、トランスフェクション効率が大きく向上することを示している。 図29は、トランスフェクション試薬−ラミニン混合液が96ウエル式細胞培養装置内におけるHUV-EC細胞へのGFPリポーター遺伝子の送達に与える影響を示したものである。NDT-CP-1のGFPトランスフェクション効率は約20%で、Superfectの効率は約15%であった。リポフェクタミンのトランスフェクション効率は極めて低かった（1.0%未満）。これは、陽イオン性ポリマー−ラミニン・トランスフェクション混合液系によって、293、HeLa、HepG2などの形質転換細胞株だけでなく初代細胞もトランスフェクションできることを示している。 図30は、トランスフェクション試薬−ラミニン混合液が96ウエル式細胞培養装置内におけるHUV-EC細胞へのルシフェラーゼリポーター遺伝子の送達に与える影響を示したものである。NDT-CP-1のトランスフェクション効率とSuperfectトランスフェクション効率は、タンパク質一ミリグラム当たりそれぞれ12.6 x 107、8.26 x 106 RLUであった。リポフェクタミン2000は、陽イオン性ポリマー−ラミニン混合液系と比べて効率が低かった。これは、本発明の実施の形態により、初代細胞への異なる遺伝子のトランスフェクションが可能であることを裏付けている。 図31は、トランスフェクション試薬−ゼラチンを塗布した96ウエルプレート内におけるトランスフェクション後の293細胞の生存率を示したものである。すべてのサンプルは、高い生存率（65%を超える）を示した。これは、本書に説明する方法で用いるトランスフェクション試薬の細胞毒性が許容レベルであることを示している。 図32は、細胞減少性試薬（グルタミン）をトランスフェクション試薬−ラミニン系トランスフェクション可能表面に導入することが293細胞内での細胞毒性の減少に与える影響を示したものである。「Non」はグルタミンを導入しないサンプル、「G」はグルタミンを導入したサンプルを示す。この結果は、グルタミン（細胞減少性試薬）を導入したグループは、グルタミンを導入しないグループと比べてトランスフェクション細胞毒性が大幅に減少したことを示した。これは、トランスフェクション試薬およびトランスフェクション手順に起因する細胞毒性の減少において、細胞減少性試薬が優れた候補であることを示している。 図33は、細胞付着試薬および細胞刺激試薬（ラミニン）をトランスフェクション試薬−ゼラチン系トランスフェクション可能表面に導入することが293細胞内での細胞毒性の減少に与える影響を示したものである。「L」はラミニンを導入したサンプル、「Non」はラミニンを導入しないサンプルを示す。この結果は、ラミニンのような細胞付着試薬を用いれば、トランスフェクション可能表面技術を利用したシステムにおけるトランスフェクション試薬およびトランスフェクション手順に起因する細胞毒性が大幅に減少することを示している。 図34は、安定性試験におけるトランスフェクション可能表面の保存期間の評価を示したものである。この結果から、新しく作製したトランスフェクション可能表面と37℃で9日間処理したトランスフェクション可能表面の間には、トランスフェクション性能に大きな差がないことが分かる。これは、トランスフェクション可能表面の保存期間が4℃で保存した場合1.5年間であるを示している。 図35は、NDT合成ポリマーと脂質−ポリマーの構造を示した表である。

Claims (26)

  1. (a) 陽イオン性ポリマーまたは脂質を少なくとも部分的に塗布した固体表面を作製する工程、(b) 真核細胞に導入する生体分子を前記固体表面上に添加する工程、および (c) 十分な濃度と適切な条件下で前記固体表面上に細胞を播種することで前記生体分子を前記真核細胞内に導入する工程を有する、生体分子の真核細胞への生体外導入方法。
  2. 前記固体表面がフラスコ、ディッシュ、マルチウエルプレート、ガラススライド、および植え込み型装置からなる群より選択される請求項1の方法。
  3. 前記固体表面に脂質−ポリマーが塗布されている請求項1の方法。
  4. 前記ポリマーまたは脂質が、細胞標的部分、細胞内標的部分、膜不安定化成分、および一以上のトランスフェクション促進剤からなる群より選択される追加試薬を含む請求項1の方法。
  5. 前記陽イオン性ポリマーまたは脂質を前記固体表面上に均一に展着させる、あるいは前記表面上の不連続の部位に前記陽イオン性ポリマーまたは脂質を斑点状に塗布することで前記表面に固定させる請求項1の方法。
  6. 前記陽イオン性ポリマーまたは脂質が、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、多糖類、ポリマー、およびこれらの混合物からなる群より選択されるマトリックス試薬を含む請求項１の方法。
  7. 前記タンパク質が、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ウシ血清アルブミン、またはそれらの混合物から選択される請求項６の方法。
  8. 前記ポリマーが、ヒドロゲル、生物分解性ポリマー、および生物適合性物質から選択される請求項６の方法。
  9. 前記陽イオン性ポリマーまたは脂質が、細胞減少性試薬、細胞結合試薬、細胞成長試薬、細胞刺激試薬、および細胞抑制試薬からなる群より選択される細胞培養試薬を含む請求項1の方法。
  10. 前記固体表面が、スライドまたはマルチウエル・プレートから選択される請求項1の方法。
  11. 前記真核細胞が哺乳類の細胞である請求項1の方法。
  12. 前記哺乳類の細胞が分裂細胞または非分裂細胞である請求項11の方法。
  13. 前記哺乳類の細胞が形質転換細胞または初代細胞である請求項11の方法。
  14. 前記哺乳類の細胞が体細胞または幹細胞である請求項11の方法。
  15. 前記真核細胞が植物の細胞である請求項1の方法。
  16. 前記陽イオン性ポリマーまたは脂質を手動でまたは自動機構を用いて前記固体表面上に均一に展着させる、あるいは前記陽イオン性ポリマーまたは脂質を手動でまたは自動機構を用いて前記固体表面上に斑点状に塗布することで前記表面に固定させる請求項１の方法。
  17. 前記生体分子が、DNA、RNA、およびDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される請求項１の方法。
  18. 前記生体分子が、直鎖分子、プラスミド、および一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）からなる群より選択される請求項１の方法。
  19. 前記生体分子が、一本鎖RNA（リボザイム）または二本鎖RNA（siNRA）から選択される請求項1の方法。
  20. 前記真核細胞が昆虫の細胞である請求項1の方法。
  21. (a) 上記の請求項のいずれかの方法を用いて前記生体分子を前記細胞内に導入する工程、および (b) 前記生体分子が前記細胞に送達されたかどうかを検出する工程を有する、生体分子が細胞内に進入できるかどうかを決定する方法。
  22. 前記生物分子が、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、糖類、多糖類、および有機化合物からなる群より選択される請求項21の方法。
  23. 前記細胞が、植物細胞、昆虫細胞、および細菌細胞からなる群より選択される請求項21の方法。
  24. 前記陽イオン性ポリマーまたは脂質が、前記表面上に手動でまたは自動機構を用いて固定される請求項1の方法。
  25. 前記検出が、前記生体分子、前記生体分子の生成物、生体分子の活性、前記生体分子の生成物の活性、標的分子、前記生体分子の触媒作用による生成物、または前記生体分子が制御する生成物を検出することで実現される請求項２１の方法。
  26. 前記生物分子が、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、糖類、多糖類、および有機化合物からなる群より選択される請求項１の方法。
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