JPH11505505A

JPH11505505A - ターゲッティングされた遺伝子輸送システム

Info

Publication number: JPH11505505A
Application number: JP8503295A
Authority: JP
Inventors: トゥルオング、バー・エル; オーガスト、トーマス; レオン、カム・ダブリュ
Original assignee: ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー
Priority date: 1994-06-27
Filing date: 1995-06-23
Publication date: 1999-05-21
Also published as: CA2193954A1; US6025337A; EP0769063A1; AU2946295A; US6410517B1; WO1996000295A1

Abstract

(57)【要約】ターゲット特異的遺伝子輸送システムが、表面に結合された結合部分又はターゲッティングリガンドを有する、酵素的に分解しうるゼラチン及び核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）ミクロ粒子から作成される。この輸送システムは、簡単な方法で作成することができる。ターゲッティングリガンドは、直接に又は結合部分を介してミクロ粒子に結合されうる。結合のデザインでは、抗体、細胞接着分子、ホルモン及び他の細胞特異的リガンドを含むミクロ粒子表面上に何れかの分子を結合しうる。

Description

【発明の詳細な説明】ターゲッティングされた遺伝子輸送システム本発明の背景細胞に外来遺伝子を導入するために種々の技術が使用されている。物理的な方法には、リン酸カルシウムを用いる共沈殿、電気穿孔法、及び粒子衝撃法（par- ticle bombardment）が含まれる。これらの直接移入技術は、in vitro においては適切であるが、in vivo では非実用的である。in vivo での遺伝子治療を保証するには、輸送のためのウイルス性ベクター又はリポソームのようなキャリアーを頼りにする。ウイルス性ベクターに対しては長期の安定性についての懸念がまだ残されている。他の制限はＤＮＡ配列のサイズであり、これは通常ウイルス性ベクターに取り込ませうる７〜８Ｋｂに制限されている。一方、リポソームは一般に導入レベルが低い。両ケースとも、これらの遺伝子輸送システムに対する細胞又は組織特異性について論争がある。制御されたドラッグデリバリーは、多くの薬物治療の成功を十分に改善している（Langer，R.，1990，New methods of drug delivery，Science，249:1527-33 ; Poznansky，et al.，1984，Biological approaches to the controlled de-li very of drugs: a critical review，Pharmacol．Rev.，36:277-336）。ドラッグデリバリーの主な目標は、医薬を標的部位に局在化させることである。これらのターゲッティングされた輸送システムは、しばしば、リポソームよりなる注射可能剤の形態（Gregoriadis，G.，1988，Liposomes as Drug Carriers，New Yor k: Wiley; Litzinger，et al.，1992，Phosphatidylethanolamineliposomes: dr ug delivery，gene transfer and immunodiagnostic applica-tions，Biochimic a et Biophysica Acta.，1113:201-27）、及び、タンパクより作成されたミクロスフェアの形態（Cummings et al.，1991，Covalent cou-pling of doxorubicin in protein microspheres is a major determinant of tumour drug depositio n，Biochem．Pharm.，41:1849-54; Verrijik，et al.，1991，Polymer-coated a lbumin microspheres as carriers for intravascular tumor targeting of cisplatin，Cancer Chemother．and Pharm.，29:117-21; T abata et al.，1988，Potentiation of antitumor activity of macrophages by recombinant interferon alpha A/D contained in gelatin microspheres，Jpn ．J．Cancer Res.，79:636-646）、多糖より作成されたミクロスフェアの形態（ Rongved，et al.，1991，Crossed-linked，degradable starch mi-crospheres a s carriers of paramagnetic resonance imaging: Synthesis，degradation，an d relaxation properties，Carbohydrate Res.，145:83-92; Carter，et al.，1 991，The combination of degradable starch microspheres and angiotensin I I in the manipulation of drug delivery in an animalmodel of colorectal m etastasis，British J．Cancer，65:37-9）、及び合成ポリマーで作成されたミクロスフェアの形態（Davis，et al.，1984，Mi-crospheres and Drug Therapy ，Amsterdam; Eldridge，et al.，1991，Biode-gradable microspheres as a va ccine delivery system，Molec．Immunology，28:287-94; Pappo，et al.，1991 ，Monoclonal antibody-directed targeting of fluorescent polystyrene micr ospheres to Peyer's patch M cells，Immu-nology，73:277-80）をとりうる。ポリマー系は、変更された薬物動力学及び生体内分布のようなリポソーム系の利点の幾つかを一部有している。リポソームは、生物適合性のよりよい見込み及び細胞との融合の可能性を有しうるが、ポリマーミクロスフェアは、より制御可能な放出動力学、よりよい保存安定性、及び幾つかの種類の化合物に対するより高い医薬導入レベルを有する。我々は以前に、ゼラチンとコンドロイチン硫酸の複合コアセルベーションによってミクロスフェアを合成した（Truong，et al.，1993，A target-specific mi crospheres drug delivery system made of enzymatically degradable gela-ti n and chondroitin sulfate coacervates，Controlled Telease Society，Ab-st ract #1336; Azhari，et al.，1991，Protein release from enzymatically deg radable chondroitin sulfate/gelatin microspheres，Intern．Symp．Con-trol ．Bioact．Mater.，18）。これらのミクロスフェアは、グルタルアルデヒドで架橋することによって安定化でき、架橋の割合により分解及び医薬放出速度が制御される。血清中でのこれらのミクロスフェアの生物分解性は、ゼラチナーゼ、コラーゲナーゼ、及びトリプシンのようなメタルプロテイナーゼの存在により影響を受ける。従って、当分野において、制御された放出を提供し、簡単に製造することができ、安定であり、実用的なコストであり、ＤＮＡ導入レベルが高く、かつ相対的に非免疫原生であるターゲッティングされたＤＮＡ輸送システムに対する必要性がある。本発明の概要本発明の目的は、細胞にＤＮＡを輸送するためのポリマー粒子を提供することである。本発明の目的は、細胞にＤＮＡを輸送するためのポリマー粒子を製造する方法を提供することである。本発明の他の目的は、ポリマー粒子を使用して細胞にＤＮＡを輸送する方法を提供することである。本発明のこれらの目的及び他の目的は、以下に説明する１以上の態様によって提供される。一態様では、特異的な標的に遺伝子を輸送するためのミクロ粒子を提供する。該ミクロ粒子は、ゼラチン及びＤＮＡを具備し、結合分子又はターゲッティングリガンドが前記ミクロ粒子の表面に結合されている。本発明の他の態様では、特異的な標的に遺伝子を輸送するためのミクロ粒子を形成する方法を提供する。該方法は、ＤＮＡとゼラチンのコアセルベーションによってミクロ粒子を形成すること、及び結合分子又はターゲッティングリガンドを該ミクロ粒子の表面に接着することのステップを具備する。本発明の更なる態様では、細胞に遺伝子を導入する方法を提供する。該方法は、形トランスフェクションされる細胞をゼラチン及びＤＮＡを含有する固体ミクロ粒子とインキュベートし、この場合にターゲッティングリガンドが前記ミクロ粒子の表面に結合され、前記ターゲッティングリガンドが前記細胞の表面に結合することを具備する。従って、本発明は、製造が簡単であり、実用的なコストであり、放出を制御する能力を有し、保存に安定であり、生物適合性である魅力的なＤＮＡ輸送システムを有する技術を提供する。図面の簡単な説明図１．ゼラチン−ＤＮＡコアセルベートの合成を示す系統図である。図２．カプセル化の前後でのｃＤＮＡのゲル電気泳動。（std=基準、Sup＝上清、pettet＝遠心によりペレット化されたミクロ粒子）。図３．完全なＬＡＭＰ−１ｃＤＮＡの制御された放出を in vitro で示したもの。ミクロ粒子は、種々のグルタルアルデヒドの濃度でグルタルアルデヒドと架橋され、次いでトリプシンで減成させた。図３Ａは種々のグルタルアルデヒドの架橋レベルでの時間経過でのＤＮＡ放出を示す。図３Ｂは、（ゲル及び濃度計自動計測での）種々の時間及び種々のレベルのグルタルアルデヒドの架橋でのミクロ粒子から放出されるＤＮＡを示す。図４．対照及びＬＡＭＰ−１ｃＤＮＡを導入したミクロ粒子によってトランスフェクションされたＵ９３７細胞の蛍光イメージ（感染後３日）。図４Ａ：ｃＤＮＡを用いない抗−ＤＣ４４ミクロ粒子。図４Ｂ：リン酸カルシウムトランスフェクション。図４Ｃ：抗体を用いないＬＡＭＰ−１ミクロ粒子。図４Ｄ：抗− ＣＤ−４４ｍＡＢでコートされたＬＡＭＰ−１ミクロ粒子。ＬＡＭＰ−１発現は、細胞内の顆粒（リソソーム）として明らかにされる。図５．抗リンパ球機能関連抗原−１でコートされたミクロ粒子及び対照によるＵ９３７細胞トランスフェクション効率のフローサイトメトリー分析。実際の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は挿入図で示した。Ｍｓｐ＝ミクロスフェア。ＭＲＫ＝ミスマッチ抗−Ｐ−糖タンパク抗体。ＰＬＭ＝抗−ＬＦＡ抗体。図６．抗−ＣＤ４４でコートされたミクロ粒子によってトランスフェクションされた２９３細胞内でのＬＡＭＰ−１の時間発現。好ましい態様の詳細な説明種々の鎖長の核酸分子を水性条件下でポリマーカチオンと複合体形成させ、サブミクロンからミクロンの範囲のサイズの固体ミクロ粒子を形成させうることが本発明で明かとなった。適切にターゲッティングされた場合、これらの核酸を導入したミクロ粒子は、食細胞活性を有する細胞をトランスフェクションすることができる。ミクロ粒子の分解及び核酸の放出速度は、架橋の割合を変化することで演繹的にデザインされうる。核酸の導入レベルは、＞９５％のカプセル化効率で３０％（ｗ／ｗ）程度の高さになりうる。本発明に従えば、ゼラチン又はゼラチンと同様の電荷密度を有する他のポリマーカチオンを使用し、核酸と複合体を形成させ、ミクロ粒子を形成する。ゼラチン源は、厳密に考慮する必要はなく、ウシ、ブタ、ヒト、又は他の動物源から得ることができる。典型的には、ポリマーカチオンは１９，０００〜３０，０００の間の分子量を有しうる。ポリ−Ｌ−リジンは本発明のポリマーカチオンとして特に有用である。望ましくは、硫酸ナトリウムを使用してポリマーカチオンと核酸のコアセルベーションを誘導する。約４０から６０％の濃度のエタノールを使用してコアセルベーションを誘導することもできる。コンドロイチン硫酸もミクロ粒子に導入されうる。これは、ミクロ粒子に医薬のような他の基質を含めることを望む場合に特に有益である。典型的にはコンドロイチン硫酸の濃度は、約０．００５％と０．１％の間である。ターゲッティングリガンドは、ミクロ粒子の表面に直接に結合されうるか、又は「架橋」若しくは「スペーサー」を使用して間接的に結合されうる。アミノ基がゼラチンのリジン基に存在するのでミクロ粒子の表面を、ターゲッティング部分の直接のカップリングのために容易に誘導体化することができる。他の方法として、アビジン−ビオチンのようなスペーサー（結合分子及びターゲッティングリガンドの誘導体化した部分）使用し、ミクロ粒子にターゲッティングリガンドを間接的に結合することができる。ビオチニル化された抗体及び／又は他のビオチニル化されたリガンドは、アビジンに対してビオチンが高親和性（Ｋ_a〜１０¹ ⁵ Ｍ^-1）であるのでアビジンでコートされたミクロ粒子表面に効果的にカップリングされる（Hazuda，et al.，1990，Processing of precursor interleukinl b eta and inflammatory disease，J．Biol．Chem.，265:6318-22; Wilchek， et al.,1990，Introduction to avidin-biotin technology，Methods In Enzy-m ology，184:5-13）。ＩｇＧの定位選択的な結合は、Ｆｃ部分に見出されるオリゴ糖基で抗体をビオチニル化することによって達成されうる（O'Shannessy，et al.，1984，A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjuga-tio n to oligosaccharides moieties，Immunol．Lett.，8:273-277）。このデザインは、利用しうる結合部位の総数を保護し、マクロファージのようなＦｃ受容体 −結合細胞に対する結合した抗体の免疫原生を低くする手助けとなる。当分野で公知のように、アビジン−ビオチン架橋以外のスペーサーも使用しうる。例えば、スタフィロコッカル（Staphhylococcal）タンパクＡを、ミクロ粒子に免疫グロブリン分子のＦｃ部分を結合するためにミクロ粒子上にコートしうる。ミクロ分子への結合分子又はターゲッティングリガンドの架橋を使用し、ミクロ粒子の安定性を増し、更にミクロ粒子に結合分子又はターゲッティングリガンドを共有結合的に付加する。架橋の割合はミクロ分子からの核酸の放出の速度に直接に影響する。架橋はグルタルアルデヒド、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３− ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）のようなカルボジイミド、カルボキシルズ（ペプチド結合）結合、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（bis(sulfosccinimid-yl) suberate）、ジメチルスベリイミデート（demethylsuberimidate）等を用いて達成しうる。本発明のターゲッティングリガンドは、体内の特異的なタイプの細胞に結合する何れかの細胞である。これらは、細胞受容体が存在する何れのタイプの分子であってもよい。好ましくは、細胞受容体は特異的な細胞タイプにのみ発現される。使用されうるターゲッティングリガンドの例は、ホルモン、抗体、細胞接着分子、糖、医薬、及び神経伝達物質である。本発明のミクロ粒子はよい導入特性を有する。典型的には、本発明の方法に従えば、少なくとも５％（ｗ／ｗ）の核酸を有するミクロ粒子が得られる。導入は核酸が１０又は１５％よりも多くなることが好ましい。しばしば、核酸が２０又は３０％よりも多いミクロ粒子が達成されうる。典型的には、９５％以上のミクロ粒子への核酸の導入効率が達成されうる。本発明の方法は、ポリマーカチオンと核酸のコアセルベーションを含む。この過程は正に荷電したポリマーカチオンと負に荷電した核酸の相互作用に依存するので、複雑なコアセルベーション過程を考えることができる。しかし、硫酸ナトリウム（又はエタノール）は相変化を誘導することによってコアセルベーション反応を誘導する。従って、簡単なコアセルベーション反応も考慮されうる。核酸は、１ ng/ml から５００μｇ／ml の間の濃度でコアセルベーション混合物中に存在する。望ましくは、核酸は少なくとも約２〜３ｋｂの長さである。硫酸ナトリウムは、７から４３ mM の間の濃度で存在する。ゼラチン又は他のポリマーカチオンは、約２から７％の間でコアセルベーション混合物中に存在する。注目すべきミクロ粒子輸送システムは、調製の容易さ、実用的なコスト、核酸の導入レベル、制御された放出能力、保存安定性、及び成分の免疫原生のようなファクターの中で、微妙なバランスを必要とする。本明細書で開示される遺伝子輸送システムは、リポソームシステムを含めた他の粒子の輸送システムに比べて有利である。不安定性、低い導入レベル、及び制御された放出能力の問題は、ポリマーミクロ粒子システムでよりよく解決される。ゼラチンは、in vivo でのその生物適合性及び酵素分解性により、外科手術の組織接着剤（Weinschelbaum，e t al.，1992，Surgical treatment of acute type A dissecting aneurysm with preservation of the native aortic valve and use of biologic glue．Follo w-up to 6 years，J．Thorac．Cardjovasc．Surg.，130:369-74）から定量的免疫組織化学分析（Izumi，et al.，1990，Novel gelatin particle agglu-tinati on test for serodiagnosis of leprosy in the field，J．Clinical Mi-crobio l.，28:525-9）の範囲に及ぶ増加した生物学的使用、及びドラッグデリバリービヒクル（Tabata，et al.，1991，Effects of recombinant alpha-interferon-ge latin conjugate on in vivo murine tumor cell growth，Cancer Res.，51:553 2-8）としての増加した生物学的使用を受け入れている。広く研究されたポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマー（polylactic/polyglycolic co-polymers）のような他の合成ポリマーシステムに比べて、穏和な条件でのミクロ粒子の形成をアピールすることができる。溶媒の蒸発及びホットメルト技術は合成ポリマーミクロ粒子を形成するのに使用されるが、複合コアセルベーションは有機溶媒との接触も熱も必要としない。これは、不活性溶媒捕捉によるばかりでなく、直接の電荷−電荷相互作用によっても、核酸のような生物マクロ分子をカプセル化するのに特に適している。１０ｋｂ以上の遺伝子を輸送することができないウイルス性ベクターと異なって、本発明のミクロ粒子輸送システムではこのような大きさの制限はない。約２ｋｂ以上の核酸分子を使用し得、１０ｋｂよりも大きい核酸分子さえも使用することができる。一般に、可能なターゲットの範囲は、注入の経路、例えば静脈内若しくは動脈内、皮下、腹腔内、髄腔内等に依存する。全身性の注入に対しては、この輸送システムの特異性は血液に結合したミクロ粒子に対するターゲットの接近性に影響され、これはまた粒子のサイズの範囲に影響される。粒子のサイズは、温度、成分の濃度、及びコアセルベーション混合物のｐＨに影響される。粒子はまた、例えば蔗糖勾配超遠心分離法によって大きさで分別されうる。１５０ナノメータ以下のサイズの粒子は、ほとんどの血管壁に一列に並んだ開窓を介して浸透することによって間隙スペースに近づくことができる。このような状況下では、ターゲッティングされうる細胞の範囲は広がる。ターゲッティングされうる細胞の省略したリストには、肝シヌソイドの実質細胞、結合組織の繊維芽細胞、膵臓のランゲルハンス島内の細胞、心筋細胞、腸のチーフ（Chief）及び壁細胞、骨の骨細胞及びクロンドサイト（chrondocytes）、ケラチン生成細胞、末梢神経系の神経細胞、腎臓及び肺の上皮細胞、精巣のセルトリ細胞等が含まれる。０．２ミクロン以上の大きさのサイズを有する粒子に対するターゲットは、血管区画に大きく制限されるであろう。ここで、ターゲットとなりうる細胞のタイプには、赤血球、白血球（即ち、単核細胞、マクロファージ、Ｂ及びＴリンパ球、好中球、ナチュラルキラー細胞、始原細胞、マスト細胞、エオシン好性細胞）、血小板、及び内皮細胞が含まれる。皮下注入に対して、ターゲッティングしうる細胞には、結合組織（例えば、繊維芽細胞、マスト細胞等）、ランゲルハンス細胞、ケラチン生成細胞、及び筋細胞に存する全ての細胞が含まれる。髄腔内注入に対して、ターゲッティングしうる細胞には、ニューロン、グリア細胞、星状細胞、及び血液脳関門内皮細胞が含まれる。腹腔内注入に対して、ターゲッティングしうる細胞には、マクロファージ及び好中球が含まれる。例マトリックス材料：ゼラチン（６０ブルーム、ブタ皮膚より得たタイプＡ）、コンドロイチン４−硫酸、グルタルアルデヒド（２５％、グレード１）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ塩酸塩）、及び超高純度蔗糖をシグマケミカルＣｏ．（セントルイス、ＭＯ）より購入した。ビオチンＬＣヒドラジド、及びニュートロアビジン（NeutrAvidin）、及びクーマッシー（Coomassie）タンパクアッセイ試薬をピアース（Pierce）（ロックフォード、ＩＬ）より得た。セントリコンミクロコンセントレーターをアミコン（Amicon）（ベヴァリー、ＭＡ）より得た。モノクローナル掟体：ｍＡｂＰＬＭ−２、ＢＡＬＢ／ｃマウス抗−ブタＬＦＡ −１（ＩｇＧ_1k）（これは、ネズミＬＦＡ−１とも交差反応する。）を、先に開示されたように単離し、精製した（Hildreth，et al.，1989，Monoclonal an-ti bodies against porcine LFA-1: species cross-reactivity and functionaleff ects of b-subunit-specific antibodies，Molec．Immunol.，26:883-895）。ＩＢ−４Ｂ、ラット抗−マウスＬＡＭＰ−１腹水液及びマウス抗−ヒトＣＤ４４ｍＡｂを先に開示されたように単離した（de Wet，et al.，1987，Firefly lu-cif erase gene: structure and expression in mammalian cells，Mol．& Cell Bio l.，7:725-37）。ＣＨＡは、何れの公知の in vivo マウスエピトープ（ハイブリテック社（hybritech Inc.）サンディエゴ、ＣＡ）も認識しないＩｇＧ₁である。親和性により精製したＦＩＴＣ及びテキサスレッドラベルポリクローナル（ Texas Red-labeled polyclonal）抗−ラットＩｇＧをシグマより得た。遺伝子：２種類の遺伝子を、本発明の輸送システムの実行可能性を示すために使用した。ＬＡＭＰ−ａｃＤＮＡは、ＣＭＶプロモータを有するインビトロゲンプラスミド（Invitrogen plasmid）ｃＤＮＡに挿入されたマウスＬＡＭＰ−１遺伝子（２．４ｋｂ）を有する６．４ｋｂの環状スーパーコイルプラスミドｃＤＮＡである（Guaaranieri，et al.，1993，J．Biol．Chem.，268:1941）。ＬＡＭＰ−１の発現の検出は、抗−ＬＡＭＰ−１ｍＡｂ及びテキサスレッドと複合体形成された第二の抗ＩｇＧｍＡｂで細胞を染色することによって行った。ルシフェラーゼ酵素をコードする遺伝子は、高感度のアッセイ、その簡便性、及び低コスト故に遺伝子発現の研究の細胞生物学で広く使用されている。加えて、該酵素は、これが酵素活性のための翻訳後のプロセッシングを必要としないサイトソルタンパクであるから、遺伝子発現のよいレポーターである（de Wet，et al.，1987 ，Firefly luciferase gene: structure and expression inmammmalian cells， Mol．& Cell．Biol.，7:725-37; Wood，et al.，1989，Introduction to beetle luciferases and their applications，J．of Biolumin．& Chemilum.，4:289-3 01）。ルシフェラーゼの存在は、フォトンの生成（化学ルミネッセンスの形態）に伴う甲虫ルシフェリンの酸化を含む酵素反応によって容易に検出されうる。アッセイは、プロメガ杜（Promega Corp.）（マジソン、ＷＩ）から購入したアッセイキットを用いて行った。ミクロスフェアみ今成：ゼラチン−ＤＮＡコアセルベートの合成の詳細な系統図を図１に示した。示された濃度は全て、特に示さない限り６７℃にセットした反応混合物の最終濃度である。アビジンでコートされたゼラチン／プラスミドＤＮＡミクロ粒子は、まず、４２ mM 硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₄）中のリソソーム関連膜タンパク−１（ＬＡＭＰ−１）（６．７Ｋｂ、環状スーパーコイル）をコードするプラスミドＤＮＡの３．５mg/ml 溶液を調製することによって合成した。コアセルベーションを、高スピードで１分間ボルテックスしながらＤＮＡ／Ｎａ₂ＳＯ₄溶液にゼラチン（５％）を等容量で加えることによって開始した。ゼラチンとのコアセルベーションを開始する前に、ＤＮＡ／Ｎａ₂ＳＯ₄溶液へ直接に添加することによって医薬と他の薬剤を共にカプセル化した。アビジン（５mg /ml）を、ミクロスフェア懸濁液に７５μｇアビジン／ml ミクロスフェア溶液の最終濃度で加えた。ミクロスフェア混合物を、７０％スクロース（ｗ／ｖ）の層上に層上に重ね、４分間６，０００×ｇで遠心した（ブリンクマンインスツルメンツ社（Brinkman Instruments Inc.）、ウエストベリー、ＮＹ、モデルＬ８−７５）。蔗糖層から回収されたミクロスフェア画分を水で５倍に希釈し、次いで、室温で１０分間グルタルアルデヒド（１２．５ mM 最終濃度）で架橋した。未反応のグルタルアルデヒドをエタノールアミン（１Ｍ）を加え、１０分間クエンチした。ミクロスフェアを上述のように蔗糖遠心によって透析した。アビジンでコートされカミクロスフェアへのビオチニル化されたｍＡｂの結合：３０ ug の抗体（刊行物に記載された手順に従ってビオチニル化した（O'Shar messy，et al.，1984，A novel procedure for labeling immunoglobu-lins by conjugation to oligosaccharides moietys，Immunol．Lett.，8:273-277））を１ml のアビジンでコートされたミクロスフェア懸濁液（１１ mg/ml）に穏やかに撹拌しながら１時間で加えた。未結合のｍＡｂを透析によってミクロスフェアから除去した。ミクロスフェアの特徴づけ及び結合能：ＤＮＡを導入したミクロスフェアは、多形コロイド型を示した。これは、光学顕微鏡による測定で３ミクロン以下の多分散系の粒子サイズを有していた。精製されたミクロスフェアは、評価し得るほどの分解をすることなく少なくとも１カ月間安定であった。ＬＡＭＰ−１プラスミドＤＮＡの導入レベルは、２０％（ｗ／ｗ）であった。カプセル化効率は、典型的には＞９５％であった。１％アガロースゲル電気泳動での遊離のＬＡＭＰ− １及び（ミクロスフェアから）遊離されたＤＮＡの可動性を示した（図２）。これはカプセル化したＤＮＡがそのもとの形態で放出されることを示唆している。ミクロスフェアからのｃＤＮＡの放出速度は、架橋密度及び酵素レベルに依存する（図４）。数週間までの継続的な放出が容易に得られた。我々は、組織培養中でのヒト組織球リンパ腫細胞（Ｕ９３７）に結合し、引き続いてこれにトランスフェクションするようにミクロスフェアを導入したＬＡＭＰ−１ＤＮＡの能力を試験した。抗−ＬＦＡ又は抗−ＣＤ４４モノクローナル抗体（両タンパクターゲットは、Ｕ９３７細胞表面に多量に発現される。）の何れかでコートした場合、ＬＡＭＰ−１を認識する抗体で染色すると、発現ＬＡＭＰ −１タンパクは３日目まで検出された（図４Ａ、蛍光性の顆粒）。ＬＡＭＰ−１ミクロスフェアでインキュベートしたＵ９３７細胞の染色パターンは、リン酸カルシウム法のトランスフェクションと同様であった（図４Ｂ）。アビジン又は非特異的ＣＨＡｍＡｂの何れかでコートされたミクロスフェアは、顆粒状染色パターンを示さず、未処理細胞と同様であった（図４Ｃ）。フローサイトメトリーを用いて、我々は、ＬＡＭＰ−１の発現が培養物中の５％のＵ９３７細胞まで検出されることを示した。対照--ブランクのミクロスフェア、ｃＤＮＡを用いるが抗体を全く用いないミクロスフェア、ｃＤＮＡを用い、ミスマッチ抗−Ｐ−糖タンパク抗体（ＭＲＫ−Ｍｓｐ．）でコートされたミクロスフェア、及びミクロスフェアにトラップされているよりも６倍高い濃度の遊離のｃＤＮＡ--のどれも、トランスフェクションの何れの証拠も示さなかった。トランスフェクションの効率は、投与量−応答的であると思われる。一般に、この個々の遺伝子及び細胞タイプのトランスフェクション効率は、提案されたミクロスフェア輸送システム（１〜１０％）及びリン酸カルシウム沈殿法（２〜１５％）の間に位置する。図６は、異なったモノクローナル抗体を使用した異なった細胞タイプにおける概念を示す。再度言うが、ｃＤＮＡは細胞をトランスフェクションしない。結局、ＬＡＭＰ−１発現は幾つかの継代の後に消失する。陽性の結果はルシフェラーゼレポーター遺伝子システムに対しても得られた。トランスフェクションは、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したミクロスフェアとインキュベートされたＵ２９３細胞でルシフェラーゼ酵素活性の測定によって明確に検出された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者オーガスト、トーマスアメリカ合衆国、メリーランド州 21210、バルチモア、ポプラー・ヒル・ロード 905 (72)発明者レオン、カム・ダブリュアメリカ合衆国、メリーランド州 21042、エリコット・シティー、ブレコンシャー・ロード 10242

Claims

【特許請求の範囲】１．ポリマーカチオン及び核酸分子を含有する特定のターゲット細胞への遺伝子輸送のための固体ミクロ粒子であって、結合分子又はターゲッティングリガンドが前記ミクロ粒子の表面に結合されている固体ミクロ粒子。２．請求の範囲第１項に記載のミクロ粒子であって、該結合分子が前記ミクロ粒子に結合されているもの。３．請求の範囲第１項に記載のミクロ粒子であって、該ターゲッティングリガンドが前記ミクロ粒子に結合されているもの。４．請求の範囲第２項に記載のミクロ粒子であって、該結合分子がグルタルアルデヒド架橋によって前記ミクロ粒子によって共有結合的に結合されているもの。５．請求の範囲第２項に記載のミクロ粒子であって、前記結合分子がアビジンであるもの。６．請求の範囲第２項に記載のミクロ粒子であって、前記ターゲッティングリガンドが結合分子にカップリングされているもの。７．請求の範囲第３項に記載のミクロ粒子であって、前記ターゲッティングリガンドがホルモン、抗体、細胞接着分子、糖、医薬、及び神経伝達物質よりなる群から選択されるもの。８．請求の範囲第６項に記載のミクロ粒子であって、前記ターゲッティングリガンドがホルモン、抗体、細胞接着分子、糖、医薬、及び神経伝達物質よりなる群から選択されるもの。９．請求の範囲第１項に記載のミクロ粒子であって、前記ポリマーカチオンがゼラチンであるもの。１０．請求の範囲第１項に記載のミクロ粒子であって、前記ミクロ粒子が５％（ｗ／ｗ）以上の核酸を含有するもの。１１．請求の範囲第１項に記載のミクロ粒子であって、前記ミクロ粒子が２０％（ｗ／ｗ）以上の核酸を含有するもの。１２．請求の範囲第５項に記載のミクロ粒子であって、ビオチニル化されたターゲッティングリガンドが結合分子にカップリングされるもの。１３．請求の範囲第１２項に記載のミクロ粒子であって、前記ビオチニル化されたターゲッティングリガンドがビオチニル化された抗体であるもの。１４．請求の範囲第１３項に記載のミクロ粒子であって、ビオチンが前記抗体のＦ_c部位上のオリゴ糖基で前記抗体に結合されるもの。１５．請求の範囲第１項に記載のミクロ粒子であって、前記核酸が１０ｋｂ以上の遺伝子を含有するもの。１６．コンドロイチン硫酸を更に含有する請求の範囲第１項に記載のミクロ粒子。１７．特異的ターゲット細胞に遺伝子を輸送するための固体ミクロ粒子を形成する方法であって、核酸とポリマーカチオンのコアセルベーションによってミクロ粒子を形成すること、該ミクロ粒子の表面に結合分子又はターゲッティングリガンドを接着すること、のステップを具備する方法。１８．結合分子又はターゲッティングリガンドをミクロ粒子に架橋するステップを更に含有する請求の範囲第１７項に記載の方法。１９．請求の範囲第１７項に記載の方法であって、結合分子が接着され、前記方法がターゲッティングリガンドを結合分子に結合するステップを更に具備する方法。２０．請求の範囲第１７項に記載の方法であって、コアセルベーションが硫酸ナトリウムの存在下で行われる方法。２１．請求の範囲第１７項に記載の方法であって、ポリマーカチオンがゼラチンである方法。２２．請求の範囲第１７項に記載の方法であって、ターゲッティングリガンドが、前記ミクロ粒子の表面に接着され、前記ターゲッティングリガンドが、抗体、ホルモン、細胞接着分子、糖、医薬、及び神経伝達物質よりなる群から選択される方法。２３．請求の範囲第１９項に記載の方法であって、ターゲッティングリガンドが、抗体、ホルモン、細胞接着分子、糖、医薬、及び神経伝達物質よりなる群から選択される方法。２４．請求の範囲第１７項に記載の方法であって、結合分子がアビジンである方法。２５．請求の範囲第１９項に記載の方法であって、ターゲッティングリガンドが誘導体化され、これによってこれが結合分子に結合する方法。２６．請求の範囲第２１項に記載の方法であって、ゼラチンがコアセルベーションのステップで約２〜７％の濃度で存在する方法。２７．請求の範囲第１７項に記載の方法であって、核酸がコアセルベーションのステップで１ｎｇ／ｍｌから５００μｇ／ｍｌの濃度で存在する方法。２８．請求の範囲２０項に記載の方法であって、硫酸ナトリウムの濃度がコアセルベーションのステップで約７と４３mMの間である方法。２９．（ａ）細胞を（ｂ）ポリマーカチオン及び核酸を含有する固体ミクロ粒子でトランスフェクションするためにインキュベートするステップを含有する細胞へ遺伝子を導入するための方法であって、ターゲッティングリガンドが前記ミクロ粒子の表面に結合され、前記ターゲッティングリガンドがトランスフェクションされる前記細胞の表面に結合される方法。３０．請求の範囲第２９項に記載の方法であって、ターゲッティングリガンドが結合分子によって前記ミクロ粒子の表面に結合される方法。３１．請求の範囲第２９項に記載の方法であって、結合分子がアビジンである方法。３２．請求の範囲第２９項に記載の方法であって、ターゲッティングリガンドが抗体、ホルモン、細胞接着分子、糖、医薬、及び神経伝達物質よりなる群から選択される方法。３３．請求の範囲第２９項に記載の方法であって、ポリマーカチオンがゼラチンである方法。３４．請求の範囲第２９項に記載の方法であって、核酸がＤＮＡである方法。３５．請求の範囲第２９項に記載の方法であって、核酸がＲＮＡである方法。