CN104981236B - 刺激敏感性微粒和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了刺激敏感性微粒和它们的用途，例如，在示踪从细胞混合物中回收稀少细胞群体(例如，循环肿瘤细胞)的效率中的用途；和在提供对照核酸以指标化不依赖于稀少细胞选择步骤的分子测定中的用途。

Description

刺激敏感性微粒和使用方法
相关申请的的交叉引用
本申请按35 U.S.C.§119（e）要求提交于2012年9月27日的美国临时申请号61/706,126的权益，其通过引用以其整体结合到本文中用于所有目的。
发明领域
提供了刺激敏感性微粒及其用途，例如，在示踪从细胞混合物中回收稀少细胞群体(例如，循环肿瘤细胞)的效率中的用途；和在提供对照核酸以指标化不依赖于稀少细胞选择步骤的分子测定中的用途。
发明背景
实体组织癌开始生长于原发位点。随着疾病进展，转移出现在远端位置。这些转移事件加速疾病并最后导致死亡。作为转移过程的一部分，细胞或细胞碎片离开原发位点。转移的过程是复杂的。一部分转移过程涉及稀少循环肿瘤细胞(CTC)。越来越清楚在给定的患者中这些CTC不是整体(monolithic)群体。患者中的CTC分级对于理解突变(其是折磨患者的癌症的原因)是必要的。纯化和分离这些稀少肿瘤细胞(或细胞衍生事件)对于定义在患者的血中的致癌突变是必须的。许多细胞和细胞碎片存在于不含突变的全血中，因此为了分离有用的携带突变的细胞，需要纯化策略。
为了通过任何技术从细胞混合物中测量在稀少细胞群体（例如，循环肿瘤细胞(CTC)）的DNA基因组中的突变，需要足够数量或质量的DNA。通常2-4 ml的全血，可期望回收2-10个CTC。此数量的细胞必须用优秀的回收处理以确保携带突变的染色体在处理期间不被丢失。
简述
本文公开的实施方法部分地基于热不稳定性微球的发现以及它们在示踪从稀少细胞群体的细胞中分离基因组DNA的效率中的用途，所述稀少细胞群体从细胞混合物(例如，来自生物样本)中分离。本文中描述的热不稳定性微球和示踪方法提供了多步骤过程内部对照能力，其允许用于性能的校准，例如，在细胞分离的水平上和也在基因组DNA分离的水平上。
在一个方面中，本发明提供了热不稳定性微球。在一些实施方案中，热不稳定性微球包括：
i)热不稳定性聚合物，其包括内部空间和外部表面，其中所述聚合物在内部空间中含有靶核酸，其中所述聚合物包含明确的熔点并在大于约50℃的温度下释放核酸；和
ii)与聚合物的外部表面连接的免疫原性表位或抗原，或表面或其它标志物。在一些实施方案中，热不稳定性微球另外包括：iii)可检测的标记并且当其被包含于热不稳定性聚合物内时是可检测的。任选地，可检测的标记被包含于热不稳定性微球的内部空间。在一些实施方案中，热不稳定性聚合物是同聚物。在一些实施方案中，热不稳定性聚合物包含在约50℃-约110℃的温度范围内的明确的熔点，例如，在约50-60℃或55-65℃的范围内，例如，约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃或110℃。在一些实施方案中，热不稳定性聚合物包括这样的聚合物，其在水性缓冲液中在大于约50℃的温度下（例如，大于约55℃，大于约60℃或大于约65℃）被降解。在一些实施方案中，热不稳定性聚合物选自聚己内酯(PCL)、聚L-赖氨酸(PLL)、聚苯乙烯、聚异丁烯酸甲酯(PMMA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚异丙基丙烯酰胺、丁基乙烯基醚、顺式氯丁二烯、己二酸乙二酯、氧化乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、乙基乙烯基醚、反式异戊二烯、聚(己烯1)、聚(异丁烯酸甲酯)、聚(氯乙烯)、氧化丙烯、丙基乙烯基醚和乙烯基乙缩醛。在一些实施方案中，热不稳定性聚合物是生物可降解的。在一些实施方案中，热不稳定性聚合物是生物可降解的聚酯。在一些实施方案中，热不稳定性聚合物是聚己内酯(PCL)。在一些实施方案中，聚己内酯(PCL)包含在约Mn 10,000-约Mn 90,000的范围（例如，约Mn 10,000-14,000、Mn 45,000或Mn 70,000-90,000）中的分子重量。在一些实施方案中，热不稳定性聚合物是聚羟基链烷酸酯。在一些实施方案中，微球具有在约10-30 µm的范围（例如，在约20-30 µm的范围内，例如，约10 µm、11 µm、12 µm、13 µm、14 µm、15 µm、16 µm、17 µm、18 µm、19 µm、20 µm、21 µm、22 µm、23 µm、24 µm、25 µm、26 µm、27 µm、28 µm、29 µm或30 µm的平均或均值直径）内的大小。在一些实施方案中，靶核酸被包含于DNA质粒中。在一些实施方案中，靶核酸编码非人DNA序列或突变的人DNA序列或人造的DNA序列。在一些实施方案中，靶核酸编码基因，其选自质粒维持蛋白ccdB和3',5'-环腺苷一磷酸磷酸二酯酶cpdA。在一些实施方案中，免疫原性表位或抗原，或表面或其它标志物包括一种或多种CTC相关的标志物，例如，上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)、KRT19、MUC1、CEACAM5、BIRCS、SCGB2A2和ERBB2。在一些实施方案中，免疫原性表位或抗原，或表面或其它标志物选自生物素、上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)和洋地黄毒苷。在一些实施方案中，可检测的标记是荧光基团。在一些实施方案中，荧光基团包含约460 nm的激发峰和约500 nm的发射峰，例如，FAM。在一些实施方案中，荧光基团选自氧杂蒽衍生物(例如，荧光素、若丹明、俄勒冈绿、伊红和德克萨斯红)、花青衍生物(例如，花青、靛炭花青、氧杂炭花青、硫杂炭花青和部花青)、萘衍生物(例如，丹酰和氟硅酸钠(prodan)衍生物)、香豆素衍生物(例如，羟基香豆素、甲氧基香豆素和氨基香豆素)、噁二唑衍生物(例如，吡啶基噁唑、硝基苯噁二唑和苯噁二唑)、芘衍生物(例如，瀑布蓝（cascade blue）)、噁嗪衍生物(例如，尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170)、吖啶衍生物(例如，二氨基吖啶、吖啶橙、吖啶黄)、芳基甲川衍生物(例如，金胺、结晶紫、孔雀石绿)和四吡咯衍生物(例如，卟吩、酞菁、胆红素)。
在另外的方面中，本发明提供了示踪从细胞混合物中回收稀少细胞群体的细胞的效率的方法。在一些实施方案中，方法包括：
a)将预定数量的如上面和本文中描述的热不稳定性微球与细胞混合物（其被怀疑包含稀少细胞群体的细胞）混合，其中与微球的外部表面连接的免疫原性表位或抗原、或表面或其它标志物是用于分离稀少细胞群体的相同表位或抗原；
b)向包含热不稳定性微球的细胞混合物中添加结合配偶体，所述结合配偶体与免疫原性表位或抗原、或表面或其它标志物结合；和
c)从细胞混合物中并发地分离结合配偶体结合的微球和稀少细胞群体的细胞，其中捕获的微球的数量代表从细胞混合物中捕获稀少细胞群体中的细胞的效率；由此示踪从细胞混合物中回收稀少细胞群体的效率。
在另外的方面中，本发明提供了示踪从细胞混合物中回收稀少细胞群体的效率和回收基因组DNA的效率的方法。在一些实施方案中，该方法包括：
a)将预定数量的上面和本文中描述的热不稳定性微球与细胞混合物（其被怀疑包含稀少细胞群体的细胞）混合，其中与微球的外部表面连接的免疫原性表位或抗原、或表面或其它标志物是用于分离稀少细胞群体的相同表位或抗原；
b)向包含热不稳定性微球的细胞混合物中添加结合配偶体，所述结合配偶体与免疫原性表位或抗原、或表面或其它标志物结合；
c)从细胞混合物中并发地分离结合配偶体结合的微球和稀少细胞群体的细胞，其中捕获的微球的数量代表从细胞混合物中捕获稀少细胞群体中的细胞的效率；
d)在并发地从细胞中释放基因组DNA和从微球中释放靶核酸的条件下，使分离的微球和分离的稀少细胞群体中的细胞经历至少50℃的温度；和
e)并发地扩增和定量来自分离的细胞的基因组DNA和从热不稳定性微球中释放的靶核酸，其中扩增的靶核酸的量代表从分离的稀少细胞群体的细胞中回收基因组DNA的效率，由此示踪从细胞混合物中回收稀少细胞群体的效率和回收基因组DNA的效率。
在一些实施方案中，该方法另外包括：
在d)之前，通过询问可检测的标记鉴定在c)期间分离的微球的数量；和
将鉴定的微球的数量与在a)中提供的预定数量相比较。在一些实施方案中，在稀少细胞群体中的细胞是真核细胞或原核细胞。在一些实施方案中，稀少细胞群体包括循环肿瘤细胞(CTC)。在一些实施方案中，细胞混合物在来自患者的生物样本中。在一些实施方案中，生物样本是全血。在一些实施方案中，热不稳定性微球的预定数量在约10-约100个微球的范围内。在一些实施方案中，所述患者是人。在一些实施方案中，结合配偶体（其与免疫原性表位或抗原、或表面或其它标志物结合）是抗体或抗体片段。
在另外的方面中，提供了刺激敏感性微粒。在一些实施方案中，该微粒包含：
i)包含内部空间和外部表面的壳，其中所述壳在内部空间中包含一种或多种报告分子，其中所述壳当暴露于刺激时释放所述一种或多种报告分子；和
ii)与壳的外部表面连接的免疫原性表位。在不同的实施方案中，微粒是球状的。在一些实施方案中，微粒包含在约1 µm-约100 µm的范围内的平均直径，例如，在约1 µm-约10 µm的范围内的平均直径，例如，在约10 µm-约100 µm的范围内的平均直径。在不同的实施方案中，刺激是温度、pH、辐射、光和/或与酶接触。在不同的实施方案中，壳包括一种或多种聚合物、单层（unilamellar）胶束、双层（bilamellar）胶束、树状聚体或树状体（dendrosme）和/或碳纳米管或由它们组成。在一些实施方案中，壳由pH敏感性树状聚体或树状体、脂质体或一种或多种聚合物组成。在一些实施方案中，壳是由温度敏感性树状聚体或树状体、脂质体或聚合物组成。在不同的实施方案中，壳是由同聚物，例如，生物可降解的聚酯组成。在一些实施方案中，同聚物含有明确的熔点并在大于约50℃的温度下释放核酸。在一些实施方案中，同聚物选自聚己内酯(PCL)、聚L-赖氨酸(PLL)、聚苯乙烯、聚异丁烯酸甲酯(PMMA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚异丙基丙烯酰胺、丁基乙烯基醚、顺式氯丁二烯、己二酸乙二酯、氧化乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、乙基乙烯基醚、反式异戊二烯、聚(己烯1)、聚(异丁烯酸甲酯)、聚(氯乙烯)、氧化丙烯、丙基乙烯基醚和乙烯基乙缩醛。在一些实施方案中，同聚物是聚己内酯(PCL)。在一些实施方案中，壳是由一种或多种共聚合物组成。例如，在不同的实施方案中，壳包括N异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、丙基丙烯酸(PAA)和丙烯酸丁酯(BA)。在一些实施方案中，壳包含羧甲基壳聚糖(CMCTS)和羧甲基壳聚糖-接枝-聚(N,N-二乙基丙烯酰胺) (CMCTS-g-PDEA)。在一些实施方案中，壳包含三甲基-壳聚糖(TMC)、聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)和异丁烯酸(MAA)。在一些实施方案中，壳包含聚(N异丙基丙烯酰胺) (PNIPAM)和聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，壳包括聚(异丁烯酸(MAA)-乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)共聚物(P(MAA-co-EGDMA)或聚(异丁烯酸(MAA)-乙二醇异丁烯酸酯(EGMA)共聚物(P(MAA-co-EGMA)。在一些实施方案中，壳包含水解的异丁烯酸化的明胶(HGel-MA)、N,N'亚甲基双丙烯酰胺和N异丙基丙烯酰胺。在一些实施方案中，壳包括藻酸钙(Ca-ALG)、藻酸-寡壳聚糖(ALGOCH)和藻酸-寡壳聚糖-EUDRAGIT® L100-55 (ALG-OCH-EL)。在不同的实施方案中，壳是由树状聚体或树状体组成。在一些实施方案中，树状体由高分枝的聚甘油、β-环糊精和双链聚己内酯(BPCL)组成。在一些实施方案中，壳在小于约7或大于约8的pH下或在小于约20℃或大于约37℃的温度下释放一种或多种报告分子。在一些实施方案中，壳由油酰胺衍生物组成。在不同的实施方案中，一种或多种报告分子包括靶核酸。在一些实施方案中，靶核酸包括DNA。在一些实施方案中，靶核酸包含于DNA质粒中。在一些实施方案中，靶核酸编码非人DNA序列或突变的人DNA序列或人造的DNA序列。在一些实施方案中，一种或多种报告分子包括可检测的标记。在不同的实施方案中，可检测的标记是荧光基团。在不同的实施方案中，荧光基团包含约460 nm的激发峰和约500 nm的发射峰。在一些实施方案中，免疫原性表位或抗原选自上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)、洋地黄毒苷和生物素。
在另一方面中，提供了示踪从细胞混合物中回收稀少细胞群体的细胞的效率的方法。在一些实施方案中，该方法包括：
a)将上面和本文中描述的预定数量的微粒与细胞混合物（其被怀疑包含稀少细胞群体的细胞）混合，其中与微粒外部表面连接的免疫原性表位或抗原是用于分离稀少细胞群体的相同表位；
b)向包含微粒的细胞混合物中添加结合配偶体，所述结合配偶体与免疫原性表位结合；
c)从细胞混合物中并发地分离结合配偶体结合的微粒和稀少细胞群体的细胞，其中捕获的微粒的数量代表从细胞混合物中捕获稀少细胞群体中的细胞的效率；
d)使分离的微粒和分离的稀少细胞群体中的细胞经历并发地从细胞中释放基因组DNA和从微粒中释放一种或多种报告分子的条件；和
e)并发地定量来自分离的细胞的基因组DNA和从微粒中释放的一种或多种报告分子，其中一种或多种报告分子的量代表从分离的稀少细胞群体的细胞中回收基因组DNA的效率，由此示踪从细胞混合物中回收稀少细胞群体的效率。在一些实施方案中，该方法另外包括：在d)之前，通过询问一种或多种报告分子鉴定在c)期间分离的微粒的数量；并将鉴定的微粒的数量与在a)中提供的预定的数量作比较。在不同的实施方案中，稀少细胞群体包括真核细胞（例如，循环肿瘤细胞(CTC)）。在不同的实施方案中，微粒包含与被示踪、捕获、回收和处理的细胞接近或类似的大小和形状。在不同的实施方案中，细胞混合物在来自患者的生物样本（例如，全血）中。在一些实施方案中，患者是人。在一些实施方案中，微粒的预定数量在约10-约100个微粒的范围内。在一些实施方案中，结合配偶体（其与免疫原性表位或抗原结合）是抗体或抗体片段。在一些实施方案中，稀少细胞群体包括原核细胞。在一些实施方案中，细胞混合物在水样本中。在一些实施方案中，细胞混合物在食品样本中。
定义
术语“明确的熔点”是指在10或更少℃内（例如，在9、8、7、6、5或更少℃内）聚合物从晶体或半晶体相至液相/熔融相/流动相的转变。在多个实施方案中，聚合物包括基本上均匀的分子量的单体，例如，约10%或更低的分子量分布。
术语“稀少细胞群体”是指在样本中的细胞群体，其少于在样本中的全部细胞的1/106(即，百万分之一或10-4 %)，时常少于1/107 (即，千万分之一或10-5 %)或少于1/108(即，一亿分之一或10-6 %)或少于1/109 (即，十亿分之一或10-7 %)。在稀少细胞群体中的细胞可以是真核细胞或原核细胞。稀少细胞群体的例证性实例包括但不限于，例如，循环肿瘤细胞(CTC)、干细胞、树突细胞、内皮祖细胞、循环内皮细胞、癌干细胞、细胞因子-分泌细胞、抗原特异性T细胞和具核胎儿红细胞。循环肿瘤细胞常常以大约1-10个CTC/mL患有转移性疾病的患者的全血的数量级被发现。用于比较，一毫升的血含几百万个白血细胞和十亿个红血细胞。
生物学的和生物化学的术语：在讨论特定范畴的分子（例如核酸或蛋白）时，包括合成形式，例如天然存在的分子的模拟或异构形式。除非另外指出，否则同样包含修饰的形式，只要所需功能性质被保留。例如，针对CD34细胞表面蛋白的选择性适体包括化学衍生物(例如，聚乙二醇化、产生前形式、用另外的活性部分（例如酶、核酶等）衍生)。
术语"生物流体"表示流体源，并包括（但不限于）羊水、水状液、血和血浆(并且本文中血是指血浆组分，除非另外清楚地声明或在上下文中指出)、耳垢(耳蜡)、考珀液、chime、间质液、淋巴液、哺乳动物的乳、粘液、胸膜液、脓、唾液、皮脂、精液、血清、汗泪、尿、阴道分泌物、呕吐物和渗出物(从创口或损伤)。
术语“受验者”或“个体”或“患者”是指任何哺乳动物(例如人或非人灵长类)、家养的哺乳动物(例如，犬或猫)、农业的哺乳动物(例如，牛、羊、猪、马)或实验哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、兔、仓鼠、豚鼠)。
术语“选择性结合分子”、“抗原结合分子”和“结合配偶体”可互换地表示选择性地但不一定特异性地与特定的靶部分结合的分子。结合是非随机的。选择性结合分子可从多种抗体和抗体片段或其变更中选择(例如，多或单克隆、肽体（peptibodies）、人化的、前端缩短的（foreshortened）、模拟物和本领域中可用的其它)、适体(其可以是DNA、RNA或多种蛋白质形式，并可以用其他功能部分例如酶部分或显色部分进一步修饰)，或可以对于特定的生物系统是特定的。蛋白可以与特定的“标签”例如“His-标签”一起表达，并且熟练的实施者会确定适当类型的选择性结合分子或可检测的标记是合适的。此列表并未穷举。
如本文使用的"多核苷酸"包括对脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其类似物（其具有天然核糖核苷酸的基本性质，所述基本性质在于它们与天然存在的核苷酸一样在严格的杂交条件下与基本上相同的核苷酸序列杂交，和/或允许与天然存在的核苷酸一样翻译成相同的氨基酸）的提及。多核苷酸可以是天然或异源结构或调控基因的全长或子序列。除非另外指出，否则该术语包括对特定序列和其互补序列的提及。因此，带有为了稳定性或其它原因而修饰的主链的DNA或RNA是如本文意指的术语"多核苷酸"。此外，包括不常见的碱基（例如肌苷）或修饰的碱基（例如三苯甲基化的碱基）（提出仅两个实例）的DNA或RNA，是如本文使用的术语多核苷酸。应该理解的是，已对DNA和RNA作出了多种修饰，这用于本领域技术人员已知的许多有用目的。如本文中使用的术语多核苷酸包括这类经化学、酶或代谢修饰的形式的多核苷酸，以及病毒和细胞（尤其包括简单和复杂的细胞）所特有的化学形式的DNA和RNA。
附图简述
图1说明了刺激敏感性微粒(例如，热不稳定性微球)的示意图，所述刺激敏感性微粒在其外部表面上与抗原(Ag)连接并且含有或包封一种或多种报告分子(例如，靶多核苷酸和/或可检测的标记)。刺激敏感性微粒(例如，热不稳定性微球)当加入到生物样本时是完整的(A)，并在暴露于刺激(例如，阈值温度、阈值pH)达到足以释放一种或多种报告分子(例如，靶多核苷酸和/或可检测的标记)的一段时间时熔化或降解(B)。
图2说明了将热不稳定性微球使用作为对照试剂以示踪稀少细胞群体(例如，CTC)的细胞的分离和分离的稀少细胞群体的细胞的基因组DNA的分析。A. 标记的微球(例如，带有荧光基团的微球)，可与稀少群体的细胞一起被捕获（例如，被保留在微流体芯片中），所述微球具有在大小上约10-30 μm的范围(例如，约20 µm)内的平均或均值直径，并与半抗原或免疫原性抗原连接。B. 从捕获的稀少细胞群体的细胞和热不稳定性微球中分离基因组DNA。作为所述方法的一部分，将细胞和微球暴露于热，以从细胞中分离基因组DNA，引起微球的热诱导性降解或熔化，释放在微球内含有的靶多核苷酸。C. 扩增和分析（例如，基于扩增信号和/或测序）基因组DNA和靶多核苷酸。
详述
1. 引言
本文公开的实施方案部分地基于合成的刺激敏感性微粒（例如，微球）的开发，和它们示踪稀少细胞分离方法（其包括例如，细胞标记、回收、DNA回收、模板扩增和/或稀少等位基因的检测限制）的一个或多个步骤的应用。在多个实施方案中，刺激敏感性微粒(例如，热不稳定性微球)被用于对照和指标化细胞的回收和在进一步的操作和分析期间指标化DNA样本。分析可以是多种分子测定例如，但不限于，定量PCR (Q-PCR)和DNA测序。在从全血分离稀少细胞中一个考虑是对于各具体分离实例的实际回收效率。为确定稀少细胞回收的效率，我们开发了内部对照的方法。此内部对照可用于校准从生物样本中分离细胞和从分离的细胞中分离基因组DNA的性能。刺激敏感性微粒(例如，热不稳定性荧光微球)可用于内部对照和指标化的方法。我们的方法学支持临床样本分析。用于此应用的试剂不含有会混淆后续分子分析的组分。
2. 刺激敏感性微粒
a. 概述
通常，刺激敏感性微粒(例如，热不稳定性微球)包含壳，其在暴露于刺激(例如，热、pH、辐射、光、酶)时溶解和/或分解（dissemble）并且壳用还可用于分离稀少细胞群体(例如，CTC)的细胞的免疫原性表位或抗原或表面或其它标志物在其外部表面上装饰。一种或多种报告分子（例如，不存在于稀少细胞群体的细胞中的靶多核苷酸序列和任选可检测的标记）可被包封在刺激敏感性微粒的壳内。
尺寸/形状：通常，期望的是，微粒具有与细胞靶类似的尺寸。在多个实施方案中，微粒的形状是球，但微粒可以是任何合适的形状，其模拟被示踪的细胞群体中的细胞的形状（例如，球状的、椭圆体、杆状的）。原核细胞通常在大小上是1-5 µm，而真核细胞在大小上是10 - 100 µm，由此微粒可根据具体应用满足从1µm-100µm的范围的大小。微粒或微球可具有被示踪的稀少细胞群体的细胞的平均直径（例如，在约1-100 µm的范围内，例如，约20-30 µm、约1-10 µm或约10-100 µm，取决于是原核还是真核细胞被示踪）。
表面性质：微粒的表面允许它通过本文描述的方法（例如，通过抗体捕获抗原）纯化或识别。在不同的实施方案中，微粒在其表面上展示抗原，其允许抗体捕获或以其他方式可区别于样本细胞。用抗原或免疫原性表位的装饰也允许微粒用作在混合细胞群体的FACS分选期间的有用的对照。在不同的实施方案中，表面捕获抗原或免疫原性表位可以是半抗原（例如洋地黄毒苷）、其它化学品或配体（例如生物素）、或蛋白重组体或纯化的蛋白（例如Epcam或IgG-Epcam融合蛋白）或荧光基团（其可以被检测和计算）。
递送和可检测性：微粒可通过视觉和分子方法的任一或两者检测。为允许两者，对照可含有一种或多种报告分子（其可视觉地和/或通过分子方法检测）。因此可使用包装入微粒的任何视觉的或分子的报告分子。这可包括大小和形状、表面表位（其可被染色用于分开的评估）或染料的包封（其允许直接显色用于可通过分子方法检测的颗粒和/或多核苷酸或多肽的荧光检测）。
成分：微粒的材料成分被设计以在其内部包封或含有一种或多种报告分子。材料还适合于或能够作为用捕获抗原或免疫原性表位标记的表面。微粒，在物理状态改变时或在暴露于刺激(例如，阈值温度、阈值pH、辐射、光、与酶接触)时，释放一种或多种报告分子(例如，靶多核苷酸、可检测的标记)。微粒壳的化学成分可以是许多合适的可能的任一种。
在多个实施方案中，微粒的刺激敏感性壳可以由一种或多种聚合物、单层胶束、双层胶束、脂质体、树状聚体或树状体和/或碳纳米管组成。在多个实施方案中，刺激敏感性微粒在水性缓冲液中于升高的温度下(在55℃下3小时/在70℃下1小时)降解，例如，是热不稳定的。微粒可以在其外表面上被衍生（例如，用COOH或其它化学官能度）以能够与一种或多种免疫原性表位或表面或其它标志物（例如，生物素、Ep-CAM或洋地黄毒苷）连接，用于与稀少细胞群体的细胞并发分离（例如，使用磁分离技术）。微粒另外含有一种或多种报告分子。例如，刺激敏感性微粒可装载有可检测的标记（例如，荧光标记），以促进可视化。刺激敏感性微粒可另外含DNA靶多核苷酸序列。此DNA靶可以是核酸序列，其不存在于稀少细胞群体的细胞中并且不从稀少细胞群体的细胞中扩增(例如，是非人的、突变的或合成的)，并可与从稀少细胞群体的细胞中分离的基因组DNA一起并发地定量和分析(例如，扩增和/或测序)。
在多个实施方案中，在将抗体或其片段用于从细胞混合物中并发分离稀少细胞和装饰的刺激敏感性微粒之前将刺激敏感性微粒引入全血中。含刺激敏感性微粒的全血可经抗体标记，并使用固体基质（例如，磁体、珠、微流体芯片）分级以分离所有抗体标记的细胞和微粒。可将细胞和刺激敏感性微粒例如通过使用荧光标记定量以验证身份。微粒回收是芯片性能的回收效率的量度。
在多个实施方案中，将稀少细胞群体的细胞和刺激敏感性微粒从固体基质中回收并使用本领域已知的DNA分离程序处理。DNA分离程序常常涉及升高的温度（例如，至至少约50℃）。对升高的温度(例如，大于约50℃)敏感的热不稳定性微粒或微球可被方便地用于示踪从分离的稀少细胞群体的细胞中回收基因组DNA的效率，使得随着它们在暴露于阈值温度时降解，从微粒中释放一种或多种报告分子(例如，靶多核苷酸和/或可检测的标记)。随后使用本领域中已知的方法，将靶多核苷酸与从稀少细胞群体的细胞中分离的基因组DNA一起定量和/或分析。
在多个实施方案中，刺激敏感性微粒不通过磁捕获回收但用作稀少事件的分离的对照。在这类实施方案中，刺激敏感性微粒可用可检测的标记（其可被分选）标记。在一些实施方案中，刺激敏感性微粒用荧光基团标记，与包含稀少细胞群体的细胞的细胞混合物混合，并且将细胞混合物通过荧光活化的细胞分选(FACS)分选。通过分选鉴定的标记的刺激敏感性微粒代表经历分选的细胞混合物中的稀少细胞群体的细胞。在这类实施方案中，可不进行磁捕获，但荧光分选和分子分析仍可进行。按需要，刺激敏感性微粒和稀少细胞群体的细胞可通过细胞分选方法捕获。
b. 微粒壳
i. 温度敏感性壳
在不同的实施方案中，微粒是热不稳定的或热应答的，并在暴露于阈值温度时降解。
例如，在一些实施方案中，热不稳定性微粒或微球的壳由一种或多种聚合物组成。在不同的实施方案中，在热不稳定性微粒或微球中使用的一种或多种聚合物具有明确的熔点，例如，在10或更少℃内（例如在9、8、7、6、5或更少℃内）经历从固相至熔融相/流动相/液相的转变。在不同的实施方案中，聚合物是同聚物。在不同的实施方案中，聚合物由基本上均匀的分子量的单体(例如，具有约10%或更小的分子量的偏差的单体，其中分子量依据数量平均摩尔质量统计方法确定)组成。
在某些实施方案中，一种或多种聚合物在用于从稀少细胞中释放核酸的方法步骤的温度的相应温度下在足以释放靶多核苷酸的水性溶液中熔化或经历降解。在多个实施方案中，一种或多种聚合物在水性溶液中于大于约50℃的温度下（例如，于大于约55℃、60℃、65℃或70℃的温度下）在足以释放在微粒或微球中含有的靶多核苷酸的时间段内熔化(即，经历从固相至熔融相/流动相/液相的转变)或降解。例如，在多个实施方案中，微粒或微球的熔化和降解在暴露于升高的温度5或更少的小时（例如，5、4、3、2、1或0.5小时）的时间段时(例如，在55℃下3小时或在70℃下1小时)发生。温度越高，降解或熔化在越短的时间段内发生。优选地，呈固相的一种或多种热不稳定性聚合物对于包含于微粒中的一种或多种报告分子(例如，靶多核苷酸和/或可检测的标记)是不可渗透的。热不稳定性聚合物是本领域中已知的，并可在本发明的微粒中找到用途。
在多个实施方案中，使用的聚合物是生物可降解的和/或生物相容的。在一些实施方案中，热不稳定性聚合物选自聚己内酯(PCL)、聚L-赖氨酸(PLL)、聚苯乙烯、聚异丁烯酸甲酯(PMMA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚异丙基丙烯酰胺、丁基乙烯基醚、顺式氯丁二烯、己二酸乙二酯、氧化乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、乙基乙烯基醚、反式异戊二烯、聚(己烯1)、聚(异丁烯酸甲酯)、聚(氯乙烯)、氧化丙烯、丙基乙烯基醚和乙烯基乙缩醛。在一些实施方案中，热不稳定性聚合物是生物可降解的聚酯。在一些实施方案中，热不稳定性聚合物选自聚己内酯(PCL)、聚L-赖氨酸(PLL)、聚苯乙烯、聚异丁烯酸甲酯(PMMA)和聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)。在一些实施方案中，热不稳定性聚合物是聚己内酯(PCL)。在一些实施方案中，聚己内酯(PCL)包括在约Mn 10,000-约Mn 90,000的范围（例如，约Mn 10,000-14,000、Mn45,000、或Mn 70,000-90,000）内的分子量，其中Mn是指数量平均摩尔质量。在一些实施方案中，热不稳定性聚合物是聚羟基链烷酸酯。
其它材料也找到在热不稳定性微粒壳的制备中的用途，所述材料包括在以下文献中描述的那些：Curcio等人, AAPS PharmSciTech. (2010) 11(2):652-62；Cirillo等人,J Biomater Sci Polym Ed. (2011) 22(4-6):823-44；Curcio等人, Eur J PharmBiopharm. (2010) 76(1):48-55；Huang等人, Electrophoresis. (2011) 32(23):3364-70；Joshi等人, Acta Biomater. (2013) 9(5):6526-34；和Ma等人, J Biomed Mater ResB Appl Biomater. (2011) Nov 25. doi: 10.1002/jbm.b.31900。Curcio等人, AAPSPharmSciTech. (2010)描述了水凝胶，其通过分别作为助亲水的（pro-hydrophilic）多功能的大分子单体和交联剂的水解的异丁烯酸化的明胶(HGel-MA)和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺和作为热应答性单体的N-异丙基丙烯酰胺的自由基聚合而合成，并且其具有约36-37℃的转变温度。Cirillo等人描述了热和pH双重敏感性微粒，其由作为交联剂的异丁烯酸牛血清白蛋白(BSA-MA)和异丁烯酸钠(NaMA)和/或N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)组成。Curcio等人, Eur J Pharm Biopharm. (2010)描述了微球状的水凝胶，其通过将N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)与明胶接枝合成，具有在约34-35℃的范围内的转变温度。Huang等人描述了可调的微粒，其包含聚(N-异丙基丙烯酰胺) (PNIPAM)并通过加入不同大小和不同比例的聚乙二醇(PEG)调节。Joshi等人描述了热和pH双重敏感性微粒，其由N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、丙基丙烯酸(PAA)和丙烯酸丁酯(BA)组成。Ma等人描绘了pH和温度敏感性自装配微胶囊/微粒，其包含羧甲基壳聚糖(CMCTS)和羧甲基壳聚糖-接枝-聚(N,N-二乙基丙烯酰胺) (CMCTS-g-PDEA)。
在不同的实施方案中，聚合物具有在微粒的外部表面上的官能团，其用于一种或多种免疫原性表位或表面或其它标志物的化学连接或衍生。用于衍生的官能团是本领域中已知的并可被使用。例证性的官能团包括羧基、氨基、酰胺基、羰基、亚胺基、碳二亚胺、羟基琥珀酰亚胺、巯基、叠氮基、重氮甲烷（diazirine）、马来酰亚胺、异氰酸酯、巯基、酰肼、醛和酐。用于交联、衍生和修饰的试剂是商售可得的，例如，得自ThermoFisher Scientific(piercenet.com)。
ii.pH应答性壳
在不同的实施方案中，微粒壳应答于阈值pH或在壳暴露于阈值pH时溶解。pH应答性微粒壳成分是本领域中已知的并可在本发明的微粒中找到用途。例如，Kondiah等人,Int J Pharm. (2013) Sep 1. pii: S0378-5173(13)00771-0描述了pH敏感性微粒，其使用三甲基-壳聚糖(TMC)、聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)和异丁烯酸(MAA)制备。Lee等人，Drug Deliv. (2010) 17(8):573-80描述了pH应答性聚(异丁烯酸(MAA)-乙二醇异丁烯酸酯(EGMA)共聚物)水凝胶微粒。Zhang等人, Langmuir. (2013) 29(1):65-74描述了pH敏感性微粒，其由油酰胺衍生物组成。
iii.脂质体的和胶束的壳
在不同的实施方案中，微粒壳由脂质体或单层或双层胶束组成。热敏感性和pH敏感性脂质体成分是本领域中已知的并可在本发明的微粒中找到用途，其包括但不限于在以下文献中描述的那些：例如，Caldeira de Araújo Lopes等人, Biomed Res Int. (2013)2013:467147；Ferreira Ddos等人, Ther Deliv. (2013) 4(9):1099-123；Hossann等人,J Control Release. (2010) 147(3):436-43；Kheirolomoom等人, J Control Release.(2013) Aug 28. pii: S0168-3659(13)00478-1；Kim等人, ACS Appl Mater Interfaces.(2013) 5(12):5648-58；Laouini等人, ACS Appl Mater Interfaces. (2013) Sep 3(PMID: 23947913)；Li等人, Int J Biol Macromol. (2013) Aug 31. pii: S0141-8130(13)00465-0；Li等人, Int J Biol Macromol. (2013) 55:69-74；Li等人, J BiomedMater Res A. (2013) Jul 27. doi: 10.1002/jbm.a.34894；Needham等人, FaradayDiscuss. (2013) 161:515-34；Won等人, J Nanosci Nanotechnol. (2013) 13(6):3792-800；和Zhang等人, Int J Biol Macromol. (2012) 51(5):1109-15。
iv.树状聚体和/或树状体
在不同的实施方案中，微粒壳由树状聚体或树状体组成。热敏感性和pH敏感性树状聚体和树状体是本领域中已知的并且可在本发明的微粒中找到用途，其包括但不限于在以下文献中描述的那些，例如，Bikram等人, Expert Opin Drug Deliv. (2008) 5(10):1077-91；Chen等人, Chemistry. (2013) 19(33):11051-61；Kojima等人, Biopolymers.(2013) Jul 26. doi: 10.1002/bip.22276；Li等人, Bioconjug Chem. (2013) 24(2):282-90；Rajasekhar等人, New J Chem. (2012) 36(2):340-349；Zhao等人, Int JPharm. (2011) 409(1-2):229-36；和Adeli等人, Nanomedicine. 2013 Jun 6. pii:S1549-9634(13)00264-5。
c.报告分子
刺激敏感性微粒通常在壳的内部空间中包含一种或多种报告分子。在不同的实施方案中，一种或多种报告分子包括靶多核苷酸和/或可检测的标记。
i.靶多核苷酸
在一些实施方案中，微粒在它们的内部空间中含有或包封靶多核苷酸。在多个实施方案中，靶多核苷酸是多核苷酸序列，其不存在于稀少细胞群体(例如，CTC)的细胞中并且不可从稀少细胞群体(例如，CTC)的细胞中扩增或测序。在一些实施方案中，靶多核苷酸是具有与稀少细胞群体(例如，CTC)的细胞中的类似序列可区别的扩增性能的序列变体。在多个实施方案中，靶多核苷酸是多核苷酸序列，其不是哺乳动物的或其是非人的。在多个实施方案中，靶多核苷酸是多核苷酸序列，其是突变的人的DNA序列或合成的或人造的DNA序列。靶多核苷酸通常具有可被完全包含于微粒中的大小。在不同的实施方案中，靶多核苷酸是质粒的一部分或在质粒中。在多个实施方案中，靶多核苷酸可以是DNA和/或RNA或其衍生物或类似物。
靶多核苷酸的一个实例包括编码质粒维持蛋白(ccdB)的多核苷酸。靶多核苷酸的另一实例包括编码3',5'-环腺苷一磷酸磷酸二酯酶cpdA的多核苷酸。
ii.可检测的标记
在一些实施方案中，微粒与可检测的标记连接，或在它们的内部空间中含有或包封可检测的标记。通常，在其包含于微粒中时，所用的可检测标记可使用本领域中已知的任何方法检测。在不同的实施方案中，可检测的标记是荧光基团、光致发光的标记或放射性的标记。
在一些实施方案中，可检测的标记是荧光基团。例证性的荧光基团包括但不限于氧杂蒽衍生物(例如，荧光素、若丹明、俄勒冈绿、伊红和德克萨斯红)、花青衍生物(例如，花青、靛炭花青、氧杂炭花青、硫杂炭花青和部花青)、萘衍生物(例如，丹酰和氟硅酸钠衍生物)、香豆素衍生物(例如，羟基香豆素、甲氧基香豆素和氨基香豆素)、噁二唑衍生物(例如，吡啶基噁唑、硝基苯噁二唑和苯噁二唑)、芘衍生物(例如，瀑布蓝)、噁嗪衍生物(例如，尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170)、吖啶衍生物(例如，二氨基吖啶、吖啶橙、吖啶黄)、芳基甲川衍生物(例如，金胺、结晶紫、孔雀石绿)和四吡咯衍生物(例如，卟吩、酞菁、胆红素)。在一些实施方案中，荧光基团是荧光素，例如，FAM或异硫氰酸荧光素。
在不同的实施方案中，可检测的标记是放射性的同位素。找到用途的放射性标记包括但不限于3H、125I、35S、14C、32P、99Tc、203Pb、67Ga、68Ga、72As、111In、113mIn、97Ru、62Cu、64Cu、52Fe、52mMn、51Cr、186Re、188Re、77As、90Y、67Cu、169Er、121Sn、127Te、142Pr、143Pr、198Au、199Au、161Tb、109Pd、165Dy、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、159Gd、166Ho、172Tm、169Yb、175Yb、177Lu、105Rh和111Ag。
在多个实施方案中，可检测的标记可以是光致发光的组分。光致发光的组分可以是可通过光检测而检测的任何已知的或可得的探针、金属或半导体材料。例证性光致发光的组分是半导体材料的纳米晶体，其包括但不限于“量子点”(QD)、量子杆(QR)和量子线(QW)。QD、QR和QW具有几种超过传统荧光染料的优点，其包括长发光寿命和在多种预选的波长下近似定量的光发射。QD通常包含金属硫化物或金属硒化物（例如硫化锌（ZnS）、硫化铅(PbS)，或更通常的，硒化镉(CdSe)）的半导体核。基于非重金属的QD也已经被报道了。QD通常具有1-约20 nm的直径，取决于所需的发射波长、包衣的厚度。在一个实施方案中，无机核包括荧光半导体纳米晶体或金属纳米颗粒。找到具体用途的量子点标记是其为生物相容的那些。这类量子点通常具有有机包衣的层以使得它们亲水、生物相容和提供特定的化学基团。生物相容的荧光纳米晶体是指核/壳结构量子点（其包含CdSe/ZnS），其通常具有亲水的聚合物包衣，二氧化硅，用生物分子（例如链霉抗生物素蛋白、核苷酸、肽）或化学基团衍生的表面。参见，例如，Gerion等人, Journal of Physical Chemistry (2001) 105(37):8861-8871；Pathak等人, J.Am.Chem.Soc.(2001) 123(17):4103-4104；Chan等人,Current Opinion in Biotechnology (2002) 13(1):40-46；Larson等人, Science(2003) 300(5624):1434-1436；Jaiswal等人, Nature Methods (2004) 1(1):73-78；Jaiswal等人, Trends in Cell Biology (2004) 14(9):497-504；Alivisatos等人,Annual Review of Biomedical Engineering (2005) 7:55-76；Bentzen等人,Bioconjugate Chemistry (2005) 16(6):1488-1494；Parak等人, Nanotechnology(2005) 16:R9-R25；Selvan等人, Advanced Materials (2005) 17(13):1620-1625；Jiang等人, Chemistry of Materials (2006) 18(20):4845-4854。此外，Michalet等人,Science (2005) 307(5709):538-544；和Klostranec等人, Advanced Materials (2006)18(15):1953-1964提供对用于量子点的表面聚合物包衣的全面的综述。使用的量子点是商售可得的，例如，得自Ocean NanoTech (oceannanotech.com)、NN-Labs (nn-labs.com)、Cytodiagnostics (cytodiagnostics.com)和Life Technologies(lifetechnologies.com)。
d.与外部表面连接的免疫原性表位或抗原
在一些实施方案中，微粒用一种或多种免疫原性表位或表面或其它标志物装饰，或在聚合物的外部表面上与一种或多种免疫原性表位或表面或其它标志物连接。通常，一种或多种免疫原性表位或表面或其它标志物是用于从细胞混合物中分离稀少细胞群体(例如，CTC)的细胞的相同表位或标志物。注意：在微粒的表面上的“相同”表位或表面标志物不需要在所有执行中与用于分离稀少细胞群体的表位或标志物是化学上相同的。然而，在微粒上的这样的表位或表面标志物就涉及与结合配偶体的结合而言应模拟在稀少细胞上的表位或标志物。通常，在微粒和稀少细胞上的表位或标志物将是化学上相同的或对结合配偶体具有密切相似的亲和性和选择性。
在多个实施方案中，免疫原性表位或表面或其它标志物在稀少细胞群体的细胞的表面上表达。在其中稀少细胞群体是循环肿瘤细胞(CTC)的实施方案中，与聚合物的外部表面连接的一种或多种表位来自CTC相关的标志物。例证性的CTC相关的标志物包括，例如，上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)、角蛋白19 (KRT19)、黏蛋白1 (MUC1)、癌胚抗原-相关细胞粘附分子5 (CEACAM5)、杆状病毒IAP重复包含5 (BIRC5)、分泌球蛋白家族2A成员2 (SCGB2A2)和ERBB2。在一些实施方案中，免疫原性表位或表面或其它标志物选自生物素、Ep-CAM或洋地黄毒苷。
在其它实例中，胎儿红细胞的例证性标志物包括胎儿红细胞抗原和CD71。人骨髓衍生的间充质干细胞的例证性阳性标志物包括，例如，CD10、CD13、CD15、CD29、CD44、CD49d、CD49e、CD51、CD54、CD56、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD117、CD120a、CD120b、CD166、CD271和CD309。例证性人多能性干细胞标志物包括，例如，TRA-1-81和SSEA-3。例证性癌干细胞标志物包括例如，CD13、CD133、CD34、CD44、细胞角蛋白(CK5、CK14、CK17)、AFP /甲胎蛋白；L1CAM / CD107；β-联蛋白/ CTNNB1；LMO2；BMI-1；CD64 / Fc γ RI；Nodal；BMP-4；CD74；Notch-1；CD2；CD90 / THY-1；PDGFRB / CD140b；CD3d；CD96；平足蛋白（Podoplanin）；CD3e；CD123 / IL3RA；PTEN；CD3g；CD166 / ALCAM；Sonic Hedgehog；CD16 / Fc γ RIII；c-Kit / CD117；STAT3；CD18；CXCL12 / SDF-1；黏结蛋白聚糖-1 / SDC1 / CD138；CD19；CXCR4；转铁蛋白受体/ TFRC / CD71；CD20 / MS4A1；饰胶蛋白聚糖；波形蛋白；CD27；E-钙粘蛋白/钙粘蛋白1；CD29 /整联蛋白β1 / ITGB1；EGFR / ErbB1；CD31 / PECAM-1；内皮糖蛋白/ CD105；CD34；EpCAM / TROP-1；CD38；Fc ε RI A / FCER1A和在Klonish等人,Trends in Molecular Medicine, (2008) 14(10)450-460中概述的那些。另外的癌干细胞标志物包括，例如，膀胱癌干细胞标志物(例如，CD44和CD47)；乳腺癌干细胞标志物(例如，醛脱氢酶1-A1/ALDH1A；GLI-1；BMI-1；GLI-2；CD2；IL-1 α/IL-1F1；CD4；IL-6 R α；CXCR4；CXCR1/IL-8 RA；DLL4整联蛋白α 6/CD49f；EpCAM/TROP；PTEN；ErbB2/Her2)；结肠癌干细胞标志物(例如，ALCAM/CD166；EpCAM/TROP1；醛脱氢酶1-A1/ALDH1A1；GLI-1；CD44；Musashi-1；DPPIV/CD26)；胃癌干细胞标志物(例如，CD44和DLL4)；神经胶质瘤/成神经管细胞瘤癌干细胞标志物(例如，A20/TNFAIP3；整联蛋白α6/CD49f；ABCG2；L1CAM；CX3CL1/CXXXC趋化分子；Musashi-1；CX3CR1 c-Myc；CXCR4；巢蛋白；HIF-2 α/EPAS1；平足蛋白；IL-6Rα)；头&颈癌干细胞标志物(例如，ABCG2；BMI-1；醛脱氢酶1-A1/ALDH1A1；CD44)；白血病癌干细胞标志物(例如，BMI-1 GLI-2；CD34；IL-3Rα；CD38 MICL/CLEC12A；CD44；Musashi-2；CD47；SCF R/c-kit；CD96；TIM-3；GLI-1)；肝癌干细胞标志物(例如，甲胎蛋白/AFP CD90/Thy1；氨基肽酶N/ANPEP；NF2/Merlin)；肺癌干细胞标志物(例如，ABCG2；EpCAM/TROP1；醛脱氢酶1-A1/ALDH1A1；SCF R/c-kit；CD90/Thy1)；黑色素瘤癌干细胞标志物(例如，ABCB5；MS4A1/CD20；ABCG2巢蛋白；ALCAM/CD166；NGF；R/TNFRSF16)；骨髓瘤癌干细胞标志物(例如，CD19；MS4A1/CD20；CD27/TNFRSF7；黏结蛋白聚糖-1/CD138；CD38)；骨肉瘤癌干细胞标志物(例如，ABCG2；STRO-1；巢蛋白)；卵巢癌干细胞标志物(例如，α-甲基酰基-CoA消旋酶/AMACR；SCF R/c-kit; CD44)；胰腺癌干细胞标志物(例如，BMI-1；CXCR4；CD24；EpCAM/TROP1；CD44)；前列腺癌干细胞标志物(例如，ABCG2；CD44；α-甲基酰基-CoA消旋酶/AMACR c-Myc；BMI-1)。
3.示踪从细胞混合物中回收稀少细胞群体的方法
a.概述
微粒找到在监测从复杂的混合物中捕获和回收在稀少细胞群体中的细胞中的用途。微粒用作内部过程的对照并可被设计或选择具有待示踪的目的细胞的近似形状和大小，并可用于在整个过程(例如，开始于从复杂混合物中捕获并结束于基因组DNA分析)中监测对样本的捕获、回收和加工的效率和精确度。在多个实施方案中，将上面和本文中描述的微粒在暴露于结合配偶体之前掺入或引入细胞混合物(例如，全血)。随后将含刺激敏感性微粒(例如，热不稳定性微球)的细胞混合物和与免疫原性表位或表面或其它标志物的结合配偶体接触用于分离微粒和稀少细胞群体(例如，CTC)的细胞。可将结合配偶体与固体基质(例如，珠、磁体、微流体芯片)连接，所述固体基质允许从细胞混合物中选择性地和并发地分离稀少细胞群体的细胞和微粒。分离的细胞和微粒通过使用与结合配偶体和/或刺激敏感性微粒(例如，热不稳定性微球)连接的可检测的标记计数。微粒回收是对从细胞混合物中回收稀少细胞群体的细胞的效率的量度。在某些实施方案中，结合的细胞和微粒使用磁泳（magentophoretic）技术分离。在一些实施中，磁泳分离使用微流体芯片实现，在所述微流体芯片中样品流和一种或多种缓冲液流以层流形式并发地引入分离室。这类技术的实例（其使用了鞘流芯片）描述于提交于2009年6月10日的美国专利申请号12/813,285 (作为2011/0003303公布)，其通过引用以其整体结合到本文中。
在不同的实施方案中，将稀少细胞群体的细胞和微粒从固体基质中回收并使其经历本领域中已知的基因组DNA分离程序。基因组DNA分离程序通常涉及升高的温度(例如，大于约50℃)并且与热不稳定性微粒的使用是相容的。热不稳定性微粒对阈值温度的暴露随着它们溶解和/或降解从微粒中放出或释放一种或多种报告分子(例如，靶多核苷酸序列)。使用本领域中已知的方法将从微粒中释放的靶多核苷酸和来自稀少细胞群体的细胞的基因组DNA并发地定量和分析(例如，扩增和/或测序)。
b.将预定数量的刺激敏感性微粒与被怀疑包含稀少细胞群体的细胞的细胞混合物混合
将预定数量的刺激敏感性微粒(例如，热不稳定性微球)加入并均质混合入(例如，彻底均匀地分布)包含细胞混合物的生物样本，所述细胞混合物被怀疑包含稀少细胞群体(例如，CTC)的一个或多个细胞。
在多个实施方案中，方法另外包括获得生物样本的步骤，所述生物样本被怀疑包含稀少细胞群体的一个或多个细胞。生物样本可包括培养的细胞或可从受试者获得。在多个实施方案中，来自受试者的生物样本是流体生物样本，例如，羊水、水状液、血和血浆(并且本文中血是指血浆组分，除非另外清楚地声明或在上下文中指出)、耳垢(耳蜡)、考珀液、chime、间质液、淋巴液、哺乳动物的乳、粘液、胸膜液、脓、唾液、皮脂、精液、血清、汗泪、尿、阴道分泌物、呕吐物和渗出物(从创口或损伤)。
在一些实施方案中，生物样本是来自受试者的全血样本。在其中试图分析的稀少细胞群体是CTC的情况下，受试者被怀疑在生物样本中，例如，在全血样本中具有CTC。
加入的刺激敏感性微粒(例如，热不稳定性微球)的预定数量可取决于样本的体积或被怀疑包含于样本中的稀少细胞群体的细胞的数量。加入至包含细胞混合物的样本的微粒的数量通常在10-100个微粒（例如，10、20、25、30、40、50、60、70、75、80、90或100个微粒）的范围内。在一些实施方案中，加入至生物样本的刺激敏感性微粒(例如，热不稳定性微球)的数量基于待评估的回收分辨率的水平确定。例如，为验证稀少细胞群体的少量细胞的回收的高分辨率，将少量的微粒(例如，少于20个微粒，例如，10、9、8、7、6或5个微粒)加入生物样本。在多个实施方案中，可将两种不同微粒(例如，具有不同的靶多核苷酸序列或具有不同的免疫原性表位或表面或其它标志物的微粒)以两种不同浓度（低和高）掺入血样。例如，对于低浓度，约10个球被混合入生物样本；对于高浓度，约100个球被混合入生物样本。
c.加入与在刺激敏感性微粒和稀少细胞群体的细胞上的免疫原性表位或表面或其它标志物结合的结合配偶体
在将微粒掺入或混合入生物样本中的细胞混合物（其被怀疑包含稀少细胞群体(例如，CTC)的一个或多个细胞）之后，将生物样本（其包含微粒和细胞）与一种或多种结合配偶体或抗原结合分子（其结合至与微粒的外部表面连接并且在稀少细胞群体的细胞上或内的免疫原性表位或表面或其它标志物）在允许结合配偶体或抗原结合分子与免疫原性表位或表面或其它标志物结合的条件下接触。一种或多种结合配偶体或抗原结合分子可以是抗体(或其片段)或非抗体分子。
i.与表位结合的抗体或其片段
在多个实施方案中，结合配偶体或抗原结合分子是与免疫原性表位结合的抗体或抗体片段。用于本发明的方法的与免疫原性表位(例如，CTC标志物)结合的抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人化的抗体、人抗体和其片段。
用于本发明的方法的抗体片段可通过抗体的蛋白水解或通过编码片段的DNA的大肠杆菌中的表达而制备。抗体片段可通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全抗体而获得。例如，抗体片段可通过用胃蛋白酶酶切抗体而制备以提供标示为F(ab')2的片段。可使用硫醇还原剂和任选针对巯基基团（其由二硫键的裂解而产生）的封闭基团进一步裂解此片段以产生Fab'单价片段。替代地，使用胃蛋白酶的酶切直接产生两个单价Fab'片段和一个Fc片段。这些方法通过例如Goldenberg,美国专利号4,036,945和4,331,647和其中包含的参考文献而描述。这些专利通过引用以其整体结合到本文中。还参见Nisonhoff等人,Arch. Biochem. Biophys. 89:230 (1960)；Porter, Biochem. J. 73:119 (1959):Edelman等人, METHODS IN ENZYMOLOG Y, 卷1，第422页(Academic Press 1967)；和Coligan等人, Current Protocols in Immunology（免疫学中的现行方案）, Wiley，2012年8月1日更新，例如，在段2.8.1-2.8.10和2.10.1-2.10.4中。
也可使用裂解抗体的其它方法（例如分离重链以形成单价的轻-重链片段，进一步裂解片段，或其它酶、化学或遗传学技术），只要所述片段与被完整的抗体识别的抗原结合。
例如，Fv片段包含缔合的VH和VL链。此缔合可以是非共价的，如在Inbar等人,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659 (1972)中所述。替代地，可将可变链通过分子间的二硫键连接或通过化学品例如戊二醛交联。参见例如，Sandhu, Crit Rev Biotechnol.1992;12(5-6):437-62。在一些实施方案中，Fv片段包含由肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)通过构建包含编码由寡核苷酸连接的VH和VL结构域的DNA序列的结构基因而制备。将此结构基因插入表达载体，其随后被引入宿主细胞（例如大肠杆菌）中。重组宿主细胞合成具有桥接两个V结构域的接头肽的单一多肽链。用于制备sFv的方法通过以下描述：例如Whitlow等人, METHODS: A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY（方法：酶学中的方法指南），卷2，第97页(1991)；Bird等人, Science 242:423-426 (1988)；Ladner等人，美国专利号4,946,778；Pack等人, BioTechnology 11:1271 77 (1993)；和Sandhu,同上。
适合与本发明的方法一起使用的另一种形式的抗体片段是编码单一互补决定区(CDR)的肽。CDR肽("最小识别单位")可通过构建编码目的抗体的CDR的基因而获得。这类基因通过以下制备：例如使用聚合酶链反应从产生抗体的细胞的RNA中合成可变区。参见，例如，Larrick等人, METHODS: A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOG Y（方法：酶学中的方法指南）, 卷2，第106页(1991)iv.小的有机化合物。
在一些实施方案中，抗-表位抗体是单域抗体(sdAb)或纳米体（nanobody）。单域抗体或纳米体是缺乏轻链的全功能抗体；它们是包含单一可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)的重链抗体。和全抗体一样，单域抗体或纳米体能够选择性地与特定抗原结合。具有仅12-15 kDa的分子量的单域抗体比由两条重链和两条轻链组成的普通抗体(150–160 kDa)小得多，甚至比Fab片段(约50 kDa，一条轻链和半条重链)和单链可变片段(约25kDa，两个可变结构域，一个来自轻链和一个来自重链)小。
与Ep-CAM特异性结合的抗体是商售可得的和可找到用途，例如得自EMDMillipore (millipore.com)、OriGene (origene.com)、Abcam (abcam.com)、CellSignaling Technology (cellsignal.com)、StemCell Technologies (stemcell.com)、R&D Systems (rndsystems.com)、eBioscience (ebioscience.com)、Santa CruzBiotechnology (scbt.com)和Miltenyi Biotec (miltenybiotec.com)。与洋地黄毒苷特异性结合的抗体是商售可得的和找到用途，例如得自Origene、Acris Antibodies(us.acris-antibodies.com)、Abcam、Life Technologies、Santa Cruz Biotechnology、Novus Biologicals (novusbio.com)。
ii.非抗体结合配偶体或抗原结合分子
在多个实施方案中，结合配偶体或抗原结合分子是非抗体结合蛋白。已经开发蛋白分子，其以类似于抗体的方式靶向和结合至靶。这些“抗体模拟物”的某些将非免疫球蛋白蛋白支架用作替代的蛋白框架用于抗体的可变区。
例如，Ladner等人(美国专利号5,260,203)描述了单一多肽链结合分子，其具有与聚集的、但分子上分离的抗体的轻链和重链可变区类似的结合特异性。单链结合分子含有通过肽接头连接的抗体的重链和轻链可变区两者的抗原结合位点，并折叠成与两个肽抗体的结构类似的结构。单链结合分子表现出几种超过传统抗体的优点，其包括较小的大小、较大的稳定性和较容易被修饰。
Ku等人(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(14):6552-6556 (1995))公开了基于细胞色素b562的抗体的替代物。Ku等人(1995)生成了文库，其中将细胞色素b562的两个环随机化和选择用于针对牛血清白蛋白的结合。发现单个的突变与抗BSA抗体类似地选择性地结合BSA。
Lipovsek等人(美国专利号6,818,418和7,115,396)公开了抗体模拟物，其特征是纤连蛋白或纤连蛋白样蛋白支架和至少一个可变的环。被称为Adnectin的这些基于纤连蛋白的抗体模拟物表现出天然或工程化抗体的许多相同的特性，其包括对任何靶配体的高亲和性和特异性。进化（evolving）新的或改进的结合蛋白的任何技术可与这些抗体模拟物一起使用。
这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构与IgG重链的可变区的结构类似。因此，这些模拟物表现出在性能和亲和性上与天然抗体的抗原结合性质类似的抗原结合性质。另外，这些基于纤连蛋白的抗体模拟物表现出超过抗体和抗体片段的某些益处。例如，这些抗体模拟物不依赖于用于天然折叠稳定性的二硫键，并因此在通常会破坏抗体的条件下是稳定的。此外，因为这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构与IgG重链的结构是类似的，所以可在体外使用环的随机化和改组的方法，其与体内抗体的亲和力成熟的方法是类似的。
Beste等人(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96(5): 1898-1903 (1999))公开了基于脂笼蛋白支架的抗体模拟物(Anticalin®)。脂笼蛋白由在蛋白末端带有四个高变环的β桶组成。Beste (1999)使环经历随机诱变并针对例如与荧光素结合选择。三个变体表现出与荧光素的特异性结合，一个变体表现出与抗荧光素抗体的结合类似的结合。进一步的分析揭示所有随机化位点是可变的，这表明Anticalin®适合用作抗体的替代物。Anticalins®是小的单链肽（通常在160和180个残基之间），其提供几种超过抗体的优点，包括减少生产费用、增加储存稳定性和降低免疫反应。
Hamilton等人(美国专利号5,770,380)公开了合成的抗体模拟物，其使用与用做结合位点的多个可变肽环连接的杯芳烃(calixarene)的刚性、非肽有机支架。肽环相对于彼此都从杯芳烃几何上的同侧伸出。因为此几何构型，所有的环对于结合都是可利用的，这增加了对配体的结合亲和性。然而，与其它抗体模拟物相比，基于杯芳烃的抗体模拟物不专有地由肽组成，并因此对于通过蛋白酶的攻击不那么易受损。支架不完全由肽、DNA或RNA组成，这说明此抗体模拟物在极端环境条件下是相对稳定的并且具有长的生命期限。此外，因为基于杯芳烃的抗体模拟物相对小，它不大可能产生免疫原性应答。
Murali等人(Cell. MoI. Biol. 49(2):209-216 (2003))讨论了用于将抗体还原成较小的肽模拟物的方法，所述肽模拟物被称为“抗体样结合肽模拟物”(ABiP)，其也可用作抗体的替代物。
Silverman等人(Nat. Biotechnol. (2005), 23: 1556-1561 )公开了融合蛋白，其为包含多个被称为"avimer"的结构域的单链多肽。Avimer，其通过体外外显子改组和噬菌体展示从人细胞外受体结构域发展，是一类在其对多种靶分子的亲和性和特异性上与抗体有点类似的结合蛋白。所得多域蛋白可包含多个独立的结合结构域，其与单一表位结合蛋白相比可显示改善的亲和性（在某些情况下亚-纳摩尔）和特异性。关于avimer的构建方法和用途的另外的细节被公开于例如美国专利申请公开号2004/0175756、2005/0048512、2005/0053973、2005/0089932和2005/0221384中。
除了非免疫球蛋白蛋白框架之外，抗体性质也在包括RNA分子和非天然的低聚物的化合物（例如，蛋白酶抑制剂、苯二氮、嘌呤衍生物和β-转角模拟物）中被模拟，所述化合物都适合与本发明的方法一起使用。链霉抗生物素蛋白和相关分子(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、NeutrAvidin和CaptAvidin)可被用于结合生物素。这类抗生物素蛋白类似物和缀合物是商售可得的，例如，得自Life Technologies。
d.从生物样本中并发地分离结合配偶体结合的微粒和稀少细胞群体的细胞
方法另外包括并发地分离稀少细胞群体的细胞与混合入生物样本的刺激敏感性微粒(例如，热不稳定性微球)的步骤。稀少细胞群体(例如，CTC)的细胞和微粒可使用本领域中已知的任何合适的或可应用的方法分离。在一些实施方案中，稀少细胞群体可基于免疫原性表位或标志物的表面表达分离。例如，与免疫原性表位或标志物的同源结合配偶体连接的固体支持物可用于捕获和分离稀少细胞群体的细胞。在多个实施方案中，固体支持物是与标志物的同源结合配偶体连接(例如，缀合或共价结合)的磁珠。在一些实施方案中，固体支持物是芯片，例如，微流体芯片。这类方法是本领域中已知的。
在其中稀少细胞群体是CTC的实施方案中，CTC和微粒可并发地基于其一种或多种已知的CTC-相关标志物（例如，上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)、角蛋白19 (KRT19)、黏蛋白1(MUC1)、癌胚抗原相关细胞粘附分子5 (CEACAM5)、杆状病毒IAP重复包含5 (BIRC5)、分泌球蛋白家族2A成员2 (SCGB2A2)和ERBB2）的表达浓缩和/或分离。可将这类表面表达的标志物的同源结合配偶体(例如，与标志物结合的同源配体或抗体)连接至固体支持物（例如，磁珠）并用于浓缩和分离CTC。在多个实施方案中，生物样本中的CTC通过从样本中的细胞中除去CD45+白细胞而富集。
在本领域中描述的用于浓缩和/或分离CTC的方法找到用于CTC和刺激敏感性微粒(例如，热不稳定性微球)的并发分离的用途。用于浓缩和/或分离CTC的例证性方法在例如美国公开号2011/0137018；2011/0127222；2011/0003303；2010/0317093；和2009/0053799中教导，其通过引用以其整体结合到本文中用于所有目的。用于浓缩和/或分离CTC的另外的方法（其可被应用于CTC和刺激敏感性微粒（例如，热不稳定性微球）的并发分离的本发明方法）被描述于例如Lin等人, Biosens Bioelectron. (2012) Jun 28., PMID 22784495；Yang等人, Technol Cancer Res Treat. (2012) Jul 10. PMID 22775338；O’Brien等人,J Biomed Opt. (2012) 17(6):061221, PMID 22734751；Hughes等人, J Vis Exp.(2012) Jun 15；(64). pii: 4248. doi: 10.3791/4248, PMID 22733259；Kim等人, LabChip. (2012) Jun 11, PMID 22684249；Yu等人, J Cell Biol. (2011) 192(3):373-82；和Danova等人, Expert Rev Mol Diagn. (2011) 11(5):473-85中。具有在浓缩和/或分离CTC中的用途的另外的可应用的方法和系统被描述于例如美国专利公开号2012/0129252；2012/0100560；2012/0045828；和2011/0059519中。
将从细胞混合物中分离或回收的微粒的数量与在处理前被掺入或混合入细胞混合物中的微粒的总数作比较。从细胞混合物中分离或回收的微粒的百分比代表回收稀少细胞群体的细胞的效率。定量投入细胞混合物中的和/或从细胞混合物中回收的微粒的数量可使用本领域中的任何方法而进行。在多个实施方案中，投入细胞混合物中的和/或从细胞混合物中回收的微粒的数量通过测量来自可检测的标记的信号水平而定量。可单独地针对各刺激敏感性微粒（例如，热不稳定性微球）或针对作为一组的微粒确定可检测的标记的信号。
e.使分离的微粒和分离的稀少细胞群体中的细胞经历引起微粒溶解和/或降解的刺激
在将稀少细胞群体(例如，CTC)的细胞与微粒一起并发地分离之后，将细胞和微粒暴露于足以诱导微粒的溶解和/或降解的条件下。这类条件包括：例如，暴露于阈值温度、阈值pH、酶、辐射或光。阈值温度和/或阈值pH或诱导微粒的溶解和/或降解的其它刺激将取决于微粒壳的成分。
i.阈值温度
在不同的实施方案中，微粒是温度敏感的并在暴露于阈值温度时降解以释放一种或多种报告分子（例如，靶多核苷酸和/或可检测的标记）。
热不稳定性微粒可用作对从稀少细胞群体的细胞中回收基因组DNA的效率的合适量度，特别是当颗粒降解的阈值温度接近用于从细胞中释放基因组DNA的温度时。在将稀少细胞群体(例如，CTC)的细胞与热不稳定性微粒(例如，热不稳定性微球)分离之后，将基因组DNA从细胞中分离并将一种或多种报告分子(例如，靶多核苷酸和/或可检测的标记)从微粒中分离。任何本领域中已知的方法可被用于从细胞中分离基因组DNA和从微粒中分离靶多核苷酸。为了从微粒中释放一种或多种报告分子(例如，靶多核苷酸和/或可检测的标记)，可将微粒暴露于至少约50℃(例如，至少约55℃、60℃、65℃或70℃)的升高的温度下一段时间和处于足以使热不稳定性颗粒降解并释放一种或多种报告分子(例如，靶多核苷酸和/或可检测的标记)的条件下。升高的温度越高，对于微粒降解和释放靶多核苷酸所需要的将微粒暴露于升高的温度条件的时间越少。例如，包含聚己内酯壳的热不稳定性微粒(例如，热不稳定性微球)在水性溶液中当暴露于55℃达3小时或当暴露于70℃达1小时时降解。将细胞和微粒在足以让一种或多种报告分子(例如，靶多核苷酸和/或可检测的标记)从热不稳定性微粒或微球中释放的升高的温度下孵育常常是从细胞中分离基因组DNA的实验方案的一部分（例如，失活降解基因组DNA的核酸酶）。
用于纯化和/或分离基因组DNA的方法在本领域中是周知的并可应用于本发明的方法。用于纯化和/或分离基因组DNA的商售可得的试剂盒是购买易得的。用于纯化和/或分离基因组DNA的基本方法被描述于例如Green和Sambrook, Molecular Cloning: ALaboratory Manual（分子克隆：实验手册），第4版，2012, Cold Spring HarborLaboratory Press；和Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学中的当前方案）, Wiley，更新至2012年7月31日。用于纯化或分离基因组DNA的试剂盒可从许多来源购买，所述来源包括例如，QIAGEN (在互联网上在qiagen.com)；Promega (在互联网上在promega.com)；Life Technologies (在互联网上在invitrogen.com)；GBiosciences (在互联网上在gbiosciences.com)；Sigma-Aldrich (在互联网上在sigmaaldrich.com)；Affymetrix (在互联网上在affymetrix.com)；和FermentasMolecular Biology Tools (在互联网上在fermentas.com)。
f.对来自分离的细胞的基因组DNA和从刺激敏感性微粒中释放的一种或多种报告分子并发地扩增和定量
在分离来自稀少细胞群体(例如，CTC)的细胞中的基因组DNA和从微粒中释放的一种或多种报告分子（例如，靶多核苷酸和/或可检测的标记）之后，对基因组DNA和一种或多种报告分子(例如，靶多核苷酸和/或可检测的标记)定量。
回收的/分离的基因组DNA和一种或多种报告分子（例如，靶多核苷酸和/或可检测的标记）可使用本领域中已知的任何方法定量。用于定量基因组DNA的方法在本领域中是周知的并可应用于本发明的方法（其包括对从微粒中释放的靶多核苷酸定量）。用于定量基因组DNA（例如，通过定量PCR）的商售可得的试剂盒和仪器是购买易得的，例如，得自RocheMolecular Systems/Roche Applied Sciences、Thermoscientific Dharmacon、Sigma-Aldrich、Agilent Technologies。使用的用于定量基因组DNA的基本方法被描述于例如Green和Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual（分子克隆:实验手册）,第四版, 2012, Cold Spring Harbor Laboratory Press；和Ausubel等人, CurrentProtocols in Molecular Biology（在分子生物学中的当前方案）, Wiley，更新至2012年7月31日；Waye等人, Biotechniques. (1989) 7(8):852-5；Sestili等人, MutationResearch/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis（突变研究/遗传毒理学和环境诱变）, (2006) 607(2):205–214；Georgiou等人, Analytical Biochemistry(2006) 358(2):247–256；Haque等人, BMC Biotechnology (2003) 3:20。在一些实施方案中，将来自稀少细胞群体(例如，CTC)的细胞的基因组DNA和从微粒中释放的靶多核苷酸使用定量PCR (qPCR)定量。用于进行定量PCR的技术是本领域中已知的并可应用于本发明的方法。
提供用于进行定量PCR的适用的实验方案的出版物包括，例如Bustin, “A-Z ofQuantitative PCR （定量PCR的A-Z）(IUL Biotechnology, No.5),” InternationalUniversity Line; (2004)；“Quantitative PCR Protocols (Methods in MolecularMedicine)（定量PCR方案（分子医学中的方法））” Kochanowski和Reischl,编辑, HumanaPress; (1999)；“Quantitative Real-time PCR in Applied Microbiology（应用微生物学中的定量实时PCR）,” Martin Filion (编辑), Caister Academic Press (2012)；和Arya等人, Expert Rev Mol Diagn.2005 Mar;5(2):209-19。
将从回收的微粒中分离或回收的靶多核苷酸的质量和数量与没有混合入生物样本中的预定数量的对照微粒的靶多核苷酸的质量和数量作比较。从回收的微粒中分离或回收的靶多核苷酸的质量和数量代表从稀少细胞群体(例如，CTC)的细胞中回收的基因组DNA的质量和数量。
应该理解的是，本文中描述的实施例和实施方案仅用于例证性目的，并且将向本领域技术人员建议根据其的多种修改和改变，其包含在本申请的精神和范围内和随附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其整体结合到本文中用于所有目的。

Claims (24)

1.一种热不稳定性微球，其包括：
i)热不稳定性同聚物，其包括内部空间和外部表面，其中所述同聚物在内部空间中含有靶核酸，其中所述同聚物包含明确的熔点并在大于60℃的温度下释放所述核酸，其中所述同聚物选自聚己内酯(PCL)，所述聚己内酯包含在Mn 10,000-Mn 90,000的范围中的分子重量，其中Mn是指数量平均摩尔质量，并且所述聚己内酯包含聚己内酯单体；和
ii)与所述聚合物的外部表面连接的表面捕获抗原或配体，所述表面捕获抗原或配体是循环肿瘤细胞(CTC)相关的标志物。
2.权利要求1的微球，其中所述同聚物：
a)在10或更少℃内从晶体或半晶体相至液相/熔融相/流动相转变；和/或
b)包括10％或更低的分子量的偏差的单体。
3.权利要求1的微球，其中所述微球另外包括：
iii)可检测的标记，其在包含于所述热不稳定性聚合物内时是可检测的。
4.权利要求1-3的任一项的微球，其中所述热不稳定性聚合物包含在55℃-65℃的温度范围内的明确的熔点。
5.权利要求1-3的任一项的微球，其中所述热不稳定性聚合物包含在水性缓冲液中于大于60℃的温度下降解的聚合物。
6.权利要求1-3的任一项的微球，其中所述微球具有在10-30μm的范围内的大小。
7.权利要求1-3的任一项的微球，其中所述微球具有在20-30μm的范围内的大小。
8.权利要求1-3的任一项的微球，其中所述靶核酸包括DNA。
9.权利要求1-3的任一项的微球，其中所述靶核酸包含于DNA质粒中。
10.权利要求1-3的任一项的微球，其中所述靶核酸编码非人DNA序列、突变的人DNA序列或人造的DNA序列。
11.权利要求1-3的任一项的微球，其中所述表面捕获抗原或配体选自上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)和洋地黄毒苷。
12.权利要求1-3的任一项的微球，其中所述表面捕获抗原或配体选自上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)、角蛋白19(KRT19)、黏蛋白1(MUC1)、癌胚抗原-相关细胞粘附分子5(CEACAM5)、杆状病毒IAP重复包含5(BIRC5)、分泌球蛋白家族2A成员2(SCGB2A2)和ERBB2。
13.权利要求1-3的任一项的微球，其中所述靶核酸编码选自质粒维持蛋白(ccdB)和3',5'-环腺苷一磷酸磷酸二酯酶cpdA的蛋白。
14.权利要求3的微球，其中所述可检测的标记包含于内部空间中。
15.权利要求3的微球，其中所述可检测的标记是荧光团。
16.权利要求15的微球，其中所述荧光团包含460nm的激发峰和500nm的发射峰。
17.权利要求1-3的任一项的微球，其中所述PCL包含在Mn 10,000-Mn 14,000的范围中的分子重量。
18.示踪从细胞混合物中回收稀少细胞群体的效率的方法，其包括：
a)将预定数量的权利要求1-3的任一项的热不稳定性微球与被怀疑包含稀少细胞群体的细胞的细胞混合物混合，其中与微球的外部表面连接的所述表面捕获抗原或配体是用于分离稀少细胞群体的相同表位；
b)向包含热不稳定性微球的细胞混合物中添加结合配偶体，所述结合配偶体与所述表面捕获抗原或配体结合，所述表面捕获抗原或配体是循环肿瘤细胞(CTC)相关的标志物；
c)从细胞混合物中并发地分离结合配偶体结合的微球和稀少细胞群体的细胞，其中捕获的微球的数量代表从细胞混合物中捕获稀少细胞群体中的细胞的效率；
d)在并发地从细胞中释放基因组DNA和从微球中释放靶核酸的条件下，使分离的微球和分离的稀少细胞群体中的细胞经历至少60℃的温度；和
e)并发地扩增和定量来自分离的细胞的基因组DNA和从热不稳定性微球中释放的靶核酸，其中扩增的靶核酸的量代表从分离的稀少细胞群体的细胞中回收基因组DNA的效率，由此示踪从细胞混合物中回收稀少细胞群体的效率。
19.权利要求18的方法，其中所述方法包括将预定数量的权利要求3的热不稳定性微球混合并进一步包括：
在d)之前，通过询问可检测的标记鉴定在c)期间分离的微球的数量；和
将鉴定的微球的数量与在a)中提供的预定的数量作比较。
20.权利要求18-19的任一项的方法，其中所述细胞混合物在来自患者的生物样本中。
21.权利要求20的任一项的方法，其中所述生物样本是全血。
22.权利要求18-19的任一项的方法，其中所述热不稳定性微球的预定数量在10-100个微球的范围内。
23.权利要求20的任一项的方法，其中所述患者是人。
24.权利要求18-19的任一项的方法，其中与表面捕获抗原或配体结合的结合配偶体是抗体或抗体片段。
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