JP2001508815A

JP2001508815A - カチオン性ポリマー／脂質核酸送達ビヒクル

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Publication number: JP2001508815A
Application number: JP54298297A
Authority: JP
Inventors: エム．サリバン，シーン; メン，シャオ―イン
Original assignee: セルジェネシス，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-05-29
Filing date: 1997-05-29
Publication date: 2001-07-03
Also published as: AU3290997A; EP0904031A1; CA2256900A1; US20020082237A1; US20010007771A1; EP0904031A4; AU739969B2; WO1997045069A1

Abstract

(57)【要約】新規なカチオン性ポリマーおよびカチオン性脂質、ならびにそれらを作製および使用する方法が、提供される。カチオン性ポリマーおよびカチオン性脂質は、インビトロおよびインビボで、核酸ポリマーおよびオリゴマーの、細胞への送達のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】カチオン性ポリマー／脂質核酸送達ビヒクル関連する出願に対する相互参照本願は、1996年５月29日に出願された米国暫定特許出願第60/018,377の優先権を主張する。 1.0．序論本発明は生化学の分野である。特に、ポリヌクレオチドまたは他の生物活性物質を細胞に効率的に送達する新規の組成物および方法が報告される。 2.0．背景本発明は、細胞へのポリヌクレオチドの送達に有用な、新規のカチオン性ポリマーおよびカチオン性脂質に関する。分子生物学の分野が成熟するにつれて、研究者らがポリヌクレオチドを操作することを可能にする、広範な種々の方法および技法が開発されてきた。ポリヌクレオチドは、代表的には、細胞内で特定の機能を行う目的で操作される。不運にも、ポリヌクレオチドポリマーは、（リン酸骨格のために）高度に荷電した分子であり、そして細胞膜を容易に透過しない。このように、遺伝子工学で得られる進歩とともに、研究者らが遺伝子操作された物質を細胞中に導入し得る方法における進歩もまた、得られている。遺伝子操作されたポリヌクレオチドを細胞に送達するために開発された方法の１つは、リポソームの使用を包含する。リポソームのリン脂質二重層は、代表的には、細胞膜の成分と類似の物質から製造される。したがって、リポソームと（外部または内部のいずれかで）会合したポリヌクレオチドは、リポソームの包膜が細胞膜と融合するとき、細胞に送達され得る。より代表的には、リポソームは細胞中にエンドサイトーシスされる。インターナリゼーションの後、エンドサイトーシス小胞の内部pHは実質的に低下し得、そして／または小胞はリソソームを含む他の細胞内小胞と融合し得る。小胞融合のプロセス中またはその後、エンドソームの内部含有物は細胞中に放出され得る。リポソームは、ポリヌクレオチド送達ビヒクルとしてリポソームの比較的少ない内部容量により限定される。したがって、リポソーム処方物内に高濃度のポリヌクレオチドを効果的に捕らえることは困難である。研究者らは、リポソーム処方物に正の電荷を有する両親媒性の脂質部分を添加するか、または使用することによって、上記の無効果を補うことを試みた。原則的には、両親媒性脂質の正の電荷を有する基は、負の電荷を有するポリヌクレオチドとイオン対を形成し、そしてポリヌクレオチドと脂質粒子との間の会合量を増加させる。増強された会合はおそらく脂質二重層への核酸の結合を促進する。例えば、いくつかのカチオン性脂質産物が現在入手可能であり、核酸の細胞中への導入に有用である。特に重要なものは、LIP0FECTIN^TM(DOTMA)、これはジアシルグリセロールに付着した１価カチオン性コリン頭部基からなる（一般的に、Ep steinらの米国特許第5,208,036号を参照のこと）；TRANSFECTAM^TM（DOGS）、リポスペルミン頭部基を有する合成カチオン性脂質（Promega，Madison、Wisconsi n）；DMRIEおよび寵MRIE-HP（Vical、La Jolla、CA）；D0TAP^TM（Boehringer Ma nnheim、Indianapolis、Indiana）、ならびにLipofectamine（DOSPA）（Life Te chnology，Inc.、Gaithersburg、Maryland）である。適切に用いられると、上記の化合物は、インビトロで培養された細胞への核酸の透過性を増強する。したがって、リポフェクションのプロセスは細胞生物学の重要な手段になっている。代表的には、カチオン性脂質を含む処方物は送達されるポリヌクレオチドと内部混合され、次いで標的細胞に適用される。リポフェクション効率は、形成して24時間後に検出可能でないレベルまで著しく低下するので、カチオン性脂質−ポリヌクレオチド複合体は、一般的に、混合後比較的すぐに使用されなければならない。この観察から、少なくともリポフェクション効率に関して、カチオン性脂質−ポリヌクレオチド複合体はむしろ不安定であり、または非常に限定された有効期間を有すると推測し得る。研究の展望から、上記の複合体はかなり調製し易い。したがって、調製された複合体の比較的短い活性寿命は、インビトロでの分析的適用を妨げない。しかし、カチオン性脂質を含むポリヌクレオチド送達ビヒクルの医学的使用またはインビボ使用が意図される場合、（単なる再構性とは対照的に）臨床医に委任された産物製剤によって付与される不確かさを除くことが望ましい。処方物は、至適活性の狭い範囲内で使用されなければならないことが考えられる場合、これはなおより明らかになる。したがって、特に臨床的使用が意図される場合、より安定なポリヌクレオチド送達システムが好ましい。現在入手可能な合成カチオン性脂質の別の欠点は、それぞれの脂質およびカチオン性成分が、おそらく合成カチオン性脂質の固有の毒性に寄与する生分解性化学結合によって、連結されないことである。所定のレベルの細胞毒性は有害であり得るが、ポリヌクレオチドを送達するためのカチオン性脂質のインビトロ使用または研究の使用が意図される場合は受容可能であり得る；しかし、このような毒性は、一般的に、カチオン性脂質のインビボ使用が意図される場合は受容可能ではない。従って、生体適合性、生分解性、または代謝成分を含む合成カチオン性脂質は、インビボで使用するためのカチオン性脂質-ポリヌクレオチド送達ビヒクルの調製において好ましい。あるいは、他の脂質基が、減少した毒性を有するカチオン性脂質を生成する試みにおいて、適切なカチオン性成分に結合され得る。さらに、合成カチオン性脂質の毒性は、適切に構成されたポリヌクレオチドの送達ビヒクル中にカチオン性脂質を凝集させることにより、低減され得る。最後に、細胞をトランスフェクトするために合成カチオン性脂質を使用するための現在利用可能な方法はすべて、比較的低濃度の血清によって迅速に不活性化される脂質／DNA複合体を生成する。血清感受性は、無血清培地中でトランスフェクション手順の開始部分を行うことによって、インビトロ適用において容易に回避され得る。しかし、血清感受性は、インビボでのカチオン性脂質媒介DNA送達の広範な使用に対する、主な障害のままである。 3.0 発明の要旨本発明は、ポリヌクレオチドのパッケージングおよび送達に有用な合成生体適合性のカチオン性脂質およびカチオン性ポリマーの新規なクラスに関する。特に、本発明は、適した脂質基（例えば、リン脂質、コレステロールなど）を誘導体化するために、例えば、エチレン炭化水素（すなわち、ペンタエチレンヘキサミン（PEHA）のような多価カチオン性基）により分離される一級および二級アミンの組み合わせの使用を記載する。従って、本発明の実施態様は、コレステロールに共有結合で結合されたPEHA誘導体（ジエチレントリアミン）を含む新規な化合物トリアミノコレステロール（TAC）である。さらに、多価カチオン性基はカチオン性ポリマー内に凝集され得る。本発明のカチオン性ポリマーは、生体適合性または実質的に生体適合性の結合基により相互接続される実質的に生体適合性のカチオン性モノマーを含む。好ましくは、本発明のカチオン性ポリマーを構成するために使用される化学的結合は、生理学的条件下で加水分解性であり、または、より好ましくは、生分解性である。代表的には、カチオン性部分は、例えば、ジスルフィド結合、加水分解性結合、pH感受性結合、またはそれらの任意の組合せのような生体適合性の共有結合により連結される。本発明のさらなる実施態様は、新規なカチオン性脂質および／またはカチオン性ポリマーを含む適切なポリヌクレオチド送達ビヒクル、ならびにその生成方法および使用方法を含む。本発明のさらなる実施態様は、一般式： (R₁,R₂)N-C(O)O-Y を有する化合物である。ここで、R₁およびR₂は、H、C₁〜C₆アルキル、アルケニル、またはアルキニル、もしくは一価または多価カチオン性アミン基（例えば、スペルミン、スペルミジン、ペンタエチレンヘキサミン（PEHA）、ジエチレントリアミン、ペンタメチレンヘキサミン、ペンタプロピレンヘキサミンなど）から構成される群から導かれ、そしてYはコレステロールまたはコレステロール誘導体である。本発明のさらなる実施態様は、一般式： ...(R-X-R)n... を有する生体適合性カチオン性ポリマーを含む。ここで、Rは、核酸を結合可能なカチオン性基であり、およびXは生体適合性、生分解性、または他の易動性共有結合架橋分子であり、そしてnは約10〜約10,000までの間の数である。ポリマー調製のための好ましい平均分子量は、代表的には約40,000ダルトンと約1,000, 000ダルトンの間であり、より代表的には、約60,000ダルトンと約250,000ダルトンの間であり、好ましくは約80,000ダルトンと約150,000ダルトンの間であり、そしてより好ましくは約90,000ダルトンと約110,000ダルトンの間である。あるいは、Rはヘテロポリマーを作製するために使用されるカチオンの基の任意の１つを含み得る。さらに、ヘテロポリマーカチオンは、一般式：（...(X-R_x-X-R_y-X)...）を有することが意図される。ここで、R_xは、核酸と相互作用し得る所定のカチオンであり；R_yも核酸と相互作用し得るR_xとは異なる多数の任意のカチオンであり；およびXは生体適合性架橋分子である。本発明の別の実施態様は、ポリヌクレオチド、およびカチオン性ポリマー、および／またはB-型ヘリックスとしてDNAを維持する緩衝液（例えば、水性アルコール溶液）中のカチオン性脂質を複合体化する工程、ならびにエバポレーションにより緩衝液を除去する工程を包含する、ポリヌクレオチド送達ビヒクルの作製するための新規なプロセスを含む。乾燥したポリヌクレオチドーカチオン性脂質／カチオン性ポリマー複合体の水溶液との再構成の後、安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルが生成される。本発明の別の実施態様は、目的のポリヌクレオチド（単数または複数）を細胞に送達するためのカチオン性脂質および／またはポリマーを含むポリヌクレオチド送達ビヒクルの使用を意図する。従って、記載されるカチオン性ポリマーは個体に対して治療的利点を提供するために使用され得る。 4.0 図面の説明図1は、どのようにしておよびどこに代表的なカチオン性基が適切なジカルボン酸リンカー分子を使用して重合化し得るかを示す。図２は、カチオン性ポリマーを生成するために使用され得るいくつかの代替カチオン基およびリンカー剤のさらなる例を提供する。図３は、新規なカチオン性リン脂質の生成のための概略的な合成スキームを示す。図４は、トリアミノコレステロールの概略的な合成スキームを示す。図５はエタノールエバポレーション法により生成されるPDVを使用して得られるインビボ発現データを示す。 5.0 発明の詳細な説明本発明の生体適合性カチオン性ポリマーおよびカチオン性脂質は、目的のポリヌクレオチド（単数または複数）と接触（イオン対形成）され得、その結果、カチオン性基の正電荷が負電荷を有するポリヌクレオチドと静電的に相互作用する。カチオン性部分とポリヌクレオチドとの間の静電的相互作用は、ポリヌクレオチド中の電荷の反発をおそらく低下させ、そしてポリヌクレオチドを（ゲルシフトアッセイなどで見られるような）より小型の立体配置中に凝縮させる。本明細書中に記載されるカチオン性脂質およびカチオン性ポリマーにおいて使用されるカチオン性成分は、一価、二価、多価、または好ましくはポリ価（すなわちポリカチオン性）であり得る。DNAと結合し得る一価のカチオンの例は、一級アミン（メチルアミン、エチルアミンなどを含むがこれらに限定されない）を含み、そして多価アミン（例えば、スペルミン、スペルミジン、ペンタエチレンヘキサミン、ジエチレン、トリアミン、ペンタメチレンヘキサミン、ペンタプロピレンヘキサミン）を含むがこれらに限定されない。カチオン性成分は、好ましくは生体適合性すなわち生体耐容性（biotolerable）である。カチオン性成分は、pH５〜pH８の間で正電荷を保持する種々の任意の化学基（アミノ基（（オリゴアミンまたはポリアミン）、例えば、スペルミン、スペルミジン、ペンタエチレンヘキサミン（PEHA）、ジエチレントリアミン、ペンタメチレンヘキサミン、ペンタプロピレンヘキサミンなど）、アミド基、アミジン基、正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジン）、イミダゾール基、グアニジニウム基、またはそれらの混合物および誘導体を含むがこれらに限定されない）を含み得る。カチオン性成分は、一般的に、所定の適用のために最適化したカチオン／リン酸比でポリヌクレオチドと組み合わせられる。通常、カチオン／リン酸比は、約 0.1と約20との間、しばしば約５と約17との間、および好ましくは約６と約15との間である。従って、電荷比は、カチオン上に含まれる正に荷電された基の数、およびポリヌクレオチドのサイズに依存して変化する。例えば、DOSPAに関する場合、約0.6のDOSPA/DNAヌクレオチド比が適切である。現在入手可能なカチオン性脂質（すなわち、DOSPA）の固有の毒性のために、このような脂質は一般的にインビボ遺伝子送達において好ましくない。従って、低減した毒性を有するカチオン性脂質が、インビボでのポリヌクレオチドの非ウイルス性送達の好ましい促進剤である。従って、本発明のさらなる実施態様は、多価カチオン性（アミノ）基が、例えば、コレステロールまたはDOPEと反応することにより生成される新規のカチオン性脂質である。カチオン性基がリン脂質と結合する場合、本発明の好ましい実施態様は式： R-N-(CH)_n-リン脂質を有する化合物である。ここで、リン脂質はホスホジエステル結合により結合され；nは約１〜約６であり、およびRは以下：を構成する基から導かれる。ここで、R₁およびR₂は、H、メチル、エチル、-C₁〜 C₄アルキル、-C₁〜C₄アルケニル、または-C₁〜C₄アルキニル、-(CH₂)_nNH₂、-(CH₂ )_nNH(CH₂)_nNH₂、-(CH₂)_nN(CH₃)₃+、-(CH₂)_nNH(CH₂)_nN(CH₃)₃+、および-(CH₂)_nN H(CH₂)_nNH(CH₂)_nNH₂からなる基から導かれ、n=１〜６である。このようなカチオン性脂質の特定の例は、図３に示されるような基本的に生成されるカチオン性リン脂質を含む。本発明の別の実施態様は、構造：を有する誘導体化されたコレステロール化合物である。ここで、Rは以下：を構成する基から導かれる。ここで、R₁およびR₂は、H、メチル、エチル、-C₁〜 C₄アルキル、-C₁〜C₄アルケニル、または-C₁〜C₄アルキニル、-(CH₂)_nNH₂、-(CH₂ )_nNH(CH₂)_nNH₂、-(CH₂)_nN(CH₃)₃+、-(CH₂)_nNH(CH₂)_nN(CH₃)₃+、および-(CH₂)_nN H(CH₂)_nNH(CH₂)_nNH₂、からなる基から導かれ、n=１〜６である。さらに、当業者は、広範な種々のコレステロール誘導体および関連した化合物が適切なカチオン性基と共に同様に誘導体化され得ることを認識する。このようなカチオン性脂質の特定な例は、分子トリアミノコレステロール（TA C）を含む。TACは、図４に示されるように、基本的にPEHAのジエチレントリアミン誘導体の適切に処置されたコレステロール誘導体との反応により構築される。カチオン性脂質に加えて、同様の化学反応がカチオン性脂質を生成するために使用され得る。本明細書中で記載されるポリマーを調製するために使用される架橋剤は、好ましくは生体適合性すなわち生体耐容性であり、そしてカチオン上で適切な化学基と各々が結合を形成し得る少なくとも２つの化学基（すなわち、架橋は二官能基である）を一般的に含む。そのリンカー基は、ホモ二官能基（同じ化学基）またはヘテロ二官能基（異なる化学基）であり得る。好ましくは、連結基とカチオン性部分との間で形成される化学結合は、生理学的条件下において加水分解性である（すなわち、pH不安定性または他に標的細胞において破損する）。さらに、架橋剤は連結基の間で生理学的条件下で加水分解性である結合を含み得る。必要に応じて、架橋剤は分枝化ポリマーの形成を可能にするさらなる架橋剤と結合し得る。架橋剤をポリマー化するために分枝化した連結分子の比を変化することにより、種々の化学的性質を有するカチオン性ポリマーが生成される。代表的には、本請求の範囲に記載されるカチオン性ポリマーのカチオン性成分および脂質成分は以下に記載され、または以下を含むがこれらに限定されない種々の供給源のいずれかから得られ得る：Merck Indexの1995年版、Budavariら編、Merck and Company，Inc.、Rahway、N.J.、1995 SIGMA chemical company cat alogue、St．Louis、MO.、1995 Aldrich Biochemicals Catalogue、または1995 Ofatlz and Bauer catalogue。カチオン性基は、好ましくは、生理学的条件下で、すなわち例えば、グルコシラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、もしくはホスホリパーゼなどの天然の酵素の作用により、リンカーにカチオン性基からの分離可能性を与えるアミド結合、エステル結合、またはホスホジエステル結合により、架橋剤に結合され得る。このような結合は、固有に毒性である現在入手可能な合成カチオン性脂質に対する改良を意味する。本明細書中に記載されるポリマー化反応のさらなる特徴は、好ましくは実用上有用なカチオン性ポリマーは保護基の使用を厳密に必要とせずに形成され、または脱保護スキームを生成し得る。本発明の１つの実施態様は、カチオン性ポリマーを形成するための炭水化物の少なくとも多カルボン酸誘導体であるリンカー分子の使用である。代表的には、分子は少なくとも炭水化物ジカルボン酸誘導体（すなわち、モノサッカライド分子、ジサッカライド分子、またはポリサッカライド分子）であり、そしてアミド結合によりカチオン性部分を架橋する。あるいは、ポリマー化炭水化物（すなわち、ムレインに類似）は、アミン、ポリアミン、またはN-アセチル基に位置するカチオン性アミノ酸、またはムラミン酸で誘導体化されると考えられる。さらに、カチオン性基がポリアミンである場合、実質的にジカルボン酸基を含む任意の化合物は、適切なリンカー分子として作用し得る。好ましくは、リンカーは水性条件下で可溶性であり、そしてカルボン酸基は通常、基の間に分散する少なくとも１〜３個の炭素原子を有する。リンカーの溶解性を増加するために、実質的にポリマー化反応（すなわち、ヒドロキシル基またはポリエーテル）を妨害しない場合、疎水性を増大させるさらなる基を取り込むジカルボン酸を使用することが好ましくあり得る。さらなるリンカー分子は一般タイプ、または、本明細書中に参考として援用される米国特許第4,833,230号に記載されるものと同様の化学的ストラテジーを使用する分子を含む。さらに意図されるのは、アミノ基との反応の際に酸不安定性結合を形成するリンカーである。このようなpH不安定性結合は、請求されたpH感受性／不安定性共有結合リンカー部分（これはまたエステル結合を含み得る）の実用的例証を含む。本発明の目的のために、用語「生分解性カチオン性ポリマー」は、細胞中への侵入の際に、カチオン性ポリマーが、細胞の異化プロセスもしくは代謝プロセスに一般に関与し得るか、または細胞により分泌され、そして排泄される成分（およびそれらの代謝可能な副生成物）に変化される事実をいう。用語「生体適合性」とは、化合物が意図された用量で有意な毒性または有害な免疫学的効果を示さないことを意味する。用語「生体耐容性」とは、品目（item）または化合物が、動物または動物細胞を、管理可能な副作用または毒性効果を伴って処置するために使用され得ることを意味する。用語「pH感受性」とは、分予中の少なくとも１つの共有結合が、エンドソーム融合後に生じるpHに一般的に接近するpHの変化によって破壊され得ることを意味する。用語「実質的に毒性」とは、治療的用量で、所定の薬剤が、結局、薬剤の意図した治療的利益を明らかに越える有害な結果を生じることを意味する。生分解性結合を使用する、スペルミン、PEHA、または他のカチオンのポリマー化の別の方法は、リソソームプロテアーゼ（チオプロテアーゼまたはカテプシンを含むがこれらに限定されない）によってタンパク質分解切断を受けやすいジペプチドリンカーを使用する工程を包含する。本発明のさらなる実施態様は、インビトロまたはインビボで細胞にポリヌクレオチドを送達するために、上記のカチオン性ポリマーおよびカチオン性脂質を使用する新規な方法である。遺伝子送達のために使用する場合、カチオン性ポリマーおよびカチオン性脂質は、従来の脂質または現在入手可能なカチオン性脂質抱合体（例えば、Lipofectin，Lipofectamineなど）と共同で使用され得る。好ましくは、遺伝子送達は、細胞または患者に対して実質的に毒性のない方法を使用して行われる。本明細書中に記載されるカチオン性ポリマーは、水溶液において、一般に構造を形成し、これは、所与のポリマーの特徴である。一般に、ポリマーは水中で比較的緻密な構造を形成し、添加された塩の存在下で膨張し、そしてポリヌクレオチドが添加されると中間サイズの構造を形成する。ポリヌクレオチド結合の前および後の分子の物理的サイズおよび密度における変化は、ポリヌクレオチド結合の進行を追跡することを可能にし、そして所望の産物の単離を容易にする。開示されるカチオン性脂質もしくはカチオン性ポリマー、またはこれらの混合物を含むポリヌクレオチド送達ビヒクル（PDV）は、PDVの構造成分として送達されるポリヌクレオチドを一般に組み込む。このように、ポリヌクレオチドの構造は、PDVの構造的特徴に寄与する。代表的には、ポリヌクレオチドがプラスミドの形態である場合、DNAは一般的に超らせん形成した環または弛緩した環のいずれか、あるいはその混合物を含む。特定の形態が所定の適用に好適であり得る程度まで、DNAジャイレース、リガーゼ、およびトポイソメラーゼのような酵素は必要と考えられるようにプラスミドの構造を変化するために使用され得る。直線状ポリヌクレオチドが好ましい場合、プラスミドは、複合体形成の前に直線状にされ得、そして必要に応じてコンカテマー化（concatamerized）される。一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドはまた、ウイルスタンパク質、一本鎖結合タンパク質、ヒストンタンパク質などのような適切なポリヌクレオチド結合タンパク質の添加による複合体形成の前に、「予めパッケージされ」得る。本願に係るポリヌクレオチド送達ビヒクルを使用して送達され得る目的のポリヌクレオチドには、DNA、RNA、原核生物および真核生物ウイルス粒子に随伴するポリヌクレオチド（例えば、レトロウイルスコア粒子、バクテリオファージ粒子、アデノウイルス粒子、アデノ随伴ウイルスコア粒子など）、タンパク質／DNA 複合体、すなわち、遺伝子導入および発現などを容易にするための組込み、エンドソーム破壊のためのタンパク質；RNA/DNA複合体、ならびに上記の任意およびすべての誘導体および改変体が挙げられるが、これらに限定されない。DNA分子が送達されるべき場合には、代表的には、これは目的の遺伝子またはその一部を含み、目的のDNAの発現を最適にするために空間的に編成される調節配列に隣接する。好ましくは、本明細書に記載されるPDVを使用して送達されるべきポリヌクレオチドは、実質的に純粋である（すなわち、混入しているタンパク質、脂質、多糖、リポ多糖、および核酸を実質的に含まない）。例えば、プラスミドDNAが使用される場合、調製物は、一般的に、フェノール、またはフェノール：クロロホルム、抽出、および同密度遠心分離（CsClなどを使用して）を含むプロセス、またはその機能等価物によって調製される。好ましくは、DNA調製物はまた、RNase で処理され、そして複数回の抽出および少なくとも２回の超遠心分離（または少なくとも純粋物としてDNAを生成する任意の他の方法）にかけられる。代表的には、実質的に純粋な核酸の調製物は、全核酸の少なくとも約80パーセント、一般的には少なくとも約90パーセント、および好ましくは少なくとも約95パーセントが所望の核酸から構成される調製物である。目的の遺伝子は、広範な任意の発現ベクターに代表的に挿入され、続いて本明細書に開示した方法および材料を使用して送達される。本明細書に開示した方法および組成物を使用して送達され得る適切なベクターには、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、仮性狂犬病ウイルス、α-ヘルペスウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクター、特に非複製細胞を改変するために適切なウイルスベクターの詳細な総説、および目的のポリヌクレオチドの発現に関連してこのようなベクターを使用する方法は、Viral Vectors:Gene Therapy and Neuroscience Applications CaplittおよびLoewy編、Academic Pr ess、San Diego(1995)の本に見出され得る。本発明の方法および組成物が、目的の核酸をコードするかまたは含む、ベクター核酸、または適応可能である場合は、ウイルスまたはサブウイルス粒子を直接送達するために使用され得ることが意図される。本明細書で用いられる場合、用語「発現」とは、目的のDNAの転写、ならびに対応するmRNA転写物のスプライシング、プロセシング、安定化、および必要に応じて、翻訳をいう。送達されるDNA分子の構造に依存して、発現は一過性または連続的であり得る。多くの転写プロモーターおよびエンハンサーは、目的のDNAで使用され得、これらには単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、SV40プロモーター、およびレトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター／エンハンサーなど、ならびにそれらの任意の置換および改変体が挙げられるがこれらに限定されず、十分確立された分子生物学技法を使用して産生され得る（一般的に、Sambrookら、（1989）Molecular Cloning I-III巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New Yo rk、ならびにCurrent Protocols in Molecular Biology（1989）John Wiley & S ons、全巻およびその定期的最新巻を参照のこと、これらは参考として本明細書中に援用される）。プロモーター／エンハンサー領域はまた、組織特異的発現を提供するために選択され得る。代表的には、翻訳が所望される場合、（必要ならば）目的の遺伝子はまた、適切な3'ポリアデニル化配列を含むように操作される。特定の目的のDNAには、以下をコードする配列が挙げられるが、これらに限定されない：種々のタンパク質、サイトカインおよび成長因子（例えば、G-CSF，G M-CSF、神経成長因子(NGF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、脳由来神経栄養因子(B DNF)、インターロイキン１〜２および４〜14、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、αまたはγインターフェロン、エリスロポイエチンなど）、嚢胞性線維症膜貫通型調節タンパク質(CFTR)、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、D-アミノ酸デカルボキシラーゼ、GTPシクロヒドロラーゼ、レプチン、レプチンレセプター、第VIII因子および第IX因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター(tpA)をコードする配列。用語「生物学的に活性な物質」は特に、薬学的に活性なタンパク性物質および薬学的に活性な有機分子を含む。さらに、アンチセンス、抗原、またはアプトメリックオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されたPDVを使用して送達され得る。リボザイム、RNA-DNAハイブリッド、ポリヌクレオチドペプチド結合したオリゴ(PNA)、環状または直線状RNA 、環状一本鎖DNA。目的のRNAには、自己複製RNA、細胞質内で直接翻訳され得る上記遺伝子のいずれかに対応するmRNA転写物、または触媒性RNA、例えば「ハンマーヘッド」ヘアピン、Ｄ型肝炎ウイルス、特定のRNA配列をインビボで特異的に標的化および／または切断し得るグループＩイントロンが含まれる。触媒性RNAによって標的化するための特に重要なものは、RNAウイルス、ならびに細胞性およびウイルス性転写物の両方である。あるいは、RNA、DNA、または両方の混合物のアンチセンス形態は、細胞内の目的の特定の遺伝子の発現を阻害するために、または点変異もしくは他の変異（ナンセンスまたはミスセンスなど）を修正するために、細胞に送達され得る。本発明のさらなる実施態様は、より大きなポリヌクレオチドとともにPDVに組み込まれているオリゴマーヌクレオチドの送達を意図する。このような「キャリア」ポリヌクレオチドは、一本鎖（直線状または環状）または実質的に二本鎖であり得、そして送達されるべきオリゴマーヌクレオチドに実質的に相同または相補的である１つ以上の領域をさらに含み得る。所望である場合、目的のDNAは、送達ビヒクルによって既に送達された目的のD NAを保有しそして発現する細胞の根絶の制御を可能にする自殺シグナルをさらに組み込み得る。例えば、チミジンキナーゼ(tk)遺伝子は、送達されたDNAに組み込まれ得る。この結果、正確な量のアシクロビル、ガンシクロビル、またはそれらの概念上のもしくは機能的等価物を投与することによって、医師がtk遺伝子を発現する細胞を殺すことが可能になる。ポリヌクレオチド送達ビヒクルを作製する本明細書中に記載の方法は、目的のポリヌクレオチド（単数または複数）が両親媒性のカチオン性脂質結合体と接触し、その結果、カチオン性部分とポリヌクレオチドとの間のイオン対形成が複合体形成を可能にすることを必要とする。凝縮されたカチオン性ポリマー／脂質ポリヌクレオチド複合体は、ポリヌクレオチド送達ビヒクル（PDV）のアセンブリのために、骨格または核として引き続き使用され得る。あるいは、カチオン性ポリマー／脂質ポリヌクレオチド複合体は直接使用され得る。イオン対形成がポリヌクレオチド送達ビヒクルの形成に役割を果たすとすれば、複合体形成中のpHは、特定の成分の相互作用を最適化または安定化するために変化され得る。例えば、非pH感受性カチオン性ポリマーが使用される場合は、約４の低いpHが、ポリヌクレオチドと同時に組み込まれ得る所定のポリヌクレオチド（例えば、RNA）または他の化学薬剤を複合体化するために、好適であり得る。さらに、ポリヌクレオチド（例えば、DNA）が塩基加水分解に実質的に感受性ではない場合、状況は、約10までのpHを複合体形成中に使用することを指図し得る。一般的に、約５から約９までの範囲内のpHは、複合体形成およびトランスフェクションの間維持される。同様に、塩（例えば、NaCl、KCl、MgCl₂など）の濃度は、複合体形成の至適化のために、または遺伝子送達および遺伝子発現の効率を増強するために変化され得る。さらに、カチオン性脂質またはカチオン性ポリマーが複合体化されるときの温度のような因子は、生じるPDVの構造的および機能的性質を至適化するように変化され得る。さらに、複合体が形成される溶液中の浸透圧は、塩濃度を調整することにより、変化され得る。緩和な塩濃度が複合体形成を妨害し得るとすれば、またグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マルトース、マンノースなどであって、これらに限定されない適切な賦形剤を添加または置換することにより、浸透圧を調整し得る。代表的には、多くのカチオン性凝縮剤（例えば、スペルミン、PEHA、またはスペルミジン）は、ポリヌクレオチドを沈殿させる。しかし、凝縮カチオンポリマーを、ポリヌクレオチドへ注意深く制御して添加（注入ポンプなどを使用して）することにより、比較的高い濃度（例えば、約0.5mg/ml）のポリヌクレオチドが凝縮剤と複合体化することが可能になる。このように、カチオン性脂質凝縮剤へのポリヌクレオチド添加を注意深く制御することによって、カチオン性凝縮剤による比較的高い濃度のポリヌクレオチドを複合体化することが可能になる。カチオン性または中性脂質がカチオン性ポリマーと組合わせて使用される場合、脂質ミセルを形成するために、脂質は一般に、適切な界面活性剤に溶解または可溶化される。脂質を溶解するために適した界面活性剤には、コール酸、デオキシコール酸、ラウロイルサルコシン、オクタノイルスクロース、CHAPS(３-[(３- コールアミドプロピル)-ジーメチルアミン]-２-ヒドロキシル-１-プロパン)、新規-β-D-グルコピラノシド、ラウリルジメチルアミンオキシド、オクチルグルコシドなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、界面活性剤は非イオン性であり、そして高い臨界ミセル濃度（CMC）を有する。ポリヌクレオチドおよびカチオン性ポリマーが、ミセル化した両親媒性カチオン性脂質抱合体に添加される場合、イオン対形成が起こり、そしてポリヌクレオチドは、カチオン性成分との複合体として凝縮する。最初の複合体形成の後、界面活性剤をゆっくり除去（すなわち、大規模な透析による）することにより、安定な脂質結合ポリヌクレオチド送達ビヒクルのアセンブリおよび形成が可能になる。ゆっくりした透析は界面活性剤除去の好ましい方法のままであるが、透析緩衝液の相対量を増加することによって、または界面活性剤と結合しそしてこれを透析物緩衝溶液から除去する緩衝液に試薬を添加することによって、界面活性剤の除去が促進され得る。あるいは、ポリヌクレオチドおよびカチオン性ポリマーを、脂質および界面活性剤を添加する前に適切なカチオンを含む溶液に溶解し得る。界面活性剤が添加された後、これはカチオンの存在下で透析によって除去され、そして続いてカチオンが透析によって除去され得る。適切なカチオンには、正電荷を有する任意の元素が含まれる。カチオンは、１価、２価、または多価であり得る。適切な元素のカチオンの代表的な例には、マンガン、マグネシウム、ナトリウム、カルシウム、ルビジウム、亜鉛、モリブデン、ニッケル、鉄などが挙げられるが、これらに限定されない。一般的には、元素のカチオンは、脂質とポリヌクレオチドとの複合体化の間の凝集形成を妨げるに十分な量で、および所定のカチオン性化合物のほとんど最大の溶解度の濃度まで添加される。好ましくは、ナトリウム（例えば、塩化ナトリウム）の濃度は、約0.1モル濃度と約５モル濃度との間であり、マグネシウム（例えば、塩化マグネシウム）の濃度は約0.05モル濃度と約５モル濃度との間であり；そしてマンガン（例えば、塩化マンガン）の濃度は約0.1モル濃度と約４モル濃度との間である。さらに、カチオンのタイプおよび濃度が、PDVをアセンブリするために使用されるカチオン性ポリマーの特徴に依存して調整されなければならないかもしれないことは、当業者に理解される。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドがPDVのアセンブリの間にカチオンと複合体化されるべき場合、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質（分子カチオン）、および／または界面活性剤は、カチオンの添加の前に、同時に、またはその後に添加され得る。一般的には、カチオン性ポリマーおよびカチオン性脂質は、約0.１:１と約16:1との間、好ましくは約0.5:１と約7:１との間、より好ましくは約0.7:1と約2:１との間、そして特定すると約1:１の、正味の分子カチオン対ポリヌクレオチドリン酸比で、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに添加される。上記の比は、限定ではなく例示として提供され、そしてPDV をアセンブリするために使用される分子カチオンの特性に依存して改変され得る。また、任意の比はDNA濃度に依存する。カチオン、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、カチオン性ポリマー、カチオン性（または他の）脂質、および界面活性剤が環境中に存在した後、界面活性剤は、好ましくはカチオン含有緩衝液中での透析によって除去される。界面活性剤が除去された後、カチオンは、続いて透析または機能的等価物によって実質的に除去され得る。好ましくは、透析は、一般的に、約４℃と約30℃との間の温度で行われ、そしてPDVの意図する使用に有害でない最終カチオン濃度になる。例えば、元素のカチオンは、例えば非経口投与に適切である緩衝化溶液での透析によって、実質的に除去され得る。カチオンの実質的な除去の後、得られるPDVは、一般的に、約４℃で保存した場合、少なくとも２週間安定なままである（すなわち、形質導入活性を保持する）か、または凍結乾燥されて無期限に保存され得る。本明細書中で記載されているカチオン性ポリマーが、好ましくは生体適合性であるので、カチオン性ポリマーを含むPDVは減少した毒性を有する。本開示の目的のために、減少した毒性は、少なくとも約10μgのDNAを含むPDVが、動物に重篤な毒性効果を与えずに注射され得ることを意味する。ポリヌクレオチドを予備縮合するために使用する元素のカチオンの濃度を上昇させることにより、対応する量によってPDVをアセンブリするために使用されるD NAの濃度を上昇させ得る（すなわち、２モル濃度のMnCl₂は約１g/mlのDNAの濃度でPDV形成を可能にし得る）。適用可能なカチオンが比較的高い溶解性（すなわち、NaClは約5.5モル濃度で飽和する）ならば、本発明の方法が、少なくとも約1 0mg/mlの濃度のDNA（または他のポリヌクレオチド）のPDVの形成を可能にすることは明らかである。従って、本発明の別の実施態様は、上記のように処方されているPDVの調製物であり、そしてこれは、一般的には約0.05mg/mlと約10mg/m lとの間、好ましくは約0.25mg/mlと約10mg/mlとの間、より好ましくは約0.5mg/m lと約1.5mg/mlとの間、そして特定すると約0.8mg/mlと1.2mg/mlとの間の濃度のD NA（または他のヌクレオチド）を含む。従って、本発明の別の実施態様は、高濃度の核酸（すなわち、＞0.25mg/ml核酸）を含むPDV組成物である。上記の界面活性剤透析方法を使用したPDVの処方は、代表的には、平均直径において200nmより大きい粒子を生成する。より小さい粒子が好ましい場合、PDVを処方する代替方法は、カチオン性脂質またはカチオン性ポリマーにより結合を可能にする構造的コンホメーションにおいてポリヌクレオチドを維持するように処方された混合水溶液中で、カチオン性脂質ポリヌクレオチド複合体を形成する工程を包含する。このような溶液の例として、混合した水／アルコール溶液（メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、および異性体、ならびにそれらの混合物）が挙げられる。好ましくは、このような複合体生成緩衝液はまた、特定の濃度の溶解された糖および／または塩を、あるパーセントのアルコールに加えて含む。一般には、複合体形成の間に存在するアルコール（例えば、エタノール）の濃度は、約10パーセントと約80パーセントまでの間、代表的には約20パーセントと約50パーセントの間、より代表的には、より代表的には約30パーセントと約45パーセントの間、好ましくは約37パーセントと約43パーセントの間、およびより好ましくは約40パーセントの範囲である。複合体形成の間存在し得る糖（デキストロース、スクロースなど、先に列挙した一覧を参照のこと）の量は、一般には約２パーセントと約15パーセントの間、好ましくは約３パーセントと約８パーセントの間、より好ましくは約５パーセントで変化するはずである。あるいは、溶液の重量モル浸透圧濃度はまた、塩および糖の混合物により調整され得る。当業者は、遺伝子送達の効率を最適化するための塩および糖の濃度を適格に変化させる方法を明瞭に知っている。さらなる最適化のための開始点として作用し得る塩および糖の代表的な濃度は、250mM（グルコース）および25mM塩（NaCl）である。複合体形成のさらなる特徴は、温度調節である。代表的に、カチオン性脂質またはカチオン性ポリマーは、約４℃と約65℃の間、より代表的には約10℃と約42 ℃の間、好ましくは約15℃と約37℃の間、およびより好ましくはおよそ室温の温度で、ポリヌクレオチドと複合体化される。多くの場合において、温度の正確な調節は、生成物の可変性を最小化するために重要である。溶液を、例えばエバポレーションにより複合体から除去した後、乾燥した複合体は安定なままであり、そして無期限に貯蔵され得る。再構成の後、複合体の大きさは確立した方法（例えば、抽出、均質化、超音波処理など）によりさらに調整され得る。記載されたカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質を含むポリヌクレオチド送達ビヒクルが、大きくないサイズの粒子を形成するので、標的化薬剤は、安定にビヒクルに組み込まれ得、ビヒクルを特定の細胞および／または組織に指向する。従って、任意の多様な標的化薬剤もまた、送達ビヒクルに組み込まれ得る。本開示の目的のために、用語、標的化薬剤は、送達ビヒクルに組み込まれ得る任意のおよび全てのリガンドまたはリガンドレセプターをいう。このようなリガンドとして、IgM、IgG、IgA、IgDなどのような抗体、またはそれらの任意の部位もしくはサブセット、細胞因子、細胞表面レセプター、MHCもしくはHLAマーカー、ウイルス外被タンパク質、ペプチドもしくは小有機リガンド、それらの誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。標的化リガンドは、ポリヌクレオチド送達ビヒクルの形成の前に、カチオン性ポリマーの適切な部分に誘導体化され得る。例えば、標的化剤（例えば、免疫グロブリン）は、Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミド（NHS）および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDAC）、またはそれらのメチオダイド（E DCメチオダイド）、ならびに標的化分子上の遊離アミノ基を使用して、最初に脱離基をカルボキシル基へ誘導体化することにより、分枝化架橋分子の極性領域の遊離カルボキシル基にＮ連結され得る。あるいは、標的化薬剤は、適切に条件化された連結薬剤またはカチオンにジスルフィド結合され得る（チオ酢酸、ヒドロキシルアミン、およびEDTAを使用して）。 PDVが脂質を含む場合、スクシンイミジルア七チルチオアセテートは、脂肪酸との組合せ（例えば、ジオレイルホスファチジル-エタノールアミン、DOPE）で使用され、D0PE-チオアセテート（ATA）を形成し得、これは、還元分子（DOPE- アセチル-SH）を生成するためにヒドロキシルアミンで処置され得る。標的化薬剤上の遊離アミノ基は、スクシンイミジルマレイミドフェニルブチレート（SMPB ）と反応させられ、ペプチド結合によりマレイミドフェニルブチレート（MPB）と結合する標的を生成する。誘導体化された脂肪酸は、次いで標的-MPB複合体と結合され、脂肪酸に架橋している標的化薬剤を生成する。さらに、標的化薬剤は、上記のような生分解性結合（ペプチドリンカーまたはジペプチドリンカー、pH加水分解性のリンカーなど）により脂質へ連結され得る。あるいは、標的化薬剤はまた、PDVと「標的化」細胞または組織との間のブリッジとして作用し得る。例えば、標的化薬剤が、複合体と単に結合する場合、薬剤は、複合体形成または単離の充分後に、複合体に添加され得る。標的化薬剤もまた、細胞表面上の分子を認識し得るか、またはそれにより認識され得る程度まで、標的化薬剤は細胞表面との密接な接触において複合体を効率的に配置するブリッジ分子として作用し得る。特に、肝細胞がPDV指向トランスフェクションの好ましい標的である場合、フェチュインのような分子は、有用性を立証し得る。肝細胞は、ガラクトースレセプターを含む。ノイラミニダーゼでの処置の後、フェチュインを、その表面上に多数のガラクトース残基を表示するアシアロフェチュインに変化させる。さらに、フェチュインおよびアシアロフェチュインの両方は、カチオン性脂質を含むDN A複合体と結合することが知られている。酸性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）が豊富な分子として、アシアロフェチュイン（ASF）は、DNA/カチオン複合体のカチオン性基とおそらく結台する。その結果、アシアロフェチュイン結合複台体は、タンパク質上の曝されたガラクトース残基によって肝細胞へ標的化される。アシアロフェチュインが、DNA/カチオン複合体と結合するという観察はまた、はるかに及ぶ可能性を有する。例えば、アシアロフェチュインは、任意の多数の従来の化学方法を使用して、広範な数の任意の標的化リガンドと共に誘導され得る。例えば、過ヨウ素酸塩はガラクトースの水酸基の少なくとも一部をアルデヒドに変化するために使用され得、アルデヒドは１級アミノ基と反応して、シッフ塩基を形成する。これは次いでリチウムアルミニウムヒドリドで還元され得る（標的化リガンドを添加するために）。あるいは、アルデヒドはヒドラジドと反応して、ヘテロ二機能性架橋試薬（これは、適切な標的化リガンドとなる）と結合する。上記ストラテジーのどちらも単に、アシアロフェチュインが実際に任意の標的化リガンドで誘導体化され得る多くの可能な方法の例示であり、そしていかなる方法においても、本発明を限定するように解釈されるべきではない。リガンド結合の後、誘導体化されたアシアロフェチュインは、上記のようにDN A／カチオン複合体と結合され得る。実質的に任意のリガンドがアシアロフェチュインに結合され得、そして実質的に任意のDNAが安定な複合体中にパッケージされ得る。従って、適切に誘導体化したアシアロフェチュインを適切なDNA／カチオン複合体に注意深く整合することにより、実質的に任意の細胞が、実質的に任意の遺伝子を発現するように標的化され得る。さらに、アシアロフェチュインまたはその機能的等価物（vis-a-vis結合）は、カチオン性ポリマーにＮ連結され、そして直接PDV内に取り込まれ得る。さらに、PDVとも結合可能な他のタンパク質が同定または発現されるようである。アシアロフェチュインのように、PDVと結合するタンパク質は、標的化リガンドと共に適切に誘導体化され、そしてPDVを特異的な細胞および組織に指向させるために使用され得る。この様式において、内皮細胞、系統細胞、上皮細胞、島細胞、神経細胞または神経組織、中皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、造血細胞、免疫細胞、主要な腺または器官（例えば、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓、皮膚など）の細胞、外分泌細胞および／または内分泌細胞などのような任意の種々の細胞が、遺伝子送達のために標的化され得る。特定の目的は、種々の細胞表面マーカーおよびレセプターをコードするタンパク質である。このようなタンパク質の例である簡単なリストは以下を含む：CDI( a-c)、CD4、CD8-11(a-c)、CD15、CDw17、CD18、CD21-25、CD27、CD30-45（R（O 、A、およびB））、CD46-48、CDw49（b、d、f）、CDw50、CD51、CD53-54、CDw60 、CD61-64、CDw65、CD66-69、CDw70、CD71、CD73-74、CDw75、CD76-77、LAMP-1 およびLAMP-2、ならびにＴ細胞レセプター、インテグリンレセプター、増殖性内皮のエンドグリン（endoglin）、またはエンドグリンに対する抗体。本発明の開示の目的のために、記載されたカチオン性ポリマーおよびカチオン性脂質を含むポリヌクレオチド送達ビヒクルは、一般に、48時間の貯蔵の後の新鮮に調製された産物のポリヌクレオチドトランスフェクション効率の少なくとも約20パーセントのトランスフェクション効率を保持し、および好ましくは、48時間後にすくなくとも約35パーセントのトランスフェクション効率を保持し、および特に好ましい実施態様においては、48時間後に少なくとも約50パーセントのトランスフェクション効率を保持する。あるいは、本明細書中で記載されるPDVは、サイズ安定性を保持し、そして一般に、少なくとも48時間液状で放置された後、平均粒子サイズ（Gaussian分布による）が約50と約1,000nmとの間、好ましくは約75と600nmとの間、そして好ましくは約100と約450nmとの間の分散サイズ範囲を保持する。一般に、エタノールエバポレーションにより形成されるPDVは、界面活性透析により形成されるPDV（約 200nmを超える平均直径）よりも小さい（約150nm未満の平均直径）。血清における安定性に関係する場合、本明細書中で記載されるPDVは、好ましくは血清安定性であり、そこでこれらは一般に、約15パーセントまでの血清濃度に曝された場合、先行技術により教示される方法／合成カチオン性脂質を使用して産生されるリポゾーム処方物よりも少なくとも約２倍安定であり、そして好ましくは少なくとも約10倍の大きさでさらに安定である。本明細書中に記載されるPDVの安定性は、適切な貯蔵条件により増強され得る。例えば、PDVは、規定されずに凍結および貯蔵され得る。迅速なまたは遅い解凍（約４℃で）の後、PDVは、代表的に、新たに産生されたサンプルのトランスフェクション効率の、全部でなくても実質的な部分を保持する。さらに、本発明のPDVはまた、凍結乾燥および再構成の後、それらの本来のトランスフェクション効率の実質的な量（すなわち、少なくとも約50パーセント）を保持する。 PDVの凍結または凍結乾燥により、長期的な安定性の増強を求める場合、適切な賦形剤が、凍結の前にPDV調製物に添加され得る。このような安定化賦形剤の例は、モノサッカライドまたはジサッカライド（例えば、グルコース、スクロースなど）、ポリサッカライド、または任意の種々の周知の薬剤（例えば、グリセロール、ガム、デキストランなど）を含む。 PDVは凝集し得る。この開示の目的のために、容易に懸濁液中に分散し得る凝集体として、緩い凝集体が規定される。必要に応じて、このような凝集体は、凍結保存（約-20℃またはそれ以下で）期間、続く解凍の後に起こり得る。凝集体が所望される程度まで、凝集体のレベルは、温度調整に加えて、任意の多数の手段により調節され得る。例えば、緩衝液／塩濃度は、凝集体の量を増加するように調整され得る。さらに、安定な複合体と複合体化する共沈殿物が添加され得、そしてさらに沈殿の程度の割合を増加する。凝集はまた、促進剤の添加により増加され得る。例えば、標的化剤またはレセプターが複合体中に取り込まれる場合、適切なレクチン、リガンド、または抗体が複合体を架橋するために添加され得、そして凝集または沈殿の割合および程度を増加し得る。標的化剤がPDV内に組み込まれている場合、適切なリガンドもしくは抗体、またはそれらの混合物は、適切な固体支持体、すなわち、ラテックスビーズ、マイクロキャリアビーズ、メンブレン、またはフィルターなどに付着され、そして調製物から標的化レセプターまたはリガンドを取り込むPDVに、選択的に結合するように使用され得る。従って、方法は使用する前に所望のPDVを単離するために提供される。凝集、単離、再懸濁の最終的な結果として、PDVは、DNAトランスフェクション活性を保持し、かつ慣習的に産生された脂質／DNA複合体の中に通常装填され得るDNAの量をさらに上回るDNA濃度を含んで、得られ得る。従って、本発明のさらなる実施態様は、測定可能なトランスフェクション活性を保持し、そして少なくとも１mlあたり約10μg〜約10mg/mlの核酸を含むPDVを生成する方法である。同様に、本発明の別の実施態様は、実質的に減少した毒性を有するPDVを産生する方法である。この開示の目的のために、用語「実質的に減少した毒性」または「実質的に無毒性」は、薬剤の毒性が、一般に、現存のカチオン誘導体化ポリマー（すなわち、DEAE-デキストランなど）と比較して少なくとも約25パーセント、好ましくは少なくとも約50パーセント減少されるはずであることを意味するはずであり、そして最適には、少なくとも約100パーセントの減少が達成される。毒性はまた、試験被験体の50パーセントまでが致死である用量を決定することにより、測定され得る。一般に、記載されるPDVは、致死用量またはLD₅₀（同様のカチオン性脂質／ホスフェート比で形成される単離されていない安定な複合体の致死用量の２倍）を有し、そして最適には、減少した毒性ビヒクルは、DEAE- デキストランのLD₅₀よりも少なくとも約10倍大きい大きさのLD₅₀を有する。さらに、任意の種々の安定化剤が、記載されたビヒクルと組合わせて利用され得る。種々の成分の酸化は、窒素のような不活性雰囲気下で、本発明に従って処方物を調製することによって実質的に減少され得るが、これは幾分不便であり、そして高価なプロセスであり、そしてそのため化学的抗酸化剤を添加することがしばしば好適である。適切な薬学的に受容可能な抗酸化剤としては、没食子酸プロピル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、アスコルビン酸またはアスコルビン酸ナトリウム、DL-またはD-αトコフェロールおよびDL-またはD-α-酢酸トコフェリルが挙げられる。存在する場合、抗酸化剤は、例えば、0.1％(w/v)まで、好ましくは0.0001〜0.05％の量で、ビヒクルの組み立ての前、間、または後のいずれかに、単独でまたはポリヌクレオチド送達ビヒクルと組み合わせて添加され得る。医師または患者の面から、所望されない徴候（例えば、疾患に関連する徴候、環境または因子への感受性、正常な老化など）の任意の緩和または防止が所望されることが、当業者には理解される。従って、本出願の目的では、本明細書で使用される用語「処置」、「治療的使用」、または「医学的使用」は、本発明の組成物の任意のおよびすべての使用をいい、この組成物は、疾患の状態または徴候を治療し、またはさもなければ、何らかの方法で、疾患または他の所望されない徴候を防止し、妨げ、遅延させ、または逆転させる。疾患の治療的処置に使用される場合、ポリヌクレオチド送達ビヒクル（PDV）またはその誘導体の適切な投与量は、任意のいくつかの十分に確立された方法論によって決定され得る。例えば、動物研究は、１キログラム体重当たりの生物活性薬剤の最大許容用量、またはMTDを決定するために通常使用される。一般的に、試験される少なくとも１つの動物種は哺乳動物である。当業者は、ヒトを含む他の種に対する効能および毒性の回避について用量を適切に推定する。効能のヒト研究が行われる前に、正常被験体における第Ｉ相臨床試験が安全用量の確立に役立つ。特にインビボ使用が意図される場合、本発明の種々の生化学的成分は、好ましくは高純度であり、そして潜在的に有害な夾雑物を実質的に含まない（例えば、少なくとも国によって定められた食品（National Food）（NF）クレード、一般的には少なくとも分析グレード、および好ましくは少なくとも薬学的グレード）。所定の化合物が使用前に合成されなければならないならば、このような合成または続く精製は、合成または精製手順の間に使用され得る任意の潜在的に毒性の薬剤を実質的に含まない産物を、好ましくは生じる。さらに、PDVはまた、確立された方法により、安定性ならびに任意の種々の薬理学的特性をインビボにおいて増強するように改変され得る（例えば、インビボでの半減期の延長、毒性のさらなる減少など）。例えば、カチオン性ポリマーにおける架橋および分枝化の程度を変化することにより、PDVの生理学的性質は変化され得る。この変化は、経時放出（time-released）様式で体への核酸送達を可能にするPDVを構築し得る。このような経時放出処方物は、一過性の遺伝子送達の期間の拡張を提供するこど、またはインビボでの核酸の投与および送達の代替手段を開業医に提供するこどにより、急性状態の処置を容易にするように意図される。特に、本明細書中に記載されるPDVは、核酸に基づくビヒクルのパッケージングおよび送達のために理想的である。 PDVまたはその誘導体の診断的、治療的、または医学的使用が意図される場合、PDVは滅菌条件下で調製および維持され得、従って微生物の夾雑を回避し得る。PDVの比較的小さいサイズおよび固有の安定性のため、PDVを含む組成物はまた、使用前に濾過滅菌され得る。滅菌調製および濾過滅菌の上記の方法に加えて、抗菌剤もまた添加され得る。抗菌剤（これは、一般的に、総処方物の約３％w/v まで、好ましくは約0.5〜2.5％の量で使用され得る）には、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、フェノール、デヒドロ酢酸、フェニルエチルアルコール、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、チモール、チメロサール、ジヒドロ酢酸ナトリウム、ベンジルアルコール、クレゾール、p-クロロ-m-クレゾール、クロロブタノール、酢酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、および塩化ベンジルアルコニウムが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、抗菌添加剤は、PDVの生化学的特性を増強するか、またはPDV活性について不活であるかのいずれかである。所定の抗菌剤がPDV活性に対して有害であると証明し得れば、より低い程度にPDV機能をもたらす別の薬剤に置換され得る。有効成分としてPDVを含む組成物は、任意の多くの確立された方法によってインビボで導入され得る。例えば、薬剤は吸入によって；皮下（sub-q）注射によって、静脈内（I.V.）注射によって、腹腔内（I.P.）注射によって、または筋肉内（I.M.）注射によって；直腸内に、局所適用薬剤（経皮パッチ、軟膏（ointme nt）、クリーム、軟膏（salve）、点眼剤など）として投与され得るか、あるいは、腫瘍または他の器官のような組織に、または内臓内もしくは周囲に、直接注入され得る。本発明の別の実施態様は、遺伝子治療を行うためのPDVの使用を包含する。このような遺伝子治療は、罹患した個体のゲノム中の遺伝子欠損を補うことを意図し、そしてエクスビボ体細胞遺伝子治療によってもたらされ得、それによって、宿主細胞は体から取り出され、そして欠損遺伝子を発現するように形質導入されて、宿主に再移植される。あるいは、体細胞遺伝子治療は、所望の遺伝子を有するべクターを個体にインビボで直接注入することによって行われ得、それによって、遺伝子は送達され、そして宿主組織によって発現される。上記のポリヌクレオチド送達ビヒクルは、主としてポリヌクレオチドを細胞に提供することが意図されるが、本発明のさらなる実施態様は、ポリヌクレオチドに加えて任意の種々の適切な生物活性薬剤のパッケージングおよび送達を意図する。例えば、目的の生物活性薬剤（例えば、任意のタンパク質、ペプチド、有機低分子など）が正味の負の電荷を含むかまたは実質的な量の負に荷電した特徴を含むならば、本明細書中に記載されるカチオン性ポリマーを使用して、このような薬剤を送達することが有用であると証明され得る。さらに、目的の所定の薬剤がポリヌクレオチド（例えば、DNAおよび／またはR NA結合活性を有するタンパク質または他の分子）と会合し得るならば、薬剤を記載のポリヌクレオチド送達ビヒクル中に最初に組み込むことによって、薬剤を体に送達することが有用であると証明され得る。所望であれば、１つ以上の安定化剤および／または可塑剤が、より高い貯蔵安定性のために、PDV処方物に添加され得る。安定化剤および／または可塑剤として有用な物質としては単純炭化水素が挙げられ、これには、グルコース、ガラクトース、スクロース、またはラクトース、デキストリン、アカシア、カルボキシポリメチレン、およびコロイド状水酸化アルミニウムが挙げられるがこれらに限定されない。安定化剤／可塑剤が添加される場合、これらは全調製物の約10％(w /v)、好ましくは約0.5から6.5％までの量で組み込まれ得る。脂質処方物（例えば、エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、または送達ビヒクル）はまた、PDVを消化プロセスから顕著に保護し得る。このように処方された場合、PDVはまた、生物活性薬剤の経口投与に有用であるとを証明され得る。さらなる腸の保護が所望されるならば、腸溶解性コートされた形態またはそうでなければ他の保護された形態で、本発明に従って固体または液体処方物を処方することが可能である。液体処方物の場合には、これらは、中間鎖トリグリセリドの液体混合物のような保護剤と混合され得るかまたは単に同時投与され得るかのいずれかであり得るか、あるいはこれらは腸溶解性カプセル（例えば、軟または硬ゼラチンの、これらはそれ自体が必用に応じてさらに腸溶解性にされる）中に充填され得る。あるいは、PDVの固体または乾燥（すなわち、乾燥させたまたは凍結乾燥させた）処方物はより可撓的に処理され得る。これらは、錠剤を形成するために腸溶解性物質でコートされ得るか、または腸溶解性カプセル中に充填され得るかのいずれかである。錠剤またはカプセル剤上の腸溶解性コーティングの厚さは、例えば、0.5〜４ミクロンの厚さであり得るが、正確な厚さは処方の当業者によって決定される。腸溶解性コートされた顆粒（その粒子サイズは、例えば、0.5〜２mmであり得る）は、コーティングのために錠剤中に混合されることなく、それ自体がコートされ得る。同様に、マイクロカプセルが腸溶解性コートされ得る。腸溶解性コーティングは、経口投与可能な薬学的処方物に従来から利用される腸溶解性物質のいずれかを含み得る。適切な腸溶解性コーティングは、例えば、「Remington's Ph armaceutical Sciences」、第15版、1614-1615頁（1975）；第２版、116-117頁、371-374頁（1976）；および「Hagars Handbuch der Pharmazeutischen Praxie 」、第４版、第7a巻(Springer Verlag 1971)、739-742頁および776-778頁から公知である。適切な腸溶解性コーティング物質の例としては、セルロースアセチルフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（HPMC-P）、サリチル酸ベンゾフェニル、セルロースアセトスクシネート、スチレンおよびマレイン酸のコポリマー、処方されたゼラチン（formulated gelatin）、ケラチン、ステアリン酸、ミリスチン酸、ポリエチレングリコール、シェラック、グルテン、アクリル酸およびメタクリル酸樹脂、ならびにマレイン酸およびフタル酸誘導体のコポリマーが挙げられる。腸溶解性コーティング物質（単数または複数）は、ジクロロメタン、エタノールおよび水、セルロースフタレート、またはポリビニルアセテートフタレートのような溶媒に溶解され得る。腸溶解性コーティングとしてHPMC -P、ポリエチレングリコール6000、またはシェラックを利用することが好ましい。pH5.5での分解または消失（これは、ヒト幽門で遭遇される）を目的とするHPM C-Pの専売調製物は、商標HP5-5のもとで入手可能であり、そしてこれが特に好ましい。本明細書中で開示されるカヂオン性ポリマー、およびそれとともに産生されるポリヌクレオチド送達ビヒクルは、細胞への現在入手可能な合成カチオン性脂質対面ポリヌクレオチド送達に対して顕著な改良を示す。なぜなら、分解反応の副産物が実質的に非毒性であるか、または本来生体適合性であるからである。このように、本明細書中で開示されるカチオン性ポリマーは、インビトロならびにインビボでの細胞へのポリヌクレオチドの送達に有用である。本発明の別の実施態様は、本明細書中で開示されたカチオン性基の代わりに他の生体適合性または基を付着するための、カチオン性ポリマー分子の生体適合性のpH感受性またはさもなければ生分解性のリンカー部分の使用である。例えば、生物活性分予は、上記のようにポリマーに機能的に誘導体化され、そして制御された放出様式において体に送達され得る。本発明に従って使用され得るタンパク質性生物学的物質の例としては、インスリン、カルシトニン、および成長ホルモンのようなタンパク質ホルモン（ヒトまたは動物由来あるいは半合成または全体が合成によって調製されるのいずれにしても）、エリスロポエチン、プラスミノーゲンアクチベーターおよびそれらの前駆体（例えば、tPA、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、およびストレプトキナーゼ）、ヒトインターフェロンαを含むインターフェロン、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、およびIL-12 を含むインターロイキン、ならびに第VIII因子を含む血液因子が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、同様の技術を使用して産生される生体適合性のアニオン性ポリマーがまた、それらの独特の利点を薬物パッケージングおよび薬物送達に提供することが意図される。以下の実施例は、本発明を説明するために提供される。当業者のレベルであれば、本発明の具体的に記載された特徴から実質的でない差を生じるように、上記または以下の開示のいずれもを改変することを予測し得る。このように、以下の実施例は、例示によって提供され、そして本発明を限定する目的のために含まれない。 6.0．実施例 6.1．カチオン性ポリマー結合体の作製方法図１は、カチオン性ポリマーを生成するための方法の概要を提供する。ポリカチオンPEHAは、より少ない、より多い、またはもっと多い分枝アミン基を含む同様のカチオンが同等に有用であることを詳細に示すが、これは意図される。図１に示される連結基は、アミド結合によりPEHAモノマーを架橋するジカルボキシル酸である。図２は、遺伝子送達のためのカチオン性ポリマーを構築するためにもまた使用され得る、様々な他のカチオン性基、架橋剤、官能基、および分枝架橋剤の一部分を記述する。特に、別の生体アミンを示す。さらに、ホモ官能性架橋剤（イミノチオールアン（iminothiolane）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、およびジスクシンイミジルタルタレート）を示す。N-BOC-グルタミン酸分子を、さらなる官能基がカチオン性ポリマー（アミノ酸上のカルボキシル酸基を用いて）に取り込まれ得る方法の一例として提供し、そして分枝架橋剤としての、クエン酸およびエチレンジアミン四酢酸（EDTA）の使用もまた示す。6.1.1 ．試薬試薬グレードPEHAを、Aldrich chemicalsから得、そして分析は、分子が、提供された場合に、種々のより短いおよびより長い合成産物と混合された約80パーセントの全長産物であることを示した。インビボでの使用が意図される場合、全ての試薬は、可能な限りの最高の純度、および好ましくは薬学的グレードまたはそれ以上のグレードの試薬である。 6.1.2 ．カチオン性ポリマーの産生 PEHAを過剰のリンカーにゆっくり添加することにより、架橋剤を使用してPEHA をポリマー化する（ほぼ室温で、室内で撹拌しながら）。反応の間、生成ポリマーを溶液から沈殿し、生成物の単離を容易にし得る。あるいは、試薬の相対濃度を逆転させ得る。ポリマー化反応の持続時間または反応条件を変化させることにより、当業者は広範な平均分子量を有するポリマーを生成し得る。特定の条件下で、約100,000〜約400,000ダルトンの間の平均分子量を有するPEHAポリマーを産生する。 6.2．安定な送達ビヒクルを作製する方法 6.2.1．DNA ／カチオン性ポリマー複合体を形成させるためのプロトコル PEHAポリマーを、適切な緩衝液（例えば、150mM NaCl;50mM NaCl;10mM NaCl;0 .2Mデキストロース;50mM NaCl，0.2Mデキストロース；または150mM NaCl，0.2M デキストロース）中で、約450μgのポリマー／ml、または約４mg／mlまでの濃度で水和した。DNA（SSV9-pMD-AP）を、約１：１から約20:１までの間のカチオン／DNAホスフェートの比でPEHAポリマーに添加し、そして約10〜30分間インキュベートした。代表的には、複合体形成の間に存在する塩の濃度および型は、意図する複合体の使用（すなわち、インビトロ対インビボ）に依存して変化する。得られたカチオン／DNA複合体を、約300μl中約60μgのDNAを含む組成物として、直接的に細胞に与えるかまたはマウス尾静脈内に注射する（I.V.）かのいずれかで与えた。 6.2.2．アルコールエパポレーションによるDNA／カチオン性脂質複合体を形成させるためのプロトコル適量のリポフェクタミン（DOSPA）を、乾燥状態までエバポレートし、約40％エタノール／250mMグルコース／25mM NaCl（例えば、提供するのに十分なDOSPA ：DNAヌクレオチド比（mol/mol）は、約0.6）に溶解した。DOPEを、約62：38のD OPE：DOSPAの最終mol/mol比を与えるまで添加した。 DNA溶液を、40パーセントエタノール／250mMグルコース／25mM NaCl中1.2mg/m lの濃度まで調製した。次いで等量のDNAを脂質溶液に添加し、約0.63mg/mlの最終DNA濃度および約0.6の最終DOSPA/DNAヌクレオチド比を得た。エタノール／水溶液を、ローターエバポレーションにより除去し、DNA／カチオン複合体の薄い乾燥膜を得た。次いで、膜を水で水和し、PDVの安定な溶液を得た。図５は、PDV を使用して得たインビボでの発現データを示し、そして、とりわけ、NaClの存在下または非存在下で調製されたPDVを使用して得られた結果を比較する。 TACをDOSPAの代わりに使用する場合、TACを、約75：25のTAC：DOPE（mol/mol ）比で使用し、複合体生成緩衝液は、好ましくは約６のpHを有し、そして複合体生成反応は、好ましくはだいたい室温にて行う。 6.3．粒子サイズ分析粒子サイズ分析を、LeedsおよびNorthropのレーザー動的光散乱装置を使用して行った。カチオン性ポリマー（水中）の特徴付けは、粒子が直径において約20 0nmの平均サイズを有して形成されることを示した。NaCl(150mM)の添加は、平均サイズを約1,000nmに増加した。DNAの添加は、粒子の平均サイズを約400nmに減少した。アルコールエバポレーション方法を使用して調製したPDVは、代表的に200nm未満の平均直径を有し、そして100nm未満の平均直径の粒子を形成するように押し出して形成され得る。特に、TACを使用して調製されたPDVは、約40〜約100nmの間の平均粒子サイズを形成するように突出され得る。 6.4．PDV での細胞トランスフェクション PDVを、基本的に6.2節に記載する（150mM NaCl）ように形成し、そして0.5ml の無血清培地中で培養した約10⁵個のNIH 3T3細胞に添加した。PDV（約10μgのDN A）を添加した後、細胞を約４時間インキュベートした。続いて細胞をアルカリホスファターゼ免疫捕獲アッセイにより、レポーター遺伝子の発現についてアッセイした。これらの研究は、PDVが、インビトロでの遺伝子送達に有用であることを明らかにした。 6.5．インビボでのポリヌクレオチド送達ビヒクルの使用基本的に6.2節に記載するように形成したPDVを、以下のようにマウスに注射した。約60μgのDNAを含むPDVを、約500μlの正味の容量でマウス尾静脈に注射した。マウス組織サンプルを、PDV投与の48時間後に収集し、そして約100mg/mlの正味の濃度で緩衝液中でホモジナイズした。ホモジネートを、30分間65℃にて加熱し、内因性アルカリホスファターゼを不活化し、そして、続いて添加された抗ヒト胎盤アルカリホスファターゼポリクローナル抗体に結合する二次抗体を、96 ウェルプレートに吸収させることを含む免疫捕獲アッセイを使用して分析した。 0.2mlのホモジネートを各ウェルに添加し、そして４℃で一晩インキュベートすることを可能にした。ウェルを洗浄し、さらなる200μlのアリコートをウェルに添加し、そして２時間インキュベートしてシグナルを増加させ、ウェルを再度洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ基質を添加した。次いでプレートを、各ウェルのV_max、を測定し得る分子デバイスプレートリーダーを使用して読み取った。V_maxをAPのミリユニットに変換し、そしてデータを、アルカリホスファターゼ（AP）の20ミリユニット〜0.1ミリユニットまでの範囲の標準曲線を使用して、1 00mgの組織に対して標準化した。おそらく、PDVの比較的大きいサイズのために、心肺組織は、界面活性透析方法により形成されるPDVにより送達される遺伝子を最も良好に発現し、そして記載されるように送達される傾向にある。PDVのサイズを変化させることにより（P DVを構築するために使用したカチオン性ポリマーの平均サイズを制御することにより）、発現の程度および場所を、対応して変化させ得る。 PDV組成物は固有に生体適合性であるか、または減少した毒性を有するように処方されているので、PDVで注射された動物は、インビボ研究において、存在する場合は、明らかな毒性の徴候をほとんど示さない。より小さいPDVを使用した場合（アルコールエバポレーション方法により産生される）に観察されるインビボ発現量の結果を図５に示す。図５は、PDVが心臓、肺、筋肉、脾臓、および肝臓に遺伝子を効率的に送達し得ることを示す。上記の明細書に記載の全ての刊行物および特許は、本明細書中に参考として援用される。本発明の記載された方法およびシステムの種々の改変および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明白である。本発明は、特定の好ましい実施態様に関連して記載されているが、請求する場合、本発明がこのような特定の実施態様に過度に限定されるべきでないことが理解されるはずである。実際、分子生物学の分野または関連の分野における当業者に明らかである、本発明を実施するための上記の方法の様々な改変が、以下の請求の範囲内にあることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の一般構造: ...(R-X-R)n... を有するカチオン性ポリマーであって、ここで、Ｒは核酸を結合可能なカチオン性基であり、Ｘは生体耐容性の共有結合の架橋分子、およびｎは約10から10,000までの間の数である、カチオン性ポリマー。２．前記Ｒが多価アミンである、請求項１に記載のカチオン性ポリマー。３．前記多価アミンがペンタエチレンヘキサミンである、請求項３に記載のカチオン性ポリマー。４．以下の一般構造：（...(X-R_x-X-R_y-X)...）を有するカチオン性ヘテロポリマーであって、ここで、R_xは、核酸と相互作用し得るカチオン性基であり；R_yは、核酸とまた相互作用し得るR_x以外の多数の任意のカチオン性基であり；およびＸは、生体耐容性の架橋分子である、カチオン性ヘテロポリマー。５． R_xまたはR_yの少なくとも１つがペンタエチレンヘキサミンである、請求項４に記載のカチオン性ヘテロポリマー。６．以下の一般構造： (R₁,R₂)N-C(O)O-Y を有するカチオン性脂質であって、ここで、R₁およびR₂は、Ｈ，C₁〜C₆アルキル、アルケニル、またはアルキニル、一価アミンまたは多価アミンからなる群から導かれ；ならびにＹは、コレステロールまたはコレステロール誘導体である、カチオン性脂質。７．前記R₁およびR₂が一価アミンである、請求項６に記載のカチオン性脂質。８．前記一価アミンがエチルアミンである、請求項７に記載のカチオン性脂質。９．ポリヌクレオチド送達ビヒクルを作製する方法であって、以下の工程：ａ）カチオン性ポリマーおよび／またはカチオン性脂質を、界面活性剤の存在下でポリヌクレオチドと複合体化する工程；ｂ）界面活性剤を除去し、それにより安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルが生成される工程、を包含する、方法。１０．前記除去が透析による、請求項９に記載の方法。１１．ポリヌクレオチド送達ビヒクルを作製する方法であって、以下の工程：ａ） DNAをＢヘリックスとして実質的に維持する緩衝液中で、該DNAをカチオン性ポリマーおよび／またはカチオン性脂質と複合体化する工程；ｂ）複合体化DNAから該緩衝液を除去する工程；およびｃ）水性溶液を該複合体化DNAに添加する；これによりポリヌクレオチド送達ビヒクルが形成される、工程、を包含する、方法。１２．前記緩衝液が、約10パーセントと約80パーセントとの間のアルコールを含む、請求項１１に記載の方法。１３．前記アルコールがエタノールである、請求項１２に記載の方法。１４．前記カチオン性脂質が請求項６のカチオン性脂質である、請求項１１に記載の方法。１５．請求項９〜１４のいずれか１つに記載される方法により生成される、ポリヌクレオチド送達ビヒクル。