MX2011006166A - Alfa-amilasas hibridas. - Google Patents

Abstract

Se proveen alfa-amilasas híbridas que comparten una estructura 3D conservada en su totalidad o en parte con una a-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre, v.gr., una amilasa de Bacillus. En el híbrido, una porción N-terminal de una a-amilasa similar a Termamyl es reemplazada por secuencias de una a-amilasa de arquea. La similitud de secuencia entre las dos secuencias de amilasa puede ser menos de 60%. La conservación de la estructura 3D de tipo silvestre en el híbrido facilita la obtención de amilasas enzimáticamente activas. En una modalidad, una o ambas secuencias de amilasa aportan residuos al dominio B, lo que da por resultado propiedades particularmente ventajosas. Por ejemplo, el reemplazo del sitio de unión a Ca2+ en el dominio B de la a-amilasa similar a Termamyl con una secuencia de dominio B de una a-amilasa de arquea que no se une a Ca2+ puede producir un híbrido que sea completamente activo en ausencia de Ca2+.

Description

ALFA-AMILASAS HIBRIDAS Campo de la Invención Se proveen amilasas híbridas que comprenden secuencias de a-amilasa de arqueas y a-amilasa similar a Termamyl . Las amilasas híbridas pueden tener propiedades alteradas, comparadas con la a-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre.

Antecedentes de la Invención Enzimas relacionadas que tienen una función común pueden o no tener identidad de secuencia significativa. Por ejemplo, las alfa-amilasas de Bacillus ( 1 , 4 - -D-glucano glucanohidrolasa , EC 3.2.1.1) se clasifican como "similar a Termamyl" si sus secuencias de aminoácidos comparten 60% o más de identidad a alfa-amilasa de B. licheniformis . Véase O 96/23874. Las amilasas híbridas se pueden crear entre amilasas que comparten 62% o más de identidad de secuencia. Véase Gray et al., J. Bacteriology 166: 635-43 (1986); patente de E.U.A. No. 6,143,708. Por ejemplo, una amilasa quimérica que contiene residuos 1-300 de Bacillus amyloliquefacens y residuos 301-483 de B. licheniformis ha sido expresada recombinantemente y cristalizada. Véase Brzozowski et al., Biochemistry 39: 9099-107 (2000); véase también WO 96/23874; WO 97/41213. Sin embargo, incluso las Ref. 220131 amilasas que comparten menos de 25% de identidad de secuencia, tales como las amilasas de Bacillus subtilis y B. licheniformis, no obstante pueden compartir una función catalítica común y un doblamiento tridimensional (3D) conservado global .

Las estructuras de cristal de numerosas amilasas están actualmente disponibles. Véase Brzozowski et al. (2000) supra. El banco de datos de proteínas (PDB) , por ejemplo, contiene estructuras 3D de por lo menos las amilasas mostradas en la tabla 1.

Tabla 1 La comparación de estas estructuras de cristal revela un alto grado de conservación de estructura tridimensional (3D) , incluso en ausencia de similitud de secuencia significativa. Todas las estructuras de alfa-amilasa reportadas comparten un dominio de núcleo catalítico (ß/a)8, dominio A. "(ß/a)8'" se refiere a una denominada "estructura de barril de TI " , definida como una conformación 3D de proteína conservada, o "doblamiento" , que consiste de ocho hélices y ocho cadenas ß paralelas que alternan a lo largo del esqueleto del péptido. Véase Lolis et al, Biochemistry 29: 6609-18 (1990). El dominio B es una excursión, o estructura extendida, entre la cadena de barril ß-3 y la hélice a-3 del dominio A. El dominio C, típicamente una hoja ß de ocho cadenas, forma la porción C-terminal restante de las amilasas. La estructura de dominio de las amilasas se describe con más detalle más adelante.

Existe una continua necesidad en la técnica para proveer alfa-amilasas variantes que se doblen apropiadamente, mantengan estabilidad, y demuestren expresión eficiente en una célula hospedera recombinante , sin la necesidad de hacer cambios al por mayor a la secuencia de aminoácidos o estructura 3D de la proteína.

Sumario de la Invención La estructura 3D de una alfa-amilasa similar a Termamyl se usa como una guía para construir alfa-amilasas híbridas novedosas. En la amilasa híbrida, una porción del N-terminal de una alfa-amilasa similar a Termamyl es reemplazada por secuencias de una amilasa de arqueas. Las dos amilasas comparten una estructura 3D conservada. Además, la identidad de secuencia entre las amilasas puede ser menor que 60%. En una modalidad, la amilasa híbrida contiene aproximadamente 400 a aproximadamente 500 residuos de aminoácidos. Entre aproximadamente 10% y aproximadamente 80% del total de aminoácidos en la amilasa híbrida son contribuidos por la amilasa de arqueas. Se predice que la porción reemplazada en la enzima híbrida tiene una estructura 3D que es estructuralmente conservada en su totalidad o en parte con la amilasa similar a Termamyl . En una modalidad, por lo menos el residuo C-terminal de la secuencia de amilasa de arqueas (residuo "x" ) y el residuo N-terminal de la secuencia de amilasa similar a Termamyl (residuo "y") son estructuralmente conservadas. La amilasa híbrida venta osamente puede combinar propiedades deseables de las secuencias de amilasa constituyentes, tales como un nivel alterado de expresión recombinante, solubilidad alterada, y propiedades de rendimiento deseables, tal como perfiles de actividad de pH óptimos, especificidad de sustrato, características de producto, y actividad específica.

Debido a que se piensa que los dominios de proteína a menudo se doblan como unidades independientes, se podría esperar que los dominios tuvieran que ser reemplazados como unidades enteras para mantener el doblamiento apropiado en una enzima híbrida. Al diseñar los híbridos para mantener el doblamiento conservado de la enzima de Bacillus de tipo silvestre, sin embargo, las secuencias de alfa-amilasa no necesitan ser fusionadas en colindancias de dominios. En algunas modalidades, una amilasa híbrida comprende una primera secuencia de aminoácidos que contiene una porción del dominio B de una primera alfa-amilasa, que es fusionada a una segunda secuencia de aminoácidos de una alfa-amilasa de Bacillus que contiene la porción restante del dominio B. De esta manera, amilasas híbridas con propiedades únicas puede ser diseñada, según la porción particular de los dominios B que son fusionados entre sí.

Por ejemplo, ciertas modalidades son dirigidas a amilasas híbridas que contienen secuencias de alfa-amilasa de B. stearothermophilus (AmyS; también conocida en la técnica como Geobacillus stearothermophilus) fusionadas a secuencias de "Ultrathin" , una alfa-amilasa de arqueas descrita en Richardson et al, J". Biol . Chem. 211: 26501-07 (2002) (acceso a GenBank™ No. AAM48114) . En varias modalidades descritas en la presente, el N-terminal del híbrido está compuesto de residuos de aminoácidos de Ultrathin (es decir, la primera secuencia de aminoácidos) , mientras que el C-terminal está compuesto de residuos de AmyS (es decir, la segunda secuencia de aminoácidos) . Residuos de Ultrathin específicos son denotados "UTn" , en donde n es el número de residuo de aminoácido del N-terminal. Por ejemplo, el residuo 104 de Ultrathin es denotado "UT 104" . El término "des-Met Ultrathin" se refiere a Ultrathin que carece de un residuo de metionina N-terminal. Una amilasa híbrida entre residuos de Ultrathin 1-104 y residuos de AmyS 100-483, por ejemplo, es denotado "UT 1-104: AmyS 100-483".

Ultrathin, igual que otras amilasas de arqueas, tiene un sitio de unión a Zn2+ en el dominio B. Por el contrario, el dominio B de alfa-amilasas de Bacillus tiene un sitio de unión a Ca2+-Na+-Ca2+ . Un híbrido que contiene el sitio de unión a Zn2+ de Ultrathin fusionado al dominio B restante de una alfa-amilasa de Bacillus puede tener características de rendimiento de una alfa-amilasa de Bacillus sin requerir Ca2+ para actividad enzimática. Esa amilasa híbrida puede ser particularmente útil cuando se usa en combinación con otra enzima, tal como una glucoamilasa , que tiene un requerimiento de calcio diferente de una alfa-amilasa de Bacillus de tipo silvestre. Por ejemplo, la amilasa híbrida se puede usar para sacarificar almidón en el mismo recipiente de reacción que una glucoamilasa, por ejemplo, en donde la concentración de Ca+ puede ser optimizada para rendimiento de la glucoamilasa.

Por consiguiente, la presente descripción provee una amilasa híbrida que comprende el polipéptido que tiene, de N-terminal al C-terminal , la fórmula (I): A-x-y-B (I), en donde A es una primera secuencia de aminoácidos de una alfa-amilasa de arqueas, B es una segunda secuencia de aminoácidos de una alfa-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre o una variante de la misma, x es un residuo C-terminal de la primera secuencia de aminoácidos, e y es un residuo N-terminal de la segunda secuencia de aminoácidos. La variante de alfa-amilasa similar a Termamyl puede tener por lo menos aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, o aproximadamente 99% de identidad de secuencia a la alfa-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre. La primera y segunda secuencias de aminoácidos juntas pueden contener aproximadamente 400, aproximadamente 410, aproximadamente 420, aproximadamente 430, aproximadamente 440, aproximadamente 450, aproximadamente 460, aproximadamente 470, aproximadamente 480, aproximadamente 490, o aproximadamente 500 residuos de aminoácidos. Aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, o aproximadamente 80% de aminoácidos en la amilasa híbrida pueden ser contribuidos por la alfa-amilasa de arqueas. Tanto los residuos x como los residuos y son estructuralmente conservados en la amilasa híbrida en comparación con la alfa- amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre. La amilasa híbrida puede comprender la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NOs : 1-8. En un aspecto adicional, la amilasa híbrida puede ser purificada.

En un aspecto, la distancia media cuadrática entre carbonos alfa en residuos x e y en comparación con la estructura 3D de la alfa-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre es no mayor que aproximadamente 0.5 Á, aproximadamente 0.4 Á, aproximadamente 0.3 Á, aproximadamente 0.2 Á, o aproximadamente 0.1 Á. En otro aspecto, la primera secuencia de aminoácidos A es estructuralmente conservada en la amilasa híbrida en comparación con la alfa-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre. La alfa-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre puede ser una de Bacillus . La alfa-amilasa de Bacillus puede ser una alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, alfa-amilasa de B. licheniformis, alfa-amilasa de B. subtilis, alfa-amilasa de Bacillus sp. KSM-K38, o alfa-amilasa de B. halmapalus . La variante de alfa-amilasa similar a Termamyl puede derivar de la alfa-amilasa B. stearothermophilus al remover la C-terminal de la enzima progenitora. La alfa-amilasa de arqueas puede ser alfa-amilasa Ultrathin. La primera y segunda secuencias de aminoácidos de la amilasa híbrida se derivan de amilasas que pueden compartir menos de aproximadamente 60%, aproximadamente 55%, aproximadamente 50%, aproximadamente 45%, aproximadamente 40%, aproximadamente 35%, o aproximadamente 30% de identidad de secuencia. También se contempla una amilasa híbrida que comprende un sitio de unión a Zn2+ dentro de la primera secuencia de aminoácidos. La amilasa híbrida puede tener por lo menos un aminoácido de un sitio de unión a Ca2+ de la alfa-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre reemplazada por un residuo de aminoácido de la primera secuencia de aminoácidos.

En un aspecto adicional, los residuos x e y están en el dominio B. La primera secuencia de aminoácidos puede contribuir por lo menos aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, o aproximadamente 98% de los residuos de aminoácidos del dominio B.

Otro aspecto contempla una amilasa híbrida que tiene un nivel alterado de expresión recombinante , solubilidad, perfil de actividad de pH, especificidad de sustrato, o actividad específica en comparación con la alfa-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre. La amilasa híbrida puede tener actividad de alfa-amilasa que no es afectada por concentración de Ca2+ .

También se contempla un ácido nucleico que codifica la amilasa híbrida como se describe actualmente. Un aspecto adicional es un vector que comprende el ácido nucleico. Un aspecto adicional contempla una célula hospedera que contiene el ácido nucleico o el vector. La célula hospedera puede ser una bacteria u hongo. En otro aspecto adicional, la bacteria puede ser Bacillus sp .

Un aspecto adicional contempla un método para diseñar el ácido nucleico que codifica la enzima híbrida. El método comprende alinear una estructura 3D de una alfa-amilasa de arqueas y una alfa-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre en un procedimiento implementado por computadora, seleccionar los residuos de aminoácidos x e y que son estructuralmente conservados, y diseñar el ácido nucleico para codificar la enzima híbrida. El procedimiento implementado por computadora puede comprender desplegar la alineación estructural 3D en un monitor de computadora. La distancia media cuadrática entre carbonos alfa en residuos x e y en comparación con la estructura 3D de la alfa-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre es' no más de aproximadamente 0.5 Á, aproximadamente 0.4 Á, aproximadamente 0.3 Á, aproximadamente 0.2 Á, o aproximadamente 0.1 Á.

Breve Descripción de las Figuras Las figuras anexas se incorporan en y constituyen una parte de esta especificación e ilustran varias modalidades .

La figura 1 ilustra una alineación de secuencia de aminoácidos y secuencia de consenso entre una forma madura (es decir, falta de una secuencia de señal) de alfa-amilasa de B . stearothermophilus ("MatArayS": SEQ ID NO: 10) y una forma madura de amilasa de des-Met Ultrathin ( "MatUltrathin" : SEQ ID NO: 9) .

Las figuras 2A y 2B ilustran las actividades relativas de varias amilasas mediante el uso de la prueba de amilasa de Phadebas® colorimétrica (Magle Life Sciences) . El sustrato consiste de microesferas de almidón insolubles en agua con colorante azul químicamente unido que es soluble en agua. Las amilasas hidrolizan el almidón, al liberar el colorante azul que se mide por un cambio en adsorción a 620 nm. Una serie de dilución de muestra de sobrenadante de cultivo se probaron a pH 7 (Figura 2A) y pH 10 (Figura 2B) . Las unidades arbitrarias de absorbancia se grafican como una función de dilución de las muestras de prueba de amilasa. Se analizaron las siguientes amilasas híbridas: Híbrido A: UT 1-104: AmyS 100-483 (SEQ ID NO: 1) ; Híbrido B: UT 1-113: AmyS 109-483 (SEQ ID NO: 2); Híbrido C: UT 1-128: AmyS 140-483 (SEQ ID NO: 3 ) ; Híbrido D: UT 1-145: AmyS 161-483 (SEQ ID NO: 4); Híbrido E: UT 1-163: AmyS 203-483 (SEQ ID NO: 5); Híbrido F: UT 1-175: AmyS 215-483 (SEQ ID NO: 6); Híbrido G: UT 1-191: AmyS 228-483 (SEQ ID NO: 7); y Híbrido H: UT 1-209: AmyS 246-483 (SEQ ID NO: 8). La figura 3 ilustra la secuencia de aminoácidos de amilasa des-Met Ultrathin (SEQ ID NO : 9) . Los residuos de aminoácidos en negritas y subrayados marcan las varias C-terminales de residuo de la porción Ultrathin en los híbridos mostrados en las figuras 2A y 2B. Las "posiciones cruzadas" en Ultrathin están en negritas y subrayadas.

La figura 4 ilustra la secuencia de aminoácidos de una variante AmyS que tiene una truncación de C-terminal que remueve un dominio de unión a almidón (SEQ ID NO: 11) . Los residuos de aminoácidos en negritas y subrayados marcan las N-terminales de residuo de la porción AmyS en los híbridos mostrados en las figuras 2A y 2B. Las "posiciones cruzadas" en AmyS están en negritas y subrayadas.

La figura 5A ilustra dos vistas estereoscópicas de AmyS, con el dominio B en negro. Las esferas atrás del dominio B representan átomos de Na+ y Ca2+ unidos.

La figura 5B ilustra dos vistas estereoscópicas de UT 1-104: AmyS 100-483, con residuos UT 1-104 en negro. Las esferas atrás del dominio B representan átomos de Na+ y Ca2+ unidos .

La figura 5C ilustra dos vistas estereoscópicas de UT 1-209: AmyS 246-483, con residuos UT 1-209 en negro. Las esferas atrás del dominio B representan átomos de Na+ y Ca2+ unidos.

Descripción Detallada de la Invención Se proveen alfa-amilasas híbridas que comparten una estructura 3D conservada en total o en parte con una o¡-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre, v.gr. , una amilasa de Bacillus . En el híbrido, una porción N-terminal de una -amilasa similar a Termamyl es reemplazada por secuencias de una amilasa de arqueas. La similitud de secuencia entre las dos amilasas puede ser menor que 60%. La conservación de la estructura 3D de tipo silvestre en el híbrido facilita obtener amilasas enzimáticamente activas. En una modalidad, una o ambas secuencias de amilasa aportan residuos al dominio B, lo que da por resultado propiedades particularmente ventajosas. Por ejemplo, el reemplazo del sitio de unión a Ca2+ en el dominio B de la a-amilasa similar a Termamyl con una secuencia de dominio B de una amilasa de arqueas que no se une a Ca2+ puede producir un híbrido que es completamente activo en ausencia de Ca2+ . 1. Definiciones y abreviaturas De conformidad con esta descripción detallada, se aplican las siguientes abreviaturas y definiciones. Cabe notar que, como se usa en la presente, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una enzima" incluye una pluralidad de esas enzimas, y la referencia a "la formulación" incluye referencia a una o más formulaciones y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica, etc.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que es comúnmente entendido por un experto en la técnica. Los siguientes términos se proveen a continuación. 1.1. Definiciones "Arqueas", como se usa en la presente, se refiere a organismos unicelulares de un reino distinto de procariotas y eucariotas . Las arqueas incluyen termófilos, halófilos y metanógenos .

Las amilasas son hidrolasas que digieren los enlaces de a-D-(l?4) O-glicosídicos en almidón e incluyen glucoamilasas y ß-amilasas, así como alfa-amilasas . Para el propósito de esta descripción, sin embargo, "amilasa" se refiere a una alfa-amilasa a menos que se designe otra cosa. Alfa-amilasas (EC 3.2.1.1; a-D- ( l->4 ) -glucano glucanohidrolasa) se definen como enzimas de endo-acción que digieren enlaces OÍ-D-(1?4) O-glicosídicos dentro de la molécula de almidón de una manera aleatoria. Por el contrario, las enzimas amilolíticas de exo-acción, tales como ß-amilasas (EC 3.2.1.2; a-D- (l-?4 ) -glucano maltohidrolasa) y algunas amilasas específicas del producto como a-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133) digieren la molécula de almidón del extremo no reductor del sustrato. Las ß-amilasas, a- glucosidasas (EC 3.2.1.20; -D-glucósido glucohidrolasa) , ¦glucoamilasa (EC 3.2.1.3; -D- ( 1?4 ) -gl cano glucohidrolasa), y amilasas específicas del producto pueden producir malto-oligosacáridos de una longitud específica a partir del almidón.

Una amilasa similar a "Termamyl" tiene por lo menos aproximadamente 60% de identidad de secuencia a la alfa- amilasa de B. licheniformis de tipo silvestre.

Una enzima "de tipo silvestre" se refiere a una enzima que ocurre naturalmente. Una a-amilasa "de tipo silvestre similar a Termamyl por lo tanto se refiere a una OÍ- amilasa que ocurre naturalmente que tiene por lo menos aproximadamente 60% de identidad de secuencia a la alfa- amilasa de B. licheniformis de tipo silvestre.

"Por ciento de identidad de secuencia" se determina al alinear dos secuencias y al compararlas mediante el uso del programa BLAST con valores de alineación por omisión, disponible en el sitio web del National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional para Información de Biotecnología) (NCBI) de la National Library of Medicine (Biblioteca Nacional de Medicina) .

Una "variante" o "variantes" se refiere ya sea a polipéptidos o ácidos nucleicos. Para el propósito de la presente descripción, una "variante" incluye proteínas híbridas que contienen secuencias de aminoácidos de dos diferentes amilasas progenitoras . El término "variante" se puede usar indistintamente con el término "mutante" . Las variantes incluyen inserciones, sustituciones, transversiones, truncaciones , y/o inversiones en uno o más lugares en la secuencia de aminoácido o nucleótido, respectivamente, en comparación con la secuencia de tipo silvestre. Las frases "polipéptido variante" y "enzima variante" por lo tanto significan una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que ha sido modificada a partir de la secuencia de aminoácidos de una proteína de tipo silvestre. Los polipéptidos variantes incluyen un polipéptido que tiene un cierto por ciento, v.gr. , por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% o 99%, de identidad de secuencia con la enzima progenitora. Las variantes pueden tener 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 ó 30 sustituciones, adiciones o deleciones aminoácidos, o cualquier valor integral dentro del intervalo de 1-30, en comparación con la secuencia de tipo silvestre. Una variante puede ser expresada como una proteína de fusión que contiene un polipéptido heterólogo. Por ejemplo, la variante puede comprender un péptido de señal d otra proteína o una secuencia diseñada para ayudar a la identificación o purificación de la proteína de fusión expresada, tal como una secuencia de His-Tag.

El término "proteína de fusión" se refiere a dos o más polipéptidos unidos entre sí por cualesquiera medios conocidos en la técnica. Estos medios incluyen síntesis química o corte y empalme de ácidos nucleicos codificantes por ingeniería genética recombinante .

Como se usa en la presente, el término "proteína híbrida" es una forma especial de proteína de fusión. Igual que una proteína de fusión, una secuencia de aminoácidos de una primera proteína, una alfa-amilasa de arqueas, es fusionada o unida a una secuencia de aminoácidos de una segunda proteína, una alfa-amilasa similar a Termamyl, para formar una proteína híbrida. En la alfa-amilasa híbrida de la presente descripción, la primera secuencia de aminoácidos de una alfa-amilasa de arqueas reemplaza una porción de una alfa-amilasa similar a Termamyl, mientras conserva toda o una parte de la estructura 3D de la porción reemplazada de la alfa-amilasa similar a Termamyl. La alfa-amilasa de arqueas y/o la alfa-amilasa similar a Termamyl, de la cual se deriva la amilasa híbrida, pueden ser "variantes" de una amilasa de tipo silvestre.

"Carbono alfa" se refiere al carbono del esqueleto en una cadena de polipéptido, el carbono que es unido al carbono del carbonilo.

Como se usa en la presente, una primera estructura 3D o doblamiento o porción de la misma es "estructuralmente conservada" con una segunda estructura 3D o porción de la misma cuando las estructuras están alineadas por lo que la distancia media cuadrática (RMSD) de carbonos alfa es no mayor que aproximadamente 1 Á. Véase también, Orengo et al, Protein Eng. 6: 485-500 (1993).

Como se usa en la presente, el término "fragmento" se refiere a una secuencia de polinucleótido o polipéptido que es menor que la longitud completa, y es una secuencia que comprende dos o más residuos de aminoácido o ácido nucleico, v.gr., 5, 10, 15, 20, 30 ó 50 residuos.

Como se usa en la presente, el término "expresión" se refiere al proceso por el cual un polipéptido es producido con base en la secuencia de ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto transcripción como traducción.

"Aislado" significa que la secuencia es por lo menos sustancialmente libre de por lo menos otro componente al cual la secuencia está naturalmente asociada y encontrada en la naturaleza, v.gr., secuencias genómicas .

"Purificado" significa que el material está en un estado relativamente puro, v.gr., por lo menos aproximadamente 90% puro, por lo menos aproximadamente 95% puro, o por lo menos aproximadamente 98% puro.

"Termoestable" significa que la enzima retiene actividad después de ser expuesta a temperaturas elevadas. La termoestabilidad de una enzima se mide por su vida media (t¾) , en donde la mitad de la actividad de la enzima se pierde por la vida media. El valor de vida media se calcula bajo condiciones definidas al medir la actividad de amilasa residual. Para determinar la vida media de la enzima, la muestra se calienta a la temperatura de prueba durante 1-10 min, y la actividad se mide mediante el uso de una prueba estándar para la actividad de la enzima.

Como se usa en la presente, "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "polipéptido" y/o el término "proteína." En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "péptido" ; en algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "enzima." Como se usa en la presente, "secuencia de nucleótido" o "secuencia de ácido nucleico" se refiere a una secuencia de oligonucleótido o secuencia de polinucleótido y variantes, homólogos, fragmentos y derivados de la misma. La secuencia de nucleótido puede ser de origen genómico, sintético o recombinante y puede ser de doble cadena o de cadena sencilla, ya sea que represente la cadena de sentido o anti-sentido . Como se usa en la presente, el término "secuencia de nucleótido" incluye ADN genómico, ADNc, ADN sintético y ARN.

"Homólogo" significa una entidad que tiene un cierto grado de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas y las secuencias de nucleótidos expuestas. Una "secuencia homologa" incluye un polinucleótido o un polipéptido que tiene un cierto por ciento, v.gr., por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% o 99%, de identidad de secuencia con otra secuencia. Típicamente, los homólogos comprenderán los mismos residuos de sitio activo que la secuencia de aminoácidos expuesta. Los homólogos también retienen actividad enzimática, aunque el homólogo puede tener diferentes propiedades enzimáticas que la enzima de tipo silvestre.

Como se usa en la presente, "hibridación" incluye el proceso por el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria a través de apareamiento de bases, así como el proceso de amplificación como se lleva a cabo en tecnologías de reacción en cadena de polimerasa (PCR) . El ácido nucleico variante puede existir como ADN o AR de cadena sencilla o doble, un heteroduplex de ARN/ADN o un copolímero de ARN/ADN. Como se usa en la presente, "copolímero" se refiere a una cadena de ácido nucleico individual que comprende tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos . El ácido nucleico variante puede ser optimizado con codón para incrementar adicionalmente la expresión .

Como se usa en la presente, un compuesto "sintético" es producido por síntesis química o enzimática in vitro. Incluye, pero no se limita a, ácidos nucleicos variantes hechos con uso de codón óptimo para organismos hospederos, tales como un hospedero de células de levadura u otros hospederos de expresión de elección.

Como se usa en la presente, "célula transformada" incluye células, que incluyen tanto células bacterianas como fúngicas, que han sido transformadas mediante el uso de técnicas de ADN recombinante . La transformación típicamente ocurre por inserción de una o más secuencias de nucleótidos en una célula. La secuencia de nucleótido insertada puede ser una secuencia de nucleótido heteróloga, es decir, es una secuencia que no es natural a la célula que ha de ser transformada, tal como una proteína de fusión.

Como se usa en la presente, "operablemente enlazada" significa que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de su manera destinada. Por ejemplo, una secuencia reguladora operablemente enlazada a una secuencia codificante es ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra bajo condición compatible con las secuencias de control .

Como se usa en la presente, "biológicamente activa" se refiere a una secuencia que tiene una función estructural, reguladora o bioquímica similar a la de la secuencia que ocurre naturalmente, aunque no necesariamente al mismo grado.

Como se usa en la presente, el término "almidón" se refiere a cualquier material compuesto de los carbohidratos de polisacárido complejos de plantas, tales como maíz, compuestos de amilosa y amilopectina con la fórmula (CeHio05)x, en donde X puede ser cualquier número. 1.2 . Abreviaturas Se aplican las siguientes abreviaturas a menos que se indique otra cosa: 3-D o 3D tridimensional ADA azodicarbonamida AmyS amilasa de B. stearothermophilus (a/k/a Geobacillus stearothermophilus) ; AmyS n Residuo n de AmyS, con el uso del esquema de numeración de SEQ ID NO: 9 AmyS n-483 Residuos n-483 de AmyS, con el uso del esquema de numeración de SEQ ID NO: 9 ADNc ADN complementario DEAE dietilamino etanol ADN ácido desoxirribonucleico EC designación de clasificación de enzima HPLC cromatografía de líquidos de alto rendimiento ARNm ácido ribonucleico mensajero PCR reacción en cadena de polimerasa PDB base de datos de proteína PEG poli (etilenglicol) Ppm partes por millón RMSD distancia media cuadrática RT-PCR reacción en cadena de polimerasa con transciptasa inversa SDS-PAGE dodecilsulfato de sodio-electroforesis en gel de poliacrilamida IX SSC 0.15 de NaCl , 0.015 M de citrato de sodio pH 7.0 t¾ vida media Tf temperatura de fusión (°C) a la cual 50% de la proteína en cuestión es fundida ATm cambio de °C en Tf Ultrathin amilasa de arqueas descritas en acceso a GenBank™ No. AAM48115.1 (SEQ ID NO: 10) UT n Residuo n de amilasa Ultrathin, con el uso del esquema de numeración de SEQ ID NO: 10 UT 1-n Residuos de Ultrathin 1-n, con el uso del esquema de numeración de SEQ ID NO: 10 UT 1-x: Amy S y-483 Residuos de Ultrathin 1-x fusionados a residuos y-483 de AmyS o/v peso/volumen p/p peso/peso 2. Ingeniería de proteínas de fusión con estructura 3D conservada estructura de dominio puede ser alterada cuando se fusionan secuencias de aminoácidos disímiles para hacer una enzima híbrida, particularmente cuando las dos secuencias se unen a la mitad de un dominio. La alteración de la estructura del dominio a su vez puede conducir a actividad más baja y/o dificultades en doblamiento de proteína, lo que da por resultado una pérdida de rendimiento de la proteína de fusión expresada. Este problema es enfrentado al seleccionar un punto de fusión apropiado entre la secuencia de aminoácidos de la primera proteína y la secuencia de aminoácidos de la proteína de Bacillus . A saber, las dos secuencias son fusionadas en un punto en donde la estructura 3D de las dos secuencias de amilasa es conservado. De esta manera, alteraciones de estructura 3D mínimas ocurren cuando las dos secuencias se unen en la enzima híbrida. Además, este enfoque facilita la construcción de híbridos activos, aun cuando las amilasas comparten menos de 60% de identidad de secuencia .

Una alineación estructural de dos proteínas se pueden usar para determinar si toda o parte de la estructura 3D es conservada entre dos proteínas. Para este fin, la estructura 3D de una primera proteína puede ser sobrepuesta sobre o alineada con la estructura 3D de una segunda proteína. La sobreposición o alineación se puede hacer a través de la estructura de proteína entera o elementos de estructura secundaria. Por ejemplo, los elementos de estructura secundaria, tales como las cadenas ß centrales en un barril ß, se pueden alinear. Los métodos de sobreposición o alineamiento de estructuras son conocidos en la técnica. En una modalidad, la alineación es conducida con un proceso implementado por computadora, tal como el algoritmo de Ambiente de Operación Molecular provisto por el Chemical Computing Group (Grupo de Computación Química) . En otra modalidad, la salida de la alineación se despliega en un monitor de computadora o sistema de despliegue.

Bajo alineación de las dos estructuras, el grado de alineación de las cadenas de carbón alfa para las dos estructuras se puede determinar. Los aminoácidos que son estructuralmente conservados son seleccionados. Para el propósito de esta descripción, una primera estructura 3D o doblamiento es "estructuralmente conservada" con una segunda estructura 3D cuando la RMSD de carbonos alfa en las estructuras no es más que aproximadamente 1 Á. La conservación estructural puede extenderse a través de por lo menos dos o más residuos de aminoácidos y puede incluir la porción entera de la amilasa híbrida contribuida por la a-amilasa de arqueas. En una modalidad, el grado de conservación estructural es suficientemente alto por lo que la RMSD de carbonos alfa es no más que aproximadamente 0.5 A.

La amilasa híbrida tiene la estructura general, de N-terminal a C-terminal, mostrada en la fórmula (I) : A-x-y-B (I), en donde A es una primera secuencia de aminoácidos de una o¡-amilasa de arqueas, B es una segunda secuencia de aminoácidos de una a-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre o una variante de la misma, x es el residuo C-terminal de la primera secuencia de aminoácidos, e y es el residuo N-terminal de la segunda secuencia de aminoácidos. En una modalidad, por lo menos los residuos x e y son estructuralmente conservados con la a-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre. Es decir, la RMSD de carbonos alfa en residuos x e y es no más que aproximadamente 1 Á. En otra modalidad, la RMSD de carbonos alfa en residuos x e y es no más que aproximadamente 0.5 Á.

Residuos de aminoácidos representativos correspondientes a x en la fórmula (I) se muestran como residuos de aminoácidos en negritas y subrayados, ilustrados en la figura 3. Los residuos de aminoácidos representativos correspondientes a y en la fórmula (I) se muestran como residuos de aminoácidos en negritas y subrayados, ilustrados en la figura 4. Los residuos x e y ocurren en "posiciones de entrelazamiento" .

El proceso de unir secuencias de las dos amilasas para formar el híbrido se puede hacer por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos se pueden unir a través de una conjugación química de los aminoácidos en las terminales de las secuencias de polipéptido. Alternativamente, los ácidos nucleicos codificantes pueden ser recombinantemente manipulados por ingeniería genética para codificar la proteína híbrida en una célula hospedera de expresión. Los métodos de ingeniería genética recombinante son bien conocidos en la técnica. Los métodos apropiados se pueden encontrar, por ejemplo, en cualquier manual de laboratorio actualmente disponible, tal como Sambrook et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) . 3. La estructura del dominio de amilasas de Bacillus La alfa-amilasa de Bacillus está hecha de tres dominios globulares A, B y C. Véase el documento WO 96/23874 para una discusión completa. Los dominios se pueden definir como residuos 1-103 y 206-395 para el dominio A, los residuos 104-205 para el dominio B, y los residuos 396-483 para el dominio C, los números se refieren a alfa-amilasa de B. licheniformis. La alfa-amilasa de Bacillus es una molécula alargada, el eje más largo es de aproximadamente 85 Á. El punto más amplio perpendicular a este eje es aproximadamente 50 Á y abarca el dominio A central. Los residuos del sitio activo de la alfa-amilasa de B . licheniformis son D323, D231 y E261. 3.1. Dominio A El dominio A es el dominio más grande y contiene el sitio activo, compuesto de un agregado de tres residuos de aminoácidos en una hendidura profunda en la superficie de la enzima. El dominio A de todas las estructuras de alfa-amilasa conocidas tiene el mismo doblamiento global, a saber, el barril (ß/a)8 con ocho cadenas ß centrales y ocho hélices flanqueadoras . El extremo C-terminal de la cadena ß 1 es conectado a la hélice 1 por un bucle denotado bucle 1, y un patrón idéntico se encuentra para los otros bucles . Estos bucles muestran alguna variación en tamaño y algunos pueden ser muy costosos.

Las ocho cadenas ß centrales en el barril (ß/a)8 se sobreponen bien entre las varias estructuras de a-amilasa conocidas, y esta parte de la estructura, que incluye los alrededores cercanos del sitio activo localizados en el extremo C-terminal de las cadenas ß, muestran alta similitud entre las diferentes amilasas.

Los bucles que conectan las cadenas ß y hélices o¡ despliegan variaciones altas entre alfa-amilasas similares a Termamyl y alfa-amilasas fúngicas. Estos bucles constituyen el contexto estructural del sitio activo y la mayoría de los contactos al sustrato se encuentra entre los residuos localizados en estos bucles. Características importantes tales como especificidad de sustrato, unión a sustrato, perfil de pH/actividad, patrón de digestión de almidón son determinadas por los aminoácidos y las posiciones de los mismos en estos bucles. 3.2. Dominio B El dominio B es un dominio compacto que tiene un número muy alto de residuos cargados. El dominio B surge como una extensión del bucle entre la cadena 3 y la hélice 3 del dominio A y contiene una estructura de hoja ß antiparalela de cinco cadenas que contiene por lo menos una estructura de bucle larga y que tiene la conectividad -1, +3, -IX, +2. Véase Richardson, Adv. Protein Chem. 34, 167-339 (1981) .

Las primeras cuatro cadenas del dominio B de dos bucles de horquilla, que se tuercen uno alrededor del otro como un par de dedos cruzados (torsión de mano derecha) . La cadena principal se dobla en una cadena ß, que conecta dos estructuras de hoja ß pequeñas. Después de hacer una vuelta en una hoja, se dobla hacia atrás y forma una hoja de dos cadenas en contacto con el dominio A y un agujero interno en la estructura de -amilasa. Después, la cadena principal se dobla a una estructura de hoja pequeña casi perpendicular a las primeras dos hojas. Antes de entrar a la hélice 3 en la parte superior de la cadena ß 3, los aproximadamente 24 últimos aminoácidos en el dominio B forman dos sitios de unión a calcio en la región de contacto al dominio A.

El dominio B es conectado con el dominio A por dos tramos de péptido, que dividen las áreas de contacto dominio-dominio en dos. El dominio B está en contacto con el dominio A por una región de unión a calcio y un agujero internamente incrustado que contiene moléculas de agua. Muchos tipos de contactos moleculares están presentes. La interacción iónica entre los aminoácidos ácidos y básicos es posible, estas interacciones son muy importantes para la estabilidad general a pH alto y para mantener los sitios de unión a calcio intactos . 3.3. Dominio C El dominio C es la parte C-terminal de la proteína que consiste de los aminoácidos 394-483. El dominio C está compuesto en su totalidad de cadenas ß, que forman una sola estructura de hoja de 8 cadenas que se doblan hacia atrás sobre sí mismas. La estructura de hoja por lo tanto se puede describir como una estructura ß - intercalada . La conectividad es +1, +1, +5, -3, +1, +1, -3, aunque las cadenas 6 y 7 son conectadas sólo de manera suelta. Una parte de la hoja ß forma la interfaz para el dominio A. 3.4. Sitios de unión a Ca2+ y unión a Na+ La estructura de la a-amilasa similar a Termamyl contiene cuatro sitios de unión a calcio y un sitio de unión a sodio, aunque uno de los iones de calcio despliega coordinación muy débil. Dos de los iones de calcio forman parte de un agregado lineal de tres iones, el ion central es atribuido al sodio, que está en la unión de los dominios A y B.

Para el ion de calcio cercano al sitio activo, los carbonilos del esqueleto de His235 y Aspl94, un átomo de cadena lateral de los residuos Aspl94, Asnl02 y Asp200, y una molécula de agua se unen al calcio. Para el ion de sodio, el sitio de unión implica Asp 194, Asp200, Asp 183 y Aspl59, y un carbonilo de esqueleto de Val201. El sitio de unión a calcio entre el dominio A y el dominio B implica Asp204 y Aspl59, el carbonilo del esqueleto de Aspl83 y Alal81, un átomo de Asp202, y una molécula de agua.

Un ion de calcio está localizado entre el dominio A y el dominio C, otro está localizado en el dominio C. El primer calcio mencionado se une a un esqueleto de carbonilo de Gly300, Tyr302 y His406, átomos de Asp430, un átomo de Asp407, y una molécula de agua. El sitio de calcio débilmente coordinado comprende cuatro moléculas de agua, y átomos de Glu447 y Asn444. 4. Amilasas híbridas Se provee una amilasa híbrida que puede ser aislada y/o purificada. La amilasa híbrida comprende un fragmento N-terminal de una primera alfa-amilasa y un fragmento C-terminal de una segunda alfa-amilasa, que es una alfa-amilasa de Bacillus . En una modalidad, la alfa-amilasa de Bacillus es una amilasa similar a Termamyl . En una modalidad específica, la alfa-amilasa de Bacillus es AmyS . La primera y segunda amilasas pueden compartir menos de aproximadamente 60% de identidad de secuencia en una modalidad. Por ejemplo, las amilasas pueden compartir menos de aproximadamente 50%, 40%, 30% o 20% de identidad de secuencia. Las secuencias de la primera alfa-amilasa comprende por lo menos aproximadamente 10%, pero no más de 80%, de la secuencias de aminoácidos del híbrido. En varias modalidades, la primera alfa-amilasa comprende por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o cualquier valor integral entre 10-80% de los residuos de aminoácidos del híbrido.

La secuencia de la primera alfa-amilasa, cuando se usa en la amilasa híbrida, mantiene una estructura 3D conservada con parte o toda la porción correspondiente de la alfa-amilasa de Bacillus que es reemplazada en el híbrido. La primera alfa-amilasa puede ser una alfa-amilasa de arqueas. Las alfa-amilasas de arqueas incluyen Ultrathin, descrita en GenBank™, número de acceso AAM48115.1 (SEQ ID NO: 11). Las alfa-amilasas de arqueas, como Ultrathin, tienen un sitio de unión a Zn2+ en el mismo lugar general del dominio B que el sitio de unión a Ca2+-Na+-Ca2+ en amilasas de Bacillus . Ca2+ no tiene efecto significativo sobre la estabilidad o actividad de alfa-amilasas de arqueas. Ultrathin muestra una identidad de secuencia relativamente débil con AmyS, como se ilustra en la figura 1. Ultrathin, sin embargo, despliega similitud relativamente alta a AmyS al nivel de estructura 3D.

Las figuras 5A y 5C muestran representaciones estereoscópicas de las estructuras 3D de amilasas híbridas representativas. Las estructuras son generadas por una serie de algoritmos modeladores descritos más adelante en los ejemplos. En la figura 5A, el dominio B se muestra en negro. En la figura 5B, los residuos N-terminal de AmyS son reemplazados por residuos 1-104 de Ultrathin. Sólo una pequeña fracción del dominio B es reemplazada en esta modalidad. La comparación de la estructura 3D del híbrido en la figura 5B con la de estructura de AmyS de tipo silvestre en la figura 5A demuestra la alta proporción de la estructura 3D que es conservada en el híbrido. Las estructura híbrida ilustrada en la figura 5C ilustra un híbrido en el cual los residuos de AmyS N-terminal son reemplazados por residuos 1-209 de Ultrathin, aun que la estructura global del híbrido es similar a la enzima de Bacillus, no toda la estructura híbrida es necesariamente "conservada," como se definió el término anteriormente .

En una modalidad, una amilasa híbrida comprende la región de unión a Zn2+ de la alfa-amilasa de arqueas, tal como la alfa-amilasa Ultrathin. La amilasa híbrida por lo tanto se puede hacer insensible a la concentración de Ca2+, mientras el híbrido retiene las características de actividad y estabilidad estructural de alfa-amilasa de tipo silvestre de Bacillus . Por ejemplo, una amilasa híbrida incluye una porción C- terminal de AmyS fusionada a una porción de Ultrathin que contiene el sitio de unión a Zn2+. Híbridos específicos construidos a lo largo de estas líneas contienen varias porciones del dominio B de alfa-amilasa Ultrathin (UT) : Híbrido A: UT 1- 104 : : AmyS 100-483 (SEQ ID NO 1) , Híbrido B: UT 1- 113 : : AmyS 109-483 (SEQ ID NO : 2) Híbrido C: UT 1- 128 : : AmyS 140-483 (SEQ ID NO : 3) Híbrido D': UT 1- 145 : : AmyS 161-483 (SEQ ID NO - 4) Híbrido E: UT 1- 163 ; : AmyS 203-483 (SEQ ID NO : 5) f Híbrido F: UT 1 175 ; : AmyS 215 483 (SEQ ID NO : 6) f Híbrido G: UT 1- 191 : : AmyS 228-483 (SEQ ID NO : 7) , y Híbrido H: UT 1- 209 AmyS : 246-483 (SEQ ID NO : 8) .

Las amilasas híbridas pueden ser manipuladas por ingeniería genética para proveer amilasas con propiedades mejoradas, tales como un requerimiento alterado para Ca2+, termoestabilidad incrementada, actividad específica alterada, actividad de endo- o exo-amilasa alterada, o un pH alterado óptimo .

También se proveen ácidos nucleicos que codifican las amilasas híbridas. A manera de ejemplo no limitante, un ácido nucleico que codifica una amilasa híbrida puede ser un ADNc que codifica la proteína de SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO 7 o SEQ ID NO 8. Como es bien entendido por un experto en la técnica, el código genético es degenerado, lo que significa que múltiples codones en algunos casos pueden codificar el mismo aminoácido. Los ácidos nucleicos incluyen ADN genómico, ARNm y ADNc que codifican una amilasa híbrida. Los ácidos nucleicos representativos que codifican amilasas híbridas incluyen SEQ ID NOS: 20-27, que codifican las amilasas híbridas de SEQ ID NOS 1-8, respectivamente. 4.1. Amilasas híbridas que tienen secuencias variantes En una modalidad, una secuencia que comprende una amilasa híbrida es una variante de la secuencia nativa o de tipo silvestre. En un aspecto, sólo el fragmento del híbrido correspondiente a la primera amilasa es una variante con respecto a su secuencia nativa sobre los mismos residuos contiguos. En otro aspecto, sólo el fragmento del híbrido correspondiente a la amilasa de Bacillus es una variante con respecto a su secuencia nativa sobre los mismos residuos contiguos. Por ejemplo, la secuencia de AmyS se puede seleccionar del AmyS que tiene una truncación C-terminal expuesta en SEQ ID NO: 11, dicha truncación remueve un dominio de unión a almidón. En algunas modalidades, una célula hospedera es genéticamente manipulada para expresar una variante de fusión de segmentos de doblamiento con una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad con las SEQ ID NOS: 1-8.

Los métodos de modificación genética y producción recombinante de amilasas y variantes de las mismas son bien conocidas en la técnica e incluyen aquellas descritas en las patentes de E.U.A. Nos. 7,166,453; 6,890,572; y 6,667,065. La preparación de secuencia de polinucleótidos codificantes, iniciadores, vectores, métodos de selección, células hospederas, purificación y reconstitución de variantes de amilasa expresadas, y caracterización de las mismas, que incluyen reguladores de pH útiles, intervalos de pH, concentraciones de sustrato y concentraciones de enzima para pruebas enzimáticas, todos bien conocidos en la técnica. Las amilasas híbridas compuestas de secuencias de variantes, como se describe en la presente, también se pueden producir sintéticamente o a través de expresión recombinante en una célula hospedera, de conformidad con procedimientos bien conocidos en la técnica. 5.0 Producción de fusiones de segmento de doblamiento 5.1. Vectores En algunas modalidades, un constructo de ADN que comprende un ácido nucleico que codifica una amilasa híbrida, que incluye una variante de una amilasa híbrida tal como se describió antes, es transferido a una célula hospedera en un vector de expresión que comprende secuencias reguladoras operablemente enlazadas a una secuencia codificante amilasa híbrida. El vector puede ser cualquier vector que puede ser integrado a un genoma de la célula hospedera y replicado cuando es introducido a la célula hospedera. Ejemplos adicionales de vectores de expresión y/o integración adecuados se proveen en Sambrook et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3a ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); Bennett et al., MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press, San Diego (1991), pp. 396-428; y patente de E.U.A. No. 5,874,276. Vectores ilustrativos incluyen pFB6 , pBR322, PUC18, pUClOO y pENTR/D, pDON™201, pDONR™221, pENTR™, pGEM*3Z y pGEM^Z. Ilustrativos para usarse en células bacterianas incluyen pBR322 y pUC19, que permiten la replicación en E. coli, y pE194, por ejemplo, que permite la replicación en Bacillus .

En algunas modalidades, un ácido nucleico que codifica una amilasa híbrida es operablemente enlazado a un promotor adecuado, que permite la transcripción en la célula hospedera. El promotor puede ser derivado de genes que codifican proteínas ya sea homologas o heterólogas a la célula hospedera. Ejemplos no limitantes adecuados de promotores incluyen los promotores cbhl , cbh2, egll y egl2. En una modalidad, el promotor es uno que es nativo a la célula hospedera. Por ejemplo, cuando una célula de Bacillus es la célula hospedera de expresión, el promotor es un promotor de Bacillus nativo. Un "promotor inducible" es un promotor que es activo bajo regulación ambiental o de desarrollo. En otra modalidad, el promotor es uno que es heterólogo a la célula hospedera.

En algunas modalidades, la secuencia codificante es operablemente enlazada a una secuencia de señal. El ADN que codifica la secuencia de señal puede ser la secuencia de ADN naturalmente asociada con el ácido nucleico de la amilasa híbrida que ha de ser expresada. En otras modalidades, el ADN que codifica la secuencia de señal es reemplazado por una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de señal de una especie distinta de Bacillus . En esta modalidad, el polinucleótido que codifica la secuencia de señal es inmediatamente en orientación 5' y en marco del polinucleótido que codifica el polipéptido. La secuencia de señal puede ser seleccionada de la misma especie que la célula hospedera. En un ejemplo no limitante, la secuencia de señal es una ciclodextrina glucanotransferasa (CGTasa; EC 2.4.1.19) secuencia de señal de Bacillus s . , y la amilasa híbrida es expresada en una célula hospedera de B. subtilis . Un residuo de metionina se puede añadir al N-terminal de la secuencia de señal .

En modalidades adicionales, una secuencia de señal y una secuencia de promotor que comprende un constructo de ADN o vector que ha de ser introducido en una célula hospedera fúngica se derivan de la misma fuente. En algunas modalidades, el vector de expresión también incluye una secuencia de terminación. En una modalidad, la secuencia de terminación y la secuencia de promotor se derivan de la misma fuente. En otra modalidad, la secuencia de terminación es homologa a la célula hospedera.

En algunas modalidades, un vector de expresión incluye un marcador seleccionable . Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados incluyen aquellos que confieren resistencia a agentes antimicrobianos, v.gr., higromicina o fleomicina. Los marcadores selectivos nutricionales también son adecuados e incluyen amdS, argB y pyr . En una modalidad, el marcador selectivo es el gen amdS, que codifica la enzima acetamidasa ; permite que las células transformadas crezcan sobre acetamida como una fuente de nitrógeno. El uso de un gen de amdS de A. nidulans como un marcador selectivo se describe en Kelley et al., (1985) EMBO J.4; 475-479 y Penttila et al, (1987) Gene 61: 155-164.

Un vector de expresión adecuado que comprende un constructo de ADN con un . polinucleótido que codifica una amilasa híbrida puede ser cualquier vector que sea capaz de replicarse de manera autónoma en un organismo hospedero dado o al integrarse al ADN del hospedero. En algunas modalidades, el vector de expresión es un plásmido. En algunas modalidades, se contemplan dos tipos de vectores de expresión para obtener la expresión de ADNc . El primer vector de expresión comprende secuencias de ADN en las cuales el promotor, región codificante de amilasa híbrida, y terminador se originan todos ellos de la secuencia de ADNc que ha de ser expresada. En algunas modalidades, la truncación de gen se obtiene al deletar las secuencias de ADN no deseadas, v.gr., ADN que codifica el dominio de unión a almidón C-terminal, para dejar el dominio que ha de ser expresado bajo control de sus propias secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales . El segundo tipo de vector de expresión es pre-ensamblado y contiene secuencias requeridas para transcripción de alto nivel y un marcador seleccionable . En algunas modalidades, la región codificante para un ADNc de amilasa híbrida o parte del mismo es insertado en este vector de expresión de propósitos generales, de tal manera que está bajo el control transcripcional de la secuencias del promotor y terminador del constructo de expresión. En algunas modalidades, los genes o parte de los mismos son insertados en orientación 3' del promotor cbhl fuerte. 5.2. Transformación, expresión y cultivo de células hospederas Introducción de un constructo de ADN o vector en una célula hospedera incluye técnicas tales como transformación; electroporación; microinyección nuclear; transducción; transíección, v.gr., lipofección mediada y transfección mediada por DEAE-Dextrin; incubación con precipitado de ADN con fosfato de calcio; bombardeo a alta velocidad con microproyectiles revestidos con ADN; y fusión de protoplastos . Técnicas de transformación generales son conocidas en la técnica. Véase, v.gr., Ausubel et al. (1987), supra, capítulo 9; Sambrook et al (2001) , supra; y Campbell et al., (1989) Curr. Genet. 16: 53-56. La expresión de proteína heteróloga en Trichoderma se describe, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 6,022,725; patente de E.U.A. No. 6,268,328; Harkki et al, (1991) Enzyme Microb. Technol . 13: 227-233; Harkki et al., (1989) BioTechnol . 7: 596-603; EP 244,234; y EP 215,594. En una modalidad, transformantes genéticamente estables se construyen con sistemas de vector por lo que el ácido nucleico que codifica una amilasa híbrida es establemente integrado en un cromosoma de célula hospedera. Los transformantes son después purificados por técnicas conocidas.

En un ejemplo no limitante, los transformantes estables que incluyen un marcador amdS se distinguen de los transformantes inestables por su tasa de crecimiento más rápida y la formación de colonias circulares con un contorno suave, más que áspero sobre el medio de cultivo sólido que contenía acetamida. Además, en algunos casos una prueba adicional de estabilidad es conducida al hacer crecer los transformantes sobre un medio no selectivo sólido, v.gr., un medio que carece de acetamida, que cosecha esporas de este medio de cultivo y que determina el porcentaje de estas esporas que subsecuentemente germinan y crecen en medio selectivo que contiene acetamida. Otros métodos conocidos en la técnica se pueden usar para seleccionar transformantes.

Células hospederas ilustrativas incluyen una bacteria Gram positiva tal como Bacillus subtilis , B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. thuringiensis , Streptomyces lividans, o S. murinus; o una bacteria Gram negativa, tal como Escherichia coli o una especie de Pseudomonas . 6.0 Producción y caracterización de amilasas híbridas 6.1. Métodos para purificar amilasas híbridas En general, una amilasa híbrida producida en cultivo de células es secretada en el medio y puede ser purificada o aislada, v.gr., al remover componentes no deseados del medio de cultivo de células. En algunos casos, una amilasa híbrida puede ser recuperada de un lisado de células. En tales casos, la amilasa híbrida es purificada de las células en las cuales se produjo mediante el uso de técnicas rutinariamente utilizadas por los expertos en la técnica. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de afinidad, métodos de cromatografía de intercambio de iones, que incluyen intercambio de iones de alta resolución, cromatografía de interacción hidrofóbica, partición de dos fases, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio de cationes, tal como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación con sulfato de amonio, y filtración en gel, por ejemplo, mediante el uso de Sephadex G-75. Otras técnicas para purificación de proteína son bien conocidas en la técnica y están ampliamente disponibles. 6.2. Identificación de actividad de amilasa híbrida Para evaluar la expresión de una amilasa híbrida en una célula hospedera, se pueden usar pruebas para medir la proteína expresada, ARNra correspondiente, o actividad de a-amilasa. Pruebas ilustrativas incluyen Northern y Southern blotting, RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa inversa) , e hibridación in situ, mediante el uso de una sonda hibridizante apropiadamente marcada. Las pruebas también incluyen medir la actividad de amilasa híbrida en una muestra. Las pruebas para exo-actividad de una amilasa híbrida expresada incluyen, pero no se limitan a, la prueba de Betamyl® (Megazyme, Irlanda) . Pruebas adecuadas de la endo-actividad de una amilasa híbrida incluyen, pero no se limitan a, la prueba de amilasa de Phadebas® (Magle Life Sciences) . Las pruebas también incluyen análisis de HPLC de licuefaciente preparado en presencia de una amilasa híbrida. HPLC se puede usar para medir la actividad de amilasa al separar sacáridos DP-3 y DP-4 de otros componentes de la prueba . 6.3. Caracterización de variante de amilasa híbrida Las amilasas híbridas pueden ser caracterizadas por su ácido nucleico y secuencias de polipéptido primarias, por modelado estructural tridimensional, y/o por su actividad específica. Características adicionales de la amilasa híbrida incluyen, por ejemplo, estabilidad, intervalo de pH, estabilidad a la oxidación, y termoestabilidad. Los niveles de expresión y actividad de enzima se pueden evaluar mediante el uso de pruebas estándares conocidas por el experto en este campo. En otro aspecto, las variantes demuestran características de rendimiento mejorado en relación con la enzima de tipo silvestre, tales como estabilidad mejorada a altas temperaturas, v.gr., 65-85°C. Las amilasas híbridas son ventajosas para usarse en licuefacción u otros procesos que requieren temperaturas elevadas, tales como el horneado. Por ejemplo, una amilasa híbrida termoestable puede degradar almidón a temperaturas de aproximadamente 55°C a aproximadamente 85°C o más.

Una característica de expresión significa un nivel expresión alterado de la variante, cuando la variante es producida en una célula hospedera particular. La expresión generalmente se relaciona con la cantidad de variante activa que es recuperable de un caldo de fermentación mediante técnicas estándares conocidas en esta técnica durante una cantidad de tiempo dada. La expresión también se puede relacionar con la cantidad o tasa de variante producida dentro de la célula hospedera o secretada por la célula hospedera. La expresión también se puede relacionar con la tasa de traducción del ARNm que codifica la enzima variante.

Se provee un ácido nucleico complementario a un ácido nucleico que codifica cualquiera de las amilasas híbridas expuestas aquí. Además, se provee un ácido nucleico capaz de hibridar al complemento. En otra modalidad, la secuencia para usarse en los métodos y composiciones descritas aquí es una secuencia sintética. Incluye, pero no se limita a, secuencias hechas con uso de codón óptimo para expresión en organismos hospederos, tales como levadura. 7. Composiciones y usos de amilasas híbridas Una amilasa híbrida producida y purificada por los métodos descritos aquí es útil para una variedad de aplicaciones industriales. El deseo de usar una amilasa híbrida particular dependerá de las propiedades globales desplegadas por la amilasa híbrida en relación con los requerimientos de una aplicación particular.

En una modalidad, la amilasa híbrida es útil en un proceso de conversión de ' almidón, particularmente en un proceso de licuefacción de un almidón, v.gr., almidón de maíz, almidón de trigo o almidón de cebada. El producto final deseado puede ser cualquier producto que pueda ser producido por la conversión enzimática del sustrato de almidón. Por ejemplo, el producto deseado puede ser un jarabe rico en sacáridos útiles para fermentación, particularmente maltotriosa, glucosa y/o maltosa.

Las amilasas de Bacillus se usan comúnmente para catalizar la degradación de una suspensión de almidón, que puede contener 30-40% p/p de sólidos secos (ds) , a maltodextranos . Debido a que la licuefacción típicamente es conducida a altas temperaturas, v.gr., 90-100°C, a-amilasas termoestables , tales como amilasas de Bacillus, son preferidas para este paso. Las amilasas de Bacillus típicamente no producen cantidades significativas de glucosa. Más bien, el licuefaciente resultante tiene un equivalente de dextrosa bajo (DE) y contiene maltosa y azúcares con altos grados de polimerización (DPn) .

El licuefaciente por lo tanto es usualmente sometido a una reacción de sacarificación adicional, que puede ser catalizado por glucoamilasas y/o a-amilasas maltogénicas . Estas enzimas catalizan la hidrólisis de extremos no reductores de los maltodextranos formados después de la licuefacción, que liberan D-glucosa, maltosa e isomaltosa. La sacarificación produce ya sea jarabe rico en glucosa o con alto contenido de maltosa. En el primer caso, las glucoamilasas típicamente catalizan la sacarificación bajo condiciones ácidas a temperaturas elevadas, v.gr., 60°C, pH 4.3. Las glucoamilasas usadas en este proceso típicamente se obtienen de hongos, v.gr., glucoamilasa de Aspergillus niger usada en Optidex® L400 o glucoamilasa de Humincola grísea. Enzimas desramificantes, tales como pululanasas, pueden ayudar a la sacarificación. Las glucoamilasas, sin embargo, típicamente no tienen buen rendimiento en presencia de Ca+ . Por esta razón, el Ca2+ usado para soportar actividad óptima de las amilasas de Bacillus en el paso de licuefacción debe ser removido antes de la sacarificación en una operación que consume tiempo.

Las amilasas híbridas descritas aquí son particularmente ventajosas cuando se usan en un proceso de licuefacción de almidón. Debido a que algunas de las amilasas híbridas de la presente no requieren Ca+ para actividad, se pueden usar para licuar almidón en ausencia de Ca2+ añadido. El almidón licuado entonces puede ser sacarificado directamente con una glucoamilasa , sin el requerimiento de remover primero Ca2+, lo que acelera la reacción global e incrementa la eficiencia de producción de azúcar.

Será evidente para los expertos en la técnica que varias modificaciones y variación se pueden hacer a las composiciones y métodos de uso de las mismas sin apartarse de la esencia o alcance del uso pretendido. Por lo tanto, son las modificaciones y variaciones provistas las que caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas y sus equivalentes .

Ej emplos Ejemplo 1 1.1. Alineación de estructuras de amilasa En un paso preliminar, la estructura 3D de amilasa de Pyrococcus woesei (acceso a PDP No. IMXG) fue alineada con una estructura 3D de AmyS (acceso a PDB No. IHVX) . La alfa-amilasa de arqueas des-Met Ultrathin (acceso a GenBank™ No. AAM48115.1; SEQ ID NO : 9) estructura 3D después se determinó mediante el uso de la estructura de Pyrococcus woesei como una guía. Ultrathin comparte un alto nivel de identidad de secuencia (86.7%) a la amilasa de Pyrococcus woesei, lo que facilita la construcción de un modelo estructural 3D exacto. El modelado se realizó con el programa Clustal . Véase Thompson et al, Nucleic Acids Res. 22: 4673-46 (1994).

Finalmente, la estructura de des-Met Ultrathin fue alineada con AmyS mediante el uso de ClustalW. La sobreposición final se basó en carbonos alfa alineados con una RMSD una de otro de aproximadamente 1 Á. Los residuos alineados que tienen carbonos alfa que tienen una RMSD de 0.5 Á fueron identificados como posiciones preferidas para unir las secuencias de Ultrathin y AmyS en la amilasa híbrida. 1.2. Construcción y expresión de híbrido Acidos nucleicos que codifican amilasas híbridas fueron diseñados y construidos. Para el propósito de este ejemplo, las amilasas híbridas de SEQ ID NOS: 1-8 tienen las abreviaturas mostradas en la tabla 2. Los paréntesis antes y después de los números de residuo indican residuos de aminoácidos que son conectados en la proteína de fusión. La posición de estos residuos con respecto a la secuencia de longitud completa de Ultrathin y AmyS se ilustran en las figuras 3 y 4, respectivamente. Los residuos de Ultrathin entre paréntesis representan residuo x en la fórmula (I), A-x-y-B, mientras que los residuos de AmyS entre paréntesis representan residuo y en la fórmula (I) .

Tabla 2 El híbrido A fue sintetizado químicamente mediante el uso de técnicas estándares bien conocidas en el campo. El híbrido A se usó como un esqueleto para clonar en los híbridos restantes. El ácido nucleico que codifica el híbrido A es de 1551 pares de bases de longitud y contiene un sitio de restricción BssHII en la posición 1199. Los genes del híbrido restantes fueron sintetizados hasta el sitio de restricción de BssHII, ya que todos contienen la misma secuencia de ADN de este sitio de restricción al extremo del gene. Esto permitió facilidad de clonación en un vector que contenía el esqueleto del híbrido A hasta el sitio BssHII.

Se construyó un plásmido que tenía los siguientes elementos: un gen de beta lactamasa, que confiere resistencia a la ampicilina/carbenicilina ; un promotor de AprE (proteasa alcalina) de B. subtilis, que tiene una región de homología al cromosoma del hospedero de Bacillus que promueve integración en el genoma del hospedero; una secuencia de señal de AprE de B. subtilis; el ácido nucleico que codifica amilasa híbrida; un terminador de LAT (termoestable a amilasa de licheniformis) de B. licheniformis; un gen de cloranfenicol acil transferasa para resistencia a cloranfenicol ; y un origen de replicación de E. coli.

Los ácidos nucleicos que codifican amilasas híbridas fueron amplificados mediante el uso de PCR con los siguientes cebadores: PstI-Nhel-F: ctcagctctgcagctagcgcagcaa (SEQ ID NO: 12) BssHII-Ethyl Rev: gtgtggaattgtgagcggcca (SEQ ID NO: 13) Los contenidos de reacción de PCR incluyeron 5 pL de pFU UltraBuffer (10X), 42 pL de H20, 0.5 pL de Cebador: PstI-Nhel-F, 0.5 pL de Cebador: BssHII-Ethyl Rev, 1 pL de dNTP's de Roche (5 mM de solución de abastecimiento), 1 yL de ADN híbrido y 1 ih de ADN polimerasa pFU Ultra HF. El ciclo del programa de PCR fue 1 minuto a 95°C, 18x (1 minuto 95°C, 1 minuto 60°C, 2 minutos, 20 segundos a 68°C) , seguido por 7 minutos a 68°C y una contención a 4°C, mediante el uso de un ciclador térmico (MJ Research® PTC-200 Peltier) .

El fragmento de 1.5 Kb lineal amplificado fue purificado mediante el uso de un kit de purificación de PCR Qiagen" Qiaquick. El plásmido pJHlOl, un vector de integración para expresión en Bacillus subtilis (Ferrari et al., J. Bacteriol. 154: 1513-15 (1983)) se usó para la expresión de todas las amilasas híbridas. El gen de híbrido A y el vector de integración (pJHlOl) fueron ambos doblemente digeridos con enzimas de restricción HindIII y Nhel a fin de generar extremos pegajosos cohesivos, y el gen de híbrido A fue ligado al vector pJHlOl mediante el uso de un kit de ligación de ADN con ADN ligasa de T4 (Takara Bio, número de catálogo 6023 kit) . Cien de células de E. coli competentes Top 10 (Invitrogen) fueron transformadas con 5 yL de reacción de ligación y colocadas en LA (Luria Agar) + 50 ppm de carbenicilina e incubadas a 37°C durante la noche. Después de que habían crecido las colonias bacterianas, clones individuales se seleccionaron para realizar PCR de colonias mediante el uso de puReTaq Ready-To-Go PCR Beads™ de GE Healthcare. Las colonias se recogieron y fueron transferidas directamente a los tubos de PCR. Los cebadores de PCR usados fueron : pAprBbsGTG-201-fwd: agcgagagatgatataccta (SEQ ID NO: 14) pJH101-end-rev: tttcggcgtgggtatggtggc (SEQ ID NO: 15) El ADN de cada reacción de PCR se separó en geles de agarosa para confirmar que la PCR de colonias había sido exitosa .

Los clones fueron enviados después a QuintaraBio (Berkeley, CA) para análisis de secuenciación de ADN mediante el uso de los siguientes cebadores: pAprBbsGTG-201-fwd: agcgagagatgatataccta (SEQ ID NO: 14) pJH101-end-rev: tttcggcgtgggtatggtggc (SEQ ID NO: 15) Et538-fwd: ggtggacgccgtcgaagtcaat (SEQ ID NO: 16) Etll30-F: cgcacgttaatgaccaatacac (SEQ ID NO: 17) Los híbridos restantes fueron clonados mediante el uso del vector del híbrido A. Los genes para los híbridos B, C, E, F, G y H fueron cortados directamente del vector suministrado por Gene Oracle Inc. En resumen, muestras de E. coli suministradas por Gene Oracle Inc. Se sembraron sobre placas de LA + 50 ppm de carbenicilina y se hicieron crecer cultivos durante la noche a 37 °C. El ADN de estos cultivos se preparó mediante el uso del kit Qiagen Miniprep Kit .

Los genes para híbridos B, C, E, F, G y H fueron doblemente digeridos con enzimas de restricción BssHII y Nhel a fin de generar extremos pegajosos cohesivos. Estos extremos pegajosos permitieron ligación directa de genes del híbrido en el vector de esqueleto del híbrido A. Los genes del híbrido fueron extraídos en gel y purificados mediante el uso de Qiagen Gel Extracción Kit . Los genes del híbrido fueron ligados en el vector de esqueleto del híbrido A mediante el uso de un kit de ligación de ADN con ADN ligasa de T4 (Takara Bio, número de catálogo 6023 kit) El gen para el híbrido D fue amplificado mediante el uso de los siguientes cebadores: PstI-Nhel-F: ctcagctctgcagctagcgcagcaa (SEQ ID NO: 18) BssHII-Eth-new2R: gacgacgagcgcgcgatcagaag (SEQ ID NO: 19) Los contenidos de reacción de PCR incluyeron 5 µ??? de pFU UltraBuffer (10X) , 42 µ?? H20, 0 5 pL de Cebador. Pstl-Nhel-F, 0.5 de Cebador: BssffII -Eth-new2R, 1 µ?? de dNTP's de Roche (solución de abastecimiento 5 mM) , 1 µ ?_ de ADN de Ultra-Ethyl Hybrid y 1 µ?. de ADN polimerasa pFU Ultra HF. El ciclo del programa de PCR fue 2 minutos a 95°C, 18x (1 minuto a 95°C, 1 minuto a 56°C, 1 minuto, 15 segundos, a 68°C) , 1 minuto, 15 segundos a 68°C seguido por una contención a 4°C, ® mediante el uso de un ciclador térmico MJ Research PTC-200 Peltier .

Generalmente, después de realizar PCR de un gen particular, sólo aproximadamente 2-5 µ?? por reacción es analizado sobre gel de agarosa para confirmar que el ADN se amplificó correctamente. El resto de la reacción original fue purificado mediante el uso de un kit Qiagen PCR Purification Kit. Sin embargo, en este caso, se observaron dos bandas en el gel analítico. Por lo tanto, la reacción de PCR entera se aplicó a un gel de agarosa para extraer y purificar la banda que corresponde a la longitud de ADN correcta (-1100 pares de bases) . El ADN se aisló del gel mediante el uso de un kit Qiagen Gel Extraction Kit.

Subsecuentemente, el fragmento lineal purificado (-1100 pares de bases) fue digerido secuencialmente mediante el uso de enzimas BssHII y Nhel . La muestra entera fue purificada mediante el uso del kit Qiagen PCR Purification Kit. El vector de esqueleto de híbrido A también fue digerido de manera similar y fue extraído en gel mediante el uso del kit Qiagen Gel Extraction Kit. El gen del híbrido D fue ligado al vector de esqueleto de híbrido A mediante el uso del kit Takara Bio - lote #6023. Células de E. coli competentes Top 10 (Invitrogen) fueron transformadas con 5 µ?? de cada reacción de ligación y se realizaron reacciones de transformación en LA + 50 ppm de carbenicilina y se incubaron a 37°C durante la noche.

Las reacciones de ligación para híbridos B, C, E, F, G y H fueron amplificadas mediante el uso de un kit Rolling Circle Amplification (RCA) TempliPhi (Amersham cat . # 25 6400) según el protocolo del fabricante. Células de E. coli competentes Top 10 (Invitrogen) fueron transformadas con 5 µ?? de cada reacción de ligación y reacciones de transformación se colocaron en LA + 50 ppm de carbenicilina y se incubaron a 37°C durante la noche.

Clones individuales se seleccionaron de cultivos de todos los constructos de híbrido. La PCR de colonias se realizó en colonias individuales mediante el uso de puReTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare) . Las colonias se recogieron directamente en los tubos de PCR. Los cebadores de PCR usados fueron: pAprBbsGTG-201-fwd: agcgagagatgatataccta (SEQ ID NO: 14) pJH101-end-rev: tttcggcgtgggtatggtggc (SEQ E) NO: 15) Un gel de agarosa se corrió para confirmar que la reacción de colonia de PCR había sido exitosa. Los clones se enviaron después a QuintaraBio para análisis de secuenciación mediante el uso de los siguientes cebadores: pAprBbsGTG-201-fwd: agcgagagatgatataccta (SEQ ID NO: 14) pJH101-end-rev: tttcggcgtgggtatggtggc (SEQ ID NO: 15) Et538-fwd: ggtggacgccgtcgaagtcaat (SEQ ID NO: 16) Etl 130-F: cgcacgttaatgaccaatacac (SEQ ID NO: 17) Cultivos líquidos de clones con secuencias de ADN correctas se congelaron en un volumen total de 15% de glicerol a -80°C.

Minipreparaciones de plásmido se realizaron en clones mediante el uso de kit Qiagen Minipre . Muestras de 5 \ih de ADN de plásmido (0.4 - 0.5 µg) fueron transformadas en 100 pL de células de Bacillus BG6006 (fenotipo: DaprE, DnprE, Depr, DispA, Obpr, Dvpr, DwprA, Ompr-ybfJ, OnprB, degUHy32 , oppA, DspoIIE3501, amyE: :xylRPxylAcomK-ermC) . Las mezclas de reacción se incubaron en un agitador a 37°C durante 1 hora y se colocaron en 1% de almidón de maíz insoluble, +5 ppm de cloranfenicol y se incubaron a 37°C, durante la noche (por lo menos 16 horas) . El plásmido pJHlOl es un vector de integración (que carece de un origen de replicación para Bacillus) y por lo tanto tiene la capacidad para integrarse en el genoma del hospedero. La integración del plásmido se logró al colocar en placas las células en concentraciones más altas de antibiótico, que forzaron al vector a insertar múltiples copias del mismo en el genoma para sobrevivir en una alta concentración de antibiótico. De manera específica, las colonias se re-sembraron en placas con 1% de almidón insoluble + 25 ppm de cloranfenicol LB varias veces. En este caso, los híbridos fueron re-sembrados un total de 4 veces antes de que las colonias parecieran resistir la concentración más alta de antibiótico. En esta etapa, los híbridos estaban listos para se probados para amilasa actividad mediante el uso de la prueba de placa de almidón descrita más adelante que se basa en el cambio en turbidez del almidón dentro de la matriz de la placa como una lectura para hidrólisis de almidón.

Ejemplo 2 2.1. Preparación de amilasas híbridas Abastecimientos de glicerol frescos de las diferentes amilasas híbridas clonadas en células hospederas BG6006 de B. subtilis se sembraron por estrías en placas LB que contenían 1% de almidón de maíz insoluble + 25 ppm cloranfenicol y se incubaron a 37°C durante la noche. La mañana siguiente, los cultivos de inicio se hicieron crecer en 5 mL de medio que contenía 25 ppm de cloranfenicol . El cultivo de inicio se dejó crecer durante 8 horas y 15 minutos en un agitador (250 rpm) a 37°C. Después, 30 yL de este pre-cultivo se . añadió a un matraz de 250 mL llenado con 30 mL de medio de cultivo (descrito más adelante) complementado con 25 ppm de cloranfenicol y 5 mM CaCl2. Los matraces con agitación se incubaron durante 60-65 horas a 37°C, con mezclado a 250 rpm. El medio de cultivo fue un medio semi-definido enriquecido basado en regulador de pH MOPS, con urea como fuente principal de nitrógeno y glucosa como la fuente principal de carbono, y complementado con 1% de soytone para crecimiento de células robusto. Después del crecimiento de células, los cultivos se dividieron en dos conjuntos: el conjunto 1 se mantuvo a un pH nativo de 7 y el pH de los cultivos del conjunto 2 se incrementó a aproximadamente 10.5. Veinticinco mL de suspensión de células de cada cultivo del conjunto 1 se centrifugó a 5000 rpm durante 20 minutos para separar la proteína en el sobrenadante de la pastilla de células. Para el conjunto 2, 1.5 mL de cada cultivo se puso en alícuotas en tubos de centrífuga de 2 mi y 1-3 µ? de NaOH se añadió para incrementar el pH a 10.5. Las muestras se centrifugaron a 14,000 rpm durante 5 minutos. Los sobrenadantes (que contenían proteínas de interés) fueron transferidos a tubos limpios y colocados en el refrigerador hasta que estaban listos para la prueba. 2.2. Prueba de Phadebas para actividad de amilasa Las amilasas híbridas preparadas antes se probaron para actividad de amilasa mediante el uso de la prueba colorimétrica Phadebas, en donde se usó Ultrathin como un control. Los resultados de la prueba se ilustran en la figura 2. Los sobrenadantes de cultivo de matraces con agitación de los diferentes híbridos de amilasa (preparados como se describió antes) se probaron para actividad de amilasa en placas de Millipore multiscreen-HV (#MAHV 4550 ) mediante el uso de sustrato de almidón enlazado a colorante Phadebas®. Tabletas de prueba de amilasa Phadebas® de Magle Life Sciences se disolvieron en regulador de pH de prueba (50 mm maleato de Na, 50 mM de NaCl , 2 mM de CaCl2, pH 5.2) con mezclado de remolino ocasional durante 5-10 minutos. Quince µL de sobrenadante de cultivo de cada conjunto de muestras de proteína se añadió a 135 µL de regulador de pH de prueba en la hilera superior de una placa de 96 pozos (dilución 1:10) y las muestras se mezclaron con pipeta. Una alícuota de 50 µL de cada uno de estos pozos fue transferida a la hilera de abajo, que contenía 100 µL de regulador de pH de prueba (dilución 1:3) , se mezcló con pipeta, seguido por transferencia serial de 50 L a la placa para diluciones subsecuentes. Una alícuota de 100 de solución de sustrato se añadió a cada pozo. Las placas fueron cubiertas, se mezclaron brevemente en un rotador/mezclador de placas y se colocaron en una incubadora a 37°C durante 45 minutos. Después de esta incubación, las placas se colocaron en un múltiple de vacío de Millipore, los contenidos se filtraron en una placa estándar de fondo plano, y la densidad óptica se midió a 620 nm en un lector de microplaca. 2.3. Prueba de placa de almidón para actividad de amilasa En esta prueba, la producción de amilasa por células que expresan los diferentes híbridos de amilasa se probó al colocar en placas los clones de Bacillus sobre placas de LA complementadas con 1% de almidón insoluble + 25 ppm de cloranfenicol y al incubar las placas durante la noche (por lo menos 16 hr) a 37°C. El día siguiente, los clones se calificaron cualitativamente al observar la presencia de zonas de aclaramiento en las placas de almidón y al asignar un tamaño de halo relativo. Se usó Ultrathin como un control. Aunque Ultrathin es típicamente cultivado a 37°C, las placas de prueba tuvieron que ser cultivadas a 70°C para ver halos. 2.4. Resultados Los resultados de las pruebas expuestas en los ejemplos 22 y 2.3 se ilustran en las figuras 2A y 2B y tabla 3, mediante el uso de Ultrathin como un control. Los resultados de la prueba de halo se muestran en la segunda columna de la tabla 3, y los resultados de la prueba colorimétrica se muestran en la tercera columna.

Tabla 3 El híbrido B contiene residuos de AmyS 109-483, lo que significa que no posee el residuo 102 del dominio B que está implicado en unión a calcio. Sin embargo, este híbrido despliega actividad de amilasa significativa, lo que demuestra la factibilidad de formar secuencias de híbridos de amilasa que contienen cada uno de ellos una porción del dominio B. Las mediciones de actividad de amilasa (como se muestra en las figuras 2A y 2B) sugieren que los híbridos, tales como el híbrido A y el híbrido H, puedan hidrolizar almidón insoluble de manera mucho más efectiva que la enzima Ultrathin de tipo silvestre bajo ambas condiciones de pH probadas .

Las actividades relativamente altas desplegadas por los híbridos G y H son particularmente interesantes. Estos híbridos contienen residuos 215-483 y 246-483 de AmyS , respectivamente, lo que significa que poseen el dominio B entero de Ultrathin, así como una porción significativa del dominio A catalítico de Ultrathin. Si la variante de AmyS que carece del dominio de unión a almidón C-terminal de 29 aminoácidos se usó para contribuir a la secuencia de AmyS en el híbrido H, aproximadamente 50% de los residuos de este híbrido serían los residuos de Ultrathin. Se espera que estas amilasas híbridas no requieran Ca2+, porque el sitio de unión a calcio de AmyS es completamente reemplazado por el sitio de unión a zinc de Ultrathin.

Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden hacer varias modificaciones y variaciones a las composiciones y métodos de uso de las mismas sin apartarse de la esencia o alcance del uso pretendido en la presente. Por lo tanto, son las modificaciones y variaciones provistas que caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas y sus equivalentes.

Listado de secuencias SEQ ID NO: 1: Híbrido A: AAM48115.1 Al a 1104/AmyS A100 a R483. Residuos 1-488. 1-104 = AAM48115.1 (sin Met N-term) los residuos se muestran en negritas 105-488 = residuos de AmyS 100-483 A K Y S E L E K G G V I M Q A F Y W D V P s G G I W W D T I R Q K I P E Y D A G I S A I I P P A S K G M G G A Y s M G Y D P Y D F F D L G E Y D Q K G T V E T R F G S K Q E L V N M I N T A H A Y G M K V I A D V V F D H K G G A D G T E V D A V E V N P S D R N Q E I S G T Y Q I Q A w T K F D F P G R G N T Y s S F K w R W Y H F D G V D W D E s R K L S R I Y K F R G I G K A w D W E V D T E N G N Y D Y L Y A D L D M D H P E V V T E L K N w G K W Y V N T T N I D G F R L D A V H I K F s F F P D L S Y V R s Q T G K P L F T V G E Y W S Y D I N K L H N Y I T K T N G T M S L F D A P L H N K F Y T A S K S G G A F D M R T L T N T L M K D Q P T L A V T F V D N H D T E P G Q A L Q S W V D P W F P L A Y A F I L T R Q E G Y P C V F Y G D Y Y G I P Q Y N I P S L K S K I D P L L I A R R D Y A Y G T Q H D Y L D H S D I I G W T R E G V T E K P G S G L A A L I T D G P G G s K W Y V G Q H A G K V F Y D L T G N R S D T V T I N S D G W G E F V N G G S V S V W V P R SEQ ID NO: 2: Híbrido B: AAM48115.1 Al a All3/AmyS G109 a R483. Residuos 1-488. 1-113 = AAM48115.1 (sin Met N-term) residuos mostrados en negritas 114-488 = residuos de AmyS 109-483 A K Y s E L E K G G V I M Q A P Y W D V P s G G I w w D T I R Q K I P E w Y D A G I S A I W I P P A s K G M s G A Y s M G Y D P Y D F F D L G E Y D Q K G T V E T R F G S K Q E L V N M I N T A H A Y G M K V I A D I V I N H R A G A D G T E W V D A V E V N P S D R N Q E I s G T Y Q I Q A T K F D F P G R G N T Y 3 S F K w R W Y H F D G V D w D E s R K L s R I Y K F R G I G K A D W E V D T E N G N Y D Y L M Y A D L D M D H P E V V T E L K N W G K W Y V N T T N I D G F R L D A V K H I K F s F F P D W L s Y V R s Q T G K P L F T V G E Y S Y D I N K L H N Y I T K T N G T M S L F D A P L H N K F Y T A S K S G G A F D M R T L T N T L M K D Q P T L A V T F V D N H D T E P G Q A L Q S W V D P W F K P L A Y A F I L T R Q E G Y P C V F Y G D Y Y G I P Q Y N I P S L K S K I D P L L I A R R D Y A Y G T Q H D Y L D H S D I I G w T R E G V T E K P G S G L A A L I T D G P G G s K W M Y V G K Q H A G K V F Y D L T G N R S D T V T I N S D G W G E F K V N G G S V S V W V P R SEQ ID NO: 3: Híbrido C: AAM48115.1 Al a W128/AmyS T140 a R483. Residuos 1-472. 1-128 = AAM48115.1 (sin Met N-term) los residuos se muestran en negritas 129-472 = residuos de AmyS 140-483 A K Y s E L E K G G V I Q A F Y W D V P S G G I W W D T I R Q K I P E w Y D A G I S A I W I P P A s K G M G G A Y s M G Y D P Y D F F D L G E Y D Q K G T V E T R F G S K Q E L V N M I N T A H A Y G M K V I A D I V I N H R A G G D L E W N P F V N D Y T w T K F D F P G R G N T Y s s F K W R W Y H F D G V D D E S R K L S R I Y K F R G I G K A w D W E V D T E N G M Y D Y L M Y A D L D M D H P E V V T E L K N w G K W Y V N T T N I D G F R L D A V K H I K F S F F P D L s Y V R s Q T G K P L F T V G E Y W S Y D I N K L H N Y I T K T N G T M S L F D A P L H N K F Y T A S S G G A F D M R T L M T N T L M K D Q P T L A V T F V D N H D T E P G Q A L Q S W V D P w F K P L A Y A F I L T R Q E G Y P C V F Y G D Y Y G I P Q Y N I P S L K S K I D P L L I A R R D Y A Y G T Q H D Y L D H S D I I G w T R E G V T E K P G s G L A A L I T D G P G G s K W M Y V G Q H A G K V F Y D L T G N R S D T V T I N S D G W G E F K V N G G S V S V w V P R SEQ ID NO: 4: Híbrido D: AAM48115.1 Al a D145/AmyS F161 a R483. Residuos 1-468. 1-145 = AAM48115.1 (sin Met N-term) los residuos se muestran en negritas 146-468 = residuos de AmyS 161-483 A K Y S E L E K G G V I M Q A F Y W D V P S G G I W W D T I R Q K I P E W Y D A G I S A I W I P P A S G M G G A Y S M G Y D P Y D F F D L G E Y D Q K G T V E T R F G S K Q E L V N M I N T A H A Y G M K V I A D I V I N H R A G G D L E W N P F V N D Y T T D F S ? V A S G ? Y T A N Y L D F D G V D W D E S R K L S R I Y K F R G I G ? A W D w E V D T E N G N Y D Y L M Y A D L D M D H P E V V T ? L ? ? W G ? W Y V N T T N I D G F R L D A V K H I K F s F F P D L S Y V R s Q T G K P L F T V G E Y W S Y D I N K L H N Y I T K ? ? G ? ? S L F D A P L H N K F Y T A S K g G G A F D M R T L M T ? ? L ? D Q P T L A V T F V D N H D T E P G Q A L Q S W V D P w F ? ? L A Y A F I L T R Q E G Y P C V F Y G D Y Y G I P Q Y N I P S L ? S ? I D P L L I A R R D Y A Y G T Q H D Y L D H S D I I G w ? R ? G V ? E K P G s G L A A L I T D G P G G s W M Y V G K Q H A G ? V F Y D L T G N R S D T V T I N S D G G E F K V N G G s V S V W V P R SEQ ID NO: 5: Híbrido E: AAM48115.1 Al a P163/AmyS D203 a R483 Residuos 1-444. 1-163 = AAM48115.1 (sin Met N-term) los residuos se muestran en negritas 164-444 = residuos de AmyS 203-483 A K Y S E L E K G G V I M Q A F Y W D V P S G G I W w D T I R Q K I P E w Y D A G I S A I W I P P A s K G M G G A Y s M G Y D P Y D F F D L G E Y D Q K G T V ? T R F G S K Q E L V N M I N T A H A Y G M K V I A D I V I N H R A G G D L E W N P F V N D Y T w T D F S K V A S G K Y T A N Y L 0 F H P N E L H A G D S G T F G G Y P D L D M D H P E V V T E L K N W G K W Y V N T T N I D G F R L D A V K H I K F s F F P D W L s Y V R s Q T G K P L F T V G E Y W S Y D I N K L H N Y I T K T N G T M S L F D A P L H N K F Y T A S K S G G A F D M R T L M T N T L M K D Q P T L A V T F V D N H D T E P G Q A L Q S W V D P W F K P L A Y A F I L T R Q E G Y P C V F Y G D Y Y G I P Q Y N I P S L K S K I D P L L I A R R D Y A Y G T Q H D Y L D H S D I I G W T R ? G V T E K P G S G L A A L I T D G P G G s K W M Y V G K Q H A G K V F Y D L T G N R S D T V T I N S D G W G E F K V N G G S V S V w V P R SEQ ID NO: 6: Híbrido F: AAM48115.1 Al a W175/AmyS L215 a 483 Residuos 1-444. 1-175 = AAM48115.1 (sin Met N-term) los residuos se muestran en negritas 176-444 = residuos de AmyS 215-483 A K Y S E L E K G G V I M Q A F Y W D V P 5 G G I w W D T I R Q K I P E w Y D A G I S A I W I P P A s K G M G G A Y s M G Y 0 P Y D F F D L G E Y D Q K G T V E T R F G S K Q E L V N M I N T A H A Y G M K V I A D I V I N H R A G G D L E W N P F V N D Y T w T D F S K V A S G K Y T A N Y L D F H P N E L H A G D S G T F G G Y P D I C H D K S W D Q Y W L K N W G K W Y V N T T N I D G F R L D A V K H I K F s F F P D w L s Y V R s Q T G K P L F T V G E Y W S Y D I N K L H N Y I T K T N G T M S L F D A P L H N K F Y T A S K s G G A F D M R T L M T N T L M K D Q P T L A V T F V D N H D T E P G Q A L Q S W V D P W F K P L A Y A F I L T R Q E G Y P C V F Y G D Y Y G I P Q Y N I P S L K S K I D P L L I A R R D Y A Y G T Q H D Y L D H S D I I G w T R E G V T E K P G S G L A A L I T D G P G G s K W M Y V G K Q H A G K V F Y D L T G N R S D T V T I N S D G W G E F K V N G G S V S V w V P R SEQ ID NO: 7: Híbrido G: AAM48115.1 Al a G19l/AmyS 1228 a 483 Residuos 1-447. 1-191 = AAM48115.1 (sin Met N-term) los residuos se muestran en negritas. 192-447 = residuos de AmyS 228-483 A K Y S E L E K G G V I M Q A F Y W D V P S G G I W W D T I R Q K I P E W Y D A G I S A I W I P P A S K G M G G A Y S M G Y D P Y D F F D L G E Y D Q K G T V E T R F G S K Q E L V N M I N T A H A Y G M K V I A D I V I N H R A G G D L E W N P F V N D Y T W T D F S K V A S G K Y T A N Y L D F H P N E L H A G D S G T F G G Y P D I C H D K S W D Q Y W L W A S Q E S Y A A Y L R S I G I D G F R L D A V K H I K F S F F P D w L S Y V R S Q T G K P L F T V G E Y S Y D I N K L H N Y I T K T N G T S L F D A P L H N K F Y T A S K S G G A F D M R T L M T N T L M K D Q P T L A V G F V D N H D T E P G Q A L Q S W V D P W F K P L A Y A F I L T R Q E G Y P C V F Y G D Y Y G I P Q Y N I P S L K S K I D P L L I A R R D Y A Y G T Q H D Y L D H S D I I G w T R E G V T E K P G s G L A A L I T D G P G G s K W M Y V G K Q H A G K V F Y D L T G N R S D T V T I N S D G W G E F K V N G G s V S V w V P R SEQ ID NO: 8: Híbrido H: AAM48115.1 Al a K209/AmyS A246 a R483 Residuos 1-447. 1-209 = AAM48115.1 (sin Met N-term) residuos mostrados en negritas 210-447 = residuos de AmyS 246-483 A K Y s ? 1 E K G G V I M Q A F Y w D V P s G G r w W D T I R Q K I P E w Y D A G I S A I W I P P A s K G M G G A Y s M G Y D P Y D F F D L G E Y D Q K G T V E T R F G S K Q E L V N M I N T A H A Y 6 M K V I A D I V I N H R A G G D L E W N P F V N D Y T w T D F S K V A S G K Y T A N Y L D F H P N E L H A G D S G T F G G Y P 0 I C H D K S D Q Y W L W A S Q E S Y A A Y L R S I G I D A w R F D Y V K G Y A P w V V K D W L S Y V R S Q T G K P L F T V G E Y W S Y D I N L H N Y I T K T N G T M S L F D A P L H N K F Y T A s K s G G A F D M R T L M T N T L M K D Q P T L A V T F V D N H D T E P G Q A L Q S W V D P W F K P L A Y A F I L T R Q E G Y P C V F Y G D Y Y G I P Q Y N I P S L K S K I D P L L I A R R D Y A Y G T Q H D Y L D H S D I I G W T R E G V T E K P G S G L A A L I T D G P G G s K W M Y V G K Q H A G K V F Y D L T G N R S D T V T I N S D G W G E F K V N G G S V S V W V P R SEQ ID NO: 9: alfa-amilasa Ultrathin (número de acceso AAM48115.1) MAKYSELEKGGVIMQAFYWDVPSGGIíV DTIRQKIPEWYDAGISAIWIPPASKGMGGAYSMGYDP YDFFDLGEYDQKGTVETRFGSKQELVNMINTAHAYG KVIADIVINHRAGGDLEWNPFVNDYTWT DFSKVASGKYTANYLDFHPNELHAGDSGTFGGYPDICHDKSWDQYWLWASQESYAAYLRSIGIDA WRFDYVKGYAP VVKD LNWWGGWAVGEYWDTNVDAVLNWAYS SGAKVFDFALYYKMDEAFDNKN IPALVSALQNGQTWSRDPFKAVTFVANHDTDIIWNKYPAYAFILTYEGQPTIFYRDYEEWLNKD KLKNLIWIHENLAGGSTDIVYYDNDELIFVRNGYGDKPGLITYINLGSSKAGRWVYVPKFAGACI HEYTGNLGGWVDKYVYSSGWVYLEAPAYDPANGQYGYSVWSYCGVG SEQ ID NO: 10: AmyS, secuencia de proteína de longitud completa (amilasa de B. stearothermophilus) (NCBI PDB número de estructura IHVX, número de proteína 1HVX.A) 1 AAPFNGTMMQ YFEWYLPDDG TLWTKVANEA NNLSSLGITA LWLPPAYKGT SRSDVGYGVY 61 DLYDLGEFNQ KGAVRTKYGI KAQYLQAIQA AHAAGMQVYA DWFDHKGGA DGTEWVDAVE 121 VNPSDRNQEI SGTYQIQAWI KFDFPGRGNT YSSFK RWYH FDGVDWDSSR KLERIY FRG 181 IGKAWDWEYD TENGNYDYLM YADLDMDHPE WTELKSWGK WYVNTTNIDG FRLDAVKHIK 241 FSFFPDWLSY VRSQTGKPLF TVGEYWSYDI NKLHNYIMKT NGTMSLFDAP LHNKFYTASK 301 SGGTFDMRTL MTNTLMKDQP TLAVTFVDNH DIEPGQALQS VDP F PLA YAFILTRQEG 361 YPCVFYGDYY GIPQYNIPSL KSKIDPLLIA RRDYAYGTQH DYLDHSDIIG TP.EGVTEKP 421 GSGLAALITD GPGGSKWMYV GKQHAGKVFY DLTGNRSDTV TINSDGKGEF KVNGGSVSVW 481 VPRKTTVSTI AWSITTRP T DEFVRWTEPR IVA P SEQ ID NO: 11: AmyS, truncada en el C- terminal (amilasa de Geobacillus stearothermophilus) (NCBI PDB número de estructura IHVX, número de proteína 1HVX.A) . 10 20 30 40 50 60 AAPFNGTMMQ YFEWYLPDDG TLWTKVANEA NNLSSLGITA LWLPPAYKGT SRSDVGYGVY 70 80 90 100 110 120 DLYDLGEFNQ KGTVRTKYGT KAQYLQAIQA AH AGMQVYA DWFDHKGGA DGTEWVDAVE 130 140 150 160 170 180 VNPSDRNQEI SGTYQIQA T KFDFPGRGNT YSSFKWRWYH FDGVD DESR KLSRIY FRG 190 200 210 220 230 240 IGKAWDWEVD TENGNYDYLM YADLDMDHPE WTELKNWGK WYVNTTNIDG FRLDAVKHIK 250 260 270 280 290 300 FSFFPDWLSY VRSQTGKPLF TVGEYWSYDI NKLHNYITKT NGTMSLFDAP LHNKFYTASK 310 320 330 340 350 360 SGGAFDMRTL MTNTLMKDQP TLAVTFVDNH DTEPGQALQS WVDPWFKPLA YAFILTRQEG 370 380 390 400 410 420 YPCVFYGDYY GIPQYNIPSL KSKIDPLLIA RRDYAYGTQH DYLDHSDIIG WTREGVTEKP 430 440 450 460 470 480 GSGLAALITD GPGGSKWMYV GKQHAGKVFY DLTGNRSDTV TINSDGWGEF KVNGGSVSVW VPRKTT SEQ ID NO: 12: Secuencia sintética ctcagctctgcagctagcgcagcaa SEQ ID NO: 13: Secuencia sintética gtgtggaattgtgagcggcca SEQ ID NO: 14: Secuencia sintética agcgagagatgatataceta SEQ ID NO: 15: Secuencia sintética tttcggcgtgggtatggtggc SEQ ID NO: 16: Secuencia sintética ggtggacgccgtcgaagtcaat SEQ ID NO: 17: Secuencia sintética cgcacgttaatgaccaatacac SEQ ID NO: 18: Secuencia sintética ctcagctctgcagctagcgcagc SEQ ID NO: 19: Secuencia sintética gacgacgagcgcgcgatcagaag SEQ ID NO: 20: secuencia de nucleótido del Híbrido A: AAM48115.1/AmyS GCAAAGTATAGCGAATTGGAGAAAGGGGGAGTTATAATGCAAGCATTTTATTGGGATGTGCCGTC CGGCGGCATATGGTGGGACACAATCCGTCAGAAAATTCCGGAATGGTACGATGCGGGCATTTCGG CGATTTGGATACCGCCTGCTTCTAAAGGCATGGGAGGTGCTTACTCAATGGGCTATGACCCATAT GArTTCTTCGATTTAGGCGAATATGACCAGAAAGGGACAGTCGAGACTCGCTTTGGGTCTAAACA GGAGTTGGTTAATATGATTAATACCGCGCATGCTTATGGAATGAAAGTGATAGCCGATGTCGTGT TCGACCATAAAGGCGGCGCTGACGGCACGGAATGGGTGGACGCCGTCGAAGTCAATCCGTCCGAC CGCAACCAAGAAATCTCAGGCACCTATCAAATCCAAGCATGGACGAAATTTGATTTTCCCGGGCG GGGCAACACATACTCTAGCTTTAAGTGGCGCTGGTACCATTTTGACGGCGTTGATTGGGACGAAA GCCGTAAATTAAGCCGCATTTACAAATTCCGCGGCATCGGCAAAGCGTGGGATTGGGAAGTAGAC ACAGAAAACGGAAACTATGACTACTTAATGTATGCCGACCTTGATATGGACCATCCGGAAGTCGT GACCGAGCTCAAAAACTGGGGGAAATGGTATGTCAACACAACGAACATTGATGGGTTCCGGCTTG ATGCCGTCAAGCATATTAAGTTCAGCTTTTTTCCTGATTGGTTGTCATATGTGCGTTCTCAGACT GGCAAGCCGCTGTTTACAGTCGGGGAATATTGGAGCTATGATATCAACAAGTTGCACAATTACAT TACGAAAACAAACGGAACGATGTCTTTGTTTGATGCCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTT CCAAAAGCGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACACrGATGAAAGATCAACCG ACATTGGCCGTCACGTTCGTTGATAATCATGACACAGAGCCGGGCCAAGCGCTTCAGTCATGGGT CGACCCATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTGACACGGCAGGAAGGATACCCGTGCG TCTTTTATGGTGACTATTATGGCATTCCACAATATAACATTCCTTCTCTGAAAAGCAAAATCGAT CCGCTTCTGATCGCGCGCCGTGATTATGCTTACGGAACGCAACATGATTATCTTGATCACTCAGA CATCATTGGGTGGACAAGAGAAGGGGTCACAGAAAAACCAGGATCAGGCCTCGCCGCACTGATCA CGGATGGGCCGGGAGGAAGCAAATGGATGTACGTTGGCAAACAGCATGCTGGAAAAGTGTTCTAT GACCTTACAGGCAACCGGAGCGACACAGTCACGATCAACTCAGATGGATGGGGGGAATTCAAAGT CAATGGCGGTAGCGTTTCAGTTTGGGTTCCTAGA SEQ ID NO: 21: secuencia de nucleótido del Híbrido GCAAAGTATAGCGAATTGGAGAAAGGGGGAGTTATAATGCAAGCATTTTATTGGGATGTGCCGTC CGGCGGCATATGGTGGGACACAATCCGTCAGAAAATTCCGGAATGGTACGATGCGGGCATTTCGG CGATTTGGATACCGCCTGCrTCTAAAGGCATGGGAGGTGCTTACTCAATGGGCTATGACCCATAT GATTTCTTCGATTTAGGCGAATATGACCAGAAAGGGACAGTCGAGACTCGCTTTGGGTCTAAACA GGAGTTGGTTAATATGATTAATACCGCGCATGCTTATGGAATGAAAGTGATAGCCGATATTGTCA TCAACCACAGAGCTGGCGCTGACGGCACGGAATGGGTGGACGCCGTCGAAGTCAATCCGTCCGAC CGCAACCAAGAAATCTCAGGCACCTATCAAATCCAAGCATGGACGAAATTTGATrTTCCCGGGCG GGGCAACACATACTCTAGCTTTAAGTGGCGCTGGTACCATTTTGACGGCGTTGATTGGGACGAAA GCCGTAAATTAAGCCGCATTTACAAATTCCGCGGCATCGGCAAAGCGTGGGATTGGGAAGTAGAC ACAGAAAACGGAAACTATGACTACTTAATGTATGCCGACCTTGATATGGACCATCCGGAAGTCGT GACCGAGCTCAAAAACTGGGGGAAATGGTATGTCAACACAACGAACATTGATGGGTTCCGGCTTG ATGCCGTCAAGCATATTAAGTTCAGCTTTTTTCCTGATTGGTTGTCATATGTGCGTTCTCAGACT GGCAAGCCGCTGTTTACAGTCGGGGAATATTGGAGCTATGATATCAACAAGTTGCACAATTACAT TACGAAAACAAACGGAACGATGTCTTTGTTTGATGCCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTT CCAAAAGCGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACACTGATGAAAGATCAACCG ACATTGGCCGTCACGTTCGTTGATAATCATGACACAGAGCCGGGCCAAGCGCTTCAGTCATGGGT CGACCCATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTGACACGGCAGGAAGGATACCCGTGCG TCTTTTATGGTGACTATTATGGCATTCCACAATATAACATTCCTTCTCrGAAAAGCAAAATCGAT CCGCTTCTGATCGCGCGCCGTGATTATGCTTACGGAACGCAACATGATTATCTTGATCACTCAGA CATCATTGGGTGGACAAGAGAAGGGGTCACAGAAAAACCAGGATCAGGCCTCGCCGCACTGATCA CGGATGGGCCGGGAGGAAGCAAATGGATGTACGTTGGCAAACAGCATGCTGGAAAAGTGTTCTAT GACCTTACAGGCAACCGGAGCGACACAGTCACGATCAACTCAGATGGATGGGGGGAATTCAAAGT CAATGGCGGTAGCGTTTCAGTTTGGGTTCCTAGA SEQ ID NO: 22: secuencia de nucleótido del Híbrido C GCAAAGTATAGCGAATTGGAGAAAGGGGGAGTTATAATGCAAGCATTTrATTGGGATGTGCCGTC CGGCGGCATATGGTGGGACACAATCCGTCAGAAAATTCCGGAA.TGGTACGATGCGGGCATTTCGG CGATTTGGATACCGCCTGCTTCTAAAGGCATGGGAGGTGCTTACTCAATGGGCTATGACCCATAT GATTTCTTCGATTTAGGCGAATATGACCAGAAAGGGACAGTCGAGACTCGCTTTGGGTCTAAACA GGAGTTGGTTAATATGATTAATACCGCGCATGCTTATGGAATGAAAGTGATAGCCGATATTGTCA TCAACCACAGAGCTGGGGGCGACCTCGAATGGAACCCGTTTGTCAACGATTACACTTGGACGAAA TTTGATTTTCCCGGGCGGGGCAACACATACTCTAGCTTTAAGTGGCGCTGGTACCATTTTGACGG CGTTGATTGGGACGAAAGCCGTAAATTAAGCCGCATTTACAAATTCCGCGGCATCGGCAAAGCGT GGGATTGGGAAGTAGACACAGAAAACGGAAACTATGACTACTTAATGTATGCCGACCTTGATATG GACCATCCGGAAGTCGTGACCGAGCTCAAAAACTGGGGGAAATGGTATGTCAACACAACGAACAT TGATGGGITCCGGCTTGATGCCGTCAAGCATATTAAGTTCAGCTTTTTTCCTGATTGGTTGTCAT ATGTGCGTTCTCAGACTGGC AGCCGCTGTTTACAGTCGGGGAATATTGGAGCTATGATATCAAC AAGTTGCACAATTACATTACGAAAACAAACGGAACGATGTCTTTGTTTGATGCCCCGTTACACAA CAAATTTTATACCGCTTCCAAAAGCGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACAC TGATGAAAGATCAACCGACATTGGCCGTCACGTTCGTTGATAATCATGACACAGAGCCGGGCCAA GCGCTTCAGTCATGGGTCGACCCATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTGACACGGCA GGAAGGATACCCGTGCGTCTTTTATGGTGACTATTATGGCATTCCACAATATAACATTCCTTCTC TGAAAAGCAAAATCGATCCGCTTCTGATCGCGCGCCGTGATTATGCTTACGGAACGCAACATGAT TATCTTGATCACTCAGACATCATTGGGTGGACAAGAG AGGGGTCACAGAAAAACCAGGATCAGG CCTCGCCGCACTGATCACGGATGGGCCGGGAGGAAGCAAATGGATGTACGTTGGCAAACAGCATG CTGGAAAAGTGTTCTATGACCTTACAGGCAACCGGAGCGACACAGTCACGATCAACTCAGATGGA TGGGGGGAATTCAAAGTCAATGGCGGTAGCGTTTCAGTTTGGGTTCCTAGA SEQ ID NO: 23: secuencia de nucleótido del Híbrido D GCAAAGTATAGCGAATTGGAGAAAGGGGGAGTTATAATGCAAGCATTTTATTGGGATGTG CCGTCCGGCGGCATATGGTGGGACACAATCCGTCAGAAAATTCCGGAATGGTACGATGCG GGCATTTCGGCGATTTGGATACCGCCTGCTTCTAAAGGCATGGGAGGTGCTTACTCAATG GGCTATGACCCATATGATTTCTTCGATTTAGGCGAATATGACCAGAAAGGGACAGTCGAG ACTCGCTTTGGGTCTAAACAGGAGTTGGTTAATATGATTAATACCGCGCATGCTTATGGA ATGAAAGTGATAGCCGATATTGTCATCAACCACAGAGCTGGGGGCGACCTCGAATGGAAC CCGTTTGTCAACGATTACACTTGGACGGATTTTTCAAAAGTCGCGAGCGGCAAGTATACG GCTAATTACTTAGACTTTGACGGCGTTGATTGGGACGAAAGCCGTAAATTAAGCCGCATT TACAAATTCCGCGGCATCGGCAAAGCGTGGGATTGGGAAGTAGACACAGAAAACGGAAAC TATGACTACTTAATGTATGCCGACCTTGATATGGACCATCCGGAAGTCGTGACCGAGCTC AAAAACTGGGGGAAATGGTATGTCAACACAACGAACATTGATGGGTTCCGGCTTGATGCC GTCAAGCATATTAAGTTCAGCTTTTTTCCTGATTGGTTGTCATATGTGCGTTCTCAGACT GGCAAGCCGCTGTTTACAGTCGGGGAATATTGGAGCTATGATATCAACAAGTTGCACAAT TACATTACGAAAACAAACGGAACGATGTCTTTGTTTGATGCCCCGTTACACAACAAATTT TATACCGCTTCCAAAAGCGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACACTG ATGAAAGATCAACCGACATTGGCCGTCACGTTCGTTGATAATCATGACACAGAGCCGGGC CAAGCGCTTCAGTCATGGGTCGACCCATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTG ACACGGCAGGAAGGATACCCGTGCGTCTTTTATGGTGACTATTATGGCATTCCACAATAT AACATTCCTTCTCTGAAAAGCAAAATCGATCCGCTTCTGATCGCGCGCCGTGATTATGCT TACGGAACGCAACATGATTATCTTGATCACTCAGACATCATTGGGTGGACAAGAGAAGGG GTCACAGAAAAACCAGGATCAGGCCTCGCCGCACTGATCACGGATGGGCCGGGAGGAAGC AAATGGATGTACGTTGGCAAACAGCATGCTGGAAAAGTGTTCTATGACCTTACAGGCAAC CGGAGCGACACAGTCACGATCAACTCAGATGGATGGGGGGAATTCAAAGTCAATGGCGGT AGCGTTTCAGTTTGGGTTCCTAGA SEQ ID NO: 24: secuencia de nucleótido del Híbrido E GCAAAGTATAGCGAATTGGAGAAAGGGGGAGTTATAATGCAAGCATTTTATTGGGATGTGCCGTC CGGCGGCATATGGTGGGACACAATCCGTCAGAAAATTCCGGAATGGTACGATGCGGGCATTTCGG CGATTTGGATACCGCCTGCTTCTAAAGGCATGGGAGGTGCTTACTCAATGGGCTATGACCCATAT GATTTCTTCGATTTAGGCGAATATGACCAGAAAGGGACAGTCGAGACTCGCTTTGGGTCTAAACA GGAGTTGGTTAATATGATTAATACCGCGCATGCTTATGGAATGAAAGTGATAGCCGATATTGTCA TCAACCACAGAGCTGGGGGCGACCTCGAATGGAACCCGTTTGTCAACGATTACACTTGGACGGAT TTrTCAAAAGTCGCGAGCGGCAAGTATACGGCTAATTACTTAGACTTTCACCCAAACGAACTCCA CGCTGGCGACTCCGGTACATTCGGGGGATATCCTGACCTTGATATGGACCATCCGGAAGTCGTGA CCGAGCTCAAAAACTGGGGGAAATGGTATGTCAACACAACGAACATTGATGGGTTCCGGCTTGAT GCCGTCAAGCATATTAAGTTCAGCTTTTTTCCTGATTGGTTGTCATATGTGCGTTCTCAGACTGG CAAGCCGCTGTTTACAGTCGGGGAATATTGGAGCTATGATATCAACAAGTTGCACAATTACATTA CGAAAACAAACGGAACGATGTCTTTGTTTGATGCCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTTCC AAAAGCGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACACTGATGAAAGATCAACCGAC ATTGGCCGTCACGTTCGTTGATAATCATGACACAGAGCCGGGCCAAGCGCTTCAGTCATGGGTCG ACCCATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTGACACGGCAGGAAGGATACCCGTGCGTC TTTTATGGTGACTATTATGGCATTCCACAATATAACATTCCTTCTCTGAAAAGCAAAATCGATCC GCTTCTGATCGCGCGCCGTGATTATGCTTACGGAACGCAACATGATTATCTTGATCACTCAGACA TCATTGGGTGGACAAGAGAAGGGGTCACAGAAAAACCAGGATCAGGCCTCGCCGCACTGATCACG GATGGGCCGGGAGGAAGCAAATGGATGTACGTTGGCAAACAGCATGCTGGAAAAGTGTTCTATGA CCTTACAGGCAACCGGAGCGACACAGTCACGATCAACTCAGATGGATGGGGGGAATTCAAAGTCA ATGGCGGTAGCGTTTCAGTTTGGGTTCCTAGA SEQ ID NO: 25: secuencia de nucleótido del Híbrido F GCAAAGTATAGCGAATTGGAGAAAGGGGGAGTTATAATGCAAGCATTTTATTGGGATGTGCCGTC CGGCGGCATATGGTGGGACACAATCCGTCAGAAAATTCCGGAATGGTACGATGCGGGCATTTCGG CGATTTGGATACCGCCTGCTTCTAAAGGCATGGGAGGTGCTTACTCAATGGGCTATGACCCATAT GATTTCTTCGATTTAGGCGAATATGACCAGAAAGGGACAGTCGAGACTCGCTTTGGGTCTAAACA GGAGTTGGTTAATATGATTAATACCGCGCATGCTTATGGAATGAAAGTGATAGCCGATATTGTCA TCAACCACAGAGCTGGGGGCGACCTCGAATGGAACCCGTTTGTCAACGATTACACTTGGACGGAT TTrTCAAAAGTCGCGAGCGGCAAGTATACGGCTAATTACTTAGACTTTCACCCAAACGAACTCCA CGCTGGCGACTCCGGTACATTCGGGGGATATCCTGATATCTGTCATGACAAAAGCTGGGATCAAT ATTGGCTCAAAAACTGGGGGAAATGGTATGTCAACACAACGAACATTGATGGGTTCCGGCTTGAT GCCGTCAAGCATATTAAGTTCAGCTTTTTTCCTGATTGGTTGTCATATGTGCGTTCTCAGACTGG CAAGCCGCTGTTTACAGTCGGGGAATATTGGAGCTATGATATCAACAAGTTGCACAATTACATTA CGAAAACAAACGGAACGATGTCTTTGTTTGATGCCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTTCC AAAAGCGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACACTGATGAAAGATCAACCGAC ATTGGCCGTCACGTTCGTTGATAATCATGACACAGAGCCGGGCCAAGCGCTTCAGTCATGGGTCG ACCCATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTGACACGGCAGGAAGGATACCCGTGCGTC TTTTATGGTGACTATTATGGCATTCCACAATATAACATTCCTTCTCTGAAAAGCAAAATCGATCC GCTTCTGATCGCGCGCCGTGATTATGCTTACGGAACGCAACATGATTATCTTGATCACTCAGACA TCATTGGGTGGACAAGAGAAGGGGTCACAGAAAAACCAGGATCAGGCCTCGCCGCACTGATCACG GATGGGCCGGGAGGAAGCAAATGGATGTACGTTGGCAAACAGCATGCTGGAAAAGTGTTCTATGA CCTTACAGGCAACCGGAGCGACACAGTCACGATCAACTCAGATGGATGGGGGGAATTCAAAGTCA ATGGCGGTAGCGTTTCAGTTTGGGTTCCTAGA SEQ ID NO: 26: secuencia de nucleótido del Híbrido G GCAAAGTATAGCGAATTGGAGAAAGGGGGAGTTATAATGCAAGCATTTTATTGGGATGTGCCGTC CGGCGGCATATGGTGGGACACAATCCGTCAGAAAATTCCGGAATGGTACGATGCGGGCATTTCGG CGATTTGGATACCGCCTGCTTCTAAAGGCATGGGAGGTGCTTACTCAATGGGCTATGACCCATAT GATTTCTTCGATTTAGGCGAATATGACCAGAAAGGGACAGTCGAGACTCGCTTTGGGTCTAAACA GGAGTTGGTTAATATGATTAATACCGCGCATGCTTATGGAATGAAAGTGATAGCCGATATTGTCA TCAACCACAGAGCTGGGGGCGACCTCGAATGGAACCCGTTTGTCAACGATTACACTTGGACGGAT TTTTCAAAAGTCGCGAGCGGCAAGTATACGGCTAATTACTTAGACTTTCACCCAAACGAACTCCA CGCTGGCGACTCCGGTACATTCGGGGGATATCCTGATATCTGTCATGACAAAAGCTGGGATCAAT ATTGGCTGTGGGCTTCACAAGAAAGCTACGCCGCATATCTTCGGTCCATCGGGATTGATGGGTTC CGGCTTGATGCCGTCAAGCATATTAAGTTCAGCTTTTTTCCTGATTGGTTGTCATATGTGCGTTC TCAGACTGGCAAGCCGCTGTTTACAGTCGGGGAATATTGGAGCTATGATATCAACAAGTTGCACA ATTACATTACGAAAACAAACGGAACGATGTCTTTGTTTGATGCCCCGTTACACAACAAATTTTAT ACCGCTTCCAAAAGCGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACACTGATGAAAGA TCAACCGACATTGGCCGTCACGTTCGTTGATAATCATGACACAGAGCCGGGCCAAGCGCTTCAGT CATGGGTCGACCCATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTGACACGGCAGGAAGGATAC CCGTGCGTCTTTTATGGTGACTATTATGGCATTCCACAATATAACATTCCTTCTCTGAAAAGCAA AATCGATCCGCTTCTGATCGCGCGCCGTGATTATGCTTACGGAACGCAACATGATTATCTTGATC ACTCAGACATCATTGGGTGGACAAGAGAAGGGGTCACAGAAAAACCAGGATCAGGCCTCGCCGCA CTGATCACGGATGGGCCGGGAGGAAGCAAATGGATGTACGTTGGCAAACAGCATGCTGGAAAAGT GTTCTATGACCTTACAGGCAACCGGAGCGACACAGTCACGATCAACTCAGATGGATGGGGGGAAT TCAAAGTCAATGGCGGTAGCGTTTCAGTTTGGGTTCCTAGA SEQ ID NO: 27: secuencia de nucleótido del Híbrido H GCAAAGTATAGCGAATTGGAGAAAGGGGGAGTTATAATGCAAGCATTTTATTGGGATGTGCCGTC CGGCGGCATATGGTGGGACACAATCCGTCAGAAAATTCCGGAATGGTACGATGCGGGCATTTCGG CGATTTGGATACCGCCTGCTTCTAAAGGCATGGGAGGTGCTTACTCAATGGGCTATGACCCATAT GATTTCTTCGATTTAGGCGAATATGACCAGAAAGGGACAGTCGAGACTCGCTTTGGGTCTAAACA GGAGTTGGTTAATATGATTAATACCGCGCATGCTTATGGAATGAAAGTGATAGCCGATATTGTCA TCAACCACAGAGCTGGGGGCGACCTCGAATGGAACCCGTTTGTCAACGATTACACTTGGACGGAT TTTTCAAAAGTCGCGAGCGGCAAGTATACGGCTAATTACTTAGACTTTCACCCAAACGAACTCCA CGCTGGCGACTCCGGTACATTCGGGGGATATCCTGATATCTGTCATGACAAAAGCTGGGATCAAT ATTGGCTGTGGGCTTCACAAGAAAGCTACGCCGCATATCTTCGGTCCATCGGGATCGATGCGTGG AGGTTTGACTATGTCAAGGGCTATGCTCCTTGGGTTGTCAAAGATTGGTTGTCATATGTGCGTTC TCAGACTGGCAAGCCGCTGTTTACAGTCGGGGAATATTGGAGCTATGATATCAACAAGTTGCACA ATTACATTACGAAAACAAACGGAACGATGTCTTTGTTTGATGCCCCGTTACACAACAAATTTTAT ACCGCTTCCAAAAGCGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACACTGATGAAAGA TCAACCGACATTGGCCGTCACGTTCGTTGATAATCATGACACAGAGCCGGGCCAAGCGCTTCAGT CATGGGTCGACCCATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTGACACGGCAGGAAGGATAC CCGTGCGTCTTTTATGGTGACTATTATGGCATTCCACAATATAACATTCCTTCTCTGAAAAGCAA AATCGATCCGCTTCTGATCGCGCGCCGTGATTATGCTTACGGAACGCAACATGATTATCTTGATC ACTCAGACATCATTGGGTGGACAAGAGAAGGGGTCACAGAAAAACCAGGATCAGGCCTCGCCGCA CTGATCACGGATGGGCCGGGAGGAAGCAAATGGATGTACGTTGGCAAACAGCATGCTGGAAAAGT GTTCTATGACCTTACAGGCAACCGGAGCGACACAGTCACGATCAACTCAGATGGATGGGGGGAAT TCAAAGTCAATGGCGGTAGCGTTTCAGTTTGGGTTCCTAGA Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (26)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una amilasa híbrida caracterizada porque comprende el polipéptido que tiene, de N-terminal a C-terminal, la fórmula (I) : A-x-y-B (I), en donde A es una primera secuencia de aminoácidos de una a-amilasa de arqueas; B es una segunda secuencia de aminoácidos de una OÍ-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre o una variante de la misma que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a la a-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre ; x es un residuo C-terminal de la primera secuencia de aminoácidos; y es un residuo N-terminal de la segunda secuencia de aminoácidos; en donde la primera y segunda secuencias de aminoácidos juntas contienen aproximadamente 400 a aproximadamente 500 residuos de aminoácidos; en donde entre aproximadamente 10% y aproximadamente 80% del total de aminoácidos en la amilasa híbrida son contribuidos por la a-amilasa de arqueas; y en donde los residuos x e y son estructuralmente conservados en la amilasa híbrida en comparación con la OÍ-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre.

2. La amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la amilasa híbrida tiene un nivel alterado de expresión recombinante , solubilidad, perfil de actividad de pH, especificidad de sustrato, o actividad específica, en comparación con la a-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre.

3. La amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la distancia media cuadrática entre carbonos alfa en residuos x e y en comparación con la estructura tridimensional de la -amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre es no más de aproximadamente 0.5 Á.

4. La amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la primera secuencia de aminoácidos A es estructuralmente conservada en la amilasa híbrida en comparación con la -amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre.

5. La amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la a-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre es una a-amilasa de Bacillus .

6. La amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la a-amilasa de Bacillus es una alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, alfa-amilasa de B. licheniformis, alfa-amilasa de B. subtilis, alfa-amilasa de Bacillus sp. KSM-K38, o alfa-amilasa de B. halmapalus .

I . La amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la a-amilasa de Bacillus es una a-amilasa de B. stearothermophilus .

8. La amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la a-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre es una variante de una a-amilasa de B. stearothermophilus, en donde un dominio de unión a almidón es removido del C-terminal de la a-amilasa de B. stearothermophilus.

9. La amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la amilasa de arqueas es a-amilasa de Ultrathin.

10. La amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la primera y segunda secuencias de aminoácidos se derivan de amilasas que comparten menos de aproximadamente 60% de identidad de secuencia .

II. La amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque residuos x e y están en el dominio B.

12. La amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la primera secuencia de aminoácidos aporta por lo menos 80% de los residuos de aminoácidos del dominio B.

13. La amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la primera secuencia de aminoácidos comprende un sitio de unión a Zn2+ .

14. La amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque por lo menos un aminoácido en un sitio de unión a Ca2+ de la a-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre es reemplazado por un residuo de aminoácido de la primera secuencia de aminoácidos.

15. La amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la amilasa híbrida tiene actividad de a-amilasa, y en donde la actividad no es afectada por la concentración de Ca2+.

16. La amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NOS: 1-8.

17. La amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la amilasa comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 2 , 6 , 7 ó 8.

18. La amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la amilasa híbrida es purificada .

19. Un ácido nucleico caracterizado porque codifica la amilasa híbrida de conformidad con la reivindicación 1.

20. Un vector caracterizado porque comprende el ácido nucleico de la reivindicación 19.

21. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 19 o el vector de conformidad con la reivindicación 20.

22. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la célula hospedera es una bacteria o un hongo.

23. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la bacteria es Bacillus sp.

24. Un método de diseño del ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque comprende : (a) alinear una estructura 3D de una amilasa de arqueas y una a-amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre en un proceso implementado por computadora; (b) seleccionar los residuos de aminoácidos x e y que son estructuralmente conservados; y (c) diseñar el ácido nucleico para codificar la arailasa híbrida.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la distancia media cuadrática entre carbonos alfa en los residuos x e y en comparación con la estructura tridimensional de la -amilasa similar a Termamyl de tipo silvestre es no más de aproximadamente 0.5 Á.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el proceso implementado por computadora comprende desplegar la alineación estructural tridimensional en un monitor de computadora.