CN102213716A - 一种用酶标法测定海马幼苗组织消化酶活力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用酶标法测定海马幼苗组织消化酶活力的方法，包括：1)将冰冻海马幼苗加入到容器中，冰浴下再加入0.7％NaCl的生理盐水或匀浆介质后，用多功能样品均质器匀浆，离心机离心，取上清液备用；2)取部分上述上清液测定组织总蛋白浓度；3)取容器A、B，分别加入底物淀粉缓冲液，再向B中加入步骤1)所得上清液，然后分别在A、B中各加入碘反应液和蒸馏水；4)吸取A、B中溶液分别滴入酶标板的两个孔中；随后将上述的酶标板放入酶标仪中，同时检测两孔中溶液的吸光度；5)最后计算样品的淀粉酶活力。本发明的方法操作简单，成本低廉，效率高，且环保无污染。
Description
技术领域
本发明属于消化酶活力的测定领域，特别涉及一种用酶标法测定海马幼苗组织消化酶活力的方法。
背景技术
海马是传统的名贵中药，具有很高的经济价值。近年来，海马被当作高级观赏动物，使其价值大涨。但由于自然资源破坏严重，供应满足不了需求，人工养殖成了唯一选择。在海马幼苗养殖中，饵料营养是否足够，环境条件是否适宜均成为影响海马育苗成功与否的重要因素。消化酶活力在水产研究中是反映鱼类对不同营养物质利用能力的重要指标。除饵料营养外，环境因子等也可影响机体的消化酶活力，因此消化酶活力也可以作为反应环境好坏的指标之一。
在实际生产中，海马与其他鱼类的死亡往往发生在初孵幼苗阶段。而此时，人们往往通过对大量幼苗组织进行生化分析，来判断其营养状况和对环境的适应程度。而传统的消化酶分析方法存在以下问题：1)往往需要重量达数百毫克的幼体组织，这就需要消耗数十甚至成百上千只幼体。2)需要自行配置分析试剂或购买商用试剂盒。而试剂盒的价格也往往达到数百乃至上千元。3)实验测试前的组织匀浆，往往采用手动玻璃匀浆器或高速匀浆机，但一般每次只能匀浆一个样品。4)吸光度读取时，一般采用光程为1cm的比色杯在分光光度计下读取。而在一些科学研究中，有时一次就需要分析数百份样本。这不但需要高昂的分析费用，同时也需要消耗大量的人力物力。且由于大量样本的测试过程需要花费十几甚至数十天，这极大增加了测试过程跨越时间长所造成的偏差。而需要一种高效，且对研究材料和研究试剂需求量大大减少的方法，对消化酶活力进行分析。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用酶标法测定海马幼苗组织消化酶活力的方法，该方法操作简单，成本低廉，效率高，且环保无污染。
本发明的一种用酶标法测定海马幼苗组织消化酶活力的方法，包括：
1)将冰冻海马幼苗10-20mg加入到容器中，冰浴下再加入90-180μl 2-4℃的0.7％g/mlNaCl的生理盐水或匀浆介质后，匀浆成匀浆液，然后再于冷冻离心机中0-4℃9000-10000rpm下离心10min，取上清液备用；
2)取上述上清液，采用考马斯亮蓝G250法测定组织总蛋白浓度，其中牛血清白蛋白为标准蛋白；
3)取两个干净的容器A、B，分别加入等体积的试剂盒中的“底物淀粉缓冲液”(南京建成生物工程研究所)50ul，再向B中加入步骤1)所得上清液10ul，并震荡B；然后将A、B于37℃恒温水浴中加热7.5min后再各加入等体积浓度为0.01mol/L的碘反应液50ul，最后在A、B中各加入蒸馏水300-310ul，使得A、B中溶液的体积相等，再同时震荡A、B；
4)从上述A、B中各吸取等体积的溶液，分别滴入酶标板的两个孔中；将酶标仪波长调至660nm，随后将上述的酶标板放入酶标仪中，同时检测两孔中溶液的吸光度；
5)最后根据公式计算样品的淀粉酶活力.
AMS表示酶活力，U/mgprot为酶活力单位；A表示A的吸光度，B表示B的吸光度；0.4和0.05分别表示“底物淀粉缓冲液”的浓度0.4mg/ml和用量的毫升数(50ul＝0.05ml)；30分钟和10表示反应30分钟消耗10mg淀粉作为一个酶活力单位；7.5分钟是本实验于37℃恒温水浴中实际加热7.5分钟；取样量为步骤3)中取用的上清液的体积(ml)，组织总蛋白浓度为步骤2)中测试所得的组织总蛋白浓度。
上述步骤1)中所述的匀浆介质为pH值为7.4，且含有0.01mol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl，0.0001mol/L EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)，0.01mol/L蔗糖，0.8％g/mlNaCl的水溶液。
上述步骤1)中所述的匀浆成匀浆液过程中，使用的是多功能样品均质器(BertinPrecellys-24，法国白金公司)。
上述步骤1)中所得的上清液中10ul准备用于淀粉酶活力测定，剩余可用作组织总蛋白含量测定、脂肪酶活力测定、蛋白酶活力测定。
上述步骤2)中所取上清液的体积为80-160ul。
上述步骤3)中所述的容器A、B，其中A为空白对照，B用于样品的测定。
上述步骤3)中所述的震荡均为用旋窝振荡器震荡。
本发明的方法简便易学，实验材料用量和实验试剂成本均减少到普通检测时的0.1倍，组织匀浆效率最多可提高24倍，吸光度读取效率最多可提高96倍。在测吸光度的溶液为270ul，约为普通分光光度法检测时的0.1倍(光程为1cm比色杯容积为3000ul)。因此，步骤1中幼体组织用量也可按比例降为普通检查时的0.1倍；
化学反应中试剂盒试剂的用量，也按比例缩小到了普通情况的0.1倍；选用BertinPrecellys-24多功能样品均质器，可以同时匀浆24个样品，且每次匀浆时间约为2min。而普通手动匀浆每人每次只能匀浆一个样品，每个样品需要2min。据此推算该步骤的效率将提高24倍。
本发明选用了96孔酶标版和酶标仪(酶标法)进行吸光度的测试，本发明在3-5min内可以一次性最多检测96个样品，其效率是普通普通检测(分光光度法)时的96倍。而且96孔板为无污染一次性耗材，且价格低廉。
有益效果
本发明的方法操作简单，成本低廉，效率高，且环保无污染。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1)将冰冻海马幼苗10mg加入到1.5ml容器中，冰浴下再加入90μl 4℃左右的匀浆介质(pH 7.4，0.01mol/L Tris-HCl，0.0001mol/L EDTA-2Na，0.01mol/L蔗糖，0.8％g/mlNaCl溶液)，匀浆成匀浆液，然后再于TGL-16G型冷冻离心机中4℃，9000rpm下离心10min，取上清液80ul，其中20ul用作以下检测，另60ul可留作他用；
2)取上述上清液10ul采用考马斯亮蓝G250法测定组织总蛋白浓度为0.34mg/ml，其中牛血清白蛋白为标准蛋白；
3)取两个干净的容器A、B，分别加入50ul试剂盒中的“底物淀粉缓冲液”，再向B中加入10ul步骤1)所得上清液，并用旋窝振荡器震荡B，使试剂充分混匀；然后将A、B于37℃恒温水浴中加热7.5min，取出后分别在A、B中各加入50ul浓度为0.01mol/L的碘反应液，在A中加入蒸馏水310ul，B中加入蒸馏水300ul，再用旋窝振荡器同时震荡A、B；
4)用移液器从A、B中各吸取溶液270ul，分别滴入孔容积为405ul酶标板的两个孔中；将酶标仪波长调至660nm，随后将上述的酶标板放入酶标仪中，同时检测两孔中溶液的吸光度为0.38、0.29；
5)根据公式计算出样品的酶活力为0.56U/mgprot。
实施例2
1)将冰冻海马幼苗20mg加入到离心管中，冰浴下再加入180μl 2。℃左右的0.7％g/mlNaCl的生理盐水，匀浆成匀浆液，然后再于冷冻离心机中4℃，10000rpm下离心10min，取上清液160ul，其中20ul用作以下检测，另140ul可留作他用；
2)取上述上清液10ul采用考马斯亮蓝G250法测定组织总蛋白浓度为0.30mg/ml，其中牛血清白蛋白为标准蛋白；
3)取两个干净的离心管A、B，分别加入50ul试剂盒中的“底物淀粉缓冲液”，再向B中加入10ul步骤1)所得上清液，并用旋窝振荡器震荡B管，使管中试剂充分混匀；然后将A、B于37℃恒温水浴中加热7.5min，取出后分别在A、B中各加入50ul浓度为0.01mol/L的碘反应液，在A中加入蒸馏水310ul，B中加入蒸馏水300ul，再用旋窝振荡器同时震荡A、B；
4)从A、B中各吸取溶液270ul，分别滴入酶标板的两个孔中；将酶标仪波长调至660nm，随后将上述的酶标板放入酶标仪中，同时检测两孔中溶液的吸光度为0.35，0.28；
5)根据公式计算出样品的酶活力为0.53U/mgprot。
实施例3
采用考马斯亮蓝G250法测定组织总蛋白浓度：
1)取材制备匀浆上清液和离心过程与实施例2的步骤1)相同；
2)分别取三个干净离心管(空白管A、标准管C、测定管B)，然后向分别向空白管加入10ul蒸馏水，标准管加入10ul标准液，测定管加入10ul样本匀浆上清液；再分别向每个管各加入300ul考马斯亮蓝显色剂，然后混匀，静置10min；
3)混匀，取溶液270ul滴入(每孔容积为405ul的96孔)酶标板中，将酶标仪波长调至595nm，测吸光度分别为空白管A：0.323、测定管B：0.424、标准管C：0.511；再根据公式计算出组织总蛋白浓度为0.30mg/ml，其中标准管浓度为0.563mg/ml。
Claims (4)
1.一种用酶标法测定海马幼苗组织消化酶活力的方法，包括：
1)将冰冻海马幼苗10-20mg加入到容器中，冰浴下再加入90-180μl 2-4℃左右的0.7％g/mlNaCl的生理盐水或匀浆介质后，匀浆成匀浆液，然后再于冷冻离心机中0-4℃9000-10000rpm下离心10min，取上清液备用；
2)取上述上清液，采用考马斯亮蓝法测定组织总蛋白浓度，其中牛血清白蛋白为标准蛋白；
3)取两个干净的容器A、B，分别加入等体积的试剂盒中的“底物淀粉缓冲液”50ul，再向B中加入步骤1)所得上清液10ul，并震荡B；然后将A、B于37℃恒温水浴中加热7.5min后再各加入浓度为0.01mol/L的碘反应液50ul，最后在A、B中各加入蒸馏水300-310ul，使得A、B中溶液的体积相等，再同时震荡A、B；
4)从上述A、B中各吸取等体积的溶液，分别滴入酶标板的两个孔中；将酶标仪波长调至660nm，随后将上述的酶标板放入酶标仪中，同时检测两孔中溶液的吸光度；
5)最后计算样品的淀粉酶活力。
2.根据权利要求1所述的一种用酶标法测定海马幼苗组织消化酶活力的方法，其特征在于：步骤1)中所述的匀浆介质为pH值为7.4，且含有0.01mol/L Tris-HCl、0.0001mol/LEDTA-2Na、0.01mol/L蔗糖、0.8％g/mlNaCl的水溶液。
3.根据权利要求1所述的一种用酶标法测定海马幼苗组织消化酶活力的方法，其特征在于：步骤1)中所述的匀浆成匀浆液过程中，使用的是Bertin Precellys-24多功能样品均质器。
4.根据权利要求1所述的一种用酶标法测定海马幼苗组织消化酶活力的方法，其特征在于：步骤3)中所述的震荡均为用旋窝振荡器震荡。
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