EP1590460A1 - Transposases d elements genetiques mobiles mariner mutantes, non phosphorylables et hyperactives - Google Patents

Transposases d elements genetiques mobiles mariner mutantes, non phosphorylables et hyperactives

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Publication number
EP1590460A1
EP1590460A1 EP04704632A EP04704632A EP1590460A1 EP 1590460 A1 EP1590460 A1 EP 1590460A1 EP 04704632 A EP04704632 A EP 04704632A EP 04704632 A EP04704632 A EP 04704632A EP 1590460 A1 EP1590460 A1 EP 1590460A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
transposase
tnp
transposition
recombinant
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04704632A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Yves Bigot
Corinne Auge-Gouillou
Marie-Hélène HAMELIN
Benjamin Brillet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Tours
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Francois Rabelais de Tours
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Francois Rabelais de Tours filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1590460A1 publication Critical patent/EP1590460A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the field of molecular biology relating to transposable elements.
  • the invention relates more particularly to the improvement of the properties of natural transposases of mobile mariner genetic elements, for the purposes of their use in biotechnologies.
  • the subject of the present invention is mutant, non-phosphorylatable, hyperactive transposases of mobile mariner genetic elements.
  • the invention also relates to recombinant nucleotide sequences encoding such transposases.
  • the invention relates to a process for the production of these transposases, as well as the use of the latter for transposition In vitro or in vivo.
  • Transposable elements or mobile genetic elements (EGM) are small DNA fragments capable of moving from one chromosomal site to another (Renault et al., 1997). These DNA fragments are characterized by inverted repeat (ITR) sequences located at the 5 ′ and 3 ′ positions distally.
  • ITR inverted repeat
  • TEs have been identified in both prokaryotes and eukaryotes (see a reference work in this area: Craig et al., 2002).
  • TEs are divided into two classes according to their transposition mechanism.
  • class I elements or retrotransposons, transpose via the reverse transcription of an RNA intermediate.
  • class II elements transpose directly from a site chromosome to another, via a DNA intermediary, according to a “cut and paste” type mechanism.
  • TEs In prokaryotes, a large number of TEs have been identified to date. Mention may be made, for example, of insertion sequences such as IS, and of transposons, such as Tn5.
  • class II elements include five families: P, PiggyBac, hAT, helitron and Tel-mariner.
  • the mobile mariner genetic elements constitute a large group of TE class II, belonging to the Tel-mariner superfamily (Plasterk et al., 1999).
  • TE transposases to mobilize more or less long DNA fragments, homologous or heterologous, comprising sequences of interest, to insert them into target nucleic acids, in particular in the chromosome of a host, has been and is still widely used in the field of biotechnology, especially in the field of genetic engineering.
  • MLEs have particularly advantageous properties for use in biotechnologies, in particular in genetic engineering and functional genomics.
  • the following properties may for example be mentioned without limitation:
  • MLE are small transposons, easy to handle.
  • transposase The mechanism for transposing MLE is simple. Indeed, the transposase is capable of catalyzing, on its own, all the stages involved in the process of transposition of MLE. It is moreover necessary and sufficient to ensure the mobility of MLE in the absence of host factors (Lampe et al., 1996).
  • MLE is characterized by a very wide ubiquity in prokaryotes and eukaryotes.
  • Dmmarl also called Mos-1
  • Mos-1 Drosophila Mauritiana
  • Transposition events can be controlled by various factors, such as temperature and pH.
  • MLE transposases are phosphorylated in eukaryotes, by means of post-translational modifications (see Experimental Part below).
  • the invention aims to suppress, by point mutagenesis, one or more phosphorylation sites of these enzymes.
  • the subject of the present invention is a mutant and hyperactive MLE transposase.
  • such a transposase has at least one mutation by conservative substitution of at least one phosphorylatable residue in at least one phosphorylation site, said conservative substitution rendering said site non-phosphorylable in vivo.
  • a mutant and hyperactive transposase according to the invention is therefore at least partially non-phosphorylable.
  • such a transposase will be designated as being “mutant, non-phosphorylable and hyperactive”.
  • hypoactive transposase is understood here to mean a transposase whose transposition efficiency in eukaryotes is increased by a factor greater than or equal to approximately 10, preferably greater than or equal to approximately 25, more preferably greater than or equal to about 50, more preferably greater than or equal to about 100.
  • a transposase according to the invention is “hyperactive” for at least one function among: specific and non-specific binding to DNA, dimerization, transfer of DNA strands, and endonuclease and internalization properties nuclear (see Figure 2 below).
  • the expression “hyperactivity of a transposase” means that the biological properties (or functions or activities) of this transposase are improved or increased.
  • Each of the above-mentioned activities is necessary, but can be limiting, during the implementation of the transposition process. In in particular, each of these activities is capable of being regulated by post-translational phosphorylations in eukaryotes.
  • DNA binding involves three mechanisms of DNA recognition by MLE transposases.
  • Transposases can bind DNA via their N-terminal domain, either non-specifically (first mechanism) or specifically via ITRs (second mechanism). These two link modes depend on the conformational state of the N-terminal domain.
  • first mechanism non-specifically
  • second mechanism specifically via ITRs
  • these two link modes depend on the conformational state of the N-terminal domain.
  • the transposases are trapped in the synaptic complex, just after excision of the transposon (this complex comprising at least one transposase dimer linked by ITRs to the excised transposon), they can bind to DNA according to a third mechanism, for recognize the site of insertion into the target DNA.
  • MLE transposases are able to self-associate (“dimerization” properties in the context of the invention) according to two processes. They can dimerize (homodimers) when they are specifically linked to ITRs. They are also capable of oligomerizing (homodimers or homooligomers) when they are in an inactive and / or high concentration conformation, when they are not linked to ITRs. In the Mos-1 transposase, the region comprising the position T88 (see below) has been proposed as being involved in dimerization (personal data; Zhang et al., 2001).
  • DNA strand transfer is defined in the literature as covering the capacity of MLE transposases, which are phosphoryl transferases, to bind DNA fragments, concomitantly with the cutting of these.
  • the endonuclease properties are therefore very closely linked to the above-mentioned “DNA strand transfer” activity.
  • the cleavage activities presented by MLE transposases are of three types: cleavage at the ends of the transposon during excision, linearization circular excision intermediates and cleavage of the site of insertion into the target DNA.
  • MLE transposases have two potential bipartite sites allowing nuclear internalization.
  • the terms and expressions “activity”, “function”, “property”,
  • transposase activity or “transposase function”.
  • transposase activity may generically designate all of the enzymatic activities of an MLE transposase, as mentioned above, or one or more of these activities. In any case, the meaning to be given to this expression will be deduced in a clear and unambiguous manner from the context by those skilled in the art.
  • a “mutation” designates a substitution of one or more bases in a nucleotide sequence, or of one or more amino acids in a protein sequence. More particularly, a “mutation” should here be understood as designating a substitution of at least one base of a codon of a nucleotide sequence encoding an MLE transposase, said substitution resulting, during the translation of the nucleotide sequence in question , the incorporation of a different (non-phosphorylatable) amino acid in place of the native amino acid (phosphorylatable), in the resulting protein sequence.
  • a mutation by substitution according to the invention must be “conservative”, ie, it must be a non-random substitution preserving and, preferably, improving one or more enzymatic activities of wild MLE transposases.
  • a “conservative” substitution in accordance with the invention improves all of the enzymatic activities of the MLE transposases. This is possible especially when the overall tertiary structure of the MLE transposase is conserved despite the substitution mutation (s) introduced.
  • substitutions may be wholly or partly conservative of the activities of the protein if these are for example performed as follows: substitution of a serine or a threonine with, in order of preference, a cysteine, an alanine, a valine, a leucine, a tyrosine or an arginine.
  • a conservative substitution appropriate to the present context can in no case be carried out using, as a substitution residue, in particular a serine, a threonine, an aspartic acid, a glutamic acid or a proline.
  • the “phosphorylation sites” can in particular be sites of phosphorylation by the protein kinase AMPc, gMPc dependent, or by protein kinase C, or also by casein kinase 11. It can furthermore s 'act of putative phosphorylation sites, corresponding to consensus patterns known to those skilled in the art (PROSITE motif banks: httD: // ww.infobio ⁇ en.fr) as shown in Figure 1 below.
  • the short sites, absent from PROSITE, and corresponding to 4 QS, QT, SQ and TQ dipeptides phosphorylatable by ATM kinases are also taken into account as being “putative phosphorylation sites” (Kastan et al., 2000; Kastan et al ., 2001).
  • the phosphorylation sites targeted by the invention can be conserved through at least two MLE transposases.
  • they can be demonstrated by aligning the protein sequences of at least two MLE transposases.
  • One of these sequences can be, for example, that of the Mos-1 transposase (see the alignment of the MLE transposase sequences deposited with the EMBL database under the access number DS36877).
  • the residues of two distinct protein sequences thus aligned are called here "corresponding residues".
  • corresponding residues are called here "corresponding residues".
  • a transposase according to the invention exhibits at least one mutation by conservative substitution of at least one phosphorylatable residue in each phosphorylation site, said conservative substitution making each site non-phosphorylable in vivo.
  • a transposase which is the subject of the present invention is such that said phosphorylatable residue which is the target of the mutation by conservative substitution is substituted by a non-phosphorylatable residue.
  • a mutant, non-phosphorylatable, hyperactive transposase which is the subject of the invention comes from an MLE belonging to the Mauiana subfamily.
  • the “MLE” targeted in the context of the present invention have between them sequence homologies of at least 50%, preferably at least 75%, more preferably at least 80%, or more preferably still , at least 90%.
  • the MLEs according to the invention have sequence homologies between them at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, or more preferably still, at least 98%.
  • the MLEs in question have, over their entire length, at least 50%, preferably at least 75%, more preferably at least 80%, or even more preferably at least 90% of identical bases.
  • the MLEs have, over their entire length, at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95% or, more preferably still, at least 98%, of identical bases.
  • Identical bases can be consecutive, in whole or in part only.
  • the MLEs thus envisaged can be of the same length, or of a different length if their sequences have, relative to one another, deletions or insertions of one or more bases.
  • the "mauritiana subfamily” gathers the MLE whose transposases are coded by sequences presenting, over their entire length or at the level of the regions coding for the N- and C-terminal domains only, a sufficient level of homology, that is that is to say at least 75%, to be included in the same line as the four sequences below, during phylogenetic studies carried out using the methods of parsimony and "Neighbor-Joining" on a dataset of 1000 subsamples (1000 "bootstrap”) [See Felsenstein (1993) and Augé-Gouillou et al. (2000)]:
  • a mutant, non-phosphorylatable, hyperactive transposase which is the subject of the invention comes from MLE mos-1.
  • one or more phosphorylatable residues from the following residues are substituted with non-phosphorylatable residues.
  • at least the phosphorylatable residue T88 or, alternatively, at least the phosphorylatable residue S104 of such a transposase is substituted by a non-phosphorylatable residue.
  • the present invention relates to a recombinant nucleotide sequence encoding a transposase as described above.
  • nucleotide sequence or a “nucleic acid” according to the invention conforms to the usual meaning in the field of biology. These two expressions indifferently cover DNA and RNA, the former being for example genomic, plasmid, recombinant, complementary (cDNA), and the latter, messenger (mRNA), ribosomal (rRNA), transfer (tRNA).
  • the nucleotide and nucleic acid sequences of the invention are DNA.
  • the present invention relates to a recombinant vector comprising at least one recombinant nucleotide sequence encoding a transposase according to the invention.
  • such a recombinant vector allows the expression of said recombinant nucleotide sequence.
  • the subject of the present invention is a recombinant host cell hosting at least one recombinant vector as described above.
  • a recombinant host cell according to the invention can be of both eukaryotic and prokaryotic origin.
  • It can, for example and without limitation, be a eukaryotic cell coming from a yeast, a fungus, a plant, an insect (eg, Drosophila), a rodent or a mammal (eg, rabbit).
  • a cell suitable for implementing the invention can come from a bacterium (e.g., Escherichia coli).
  • the present invention relates to a process for the production of a mutant, non-phosphorylatable, hyperactive transposase, as described above.
  • a method according to the invention comprises at least: a) cloning of the recombinant nucleotide sequence coding for the mutant, non-phosphorylatable, hyperactive transposase in an expression vector; b) transforming a host cell with said recombinant expression vector; and c) expression of said nucleotide sequence by said recombinant host cell. All of the steps implemented in the context of such a process use conventional techniques known to those skilled in the art (see for example, Sambrook and Russel, 2001).
  • transformation is here given a generic meaning in that it also covers, in addition to transformation in the strict sense, transduction by a viral vector and transfection, as many molecular biology techniques perfectly usual for those skilled in the art.
  • such a method further comprises a prior step of obtaining said recombinant nucleotide sequence, by substitution, in the nucleotide sequence encoding the corresponding native transposase, of at least one nucleotide of a triplet or codon encoding a phosphorylatable residue, by another nucleotide, so that the resulting triplet encodes a non-phosphorylatable residue.
  • This preliminary step involves directed mutagenesis techniques, known to those skilled in the art (Ausubel et al., 1994).
  • a subsequent step of purification of said transposase is carried out.
  • the abovementioned purification step consists in purifying, by conventional methods customary for those skilled in the art, the protein fraction having the desired enzymatic activity, and not the enzyme itself. even. It is precisely this active protein fraction thus purified that is called here "pure enzyme” or "pure transposase".
  • pure enzyme or pure transposase
  • the presence of contaminating substances, including that of other proteins, in a minority amount is not excluded, as long as the transposase activity of interest is preserved, and that only this activity is detected.
  • the detection of the enzymatic activity of interest can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art (Ausubel et al., 1994).
  • the host cell is chosen from prokaryotic cells, for example from bacteria, and eukaryotic cells, for example from yeasts, fungi, plants, insects and mammals.
  • the present invention relates to uses of at least one mutant, non-phosphorylatable, hyperactive transposase, as described above, in the field of biotechnology.
  • such a transposase is used for the in vitro transposition of a transposable DNA sequence of interest into a target DNA sequence.
  • a use in accordance with the invention is carried out for the purposes of the in vivo transposition of a transposable DNA sequence of interest into the genome of the host.
  • a transposase according to the invention may be useful for preparing a medicament intended to allow the transposition in vivo of a transposable DNA sequence of interest into the genome of the host.
  • a “host” is understood here as being able to be an organism, eukaryotic or prokaryotic, or a tissue of an organism, or even a cell of an organism or a tissue.
  • Figure 1 Nucleotide sequence of the mos-1 transposon (SEQ ID No. 1) and protein sequence of the Mos-1 transposase (SEQ ID No. 2).
  • the putative phosphorylation sites are located as follows:
  • 89 of the protein sequence SEQ ID No. 2 correspond to the putative site of phosphorylation by the family of ATM kinases.
  • the circled residues are the ⁇ sp residues involved in the catalytic triad characteristic of MLE transposases (D, D34-35 [D / E]).
  • Figure 2 Diagram representing the structure of the transposase of the Mos-1 element.
  • N-term N-terminal domain responsible for linking to ITRs
  • C-term C-terminal domain responsible for the catalysis of DNA strand transfer
  • NLS putative nuclear localization signal (or nuclear internationalization)
  • HTH propeller-turn-propeller motif
  • aa amino acid.
  • the numbers indicate the positions of the amino acids.
  • Figure 5 Graph showing the Tnp / Transposase mRNA correlation as a function of the culture conditions in the pBadR expression system.
  • Figure 6 “Dots” of hybrid pKK-Tnp mRNA with:
  • Figure 7 Graph showing the Tnp / Transposase mRNA correlation as a function of the culture conditions in the pKK expression system.
  • Figure 8 Photograph of a 10% SDS-PAGE protein gel of protein extracts (A) and autoradiogram of a delay on gel of transposases in the presence of 3 'ITR (B).
  • Track 1 pBadR control Tracks 2 to 7: Tnp from the pBadR-Tnp system (2: 1% glucose, 3: control, 4: 0.001% ara, 5: 0.01% ara, 6: 0.1% ara, 7: 1% ara)
  • IPTG 11: 1 mM IPTG, 12: 3 mM IPTG.13: 6 mM IPTG
  • Figure 9 Graph representing the frequency of transposition and enrichment in transposase, as a function of the culture conditions in the pBadR expression system.
  • Figure 10 Graph representing the frequency of transposition and enrichment in transposase, as a function of the culture conditions in the pKK expression system.
  • Figure 11 Graphical representation according to Scatchard of the ITR-binding saturation experiments with MBP-Tnp produced in insect cells.
  • Figure 12 Graphic representation according to Scatchard of ITR-binding saturation experiments with eukaryotic Tnp produced in vitro.
  • Figure 13 Autoradiogram of an SDS-Page 10% acrylamide gel of the various in vitro syntheses in the presence of ATP- ⁇ 32 P.
  • Figure 14 Graphical representation according to Scatchard of ITR-binding saturation experiments with dephosphorylated MBP-Tnp.
  • Figure 15 Graphic representation according to Scatchard of the ITR-binding saturation experiments with Tnp produced in vitro and dephosphorylated.
  • Figure 16 Autoradiograms and graphs illustrating the results of delayed gel analysis (A and C) and transposition into bacteria (B and D) of the transposases by Zhang et al. (2001) (A and B) and mutated transposases at position T88 (C and D).
  • WT wild transposase
  • PBadR-Tnp carries an ampicillin resistance gene. Its construction is detailed in paragraph 1.2.1. below.
  • the vector pKK-Tnp (5.6 kb) allows a strong expression of the transposase via a Plac promoter inducible to IPTG.
  • the promoter is not modular and has a natural expression leak.
  • PKK-Tnp also carries the ampicillin resistance gene.
  • the construction of the vector is presented in paragraph 1.2.2. infra.
  • PBC 3K3 is a mos-pseudo-mariner donor plasmid (Augé-Gouillou et al, 2001). It contains the kanamycin resistance gene "OFF" (ie without promoter) bordered by two ITR 3 '. Thus, only the bacteria which have carried out the transposition of the pseudotransposon downstream of a promoter (“tagging” promoter) will be selected on LBkanamycin boxes.
  • the vector carries a chloramphenicol resistance gene.
  • PBS (3 ') carries the 3' ITR clone at the Smal site of pBS (Stratagene, La Jolla, California, United States). PBS is identical to pBC, except that it carries an ampicillin resistance gene instead of chloramphenicol.
  • the vector pET-Tnp (6.4 kb) (Augé-Gouillou et al, 2001) codes for the transposase under the control of the T7 promoter and has a gene for resistance to kanamycin.
  • This vector was used as a source of DNA for in vitro transcription / translation into a reticulocyte lysate to produce a eukaryotic transposase.
  • BL21 bacteria, encoding T7 polymerase under IPTG-inducible Plac control, were transformed with pET-Tnp to produce prokaryotic transposase in the phosphorylation test described below.
  • the vector pGEM®-T-Easy (Promega, Charbonippos, France) has the primers for sequencing Pu and pRev (Ausubel et al., 1994) and the gene for resistance to ampicillin. It is designed to clone PCR products into the LacZ gene, which allows white / blue screening of the bacterial colonies obtained on an LBampicillin dish, in the presence of IPTG and X-Gal. It was used to give the pGEM-T (Tnp) (Augé-Gouillou et al, 2001) and the pGEM-T (L27) whose construction is detailed in paragraph 1.2.3. below.
  • PBadR-Tnp was obtained from pBad 18 in two stages: o Cloning of RBS (Ribosome Binding Site) Cloning of RBS in pBad 18 reconstitutes the following sequence: 5 'GAAGGAGTAcccgggGATC 3' (SEQ ID N ° 3)
  • This sequence corresponds to a consensus site for initiating translation if the gene encoding the transposase is cloned into a Sma ⁇ site (in lower case).
  • RBS was purchased as two non-phosphorylated complementary single-stranded oligonucleotides. The pairing of the two strands reconstitutes the following sequence: 5 "AATTC GA ⁇ A ⁇ CGAAGGAGTAC 3 '(SEQ ID N ° 4) - 3' G CTATAGC ⁇ TCCI 5 '(SEQ ID N ° 5) The outgoing 5' end corresponds to an EcoRI site, the outgoing 3 'end at a Kpn ⁇ site, allowing the cloning of the RBS in pBad18. This sequence also provides a unique EcoRV site (in italics) which makes it possible to control the cloning.
  • the two paired strands were phosphorylated with T4 polynucleotide kinase (New England BioLabs, Beverly, MA, United States).
  • T4 polynucleotide kinase New England BioLabs, Beverly, MA, United States.
  • the plasmid pBad 18 was digested with Kpn ⁇ and EcoRI, then dephosphorylated.
  • the RBS (15 ng) was then ligated to the plasmid (25 ng) overnight at 16 ° C in the presence of a T4 DNA ligase (Promega), in order to obtain pBadR. Competent E.
  • coli MC1061 bacteria (strain lacking an active transport of arabinose) were transformed with pBadR, on LB dish (5 g NaCl, 5 g yeast extract, 10 g tryptone, 0.3 ml of 10N NaOH, qs 1 L H2O) / ampicillin (100 ⁇ g / ml). Twelve ampicillin-resistant colonies were cultured to extract plasmid DNA and analyze the plasmid by EcoRV digestion.
  • the plasmid DNAs were sequenced using the “DNA sequencing kit” from Perkin Elmer Biosystems (Courtaboeuf, France) and analyzed on a monolaser automatic sequencer of the Licor type (Science Tec , Ulysses Innovation Park, France). The plasmid containing a single RBS was then used to clone the gene encoding the transposase.
  • Tnp The fragment coding for transposase (Tnp) was prepared from the vector pGEM-T (Tnp) by SnaBUHind W digestion and eluted on 0.8% agarose gel (TAE 1X: 0.04 M Tris-acetate, 1mM EDTA, pH 8).
  • TEE 1X 0.04 M Tris-acetate, 1mM EDTA, pH 8.
  • the plasmid pBadR obtained previously was digested with Sma ⁇ / Hind ⁇ .
  • the DNA of the plasmid was eluted, then ligated with the fragment coding for the transposase of Mos-1 (called Tnp in this experimental part), at a rate of 25 ng of fragment for 25 ng of vector.
  • the ligation product was used to transform E. coli MC1061 bacteria which were then selected on an LB-ampicillin dish (100 ⁇ g / ml). 12 ampicillin resistant clones were cultured for extraction of the plasmid.
  • the DNA mini-preparations were checked by EcoRV / H / r / c / III digestion and then by 0.8% agarose gel electrophoresis (TAE 1X) to ensure that they had integrated the gene encoding the transposase. .
  • the fragment coding for the transposase (Tnp) of marinator Mos-1 was prepared from pGEM-T (Tnp) by Nco ⁇ IHind ⁇ digestion and eluted on gel. It was ligated with the vector pKK-233-2 (Clontech, Ozyne, Saint-Quentin-en-Yvelines, France), opened by the same enzymes, at a rate of 10 ng of vector for 40 ng of Tnp fragment, to give pKK-Tnp.
  • MC1061 bacteria were transformed with the expression vector pKK-Tnp, spread on an LB-ampicillin dish (100 ⁇ g / ml), 50 mM CaCl2 and placed at 42 ° C, to limit the cytotoxic effects of the transposase.
  • 6 clones resistant to ampicillin were cultured under the same conditions to extract the plasmids.
  • Mini DNA preparations have were checked by Nco ⁇ / Hind ⁇ digestion on 0.8% agarose gel (TAE 1X) to ensure that they had integrated the gene coding for transposase.
  • the plasmid was sequenced using the “DNA sequencing kit” (Perkin Elmer Biosystems) and analyzed on an automatic monolaser sequencer of the Licor type in order to to verify the conservation of the sequence before marking.
  • the L27 probe was labeled by radioactive PCR from the pGEM-T matrix (L27) with the primers pU and pRev (which surround the cloning site [Ausubel et al., 1994]) in the presence of ATP- ⁇ 32 P.
  • the labeled probe is separated from the free dNTPs by size exclusion chromatography on a Sephadex G50 column (TE 1X: 10mM tris pH 8, 1mM EDTA). The column was washed in a fraction of 200 ⁇ l and the probe identified with the MIP 10 counter (Eurisys Measurements, Saint-Quentin-en-Yvelines, France).
  • the Tnp probe was marked by the technique of "Random Priming", ie the synthesis of DNA after pairing of random hexamers.
  • the elongation was carried out with the Klenow fragment of DNA polymerase in the presence of ATP- ⁇ 32 P.
  • the probe was eluted by size exclusion chromatography on a Sephadex G50 column (TE 1X).
  • the induction tubes (2.5 ml LB containing arabinose or IPTG according to the above conditions) were seeded volume to volume, and cultured for 3 h at 31 ° C (final volume of 5 ml ). After three hours, the proteins and mRNAs were extracted. The same protocol was followed for the bacteria containing the plasmids pBadR and pKK, in order to produce RNA and proteins devoid of Tnp (negative controls).
  • the extraction of the mRNAs was carried out at 4 ° C., in the absence of RNase in order to avoid their degradation. Following induction, the bacterial cultures were centrifuged for 10 min, at 12,000 g, at 4 ° C. The supernatant was removed, the residue taken up in 5 ml of “protoplasting buffer” (15 mM Tris pH 8, 15% sucrose, 8 mM EDTA). 40 ⁇ l of lysosyme (50 mg / ml) were added and the mixture was incubated for 15 min in ice.
  • “protoplasting buffer” 15 mM Tris pH 8, 15% sucrose, 8 mM EDTA.
  • the pellet was taken up in 250 ⁇ l of lysis buffer (1.5% SDS, 1 mM sodium citrate, 10 mM NaCl, 10 mM Tris pH 8).
  • RNA pellets were washed with 500 ⁇ l of 70% EtOH, then dried.
  • the pellets (taken up in 30 ⁇ l H2O DEPC) were subjected to the action of Dnasel for 1 h 30 at 37 ° C.
  • the RNA pellets were washed and dried, then taken up in 50 ⁇ l of H2 ⁇ DEPC.
  • the quality of the extraction was checked with 5 ⁇ l of sample on 0.8% agarose gel (TAE 1X). The extracted RNAs were stored at -80 ° C.
  • RNA was assayed using a fluorescence spectrophotometer.
  • Each extract was diluted to a hundredth in 500 ⁇ l of water.
  • the absorbance was measured at 260 nm (wavelength of maximum absorption of nucleic acids) and at 280 nm (wavelength of absorption of amino acids such as tyrosine). If the 260 nM to 280 nM absorption ratio was between 1.8 and 2.1, the total amount of extracted mRNA could be quantified, at the rate of 40 ⁇ g for an absorbance measurement at 260 nm in 1 ml.
  • RNAs which was calibrated using an RNA control, the RNA coding for the ribosomal protein L27, the quantity of which did not vary during the experiments
  • RNA control the RNA coding for the ribosomal protein L27, the quantity of which did not vary during the experiments
  • the membrane was pre-hybridized with Church buffer (7% SDS, 1 mM EDTA, 0.5 M NaPO4 pH 7.2) in order to limit non-specific hybridizations by saturation of the membrane, for 1 hour at 65 ° C.
  • the membrane was then dehybridized by three rinses with a 1% SDS solution brought to a boil. The membrane was then again put in pre-hybridization for 1 h at 65 ° C. before a new hybridization.
  • Bacteria have undergone the same induction protocol as that used for mRNA extractions. The cultures were centrifuged for 10 min at 12,000 g at 4 ° C. The bacterial pellets were taken up in 500 ⁇ L of a 20 mM Tris pH 9 buffer, 100 m M NaCl, 1 mM DTT, and stored at -20 ° C. overnight. After sonication (1 "draws" of 30s at 25 W) and centrifugation at 10,000g, 4 ° C, for 15 min, the protein supernatants were collected and then quantified by a Bradford assay relative to a concentration of bovine serum albumin (BSA). After dosing, the protein extracts were stored at -20 ° C.
  • BSA bovine serum albumin
  • the gel was washed in water 3 times 30 min. This step was repeated with a 2% H3PO4 solution.
  • the gel was then placed in a 17% CH3OH, 2% H3PO4 and 15% (NH4) 2SO4 solution for one hour.
  • the gel was then colored overnight in an identical fresh solution, to which was added 0.2% of colloidal Coomassie blue.
  • the colored gel was scanned with a scanner and then dried.
  • ITR 3 ′ ITR optimized for the binding of Tnp
  • the 3 'ITR was isolated from the plasmid pBS (3') by EcoR ⁇ / Xba ⁇ digestion, purified on a 2% NuSieve agarose gel (FMC products, United States), eluted and quantified. 100 ng of 3 'ITR were labeled with the Klenow fragment of DNA polymerase in the presence of dATP. After phenol extraction chloroform and precipitation, the pellet was taken up in 40 ⁇ l of water to obtain the ITR at a concentration of 50 nM.
  • Competent bacteria MC1061 were co-transformed with the plasmid pBC 3K3 (carrying a pseudo-mar / ner reporter of the transposition and of the gene for resistance to chloramphenicol) and with the inducible vector coding the transposase pBadR-Tnp or pKK- Tnp (carrying the ampicillin resistance gene) ( Figure 3A).
  • the bacteria were selected on ampicillin and chloramphenicol to verify the presence of two plasmids.
  • Co-transformation was also carried out with the control plasmids pBadR and pKK. The E.
  • coli MC1061 bacteria containing the reporter vector pBC3K3 and that encoding the transposase, were cultured, at 42 ° C., in 2.5 ml of LB-ampicillin (100 ⁇ g / ml) chloramphenicol (20 ⁇ g / ml ) / 50 mM CaCI 2 overnight (conditions limiting the activity of transposase).
  • the culture was titrated on an LB dish (10 ⁇ l of a dilution allowing correct counting), and on an LB-kanamycin dish (100 ⁇ g / ml) (50 ⁇ l of the saturated culture).
  • the total amount of ITR bound to transposase (B) was subtracted from the total amount of ITR present (T) to give the amount of free ITR (F).
  • the B / F ratio expressed as a function of the nM of bound ITR (nM B) gave a straight line with a slope of -1 / Kd.
  • Eukaryotic test The plasmid pET-Tnp was used in a eukaryotic (rabbit) in vitro transcription / translation system (TNT® T7 Quick Coupled Transcription / Translation System, Promega) to allow the synthesis of transposase, identical to that produced previously in prokaryotes. This system allows protein phosphorylation. The possible phosphorylation of the transposase had to be visualized thanks to the addition of ATP- ⁇ ⁇ P during the synthesis.
  • pET-Tnp 0.5 to 1 ⁇ g of pET-Tnp were incubated for 90 min at 30 ° C with 40 ⁇ l of TNT mix in the presence of ATP- ⁇ 32 P. 5 ⁇ l of the mixture was denatured with the same volume of loading buffer , then deposited in a 10% acrylamide SDS-PAGE gel. After electrophoresis, the gel was stained with colloidal Coomassie blue and then dried. The gel was autoradiographed to reveal the presence of the phosphorylated protein.
  • the Mos-1 transposon mariner has a low transposition activity in its natural host (D. mauritiana), compared to the P element (Rubin et al, 1982).
  • D. mauritiana natural host
  • P element P element
  • a study model in bacteria revealed that the transposition of a Mos-1 element carrying two 3 'type ITRs was 10,000 times more efficient than that of an element in a “natural” configuration, that is to say carrying an ITR 5 'and an ITR 3'. This difference is observed in prokaryotes but not in eukaryotes, as shown by the work carried out in Drosophila by Dr P.
  • the vector pBadR-Tnp is a weak expression system where the transposase is under the control of a promoter inducible to arabinose (Para) and modular, that is to say that the quantity of protein produced is a function of the amount of inductor.
  • PKK-Tnp is a strong expression system where the transposase is under the control of a promoter inducible to IPTG (Plac) and non-modular.
  • transposase mRNAs were absent in bacteria containing the control vector pBadR.
  • they were present in bacteria containing the expression vector pBadR-Tnp: the lowest amounts of mRNA-Tnp were detected in the absence of arabinosis or in the presence of glucose, and greatest amounts were observed at all induction conditions with a maximum amount of Tnp-mRNA for 0.1% arabinose ( Figures 4 and 5).
  • the correlation between the quantity of Tnp-mRNA and the induction conditions in the pBadR system has shown that this expression system was consistent with the known functioning of the arabinose-inducible promoter (Para). Only the 1% arabinose induction point resulted in a decrease in the amount of transposase mRNA. This difference could be explained by the high concentration of arabinose used for induction, which had to saturate or even inhibit the induction system.
  • the proteins were obtained under the same conditions as the RNAs. They were analyzed on SDS-PAGE ( Figure 8A). The digital image of the gel made it possible to calculate the percentage of transposase in the different extracts using the Molecular Analyst software (Biorad, Ivry sur Seine, France). At the same time, the binding activity to the ITR 3 'of the transposases obtained in the different extracts was tested, by gel retardation experiments (FIG. SB).
  • the graphs ( Figures 9 and 10) represent the percentage of transposase in the extracts (relative quantities) (y axis) as a function of the different induction conditions (x axis). The Tnp mRNA levels were replaced there in order to correlate mRNA and protein.
  • the proteins extracted from the bacteria containing the pBadR control vector did not contain transposase as shown in the protein gel (FIG. 8A, lane 1) and the late gel analysis (FIG. 8B , track 1).
  • the extracts obtained from bacteria containing the vector pBadR- Tnp contained very small amounts of transposase in the absence of inducer (2.42% of the crude extract, track 3) or in presence of glucose (1.04% of the raw extract, lane 2).
  • the quantities obtained in the presence of inductor were slightly higher (2.62% to 3.1% of the crude extract, lanes 4 to 7).
  • Figure 5 shows that the amount of transposase was well correlated with the amount of Tnp mRNA, except for the strongest point of induction (1% arabinose) where the amount of protein increased while the amount of mRNA decreased. This could be explained by the accumulation, at the start of induction, of the transposases synthesized before the quantity of mRNA is regulated.
  • the late gel analysis shows that there was no detectable delay, even for high concentrations of crude extracts and for large quantities of inducer.
  • the amounts of transposases produced with the expression vector pBadR-Tnp were therefore very low, which was in agreement with the activity of the arabinose-inducible promoter, and could therefore explain the absence of signal during delay experiments. on gel. Only the transposition test (biological test) could confirm or not the activity of the transposases produced with this system.
  • the proteins extracted from the bacteria containing the pKK control vector did not contain transposase, as indicated by the protein gel (lane 8 in FIG. 8A) and the late gel analysis (lane 8 in FIG. 8B).
  • the extracts obtained from bacteria containing the vector pKKTnp contained small amounts of transposase in the absence of IPTG (2.37% of the crude extract, lane 9) and large amounts of transposase in the presence of IPTG (8.48% to 10.25% of the crude extract, lane 10 to 13).
  • transposase Analysis of transposase production showed that the protein was present in our cultures, including in the absence of an inducer (arabinose) or in the presence of a repressor (glucose). Transposition began even in the absence of induction ( Figure 9, glucose conditions and control). This confirmed that, even in small quantities, the transposase had a high activity. Indeed, for a minimum quantity of transposase (1.04% of the crude extract in glucose condition), the transposition frequency was 26.10 "5. For a transposase enrichment of 2.62% of the crude extract ( induction point 0.001% arabinose), the transposition frequency, 68.10 "5 , was maximum, a slight increase by a factor of 2.5. For the induction points of 0.01% to 1% arabinose, the transposition frequency remained at a plateau despite a low enrichment in transposase compared to the induction point 0.001% arabinose.
  • FIG. 10 represents the transposition frequency as a function of the induction conditions.
  • the transposase enrichments have been added in order to correlate them with the transposition frequencies.
  • the maximum transposition frequency was 59.10 " 5 for a transposase enrichment of 8.48% (corresponding to the first point d 'induction 0.5mM IPTG), then reached a plateau for amounts of transposase varying negligibly (8 to 10% of crude extracts for the following induction points).
  • transposase produced in the pBadR-Tnp expression system was small but sufficient to have an efficient transposition, even in the absence of an inducer.
  • the production of transposase represented up to 10% of bacterial protein and made it possible to detect its activity by a biochemical test (delayed gel).
  • this higher production did not translate into a higher transposition frequency compared to the pBadR system.
  • the transposition frequency was maximum (59.10 "5 ) and similar to that obtained with pBadR-Tnp (68.10 "5 ) for the induction point 0.001% arabinose. This frequency stagnated for the other induction points.
  • all of these results seemed to indicate that in the prokaryotic system , no inhibition by overproduction was detected, which should result in a drop in the transposition frequency.
  • Tourne (Tnp coupled with a protein allowing its purification but having no impact on its activity) produced in insect cells thanks to a baculovirus system and extracted from the cell nucleus, and the transposase produced in reticulocyte lysate (rabbit) using the TNT ® T7 Quick Coupled Transcription / Translation System kit (Promega).
  • the first experiment was carried out with MBP-Tnp under the same conditions as those which were carried out with transposase of bacterial origin, that is to say for a range of ITR 3 'concentration of 0.05 nM to 10 nM.
  • the results showed that these conditions were not suitable for determining a Kd (the ligand concentration range had to "frame the Kd"), and therefore that the eukaryotic protein behaved differently from the prokaryotic transposase.
  • FIG. 11 represents the ratio of bound probe to free probe (B / F) as a function of the concentration of bound probes (nM B), which resulted in a single straight line whose slope was -0.0256.
  • the Kd being the inverse of the slope, its value was 39 nM.
  • Another Scatchard was performed under the same conditions with the transposase produced from pET-Tnp with the TNT® system allowing transcription / translation in vitro in rabbit reticulocyte lysates.
  • the result obtained (FIG. 12) showed a profile identical to that obtained with the transposase produced in insect cells and presented a unique Kd of 74 nM.
  • transposase with activity analogous to that produced in vivo in insect cells.
  • the production of transposase with pET-Tnp, in the reticulocyte lysate, in the presence of ATP- ⁇ 32 P resulted in the appearance of radiolabelled bands on the protein gel (FIG. 13, lane 3), also present when the experiment was carried out in the absence of DNA (FIG. 13, lane 1) or with pET-26b + ( Figure 13, lane 2).
  • a radiolabelled band present only in the case of production with pET-Tnp (lane 3 in FIG. 13), was located at a PM of around 40kDa, similar to that of transposase.
  • FIGS. 14 and 15 show a profile similar to that obtained with the transposase produced in the prokaryotic system, that is to say the presence of 2 lines, therefore of 2 different Kd.
  • a transposase of bacterial origin is approximately 100 times more effective in recognizing ITRs and initiating transposition than a transposase of eukaryotic origin.
  • Post-translational phosphorylations therefore affect the affinity of the transposase for DNA (specific and non-specific) and limit the conformational activation thereof.
  • the mutation of the threonine residue at position 88 into a non-phosphorylatable alanine residue seems to increase the ability of the mutated transposase to catalyze the transposition and transfer of DNA, by a factor of between 100 and 10,000 approximately, compared to that of a native transposase.

Abstract

La présente invention a pour objets des transposases mutantes, non phosphorylables, hyperactives, d'éléments génétiques mobiles mariner. L'invention concerne également des séquences nucléotidiques recombinantes codant de telles transposases. En outre, l'invention vise un procédé de production de ces transposases, ainsi que l'utilisation de ces dernières pour la transposition in vitro ou in vivo.

Description

TRANSPOSASES D'ELEMENTS GENETIQUES MOBILES mariner
MUTANTES, NON PHOSPHORYLABLES ET HYPERACTIVES
La présente invention se rapporte au domaine de la biologie moléculaire relative aux éléments transposables. L'invention concerne plus particulièrement l'amélioration des propriétés des transposases naturelles d'éléments génétiques mobiles mariner, aux fins de leur utilisation en biotechnologies.
La présente invention a pour objets des transposases mutantes, non phosphorylables, hyperactives, d'éléments génétiques mobiles mariner.
L'invention concerne également des séquences nucléotidiques recombinantes codant de telles transposases.
En outre, l'invention vise un procédé de production de ces transposases, ainsi que l'utilisation de ces dernières pour la transposition In vitro ou in vivo.
Les éléments transposables (TE) ou éléments génétiques mobiles (EGM) sont des fragments d'ADN de petite taille, capables de se déplacer d'un site chromosomique à un autre (Renault et al., 1997). Ces fragments d'ADN sont caractérisés par des séquences répétées inversées (ITR) situées en positions 5' et 3' distales. Une enzyme codée par les TE eux- mêmes, la transposase, catalyse le processus de transposition de ces derniers.
Des TE ont été identifiés tant chez les procaryotes que chez les eucaryotes (voir un ouvrage de référence dans ce domaine : Craig et al., 2002).
Les TE sont répartis en deux classes d'après leur mécanisme de transposition. D'une part, les éléments de classe I, ou rétrotransposons, transposent via la transcription inverse d'un intermédiaire ARN. D'autre part, les éléments de classe II transposent directement d'un site chromosomique à un autre, via un intermédiaire ADN, selon un mécanisme de type « couper-coller ».
Chez les procaryotes, un grand nombre de TE ont été répertoriés à ce jour. L'on peut citer, par exemple, des séquences d'insertion telles que IS , et des transposons, tel Tn5.
Chez les eucaryot.es, les éléments de classe II comprennent cinq familles : P, PiggyBac, hAT, hélitron et Tel -mariner.
Les éléments génétiques mobiles mariner (ou MLE pour « mariner- like éléments ») constituent un grand groupe de TE de classe II, appartenant à la superfamille Tel -mariner (Plasterk et al., 1999).
La capacité des transposases de TE à mobiliser des fragments d'ADN plus ou moins longs, homologues ou heterologues, comprenant des séquences d'intérêt, pour les insérer dans des acides nucléiques cibles, en particulier dans le chromosome d'un hôte, a été et est encore largement mise à profit dans le domaine des biotechnologies,, notamment dans le domaine du génie génétique.
Parmi les TE, les MLE présentent des propriétés particulièrement avantageuses pour une utilisation en biotechnologies, notamment en ingénierie génétique et génomique fonctionnelle. L'on peut par exemple citer de manière non limitative les propriétés suivantes :
(i) Les MLE sont des transposons de petite taille, faciles à manipuler.
(ii) Le mécanisme de transposition des MLE est simple. En effet, la transposase est capable de catalyser, à elle seule, toutes les étapes impliquées dans le processus de transposition des MLE. Elle est d'ailleurs nécessaire et suffisante pour assurer la mobilité des MLE en l'absence de facteurs de l'hôte (Lampe ét al., 1996).
(iii) Les MLE se caractérisent par une très large ubiquité chez les procaryotes et les eucaryotes. Le premier MLE, Dmmarl, également appelé Mos-1, a été découvert chez Drosophila mauritiana par Jacobson et Hartl (1985). Par la suite, de nombreux éléments apparentés ont été identifiés dans des génomes appartenant notamment à des protozoaires, champignons, plantes, invertébrés, vertébrés à sang froid et mammifères.
(iv) L'activité transpositionnelle des MLE est hautement spécifique, et ne stimule pas de mécanismes de
« résistance » du génome de l'hôte, tels que des phénomènes d'interférences par méthylation [MIP ; Jeong ef al. (2002) ; Martienssen et Colot (2001)] ou via des ARN
[RNAi ; Ketting et al. (1999) ; Tabara et al. (1999)]. Les événements de transposition peuvent être contrôlés par divers facteurs, tels la température et le pH.
En conséquence, les applications potentielles des MLE en biotechnologies, notamment comme outils de recombinaison génétique, sont considérables.
Néanmoins, l'efficacité de transposition des MLE naturels, comparée à celle d'autres TE, reste faible. En particulier, les MLE semblent moins actifs chez les eucaryotes que les autres EGM de classe II. En définitive, l'intérêt pratique des MLE naturels est demeuré jusqu'à présent limité, puisqu'il est important, pour l'industriel ou le chercheur, de disposer de transposases efficaces, de manière à réduire le nombre de manipulations, le coût et le temps nécessaires pour réaliser les transpositions recherchées. La présente invention permet précisément de satisfaire à ces exigences, en mettant à profit les avantages des transposases de MLE, tout en remédiant à leurs inconvénients.
La présente invention met en évidence le fait que les transposases de MLE sont phosphorylées chez les eucaryotes, par le biais de modifications post-traductionnelles (voir Partie Expérimentale ci-après).
Ces modifications post-traductionnelles ont deux effets : d'une part, elles réduisent l'affinité des transposases pour l'ADN ; et d'autre part, elles limitent l'activation conformationnelle de ces enzymes. Ceci se traduit finalement par une capacité moindre des transposases phosphorylées à catalyser la transposition chez les eucaryotes. Aussi, afin d'améliorer les propriétés transpositionnelles des transposases de MLE, l'invention vise-t-elle à supprimer, par mutagénèse ponctuelle, un ou plusieurs sites de phosphorylation de ces enzymes.
Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet une transposase de MLE, mutante et hyperactive. Selon un premier mode de réalisation, une telle transposase présente au moins une mutation par substitution conservative d'au moins un résidu phosphorylable dans au moins un site de phosphorylation, ladite substitution conservative rendant ledit site non phosphorylable in vivo.
Une transposase mutante et hyperactive selon l'invention est donc au moins partiellement non phosphorylable. L'on désignera dans ce qui suit une telle transposase comme étant « mutante, non phosphorylable et hyperactive ».
L'on entend ici par transposase « hyperactive », une transposase dont l'efficacité de transposition chez les eucaryotes est accrue par un facteur supérieur ou égal à environ 10, de préférence supérieur ou égal à environ 25, de préférence encore supérieur ou égal à environ 50, de manière encore préférée supérieur ou égal à environ 100.
En particulier, une transposase selon l'invention est « hyperactive » pour au moins une fonction parmi : la liaison spécifique et non spécifique à l'ADN, la dimerisation, le transfert des brins d'ADN, et les propriétés endonucléasiques et d'internalisation nucléaire (voir Figure 2 ci-après).
Ainsi, dans le présent contexte, l'expression « hyperactivité d'une transposase » signifie que les propriétés (ou fonctions ou activités) biologiques de cette transposase sont améliorées ou augmentées. Chacune des activités sus-citées est nécessaire, mais peut être limitante, lors de la mise en œuvre du processus de transposition. En particulier, chacune de ces activités est susceptible d'être régulée par des phosphorylations post-traductionnelles chez les eucaryotes.
La « liaison à l'ADN » met en jeu trois mécanismes de reconnaissance de l'ADN par les transposases de MLE. Les transposases peuvent se lier à l'ADN par leur domaine N-terminal, soit de façon non spécifique (premier mécanisme), soit de façon spécifique via les ITR (deuxième mécanisme). Ces deux modes de liaison dépendent de l'état conformationnel du domaine N-terminal. Lorsque les transposases sont piégées dans le complexe synaptique, juste après l'excision du transposon (ce complexe comprenant au moins un dimère de transposases liées par les ITR au transposon excisé), elles peuvent se lier à l'ADN selon un troisième mécanisme, pour reconnaître le site d'insertion dans l'ADN cible.
Les transposases de MLE sont capables de s'auto-associer (propriétés de « dimerisation » dans le contexte de l'invention) selon deux processus. Elles peuvent se dimériser (homodimères) lorsqu'elles sont liées de façon spécifique à des ITR. Elles sont également capables de s'oligomériser (homodimères ou homooligomères) lorsqu'elles se trouvent sous une conformation inactive et/ou à forte concentration, lorsqu'elles ne sont pas liées à des ITR. Dans la transposase Mos-1 , la région comprenant la position T88 (voir plus loin) a été proposée comme étant impliquée dans la dimerisation (données personnelles ; Zhang et al., 2001 ).
L'activité de « transfert des brins d'ADN » est définie dans la littérature comme couvrant la capacité des transposases de MLE, qui sont des phosphoryl-transférases, à lier des fragments d'ADN, concomitamment à la coupure de ces derniers.
Les propriétés endonucléasiques sont donc très étroitement liées à l'activité de « transfert des brins d'ADN » susvisée. Les activités de coupure présentées par les transposases de MLE sont de trois types : la coupure aux extrémités du transposon lors de l'excision, la linéarisation des intermédiaires d'excision circulaires et la coupure du site d'insertion dans l'ADN cible.
Enfin, les transposases de MLE possèdent deux sites bipartites potentiels permettant une intemalisation nucléaire. Les termes et expressions « activité », « fonction », « propriété »,
« activité biologique », « fonction biologique » et « propriété biologique » sont équivalents et répondent à l'acception usuelle dans le domaine technique de l'invention. Dans le cadre de l'invention, l'activité en cause est l'activité enzymatique d'une transposase (« activité transposase » ou « fonction transposase »). Selon le contexte, l'expression « activité transposase » peut désigner de manière générique l'ensemble des activités enzymatiques d'une transposase de MLE, telles que susmentionnées, ou une ou plusieurs de ces activités. En tous les cas, le sens à donner à cette expression sera déduit de manière claire et non ambiguë du contexte par l'homme du métier.
Au sens de l'invention, une « mutation » désigne une substitution d'une ou plusieurs bases dans une séquence nucléotidique, ou d'un ou plusieurs acides aminés dans une séquence protéique. Plus particulièrement, une « mutation » doit ici être entendue comme désignant une substitution d'au moins une base d'un codon d'une séquence nucléotidique codant une transposase de MLE, ladite substitution entraînant, lors de la traduction de la séquence nucléotidique en cause, l'incorporation d'un acide aminé différent (non phosphorylable) aux lieu et place de l'acide aminé natif (phosphorylable), dans la séquence protéique résultante.
Une mutation par substitution selon l'invention doit être « conservative », i.e., il doit s'agir d'une substitution non aléatoire préservant et, de préférence, améliorant une ou plusieurs activités enzymatiques des transposases de MLE sauvages. De préférence, une substitution « conservative » conforme à l'invention améliore l'ensemble des activités enzymatiques des transposases de MLE. Ceci est possible notamment lorsque la structure tertiaire globale de la transposase de MLE est conservée malgré la ou les mutations par substitution introduites. Aux fins de conserver la structure tertiaire d'une protéine (ici, d'une transposase), et améliorer son activité biologique, l'homme du métier sait, grâce à ses connaissances générales, quelles substitutions d'acides aminés peuvent être appropriées et quelles substitutions doivent impérativement être évitées (Mornon et al., 2002).
En particulier, l'homme du métier peut se référer au Tableau 1 suivant, qui fournit une liste non limitative des substitutions conservatives possibles.
Tableau 1
Résidu sauvage Substitution conservative
Ala (A) Gly ; Ser
Arg (R) Lys
Asn (N) Gin ; His
Cys (C) Ser acides aminés neutres
Gin (Q) Asn
Glu (E) Asp
Gly (G) Ala ; Pro
His (H) Asn ; Gin
Ile (1) Leu ; Val
Leu (L) Ile ; Val
Lys (K) Arg ; Gin ; Glu
Met (M) Leu ; Tyr, Ile
Phe (F) Met ; Leu ; Tyr
Ser (S) Thr
Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr
Tyr (Y) Trp ; Phe
Val (V) Ile ; Leu
Dans le cas d'une mutagenèse réalisée sur des sites de phosphorylation, les substitutions peuvent être en tout ou en partie conservatives des activités de la protéine si celles-ci sont par exemple réalisées comme suit : substitution d'une serine ou d'une thréonine par, par ordre de préférence, une cystéine, une alanine, une valine, une leucine, une tyrosine ou une arginine. Une substitution conservative appropriée au présent contexte ne peut en aucun cas être réalisée en utilisant, comme résidu de substitution, notamment une serine, une thréonine, un acide aspartique, un acide glutamique ou une proline.
Eventuellement, d'autres substitutions appropriées peuvent être déterminées par voie empirique ou à partir des substitutions conservatives exemplifiées dans le Tableau 1 ci-dessus. Dans le contexte de l'invention, les « sites de phosphorylation » peuvent notamment être des sites de phosphorylation par la protéine kinase AMPc, GMPc dépendante, ou par la protéine kinase C, ou encore par la caséine kinase 11. Il peut en outre s'agir de sites de phosphorylation putatifs, correspondant alors à des motifs consensus connus de l'homme du métier (banques de motifs PROSITE : httD:// ww.infobioαen.fr) tels que représentés sur la Figure 1 ci-après. Les sites courts, absents de PROSITE, et correspondant à 4 dipeptides QS, QT, SQ et TQ phosphorylables par les ATM kinases sont également pris en compte comme étant des « sites putatifs de phosphorylation » (Kastan et al., 2000 ; Kastan et al., 2001 ).
En outre, les sites de phosphorylation visés par l'invention peuvent être conservés à travers au moins deux transposases de MLE. En ce cas, ils peuvent être mis en évidence par un alignement des séquences protéiques d'au moins deux transposases de MLE. L'une de ces séquences peut être, par exemple, celle de la transposase Mos-1 (voir l'alignement des séquences des transposases de MLE déposé auprès de la banque de données EMBL sous le numéro d'accès DS36877). Les résidus de deux séquences protéiques distinctes ainsi alignés sont appelés ici « résidus correspondants ». Afin de faciliter l'identification des résidus phosphorylables susceptibles d'être mutés dans la séquence d'une transposase d'EGM mariner distincte de la séquence SEQ ID N°2 (séquence de la transposase Mos-1), ces résidus sont identifiés, dans le cadre de la présente invention, comme étant des « résidus correspondants de la séquence de ladite transposase d'EGM mariner alignée avec la séquence SEQ ID N°2 ». Ainsi, les résidus phosphorylables susceptibles d'être mutés par substitution conservative sont choisis parmi :
- les résidus suivants de la séquence SEQ ID N°2: T11 ; T24 ; S28 ; T42 ; T88 ; S99 ; S104 ; T135 ; S147 ; T154 ; S170 ; T181 ; S200 ; T216 ; T255 ; et S305 ; ou - les résidus correspondants de la séquence d'une transposase d'EGM mariner alignée avec ladite séquence SEQ ID N°2, lesdits résidus correspondants étant choisis parmi :
- une serine ; et
- une thréonine. Selon un deuxième mode de réalisation, une transposase conforme à l'invention présente au moins une mutation par substitution conservative d'au moins un résidu phosphorylable dans chaque site de phosphorylation, ladite substitution conservative rendant chaque site non phosphorylable in vivo. Selon un troisième mode de réalisation, une transposase objet de la présente invention est telle que ledit résidu phosphorylable cible de la mutation par substitution conservative est substitué par un résidu non phosphorylable.
Selon un quatrième mode de réalisation, une transposase mutante, non phosphorylable, hyperactive, objet de l'invention provient d'un MLE appartenant à la sous-famille mau tiana.
Les « MLE » visés dans le cadre de la présente invention présentent entre eux des homologies de séquence d'au moins 50%, de préférence d'au moins 75%, de manière encore préférée d'au moins 80%, ou plus preferentiellement encore, d'au moins 90%. Alternativement, les MLE selon l'invention présentent entre eux des homologies de séquence d'au moins 80%, de préférence d'au moins 90%, de manière encore préférée d'au moins 95%, ou plus preferentiellement encore, d'au moins 98%. Ainsi, les MLE en question possèdent, sur toute leur longueur, au moins 50%, de préférence au moins 75%, de manière encore préférée au moins 80%, ou plus preferentiellement encore au moins 90% de bases identiques. Alternativement, les MLE possèdent, sur toute leur longueur, au moins 80%, de préférence au moins 90%, de manière encore préférée au moins 95% ou, plus preferentiellement encore, au moins 98%, de bases identiques. Les bases identiques peuvent être consécutives, en tout ou en partie seulement. Les MLE ainsi envisagés peuvent être de même longueur, ou d'une longueur différente si leurs séquences présentent, les unes par rapport aux autres, des délétions ou insertions d'une ou plusieurs bases.
La « sous-famille mauritiana » rassemble les MLE dont les transposases sont codées par des séquences présentant, sur toute leur longueur ou aux niveaux des régions codant les domaines N- et C- terminaux uniquement, un niveau d'homologie suffisant, c'est-à-dire d'au moins 75%, pour être incluses dans la même lignée que les quatre séquences ci-dessous, lors d'études phylogénétiques effectuées en utilisant les méthodes de parcimonie et « Neighbor-Joining » sur un ensemble de données de 1000 sous-échantillonnages (1000 « bootstrap ») [Voir Felsenstein (1993) et Augé-Gouillou ét al. (2000)] :
- transposase Mos-1 (SEQ ID N°2, N°d'accès EMBL : X78906) ;
- tranposase Mdmar-1 de Mayetiola destructor (N°d'accès EMBL : U24436) ;
- transposase Btmar-1 de Bombus terrestris (séquence N°3 dans l'alignement N°d'accès EMBL : DS36877) ; et
- transposase Momar-1 de Metaseuilius occidentalis (N°d'accès EMBL : U12279). Selon un cinquième mode de réalisation, une transposase mutante, non phosphorylable, hyperactive, objet de l'invention provient du MLE mos-1.
En particulier, dans une transposase mutante, non phosphorylable, hyperactive, provenant du MLE mos-1, un ou plusieurs résidus phosphorylables parmi les résidus suivants (par référence à la séquence SEQ ID N°2) : T11 ; T24 ; S28 ; T42 ; T88 ; S99 ; S104 ; T135 ; S147 ; T154 ; S170 ; T181 ; S200 ; T216 ; T255 ; et S305, sont substitués par des résidus non phosphorylables. De manière avantageuse, au moins le résidu phosphorylable T88 ou, alternativement, au moins le résidu phosphorylable S104 d'une telle transposase se trouve substitué par un résidu non phosphorylable. En particulier, au moins les résidus T88 et S104 sont substitués par des résidus non phosphorylables. Selon un deuxième aspect, la présente invention a trait à une séquence nucléotidique recombinante codant une transposase telle que décrite supra.
Une « séquence nucléotidique » ou un « acide nucléique » selon l'invention sont conformes à l'acception usuelle dans le domaine de la biologie. Ces deux expressions couvrent indifféremment les ADN et les ARN, les premiers pouvant être par exemple génomiques, plasmidiques, recombinants, complémentaires (ADNc), et les seconds, messagers (ARNm), ribosomaux (ARNr), de transfert (ARNt). De manière préférée, les séquences nucléotidiques et acides nucléiques de l'invention sont des ADN.
Selon un troisième aspect, la présente invention concerne un vecteur recombinant comprenant au moins une séquence nucléotidique recombinante codant une transposase conforme à l'invention.
De manière avantageuse, un tel vecteur recombinant permet l'expression de ladite séquence nucléotidique recombinante. Selon un quatrième aspect, la présente invention a pour objet une cellule hôte recombinante hébergeant au moins un vecteur recombinant tel que décrit ci-dessus.
Dans la mesure où les MLE ne présentent, à ce jour, aucune restriction d'hôte, une cellule hôte recombinante selon l'invention peut être aussi bien d'origine eucaryote que procaryote.
Il peut, par exemple et de manière non limitative, s'agir d'une cellule eucaryote provenant d'une levure, d'un champignon, d'une plante, d'un insecte (e.g., la drosophile), d'un rongeur ou d'un mammifère (e.g., le lapin).
Alternativement, une cellule convenant à la mise en oeuvre de l'invention peut provenir d'une bactérie (e.g., Escherichia coli).
Selon un cinquième aspect, la présente invention vise un procédé de production d'une transposase mutante, non phosphorylable, hyperactive, telle que décrite supra.
Selon un premier mode de mise en œuvre, un procédé conforme à l'invention comprend au moins : a) le clonage de la séquence nucléotidique recombinante codant la transposase mutante, non phosphorylable, hyperactive, dans un vecteur d'expression ; b) la transformation d'une cellule hôte avec ledit vecteur d'expression recombinant ; et c) l'expression de ladite séquence nucléotidique par ladite cellule hôte recombinante. L'ensemble des étapes mises en œuvre dans le cadre d'un tel procédé fait appel à des techniques classiques connues de l'homme du métier (voir par exemple, Sambrook et Russel, 2001).
En particulier, le terme « transformation » est ici revêtu d'un sens générique en ce qu'il couvre également, outre la transformation au sens strict, la transduction par un vecteur viral et la transfection, autant de techniques de biologie moléculaire parfaitement usuelles pour l'homme du métier.
Selon un deuxième mode de mise en œuvre, un tel procédé comprend en outre une étape préalable d'obtention de ladite séquence nucléotidique recombinante, par substitution, dans la séquence nucléotidique codant la transposase native correspondante, d'au moins un nucléotide d'un triplet ou codon codant un résidu phosphorylable, par un autre nucléotide, afin que le triplet résultant code un résidu non phosphorylable. Cette étape préalable relève des techniques de mutagénèse dirigée, connues de l'homme du métier (Ausubel et al., 1994).
Selon un troisième mode de réalisation du procédé objet de l'invention, une étape ultérieure de purification de ladite transposase est effectuée. De manière préférée, au sens de la présente invention, l'étape de purification susvisée consiste à purifier, par des méthodes conventionnelles usuelles pour l'homme du métier, la fraction protéique possédant l'activité enzymatique recherchée, et non l'enzyme elle-même. C'est précisément cette fraction protéique active ainsi purifiée que l'on appelle ici « enzyme pure » ou « transposase pure ». Selon cette définition, à l'issue de cette étape, la présence de substances contaminantes, y compris celle d'autres protéines, en quantité minoritaire n'est pas exclue, dès lors que l'activité transposase d'intérêt est préservée, et que seule cette activité est détectée. La détection de l'activité enzymatique d'intérêt peut être effectuée par des méthodes conventionnelles connues de l'homme du métier (Ausubel et al., 1994).
Lors de la mise en œuvre d'un procédé tel que susvisé, la cellule hôte est choisie parmi des cellules de procaryotes, par exemple de bactéries, et des cellules d'eucaryotes, par exemple de levures, champignons, plantes, insectes et mammifères. Selon un sixième aspect, la présente invention concerne des utilisations d'au moins une transposase mutante, non phosphorylable, hyperactive, telle que décrite supra, dans le domaine des biotechnologies.
Selon un premier mode de réalisation, une telle transposase est utilisée pour la transposition in vitro d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans une séquence d'ADN cible.
Selon un deuxième mode de réalisation, une utilisation conforme à l'invention est effectuée aux fins de la transposition in vivo d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans le génome de l'hôte. Alternativement, une transposase selon l'invention peut être utile pour préparer un médicament destiné à permettre la transposition in vivo d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans le génome de l'hôte.
La mise en œuvre d'une transposition in vitro ou in vivo relève des connaissances générales de l'homme du métier dans le domaine de l'invention (Ausubel et al., 1994 ; Craig et al., 2002).
Un « hôte » est ici entendu comme pouvant être un organisme, eucaryote ou procaryote, ou un tissu d'un organisme, ou encore une cellule d'un organisme ou d'un tissu.
Les figures suivantes sont fournies à titre purement illustratif et ne limitent en aucune façon l'objet de la présente invention.
Figure 1 : Séquence nucléotidique du transposon mos-1 (SEQ ID N°1 ) et séquence protéique de la transposase Mos-1 (SEQ ID N°2). Les sites putatifs de phosphorylation sont localisés de la manière suivante :
- cadre simple : site putatif de phosphorylation par la protéine kinase AMPc, GMPc dépendante ;
- cadre en pointillé : site putatif de phosphorylation par la protéine kinase C ;
- cadre double : site putatif de phosphorylation par la caséine kinase II. Les résidus représentés en clair dans la séquence (QTQ ; positions 87 à
89 de la séquence protéique SEQ ID N°2) correspondent au site putatif de phosphorylation par la famille des ATM kinases.
Les résidus cerclés sont les résidus Âsp impliqués dans la triade catalytique caractéristique des transposases de MLE (D,D34-35[D/E]).
Figure 2 : Schéma représentant la structure de la transposase de l'élément Mos-1.
N-term : domaine N-terminal responsable de la liaison aux ITR ;
C-term : domaine C-terminal responsable de la catalyse du transfert des brins d'ADN ; NLS : signal putatif de localisation nucléaire (ou internationalisation nucléaire) ; HTH : motif hélice-tour-hélice ; aa : acide aminé.
Les nombres indiquent les positions des acides aminés.
La triade catalytique caractéristique [D, D34 (D/E)] est signalée. Figure 3 : Représentation schématique du test de transposition.
A) : bactérie co-transformée avec le vecteur d'expression codant la transposase (Tnp) et le vecteur rapporteur de la transposition.
B) : Événement de transposition après induction du vecteur d'expression.
C) : Détermination de la fréquence de transposition. Figure 4 : « Dots » d'ARNm pBadR-Tnp hybrides avec :
- la sonde L27 (A) ; et
- la sonde Tnp (B).
Figure 5 : Graphique montrant la corrélation ARNm Tnp/Transposase en fonction des conditions de culture dans le système d'expression pBadR. Figure 6 : « Dots » d'ARNm pKK-Tnp hybrides avec :
- la sonde L27 (A) ; et
- la sonde Tnp (B).
Figure 7 : Graphique montrant la corrélation ARNm Tnp/Transposase en fonction des conditions de culture dans le système d'expression pKK. Figure 8 : Photographie d'un gel de protéines SDS-PAGE 10% des extraits protéiques (A) et autoradiogramme d'un retard sur gel des transposases en présence d'ITR 3' (B).
Piste 1 : Témoin pBadR Pistes 2 à 7 : Tnp issues du système pBadR-Tnp (2 : 1 % glucose, 3 : contrôle, 4 : 0,001% ara, 5 : 0,01% ara, 6 : 0,1% ara, 7 : 1% ara)
Piste 8 : Témoin pKK
Pistes 9 à 13 : Tnp issues du système pKK-Tnp (9 : contrôle, 10 : 0,5 mM
IPTG, 11 : 1 mM IPTG, 12 : 3 mM IPTG.13 : 6 mM IPTG) M : marqueur de taille précoloré (P7708S, New England BioLabs)
Figure 9 : Graphique représentant la fréquence de transposition et l'enrichissement en transposase, en fonction des conditions de culture dans le système d'expression pBadR.
Figure 10 : Graphique représentant la fréquence de transposition et l'enrichissement en transposase, en fonction des conditions de culture dans le système d'expression pKK.
Figure 11 : Représentation graphique selon Scatchard des expériences de saturation de liaison à l'ITR avec la MBP-Tnp produite en cellules d'insectes. Figure 12 : Représentation graphique selon Scatchard des expériences de saturation de liaison à l'ITR avec la Tnp eucaryote produite in vitro.
Figure 13 : Autoradiogramme d'un gel SDS-Page 10% acrylamide des différentes synthèses in vitro en présence d 'ATP-γ32P.
1 : sans ADN 2 : avec le vecteur pET-26b+
3 : avec le vecteur pET-Tnp (300ng)
Figure 14 : Représentation graphique selon Scatchard des expériences de saturation de liaison à l'ITR avec la MBP-Tnp déphosphorylée.
Figure 15 : Représentation graphique selon Scatchard des expériences de saturation de liaison à l'ITR avec la Tnp produite in vitro et déphosphorylée. Figure 16 : Autoradiogrammes et graphiques illustrant les résultats d'analyse en gel retard (A et C) et de transposition en bactérie (B et D) des transposases de Zhang et al. (2001) (A et B) et des transposases mutées sur la position T88 (C et D). WT : transposase sauvage
La partie expérimentale ci-après, appuyée par des exemples et des figures, illustre de manière non limitative l'invention.
1. Matériel et Méthodes
1.1 Description des vecteurs utilisés :
Le vecteur pBadR-Tnp (5,6 kb) permet l'expression de la transposase sous contrôle d'un promoteur faible, modulable, inductible à l'arabinose (Para) et réprimé en présence de glucose par l'intermédiaire de la protéine AraC (codée par ce vecteur). Le pBadR-Tnp porte un gène de résistance à l'ampicilline. Sa construction est détaillée au paragraphe 1.2.1. ci-dessous.
Le vecteur pKK-Tnp (5,6 kb) permet une expression forte de la transposase via un promoteur Plac inductible à l'IPTG. Le promoteur n'est pas modulable et présente une fuite d'expression naturelle. Le pKK-Tnp porte également le gène de résistance à l'ampicilline. La construction du vecteur est présentée au paragraphe 1.2.2. infra.
Le pBC 3K3 est un plasmide donneur de pseudo mariner Mos-1 (Augé-Gouillou et al, 2001). Il contient le gène de résistance à la kanamycine « OFF » (c'est à dire sans promoteur) bordé par deux ITR 3'. Ainsi, seules les bactéries qui auront effectué la transposition du pseudotransposon en aval d'un promoteur (promoteur « tagging ») seront sélectionnées sur boîtes LBkanamycine. Le vecteur porte un gène de résistance au chloramphénicol. Le pBS (3') porte l'ITR 3' clone au site Smal du pBS (Stratagene, La Jolla, Californie, Etats-Unis). Le pBS est identique au pBC, sauf qu'il porte un gène de résistance à l'ampicilline au lieu du chloramphénicol.
Le vecteur pET-Tnp (6,4 kb) (Augé-Gouillou et al, 2001 ) code la transposase sous contrôle du promoteur T7 et possède un gène de résistance à la kanamycine. Ce vecteur a été utilisé comme source d'ADN pour la transcription/traduction in vitro en lysat de réticulocytes pour produire une transposase eucaryote. Des bactéries BL21 , codant la T7 polymérase sous contrôle du Plac inductible à l'IPTG, ont été transformées avec le pET-Tnp pour produire la transposase procaryote dans le test de phosphorylation décrit ci-dessous.
Le vecteur pGEM®-T-Easy (Promega, Charbonnières, France) possède les amorces de séquençages Pu et pRev (Ausubel et al., 1994) et le gène de résistance à l'ampicilline. Il est conçu pour cloner des produits de PCR dans le gène LacZ, ce qui permet un criblage blanc / bleu des colonies bactériennes obtenues sur boite LBampicilline, en présence d'IPTG et de X-Gal. Il a été utilisé pour donner le pGEM-T (Tnp) (Augé- Gouillou et al, 2001) et le pGEM-T (L27) dont la construction est détaillée au paragraphe 1.2.3. ci-dessous.
1.2 Construction des vecteurs :
1.2.1 Préparation de l'ADN des vecteurs : Pour les différentes constructions, toutes les élutions d'ADN à partir d'un gel d'agarose ont été réalisées avec le kit Geneclean II (BIO 101 , UK). Toutes les minipréparations de plasmides à partir de culture bactérienne ont été effectuées avec le kit Wizard Plus Minipreps (Promega). 1.2.2 pBadR-Tnp :
Le pBadR-Tnp a été obtenu à partir du pBad 18 en deux étapes : o Clonage du RBS (Ribosome Binding Site) Le clonage d'un RBS dans le pBad 18 reconstitue la séquence suivante : 5' GAAGGAGTAcccgggGATC 3' (SEQ ID N°3)
Cette séquence correspond à un site consensus d'initiation de la traduction si le gène codant la transposase est clone dans un site Sma\ (en minuscules). Le RBS a été acheté sous forme de deux oligonucléotides simples brins complémentaires non phosphorylés. L'appariement des deux brins reconstitue la séquence suivante : 5" AATTC GAΓAΓCGAAGGAGTAC 3' (SEQ ID N°4) - 3' G CTATAGCΎTCCI 5' (SEQ ID N°5) L'extrémité 5' sortante correspond à un site EcoRI, l'extrémité 3' sortante à un site Kpn\, permettant le clonage du RBS dans le pBad18. Cette séquence apporte également un site unique EcoRV (en italique) qui permet de contrôler le clonage.
Les deux brins appariés ont été phosphorylés avec la T4 polynucléotide kinase (New England BioLabs, Beverly, MA, Etats-Unis). Le plasmide pBad 18 a été digéré par Kpn\ et EcoRI, puis déphosphorylé. Le RBS (15 ng) a ensuite été ligaturé au plasmide (25 ng) sur la nuit à 16°C en présence d'une T4 DNA ligase (Promega), afin d'obtenir le pBadR. Des bactéries compétentes E. coli MC1061 (souche dépourvue d'un transport actif de l'arabinose) ont été transformées avec le pBadR, sur boite LB (5 g NaCI, 5 g extrait de levure, 10 g de tryptone, 0,3 ml de NaOH 10N, qsp 1 L H2O) /ampicilline (100 μg/ml). Douze colonies résistantes à l'ampicilline ont été mises en culture pour extraire l'ADN plasmidique et analyser le plasmide par digestion EcoRV. Afin de vérifier quels étaient les plasmides qui avaient intégré un seul RBS, les ADN plasmidiques ont été séquences en utilisant le « DNA sequencing kit » de Perkin Elmer Biosystems (Courtaboeuf, France) et analysés sur un sequenceur automatique monolaser de type Licor (Science Tec, Parc d'Innovations des Ulysses, France). Le plasmide contenant un RBS unique a ensuite été utilisé pour cloner le gène codant la transposase.
o Clonage du gène codant la transposase : Le fragment codant la transposase (Tnp) a été préparé à partir du vecteur pGEM-T (Tnp) par digestion SnaBUHind W et élue sur gel 0,8% agarose (TAE 1X : 0,04 M Tris-acétate, 1mM EDTA, pH 8). Le plasmide pBadR obtenu précédemment a été digéré par Sma\/Hind\\\. Après électrophorèse sur un gel d'agarose, l'ADN du plasmide a été élue, puis ligaturé avec le fragment codant la transposase de Mos-1 (dite Tnp dans cette partie expérimentale), à raison de 25 ng de fragment pour 25 ng de vecteur. Le produit de ligation a été utilisé pour transformer des bactéries E. coli MC1061 qui ont ensuite été sélectionnées sur boîte LB-ampicilline (100 μg/ml). 12 clones résistants à l'ampicilline ont été mis en culture pour une extraction du plasmide. Les mini-préparations d'ADN ont été contrôlées par digestion EcoRV/H/r/c/III puis en électrophorèse sur gel 0,8% agarose (TAE 1X) afin de s'assurer qu'ils avaient intégré le gène codant la transposase.
1.2.3 pKK-Tnp :
Le fragment codant la transposase (Tnp) de mariner Mos-1 a été préparé à partir du pGEM-T (Tnp) par digestion Nco\IHind\\\ et élue sur gel. Il a été ligaturé avec le vecteur pKK-233-2 (Clontech, Ozyne, Saint- Quentin-en-Yvelines, France), ouvert par les mêmes enzymes, à raison de 10 ng de vecteur pour 40 ng de fragment Tnp, pour donner le pKK-Tnp. Des bactéries MC1061 ont été transformées avec le vecteur d'expression pKK-Tnp, étalées sur boîte LB-ampicilline (100μg/ml), 50mM CaCl2 et placées à 42°C, pour limiter les effets cytotoxiques de la transposase. 6 clones résistants à l'ampicilline ont été mis en culture dans les mêmes conditions pour extraire les plasmides. Les mini-préparations d'ADN ont été contrôlées par digestion Nco\/Hind\\\ sur gel 0,8% agarose (TAE 1X) afin de s'assurer qu'ils avaient intégré le gène codant la transposase.
1.2.4 Clonage de la sonde L27 : La séquence du gène codant la protéine ribosomale L27 d'E. coli a été obtenue sur le site Infobiogen (www.infobiogen.fr). Les amorces SEQ ID N°6 et SEQ ID N°7, pour l'amplification du gène par réaction de polymérisation en chaîne ou PCR (pour « Polymerase Chain Reaction »), ont été dessinées avec le logiciel OLIGOV2, puis commandées sous forme d'oligonucléotides simples brins.
SEQ ID N°6 : 5'-ATGGCACATAAAAAGGCTG-3' SEQ ID N°7 : 5'-TTATTCAGCTTCGATGCT-3' Le gène L27 a été amplifié par la technique de PCR à partir d'ADN génomique d'Eco//. Les produits d'amplification ont été élues après électrophorèse sur gel d'agarose 0.8%, puis ligaturés dans le vecteur pGEM®-T Easy avant d'être clones. Des bactéries E.coli compétentes (DH5α) ont été transformées avec les mélanges de ligation, puis étalées sur boites LB-ampicilline (100 μg/ml) contenant du X-Gal (2%) et de l'IPTG (1 mM). 2 clones blancs résistants à l'ampicilline ont été mis en culture pour extraire l'ADN plasmidique. Après contrôle du clonage par une digestion EcoRI et électrophorèse sur gel 0,8% agarose (TAE 1X), le plasmide a été séquence grâce au « DNA sequencing kit » (Perkin Elmer Biosystems) et analysé sur un sequenceur automatique monolaser de type Licor afin de vérifier la conservation de la séquence avant marquage.
1.2.5 Marquage des sondes L27 et Tnp :
La sonde L27 a été marquée par PCR radioactive à partir de la matrice pGEM-T (L27) avec les amorces pU et pRev (qui encadrent le site de clonage [Ausubel et al., 1994]) en présence de d'ATP-γ32P. La sonde marquée est séparée des dNTP libres par chromatographie d'exclusion par la taille sur colonne Sephadex G50 (TE 1X : 10mM tris pH 8, 1mM EDTA). La colonne a été lavée par fraction de 200 μl et la sonde repérée au compteur MIP 10 (Eurisys Mesures, Saint-Quentin-en-Yvelines, France).
La sonde Tnp a été marquée par la technique de « Random Priming », c'est à dire la synthèse d'ADN après appariement d'hexamères aléatoires. L'élongation a été effectuée avec le fragment de Klenow de la DNA polymérase en présence de d'ATP-γ32P. La sonde a été éluée par chromatographie d'exclusion par la taille sur colonne Sephadex G50 (TE 1X).
1.3 Induction de bactéries contenant le vecteur codant la transposase
Avec le pBadR-Tnp : Avec le pKK-Tnp :
1 % de Glucose • Contrôle (sans IPTG)
Contrôle (0% glc, 0% ara) • 0,5 mM IPTG
0,001 % arabinose • 1 mM IPTG
0,01 % arabinose • 3 mM IPTG
0,1 % arabinose • 6 mM IPTG 1 % arabinose
Protocole d'induction :
À partir d'une culture saturée de bactéries E. coli MC1061 contenant le vecteur d'intérêt (pBadR-Tnp ou pKK-Tnp), 50 ml de LB ont été ensemencés au 1/100 et mis en culture pendant 3h à 31 °C sous agitation (250 rpm) en présence de 1 % glucose (inhibiteur du Para) dans le cas du pBadR-Tnp. La culture a ensuite été centrifugée pendant 15 min à 3000 rpm et le culot a été repris dans 2,5 ml de LB, afin de le laver et d'éliminer le glucose. Les bactéries contenant le pKK-Tnp ont si même traitement. Les tubes d'induction (2,5ml LB contenant de l'arabinose ou de l'IPTG selon les conditions ci-dessus) ont été ensemencés volume à volume, et mis en culture pendant 3h à 31 °C (volume final de 5 ml). Au bout de trois heures, on a effectué l'extraction des protéines et des ARNm. Le même protocole a été suivi pour les bactéries contenant les plasmides pBadR et pKK, afin de produire des ARN et des protéines dépourvues de Tnp (témoins négatifs).
1.4 Dosage des ARNm
1.4.1 Extraction des ARN bactériens :
L'extraction des ARNm a été réalisée à 4°C, en absence de RNase afin d'éviter leurs dégradations. Suite à l'induction, les cultures bactériennes ont été centrifugées 10 min, à 12 000g, à 4°C. Le surnageant a été éliminé, le culot repris dans 5ml de «protoplasting buffer» (15 mM Tris pH 8, 15% sucrose, 8 mM EDTA). 40μl de lysosyme (50 mg/ml) ont été ajoutés et le mélange a été incubé 15 min dans la glace. Après une centrifugation de 5 min à 6000g, à 4°C, puis élimination du surnageant, le culot a été repris dans 250 μl de tampon de lyse (1 ,5% SDS, 1 mM citrate de sodium, 10 mM NaCI, 10 mM Tris pH 8).
Après transfert du lysat dans des tubes de 1 ,5 ml, 7,5 μl de DEPC ont été ajoutés ; les mélanges ont ensuite été incubés 5 min à 37°C. Les tubes ont été refroidis dans la glace et mélangés par inversion avec 1/2 volume d'une solution saturée en NaCI. Après une incubation dans la glace de 10 min, les tubes ont été centrifugés 10 min à 12 000g. Les surnageants ont été transférés dans des tubes de 1 ,5 ml, et les acides nucléiques ont été précipités avec 3 volumes d'éthanol (EtOH) 100% froid. Les tubes ont été placés pendant 30 min à -80°C ou à -20°C pendant 16h. Les tubes ont ensuite été centrifugés 15 min à 12000g, à 4°C. Les surnageants ont été éliminés, les culots lavés avec 500μl d'EtOH 70%, puis séchés. Les culots (repris dans 30 μl H2O DEPC) ont été soumis à l'action de la Dnasel pendant 1h30 à 37°C. Après une extraction phénol-chloroforme et précipitation, les culots d'ARN ont été lavés et séchés, puis repris dans 50μl d'H2θ DEPC. On a contrôlé la qualité de l'extraction avec 5 μl d'échantillon sur gel 0,8% agarose (TAE 1X). Les ARN extraits ont été conservés à -80°C.
14.2 Analyse des ARN :
Les quantités d'ARN totaux ont été dosées à l'aide d'un spectro photomètre à fluorescence.
Chaque extrait a été dilué au centième dans 500 μl d'eau. On a mesuré l'absorbance à 260 nm (longueur d'onde d'absorption maximale des acides nucléiques) et à 280 nm (longueur d'onde d'absorption des acides aminés comme la tyrosine). Si le rapport des absorptions 260 nM sur 280 nM était compris entre 1 ,8 et 2,1 on pouvait quantifier la quantité totale d'ARNm extrait, à raison de 40 μg pour une mesure d'absorbance à 260 nm dans 1 ml. Pour quantifier les ARNm de transposase, une quantité constante d'ARN totaux (qui a été calibrée à l'aide d'un témoin ARN, l'ARN codant la protéine ribosomale L27, dont la quantité ne variait pas au cours des expériences) a été déposée sur une membrane d'hybridation. Après fixation thermique (15 min à 80°C), la membrane a été pré-hybridée avec du tampon Church (7% SDS, 1 mM EDTA, 0,5 M NaPO4 pH 7,2) afin de limiter des hybridations non-spécifiques par saturation de la membrane, pendant 1h à 65°C.
Hybridation avec la sonde contrôle L27 Le tampon de pré-hybridation a été remplacé par du tampon « Church » neuf auquel on a ajouté 6000 coups par minute (cpm) (au compteur MIP 10) de la sonde marquée L27. La membrane a été hybridée sur la nuit à 65°C. La membrane a ensuite été lavée 1 h avec un tampon 3X SSC (20X SSC : 3M NaCI, 0,3 M citrate de sodium) 10,1% SDS puis avec un tampon 1X SSC/0,1 % SDS. La présence des ARNm L27 a été détectée et quantifiée au Direct Imager (Packard, Etats-Unis) en cpm. Une quantité constante d'ARNm L27 pour chaque dépôt devait permettre de confirmer la quantité constante d'ARN totaux déposés. Dans le cas contraire, elle devait permettre de corriger les quantités d'ARNm Tnp.
La membrane a ensuite été déshybridée par trois rinçages avec une solution 1 % SDS portée à ebullition. La membrane a alors été de nouveau mise en pré-hybridation pendant 1 h à 65°C avant une nouvelle hybridation.
Hybridation avec la sonde Tnp Le tampon de pré-hybridation a été remplacé par du tampon «
Church » neuf auquel on a ajouté 6000 cpm de la sonde Tnp. La membrane a été hybridée sur la nuit à 65°C. La membrane a ensuite été rincée une heure avec un tampon 3X SSC/0,1% SDS puis avec un tampon 1X SSC/0,1% SDS. La présence des ARNm-Tnp a été détectée au Direct Imager : la quantité d'ARNm-Tnp présente dans les dépôts était exprimée en cpm.
1.5. Dosage des protéines
1.5.1 Extraction des protéines :
Des bactéries ont subi le même protocole d'induction que celui utilisé pour les extractions d'ARNm. Les cultures ont été centrifugées 10 min à 12 000g à 4°C. Les culots bactériens ont été repris dans 500 μL d'un tampon 20 mM Tris pH 9, 100m M NaCI, 1 mM DTT, et conservés à - 20°C sur la nuit. Après sonication (1 « puise » de 30s à 25 W) et centrifugation à 10 000g, 4°C, pendant 15 min, les surnageants protéiques ont été prélevés puis quantifiés par un dosage de Bradford par rapport à une concentration d'albumine de sérum bovin (BSA). Après dosage, les extraits protéiques ont été conservés à -20°C.
1.5.2. Analyse des protéines en SDS-PAGE :
Préparation des échantillons et électrophorèse :
Une quantité constante (12 μg) de protéines a été analysée. Un volume de tampon de charge a été ajouté à chaque extrait, l'ensemble a été dénaturé à 100°C pendant 5 min. Les échantillons ont été déposés dans un gel
SDS-PAGE 10% acrylamide [375 mM Tris HCI pH 8,8, 0,1% SDS,' 10 % acrylamide (30 : 0,8)] 10%. Après une électrophorèse sur 16h à 50 V, le gel a été fixé dans une solution 2% H3PO4-50% CHtaOH sous agitation douce pendant 2 à 12h.
Coloration du gel au bleu de Coomassie colloïdal :
Le gel a été lavé dans l'eau 3 fois 30 min. Cette étape a été répétée avec une solution 2% H3PO4.
Le gel a ensuite été placé dans une solution 17% CH3OH, 2% H3PO4 et 15% (NH4)2S04, pendant une heure. Le gel a alors été coloré sur la nuit dans une solution fraîche identique, à laquelle a été rajouté 0,2% de bleu de Coomassie colloïdal. Le gel coloré a été numérisé avec un scanner puis séché.
1.5.3. Analyse en retard sur gel de l'activité des transposases extraites :
Cette méthode permet de tester l'activité de liaison à l'ITR 3' (ITR optimisé pour la fixation de la Tnp) des protéines produites. L'ITR 3' a été isolé du plasmide pBS(3') par digestion EcoR\/Xba\, purifié sur un gel d'agarose NuSieve 2% (FMC products, Etats-Unis), élue et quantifié. 100 ng d'ITR 3' ont été marqués avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase en présence de dATP. Après une extraction phénol- chloroforme et précipitation, le culot a été repris dans 40 μl d'eau pour obtenir l'ITR à la concentration de 50 nM.
5 μg d'extraits bruts ont été incubés, avec l'ITR 3' marqué, dans les conditions suivantes : 1 nM de sonde, 1 μg d'ADN de sperme de saumon soniqué, 5 mM MgC , 5% glycérol, 20 mM Tris pH9, pendant 15 min dans la glace. Chaque échantillon a été déposé sur un gel 9% hydrolink (Long Ranger, TEBU, Le Perray en Yvelines, France) (TBE 0,25X : 22,25 mM Tris, 22,25 mM acide borique, 2,5 mM d'EDTA disodique dihydraté). Après électrophorèse et séchage du gel, le retard a été quantifié au Direct Imager (Packard). Une autoradiographie du gel a ensuite été effectuée.
1.6. Test de transposition
Conditions d'induction : Avec le pBadR-Tnp : Avec le pKK-Tnp :
1 % de Glucose Contrôle Contrôle 0,5 mM IPTG
0,001% arabinose 1 mM IPTG 0,01% arabinose 3 mM IPTG 0,1% arabinose 6 mM IPTG 1 % arabinose
Le principe du test de transposition est illustré sur la figure 3.
Des bactéries compétentes MC1061 ont été co-transformées avec le plasmide pBC 3K3 (porteur d'un pseudo-mar/ner rapporteur de la transposition et du gène de résistance au chloramphénicol) et avec le vecteur inductible codant la transposase pBadR-Tnp ou pKK-Tnp (porteur du gène de résistance à l'ampicilline) (Figure 3A). La sélection des bactéries a été effectuée sur ampicilline et chloramphénicol afin de vérifier la présence de deux plasmides. Une co-transformation a également été réalisée avec les plasmides témoins pBadR et pKK. Les bactéries E. coli MC1061 , contenant le vecteur rapporteur pBC3K3 et celui codant la transposase, ont été mises en culture, à 42°C, dans 2,5 ml de LB-ampicilline (100 μg/ml) chloramphénicol (20 μg/ml) / 50 mM CaCI2 sur la nuit (conditions limitant l'activité de la transposase). La culture a été titrée sur boîte LB (10 μl d'une dilution permettant un comptage correct), et sur boîte LB-kanamycine (100 μg/ml) (50 μl de la culture saturée). 2,5 ml de LB (contenant de l'arabinose ou de l'IPTG comme indiqué ci-dessus) ont été ensemencés au 1/100 et cultivés pendant 3h, à 31 °C (température optimum de fonctionnement de la transposase) et sous agitation à 250 rpm (figure 3B). Après 3 heures d'induction, la culture a été étalée sur boîte LB (titration des bactéries) et sur boîte LB-kanamycine (énumération des événements de transposition) (figure 3C). Les boîtes ont été placées à 37°C sur la nuit. Le lendemain, on a compté les colonies sur les boîtes LB et LB-kanamycine, puis on a calculé la fréquence de transposition, égale au nombre total de bactéries résistantes à la kanamycine sur le nombre total de bactéries.
1.7. Expériences de saturation de la liaison à l'équilibre : test de Scatchard Le principe de ce test est de déterminer l'affinité (Kd) de la transposase produite en système eucaryote pour l'ITR 3' (ligand), grâce à des expériences de saturation de la liaison à l'équilibre en retard sur gel. Les résultats sont représentés selon la méthode de Scatchard. Pour une quantité constante d'extraits protéiques, on a fait varier la quantité d'ITR 3' marqué dans une gamme de concentration encadrant le Kd. Après une incubation de 15 min dans la glace (réalisée dans des conditions identiques à celles des expériences de retard sur gel), les complexes ITR- protéines ont été déposés sur un gel natif 9% acrylamide (Long Ranger, TEBU) (TBE 0.25X). Après électrophorèse et séchage, le gel a été analysé au Direct Imager (Packard). La quantité d'ITR liée à la protéine et la quantité totale d'ITR ont été mesurées en coups par min (cpm). Pour déterminer le coefficient de dissociation (Kd) :
La quantité totale d'ITR lié à la transposase (B) a été soustraite de la quantité totale d'ITR présente (T) pour donner la quantité d'ITR libre (F). Le rapport B/F exprimé en fonction des nM d'ITR liés (nM B) a donné une droite dont la pente est -1/Kd.
Ce test a été effectué avec une protéine de fusion, la MBP-Tnp (donnée par le Dr S. Tourne) produite en cellules d'insectes grâce à un vecteur baculovirus et avec la transposase produite dans un système de transcription/traduction in vitro eucaryote (TNT® T7 Quick Coupled Transcription/Translation System, Promega) avec le vecteur pET-Tnp. Ce test a également été effectué avec la Tnp et la MBP-Tnp (issues de cellules eucaryotes) ayant subi une déphosphorylation de 30 min à 30°C avec la phosphatase d'intestin de veau (CIP).
1.8. Tests de phosphorylation
1.8.1. Test chez les procaryotes :
À partir d'une pré-culture de bactéries BL21 contenant le vecteur pET-Tnp, 25 ml de LB ont été ensemencés au 1/100 en présence de phosphore inorganique (PiP33) pendant 3 h à 37°C. La synthèse de la transposase a ensuite été induite en présence de 1mM IPTG pendant trois heures à 37°C. Les protéines extraites à partir de cette culture ont été analysées sur un gel SDS-PAGE 10%. Après une électrophorèse de 16 heures à 50V, le gel a été coloré au bleu de Coomassie colloïdal. Après séchage, le gel a été mis en cassette pour autoradiographie, afin de visualiser les protéines phosphorylées.
1.8.2. Test chez les eucaryotes : Le plasmide pET-Tnp a été utilisé dans un système de transcription/traduction in vitro eucaryote (lapin) (TNT® T7 Quick Coupled Transcription/Translation System, Promega) pour permettre la synthèse de la transposase, identique à celle produite précédemment chez les procaryotes. Ce système permet la phosphorylation des protéines. L'éventuelle phosphorylation de la transposase devait être visualisée grâce à l'ajout d'ATP-γ^P pendant la synthèse.
0,5 à 1 μg de pET-Tnp ont été incubés pendant 90 min à 30°C avec 40 μl de mix TNT en présence d'ATP-γ32P. 5μl du mélange a été dénaturé avec un même volume de tampon de charge, puis déposé dans un gel SDS-PAGE 10% acrylamide. Après électrophorèse, le gel a été coloré au bleu de Coomassie colloïdal puis séché. On a autoradiographié le gel pour révéler la présence de la protéine phosphorylée.
2. Résultats
Le transposon mariner Mos-1 présente une faible activité de transposition dans son hôte naturel (D. mauritiana), comparativement à l'élément P (Rubin et al, 1982). Pour pouvoir analyser toutes les étapes de la transposition de mariner Mos-1 dans un système plus simple que les cellules eucaryotes, un modèle d'étude en bactéries a été mis au point. Ce modèle a révélé que la transposition d'un élément Mos-1 porteur de deux ITR de type 3' était 10 000 fois plus efficace que celle d'un élément en configuration « naturelle », c'est-à-dire porteur d'un ITR 5' et d'un ITR 3'. Cette différence est observée chez les procaryotes mais pas chez les eucaryotes, comme l'ont montré les travaux réalisés chez la drosophile par le Dr P. Atkinson (University California Riverside) et en cellules HeLa par le Dr S. Tourne (Université de Tours) (communications personnelles). Les résultats obtenus dans ce cadre sur les cellules eucaryotes ont révélé une très faible activité de transposition, avec les deux éléments mariner (3' / 3' et 5' / 3'). Afin de comprendre pourquoi la transposase de mariner Mos-1 se comporte différemment en système procaryote, les étapes limitant l'activité de la transposase chez les eucaryotes ont été identifiées. Puis, les différences entre la transposase procaryote et eucaryote à l'origine de la réduction d'efficacité de la transposition lorsqu'elle est produite en système eucaryote ont été déterminées. Pour cela, deux étapes précoces de la transposition ont été testées: la production de protéine et la liaison à l'ITR. Enfin, un mode de régulation possible de la transposase de Mos-1, la phosphorylation a été testé.
2.1. L'Inhibition de la transposition par surproduction de la transposase
Lohe et Hartl (1996) ont montré que la fréquence de transposition diminue chez les eucaryotes lorsque la transposase de mariner Mos-1 est surexprimée. Ce phénomène a été appelé OPI pour « Over Production Inhibition ». Dans ce qui suit, l'on utilisera l'expression d'Inhibition par Surproduction (IPS).
Dans une première série d'expériences, on a voulu savoir si la transposase produite en système bactérien était soumise à l'IPS. Pour cela, deux systèmes d'expression ont été utilisés afin d'analyser les variations de la fréquence de transposition de mariner Mos-1 en fonction de la quantité de transposase présente dans les bactéries. Le vecteur pBadR-Tnp est un système d'expression faible où la transposase est sous le contrôle d'un promoteur inductible à l'arabinose (Para) et modulable, c'est-à-dire que la quantité de protéine produite est fonction de la quantité d'inducteur. Le pKK-Tnp est un système d'expression fort où la transposase est sous contrôle d'un promoteur inductible à l'IPTG (Plac) et non modulable.
2.1.1. Corrélation niveau d'induction/quantité d'ARNm/quantité de transposase : Afin de valider les vecteurs d'expression, on s'est assuré que les quantités d'ARNm Tnp et de protéines Tnp étaient bien corrélées aux conditions d'induction. Le pBadR-Tnp a été cultivé en absence d'inducteur (niveau de contrôle), en présence de glucose (répresseur du Para) et avec une gamme de 0,001 % à 1 % d'arabinose (inducteur du Para). Le pKK- Tnp a été cultivé en absence d'inducteur (niveau de contrôle) et en présence d'une gamme de 0,5 mM à 6 mM IPTG (inducteur du Plac).
1 ) Caractérisation des ARNm Après induction et extraction, les ARNm ont été hybrides avec une sonde contrôle de la protéine ribosomique L27 afin de calibrer les quantités d'ARN extraits dans les différentes conditions de culture, puis avec une sonde transposase afin de quantifier le taux d'ARNm-Tnp (figures 4 et 6) en cpm. Les quantités d'ARNm-Tnp détectées (converties en pourcentage par rapport à la quantité maximale détectée) sont représentées (axe des Y) en fonction des différentes conditions de culture (axe des X) sur les figures 5 et 7.
Analyse du système d'expression pBadR-Tnp :
Dans le système d'expression faible (pBadR), les ARNm transposase étaient absents chez les bactéries contenant le vecteur témoin pBadR. Ils étaient en revanche présents chez les bactéries contenant le vecteur d'expression pBadR-Tnp : les plus faibles quantités d'ARNm-Tnp ont été détectées en absence d'arabinose ou en présence de glucose, et de plus fortes quantités ont été observées à toutes les conditions d'induction avec une quantité maximale d'ARNm-Tnp pour 0,1 % arabinose (figures 4 et 5). Ces résultats indiquaient que le promoteur Para n'était pas complètement réprimé par le glucose et qu'il présentait une fuite d'expression en absence de glucose/arabinose dans les conditions de culture ici décrites. La quantité d'ARNm codant la transposase suivait la gamme d'inducteur, sauf pour le point à 1 % arabinose. La corrélation entre la quantité d'ARNm-Tnp et les conditions d'induction dans le système pBadR a montré que ce système d'expression était en adéquation avec le fonctionnement connu du promoteur inductible à l'arabinose (Para). Seul le point d'induction à 1 % arabinose se traduisait par une diminution de la quantité d'ARNm de transposase. Cette différence pouvait être expliquée par la forte concentration d'arabinose utilisée pour l'induction, qui devait saturer voire inhiber le système d'induction. Un autre phénomène pouvait également expliquer ce résultat : une répression du système par diminution du nombre de copies du plasmide pBadR-Tnp en présence de forte concentration en arabinose. La présence d'ARNm-Tnp en condition glucose (répresseur du Para) a montré que le promoteur n'était pas totalement verrouillable, ce qui avait déjà été montré par Guzman et al. (1995). De plus, les bactéries ont été cultivées dans un milieu riche (LB) dont la composition exacte n'est pas connue (extraits de levure et tryptone), le milieu pouvait interagir avec le fonctionnement normal du promoteur, notamment vis-à-vis de l'expression du gène AraC codant pour le répresseur du Para.
Analyse du système d'expression pKK-Tnp :
Dans le système d'expression fort (pKK), les ARNm codant la transposase étaient absents chez les bactéries contenant le vecteur témoin pKK et présents pour les bactéries contenant le vecteur pKK-Tnp : faiblement en absence d'inducteur, fortement en présence d'IPTG. La quantité maximale était détectée dès 0,5mM IPTG (Figure 7). En système d'expression fort (pKK-Tnp), la quantité d'ARNm-Tnp synthétisée reflétait là encore le fonctionnement connu du promoteur Plac inductible à l'IPTG. Ce promoteur, en absence d'inducteur, n'était pas totalement réprimé, ce qui se traduisait par une synthèse d'ARNm-Tnp (Figures 6 et 7). En revanche, en présence d'IPTG, le promoteur était actif, ce qui se traduisait par une forte expression : quelle que soit la concentration d'IPTG, la quantité d'ARNm-Tnp demeurait constante. 2) Analyse des protéines :
Les protéines ont été obtenues dans les mêmes conditions que les ARN. Elles oni été analysées en SDS-PAGE (Figure 8A). L'image numérique du gel a permis de calculer le pourcentage de transposase dans les différents extraits grâce au logiciel Molecular Analyst (Biorad, Ivry sur Seine, France). Dans un même temps, l'activité de liaison à l'ITR 3' des transposases obtenues dans les différents extraits a été testée, par des expériences de retard sur gel (figure SB). Les graphiques (Figures 9 et 10) représentent le pourcentage de transposase dans les extraits (quantités relatives) (axe des y) en fonction des différentes conditions d'induction (axe des x). Les taux d'ARNm Tnp y ont été replacés afin de corréler ARNm et protéine.
Analyse du système d'expression pBadR-Tnp : Les protéines extraites des bactéries contenant le vecteur témoin pBadR ne contenaient pas de transposase comme le montre le gel de protéine (Figure 8A, piste 1) et l'analyse en retard sur gel (Figure 8B, piste 1). Les extraits obtenus à partir de bactéries contenant le vecteur pBadR- Tnp (Figure 8A, pistes 2 à 7) contenaient de très faibles quantités de transposase en absence d'inducteur (2,42 % de l'extrait brut, piste 3) ou en présence de glucose (1 ,04 % de l'extrait brut, piste 2). Les quantités obtenues en présence d'inducteur étaient légèrement plus élevées (2,62 % à 3,1 % de l'extrait brut, pistes 4 à 7). La figure 5 montre que la quantité de transposase était bien corrélée à la quantité d'ARNm Tnp, sauf pour le point d'induction le plus fort (1% arabinose) où la quantité de protéine augmentait alors que la quantité d'ARNm diminuait. Ceci pouvait être expliqué par l'accumulation, en début d'induction, des transposases synthétisées avant que la quantité d'ARNm ne soit régulée. L'analyse en retard sur gel (Figure 8B) montre qu'il n'y avait aucun retard détectable, même pour de fortes concentrations d'extraits bruts et pour de fortes quantités d'inducteur. Les quantités de transposases produites avec le vecteur d'expression pBadR-Tnp étaient donc très faibles, ce qui était en accord avec l'activité du promoteur inductible à l'arabinose, et pouvait donc expliquer l'absence de signal lors des expériences de retard sur gel. Seul le test de transposition (test biologique) pouvait permettre de confirmer ou non l'activité des transposases produites avec ce système.
Analyse du système d'expression pKK-Tnp :
Les protéines extraites des bactéries contenant le vecteur témoin pKK ne contenaient pas de transposase, comme l'indique le gel de protéine (piste 8 de la figure 8A) et l'analyse en retard sur gel (piste 8 de la figure 8B). Les extraits obtenus à partir de bactéries contenant le vecteur pKKTnp (figure 8A, piste 9 à 13) contenaient de faibles quantités de transposase en absence d'IPTG (2,37 % de l'extrait brut, piste 9) et de fortes quantités de transposase en présence d'IPTG (8,48 % à 10,25 % de l'extrait brut, piste 10 à13). La figure 7 montre le taux d'ARNm-Tnp synthétisé et de transposase produite en fonction des conditions d'induction : la quantité de Tnp produite présentait la même évolution que la quantité d'ARNm, la quantité minimum était obtenue en absence d'inducteur, le maximum quel que soit la quantité d'inducteur. L'activité de liaison à l'ITR était fortement détectée en retard sur gel lorsque la quantité de transposase était importante (pistes 10 à 13 de la figure 8B). La transposase de l'élément mariner Mos-1 produite en système pKK-Tnp semblait toujours active, quelles que soient les conditions d'induction (figure 8B). De fortes quantités de transposase ne semblaient donc pas affecter la capacité à se lier à l'ITR 3'.
Ces premiers résultats permettaient de conclure à une corrélation quantités d'ARN-Tnp produits/quantité de transposases produites dans les deux systèmes d'expression. 2.1.2. Corrélation quantités de transposases /fréquences de transposition : Le test de transposition a été réalisé dans les mêmes conditions que celles qui avaient permis l'obtention des protéines et des ARNm. La seule différence était la présence supplémentaire dans les souches bactériennes d'un vecteur rapporteur de la transposition (pBC 3K3). Ce test de transposition permettait de savoir si une augmentation de la quantité de transposase se traduisait par une diminution de la fréquence de transposition, comme on l'attendait si la transposase procaryote était soumise à l'IPS.
Analyse du système d'expression pBadR-Tnp :
L'analyse de la production de transposase a montré que la protéine était présente dans nos cultures, y compris en absence d'inducteur (arabinose) ou en présence de répresseur (glucose). La transposition débutait même en absence d'induction (figure 9, conditions glucose et contrôle). Cela confirmait que, même en faible quantité, la transposase possédait une forte activité. En effet, pour une quantité minimale de transposase (1 ,04 % de l'extrait brut en condition glucose), la fréquence de transposition était de 26.10"5. Pour un enrichissement en transposase de 2,62 % de l'extrait brut (point d'induction 0,001 % arabinose), la fréquence de transposition, de 68.10"5, était maximale, soit une faible augmentation d'un facteur 2,5. Pour les points d'induction de 0,01 % à 1 % arabinose, la fréquence de transposition demeurait à un plateau en dépit d'un faible enrichissement en transposase par rapport au point d'induction 0,001 % arabinose.
Les expériences de transposition dans le système pBadR-Tnp indiquaient donc que la transposase même produite en faible quantité, était toujours active. De plus, la fréquence maximale de transposition était atteinte dès le premier point d'induction (0,001 % arabinose), puis atteignait un plateau pour les points d'induction suivants. L'Inhibition Par Surproduction (IPS) n'était donc pas observée dans le système pBadR- Tnp, ce qui semblait normal étant donné le peu de transposase produite.
Analyse du système d'expression pKK-Tnp : L'analyse de la production de protéine a montré que la transposase était produite quelles que soient les conditions de culture (figure 7, pistes 9 à 13). La figure 10 représente la fréquence de transposition en fonction des conditions d'inductions. Les enrichissements en transposase ont été ajoutés afin de les corréler avec les fréquences de transposition. Pour une quantité minimale de transposase (en absence d'induction), la fréquence de transposition était de 8.10"5. La fréquence maximale de transposition était de 59.10"5 pour un enrichissement en transposase de 8,48 % (correspondant au premier point d'induction 0,5mM IPTG), puis atteignait un plateau pour des quantités de transposase variant de façon négligeable (8 à 10 % d'extraits bruts pour les points d'induction suivants). Ces résultats indiquaient donc une saturation du système de production dès le premier point d'induction, ce qui correspondait au fonctionnement du promoteur fort inductible à l'IPTG. Dans le système pKK-Tnp, le phénomène d'IPS n'était pas observé, malgré la présence de forts taux de transposase dans les extraits bruts.
2.1.3. Conclusion sur l'IPS :
La quantité de transposase produite dans le système d'expression pBadR-Tnp était faible mais suffisante pour avoir une transposition efficace, même en absence d'inducteur. En système pKKTnp, la production de transposase représentait jusqu'à 10 % de protéine bactérienne et permettait une détection de son activité par un test biochimique (gel retard). Mais cette plus forte production ne se traduisait pas par une fréquence de transposition plus élevée par rapport au système pBadR. Dès le premier point d'induction (0,5 mM IPTG), la fréquence de transposition était maximale (59.10"5) et analogue à celle obtenue avec le pBadR-Tnp (68.10"5) pour le point d'induction 0,001 % arabinose. Cette fréquence stagnait pour les autres points d'induction. Contrairement au système eucaryote, l'ensemble de ces résultats semblait indiquer qu'en système procaryote, aucune inhibition par surproduction n'était détectée, ce qui devait se traduire par une chute de la fréquence de transposition.
2.2. Affinité de la transposase pour l'ADW
Il existait donc une première différence de comportement entre la transposase de l'élément mariner Mos-1 produite en système eucaryote et procaryote : l'IPS ne semblait intervenir que dans le système eucaryote. Dans le but de trouver d'autres niveaux de régulation possible de la transposition, la qualité de liaison entre l'extrémité 3' du transposon mariner Mos-1 (ITR 3') et la transposase a été testée. En effet, cette étape est la première mise en jeu lors du processus de transposition. Pour déterminer l'affinité de la transposase pour l'ITR (mesure de Kd), des expériences de saturation de la liaison à l'équilibre ont été réalisées et analysées en retard sur gel (figures 11 et 12, encadrés). Ces expériences ont été réalisées avec une quantité constante de transposase en présence d'une gamme de concentration de ligand (donc une gamme de concentration d'ITR 3'). Les résultats obtenus ont été représentés selon Scatchard. Dans ce type de représentation, le rapport de la quantité de ligand (ITR) lié sur la quantité de ligand libre (B/F) est exprimé en fonction de la concentration de ligand lié (nM B) et se visualise par une droite d'équation y = ax + b, où a = -1/Kd.
Ces tests, déjà effectués sur la transposase produite en système procaryote, ont permis de calculer un coefficient de dissociation (Kd1) de 0,6 nM pour la liaison à l'ITR 3' (publication soumise). Un deuxième Kd (Kda = 10 nM) mesurait la liaison de l'ITR en tant que cible d'intégration. Le même type de test a été réalisé avec deux transposases mariner Mos- 1 produites en système eucaryote : la protéine de fusion MBP-Tnp donnée par le Dr S. Tourne (Tnp couplée avec une protéine permettant sa purification mais n'ayant pas d'impact sur son activité) produite en cellules d'insectes grâce à un système baculovirus et extraite du noyau des cellules, et la transposase produite en lysat de réticulocytes (lapin) grâce au kit TNT ® T7 Quick Coupled Transcription/Translation System (Promega).
La première expérience a été effectuée avec la MBP-Tnp dans les mêmes conditions que celles qui ont été réalisées avec la transposase d'origine bactérienne, c'est-à-dire pour une gamme de concentration d'ITR 3' de 0,05 nM à 10 nM. Les résultats ont montré que ces conditions n'étaient pas adaptées pour déterminer un Kd (la gamme de concentration de ligand devait " encadrer le Kd "), et donc que la protéine eucaryote se comportait différemment de la transposase procaryote.
En conséquence, la gamme d' ITR 3' a été augmentée en se plaçant entre 2nM et 50nM. La figure 11 représente le rapport de sonde liée sur sonde libre (B/F) en fonction de la concentration de sondes liées (nM B), qui se traduisait par une seule droite dont la pente était -0,0256. Le Kd étant l'inverse de la pente, sa valeur était de 39 nM. Un autre Scatchard a été effectué dans les mêmes conditions avec la transposase produite à partir du pET-Tnp avec le système TNT® permettant la transcription/traduction in vitro dans des lysats de réticulocyte de lapin. Le résultat obtenu (figure 12) a montré un profil identique à celui obtenu avec la transposase produite en cellules d'insectes et présentait un Kd unique de 74 nM. Ce résultat indiquait que la transposase produite in vitro en lysat de réticulocytes avait une affinité de liaison à l'ITR 3' similaire à une transposase produite in vivo en cellules d'insectes. Ce kit de synthèse in vitro permettait donc de produire une transposase ayant le même comportement que celle produite en cellules d'insectes. Avec les deux transposases eucaryotes, une réelle différence d'affinité pour l'ITR 3', d'environ un facteur 100, était observée : la transposase produite en bactéries possédait une forte affinité pour l'ITR 3', tandis que la transposase produite en cellules d'insectes ou en système eucaryote in vitro avait une affinité plus faible.
2.3. Impact de la phosphorylation sur l'activité de la transposase
Des différences de comportement de la transposase ont été mises en évidence selon qu'elle était produite en cellules procaryotes ou en cellules eucaryotes. Afin de déterminer l'origine de ces différences, des modifications post-traductionnelles suceptibles d'avoir un impact sur le comportement de la transposase ont été recherchées.
Partant d'une hypothèse selon laquelle la transposase pouvait potentiellement subir, entre autres modifications post-traductionnelles, des phosphorylations, on a d'abord recherché si la transposase était phosphorylee lors de sa synthèse chez les eucaryotes et non phosphorylee chez les bactéries. En effet, les bactéries ne phosphorylent pas les protéines d'origine exogène.
2.3.1. Phosphorylation de la transposase chez les procaryotes et/ou eucaryotes ; Des bactéries contenant le vecteur pET-Tnp ont été mises en culture en présence de phosphore inorganique (PiP33) afin qu'il soit éventuellement intégré dans les protéines synthétisées. L'analyse en gel SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie colloïdal a révélé la présence d'une bande correspondant à la transposase pour les bactéries contenant le vecteur pET-Tnp. Une fois le gel séché, il a été autoradiographié pour vérifier l'absence de phosphorylation de la transposase chez les procaryotes. Pour étudier la phosphorylation en système eucaryote, le kit de transcription/traduction in vitro eucaryote a notamment été utilisé afin de produire une transposase à l'activité analogue à celle produite in vivo en cellule d'insectes. La production de la transposase avec le pET-Tnp, dans le lysat de réticulocytes, en présence de ATP-γ 32P se traduisait par l'apparition de bandes radiomarquées sur le gel de protéine (figure 13, piste 3), présentes également lorsque l'expérience était effectuée en absence d'ADN (figure 13, piste 1 ) ou avec le pET- 26b+ (figure 13, piste 2). Une bande radiomarquée, présente uniquement dans le cas de la production avec le pET-Tnp (piste 3 de la figure 13), était située à un PM d'environ 40kDa, similaire à celui de la transposase.
Les résultats de ces deux expériences indiquaient que : la transposase n'était pas phosphorylee lorsqu'elle était produite en bactéries tandis qu'elle était phosphorylee lorsqu'elle était produite en cellules eucaryotes.
2.3.2. Impact de la phosphorylation sur l'affinité de la transposase pour l'ADN
Afin de savoir si la phosphorylation était impliquée dans la différence d'activité entre la transposase procaryote et eucaryote, les deux protéines produites en système eucaryote ont été déphosphorylées. Un test de Scatchard a alors été effectué avec une large gamme de ligand (0,05 à 25 nM d'ITR 3'), afin d'être sûr d'encadrer le ou les Kd. Les figures 14 et 15 présentent un profil similaire à celui obtenu avec la transposase produite en système procaryote, c'est-à-dire la présence de 2 droites, donc de 2 Kd différents. Avec la MBP-Tnp produite en cellules d'insectes et déphosphorylée (figure 14), le premier Kd (Kdi) était de 0,66 nM et le deuxième (Kd2) de 24,69 nM. Ces valeurs étaient analogues à celles qui avaient été obtenues avec la transposase « procaryote » (Kdi de 0,6 nM et Kd2 de 10 nM). Avec la transposase « eucaryote » produite in vitro (figure 15), le Kdi était de 1 ,3 nM et le Kd2 de 15,5 nM. Là encore, ces valeurs étaient dans la même gamme que celles obtenues avec la transposase « procaryote ». 2.4 Impact d'une mutation rendant la transposase non phosphorylable en au moins un site, sur l'activité transpositionnelle de celle-ci.
2.4.1. Résultats préliminaires
Conformément aux Résultats décrits dans le paragraphe 2.2 supra, une transposase d'origine bactérienne est environ 100 fois plus efficace pour reconnaître les ITR et initier la transposition qu'une transposase d'origine eucaryote. Les phosphorylations post-traductionnelles affectent donc l'affinité de la transposase pour l'ADN (spécifique et non spécifique) et limitent l'activation conformationnelle de celle-ci.
La liaison spécifique de chaque monomère de transposase sur chacune des deux ITR du transposon étant réduite d'un facteur 100 environ, la réduction d'efficacité de la transposition provoquée par la phosphorylation, au moins au niveau de la position T88, est évaluée comme étant d'un facteur environ égal au carré de 100.
La mutation du résidu thréonine en position 88 en un résidu alanine non phosphorylable, selon une méthode de mutagénèse ponctuelle classique (Ausubel et al., 1994), paraît augmenter l'aptitude de la transposase ainsi mutée à catalyser la transposition et le transfert d'ADN, d'un facteur compris entre 100 et 10 000 environ, par rapport à celle d'une transposase native.
2.4.2. Impact d'une mutation rendant la transposase non phosphorylable en au moins un site, sur l'activité transpositionnelle : importance d'une substitution conservative
Comme illustré dans la Figure 16 (A et B), les résultats des analyses effectuées sur les transposases mutantes décrites dans Zhang et al. (2001) montrent que la transposase S104P est incapable de se lier aux ITR et de médier la transposition en bactérie. Concernant la transposase S302P, les résultats montrent que celle-ci n'est pas capable de former tous les complexes de liaison à l'ITR. De plus, elle est aussi incapable de médier la transposition.
Les mêmes analyses ont été consuites sur des transposases mutées de façon raisonnée sur la position T88 (Figure 16, C et D).
Cette position a été choisie dans la mesure où il a été montré, en utilisant des anticorps contre les serines phosphorylées (Qiagen), les thréonines phosphorylées (Qiagen) et les dipeptides SQ et TQ phosphorylés sur la serine ou la thréonine (New England Biolabs), que T88, ainsi que les positions S99 et S104, sont phosphorylées chez les eucaryotes.
Les résultats des analyses de l'impact des diverses mutations en position T88 montrent que seule la transposase T88V est capable de conserver une aptitude à médier la transposition qui n'est pas significativement différente de celle de la transposase native. De plus, ils montrent aussi que des mutations, telles que celle des transposases T88E et T88R, réduisent fortement la formation des plus gros complexes et inhibent totalement l'aptitude à médier la transposition. Enfin, ces expériences révèlent que, parmi les acides aminés les plus proches d'une thréonine (A, C et V), seule la substitution par une valine est véritablement conservative.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Transposase mutante hyperactive d'un élément génétique mobile (EGM) mariner, présentant au moins une mutation par substitution conservative d'au moins un résidu phosphorylable dans au moins un site de phosphorylation, ladite substitution conservative rendant ledit site non phosphorylable in vivo, ledit résidu phosphorylable étant choisi parmi :
- les résidus suivants de la séquence SEQ ID N°2: T11 ; T24 ; S28 ; T42 ; T88 ; S99 ; S104 ; T135 ; S147 ; T154 ; S170 ; T181 ; S200 ; T216 ; T255 ; et S305 ; ou
- les résidus correspondants de la séquence d'une transposase d'EGM mariner alignée avec ladite séquence SEQ ID N°2, lesdits résidus correspondants étant choisis parmi :
- une serine ; et - une thréonine.
2. Transposase selon la revendication 1 , présentant au moins une mutation par substitution conservative d'au moins un résidu phosphorylable dans chaque site de phosphorylation, ladite substitution conservative rendant chaque site non phosphorylable in vivo.
3. Transposase selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit résidu phosphorylable est substitué par un résidu non phosphorylable.
4. Transposase selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est hyperactive pour au moins une fonction parmi : la liaison spécifique et non spécifique à l'ADN, la dimerisation, le transfert des brins d'ADN, et les propriétés endonucléasiques et d'internalisation nucléaire.
5. Transposase selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit élément génétique mobile mariner appartient à la sous-famille mauritiana.
6. Transposase selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit élément génétique mobile mariner est mos-1.
7. Transposase selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit résidu phosphorylable est choisi parmi les résidus suivants (par référence à la séquence SEQ ID N°2) : T11 ; T24 ; S28 ; T42 ; T88 ; S99 ; S104 ; T135 ; S147 ; T154 ; S170 ; T181 ; S200 ; T216 ; T255 ; et S305.
8. Transposase selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit résidu phosphorylable est T88.
9. Transposase selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que ledit résidu phosphorylable est S104.
10. Séquence nucléotidique recombinante codant une transposase selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
11. Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique recombinante selon la revendication 10.
12. Vecteur recombinant selon la revendication 11 , caractérisé en ce qu'il permet l'expression de ladite séquence nucléotidique recombinante.
13. Cellule hôte recombinante caractérisée en ce qu'elle héberge au moins un vecteur recombinant selon la revendication 11 ou 12.
14. Procédé de production d'une transposase selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ledit procédé comprenant au moins : a) le clonage de la séquence nucléotidique recombinante codant ladite transposase dans un vecteur d'expression ; b) la transformation d'une cellule hôte avec ledit vecteur d'expression recombinant ; et c) l'expression de ladite séquence nucléotidique par ladite cellule hôte recombinante.
15. Procédé selon la revendication 14, comprenant en outre une étape préalable d'obtention de ladite séquence nucléotidique recombinante, par substitution, dans la séquence nucléotidique codant la transposase native correspondante, d'au moins un nucléotide d'un triplet codant un résidu phosphorylable, par un autre nucléotide, afin que le triplet résultant code un résidu non phosphorylable.
16. Procédé selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce que ladite cellule hôte est choisie parmi les cellules de bactéries, levures, champignons, plantes, insectes et mammifères.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, comprenant en outre une étape ultérieure de purification de ladite transposase.
18. Utilisation d'au moins une transposase selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour la transposition in vitro d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans une séquence d'ADN cible.
19. Utilisation d'au moins une transposase selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour la préparation d'un médicament destiné à permettre la transposition in vivo d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans le génome de l'hôte.
20. Utilisation d'au moins une transposase selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour la transposition in vivo d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans le génome de l'hôte.
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