FR2893951A1 - Procede de production chez les procaryotes de transposases actives et stables d'elements genetiques mobiles mariner - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet un procédé de production, par une cellule hôte procaryote, d'une transposase active et stable d'un élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana.L'invention concerne également une transposase active et stable susceptible d'être produite à l'aide d'un tel procédé, ainsi que les outils de biologie moléculaire, tels que les cellules hôtes procaryotes, les vecteurs d'expression, les kits, qui permettent de produire une transposase active et stable, ou qui la mettent en oeuvre.En outre, la présente invention vise les utilisations des transposases actives et stables.

Description

r PROCEDE DE PRODUCTION CHEZ LES PROCARYOTES DE TRANSPOSASES ACTIVES ET

STABLES D'ELEMENTS GENETIQUES MOBILES Mariner La présente invention se rapporte au domaine de la biologie moléculaire relative aux éléments transposables. L'invention concerne plus particulièrement l'amélioration des propriétés des transposases naturelles d'éléments génétiques mobiles mariner, aux fins de leur utilisation en biotechnologies.

La présente invention a pour objet un procédé de production, par une cellule hôte procaryote, d'une transposase active et stable d'un élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana. L'invention concerne également une transposase active et stable susceptible d'être produite à l'aide d'un tel procédé, ainsi que les outils de biologie moléculaire, tels que les cellules hôtes procaryotes, les vecteurs d'expression, les kits, qui permettent de produire une transposase active et stable, ou qui la mettent en oeuvre. En outre, la présente invention vise les utilisations des transposases actives et stables.

Les éléments transposables (TE) ou éléments génétiques mobiles (EGM) sont des fragments d'ADN de petite taille, capables de se déplacer d'un site chromosomique à un autre (Renault et al., 1997). Ces fragments d'ADN sont caractérisés par des séquences répétées inversées (ITR) situées en positions 5' et 3' terminales. Une enzyme codée par les TE eux-mêmes, la transposase, catalyse le processus de transposition de ces derniers. Des TEs ont été identifiés tant chez les procaryotes que chez les eucaryotes (voir un ouvrage de référence dans ce domaine : Craig et al., 2002).

Les TEs sont répartis en deux classes d'après leur mécanisme de transposition. D'une part, les éléments de classe I, ou rétrotransposons, 1 transposent via la transcription inverse d'un intermédiaire ARN. D'autre part, les éléments de classe II transposent directement d'un site chromosomique à un autre, via un intermédiaire ADN, selon un mécanisme de type couper-coller .

Chez les procaryotes, un grand nombre de TEs ont été répertoriés à ce jour. L'on peut citer, par exemple, des séquences d'insertion telles que ISI, et des transposons, tel Tn5. Chez les eucaryotes, les éléments de classe Il comprennent cinq familles : P, PiggyBac, hAT, hélitron et Tcl -mariner.

Les éléments génétiques mobiles mariner (ou MLE pour marinerlike elements ) constituent un grand groupe de TEs de classe II, appartenant à la superfamille Tcl -mariner (Plasterk et a1., 1999). La capacité des transposases de TE à mobiliser des fragments d'ADN plus ou moins longs, homologues ou hétérologues, comprenant des séquences d'intérêt, pour les insérer dans des acides nucléiques cibles, en particulier dans le chromosome d'un hôte, a été et est encore largement mise à profit dans le domaine des biotechnologies, notamment dans le domaine du génie génétique. Parmi les TEs, les MLEs présentent des propriétés particulièrement avantageuses pour une utilisation en biotechnologie, notamment en ingénierie génétique et génomique fonctionnelle. L'on peut par exemple citer de manière non limitative les propriétés suivantes : (i) Les MLEs sont des transposons de petite taille, faciles à manipuler. (ii) Le mécanisme de transposition des MLEs est simple. En effet, la transposase est capable de catalyser, à elle seule, toutes les étapes de la transposition des MLEs. Elle est d'ailleurs nécessaire et suffisante pour assurer la mobilité des MLEs en l'absence de facteurs de l'hôte (Lampe et al., 1996). (iii) Les MLEs se caractérisent par une très large ubiquité chez les procaryotes et les eucaryotes. Le premier MLE, Dmmarl, également appelé Most, a été découvert chez Drosophila mauritiana par Jacobson et Hartl (1985). Par la suite, de nombreux éléments apparentés ont été identifiés dans des génomes appartenant notamment à des bactéries, protozoaires, champignons, plantes, invertébrés, vertébrés à sang froid et mammifères. (iv) L'activité transpositionnelle des MLEs est hautement spécifique, et n'induit pas de mécanismes de résistance du génome de l'hôte, tels que des phénomènes d'interférences par méthylation [MIP ; Jeong et al. (2002) ; Martienssen et Colot (2001)] ou via des ARN [RNAi ; Ketting et al. (1999) ; Tabara et al. (1999)]. Les événements de transposition peuvent être contrôlés par divers facteurs, tels la température, la présence de certains cations divalents et le pH. En conséquence, les applications potentielles des MLEs en biotechnologie, notamment comme outils de recombinaison génétique, sont considérables. Typiquement, pour des applications de mutagenèse insertionnelle in vitro, le gène codant la transposase est remplacé par un ADN étiquette . La transposase doit être fournie en trans sous forme protéique. Pour des applications de transfert de gènes in vivo ou in vitro, le gène codant la transposase est remplacé par l'ADN exogène à transférer. La transposase doit être fournie en trans via un plasmide d'expression, un ARN messager ou la protéine elle-même. Dans chacune de ces applications, il est donc essentiel de disposer d'une transposase active en quantités suffisantes. La transposase est en effet nécessaire et suffisante pour assurer la totalité du processus de transposition. Cependant, en sus de son aptitude à médier la transposition, la transposase des MLEs est également capable de s'autoprotéolyser. Ce processus irréversible est vraisemblablement impliqué dans un mécanisme d'auto-contrôle, par la transposase elle-même, de la quantité maximum de transposase active présente dans une cellule. Ainsi, il semblerait que le phénomène d'OPI (pour Over Production Inhibition ), décrit par Lohe et al (1996), selon lequel la fréquence de transposition de Most diminue lorsque la transposase est surexprimée dans une cellule, soit dû à l'auto-protéolyse de la transposase surexprimée. C'est pourquoi, les transposases de MLE posent en pratique des difficultés liées à leur qualité et leur stabilité. Ceci est particulièrement vrai pour des applications telles que la transposition in vitro ou lorsque la transposase elle-même (c'est-à-dire sous forme protéique) est fournie aux cellules pour la transposition ex vivo. Ainsi, partout à travers le monde, dans l'industrie comme dans les laboratoires de recherche, les équipes qui utilisent des transposases eucaryotes (mariner ou autres) sont confrontées à un problème récurrent : les transposases sont instables lorsqu'elles sont produites en système procaryote (typiquement, en système bactérien). Les lots de transposase purifiée sont généralement contaminés par des fragments protéolytiques de la protéine. Ces fragments sont spécifiques de chaque transposase. Bien que ce problème d'instabilité des transposases ne soit pas rapporté dans la littérature scientifique, il a eu jusqu'à présent pour conséquence de limiter de manière considérable l'intérêt pratique des MLEs naturels, dans la mesure où industriels et chercheurs doivent disposer de transposases efficaces et stables afin de réduire le nombre de manipulations, le coût et le temps, nécessaires à la réalisation des transpositions recherchées. Ceci explique qu'en définitive, la production en système procaryote, notamment en bactérie, qui est pourtant à ce jour le moyen le plus simple et le moins coûteux pour obtenir les quantités de transposase requises, soit encore peu exploitée, notamment dans l'industrie. II est donc primordial d'accroître la stabilité des transposases produites en système procaryote. C'est précisément à ce besoin que répond l'objet de la présente invention, en fournissant des moyens qui permettent de stabiliser les transposases de MLEs produites en système procaryote et, plus particulièrement, en bactérie. Ainsi, un premier aspect de la présente invention concerne un procédé de production, par une cellule hôte procaryote, d'une transposase active et stable d'un élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana, comprenant au moins les étapes suivantes : a) le clonage de la séquence nucléotidique codant ladite transposase active dans un vecteur d'expression ; b) le clonage de la séquence nucléotidique codant la sous-unité 10 catalytique active de la protéine kinase AMPc-dépendante (pKa) dans un vecteur d'expression ; c) la transformation de ladite cellule hôte avec lesdits vecteurs d'expression ; d) l'expression desdites séquences nucléotidiques par ladite cellule hôte ; 15 et e) l'obtention de la transposase active et stabilisée par phosphorylation par la pKa. Une cellule hôte procaryote est définie ici conformément à l'acception usuelle dans le domaine. Il s'agira de préférence d'une cellule 20 bactérienne. Par exemple, l'homme du métier pourra avantageusement choisir des cellules de Escherichia coll. Les termes et expressions activité , fonction , activité biologique et fonction biologique sont équivalents et répondent à l'acception usuelle dans le domaine technique de l'invention. Dans le 25 cadre précis de l'invention, l'activité en cause est l'activité enzymatique d'une transposase ( activité transposase ou fonction transposase ). Les transposases visées dans le cadre de la présente invention sont des transposases actives , c'est-à-dire des transposases capables de médier la transposition d'un MLE. Avantageusement, elles peuvent être 30 hyperactives si l'activité de transposition a été améliorée par mutagénèse dirigée. On parlera alors ici de transposases mutantes hyperactives .

De telles transposases ont été décrites dans la demande de brevet français publiée sous le numéro FR 2 850 395 (déposée le 28/01/2003). L'on entend ici par transposase stable , une transposase dont l'auto-protéolyse est réduite de manière significative, voire avantageusement empêchée. On pourra parler de manière plus générale d' inhibition . De préférence, une transposase stable est telle qu'on empêche au moins 70%, de préférence au moins 75%, de manière encore préférée au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, et de manière préférée entre toutes, au moins 95%, voire au moins 98% ou encore au- delà (idéalement 100%), de la protéolyse à chaque site. L'auto-protéolyse (également appelée ici protéolyse ) des transposases implique un site actif , c'est-à-dire une séquence porteuse de l'activité de protéolyse (dans la transposase Most, acides aminés 1 à 116 sur la Figure 2), et entre un et trois sites de clivage , c'est-à-dire entre une et trois séquences cibles du clivage protéolytique. Dans la transposase Mos9, deux sites majoritaires de clivage ont été identifiés. Il sont positionnés entre les acides aminés 80/81 et les acides aminés 101/102. Un site minoritaire de clivage est situé entre les acides aminés 169/170 (voir Figure 2).

La sous-famille mauritiana rassemble les MLEs dont les transposases sont codées par des séquences présentant, sur toute leur longueur ou aux niveaux des régions codant les domaines N- et C-terminaux uniquement, un niveau d'homologie suffisant, c'est-à-dire d'au moins 75%, pour être incluses dans la même lignée que les quatre séquences ci-dessous, lors d'études phylogénétiques effectuées en utilisant les méthodes de parcimonie et Neighbor-Joining sur un ensemble de données de 1000 sous-échantillonnages (1000 bootstrap ) [Voir Felsenstein (1993) et Augé-Gouillou et al. (2000)] : - transposase Most (Fig. 2 ; N d'accès EMBL : X78906) ; - transposase Mdmar-1 de Mayetiola destructor (N d'accès EMBL : U24436) ; - transposase Btmar-1 de Bombus terrestris (Bonnin et al., 2005) ; et - transposase Momar-1 de Metaseuilius occidentales (N d'accès EMBL : U12279).

De préférence, l'élément génétique mobile ici considéré est Most. Une séquence nucléotidique ou un acide nucléique selon l'invention est conforme à l'acception usuelle dans le domaine de la biologie. Ces deux expressions couvrent indifféremment les ADN et les ARN, les premiers pouvant être par exemple génomiques, plasmidiques, recombinants, complémentaires (ADNc), et les seconds, messagers (ARNm), ribosomaux (ARNr), de transfert (ARNt). De manière préférée, les séquences nucléotidiques et acides nucléiques de l'invention sont des ADN. La séquence nucléotidique codant la sous-unité catalytique active de la protéine kinase AMPc-dépendante (pKa) a été décrite par Strausberg et al. (2002). Elle est notamment accessible dans la base de données NBRFPIR sous le numéro d'accès AAH 54834. L'ensemble des étapes mises en oeuvre dans le cadre du procédé objet de l'invention fait appel à des techniques classiques connues de l'homme du métier (voir, par exemple, Sambrook et Russel, 2001 ; Ausubel et al., 1994). En particulier, le terme transformation est ici revêtu d'un sens générique en ce qu'il couvre également, outre la transformation au sens strict, la transduction par un vecteur viral et la transfection, autant de techniques de biologie moléculaire parfaitement usuelles pour l'homme du métier. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé objet de l'invention comprend en outre une étape de purification de la transposase active et stable obtenue à l'étape e). Typiquement, cette étape de purification consiste à purifier, par des méthodes conventionnelles usuelles pour l'homme du métier, la fraction protéique possédant l'activité enzymatique recherchée, mais pas forcément l'enzyme elle-même. Les expressions enzyme pure ou transposase pure pourront donc désigner indifféremment la fraction protéique active purifiée ou, le cas échéant, l'enzyme purifiée. A l'issue de l'étape de purification, la présence de substances contaminantes, y compris celle d'autres protéines, en quantité minoritaire n'est pas nécessairement exclue, dès lors que l'activité transposase d'intérêt est préservée, et que seule cette activité est détectée. La détection de l'activité enzymatique d'intérêt peut être effectuée par des méthodes conventionnelles connues de l'homme du métier (Ausubel et al., 1994).

Selon un autre mode de réalisation, les clonages des étapes a) et b) sont réalisés dans un seul vecteur d'expression. On pourra parler de co-clonage de la séquence nucléotidique codant la transposase active et de la séquence nucléotidique codant la pKa. Dans ce cas, avantageusement, l'expression des deux séquences nucléotidiques est placée sous le contrôle des mêmes éléments de régulation. Un deuxième aspect de la présente invention concerné une transposase active et stable d'élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana, susceptible d'être obtenue par un procédé tel que décrit supra.

Dans un troisième aspect, la présente invention vise une cellule hôte procaryote, telle que définie ci-dessus, qui comprend au moins : a) la séquence nucléotidique codant une transposase active d'un élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana ; et b) la séquence nucléotidique codant la pKa.

Avantageusement, la transposase active pourra être une transposase mutante hyperactive, comme cela a été précisé plus haut. Selon un mode de réalisation particulier, les séquences nucléotidiques a) et b) sont clonées dans des vecteurs d'expression. Alternativement, ces séquences sont clonées dans un seul vecteur d'expression.

Un quatrième aspect de la présente invention a trait à un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend au moins : a) la séquence nucléotidique codant une transposase active d'un élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana ; et b) la séquence nucléotidique codant la pKa. Là encore, la transposase active pourra avantageusement être une transposase mutante hyperactive, telle que décrite plus haut. Dans un cinquième aspect, la présente invention concerne un kit comprenant au moins une transposase active et stable selon l'invention.

Par exemple, un tel kit pourra en outre comprendre un ou plusieurs éléments choisis parmi, notamment, des pseudo-transposons mariner Mosl (ADN), un tampon compatible avec la ou les transposases, un tampon "stop" pour arrêter les reactions de transposition, un ou plusieurs ADN contrôles (témoins de réaction), des oligonucléotides utiles pour le sequençage après réaction, des bactéries compétentes, etc. D'autres aspects de l'invention sont relatifs aux utilisations des outils décrits supra. Ainsi, la présente invention vise l'utilisation d'au moins une transposase active et stable conforme à ce qui précède, pour la transposition in vitro d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans une séquence d'ADN cible. La présente invention vise également l'utilisation d'au moins une transposase active et stable telle que définie ci-dessus, pour la transposition in vivo d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans une séquence d'ADN cible. L'invention s'intéresse en outre à l'utilisation d'au moins une transposase active et stable selon l'invention, pour la préparation d'un médicament résultant de la transposition in vivo d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans une séquence d'ADN cible.30 Par exemple, l'invention propose un procédé de préparation d'un médicament, comprenant au moins une étape de transposition d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans une séquence d'ADN cible, ladite transposition étant médiée par au moins une transposase active et stable selon l'invention. Le médicament peut ainsi être préparé ex vivo si la transposition est réalisée in vitro, ou bien in situ si la transposition a lieu in vivo. Ces applications impliquent d'une manière générale la mise en oeuvre d'une transposition in vitro ou in vivo, ce qui relève des connaissances générales de l'homme du métier dans le domaine de l'invention (Ausubel et al., 1994 ; Craig et al., 2002). Concernant plus particulièrement les transpositions in vivo, la séquence d'ADN cible est typiquement le génome de l'hôte, qui peut être un organisme, eucaryote ou procaryote, ou un tissu d'un organisme, ou encore une cellule d'un organisme ou d'un tissu. Une autre application objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un kit selon l'invention pour la mutagénèse insertionnelle et/ou le séquençage et/ou le clonage. Il s'agit là de techniques conventionnelles de biologie moléculaire bien connues de l'homme du métier, pour lesquelles les moyens de l'invention se révèlent d'un grand intérêt. Les figures suivantes sont fournies à titre purement illustratif et ne limitent en aucune façon l'objet de la présente invention. - Figure 1 : Représentation schématique de la transposition des MLEs. 25 Tnp : transposase ; ADNg : ADN génomique. - Figure 2: Séquence protéique de la transposase Most. Les acides aminés entre lesquels s'effectue le clivage (sites de clivage) sont notés en gris clair. Les sites putatifs de phosphorylation par la pKa sont soulignés et encadrés de gris foncé. La région potentiellement porteuse de l'activité 30 protéolytique ( site actif ) est localisée par un cadre clair. - Figure 3 : Gel SDS-page coloré au bleu de Coomassie.

MW : marqueurs de taille protéiques (Promega) 1 : Extrait protéique brut de la souche ER2566 (Tnp) 2 : MBP-Tnp purifiée à partir de la souche ER2566 (Tnp) ; Les produits de dégradation de la Tnp apparaissent sous la forme d'un doublet de PM X60 kDa. 3 : Extrait protéique brut de la souche ER2566 (TnplpKa) 4 & 5 : 2 préparations différentes de MBP-Tnp purifiée à partir de la souche ER2566 (TnplpKa) - Figure 4 : Test de transposition in vitro.

En pointillé : test réalisé avec la MBP-Tnp pure produite à partir d'une souche ER 2566 (TnplpKa). En trait continu : test réalisé avec la MBP-Tnp pure produite à partir d'une souche ER 2566 (Tnp).

La partie expérimentale ci-après, appuyée par des exemples et des figures, illustre, sans limitation, des modes de réalisation et avantages de l'invention.

A- MATERIEL ET METHODES 1. Vecteurs 1.1 Description Le vecteur pMaIC2x-Tnp (Augé-Gouillou et ai, 2005) dérive du pMaIC2x (New England Biolabs, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, France). II permet une expression en bactérie de la transposase fusionnée en N-terminal à la protéine MBP (Maltose binding protein), suite à l'induction du pLac par l'IPTG. Le plasmide porte le gène de résistance à l'ampicilline. Le vecteur pET-pKa est dérivé du vecteur pET26b+ (Novagen). Il permet une expression en bactérie de la pKa sous le contrôle du promoteur pol7. Cette expression est donc restreinte aux bactéries qui expriment la T7 DNA polymérase, comme les souches BL21 ou ER2566 d'E.coli. Le pET-pKa porte un gène de résistance à la kanamycine. Le pBC 3Tet3 est un plasmide donneur de pseudo mariner Most (Augé-Gouillou et al, 2001). Il contient le gène de résistance à la tétracycline OFF (c'est-à-dire sans promoteur) bordé par deux ITR 3'. La transposition est détectée par promoteur tagging , plaçant le pseudo-transposon en aval d'un promoteur, qui active la résistance à la tétracycline. Le vecteur porte également le gène de résistance au chloramphénicol. 1.2 Construction 1.2.1 Préparation de l'ADN des vecteurs Pour les différentes constructions, toutes les élutions d'ADN à partir d'un gel d'agarose ont été réalisées avec le kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system (Promega, France). Toutes les minipréparations de plasmides à partir de cultures bactériennes ont été effectuées avec le kit Wizard Plus minipreps (Promega). 1.2.2 pET-pKa Le fragment codant la pKa a été préparé à partir du plasmide CAT/pRESTB, fourni par le Dr Suzan Taylor [Harward Hughes Medical Institute û USCD û La Jolla CA 92093 û Etats-Unis d'Amérique] par digestion Ndel/Hindlll et élué sur gel 0,8% agarose (TAE1X : 0,04M Tris-Acétate, 1 mM EDTA pH8). Le plasmide pET26b+ a été digéré par Ndel/Hindlll, déposé sur gel d'agarose, élué puis ligaturé avec le fragment codant la pKa, pendant une nuit à 16 C. Un contrôle de recircularisation du plasmide sur lui-même a été réalisé en effectuant une ligature du plasmide en absence de fragment codant la pKa. Le produit de ligation a été utilisé pour transformer des bactéries E. coli 30 JM109 qui ont ensuite été sélectionnées sur boîte LB-kanamicyne (100 g/ml). 4 clones résistants à l'ampicilline ont été mis en culture pour une extraction du plasmide. Les mini-préparations d'ADN ont été contrôlées par digestion Ndel/Hindlll puis en électrophorèse sur gel 0,8% agarose (TAE 1X) afin de s'assurer que les plasmides ont intégré le gène codant la pKa.

Il. Préparation des souches bactériennes Deux souches bactériennes ER2566 (New England Biolabs) ont été utilisées : une (dite souche Tnp) pour produire la transposase de Most en absence de la pKa (donc non phosphorylée) et la seconde (dite souche Tnp/pKa) pour co-produire la transposase de Most et la pKa. Dans cette souche, la transposase produite sera phosphorylée dans la bactérie par la pKa. Pour préparer les souches bactériennes, des bactéries ER2566 ont été transformées : avec 100 ng du plasmide pMaIC2x-Tnp (souche Tnp). Les bactéries transformées ont été sélectionnées sur une gélose + ampicilline (100 g/ml). avec 100 ng du plasmide pMaIC2x-Tnp + 100 ng du plasmide pET- pKa (souche Tnp/pKa). Les bactéries transformées ont été sélectionnées sur une gélose kanamicyne (100 g/ml). + ampicilline (100 g/ml) + III. Production et purification de la transposase Most en cellules 25 ER2566 (Tnp) et (Tnp/pKa)

111.1 Production 50 mis de milieu BBC (Brain Heart Infusion Broth - AES) ont été 30 inoculés avec 5 à 10 clones (Tnp) ou 5 à 10 clones (Tnp/pKa) prélevés directement sur les boîtes de transformation. Le milieu a été supplémenté en ampicilline (100 g/ml) pour la souche (Tnp) ou en ampicilline (100 g/ml) + kanamicyne (100 g/ml) pour la souche (Tnp/pKa). Les bactéries ont immédiatement été induites à l'IPTG (1 mM final) et placées à 25 C sous agitation, jusqu'à l'obtention d'une culture à saturation. Pour la souche (Tnp), le temps de culture était classiquement 16 à 20 heures. Pour la souche (Tnp/pKa), le temps de culture était classiquement 30 à 36 heures. 111.2 Purification Les cultures bactériennes ont été centrifugées (5000 rpm, 10 min, 4 C) et le culot repris dans 5 mis d'un tampon 20 mM tris pH9, 100 mM NaCl, 1 mM DTT. Les bactéries ont été lysées par 800 pl de lysosyme à 20 mg/ml, pendant 30 minutes à 4 C. Le lysat bactérien a été centrifugé (10 000 rpm, 15 min, 4 C) et le surnageant recueilli : il constituait l'extrait brut. La protéine fusion MBP-Tnp contenue dans les deux types d'extrait brut (Tnp et Tnp/pKa) a été purifiée sur une résine de maltose en suivant les recommandations du fournisseur (New England Biolabs). Les fractions éluées ont été dosées selon la méthode de Bradford.

IV. Analyse de la transposase Mosl pure issue des souches (Tnp) et (TnplpKa)

IV.1 Stabilité Les transposases purifiées ont été analysées en gel SDS-page (stacking : 4% acrylamide pH6,8 û séparation : 11 % acrylamide pH8,8). Classiquement 1 à 2 .xg de protéines pures ont été déposés sur le gel, avec un marqueur de PM (Promega). Après une heure d'électrophorèse, les gels ont été colorés au bleu de Coomassie.

IV.2 Activité Les transposases purifiées ont été testées pour leur aptitude à médier la transposition, en utilisant un test de transposition in vitro. 80 nM de transposase issue soit de la lignée (Tnp) soit de la lignée (Tnp/pKa) ont été incubés avec 600 ng de plasmide pBC3Tet3 à 30 C, dans un tampon 10 mM tris pH9, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 20 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 10% glycérol, en présence de 100ng de BSA, pour des temps variants de 0 à 60 minutes. La réaction a été arrêtée 4 g de protéinase K et 0,15 % SDS pendant 5 minutes à 65 C puis 30 minutes à 37 C. Les ADN ont été purifiés par une extraction phénol/chloroforme suivie d'une précipitation alcoolique, en présence de 114 d'ARNt. Les culots d'ADN ont été repris dans 2011I d'eau ; 20 ont été utilisés pour transformer des bactéries JM109 (E. coli) compétentes. Après transformation, la culture obtenue a été titrée sur boîte LB-chloramphénicol (150 g/ml) (40 l d'une dilution au 1/1000) et sur boîte LB-tétracycline (12,5 Iag/ml) (la totalité -1 ml û de la culture non diluée). Les boîtes ont été placées à 37 C pour 24 heures. Le lendemain, les colonies ont été comptées sur les boîtes LB-chloramphénicol et LB- tétracycline puis on a calculé la fréquence de transposition égale au nombre total de bactéries résistantes à la tétracycline sur le nombre total de bactéries (cloram+tétra).

B- RESULTATS 25 La figure 3 montre que la transposase de Most est plus stable lorsqu'elle est produite en présence de la pKa. Cette stabilisation se traduit par une forte diminution de la protéolyse. Elle est illustrée dans la figure 3 par la disparition des produits d'autoprotéolyse sur les pistes 4 et 5, alors que 30 ceux-ci sont très visibles sur la piste 1 (transposase produite en l'absence de pKa). 15 Afin de vérifier que la transposase produite en présence de pKa est toujours active en transposition, des tests de transposition in vitro ont été effectués. Les résultats sont reportés dans la figure 4. Ils montrent qu'une transposase produite en présence de pKa (en pointillé) est aussi efficace, voire plus, qu'une transposase produite en l'absence de pKa (en trait continu). L'efficacité accrue de la transposase produite en présence de pKa peut être directement corrélée à la stabilisation de la protéine qui ne se dégrade pas au cours du test.

REFERENCES

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Claims (22)

REVENDICATIONS

1. Procédé de production, par une cellule hôte procaryote, d'une transposase active et stable d'un élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana, comprenant au moins les étapes suivantes : a) le clonage de la séquence nucléotidique codant ladite transposase active dans un vecteur d'expression ; b) le clonage de la séquence nucléotidique codant la sous-unité catalytique active de la protéine kinase AMPc-dépendante (pKa) dans un vecteur d'expression ; c) la transformation de ladite cellule hôte avec lesdits vecteurs d'expression ; d) l'expression desdites séquences nucléotidiques par ladite cellule hôte ; et e) l'obtention de la transposase active et stabilisée par phosphorylation par la pKa.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite transposase active est une transposase mutante hyperactive.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, comprenant en outre une étape de purification de la transposase active et stable obtenue à l'étape e).

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les clonages des étapes a) et b) sont réalisés dans un seul vecteur d'expression.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'expression de ladite séquence nucléotidique codant la transposase 19 2893951 active et de ladite séquence nucléotidique codant la pKa est placée sous le contrôle des mêmes éléments de régulation.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite cellule hôte procaryote est une cellule de bactérie.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite bactérie est Escherichia coll.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit élément génétique mobile mariner est Mos-1.

9. Transposase active et stable d'élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana, susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.

10. Cellule hôte procaryote comprenant au moins : a) la séquence nucléotidique codant une transposase active d'un élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana ; et b) la séquence nucléotidique codant la sous-unité catalytique active de la protéine kinase AMPc-dépendante (pKa).

11. Cellule hôte procaryote selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite transposase active est une transposase mutante hyperactive.

12. Cellule hôte procaryote selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce que lesdites séquences nucléotidiques a) et b) sont clonées dans des vecteurs d'expression. 20 2893951

13. Cellule hôte procaryote selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce que lesdites séquences nucléotidiques a) et b) sont clonées dans un vecteur d'expression.

14. Cellule hôte procaryote selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisée en ce qu'elle est une cellule de bactérie.

15. Cellule hôte procaryote selon la revendication 14, caractérisée en ce que ladite bactérie est Escherichia coll.

16. Cellule hôte procaryote selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, caractérisée en ce que ledit élément génétique mobile mariner est Mos-1.

17. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend au moins : a) la séquence nucléotidique codant une transposase active d'un élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana ; et b) la séquence nucléotidique codant la sous-unité catalytique active de la protéine kinase AMPc-dépendante (pKa).

18. Vecteur selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite transposase active est une transposase mutante hyperactive.

19. Vecteur selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que ledit élément génétique mobile mariner est Mos-1.

20. Kit de mutagénèse insertionnelle et/ou de séquençage et/ou de clonage, comprenant au moins une transposase active et stable selon la revendication 9. 21 2893951

21. Utilisation d'au moins une transposase active et stable selon la revendication 9, pour la transposition in vitro d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans une séquence d'ADN cible.

22. Utilisation d'au moins une transposase active et stable selon la revendication 9, pour la préparation d'un médicament résultant de la transposition in vivo d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans une séquence d'ADN cible.