JP2009517059A - 原核生物におけるマリナー可動性遺伝因子の活性かつ安定なトランスポゼースの製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、マウリチアナ亜科に属するマリナー可動遺伝因子の活性かつ安定なトランスポゼースの原核生物宿主細胞による製造方法に関する。この発明は、そのような方法を用いて製造することができる活性かつ安定なトランスポゼース、および、活性かつ安定なトランスポゼースの製造を可能とするかあるいは使用する原核生物宿主細胞、発現ベクターまたはキット等の分子生物学手段にも関する。さらに、本発明は、活性かつ安定なトランスポゼースの使用に関する。
Description
本発明は、転移可能因子を扱う分子生物学の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、バイオテクノロジーに用いるために、マリナー可動性遺伝因子の天然トランスポゼースの特性の改良に関する。
本発明はまた、原核生物宿主細胞による、マウリチアナ(mauritiana)亜種に属するマリナー可動性遺伝因子の活性かつ安定なトランスポゼースの生産方法に関する。
本発明はさらに、このような方法によって生産し得る活性かつ安定なトランスポゼース、ならびに活性かつ安定なトランスポゼースの生産および適用に必要な原核生物宿主細胞、発現ベクターおよびキットなどの分子生物学的ツールに関する。
さらに本発明は、活性かつ安定なトランスポゼースの使用を包含する。
転移可能因子(TE)または可動性遺伝因子(MGE)は、ある染色体部位から別の染色体部位へ転移し得る小型のDNA断片である(Renault et al., 1997)。これらのDNA断片は、5’末端と3’末端に位置する逆方向末端反復配列(ITR)を特徴とする。TEそれ自体にコードされている酵素トランスポゼースは前者の転移プロセスを触媒する。
TEは原核生物と真核生物の双方で確認されている(本分野の参考書を参照:Craig et al., 2002)。
TEはそれらの転移機構によって2つのカテゴリーに分けられる。一方で、カテゴリーIの因子、すなわちレトロトランスポゾンは、RNA中間体の逆転写によって転移する。他方、カテゴリーIIの因子は、「切り‐貼り」機構によるDNA中間体を介してある染色体部位から別の染色体部位へ直接転移する。
これまでに原核生物では、例えば、IS1などの挿入配列やTn5などのトランスポゾンなど、多数のTEが確認されている。
真核生物では、カテゴリーIIの因子は、P、PiggyBac、hAT、helitronおよびTc1−marinerの5つのファミリーからなる。
マリナー可動性遺伝因子(またはマリナー様因子としてのMLE)は、Tc1−marinerスーパーファミリーに属するカテゴリーIIのTEの大きな群を構成している(Plasterk et al., 1999)。
特に宿主染色体における標的核酸へ、挿入の対象とする配列を含む種々の長さの同種または異種のDNA断片を転移可能とするTEトランスポゼースの能力は、バイオテクノロジーの分野で、主として遺伝子工学の分野で広く使用されて来ており、また、使用され続けるであろう。
TEの中でもMLEは、バイオテクノロジー、すなわち、遺伝子工学および機能的ゲノム工学で用いるのに特に有利な特性を有する。限定されるものではないが、例えば、次のような特性が挙げられる。
i)MLEは取扱いの容易な小型のトランスポゾンである。
ii)MLE転移の機構は単純である。実際、このトランスポゼースはそれ自体、MLE転移の総ての段階を触媒することができる。さらに、このトランスポゼースは、宿主因子の不在下で、MLEの可動性を確保するのに必要かつ十分である(Lampe et al. 1996)。
iii)MLEは原核生物および真核生物に非常に広く分布していることを特徴とする。最初のMLE、Dimar1(Mos1とも呼ばれる)は、Jacobson and Hartl (1985)によりモリシャス系統のショウジョウバエ(Drosophila mauritiana)で発見された。これに引き続き、特に細菌、原虫、真菌、植物、無脊椎動物、冷血脊椎動物および哺乳類でそのゲノムに多くの関連因子が確認された。
iv)MLEの転移活性は極めて特異的であり、メチル化による[MIP; Jeong et al. (2002); Martienssen and Colot (2001)]またはRNAを介した[RNAi; Ketting et al. (1999); Tabara et al. (1999)]干渉現象など、宿主ゲノムの「耐性」機構を生じない。転移事象は温度、特定の二価陽イオンの存在およびpHなどの種々の要因によって制御することができる。
その結果、バイオテクノロジーにおける、主として、遺伝子組換え手段としてのMLEの適用の可能性は大きい。典型的には、in vitro挿入突然変異誘発適用では、このトランスポゼースをコードする遺伝子を「標識」DNAに置き換える。このトランスポゼースはタンパク質形態ではトランス型として供給しなければならない。in vivoまたはin vitro遺伝子導入適用では、このトランスポゼースをコードする遺伝子を移入する外来DNAに置き換える。このトランスポゼースは発現プラスミド、メッセンジャーRNAまたはタンパク質それ自体を介してトランス型として供給しなければならない。
従って、これらの各適用では、十分な量の活性トランスポゼースが利用可能であることが不可欠である。このトランスポゼースは実際に、転移プロセス全体に必要かつ十分である。しかしながらやはり、その転移媒介能に加え、MLEトランスポゼースは自己タンパク質分解も可能である。この不可逆的プロセスはおそらくは、細胞内に存在する活性トランスポゼースの最大量を決める役割を果たすための、トランスポゼース自体による自己調節機構によるものである。よって、Lohe et al. (1996)が記載している、トランスポゼースが細胞内で過剰発現される際に、それに従ってMos1転移の頻度が低下するOPI現象(過剰生産阻害)は、過剰発現したトランスポゼースの自己タンパク質分解の結果である。
これは、MLEトランスポゼースが量と安定性に関して実施上困難な点をいくつか有している理由である。特に、in vitro転移などの適用、またはex vivo転移のためトランスポゼース自体が(すなわちタンパク質形態で)細胞に供給される場合はそうである。
よって、真核生物トランスポゼース(マリナーその他)を使用している世界中の工業実験室および研究実験室双方のチームが、トランスポゼースは原核生物系(一般に細菌系)で生産された場合には不安定であるという頻発する問題に直面している。精製されたトランスポゼースのバッチには一般にタンパク質のタンパク質分解断片が混入している。これらの断片はトランスポゼースごとに特異的である。このトランスポゼースの不安定性の問題は科学文献には報告されないが、工業界および研究者の双方が、必要な転移を行うのに必要な操作数、コストおよび時間を軽減するために、処分時に効率的であり、かつ安定なトランスポゼースを確保する必要があるという限りでは、天然MLEの実施上の利益に現状で著しい制限があるまでになっている。
これが、特に工業界で、依然として必要量のトランスポゼースを得る最も直接的で最小コストの方法である原核生物系、特に細菌での生産がなぜ大いに利用されないのかという理由である。
従って、原核生物系で生産されるトランスポゼースの安定性を高めることが主として重要である。
本発明はまさにそれ自体、この必要性に、原核生物系、より具体的には細菌で生産されるMLEトランスポゼースを安定化させる手段を供給することにより取り組むものである。
よって、本発明の第一の態様は、マウリチアナ(mauritiana)亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性かつ安定なトランスポゼースの原核生物宿主細胞による生産方法であって、
少なくとも下記の
a)該活性トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターにクローニングする工程、
b)cAMP依存性タンパク質キナーゼ(pKa)の活性触媒サブユニットをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターにクローニングする工程、
c)該宿主細胞を該発現ベクターで形質転換する工程、
d)該宿主細胞により該ヌクレオチド配列を発現させる工程、および
e)pKaのリン酸化により活性かつ安定化されたトランスポゼースを得る工程
を含む方法に関する。
少なくとも下記の
a)該活性トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターにクローニングする工程、
b)cAMP依存性タンパク質キナーゼ(pKa)の活性触媒サブユニットをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターにクローニングする工程、
c)該宿主細胞を該発現ベクターで形質転換する工程、
d)該宿主細胞により該ヌクレオチド配列を発現させる工程、および
e)pKaのリン酸化により活性かつ安定化されたトランスポゼースを得る工程
を含む方法に関する。
本明細書において「原核生物宿主細胞」とは、当技術分野で受け入れられている意味に従って定義される。好ましくは、それは細菌細胞に関する。例えば、当業者ならば、有利には大腸菌(Escherichia coli)細胞を選択することができる。
「活性」、「機能」、「生物活性」および「生物機能」は等価であり、本発明の技術分野において受け入れられている意味に相当する。本発明の厳密な文脈では、対象とする活性はトランスポゼースの酵素活性(「トランスポゼース活性」または「トランスポゼース機能」)である。
本発明の範囲内で対象とするトランスポゼースは「活性なトランスポゼース」であり、言い換えれば、MLEの転移を媒介し得るトランスポゼースである。有利には、それらは、もし転移活性が指定された突然変異誘発により向上していたならば機能亢進であり得る。この場合、用いる用語は「機能亢進突然変異トランスポゼース」となる。このようなトランスポゼースはフランス特許出願第FR2850395号(2003年1月28日出願)に記載されている。
「安定なトランスポゼース」とは、その自己タンパク質分解が有意に低下されている、有利には妨げられているトランスポゼースを意味する。より一般には、これは「阻害」を意味する。好ましくは、「安定な」トランスポゼースは、各部位におけるタンパク質分解の少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、いっそうより好ましくは少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、最も好ましくは95%〜98%の間またはそれ以上(理想的には100%)が妨げられているものである。トランスポゼースの自己タンパク質分解(本明細書では「タンパク質分解」とも呼ぶ)は活性部位、言い換えれば、タンパク質分解活性を有する配列(Mos1トランスポゼースでは、図2のアミノ酸1〜116番)と、1〜3の間の「切断部位」、言い換えれば、1〜3の間の、タンパク質分解切断の標的部位を含む。Mos1トランスポゼースでは、2つの主要な切断部位が確認されている。それらはアミノ酸80/81およびアミノ酸101/102の間に位置する。アミノ酸169/170の間にマイナーな切断部位がある(図2参照)。
「マウリチアナ亜科」とは、そのトランスポゼースが、それらの全長にわたって、または特異的にそのN末端もしくはC末端ドメインをコードする領域に関して、1000種のサブサンプルのデータセットに対して、節約・近隣接合法を用いて行った系統発生学的研究の過程で上記の4配列と同じ系統に含めるために十分なレベル、言い換えれば、少なくとも75%の相同性を示す配列によりコードされているMLEを含む[Felsenstein (1993) and Auge-Gouillou et al., (2000)参照]:
・Mos1トランスポゼース(図2、EMBLアクセス番号:X78906)
・ヘシアンバエ(Mayetiola destructor)由来Mdmar−1トランスポゼース(EMBLアクセス番号:U24436)
・セイヨウオオマルハナバチ(Bombus terrestris)由来Btmar−1トランスポゼース(Bonnin et al., 2005)、および
・メタセウイリウス・オシデンタリス(Metaseuilius occidentalis)由来Momar−1トランスポゼース(EMBLアクセス番号:U12279)。
・Mos1トランスポゼース(図2、EMBLアクセス番号:X78906)
・ヘシアンバエ(Mayetiola destructor)由来Mdmar−1トランスポゼース(EMBLアクセス番号:U24436)
・セイヨウオオマルハナバチ(Bombus terrestris)由来Btmar−1トランスポゼース(Bonnin et al., 2005)、および
・メタセウイリウス・オシデンタリス(Metaseuilius occidentalis)由来Momar−1トランスポゼース(EMBLアクセス番号:U12279)。
好ましくは、本明細書で考慮する可動性遺伝因子はMos1である。
本発明において「ヌクレオチド配列」または「核酸」とは、生物学分野で受け入れられている意味に従う。これらの2つの用語は互換的にDNAおよびRNAを包含し、前者としては例えばゲノムDNA、プラスミドDNA、組換えDNAまたは相補的(cDNA)があり、後者としてはメッセンジャーRNA(mRNA)、リボゾームRNA(rRNA)およびトランスファーRNA(tRNA)がある。好ましくは、本発明のヌクレオチド配列および核酸はDNAである。
「cAMP依存性タンパク質キナーゼ(pKa)の活性触媒サブユニットをコードするヌクレオチド配列」とは、Strausberg et al. (2002)が記載したものである。特に、これはアクセス番号AAH54834としてNBRF−PIRデータベースから得ることができる。
本発明の方法の範囲内で実施される一連の工程は、当業者に公知の従来技術をさす(例えば、Sambrook and Russel, 2001またはAusubel et al., 1994参照)。特に、この場合、「形質転換」とは、厳密な意味の形質転換の他、当業者に十分知られている分子生物学的技術であるウイルスベクターによる遺伝子導入およびトランスフェクションも包含するという一般的な意味を有する。
特定の実施形態によれば、本発明の方法はまた、工程e)で得られる活性かつ安定なトランスポゼースの精製工程も含む。一般に、この精製工程は、当業者に公知の一般法を用いて、必ずしも酵素それ自体ではなく、望ましい酵素活性を有するタンパク質画分の精製からなる。従って、「純粋な酵素」または「純粋なトランスポゼース」とは、精製された活性タンパク質画分または適切であれば精製された酵素を表すために互換的に使用することができる。精製工程の終了時に、他のタンパク質を含め、少量の夾雑物質の存在は、対象とするトランスポゼースの活性が完全であり、この活性だけが検出される限り必ずしも排除する必要はない。対象とする酵素活性の検出は、当業者に公知の常法を用いて行うことができる(Ausubel et al., 1994)。
別の実施形態によれば、工程a)およびb)のクローニングは単一の発現ベクターで行われる。これは活性トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とpKaをコードするヌクレオチド配列の「同時クローニング」と呼ぶことができる。この場合、この2つのヌクレオチド配列の発現は同じ調節因子の制御下にあるのが有利である。
本発明の第二の実施形態は、上記のものなどの方法により得られるマウリチアナ亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性かつ安定なトランスポゼースに関する。
第三の実施形態では、本発明は、少なくとも
a)マウリチアナ亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列と、
b)pKaをコードするヌクレオチド配列
を含む、上記で定義されたような原核生物宿主細胞を対象とする。
a)マウリチアナ亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列と、
b)pKaをコードするヌクレオチド配列
を含む、上記で定義されたような原核生物宿主細胞を対象とする。
有利には、活性トランスポゼースは、上記のような機能亢進突然変異トランスポゼースであり得る。
特定の実施形態では、ヌクレオチド配列a)とb)は複数の発現ベクターにクローニングされる。あるいは、これらの配列は単一の発現ベクターにクローニングされる。
本発明の第四の態様は、少なくとも
a)マウリチアナ亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列と、
b)pKaをコードするヌクレオチド配列
を含む発現ベクターに関する。
a)マウリチアナ亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列と、
b)pKaをコードするヌクレオチド配列
を含む発現ベクターに関する。
ここでもまた、有利には、この活性トランスポゼースは上記のような機能亢進突然変異トランスポゼースであり得る。
第五の実施形態では、本発明は、本発明の少なくとも1つの活性かつ安定なトランスポゼースを含むキットに関する。
例えば、このようなキットは、マリナーMos1偽トランスポゾン(DNA)、そのトランスポゼースに適合するバッファー、転移反応を停止させるための停止バッファー、1以上の対照DNA(反応対照)、反応後のシーケンシングに用いるオリゴヌクレオチド、活性な細菌などから選択される1以上の要素をさらに含み得る。
本発明の他の態様は、上記のツールの使用に関する。
よって、本発明は、標的DNA配列において対象とする転移可能なDNA配列のin vitro転移のための、前記に従う少なくとも1つの活性かつ安定なトランスポゼースの使用に関する。
本発明はまた、標的DNA配列において対象とする転移可能なDNA配列のin vivo転移のための、上記で定義されたような少なくとも1つの活性かつ安定なトランスポゼースの使用に関する。
本発明はさらに、標的DNA配列において対象とする転移可能なDNA配列のin vivo転移をもたらす薬剤の製造のための、本発明の少なくとも1つの活性かつ安定なトランスポゼースの使用に関する。
例えば、本発明は、標的DNA配列において対象とする転移可能なDNA配列の、少なくとも1回の転移工程(この転移は本発明による少なくとも1つの活性かつ安定な安定なトランスポゼースにより媒介される)を含む、薬剤の製造のための方法を提案する。よって、この薬剤は、転移がin vitroで行われる場合にはex vivoで製造することができ、あるいは転移がin vivoで起こる場合にはそれをin situで行うことができる。
これらの適用は一般に、本発明の分野の熟練者に公知の方法であるin vitroまたはin vivo転移(Ausubel et al., 1994; Craig et al., 2002)の使用を含む。より詳しくは、in vivo転移に関して、標的DNA配列は一般に宿主ゲノムであり、これは生物、真核生物もしくは原核生物、生物由来の組織または生物もしくは組織由来の細胞であってもよい。
本発明に関する別の適用は、挿入突然変異誘発および/またはシーケンシングおよび/またはクローニングのための、本発明のキットの使用に関する。これは、本発明の方法が大きな利益となることが見出される当業者に公知の従来の分子生物学的技術を含む。
以下の実験のセクションは実施例および図面により裏付けられ、何ら限定されることなく、本発明の実施形態および利点を示す。
A−材料および方法
I.ベクター
1.1 説明
ベクターpMalC2x−Tnp(Auge-Gouillou et al., 2005)はpMalC2x(New England Biolabs, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, France)に由来する。このベクターにより、細菌において、IPTGによるpLacの誘導後に、N末端でMBP(マルトース結合タンパク質)と融合させたトランスポゼースを発現させることができる。このプラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を有する。
I.ベクター
1.1 説明
ベクターpMalC2x−Tnp(Auge-Gouillou et al., 2005)はpMalC2x(New England Biolabs, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, France)に由来する。このベクターにより、細菌において、IPTGによるpLacの誘導後に、N末端でMBP(マルトース結合タンパク質)と融合させたトランスポゼースを発現させることができる。このプラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を有する。
ベクターPET−pKaはベクターpET26b+(Novagen)に由来する。これにより、細菌において、プロモーターpol7の制御下でpKaを発現させることができる。従って、この発現は、大腸菌BL21またはER2566株など、T7DNAポリメラーゼを発現する細菌に限定される。PET−pKaはカナマイシン耐性遺伝子を有する。
pBC 3Tet3は、偽マリナーMos1のドナープラスミドである(Auge-Gouillou et al., 2001)。これは2つの3’ITRにより挟まれたテトラサイクリン耐性遺伝子「オフ」(言い換えれば、プロモーター無し)を含む。転移は、プロモーターの手前に偽トランスポゾンを置くプロモータータッグ付けにより、テトラサイクリンに対する耐性を活性化することで検出される。このベクターはまたクロラムフェニコール耐性遺伝子も有する。
I.2 構築
1.2.1 ベクターDNAの作製
種々の構築物について、アガロースゲルからの全DNA溶出物をWizard SV Gel and PCR Clean-Up system kit (Promega, France)を用いて行った。細菌培養物からの全プラスミドのミニプレパレーションを、Wizard Plus minipreps kit (Promega)を用いて行った。
1.2.1 ベクターDNAの作製
種々の構築物について、アガロースゲルからの全DNA溶出物をWizard SV Gel and PCR Clean-Up system kit (Promega, France)を用いて行った。細菌培養物からの全プラスミドのミニプレパレーションを、Wizard Plus minipreps kit (Promega)を用いて行った。
1.2.2 PET−pKa
pKaをコードする断片を、Dr Susan Taylor [Harward Hughes Medical Institute- USCD- La Jolla CA 92093-United States of America]から供給されたCAT/pRESTBプラスミドから、Ndel/HindIII消化により調製し、0.8%アガロースゲル(TAE1X:0.04Mトリス塩酸、1mM EDTA pH8)で溶離した。
pKaをコードする断片を、Dr Susan Taylor [Harward Hughes Medical Institute- USCD- La Jolla CA 92093-United States of America]から供給されたCAT/pRESTBプラスミドから、Ndel/HindIII消化により調製し、0.8%アガロースゲル(TAE1X:0.04Mトリス塩酸、1mM EDTA pH8)で溶離した。
pET26b+プラスミドをNdel/HindIIIで処理し、アガロースゲルに付着させ、溶離した後、16℃で一晩、pKaをコードする断片と連結させた。プラスミドをそれ自体で再環化するという対照実験を、pKaをコードする断片の不在下でプラスミドを連結することにより行った。
この連結産物を用いて大腸菌JM109を形質転換し、次にこれらをLB−カナマイシンディッシュ(100μg/ml)上で選択した。4つのアンピシリン耐性クローンをプラスミド抽出のために培養した。これらのプラスミドがpKaをコードする遺伝子に確実に組み込まれているように、Ndel/HindIII消化とその後の0.8%アガロースゲル(TAE 1×)上での電気泳動によりDNAミニプレパレーションを管理した。
II. 細菌株の準備
pKaの不在下でのMos1トランスポゼース(従って非リン酸化型)の産生のためのもの(Tnp株と呼ぶ)と、Mos1トランスポゼースとpKaの同時産生のためのもの(Tnp/pKa株と呼ぶ)の、2つのER2566細菌株(New England Biolabs)を用いた。この株では、産生されたトランスポゼースは細菌内でpKaによりリン酸化される。
pKaの不在下でのMos1トランスポゼース(従って非リン酸化型)の産生のためのもの(Tnp株と呼ぶ)と、Mos1トランスポゼースとpKaの同時産生のためのもの(Tnp/pKa株と呼ぶ)の、2つのER2566細菌株(New England Biolabs)を用いた。この株では、産生されたトランスポゼースは細菌内でpKaによりリン酸化される。
細菌株を作製するためにER2566細菌を下記のもので形質転換した。
・100ngのプラスミドpMalC2X−Tnp(Tnp株)(形質転換した細菌は寒天+アンピシリン(100μg/ml)上で選択した)
・100ngのプラスミドpMalC2X−Tnp+100ngのプラスミドPET−pKa(Tnp/pKa株)(形質転換した細菌は寒天+アンピシリン(100μg/ml)+カナマイシン(100μg/ml)上で選択した)
III. ER2566細胞(Tnp)および(Tnp/pKa)におけるMos1トランスポゼースの産生および精製
・100ngのプラスミドpMalC2X−Tnp(Tnp株)(形質転換した細菌は寒天+アンピシリン(100μg/ml)上で選択した)
・100ngのプラスミドpMalC2X−Tnp+100ngのプラスミドPET−pKa(Tnp/pKa株)(形質転換した細菌は寒天+アンピシリン(100μg/ml)+カナマイシン(100μg/ml)上で選択した)
III. ER2566細胞(Tnp)および(Tnp/pKa)におけるMos1トランスポゼースの産生および精製
III.1 産生
50mlのBBC培地(ブレイン・ハート・インフュージョン培地−AES)に、形質転換ディッシュから直接採取した5〜10(Tnp)クローンまたは5〜10(Tnp/pKa)クローンを接種した。培地に、(Tnp)株にはアンピシリン(100μg/ml)を、または(Tnp/pKa)株にはアンピシリン、(Tnp/pKa)株には+カナマイシン(100μg/ml)を添加した。これらの細菌をすぐにIPTG(最終1mM)で誘導し、飽和培養物が得られるまで25℃で攪拌した。培養時間は(Tnp)株では通常16〜20時間であり、(Tnp/pKa)株では30〜36時間であった。
50mlのBBC培地(ブレイン・ハート・インフュージョン培地−AES)に、形質転換ディッシュから直接採取した5〜10(Tnp)クローンまたは5〜10(Tnp/pKa)クローンを接種した。培地に、(Tnp)株にはアンピシリン(100μg/ml)を、または(Tnp/pKa)株にはアンピシリン、(Tnp/pKa)株には+カナマイシン(100μg/ml)を添加した。これらの細菌をすぐにIPTG(最終1mM)で誘導し、飽和培養物が得られるまで25℃で攪拌した。培養時間は(Tnp)株では通常16〜20時間であり、(Tnp/pKa)株では30〜36時間であった。
III.2 精製
細菌培養物を遠心分離し(5000rpm、10分、4℃)、残渣を5mlのバッファー(20mM Tris pH9、100mM NaCl、1mM DTT)に採った。細菌を20mg/ml濃度のリソチーム800μlにより4℃で30分間溶解させた。この細菌溶解物を遠心分離し(10,000rpm、15分、4℃)、上清を回収した。これが粗抽出物となった。
細菌培養物を遠心分離し(5000rpm、10分、4℃)、残渣を5mlのバッファー(20mM Tris pH9、100mM NaCl、1mM DTT)に採った。細菌を20mg/ml濃度のリソチーム800μlにより4℃で30分間溶解させた。この細菌溶解物を遠心分離し(10,000rpm、15分、4℃)、上清を回収した。これが粗抽出物となった。
2種類の抽出物(TnpおよびTnp/pKa)中に含まれる融合タンパク質MBP−Tnpを、供給者の使用説明書に従い(New England Biolabs)、マルトース樹脂で精製した。溶離した画分をブラドフォード法に従ってアッセイした。
IV. (Tnp)および(Tnp/pKa)株から生じる純粋なMos1トランスポゼースの分析
IV. (Tnp)および(Tnp/pKa)株から生じる純粋なMos1トランスポゼースの分析
IV.1 安定性
精製トランスポゼースをSDS−pageゲル(重層:4%アクリルアミドpH6.8‐分離:11%アクリルアミドpH8.8)で分析した。1〜2μgの純粋なタンパク質を分子量マーカー(Promega)とともにゲルに付着させた。1時間の電気泳動後、ゲルをクーマシーブルーで染色した。
精製トランスポゼースをSDS−pageゲル(重層:4%アクリルアミドpH6.8‐分離:11%アクリルアミドpH8.8)で分析した。1〜2μgの純粋なタンパク質を分子量マーカー(Promega)とともにゲルに付着させた。1時間の電気泳動後、ゲルをクーマシーブルーで染色した。
IV.2 活性
精製したトランスポゼースを、in vitro転移試験を用いて転移を媒介するそれらの能力に関して試験した。
精製したトランスポゼースを、in vitro転移試験を用いて転移を媒介するそれらの能力に関して試験した。
(Tnp)系統または(Tnp/pKa)系統のいずれかに由来する80nMのトランスポゼースを、バッファー(10mM Tris pH9、50mM NaCl、1mM DTT、20mM MgCl2、5mM EDT、10%グリセロール)中、100ngのBSAの存在下、30℃で0〜60分の範囲の時間、600ngのプラスミドpBC3Tet3とともにインキュベートした。4μgのプロテイナーゼKおよび0.15%のSDS、65℃で5分間、その後、37℃で30分間により反応を停止させた。DNAを、フェノール/クロロホルム抽出の後、アルコール中、1μgのtRNAの存在下での沈殿により精製した。DNA残渣を20μlの水に採った。2μlを用いてJM109細菌(活性大腸菌)を形質転換した。形質転換後、得られた培養物をLB−クロラムフェニコールディッシュ(150μg/ml)(1/1000希釈液40μl)上、およびLB−テトラサイクリンディッシュ(12.5μg/ml)(全培地(1ml)は無希釈)で滴定した。ディッシュを37℃で24時間インキュベートした。翌日、LB−クロラムフェニコールおよびLB−テトラサイクリンのコロニーを計数した後、全細菌数(クロラム+テトラ)に対するテトラサイクリン耐性細菌数から、転移頻度を算出した。
B−結果
B−結果
図3は、Mos1トランスポゼースは、pKaの存在下で産生される場合には安定性が高いことを示す。この安定化はタンパク質分解の大幅な低下によるものであることがわかる。このことは図3で、系統4と5では自己タンパク質分解の産物が見られないが、系統2(pKaの不在下で産生されたトランスポゼース)では明瞭であることにより示される。
pKaの存在下で産生されたトランスポゼースがなお転移において活性であることを確認するために、in vitro転移試験を行った。結果を図4に示す。それらは、pKaの存在下で産生されたトランスポゼース(点線)は、pKaの不在下で産生されたトランスポゼース(実線)よりも、それほど高くはなくとも効果的であることを示す。pKaの存在下で産生されたトランスポゼースのこの有効性の上昇は、試験過程で分解されないこのタンパク質の安定化と直接関連があり得る。
次の図面は単に例示のために示すものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
MLE転移の概略図。TMP:トランスポゼース、gDNA:ゲノムDNA
Mos1トランスポゼースのタンパク質配列。配列間で切断が行われるアミノ酸(切断部位)を薄いグレーで強調している。pKaによる可能性のあるリン酸化部位を下線で示し、濃いグレーで示している。タンパク質分解活性を有すると思われる領域(活性部位)は白地に影を付けた。
クーマシーブルーで染色したSDS−pageゲル。 MW:分子量マーカー(Promega) 1:ER2566株の粗タンパク質抽出物(Tnp) 2:ER2566株由来の精製MBP−Tnp(Tnp)。このTnp分解の産物はMW約60kDaの二量体形態であると思われる。 3:ER2566株の粗タンパク質抽出物(Tnp/pKa) 4および5:ER2566株由来の精製MBP−Tnp(Tnp/pKa)の2つの異なる調製物
in vitro転移試験 点線:ER2566株から精製した純粋なMBP−Tnp(Tnp/pKa)で行った試験。 実線:ER2566株から産生された純粋なMBP−Tnp(Tnp)で行った試験。
Claims (22)
- マウリチアナ(Mauritiana)亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性かつ安定なトランスポゼースの原核生物宿主細胞による生産方法であって、
少なくとも下記の
a)該活性トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターにクローニングする工程、
b)cAMP依存性タンパク質キナーゼ(pKa)の活性触媒サブユニットをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターにクローニングする工程、
c)該宿主細胞を該発現ベクターで形質転換する工程、
d)該宿主細胞により該ヌクレオチド配列を発現させる工程、および
e)pKaのリン酸化により活性かつ安定化されたトランスポゼースを得る工程
を含む、方法。 - 前記活性トランスポゼースが機能亢進突然変異型トランスポゼースである、請求項1に記載の方法。
- 工程e)で得られる活性かつ安定なトランスポゼースの精製工程も含む、請求項1または2に記載の方法。
- 工程a)およびb)のクローニングが単一の発現ベクターで行われる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 活性トランスポゼースをコードする前記ヌクレオチド配列とpKaをコードする前記ヌクレオチド配列の発現が同じ調節因子の制御下にある、請求項4に記載の方法。
- 前記原核生物宿主細胞が細菌細胞である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細菌が大腸菌(Escherichia coli)である、請求項6に記載の方法。
- 前記マリナー可動性遺伝因子がMos1である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、マウリチアナ亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性かつ安定なトランスポゼース。
- 少なくとも
a)マウリチアナ亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列と、
b)cAMP依存性タンパク質キナーゼ(pKa)の活性触媒サブユニットをコードするヌクレオチド配列
を含む、原核生物宿主細胞。 - 前記活性トランスポゼースが機能亢進突然変異型トランスポゼースである、請求項10に記載の原核生物宿主細胞。
- 前記ヌクレオチド配列a)とb)が複数の発現ベクターにクローニングされている、請求項10または11に記載の原核生物宿主細胞。
- 前記ヌクレオチド配列a)とb)が一つの発現ベクターにクローニングされている、請求項10または11に記載の原核生物宿主細胞。
- 細菌細胞である、請求項10〜13のいずれか一項に記載の原核生物宿主細胞。
- 前記細菌が大腸菌(Escherichia coli)である、請求項14に記載の原核生物宿主細胞。
- 前記マリナー可動性遺伝因子がMos1である、請求項10〜15のいずれか一項に記載の原核生物宿主細胞。
- 少なくとも
a)マウリチアナ亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列と、
b)cAMP依存性タンパク質キナーゼ(pKa)の活性触媒サブユニットをコードするヌクレオチド配列
を含む、発現ベクター。 - 前記活性トランスポゼースが機能亢進突然変異型トランスポゼースである、請求項17に記載の発現ベクター。
- 前記マリナー可動性遺伝因子がMos‐1である、請求項17または18に記載の発現ベクター。
- 請求項9に記載の少なくとも1つの活性かつ安定なトランスポゼースを含む、挿入突然変異誘発および/またはシーケンシングおよび/またはクローニングキット。
- 標的DNA配列において対象とする転移可能なDNA配列のin vitro転移のための、請求項9に記載の少なくとも1つの活性かつ安定なトランスポゼースの使用。
- 標的DNA配列において対象とする転移可能なDNA配列のin vivo転移から生じる薬剤の製造のための、請求項9に記載の少なくとも1つの活性かつ安定なトランスポゼースの使用。
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