EP1957649A1 - Procede de production chez les procaryotes de transposases actives et stables d'elements genetiques mobiles mariner - Google Patents

Procede de production chez les procaryotes de transposases actives et stables d'elements genetiques mobiles mariner

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EP1957649A1
EP1957649A1 EP06830106A EP06830106A EP1957649A1 EP 1957649 A1 EP1957649 A1 EP 1957649A1 EP 06830106 A EP06830106 A EP 06830106A EP 06830106 A EP06830106 A EP 06830106A EP 1957649 A1 EP1957649 A1 EP 1957649A1
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EP
European Patent Office
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transposase
active
host cell
stable
mariner
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06830106A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Corinne Auge-Gouillou
Yves Bigot
Benjamin Brillet
Stéphanie GERMON
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Tours
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Francois Rabelais de Tours
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Francois Rabelais de Tours filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1957649A1 publication Critical patent/EP1957649A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the field of molecular biology relating to transposable elements.
  • the invention relates more particularly to the improvement of the properties of natural transposases of mariner mobile genetic elements, for the purpose of their use in biotechnologies.
  • the present invention relates to a method for producing, by a prokaryotic host cell, an active and stable transposase of a mobile mariner genetic element belonging to the subfamily mauritiana.
  • the invention also relates to an active and stable transposase capable of being produced using such a method, as well as molecular biological tools, such as prokaryotic host cells, expression vectors, kits, which allow to produce an active and stable transposase, or which implement it.
  • molecular biological tools such as prokaryotic host cells, expression vectors, kits, which allow to produce an active and stable transposase, or which implement it.
  • the present invention is directed to the uses of active and stable transposases.
  • Transposable elements or mobile genetic elements (EGMs) are small DNA fragments that are able to move from one chromosomal site to another (Renault et al., 1997). These DNA fragments are characterized by inverted repeat sequences (ITRs) located at the 5 'and 3' terminal positions.
  • ITRs inverted repeat sequences located at the 5 'and 3' terminal positions.
  • An enzyme encoded by the TE itself, the transposase catalyzes the transposition process of the latter.
  • TEs have been identified in both prokaryotes and eukaryotes (see a reference work in this area: Craig et al., 2002).
  • TEs are divided into two classes according to their transposition mechanism.
  • Class I elements or retrotransposons, transpose via reverse transcription of an RNA intermediate.
  • class II elements transpose directly from one chromosomal site to another, via a DNA intermediate, according to a "cut and paste" mechanism.
  • insertion sequences such as IS7
  • transposons such as Tn5.
  • class II elements comprise five families: P, PiggyBac, hAT, helitron and Td -mariner.
  • Mobile genetic elements mariner or MLE for "mariner-like elements" constitute a large group of class II TEs, belonging to the Tc1-mar / ner superfamily (Plasterk et al., 1999).
  • TE transposases to mobilize more or less long, homologous or heterologous DNA fragments, including sequences of interest, for insertion into target nucleic acids, in particular in the chromosome of a host, has been and is still widely used in the field of biotechnology, particularly in the field of genetic engineering.
  • MLEs have particularly advantageous properties for use in biotechnology, especially in genetic engineering and functional genomics.
  • the following properties may for example be cited in a nonlimiting manner:
  • MLEs are small transposons that are easy to handle.
  • the mechanism for transposition of MLEs is simple. Indeed, the transposase is able to catalyze, by itself, all the steps of the transposition of the MLEs. It is also necessary and sufficient to ensure the mobility of MLEs in the absence of host factors (Lampe et al., 1996).
  • MLEs are characterized by very wide ubiquity in prokaryotes and eukaryotes. The first MLE, Dmmari, also called Mos1, was found in Drosophila mauritiana by Jacobson and Hartl (1985). Subsequently, many related elements have been identified in genomes belonging in particular to bacteria, protozoa, fungi, plants, invertebrates, cold-blooded vertebrates and mammals.
  • MLEs The transpositional activity of MLEs is highly specific, and does not induce host genome "resistance” mechanisms, such as methylation interference phenomena [MIP; Jeong et al. (2002); Martienssen and Colot (2001)] or via RNAs [RNAi; Ketting et al. (1999); Tabara et al. (1999)]. Transposition events can be controlled by various factors, such as temperature, the presence of certain divalent cations, and pH.
  • the gene encoding the transposase is replaced by a "tag" DNA.
  • the transposase must be provided in trans in protein form.
  • the gene encoding the transposase is replaced by the exogenous DNA to be transferred.
  • the transposase must be provided in trans via an expression plasmid, a messenger RNA or the protein itself.
  • transposase In each of these applications, it is therefore essential to have an active transposase in sufficient quantities.
  • the transposase is indeed necessary and sufficient to ensure the entire process of transposition.
  • MLE transposase in addition to its ability to mediate transposition, MLE transposase is also able to self-proteolyze. This irreversible process is presumably involved in a mechanism of self-control, by the transposase itself, of the maximum amount of active transposase present in a cell.
  • MLE transposases pose practical difficulties in terms of quality and stability. This is particularly true for applications such as in vitro transposition or when the transposase itself (i.e., in protein form) is provided to the cells for ex vivo rearrangement.
  • transposases are unstable when produced in a prokaryotic system. (typically, in bacterial system). Batches of purified transposase are generally contaminated with proteolytic fragments of the protein. These fragments are specific for each transposase.
  • a first aspect of the present invention relates to a method for producing, by a prokaryotic host cell, an active and stable transposase of a mobile mariner genetic element belonging to the subfamily mauritiana, comprising at least the following steps: a) cloning the nucleotide sequence encoding said active transposase into an expression vector; b) cloning the nucleotide sequence encoding the active catalytic subunit of the cAMP-dependent protein kinase (pKa) into an expression vector; c) transforming said host cell with said expression vectors; d) the expression of said nucleotide sequences by said host cell; and e) obtaining the active transposase stabilized by phosphorylation by pKa.
  • a "prokaryotic host cell” is defined herein in accordance with the usual meaning in the art. It will preferably be a bacterial cell. For example, those skilled in the art may advantageously choose Escherichia coli cells.
  • transposase activity or “transposase function”
  • transposases targeted within the scope of the present invention are “active transposases”, that is to say transposases capable of mediating the transposition of an MLE.
  • active transposases that is to say transposases capable of mediating the transposition of an MLE.
  • they can be hyperactive if the transposition activity has been improved by directed mutagenesis.
  • hyperactive mutant transposases Such transposases have been described in the French patent application published under the number FR 2 850 395 (filed 28/01/2003).
  • stable transposase is meant here a transposase whose self-proteolysis is significantly reduced, or even advantageously prevented. We can talk more generally about “inhibition”.
  • a “stable” transposase is such that at least 70%, preferably at least 75%, more preferably at least 80%, at least 85%, at least 90%, and most preferably all, at least 95%, or even at least 98% or even more (ideally 100%), of proteolysis at each site.
  • the self-proteolysis (also referred to herein as "proteolysis") of transposases involves an "active site", i.e.
  • cleavage sites i.e. between one and three target sequences of proteolytic cleavage.
  • two major cleavage sites were identified. They are positioned between amino acids 80/81 and amino acids 101/102.
  • a minor cleavage site is located between amino acids 169/170 (see Figure 2).
  • the "Mautiana subfamily” gathers the MLEs whose transposases are coded by sequences having, throughout their length or at the levels of the regions coding the N- and C-terminal domains only, a sufficient level of homology; at least 75%, to be included in the same sequence as the four sequences below, in phylogenetic studies using parsimony methods and "Neighbor-Joining" on a set of 1000 subsamples (1000 bootstrap) [see Felsenstein (1993) and Augé-Gouillou et al. (2000)]: - Mos1 transposase (Fig. 2, EMBL access PID: X78906); - Mdmar-1 transposase of Mayetiola destructor (EMBL access ISP:
  • the mobile genetic element considered here is Mos1.
  • nucleotide sequence or “nucleic acid” according to the invention is in accordance with the usual meaning in the field of biology. These two expressions cover indifferently DNAs and RNAs, the former being able to be for example genomic, plasmidic, recombinant, complementary (cDNA), and second, messengers (mRNA), ribosomal (rRNA), transfer (tRNA).
  • cDNA complementary to DNA
  • mRNA messengers
  • rRNA ribosomal
  • transfer tRNA
  • nucleotide and nucleic acid sequences of the invention are DNAs.
  • nucleotide sequence encoding the active catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase (pKa) has been described by Strausberg et al. (2002). It is notably accessible in the NBRF-PIR database under the access number AAH 54834.
  • the method which is the subject of the invention further comprises a step of purification of the active and stable transposase obtained in step e).
  • this purification step consists in purifying, by conventional methods customary for those skilled in the art, the protein fraction having the desired enzymatic activity, but not necessarily the enzyme itself.
  • the terms "pure enzyme” or “pure transposase” may therefore designate either the purified active protein fraction or, where appropriate, the purified enzyme.
  • the presence of contaminating substances, including that of other proteins, in a minority quantity is not necessarily excluded, since the transposase activity of interest is preserved, and that only this activity is detected.
  • the detection of the enzymatic activity of interest can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art (Ausubel et al., 1994).
  • the cloning of steps a) and b) are carried out in a single expression vector.
  • the expression of the two nucleotide sequences is placed under the control of the same regulatory elements.
  • a second aspect of the present invention relates to an active and stable transposase mariner mobile genetic element belonging to the subfamily mauritiana, obtainable by a method as described supra.
  • the present invention provides a prokaryotic host cell, as defined above, which comprises at least: a) the nucleotide sequence encoding an active transposase of a mobile mariner genetic element belonging to the subfamily mauritiana; and b) the nucleotide sequence encoding pKa.
  • the active transposase may be a mutant hyperactive transposase, as has been specified above.
  • the nucleotide sequences a) and b) are cloned into expression vectors. Alternatively, these sequences are cloned into a single expression vector.
  • a fourth aspect of the present invention relates to an expression vector characterized in that it comprises at least: a) the nucleotide sequence coding for an active transposase of a mobile mariner genetic element belonging to the Mautiana subfamily; and b) the nucleotide sequence encoding pKa.
  • the active transposase may advantageously be a hyperactive mutant transposase, as described above.
  • the present invention relates to a kit comprising at least one active and stable transposase according to the invention.
  • a kit may further comprise one or more elements chosen from, among others, marine Mos1 pseudo-transposons (DNA), a buffer compatible with the transposase (s), a "stop" buffer for stopping the transposition reactions, one or more control DNAs (reaction controls), oligonucleotides useful for reaction sequencing, competent bacteria, etc.
  • DNA marine Mos1 pseudo-transposons
  • s buffer compatible with the transposase
  • stop for stopping the transposition reactions
  • control DNAs reaction controls
  • oligonucleotides useful for reaction sequencing competent bacteria, etc.
  • the present invention is directed to the use of at least one active and stable transposase according to the above, for the in vitro transposition of a transposable DNA sequence of interest in a target DNA sequence.
  • the present invention also relates to the use of at least one active and stable transposase as defined above, for the in vivo transposition of a transposable DNA sequence of interest in a target DNA sequence.
  • the invention furthermore relates to the use of at least one active and stable transposase according to the invention, for the preparation of a medicament resulting from the in vivo transposition of a transposable DNA sequence of interest. in a target DNA sequence.
  • the invention provides a method for preparing a medicament, comprising at least one step of transposing a transposable DNA sequence of interest into a target DNA sequence, said transposition being mediated by at least one active and stable transposase according to the invention.
  • the drug can thus be prepared ex vivo if the transposition is performed in vitro, or in situ if the transposition takes place in vivo.
  • the target DNA sequence is typically the host genome, which may be an organism, eukaryotic or prokaryotic, or a tissue of an organism, or a cell of an organism or of a fabric.
  • kits according to the invention for insertional mutagenesis and / or sequencing and / or cloning.
  • insertional mutagenesis and / or sequencing and / or cloning are conventional molecular biology techniques well known to those skilled in the art, for which the means of the invention are of great interest.
  • FIG. 1 Schematic representation of the transposition of MLEs.
  • Tnp transposase
  • GDNA genomic DNA.
  • FIG. 2 Protein sequence of the Mos1 transposase. Amino acids between which cleavage occurs (cleavage sites) are noted in light gray. The putative sites of phosphorylation by pKa are underlined and framed in dark gray. The region potentially carrying proteolytic activity ("active site”) is localized by a clear frame.
  • Tnp MBP-Tnp purified from strain ER2566 (Tnp); The degradation products of Tnp appear as a doublet of PM ⁇ 60 kDa.
  • the pMalC2x-Tnp vector (Augé-Gouillou et al, 2005) derives from pMalC2x (New England Biolabs, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, France). It allows a bacterial expression of the N-terminal fused transposase to the MBP protein (Maltose binding protein), following the induction of pLac by NPTG.
  • the plasmid carries the ampicillin resistance gene.
  • the vector pET-pKa is derived from the vector pET26b + (Novagen). It allows a bacterial expression of pKa under the control of the pol7 promoter. This expression is therefore restricted to bacteria that express T7 DNA polymerase, such as E. coli strains BL21 or ER2566. PET-pKa carries a kanamycin resistance gene.
  • PBC 3Tet3 is a plasmid donor of pseudo mariner Mos1 (Augé-Gouillou et al, 2001). It contains the tetracycline resistance gene "OFF" (that is to say without promoter) bordered by two 3 'ITRs. Transposition is detected by tagging promoter, placing the pseudo-transposon downstream of a promoter, which activates tetracycline resistance.
  • the vector also carries the chloramphenicol resistance gene.
  • the pKa coding fragment was prepared from the plasmid CAT / pRESTe, provided by Dr. Suzan Taylor [Harward Hughes Medical Institute - USCD-La Joita CA 92093 - United States of America] by Ndel / HindIII digestion and eluted on 0.8% agarose gel (TAE1X: 0.04M Tris-Acetate, 1mM EDTA pH8).
  • Plasmid pET26b + was digested with NdeI / HindIII, deposited on an agarose gel, eluted and then ligated with the pKa coding fragment overnight at 16 ° C. Recircularization control of the plasmid on itself was performed by ligation of the plasmid in the absence of pKa coding fragment.
  • the ligation product was used to transform E. coli JM109 bacteria which were subsequently selected on LB-kanamicyne (100 mcg / ml). 4 clones resistant to ampicillin were cultured for plasmid extraction. The mini-DNA preparations were monitored by NdeI / HindIII digestion and then by 0.8% agarose gel electrophoresis (1X TAE) to ensure that the plasmids integrated the pKa gene.
  • Two bacterial strains ER2566 (New England Biolabs) were used: one (said Tnp strain) to produce the Mos1 transposase in the absence of the pKa (therefore not phosphorylated) and the second (known as the Tnp / pKa strain) to co-produce the transposase of Mos1 and pKa.
  • Tnp bacterial strain
  • Tnp / pKa strain the second (known as the Tnp / pKa strain) to co-produce the transposase of Mos1 and pKa.
  • the transposase produced will be phosphorylated in the bacterium by pKa.
  • plasmid pMalC2x-Tnp strain Tnp
  • the transformed bacteria were selected on agar + ampicillin (100 ⁇ g / ml).
  • the transformed bacteria were selected on agar + ampicillin (100 ⁇ g / ml) + kanamicyne (100 ⁇ g / ml).
  • the bacterial cultures were centrifuged (5000 rpm, 10 min, 4 ° C) and the pellet taken up in 5 ml of a 20 mM buffer pH9, 100 mM NaCl, 1 mM DTT.
  • the bacteria were lysed with 800 ⁇ l of lysosyme at 20 mg / ml for 30 minutes at 4 ° C.
  • the bacterial lysate was centrifuged (10,000 rpm, 15 min, 4 ° C) and the supernatant collected: it was the crude extract.
  • the MBP-Tnp fusion protein contained in both types of crude extract was purified on a maltose resin following the recommendations of the supplier (New England Biolabs). The eluted fractions were assayed according to the Bradford method.
  • the purified transposases were analyzed in gel SDS-page
  • transposases were tested for their ability to mediate transposition using an in vitro transposition test. 80 nM of transposase resulting from either the line (Tnp) or the line
  • Tnp / pKa were incubated with 600 ng of plasmid pBC3Tet3 at 30 ° C., in a buffer of 10 mM tris pH9, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 20 mM MgCl 2 , 5 mM EDTA, 10% glycerol, in the presence 100ng of BSA, for varying times from 0 to 60 minutes.
  • the reaction was stopped 4 ⁇ g Proteinase K and 0.15% SDS for 5 minutes at 65 ° C and then 30 minutes at 37 ° C.
  • the DNAs were purified by phenol / chloroform extraction followed by alcoholic precipitation, in the presence of 1 ⁇ g of tRNA.
  • the DNA pellets were taken up in 20 ⁇ l of water; 2 ⁇ l were used to transform competent JM109 (E. coli) bacteria. After transformation, the culture obtained was titrated on LB-chloramphenicol box (150 ⁇ g / ml) (40 ⁇ l of a 1/1000 dilution) and on LB-tetracycline box (12.5 ⁇ g / ml) (the whole - 1 ml - undiluted culture). The boxes were placed at 37 ° C for 24 hours.
  • FIG. 3 shows that the Mos1 transposase is more stable when produced in the presence of pKa. This stabilization results in a sharp decrease in proteolysis. It is illustrated in FIG. 3 by the disappearance of the autoproteolysis products on lanes 4 and 5, whereas these are very visible on lane 2 (transposase produced in the absence of pKa).
  • in vitro transposition tests were carried out. The results are reported in FIG. 4. They show that a transposase produced in the presence of pKa (in dashed line) is as effective, or even more, than a transposase produced in the absence of pKa (in solid line).
  • the increased efficiency of the transposase produced in the presence of pKa can be directly correlated to the stabilization of the protein which does not degrade during the test.

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Abstract

La présente invention a pour objet un procédé de production, par une cellule hôte procaryote, d'une transposase active et stable d'un élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana. L'invention concerne également une transposase active et stable susceptible d'être produite à l'aide d'un tel procédé, ainsi que les outils de biologie moléculaire, tels que les cellules hôtes procaryotes, les vecteurs d'expression, les kits, qui permettent de produire une transposase active et stable, ou qui la mettent en oeuvre. En outre, la présente invention vise les utilisations des transposases actives et stables.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION CHEZ LES PROCARYOTES DE TRANSPOSASES ACTIVES ET STABLES D'ELEMENTS GENETIQUES MOBILES Mariner
La présente invention se rapporte au domaine de la biologie moléculaire relative aux éléments transposables. L'invention concerne plus particulièrement l'amélioration des propriétés des transposases naturelles d'éléments génétiques mobiles mariner, aux fins de leur utilisation en biotechnologies.
La présente invention a pour objet un procédé de production, par une cellule hôte procaryote, d'une transposase active et stable d'un élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana.
L'invention concerne également une transposase active et stable susceptible d'être produite à l'aide d'un tel procédé, ainsi que les outils de biologie moléculaire, tels que les cellules hôtes procaryotes, les vecteurs d'expression, les kits, qui permettent de produire une transposase active et stable, ou qui la mettent en oeuvre.
En outre, la présente invention vise les utilisations des transposases actives et stables.
Les éléments transposables (TE) ou éléments génétiques mobiles (EGM) sont des fragments d'ADN de petite taille, capables de se déplacer d'un site chromosomique à un autre (Renault et al., 1997). Ces fragments d'ADN sont caractérisés par des séquences répétées inversées (ITR) situées en positions 5' et 3' terminales. Une enzyme codée par les TE eux-mêmes, la transposase, catalyse le processus de transposition de ces derniers.
Des TEs ont été identifiés tant chez les procaryotes que chez les eucaryotes (voir un ouvrage de référence dans ce domaine : Craig et al., 2002).
Les TEs sont répartis en deux classes d'après leur mécanisme de transposition. D'une part, les éléments de classe I, ou rétrotransposons, transposent via la transcription inverse d'un intermédiaire ARN. D'autre part, les éléments de classe II transposent directement d'un site chromosomique à un autre, via un intermédiaire ADN, selon un mécanisme de type « couper-coller ». Chez les procaryotes, un grand nombre de TEs ont été répertoriés à ce jour. L'on peut citer, par exemple, des séquences d'insertion telles que IS7, et des transposons, tel Tn5.
Chez les eucaryotes, les éléments de classe II comprennent cinq familles : P, PiggyBac, hAT, hélitron et Td -mariner. Les éléments génétiques mobiles mariner (ou MLE pour « mariner- like éléments ») constituent un grand groupe de TEs de classe II, appartenant à la superfamille Tc1-mar/ner (Plasterk et al., 1999).
La capacité des transposases de TE à mobiliser des fragments d'ADN plus ou moins longs, homologues ou hétérologues, comprenant des séquences d'intérêt, pour les insérer dans des acides nucléiques cibles, en particulier dans le chromosome d'un hôte, a été et est encore largement mise à profit dans le domaine des biotechnologies, notamment dans le domaine du génie génétique.
Parmi les TEs, les MLEs présentent des propriétés particulièrement avantageuses pour une utilisation en biotechnologie, notamment en ingénierie génétique et génomique fonctionnelle. L'on peut par exemple citer de manière non limitative les propriétés suivantes :
(i) Les MLEs sont des transposons de petite taille, faciles à manipuler. (ii) Le mécanisme de transposition des MLEs est simple. En effet, la transposase est capable de catalyser, à elle seule, toutes les étapes de la transposition des MLEs. Elle est d'ailleurs nécessaire et suffisante pour assurer la mobilité des MLEs en l'absence de facteurs de l'hôte (Lampe et al., 1996). (iii) Les MLEs se caractérisent par une très large ubiquité chez les procaryotes et les eucaryotes. Le premier MLE, Dmmari, également appelé Mos1, a été découvert chez Drosophila mauritiana par Jacobson et Hartl (1985). Par la suite, de nombreux éléments apparentés ont été identifiés dans des génomes appartenant notamment à des bactéries, protozoaires, champignons, plantes, invertébrés, vertébrés à sang froid et mammifères.
(iv) L'activité transpositionnelle des MLEs est hautement spécifique, et n'induit pas de mécanismes de « résistance » du génome de l'hôte, tels que des phénomènes d'interférences par méthylation [MIP ; Jeong et al. (2002) ; Martienssen et Colot (2001 )] ou via des ARN [RNAi ; Ketting et al. (1999) ; Tabara et al. (1999)]. Les événements de transposition peuvent être contrôlés par divers facteurs, tels la température, la présence de certains cations divalents et le pH.
En conséquence, les applications potentielles des MLEs en biotechnologie, notamment comme outils de recombinaison génétique, sont considérables. Typiquement, pour des applications de mutagenèse insertionnelle in vitro, le gène codant la transposase est remplacé par un ADN « étiquette ». La transposase doit être fournie en trans sous forme protéique. Pour des applications de transfert de gènes in vivo ou in vitro, le gène codant la transposase est remplacé par l'ADN exogène à transférer. La transposase doit être fournie en trans via un plasmide d'expression, un ARN messager ou la protéine elle-même.
Dans chacune de ces applications, il est donc essentiel de disposer d'une transposase active en quantités suffisantes. La transposase est en effet nécessaire et suffisante pour assurer la totalité du processus de transposition. Cependant, en sus de son aptitude à médier la transposition, la transposase des MLEs est également capable de s'auto- protéolyser. Ce processus irréversible est vraisemblablement impliqué dans un mécanisme d'auto-contrôle, par la transposase elle-même, de la quantité maximum de transposase active présente dans une cellule. Ainsi, il semblerait que le phénomène d'OPI (pour « Over Production Inhibition »), décrit par Lohe et al (1996), selon lequel la fréquence de transposition de Mos1 diminue lorsque la transposase est surexprimée dans une cellule, soit dû à l'auto-protéolyse de la transposase surexprimée.
C'est pourquoi, les transposases de MLE posent en pratique des difficultés liées à leur qualité et leur stabilité. Ceci est particulièrement vrai pour des applications telles que la transposition in vitro ou lorsque la transposase elle-même (c'est-à-dire sous forme protéique) est fournie aux cellules pour la transposition ex vivo.
Ainsi, partout à travers le monde, dans l'industrie comme dans les laboratoires de recherche, les équipes qui utilisent des transposases eucaryotes (mariner ou autres) sont confrontées à un problème récurrent : les transposases sont instables lorsqu'elles sont produites en système procaryote (typiquement, en système bactérien). Les lots de transposase purifiée sont généralement contaminés par des fragments protéolytiques de la protéine. Ces fragments sont spécifiques de chaque transposase.
Bien que ce problème d'instabilité des transposases ne soit pas rapporté dans la littérature scientifique, il a eu jusqu'à présent pour conséquence de limiter de manière considérable l'intérêt pratique des MLEs naturels, dans la mesure où industriels et chercheurs doivent disposer de transposases efficaces et stables afin de réduire le nombre de manipulations, le coût et le temps, nécessaires à la réalisation des transpositions recherchées.
Ceci explique qu'en définitive, la production en système procaryote, notamment en bactérie, qui est pourtant à ce jour le moyen le plus simple et le moins coûteux pour obtenir les quantités de transposase requises, soit encore peu exploitée, notamment dans l'industrie.
Il est donc primordial d'accroître la stabilité des transposases produites en système procaryote.
C'est précisément à ce besoin que répond l'objet de la présente invention, en fournissant des moyens qui permettent de stabiliser les transposases de MLEs produites en système procaryote et, plus particulièrement, en bactérie.
Ainsi, un premier aspect de la présente invention concerne un procédé de production, par une cellule hôte procaryote, d'une transposase active et stable d'un élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana, comprenant au moins les étapes suivantes : a) le clonage de la séquence nucléotidique codant ladite transposase active dans un vecteur d'expression ; b) le clonage de la séquence nucléotidique codant la sous-unité catalytique active de la protéine kinase AMPc-dépendante (pKa) dans un vecteur d'expression ; c) la transformation de ladite cellule hôte avec lesdits vecteurs d'expression ; d) l'expression desdites séquences nucléotidiques par ladite cellule hôte ; et e) l'obtention de la transposase active et stabilisée par phosphorylation par la pKa.
Une « cellule hôte procaryote » est définie ici conformément à l'acception usuelle dans le domaine. Il s'agira de préférence d'une cellule bactérienne. Par exemple, l'homme du métier pourra avantageusement choisir des cellules de Escherichia coli.
Les termes et expressions « activité », « fonction », « activité biologique » et « fonction biologique » sont équivalents et répondent à l'acception usuelle dans le domaine technique de l'invention. Dans le cadre précis de l'invention, l'activité en cause est l'activité enzymatique d'une transposase (« activité transposase » ou « fonction transposase »).
Les transposases visées dans le cadre de la présente invention sont des « transposases actives », c'est-à-dire des transposases capables de médier la transposition d'un MLE. Avantageusement, elles peuvent être hyperactives si l'activité de transposition a été améliorée par mutagénèse dirigée. On parlera alors ici de « transposases mutantes hyperactives ». De telles transposases ont été décrites dans la demande de brevet français publiée sous le numéro FR 2 850 395 (déposée le 28/01/2003).
L'on entend ici par « transposase stable », une transposase dont l'auto-protéolyse est réduite de manière significative, voire avantageusement empêchée. On pourra parler de manière plus générale d'« inhibition ». De préférence, une transposase « stable » est telle qu'on empêche au moins 70%, de préférence au moins 75%, de manière encore préférée au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, et de manière préférée entre toutes, au moins 95%, voire au moins 98% ou encore au- delà (idéalement 100%), de la protéolyse à chaque site. L'auto-protéolyse (également appelée ici « protéolyse ») des transposases implique un « site actif », c'est-à-dire une séquence porteuse de l'activité de protéolyse (dans la transposase Mos1, acides aminés 1 à 116 sur la Figure 2), et entre un et trois « sites de clivage », c'est-à-dire entre une et trois séquences cibles du clivage protéolytique. Dans la transposase Mos1, deux sites majoritaires de clivage ont été identifiés. Il sont positionnés entre les acides aminés 80/81 et les acides aminés 101/102. Un site minoritaire de clivage est situé entre les acides aminés 169/170 (voir Figure 2). La « sous-famille mauήtiana » rassemble les MLEs dont les transposases sont codées par des séquences présentant, sur toute leur longueur ou aux niveaux des régions codant les domaines N- et C- terminaux uniquement, un niveau d'homologie suffisant, c'est-à-dire d'au moins 75%, pour être incluses dans la même lignée que les quatre séquences ci-dessous, lors d'études phylogénétiques effectuées en utilisant les méthodes de parcimonie et « Neighbor-Joining » sur un ensemble de données de 1000 sous-échantillonnages (1000 « bootstrap ») [Voir Felsenstein (1993) et Augé-Gouillou et al. (2000)] : - transposase Mos1 (Fig. 2 ; ISPd'accès EMBL : X78906) ; - transposase Mdmar-1 de Mayetiola destructor (ISPd'accès EMBL :
U24436) ; - transposase Btmar-1 de Bombus terrestris (Bonnin et al., 2005) ; et
- transposase Momar-1 de Metaseuilius occidentalis (N°d'accès EMBL : U12279). De préférence, l'élément génétique mobile ici considéré est Mos1.
Une « séquence nucléotidique » ou un « acide nucléique » selon l'invention est conforme à l'acception usuelle dans le domaine de la biologie. Ces deux expressions couvrent indifféremment les ADN et les ARN, les premiers pouvant être par exemple génomiques, plasmidiques, recombinants, complémentaires (ADNc), et les seconds, messagers (ARNm), ribosomaux (ARNr), de transfert (ARNt). De manière préférée, les séquences nucléotidiques et acides nucléiques de l'invention sont des ADN.
La « séquence nucléotidique codant la sous-unité catalytique active de la protéine kinase AMPc-dépendante (pKa) » a été décrite par Strausberg et al. (2002). Elle est notamment accessible dans la base de données NBRF-PIR sous le numéro d'accès AAH 54834.
L'ensemble des étapes mises en œuvre dans le cadre du procédé objet de l'invention fait appel à des techniques classiques connues de l'homme du métier (voir, par exemple, Sambrook et Russel, 2001 ; Ausubel et al., 1994). En particulier, le terme « transformation » est ici revêtu d'un sens générique en ce qu'il couvre également, outre la transformation au sens strict, la transduction par un vecteur viral et la transfection, autant de techniques de biologie moléculaire parfaitement usuelles pour l'homme du métier.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé objet de l'invention comprend en outre une étape de purification de la transposase active et stable obtenue à l'étape e). Typiquement, cette étape de purification consiste à purifier, par des méthodes conventionnelles usuelles pour l'homme du métier, la fraction protéique possédant l'activité enzymatique recherchée, mais pas forcément l'enzyme elle-même. Les expressions « enzyme pure » ou « transposase pure » pourront donc désigner indifféremment la fraction protéique active purifiée ou, le cas échéant, l'enzyme purifiée. A l'issue de l'étape de purification, la présence de substances contaminantes, y compris celle d'autres protéines, en quantité minoritaire n'est pas nécessairement exclue, dès lors que l'activité transposase d'intérêt est préservée, et que seule cette activité est détectée. La détection de l'activité enzymatique d'intérêt peut être effectuée par des méthodes conventionnelles connues de l'homme du métier (Ausubel et al., 1994). Selon un autre mode de réalisation, les clonages des étapes a) et b) sont réalisés dans un seul vecteur d'expression. On pourra parler de « co-clonage » de la séquence nucléotidique codant la transposase active et de la séquence nucléotidique codant la pKa. Dans ce cas, avantageusement, l'expression des deux séquences nucléotidiques est placée sous le contrôle des mêmes éléments de régulation.
Un deuxième aspect de la présente invention concerne une transposase active et stable d'élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana, susceptible d'être obtenue par un procédé tel que décrit supra. Dans un troisième aspect, la présente invention vise une cellule hôte procaryote, telle que définie ci-dessus, qui comprend au moins : a) la séquence nucléotidique codant une transposase active d'un élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana ; et b) la séquence nucléotidique codant la pKa. Avantageusement, la transposase active pourra être une transposase mutante hyperactive, comme cela a été précisé plus haut.
Selon un mode de réalisation particulier, les séquences nucléotidiques a) et b) sont clonées dans des vecteurs d'expression. Alternativement, ces séquences sont clonées dans un seul vecteur d'expression. Un quatrième aspect de la présente invention a trait à un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend au moins : a) la séquence nucléotidique codant une transposase active d'un élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauήtiana ; et b) la séquence nucléotidique codant la pKa.
Là encore, la transposase active pourra avantageusement être une transposase mutante hyperactive, telle que décrite plus haut.
Dans un cinquième aspect, la présente invention concerne un kit comprenant au moins une transposase active et stable selon l'invention. Par exemple, un tel kit pourra en outre comprendre un ou plusieurs éléments choisis parmi, notamment, des pseudo-transposons mariner Mos1 (ADN), un tampon compatible avec la ou les transposases, un tampon "stop" pour arrêter les reactions de transposition, un ou plusieurs ADN contrôles (témoins de réaction), des oligonucléotides utiles pour le sequençage après réaction, des bactéries compétentes, etc.
D'autres aspects de l'invention sont relatifs aux utilisations des outils décrits supra.
Ainsi, la présente invention vise l'utilisation d'au moins une transposase active et stable conforme à ce qui précède, pour la transposition in vitro d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans une séquence d'ADN cible.
La présente invention vise également l'utilisation d'au moins une transposase active et stable telle que définie ci-dessus, pour la transposition in vivo d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans une séquence d'ADN cible.
L'invention s'intéresse en outre à l'utilisation d'au moins une transposase active et stable selon l'invention, pour la préparation d'un médicament résultant de la transposition in vivo d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans une séquence d'ADN cible. Par exemple, l'invention propose un procédé de préparation d'un médicament, comprenant au moins une étape de transposition d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans une séquence d'ADN cible, ladite transposition étant médiée par au moins une transposase active et stable selon l'invention. Le médicament peut ainsi être préparé ex vivo si la transposition est réalisée in vitro, ou bien in situ si la transposition a lieu in vivo.
Ces applications impliquent d'une manière générale la mise en œuvre d'une transposition in vitro ou in vivo, ce qui relève des connaissances générales de l'homme du métier dans le domaine de l'invention (Ausubel et al., 1994 ; Craig et al., 2002). Concernant plus particulièrement les transpositions in vivo, la séquence d'ADN cible est typiquement le génome de l'hôte, qui peut être un organisme, eucaryote ou procaryote, ou un tissu d'un organisme, ou encore une cellule d'un organisme ou d'un tissu.
Une autre application objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un kit selon l'invention pour la mutagénèse insertionnelle et/ou le séquençage et/ou le clonage. Il s'agit là de techniques conventionnelles de biologie moléculaire bien connues de l'homme du métier, pour lesquelles les moyens de l'invention se révèlent d'un grand intérêt.
Les figures suivantes sont fournies à titre purement illustratif et ne limitent en aucune façon l'objet de la présente invention.
- Figure 1 : Représentation schématique de la transposition des MLEs. Tnp : transposase ; ADNg : ADN génomique.
- Figure 2 : Séquence protéique de la transposase Mos1. Les acides aminés entre lesquels s'effectue le clivage (sites de clivage) sont notés en gris clair. Les sites putatifs de phosphorylation par la pKa sont soulignés et encadrés de gris foncé. La région potentiellement porteuse de l'activité protéolytique (« site actif ») est localisée par un cadre clair.
- Figure 3 : Gel SDS-page coloré au bleu de Coomassie. MW : marqueurs de taille protéiques (Promega)
1 : Extrait protéique brut de la souche ER2566 (Tnp)
2 : MBP-Tnp purifiée à partir de la souche ER2566 (Tnp) ; Les produits de dégradation de la Tnp apparaissent sous la forme d'un doublet de PM ≈ 60 kDa.
3 : Extrait protéique brut de la souche ER2566 (Tnp/pKa)
4 & 5 : 2 préparations différentes de MBP-Tnp purifiée à partir de la souche ER2566 (Tnp/pKa)
- Figure 4 : Test de transposition in vitro. En pointillé : test réalisé avec la MBP-Tnp pure produite à partir d'une souche ER 2566 (Tnp/pKa).
En trait continu : test réalisé avec la MBP-Tnp pure produite à partir d'une souche ER 2566 (Tnp).
La partie expérimentale ci-après, appuyée par des exemples et des figures, illustre, sans limitation, des modes de réalisation et avantages de l'invention.
A- MATERIEL ET METHODES
I. Vecteurs
1.1 Description
Le vecteur pMalC2x-Tnp (Augé-Gouillou et al, 2005) dérive du pMalC2x (New England Biolabs, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, France). Il permet une expression en bactérie de la transposase fusionnée en N-terminal à la protéine MBP (Maltose binding protein), suite à l'induction du pLac par NPTG. Le plasmide porte le gène de résistance à l'ampicilline.
Le vecteur pET-pKa est dérivé du vecteur pET26b+ (Novagen). Il permet une expression en bactérie de la pKa sous le contrôle du promoteur pol7. Cette expression est donc restreinte aux bactéries qui expriment la T7 DNA polymérase, comme les souches BL21 ou ER2566 d'E.coli. Le pET-pKa porte un gène de résistance à la kanamycine.
Le pBC 3Tet3 est un plasmide donneur de pseudo mariner Mos1 (Augé-Gouillou et al, 2001 ). Il contient le gène de résistance à la tétracycline « OFF » (c'est-à-dire sans promoteur) bordé par deux ITR 3'. La transposition est détectée par promoteur « tagging », plaçant le pseudo-transposon en aval d'un promoteur, qui active la résistance à la tétracycline. Le vecteur porte également le gène de résistance au chloramphénicol.
1.2 Construction
1.2.1 Préparation de l'ADN des vecteurs
Pour les différentes constructions, toutes les élutions d'ADN à partir d'un gel d'agarose ont été réalisées avec le kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, France). Toutes les minipréparations de plasmides à partir de cultures bactériennes ont été effectuées avec le kit
Wizard Plus minipreps (Promega).
1.2.2 pET-pKa
Le fragment codant la pKa a été préparé à partir du plasmide CAT/pRESTe, fourni par le Dr Suzan Taylor [Harward Hughes Médical Institute - USCD - La JoIIa CA 92093 - Etats-Unis d'Amérique] par digestion Ndel/Hindlll et élue sur gel 0,8% agarose (TAE1X : 0,04M Tris- Acétate, 1 mM EDTA pH8).
Le plasmide pET26b+ a été digéré par Ndel/Hindlll, déposé sur gel d'agarose, élue puis ligaturé avec le fragment codant la pKa, pendant une nuit à 16°C. Un contrôle de recircularisation du plasmide sur lui-même a été réalisé en effectuant une ligature du plasmide en absence de fragment codant la pKa.
Le produit de ligation a été utilisé pour transformer des bactéries E. coli JM109 qui ont ensuite été sélectionnées sur boîte LB-kanamicyne (100 μg/ml). 4 clones résistants à l'ampicilline ont été mis en culture pour une extraction du plasmide. Les mini-préparations d'ADN ont été contrôlées par digestion Ndel/Hindlll puis en électrophorèse sur gel 0,8% agarose (TAE 1X) afin de s'assurer que les plasmides ont intégré le gène codant la pKa.
II. Préparation des souches bactériennes
Deux souches bactériennes ER2566 (New England Biolabs) ont été utilisées : une (dite souche Tnp) pour produire la transposase de Mos1 en absence de la pKa (donc non phosphorylée) et la seconde (dite souche Tnp/pKa) pour co-produire la transposase de Mos1 et la pKa. Dans cette souche, la transposase produite sera phosphorylée dans la bactérie par la pKa.
Pour préparer les souches bactériennes, des bactéries ER2566 ont été transformées :
- avec 100 ng du plasmide pMalC2x-Tnp (souche Tnp). Les bactéries transformées ont été sélectionnées sur une gélose + ampicilline (100 μg/ml).
- avec 100 ng du plasmide pMalC2x-Tnp + 100 ng du plasmide pET- pKa (souche Tnp/pKa). Les bactéries transformées ont été sélectionnées sur une gélose + ampicilline (100 μg/ml) + kanamicyne (100 μg/ml).
III. Production et purification de la transposase Mos1 en cellules ER2566 (Tnp) et (Tnp/pKa)
111.1 Production
50 mis de milieu BBC (Brain Heart Infusion Broth - AES) ont été inoculés avec 5 à 10 clones (Tnp) ou 5 à 10 clones (Tnp/pKa) prélevés directement sur les boîtes de transformation. Le milieu a été supplémenté en ampicilline (100 μg/ml) pour la souche (Tnp) ou en ampicilline (100 μg/ml) + kanamicyne (100 μg/ml) pour la souche (Tnp/pKa). Les bactéries ont immédiatement été induites à l'IPTG (1 mM final) et placées à 25°C sous agitation, jusqu'à l'obtention d'une culture à saturation. Pour la souche (Tnp), le temps de culture était classiquement 16 à 20 heures. Pour la souche (Tnp/pKa), le temps de culture était classiquement 30 à 36 heures.
111.2 Purification
Les cultures bactériennes ont été centrifugées (5000 rpm, 10 min, 4°C) et le culot repris dans 5 mis d'un tampon 20 mM tris pH9, 100 mM NaCI, 1 mM DTT. Les bactéries ont été lysées par 800 μl de lysosyme à 20 mg/ml, pendant 30 minutes à 4°C. Le lysat bactérien a été centrifugé (10 000 rpm, 15 min, 4°C) et le surnageant recueilli : il constituait l'extrait brut.
La protéine fusion MBP-Tnp contenue dans les deux types d'extrait brut (Tnp et Tnp/pKa) a été purifiée sur une résine de maltose en suivant les recommandations du fournisseur (New England Biolabs). Les fractions éluées ont été dosées selon la méthode de Bradford.
IV. Analyse de la transposase Mos1 pure issue des souches (Tnp) et (Tnp/pKa)
IV.1 Stabilité
Les transposases purifiées ont été analysées en gel SDS-page
(stacking : 4% acrylamide pH6,8 - séparation : 11% acrylamide pH8,8). Classiquement 1 à 2 μg de protéines pures ont été déposés sur le gel, avec un marqueur de PM (Promega). Après une heure d'électrophorèse, les gels ont été colorés au bleu de Coomassie. IV.2 Activité
Les transposases purifiées ont été testées pour leur aptitude à médier la transposition, en utilisant un test de transposition in vitro. 80 nM de transposase issue soit de la lignée (Tnp) soit de la lignée
(Tnp/pKa) ont été incubés avec 600 ng de plasmide pBC3Tet3 à 300C, dans un tampon 10 mM tris pH9, 50 mM NaCI, 1 mM DTT, 20 mM MgCI2, 5 mM EDTA, 10% glycérol, en présence de 100ng de BSA, pour des temps variants de 0 à 60 minutes. La réaction a été arrêtée 4 μg de protéinase K et 0,15 % SDS pendant 5 minutes à 65°C puis 30 minutes à 37°C. Les ADN ont été purifiés par une extraction phénol/chloroforme suivie d'une précipitation alcoolique, en présence de 1μg d'ARNt. Les culots d'ADN ont été repris dans 20μl d'eau ; 2μl ont été utilisés pour transformer des bactéries JM109 (E. coli) compétentes. Après transformation, la culture obtenue a été titrée sur boîte LB- chloramphénicol (150 μg/ml) (40 μl d'une dilution au 1/1000) et sur boîte LB-tétracycline (12,5 μg/ml) (la totalité -1 ml - de la culture non diluée). Les boîtes ont été placées à 37°C pour 24 heures. Le lendemain, les colonies ont été comptées sur les boîtes LB-chloramphénicol et LB- tétracycline puis on a calculé la fréquence de transposition égale au nombre total de bactéries résistantes à la tétracycline sur le nombre total de bactéries (cloram+tétra).
B- RESULTATS
La figure 3 montre que la transposase de Mos1 est plus stable lorsqu'elle est produite en présence de la pKa. Cette stabilisation se traduit par une forte diminution de la protéolyse. Elle est illustrée dans la figure 3 par la disparition des produits d'autoprotéolyse sur les pistes 4 et 5, alors que ceux-ci sont très visibles sur la piste 2 (transposase produite en l'absence de pKa). Afin de vérifier que la transposase produite en présence de pKa est toujours active en transposition, des tests de transposition in vitro ont été effectués. Les résultats sont reportés dans la figure 4. Ils montrent qu'une transposase produite en présence de pKa (en pointillé) est aussi efficace, voire plus, qu'une transposase produite en l'absence de pKa (en trait continu). L'efficacité accrue de la transposase produite en présence de pKa peut être directement corrélée à la stabilisation de la protéine qui ne se dégrade pas au cours du test.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de production, par une cellule hôte procaryote, d'une transposase active et stable d'un élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana, comprenant au moins les étapes suivantes : a) le clonage de la séquence nucléotidique codant ladite transposase active dans un vecteur d'expression ; b) le clonage de la séquence nucléotidique codant la sous-unité catalytique active de la protéine kinase AMPc-dépendante (pKa) dans un vecteur d'expression ; c) la transformation de ladite cellule hôte avec lesdits vecteurs d'expression ; d) l'expression desdites séquences nucléotidiques par ladite cellule hôte ; et e) l'obtention de la transposase active et stabilisée par phosphorylation par la pKa.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ladite transposase active est une transposase mutante hyperactive.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, comprenant en outre une étape de purification de la transposase active et stable obtenue à l'étape e).
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les clonages des étapes a) et b) sont réalisés dans un seul vecteur d'expression.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'expression de ladite séquence nucléotidique codant la transposase active et de ladite séquence nucléotidique codant la pKa est placée sous le contrôle des mêmes éléments de régulation.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite cellule hôte procaryote est une cellule de bactérie.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite bactérie est Escherichia coli.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit élément génétique mobile mariner est Mos-1.
9. Transposase active et stable d'élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana, susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
10. Cellule hôte procaryote comprenant au moins : a) la séquence nucléotidique codant une transposase active d'un élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana ; et b) la séquence nucléotidique codant la sous-unité catalytique active de la protéine kinase AMPc-dépendante (pKa).
11. Cellule hôte procaryote selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite transposase active est une transposase mutante hyperactive.
12. Cellule hôte procaryote selon la revendication 10 ou 11 , caractérisée en ce que lesdites séquences nucléotidiques a) et b) sont clonées dans des vecteurs d'expression.
13. Cellule hôte procaryote selon la revendication 10 ou 11 , caractérisée en ce que lesdites séquences nucléotidiques a) et b) sont clonées dans un vecteur d'expression.
14. Cellule hôte procaryote selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisée en ce qu'elle est une cellule de bactérie.
15. Cellule hôte procaryote selon la revendication 14, caractérisée en ce que ladite bactérie est Escheήchia coli.
16. Cellule hôte procaryote selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, caractérisée en ce que ledit élément génétique mobile mariner est Mos-1.
17. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend au moins : a) la séquence nucléotidique codant une transposase active d'un élément génétique mobile mariner appartenant à la sous-famille mauritiana ; et b) la séquence nucléotidique codant la sous-unité catalytique active de la protéine kinase AMPc-dépendante (pKa).
18. Vecteur selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite transposase active est une transposase mutante hyperactive.
19. Vecteur selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que ledit élément génétique mobile mariner est Mos-1.
20. Kit de mutagénèse insertionnelle et/ou de séquençage et/ou de clonage, comprenant au moins une transposase active et stable selon la revendication 9.
21. Utilisation d'au moins une transposase active et stable selon la revendication 9, pour la transposition in vitro d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans une séquence d'ADN cible.
22. Utilisation d'au moins une transposase active et stable selon la revendication 9, pour la préparation d'un médicament résultant de la transposition in vivo d'une séquence d'ADN transposable d'intérêt dans une séquence d'ADN cible.
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