JP2020521508A - 核酸合成におけるターミナルトランスフェラーゼ酵素の使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、１つ以上のヌクレオチドを核酸の３’末端に付加させる方法における改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素の使用に関する。本発明はさらに、上記改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素の使用を含む核酸合成及び配列決定の方法、上記改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を含むキット、ならびに核酸合成及び配列決定の方法における上記キットの使用に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、１つ以上のヌクレオチドを核酸の３’末端に付加させる方法における改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素の使用に関する。本発明はさらに、上記改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素の使用を含む核酸合成及び配列決定の方法、上記改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を含むキット、ならびに核酸合成及び配列決定の方法における上記キットの使用に関する。

核酸合成は現代の生物工学にとって必須である。生物工学分野における急速な発展は、科学界のＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を人工合成する能力によって可能になった。

人工ＤＮＡ合成は、成長し続けている１８億ポンドの規模の市場であるが、生物工学及び製薬会社が様々なペプチド治療薬、例えば糖尿病の治療のためのインスリンを開発することを可能にする。それは、研究者達が細胞タンパク質の特性評価を行って、高齢化しつつある集団が今日直面している疾患、例えば心疾患及びがんの治療のための新たな低分子治療薬を開発することを可能にする。それは、Ｖｅｎｔｅｒ研究所が人工合成ゲノムを細菌細胞内に入れた２０１０年に実証したように、生命体を生み出す道さえも切り開く。

しかしながら、現在のＤＮＡ合成技術は生物工学産業の需要を満たしていない。ＤＮＡ合成の利点は数多くあるものの、よく言及される問題が人工ＤＮＡ合成産業、したがって生物工学分野のさらなる成長を妨げている。それは成熟した技術であるにもかかわらず、長さが２００ヌクレオチドより長いＤＮＡ鎖を合成することが事実上不可能であり、ほとんどのＤＮＡ合成会社が提供するのはたったの１２０ヌクレオチド以下である。これに比べて、平均的なタンパク質コード遺伝子は２０００〜３０００ヌクレオチドほどであり、平均的な真核生物ゲノムは数十億ヌクレオチドにもなる。このため、今日の主要な遺伝子合成会社は皆、重複する４０〜６０ｍｅｒ断片を合成してＰＣＲによって縫い合わせる様々な「合成と縫合わせ」技術に頼っている（Ｙｏｕｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３２，ｅ５９参照）。遺伝子合成産業によって提供される現行の方法は概して、通例の生産に３ｋｂまでの長さを可能としている。

１２０〜２００ヌクレオチドを上回るＤＮＡを一度に合成することができない原因は、ＤＮＡを生成する現行の方法論に起因しており、これは、合成化学（すなわちホスホロアミダイト技術）を用いてヌクレオチドを一度に１つずつ連結させてＤＮＡを作るものである。各ヌクレオチド連結ステップの効率は９５．０〜９９．０％効率であるため、許容される収率で２００ヌクレオチドよりも長いＤＮＡを合成するのは数学的に不可能である。Ｖｅｎｔｅｒ研究所は、細菌の比較的小さいゲノムを合成するのに４年及び２千万米ドルを費やすことによってこの骨の折れるプロセスを例証した（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９，５２−５６参照）。

ＤＮＡ配列決定の既知の方法は、鋳型依存的なＤＮＡポリメラーゼを使用して、成長している二本鎖基質に３’可逆的停止ヌクレオチドを付加させる（Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ ４５６，５３−５９参照）。「合成による配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」プロセスでは、付加する各ヌクレオチドは色素を含有し、ユーザーが鋳型鎖の正確な配列を同定することを可能にしている。二本鎖ＤＮＡにおいてではあるが、この技術は長さ５００〜１０００ｂｐの鎖を生産することができる。しかしながら、この技術は、既存の核酸鎖が鋳型として作用することを要求するので、デノボ核酸合成には適していない。

したがって、現行の利用可能な方法に関連する問題を克服することができる改善された核酸合成及び配列決定の方法を提供する必要がある。

本発明の第１の態様によれば、１つ以上のヌクレオチドを核酸の３’末端に付加させる方法における改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素の使用は、上記酵素が突然変異ＢＲＣＡ−１ Ｃ末端（ＢＲＣＴ）ドメインを含むことを特徴とする。

本発明の第２の態様によれば、核酸合成方法であって、
（ａ）初発開始因子配列を提供するステップ、
（ｂ）本明細書において定義される改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素の存在下で可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸を上記開始因子配列に付加させるステップ、
（ｃ）開始因子配列から全ての試薬を除去するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）で上記開始因子配列に付加した可逆的遮断ヌクレオチドから遮断基を切断するステップ、及び
（ｅ）上記切断剤を除去するステップ
を含む、当該方法が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、マイクロ流体装置内で実施される核酸合成方法であって、
（ａ）マイクロ流体装置内の表面に結合した初発開始因子配列を提供するステップ、
（ｂ）本明細書において定義される改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素の存在下で可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸を上記開始因子配列に付加させるステップ、
（ｃ）開始因子配列から全ての試薬を除去するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）において上記開始因子配列に付加した可逆的遮断ヌクレオチドから遮断基を切断するステップ、及び
（ｅ）切断剤を除去するステップ
を含む、当該方法が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、キットであって、本明細書において定義される改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を、場合によって開始因子配列、マイクロ流体装置またはチップ、１つ以上の可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸、無機ピロホスファターゼ、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の精製済み組換え無機ピロホスファターゼ、及び切断剤から選択される１つ以上の構成要素と組み合わせて含み、さらに場合によって、本明細書において定義される方法に従ってキットを使用するための説明書を一緒に含む、当該キットが提供される。

本発明のさらなる態様によれば、核酸合成または核酸配列決定の方法における、本明細書において定義されるキットの使用が提供される。

ＴｄＴからタンパク質分子量のおよそ２１％に対応するＮ末端ＢＲＣＴドメインを完全に切断することを含めたＮ末端側切断によって改変されたターミナルトランスフェラーゼＴｄＴは、完全またはより良好な触媒活性を保持する。この実験において、２１％のＮ末端側切断を含有するＴｄＴ（「短縮型ＴｄＴ」またはΔＮＴＥ−ＴｄＴ）は、「野生型ＴｄＴ」に比べてより多くの修飾２’−デオキシヌクレオチド三リン酸（ビオチン−１６−ｄＵＴＰ）をＤＮＡ開始因子分子（Ｎ対照）の３’末端に付加させた。ＴｄＴをＤＮＡ開始因子及びビオチン−１６−ｄＵＴＰと共に３７℃で５分間インキュベートした。ＤＮＡを、開始因子分子の５’末端に共有結合で取り付けられたＣｙ−５蛍光色素によって可視化した。ＰＡＧＥを変性させることによって反応生成物を分析した。スペースの関係上、ゲルを９０°の角度で示す。 単一ステップでの修飾ヌクレオチド三リン酸の組込み。改変された完全長ＴｄＴは、３’−Ｏ−修飾可逆的停止ヌクレオチド三リン酸を定量的に付加させることができる。完全長ＴｄＴは、３’−Ｏ−アジドメチル２’−デオキシチミジン三リン酸及び３’−Ｏ−アジドメチル２’−デオキシグアノシン三リン酸を定量的に付加させることができた。ＰＡＧＥを変性させることによって反応物質を分析した。 ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する典型的なＰＯＬＸファミリーのポリメラーゼの模式図。ＮＴ−ＰＯＬＸｃ及びＰＯＬＸｃは、ターミナルトランスフェラーゼ及びヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を付与するものであるＤＮＡポリメラーゼベータ様ドメインを表すドメイン注釈である。ＮＴ−ＰＯＬＸｃ／ＰＯＬＸｃドメインのＮ末端側にあるのはＢＲＣＴドメインであるが、これは、二量体境界面モチーフと、配列Ｔｒｐ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ／ＳｅｒからなるシグネチャＢＲＣＴ配列とを含有し、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。 ＴｄＴのＮ末端側切断（「短縮型ＴｄＴ」）が５’−Ｃｙ５標識オリゴヌクレオチドから速やかに解離するのに対し、ＴｄＴの完全長形態は、ＮａＣｌ濃度を１Ｍよりも高くしてやっと同程度の解離を示す。ＴｄＴ（５μＭ）を５’−Ｃｙ５標識２’−デオキシオリゴヌクレオチド（１μＭ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。蛍光強度測定前に全ての試料を指定のイオン強度にし、０．２２ミクロンのスピンフィルターで濾過した。蛍光強度は蛍光プレートリーダーを使用して決定した。 Ｎ末端側切断によって改変されたＴｄＴは、サイクリックＤＮＡ合成プロセスにおいて優れた性能を示す。この実験では、本文に記載のサイクリックプロセスを繰り返してＮ＋２生成物を得た。レーン１（Ｎ）：Ｎ対照ＤＮＡ開始因子。レーン２及び３：完全長の改変型ＴｄＴ変異体。レーン４〜６：Ｎ末端側が切断された改変型ＴｄＴ変異体。ＤＮＡを、開始因子分子の５’末端に共有結合で取り付けられたＣｙ−５蛍光色素によって可視化した。ＰＡＧＥを変性させることによって反応物質を分析した。 Ｎ末端側切断によって改変されたＴｄＴは、可逆的停止剤を保有している修飾ヌクレオチドを２個、５個、１０個及びそれより多く付加させることを触媒することができる。１サイクルごとに、改変された短縮型ＴｄＴを可逆的停止ヌクレオチドと共にＤＮＡ開始因子に導入した。付加後、ＤＮＡ開始因子を洗い流して、残存する修飾ヌクレオチドを全て除去した。その後、ヌクレオチドを「脱保護」し、続いて追加の洗浄ステップを行って、残存する脱保護剤を全て除去した。このサイクリックプロセスを、示された数だけ可逆的停止ヌクレオチドが付加するまで繰り返した（つまり、サイクルの回数をＸとして、Ｎ＋Ｘ）。ＰＡＧＥを変性させることによって反応物質を分析した。 Ｌ．ｏｃｕｌａｔｕｓのＴｄＴとの同一性が４１．０％以下となる相違を有し、またＳ．ｈａｒｒｉｓｉｉのＴｄＴとの同一性が３９．８％以下となる相違を有する、ＴｄＴの１１個のオーソログは、ＢＲＣＴドメインが切断されているとより高い溶解性を示す（上）。Ｅ．ｃｏｌｉ内での発現収率は、タンパク質の（１）挙動及び（２）溶解性の標準的な評価尺度である。より高い収率は総じて、挙動が良好で溶解性が高いタンパク質を示唆している。脊索動物内のほとんどのオーソログ部類を網羅する広範なＴｄＴオーソログに対するＢＲＣＴ切断の結果として、一貫した２倍超の溶解性の向上によって立証されるとおり、ＴｄＴ溶解性が向上する（下）。標準的プロトコールに従う部位特異的変異導入法によって、１１個のＴｄＴオーソログの遺伝子において切断を行った。発現はＥ．ｃｏｌｉにおいてＩＰＴＧによる標準的な誘導の後に２０℃で一晩、３ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈの中で実施した。溶解は２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭのＫＣｌ、１０％のグリセロール及び１ｍＭのＰＭＳＦの中で１×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒを使用して実施した。溶解後、ＨｉｓＰｕｒ Ｎｉ−ＮＴＡ ９６ウェルスピンプレートを使用してタンパク質を精製した。標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価したときの均一性が８０％超になるまでタンパク質を精製した。濃度及び収率はＮａｎｏＯｒａｎｇｅタンパク質定量キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ蛍光光度計（Ｐｒｏｍｅｇａ）で決定した。各発現は３反復で実施した。 野生型ＴｄＴ酵素と、ＢＲＣＴが切断されたＴｄＴ酵素とを比較する表面到達可能性試験から、ＢＲＣＴドメインを有するＴｄＴはＤＮＡ固定化表面の汚染を増加させターミナルトランスフェラーゼ活性を妨げると結論付けられる。全てのレーンで、ＴｄＴオーソログは、表面に５’固定化一本鎖ＤＮＡ片を含有するウェルの中でインキュベートされた。ウェル内でＴｄＴを、適度なターミナルトランスフェラーゼ活性に適した緩衝液の中で１時間、３７℃でインキュベートした。１時間のインキュベーションの後、市販のＢ．ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ、ピロホスファターゼ、及びチミジン５’−三リン酸（遊離３’−ＯＨ）をウェルに加えた。反応物質を２０％変性ＰＡＧＥ（１９：１）によって分析し、一本鎖ＤＮＡ片上の内部蛍光団でもって画像化した。レーン１〜８には野生型ＴｄＴオーソログ（それぞれ、Ｓ．ｈａｒｒｉｓｉｉ、Ｓ．ｓｃｒｏｆａ、Ｏ．ｇａｒｎｅｔｔｉｉ、Ｃ．ｌａｎｉｇｅｒａ、Ｂ．ｔａｕｒｕｓ、Ｐ．ｐａｎｉｃｕｓ、及びＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）が入っている。レーン９〜１９には、ＢＲＣＴが切断されたＴｄＴオーソログ（それぞれ、Ｓ．ｈａｒｒｉｓｉｉ、Ｓ．ｓｃｒｏｆａ、Ｏ．ｇａｒｎｅｔｔｉｉ、Ｃ．ｌａｎｉｇｅｒａ、Ｂ．ｔａｕｒｕｓ、Ｄ．ｎｏｖｅｍｃｉｎｃｔｕｓ、Ｍ．ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、Ｐ．ｎｙｅｒｅｒｅｉ、Ｍ．ｂｒａｎｄｔｉｉ、Ｐ．ｐａｎｉｃｕｓ、及びＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）が入っている。高い不溶性の結果として発現収率が低くなったために、全ての野生型ＴｄＴオーソログを試験することはできなかった。驚くべきことに、ＢＲＣＴ切断は、広範なＴｄＴオーソログ（３９．８％以下の同一性）にわたって、野生型ＴｄＴにみられていた表面汚染を防止した。表面汚染、タンパク質凝集及び総合的タンパク質挙動不良は表面固定化ＤＮＡへのヌクレオチドの効率的な多サイクル付加を妨げる。このように、ＢＲＣＴ切断はＤＮＡのＴｄＴ媒介デノボ合成に必要である。

本発明の第１の態様によれば、１つ以上のヌクレオチドを核酸の３’末端に付加させる方法における改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素の使用は、上記酵素が突然変異ＢＲＣＡ−１ Ｃ末端（ＢＲＣＴ）ドメインを含むことを特徴とする。

酵素に基づくデノボ核酸合成は、ホスホロアミダイトＤＮＡ合成の代替方法である。前者を成し遂げるための１つの方法は、ターミナルトランスフェラーゼとして作用するポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ（ＤＮＴＴ／ＴｄＴ）、ＤＮＡポリメラーゼミュー（ＰＯＬＭまたはＰｏｌμ）、ＤＮＡポリメラーゼラムダ（ＰＯＬＬまたはＰｏｌλ）、ＤＮＡポリメラーゼシータ（ＰＯＬＱまたはＰｏｌθ）、及び原核生物ポリメラーゼ）を使用してヌクレオチド三リン酸を一度にランダムまたは配列特異的に付加させることである。配列制御を実現するためには、修飾ヌクレオチド、例えば、（英国特許出願第１７０１３９６．２号に記載されているような）窒素塩基または（ＷＯ２０１６／１２８７３１及びＵＳ６，２３２，４６５に記載されているような）糖部分によって遮断されたものを、合成プロセスに使用せねばならない。したがって、配列が制御されるかたちでのターミナルトランスフェラーゼ媒介デノボＤＮＡ合成は、（１）液相または固相の修飾ヌクレオチドを核酸（Ｎ種）の３’末端に付加させて、遮断されたＮ＋１種を形成することと、（２）付加したヌクレオチドを脱保護して活性Ｎ＋１種を再生することとのサイクリックプロセスを必要とする。そのようなサイクリックプロセスは、（ａ）Ｎ＋１種から速やかに遊離し、（ｂ）ヌクレオチド付加が起こる領域または表面をあまり汚染せず、しかも（ｃ）ヌクレオチド付加の間、安定である（例えば、凝集または不活性化の傾向がない）、挙動の良好なターミナルトランスフェラーゼ酵素を必要とする。

驚くべきことに本発明者らは、ＢＲＣＴドメインの欠失に相当する、Ｎ末端からのＴｄＴの野生型質量の２１％の除去（ΔＮＴＥ−ＴｄＴ）の後に、ＴｄＴが活性を保持するだけでなくさらに溶液中での活性も獲得するようであることを発見した（図１参照）。以前には、ＴｄＴはＮ末端から残基を欠失した場合に結晶形態において触媒活性を保持するが、溶液中では活性が示されなかった、ということが実証されたにすぎなかった^１、２。タンパク質活性、巨大分子配座及び基質到達可能性は、液相巨大分子と、結晶格子内に閉じ込められた同じ巨大分子とではかなり異なっていることが多い。Ｍｏｚｚａｒｅｌｌｉ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉによれば、「リガンド結合、触媒及びアロステリック調節は結晶環境で起こるものの、分子間相互作用は機能関連の遷移を阻むことがあり、溶液に関して活性を変化させることがある^３」。よく知られている例として、二本鎖ＤＮＡの最初の原子モデルは、周知のＢ−ＤＮＡ配座^４ではなく、生物学的機能が未だ結論として確定していないＺ−ＤＮＡ配座で解明された。

実際、ＴｄＴに対するＮ末端欠失の影響の生体内での観察結果は、ＴｄＴが野生型ＴｄＴ質量の２１％分のＮ末端欠失（ΔＮＴＥ−ＴｄＴ）によって活性を獲得するという発明者らの驚くべき発見を強固にする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における再構成Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えアッセイにおいてＳｃｈａｔｚ及び同僚らは、マウスＴｄＴのＮ末端にＢＲＣＴドメインが存在しないことによってコード接合部Ｎ−ヌクレオチド付加が、マウスＴｄＴの不活性長鎖アイソフォーム（ＴｄＴＬ）のそれに類似したレベルにまで一貫して低下することを実証した^５。Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓにおいてＴｄＴは、選択的スプライシングが行われてＴｄＴＳ及びＴｄＴＬとして知られる２つのアイソフォームになる。ＴｄＴＳは生理的温度において活性であることが示された一方、ＴｄＴＬは生理的温度において不活性であることが示された^６。ＢＲＣＴドメインを欠くＴｄＴが生体内で一貫して活性の低下または非存在を（ＴｄＴＬのそれに類似して）呈することを考慮すれば、Ｎ末端ＢＲＣＴドメイン切断を有する組換え改変型ＴｄＴはターミナルトランスフェラーゼ活性の低下または非存在をもたらすと予想されよう。図１は、驚くべきことにΔＮＴＥ−ＴｄＴがターミナルトランスフェラーゼ触媒活性の保持だけでなく獲得もするということを明瞭に示している。

図１で示された驚くべき結果を、ＴｄＴ、ＤＮＡポリメラーゼミュー及びラムダとの相同性が高い近縁種に拡張することができる。実際、ＤＮＡポリメラーゼミュー及びラムダが野生型ＴｄＴ配列との相同性を指針とした突然変異の後に高活性なターミナルトランスフェラーゼに簡単に変換されることは文献においてよく知られている。例えば、Ｂｌａｎｃｏ及び同僚らは、ＴｄＴを模した点突然変異（ヒトＤＮＡポリメラーゼミューにおけるＲ３８７Ｋ）がＤＮＡポリメラーゼミューを、数十個のヌクレオチドの付加を可能とする弱いターミナルトランスフェラーゼから数百個のヌクレオチドの付加を可能とする強いターミナルトランスフェラーゼへと変換したことを実証した^７。本発明者らはＢＲＣＴドメインを欠くＴｄＴによる新規なターミナルトランスフェラーゼ活性を実証するので、当然、ＴｄＴを模した点突然変異を保有しているポリメラーゼミュー及びポリメラーゼラムダはたとえＢＲＣＴドメインが存在していなくともターミナルトランスフェラーゼとして活性であるということになる。

ＢＲＣＴドメインを切断した場合に溶解性が向上し（図７参照）、固定化ＤＮＡへの表面到達可能性が向上する（図８参照）ということを実証するデータも示す。これらの結果は、互いに４０％より高い配列同一性を有するＴｄＴに認められる。理論に束縛しないが、本明細書に示すデータは、ＢＲＣＴ欠失を有する本発明に係る全てのＴｄＴが、強化された核酸合成方法において有用となる、ということの極めて高い妥当性を提供すると考えられる。

かくして、一実施形態では、ターミナルトランスフェラーゼ酵素は、ＤＮＡポリメラーゼＸファミリー由来のもの、例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ＤＮＡポリメラーゼλ（Ｐｏｌλ）及びＤＮＡポリメラーゼμ（Ｐｏｌμ）である。さらなる実施形態では、ターミナルトランスフェラーゼ酵素はターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）から選択される。

本明細書中での「ＴｄＴ」への言及は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素を指し、上記酵素の精製済み及び組換えの形態への言及を含む。ＴｄＴは、一般にはＤＮＴＴ（ＤＮＡヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ）としても知られており、いかなるそのような用語も交換可能に使用されるべきである。

本明細書中での「Ｐｏｌλ」への言及は、ＤＮＡポリメラーゼλ（ＰＯＬＬまたはＤＮＡポリメラーゼラムダとしても知られる）を指し、真核生物にみられるタンパク質である。ヒトにおいてそれはＰＯＬＬＡ遺伝子にコードされる。ＰｏｌλはＤＮＡポリメラーゼのＸファミリーのメンバーである。それは、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復の経路である非相同末端再結合（ＮＨＥＪ）の間に欠如しているヌクレオチドを再合成すると考えられている。

本明細書中での「Ｐｏｌμ」への言及は、ＤＮＡポリメラーゼμ（ＰＯＬＭまたはＤＮＡポリメラーゼミューとしても知られる）を指し、真核生物にみられるポリメラーゼ酵素である。ヒトにおいてこのタンパク質はＰＯＬＭ遺伝子にコードされる。ＰｏｌμはＤＮＡポリメラーゼのＸファミリーのメンバーである。それは、ＤＮＡ修復の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の間、損傷を受けたかまたは欠如しているヌクレオチドの再合成に関与する。

本明細書中での「ＢＲＣＡ−１ Ｃ末端（ＢＲＣＴ）ドメイン」という用語への言及は、乳癌感受性タンパク質のＣ末端ドメインを指す）。このドメインは主に、ＤＮＡ損傷に応答する細胞周期チェックポイント機能に関与するタンパク質にみられ、例えば乳癌ＤＮＡ修復タンパク質ＢＲＣＡ１にみられる。当該ドメインはおよそ１００アミノ酸の縦列反復配列であるが、これはリン−タンパク質結合ドメインとして働くようである。例えば、ＢＲＣＴドメインはＴｄＴのアミノ酸残基２６〜１３０に存在している。

本明細書中での「突然変異ＢＲＣＡ−１ Ｃ末端（ＢＲＣＴ）ドメイン」という用語への言及は、ＢＲＣＴドメインの任意の不活性化形態を指す。突然変異ＢＲＣＴドメインの例としては、欠失、置換または挿入から選択される１つ以上の突然変異が挙げられる。

一実施形態では、上記酵素は、切断型ＢＲＣＴドメイン、例えば、Ｎ末端側が切断型ＢＲＣＴドメイン（例えば、Ｎ末端側でのＴｄＴ野生型分子量のおよそ２１％分の切断）を含む。本発明のこの実施形態は、驚くべきことに、多ステップのデノボ酵素的ＤＮＡ合成にとって必須である。Ｎ末端側切断は野生型及び改変型ＴｄＴに、ＴｄＴ媒介核酸合成の産業上の有用性を大いに高める、よりはるかに高いサイクル効率を付与する。

代替実施形態では、上記ＢＲＣＴドメインが存在していない。

ターミナルトランスフェラーゼ酵素におけるＢＲＣＴドメインの非存在または切断は、以下のとおりに定義される：
（１）ターミナルトランスフェラーゼ活性を有し、かつ
（２）米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）が管理する保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）^８によって定義され保存ドメイン検索（ＣＤ検索）^９によって同定されるとき、ＮＴ−ＰＯＬＸｃ／ＰＯＬＸｃ ＤＮＡポリメラーゼベータｔｈｕｍｂスーパーファミリーに属するドメイン（ｃｄ００１４１、ｃｌ２５９６１、ｓｍａｒｔ００４８３、ｐｆａｍ１４７９１、ＣＯＧ１７９６）を含有し、かつ
（３）ＢＲＣＴスーパーファミリーに属するドメイン（ｃｌ０００３８、ｃｄ０００２７、ｓｍａｒｔ００２９２、ｐｆａｍ００５３３、ｐｆａｍ１２７３８、ｐｆａｍ１６５８９、ｐｆａｍ１６７５９、ｐｆａｍ１６７７０）を含有しない、
任意のアミノ酸配列。模式的なドメインを図３に示す。タンパク質ドメインは、閾値ビットスコアが１９９．３４４または２９．２１１９よりも大きい場合にそれぞれＮＴ−ＰＯＬＸｃ／ＰＯＬＸｃ（ｃｄ００１４１）かＢＲＣＴ（ｃｄ０００２７）かのどちらかに属すると同定されることとする。注釈が付いた各ドメインの閾値ビットスコアは、ＮＣＢＩ ＣＤＤの学芸員によってタンパク質配列が特定ドメインに属するか否かについての保存性評価尺度として定められる。クエリー配列のビットスコアを算出して、それがＮＣＢＩ学芸員によって定められた閾値よりも高いか否かを判定する。ビットスコアは、まず各ドメイン注釈に固有の位置特異的スコア行列（ＰＳＳＭ）を使用してアラインメントを実施して原アラインメントスコアを最大限にすることによって算出され、この場合、ギャップを設けるコストを１１とし、ギャップを１つ拡張するコストを１とする。上に示したドメイン注釈のためのドメイン固有ＰＳＳＭをＮＴ−ＰＯＬＸｃ／ＰＯＬＸｃ（ｃｄ００１４１）またはＢＲＣＴ（ｃｄ０００２７）についてそれぞれ表１及び表２に示す。次に、原アラインメントスコアを使用してビットスコアを以下の等式によって算出する：

〔式中、Ｓ’はビットスコアに相当し、Ｓは原アラインメントスコアであり、λ及びＫは、Ｇｅｒｔｚ（Ｇｅｒｔｚ，Ｅ．Ｍ．ＢＬＡＳＴ ｓｃｏｒｉｎｇ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ．２００５．）によって記載されているとおりにして得られる正規化係数である〕。ビットスコアを算出するプロセスは典型的には、Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ及び同僚ら^８〜９によって記載されているように、逆向き位置特異的ＢＬＡＳＴ（ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴ）と呼ばれる公的に利用可能なアルゴリズムによってＣＤＤデータベースに対して実施される。
表１：このファミリーのメンバーとみなされるには１９９．３４４の閾値ビットスコアが要求される、ＮＴ−ＰＯＬＸｃ（ｃｄ００１４１）ドメインのための位置特異的スコア行列（ＰＳＳＭ）。ＰＳＳＭはＮＣＢＩ ＣＤＤから取得した。表の上左隅の見出しにおいて、Ｐは位置を表す記号であり、Ｃはコンセンサス配列を表す記号であり、Ｍは既知構造を有する主配列を表す記号である。表の残りの部分において、文字は、標準的なアミノ酸の一文字での術語体系を表す。

表２：このファミリーのメンバーとみなされるには２９．２１１９の閾値ビットスコアが要求される、ＢＲＣＴ（ｃｄ０００２７）ドメインのための位置特異的スコア行列（ＰＳＳＭ）。ＰＳＳＭはＮＣＢＩ ＣＤＤから取得した。表の上左隅の見出しにおいて、Ｐは位置を表す記号であり、Ｃはコンセンサス配列を表す記号であり、Ｍは既知構造を有する主配列を表す記号である。表の残りの部分において、文字は、標準的なアミノ酸の一文字での術語体系を表す。

あるいは、ターミナルトランスフェラーゼ酵素におけるＢＲＣＴドメインの非存在または切断は、以下のとおりに定義される：
ターミナルトランスフェラーゼの挙動をより良好にする、及び／またはそれをより迅速に核酸から解離させるような、「二量体境界面」及び／または（Ｔｒｐ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ／Ｓｅｒの特徴的配列を有する）「ＢＲＣＴ配列」から構成される野生型天然ＢＲＣＴドメインの２つの保存モチーフの任意の改変、突然変異、欠失または挿入。二量体境界面は、Ａｓｐ／Ｇｌｕ（１６）、Ｇｌｕ／Ｌｙｓ（２０）、Ｇｌｕ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ（２３）、Ｇｌｙ（２６）及びＬｙｓ／Ｔｈｒ（２８）のコンセンサス配列を有するｃｄ０００２７ ＰＳＳＭの位置１６、２０、２３、２６及び２８として定義されることとする。ＢＲＣＴ配列は、Ｔｒｐ（６６）及びＣｙｓ／Ｓｅｒ（７０）のコンセンサス配列を有するｃｄ０００２７ ＰＳＳＭの位置６６及び位置７０として定義されることとする。より良好な挙動は、より小さい凝集傾向、より高い酵素ターンオーバー率、より良好な多ステップサイクル効率、及び／または貯蔵もしくは反応条件下でのより長い活性維持を意味し得る。保存モチーフは保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）によって注釈が付けられているとおりである。

あるいは、ターミナルトランスフェラーゼ酵素におけるＢＲＣＴドメインの非存在または切断は、以下のとおりに定義される：
米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）が管理する保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）^８によって定義され保存ドメイン検索（ＣＤ検索）^９によって同定されるとき、ＢＲＣＴスーパーファミリー注釈（ｃｌ０００３８、ｃｄ０００２７、ｓｍａｒｔ００２９２、ｐｆａｍ００５３３、ｐｆａｍ１２７３８、ｐｆａｍ１６５８９、ｐｆａｍ１６７５９、ｐｆａｍ１６７７０）を含有せず、付録１に提供するターミナルトランスフェラーゼ配列一覧との９０％以上の配列同一性を有する、任意のアミノ酸配列またはその断片。

あるいは、ターミナルトランスフェラーゼ酵素におけるＢＲＣＴドメインの非存在または切断は、以下のとおりに定義される：
Ｎ末端部分（最初の２００アミノ酸として定義される）の任意の突然変異、改変または切断。そのような切断は多ステップサイクル効率をより大きくすることが本明細書において示される。

一実施形態では、改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を固体担体上に固定する。代替実施形態では、改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素は液相中にある。液相中にある、または固体担体上に固定された、ターミナルトランスフェラーゼ酵素を提供する詳細な方法論は、英国特許出願第１７０１３９６．２号に提供されており、参照によりその内容を本明細書に援用する。

核酸合成方法
本発明の一実施形態では、核酸合成方法における、本発明の第１の態様に係る使用が提供される。

本発明の第２の態様によれば、核酸合成方法であって、
（ａ）初発開始因子配列を提供するステップ、
（ｂ）本明細書において定義される改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素の存在下で可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸を上記開始因子配列に付加させるステップ、
（ｃ）開始因子配列から全ての試薬を除去するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）で上記開始因子配列に付加した可逆的遮断ヌクレオチドから遮断基を切断するステップ、及び
（ｅ）切断剤を除去するステップ
を含む、当該方法が提供される。

本明細書中での「核酸合成方法」への言及は、核酸の鎖（ｎ）がさらなるヌクレオチドの付加によって伸長する（ｎ＋１）、ある長さのＤＮＡ（デオキシリボ核酸）またはＲＮＡ（リボ核酸）を合成する方法を含む。一実施形態では、核酸はＤＮＡである。代替実施形態では、核酸はＲＮＡである。

本明細書中での「ＤＮＡ合成方法」への言及は、ＤＮＡ鎖（ｎ）がさらなるヌクレオチドの付加（ｎ＋１）によって伸長する、ＤＮＡ鎖合成方法を指す。本明細書に記載の方法は、当技術分野で現在知られているＤＮＡ合成方法に比べていくつかの利点を有するデノボＤＮＡ鎖合成においてヌクレオチドを逐次付加させるための、本発明のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼと、３’−Ｏ−アジドメチル置換基を有するヌクレオチド三リン酸との新規な使用を提供する。

さらなる実施形態では、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を繰り返すことによって１つより多くのヌクレオチドが付加する。

方法のステップ（ｂ）〜（ｅ）を複数回繰り返して所望の長さのＤＮＡまたはＲＮＡ鎖が生成され得ることは理解されよう。したがって、一実施形態では、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を繰り返すことによって１つより多くのヌクレオチドが開始因子配列に付加し、例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０個より多くのヌクレオチドが開始因子配列に付加する。さらなる実施形態では、２００個より多くのヌクレオチド、例えば、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１００００個より多くのヌクレオチドが付加する。

本明細書中での「ヌクレオチド三リン酸」への言及は、３つのリン酸基に結合したヌクレオシド（すなわちデオキシリボースまたはリボース糖分子に取り付けられた塩基）を含有する分子を指す。デオキシリボースを含有するヌクレオチド三リン酸の例は、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）またはデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）である。リボースを含有するヌクレオチド三リン酸の例は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）またはウリジン三リン酸（ＵＴＰ）である。ヌクレオシドの他のタイプが３つのリン酸に結合してヌクレオチド三リン酸、例えば天然に存在する修飾ヌクレオシド及び人工ヌクレオシドを形成していてもよい。

本明細書中での「可逆的遮断」ヌクレオチドへの言及は、可逆的停止部分を糖部分（３’遮断ヌクレオチド三リン酸）及び窒素塩基部分（塩基遮断ヌクレオチド三リン酸）に含有しているヌクレオチドを含む。可逆的停止剤は、ポリメラーゼまたはターミナルトランスフェラーゼによって核酸開始因子の３’末端に付加することができる、及びヌクレオチドのさらなる付加を防止する、化学的部分である。可逆的停止剤が切断剤によって切断されたとき及びそのときに限り、ポリメラーゼまたはターミナルトランスフェラーゼは追加のヌクレオチドを付加させることができる。

３’遮断ヌクレオチド三リン酸
したがって、本明細書中での「３’遮断ヌクレオチド三リン酸」への言及は、ヌクレオチドのさらなる付加を防止する追加の基を３’末端上に有する、つまり保護基による３’−ＯＨ基の置換えによって有する、ヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰまたはｄＴＴＰ）を指す。

本明細書中での「３’遮断」、「３’遮断基」または「３’保護基」への言及が、ヌクレオチド三リン酸の３’末端に取り付けられた、さらなるヌクレオチド付加を防止する基を指すことは理解されよう。本発明の方法は、切断によって除去されてさらなるヌクレオチドの付加を許容することができる可逆的３’遮断基を使用する。対照的に、不可逆的３’遮断基とは、切断によって３’−ＯＨ基を露出させることも剥き出しにすることもできないｄＮＴＰを指す。

文献によって支持されたいくつかの可逆的保護基、例えば、２−シアノエチル、アジドメチル、アミノキシ及びアリルが存在するが、これらを本明細書に記載の方法に適用することができる。好適な保護基の例は、Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ． ＆Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．（２０１２）４ｔｈ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ）に記載されている。

一実施形態では、３’遮断ヌクレオチド三リン酸は可逆的保護基によって遮断されている。代替実施形態では、３’遮断ヌクレオチド三リン酸は不可逆的保護基で遮断されている。

したがって、一実施形態では、３’遮断ヌクレオチド三リン酸は、３’−Ｏ−メチル、３’−アジド、３’−Ｏ−アジドメチル、３’−アミノキシ、３’−Ｏ−（２−シアノエチル）、３’−Ｏ−（２−シアノエトキシ）、または３’−Ｏ−アリル基のいずれかによって遮断されている。さらなる実施形態では、３’遮断ヌクレオチド三リン酸は、３’−Ｏ−アジドメチル、３’−アミノキシ、３’−Ｏ−（２−シアノエチル）、３’−Ｏ−（２−シアノエトキシ）、または３’−Ｏ−アリル基のいずれかによって遮断されている。

塩基遮断ヌクレオチド三リン酸
したがって、本明細書中での塩基遮断ヌクレオチド三リン酸への言及は、ヌクレオチドのさらなる付加を防止する追加の基を窒素塩基上に有するヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰまたはｄＴＴＰ）を指す。窒素塩基上に位置する可逆的停止部分は、切断剤によって切断されたとき及びそのときに限り後のヌクレオチドの付加を許容する任意の分子部分であり得る。可逆的停止剤は、グアニンの７位または８位；アデニンの７位、８位またはＮ６位；及びピリミジンの５位に位置し得る。

窒素塩基に取り付けられることができる、文献によって支持された可逆的保護基は、本特許の交互相の節で挙げる光切断可能な置換ニトロベンジル基、ペプチド及び他の化学的／担体部分を含めていくつか存在する。

切断剤
本明細書中での「切断剤」への言及は、可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸から３’遮断基を切断することができる物質を指す。

本明細書に記載の可逆的遮断基は全て、文献によって支持され切断剤として使用され得る化合物を使用して水溶液中で定量的に除去され得る（例えば、Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．＆Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．（２０１２）４ｔｈ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ、Ｈｕｔｔｅｒ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２９，８７９−８９５、ＥＰ１５６０８３８、及びＵＳ７，７９５，４２４）を参照のこと）。

一実施形態では、切断剤は化学的切断剤である。代替実施形態では、切断剤は酵素的切断剤である。さらなる実施形態では、切断剤は電磁放射線、例えば紫外光または可視光である。

当業者であれば、切断剤の選択が、使用する可逆的遮断ヌクレオチドのタイプに依拠することを理解するであろう。例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を使用して３’−Ｏ−アジドメチル基を切断することができ、パラジウム錯体を使用して３’−Ｏ−アリル基を切断することができ、水酸化アンモニウムを使用して３’−Ｏ−（２−シアノエチル）／３’−Ｏ−２−（シアノエトキシ）メチル基を切断することができ、または亜硝酸ナトリウムを使用して３’−アミノキシ基を切断することができる。それゆえ、一実施形態では、切断剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、パラジウム錯体または亜硝酸ナトリウムから選択される。

一実施形態では、尿素、塩化グアニジニウム、ホルムアミドまたはベタインなどの変性剤を含む切断用溶液の存在下で切断剤を添加する。変性剤の添加は、ＤＮＡの何らかの望ましくない二次構造を妨害することができるという利点を有する。さらなる実施形態では、切断用溶液は１つ以上の緩衝剤を含む。当業者であれば、緩衝剤の選択が厳密な切断化学及び必要とされる切断剤に依拠することを理解するであろう。

開始因子配列
本明細書中での「初発開始因子配列」への言及は、ターミナルトランスフェラーゼ酵素による可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸の最初の付加において可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸を取り付けられることができる遊離３’末端を有する短鎖オリゴヌクレオチドを指す。一実施形態では、初発開始因子配列はＤＮＡ開始因子配列である。代替実施形態では、初発開始因子配列はＲＮＡ開始因子配列である。

本明細書中での「開始因子配列」への言及は、可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸を取り付けられることができる遊離３’末端を有するオリゴヌクレオチドを指す。一実施形態では、開始因子配列はＤＮＡ開始因子配列である。代替実施形態では、開始因子配列はＲＮＡ開始因子配列である。

本明細書中での「ＤＮＡ開始因子配列」への言及は、可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸を取り付けられることができるＤＮＡの配列を指し、つまり、ＤＮＡ開始因子配列の末端からＤＮＡが合成されることになる。

一実施形態では、初発開始因子配列は、５〜１００ヌクレオチドの長さ、例えば、１０〜９０ヌクレオチドの長さ、特に、５〜２０ヌクレオチドの長さである。

一実施形態では、開始因子配列は一本鎖である。代替実施形態では、開始因子配列は二本鎖である。当業者であれば、３’突出部（すなわち遊離３’末端）が効率的な付加を可能にすることを理解するであろう。

一実施形態では、開始因子配列は固体担体上に固定される。これは、合成された核酸を洗い流すことなく改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素及び切断剤を（それぞれステップ（ｃ）及び（ｅ）で）除去することを可能にする。方法を流動構成によって簡単に実施することができるように、水性条件下で安定な固体担体に開始因子配列を取り付けてもよい。

一実施形態では、開始因子配列は、可逆的相互作用部分、例えば、化学的切断可能リンカー、抗体／免疫原性エピトープ、ビオチン／ビオチン結合タンパク質（例えばアビジンまたはストレプトアビジン）、またはグルタチオン−ＧＳＴタグを介して固体担体に固定される。したがって、さらなる実施形態では、方法はさらに、得られた核酸の抽出を、プロテイナーゼＫと共にインキュベートすることなどによる開始因子配列中の可逆的相互作用部分の除去によって行うことを含む。

さらなる実施形態では、開始因子配列は、化学的切断可能リンカー、例えば、ジスルフィド、アリル、またはアジドでマスクされたヘミアミナールエーテルリンカーによって固体担体上に固定される。したがって、一実施形態では、方法はさらに、得られた核酸の抽出を、ジスルフィドリンカーの場合はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）もしくはジチオスレイトール（ＤＴＴ）；アリルリンカーの場合はパラジウム錯体；またはアジドでマスクされたヘミアミナールエーテルリンカーの場合はＴＣＥＰを添加することによる化学リンカーの切断によって行うことを含む。

一実施形態では、得られた核酸の抽出及び増幅を、固体担体に結合した核酸を鋳型として使用するポリメラーゼ連鎖反応によって行う。したがって、開始因子配列は適切な順方向プライマー配列を含有し得、適切な逆方向プライマーは合成され得る。

代替実施形態では、固定化開始因子配列は少なくとも１つの制限部位を含有する。したがって、さらなる実施形態では、方法はさらに、得られた核酸の抽出を１つ以上の制限酵素の使用によって行うことを含む。

制限酵素の使用、及び特定位置で核酸を切る制限部位は、当技術分野でよく知られている。制限部位及び酵素の選択は、所望の特性、例えば、「平滑」末端が必要とされるのかそれとも「付着」末端が必要とされるのかによって決まり得る。制限酵素の例としては、ＡｌｕＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｌＩ、Ｓａｕ３Ａ、ＳｃａＩ、ＳｍａＩ、ＴａｑＩ及びＸｂａＩが挙げられる。

代替実施形態では、開始因子配列は少なくとも１つのウリジンを含有する。ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）による処理は脱塩基部位を生成する。脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）部位エンドヌクレアーゼによる適切な基質に対する処理は、核酸鎖を抽出することになる。

緩衝剤
一実施形態では、１つ以上の緩衝剤（例えばトリスまたはカコジレート）、１つ以上の塩（例えば、どれもがＣｌ⁻などの適切な対イオンを伴うＮａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃｏ^２＋など）、及び無機ピロホスファターゼ（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅホモログ）を含む伸長用溶液の存在下で本発明の改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を添加する。緩衝剤及び塩の選択が最適な酵素活性及び安定性に依拠することは理解されよう。

無機ピロホスファターゼの使用は、ターミナルトランスフェラーゼによるヌクレオチド三リン酸加水分解に起因するピロホスファターゼの蓄積を軽減するのに役立つ。それゆえ、無機ピロホスファターゼの使用は、（１）逆反応及び（２）ターミナルトランスフェラーゼ鎖不均化の速度を低減する利点を有する。一実施形態では、無機ピロホスファターゼは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の精製済み組換え無機ピロホスファターゼを含む。

一実施形態では、ステップ（ｂ）を５〜１０のｐＨ範囲で実施する。したがって、ｐＨ５〜１０の緩衝範囲を有する任意の緩衝剤、例えば、カコジレート、トリス、ＨＥＰＥＳまたはトリシン、特にカコジレートまたはトリスを使用することができることは理解されよう。

一実施形態では、ステップ（ｄ）を９９℃未満、例えば、９５℃、９０℃、８５℃、８０℃、７５℃、７０℃、６５℃、６０℃、５５℃、５０℃、４５℃、４０℃、３５℃または３０℃未満の温度で実施する。使用する切断剤によって最適温度が決まることは理解されよう。用いる温度は、切断を支援し、ヌクレオチド付加中に形成されるいかなる二次構造も妨害する役割を果たす。

一実施形態では、洗浄溶液と接触させることによってステップ（ｃ）及び（ｅ）を実施する。一実施形態では、洗浄溶液は、本明細書に記載の伸長用溶液に使用されるのと同じ緩衝剤及び塩を含む。このことは、方法ステップを繰り返す場合に洗浄溶液をステップ（ｃ）の後に回収してステップ（ｂ）で伸長用溶液として再利用することを可能にするという利点を有する。

装置
一実施形態では、方法を流動機器内、例えば、マイクロ流体機器内、またはカラムに基づく流動機器の中で実施する。本明細書に記載の方法は、方法を用いることを単純にする流動構成で簡単に実施されることができる。要求される反応条件のために市販のＤＮＡ合成装置の例（例えば、ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ提供のＭｅｒＭａｄｅ １９２Ｅ、またはＫ＆Ａ提供のＨ−８ ＳＥ）を最適化して本明細書に記載の方法の実施のために使用してもよいことは理解されよう。

一実施形態では、方法をプレートまたはマイクロアレイ構成で実施する。例えば、圧電噴射及び熱噴射を含めた任意の適用可能な噴射技術を用いる一連の微量分注ノズルによってヌクレオチドを個々に取り扱ってもよい。この高度に並行するプロセスは、ハイブリダイゼーションマイクロアレイを作り出すために用いられてもよく、さらに、標準的な分子生物学技術によるＤＮＡ断片組立に適している。

一実施形態では、マイクロ流体装置内で実施される方法が提供される。かくして、本発明のさらなる態様によれば、マイクロ流体装置内で実施される核酸合成方法であって、
（ａ）マイクロ流体装置内の表面に結合した初発開始因子配列を提供するステップ、
（ｂ）本明細書において定義される改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素の存在下で可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸を上記開始因子配列に付加させるステップ、
（ｃ）開始因子配列から全ての試薬を除去するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）において上記開始因子配列に付加した可逆的遮断ヌクレオチドから遮断基を切断するステップ、及び
（ｅ）切断剤を除去するステップ
を含む、当該方法が提供される。

本明細書中でのマイクロ流体装置への言及は、連続流マイクロ流体装置、液滴に基づくマイクロ流体装置、プログラマブルデジタル式マイクロ流体装置、デジタル式マイクロ流体装置、マイクロアレイ装置（例えばＤＮＡチップ）、光流体工学装置、及び音響液滴吐出（ＡＤＥ）装置を含む。

さらなる実施形態では、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を繰り返すことによって１つより多くのヌクレオチドが付加する。さらなる実施形態では、ステップ（ａ）においてマイクロ流体装置内の表面は、決められた場所で結合している開始因子を得るべくパターニングされていてもよい。したがって、さらなる実施形態では、マイクロ流体装置は、１個の反応チャンバまたは複数個の反応チャンバ、例えば、１００、１０００もしくは１００００個より多くの反応チャンバを有し得る。

一実施形態では、方法はさらに、得られた核酸を増幅することを含む。ＤＮＡ／ＲＮＡ増幅方法は当技術分野でよく知られている。例えば、さらなる実施形態では、増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施される。このステップは、得られる核酸の増幅及び抽出をまとめて１ステップで行うことができるという利点を有する。

鋳型に依存しない本明細書に記載の核酸合成方法は、規定の組成及び長さの核酸配列を開始因子配列に付加させる能力を有する。したがって、アダプター配列を核酸ライブラリーに導入するための新規な方法として本明細書に記載の方法を使用してもよいことは当業者に理解されよう。

開始因子配列が１つの規定された配列ではなくて、（例えば、ゲノムＤＮＡまたは例えば伝令ＲＮＡの超音波処理によって生成する）核酸断片のライブラリーである場合、この方法は全ての断片上に「アダプター配列」をデノボ合成することができる。アダプター配列の組込みは次世代ライブラリー核酸シーケンシング法にとってライブラリー作製の不可欠な部分である、というのも、アダプター配列はフローセル／固体担体とのハイブリダイゼーション及び配列決定用プライマーのハイブリダイゼーションを可能にする配列情報を含有するからである。

現在用いられている方法は一本鎖ライゲーションを含むが、ライゲーション効率は断片長の増加に伴って大幅に低下するのでこの技術には限界がある。結果として現行の方法は長さが１００ヌクレオチドよりも長い配列を取り付けることができない。したがって、本明細書に記載の方法は、現在可能なものに比べて改善されるようなライブラリー作製を行うことを可能にする。

したがって、一実施形態では、アダプター配列を開始因子配列に付加させる。さらなる実施形態では、開始因子配列は核酸断片のライブラリーからの核酸であり得る。

交互相プロセス
全般的交互相プロセス
本発明の第５の態様によれば、交互相ポリマー合成方法であって、
（ａ）切断可能リンカーを介して担体部分に固定されたモノマーを提供するステップ、
（ｂ）長さ（Ｎ）のポリマーを提供するステップ、
（ｃ）本明細書において定義される改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を提供してポリマーを固定化モノマーに連結して長さ（Ｎ＋１）の固定化連結ポリマーを生み出すステップ、
（ｄ）未連結のポリマーを全て除去するステップ、及び
（ｅ）長さ（Ｎ＋１）の固定化連結ポリマーを担体部分から切断するステップ
を含む、当該方法が提供される。

本発明の第５の態様の十分な詳細は英国特許出願第１７０１３９６．２号に提供されており、参照によりその記載及び図面を本明細書に援用する。

担体部分に固定された追加のモノマーにステップ（ｅ）の生成物を供給すること、ならびにその後にステップ（ｂ）及び（ｅ）を所望の長さのポリマーが合成されるまで繰り返すことによって、１つより多くのモノマーが付加し得ることは理解されよう。

一実施形態では、ステップ（ｄ）における除去は、洗浄ステップを含む。そのような洗浄ステップは、全ての未結合ポリマーを除去することによってエラー補正ステップを提供する目的を果たす。

一実施形態では、ステップ（ｅ）における切断は、光、ｐＨ、温度、電圧などを含む。

一実施形態では、ステップ（ｅ）に続いて単離または捕捉ステップが行われる。

ポリマーが、液相中にあるか、切断可能リンカーによってそれ自体が担体部分に固定されているかのどちらかであり得ることは理解されよう。

交互相核酸合成プロセス
本発明の第５の態様として本明細書に記載する全般的交互相プロセスの一実施形態を本明細書では「交互相核酸合成プロセス」と呼ぶ。

本発明の第５の態様の一実施形態では、モノマーは、切断可能リンカーを介して担体部分に固定されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）である。

本発明の第５の態様の一実施形態では、ポリマーは長さ（Ｎ）の開始因子核酸配列である。

したがって、本発明の第６の態様によれば、核酸合成方法であって、
（ａ）切断可能リンカーを介して担体部分に固定されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を提供するステップ、
（ｂ）長さ（Ｎ）の開始因子核酸配列を提供するステップ、
（ｃ）本明細書において定義される改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を添加して開始因子核酸配列を固定化ｄＮＴＰ／ＮＴＰに連結して長さ（Ｎ＋１）の固定化連結配列を生み出すステップ、
（ｄ）未連結の開始因子核酸配列を全て除去するステップ、及び
（ｅ）長さ（Ｎ＋１）の固定化連結配列を担体部分から切断するステップ
を含む、当該方法が提供される。

本発明の第６の態様の十分な詳細は英国特許出願第１７０１３９６．２号に提供されており、参照によりその記載及び図面を本明細書に援用する。

担体部分に固定された追加のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）にステップ（ｅ）の生成物を供給すること、ならびにその後にステップ（ｂ）及び（ｅ）を所望の長さの核酸が合成されるまで繰り返すことによって、１つより多くのｄＮＴＰ／ＮＴＰが付加し得ることは理解されよう。

一実施形態では、ステップ（ｄ）における除去は、洗浄ステップを含む。そのような洗浄ステップは、全ての未結合開始因子核酸配列を除去することによってエラー補正ステップを提供する目的を果たす。

一実施形態では、ステップ（ｅ）における切断は、光、ｐＨ、温度、電圧などを含む。

一実施形態では、ステップ（ｅ）に続いて単離または捕捉ステップが行われる。

プロセス変化形態１
本発明の第６の態様として本明細書に記載する交互相核酸合成プロセスの一実施形態を本明細書では「プロセス変化形態１」と呼ぶ。概して、プロセスのこの変化形態は、ｄＮＴＰ／ＮＴＰと同じ担体部分に固定された捕捉鎖を含めることに関する。

したがって、本発明の第６の態様の一実施形態では、方法はさらに、開始因子核酸配列に対して相補的でありかつハイブリダイズすることができる核酸捕捉鎖配列を提供することを含み、ここで、上記捕捉鎖の３’末端はステップ（ａ）のｄＮＴＰ／ＮＴＰと同じ担体部分に固定されている。

かくして、本発明の第７の態様によれば、核酸合成方法であって、
（ａ）切断可能リンカーを介して担体部分に固定されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を提供するステップと、
（ｂ）長さ（Ｎ）の開始因子核酸配列を提供するステップと、
（ｃ）開始因子核酸配列に対して相補的でありかつハイブリダイズすることができる核酸捕捉鎖配列を提供するステップと
を含み、上記捕捉鎖の３’末端がステップ（ａ）のｄＮＴＰ／ＮＴＰと同じ担体部分に固定されており、
（ｄ）本明細書において定義される改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を添加して開始因子核酸配列を固定化ｄＮＴＰ／ＮＴＰに連結して長さ（Ｎ＋１）の固定化連結配列を生み出すステップと、
（ｅ）どの捕捉鎖／開始因子配列二本鎖の融解温度よりも高い反応温度を提供するステップと、
（ｆ）未連結の開始因子核酸配列を全て除去するステップと、
（ｇ）どの捕捉鎖／開始因子配列二本鎖の融解温度よりも低い反応温度を提供するステップと、
（ｈ）長さ（Ｎ＋１）の固定化連結配列を担体部分から切断するステップと、
（ｉ）どの捕捉鎖／開始因子配列二本鎖の融解温度よりも高い反応温度を提供して捕捉鎖／開始因子配列二本鎖を分離するステップと
を含む、当該方法が提供される。

本発明の第７の態様の十分な詳細は英国特許出願第１７０１３９６．２号に提供されており、参照によりその記載及び図面を本明細書に援用する。

必要なデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）と、固定化捕捉鎖とが上に固定されている追加の担体部分に、ステップ（ｉ）の生成物を供給すること、ならびにその後にステップ（ｄ）及び（ｉ）を所望の長さの核酸が合成されるまで繰り返すことによって、１つより多くのｄＮＴＰ／ＮＴＰが付加し得ることは理解されよう。

捕捉鎖に対して開始因子配列の５’末端がハイブリダイズして二本鎖を形成し得ることも理解されよう。一実施形態では、二本鎖は長さが少なくとも１０、２０または３０塩基対である。

さらに、またはあるいは、ステップ（ｄ）の改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素は固定化ｄＮＴＰ／ＮＴＰを開始因子核酸配列の３’末端に付加させる。

一実施形態では、ステップ（ｅ）及び（ｉ）で提供される温度は、二本鎖の形成を防止するように選択され、例えば、温度はおよそ９５℃であることが好適であろう。

一実施形態では、ステップ（ｆ）における除去は、洗浄ステップを含む。そのような洗浄ステップは、全ての未結合開始因子核酸配列を除去することによってエラー補正ステップを提供する目的を果たす。さらなる実施形態では、ステップ（ｆ）はステップ（ｅ）と同じ温度で行われる。

一実施形態では、ステップ（ｇ）で提供される温度は、ハイブリダイゼーションによる二本鎖の形成を可能にするように選択される。

一実施形態では、ステップ（ｈ）における切断は、光、ｐＨ、温度、電圧などを含む。さらなる実施形態では、ステップ（ｈ）における切断は、還元剤（すなわちＴＣＥＰ）または特定のｐＨ緩衝剤から選択される切断剤を含む。そのような切断剤は、長さ（Ｎ＋１）の連結配列の３’末端を結び付けている切断可能リンカーを担体部分から切断する。一実施形態では、切断を容易にするために、ステップ（ｈ）で提供される温度はどの捕捉鎖／開始因子配列二本鎖の融解温度より低い任意の温度である。

一実施形態では、ステップ（ｈ）に続いて、余った切断剤を全て除去するために洗浄ステップが実施され得る。

プロセス変化形態２
本発明の第６の態様として本明細書に記載する交互相核酸合成プロセスのさらなる実施形態を本明細書では「プロセス変化形態２」と呼ぶ。概して、プロセスのこの変化形態は、ｄＮＴＰ／ＮＴＰを移動相担体部分に固定し、開始因子核酸配列を固相担体部分に固定する、という事実に関する。

したがって、本発明の第６の態様の一実施形態では、方法はさらに、切断可能リンカーを介して移動相担体部分に固定されたｄＮＴＰ／ＮＴＰ、及び切断可能リンカーを介して固相担体部分に固定された長さ（Ｎ）の開始因子核酸配列を提供することを含む。

かくして、本発明の第８の態様によれば、核酸合成方法であって、
（ａ）切断可能リンカーを介して移動相担体部分に固定されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）もしくはヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、または窒素塩基を介して可逆的停止剤もしくは遮断部分を含有しているｄＮＴＰ／ＮＴＰを提供するステップ、
（ｂ）切断可能リンカーを介して固相担体部分に固定された長さ（Ｎ）の開始因子核酸配列を提供するステップ、
（ｃ）本明細書において定義される改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を添加して移動相固定化ｄＮＴＰ／ＮＴＰを固相固定化開始因子核酸配列に連結して長さ（Ｎ＋１）の固定化連結配列を生み出すステップ、
（ｄ）未連結の開始因子核酸配列を全て除去するステップ、及び
（ｅ）移動相担体部分を長さ（Ｎ＋１）の固定化連結配列から切断するステップ
を含む、当該方法が提供される。

本発明の第８の態様の十分な詳細は英国特許出願第１７０１３９６．２号に提供されており、参照によりその記載及び図面を本明細書に援用する。

一実施形態では、固相担体部分は反応ウェルの底部を含み、移動相担体部分は上記反応ウェル内の液相の中のビーズを含む。

一実施形態では、開始因子核酸配列の５’末端は固相担体部分に固定され、３’末端は表面から解放される。

一実施形態では、ステップ（ｃ）における改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素の添加に続いてエキソヌクレアーゼ、例えば３’−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩ）が添加され得る。このステップは、欠失または突然変異を防止するためのエラー補正ステップとして、残存するＮ種を全て分解させるという利点を提供する。

一実施形態では、ステップ（ｅ）の切断剤は、光、ｐＨ、温度、電圧などを含む。さらなる実施形態では、ステップ（ｈ）における切断は、還元剤（すなわちＴＣＥＰ）、光、熱または特定のｐＨ緩衝剤から選択される切断剤を含む。

一実施形態では、切断ステップ（ｅ）に続いて洗浄ステップを実施する。そのような洗浄ステップは、前のステップで使用した全ての溶液を除去する目的を果たす。

ｄＮＴＰ／ＮＴＰ
本明細書中での「デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）」への言及は、３つのリン酸基に結合したヌクレオシド（すなわちデオキシリボースまたはリボース糖分子に取り付けられた塩基）を含有する分子を指す。デオキシリボースを含有するヌクレオチド三リン酸の例は、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）またはデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）である。リボースを含有するヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）の例は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）またはウリジン三リン酸（ＵＴＰ）である。ヌクレオシドの他のタイプが３つのリン酸に結合してヌクレオチド三リン酸、例えば天然に存在する修飾ヌクレオシド及び人工ヌクレオシドを形成していてもよい。

担体部分
担体部分が固相担体部分か移動相担体部分かのどちらかを含むことになることは理解されよう。ｄＮＴＰ／ＮＴＰ及び／または開始因子核酸配列を固定するための固相担体部分または移動相担体部分が、ｄＮＴＰ／ＮＴＰ及び／または開始因子核酸配列を固定することを可能にすることができる任意の好適な基材から選択されることになることも、理解されよう。固相担体部分は典型的には、合成プロセス全体を通してずっと静止し続ける表面、材料または粒子を含む。移動相担体部分（例えば、粒子、ビーズ、ナノ材料など）は典型的には、径が１ｎｍ以上、例えば１〜１０００ｎｍ、特に１〜１００ｎｍ、とりわけ２ｎｍ以上、３ｎｍ以上、５ｎｍ以上または１０ｎｍ以上であり合成プロセスの異なる部分を通してずっと移動または静止し得る表面、材料またはビーズを含む。

好適な固相／移動相担体部分の例は、固体表面（例えば、ガラス、シリコン、金、プラスチックなど）、例えば平坦面、特に９６／３８４ウェルプレート、または疎水性基材（例えばテフロン）；量子ドット（例えば、ＣｄＳｅＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、及び／またはＣｕＩｎＳ２ＺｎＳ）、磁気粒子（例えば酸化鉄）、金属／半金属／金属合金粒子（例えば、金、銀及び／またはセレン）、金属酸化物粒子（例えば、Ａｌ、Ｍｇ、Ｚｒ、Ｃｅ、Ｔｉ、Ｚｎ、Ｆｅ、Ｓｎの酸化物）、シリカ粒子、アガロース粒子、ポリスチレン粒子、炭素系粒子すなわち有機粒子（例えば、グラフェン及び／またはグラフェン酸化物、核酸、タンパク質及び炭水化物）を含めた粒子、ビーズ、ナノ粒子及び／またはナノビーズ；ならびに（例えばポリエチレングリコール、金などによって）官能基化または不動態化された任意の上記表面、粒子、ビーズ、ナノ粒子及び／またはナノビーズから選択され得るが、これらは各々、どの寸法も１ｎｍ以上、例えば１〜１０００ｎｍ、特に１〜１００ｎｍ、とりわけ１ｎｍ以上、２ｎｍ以上、３ｎｍ以上、５ｎｍ以上または１０ｎｍ以上であり得る。

一実施形態では、固相担体部分は、固体表面（例えば、ガラス、シリコン、金、プラスチックなど）、例えば平坦面、特に９６／３８４ウェルプレート、または疎水性基材（例えばテフロン）；固相粒子、ポリマー及び膜から選択される。

一実施形態では、移動相担体部分は、移動相粒子、ナノ粒子、超微細粒子、ナノ材料、または径が１ｎｍ以上、例えば１〜１０００ｎｍ、特に１〜１００ｎｍ、とりわけ１ｎｍ以上、２ｎｍ以上、３ｎｍ以上、５ｎｍ以上または１０ｎｍ以上である任意の他の材料から選択される。ナノ粒子、超微細粒子またはナノ材料という用語を使用する場合、それらは可溶性粒子及び不溶性粒子の両方ともに該当する。

好適なポリマーの例は、任意の分子量のポリエチレングリコール及びポリエチレンオキシド；任意の分子量の天然ポリマー及び生体高分子（例えば、デキストラン、セルロース、コラーゲン、リグニン、ポリアミノ酸、キトサン／キチン、核酸及び／または任意の他の炭水化物もしくはデンプン）；生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド、ポリグリコライド、ポリホスホエステル、カプロラクトンなど）；π共役ポリマー（例えば、シアノ−ポリフェニレンビニレン、ポリアニリン、ポリフルオレン、ポリ（フッ化ビニレン）、ポリピリジンなど）；親水性ポリマー（例えば、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−オキサゾリン）など）；ポリシロキサンポリマー；疎水性ポリマー（例えば、スチレン、オレフィン、エステル、エーテル、カーボネートなど）；ならびに共有結合または非共有結合による分子の取付けを可能にする化学的または生化学的部分で官能基化された任意の上記ポリマーから選択され得る。

好適な膜の例は、脂質二重層；脂質単層；小胞またはミセル；ポリマー（例えば、セルロース系、ポリフッ化ビニリデンなど）で形成された膜；及び共有結合または非共有結合による分子の取付けを可能にする化学的または生化学的部分で官能基化された任意の上記膜から選択され得る。

一実施形態では、担体部分（すなわち移動相担体部分）は、直径が１ｎｍ以上である球状または球形の粒子を含む。さらなる実施形態では、担体部分は、直径が１〜１０００ｎｍ、例えば１〜１００ｎｍ、特に、１ｎｍ以上、２ｎｍ以上、３ｎｍ以上、５ｎｍ以上または１０ｎｍ以上である球状または球形の粒子を含む。

代替実施形態では、担体部分（すなわち移動相担体部分）は、どの寸法も１ｎｍ以上である棒形または棒状の粒子を含む。さらなる実施形態では、担体部分は、どの寸法も１〜１０００ｎｍ、例えば１〜１００ｎｍ、特に、１ｎｍ以上、２ｎｍ以上、３ｎｍ以上、５ｎｍ以上または１０ｎｍ以上である棒形または棒状の粒子を含む。

代替実施形態では、担体部分（すなわち移動相担体部分）は、どの寸法も１ｎｍ以上である平坦な構造体、例えば表面を含む。さらなる実施形態では、担体部分は、どの寸法も１〜１０００ｎｍ、例えば１〜１００ｎｍ、特に、１ｎｍ以上、２ｎｍ以上、３ｎｍ以上、５ｎｍ以上または１０ｎｍ以上である平坦な構造体、例えば表面を含む。

一実施形態では、担体部分（すなわち移動相担体部分）は、１，０００Ｄａ超、例えば５，０００超、特に、１０，０００Ｄａ超、とりわけ２５，０００Ｄａ超の分子量を有する。

一実施形態では、ｄＮＴＰ／ＮＴＰを、固相粒子上に固定するかまたは、核酸合成が起こることになる表面に直接堆積させることによって固定する。ｄＮＴＰ／ＮＴＰが固相粒子上に固定されている場合、核酸合成が起こることになる表面に固相粒子を固定することになる。あるいは最初に固相粒子を、核酸合成が起こることになる表面に固定してもよい。その後、ｄＮＴＰ／ＮＴＰを固相粒子に固定する。代替実施形態では、ｄＮＴＰ／ＮＴＰを移動相粒子に固定する。移動相粒子上に固定されたｄＮＴＰ／ＮＴＰは次に、プロセス変化形態２に記載のプロセスに従って固相担体部分に固定された開始因子鎖に付加した後、固相担体部分に固定される。

一実施形態では、固相粒子を固定する方法は磁気的なものである。

一実施形態では、ｄＮＴＰ／ＮＴＰは、窒素塩基（すなわちプリンまたはピリミジン部分）または三リン酸部分または糖部分を介して固相担体に固定される。

さらなる実施形態では、固定は、アジド−アルキン１，３−双極子環化付加、テトラジン／アルケンに基づく環化付加、金−硫黄結合、エポキシド基に対するアミンの求核付加、ビオチン−ストレプトアビジン／アビジン相互作用、マイケルアクセプター（例えばマレイミド）に対するスルフヒドリル基のマイケル付加、ジスルフィド結合を形成するための２つのスルフヒドリル基の酸化、抗体−抗原相互作用（例えば、ジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン）などを含む。

固定用リンカーが切断可能リンカーを含有することは理解されよう。かくして、一実施形態では、固定は可逆及び／または切断可能である。

一実施形態では、切断可能リンカーは、電磁放射線（例えば３５０ｎｍの光）もしくは還元剤もしくは酸化剤もしくは熱もしくは電気化学またはそれらの組み合わせによって切断されることができる。

一実施形態では、５’固定化鎖（すなわち捕捉鎖）は、鎖の５’末端を固体担体表面に繋げることができるアジド基などの官能基を含有する。

切断可能リンカー
切断可能リンカーが、２つ以上の単位を結び付ける広範に安定な部分であることは理解されよう。但し、当該リンカーは切断条件への曝露によって破壊され、したがって、リンカーによって結び付けられた２つの単位の分離が起こる。有用性を提供するためには、切断条件は関心対象の系に適合していなければならない。当技術分野で利用することができる多くの化学的切断可能リンカーが存在する。好適ないくつかの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：

アジドでマスクされたヘミアミナールエーテル部位（−ＯＣＨＮ_３−）を含むリンカーは、アジドからアミンへの還元によって切断され得るものであるが、結果的に、剥き出しになったヘミアミナールエーテルの自発的分解が誘発される。好適な還元剤としては、ホスフィン（例えばＴＣＥＰ）、チオール（例えば、ＤＴＴ、ＥＤＴ）、ならびに金属−リガンド錯体、例えば、有機金属のＲｕ−、Ｉｒ−、Ｃｒ−、Ｒｈ−、及びＣｏ−錯体が挙げられる。好適な金属−リガンド錯体の例は有機金属（Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋）及びその塩、例えばＲｕ（ｂｐｙ）_３Ｃｌ_２である。

保護されたヘミアミナールエーテルのための他の構成としては、水溶性リガンドと錯形成した遷移金属（例えば水溶性ホスフィンリガンドと錯形成したＰｄ）を使用して切断され得るものである、アリルまたはアリルカルバメート部分；弱塩基、例えば１％のＮａ_２ＣＯ_３で切断され得るものである、ｓｕｌｆｍｏｃ；弱塩基、例えば０．１ＭのＮａＯＨで切断され得るものである、ｍ−クロロ−ｐ−アシルオキシベンジルカルバメート；及び還元剤、例えばＴＣＥＰ、ＤＴＴによって切断され得るものである、４−アジドベンジルカルバメートが挙げられる。

ホスフィン部分を含むリンカーは、アジド試薬、例えばアルキルまたはアリールアジドとのインキュベーションによって切断され得る。生成するアザ−イリドは、切断を容易にするために適切に配置されたエステル部分と反応し得る。

ケイ素含有部位を含むリンカーは、ＫＦ及びテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）などのフッ化イオンの存在下で切断され得る。

ジスルフィド部位を含むリンカーは、ホスフィンまたはチオール試薬による還元によって切断され得る。

シアノエチル部位を含むリンカーは、ＮＨ_３または１０％Ｋ_２ＣＯ_３の溶液などの塩基性条件下で切断され得る。

光切断可能部位を含むリンカーは、ＵＶ光、理想的には、関心対象の系に関与しない波長のＵＶ光によって切断され得る。好適な光切断可能部位は当技術分野でよく知られている。例えば、オルトニトロベンジル基は３６５ｎｍのＵＶによって切断され得る。

他の好適な切断部位は当技術分野でよく知られている。

固定化ｄＮＴＰ／ＮＴＰ
一実施形態では、ヌクレオチドは、式（Ｉ）の化合物：

〔ここで、
Ｒ_０は、ヒドロキシル保護基を表し、
Ｒ_２は、水素、ヒドロキシル、−Ｎ_３、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、−Ｏ−２−（シアノエトキシ）メチル、−Ｏ−（２−シアノエチル）、−Ｏ−アジドメチル、−アミノキシ、または−Ｏ−アリルを表し、
Ｘは、水素または１つ以上のリン酸基を表し、
Ｗは、塩基を表す〕
によって遮断される。

代替実施形態では、ヌクレオチドは、式（ＩＩ）の化合物：

〔ここで、
Ｒ_１及びＲ_２は、独立してＨまたはＯＨもしくはその保護誘導体を表し、
Ｘは、水素または１つ以上のリン酸基を表し、
Ｗは、塩基を表し、
Ｙは、切断可能リンカーを表し、
Ｚは、遮断基または担体部分を表す〕
によって遮断される。

一実施形態では、Ｘは、一リン酸、二リン酸、三リン酸または四リン酸基を表す。

一実施形態では、Ｗは、窒素塩基から選択される。さらなる実施形態では、Ｗは、プリンまたはピリミジン部分から選択される。さらなる実施形態では、塩基は、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンまたはシトシンから選択される。

一実施形態では、Ｚとして定義される担体部分は、本明細書において定義されているとおりである。

さらなる実施形態では、担体部分はさらに、本明細書において定義される核酸捕捉鎖配列を含む。

キット
本発明のさらなる態様によれば、キットであって、本明細書において定義される改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を、場合によって開始因子配列、マイクロ流体装置またはチップ、１つ以上の可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸、無機ピロホスファターゼ、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の精製済み組換え無機ピロホスファターゼ、及び切断剤から選択される１つ以上の構成要素と組み合わせて含み；さらに場合によって、本明細書において定義される方法に従ってキットを使用するための説明書を一緒に含む、当該キットが提供される。

好適には、本発明に係るキットはさらに、本明細書において定義される伸長用溶液、洗浄溶液及び／または切断用溶液の群から選択される１つ以上の構成要素を、場合によって本明細書において定義されるいずれかの方法に従ってキットを使用するための説明書と一緒に、含有し得る。

本発明のさらなる態様によれば、核酸合成方法における、本明細書において定義されるキットの使用が提供される。

以下の試験及びプロトコールは、本明細書に記載の方法の実施形態を例示する：
図２からも分かるように、完全長ＴｄＴは、酵素に基づく核酸合成基盤において配列制御の手段を提供するものである３’可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸を受容するように改変されることができる（ＷＯ２０１６／１２８７３１参照）。しかしながら、完全長ＴｄＴは、それをサイクリックプロセスでの使用のための酵素としてはあまり適さないものにするいくつかの形質を有し、これらは、単回付加アッセイでは観察されないものである。完全長ＴｄＴは、溶液中で凝集する傾向にあり、多種多様な表面を急速に汚染し、図４からも分かるように単量体種、多量体種または凝集物としてＤＮＡと強く会合する。図４では、本発明者らは、完全長ＴｄＴがＤＮＡ開始因子分子から速やかに解離しないのに対し、短縮型ＴｄＴは速やかに解離するということを実証した。当然、それに続く修飾ヌクレオチドの組込効率は、完全長ＴｄＴの挙動不良に起因して悪化する可能性があるということになる。考えられる原因としては、付加した３’可逆的停止剤への到達が制限されて結果的に化学的手段か酵素的手段かのどちらかによる脱保護が妨げられること、または無能力な酵素形態が永続的に結合することが挙げられる。

実際、図５及び図６からも分かるように、完全長の改変型ＴｄＴは総じて修飾ヌクレオチド三リン酸を定量的に連続して付加させることができない。多ステップサイクルアッセイは以下のとおりに実施した：（１）ＴｄＴ触媒によって可逆的停止ヌクレオチド三リン酸を固定化ＤＮＡ開始因子分子の３’末端に付加させ、（２）未反応のヌクレオチド三リン酸及び酵素を洗い流し、（３）付加した可逆的停止ヌクレオチドを脱保護し、（４）脱保護剤を洗い流し、（５）プロセスをステップ（１）から繰り返す。ＴｄＴ媒介核酸合成の循環的性質ゆえに、単一ステップ組込効率ではなく多ステップ組込効率を使用してＴｄＴ酵素変異体の品質を鑑定せねばならない。このように、ＤＮＡと強く会合する傾向は、図２に示す単回ステップでの修飾ヌクレオチド三リン酸の定量的な転化にもかかわらず多ステップでの同じ修飾ヌクレオチド三リン酸の組込効率が良くないこと（図３〜４）の原因である。

上に述べたとおり、本発明者らは、本発明者らによるより良好なＴｄＴ変異体の探索の一部として、ＴｄＴの野生型及び改変型変異体に対して一連の切断を行った。驚くべきことに、本発明者らは、ＢＲＣＴドメインまたはその断片を欠く改変型ＴｄＴが修飾ヌクレオチド三リン酸を連続して定量的に付加させることができるのに対し、完全長の改変型ＴｄＴ酵素はそのような逐次付加をすることができない、ということを発見した。図４に示すように、短縮型ＴｄＴはＤＮＡとそれほど強く会合せず、このため多ステップ組込効率がより良好になる。ＴｄＴのＮ末端側での突然変異及び切断はまた、酵素のストークス径を減少させ、その結果、ＤＮＡ開始因子分子が表面に固定されているときの立体的問題がより少なくなるとともに、多孔質マトリックス中への酵素の浸透がより良好になる。図５は、完全長ＴｄＴが開始因子からＮ＋２生成物への乏しい転化を呈することを示す。これとは全く対照的に、ＴｄＴのＮ末端突然変異は、図６に示すように連続して１０個超の可逆的遮断ヌクレオチドをＤＮＡ開始因子分子の３’末端に付加させる能力からも分かるように、サイクル組込効率の著しい向上をもたらす。

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８．Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．ＣＤＤ／ＳＰＡＲＣＬＥ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｖｉａ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４５，Ｄ２００−Ｄ２０３（２０１７）。
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付録１
ターミナルトランスフェラーゼ酵素配列

Claims (24)

1. １つ以上のヌクレオチドを核酸の３’末端に付加させる方法における改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素の使用であって、前記酵素が突然変異ＢＲＣＡ−１ Ｃ末端（ＢＲＣＴ）ドメインを含むことを特徴とする、前記使用。
2. 前記ターミナルトランスフェラーゼ酵素がＤＮＡポリメラーゼＸファミリー由来のものである、請求項１に記載の使用。
3. 前記ターミナルトランスフェラーゼ酵素が、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ＤＮＡポリメラーゼλ（Ｐｏｌλ）及びＤＮＡポリメラーゼμ（Ｐｏｌμ）、例えばターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）から選択される、請求項１または請求項２に記載の使用。
4. 前記ＢＲＣＴドメインが、欠失、置換または挿入から選択される１つ以上の突然変異を含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
5. 前記酵素が、
   切断型ＢＲＣＴドメイン、例えば、Ｎ末端側が切断されたＢＲＣＴドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
6. 前記ＢＲＣＴドメインが存在していない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
7. 前記方法が核酸合成である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
8. 核酸合成方法であって、
   （ａ）初発開始因子配列を提供するステップ、
   （ｂ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素の存在下で可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸を前記開始因子配列に付加させるステップ、
   （ｃ）前記開始因子配列から全ての試薬を除去するステップ、
   （ｄ）ステップ（ｂ）で前記開始因子配列に付加した前記可逆的遮断ヌクレオチドから遮断基を切断するステップ、及び
   （ｅ）前記切断剤を除去するステップ
   を含む、前記方法。
9. ステップ（ｂ）〜（ｅ）を繰り返すことによって１つより多くのヌクレオチドが付加する、請求項８に記載の方法。
10. 前記ヌクレオチドが、式（Ｉ）の化合物：
    

    

    〔ここで、
    Ｒ_０は、ヒドロキシル保護基を表し、
    Ｒ_２は、水素、ヒドロキシル、−Ｎ_３、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、−Ｏ−２−（シアノエトキシ）メチル、−Ｏ−（２−シアノエチル）、−Ｏ−アジドメチル、−アミノキシ、または−Ｏ−アリルを表し、
    Ｘは、水素または１つ以上のリン酸基を表し、
    Ｗは、塩基を表す〕
    で遮断されている、請求項８または請求項９に記載の方法。
11. 前記可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸が前記ヌクレオチドの糖部分の３’位置において３’−Ｏ−２−（シアノエトキシ）メチル、３’−Ｏ−（２−シアノエチル）、３’−Ｏ−アジドメチル、３’−アミノキシ、または３’−Ｏ−アリル基のいずれかによって遮断されている、請求項８または請求項９に記載の方法。
12. 前記可逆的遮断ヌクレオチドが、前記ヌクレオチドの塩基部分の任意の位置において式（ＩＩ）の化合物：
    

    

    〔ここで、
    Ｒ_１及びＲ_２は、独立してＨまたはＯＨもしくはその保護誘導体を表し、
    Ｘは、水素または１つ以上のリン酸基を表し、
    Ｗは、塩基を表し、
    Ｙは、切断可能リンカーを表し、
    Ｚは、遮断基または担体部分を表す〕
    によって遮断されている、請求項８または請求項９に記載の方法。
13. 前記初発開始因子配列が５〜１００ヌクレオチドの長さ、または１０〜９０ヌクレオチドの長さ、または５〜２０ヌクレオチドの長さである、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素が固体担体上に固定されている、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素が液相中にある、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 交互相ポリマー合成方法であって、
    （ａ）切断可能リンカーを介して担体部分に固定されたモノマーを提供するステップ、
    （ｂ）長さ（Ｎ）のポリマーを提供するステップ、
    （ｃ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を提供して前記ポリマーを前記固定化モノマーに連結して長さ（Ｎ＋１）の固定化連結ポリマーを生み出すステップ、
    （ｄ）未連結のポリマーを全て除去するステップ、及び
    （ｅ）長さ（Ｎ＋１）の前記固定化連結ポリマーを前記担体部分から切断するステップ
    を含む、前記方法。
17. 核酸合成方法であって、
    （ａ）切断可能リンカーを介して担体部分に固定されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を提供するステップ、
    （ｂ）長さ（Ｎ）の開始因子核酸配列を提供するステップ、
    （ｃ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を添加して前記開始因子核酸配列を前記固定化ｄＮＴＰ／ＮＴＰに連結して長さ（Ｎ＋１）の固定化連結配列を生み出すステップ、
    （ｄ）未連結の開始因子核酸配列を全て除去するステップ、及び
    （ｅ）長さ（Ｎ＋１）の前記固定化連結配列を前記担体部分から切断するステップ
    を含む、前記方法。
18. 核酸合成方法であって、
    （ａ）切断可能リンカーを介して担体部分に固定されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を提供するステップと、
    （ｂ）長さ（Ｎ）の開始因子核酸配列を提供するステップと、
    （ｃ）前記開始因子核酸配列に対して相補的でありかつハイブリダイズすることができる核酸捕捉鎖配列を提供するステップであって、前記捕捉鎖の３’末端がステップ（ａ）の前記ｄＮＴＰ／ＮＴＰと同じ担体部分に固定されている前記ステップと、
    （ｄ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を添加して前記開始因子核酸配列を前記固定化ｄＮＴＰ／ＮＴＰに連結して長さ（Ｎ＋１）の固定化連結配列を生み出すステップと、
    （ｅ）どの捕捉鎖／開始因子配列二本鎖の融解温度よりも高い反応温度を提供するステップと、
    （ｆ）未連結の開始因子核酸配列を全て除去するステップと、
    （ｇ）どの捕捉鎖／開始因子配列二本鎖の融解温度よりも低い反応温度を提供するステップと、
    （ｈ）長さ（Ｎ＋１）の前記固定化連結配列を前記担体部分から切断するステップと、
    （ｉ）どの捕捉鎖／開始因子配列二本鎖の融解温度よりも高い反応温度を提供して前記捕捉鎖／開始因子配列二本鎖を分離するステップと
    を含む、前記方法。
19. 核酸合成方法であって、
    （ａ）切断可能リンカーを介して移動相担体部分に固定されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）もしくはヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、または窒素塩基を介して可逆的停止剤もしくは遮断部分を含有しているｄＮＴＰ／ＮＴＰを提供するステップ、
    （ｂ）切断可能リンカーを介して固相担体部分に固定された長さ（Ｎ）の開始因子核酸配列を提供するステップ、
    （ｃ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を添加して前記移動相固定化ｄＮＴＰ／ＮＴＰを前記固相固定化開始因子核酸配列に連結して長さ（Ｎ＋１）の固定化連結配列を生み出すステップ、
    （ｄ）未連結の開始因子核酸配列を全て除去するステップ、及び
    （ｅ）前記移動相担体部分を長さ（Ｎ＋１）の前記固定化連結配列から切断するステップ
    を含む、前記方法。
20. マイクロ流体装置内で実施される、請求項８〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. マイクロ流体装置内で実施される核酸合成方法であって、
    （ａ）マイクロ流体装置内の表面に結合した初発開始因子配列を提供するステップ、
    （ｂ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素の存在下で可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸を前記開始因子配列に付加させるステップ、
    （ｃ）前記開始因子配列から全ての試薬を除去するステップ、
    （ｄ）ステップ（ｂ）において前記開始因子配列に付加した前記可逆的遮断ヌクレオチドから前記遮断基を切断剤の存在下で切断するステップ、及び
    （ｅ）前記切断剤を除去するステップ
    を含む、前記方法。
22. 前記マイクロ流体装置が連続流マイクロ流体装置、液滴に基づくマイクロ流体装置、デジタル式マイクロ流体装置、プログラマブルデジタル式マイクロ流体装置、マイクロアレイ装置（例えばＤＮＡチップ）、光流体工学装置、及び音響液滴吐出（ＡＤＥ）装置から選択される、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
23. キットであって、
    請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を、場合によって開始因子配列、マイクロ流体装置またはチップ、１つ以上の可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸、無機ピロホスファターゼ、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の精製済み組換え無機ピロホスファターゼ、及び切断剤から選択される１つ以上の構成要素と組み合わせて含み、
    さらに場合によって、請求項８〜２２のいずれか１項に記載の方法に従って前記キットを使用するための説明書を一緒に含む、
    前記キット。
24. 核酸合成方法における請求項２３に記載のキットの使用。

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