JP2023521704A - 核酸を合成するための再利用可能なイニシエーター - Google Patents
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Abstract
本発明は、固体支持体にカップリングされた再生可能なイニシエーターを使用して、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡを合成するための改善された方法を提供する。本発明の方法を使用して、ポリヌクレオチドの特異的配列を、水性環境下、核酸鋳型を使用せずに、１塩基ごとにｄｅ ｎｏｖｏで合成することができる。本発明は、鋳型の必要性なく、所望の配列を有するポリヌクレオチドを合成するための方法および装置に関する。
Description
関連出願
本出願は、２０２０年４月６日に出願された米国出願第１６／８４１，２１４号の利益およびそれに対する優先権を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、鋳型の必要性なく、所望の配列を有するポリヌクレオチドを合成するための方法および装置に関する。
本出願は、２０２０年４月６日に出願された米国出願第１６／８４１，２１４号の利益およびそれに対する優先権を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、鋳型の必要性なく、所望の配列を有するポリヌクレオチドを合成するための方法および装置に関する。
背景
ほとんどのｄｅ ｎｏｖｏ核酸配列決定は、十分に確立された固相ホスホルアミダイト技法を使用して行われている。ホスホルアミダイト技法は、天然（または、非天然）の核酸塩基に対応するホスホルアミダイト試薬から構築される配列の逐次的な脱保護および合成を含む。しかしながら、ホスホルアミダイト核酸合成は、２００塩基対（ｂｐ）長より長い核酸が高い破損の割合および副反応を経験する点で、長さが限定されている。加えて、ホスホルアミダイト合成は、毒性の副生成物を生成し、この廃棄物の処分は、核酸合成機の利用可能性を限定し、契約オリゴヌクレオチド生成の費用を増加させる（オリゴヌクレオチド合成の一年の需要は、アセトニトリル、トリクロロ酢酸、トルエン、テトラヒドロフラン、およびピリジンを含む、３００，０００ガロンより多くの有害な化学廃棄物の原因であると推定されている。その全体が参照により本明細書に組み込まれるLeProust et al., Nucleic Acids Res., vol. 38(8), p.2522-2540, (2010)を参照されたい）。そのため、オリゴヌクレオチド合成のためのより効率的かつ費用効果が高い方法についての必要性が存在する。
ほとんどのｄｅ ｎｏｖｏ核酸配列決定は、十分に確立された固相ホスホルアミダイト技法を使用して行われている。ホスホルアミダイト技法は、天然（または、非天然）の核酸塩基に対応するホスホルアミダイト試薬から構築される配列の逐次的な脱保護および合成を含む。しかしながら、ホスホルアミダイト核酸合成は、２００塩基対（ｂｐ）長より長い核酸が高い破損の割合および副反応を経験する点で、長さが限定されている。加えて、ホスホルアミダイト合成は、毒性の副生成物を生成し、この廃棄物の処分は、核酸合成機の利用可能性を限定し、契約オリゴヌクレオチド生成の費用を増加させる（オリゴヌクレオチド合成の一年の需要は、アセトニトリル、トリクロロ酢酸、トルエン、テトラヒドロフラン、およびピリジンを含む、３００，０００ガロンより多くの有害な化学廃棄物の原因であると推定されている。その全体が参照により本明細書に組み込まれるLeProust et al., Nucleic Acids Res., vol. 38(8), p.2522-2540, (2010)を参照されたい）。そのため、オリゴヌクレオチド合成のためのより効率的かつ費用効果が高い方法についての必要性が存在する。
ＬｅＰｒｏｕｓｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１０）ｖｏｌ．３８（８）ｐ．２５２２～２５４０
概要
本発明は、核酸合成のための改善された方法を提供する。本発明の方法は、ポリヌクレオチドのより速くかつより長いｄｅ ｎｏｖｏの合成を提供する。このように、本発明は、カスタム核酸合成の全費用を劇的に低減する。本発明の方法は、切断可能なリンカーによって阻害剤にカップリングされたヌクレオチドアナログを組み込むためにヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を使用することによる、ポリヌクレオチドの鋳型非依存的合成を対象とする。阻害剤のため、合成は、それぞれの新しい塩基の付加とともに停止し、そして、リンカーは、切断され、阻害剤が分離され、天然に存在するヌクレオチドと本質的に同一であるポリヌクレオチドが残る（すなわち、酵素によって、さらなるヌクレオチド組み込みのための基質として認識される）。
本発明は、核酸合成のための改善された方法を提供する。本発明の方法は、ポリヌクレオチドのより速くかつより長いｄｅ ｎｏｖｏの合成を提供する。このように、本発明は、カスタム核酸合成の全費用を劇的に低減する。本発明の方法は、切断可能なリンカーによって阻害剤にカップリングされたヌクレオチドアナログを組み込むためにヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を使用することによる、ポリヌクレオチドの鋳型非依存的合成を対象とする。阻害剤のため、合成は、それぞれの新しい塩基の付加とともに停止し、そして、リンカーは、切断され、阻害剤が分離され、天然に存在するヌクレオチドと本質的に同一であるポリヌクレオチドが残る（すなわち、酵素によって、さらなるヌクレオチド組み込みのための基質として認識される）。
特に、本発明は、鋳型非依存的核酸合成のための再生可能な基質を提供する。ｄｅ ｎｏｖｏ合成は、固体支持体に結合している核酸イニシエーターにより開始する。好適な酵素、例えば、ポリメラーゼ、例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の存在下、ヌクレオチドアナログは、オリゴヌクレオチドを作出するために、核酸イニシエーターに付加される。ヌクレオチドアナログが、１つのヌクレオチドの付加後に停止する酵素的付加を引き起こす除去可能な終端基（terminating group）を含むことが好ましい。除去可能な終端基は、核酸の塩基部分および／または核酸の３’ヒドロキシルに連結され得る。終端基および／または３’ブロッキング基の脱ブロッキングは、酵素のための基質である新しい活性部位を作出する。新しいヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのその後の付加により、オリゴヌクレオチドが伸長する。
一部の例では、核酸イニシエーターは、酵素のための基質である３’部分を含む。放出剤（release agent）は、３’部分を切り離すために使用され、それによって、オリゴヌクレオチドを放出する。３’部分、核酸イニシエーター、および固体支持体は、新生オリゴヌクレオチドの放出後に再利用可能である。
本発明は、さらに、カスタムポリヌクレオチドの生成のために本発明の方法を利用する装置を含む。本発明の装置は、水性条件およびヌクレオチドアナログの複数の供給源を提供する１つまたは複数のバイオリアクターを含む。バイオリアクターは、例えば、リザーバー、フローセル、またはマルチウェルプレートであってもよい。バイオリアクターは、核酸イニシエーターおよび切断可能な３’部分を有する固体支持体を含んでいてもよい。固体支持体から開始して、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）または鋳型の指示なしでＤＮＡもしくはＲＮＡ鎖を伸長させる他の任意の酵素の天然の活性による逐次的なヌクレオチドの付加によって、リアクター中で成長する。リンカーの切断の際に、天然のポリヌクレオチドが、固体支持体から放出される。配列が完成したら、支持体は切断されるか、または３’部分は放出剤と接触し、天然で見出されるものと本質的に同等のポリヌクレオチドが残る。一部の実施形態では、装置は、ヌクレオチド付加後に溶液を回収すること、およびその後のヌクレオチド付加のために溶液を再利用することによって、ヌクレオチドアナログ溶液をリサイクルするように設計される。そのため、より少ない廃棄物が生成し、１塩基あたりの全費用は、技術水準の方法と比較して、低減される。ある特定の実施形態では、バイオリアクターは、マイクロ流体デバイスを含んでいてもよく、および／またはインクジェット印刷技術を使用してもよい。
終端基は、例えば、荷電部分または立体的阻害剤を含んでいてもよい。一般に、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素が機能的コンフォメーションを達成することを防止する大きな高分子は、オリゴヌクレオチド合成を阻害するために有用に使用される。そのような高分子としては、ポリマー、ポリペプチド、ポリペプトイド、およびナノ粒子が挙げられる。高分子は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼの活性部位への接近を物理的にブロックするのに十分大きくなければならず、反応動態を負に変更するように大きくてはならない。高分子は、下記に記載されるように、各種のリンカーのいずれかを使用して、ヌクレオチドアナログに連結される。
３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオチドアナログを使用する実施形態では、３’－Ｏ－ブロッキング基は、典型的には、小さく、容易に除去され、そのため、修飾された活性部位を有する操作された酵素とともに使用することが可能になる。例えば、３’－Ｏ－ブロッキング基は、アジドメチル、アミノ、またはアリル基を含み得る。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド合成は、それぞれのヌクレオチドアナログの付加の後であるが、終端基を切断する前に、１つまたは複数の合成されたオリゴヌクレオチドへの３’エキソヌクレアーゼの導入を含んでいてもよい。終端基は、３’エキソヌクレアーゼが、ヌクレオチドアナログが付加された任意のオリゴヌクレオチドに対して作用するのをブロックするが、ターミネーターを含有するアナログが成功裏に付加されなかったオリゴヌクレオチドは、３’エキソヌクレアーゼによって除去される。この様式では、本発明は、プロセス中の品質管理を可能にし、合成後の精製の必要性を排除し得る。
本発明の他の態様は、以下の図および詳細な説明の考慮により、当業者に明らかである。
詳細な説明
本発明は、酵素および核酸アナログを使用して、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡを合成するための改善された方法を提供する。開示される方法を使用して、ポリヌクレオチドの特異的配列を、水性環境下、核酸鋳型を使用せずに、１塩基ごとにｄｅ ｎｏｖｏで合成することができる。
本発明は、酵素および核酸アナログを使用して、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡを合成するための改善された方法を提供する。開示される方法を使用して、ポリヌクレオチドの特異的配列を、水性環境下、核酸鋳型を使用せずに、１塩基ごとにｄｅ ｎｏｖｏで合成することができる。
ヌクレオチドアナログは、未修飾３’ヒドロキシルを有していてもよく、または３’－Ｏ－ブロッキング基を有していてもよく、またはホスフェートに放出可能に付着したブロッカーを有していてもよい。任意の場合では、ブロッキング基は、実質的な追加分子を残さないように設計される、すなわち、酵素によって「天然の」ヌクレオチドとして認識される「跡のない（scarless）」ヌクレオチドが残るように設計される。そのため、合成の完了時に、最後のブロッキング基の除去の際に、合成されたポリヌクレオチドは、同じ配列を有する天然に存在するポリヌクレオチドと化学的および構造的に同等である。そのため、合成ポリヌクレオチドは、合成されたポリヌクレオチドが生化学的経路または代謝を妨げる懸念なく、生物系に組み込むことができる。
本発明のプロセスおよびアナログは、オリゴ－およびオリゴデオキシヌクレオチド、特に、長いオリゴヌクレオチド（＜５０００ｎｔ）の非鋳型媒介酵素合成のために使用される。生成物は、使用されるイニシエーターに応じて、一本鎖または部分的に二本鎖であり得る。長いオリゴヌクレオチドの合成は、高効率の組み込みおよび高効率の可逆的なターミネーターの除去を必要とする。固体支持体に結合したイニシエーターは、使用者が定めた配列の短片または使用者が定めた一本鎖生成物が除去される汎用のイニシエーターのいずれかである短い一本鎖ＤＮＡ配列からなる。
一態様では、開示される方法は、市販のヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素、例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いて、ステップバイステップの方式でヌクレオチドアナログからポリヌクレオチドを合成する。ヌクレオチドアナログは：
ＮＴＰ－リンカー－阻害剤
の形態のものであり、ここで、ＮＴＰは、ヌクレオチド三リン酸（すなわち、ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰ）であり、リンカーは、塩基のピリジンまたはピリミジン間の切断可能なリンカーであり、阻害剤は、酵素が、その後のヌクレオチドを組み込むのを防止する基である。それぞれのステップで、新しいヌクレオチドアナログは、成長中のポリヌクレオチド鎖に組み込まれ、そして、酵素は、阻害剤基によって、さらなるヌクレオチドを付加することをブロックされる。酵素が停止したら、過剰なヌクレオチドアナログは、成長中の鎖から除去され、阻害剤は、ＮＴＰから切断され得、新しいヌクレオチドアナログが、鎖に次のヌクレオチドを付加するため導入され得る。このステップを逐次的に反復することによって、所望の長さおよび配列のヌクレオチド配列を迅速に構築することが可能である。ポリヌクレオチド合成のためにヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用する利点としては、１）鋳型非依存的重合において、一本鎖（ｓｓ）開始プライマーを使用する３’－伸長活性、２）高効率の様式でプライマーを伸長させて、数千のヌクレオチドの付加をもたらす能力、および３）効率的な基質としての多種多様な修飾および置換ＮＴＰの許容が挙げられる。
ＮＴＰ－リンカー－阻害剤
の形態のものであり、ここで、ＮＴＰは、ヌクレオチド三リン酸（すなわち、ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰ）であり、リンカーは、塩基のピリジンまたはピリミジン間の切断可能なリンカーであり、阻害剤は、酵素が、その後のヌクレオチドを組み込むのを防止する基である。それぞれのステップで、新しいヌクレオチドアナログは、成長中のポリヌクレオチド鎖に組み込まれ、そして、酵素は、阻害剤基によって、さらなるヌクレオチドを付加することをブロックされる。酵素が停止したら、過剰なヌクレオチドアナログは、成長中の鎖から除去され、阻害剤は、ＮＴＰから切断され得、新しいヌクレオチドアナログが、鎖に次のヌクレオチドを付加するため導入され得る。このステップを逐次的に反復することによって、所望の長さおよび配列のヌクレオチド配列を迅速に構築することが可能である。ポリヌクレオチド合成のためにヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用する利点としては、１）鋳型非依存的重合において、一本鎖（ｓｓ）開始プライマーを使用する３’－伸長活性、２）高効率の様式でプライマーを伸長させて、数千のヌクレオチドの付加をもたらす能力、および３）効率的な基質としての多種多様な修飾および置換ＮＴＰの許容が挙げられる。
加えて、本発明は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼのための基質であるイニシエーター配列を使用することができる。イニシエーターは、固体支持体に付着され、酵素のための認識部位としての役割を果たす。イニシエーターは、好ましくは、酵素のための汎用のイニシエーター、例えば、ホモポリマー配列であり、固体支持体上でリサイクル可能であり、形成されたオリゴヌクレオチドは、イニシエーターから切断可能である。
本発明の方法は、合成核酸、例えば、ホスホルアミダイト合成されたＤＮＡオリゴヌクレオチドを現在使用する種々の適用に非常に適している。例えば、本発明の方法を使用して合成されたポリヌクレオチドは、核酸増幅のためのプライマー、特異的マーカーの検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして、および遺伝子工学のためのプラスミドへの組み込みのために使用される。しかしながら、開示される方法は、より速い速度および水性環境下でより長い合成鎖のヌクレオチドを生成するので、開示される方法は、それ自体が、ハイスループット適用、例えば、細胞アッセイにおける遺伝的変異の発現についてのスクリーニングならびに合成生物学にも役に立つ。さらにまた、本発明の方法は、次世代適用、例えば、合成の読み取り／書き込みメモリーとしてＤＮＡを使用するため、またはＤＮＡから完全に（または部分的に）合成される巨視的材料を作出するために必要な機能性を提供するであろう。
本発明および本明細書に記載されるシステムは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含むポリヌクレオチドの合成を提供する。ＤＮＡおよびＲＮＡなどの「天然の」ヌクレオチドのための合成経路は、通常の核酸塩基、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）の文脈中で記載される一方で、本発明の方法が、汎用塩基が組み込まれているヌクレオチド、例えば、３－ニトロピロール２’－デオキシヌクレオシド（deoxynucloside）および５－ニトロインドール２’－デオキシヌクレオシド、アルファホスホロチオエート（phosphorothiolate）、ホスホロチオエートヌクレオチド三リン酸、または他の所望の性質、例えば、蛍光を有するプリンもしくはピリミジンコンジュゲートを含む、いわゆる「非天然の」ヌクレオチドに適用され得ることが理解されるべきである。プリンおよびピリミジン塩基の他の例としては、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ（例えば、８－ブロモ）、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、デアザグアニン、７－デアザグアニン、３－デアザグアニン、デアザアデニン、７－デアザアデニン、３－デアザアデニン、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、イミダゾ［１，５－ａ］１，３，５トリアジノン、９－デアザプリン、イミダゾ［４，５－ｄ］ピラジン、チアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン、ピラジン－２－オン、１，２，４－トリアジン、ピリダジン、ならびに１，３，５トリアジンが挙げられる。一部の例では、非反応性であるが、およそ同等の塩基、すなわち、他のタンパク質、すなわち、トランスクリプターゼと反応せず、そのため、配列情報の影響を塩基の構造的効果から切り離すことを可能にする塩基を有する、ヌクレオチド配列を生成することは有用であり得る。
アナログ
本発明は、水性環境下でのポリヌクレオチドの合成のための、式ＮＴＰ－リンカー－阻害剤を有するヌクレオチドアナログを提供する。ＮＴＰ－リンカー－阻害剤の形態のアナログに関して、ＮＴＰは、任意のヌクレオチド三リン酸、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、ヌクレオチド三リン酸、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、またはデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）であり得る。
本発明は、水性環境下でのポリヌクレオチドの合成のための、式ＮＴＰ－リンカー－阻害剤を有するヌクレオチドアナログを提供する。ＮＴＰ－リンカー－阻害剤の形態のアナログに関して、ＮＴＰは、任意のヌクレオチド三リン酸、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、ヌクレオチド三リン酸、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、またはデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）であり得る。
リンカーは、阻害剤をＮＴＰに連結し、切断され得る、任意の分子部分であり得る。例えば、リンカーは、周囲環境のｐＨを調整することによって、切断され得る。リンカーはまた、所与の温度で活性化されるが、別の温度で不活性化される酵素によって切断されてもよい。一部の実施形態では、リンカーは、ジスルフィド結合を含む。
リンカーは、例えば、光切断可能な、求核性または求電子性の切断部位を含んでいてもよい。切断が特定の波長の光によって活性化される光切断可能なリンカーとしては、ベンゾイン、ニトロベラトリル、フェナシル、ピバロイル、シリル（sisyl）、２－ヒドロキシ－シンナミル（cinamyl）、クマリン－４－イル－メチル、または２－ニトロベンジルに基づくリンカーが挙げられ得る。
求核性切断部位の例としては、フッ化物イオンで切断可能なケイ素－酸素結合、または塩基性溶液中で切断され得るエステルが挙げられる。求電子的に切断されるリンカーとしては、トリチル、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基、アセタール基、ならびにｐ－アルコキシベンジルエステルおよびアミドを含み得る酸誘導切断部位が挙げられ得る。ある特定の態様では、切断可能なリンカーは、図１５に示されるように、システイン残基を含み得る。
炭素での付着が、ポリメラーゼを阻害する基の除去後に残る跡の存在をもたらすので、リンカーは、例えば、シトシンのＮ４、チミンのＮ３もしくはＯ４、グアニンのＮ２もしくはＮ３、およびアデニンのＮ６、またはウラシルのＮ３もしくはＯ４で付着することができる。リンカーは、典型的には、少なくとも約１０オングストロームのオーダーの長さ、例えば、少なくとも約２０オングストロームの長さ、例えば、少なくとも約２５オングストロームの長さであり、このようにして、阻害剤をピリジンまたはピリミジンから十分に離すことを可能にして、酵素が、付着した糖骨格を介してポリヌクレオチド鎖にＮＴＰを結合させるのを可能にする。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、成長中のヌクレオチド鎖に対して特に非反応性である環状分子を形成する点で、自己環化する。
ある特定の態様では、切断可能なリンカーは、図１４および図１６Ａ～Ｃに示されるように、ＮＴＰまたはジスルフィド結合の阻害剤側において、例えば、１、２、３もしくは４つのメチレン架橋を含む、可変数のメチレン架橋を含み得る。これらのメチレン架橋は、ＮＴＰと阻害剤との間の空間を増加させるために使用され得る。上述のように、阻害剤が、ＮＴＰの合成されたポリヌクレオチドへのカップリングを妨げるのを防止するために、切断可能なリンカーの長さが選択され得る。本発明の一部の実施形態では、荷電基からＮＴＰまでの距離は、その後のヌクレオチド組み込みを阻害する有効性において重要な役割を果たす。
例えば、阻害剤として荷電部分を使用する一部の実施形態では、荷電部分は、ＮＴＰから約５～約６０結合離れていてもよい。一部の他の実施形態では、阻害剤の荷電部分は、ＮＴＰから約１０～約４０結合離れていてもよい。一部の他の実施形態では、阻害剤の荷電部分は、ＮＴＰから約１０～約３５結合離れることができる。一部の他の実施形態では、阻害剤の荷電部分は、ＮＴＰから約１０～約３０結合離れていてもよい。一部の他の実施形態では、阻害剤の荷電部分は、ＮＴＰから約１０～約２０結合離れている。荷電部分とＮＴＰとの間の結合の数は、さらなるメチレン架橋を含むことによって増加し得る。
ヌクレオチドアナログは、酵素によるその後のヌクレオチドのカップリングを阻害するＮＴＰに連結された任意の部分を含むことができる。阻害性基は、荷電基、例えば、荷電アミノ酸であり得るか、または阻害性基は、周囲条件に応じて荷電されるようになる基であり得る。一部の実施形態では、阻害剤は、負に荷電しているか、または負に荷電するようになることが可能な部分を含んでいてもよい。例えば、阻害剤は、図１６Ａ～Ｃに示されるように、ホスフェート基の鎖（例えば、１、２または３個のホスフェート）を含んでいてもよく、ここで、さらなるホスフェートは、阻害剤の全体的なアニオン電荷を増加させる。他の実施形態では、阻害剤基は、正に荷電しているか、または正に荷電するようになることが可能である。一部の他の実施形態では、阻害剤は、アミノ酸またはアミノ酸アナログである。阻害剤は、２～２０単位のアミノ酸もしくはアナログのペプチド、２～１０単位のアミノ酸もしくはアナログのペプチド、３～７単位のアミノ酸もしくはアナログのペプチド、３～５単位のアミノ酸またはアナログのペプチドであってもよい。一部の実施形態では、阻害剤は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、およびＬｙｓ、ならびにそれらの組合せ（例えば、Ａｒｇ、Ａｒｇ－Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｐ－Ａｓｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ、Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ、またはＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐなど）からなる群より選択される基を含む。ペプチドまたは基は、同じまたは異なるアミノ酸またはアナログの組合せであってもよい。ある特定の実施形態では、ペプチド阻害剤は、アセチル化されて、遊離アミノ基の誤った結合が阻止され得る。阻害性基はまた、酵素の活性部位中の残基と反応し、このようにして、酵素によるその後のヌクレオチドのカップリングを妨げる基を含んでいてもよい。阻害剤は、－ＣＯＯ、－ＮＯ２、－ＰＯ４、－ＰＯ３、－ＳＯ２、または－ＮＲ３（式中、それぞれのＲは、Ｈもしくはアルキル基であり得る）からなる群より選択される荷電基を有していてもよい。他の実施形態では、阻害剤部分は、－ＰＯ４基を含まない。
ある特定の態様では、ターミネーターまたは阻害剤は、立体的阻害剤基を含んでいてもよい。そのような立体的阻害剤基は、ＮＴＰ－リンカー－阻害剤（すなわち、ヌクレオチドアナログ）がオリゴヌクレオチドのブロックされていない３’ＯＨにおいて組み込まれるのを可能にし得、前記組み込みは、ヌクレオチジルトランスフェラーゼによって触媒される。立体的阻害剤基は、組み込まれたヌクレオチドアナログのブロックされていない３’ＯＨにおけるヌクレオチドまたはさらなるヌクレオチドアナログの組み込みを物理的にブロックし得る。立体的阻害剤はまた、３’エンドヌクレアーゼが、ヌクレオチドアナログに作用すること、したがって、切断されていないヌクレオチドアナログが組み込まれているオリゴヌクレオチドにおいて作用することをブロックし得る。
立体的阻害剤としては、例えば、化学ポリマー、ナノ粒子、ポリＮ－置換グリシン（ペプトイド）、またはタンパク質が挙げられ得る。本発明の立体的阻害剤は、例えば、２０Å超、３０Å超、４０Å超、５０Å超、６０Å超、７０Å超、８０Å超、９０Å超、１００Å超、１１０Å超、１２０Å超、１３０Å超、１４０Å超、または１５０Å超を含む、種々のサイズであり得る。好ましい実施形態では、立体的阻害剤は、単分散または実質的に単分散であり得る。立体的阻害剤は、水溶性であってもよく、コンフォメーション的に拘束されていてもよい（すなわち、剛性または半剛性の形態のもの）。ある特定の態様では、阻害剤のサイズまたはコンフォメーションのため、立体的阻害剤は、関連するヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素の活性部位への接近を物理的にブロックする。好ましい実施形態では、立体的阻害剤は、非天然の生体模倣（bio-inspired）ポリマー、例えば、ポリペプトイドまたは非天然のポリペプチドを含み得る。
ある特定の態様では、自己集合性ポリペプトイド配列を、立体的阻害剤として使用してもよい。ペプトイドモノマーは、多くの場合、Ｎ－置換グリシン骨格に基づく。骨格は水素結合ドナーを欠くので、ポリペプトイドは、容易に処理される一方で、二次構造、例えば、ヘリックスを依然として形成することが可能である。それらは、一般に、化学的および熱的に安定していながら、ペプチドと同様の極性および側鎖を可能にする有益な性質も提供する。本発明による自己集合性ポリペプトイド立体的阻害剤は、単一のペプトイドヘリックスに自己集合して、とりわけ、０．３μｍ、０．４μｍ、０．５μｍ、０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、１．０μｍ、１．５μｍ、２μｍ、２．５μｍ、３μｍ、または３．５μｍを含むマイクロメートル範囲の直径のマイクロスフェアを形成し得る。ある特定の態様では、立体的阻害剤は、Ｃ－α－分枝状側鎖、Ｎ－アリール側鎖、Ｎ－１－ナフチルエチル側鎖、または安定なヘリックス構造を形成することができる他の構造(formation)を有するペプトイドを含んでいてもよい。ペプトイド立体的阻害剤の例を図１８に示す。図１８は、本発明による立体的阻害剤として使用され得る分枝状ポリＮ－メトキシエチルグリシンを図示する。ある特定の実施形態では、立体的阻害剤は、リンカー基、例えば、本明細書に記載される切断可能な連結基に容易に接合される反応性基を含んでいてもよい。
他の実施形態では、立体的阻害剤は、ポリマー、例えば、生体適合性ポリマーを含んでいてもよい。ポリマーは、異なるポリマーのブロックを含んでいてもよく、その結果、ブロックは、水性環境に曝露された場合に、所望の巨視的構造、例えば、球(sphere)を形成する。例えば、ポリマーが、水への添加の際にミセル構造に自己集合するように、コポリマーは、親水性および疎水性ブロックのブロックを含んでいてもよい。一部の実施形態では、疎水性ブロックは、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、またはポリラクチド（ＰＬＡ）から選択されてもよい。親水性ブロックは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または他の多価アルコールを含んでいてもよい。
他の実施形態では、阻害剤は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼの活性をブロックするために十分なサイズのナノ粒子を含んでいてもよい。そのようなナノ粒子は、例えば、金、銀、ケイ素、酸化セリウム、酸化鉄、二酸化チタン、窒化ケイ素、ホウ化ケイ素、またはシリカ、例えば、メソ多孔性シリカを含んでいてもよい。他の実施形態では、ナノ粒子は、炭素または半導体を含む、高次の分子構造、例えば、フラーレン、例えば、バッキーボールおよびナノチューブを含んでいてもよい。
立体的阻害剤は、それが連結されるヌクレオチドとの適合性およびヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素との適合性を提供するように、電荷を有していなくてもよく、または正もしくは負に荷電していてもよく、その結果、阻害剤は、ＮＴＰアナログの５’末端における組み込み反応を妨げない。立体的阻害剤は、所望のコンフォメーション、電荷、または付着部位を提供するために、種々のアミノ酸残基を組み込み得る。
ＮＴＰ－リンカー－阻害剤型のヌクレオチドアナログの例を図１Ａに示す。図１Ａにおけるアナログは、糖環上にブロックされていない未修飾３’－ＯＨを提供しながら、ジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）結合によりｄＣＴＰのＮ４位に連結された阻害性（－Ａｓｐ－Ａｓｐ－）基を含む。すべてのリンカー原子（第２の組み込みを阻害する部分を含む）を除去することができ、それによって、新生ＤＮＡ鎖を天然のヌクレオチドに戻すことが可能になるように、リンカーが構築される。図１Ｂに示されるように、水性還元剤、例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはジチオスレイトール（ＤＴＴ）を使用して、－Ｓ－Ｓ－結合を切断することができ、阻害剤機能の喪失をもたらす（脱ブロッキング）。図１Ｂに示されるように、自己環化リンカーを組み込むことができ、ヌクレオチド合成の完了時に試薬溶液から容易に除去される環状の酸化されたテトラヒドロチオフェン脱離基を生じる。
図１ＡのｄＣＴＰアナログを合成するための例示的なスキームを、下記のスキーム１Ａおよび１Ｂに示す。
スキーム１Ａおよび１Ｂと類似する方式で、ＮＴＰ－リンカー－阻害剤型のヌクレオチドアナログは、リンカー－阻害剤部分をアデニンのＮ６（図２）、グアニンのＮ２（図３）、チミンのＮ３（図４）、またはウラシルのＮ３（図５）に付着させることによって形成することもでき、それによって、「天然に存在する」ｄＮＴＰ、およびデオキシウラシルヌクレオチド（ｄＵＴＰ）のアナログを提供する。ｄＵＴＰの広範な使用の可能性は低いが、合成は、化学に基づいて明快である。
本発明は、スキーム１Ａおよび１Ｂの連結化学に限定されないが、しかしながら、カルバミメートとして、アミド、または他の自己排除連結（self-eliminating linkage）を利用することもできる。例えば、スキーム２に示されるように、ヌクレオチドは、シュタウディンガーリンカーを用いて調製することもできる。
Ａｓｐ－Ａｓｐブロッキング基に対するシュタウディンガーリンカー（スキーム２）を用いて作出されるデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）アナログを図６に示す。図６に示されるように、シュタウディンガーｄＣＴＰアナログは、アジドおよびトリフェニルホスフィンの添加により、水性条件下で切断を受ける。上記に記載され、図１～図５に例示されるように、図６に示されるシュタウディンガーアナログは、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、例えば、ＴｄＴを使用するヌクレオチド伸長のためにも好適である。図において明確に示されないが、当業者は、適切な反応物とのコンジュゲーションにおいてスキーム２を使用して、完全なｄｅ ｎｏｖｏヌクレオチド合成のために必要なシュタウディンガーリンカーを有する他のヌクレオチドアナログを生成することができる。図６と類似する方式で、スキーム２のヌクレオチドアナログは、シュタウディンガー部分をアデニンのＮ６、グアニンのＮ２、チミンのＮ３、またはウラシルのＮ３に付着させることによって形成することができ、それによって、「天然に存在する」ｄＮＴＰ、およびデオキシウラシルヌクレオチド（ｄＵＴＰ）のアナログを提供する。
例えば図７～図１０に示されるように、適切なリボヌクレオチド反応物で開始することによって、スキーム１Ａの方法論を使用して、対応するリボヌクレオチドアナログを生成することができる。図１２に示されるように、例えば、ＣＴＰアナログを含む必要なリボヌクレオチドアナログを形成するために、スキーム２を使用して、シュタウディンガーリンカーを含むリボヌクレオチドアナログも作出され得る。さらにまた、リボヌクレオチドアナログのすべて、すなわち、Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｕは、スキーム２と同様の反応を使用して形成することができる。
他の実施形態では、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオチドアナログを、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオチドアナログをオリゴヌクレオチドに組み込むことができる改変酵素と一緒に使用することができる。そのような改変酵素は、３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰアナログを、使用者が定めた配列に開始核酸を伸長させるステップバイステップの方法において使用することを可能にする（図２０を参照されたい）。さらにまた、それぞれのヌクレオチド伸長ステップの後、反応物は、固体支持体から回収およびリサイクルされて、元の試薬リザーバーに戻り得る。ステップが完了したら、３’－Ｏ－ブロッキング基が除去され、サイクルを新たに開始することが可能になる。伸長－回収－脱ブロック－洗浄のｎ回のサイクルの完了の際に、全長の一本鎖ポリデオキシヌクレオチドが、固体支持体から切断され、その後の使用のために単離される。種々の３’－Ｏ－ブロックされたデオキシヌクレオチドが使用され得るが、特定の３’－Ｏ－ブロッキング基の選択は、１）ＴｄＴによる基質利用を最大化するための最小の可能なかさ、および２）最短時間での、最も穏和で、かつ好ましくは水性条件でのブロッキング基の除去によって決まる。
種々の３’－Ｏ－修飾されたｄＮＴＰおよびＮＴＰは、ｄｅ ｎｏｖｏ合成のための開示されるタンパク質とともに使用され得る。一部の実施形態では、好ましい除去可能な３’－Ｏ－ブロッキング基は、３’－Ｏ－アミノ、３’－Ｏ－アリル、または３’－Ｏ－アジドメチルである。他の実施形態では、除去可能な３’－Ｏ－ブロッキング部分は、Ｏ－フェノキシアセチル、Ｏ－メトキシアセチル、Ｏ－アセチル、Ｏ－（ｐ－トルエン）－スルホネート、Ｏ－ホスフェート、Ｏ－ニトレート、Ｏ－［４－メトキシ］－テトラヒドロチオピラニル、Ｏ－テトラヒドロチオピラニル、Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロフラニル、Ｏ－［２－メチル，４－メトキシ］－テトラヒドロピラニル、Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロピラニル、およびＯ－テトラヒドロチオフラニルからなる群より選択される（米国特許第８，１３３，６６９号を参照されたい）。他の実施形態では、除去可能なブロッキング部分は、エステル、エーテル、カルボニトリル、ホスフェート、カーボネート、カルバメート、ヒドロキシルアミン、ボラート、ニトレート、糖、ホスホルアミド、ホスホルアミデート、フェニルスルフェナート、スルフェート、スルホン、およびアミノ酸からなる群より選択される（Metzker ML et al. Nuc Acids Res. 1994;22(20):4259-67；米国特許第６，２３２，４６５号、米国特許第７，４１４，１１６号、および米国特許第７，２７９，５６３号を参照されたく、そのすべては、それらの全体が参照により組み込まれる）。
図２１は、４種の例示的な３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰアナログ、すなわち、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＧＴＰ、および３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰを示す。３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰアナログは、専門的な供給業者、例えば、Ａｚｃｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ、ＣＡから購入することができる。対応する３’－Ｏ－ブロックされたリボヌクレオチドも商業的に入手することができ、このようにして、カスタムＲＮＡオリゴヌクレオチドの作出が可能になる。
さまざまな実施形態では、本発明のヌクレオチドアナログは、以下の構造：
を有し得る。
ＢＧは、上記で議論されるものなどの３’－Ｏ－ブロッキング基を表す。ある特定の実施形態では、３’－Ｏ－ブロッキング基は、３’－ＯＮＯ２、３’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、３’－ＯＣＨ２Ｎ３、３’－ＯＰＯ３、３’－ＯＣＨ２ＳＳＣＨ３、および３’－ＯＮＨＣ（Ｏ）Ｈであり得る。ヌクレオチド－Ｒ基は、さまざまなリンカーおよびブロッキング基または他の修飾を含む上記で議論されるヌクレオチド基のいずれかであり得る。ある特定の実施形態では、Ｒは、Ｈ、アミド、カルバメート、または尿素であり得る。これらのＲ基のいずれかは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、ピバロイル、シクロヘキシル、シクロプロピル、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、ピレニル、クリセニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、フラニル、チオフェニル、モルホリニル、ピペリジニル、ジオキサニル、テトラヒドロフラニル、またはビオチンにさらに連結されていてもよい。
完全なヌクレオチド－Ｒ基は、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、Ｎ６－修飾デオキシアデノシン、Ｎ４－修飾デオキシシチジン、Ｎ１－修飾デオキシチミジン、Ｏ６－修飾デオキシグアノシン、Ｎ１－修飾デオキシグアノシン、またはＮ２－修飾デオキシグアノシンを含み得る。
さまざまな実施形態では、ヌクレオチドアナログは、Ｎ４－修飾デオキシシチジン、またはＯ６、Ｎ１もしくはＮ２－修飾デオキシグアノシンのみであり得、それぞれ、３’－Ｏ－ブロッキング基をさらに含む。一部の実施形態では、ヌクレオチドアナログは、Ｎ４－修飾デオキシシチジン、またはＮ１－修飾デオキシチミジンのみであり得、それぞれ、３’－Ｏ－ブロッキング基をさらに含む。
一部の実施形態では、ヌクレオチドアナログは、Ｎ４－修飾デオキシシチジン、またはＮ６－修飾デオキシアデノシンのみであり得、それぞれ、３’－Ｏ－ブロッキング基をさらに含む。
一部の実施形態では、ヌクレオチドアナログは、Ｏ６、Ｎ１またはＮ２－修飾デオキシグアノシン、およびＮ６－修飾デオキシアデノシンまたはＮ１－修飾デオキシチミジンのみであり得、それぞれ、３’－Ｏ－ブロッキング基をさらに含む。
酵素
本発明の方法は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、ヌクレオチドアナログをポリヌクレオチドに集合させる。ヌクレオチジルトランスフェラーゼとしては、関連するトランスフェラーゼおよびポリメラーゼ酵素のいくつかのファミリーが挙げられる。一部のヌクレオチジルトランスフェラーゼは、リボヌクレオチドよりも効率的にデオキシリボヌクレオチドを重合し、一部のヌクレオチジルトランスフェラーゼは、デオキシリボヌクレオチドよりも効率的にリボヌクレオチドを重合し、一部のヌクレオチジルトランスフェラーゼは、およそ同じ速度でリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを重合する。
本発明の方法は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、ヌクレオチドアナログをポリヌクレオチドに集合させる。ヌクレオチジルトランスフェラーゼとしては、関連するトランスフェラーゼおよびポリメラーゼ酵素のいくつかのファミリーが挙げられる。一部のヌクレオチジルトランスフェラーゼは、リボヌクレオチドよりも効率的にデオキシリボヌクレオチドを重合し、一部のヌクレオチジルトランスフェラーゼは、デオキシリボヌクレオチドよりも効率的にリボヌクレオチドを重合し、一部のヌクレオチジルトランスフェラーゼは、およそ同じ速度でリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを重合する。
本発明に特に重要なことには、ポリメラーゼ活性を有するトランスフェラーゼ、例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）が、ヌクレオチド鎖の３’末端へのデオキシリボヌクレオチドの付加を触媒することができ、それによって、ＤＮＡヌクレオチドの鎖長が増加する。ＴｄＴは、ＤＮＡ鎖の成長中の末端への１～２つのリボヌクレオチドの付加のみを触媒し、これは、部位特異的ＤＮＡ－ＲＮＡキメラポリヌクレオチドの構築において有用であり得る。特に、操作されたＥ．ｃｏｌｉから供給される仔ウシ胸腺ＴｄＴは、本発明での使用のために好適であり、商業的供給源、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）から入手可能である。仔ウシＴｄＴに対応するアミノ酸配列を、配列番号１として表１に列挙する。
仔ウシＴｄＴに対応するヌクレオチド配列を、配列番号２として表２に列挙する。
市販のＴｄＴは、本発明の方法での使用のために好適であるが、例えば、配列番号１と少なくとも９５％共通のアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号１と少なくとも９８％共通のアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号１と少なくとも９９％共通のアミノ酸配列を有する改変ＴｄＴを、本発明の方法で使用してもよい。好適なヌクレオチジルトランスフェラーゼを発現する生物は、配列番号２と少なくとも９５％共通の、例えば、配列番号２と少なくとも９８％共通の、例えば、配列番号２と少なくとも９９％共通の核酸配列を含んでいてもよい。一部の例では、改変ＴｄＴは、ポリヌクレオチドのより効率的な生成をもたらすか、または鎖長のより良好な制御を可能にする。ＴｄＴに対する他の改変は、酵素の放出特性を変化させ、それによって、水性還元剤、例えば、ＴＣＥＰまたはＤＴＴの必要性を減少させ得る。
ＲＮＡポリヌクレオチドの合成について、Ｅ．Ｃｏｌｉポリ（Ａ）ポリメラーゼのようなヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、リボヌクレオチドイニシエーターの３’末端へのリボヌクレオチドの付加を触媒することができる。他の実施形態では、Ｅ．Ｃｏｌｉポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、本発明の方法での使用のためにより好適であり得る。Ｅ．Ｃｏｌｉポリ（Ａ）ポリメラーゼおよびＥ．Ｃｏｌｉポリ（Ｕ）ポリメラーゼは両方とも、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から入手可能である。これらの酵素を、３’ブロックされていない可逆的ターミネーターリボヌクレオチド（ribonuclotide）三リン酸（ｒＮＴＰ）とともに使用して、ＲＮＡを合成してもよい。ある特定の実施形態では、ＲＮＡは、３’ブロックされた、２’ブロックされた、もしくは２’－３’ブロックされたｒＮＴＰ、およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼまたはポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して合成されてもよい。Ｅ．Ｃｏｌｉポリ（Ａ）ポリメラーゼおよびＥ．Ｃｏｌｉポリ（Ｕ）ポリメラーゼについてのアミノ酸およびヌクレオチド配列を下記に再現する。改変されたＥ．Ｃｏｌｉポリ（Ａ）ポリメラーゼまたはＥ．Ｃｏｌｉポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、本発明の方法での使用のために好適であり得る。例えば、配列番号３と少なくとも９５％共通のアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号３と少なくとも９８％共通のアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号３と少なくとも９９％共通のアミノ酸配列を有する酵素を、本発明の方法で使用してもよい。好適な酵素を発現する生物は、配列番号４と少なくとも９５％共通の、例えば、配列番号４と少なくとも９８％共通の、例えば、配列番号４と少なくとも９９％共通の核酸配列を含んでいてもよい。あるいは、配列番号５と少なくとも９５％共通のアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号５と少なくとも９８％共通のアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号５と少なくとも９９％共通のアミノ酸配列を有する酵素を、本発明の方法で使用してもよい。好適な酵素を発現する生物は、配列番号６と少なくとも９５％共通の、例えば、配列番号６と少なくとも９８％共通の、例えば、配列番号６と少なくとも９９％共通の核酸配列を含んでいてもよい。
Ｅ．ｃｏｌｉポリ（Ａ）ポリメラーゼに対応するヌクレオチド配列を、配列番号４として表４に列挙する。
Ｅ．ｃｏｌｉポリ（Ｕ）ポリメラーゼに対応するヌクレオチド配列を、配列番号６として表６に列挙する。
上記で議論されるように、ヌクレオチドアナログにカップリングされた阻害剤は、トランスフェラーゼ、例えば、ＴｄＴが、ポリヌクレオチドから放出させないか、または他のアナログが成長中の鎖に組み込まれるのを防止させる。荷電部分は、より良好な阻害をもたらすが、しかしながら、研究は、阻害剤の特定の化学的特質が、特に重要ではないことを示唆する。例えば、ホスフェートおよび酸性ペプチドの両方を使用して、酵素活性を阻害することができる。例えば、Bowers et al., Nature Methods, vol. 6, (2009) p. 593-95および米国特許第８，０７１，７５５号を参照されたく、その両方とも、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、阻害剤は、単一のアミノ酸または－（Ａｓｐ）２のようなジペプチドを含むが、しかしながら、第１のヌクレオチドの組み込みおよび第２のヌクレオチドの組み込みの実験的に決定された速度に基づいて、必要により、その部分のサイズおよび電荷を調整することができる。すなわち、他の実施形態は、より多くのまたは異なる荷電アミノ酸または他の生体適合性荷電分子を使用し得る。
ヌクレオチド合成の他の方法を使用して、ヌクレオチジルトランスフェラーゼまたは改変ヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、鋳型非依存的方式で、ｄｅ ｎｏｖｏオリゴヌクレオチドを構築してもよい。一実施形態では、ポリメラーゼ／トランスフェラーゼ酵素は、それらが３’未修飾ｄＮＴＰアナログのホスフェートに対する修飾に遭遇した場合に、それらがヌクレオチド付加を停止するように、改変することができる。このスキームは、ヌクレオチドアナログのホスフェート末端を修飾する脱ブロッキング試薬／反応を必要とし、これは、その後のヌクレオチド組み込みのために新生鎖を解放する。この手法の好ましい実施形態は、ヌクレオチドのプリン／ピリミジン塩基の修飾が許容されるが、ホスフェート（アルファ、ベータ、またはガンマ）でのみ修飾されたヌクレオチドアナログを使用する。
一部の実施形態では、その後のヌクレオチドアナログ付加の前に、３’エキソヌクレアーゼを使用して、阻害剤で適正に終了しなかったオリゴヌクレオチドを除去することが有利であり得る。特に、適正に終了したオリゴヌクレオチドのみが構築されるように、ヌクレオチドアナログの阻害剤を選択して、ヌクレオチジルトランスフェラーゼおよび３’エキソヌクレアーゼの活性を阻害することができる。この品質管理技法を使用して、得られるオリゴヌクレオチド配列の純度が改善されるであろう。一部の実施形態では、そのような品質管理手段の使用は、合成後の精製についての必要性を否定し得る。この技法は、図１９に模式的に表され、ここで、３’エキソヌクレアーゼは、過剰なヌクレオチドアナログを除去するための洗浄ステップ後およびリンカー切断の前に、導入される。図１９に示されるように、そのような浄化ステップは、望ましくない長さおよび／または配列のものであるオリゴヌクレオチドの数を低減するであろう。
非鋳型依存的ポリメラーゼ／トランスフェラーゼ酵素を使用するための別の実施形態は、タンパク質工学またはタンパク質進化を使用して、酵素を改変し、それぞれの単一ヌクレオチド組み込みの後に新生鎖に堅固に結合し、かつ新生鎖に対して不活性のままにし、このようにして、ポリメラーゼ／トランスフェラーゼが放出試薬／条件の使用によって鎖から放出される時間まで、任意のその後の組み込みを防止することであろう。そのような改変は、可逆的ターミネーターｄＮＴＰの代わりに、天然の未修飾ｄＮＴＰの使用を可能にするように選択されるであろう。放出試薬は、高塩緩衝液、変性剤などであり得る。放出条件は、高温、撹拌などであり得る。例えば、ＴｄＴのループ１およびＳＤ１領域に対する変異は、活性を、鋳型非依存的活性からより高い鋳型依存的活性に劇的に変更することが示された。目的の特異的変異としては、限定されるものではないが、Δ３３８４／３９１／３９２、ｄｅｌ ｌｏｏｐ １（３８６→３９８）、Ｌ３９８Ａ、Ｄ３３９Ａ、Ｆ４０１Ａ、およびＱ４０２Ｋ４０３Ｃ４０４→Ｅ４０２Ｒ４０３Ｓ４０４が挙げられる。組み込み後に堅固に結合する（すなわち、単一ターンオーバー）ＴｄＴ酵素の目標を達成するための他の手段としては、限定されるものではないが、Ｋ２６１、Ｒ４３２、およびＲ４５４を含むイニシエーター鎖の３つのホスフェートへの結合の原因となる残基への変異が挙げられ得る。
非鋳型依存的ポリメラーゼ／トランスフェラーゼ酵素を使用するための別の実施形態は、タンパク質工学またはタンパク質進化を使用して、高効率で３－ブロックされた可逆的ターミネーターを許容するように酵素を改変することである。天然に存在するポリメラーゼ／トランスフェラーゼ酵素は、酵素の活性部位における立体的制約に起因して、３’－ブロックされた可逆的ターミネーターを組み込まない。酵素の活性部位における単一またはいくつかのアミノ酸を改変することで、上記に記載されるプロセスと完全に類似のプロセスにおいて、支持体に結合したイニシエーターへの３’－ブロックされた可逆的ターミネーターの高効率の組み込みを可能にし得る。組み込み後に、３’－可逆的ターミネーターは、脱ブロッキング試薬／条件で除去され、このようにして、その後の制御された伸長反応の準備ができている完全に天然の（跡のない）一本鎖分子が生成される。酵素は、入来ｄＮＴＰの３’－ＯＨに近いアミノ酸を含有し、これは、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と同じくらい容易にリボヌクレオチド三リン酸を組み込むＴｄＴの傾向を説明し、限定されるものではないが、β１とβ２との間、特に、Ｒ３３４、ループ１、およびα１３とα１４との間、特に、Ｒ４５４を含むアミノ酸は、３’－可逆的ターミネーター基のかさを収容し、それらの効率的な組み込みを可能にする、変異誘発のための標的である可能性が高い。ある特定の実施形態では、さらなるアミノ酸変化が、３’－可逆的ターミネーターを収容するために作製される変更を相殺するために必要であってもよい。鋳型依存的ポリメラーゼを使用するための別の実施形態は、３’ブロックされたか、または３’ブロックされていないｄＮＴＰアナログを、固体支持体に付着した複数のプライマー－鋳型対とともに使用することであり、ここで、鋳型は、使用者によって指定される４種の塩基のいずれかのポリメラーゼ媒介プライマー伸長を支持する核酸アナログである。
一部の実施形態では、操作されたＴｄＴを使用して、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオチドアナログを用いる段階的合成が達成される。ＡｕｔｏＤｏｃｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して、ＴｄＴタンパク質の活性部位をモデル化することが可能である。この算出に基づいて、Ａｒｇ３３６およびＡｒｇ４５４での変化を有する改変ＴｄＴが、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオチドアナログに対する酵素活性を有し得ると予測される。Ｇｌｙ４５２およびＳｅｒ４５３が、シス－ペプチド結合コンフォメーションで存在し（その全体が参照により本明細書に組み込まれるDelarue et al, EMBO J., 2002; 21(3):427-39を参照されたい）、およびＡｒｇ３３６のグアニジニウム基が、このコンフォメーションの安定化を支援すると思われる。Ａｒｇ３３６によって提供された安定性は、この位置の置換が、改変ＴｄＴタンパク質の反応性に対して負の影響を有する理由を説明するのを助け得る。一部の例では、３３６位を改変することによって作出される不安定性は、シス－ペプチド結合コンフォメーションを安定化するためにプロリンを使用することによって克服され得る。しかしながら、Ａｒｇ３３６が、例えば、アラニンまたはグリシンで置換されると、ＴＧＳＲモチーフ全体（４５１位、４５２位、４３５位、４５４位）も、この変化を相殺するように改変される必要があり得る。例えば、ＴＧＳＲモチーフは、ＴＰＳＲまたはＴＧＰＲに改変されてもよい。別の実施形態では、３’－Ｏ－ブロッキング基の立体的かさを収容するためのＡｒｇ４５４での置換は、Ａｒｇ４５４でのグリシンまたはアラニンの置換を相殺するようにα１４領域へのさらなる改変を必要としてもよい。他の実施形態では、α１１領域における他のアミノ酸についての置換が、ＧＳＲモチーフの改変の代わりに、またはそれに加えて、Ａｒｇ３３６に対する置換を相殺するように必要とされてもよい。
Ａｒｇ３３６およびＡｒｇ４５４への改変は、３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰの結合相互作用を変化させ得るが、３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰとＴｄＴの改善された立体的相互作用をもたらすであろう置換を探索することも必要であり得る。そのような立体的改変は、コンピューター的に探索することもできる。残基Ｇｌｙ３３２、Ｇｌｙ３３３、Ｇｌｙ４５２、Ｔｈｒ４５１、およびＳｅｒ４５３は、３’－Ｏ－アジドメチルまたは３’－Ｏ－アリルのような３’－ブロッキング基の追加の立体的かさを許容する置換のための潜在的な標的でもある。Ｇｌｕ４５７、Ａｌａ５１０、Ａｓｐ５０９、Ａｒｇ５０８、Ｌｙｓｌ９９、Ｓｅｒｌ９６、Ｍｅｔｌ９２、またはＬｅｕｌ６１などの３’－ＯＨの１．２ｎｍ以内にある残基はまた、３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰの基質利用を潜在的に妨げてもよく、したがって、Ａｒｇ３３６およびＡｒｇ４５４に加えて、またはそれと組み合わせて、置換のための標的である。５０８位、５０９位および５１０位でのアミノ酸置換に加えて、３’－Ｏ－ブロッキング基との干渉を除去するために、アミノ酸を欠失させることが必要であり得る。それらのアミノ酸は、タンパク質のＣ末端の近くに位置し、比較的組織化されていない領域に存在するので、それらは、上記に記載される改変の代わりに、またはそれと組み合わせて、単独でまたはまとめて欠失されてもよい。
非鋳型依存的ポリメラーゼ／トランスフェラーゼ酵素を使用するための別の実施形態は、タンパク質工学またはタンパク質進化を使用して、酵素を改変して、アナログ特異的な様式で４種の異なるヌクレオチドのそれぞれまたはさらに異なる修飾ヌクレオチドアナログの使用を最適化することができる。ヌクレオチド特異的またはヌクレオチドアナログ特異的酵素バリアントは、所望のポリヌクレオチドの合成の費用をさらに低減するであろうＫｍの低減もしくは付加速度の増強のような所望の生化学的な属性を持つように操作することができる。
固体状態合成
本発明の方法は、種々の反応条件下で実施することができるが、しかしながら、所望のポリヌクレオチドの順序正しい構築および回収は、ほとんどの場合に、ポリヌクレオチドを伸長できる固体支持体を必要とする。上記で議論されたＮＴＰ、リンカーおよび阻害剤アナログと併用される場合、例えば、水性環境下でＴｄＴまたはポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用することによって、ＤＮＡおよびＲＮＡの特定のポリヌクレオチド配列を構築することが可能である。図１３に示されるように、ＴｄＴを使用して、段階的な方式で、ポリヌクレオチド配列を伸長することによって、カスタムポリヌクレオチドの段階的な構築を生じさせることができる。前に議論されたように、それぞれのＮＴＰアナログの阻害剤基は、酵素に、ヌクレオチドの付加を停止させる。それぞれのヌクレオチド伸長ステップ後に、反応物は、リンカーを切断することによる阻害剤の除去の前に、固体支持体から洗い流され、次いで、新しい反応物が添加され、サイクルを新たに開始することが可能になる。
本発明の方法は、種々の反応条件下で実施することができるが、しかしながら、所望のポリヌクレオチドの順序正しい構築および回収は、ほとんどの場合に、ポリヌクレオチドを伸長できる固体支持体を必要とする。上記で議論されたＮＴＰ、リンカーおよび阻害剤アナログと併用される場合、例えば、水性環境下でＴｄＴまたはポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用することによって、ＤＮＡおよびＲＮＡの特定のポリヌクレオチド配列を構築することが可能である。図１３に示されるように、ＴｄＴを使用して、段階的な方式で、ポリヌクレオチド配列を伸長することによって、カスタムポリヌクレオチドの段階的な構築を生じさせることができる。前に議論されたように、それぞれのＮＴＰアナログの阻害剤基は、酵素に、ヌクレオチドの付加を停止させる。それぞれのヌクレオチド伸長ステップ後に、反応物は、リンカーを切断することによる阻害剤の除去の前に、固体支持体から洗い流され、次いで、新しい反応物が添加され、サイクルを新たに開始することが可能になる。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ヌクレオチドアナログ伸長ステップの後かつ阻害剤切断の前に、３’エキソヌクレアーゼに曝露される追加の品質管理ステップが組み込まれてもよい。３’エキソヌクレアーゼは、ブロックされていない３’ＯＨを有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド鎖を分解する。切断されていない阻害剤（例えば、立体的阻害剤）は、３’エキソヌクレアーゼが、切断されていないヌクレオチドアナログが成功裏に組み込まれた鎖を分解するのを物理的にブロックし得る。そのような品質管理ステップは、前の付加ステップにおいて所望のヌクレオチドアナログの組み込みが不成功に終わったオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのみを分解し、それによって、完成した合成配列におけるあらゆるエラーを排除する。３’エキソヌクレアーゼ曝露後に、酵素は、阻害剤切断ステップを行う前に洗い流されてもよい。
３’エキソヌクレアーゼは、所望のヌクレオチドアナログが成功裏に付加されなかった鎖を短縮するかまたは完全に分解することによって作用する。所与のサイクルで酵素的に伸長するのに失敗した鎖は、リンカー切断ステップの前に、末端高分子－ｄＮＭＰコンジュゲートを有さない。３’エキソヌクレアーゼがこの段階で導入されると、「失敗」鎖は、長さが短縮されるか、またはモノヌクレオチドリン酸まで潜在的に完全に分解されるが、全長鎖は、分解から保護され得る。長い（＞５００塩基）合成ＤＮＡの収率は、それぞれのおよびすべてのサイクルで起こる高効率の反応に依存し、酵素的伸長および脱ブロッキング／自己排除ステップの両方が、定量的収率近くで起こらなければならない。伸長の効率が低い（すなわち、伸長されず、したがって天然の未修飾末端ヌクレオチドを持つ鎖が存在する）場合、酵素的伸長ステップの後であるが、高分子ターミネーター切断ステップの前の３’エキソヌクレアーゼの導入は、新生鎖の純度に肯定的な影響を有する。
反対に、それらの鎖が、高分子ターミネーターによって依然として保護されており、次の伸長ステップの間に伸長することに失敗するので、脱ブロッキング／排除ステップが定量的レベル未満である場合、３’エキソヌクレアーゼステップは、合成の品質に影響を有さないであろう。そのため、３’エキソヌクレアーゼステップの追加による合成の品質の実際の改善は、実験的に決定することしかできず、その結果、評価は、追加の費用およびサイクル時間の価値がある場合に行われる。
３’－５’－エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素としては、上記で議論された３’－エキソヌクレアーゼ、および３’－エキソヌクレアーゼを有するポリメラーゼが挙げられる。例示的な３’－５’－エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素としては、ＥｘｏＩ、熱不安定性ＥｘｏＩ、およびＥｘｏＴ、Ｅｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ Ｔ、熱不安定性Ｅｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ ＩＩ、Ｅｘｏ ＩＩＩ、Ｅｘｏ ＩＶ、Ｅｘｏ Ｖ、Ｅｘｏ ＶＩＩ、Ｅｘｏ ＩＸ、Ｅｘｏ ＩＸ、ＴＲＥＸ１、ＴＲＥＸ２ ＲＮａｓｅ Ｔ、Ｐｏｌ ｄ、Ｐｏｌ ｅ、Ｐｏｌ ｇ、ＰＯＬ３、ＰＯＬ２、ＭＩＰ１、ＷＲＮ、ｐ５３、ＭＲＥ１１、ｈＲＡＤｌ、ＲＡＤ１、ｈＲＡＤ９、およびＲａｄ９が挙げられる。
ｎサイクルの伸長－除去－脱ブロッキング－洗浄の完了の際に、完成した全長の一本鎖ポリヌクレオチドは完全であり、固体支持体から切断され、ＤＮＡ配列決定またはＰＣＲなどの適用におけるその後の使用のために回収される。あるいは、完成した全長の一本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション分析、タンパク質またはＤＮＡ親和性捕捉などの適用におけるその後の使用のために、固体支持体に付着したままにすることができる。他の実施形態では、部分的に二本鎖のＤＮＡを、イニシエーターとして使用することができ、二本鎖ポリヌクレオチドの合成をもたらす。
ある特定の実施形態では、ヌクレオチドアナログの付加サイクルは、固体支持体に付着したオリゴヌクレオチドを、ヌクレオチドアナログに、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素の存在下かつ核酸鋳型の非存在下、前記オリゴヌクレオチドへの前記アナログの組み込みのために十分な条件下で曝露するステップを含み得る。ヌクレオチドアナログは、３’－Ｏ－ブロッキング基を含むことができ、これは、前記ブロッキング基が除去されるまで、ヌクレオチジルトランスフェラーゼが、前記オリゴヌクレオチドへの天然ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログいずれかの付加を触媒するのを防止する。それぞれのヌクレオチドアナログの組み込みの後、オリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与しない第２のヌクレオチドアナログに曝露されてもよい。次いで、オリゴヌクレオチドは、３’－ブロッキング基の除去の前に、３’－５’－エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素に曝露されてもよい。所望の３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオチドアナログが組み込まれなかった鎖は、代わりに、組み込まれた第２のヌクレオチドアナログを有するか、または何も有さない（エキソヌクレアーゼ活性に感受性の未修飾３’－ＯＨが残っている）。したがって、３’－Ｏ－ブロッキング基の除去の前のエキソヌクレアーゼによる処理は、所望のヌクレオチドアナログが組み込まれなかったエラー鎖の消化をもたらす。第２のヌクレオチドアナログは、２’，３’－ジデオキシヌクレオチドおよび２’，３’－デヒドロヌクレオチドからなる群より選択される。
エキソヌクレアーゼ処理は、それぞれのヌクレオチドアナログの組み込みサイクルの後に起こってもよく、あるいは保留され、２つもしくはそれよりも多くのヌクレオチドアナログの組み込みの後、または最終のヌクレオチドアナログを組み込み、所望のオリゴヌクレオチド配列が完成した後（しかし、最終のブロッキング基の除去の前）にのみ行われてもよい。配列を終端させる第２のヌクレオチドアナログの場合では、所望の３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオチドアナログが成功裏に組み込まれなかったエラー鎖は、鎖を終端させる第２のヌクレオチドによるさらなる伸長からブロックされ、したがって、組み込まれたさらなる３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオチドアナログを有さない。したがって、エキソヌクレアーゼ処理が、最終の組み込みステップのために保留される場合であっても、途中で生じたあらゆるエラー鎖は、エキソヌクレアーゼ活性に感受性のままである。
１１．付加サイクルが、ステップａ）、ｂ）、およびｃ）、それに続いて３’－ブロッキング基の除去ステップを含み、方法が、付加サイクルを２回またはそれよりも多く反復するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。ある特定の実施形態では、最終の組み込みステップは、３’－Ｏ－ブロッキング基およびビオチン改変を有するヌクレオチドアナログを付加することを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、核酸イニシエーターは、放出剤の存在下である場合、合成されたオリゴヌクレオチドを放出する３’部分を含む。この特徴は、一般に、図２２に図示され、ここで、核酸イニシエーター（５’－イニシエーター－）は、固体状態の支持体（白丸）および放出可能な３’部分（白星）にカップリングされて示される。一部の実施形態では、イニシエーターは、一本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、または八量体である。イニシエーターに付着した３’部分は、酵素、例えば、ＴｄＴ、例えば、改変ＴｄＴのための基質であるので、酵素は、段階的な方式で、さらなるヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを付加することができる。それぞれの付加により、合成されたオリゴヌクレオチドの長さは増加する。オリゴヌクレオチド合成が完了したら、放出剤を導入して、３’部分を核酸イニシエーターから切り離させることができる。一部の実施形態では、３’部分は、リボヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵリボヌクレオチドである。他の実施形態では、３’部分は、脱塩基デオキシリボースである。他の実施形態では、３’部分は、脱塩基リボースである。他の実施形態では、３’部分は、非ヌクレオシド５’－一リン酸である。放出剤は、塩基性溶液または金属イオンを含んでいてもよい。例えば、放出剤は、８超のｐＨ、すなわち、８．５超のｐＨ、すなわち、９．０超のｐＨ、すなわち、９．５超のｐＨを有する濃ＮＨ４ＯＨ溶液であり得る。一部の実施形態では、放出剤は、酵素、例えば、ＩＩ型制限ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、酵素は、イニシエーターの核酸配列と独特に相互作用し、イニシエーターから合成されたオリゴヌクレオチドを溶解し、イニシエーターを残す。
ある実施形態では、イニシエーターは、核酸六量体であり、３’部分は、リボヌクレオチド、例えば、アデノシンである。例えば、Ｎ－４位で連結された切断可能なターミネーターを含むヌクレオチドまたは３’－Ｏ－ブロックされた位置を有するヌクレオチドを使用して、オリゴヌクレオチド合成が完了したら、オリゴヌクレオチドを、結合したオリゴヌクレオチドをおよそ８のｐＨの水酸化アンモニウム溶液に曝露することによって、放出させることができる。次いで、合成されたオリゴヌクレオチドを含有する塩基性溶液は、六量体イニシエーターを含む固体基材から分離することができる。次いで、固体基材は、洗浄および／または中和されて、新しいオリゴヌクレオチドの製造のためのイニシエーターおよび３’部分が調製される。一部の実施形態では、末端リボヌクレオチドは、ホスファターゼまたはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの３’ホスファターゼ活性の使用によりオリゴヌクレオチド合成の前に再生される。
一部の実施形態では、固体支持体、および３’部分を含む核酸イニシエーターは、再利用可能であり、それによって、固体支持体にカップリングされたイニシエーターを、オリゴヌクレオチドの迅速な合成のために何度も使用することを可能にする。本発明の方法での使用のために好適な固体支持体としては、ビーズ、スライド、ペグまたはウェルを含む、ガラスおよびシリカ支持体が挙げられ得る。一部の実施形態では、支持体は、別の構造体、例えば、ポリマーウェルプレートまたはピペットチップに係留されてもよい。一部の実施形態では、固体支持体は、追加の磁気的性質を有していてもよく、このようにして、支持体を、磁石を使用して操作するか、またはある位置から除去することを可能にする。他の実施形態では、固体支持体は、シリカでコーティングされたポリマーであってもよく、それによって、それ自体が自動処理に役に立つ種々の構造的形状の形成を可能にする。
基材の材料およびイニシエーターと基材との間の共有結合的連結化学の選択は、イニシエーターの喪失がない合成条件に耐える構築物の能力によってのみ制限される。好ましい実施形態は、構築物全体の安定性が、付着したオリゴヌクレオチドのものであって、基材に依存しないように、イニシエーターよりも化学的安定性が高い基材およびリンカーを利用する。一部の実施形態では、密度およびイニシエーターの質を正確に制御することができるように、イニシエーターが代わりに基材にグラフトされる好ましい実施形態により、イニシエーターは、表面ヒドロキシル基を提示する材料から、５’から３’の方向で合成され得る。
イニシエーターと基材との間の共有結合的連結は、構築物の安定性を損なわない任意の結合であり得る。好ましい実施形態は、５’－アミン、５’－ヒドロキシル、５’－ホスフェート、５’－スルフヒドリル、または５’－ベンズアルデヒド基のいずれかを含有するオリゴヌクレオチドと、基材上にホルミル、クロロメチル、エポキシド、アミン、チオール、アルケン、または末端Ｃ－Ｆ結合を含有する表面または樹脂との間のカップリングを利用し得る。
一部の実施形態では、イニシエーターは、配列特異的な切断戦略のためのエレメント、例えば、制限酵素、ウラシル特異的切除試薬（ＵＳＥＲ）、または任意の種々の配列特異的ヌクレアーゼを利用するものを含有していてもよい。他の実施形態では、代わりに、これらのエレメントは、樹脂にカップリングされた後に、酵素的に合成されてもよく、またはイニシエーターに付加されてもよい。そのようなシナリオは、例えば、カップリングプロセスの間に表面官能基との潜在的な副反応を最小化するために、イニシエーターが、もっぱらチミジンで構成される場合に、好ましくあり得る。
図２３は、短いポリウラシル（Ｕ）トラクトが、ＴｄＴを使用して、イニシエーターの３’－末端に付加される溶液相の例を示す。次いで、得られるイニシエーターは、記載されるようなさらなる伸長反応のために使用されて、所望の配列が生成され得る。合成の完了の際に、新たに生成された配列は、内部ポリＵトラクトで切断されて、元のイニシエーターから新しい配列が分離され得る。使用される３０ヌクレオチドイニシエーターは、配列５’－ＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＧＧＣＣＡＡＡＡＡＡのものである。図２３に示されるゲルは、レーン１において流されたイニシエーターを含む一方で、ｄＵＴＰ（すなわち、ポリウラシルトラクト）の１または複数の付加後のイニシエーターは、レーン２において流された。次いで、生成された配列を、１０、３０、および６０分間、ＵＳＥＲ消化に付し、それぞれ、レーン３、４、および５において流した。
図２４は、内部ポリＵトラクトを含有する配列の切断が、５’－ホスフェートを持つ均質な長さの単一生成物を生成することを示す。切断プロセスは、樹脂結合イニシエーター上に３’－ホスフェートを残し、これは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、アルカリホスファターゼ、または他の脱リン酸化プロセスでの処理により除去され得る（図２５を参照されたい）。図２４に表される例において切断された内部ポリＵトラクト配列は、配列５’－ＴＴＡＡＴＴＡＡＴＵＵＵＵＧＴＧＡＧＣＴＴＡＡＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴのものであり、これは、ＵＳＥＲ消化後に、配列５’－ｐｈｏｓ－ＧＴＧＡＧＣＴＴＡＡＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴの生成物をもたらした。得られる生成物は、図２４に示されるように、レーン１、２、３、および４において、ＵＳＥＲ消化の０、１０、３０、および６０分後に流し、成功裏の切断および生成物の均質な長さを示した。レーン５において、配列ＧＴＧＡＧＣＴＴＡＡＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴの対照オリゴヌクレオチドを流した。
図２５は、例示的な固相脱リン酸化およびＴｄＴ伸長プロセスを示す。チャートは、固相伸長におけるＴｄＴ反応混合物の吸光度を表す。ｄＮＴＰが樹脂に結合したイニシエーターに付加される場合、それらは、溶液から枯渇し、上清の吸光度を低減する。トレースＡは、イニシエーターの３’－末端が末端ホスフェートでブロックされている樹脂上でのｄＮＴＰ組み込みの無視できる割合を示す。トレースＢは、そのようなイニシエーターが、１５分間エビアルカリホスファターゼで処理された後の組み込みの割合を示す。トレースＣは、ブロックされていないイニシエーターを使用した同じ条件下でのｄＮＴＰ組み込みの割合を示す。
合成された配列の切断後、次いで、樹脂は、切断部位の設置、合成、生成物除去、および再生の別のサイクルにおいて使用され得る。図２６は、例示的な再生サイクルの概要を提供する。
他の実施形態では、切断部位の設置を使用して、イニシエーターのオリゴヌクレオチドの酵素的な接近性が均質にされ得る。酵素合成サイクルの間に使用されるそれぞれの酵素は、それ自身が、潜在的に別個の最適なローディングおよび表面からの間隔を伴う立体的なフットプリントを有する。これは、段階的付加の動態および酵素切断プロセスからの収率に関する予想外の挙動を生じさせ得る。一部の実施形態では、切断部位の設置、切断、および再生の反復サイクルは、切断酵素および鋳型非依存的ポリメラーゼが、表面オリゴヌクレオチドの同じ集団に接近するように、オリゴヌクレオチド合成の前に実施されてもよい。
一部の実施形態は、合成の間に、鎖全体にわたって複数の異なる切断部位を設置し得る。消化の際に、切断部位間に位置する鎖の複雑なライブラリーが樹脂から放出され得る。次いで、そのような配列は、さらに増幅することができ、当業者により酵素的集合プロセスのために使用することができる。この手法は、独特に、表面上の比較的少ない別個の場所での配列断片のより高い多様性を生じさせるために、または合成の間の二次構造形成の危険にさらす隣接する鎖の合成を回避するために、並列合成スキームに適していることがある。
他の実施形態では、切断部位の設置は、ホスホルアミダイトに基づくオリゴヌクレオチド合成において使用されるアセチル化と類似して、未反応のイニシエーター配列の除去において支援するために、酵素的伸長のそれぞれのサイクルの直後に使用されてもよい。付加サイクル間に伸長されていない鎖は、ポリＵトラクトのための基質として作用するが、鎖ターミネーターを持つ伸長されたイニシエーターはそうではない。合成サイクルの最後に、単一ＵＳＥＲ消化を実施し、その結果、オリゴヌクレオチドが支持体から放出され、失敗した付加を含有する配列は、同時に、完全なサイズの生成物よりも短い長さに消化される。失敗した配列はまた、それらが、それらの３’－末端でここでリン酸化されるという点で、似ており、さらなる酵素的伸長に対してそれらを非反応性にする。次いで、全長配列は、伸長を受けて、選択的な捕捉、単離、または富化を可能にする任意のエレメントが付け加えられてもよい。そのようなエレメントは、追加のホモポリマートラクト、例えば、さらなるポリＵトラクト（ハイブリダイゼーションに基づく手法によって単離され、その後消化され得る）、または非共有結合的捕捉のためのビオチン化されたエレメントのいずれかであり得る。この手法は、長い（１５０ｎｔ＋オリゴヌクレオチド）、少ない試料の量、または可変の長さの配列の複雑な混合物のために好適な、好適なクロマトグラフィー技法の欠如を相殺する。
さらなる実施形態は、高度にインデックス化されたＤＮＡに基づくデータ記録媒体のリサイクルを支援するために、切断部位の設置を用いてもよい。例を図２７に示す。そのような場合では、５’－表面に固定された配列は、短いポリＡトラクトで終端する。十分な長さの末端３’－ポリＵ部位を生成するための伸長は、適切な条件下でヘアピンの折り畳みを可能にし、その結果、ポリＡストレッチに先行するイニシエーターのエレメントは、鋳型依存的ポリメラーゼを使用して複製され得る。次いで、配列を、新しいホモポリマートラクトで伸長して、自由な３’－末端を残し、これは、その後のデータ書き込み操作において使用することができる。書き込みステップの完了の際に、ヘアピンリンカーは、次いで、ＵＳＥＲ酵素で消化されて、データ鎖を放出することができるが、３’－脱リン酸化ステップ、ポリＵ付加、および鋳型鎖の再コピーにより再生される鋳型イニシエーターを残す。ＤＮＡに基づくデータ記録におけるホモポリマートラクトの使用は、参照により本明細書に組み込まれる、共同所有の米国特許出願番号第１５／９９４，３３５号に記載されている。
合成機
開示される方法の効率を十分に利用するために、水相ＤＮＡ合成機を構築して、実質的な量の所望のポリヌクレオチドを生成することができる。一実施形態では、合成機は、記載されるＮＴＰアナログ試薬、すなわち、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの４種のウェル、ならびにポリヌクレオチド成長をもたらすのに十分な濃度のＴｄＴを含む。複数の開始配列を、例えば、実験室ロボットを使用して、４種のウェルのそれぞれに反復して浸漬されるように設計された固体支持体に付着させることができる。ロボットは、ヌクレオチド付加の間に洗浄緩衝液で固体支持体をすすぎ、支持体を脱ブロッキング剤に曝露することによって連結基を切断し、次の所望のヌクレオチドのウェルに固体支持体を移動させる前に、２回目の洗浄を固体支持体にするように、さらにプログラムされ得る。単純なプログラミングにより、数時間で、有害な廃棄物の実質的な低減を伴って、有用な量の所望のヌクレオチド配列を作出することが可能である。注意深く制御された条件下で進行する合成は、数千の塩基対の長さを有するポリヌクレオチドの合成を可能にする。完了の際に、伸長生成物は、固体支持体から放出され、そして、それらを、完成したヌクレオチド配列として使用することができる。
開示される方法の効率を十分に利用するために、水相ＤＮＡ合成機を構築して、実質的な量の所望のポリヌクレオチドを生成することができる。一実施形態では、合成機は、記載されるＮＴＰアナログ試薬、すなわち、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの４種のウェル、ならびにポリヌクレオチド成長をもたらすのに十分な濃度のＴｄＴを含む。複数の開始配列を、例えば、実験室ロボットを使用して、４種のウェルのそれぞれに反復して浸漬されるように設計された固体支持体に付着させることができる。ロボットは、ヌクレオチド付加の間に洗浄緩衝液で固体支持体をすすぎ、支持体を脱ブロッキング剤に曝露することによって連結基を切断し、次の所望のヌクレオチドのウェルに固体支持体を移動させる前に、２回目の洗浄を固体支持体にするように、さらにプログラムされ得る。単純なプログラミングにより、数時間で、有害な廃棄物の実質的な低減を伴って、有用な量の所望のヌクレオチド配列を作出することが可能である。注意深く制御された条件下で進行する合成は、数千の塩基対の長さを有するポリヌクレオチドの合成を可能にする。完了の際に、伸長生成物は、固体支持体から放出され、そして、それらを、完成したヌクレオチド配列として使用することができる。
高度に並列の実施形態は、９６または３８４ウェルいずれかの形式のペグ上の一連のイニシエーター－固体支持体からなり得、これは、個々に、引き込められるかもしくは降下されることができ、その結果、ペグは、制御された方式でウェル中の液体と接触するようにインデックス化され得る、。したがって、合成機は、無作為にアドレス可能なペグデバイス、ペグデバイスと同じ形式（９６または３８４間隔）の４種の酵素－ｄＮＴＰアナログリザーバー、ペグデバイスと同じ形式（９６または３８４間隔）の追加の試薬リザーバー（洗浄、脱ブロッキングなど）、および使用者がプログラム可能な制御されているが、ランダムなアクセス方式で１つのリザーバーから別のものにペグデバイスを移動させる輸送機構（例えば、実験室ロボット）からなり得る。内容物は、それぞれのポリヌクレオチド合成の費用を低減するために合成プロセス全体を通して再利用されるので、４種の酵素－ｄＮＴＰリザーバーのそれぞれの混入を回避するように注意されなければならない。
代替の実施形態では、試薬（例えば、ヌクレオチドアナログ、酵素、緩衝液）は、固体支持体間で移動され、試薬をリサイクルすることを可能にする。例えば、リザーバーおよびにポンプのシステムは、オリゴヌクレオチドが形成される１つまたは複数のリアクター間で４種の異なるヌクレオチドアナログ溶液、洗浄緩衝液および／または還元剤溶液を移動させることができる。リアクターおよびポンプは、従来のものであり得るか、またはデバイスは、マイクロフルイディクスを使用して構築されてもよい。無水でない（水性の）特質のプロセスのため、水への曝露を排除するために使用されるハードウェアの設計において、特別な注意を払う必要はない。合成プロセスは、蒸発での損失を制御するための予防措置のみを用いて行うことができる。高度に並列の実施形態は、同じ一致する形式での一連のウェルに相互接続することができる９６または３８４ウェルいずれかの形式のペグ上のモノシリックの一連のイニシエーター－固体支持体からなり得る。それぞれのウェルは、実際に、適切なバルブを有する４種の酵素－ｄＮＴＰアナログリザーバー、および追加の試薬リザーバー（洗浄、脱ブロッキングなど）によって供給される反応チャンバーであろう。酵素－ｄＮＴＰ反応物が、それぞれのポリヌクレオチド合成の費用を低減するために、合成プロセス全体を通して再利用されるので、フルイディクスの論理で、それぞれの伸長反応後に初期の方式で酵素－ｄＮＴＰ反応物を回収するための準備が行われるであろう。他の実施形態では、ピペッティングチップのシステムを使用して、試薬を添加および除去することができる。
ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは、マイクロ流体デバイスおよび／またはインクジェット印刷技術を使用して合成されてもよい。例示的なマイクロ流体ポリヌクレオチド合成デバイスを、例示目的のために図１７に示すが、一定の拡大縮小比ではない。レギュレーター２５７を含むマイクロ流体チャネル２５５は、リザーバー２５３を反応チャンバー２５１に連結し、レギュレーター２５７を含む出口チャネル２５９は、反応チャンバー２５１から廃棄物を排出することができる。ポリヌクレオチド合成のためのマイクロ流体デバイスは、例えば、チャネル２５５、リザーバー２５３、および／またはレギュレーター２５７を含み得る。ポリヌクレオチド合成は、マイクロ流体の反応チャンバー２５１において起こり得、これは、いくつかの繋留された合成されたヌクレオチドイニシエーターを含んでいてもよく、これは、反応チャンバーの内面に繋留または結合されたビーズまたは他の基材（これは、ＮＴＰアナログもしくはポリヌクレオチドイニシエーターを放出可能に結合することができる）を含んでいてもよい。反応チャンバー２５１は、少なくとも１つの取込みおよび１つの出口チャネル２５９を含んでいてもよく、その結果、試薬は、反応チャンバー２５１に添加および除去され得る。マイクロ流体デバイスは、それぞれの個々のＮＴＰアナログについてのリザーバー２５３を含んでいてもよい。これらのＮＴＰアナログのリザーバー２５３のそれぞれはまた、適切な量のＴｄＴ、または鋳型の指示なしでＤＮＡもしくはＲＮＡ鎖を伸長する任意の他の酵素を含んでいてもよい。追加のリザーバー２５３は、リンカー／阻害剤の切断および洗浄のための試薬を含有していてもよい。これらのリザーバー２５３は、別々のチャネル２５５を介して反応チャンバー２５１に連結することができ、反応チャンバー２５１へのそれぞれのチャネル２５５を通る試薬の流れは、ゲート、バルブ、圧力レギュレーター、または他の手段の使用により、個々に調節され得る。出口チャネル２５９を通る反応チャンバー２５１からの流れは、同様に、調節され得る。
ある特定の例では、試薬、特に、ＮＴＰアナログ－酵素試薬は、リサイクルされ得る。試薬は、ゲート、バルブ、圧力レギュレーターまたは他の手段を使用して逆流を誘導することによって、それらが入る同じチャネル２５５を介して反応チャンバー２５１からそれらの個々のリザーバー２５３に引き戻されてもよい。あるいは、試薬は、独立した戻りチャネルを介して反応チャンバー２５１からそれらの個々のリザーバー２５３に戻されてもよい。マイクロ流体デバイスは、上記に記載されるゲート、バルブ、圧力または他のレギュレーター２５７を操作することができるコントローラーを含んでいてもよい。
例示的なマイクロ流体ポリヌクレオチド合成反応は、反応チャンバー２５１に所望の酵素－ＮＴＰアナログ試薬を流すステップ；設定時間後に、酵素－ＮＴＰアナログ試薬を出口チャネル２５９または戻りチャネルを介して反応チャンバー２５１から除去するステップ；反応チャンバー２５１に洗浄試薬を流すステップ；洗浄試薬を、出口チャネル２５９を通して反応チャンバー２５１から除去するステップ；反応チャンバー２５１に脱ブロッキングまたは切断試薬を流すステップ；脱ブロッキングまたは切断試薬を出口チャネル２５９もしくは戻りチャネルを介して反応チャンバー２５１から除去するステップ；反応チャンバー２５１に洗浄試薬を流すステップ；洗浄試薬を、出口チャネル２５９を通して反応チャンバー２５１から除去するステップ；反応チャンバー２５１に合成される所望の配列における次のＮＴＰを含む酵素－ＮＴＰアナログ試薬を流すステップ；および所望のポリヌクレオチドが合成されるまで反復するステップを含み得る。所望のポリヌクレオチドが合成された後、それは、反応チャンバーアンカーまたは基材から放出させ、出口チャネル２５９または他の手段を介して収集され得る。
ある特定の態様では、ＮＴＰアナログ、ＴｄＴおよび／または他の酵素を含む、試薬および化合物、ならびにリンカー／阻害剤の切断および／または洗浄のための試薬は、インクジェット印刷技術または圧電性ドロップオンデマンド（ＤＯＤ）インクジェット印刷技術を使用して、反応チャンバーに堆積されてもよい。インクジェット印刷技術を使用して、液滴を形成することができ、それを、空気により反応チャンバーに堆積させることができる。試薬液滴は、ピコリットル～ナノリットルスケールの体積を有し得る。液滴は、１Ｈｚ、１０Ｈｚ、１００Ｈｚ、１ｋＨｚ、２ｋＨｚ、および２．５ｋＨｚを含む各種の周波数で、インクジェット印刷技術を使用して導入されてもよい。さまざまな試薬が、インクジェット印刷デバイス内の別々のリザーバーに保管され得、インクジェット印刷デバイスは、例えば、チップ内の異なる反応チャンバーまたはウェルを含む、さまざまな別々の位置にさまざまな試薬の液滴を送達し得る。ある特定の実施形態では、インクジェットおよびマイクロ流体技術は組み合わされてもよく、ここで、ある特定の試薬および化合物は、インクジェット印刷技術を介して反応チャンバーに送達される一方、他のものは、マイクロ流体チャネルまたは管を介して送達される。インクジェット印刷デバイスは、プロセッサーにカップリングされた少なくとも非一過性の有形メモリーを含むコンピューティングデバイスによって制御されてもよい。コンピューティングデバイスは、例えば、タッチスクリーン、マウスもしくはキーボードを含む入力デバイスからの入力を受信し、インクジェット印刷デバイスが、試薬の液滴を堆積する時間および場所、それを堆積する試薬、ならびに／または堆積される試薬の量を制御するように操作可能であり得る。
ある特定の例では、所望のポリヌクレオチド配列は、入力デバイスを通してコンピューティングデバイスに入力され得、ここで、コンピューティングデバイスは、上記に記載されるように、適切な順序で、適切なＮＴＰアナログ、酵素、切断試薬、および洗浄試薬を逐次的に堆積させることによって、所望のポリヌクレオチド配列を生成するために必要な反応を行うように操作可能である。
合成後に、放出された伸長生成物を、高分解能ＰＡＧＥによって分析して、イニシエーターが、対照と比較して、予想された塩基の数まで伸長されたかどうかを決定することができる。回収された合成ＤＮＡの一部はまた、配列決定されて、合成されたポリヌクレオチドが予想された配列のものであるかどうかが決定され得る。
合成機は、比較的単純であり、ホスホルアミダイト合成のために必要な有毒な構成要素を必要としないので、本発明の合成機は、研究機関、バイオテクノロジー企業、および病院にとって広く利用しやすい。加えて、試薬を再利用／リサイクルする能力は、生成する廃棄物を低減し、消耗品の費用を低減するのを助ける。本発明者らは、本方法およびシステムが、多数の適用、例えば、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ、および合成生物学において有用であると予想する。
参照による組み込み
他の文書、例えば、特許、特許出願、特許公開、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツへの参照および引用を、本開示全体を通して行った。そのような文書のすべては、すべての目的のために、それらの全体が、ここに参照により本明細書に組み込まれる。
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均等物
本明細書に示され、記載したものに加えて、本発明のさまざまな改変およびその多くのさらなる実施形態は、本明細書に引用された科学文献および特許文献への言及を含む、本文書の全内容から当業者に明らかになるであろう。本明細書の主題は、そのさまざまな実施形態およびその均等物における本発明の実施に適合し得る重要な情報、例示、および指針を含む。
本明細書に示され、記載したものに加えて、本発明のさまざまな改変およびその多くのさらなる実施形態は、本明細書に引用された科学文献および特許文献への言及を含む、本文書の全内容から当業者に明らかになるであろう。本明細書の主題は、そのさまざまな実施形態およびその均等物における本発明の実施に適合し得る重要な情報、例示、および指針を含む。
Claims (20)
- オリゴヌクレオチドを合成するための方法であって、前記方法は、
固体支持体に付着したオリゴヌクレオチドを、ヌクレオチドアナログに、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素の存在下かつ核酸鋳型の非存在下、前記オリゴヌクレオチドへの前記アナログの組み込みのために十分な条件下で曝露するステップであって、前記ヌクレオチドアナログが、３’－Ｏ－ブロッキング基を含み、前記３’－Ｏ－ブロッキング基は、前記ブロッキング基が除去されるまで、前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼが、前記オリゴヌクレオチドへの天然ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログいずれかの付加を触媒するのを防止する、ステップ、ならびに
前記３’－Ｏ－ブロッキング基の除去の前に、前記オリゴヌクレオチドを、３’－５’－エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素に曝露するステップ
を含む、方法。 - 前記ヌクレオチドアナログの構造が、
ＢＧは、３’－ＯＮＯ２、３’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、３’－ＯＣＨ２Ｎ３、３’－ＯＰＯ３、３’－ＯＣＨ２ＳＳＣＨ３、および３’－ＯＮＨＣ（Ｏ）Ｈからなる群より選択される３’－Ｏ－ブロッキング基であり、
Ｒは、Ｈ、アミド、カルバメート、および尿素からなる群より選択され、それぞれの場合に、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、ピバロイル、シクロヘキシル、シクロプロピル、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、ピレニル、クリセニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、フラニル、チオフェニル、モルホリニル、ピペリジニル、ジオキサニル、テトラヒドロフラニル、およびビオチンからなる群より選択されるメンバーに必要に応じて連結されている、
請求項１に記載の方法。 - 前記ヌクレオチドアナログが、以下の構造：
ＢＧは、３’－ＯＮＯ２、３’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、３’－ＯＣＨ２Ｎ３、３’－ＯＰＯ３、３’－ＯＣＨ２ＳＳＣＨ３、および３’－ＯＮＨＣ（Ｏ）Ｈからなる群より選択される３’－Ｏ－ブロッキング基であり、
ヌクレオチド－Ｒは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、Ｎ６－修飾デオキシアデノシン、Ｎ４－修飾デオキシシチジン、Ｎ１－修飾デオキシチミジン、Ｏ６－修飾デオキシグアノシン、Ｎ１－修飾デオキシグアノシン、およびＮ２－修飾デオキシグアノシンからなる群より選択される、
請求項１に記載の方法。 - 前記３’－５’－エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、ＥｘｏＩ、熱不安定性ＥｘｏＩ、およびＥｘｏＴ、Ｅｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ Ｔ、熱不安定性Ｅｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ ＩＩ、Ｅｘｏ ＩＩＩ、Ｅｘｏ ＩＶ、Ｅｘｏ Ｖ、Ｅｘｏ ＶＩＩ、Ｅｘｏ ＩＸ、Ｅｘｏ ＩＸ、ＴＲＥＸ１、ＴＲＥＸ２ ＲＮａｓｅ Ｔ、Ｐｏｌ ｄ、Ｐｏｌ ｅ、Ｐｏｌ ｇ、ＰＯＬ３、ＰＯＬ２、ＭＩＰ１、ＷＲＮ、ｐ５３、ＭＲＥ１１、ｈＲＡＤｌ、ＲＡＤ１、ｈＲＡＤ９、およびＲａｄ９からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
- ヌクレオチド－Ｒが、Ｎ４－修飾デオキシシチジン、Ｏ６－修飾デオキシグアノシン、Ｎｌ－修飾デオキシグアノシン、およびＮ２－修飾デオキシグアノシンからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
- ヌクレオチド－Ｒが、Ｎ４－修飾デオキシシチジン、およびＮ１－修飾デオキシチミジンからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
- ヌクレオチド－Ｒが、Ｎ４－修飾デオキシシチジン、およびＮ６－修飾デオキシアデノシンからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
- ヌクレオチド－Ｒが、Ｏ６－修飾デオキシグアノシン、Ｎｌ－修飾デオキシグアノシン、Ｎ２－修飾デオキシグアノシン、Ｎ６－修飾デオキシアデノシン、およびＮ１－修飾デオキシチミジンからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドを合成するための方法であって、前記方法は、
ａ）固体支持体に付着したオリゴヌクレオチドを、ヌクレオチドアナログに、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素の存在下かつ核酸鋳型の非存在下、前記オリゴヌクレオチドへの前記アナログの組み込みのために十分な条件下で曝露するステップであって、前記ヌクレオチドアナログが、３’－Ｏ－ブロッキング基を含み、前記３’－Ｏ－ブロッキング基は、前記ブロッキング基が除去されるまで、前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼが、前記オリゴヌクレオチドへの天然ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログいずれかの付加を触媒するのを防止する、ステップ、
ｂ）３’－ブロッキング基の除去の前に、前記オリゴヌクレオチドを、エキソヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与しない第２のヌクレオチドアナログに曝露するステップ、ならびに
ｃ）前記３’－ブロッキング基の除去の前に、前記オリゴヌクレオチドを、３’－５’－エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素に曝露するステップ
を含む、方法。 - 前記第２のヌクレオチドアナログが、２’，３’－ジデオキシヌクレオチドおよび２’，３’－デヒドロヌクレオチドからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
- 付加サイクルが、ステップａ）、ｂ）、およびｃ）、それに続いて前記３’－ブロッキング基の除去ステップを含み、前記方法が、前記付加サイクルを２回またはそれよりも多く反復するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
- 付加サイクルが、ステップａ）、およびｂ）、それに続いて前記３’－ブロッキング基の除去ステップを含み、前記方法が、
前記付加サイクルを２回またはそれよりも多く反復するステップ、ならびに
前記付加サイクルの最後の反復の後、ステップａ）、ｂ）、およびｃ）を含む最終サイクルを行うステップ
をさらに含む、請求項９に記載の方法。 - 前記付加サイクルの最後の反復の後、前記オリゴヌクレオチドを、前記３’－Ｏ－ブロッキング基およびビオチン修飾を含む第３のヌクレオチドアナログに曝露するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドアナログの構造が、
ＢＧは、３’－ＯＮＯ２、３’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、３’－ＯＣＨ２Ｎ３、３’－ＯＰＯ３、３’－ＯＣＨ２ＳＳＣＨ３、および３’－ＯＮＨＣ（Ｏ）Ｈからなる群より選択される３’－Ｏ－ブロッキング基であり、
Ｒは、Ｈ、アミド、カルバメート、および尿素からなる群より選択され、それぞれの場合に、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、ピバロイル、シクロヘキシル、シクロプロピル、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、ピレニル、クリセニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、フラニル、チオフェニル、モルホリニル、ピペリジニル、ジオキサニル、テトラヒドロフラニル、およびビオチンからなる群より選択されるメンバーに必要に応じて連結されている、
請求項９に記載の方法。 - 前記ヌクレオチドアナログが、以下の構造：
ＢＧは、３’－ＯＮＯ２、３’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、３’－ＯＣＨ２Ｎ３、３’－ＯＰＯ３、３’－ＯＣＨ２ＳＳＣＨ３、および３’－ＯＮＨＣ（Ｏ）Ｈからなる群より選択される３’－Ｏ－ブロッキング基であり、
ヌクレオチド－Ｒは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、Ｎ６－修飾デオキシアデノシン、Ｎ４－修飾デオキシシチジン、Ｎ１－修飾デオキシチミジン、Ｏ６－修飾デオキシグアノシン、Ｎ１－修飾デオキシグアノシン、およびＮ２－修飾デオキシグアノシンからなる群より選択される、
請求項９に記載の方法。 - 前記３’－５’－エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、ＥｘｏＩ、熱不安定性ＥｘｏＩ、およびＥｘｏＴ、Ｅｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ Ｔ、熱不安定性Ｅｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ ＩＩ、Ｅｘｏ ＩＩＩ、Ｅｘｏ ＩＶ、Ｅｘｏ Ｖ、Ｅｘｏ ＶＩＩ、Ｅｘｏ ＩＸ、Ｅｘｏ ＩＸ、ＴＲＥＸ１、ＴＲＥＸ２ ＲＮａｓｅ Ｔ、Ｐｏｌ ｄ、Ｐｏｌ ｅ、Ｐｏｌ ｇ、ＰＯＬ３、ＰＯＬ２、ＭＩＰ１、ＷＲＮ、ｐ５３、ＭＲＥ１１、ｈＲＡＤｌ、ＲＡＤ１、ｈＲＡＤ９、およびＲａｄ９からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
- ヌクレオチド－Ｒが、Ｎ４－修飾デオキシシチジン、Ｏ６－修飾デオキシグアノシン、Ｎｌ－修飾デオキシグアノシン、およびＮ２－修飾デオキシグアノシンからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
- ヌクレオチド－Ｒが、Ｎ４－修飾デオキシシチジン、およびＮ１－修飾デオキシチミジンからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
- ヌクレオチド－Ｒが、Ｎ４－修飾デオキシシチジン、およびＮ６－修飾デオキシアデノシンからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
- ヌクレオチド－Ｒが、Ｏ６－修飾デオキシグアノシン、Ｎｌ－修飾デオキシグアノシン、Ｎ２－修飾デオキシグアノシン、Ｎ６－修飾デオキシアデノシン、およびＮ１－修飾デオキシチミジンからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
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|---|---|---|---|
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