KR20220025903A - 바코딩된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 시약을 이용한 단백질 발현의 측정 - Google Patents

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Abstract

본 명세서에 개시된 일부 구현예는 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약을 각각 포함하는 복수의 조성물들을 제공한다. 올리고뉴클레오티드는 그에 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약에 대한 고유 식별자를 포함하고, 단백질 결합 시약은 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 샘플에서 복수의 단백질 표적들의 정량 분석 및 샘플에서 단백질 및 핵산 표적의 동시 정량 분석을 위한 방법 및 키트가 개시된다. 또한, 본 명세서에는 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약을 포함하는 표지된 생체분자제를 포함하는, 표지된 생체분자 시약을 제조하기 위한 시스템 및 방법이 개시된다.

Description

바코딩된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 시약을 이용한 단백질 발현의 측정{MEASUREMENT OF PROTEIN EXPRESSION USING REAGENTS WITH BARCODED OLIGONUCLEOTIDE SEQUENCES}
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)에 의거하여, 미국 가출원 62/399,795호(2016년 9월 26일); 미국 가출원 62/464279호(2017년 2월 27일); 및 미국 가출원 62/515,952호(2017년 6월 6일)에 대한 우선권을 주장한다. 이들 관련 출원의 각각의 내용은 그 전체가 참고문헌으로 본 명세서에 명시적으로 포함된다.
서열 목록의 참조
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 2017년 9월 24일 생성된 2,988 바이트 크기의, Sequence_Listing_BDCRI_025A.txt라는 제목의 파일로서 제공된다. 서열 목록의 전자 형식에서의 정보는 그 전체가 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다.
기술분야
본 개시 내용은 대체로 분자 생물학, 더욱 구체적으로 단백질 발현 및 유전자 발현의 동시 측정에 관한 것이다.
현재 기술은, 세포 특이적 올리고뉴클레오티드 바코드를 개별 세포로부터 폴리(A) mRNA 분자에 부착시킴으로써, 각각의 세포가 피코리터 마이크로웰 내에서 바코딩된 시약 비드와 공동-국재화됨(co-localized)에 따라, 초병렬(massively parallel) 방식(예를 들어, 10,000 개 초과의 세포)으로 단일 세포의 유전자 발현의 측정을 가능하게 한다. 다른 이용가능한 기술은 한번에 96 개 내지 384 개의 단일 세포의 유전자 발현의 측정을 가능하게 한다. 색인화된 분류(sorting)는 먼저 형광 항체로 세포를 표지하고, 유동 분류기, 예를 들어, BD FACSseq 기계에 의해 분류함으로써 달성될 수 있다. FACSseq는 하나의 파라미터 분류를 가능하게 하는 적정 가격의 유동 분류기이다. 다수의 단백질의 발현을 시험하고자 하는 연구자들의 경우, 더욱 복잡한 다중-색상 유동 분류기를 필요로 할 것이다.
단백질 발현을 정량적으로 분석할 수 있는 방법 및 시스템뿐만 아니라, 세포에서 단백질 발현 및 유전자 발현의 동시 측정을 가능하게 하는 방법 및 시스템에 대한 요구가 존재한다.
본 명세서에 개시된 일부 구현예는 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약을 각각 포함하는 복수의 조성물들을 제공하고, 올리고뉴클레오티드는 그와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약에 대한 고유 식별자를 포함하고, 단백질 결합 시약은 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 1,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 복수의 항체들, 복수의 압타머들, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, 링커는 화학 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학 기는 단백질 결합 시약에 가역적으로 부착된다. 일부 구현예에서, 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 샘플의 유전체 서열에 대해 상동성이 아니다. 일부 구현예에서, 샘플은 단일 세포, 복수의 세포들, 조직, 종양 샘플, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 샘플은 포유동물 샘플, 세균 샘플, 바이러스 샘플, 효모 샘플, 균류 샘플, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 폴리(A) 테일, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 100 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 100 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 1,000 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 10,000 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 단백질 결합 시약은 적어도 10 개의 상이한 바코드 서열의 세트로부터 선택된 적어도 하나의 바코드 서열을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, 각각의 단백질 결합 시약은 적어도 100 개의 상이한 바코드 서열의 세트로부터 선택된 적어도 하나의 바코드 서열을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, 각각의 단백질 결합 시약은 적어도 1,000 개의 상이한 바코드 서열의 세트로부터 선택된 적어도 하나의 바코드 서열을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된다. 복수의 조성물들은 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트되지 않은 제2 단백질 결합 시약을 추가로 포함할 수 있다. 단백질 결합 시약과 제2 단백질 결합 시약은 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 복수의 단백질 표적들에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 10 내지 400 개의 상이한 단백질 표적을 포함한다.
본 명세서에 개시된 일부 구현예는: 복수의 단백질 표적들을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약을 각각 포함하는 복수의 조성물들을 제공하는 단계로서, 올리고뉴클레오티드는 그와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약에 대한 고유 식별자를 포함하고, 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 단계; 복수의 단백질 표적들과 특이적으로 결합시키기 위해 복수의 조성물들을 샘플과 접촉시키는 단계; 미결합된 조성물을 제거하는 단계; 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들을 제공하는 단계로서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들의 각각은 표적 결합 영역 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함하고, 바코드 서열은 고유 바코드 서열의 다양한 세트로부터의 것인 단계; 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들을 복수의 조성물들의 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계; 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 연장하여 복수의 표지된(labeled) 핵산들을 생성하는 단계로서, 각각의 표지된 핵산은 고유 식별자 및 바코드 서열을 포함하는 단계; 및 각각의 고유 식별자에 대한 고유 바코드 서열의 수를 결정하는 단계를 포함하는 샘플 중에서 복수의 단백질 표적들의 정량 분석 방법을 제공하며, 이에 의해 샘플 중 각각의 단백질 표적의 양이 결정된다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 1,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 복수의 항체들, 복수의 압타머들, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, 링커는 화학 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학 기는 단백질 결합 시약에 가역적으로 부착된다. 일부 구현예에서, 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 샘플은 단일 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 단일 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 구현예에서, 미결합된 조성물을 제거하는 단계는 단일 세포를 세척 버퍼로 세척하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 단일 세포를 용해하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 단백질 결합 시약으로부터 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 UV 광분할, 화학 처리(디티오트레이톨), 가열, 효소 처리, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 단백질 결합 시약으로부터 분리된다. 일부 구현예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브는 세포 표지, 범용 프라이머를 위한 결합 부위, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 결합 영역은 폴리(dT)를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들은 고체 지지체 상에 고정된다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 비드이다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 표지된 핵산들을 증폭시켜 복수의 암프리콘들을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 증폭 단계는 바코드 서열의 적어도 일부, 및 고유 식별자의 적어도 일부의 PCR 증폭을 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 바코드 서열의 다양한 세트는 적어도 100 개의 고유 바코드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 바코드 서열의 다양한 세트는 적어도 1,000 개의 고유 바코드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 바코드 서열의 다양한 세트는 적어도 10,000 개의 고유 바코드 서열을 포함한다. 복수의 조성물들은 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트되지 않은 제2 단백질 결합 시약을 추가로 포함할 수 있다. 단백질 결합 시약과 제2 단백질 결합 시약은 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 암프리콘들을 서열화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 서열화는 바코드 서열의 적어도 일부, 및 고유 식별자의 적어도 일부를 서열화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 일부 구현예는: 복수의 단백질 표적들 및 복수의 핵산 표적 분자들을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약을 각각 포함하는 복수의 조성물들을 제공하는 단계로서, 올리고뉴클레오티드는 그와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약에 대한 고유 식별자를 포함하고, 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 단계; 복수의 단백질 표적들과 특이적으로 결합시키기 위해 복수의 조성물들을 샘플과 접촉시키는 단계; 미결합된 조성물을 제거하는 단계; 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들을 제공하는 단계로서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들의 각각은 표적 결합 영역 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함하고, 바코드 서열은 고유 바코드 서열의 다양한 세트로부터의 것인 단계; 혼성화를 위해, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들을 조성물 중의 올리고뉴클레오티드 및 복수의 핵산 표적 분자들과 접촉시키는 단계; 올리고뉴클레오티드 및 핵산 표적 분자에 혼성화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 연장하여 복수의 표지된 핵산들을 생성하는 단계로서, 각각의 표지된 핵산은 고유 식별자 또는 핵산 표적 분자, 및 바코드 서열을 포함하는 단계; 및 각각의 고유 식별자 및 각각의 핵산 표적 분자에 대한 고유 바코드 서열의 수를 결정하는 단계를 포함하는 샘플 중 복수의 단백질 표적들 및 복수의 핵산 표적 분자들의 동시 정량 분석 방법을 제공하며, 이에 의해 샘플 중 각각의 단백질 표적 및 각각의 핵산 표적 분자의 양이 결정된다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 1,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 복수의 항체들, 복수의 압타머들, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, 링커는 화학 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학 기는 단백질 결합 시약에 가역적으로 부착된다. 일부 구현예에서, 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 샘플은 단일 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 단일 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 구현예에서, 미결합된 조성물을 제거하는 단계는 단일 세포를 세척 버퍼로 세척하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 단일 세포를 용해하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 올리고뉴클레오티드를 단백질 결합 시약으로부터 분리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 UV 광분할, 화학 처리(디티오트레이톨), 가열, 효소 처리, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 단백질 결합 시약으로부터 분리된다. 일부 구현예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브는 세포 표지, 범용 프라이머를 위한 결합 부위, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 결합 영역은 폴리(dT)를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들은 고체 지지체 상에서 고정된다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 비드이다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 표지된 핵산들을 증폭시켜 복수의 암프리콘들을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 증폭은 바코드 서열의 적어도 일부, 고유 식별자의 적어도 일부, 및 핵산 표적 분자의 적어도 일부의 PCR 증폭을 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 바코드 서열의 다양한 세트는 적어도 100 개의 고유 바코드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 바코드 서열의 다양한 세트는 적어도 1,000 개의 고유 바코드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 바코드 서열의 다양한 세트는 적어도 10,000 개의 고유 바코드 서열을 포함한다. 복수의 조성물들은 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트되지 않은 제2 단백질 결합 시약을 추가로 포함할 수 있다. 단백질 결합 시약과 제2 단백질 결합 시약은 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 암프리콘들을 서열화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 서열화는 바코드 서열의 적어도 일부, 고유 식별자의 적어도 일부, 및 핵산 표적 분자의 적어도 일부를 서열화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 일부 구현예는 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약, 및 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들을 각각 포함하는 복수의 조성물들을 포함하는 샘플 중 복수의 단백질 표적들 및 복수의 핵산 표적 분자들의 동시 정량 분석을 위한 키트를 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 그와 함께 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약에 대한 고유 식별자를 포함하고, 단백질 결합 시약은 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들의 각각은 표적 결합 영역 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함하고, 바코드 서열은 고유 바코드 서열의 다양한 세트로부터의 것이다. 본 명세서의 개시는 올리고뉴클레오티드와 각각 컨쥬게이트된 둘 이상의 단백질 결합 시약, 및 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들을 각각 포함하는 복수의 조성물들을 포함하는 샘플 중 복수의 단백질 표적들 및 복수의 핵산 표적 분자들의 동시 정량 분석을 위한 키트를 포함하며, 올리고뉴클레오티드는 그와 함께 컨쥬게이트된 둘 이상의 단백질 결합 시약 중 하나에 대한 고유 식별자를 포함하고, 단백질 결합 시약은 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들의 각각은 표적 결합 영역 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함하고, 바코드 서열은 고유 바코드 서열의 다양한 세트로부터의 것이다. 본 명세서의 개시는 올리고뉴클레오티드와 각각 컨쥬게이트된 둘 이상의 단백질 결합 시약, 및 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들을 각각 포함하는 복수의 조성물들을 포함하는 샘플 중 복수의 단백질 표적들 및 복수의 핵산 표적 분자들의 동시 정량 분석을 위한 키트를 포함하며, 올리고뉴클레오티드는 그와 함께 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약에 대한 고유 식별자를 포함하고, 단백질 결합 시약은 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들의 각각은 표적 결합 영역 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함하고, 바코드 서열은 고유 바코드 서열의 다양한 세트로부터의 것이다.
일부 구현예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브는 세포 표지, 범용 프라이머를 위한 결합 부위, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 결합 영역은 폴리(dT)를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들은 고체 지지체 상에 고정된다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 비드이다. 일부 구현예에서, 고유 바코드 서열의 다양한 세트는 적어도 100 개의 고유 바코드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 바코드 서열의 다양한 세트는 적어도 1,000 개의 고유 바코드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 바코드 서열의 다양한 세트는 적어도 10,000 개의 고유 바코드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 적어도 1,000 개의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 적어도 10,000 개의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 적어도 100,000 개의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 적어도 1,000,000 개의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 1,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 복수의 조성물들은 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트되지 않은 제2 단백질 결합 시약을 추가로 포함할 수 있다. 단백질 결합 시약과 제2 단백질 결합 시약은 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 복수의 항체들, 복수의 압타머들, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, 링커는 화학 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학 기는 단백질 결합 시약에 가역적으로 부착된다. 일부 구현예에서, 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 샘플의 유전체 서열과 상동성이 아니다. 일부 구현예에서, 샘플은 단일 세포, 복수의 세포들, 조직, 종양 샘플, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 샘플은 포유동물 샘플, 세균 샘플, 바이러스 샘플, 효모 샘플, 균류 샘플, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 폴리(A) 테일, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 100 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 100 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 1,000 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 10,000 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 10,000 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 단백질 결합 시약은 적어도 10 개의 상이한 바코드 서열의 세트로부터 선택된 적어도 하나의 바코드 서열을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, 각각의 단백질 결합 시약은 적어도 100 개의 상이한 바코드 서열의 세트로부터 선택된 적어도 하나의 바코드 서열을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, 각각의 단백질 결합 시약은 적어도 1,000 개의 상이한 바코드 서열의 세트로부터 선택된 적어도 하나의 바코드 서열을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 복수의 단백질 표적들에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 10 내지 400 개의 상이한 단백질 표적을 포함한다.
본 명세서에 개시된 일부 구현예는: 복수의 단백질 표적들 및 복수의 핵산 표적 분자들을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약을 각각 포함하는 복수의 조성물들을 제공하는 단계로서, 올리고뉴클레오티드는 그와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약에 대한 고유 식별자를 포함하고, 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 단계; 복수의 단백질 표적들과 특이적으로 결합시키기 위해 복수의 조성물들을 샘플과 접촉시키는 단계; 미결합된 조성물을 제거하는 단계; 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들을 제공하는 단계로서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들의 각각은 표적 결합 영역 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함하고, 바코드 서열은 고유 바코드 서열의 다양한 세트로부터의 것인 단계; 혼성화를 위해 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들을 조성물의 올리고뉴클레오티드 및 복수의 핵산 표적 분자들과 접촉시키는 단계; 올리고뉴클레오티드 및 핵산 표적 분자에 혼성화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 연장하여 복수의 표지된 핵산들을 생성하는 단계로서, 각각의 표지된 핵산은 고유 식별자 또는 핵산 표적 분자, 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함하는 단계; 각각의 고유 식별자 및 각각의 핵산 표적 분자에 대한 고유 바코드 서열의 수를 결정하는 단계; 및 단백질 표적의 양 또는 핵산 표적 분자의 양을 이용하여 바이오마커(biomarker)를 식별하는 단계를 포함하는 샘플 중에서 바이오마커를 식별하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 단백질 표적 및 적어도 하나의 핵산 표적 분자의 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 단백질 표적 및 그의 상응하는 핵산 표적 분자의 양을 비교하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 단백질 표적의 양이 그의 상응하는 핵산 표적 분자의 양을 초과하는 경우 바이오마커를 식별하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 단백질 표적의 양이 그의 상응하는 핵산 표적 분자의 적어도 10X인 경우 바이오마커를 식별하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 단백질 표적의 상응하는 핵산 표적 분자의 양이 10 미만인 경우 바이오마커를 식별하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 단백질 표적의 상응하는 핵산 표적 분자의 양이 0인 경우 바이오마커를 식별하는 단계를 포함한다.
본 명세서의 개시는 제어 입자 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 제어 입자 조성물은 제어 입자와 연결된 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 포함하고, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 각각은 제어 바코드 서열 및 폴리(dA) 영역을 포함한다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 2 개는 상이한 제어 바코드 서열을 포함할 수 있다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함할 수 있다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 범용 프라이머를 위한 결합 부위를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 바코드 서열은 적어도 6 개의 뉴클레오티드 길이, 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이, 약 128 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 128 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 조합이다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 약 50 개의 뉴클레오티드 길이, 약 100 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 200 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 300 개 미만의 뉴클레오티드 길이, 약 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 조합일 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 5, 10, 100, 1000 개, 또는 그 이상의 제어 바코드 서열은 동일할 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 약 10, 100, 1000 개, 또는 그 이상의 제어 바코드 서열은 동일할 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 3, 5, 10, 100 개, 또는 그 이상은 상이한 제어 바코드 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제1 제어 바코드 서열을 각각 포함하는 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들, 및 제2 제어 바코드 서열을 각각 포함하는 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 포함하고, 제1 제어 바코드 서열과 제2 제어 바코드 서열은 상이한 서열을 갖는다. 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수와 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수는 대략 동일할 수 있다. 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수와 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수는 상이할 수 있다. 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수는 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수의 적어도 2 배, 10 배, 100 배, 또는 그 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 바코드 서열은 종의 유전체 서열에 대해 상동성이 아니다. 제어 바코드 서열은 종의 유전체 서열에 대해 상동성일 수 있다. 종은 비-포유동물 종일 수 있다. 비-포유동물 종은 파지 종일 수 있다. 파지 종은 T7 파지, PhiX 파지, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나는 링커를 통해 제어 입자와 연결된다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 이황화 결합, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 입자의 직경은 약 1 내지 1000 마이크로미터, 약 10 내지 100 마이크로미터, 7.5 마이크로미터, 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제어 입자 상에 고정된다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제어 입자 상에 부분적으로 고정될 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제어 입자 내에 봉입될 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제어 입자 내에 부분적으로 봉입될 수 있다. 제어 입자는 붕괴될 수 있다. 제어 입자는 비드일 수 있다. 비드는 세파로스(Sepharose) 비드, 스트렙트아비딘 비드, 아가로스 비드, 자석 비드, 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 올리고(dT) 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 제어 입자는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스티렌, 유리, 폴리프로필렌, 아가로스, 젤라틴, 하이드로겔, 상자성체, 세라믹, 플라스틱, 유리, 메틸스티렌, 아크릴성 중합체, 티타늄, 라텍스, 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 실리콘, 또는 이들의 임의의 조합의 재료를 포함할 수 있다. 제어 입자는 붕괴될 수 있는 하이드로겔 입자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 입자는 검출가능한 모이어티(moiety)와 연결된다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티와 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 입자는 복수의 제1 단백질 결합 시약들과 연결되고, 복수의 제1 단백질 결합 시약들 중 적어도 하나는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 하나와 연결된다. 제1 단백질 결합 시약은 제1 항체를 포함할 수 있다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 제1 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트될 수 있다. 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 제1 단백질 결합 시약에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 이황화 결합, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 시약은 동일한 제어 바코드 서열을 갖는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 둘 이상과 연결된다. 제1 단백질 결합 시약은 상이한 제어 바코드 서열을 갖는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 둘 이상과 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 제1 단백질 결합 시약들 중 적어도 하나는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 어느 것과도 연결되지 않는다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드와 연결된 제1 단백질 결합 시약 및 임의의 제어 입자 올리고뉴클레오티드와 연결되지 않은 제1 단백질 결합 시약은 동일한 단백질 결합 시약일 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 입자는 복수의 제2 단백질 결합 시약들과 연결된다. 복수의 제2 단백질 결합 시약들 중 적어도 하나는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 하나와 연결될 수 있다. 제1 단백질 결합 시약과 연결된 제어 입자 올리고뉴클레오티드와 제2 단백질 결합 시약과 연결된 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 상이한 제어 바코드 서열을 포함할 수 있다. 제1 단백질 결합 시약과 제2 단백질 결합 시약은 동일한 단백질 결합 시약일 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 시약은 파트너 결합 시약과 연결될 수 있고, 제1 단백질 결합 시약은 파트너 결합 시약을 이용하여 제어 입자와 연결된다. 파트너 결합 시약은 파트너 항체를 포함할 수 있다. 파트너 항체는 항-고양이 항체, 항-닭 항체, 항-소 항체, 항-개 항체, 항-당나귀 항체, 항-염소 항체, 항-기니피그 항체, 항-햄스터 항체, 항-말 항체, 항-인간 항체, 항-라마 항체, 항-원숭이 항체, 항-마우스 항체, 항-돼지 항체, 항-토끼 항체, 항-래트 항체, 항-양 항체, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 파트너 항체는 면역글로불린 G(IgG), F(ab') 단편, F(ab')2 단편, 이들의 조합, 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 시약은 검출가능한 모이어티와 연결될 수 있다. 제2 단백질 결합 시약은 검출가능한 모이어티와 연결될 수 있다.
표적의 수를 결정하기 위한 방법이 본 명세서에 개시된다. 일부 구현예에서, 방법은: 복수의 바코드들(예를 들어, 추계적 바코드)을 이용하여, 복수의 세포들 중 하나의 세포의 복수의 표적들 및 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 바코딩(예를 들어, 추계적 바코딩)하여, 복수의 바코딩된 표적들(예를 들어, 추계적으로 바코딩된 표적) 및 복수의 바코딩된 제어 입자 올리고뉴클레오티드들(예를 들어, 추계적으로 바코딩된 제어 입자 올리고뉴클레오티드들)을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 추계적 바코드들의 각각은: 세포 표지 서열, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열) 및 표적-결합 영역 중 하나 이상을 포함한다. 복수의 바코드들 중 적어도 둘 이상의 바코드의 바코드 서열은 상이한 서열을 포함할 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제어 입자 조성물은 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들과 연결된 제어 입자를 포함하고, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 각각은 제어 바코드 서열, 및 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 표적-결합 영역에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 의사-표적(pseudo-target) 영역을 포함한다. 방법은: 복수의 바코딩된 표적들 및 복수의 바코딩된 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계; 서열화 데이터 중, 제어 바코드 서열을 갖는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 계수하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은: 복수의 표적들 중 적어도 하나의 표적에 대하여: 서열화 데이터 중, 표적과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 계수하는 단계; 및 표적의 수를 예측하는 단계로서, 예측되는 표적의 수는 계수된 표적과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수와 상관되는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 의사-표적 영역은 폴리(dA) 영역을 포함한다. 의사-표적 영역은 표적의 하위서열(subsequence)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제어 바코드 서열은 적어도 6 개의 뉴클레오티드 길이, 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이, 약 128 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 128 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 조합일 수 있다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 약 50 개의 뉴클레오티드 길이, 약 100 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 200 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 300 개 미만의 뉴클레오티드 길이, 약 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 5, 10, 100, 1000 개, 또는 그 이상의 제어 바코드 서열은 동일할 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 3, 5, 10, 100 개, 또는 그 이상은 상이한 제어 바코드 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제1 제어 바코드 서열을 각각 포함하는 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들, 및 제2 제어 바코드 서열을 각각 포함하는 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 포함한다. 제1 제어 바코드 서열과 제2 제어 바코드 서열은 상이한 서열을 가질 수 있다. 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수와 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수는 대략 동일할 수 있다. 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수와 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수는 상이할 수 있다. 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수는 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수의 적어도 2 배, 10 배, 100 배, 또는 그 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 서열화 데이터 중, 제어 바코드 서열을 갖는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 계수하는 단계는: 서열화 데이터 중, 제1 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 계수하는 단계; 및 서열화 데이터 중, 제2 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 계수하는 단계를 포함한다. 예측되는 표적의 수는 계수된 표적과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수, 제1 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수, 및 제2 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수와 상관될 수 있다. 예측되는 표적의 수는 계수된 표적과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수, 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수, 및 제어 바코드 서열을 포함하는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수와 상관될 수 있다. 예측되는 표적의 수는 계수된 표적과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수, 및 제어 바코드 서열을 포함하는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수와 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수의 비와 상관될 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 세포의 유전체 서열에 대해 상동성이 아니다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 종의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 종의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 종은 비-포유동물 종일 수 있다. 비-포유동물 종은 파지 종일 수 있다. 파지 종은 T7 파지, PhiX 파지, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 제어 입자에 컨쥬게이트될 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나는 링커를 통해 제어 입자와 연결될 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나는 링커를 포함할 수 있다. 화학 기는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 이황화 결합, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 입자의 직경은 약 1 내지 1000 마이크로미터, 약 10 내지 100 마이크로미터, 약 7.5 마이크로미터, 또는 이들의 조합이다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제어 입자 상에 고정된다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제어 입자 상에 부분적으로 고정될 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 제어 입자 내에 봉입될 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제어 입자 내에 부분적으로 봉입될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 복수의 표적들과 제어 입자 및 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 바코딩하기 전에, 제어 입자로부터 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나를 방출하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 제어 입자는 붕괴될 수 있다. 제어 입자는 제어 입자 비드일 수 있다. 제어 입자 비드는 세파로스 비드, 스트렙트아비딘 비드, 아가로스 비드, 자석 비드, 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 올리고(dT) 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 제어 입자는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스티렌, 유리, 폴리프로필렌, 아가로스, 젤라틴, 하이드로겔, 상자성체, 세라믹, 플라스틱, 유리, 메틸스티렌, 아크릴성 중합체, 티타늄, 라텍스, 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 실리콘, 또는 이들의 임의의 조합의 재료를 포함할 수 있다. 제어 입자는 붕괴될 수 있는 하이드로겔 입자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 입자는 검출 가능한 모이어티와 연결된다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티와 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 입자는 복수의 제1 단백질 결합 시약들과 연결될 수 있고, 복수의 제1 단백질 결합 시약들 중 적어도 하나는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 하나와 연결될 수 있다. 제1 단백질 결합 시약은 제1 항체를 포함할 수 있다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 제1 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트될 수 있다. 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 제1 단백질 결합 시약에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 이황화 결합, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 시약은 동일한 제어 바코드 서열을 갖는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 둘 이상과 연결될 수 있다. 제1 단백질 결합 시약은 상이한 제어 바코드 서열을 갖는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 둘 이상과 연결될 수 있다. 복수의 제1 단백질 결합 시약들 중 적어도 하나는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 어느 것과도 연결될 수 없다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드와 연결된 제1 단백질 결합 시약과 임의의 제어 입자 올리고뉴클레오티드와 연결되지 않은 제1 단백질 결합 시약은 동일한 단백질 결합 시약일 수 있다. 제어 입자는 복수의 제2 단백질 결합 시약들과 연결될 수 있다. 복수의 제2 단백질 결합 시약들 중 적어도 하나는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 하나와 연결될 수 있다. 제1 단백질 결합 시약과 연결된 제어 입자 올리고뉴클레오티드와 제2 단백질 결합 시약과 연결된 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 상이한 제어 바코드 서열을 포함할 수 있다. 제1 단백질 결합 시약과 제2 단백질 결합 시약은 동일한 단백질 결합 시약일 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 시약은 파트너 결합 시약과 연결되고, 제1 단백질 결합 시약은 파트너 결합 시약을 이용하여 제어 입자와 연결된다. 파트너 결합 시약은 파트너 항체를 포함할 수 있다. 파트너 항체는 항-고양이 항체, 항-닭 항체, 항-소 항체, 항-개 항체, 항-당나귀 항체, 항-염소 항체, 항-기니피그 항체, 항-햄스터 항체, 항-말 항체, 항-인간 항체, 항-라마 항체, 항-원숭이 항체, 항-마우스 항체, 항-돼지 항체, 항-토끼 항체, 항-래트 항체, 항-양 항체, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 파트너 항체는 면역글로불린 G(IgG), F(ab') 단편, F(ab')2 단편, 이들의 조합, 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 시약은 검출가능한 모이어티와 연결될 수 있다. 제2 단백질 결합 시약은 검출가능한 모이어티와 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 바코드는 범용 프라이머를 위한 결합 부위를 포함한다. 표적-결합 영역은 폴리(dT) 영역을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들은 바코딩 입자와 연결된다. 예를 들어, 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 상에 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 상에 부분적으로 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 내에 봉입될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 내에 부분적으로 봉입될 수 있다.
일부 구현예에서, 바코딩 입자는 붕괴될 수 있다. 바코딩 입자는 바코딩 비드일 수 있다. 바코딩 비드는 세파로스 비드, 스트렙트아비딘 비드, 아가로스 비드, 자석 비드, 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 올리고(dT) 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 바코딩 입자는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스티렌, 유리, 폴리프로필렌, 아가로스, 젤라틴, 하이드로겔, 상자성체, 세라믹, 플라스틱, 유리, 메틸스티렌, 아크릴성 중합체, 티타늄, 라텍스, 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 실리콘, 또는 이들의 임의의 조합의 재료를 포함할 수 있다. 바코딩 입자는 붕괴될 수 있는 하이드로겔 입자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 바코딩 입자의 바코드는 적어도 1000, 10000 개, 또는 그 이상의 상이한 바코드 서열로부터 선택된 바코드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 바코드의 바코드 서열은 랜덤 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 바코딩 입자는 적어도 10000 개의 바코드를 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들을 이용하여 복수의 표적들 및 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 바코딩하는 단계는: 복수의 바코드들을 복수의 표적들 중 표적 및 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 제어 입자 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜 표적 및 제어 입자 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 생성하는 단계; 및 표적 및 제어 입자 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 표적들 및 복수의 바코딩된 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함한다. 바코드를 연장하는 단계는 DNA 중합효소, 역전사효소, 또는 이들의 조합을 이용하여 바코드를 연장하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 복수의 바코딩된 표적들 및 복수의 바코딩된 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 증폭시켜 복수의 암프리콘들을 생성하는 단계를 포함한다. 복수의 바코딩된 표적들 및 복수의 바코딩된 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 증폭시키는 단계는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여, 바코드 서열의 적어도 일부 및 제어 입자 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부 또는 바코드 서열의 적어도 일부 및 제어 입자 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 서열화 데이터를 수득하는 단계는 복수의 암프리콘들의 서열화 데이터를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 서열화 데이터를 수득하는 단계는 바코드 서열의 적어도 일부 및 제어 입자 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부, 또는 바코드 서열의 적어도 일부 및 제어 입자 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 서열화하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에는 키트가 개시된다. 일부 구현예에서, 키트는: 제어 입자와 연결된 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 포함하는 제어 입자 조성물을 포함하며, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 각각은 제어 바코드 서열 및 폴리(dA) 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 2 개는 상이한 제어 바코드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제어 바코드 서열은 적어도 6 개의 뉴클레오티드 길이, 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이, 약 128 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 128 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 조합일 수 있다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 약 50 개의 뉴클레오티드 길이, 약 100 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 200 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 300 개 미만의 뉴클레오티드 길이, 약 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 5, 10, 100, 1000 개, 또는 그 이상의 제어 바코드 서열은 동일할 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 3, 5, 10, 100 개, 또는 그 이상은 상이한 제어 바코드 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제1 제어 바코드 서열을 각각 포함하는 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들, 및 제2 제어 바코드 서열을 각각 포함하는 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 포함한다. 제1 제어 바코드 서열과 제2 제어 바코드 서열은 상이한 서열을 가질 수 있다. 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수와 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수는 대략 동일할 수 있다. 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수와 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수는 상이할 수 있다. 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수는 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수의 적어도 2 배, 10 배, 100 배, 또는 그 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 세포의 유전체 서열에 대해 상동성이 아니다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 종의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 종의 유전체 서열에 대해 상동성일 수 있다. 종은 비-포유동물 종일 수 있다. 비-포유동물 종은 파지 종일 수 있다. 파지 종은 T7 파지, PhiX 파지, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 제어 입자에 컨쥬게이트될 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나는 링커를 통해 제어 입자에 연결될 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나는 링커를 포함할 수 있다. 화학 기는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 이황화 결합, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 입자의 직경은 약 1 내지 1000 마이크로미터, 약 10 내지 100 마이크로미터, 약 7.5 마이크로미터, 또는 이들의 조합이다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제어 입자 상에 고정된다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제어 입자 상에 부분적으로 고정될 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제어 입자 내에 봉입될 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제어 입자 내에 부분적으로 봉입될 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 입자는 붕괴될 수 있다. 제어 입자는 제어 입자 비드일 수 있다. 제어 입자 비드는 세파로스 비드, 스트렙트아비딘 비드, 아가로스 비드, 자석 비드, 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 올리고(dT) 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 제어 입자는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스티렌, 유리, 폴리프로필렌, 아가로스, 젤라틴, 하이드로겔, 상자성체, 세라믹, 플라스틱, 유리, 메틸스티렌, 아크릴성 중합체, 티타늄, 라텍스, 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 실리콘, 또는 이들의 임의의 조합의 재료를 포함할 수 있다. 제어 입자는 붕괴될 수 있는 하이드로겔 입자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 입자는 검출가능한 모이어티와 연결된다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티와 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 입자는 복수의 제1 단백질 결합 시약들과 연결될 수 있고, 복수의 제1 단백질 결합 시약들 중 적어도 하나는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 하나와 연결될 수 있다. 제1 단백질 결합 시약은 제1 항체를 포함할 수 있다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 제1 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트될 수 있다. 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 제1 단백질 결합 시약에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 이황화 결합, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 시약은 동일한 제어 바코드 서열을 갖는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 둘 이상과 연결될 수 있다. 제1 단백질 결합 시약은 상이한 제어 바코드 서열을 갖는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 둘 이상과 연결될 수 있다. 복수의 제1 단백질 결합 시약들 중 적어도 하나는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 어느 것과도 연결되지 않을 수 있다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드와 연결된 제1 단백질 결합 시약 및 임의의 제어 입자 올리고뉴클레오티드와 연결되지 않은 제1 단백질 결합 시약은 동일한 단백질 결합 시약일 수 있다. 제어 입자는 복수의 제2 단백질 결합 시약들과 연결될 수 있다. 복수의 제2 단백질 결합 시약들 중 적어도 하나는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 하나와 연결될 수 있다. 제1 단백질 결합 시약과 연결된 제어 입자 올리고뉴클레오티드와 제2 단백질 결합 시약과 연결된 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 상이한 제어 바코드 서열을 포함할 수 있다. 제1 단백질 결합 시약과 제2 단백질 결합 시약은 동일한 단백질 결합 시약일 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 시약은 파트너 결합 시약과 연결되며, 제1 단백질 결합 시약은 파트너 결합 시약을 이용하여 제어 입자와 연결된다. 파트너 결합 시약은 파트너 항체를 포함할 수 있다. 파트너 항체는 항-고양이 항체, 항-닭 항체, 항-소 항체, 항-개 항체, 항-당나귀 항체, 항-염소 항체, 항-기니피그 항체, 항-햄스터 항체, 항-말 항체, 항-인간 항체, 항-라마 항체, 항-원숭이 항체, 항-마우스 항체, 항-돼지 항체, 항-토끼 항체, 항-래트 항체, 항-양 항체, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 파트너 항체는 면역글로불린 G(IgG), F(ab') 단편, F(ab')2 단편, 이들의 조합, 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 시약은 검출가능한 모이어티와 연결될 수 있다. 제2 단백질 결합 시약은 검출가능한 모이어티와 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 복수의 바코드들을 포함한다. 복수의 바코드들 중 하나의 바코드는 표적-결합 영역 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함할 수 있고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드의 바코드 서열은 상이한 분자 표지 서열을 포함할 수 있다. 바코드는 세포 표지 서열, 범용 프라이머를 위한 결합 부위, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 표적-결합 영역은 폴리(dT) 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들은 바코딩 입자와 연결될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 상에 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 상에 부분적으로 고정된다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 내에 봉입될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 내에 부분적으로 봉입될 수 있다. 바코딩 입자는 붕괴될 수 있다. 바코딩 입자는 제2 비드일 수 있다. 비드는 세파로스 비드, 스트렙트아비딘 비드, 아가로스 비드, 자석 비드, 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 올리고(dT) 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 바코딩 입자는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스티렌, 유리, 폴리프로필렌, 아가로스, 젤라틴, 하이드로겔, 상자성체, 세라믹, 플라스틱, 유리, 메틸스티렌, 아크릴성 중합체, 티타늄, 라텍스, 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 실리콘, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 재료를 포함할 수 있다. 바코딩 입자는 붕괴될 수 있는 하이드로겔 입자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 바코딩 입자의 바코드는 적어도 1000, 10000 개, 또는 그 이상의 상이한 바코드 서열로부터 선택된 바코드 서열을 포함한다. 바코드의 바코드 서열은 랜덤 서열을 포함할 수 있다. 바코딩 입자는 적어도 10000 개의 바코드를 포함할 수 있다. 키트는 DNA 중합효소를 포함할 수 있다. 키트는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 위한 시약을 포함할 수 있다.
서열화 제어에 사용될 수 있는 방법 및 조성물이 본 명세서에 개시된다. 일부 구현예에서, 방법은: 복수의 제어 조성물들 중 하나의 제어 조성물을 복수의 세포들 중 하나 이상의 세포와 접촉시키는 단계로서, 복수의 세포들 중 하나의 세포는 복수의 표적들 및 복수의 단백질 표적들을 포함하고, 복수의 제어 조성물들의 각각은 제어 올리고뉴클레오티드와 연결된 단백질 결합 시약을 포함하고, 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있고, 제어 올리고뉴클레오티드는 제어 바코드 서열, 및 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 표적-결합 영역에 대해 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 의사-표적 영역을 포함하는 단계; 복수의 바코드들을 이용하여 제어 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 세포 표지 서열, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 및/또는 표적-결합 영역을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드의 바코드 서열은 상이한 서열을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계; 서열화 데이터 중, 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들의 적어도 하나의 특성을 이용하여 하나 이상의 세포의 적어도 하나의 특성을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 의사-표적 영역은 폴리(dA) 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 제어 바코드 서열은 적어도 6 개의 뉴클레오티드 길이, 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이, 약 128 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 128 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 조합이다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 약 50 개의 뉴클레오티드 길이, 약 100 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 200 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 300 개 미만의 뉴클레오티드 길이, 약 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 조합일 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 2, 10, 100, 1000 개, 또는 그 이상의 제어 바코드 서열은 동일할 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 2, 10, 100, 1000 개, 또는 그 이상은 상이한 제어 바코드 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 세포의 적어도 하나의 특성을 결정하는 단계는: 서열화 데이터 중, 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들과 연결된 별개의 서열을 갖는 세포 표지 서열의 수를 결정하는 단계; 및 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들과 연결된 별개의 서열을 갖는 세포 표지 서열의 수를 이용하여 하나 이상의 세포의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 방법은: 결정된 하나 이상의 세포의 수를 기준으로 단일 세포 포획 효율을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은: 결정된 하나 이상의 세포의 수와 복수의 세포들의 수의 비를 기준으로 단일 세포 포획 효율을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 서열화 데이터 중, 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들의 특성을 이용하여 하나 이상의 세포의 적어도 하나의 특성을 결정하는 단계는: 서열화 데이터 중 각각의 세포 표지에 대하여, 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 결정하는 단계; 및 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 이용하여 하나 이상의 세포의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 결정하는 단계는: 서열화 데이터 중 각각의 세포 표지에 대하여, 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 최대 수의 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 이용하여 하나 이상의 세포의 수를 결정하는 단계는: 최대 수의 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수와, 최대 수의 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수와 연관된 서열화 데이터 중 세포 표지의 수의 플롯을 생성하는 단계; 및 플롯에서의 컷오프를 하나 이상의 세포의 수로서 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 올리고뉴클레오티드는 임의의 복수의 세포들의 유전체 서열에 대해 상동성이 아니다. 제어 올리고뉴클레오티드는 종의 유전체 서열에 대해 상동성일 수 있다. 종은 비-포유동물 종일 수 있다. 비-포유동물 종은 파지 종일 수 있다. 파지 종은 T7 파지, PhiX 파지, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 제어 올리고뉴클레오티드를 바코딩하기 전에 단백질 결합 시약으로부터 제어 올리고뉴클레오티드를 방출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 제어 조성물들 중 미결합된 제어 조성물을 제거하는 단계를 포함한다. 미결합된 제어 조성물을 제거하는 단계는 복수의 세포들 중 하나 이상의 세포를 세척 버퍼로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 미결합된 세포 식별 조성물을 제거하는 단계는 유세포 분석을 이용하여 제어 조성물의 적어도 하나의 단백질 결합 시약에 결합된 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나는 세포 표면 상에 존재한다. 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나는 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 인테그린, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 단백질 결합 시약은 항체를 포함할 수 있다. 제어 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트될 수 있다. 제어 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 제1 단백질 결합 시약에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 이황화 결합, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 결합 시약은 동일한 제어 바코드 서열을 갖는 둘 이상의 제어 올리고뉴클레오티드와 연결된다. 단백질 결합 시약은 상이한 동일한 제어 바코드 서열을 갖는 둘 이상의 제어 올리고뉴클레오티드와 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 제어 조성물들 중 제2 단백질 결합 시약은 제어 올리고뉴클레오티드와 연결되지 않는다. 단백질 결합 시약과 제2 단백질 결합 시약은 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 바코드는 범용 프라이머를 위한 결합 부위를 포함한다. 표적-결합 영역은 폴리(dT) 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 바코드들은 바코딩 입자와 연결된다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 상에 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 상에 부분적으로 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 내에 봉입된다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 내에 부분적으로 봉입된다. 바코딩 입자는 붕괴될 수 있다. 바코딩 입자는 바코딩 비드일 수 있다. 바코딩 비드는 세파로스 비드, 스트렙트아비딘 비드, 아가로스 비드, 자석 비드, 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 올리고(dT) 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 바코딩 입자는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스티렌, 유리, 폴리프로필렌, 아가로스, 젤라틴, 하이드로겔, 상자성체, 세라믹, 플라스틱, 유리, 메틸스티렌, 아크릴성 중합체, 티타늄, 라텍스, 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 실리콘, 또는 이들의 임의의 조합의 재료를 포함할 수 있다. 바코딩 입자는 붕괴될 수 있는 하이드로겔 입자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 바코딩 입자는 광학 모이어티와 연결된다. 제어 올리고뉴클레오티드는 광학 모이어티와 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 바코딩 입자의 바코드는 적어도 1000, 10000 개, 또는 그 이상의 상이한 바코드 서열로부터 선택된 바코드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 바코드의 바코드 서열은 랜덤 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 바코딩 입자는 적어도 10000 개의 바코드를 포함한다.
일부 구현예에서, 제어 올리고뉴클레오티드를 바코딩하는 단계는: 복수의 바코드들을 이용하여 제어 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 바코드들을 이용하여 복수의 제어 올리고뉴클레오티드들을 바코딩하는 단계는: 복수의 바코드들을 복수의 제어 조성물들의 제어 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜 제어 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 생성하는 단계; 및 제어 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함한다. 바코드를 연장하는 단계는 DNA 중합효소, 역전사효소, 또는 이들의 조합을 이용하여 바코드를 연장하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들을 증폭시켜 복수의 암프리콘들을 생성하는 단계를 포함한다. 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들을 증폭시키는 단계는 중합효소 연쇄 반응 PCR)을 이용하여, 바코드 서열의 적어도 일부 및 제어 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열화 데이터를 수득하는 단계는 복수의 암프리콘들의 서열화 데이터를 수득하는 단계를 포함한다. 서열화 데이터를 수득하는 단계는 바코드 서열의 적어도 일부 및 제어 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 서열화하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서의 개시는 서열화 제어 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은: 복수의 세포들 중 하나 이상의 세포를 복수의 제어 조성물들 중 하나의 제어 조성물과 접촉시키는 단계로서, 복수의 세포들 중 하나의 세포는 복수의 표적들 및 복수의 결합 표적들을 포함하고, 복수의 제어 조성물들의 각각은 제어 올리고뉴클레오티드와 연결된 세포 성분 결합 시약을 포함하고, 세포 성분 결합 시약은 복수의 결합 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있고, 제어 올리고뉴클레오티드는 제어 바코드 서열, 및 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 표적-결합 영역에 대해 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 의사-표적 영역을 포함하는 단계; 복수의 바코드들을 이용하여 제어 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 세포 표지 서열, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 및/또는 표적-결합 영역을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드의 바코드 서열은 상이한 서열을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계; 서열화 데이터 중, 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나의 특성을 이용하여 하나 이상의 세포의 적어도 하나의 특성을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 의사-표적 영역은 폴리(dA) 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 제어 바코드 서열은 적어도 6 개의 뉴클레오티드 길이, 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이, 약 128 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 128 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 조합이다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 약 50 개의 뉴클레오티드 길이, 약 100 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 200 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 300 개 미만의 뉴클레오티드 길이, 약 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 조합일 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 2, 10, 100, 1000 개, 또는 그 이상의 제어 바코드 서열은 동일할 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 2, 10, 100, 1000 개, 또는 그 이상은 상이한 제어 바코드 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 세포의 적어도 하나의 특성을 결정하는 단계는: 서열화 데이터 중, 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들과 연결된 별개의 서열을 갖는 별개의 세포 표지 서열의 수를 결정하는 단계; 및 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들과 연결된 별개의 서열을 갖는 세포 표지 서열의 수를 이용하여 하나 이상의 세포의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은: 결정된 하나 이상의 세포의 수를 기준으로 단일 세포 포획 효율을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은: 결정된 하나 이상의 세포의 수와 복수의 세포들의 수의 비를 기준으로 단일 세포 포획 효율을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 세포의 적어도 하나의 특성을 결정하는 단계는: 서열화 데이터 중 각각의 세포 표지에 대하여, 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 결정하는 단계; 및 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 이용하여 하나 이상의 세포의 수를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 결정하는 단계는: 서열화 데이터 중 각각의 세포 표지에 대하여, 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 최대 수의 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 이용하여 하나 이상의 세포의 수를 결정하는 단계는: 최대 수의 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수와, 최대 수의 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수와 연관된 서열화 데이터 중 세포 표지의 수의 플롯을 생성하는 단계; 및 플롯에서의 컷오프를 하나 이상의 세포의 수로서 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 올리고뉴클레오티드는 임의의 복수의 세포들의 유전체 서열에 대해 상동성이 아니다. 제어 올리고뉴클레오티드는 종의 유전체 서열에 대해 상동성일 수 있다. 종은 비-포유동물 종일 수 있다. 비-포유동물 종은 파지 종일 수 있다. 파지 종은 T7 파지, PhiX 파지, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 제어 올리고뉴클레오티드를 바코딩하기 전에, 세포 성분 결합 시약으로부터 제어 올리고뉴클레오티드를 방출하는 단계를 포함한다. 복수의 결합 표적들 중 적어도 하나는 세포 표면 상에 발현될 수 있다. 복수의 결합 표적들 중 적어도 하나는 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 인테그린, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 세포 성분 결합 시약은 세포 표면 결합 시약, 항체, 테트라머, 압타머, 단백질 스캐폴드, 침입(invasion), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 성분 결합 시약의 결합 표적은 10 내지 100 개의 상이한 결합 표적을 포함하는 군으로부터 선택된다. 세포 성분 결합 시약의 결합 표적은 탄수화물, 지질, 단백질, 세포외 단백질, 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 인테그린, 세포내 단백질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 제어 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 세포 성분 결합 시약에 컨쥬게이트될 수 있다. 제어 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 제1 세포 성분 결합 시약에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 이황화 결합, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 성분 결합 시약은 동일한 제어 바코드 서열을 갖는 둘 이상의 제어 올리고뉴클레오티드와 연결될 수 있다. 세포 성분 결합 시약은 상이한 동일한 제어 바코드 서열을 갖는 둘 이상의 제어 올리고뉴클레오티드와 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 제어 조성물들의 제2 세포 성분 결합 시약은 제어 올리고뉴클레오티드와 연결되지 않는다. 세포 성분 결합 시약과 제2 세포 성분 결합 시약은 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 바코드는 범용 프라이머를 위한 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적-결합 영역은 폴리(dT) 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들은 바코딩 입자와 연결된다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 상에 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 상에 부분적으로 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 내에 봉입될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 내에 부분적으로 봉입될 수 있다. 바코딩 입자는 붕괴될 수 있다. 바코딩 입자는 바코딩 비드일 수 있다. 일부 구현예에서, 바코딩 비드는 세파로스 비드, 스트렙트아비딘 비드, 아가로스 비드, 자석 비드, 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 올리고(dT) 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 바코딩 입자는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스티렌, 유리, 폴리프로필렌, 아가로스, 젤라틴, 하이드로겔, 상자성체, 세라믹, 플라스틱, 유리, 메틸스티렌, 아크릴성 중합체, 티타늄, 라텍스, 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 실리콘, 또는 이들의 임의의 조합의 재료를 포함할 수 있다. 바코딩 입자는 붕괴될 수 있는 하이드로겔 입자를 포함할 수 있다. 바코딩 입자는 광학 모이어티와 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 올리고뉴클레오티드는 광학 모이어티와 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 바코딩 입자의 바코드는 적어도 1000, 10000 개, 또는 그 이상의 상이한 바코드 서열로부터 선택된 바코드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 바코드의 바코드 서열은 랜덤 서열을 포함한다. 바코딩 입자는 적어도 10000 개의 바코드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 올리고뉴클레오티드들을 바코딩하는 단계는: 복수의 바코드들을 이용하여 제어 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함한다. 복수의 바코드들을 이용하여 복수의 제어 올리고뉴클레오티드들을 바코딩하는 단계는: 복수의 바코드들을 복수의 제어 조성물들의 제어 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜 제어 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 생성하는 단계; 및 제어 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 바코드를 연장하는 단계는 DNA 중합효소, 역전사효소, 또는 이들의 조합을 이용하여 바코드를 연장하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들을 증폭시켜 복수의 암프리콘들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들을 증폭시키는 단계는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여, 바코드 서열의 적어도 일부 및 제어 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 서열화 데이터를 수득하는 단계는 복수의 암프리콘들의 서열화 데이터를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 서열화 데이터를 수득하는 단계는, 바코드 서열의 적어도 일부 및 제어 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 서열화하는 단계를 포함할 수 있다.
서열화 제어 방법이 본 명세서에 개시된다. 일부 구현예에서, 방법은: 복수의 세포들 중 하나 이상의 세포를 복수의 제어 조성물들 중 하나의 제어 조성물과 접촉시키는 단계로서, 복수의 세포들 중 하나의 세포는 복수의 표적들 및 복수의 단백질 표적들을 포함하고, 복수의 제어 조성물들의 각각은 제어 올리고뉴클레오티드와 연결된 단백질 결합 시약을 포함하고, 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있고, 제어 올리고뉴클레오티드는 제어 바코드 서열, 및 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 표적-결합 영역에 대해 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 의사-표적 영역을 포함하는 단계; 및 복수의 제어 올리고뉴클레오티드들의 적어도 하나의 특성을 이용하여 하나 이상의 세포의 적어도 하나의 특성을 결정하는 단계를 포함한다. 의사-표적 영역은 폴리(dA) 영역을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 바코드 서열은 적어도 6 개의 뉴클레오티드 길이, 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이, 약 128 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 128 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 조합이다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 약 50 개의 뉴클레오티드 길이, 약 100 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 200 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 300 개 미만의 뉴클레오티드 길이, 약 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 조합일 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 2, 10, 100, 1000 개, 또는 그 이상의 제어 바코드 서열은 동일할 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 2, 10, 100, 1000 개, 또는 그 이상은 상이한 제어 바코드 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 세포의 적어도 하나의 특성을 결정하는 단계는: 서열화 데이터 중, 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들과 연결된 별개의 서열을 갖는 세포 표지 서열들의 수를 결정하는 단계; 및 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드와 연결된 별개의 서열을 갖는 세포 표지 서열의 수를 이용하여 하나 이상의 세포의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 방법은: 결정된 하나 이상의 세포의 수를 기준으로 단일 세포 포획 효율을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은: 결정된 하나 이상의 세포의 수와 복수의 세포들의 수의 비를 기준으로 단일 세포 포획 효율을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 서열화 데이터 중, 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들의 특성을 이용하여, 하나 이상의 세포의 적어도 하나의 특성을 결정하는 단계는: 서열화 데이터 중 각각의 세포 표지에 대하여, 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 결정하는 단계; 및 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 이용하여 하나 이상의 세포의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 결정하는 단계는: 서열화 데이터 중 각각의 세포 표지에 대하여, 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 최대 수의 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 이용하여 하나 이상의 세포의 수를 결정하는 단계는: 최대 수의 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수와, 최대 수의 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수와 연관된 서열화 데이터 중 세포 표지의 수의 플롯을 생성하는 단계; 및 플롯에서의 컷오프를 하나 이상의 세포의 수로서 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 올리고뉴클레오티드는 임의의 복수의 세포들의 유전체 서열에 대해 상동성이 아니다. 제어 올리고뉴클레오티드는 종의 유전체 서열에 대해 상동성일 수 있다. 종은 비-포유동물 종일 수 있다. 비-포유동물 종은 파지 종일 수 있다. 파지 종은 T7 파지, PhiX 파지, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 제어 올리고뉴클레오티드를 바코딩하기 전에, 단백질 결합 시약으로부터 제어 올리고뉴클레오티드를 방출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 제어 조성물들 중 미결합된 제어 조성물을 제거하는 단계를 포함한다. 미결합된 제어 조성물을 제거하는 단계는 복수의 세포들 중 하나 이상의 세포를 세척 버퍼로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 미결합된 세포 식별 조성물을 제거하는 단계는 유세포 분석을 이용하여 제어 조성물 중 적어도 하나의 단백질 결합 시약에 결합된 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나는 세포 표면 상에 존재한다. 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나는 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 인테그린, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 단백질 결합 시약은 항체를 포함할 수 있다. 제어 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트될 수 있다. 제어 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 제1 단백질 결합 시약에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 이황화 결합, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 결합 시약은 동일한 제어 바코드 서열을 갖는 둘 이상의 제어 올리고뉴클레오티드와 연결된다. 단백질 결합 시약은 상이한 동일한 제어 바코드 서열을 갖는 둘 이상의 제어 올리고뉴클레오티드와 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 제어 조성물들 중 제2 단백질 결합 시약은 제어 올리고뉴클레오티드와 연결되지 않는다. 단백질 결합 시약과 제2 단백질 결합 시약은 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 바코드는 범용 프라이머를 위한 결합 부위를 포함한다. 표적-결합 영역은 폴리(dT) 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 바코드들은 바코딩 입자와 연결된다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 상에 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 상에 부분적으로 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 내에 봉입된다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 바코딩 입자 내에 부분적으로 봉입된다. 바코딩 입자는 붕괴될 수 있다. 바코딩 입자는 바코딩 비드일 수 있다. 바코딩 비드는 세파로스 비드, 스트렙트아비딘 비드, 아가로스 비드, 자석 비드, 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 올리고(dT) 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 바코딩 입자는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스티렌, 유리, 폴리프로필렌, 아가로스, 젤라틴, 하이드로겔, 상자성체, 세라믹, 플라스틱, 유리, 메틸스티렌, 아크릴성 중합체, 티타늄, 라텍스, 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 실리콘, 또는 이들의 임의의 조합의 재료를 포함할 수 있다. 바코딩 입자는 붕괴될 수 있는 하이드로겔 입자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 바코딩 입자는 광학 모이어티와 연결된다. 제어 올리고뉴클레오티드는 광학 모이어티와 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은; 복수의 바코드들을 이용하여 제어 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 세포 표지 서열, 바코드 서열, 및/또는 표적-결합 영역을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드의 바코드 서열은 상이한 서열을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함하는 단계; 및 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 바코딩 입자의 바코드는 적어도 1000, 10000 개, 또는 그 이상의 상이한 바코드 서열로부터 선택된 바코드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 바코드의 바코드 서열은 랜덤 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 바코딩 입자는 적어도 10000 개의 바코드를 포함한다.
일부 구현예에서, 제어 올리고뉴클레오티드를 바코딩하는 단계는: 복수의 바코드들을 이용하여 제어 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 바코드들을 이용하여 제어 올리고뉴클레오티드들을 바코딩하는 단계는: 복수의 바코드들을 복수의 제어 조성물들의 제어 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜 제어 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 생성하는 단계; 및 제어 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함한다. 바코드를 연장하는 단계는 DNA 중합효소, 역전사효소, 또는 이들의 조합을 이용하여 바코드를 연장하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들을 증폭시켜 복수의 암프리콘들을 생성하는 단계를 포함한다. 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들을 증폭시키는 단계는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여, 바코드 서열의 적어도 일부 및 제어 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열화 데이터를 수득하는 단계는 복수의 암프리콘들의 서열화 데이터를 수득하는 단계를 포함한다. 서열화 데이터를 수득하는 단계는 바코드 서열의 적어도 일부 및 제어 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 서열화하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서의 개시는 세포 식별 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은: 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들을 2 개의 세포 식별 조성물과 각각 접촉시키는 단계로서, 제1 복수의 세포들의 각각 및 제2 복수의 세포들의 각각은 하나 이상의 항원 표적을 포함하고, 2 개의 세포 식별 조성물의 각각은 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 항원 결합 시약을 포함하고, 항원 결합 시약은 하나 이상의 항원 표적 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있고, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 세포 식별 서열을 포함하고, 2 개의 세포 식별 조성물의 세포 식별 서열은 상이한 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코드들을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 세포 표지 서열, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 및/또는 표적-결합 영역을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드의 바코드 서열은 상이한 서열을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계; 및 수득된 서열화 데이터 중, 둘 이상의 세포 식별 서열과 연결된 세포 표지 서열을 식별하는 단계; 및 수득된 서열화 데이터로부터 세포 표지 서열과 연관된 서열화 데이터를 제거하는 단계 및/또는 세포 표지 서열과 연관된 서열화 데이터를 후속 분석에서 제외하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열, 범용 프라이머를 위한 결합 부위, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 명세서의 개시는 멀티플렛 식별 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은: 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들을 2 개의 세포 식별 조성물과 각각 접촉시키는 단계로서, 제1 복수의 세포들의 각각 및 제2 복수의 세포들의 각각은 하나 이상의 항원 표적을 포함하고, 2 개의 세포 식별 조성물의 각각은 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 항원 결합 시약을 포함하고, 항원 결합 시약은 하나 이상의 항원 표적 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있고, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 세포 식별 서열을 포함하고, 2 개의 세포 식별 조성물의 세포 식별 서열은 상이한 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코드들을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 세포 표지 서열, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 및/또는 표적-결합 영역을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드의 바코드 서열은 상이한 서열을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계; 및 수득된 서열화 데이터 중, 둘 이상의 세포 식별 서열과 각각 연결된 하나 이상의 다중 세포 표지 서열을 식별하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은: 하나 이상의 다중 세포 표지 서열과 연관된 서열화 데이터를 수득된 서열화 데이터로부터 제거하는 단계 및/또는 하나 이상의 다중 세포 표지 서열과 연관된 서열화 데이터를 후속 분석에서 제외하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 범용 프라이머를 위한 결합 부위, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들을 2 개의 세포 식별 조성물과 각각 접촉시키는 단계는: 제1 복수의 세포들을 2 개의 세포 식별 조성물 중 제1 세포 식별 조성물과 접촉시키는 단계; 및 제1 복수의 세포들을 2 개의 세포 식별 조성물 중 제2 세포 식별 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 식별 서열은 적어도 6 개의 뉴클레오티드 길이, 25 내지 60 개의 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 45 개의 뉴클레오티드 길이), 약 128 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 128 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 조합이다. 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 약 50 개의 뉴클레오티드 길이, 약 100 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 200 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 300 개 미만의 뉴클레오티드 길이, 약 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 세포 식별 조성물들 중 적어도 10, 100, 1000 개, 또는 그 이상의 세포 식별 조성물의 세포 식별 서열은 상이한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 시약은 항체, 테트라머, 압타머, 단백질 스캐폴드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 항원 결합 시약에 컨쥬게이트될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 항원 결합 시약에 가역적으로 또는 비가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 디설피드 결합, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 이황화 결합 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들 중 적어도 하나는 단일 세포를 포함한다. 하나 이상의 항원 표적 중 적어도 하나는 세포 표면 상에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은: 2 개의 세포 식별 조성물 중 미결합된 세포 식별 조성물을 제거하는 단계를 포함한다. 미결합된 세포 식별 조성물을 제거하는 단계는 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들의 세포를 세척 버퍼로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 미결합된 세포 식별 조성물을 제거하는 단계는 유세포 분석을 이용하여 2 개의 세포 식별 조성물의 적어도 하나의 항원 결합 시약에 결합된 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은: 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들 중 하나 이상의 세포를 용해하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 항원 결합 시약으로부터 분리할 수 있거나 분리할 수 없도록 구성된다. 방법은 항원 결합 시약으로부터 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계는 UV 광분할, 화학 처리(예를 들어, 디티오트레이톨과 같은 환원 시약을 이용), 가열, 효소 처리, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 항원 결합 시약으로부터 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 임의의 하나 이상의 세포의 유전체 서열에 대해 상동성이 아니다. 제어 바코드 서열은 종의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 종은 비-포유동물 종일 수 있다. 비-포유동물 종은 파지 종일 수 있다. 파지 종은 T7 파지, PhiX 파지, 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들은 종양 세포, 포유동물 세포, 세균 세포, 바이러스 세포, 효모 세포, 균류 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드의 포획 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 바코드는 포획 서열을 포함하는 표적-결합 영역을 포함할 수 있다. 표적-결합 영역은 폴리(dT) 영역을 포함할 수 있다. 바코드의 포획 서열에 상보적인 세포 식별 올리고뉴클레오티드의 서열은 폴리(dA) 영역을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 표적은 세포외 단백질, 세포내 단백질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 항원 표적은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 인테그린, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 항원 표적은 지질, 탄수화물, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 항원 표적은 10 내지 100 개의 상이한 항원 표적을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 시약은 동일한 서열을 갖는 둘 이상의 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된다. 항원 결합 시약은 상이한 세포 식별 서열을 갖는 둘 이상의 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결될 수 있다. 복수의 세포 식별 조성물들 중 세포 식별 조성물은 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트되지 않은 제2 항원 결합 시약을 포함할 수 있다. 항원 결합 시약과 제2 항원 결합 시약은 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들 중 바코드는 표적-결합 영역 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드의 바코드 서열은 상이한 분자 표지 서열을 포함한다. 바코드는 세포 표지 서열, 범용 프라이머를 위한 결합 부위, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 표적-결합 영역은 폴리(dT) 영역을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들은 입자와 연결될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 상에 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 상에 부분적으로 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 내에 봉입될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 내에 부분적으로 봉입될 수 있다. 입자는 붕괴될 수 있다. 입자는 비드일 수 있다. 비드는 세파로스 비드, 스트렙트아비딘 비드, 아가로스 비드, 자석 비드, 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 올리고(dT) 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 입자는 폴리디메틸실록산 /(PDMS), 폴리스티렌, 유리, 폴리프로필렌, 아가로스, 젤라틴, 하이드로겔, 상자성체, 세라믹, 플라스틱, 유리, 메틸스티렌, 아크릴성 중합체, 티타늄, 라텍스, 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 실리콘, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 재료를 포함할 수 있다. 입자는 붕괴될 수 있는 하이드로겔 입자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 시약은 검출가능한 모이어티와 연결된다. 일부 구현예에서, 입자는 검출가능한 모이어티와 연결된다. 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 광학 모이어티와 연결된다. 일부 구현예에서, 입자의 바코드는 적어도 1000, 10000 개, 또는 그 이상의 상이한 바코드 서열로부터 선택된 바코드 서열을 포함할 수 있다. 바코드의 바코드 서열은 랜덤 서열을 포함할 수 있다. 입자는 적어도 10000 개의 바코드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 바코딩하는 단계는: 복수의 바코드들을 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜 세포 식별 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 생성하는 단계; 및 세포 식별 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함한다. 바코드를 연장하는 단계는 DNA 중합효소를 이용하여 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 바코드를 연장하는 단계는 역전사효소를 이용하여 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은: 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 증폭시켜 복수의 암프리콘들을 생성하는 단계를 포함한다. 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 증폭시키는 단계는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여, 바코드 서열의 적어도 일부 및 세포 식별 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계는 복수의 암프리콘들의 서열화 데이터를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 서열화 데이터를 수득하는 단계는 바코드 서열의 적어도 일부 및 세포 식별 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 서열화하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 세포의 샘플 기원을 식별하는 단계는 적어도 하나의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드의 세포 식별 서열을 기준으로 복수의 바코딩된 표적들의 샘플 기원을 식별하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계는, 복수의 추계적 바코드들을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 추계적으로 바코딩하여 복수의 추계적으로 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은: 복수의 바코드들을 이용하여 세포의 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 세포 표지 서열을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함하는 단계; 및 바코딩된 표적의 서열화 데이터를 수득하는 단계를 포함한다. 복수의 바코드들을 이용하여 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는: 표적의 복제물(copy)을 바코드의 표적-결합 영역과 접촉시키는 단계; 및 복수의 바코드들을 이용하여 복수의 표적들을 역전사하여 복수의 역전사된 표적들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은: 복수의 바코딩된 표적들의 서열화 데이터를 수득하기 전에, 바코딩된 표적을 증폭시켜 복수의 증폭된 바코딩된 표적들을 생성하는 단계를 포함한다. 바코딩된 표적을 증폭시켜 복수의 증폭된 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 바코딩된 표적을 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 복수의 바코드들을 이용하여 세포의 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는 복수의 추계적 바코드들을 이용하여 세포의 복수의 표적들을 추계적으로 바코딩하여 복수의 추계적으로 바코딩된 표적들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서의 개시는 세포 식별 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은: 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들을 2 개의 세포 식별 조성물과 각각 접촉시키는 단계로서, 제1 복수의 세포들의 각각 및 제2 복수의 세포들의 각각은 하나 이상의 세포 성분 표적을 포함하고, 2 개의 세포 식별 조성물의 각각은 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 세포 성분 결합 시약을 포함하고, 세포 성분 결합 시약은 하나 이상의 세포 성분 표적 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있고, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 세포 식별 서열을 포함하고, 복수의 세포 식별 조성물들 중 2 개의 세포 식별 조성물의 세포 식별 서열은 상이한 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코드들을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 세포 표지 서열, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 및/또는 표적-결합 영역을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드의 바코드 서열은 상이한 서열을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계; 수득된 서열화 데이터 중, 둘 이상의 세포 식별 서열과 각각 연결된 하나 이상의 세포 표지 서열을 식별하는 단계; 및 둘 이상의 세포 식별 서열과 각각 연결된 하나 이상의 세포 표지 서열과 연관된 서열화 데이터를 수득된 서열화 데이터로부터 제거하는 단계 및/또는 둘 이상의 세포 식별 서열과 각각 연결된 하나 이상의 세포 표지 서열과 연관된 서열화 데이터를 후속 분석에서 제외하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 범용 프라이머를 위한 결합 부위, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 명세서의 개시는 멀티플렛 식별 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은: 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들을 2 개의 세포 식별 조성물과 각각 접촉시키는 단계로서, 제1 복수의 세포들의 각각 및 제2 복수의 세포들의 각각은 하나 이상의 세포 성분 표적을 포함하고, 2 개의 세포 식별 조성물의 각각은 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 세포 성분 결합 시약을 포함하고, 세포 성분 결합 시약은 하나 이상의 세포 성분 표적 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있고, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 세포 식별 서열을 포함하고, 복수의 세포 식별 조성물들 중 2 개의 세포 식별 조성물의 세포 식별 서열은 상이한 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코드들을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 세포 표지 서열, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 및/또는 표적-결합 영역을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드의 바코드 서열은 상이한 서열을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계; 수득된 서열화 데이터 중, 둘 이상의 세포 식별 서열과 각각 연결된 하나 이상의 다중 세포 표지 서열을 식별하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은: 하나 이상의 다중 세포 표지 서열과 연관된 서열화 데이터를 수득된 서열화 데이터로부터 제거하는 단계 및/또는 하나 이상의 다중 세포 표지 서열과 연관된 서열화 데이터를 후속 분석에서 제외하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 범용 프라이머를 위한 결합 부위, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들을 2 개의 세포 식별 조성물과 각각 접촉시키는 단계는: 제1 복수의 세포들을 2 개의 세포 식별 조성물 중 제1 세포 식별 조성물과 접촉시키는 단계; 및 제1 복수의 세포들을 2 개의 세포 식별 조성물 중 제2 세포 식별 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 식별 서열은 적어도 6 개의 뉴클레오티드 길이, 25 내지 60 개의 뉴클레오티드 길이,(예를 들어, 45 개의 뉴클레오티드 길이), 약 128 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 128 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 조합이다. 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 약 50 개의 뉴클레오티드 길이, 약 100 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 200 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 300 개 미만의 뉴클레오티드 길이, 약 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 세포 식별 조성물들 중 적어도 10, 100, 1000 개, 또는 그 이상의 세포 식별 조성물의 세포 식별 서열은 상이한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 성분 결합 시약은 항체, 테트라머, 압타머, 단백질 스캐폴드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 세포 성분 결합 시약에 컨쥬게이트될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 세포 성분 결합 시약에 가역적 또는 비가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 디설피드 결합, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 이황화 결합 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들 중 적어도 하나는 단일 세포를 포함한다. 하나 이상의 세포 성분 표적 중 적어도 하나는 세포 표면 상에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은: 2 개의 세포 식별 조성물 중 미결합된 세포 식별 조성물을 제거하는 단계를 포함한다. 미결합된 세포 식별 조성물을 제거하는 단계는 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들의 세포를 세척 버퍼로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 미결합된 세포 식별 조성물을 제거하는 단계는 유세포 분석을 이용하여 2 개의 세포 식별 조성물의 적어도 하나의 세포 성분 결합 시약에 결합된 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은: 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들 중 하나 이상의 세포를 용해하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 세포 성분 결합 시약으로부터 분리할 수 있거나 분리할 수 없도록 구성된다. 방법은 세포 성분 결합 시약으로부터 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계는 UV 광분할, 화학 처리(예를 들어, 디티오트레이톨과 같은 환원 시약을 이용), 가열, 효소 처리, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 세포 성분 결합 시약으로부터 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 임의의 하나 이상의 세포의 유전체 서열에 대해 상동성이 아니다. 제어 바코드 서열은 종의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 종은 비-포유동물 종일 수 있다. 비-포유동물 종은 파지 종일 수 있다. 파지 종은 T7 파지, PhiX 파지, 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들은 종양 세포, 포유동물 세포, 박테리아 세포, 세균 세포, 효모 세포, 균류 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드의 포획 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 바코드는 포획 서열을 포함하는 표적-결합 영역을 포함할 수 있다. 표적-결합 영역은 폴리(dT) 영역을 포함할 수 있다. 바코드의 포획 서열에 상보적인 세포 식별 올리고뉴클레오티드의 서열은 폴리(dA) 영역을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 표적은 세포외 단백질, 세포내 단백질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 항원 표적은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 인테그린, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 항원 표적은 지질, 탄수화물, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 항원 표적은 10 내지 100 개의 상이한 항원 표적을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 성분 결합 시약은 동일한 서열을 갖는 둘 이상의 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된다. 세포 성분 결합 시약은 상이한 세포 식별 서열을 갖는 둘 이상의 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결될 수 있다. 복수의 세포 식별 조성물들 중 세포 식별 조성물은 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트되지 않은 제2 세포 성분 결합 시약을 포함할 수 있다. 세포 성분 결합 시약과 제2 세포 성분 결합 시약은 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들 중 바코드는 표적-결합 영역 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드의 바코드 서열은 상이한 분자 표지 서열을 포함한다. 바코드는 세포 표지 서열, 범용 프라이머를 위한 결합 부위, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 표적-결합 영역은 폴리(dT) 영역을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들은 입자와 연결될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 상에 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 상에 부분적으로 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 내에 봉입될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 내에 부분적으로 봉입될 수 있다. 입자는 붕괴될 수 있다. 입자는 비드일 수 있다. 비드는 세파로스 비드, 스트렙트아비딘 비드, 아가로스 비드, 자석 비드, 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 올리고(dT) 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 입자는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스티렌, 유리, 폴리프로필렌, 아가로스, 젤라틴, 하이드로겔, 상자성체, 세라믹, 플라스틱, 유리, 메틸스티렌, 아크릴성 중합체, 티타늄, 라텍스, 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 실리콘, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 재료를 포함할 수 있다. 입자는 붕괴될 수 있는 하이드로겔 입자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 성분 결합 시약은 검출가능한 모이어티와 연결된다. 일부 구현예에서, 입자는 검출가능한 모이어티와 연결된다. 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 광학 모이어티와 연결된다.
일부 구현예에서, 입자의 바코드는 적어도 1000, 10000 개, 또는 그 이상의 상이한 바코드 서열로부터 선택된 바코드 서열을 포함할 수 있다. 바코드의 바코드 서열은 랜덤 서열을 포함할 수 있다. 입자는 적어도 10000 개의 바코드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 바코딩하는 단계는: 복수의 바코드들을 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜 세포 식별 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 생성하는 단계; 및 세포 식별 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함한다. 바코드를 연장하는 단계는 DNA 중합효소를 이용하여 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 바코드를 연장하는 단계는 역전사효소를 이용하여 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은: 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 증폭시켜 복수의 암프리콘들을 생성하는 단계를 포함한다. 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 증폭시키는 단계는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여, 바코드 서열의 적어도 일부 및 세포 식별 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계는 복수의 암프리콘들의 서열화 데이터를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 서열화 데이터를 수득하는 단계는 바코드 서열의 적어도 일부 및 세포 식별 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 서열화하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 세포의 샘플 기원을 식별하는 단계는 적어도 하나의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드의 세포 식별 서열을 기준으로 복수의 바코딩된 표적들의 샘플 기원을 식별하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계는, 복수의 추계적 바코드들을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 추계적으로 바코딩하여 복수의 추계적으로 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은: 복수의 바코드를 이용하여 세포의 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 세포 표지 서열을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함하는 단계; 및 바코딩된 표적의 서열화 데이터를 수득하는 단계를 포함한다. 복수의 바코드들을 이용하여 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는: 표적의 복제물을 바코드의 표적-결합 영역과 접촉시키는 단계; 및 복수의 바코드들을 이용하여 복수의 표적들을 역전사하여 복수의 역전사된 표적들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은: 복수의 바코딩된 표적들의 서열화 데이터를 수득하기 전에, 바코딩된 표적을 증폭시켜 복수의 증폭된 바코딩된 표적들을 생성하는 단계를 포함한다. 바코딩된 표적을 증폭시켜 복수의 증폭된 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는: 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 바코딩된 표적을 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 복수의 바코드들을 이용하여 세포의 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는, 복수의 추계적 바코드들을 이용하여 세포의 복수의 표적들을 추계적으로 바코딩하여 복수의 추계적으로 바코딩된 표적들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서의 개시는 세포 식별 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은: 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들의 각각으로부터 하나 이상의 세포를, 복수의 2 개의 세포 식별 조성물들 중 하나의 세포 식별 조성물과 각각 접촉시키는 단계로서, 제1 복수의 세포들의 각각 및 제2 복수의 세포들의 각각은 하나 이상의 항원 표적을 포함하고, 2 개의 세포 식별 조성물의 각각은 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 항원 결합 시약을 포함하고, 항원 결합 시약은 하나 이상의 항원 표적 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있고, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 세포 식별 서열을 포함하고, 2 개의 세포 식별 조성물의 세포 식별 서열은 상이한 서열을 포함하는 단계; 및 둘 이상의 세포 식별 서열과 각각 연결된 하나 이상의 세포를 식별하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열, 범용 프라이머를 위한 결합 부위, 또는 이들의 조합을 포함한다.
멀티플렛 식별 방법이 본 명세서에 개시된다. 일부 구현예에서, 방법은: 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들의 각각으로부터 하나 이상의 세포를, 복수의 2 개의 세포 식별 조성물들 중 하나의 세포 식별 조성물과 각각 접촉시키는 단계로서,제1 복수의 세포들의 각각 및 제2 복수의 세포들의 각각은 하나 이상의 항원 표적을 포함하고, 2 개의 세포 식별 조성물의 각각은 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 항원 결합 시약을 포함하고, 항원 결합 시약은 하나 이상의 항원 표적 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있고, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 세포 식별 서열을 포함하고, 2 개의 세포 식별 조성물의 세포 식별 서열은 상이한 서열들을 포함하는 단계; 및 다중 세포로서 둘 이상의 세포 식별 서열와 각각 연결된 하나 이상의 세포를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 둘 이상의 세포 식별 서열과 각각 연결된 세포를 식별하는 단계는: 바코드를 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 세포 표지 서열, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 및/또는 표적-결합 영역을 포함하고, 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드의 바코드 서열은 상이한 서열을 포함하고, 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함하는 단계; 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계; 및 수득된 서열화 데이터 중, 둘 이상의 세포 식별 서열과 각각 연결된 하나 이상의 세포 표지 서열을 식별하는 단계를 포함한다. 방법은 수득된 서열화 데이터로부터 둘 이상의 세포 식별 서열과 각각 연결된 하나 이상의 세포 표지 서열과 연관된 서열화 데이터를 제거하는 단계를 포함할 수 있고/있거나, 둘 이상의 세포 식별 서열과 각각 연결된 하나 이상의 세포 표지 서열과 연관된 서열화 데이터를 후속 분석에서 제외하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들을 2 개의 세포 식별 조성물과 각각 접촉시키는 단계는: 제1 복수의 세포들을 2 개의 세포 식별 조성물 중 제1 세포 식별 조성물과 접촉시키는 단계; 및 제1 복수의 세포들을 2 개의 세포 식별 조성물 중 제2 세포 식별 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 식별 서열은 적어도 6 개의 뉴클레오티드 길이, 25 내지 60 개의 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 45 개의 뉴클레오티드 길이), 약 128 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 128 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 조합이다. 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 약 50 개의 뉴클레오티드 길이, 약 100 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 200 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 300 개 미만의 뉴클레오티드 길이, 약 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 세포 식별 조성물들 중 적어도 10, 100, 1000 개, 또는 그 이상의 세포 식별 조성물의 세포 식별 서열은 상이한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 시약은 항체, 테트라머, 압타머, 단백질 스캐폴드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 항원 결합 시약에 컨쥬게이트될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 항원 결합 시약에 가역적으로 또는 비가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 디설피드 결합, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 이황화 결합 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들 중 적어도 하나는 단일 세포를 포함한다. 하나 이상의 항원 표적 중 적어도 하나는 세포 표면 상에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은: 2 개의 세포 식별 조성물 중 미결합된 세포 식별 조성물을 제거하는 단계를 포함한다. 미결합된 세포 식별 조성물을 제거하는 단계는 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들의 세포를 세척 버퍼로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 미결합된 세포 식별 조성물을 제거하는 단계는 유세포 분석을 이용하여 2 개의 세포 식별 조성물의 적어도 하나의 항원 결합 시약에 결합된 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은: 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들 중 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 항원 결합 시약으로부터 분리할 수 있거나 분리할 수 없도록 구성된다. 방법은 항원 결합 시약으로부터 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계는 UV 광분할, 화학 처리(예를 들어, 디티오트레이톨과 같은 환원 시약을 이용), 가열, 효소 처리, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 항원 결합 시약으로부터 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 임의의 하나 이상의 세포의 유전체 서열에 대해 상동성이 아니다. 제어 바코드 서열은 종의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 종은 비-포유동물 종일 수 있다. 비-포유동물 종은 파지 종일 수 있다. 파지 종은 T7 파지, PhiX 파지, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들은 종양 세포, 포유동물 세포, 세균 세포, 바이러스 세포, 효모 세포, 균류 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드의 포획 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 바코드는 포획 서열을 포함하는 표적-결합 영역을 포함할 수 있다. 표적-결합 영역은 폴리(dT) 영역을 포함할 수 있다. 바코드의 포획 서열에 상보적인 세포 식별 올리고뉴클레오티드의 서열은 폴리(dA) 영역을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 표적은 세포외 단백질, 세포내 단백질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 항원 표적은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 인테그린, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 항원 표적은 지질, 탄수화물, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 항원 표적은 10 내지 100 개의 상이한 항원 표적을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 시약은 동일한 서열을 갖는 둘 이상의 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된다. 항원 결합 시약은 상이한 세포 식별 서열을 갖는 둘 이상의 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결될 수 있다. 복수의 세포 식별 조성물들 중 세포 식별 조성물은 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트되지 않은 제2 항원 결합 시약을 포함할 수 있다. 항원 결합 시약과 제2 항원 결합 시약은 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들 중 바코드는 표적-결합 영역 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드의 바코드 서열은 상이한 분자 표지 서열을 포함한다. 바코드는 세포 표지 서열, 범용 프라이머를 위한 결합 부위, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 표적-결합 영역은 폴리(dT) 영역을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들은 입자와 연결될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 상에 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 상에 부분적으로 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 내에 봉입될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 내에 부분적으로 봉입될 수 있다. 입자는 붕괴될 수 있다. 입자는 비드일 수 있다. 비드는 세파로스 비드, 스트렙트아비딘 비드, 아가로스 비드, 자석 비드, 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 올리고(dT) 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 입자는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스티렌, 유리, 폴리프로필렌, 아가로스, 젤라틴, 하이드로겔, 상자성체, 세라믹, 플라스틱, 유리, 메틸스티렌, 아크릴성 중합체, 티타늄, 라텍스, 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 실리콘, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 재료를 포함할 수 있다. 입자는 붕괴될 수 있는 하이드로겔 입자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 시약은 검출가능한 모이어티와 연결된다. 일부 구현예에서, 입자는 검출가능한 모이어티와 연결된다. 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 광학 모이어티와 연결된다.
일부 구현예에서, 입자의 바코드는 적어도 1000, 10000 개, 또는 그 이상의 상이한 바코드 서열로부터 선택된 바코드 서열을 포함할 수 있다. 바코드의 바코드 서열은 랜덤 서열을 포함할 수 있다. 입자는 적어도 10000 개의 바코드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 바코딩하는 단계는: 복수의 바코드들을 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜 세포 식별 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 생성하는 단계; 및 세포 식별 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함한다. 바코드를 연장하는 단계는 DNA 중합효소를 이용하여 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 바코드를 연장하는 단계는 역전사효소를 이용하여 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은: 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 증폭시켜 복수의 암프리콘들을 생성하는 방법을 포함한다. 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 증폭시키는 단계는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여, 바코드 서열의 적어도 일부 및 세포 식별 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계는 복수의 암프리콘들의 서열화 데이터를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 서열화 데이터를 수득하는 단계는 바코드 서열의 적어도 일부 및 세포 식별 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 서열화하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 세포의 샘플 기원을 식별하는 단계는 적어도 하나의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드의 세포 식별 서열을 기준으로 복수의 바코딩된 표적들의 샘플 기원을 식별하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계는, 복수의 추계적 바코드들을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 추계적으로 바코딩하여 복수의 추계적으로 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은: 복수의 바코드들을 이용하여 세포의 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 세포 표지 서열을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함하는 단계; 및 바코딩된 표적의 서열화 데이터를 수득하는 단계를 포함한다. 복수의 바코드들을 이용하여 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는: 표적의 복제물을 바코드의 표적-결합 영역과 접촉시키는 단계; 및 복수의 바코드들을 이용하여 복수의 표적들을 역전사하여 복수의 역전사된 표적들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은: 복수의 바코딩된 표적들의 서열화 데이터를 수득하기 전에, 바코딩된 표적을 증폭시켜 복수의 증폭된 바코딩된 표적들을 생성하는 단계를 포함한다. 바코딩된 표적을 증폭시켜 복수의 증폭된 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는: 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 바코딩된 표적을 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 복수의 바코드들을 이용하여 세포의 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는, 복수의 추계적 바코드들을 이용하여 세포의 복수의 표적들을 추계적으로 바코딩하여 복수의 추계적으로 바코딩된 표적들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에는 단백질-단백질 상호작용의 결정 방법이 개시된다. 일부 구현예에서, 방법은: 세포를 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물과 접촉시키는 단계로서, 세포는 제1 단백질 표적 및 제2 단백질 표적을 포함하고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 각각은 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결된 단백질 결합 시약을 포함하고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물들 중 하나의 단백질 결합 시약은 제1 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 다른 하나의 단백질 결합 시약은 제2 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 상호작용 결정 서열 및 가교 올리고뉴클레오티드 혼성 영역을 포함하고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물들 중 상호작용 결정 서열은 상이한 서열을 포함하는 단계; 가교 올리고뉴클레오티드를 이용하여 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 배위하여 배위된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계로서, 가교 올리고뉴클레오티드는 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 2 개의 혼성화 영역을 포함하는 단계; 복수의 바코드들을 이용하여 배위된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 바코드 서열 및 포획 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계; 및 수득된 서열화 데이터 중, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 서열의 연결을 기준으로 제1 단백질 표적과 제2 단백질 표적 사이의 상호작용을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은: 세포를 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물과 접촉시키는 단계로서, 세포는 제1 세포 성분 표적 및 제2 세포 성분 표적을 포함하고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 각각은 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결된 세포 성분 결합 시약을 포함하고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 하나의 조성물의 세포 성분 결합 시약은 제1 세포 성분 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 다른 하나의 조성물의 세포 성분 결합 시약은 제2 세포 성분 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 상호작용 결정 서열 및 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역을 포함하고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 서열은 상이한 서열을 포함하는 단계; 가교 올리고뉴클레오티드를 이용하여 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 배위하여 배위된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계로서, 가교 올리고뉴클레오티드는 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 2 개의 혼성화 영역을 포함하는 단계; 복수의 바코드들을 이용하여 배위된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 바코드 서열 및 포획 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계; 및 수득된 서열화 데이터 중, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 서열의 연결을 기준으로 제1 세포 성분 표적 및 제2 세포 성분 표적 사이의 상호작용을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 2 개의 세포 성분 결합 시약 중 적어도 하나는 단백질 결합 시약을 포함하고, 단백질 결합 시약은 2 개의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드 중 하나와 연결되고, 하나 이상의 세포 성분 표적은 적어도 하나의 단백질 표적을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포를 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물과 접촉시키는 단계는: 세포를 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 각각과 차례로 또는 동시에 접촉시키는 단계를 포함한다. 제1 단백질 표적은 제2 단백질 표적과 동일할 수 있다. 제1 단백질 표적은 제2 단백질 표적과 상이할 수 있다.
일부 구현예에서, 상호작용 결정 서열은 적어도 6 개의 뉴클레오티드 길이, 25 내지 60 개의 뉴클레오티드 길이, 약 45 개의 뉴클레오티드 길이, 약 50 개의 뉴클레오티드 길이, 약 100 개의 뉴클레오티드 길이, 약 128 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 128 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 200 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 300 개 미만의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 500 개의 뉴클레오티드 길이, 약 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구현예에서, 방법은 세포를 제2 쌍의 상호작용 결정 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 세포는 제3 단백질 표적 및 제4 단백질 표적을 포함하고, 제2 쌍의 상호작용 결정 조성물의 각각은 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결된 단백질 결합 시약을 포함하고, 제2 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 하나의 단백질 결합 시약은 제3 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 다른 하나의 단백질 결합 시약은 제4 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 제3 단백질 표적 및 제4 단백질 표적 중 적어도 하나는 제1 단백질 표적 및 제2 단백질 표적 중 하나와 상이할 수 있다. 제3 단백질 표적 및 제4 단백질 표적 중 적어도 하나와 제1 단백질 표적 및 제2 단백질 표적 중 적어도 하나는 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 세포를 3 개 이상의 쌍의 상호작용 결정 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 복수의 상호작용 결정 조성물들 쌍 중 적어도 10, 100, 1000 개의 또는 이들의 임의의 조합의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 서열은 상이한 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역은 상이한 서열을 포함한다. 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역 중 적어도 하나는 가교 올리고뉴클레오티드의 2 개의 혼성화 영역 중 적어도 하나에 상보적일 수 있다.
일부 구현예에서, 가교 올리고뉴클레오티드를 이용하여 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 배위하는 단계는: 가교 올리고뉴클레오티드의 제1 혼성화 영역을 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드의 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역 중 제1 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역과 혼성화하는 단계; 가교 올리고뉴클레오티드의 제2 혼성화 영역을 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드의 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역 중 제2 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역과 혼성화하는 단계; 및 가교 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 배위하여 배위된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질 결합 시약은 항체, 테트라머, 압타머, 단백질 스캐폴드, 인테그린, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트된다. 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 단백질 결합 시약에 가역적으로 또는 비가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 디설피드 결합, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 이황화 결합 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하나 이상의 단백질 표적 중 적어도 하나는 세포 표면 상에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은: 세포를 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물과 접촉시키는 단계 전에, 세포를 고정하는 단계를 포함한다. 방법은: 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 미결합된 상호작용 결정 조성물을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 미결합된 상호작용 결정 조성물을 제거하는 단계는 세포를 세척 버퍼로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 미결합된 상호작용 결정 조성물을 제거하는 단계는 유세포 분석을 이용하여 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 세포를 용해시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 단백질 결합 시약으로부터 분리할 수 있거나 분리할 수 없도록 구성된다. 방법은 단백질 결합 시약으로부터 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계는 UV 광분할, 화학 처리, 가열, 효소 처리, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 단백질 결합 시약으로부터 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 세포의 유전체 서열에 대해 상동성이 아니다. 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 종의 유전체 서열에 대해 상동성일 수 있다. 종은 비-포유동물 종일 수 있다. 비-포유동물 종은 파지 종일 수 있다. 파지 종은 T7 파지, PhiX 파지, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 종양 세포 또는 비종양 세포를 포함한다. 세포는 포유동물 세포, 세균 세포, 바이러스 세포, 효모 세포, 균류 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은: 둘 이상의 세포를 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물과 접촉시키는 단계로서, 둘 이상의 세포의 각각은 제1 단백질 표적 및 제2 단백질 표적을 포함하는 단계를 포함한다. 둘 이상의 세포 중 적어도 하나는 단일 세포를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 바코드는 세포 표지 서열, 범용 프라이머를 위한 결합 부위, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함할 수 있다. 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 하나의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 포획 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 포획 서열은 폴리(dT) 영역을 포함할 수 있다. 포획 서열에 상보적인 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드의 서열은 폴리(dA) 영역을 포함할 수 있다. 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 제2 바코드 서열을 포함할 수 있다. 제1 쌍의 상호작용 식별 조성물 중 다른 하나의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 범용 프라이머를 위한 결합 부위를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 표적은 세포외 단백질, 세포내 단백질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 단백질 표적은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 인테그린, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 표적은 지질, 탄수화물, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 단백질 표적은 10 내지 100 개의 상이한 단백질 표적을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 결합 시약은 동일한 서열을 갖는 둘 이상의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결된다. 단백질 결합 시약은 상이한 상호작용 결정 서열을 갖는 둘 이상의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 상호작용 결정 조성물들 중 하나는 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결되지 않은 제2 단백질 결합 시약을 포함한다. 단백질 결합 시약과 제2 단백질 결합 시약은 동일할 수 있다. 단백질 결합 시약은 검출가능한 모이어티와 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들은 입자와 연결된다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 상에 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 상에 부분적으로 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 내에 봉입될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 내에 부분적으로 봉입될 수 있다. 입자는 붕괴될 수 있다. 입자는 비드를 포함할 수 있다. 입자는 세파로스 비드, 스트렙트아비딘 비드, 아가로스 비드, 자석 비드, 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 올리고(dT) 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 입자는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스티렌, 유리, 폴리프로필렌, 아가로스, 젤라틴, 하이드로겔, 상자성체, 세라믹, 플라스틱, 유리, 메틸스티렌, 아크릴성 중합체, 티타늄, 라텍스, 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 실리콘, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 재료를 포함할 수 있다. 입자는 붕괴될 수 있는 하이드로겔 입자를 포함할 수 있다. 입자는 검출가능한 모이어티와 연결될 수 있다. 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티와 연결될 수 있다. 입자의 바코드는 약, 적어도, 최대 1000, 10000 개, 또는 그 이상 또는 이하, 또는 이들의 임의의 조합의 상이한 바코드 서열로부터 선택될 수 있는 바코드 서열을 포함한다. 바코드의 바코드 서열은 랜덤 서열을 포함할 수 있다. 입자는 적어도 10000 개의 바코드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들을 이용하여 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 바코딩하는 단계는: 복수의 바코드들을 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 생성하는 단계; 및 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함한다. 바코드를 연장하는 단계는 DNA 중합효소를 이용하여 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 바코드를 연장하는 단계는 역전사 효소를 이용하여 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 바코드를 연장하는 단계는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus(M-MLV)) 역전사효소 또는 Taq DNA 중합효소를 이용하여 바코드를 연장하여, 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 바코드를 연장하는 단계는 배위된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드로부터 가교 올리고뉴클레오티드를 치환하는 것(displacing)을 포함할 수 있다. 방법은: 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 증폭시켜 복수의 암프리콘들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 증폭시키는 단계는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여, 바코드 서열의 적어도 일부 및 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계는 복수의 암프리콘들의 서열화 데이터를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 서열화 데이터를 수득하는 단계는 바코드 서열의 적어도 일부 및 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 서열화하는 단계를 포함할 수 있다. 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계는 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들의 부분적인 그리고/또는 완전한 서열을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들은 복수의 추계적 바코드들을 포함하고, 복수의 추계적 바코드들의 각각의 바코드 서열은 분자 표지 서열을 포함하고, 복수의 추계적 바코드들 중 적어도 2 개의 추계적 바코드의 분자 표지 서열은 상이한 서열을 포함하고, 복수의 바코드들을 이용하여 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계는, 복수의 추계적 바코드들을 이용하여 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 추계적으로 바코딩하여 복수의 추계적으로 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들을 이용하여 세포의 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계; 및 바코딩된 표적의 서열화 데이터를 수득하는 단계. 복수의 바코드들을 이용하여 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는: 표적의 복제물을 바코드의 표적-결합 영역과 접촉시키는 단계; 및 복수의 바코드들을 이용하여 복수의 표적들을 역전사하여 복수의 역전사된 표적들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은: 복수의 바코딩된 표적들의 서열화 데이터를 수득하는 단계 전에, 바코딩된 표적을 증폭시켜 복수의 증폭된 바코딩된 표적들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 바코딩된 표적들을 증폭시켜 복수의 증폭된 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는: 바코딩된 표적을 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 복수의 바코드들을 이용하여 세포의 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는 복수의 추계적 바코드들을 이용하여 세포의 복수의 표적들을 추계적으로 바코딩하여 복수의 추계적으로 바코딩된 표적들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 구현예는 단백질-단백질 상호작용을 식별하기 위한 키트를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는: 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물로서, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 각각은 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결된 단백질 결합 시약을 포함하고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 하나의 단백질 결합 시약은 제1 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 다른 하나의 단백질 결합 시약은 제2 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 상호작용 결정 서열 및 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역을 포함하고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 서열은 상이한 서열을 포함하는, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물; 및 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 2 개의 혼성화 영역을 각각 포함하는 복수의 가교 올리고뉴클레오티드들을 포함한다.
일부 구현예에서, 상호작용 결정 서열은 적어도 6 개의 뉴클레오티드 길이, 25 내지 60 개의 뉴클레오티드 길이, 약 45 개의 뉴클레오티드 길이, 약 50 개의 뉴클레오티드 길이, 약 100 개의 뉴클레오티드 길이, 약 128 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 128 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 500 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 200 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 300 개의 뉴클레오티드 길이, 약 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구현예에서, 키트는: 제2 쌍의 상호작용 결정 조성물로서, 제2 쌍의 상호작용 결정 조성물의 각각은 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결된 단백질 결합 시약을 포함하고, 제2 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 하나의 단백질 결합 시약은 제3 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 다른 하나의 단백질 결합 시약은 제4 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있는, 제2 쌍의 상호작용 결정 조성물을 포함한다. 제3 단백질 표적 및 제4 단백질 표적 중 적어도 하나는 제1 단백질 표적 및 제2 단백질 표적 중 하나와 상이할 수 있다. 제3 단백질 표적 및 제4 단백질 표적 중 적어도 하나와 제1 단백질 표적 및 제2 단백질 표적 중 적어도 하나는 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는: 3 개 이상의 쌍의 상호작용 결정 조성물을 포함한다. 3 개 이상의 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 적어도 10 개의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 서열은 상이한 서열을 포함할 수 있다. 3 개 이상의 쌍의 상호작용 결정 조성물의 적어도 100 개의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 서열은 상이한 서열을 포함할 수 있다. 3 개 이상의 쌍의 상호작용 결정 조성물의 적어도 1000 개의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 서열은 상이한 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 상호작용 결정 조성물들 중 2 개의 상호작용 결정 조성물의 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역은 상이한 서열을 포함한다. 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역 중 적어도 하나는, 가교 올리고뉴클레오티드의 2 개의 혼성화 영역 중 적어도 하나에 상보적일 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 결합 시약은 항체, 테트라머, 압타머, 단백질 스캐폴드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트될 수 있다. 적어도 하나의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 단백질 결합 시약에 가역적으로 또는 비가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 디설피드 결합, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 이황화 결합, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 관심 대상의 임의의 세포의 유전체 서열에 대해 상동성이 아니다. 관심 대상의 세포는 종양 세포 또는 비-종양 세포를 포함할 수 있다. 관심 대상의 세포는 단일 세포, 포유동물 세포, 세균 세포, 바이러스 세포, 효모 세포, 균류 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는: 복수의 바코드들의 각각이 바코드 서열 및 포획 서열을 포함하는 복수의 바코드들을 포함한다. 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 하나의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드의 포획 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 포획 서열은 폴리(dT) 영역을 포함할 수 있다. 바코드의 포획 서열에 상보적인 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드의 서열은 폴리(dA) 영역을 포함할 수 있다. 제1 쌍의 상호작용 식별 조성물 중 다른 하나의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 세포 표지 서열, 범용 프라이머를 위한 결합 부위, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 복수의 바코드들은 복수의 추계적 바코드들을 포함할 수 있으며, 복수의 추계적 바코드들의 각각의 바코드 서열은 분자 표지 서열을 포함하고, 복수의 추계적 바코드들 중 적어도 2 개의 추계적 바코드들의 분자 표지 서열은 상이한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질 표적은 세포외 단백질, 세포내 단백질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 단백질 표적은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 단백질 표적은 10 내지 100 개의 상이한 단백질 표적을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 결합 시약은 동일한 서열을 갖는 둘 이상의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결될 수 있다. 단백질 결합 시약은 상이한 상호작용 결정 서열을 갖는 둘 이상의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 하나는 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결되지 않은 제2 단백질 결합 시약을 포함한다. 제1 단백질 결합 시약과 제2 단백질 결합 시약은 동일하거나 상이할 수 있다. 단백질 결합 시약은 검출가능한 모이어티와 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티와 연결된다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들은 입자와 연결된다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 상에 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 상에 부분적으로 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 내에 봉입될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 내에 부분적으로 봉입될 수 있다. 입자는 붕괴될 수 있다. 입자는 비드를 포함할 수 있다. 입자는 세파로스 비드, 스트렙트아비딘 비드, 아가로스 비드, 자석 비드, 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 올리고(dT) 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 입자는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스티렌, 유리, 폴리프로필렌, 아가로스, 젤라틴, 하이드로겔, 상자성체, 세라믹, 플라스틱, 유리, 메틸스티렌, 아크릴성 중합체, 티타늄, 라텍스, 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 실리콘, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 재료를 포함할 수 있다. 입자는 붕괴될 수 있는 하이드로겔 입자를 포함할 수 있다. 입자는 검출가능한 모이어티와 연결될 수 있다.
입자의 바코드는 적어도 1000 개의 상이한 바코드 서열로부터 선택된 바코드 서열을 포함할 수 있다. 입자의 바코드는 적어도 10000 개의 상이한 바코드 서열로부터 선택된 바코드 서열을 포함할 수 있다. 바코드의 바코드 서열은 랜덤 서열을 포함할 수 있다. 입자는 적어도 10000 개의 바코드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는: DNA 중합효소를 포함한다. 키트는 역전사효소를 포함할 수 있다. 키트는: 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(M-MLV) 역전사효소 또는 Taq DNA 중합효소를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 고정제(fixation agent)(예를 들어, 포르말린, 파라포름알데히드, 글루타르알데히드/오스뮴 테트록시드, 알코올성 고정제, 헤페스-글루탐산 버퍼-매개 유기 용매 보호 효과(HOPE), 부인(Bouin) 용액, 또는 이들의 임의의 조합)를 포함한다.
넓은 범위의 생체분자 및 검출가능한 표지 포트폴리오에 걸쳐 고품질 및 고성능인 특정 생성물을, 빠르고 효율적이며 고도로 확장 가능한 방식으로 전달하기 위한 시스템 및 방법이 본 명세서에 개시된다. 본 발명의 구현예에서, 표지된 생체분자에 대한 요청이 이루어지고, 그 요청에 반응하여 표지된 생체분자가 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지의 기존 컬렉션(collection)으로부터 제조된다.
일부 구현예에서, 생체분자는 폴리펩티드, 핵산, 폴리사카라이드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 핵산은 올리고뉴클레오티드, DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리펩티드는 단백질, 효소 또는 단백질 결합 시약일 수 있다. 단백질 결합 시약은 항체, 압타머, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 표지와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 복수의 단백질 표적들은 예를 들어, 10 내지 400 개의 상이한 단백질 표적을 포함할 수 있다. 생체분자는 적어도 100, 1,000 또는 10,000 개의 상이한 생체분자로부터 선택될 수 있다. 하나 이상의 표지된 생체분자 시약은 표지에 공유결합되지 않은 제2 생체분자를 추가로 포함할 수 있다. 생체분자와 제2 생체분자는 동일할 수 있다
일부 구현예에서, 표지는 형광단, 발색단, 폴리펩티드, 단백질, 효소, 효소 기질, 촉매, 산화환원 표지, 방사성표지, 음향 표지, 라만(SERS) 태그, 질량 태그, 동위원소 태그, 자석 입자, 마이크로입자, 나노입자, 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 표지는 효소, 효소 기질, 또는 이들의 조합을 포함하며, 효소는 효소 기질을 상응하는 변경된 효소 기질로 변경시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 효소 기질은 적어도 하나의 작용기에 의해 상응하는 변경된 효소 기질과 상이하다. 적어도 하나의 작용기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 페닐, 벤질, 할로, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 히드록실, 카르보닐, 알데히드, 할로포르밀, 카르보네이트 에스테르, 카르복실레이트, 카르복실, 에스테르, 메톡시, 히드로퍼옥시, 퍼옥시, 에테르, 헤미아세탈, 헤미케탈, 아세탈, 케탈, 아세탈, 오르토에스테르, 메틸렌디옥시, 오르토카르보네이트 에스테르, 카르복사미드, 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 4° 암모늄, 1차 케타민, 2차 케타민, 1차 알드이민, 2차 알드이민, 이미드, 아지드, 아조, 디이미드, 시아네이트, 이소시아네이트, 니트레이트, 니트릴, 이소니트릴, 니트로소옥시, 니트로, 니트로소, 피리딜, 설프히드릴, 설피드, 디설피드, 설피닐, 설포닐, 설피노, 설포, 티오시아네이트, 이소티오시아네이트, 카르보노티온, 카르보노티알, 포스피노, 포스포노, 포스페이트, 포스포디에스테르, 보로노, 보로네이트, 보리노, 보리네이트, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 효소는 메틸트랜스퍼라제, 글리코시드 히드롤라제, 아가라제, 아미니다제, 아밀라제, 바이오시다제, 카라기나제, 셀룰라제, 세라미다제, 키티나제, 키토사나제, 시트리나제, 덱스트라나제, 덱스트리나제, 프룩토시다제, 푸코이다나제, 푸코시다제, 푸라노시다제, 갈락토시다제, 갈락투로나제, 글루카나제, 글루코시다제, 글루쿠로니다제, 글루쿠로노시다제, 글리코히드롤라제, 글리코시다제, 헥사오시다제, 히드롤라제, 이두로니다제, 이노시다제, 이눌리나제, 락타제, 레바나제(levanase), 리케니나제(licheninase), 리가제, 리아제, 리소자임, 말토시다제, 말토트리오시다제, 만노비오시다제, 만노시다제, 무라미다제, 옥툴로소나제, 옥툴로소니다제, 프리메베로시다제(primeverosidase), 프로테아제, 풀룰라나제, 람노시다제, 사미니다제(saminidase), 시알리다제, 신타제, 트랜스퍼라제, 트레할라제, 투로니다제, 투로노시다제, 자일라나제, 자일로시다제, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 효소 기질은 6-메르캅토푸린, 셀로비오스, 셀로테트라오스, 자일로테트라오스, 이소프리메베로스, β-D-젠티오비오스, 자일로글루칸 및 만노트리오스, 아가로스, 아미닉산, 전분, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 셀룰로스, 세라마이드, 키틴, 키토산, 덱스트로스, 덱스트린, 프룩토스, 푸코이단, 푸코스, 푸라노시드, 갈락토시드, 글루칸, 글루코피라노시드, 글루코시드, 글루쿠론산, 글루쿠로노시드, 글리코스, 글리코시드, 글리코사미노글리칸, 헥사오시드, 이눌린, 락토스, 레바노스, 리포폴리사카라이드, 만노스, 말토시드, 말토트리오시드, 만노스, 옥툴로소네이트, 올리고사카라이드, 펙테이트, 펙틴, 펩티드, 폴리갈락투로니드, 폴리뉴클레오티드, 풀룰란, 람노시드, 자일란, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 생체분자에 대한 고유 식별자를 포함한다. 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택될 수 있다. 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 10, 100, 또는 1,000 개의 상이한 바코드 서열로부터 선택된 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 표지는 링커를 통해 생체분자에 컨쥬게이트될 수 있다. 표지 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 생체분자에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
고유 식별자는 샘플의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 샘플은 단일 세포, 복수의 세포들, 조직, 종양 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 샘플은 포유동물 샘플, 세균 샘플, 바이러스 샘플, 효모 샘플, 균류 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 폴리(A) 테일, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 개시내용의 양태는 또한 표지된 생체분자 시약의 제조에 이용하기 위한 시스템을 포함한다. 일부 구현예에 따른 시스템은 표지된 생체분자 시약에 대한 요청을 수신하는 입력 관리자, 복수의 표지된 생체분자 시약 저장 식별자들을 갖는 데이터세트를 저장하기 위한 메모리, 메모리에 통신가능하게 커플링되고, 표지된 생체분자 시약 요청에 상응하는 데이터세트로부터 하나 이상의 표지된 생체분자 시약 저장 식별자를 식별하도록 구성된 프로세싱 모듈, 및 하나 이상의 식별된 표지된 생체분자 시약 저장 식별자를 제공하기 위한 출력 관리자를 포함한다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약에 대한 요청은 생체분자 요청 및 표지 요청을 포함한다. 다른 구현예에서, 표지된 생체분자 시약에 대한 요청은 표지된 생체분자 요청이다. 일부 구현예에서, 표지 요청은 효소 요청 및 기질 요청을 포함한다.
일부 구현예에서, 생체분자는 폴리펩티드, 핵산, 폴리사카라이드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 핵산은 올리고뉴클레오티드, DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리펩티드는 단백질, 효소 또는 단백질 결합 시약일 수 있다. 단백질 결합 시약은 항체, 압타머, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 표지와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 복수의 단백질 표적들은 예를 들어, 10 내지 400 개의 상이한 단백질 표적을 포함할 수 있다. 생체분자는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 생체분자로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 표지는 형광단, 발색단, 폴리펩티드, 단백질, 효소, 효소 기질, 촉매, 산화환원 표지, 방사성표지(radiolabel), 음향 표지, 라만(Raman)(SERS) 태그, 질량 태그, 동위원소 태그, 자석 입자, 마이크로입자, 나노입자, 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 표지는 효소, 효소 기질, 또는 이들의 조합을 포함하며, 효소는, 상응하는 변경된 효소 기질로 효소 기질을 변경시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 효소 기질은 적어도 하나의 작용기에 의해 상응하는 변경된 효소 기질과 상이하다. 적어도 하나의 작용기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 페닐, 벤질, 할로, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 히드록실, 카르보닐, 알데히드, 할로포르밀, 카르보네이트 에스테르, 카르복실레이트, 카르복실, 에스테르, 메톡시, 히드로퍼옥시, 퍼옥시, 에테르, 헤미아세탈, 헤미케탈, 아세탈, 케탈, 아세탈, 오르토에스테르, 메틸렌디옥시, 오르토카르보네이트 에스테르, 카르복사미드, 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 4° 암모늄, 1차 케타민, 2차 케타민, 1차 알드이민, 2차 알드이민, 이미드, 아지드, 아조, 디이미드, 시아네이트, 이소시아네이트, 니트레이트, 니트릴, 이소니트릴, 니트로소옥시, 니트로, 니트로소, 피리딜, 설프히드릴, 설피드, 디설피드, 설피닐, 설포닐, 설피노, 설포, 티오시아네이트, 이소티오시아네이트, 카르보노티온, 카르보노티알, 포스피노, 포스포노, 포스페이트, 포스포디에스테르, 보로노, 보로네이트, 보리노, 보리네이트, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 효소는 메틸트랜스퍼라제, 글리코시드 히드롤라제, 아가라제, 아미니다제, 아밀라제, 바이오시다제, 카라기나제, 셀룰라제, 세라미다제, 키티나제, 키토사나제, 시트리나제, 덱스트라나제, 덱스트리나제, 프룩토시다제, 푸코이다나제, 푸코시다제, 푸라노시다제, 갈락토시다제, 갈락투로나제, 글루카나제, 글루코시다제, 글루쿠로니다제, 글루쿠로노시다제, 글리코히드롤라제, 글리코시다제, 헥사오시다제, 히드롤라제, 이두로니다제, 이노시다제, 이눌리나제, 락타제, 레바나제, 리케니나제, 리가제, 리아제, 리소자임, 말토시다제, 말토트리오시다제, 만노비오시다제, 만노시다제, 무라미다제, 옥툴로소나제, 옥툴로소니다제, 프리메베로시다제, 프로테아제, 풀룰라나제, 람노시다제, 사미니다제, 시알리다제, 신타제, 트랜스퍼라제, 트레할라제, 투로니다제, 투로노시다제, 자일라나제, 자일로시다제, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 효소 기질은 6-메르캅토푸린, 셀로비오스, 셀로테트라오스, 자일로테트라오스, 이소프리메베로스, β-D-젠티오비오스, 자일로글루칸 및 만노트리오스, 아가로스, 아미닉산, 전분, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 셀룰로스, 세라마이드, 키틴, 키토산, 덱스트로스, 덱스트린, 프룩토스, 푸코이단, 푸코스, 푸라노시드, 갈락토시드, 글루칸, 글루코피라노시드, 글루코시드, 글루쿠론산, 글루쿠로노시드, 글리코스, 글리코시드, 글리코사미노글리칸, 헥사오시드, 이눌린, 락토스, 레바노스, 리포폴리사카라이드, 만노스, 말토시드, 말토트리오시드, 만노스, 옥툴로소네이트, 올리고사카라이드, 펙테이트, 펙틴, 펩티드, 폴리갈락투로니드, 폴리뉴클레오티드, 풀룰란, 람노시드, 자일란, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 생체분자에 대한 고유 식별자를 포함한다. 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택될 수 있다. 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 10, 100, 또는 1,000 개의 상이한 바코드 서열로부터 선택된 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 표지는 링커를 통해 생체분자에 컨쥬게이트될 수 있다. 표지는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 생체분자에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
고유 식별자는 샘플의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 샘플은 단일 세포, 복수의 세포들, 조직, 종양 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 샘플은 포유동물 샘플, 세균 샘플, 바이러스 샘플, 효모 샘플, 균류 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 폴리(A) 테일, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
입력 관리자는 사용자 그래픽 인터페이스, 예컨대 표지된 생체분자 시약에 대한 요청이 인터넷 웹사이트로 입력되는 웹사이트 메뉴 인터페이스에 작동적으로 커플링될 수 있다. 일부 구현예에서, 입력 관리자는 표지된 생체분자 요청을 수신하도록 구성된다. 다른 구현예에서, 입력 관리자는 생체분자 요청 및 표지 요청을 수신하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 표지 요청은 효소 요청 및 기질 요청을 포함한다. 입력 관리자는 복수의 표지된 생체분자 시약 요청들을, 예컨대 단일 사용자로부터 또는 복수의 사용자들로부터 수신할 수 있다.
본 시스템은 표지된 생체분자, 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 및 반응성 링커에 대한 저장 식별자를 포함하는 하나 이상의 데이터세트를 저장하기 위한 메모리를 포함한다. 시스템은 또한 표지된 생체분자 시약 요청의 구성요소(예를 들어, 생체분자 요청, 표지 요청, 표지된 생체분자 요청 등)에 상응하는 하나 이상의 데이터세트들로부터 저장 식별자를 식별하는 메모리에 통신가능하게 커플링된 프로세싱 모듈을 포함한다. 일부 구현예에서, 출력 관리자는 식별된 저장 식별자를 예컨대 전자 디스플레이 상에 디스플레이하기 위해, 또는 저장 식별자를 프린터로 인쇄함으로써 통신 구성요소에 작동적으로 커플링된다.
일부 구현예에서, 관심 대상의 시스템은 표지된 생체분자 시약을 제조하기 위해 출력 관리자와 작동적으로 통신하는 시약 제조 디바이스를 추가로 포함한다. 시약 제조 관리자는 출력 관리자로부터 식별된 저장 식별자를 수신하고 표지된 생체분자 시약 요청에 상응하는 표지된 생체분자 시약을 생성하도록 구성된다.
구현예에서, 시약 제조 디바이스는, 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지를 접촉 디바이스에 제공하기 위하여, 복수의 활성화된 생체분자들, 복수의 활성화된 표지들 및 샘플링 디바이스를 포함한다. 일부 구현예에서, 시약 제조 디바이스는 예컨대 고체 상 액체 크로마토그래피에 의해, 생성된 표지된 생체분자 시약을 특성화, 조제 또는 정제에 사용될 수 있는 시약 분석기를 포함한다.
생체분자는 폴리펩티드, 핵산 또는 폴리사카라이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 생체분자는 핵산, 예컨대 올리고뉴클레오티드, DNA 또는 RNA이다. 다른 구현예에서, 생체분자는 폴리펩티드, 예컨대 단백질, 효소 또는 항체이다. 표지는 형광단, 발색단, 효소, 효소 기질, 촉매, 화학발광 기질, 전기-화학발광 기질, 산화환원 표지, 라디오 표지, 음향 표지, 라만(SERS) 태그, 질량 태그, 동위원소 태그(예를 들어, 동위원소적으로 순수한 희토류 성분), 자석 입자, 마이크로입자, 나노입자, 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
표지된 생체분자 시약은 활성화된 생체분자를 활성화된 표지와 커플링함으로써 제조된다. 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지는 각각 반응성 링커를 포함한다. 구현예에서, 반응성 링커는 반응하여 활성화된 생체분자와 활성화된 링커 사이의 화학적 연결을 형성한다.
본 개시 내용의 양태는 또한 표지된 생체분자 시약의 제조 방법을 포함한다. 일부 구현예에 따른 방법은 표지된 생체분자 시약에 대한 요청을 수신하는 단계, 표지된 생체분자 시약 요청의 구성요소에 상응하는 저장 식별자를 식별하는 단계(예를 들어, 생체분자 요청 및 표지 요청에 상응하는 저장 식별자) 및 하나 이상의 식별된 저장 식별자를 출력하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 식별된 생체분자 저장 식별자 및 표지 저장 식별자는 전자 디스플레이 상에 출력되거나 프린터로 인쇄된다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약에 대한 복수의 요청들은 예컨대 단일 사용자 또는 복수의 사용자들로부터 수신된다. 일부 경우에서, 표지된 생체분자 시약에 대한 요청은 복수의 생체분자 요청들 및 복수의 표지 요청들을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약에 대한 요청은 복수의 생체분자 요청들 및 단일 표지 요청을 포함할 수 있다. 또 다른 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약에 대한 요청은 단일 생체분자 요청 및 복수의 표지 요청들을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표지 요청은 효소 요청 및 기질 요청을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 활성화된 생체분자를 활성화된 표지와 접촉시켜 표지된 생체분자 시약을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지는 시약 제조 디바이스 내에서 접촉된다. 일부 경우에서, 표지된 생체분자 시약은 추가로 정제된다. 제조 후, 표지된 생체분자 시약은 포장되고 먼 장소로 운송될 수 있다.
본 개시 내용의 양태는 또한 표지된 생체분자 시약을 요청하고 수신하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에 따른 방법은 표지된 생체분자 시약에 대한 요청을 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 대상 시스템 중 하나에) 통신하는 단계 및 표지에 공유결합된 생체분자를 포함하는 표지된 생체분자 시약을 수신하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약에 대한 요청을 통신하는 단계는 사용자 그래픽 인터페이스, 예컨대 인터넷 웹사이트 상의 웹사이트 메뉴 인터페이스 내로 생체 분자 요청 및 표지 요청을 입력하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약에 대한 요청을 통신하는 단계는 복수의 생체분자 요청들 및 복수의 표지 요청들을 입력하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 표지 요청은 효소 요청 및 기질 요청을 포함한다. 다른 구현예에서, 표지된 생체분자 시약에 대한 요청을 통신하는 단계는 단일 생체분자 요청 및 복수의 표지 요청들을 입력하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표지된 생체분자 시약에 대한 요청을 통신하는 단계는 복수의 생체분자 요청들을 입력하고 단일 표지 요청을 입력하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표지된 생체분자 시약에 대한 요청을 통신하는 단계는 표지된 생체분자 요청을 입력하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 생체분자는 폴리펩티드, 핵산, 폴리사카라이드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 핵산은 올리고뉴클레오티드, DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리펩티드는 단백질, 효소 또는 단백질 결합 시약일 수 있다. 단백질 결합 시약은 항체, 압타머, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 표지와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 복수의 단백질 표적들은 예를 들어, 10 내지 400 개의 상이한 단백질 표적을 포함할 수 있다. 생체분자는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 생체분자로부터 선택될 수 있다. 표지된 생체분자 시약를 수신하는 단계는 표지에 공유결합된 표지된 생체분자 및 표지에 공유결합되지 않은 제2 생체분자를 수신하는 단계를 포함할 수 있다. 표지된 생체분자와 제2 생체분자는 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 표지는 형광단, 발색단, 폴리펩티드, 단백질, 효소, 효소 기질, 촉매, 산화환원 표지, 방사성표지, 음향 표지, 라만(SERS) 태그, 질량 태그, 동위원소 태그, 자석 입자, 마이크로입자, 나노입자, 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 표지는 효소, 효소 기질, 또는 이들의 조합을 포함하며, 효소는 효소 기질을 상응하는 변경된 효소 기질로 변경시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 효소 기질은 적어도 하나의 작용기에 의해 상응하는 변경된 효소 기질과 상이하다. 적어도 하나의 작용기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 페닐, 벤질, 할로, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 히드록실, 카르보닐, 알데히드, 할로포르밀, 카르보네이트 에스테르, 카르복실레이트, 카르복실, 에스테르, 메톡시, 히드로퍼옥시, 퍼옥시, 에테르, 헤미아세탈, 헤미케탈, 아세탈, 케탈, 아세탈, 오르토에스테르, 메틸렌디옥시, 오르토카르보네이트 에스테르, 카르복사미드, 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 4° 암모늄, 1차 케타민, 2차 케타민, 1차 알드이민, 2차 알드이민, 이미드, 아지드, 아조, 디이미드, 시아네이트, 이소시아네이트, 니트레이트, 니트릴, 이소니트릴, 니트로소옥시, 니트로, 니트로소, 피리딜, 설프히드릴, 설피드, 디설피드, 설피닐, 설포닐, 설피노, 설포, 티오시아네이트, 이소티오시아네이트, 카르보노티온, 카르보노티알, 포스피노, 포스포노, 포스페이트, 포스포디에스테르, 보로노, 보로네이트, 보리노, 보리네이트, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 효소는 메틸트랜스퍼라제, 글리코시드 히드롤라제, 아가라제, 아미니다제, 아밀라제, 바이오시다제, 카라기나제, 셀룰라제, 세라미다제, 키티나제, 키토사나제, 시트리나제, 덱스트라나제, 덱스트리나제, 프룩토시다제, 푸코이다나제, 푸코시다제, 푸라노시다제, 갈락토시다제, 갈락투로나제, 글루카나제, 글루코시다제, 글루쿠로니다제, 글루쿠로노시다제, 글리코히드롤라제, 글리코시다제, 헥사오시다제, 히드롤라제, 이두로니다제, 이노시다제, 이눌리나제, 락타제, 레바나제, 리케니나제, 리가제, 리아제, 리소자임, 말토시다제, 말토트리오시다제, 만노비오시다제, 만노시다제, 무라미다제, 옥툴로소나제, 옥툴로소니다제, 프리메베로시다제, 프로테아제, 풀룰라나제, 람노시다제, 사미니다제, 시알리다제, 신타제, 트랜스퍼라제, 트레할라제, 투로니다제, 투로노시다제, 자일라나제, 자일로시다제, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 효소 기질은 6-메르캅토푸린, 셀로비오스, 셀로테트라오스, 자일로테트라오스, 이소프리메베로스, β-D-젠티오비오스, 자일로글루칸 및 만노트리오스, 아가로스, 아미닉산, 전분, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 셀룰로스, 세라마이드, 키틴, 키토산, 덱스트로스, 덱스트린, 프룩토스, 푸코이단, 푸코스, 푸라노시드, 갈락토시드, 글루칸, 글루코피라노시드, 글루코시드, 글루쿠론산, 글루쿠로노시드, 글리코스, 글리코시드, 글리코사미노글리칸, 헥사오시드, 이눌린, 락토스, 레바노스, 리포폴리사카라이드, 만노스, 말토시드, 말토트리오시드, 만노스, 옥툴로소네이트, 올리고사카라이드, 펙테이트, 펙틴, 펩티드, 폴리갈락투로니드, 폴리뉴클레오티드, 풀룰란, 람노시드, 자일란, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 생체분자에 대한 고유 식별자를 포함한다. 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택될 수 있다. 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 10, 100, 또는 1,000 개의 상이한 바코드 서열로부터 선택된 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 생체분자에 컨쥬게이트된다. 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 생체분자에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
고유 식별자는 샘플의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 샘플은 단일 세포, 복수의 세포들, 조직, 종양 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 샘플은 포유동물 샘플, 세균 샘플, 바이러스 샘플, 효모 샘플, 균류 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 폴리(A) 테일, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
도 1은 비제한적인 예시적인 추계적 바코드를 도시한다.
도 2는 추계적 바코딩 및 디지털 계수의 비제한적인 예시적인 작업 흐름을 보여준다.
도 3은 복수의 표적들로부터 추계적으로 바코딩된 표적의 색인 라이브러리를 생성하기 위한 비제한적인 예시적인 과정을 보여주는 개략도이다.
도 4는 단백질 결합 시약에 대한 고유 식별자를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 예시적인 단백질 결합 시약(본 명세서에 예시된 항체)의 개략도를 보여준다.
도 5는 단백질 발현 및 유전자 발현을 동시에 고 처리량(throughput) 방식으로 측정하기 위해 올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트된 항체를 이용하는 예시적인 작업 흐름의 개략도를 보여준다.
도 6a 내지 도 6e는 올리고뉴클레오티드로 작용화된 입자들의 비제한적인 예시적인 개략도를 보여준다.
도 7은 단일 세포 서열화 제어를 위한 올리고뉴클레오티드로 작용화된 입자 이용의 예시적인 작업 흐름의 개략도를 보여준다.
도 8은 단일 세포 서열화 제어를 위한 올리고뉴클레오티드로 작용화된 입자 이용의 또 다른 예시적인 또 다른 작업 흐름의 개략도를 보여준다.
도 9는 단일 세포 서열화 효율을 결정하기 위해 제어 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체를 이용하는 예시적인 작업 흐름의 개략도를 보여준다.
도 10은 단일 세포 서열화 효율을 결정하기 위해 제어 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체를 이용하는 예시적인 작업 흐름의 또 다른 개략도를 보여준다.
도 11a 내지 도 11c는 제어 올리고뉴클레오티드가 세포 계수에 사용될 수 있음을 보여주는 플롯이다.
도 12는 일 구현예에 따른 실험실 및 임상 분석을 위한 표지된 생체분자 시약 조성물을 제공하는 데 사용되는 표지된 생체분자 시약의 제조 단계를 도시한다.
도 13은 본 발명의 구현예에 따른 방법의 예시를 제공한다.
도 14는 온-디맨드(on-demand)로 주문제작가능한(customizable) 표지된 생체분자 시약을 제공하기 위한 본 발명의 개시 내용의 방법을 도시한다.
도 15는 본 발명의 일부 구현예에 따른 표지된 생체분자 시약에 대한 요청을 통신하기 위한 사용자 그래픽 인터페이스를 나타낸다.
도 16은 본 발명의 일부 구현예에 따른 본 개시 내용의 컴퓨터 시스템을 나타낸다.
도 17은 본 발명의 일부 구현예에 따른 표지된 생체분자 시약에 대한 요청을 수신, 프로세싱 및 출력하기 위한 흐름도를 도시한다.
도 18의 패널 (a) 내지 (d)는 단백질 발현 및 유전자 발현을 동시에 결정하기 위한 올리고뉴클레오티드의 비제한적인 예시적인 설계를 보여준다.
도 19는 단백질 발현 및 유전자 발현을 동시에 결정하기 위한 비제한적인 예시적인 올리고뉴클레오티드 서열의 개략도를 보여준다.
도 20의 패널 (a) 내지 (f)는 CD4 단백질 발현 및 유전자 발현을 동시에 고 처리량 방식으로 측정하기 위한 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체 이용의 결과를 보여주는 비제한적인 예시적인 tSNE 투사 플롯이다.
도 21의 패널 (a) 내지 (f)는 CD4 T 세포, CD8 T 세포, 및 골수 세포 내 CD4 mRNA 및 단백질의 발현을 보여주는 비제한적인 예시적인 막대 차트이다.
도 22는, 유사한 서열화 깊이로, CD4 단백질 수준에 대한 검출 감도가 항체:올리고뉴클레오티드의 더 높은 비율에 따라 증가하며, 1:3의 비율이 1:1 및 1:2의 비율보다 더 양호하게 수행됨을 보여주는 비제한적인 예시적인 막대 차트이다.
도 23의 패널 (a) 내지 (d)는 유세포 분석을 이용하여 분류된 세포의 세포 표면 상에서의 CD4 단백질 발현을 보여주는 플롯이다.
도 24의 패널 (a) 내지 (f)는 2 개의 샘플의 CD4 T 세포, CD8 T 세포, 및 골수 세포에서 CD4 mRNA 및 단백질의 발현을 보여주는 비제한적인 예시적인 막대 차트이다.
도 25는 1:3의 항체:올리고뉴클레오티드 비율을 갖는 상이한 샘플 제조 프로토콜을 이용하여 결정된 CD4 단백질 수준에 대한 검출 감도를 보여주는 비제한적인 예시적인 막대 차트이다.
도 26a 내지 도 26c는 희석 적정을 이용하여 항체 스톡의 최적 희석의 결정을 보여주는 비제한적인 예시적인 플롯이다.
도 27은 항체 올리고뉴클레오티드가 서열화 데이터에서 총 판독의 바람직한 백분율을 차지하도록 하는 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체의 염색 농도를 결정하기 위한 비제한적인 예시적인 실험 설계를 보여준다.
도 28의 패널 (a) 내지 (d)는 항체 올리고뉴클레오티드의 예측된 크기와 일치하는 피크(화살표로 표시됨)를 보여주는 비제한적인 예시적인 생체분석기 트레이스이다.
도 29의 패널 (a) 내지 (f)는 상이한 항체 희석 및 항체 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 항체 분자("고온 항체")의 상이한 백분율로 염색된 샘플에 대해 검출된 항체 올리고뉴클레오티드의 분자 수를 보여주는 비제한적인 예시적인 히스토그램이다.
도 30a 내지 도 30c는 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항-CD147 항체 분자가 다양한 세포 유형을 표지하는 데 사용될 수 있음을 보여주는 비제한적인 예시적인 플롯이다. 세포 유형은 혈액 패널 내 488 개의 유전자의 발현 프로파일을 이용하여 결정되었다(도 30a). 세포는 1:100 희석된 스톡을 이용하여 제조된 10% 고온 항체:90% 저온 항체의 혼합물로 염색되었으며, 이는 검출된 항체 올리고뉴클레오티드의 분자의 수를 보여주는 히스토그램에서 명확한 신호를 생성한다(도 30b). 항체 올리고뉴클레오티드에 의한 다양한 세포 유형의 표지는 도 30c에 나타낸다.
도 31a 내지 도 31c는 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항-CD147 항체가 다양한 세포 유형을 표지하는 데 사용될 수 있음을 보여주는 비제한적인 예시적인 플롯이다. 세포 유형은 혈액 패널 내 488 개 유전자의 발현 프로파일을 이용하여 결정되었다(도 31a). 세포는 1:100의 희석된 스톡을 이용하여 제조된 1% 고온 항체:99% 저온 항체의 혼합물로 염색되었으며, 이는 검출된 항체 올리고뉴클레오티드의 분자 수를 보여주는 히스토그램에서 명확한 신호가 없도록 한다(도 31b). 항체 올리고뉴클레오티드에 의한 다양한 세포 유형의 표지는 도 31c에 나타낸다.
도 32a 내지 도 32c는 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항-CD147 항체 분자가 다양한 세포 유형을 표지하는 데 사용될 수 있음을 보여주는 비제한적인 예시적인 플롯이다. 세포 유형은 혈액 패널 내 488 개 유전자의 발현 프로파일을 이용하여 결정되었다(도 32a). 세포는 1:800 희석된 스톡으로 염색되었으며, 이는 검출된 항체 올리고뉴클레오티드의 분자의 수를 보여주는 히스토그램에서 명확한 신호를 생성한다(도 32b). 항체 올리고뉴클레오티드에 의한 다양한 세포 유형의 표지를 도 32c에 나타낸다.
도 33a 및 도 33b는 염색 버퍼 내 제어 입자 올리고뉴클레오티드 및 도 7에 예시된 작업흐름을 이용하여 검출된 제어 입자와 연결된 제어 입자 올리고뉴클레오티드의 조성을 보여주는 플롯이다.
도 34a 및 도 34b는 혈구계(hemocytometer)에서의 세포(도 34a, 백색 원) 및 제어 입자(도 34b, 흑색 원)의 명 시야상(bright-field images)이다.
도 35a 및 도 35b는 형광단에 연결된 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체에 결합된 제어 입자의 위상차(도 35a, 10X) 및 형광(도 35b, 10X) 이미지이다.
도 36은 카트리지의 마이크로웰 내로 로딩되는 세포 및 제어 입자를 보여주는 이미지이다.
하기 상세한 설명에서, 본 명세서의 일부를 이루는 첨부 도면을 참조한다. 도면에서, 문맥에서 달리 지시되지 않는 한, 유사한 부호는 통상적으로 유사한 구성요소를 나타낸다. 발명의 상세한 설명, 도면 및 청구범위에서 설명된 예시적인 구현예는 제한을 의미하지 않는다. 본 명세서에 제시된 주제의 사상 또는 범주를 벗어나지 않으면서 다른 구현예가 사용될 수 있고, 다른 변화들이 이루어질 수 있다. 본 발명의 개시 내용의 양태는, 본 명세서에 일반적으로 설명되고, 도면에 예시된 바와 같이, 광범위한 다양한 상이한 구성으로 배열, 치환, 조합, 구분 및 설계될 수 있으며, 이들 모두는 본 명세서에서 명시적으로 고려되고, 본 명세서의 개시 내용의 일부를 형성함이 쉽게 이해될 것이다.
모든 특허, 공개된 특허 출원, 기타 간행물, 및 GenBank로부터의 서열, 및 본 명세서에서 언급된 기타 데이터베이스는 관련 기술에 대하여 그 전체로 참고로 포함된다.
적은 수의 핵산, 예를 들어, 메신저 리보핵산(mRNA) 분자를 정량하는 것은 예를 들어, 개발의 상이한 단계에서 또는 상이한 환경 조건 하에서 세포 내에서 발현되는 유전자를 결정하는 데 임상적으로 중요하다. 그러나, 특히 분자의 수가 매우 적을 경우, 핵산 분자(예를 들어, mRNA 분자)의 절대 수를 결정하는 것 또한 매우 어려운 도전이 될 수 있다. 샘플 내 분자의 절대 수를 결정하는 하나의 방법은 디지털 중합효소 연쇄 반응(PCR)이다. 이상적으로, PCR은 각각의 사이클에서 분자의 동일한 복제물을 생성한다. 그러나, PCR은 각각의 분자가 추계적 확률로 복제되고, 이러한 확률은 PCR 사이클 및 유전자 서열에 의해 변화되어, 증폭 편향 및 부정확한 유전자 발현 측정을 초래하게 하는 단점을 가질 수 있다. 고유 분자 표지를 갖는 추계적 바코드(분자 인덱스(MI)로도 지칭됨)는 분자 수의 계수와 증폭 편향에 대한 보정에 사용될 수 있다. 추계적 바코딩, 예컨대 PreciseTM 분석(Cellular Research, Inc.(Palo Alto, CA))은 역전사(RT) 동안 mRNA를 표지하기 위해 분자 표지(ML)를 사용함으로써, PCR 및 라이브러리 제조 단계에 의해 유도된 편향을 보정할 수 있다.
PreciseTM 분석은 큰 수, 예를 들어, 6561 내지 65536를 갖는 추계적 바코드의 비-고갈 풀(non-depleting pool)인, 폴리(T) 올리고뉴클레오티드 상에서 고유 분자 표지를 이용하여 RT 단계 동안 샘플에서 모든 폴리(A)-mRNA에 혼성화한다. 추계적 바코드는 범용 PCR 프라이밍 부위를 포함할 수 있다. RT 동안, 표적 유전자 분자는 추계적 바코드와 랜덤으로 반응한다. 각각의 표적 분자는 추계적 바코드에 혼성화되어 추계적으로 바코딩된 상보적 리보핵산(cDNA) 분자를 생성할 수 있다. 표지 후, 마이크로웰 플레이트의 마이크로웰들로부터의 추계적으로 바코딩된 cDNA 분자는 PCR 증폭 및 서열화를 위해 단일 튜브 내로 모아둘 수 있다. 미가공 서열화 데이터를 분석하여 판독 수, 고유 분자 표지를 갖는 추계적 바코드의 수, 및 mRNA 분자의 수를 산출할 수 있다.
단일 세포의 mRNA 발현 프로파일 결정 방법은 초병렬 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, PreciseTM 분석을 사용하여 동시에 10,000 개 초과의 세포의 mRNA 발현 프로파일을 결정할 수 있다. 샘플 당 분석을 위한 단일 세포의 수(예를 들어, 100 개 또는 1,000 개의 단일 세포들)는 현재의 단일 세포 기술의 용량보다 더 낮을 수 있다. 상이한 샘플들로부터 세포를 풀링(pooling)하는 것은 현재의 단일 기술의 용량의 활용을 개선하여, 낭비되는 시약과 단일 세포 분석 비용을 절감할 수 있다. 상이한 샘플들로부터 세포를 풀링하는 것은 상이한 샘플들의 세포의 cDNA 라이브러리를 제조할 때의 변형을 최소화하여, 상이한 샘플들을 더 정확하게 비교할 수 있게 한다.
본 명세서에 개시된 일부 구현예는 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약을 각각 포함하는 복수의 조성물들을 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 그와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약에 대한 고유 식별자를 포함하고, 단백질 결합 시약은 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 1,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 복수의 항체들, 복수의 압타머들, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 100 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 100 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 1,000 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 10,000 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 10,000 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 단백질 결합 시약은 적어도 10 개의 상이한 바코드 서열의 세트로부터 선택된 적어도 하나의 바코드 서열(예를 들어, 하나의 분자 표지 서열)을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, 각각의 단백질 결합 시약은 적어도 100 개의 상이한 바코드 서열의 세트로부터 선택된 적어도 하나의 바코드 서열을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, 각각의 단백질 결합 시약은 적어도 1,000 개의 상이한 바코드 서열의 세트로부터 선택된 적어도 하나의 바코드 서열을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 복수의 단백질 표적들에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 10 내지 400 개의 상이한 단백질 표적을 포함한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 용어는 본 개시 내용이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 바와 같은, 단수 형태("a", "an", 및 "the")는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수를 포함한다. 본 명세서에서 "또는"에 대한 임의의 언급은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 포함하고자 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "어댑터"는 연결된 핵산의 증폭 또는 서열화를 용이하게 하는 서열을 의미할 수 있다. 연결된 핵산은 표적 핵산을 포함할 수 있다. 연결된 핵산은 공간 표지, 표적 표지, 샘플 표지, 색인 표지, 또는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 어댑터는 선형일 수 있다. 어댑터는 사전-아데닐화된 어댑터일 수 있다. 어댑터는 이중-가닥 또는 단일가닥일 수 있다. 하나 이상의 어댑터는 핵산의 5' 또는 3' 말단 상에 위치할 수 있다. 어댑터는 5' 및 3' 말단 상에 공지된 서열을 포함하고, 공지된 서열은 동일하거나 상이한 서열일 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 5' 및/또는 3' 말단 상에 위치한 어댑터는 표면 상에 고정된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드에 혼성화될 수 있다. 어댑터는 일부 구현예에서, 범용 서열을 포함한다. 범용 서열은 둘 이상의 핵산 분자에 공통적인 뉴클레오티드 서열의 영역일 수 있다. 둘 이상의 핵산 분자는 또한 상이한 서열의 영역들을 가질 수 있다. 따라서, 예를 들어, 5' 어댑터는 동일한 핵산 서열 및/또는 범용 핵산 서열을 포함할 수 있고, 3' 어댑터는 동일한 서열 및/또는 범용 서열을 포함할 수 있다. 복수의 핵산 분자들의 상이한 멤버에 존재할 수 있는 범용 서열은, 범용 서열에 상보적인 단일 범용 프라이머를 이용하여 다수의 상이한 서열을 복제하거나 증폭시킬 수 있게 할 수 있다. 유사하게, 핵산 분자의 컬렉션의 상이한 멤버에 존재할 수 있는 적어도 하나, 둘(예를 들어, 한 쌍), 또는 그 이상의 범용 서열은, 범용 서열에 상보적인 적어도 하나, 둘(예를 들어, 한 쌍), 또는 그 이상의 단일 범용 프라이머를 이용하여, 다수의 상이한 서열을 복제하거나 증폭시킬 수 있게 할 수 있다. 따라서, 범용 프라이머는 그러한 범용 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 표적 핵산 서열-함유 분자는 범용 어댑터(예를 들어, 비-표적 핵산 서열)를 상이한 표적 핵산 서열의 한쪽 또는 양쪽 말단에 부착하도록 변형될 수 있다. 표적 핵산에 부착된 하나 이상의 범용 프라이머는 범용 프라이머의 혼성화를 위한 부위를 제공할 수 있다. 표적 핵산에 부착된 하나 이상의 범용 프라이머는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 항체는 전장의(full-length)(예를 들어, 자연적으로 발생하거나 정상의 면역글로불린 유전자 단편 재조합 과정에 의해 형성됨), 면역글로불린 분자(예를 들어, IgG 항체) 또는 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인(즉, 특이적으로 결합하는) 부분, 예컨대 항체 단편일 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 기능적 항체 단편이다. 예를 들어, 항체 단편은 항체 예컨대 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, sFv 등의 일부일 수 있다. 항체 단편은 전장 항체에 의해 인식된 동일한 항원과 결합할 수 있다. 항체 단편은 항체의 가변 영역, 예컨대 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 이루어진 "Fv" 단편, 및 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일 사슬 폴리펩티드 분자로 이루어지는 분리된 단편을 포함할 수 있다("scFv 단백질"). 예시적인 항체는 암세포에 대한 항체, 바이러스에 대한 항체, 세포 표면 수용체(예를 들어, CD8, CD34, 및 CD45)에 결합하는 항체, 및 치료제 항체를 포함할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "연결된" 또는 "와 연결된"은 둘 이상의 종이 일정 시점에서 공동-배치된 것으로 식별됨을 의미할 수 있다. 연결은 둘 이상의 종이 유사한 용기 내에 존재하거나 존재하였음을 의미할 수 있다. 연결은 예를 들어, 둘 이상의 종과 관련되는 디지털 정보가 저장되고, 하나 이상의 종이 일정 시점에 공동 배치되었음을 결정하는 데 사용될 수 있는 정보적 연결일 수 있다. 연결은 물리적 연결일 수도 있다. 일부 예에서, 둘 이상의 연결된 종은 서로 또는 공통 고체 또는 반고체 표면에 "묶이거나(tethered)", "부착되거나", "고정된다". 연결은 표지를 고체 또는 반-고체 지지체, 예컨대 비드(bead)에 부착시키기 위한 공유결합 또는 비-공유결합 수단을 지칭할 수 있다. 연결은 표적과 표지 사이의 혼성화를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "상보적인"은 2 개의 뉴클레오티드 사이의 정확한 페어링(pairing)을 위한 용량을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 핵산의 소정의 위치에서의 뉴클레오티드가 또 다른 핵산의 뉴클레오티드와 수소 결합할 수 있는 경우, 2 개의 핵산은 그 위치에서 서로 상보적인 것으로 여겨진다. 2 개의 단일가닥 핵산 분자 사이의 상보성은 단지 일부의 뉴클레오티드가 결합하는 "부분적"일 수 있거나, 단일가닥 분자 사이에 완전한 상보성이 존재할 때 완료될 수 있다. 제1 뉴클레오티드 서열은, 제1 뉴클레오티드 서열이 제2 뉴클레오티드 서열에 상보적인 경우 제2 서열의 "보체"라고 말할 수 있다. 제1 뉴클레오티드 서열은, 제1 뉴클레오티드 서열이 제2 서열의 역(즉, 뉴클레오티드의 순서가 역전됨)인 서열에 대해 상보적인 경우, 제2 서열의 "역보체"라고 말할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "보체", "상보성", 및 "역보체"는 상호변경가능하게 사용될 수 있다. 분자가 또 다른 분자에 혼성화될 수 있는 경우, 분자는 혼성화하는 분자의 보체일 수 있음이 본 개시 내용으로부터 이해된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "디지털 계수"는 샘플 내 다수의 표적 분자를 추산하는 방법을 지칭할 수 있다. 디지털 계수는 샘플 내 표적과 연결된 다수의 고유 표지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 추계적 방법론은, 미리 정의된 표지들의 세트의 검출과 관련하여 분자를 계수하는 문제를 동일한 분자의 배치 및 식별 중 하나로부터 일련의 예/아니오의 디지털 질문으로 변환시킨다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "표지" 또는 "표지들"은 샘플 내에서 표적과 연결된 핵산 코드를 지칭할 수 있다. 표지는 예를 들어, 핵산 표지일 수 있다. 표지는 전체적으로 또는 부분적으로 증폭 가능한 표지일 수 있다. 표지는 전체적으로 또는 부분적으로 서열화 가능한 표지일 수 있다. 표지는 별개의 것으로 식별될 수 있는 천연 핵산의 일부일 수 있다. 표지는 알려진 서열일 수 있다. 표지는 핵산 서열들의 접합, 예를 들어, 천연 및 비-천연 서열의 접합을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "표지(label)"는 용어 "인덱스", "태그" 또는 "표지-태그"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 표지는 정보를 통신할 수 있다. 예를 들어, 다양한 구현예에서, 표지는 샘플의 신원, 샘플의 소스, 세포의 신원, 및/또는 표적을 결정하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "비-고갈 저장소"는 많은 상이한 표지로 이루어진 바코드들(예를 들어, 추계적 바코드)의 풀을 지칭할 수 있다. 비-고갈 저장소는 많은 수의 상이한 추계적 바코드를 포함할 수 있으므로, 비-고갈 저장소가 표적들의 풀과 연결되는 경우 각각의 표적은 고유 추계적 바코드와 연결될 수 있다. 각각의 표지된 표적 분자의 고유성은 랜덤 선택의 통계에 의해 결정될 수 있으며, 표지의 다양성에 비해 컬렉션 내 동일한 표적 분자의 복제물의 수에 따라 달라진다. 표지된 표적 분자의 결과 세트의 크기는 바코딩 과정의 추계적 특성에 의해 결정될 수 있고, 이어서 검출된 추계적 바코드의 수를 분석함으로써 원래의 컬렉션 또는 샘플 내에 존재하는 표적 분자의 수를 계산할 수 있다. 고유 추계적 바코드의 수에 대해 존재하는 표적 분자의 복제물의 수의 비가 낮으면, 표지된 표적 분자는 매우 고유하다(즉, 하나 초과의 표적 분자가 소정의 표지로 표지될 가능성이 매우 낮음).
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편을 지칭한다. 핵산은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 핵산은 세포에 대해 외인성이거나 내인성일 수 있다. 핵산은 무세포(cell-free) 환경에서 존재할 수 있다. 핵산은 유전자 또는 그의 단편일 수 있다. 핵산은 DNA일 수 있다. 핵산은 RNA일 수 있다. 핵산은 하나 이상의 유사체(예를 들어, 변경된 주쇄, 당, 또는 핵염기)를 포함할 수 있다. 유사체의 일부 비제한적 예는: 5-브로모우라실, 펩티드 핵산, 이종(xeno) 핵산, 모르폴리노, 고정(locked) 핵산, 글리콜 핵산, 트레오스 핵산, 디데옥시뉴클레오티드, 코르디세핀(cordycepin), 7-데아자-GTP, 형광단(예를 들어, 당에 연결된 로다민 또는 플루오레세인), 뉴클레오티드를 함유하는 티올, 비오틴 연결된 뉴클레오티드, 형광 염기 유사체, CpG 섬(island), 메틸-7-구아노신, 메틸화 뉴클레오티드, 이노신, 티오우리딘, 의사우리딘, 디하이드로우리딘, 큐에오신(queuosine), 및 와이오신(wyosine)을 포함한다. "핵산", "폴리뉴클레오티드", "표적 폴리뉴클레오티드", 및 "표적 핵산"은 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
핵산은 신규하거나 향상된 특성(예를 들어, 개선된 안정성)을 핵산에 제공하기 위해 하나 이상의 변경(예를 들어, 염기 변경, 주쇄 변경)을 포함할 수 있다. 핵산은 핵산 친화성 태그를 포함할 수 있다. 뉴클레오시드는 염기-당 조합일 수 있다. 뉴클레오시드의 염기 부분은 헤테로시클릭 염기일 수 있다. 그러한 헤테로시클릭 염기의 가장 일반적인 2 가지 부류는 퓨린 및 피리미딘이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유결합된 포스페이트 기를 추가로 포함하는 뉴클레오시드일 수 있다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 뉴클레오시드의 경우, 포스페이트 기는 당의 2', 3', 또는 5' 히드록실 모이어티에 연결될 수 있다. 핵산 형성에 있어서, 포스페이트 기는 인접 뉴클레오시드들을 서로 공유결합시켜 선형 중합체 화합물을 형성할 수 있다. 결국, 이러한 선형 중합체 화합물의 개별적인 말단은 추가로 결합되어 원형 화합물을 형성할 수 있지만; 선형 화합물이 일반적으로 적합하다. 또한, 선형 화합물은 내부 뉴클레오티드 염기 상보성을 가질 수 있고, 따라서 완전히 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물을 생성하는 방식으로 접힐 수 있다. 핵산 내에서, 포스페이트 기는 일반적으로 핵산의 뉴클레오시드간 주쇄를 형성하는 것으로 언급될 수 있다. 결합 또는 주쇄는 3' 내지 5' 포스포디에스테르 결합일 수 있다.
핵산은 변경된 주쇄 및/또는 변경된 뉴클레오시드간 결합을 포함할 수 있다. 변경된 주쇄는 주쇄에 인 원자를 보유하는 주쇄와 주쇄에 인 원자를 갖지 않는 주쇄를 포함할 수 있다. 그 안에 인 원자를 함유하는 적합한 변경된 핵산 주쇄는 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬 포스포트리에스테르, 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 예컨대 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트, 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노포스포아미데이트 및 아미노알킬 포스포아미데이트를 포함하는 포스포아미데이트, 포스포로디아미데이트, 티오노포스포아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트, 및 정상 3'-5' 결합을 갖는 보라노포스페이트, 2'-5' 결합된 유사체, 및 하나 이상의 뉴클레오티드간 결합이 3' 에서 3', 5' 에서 5' 또는 2' 에서 2' 결합인 역전된 극성을 갖는 것들을 포함할 수 있다.
핵산은 단쇄(short chain) 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 혼합된 헤테로원자와 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 결합에 의해 형성된 폴리뉴클레오티드 주쇄를 포함할 수 있다. 이들은 모르폴리노 결합(뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨); 실록산 주쇄; 설피드, 설폭시드 및 설폰 주쇄; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 리보아세틸 주쇄; 알켄 함유 주쇄; 설파메이트 주쇄; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 주쇄; 설포네이트 및 설폰아미드 주쇄; 아미드 주쇄를 갖는 것들; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 기타를 포함할 수 있다.
핵산은 핵산 모방체를 포함할 수 있다. 용어 "모방체"는 단지 푸라노스 고리 또는 푸라노스 고리와 뉴클레오티드간 결합 모두가 비-푸라노스 기로 치환된 폴리뉴클레오티드를 포함하고자 할 수 있고, 푸라노스 고리만의 치환은 또한 당 대체물인 것으로 지칭될 수 있다. 헤테로시클릭 염기 모이어티 또는 변경된 헤테로시클릭 염기 모이어티는 적절한 표적 핵산과의 혼성화를 위해 유지될 수 있다. 그러한 하나의 핵산은 펩티드 핵산(PNA)일 수 있다. PNA에서, 폴리뉴클레오티드의 당-주쇄는 아미드 함유 주쇄, 구체적으로 아미노에틸글리신 주쇄로 치환될 수 있다. 뉴클레오티드는 보유될 수 있고, 주쇄의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 주쇄는 PNA에 아미드 함유 주쇄를 부여하는 둘 이상의 연결된 아미노에틸글리신 단위를 포함할 수 있다. 헤테로시클릭 염기 모이어티는 주쇄의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다.
핵산은 모르폴리노 주쇄 구조를 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 리보스 고리 대신 6-원 모르폴리노 고리를 포함할 수 있다. 이들 일부 구현예에서, 포스포로디아미데이트 또는 기타 비-포스포디에스테르 뉴클레오시드간 결합은 포스포디에스테르 결합을 치환할 수 있다.
핵산은, 모르폴리노 고리에 부착된 헤테로시클릭 염기를 갖는 연결된 모르폴리노 단위(즉, 모르폴리노 핵산)를 포함할 수 있다. 연결 기는 모르폴리노 핵산에서 모르폴리노 단량체 단위를 연결할 수 있다. 비이온성 모르폴리노계 올리고머성 화합물은 세포 단백질과 바람직하지 않은 상호작용이 더 적을 수 있다. 모르폴리노계 폴리뉴클레오티드는 핵산의 비이온성 모방체일 수 있다. 모르폴리노 부류에 속하는 다양한 화합물은 상이한 연결 기를 이용하여 연결될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 모방체의 추가의 부류는 시클로헥세닐 핵산(CeNA)으로 지칭될 수 있다. 핵산 분자 중에 정상적으로 존재하는 푸라노스 고리는 시클로헥세닐 고리로 치환될 수 있다. CeNA DMT 보호된 포스포아미다이트 단량체는 제조되어, 포스포아미다이트 화학을 이용하여 올리고머성 화합물 합성에 사용될 수 있다. CeNA 단량체의 핵산 사슬 내로의 혼입은 DNA/RNA 혼성체의 안정성을 증가시킬 수 있다. CeNA 올리고아데닐레이트는 천연 복합체와 유사한 안정성을 갖는 핵산 보체와 복합체를 형성할 수 있다. 추가의 변경은 2'-히드록실 기가 당 고리의 4' 탄소 원자에 연결되어, 2'-C, 4'-C-옥시메틸렌 결합을 형성하여, 2시클릭 당 모이어티를 형성하는 고정 핵산(LNA)을 포함할 수 있다. 결합은 n이 1 또는 2이고, 2' 산소 원자와 4' 탄소 원자를 가교하는 기인, 메틸렌(-CH2)일 수 있다. LNA 및 LNA 유사체는 상보적 핵산과 함께 매우 높은 이중(duplex) 열 안정성(Tm=+3 내지 +10℃), 3'-엑소뉴클레오리틱(exonucleolytic) 분해에 대한 안정성 및 양호한 용해도 특성을 나타낼 수 있다.
핵산은 또한 핵염기(종종 간단히 "염기"로도 지칭됨) 변경 또는 치환을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "비변경된" 또는 "천연" 핵염기는 퓨린 염기, (예를 들어, 아데닌(A) 및 구아닌(G)), 및 피리미딘 염기, (예를 들어, 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U))을 포함할 수 있다. 변경된 핵염기는 다른 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 다른 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-메틸시토신(5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐(-C=C-CH3) 우라실 및 시토신과 피리미딘 염기의 기타 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(의사우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌과 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌과 3-데아자아데닌을 포함할 수 있다. 변경된 핵염기는 트리시클릭 피리미딘, 예컨대 페녹사진 시티딘(1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤즈옥사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프(clamp), 예컨대 치환된 페녹사진 시티딘(예를 들어, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도(5,4-(b)(1,4)벤즈옥사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예컨대 치환된 페녹사진 시티딘(예를 들어, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도(5,4-(b)(1,4)벤즈옥사진-2(3H)-온), 카르바졸 시티딘(2H-피리미도(4,5-b)인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘(H-피리도(3',':4,5)피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "샘플"은 표적을 포함하는 조성물을 지칭할 수 있다. 개시된 방법, 디바이스 및 시스템에 의한 분석에 적합한 샘플은 세포, 조직, 기관 또는 생물을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "샘플링 디바이스" 또는 "디바이스"는 샘플의 절단부를 취하고/취하거나 기재 상에서 그 절단부를 위치시킬 수 있는 디바이스를 지칭할 수 있다. 샘플 디바이스는 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류(FACS)기, 세포 분류기, 생검 바늘, 생검 디바이스, 조직 절단 디바이스, 마이크로유체 디바이스, 블레이드 그리드(blade grid), 및/또는 마이크로톰(microtome)을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "고체 지지체"는 복수의 바코드들(예를 들어, 추계적 바코드)이 부착될 수 있는 별개의 고체 또는 반고체 표면을 지칭할 수 있다. 고체 지지체는 핵산이 그 위에 (예를 들어, 공유결합으로 또는 비-공유결합으로) 고정될 수 있는 임의의 유형의 고체, 다공성, 또는 중공 구, 볼, 베어링, 실린더, 또는 플라스틱, 세라믹, 금속 또는 중합체성 재료(예를 들어, 하이드로겔)로 구성된 기타 유사한 구조물을 포함할 수 있다. 고체 지지체는 구형(예를 들어, 미소구체)일 수 있거나 비-구형 또는 불규칙한 형태, 예컨대 입방체, 직육면체, 피라미드형, 원통형, 원뿔형, 장타원형(oblong), 또는 원반형태 등을 가질 수 있는 별개의 입자를 포함할 수 있다. 비드는 비-구형 형태일 수 있다. 어레이 내에 이격된 복수의 고체 지지체들은 기재를 포함할 수 없다. 고체 지지체는 용어 "비드"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "추계적 바코드"는 본 개시 내용의 표지를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 추계적 바코드는 추계적 바코딩에 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 추계적 바코드는 샘플 내에서 표적을 정량화하는 데 사용될 수 있다. 추계적 바코드는 표지가 표적과 연결된 후 발생할 수 있는 오류의 제어에 사용될 수 있다. 예를 들어, 추계적 바코드는 증폭 또는 서열화 오류의 평가에 사용될 수 있다. 표적과 연결된 추계적 바코드는 추계적 바코드-표적 또는 추계적 바코드-태그-표적으로 칭할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "추계적 바코딩"은 핵산의 랜덤 표지(예를 들어, 바코딩)을 지칭한다. 추계적 바코딩은 순환 푸와송(recursive Poisson) 전략을 이용하여 표적과 연결된 표지를 연결하고 정량화할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "추계적 바코딩"은 "추계적 표지"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "표적"은 바코드(예를 들어, 추계적 바코드)와 연결될 수 있는 조성물을 지칭할 수 있다. 개시된 방법, 디바이스, 및 시스템에 의한 분석에 적합한 예시적인 표적은 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA, mRNA, 마이크로RNA, tRNA 등을 포함한다. 표적은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적은 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적은 지질이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "표적"은 "종"과 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
용어 "역전사효소"는 역전사효소 활성을 갖는 효소들의 군(즉, RNA 주형으로부터 DNA의 합성을 촉매작용함)을 지칭할 수 있다. 대체로, 그러한 효소는 레트로바이러스성 역전사효소, 레트로트랜스포존(retrotransposon) 역전사효소, 레트로플라스미드 역전사효소, 레트론 역전사효소, 세균성 역전사효소, II군 인트론-유도된 역전사효소, 및 이들의 돌연변이, 변이체 또는 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 비-레트로바이러스성 역전사효소는 비-LTR 레트로트랜스포존 역전사효소, 레트로플라스미드역전사효소, 레트론 역전사효소, 및 II군 인트론 역전사효소를 포함한다. II군 인트론 역전사효소의 예는 락토코커스 락티스(Lactococcs lactis) Ll.LtrB 인트론 역전사효소, 써모시네코코커스 일롱가투스(Thermosynechococcus elongatus) TeI4c 인트론 역전사효소, 또는 게오바실러스 스테아로테오모필러스(Geobacillus stearothermophilus) GsI-IIC 인트론 역전사효소를 포함한다. 기타 부류의 역전사효소는 많은 부류의 비-레트로바이러스성 역전사효소(즉, 특히 레트론, II군 인트론, 및 다양성-생성 레트로요소)를 포함할 수 있다.
용어 "범용 어댑터 프라이머", "범용 프라이머 어댑터" 또는 "범용 어댑터 서열"은 바코드(예를 들어, 추계적 바코드)에 혼성화하여 유전자-특이적 바코드의 생성에 사용될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭하는 데 상호교환가능하게 사용된다. 범용 어댑터 서열은 예를 들어, 본 개시 내용의 방법에서 사용된 모든 바코드에 걸쳐 보편적인 알려진 서열일 수 있다. 예를 들어, 다수의 표적이 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여 표지되는 경우, 표적-특이적 서열 각각은 동일한 범용 어댑터 서열에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 초과의 범용 어댑터 서열이 본 명세서에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 다수의 표적이 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여 표지되는 경우, 적어도 2 개의 표적-특이적 서열이 상이한 범용 어댑터 서열에 연결된다. 범용 어댑터 프라이머 및 그의 보체는 2 개의 올리고뉴클레오티드 내에 포함될 수 있으며, 그중 하나는 표적-특이적 서열을 포함하고, 나머지 하나는 바코드를 포함한다. 예를 들어, 범용 어댑터 서열은, 표적 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위한 표적-특이적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 일부일 수 있다. 범용 어댑터 서열의 바코드 및 상보성 서열을 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열과 혼성화되고 표적-특이적 바코드(예를 들어, 표적-특이적 추계적 바코드)를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 범용 어댑터 프라이머는 본 개시 내용의 방법에서 사용되는 범용 PCR 프라이머와 상이한 서열을 갖는다.
본 명세서에 개시된 일부 구현예는 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약을 각각 포함하는 복수의 조성물들을 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 그와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약에 대한 고유 식별자를 포함하고, 단백질 결합 시약은 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 1,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 복수의 항체들, 복수의 압타머들, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 100 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 100 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 1,000 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 10,000 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 적어도 10,000 개의 상이한 단백질 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 단백질 결합 시약은 적어도 10 개의 상이한 바코드 서열의 세트로부터 선택된 적어도 하나의 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, 각각의 단백질 결합 시약은 적어도 100 개의 상이한 바코드 서열의 세트로부터 선택된 적어도 하나의 바코드 서열을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, 각각의 단백질 결합 시약은 적어도 1,000 개의 상이한 바코드 서열의 세트로부터 선택된 적어도 하나의 바코드 서열을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, 복수의 조성물들은 복수의 단백질 표적들에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 10 내지 400 개의 상이한 단백질 표적을 포함한다.
바코드
바코딩, 예컨대 추계적 바코딩은, 예를 들어, US20150299784, WO2015031691, 및 문헌[Fu et al, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2011 May 31;108(22):9026-31]에 기재되어 있으며, 이들 간행물의 내용은 그 전체로 본 명세서에 포함된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바코드는 표적을 추계적으로 표지(예를 들어, 바코드, 태그)하는 데 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있는 추계적 바코드일 수 있다. 추계적 바코드의 상이한 바코드 서열의 수와, 표지되는 임의의 표적의 출현 수의 비가 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1 일 수 있거나, 대략 이들 비일 수 있거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있는 경우, 추계적 바코드로 지칭될 수 있다. 표적은 동일하거나 거의 동일한 서열을 갖는 mRNA 분자를 포함하는 mRNA 종일 수 있다. 바코드는 추계적 바코드의 상이한 바코드 서열의 수와 표지되는 임의의 표적의 출현 수의 비가 적어도, 또는 최대 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 또는 100:1인 경우 추계적 바코드로서 지칭될 수 있다. 추계적 바코드의 바코드 서열은 분자 표지로 지칭될 수 있다.
바코드, 예를 들어, 추계적 바코드는 하나 이상의 표지를 포함할 수 있다. 예시적인 표지는 범용 표지, 세포 표지, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지), 샘플 표지, 플레이트 표지, 공간 표지, 및/또는 전-공간(pre-spatial) 표지를 포함할 수 있다. 도 1은 공간 표지를 갖는 예시적인 바코드(104)를 예시한다. 바코드(104)는 고체 지지체(105)에 바코드를 연결할 수 있는 5' 아민을 포함할 수 있다. 바코드는 범용 표지, 차원(dimension) 표지, 공간 표지, 세포 표지 및/또는 분자 표지를 포함할 수 있다. 바코드에서 상이한 표지들(범용 표지, 치수 표지, 공간 표지, 세포 표지, 및 분자 표지를 포함하지만, 이에 제한되지 않음)의 순서는 변화될 수 있다. 예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같이, 범용 표지는 가장 5' 쪽(5'-most)의 표지일 수 있고, 분자 표지는 가장 3' 쪽(3'-most)의 표지일 수 있다. 공간 표지, 치수 표지, 및 세포 표지는 임의의 순서일 수 있다. 일부 구현예에서, 범용 표지, 공간 표지, 치수 표지, 세포 표지, 및 분자 표지는 임의의 순서일 수 있다. 바코드는 표적-결합 영역을 포함할 수 있다. 표적-결합 영역은 샘플 내에서 표적(예를 들어, 표적 핵산, RNA, mRNA, DNA)과 상호작용할 수 있다. 예를 들어, 표적-결합 영역은 mRNA의 폴리(A) 테일과 상호작용할 수 있는 올리고(dT) 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 바코드의 표지(예를 들어, 범용 표지, 치수 표지, 공간 표지, 세포 표지, 및 바코드 서열)은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다.
표지, 예를 들어, 세포 표지는 정의된 길이, 예를 들어, 각각 7 개의 뉴클레오티드(일부 해밍(Hamming) 오류 정정 코드에 사용된 비트들의 수에 균등함)의 핵산 하위서열의 고유 세트를 포함할 수 있고, 이는 오류 정정능을 제공하도록 설계될 수 있다. 7 개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 오류 정정 하위서열의 세트는, 세트 내 서열의 임의의 쌍의(pairwise) 조합이 정의된 "유전적 거리"(또는 미스매치된 염기의 수)를 나타내도록 설계될 수 있으며, 예를 들어, 오류 정정 하위서열의 세트가 3 개의 뉴클레오티드의 유전적 거리를 나타내도록 설계될 수 있다. 이러한 경우, 표지된 표적 핵산 분자에 대한 서열화 데이터의 세트에서 오류 정정 서열을 검토하면(아래에 더욱 충분히 설명됨), 증폭 또는 서열화 오류를 검출하거나 정정할 수 있게 된다. 일부 구현예에서, 오류 정정 코드를 생성하는 데 사용되는 핵산 하위서열의 길이는 변화될 수 있고, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 31, 40, 50 개이거나, 대략 상기 값이거나, 또는 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있는 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 다른 길이의 핵산 하위서열은 오류 정정 코드를 생성하는 데 사용될 수 있다.
바코드는 표적-결합 영역을 포함할 수 있다. 표적-결합 영역은 샘플 내에서 표적과 상호작용할 수 있다. 표적은 리보핵산(RNA), 메신저 RNA(mRNA), 마이크로RNA, 소간섭 RNAs(siRNA), RNA 분해 산물, 각각 폴리(A) 테일을 포함하는 RNA, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있거나, 이들을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 표적들은 데옥시리보핵산(DNA)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적-결합 영역은 mRNA의 폴리(A) 테일과 상호작용할 수 있는 올리고(dT) 서열을 포함할 수 있다. 바코드의 표지(예를 들어, 범용 표지, 치수 표지, 공간 표지, 세포 표지, 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지)) 중 하나 이상은 스페이서에 의해 바코드의 남아있는 표지 중 또 다른 하나 또는 둘로부터 구분될 수 있다. 스페이서는 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 바코드의 표지 중 어느 것도 스페이서에 의해 구분되지 않는다.
범용 표지
바코드는 하나 이상의 범용 표지를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 범용 표지는 소정의 고체 지지체에 부착된 바코드들의 세트 내 모든 바코드들에 대해 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 범용 표지는 복수의 비드들에 부착된 모든 바코드에 대해 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 범용 표지는 서열화 프라이머에 혼성화할 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 서열화 프라이머는 범용 표지를 포함하는 서열화 바코드를 위해 사용될 수 있다. 서열화 프라이머(예를 들어, 범용 서열화 프라이머)는 고-처리량 서열화 플랫폼과 연결된 서열화 프라이머를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 범용 표지는 PCR 프라이머에 혼성화할 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 범용 표지는 서열화 프라이머 및 PCR 프라이머에 혼성화할 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 서열화 또는 PCR 프라이머에 혼성화할 수 있는 범용 표지의 핵산 서열은 프라이머 결합 부위로서 지칭될 수 있다. 범용 표지는 바코드의 전사를 개시하는 데 사용될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 범용 표지는 바코드의 연장에 사용될 수 있는 서열 또는 바코드 내 영역을 포함할 수 있다. 범용 표지는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 개이거나 또는 대략 이들 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위인 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예를 들어, 범용 표지는 적어도 약 10 개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 범용 표지는 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 또는 300 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 분할가능한 링커 또는 변경된 뉴클레오티드는 바코드가 지지체로부터 분할되어 떨어질 수 있도록 하는 범용 표지 서열의 일부일 수 있다.
치수 표지
바코드는 하나 이상의 치수 표지를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 치수 표지는 표지(예를 들어, 추계적 표지)가 발생한 치수에 대한 정보를 제공하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 치수 표지는 표적이 추계적으로 바코딩된 시간에 대한 정보를 제공할 수 있다. 치수 표지는 샘플에서 바코딩(예를 들어, 추계적 바코딩)의 시간과 연결될 수 있다. 치수 표지는 표지 시에 활성화될 수 있다. 상이한 치수 표지는 상이한 시기에 활성화될 수 있다. 치수 표지는 표적, 표적의 군, 및/또는 샘플이 추계적으로 바코딩된 순서에 대한 정보를 제공한다. 예를 들어, 세포의 개체군은 세포 사이클의 GO 상에서 추계적으로 바코드될 수 있다. 세포는 세포 사이클의 G1 상에서 바코드(예를 들어, 추계적 바코드)로 다시 펄싱(pulsing)될 수 있다. 세포는 세포 사이클의 S 상 등에서 바코드로 다시 펄싱될 수 있다. 각 펄스(예를 들어, 세포 사이클의 각각의 상)에서 바코드는 상이한 치수 표지를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 치수 표지는, 세포 사이클의 어떤 상에서 표적이 표지되었는지에 대한 정보를 제공한다. 치수 표지는 많은 다양한 생물학적 시간에서 정보를 얻을 수 있다. 예시적인 생물학적 시간은, 세포 사이클, 전사(예를 들어, 전사 개시), 및 전사 분해를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 또 다른 예에서, 샘플(예를 들어, 세포, 세포들의 개체군)은 약물 및/또는 요법으로 처리 전 및/또는 처리 후에 추계적으로 표지될 수 있다. 별개의 표적의 복제물 수의 변화는 샘플의 약물 및/또는 요법에 대한 반응을 나타낼 수 있다.
치수 표지는 활성화될 수 있다. 활성화 가능한 치수 표지는 특정 시점에 활성화될 수 있다. 활성화 가능한 표지는, 예를 들어, 구성적으로 활성화(예를 들어, 꺼지지 않음)될 수 있다. 활성화 가능한 치수 표지는 예를 들어, 가역적으로 활성화(예를 들어, 활성화 가능한 치수 표지는 켜지고 꺼질 수 있음)될 수 있다. 치수 표지는 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 배, 또는 그 이상으로 가역적으로 활성화될 수 있다. 치수 표지는 가역적으로 활성화될 수 있고, 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 배, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 치수 표지는 형광, 빛, 화학적 이벤트(예를 들어, 분할, 또 다른 분자의 배위, 변형(예를 들어, 페길화, 수모일화(sumoylated), 아세틸화, 메틸화, 디아세틸화, 디메틸화)의 추가), 광화학적 이벤트(예를 들어, 광케이징(photocaging)), 및 비-천연 뉴클레오티드의 도입으로 활성화될 수 있다.
치수 표지는, 일부 구현예에서, 소정의 고체 지지체(예를 들어, 비드)에 부착된 모든 바코드(예를 들어, 추계적 바코드)에 대해 동일할 수 있지만, 상이한 고체 지지체(예를 들어, 비드)에 대해 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 고체 지지체 상에서 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 바코드는 동일한 치수 표지를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 고체 지지체 상에서 적어도 60%의 바코드는 동일한 치수 표지를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 고체 지지체 상에서 적어도 95%의 바코드는 동일한 치수 표지를 포함할 수 있다.
복수의 고체 지지체들(예를 들어, 비드)에 나타낸 고유 치수 표지 서열이 106 이상만큼 많이 존재할 수 있다. 치수 표지는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위인 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 치수 표지는 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 또는 300 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 치수 표지는 약 5 내지 약 200 개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 치수 표지는 약 10 내지 약 150 개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 치수 표지는 약 20 내지 약 125 개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
공간 표지
바코드는 하나 이상의 공간 표지를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 공간 표지는 바코드와 연결된 표적 분자의 공간 배향에 대한 정보를 제공하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 공간 표지는 샘플의 좌표와 연결될 수 있다. 좌표는 고정된 좌표일 수 있다. 예를 들어, 좌표는 기재에 관련되어 고정될 수 있다. 공간 표지는 2차원 또는 3차원 그리드에 관련될 수 있다. 좌표는 랜드마크(landmark)에 관련되어 고정될 수 있다. 랜드마크는 공간에서 식별가능할 수 있다. 랜드마크는 이미지화될 수 있는 구조물일 수 있다. 랜드마크는 생물학적 구조물, 예를 들어, 해부학적 랜드마크일 수 있다. 랜드마크는 세포 랜드마크, 예를 들어, 세포 소기관일 수 있다. 랜드마크는 비-천연 랜드마크, 예컨대, 색상 코드, 바 코드 자석 특성, 형광, 방사능 또는 고유 크기 또는 고유 형태와 같은 식별가능한 식별자를 갖는 구조일 수 있다. 공간 표지는 물리적 칸막이(예를 들어, 웰, 용기 또는 액적)와 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 다중 공간 표지가 공간 내 하나 이상의 위치를 인코딩하는 데 함께 사용된다.
공간 표지는 소정의 고체 지지체(예를 들어, 비드)에 부착된 모든 바코드에 대해 동일할 수 있지만, 상이한 고체 지지체(예를 들어, 비드)에 대해 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 공간 표지를 포함하는 동일한 고체 지지체 상에서 바코드의 백분율은 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 100% 이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 공간 표지를 포함하는 동일한 고체 지지체 상에서 바코드의 백분율은 적어도 또는 최대 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 고체 지지체 상에서 적어도 60%의 바코드는 동일한 공간 표지를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 고체 지지체 상에서 적어도 95%의 바코드는 동일한 공간 표지를 포함할 수 있다.
복수의 고체 지지체들(예를 들어, 비드)에 나타낸 고유한 공간 표지 서열이 106 이상만큼 많이 존재할 수 있다. 공간 표지는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위인 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 공간 표지는 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 또는 300 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 공간 표지는 약 5 내지 약 200 개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 공간 표지는 약 10 내지 약 150 개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 공간 표지는 약 20 내지 약 125 개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
세포 표지
바코드는 하나 이상의 세포 표지를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 표지는 어떤 표적 핵산이 어떤 세포로부터 기원되었는지를 결정하기 위한 정보를 제공하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 표지는 소정의 고체 지지체(예를 들어, 비드)에 부착된 모든 바코드에 대해 동일할 수 있지만, 상이한 고체 지지체(예를 들어, 비드)에 대해 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 세포 표지를 포함하는 동일한 고체 지지체 상에서 바코드의 백분율은 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 100%이거나, 대략 상기 백분율이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 세포 표지를 포함하는 동일한 고체 지지체 상에서 바코드의 백분율은 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%이거나, 대략 상기 백분율일 수 있다. 예를 들어, 동일한 고체 지지체 상에서 적어도 60%의 바코드는 동일한 세포 표지를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 동일한 고체 지지체 상에서 적어도 95%의 바코드는 동일한 세포 표지를 포함할 수 있다.
복수의 고체 지지체들(예를 들어, 비드)에 나타낸 고유 세포 표지 서열이 106 이상만큼 많이 존재할 수 있다. 세포 표지는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 세포 표지는 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 또는 300 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예를 들어, 세포 표지는 약 5 내지 약 200 개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 세포 표지는 약 10 내지 약 150 개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 세포 표지는 약 20 내지 약 125 개의 뉴클레오티드 길이를 포함할 수 있다.
바코드 서열
바코드는 하나 이상의 바코드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바코드 서열은 바코드에 혼성화된 특정 유형의 표적 핵산 종에 대한 식별 정보를 제공하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바코드 서열은 바코드(예를 들어, 표적-결합 영역)에 혼성화된 표적 핵산 종의 특정 발생에 대한 계수기를 제공하는(예를 들어, 대략적 근사치를 제공하는) 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 바코드 서열의 다양한 세트는 소정의 고체 지지체(예를 들어, 비드)에 부착된다. 일부 구현예에서, 102, 103 , 104, 105, 106, 107, 108, 109 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있는 고유 분자 표지 서열이 존재할 수 있다. 예를 들어, 복수의 바코드들은 별개의 서열을 갖는 약 6561 개의 바코드 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 복수의 바코드들은 별개의 서열을 갖는 약 65536 바코드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도, 또는 최대 102, 103 , 104, 105, 106, 107, 108, 또는 109 개의 고유 바코드 서열이 존재할 수 있다. 고유 분자 표지 서열은 소정의 고체 지지체(예를 들어, 비드)에 부착될 수 있다.
바코드는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위인 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 바코드는 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 또는 300 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
분자 표지
추계적 바코드는 하나 이상의 분자 표지를 포함할 수 있다. 분자 표지는 바코드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 분자 표지는 추계적 바코드에 혼성화된 특정 유형의 표적 핵산 종에 대한 식별 정보를 제공하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 분자 표지는 추계적 바코드(예를 들어, 표적-결합 영역)에 혼성화된 표적 핵산 종의 특정 발생에 대한 계수기를 제공하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 분자 표지의 다양한 세트는 소정의 고체 지지체(예를 들어, 비드)에 부착된다. 일부 구현예에서, 102, 103 , 104, 105, 106, 107, 108, 109 개이거나, 대략 상기 값이거나, 고유 분자 표지 서열의 어떤 수 또는 범위로 존재할 수 있다. 예를 들어, 복수의 추계적 바코드들은 별개의 서열을 갖는 약 6561 개의 분자 표지를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 복수의 추계적 바코드들은 별개의 서열을 갖는 약 65536 개의 분자 표지를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도, 또는 최대 102, 103 , 104, 105, 106, 107, 108, 또는 109 개의 고유 분자 표지 서열이 존재할 수 있다. 고유 분자 표지 서열을 갖는 추계적 바코드는 소정의 고체 지지체(예를 들어, 비드)에 부착될 수 있다.
복수의 추계적 바코드들을 이용하여 추계적으로 바코딩하기 위해, 상이한 분자 표지 서열 수와 임의의 표적의 출현 수의 비율은 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1이거나, 대략 상기 비율이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 표적은 동일하거나 거의 동일한 서열을 갖는 mRNA 분자를 포함하는 mRNA 종일 수 있다. 일부 구현예에서, 상이한 분자 표지 서열의 수와 임의의 복수의 표적들의 출현 수의 비율은 적어도, 또는 최대 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 또는 100:1이다.
분자 표지는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위인 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 분자 표지는 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 또는 300 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
표적-결합 영역
바코드는 하나 이상의 표적 결합 영역, 예컨대 포획 프로브를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적-결합 영역은 관심 대상의 표적과 혼성화할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 결합 영역은 표적(예를 들어, 표적 핵산, 표적 분자, 예를 들어, 분석될 세포 핵산)에 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열, 예를 들어, 특정 유전자 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 결합 영역은 특정 표적 핵산의 특정 위치에 부착(예를 들어, 혼성화)할 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 결합 영역은 제한 효소 부위 오버행(overhang)(예를 들어, EcoRI 점착성-말단(sticky-end) 오버행)에 특이적 혼성화가 가능한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이어서, 바코드는 제한 부위 오버행에 상보적인 서열을 포함하는 임의의 핵산 분자에 배위될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 결합 영역은 비특이적 표적 핵산 서열을 포함할 수 있다. 비특이적 표적 핵산 서열은 표적 핵산의 특정 서열에 독립적인, 다중 표적 핵산에 결합할 수 있는 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 표적 결합 영역은 랜덤 다량체 서열, 또는 mRNA 분자 상에서 폴리(A) 테일에 혼성화하는 올리고(dT) 서열을 포함할 수 있다. 랜덤 다량체 서열은 예를 들어, 랜덤 2량체, 3량체, 4량체, 5량체, 6량체, 7량체, 8량체, 9량체, 10량체 또는 임의의 길이의 상급 다량체 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 결합 영역은 소정의 비드에 부착된 모든 바코드에 대해 동일하다. 일부 구현예에서, 소정의 비드에 부착된 복수의 바코드들에 대한 표적 결합 영역은 둘 이상의 상이한 표적 결합 서열을 포함할 수 있다. 표적 결합 영역은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 개이거나, 대략 상기 값이거나, 또는 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위인 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 표적 결합 영역은 최대 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
일부 구현예에서, 표적-결합 영역은 폴리아데닐화 말단을 포함하는 mRNA와 혼성화할 수 있는 올리고(dT)를 포함할 수 있다. 표적-결합 영역은 유전자-특이적일 수 있다. 예를 들어, 표적-결합 영역은 표적의 특정 영역에 혼성화하도록 구성될 수 있다. 표적-결합 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 27, 28, 29, 30 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위인 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 표적-결합 영역은 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 27, 28, 29, 또는 30 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 표적-결합 영역은 약 5 내지 30 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 바코드가 유전자 특이적 표적-결합 영역을 포함하는 경우, 바코드는 유전자-특이적 바코드로서 본 명세서에서 지칭될 수 있다.
배향 특성
바코드는, 바코드를 배향(예를 들어, 정렬(align))하는 데 사용될 수 있는 하나 이상의 배향 특성을 포함할 수 있다. 바코드는 등전점 전기영동(isoelectric focusing)을 위한 모이어티를 포함할 수 있다. 상이한 바코드는 상이한 등전점 전기영동 지점을 포함할 수 있다. 이들 바코드가 샘플로 도입될 때, 샘플은 바코드를 알려진 방식으로 배향시키기 위하여 등전점 전기영동시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 배향 특성은 샘플 내 바코드의 알려진 지도를 개발하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 배향 특성은 전기영동 이동도(예를 들어, 바코드의 크기를 기준으로), 등전점, 스핀(spin), 전도성 및/또는 자기조립을 포함할 수 있다. 예를 들어, 자기조립의 배향 특성을 갖는 바코드는 활성화시 특정 배향(예를 들어, 핵산 나노구조)으로 자기조립할 수 있다.
친화도 특성
바코드는 하나 이상의 친화도 특성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 공간 표지는 바코드 특성을 포함할 수 있다. 친화도 특성은 또 다른 개체(entity)(예를 들어, 세포 수용체)로의 바코드의 결합을 용이하게 할 수 있는 화학 모이어티 및/또는 생물학적 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 친화도 특성은 항체, 예를 들어, 샘플 상에서 특정 모이어티(예를 들어, 수용체)에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 바코드를 특정 세포 유형 또는 분자로 안내(guide)할 수 있다. 특정 세포 유형 또는 분자에서 및/또는 그 가까이에서 표적은 추계적으로 표지될 수 있다. 친화도 특성은, 일부 구현예에서, 공간 표지의 뉴클레오티드 서열에 추가하여 공간 정보를 제공하는데, 이는 항체가 바코드를 특정 위치로 안내할 수 있기 때문이다. 항체는 치료용 항체, 예를 들어, 단클론성 항체 또는 다클론성 항체일 수 있다. 항체는 인간화되거나 키메라일 수 있다. 항체는 네이키드(naked) 항체 또는 융합 항체일 수 있다.
항체는 전장(즉, 천연 발생되거나 정상 면역글로불린 유전자 단편 재조합 과정에 의해 형성됨) 면역글로불린 분자(예를 들어, IgG 항체), 또는 항체 단편과 같은 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성(즉, 특이적으로 결합함)인 부분일 수 있다.
항체 단편은 예를 들어, 항체의 일부, 예컨대 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, sFv 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 전장 항체에 의해 인식되는 동일한 항원과 결합할 수 있다. 항체 단편은 항체의 가변 영역으로 이루어지는 단리된 단편, 예컨대 중쇄와 경쇄 및 재조합 단일 사슬 폴리펩티드 분자의 가변 영역으로 이루어진 "Fv" 단편일 수 있으며, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 펩티드 링커("scFv 단백질")에 의해 연결된다. 예시적인 항체는 암세포용 항체, 바이러스용 항체, 세포 표면 수용체에 결합하는 항체(CD8, CD34, CD45), 및 치료용 항체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
범용 어댑터 프라이머
바코드는 하나 이상의 범용 어댑터 프라이머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자-특이적 바코드, 예컨대 유전자-특이적 추계적 바코드는 범용 어댑터 프라이머를 포함할 수 있다. 범용 어댑터 프라이머는 모든 바코드에 걸쳐 범용인 뉴클레오티드 서열을 지칭할 수 있다. 범용 어댑터 프라이머는 유전자-특이적 바코드의 구축에 사용될 수 있다. 범용 어댑터 프라이머는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 27, 28, 29, 30 개이거나, 또는 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위인 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 범용 어댑터 프라이머는 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 27, 28, 29, 또는 30 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 범용 어댑터 프라이머는 5 내지 30 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
오류 정정
본 개시 내용의 세포 표지 및/또는 임의의 표지는, 오류 정정능을 제공하기 위해 설계된, 정의된 길이, 예를 들어, 각각 7 개의 뉴클레오티드(일부 해밍 오류 정정 코드에서 사용된 비트의 수에 균등함)의 핵산 서열의 고유 세트를 추가로 포함할 수 있다. 해밍 코드는, 다른 오류-정정 코드와 같이, 중복의 원리를 기반으로, 노이즈가 많은 매체를 통해 전송되는 데이터에 여분의 패리티 비트를 추가하여 구성될 수 있다. 그러한 오류-정정 코드는 여분의 패리티 비트를 갖는 샘플 식별자를 인코딩할 수 있고, 이들 샘플 식별자를 코드 워드(code word)로 "전송"할 수 있다. 해밍 코드는 단일 비트 오류를 정정할 수 있는 고유한 중복을 기반으로 하는 고유 이진 코드를 식별하는 산술 과정을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 해밍 코드는 핵산 증폭 동안 발생하는 단일 뉴클레오티드 오류를 스크린닝하기 위해 핵산 바코드와 매치될 수 있다. 해밍 코드를 이용하여 단일 뉴클레오티드 오류를 식별함으로써 핵산 바코드를 정정할 수 있다.
해밍 코드는 이진 부분 공간(binary subspace) 내 다차원 구(즉, 예를 들어, 초구(hypersphere))의 중심으로부터 선택된 가능한 코드 워드의 하위세트로 나타낼 수 있다. 단일 비트 오류는 특정 코드 워드와 연결된 초구에 속할 수 있으므로, 정정될 수 있다. 한편, 특정 코드 워드와 연결되지 않은 더블 비트 오류는 검출될 수 있지만, 정정되지는 않는다. 좌표 (0, 0, 0)에 중심이 위치한 제1 초구를 고려하면(즉, 예를 들어, x-y-z 좌표 시스템 이용), 여기서 임의의 단일-비트 오류는 중심 좌표로부터 반경 1 내에 속함으로써 정정될 수 있다; 즉, 예를 들어, 단일 비트 오류는 (0, 0, 0); (0, 1, 0); (0, 0, 1); (1, 0, 0), 또는 (1, 1, 0)의 좌표를 갖는다. 유사하게, 제2의 초구가 구성될 수 있으며, 여기서 단일-비트 오류는 그의 중심 좌표 (1, 1, 1)의 반경 1 내(즉, 예를 들어, (1,1,1); (1, 0, 1); (0, 1, 0); 또는 (0, 1, 1))에 속함으로써 정정될 수 있다.
일부 구현예에서, 오류 정정 코드의 생성에 사용되는 핵산 하위서열의 길이는 다양할 수 있으며, 예를 들어, 적어도 3 개의 뉴클레오티드, 적어도 7 개의 뉴클레오티드, 적어도 15 개의 뉴클레오티드, 또는 적어도 31 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 기타 길이의 핵산 하위서열은 오류 정정 코드의 생성에 사용될 수 있다.
링커
바코드가 하나 초과의 유형의 표지(예를 들어, 하나 초과의 세포 표지 또는 하나 초과의 바코드 서열, 예컨대 하나의 분자 표지)를 포함하는 경우, 표지는 링커 표지 서열과 함께 산재될 수 있다. 링커 표지 서열은 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 링커 표지 서열은 최대 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 경우에서, 링커 표지 서열은 12 개의 뉴클레오티드 길이이다. 링커 표지 서열은 바코드의 합성을 촉진하는 데 이용될 수 있다. 링커 표지는 오류-정정(예를 들어, 해밍) 코드를 포함할 수 있다.
고체 지지체
바코드, 본 명세서에 개시된 예컨대 추계적 바코드는, 일부 구현예에서 고체 지지체와 연결된다. 고체 지지체는, 예를 들어, 합성 입자일 수 있다. 일부 구현예에서, 바코드 서열의 일부 또는 전부는, 예컨대 고체 지지체 상에서 복수의 바코드들(예를 들어, 제1 복수의 바코드들)의 추계적 바코드(예를 들어, 제1 바코드 서열)에 대한 분자 표지는 적어도 하나의 뉴클레오티드에 의해 상이하다. 동일한 고체 지지체 상에서 바코드의 세포 표지는 동일할 수 있다. 상이한 고체 지지체 상에서 바코드의 세포 표지는 적어도 하나의 뉴클레오티드에 의해 상이하다. 예를 들어, 제1 고체 지지체 상에서 제1 복수의 바코드들의 제1 세포 표지는 동일한 서열을 가질 수 있고, 제2 고체 지지체 상에서 제2 복수의 바코드들의 제2 세포 표지는 동일한 서열을 가질 수 있다. 제1 고체 지지체 상에서 제1 복수의 바코드들의 제1 세포 표지 및 제2 고체 지지체 상에서 제2 복수의 바코드들의 제2 세포 표지는 적어도 하나의 뉴클레오티드에 의해 상이할 수 있다. 세포 표지는 예를 들어, 약 5 내지 20 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 바코드 서열은 예를 들어, 약 5 내지 20 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 합성 입자는 예를 들어, 비드일 수 있다.
비드는 예를 들어, 실리카 겔 비드, 제어된 기공 유리 비드, 자석 비드, 다이나비드(Dynabead), 세파덱스/세파로스 비드, 셀룰로스 비드, 폴리스티렌 비드, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 비드는 재료, 예컨대 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스티렌, 유리, 폴리프로필렌, 아가로스, 젤라틴, 하이드로겔, 상자성체, 세라믹, 플라스틱, 유리, 메틸스티렌, 아크릴성 중합체, 티타늄, 라텍스, 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 실리콘, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 비드는, 바코드 또는 추계적 바코드로 작용화된 중합체성 비드, 예를 들어, 변형가능한 비드 또는 겔 비드(예컨대 10X Genomics(미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재)의 겔 비드)일 수 있다. 일부 실시에서, 겔 비드는 중합체 기반 겔을 포함할 수 있다. 겔 비드는 예를 들어, 하나 이상의 중합체성 전구체를 액적 내로 캡슐화함으로서 생성될 수 있다. 중합체성 전구체를 가속화제(예를 들어, 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED))에 노출 시, 겔 비드가 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 입자는 분해될 수 있다. 예를 들어, 중합체성 비드는 원하는 조건 하에서 용해, 용융 또는 분해될 수 있다. 원하는 조건은 환경 조건을 포함할 수 있다. 원하는 조건은 제어된 방식으로 중합체성 비드를 용해, 용융 또는 분해시킬 수 있다. 겔 비드는 화학적 자극, 물리적 자극, 생물학적 자극, 열적 자극, 자기 자극, 전기 자극, 광 자극, 또는 이들의 임의의 조합으로 인해 용해, 용융, 또는 분해될 수 있다.
피분석물 및/또는 시약, 예컨대 올리고뉴클레오티드 바코드는, 겔 비드의 내부 표면(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 바코드의 확산을 통해 접근가능한 내부 및/또는 올리고뉴클레오티드 바코드의 생성에 사용된 재료) 및/또는 본 명세서에 기재된 겔 비드 또는 임의의 기타 마이크로캡슐의 외측 표면에, 예를 들어, 커플링/고정될 수 있다. 커플링/고정은 임의의 형태의 화학 결합(예를 들어, 공유결합, 이온결합) 또는 물리적 현상(예를 들어, 반데르 발스 힘, 쌍극자-쌍극자 상호작용 등)을 통해 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 겔 비드 또는 임의의 기타 마이크로캡슐로의 시약의 커플링/고정은, 예를 들어, 불안정한 모이어티를 통해(예를 들어, 본 명세서에 기재된 화학 가교결합제를 포함한, 화학 가교결합제를 통해) 가역적일 수 있다. 자극의 적용 시, 불안정한 모이어티는 분할되고 고정된 시약은 자유롭게 될 수 있다. 일부 구현예에서, 불안정한 모이어티는 디설피드 결합이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 바코드가 디설피드 결합을 통해 겔 비드에 고정된 경우, 디설피드 결합이 환원제에 노출되면 디설피드 결합은 분할되고 올리고뉴클레오티드 바코드는 비드로부터 유리될 수 있다. 불안정한 모이어티는 겔 비드 또는 마이크로캡슐의 부분으로서, 시약 또는 피분석물을 겔 비드 또는 마이크로캡슐에 연결하는 화학 링커의 부분으로서, 그리고/또는 시약 또는 피분석물의 부분으로서 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 상에 고정되거나, 입자 상에 부분적으로 고정되거나, 입자 내에 봉입되거나, 입자 내에 부분적으로 봉입되거나, 이들의 임의의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 겔 비드는 넓은 범위의 상이한 중합체들: 중합체, 열 민감성 중합체, 광 민감성 중합체, 자성 중합체, pH 민감성 중합체, 염-민감성 중합체, 화학 민감성 중합체, 고분자 전해질, 폴리사카라이드, 펩티드, 단백질 및/또는 플라스틱을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 중합체는 재료, 예컨대 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAAm), 폴리(스티렌 설포네이트)(PSS), 폴리(알릴 아민)(PAAm), 폴리(아크릴산)(PAA), 폴리(에틸렌 이민)(PEI), 폴리(디알릴디메틸-암모늄 클로라이드)(PDADMAC), 폴리(피롤)(PPy), 폴리(비닐피롤리돈)(PVPON), 폴리(비닐 피리딘)(PVP), 폴리(메트아크릴산)(PMAA), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리스티렌(PS), 폴리(테트라하이드로푸란)(PTHF), 폴리(프탈알데히드)(PTHF), 폴리(헥실 비올로겐)(PHV), 폴리(L-리신)(PLL), 폴리(L-아르기닌)(PARG), 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA)를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
비드의 붕괴, 용해 또는 분해를 촉발하기 위해 수많은 화학적 자극이 사용될 수 있다. 이들 화학적 변화의 예는, 비드 벽에 대해 pH-매개된 변화, 가교결합의 화학적 분열을 통한 비드 벽의 붕괴, 비드 벽의 촉발된 해중합(depolymerization), 및 비드 벽 스위칭 반응을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 벌크 변화 또한 비드의 붕괴를 촉발하는 데 사용될 수 있다.
다양한 자극을 통한 마이크로캡슐에 대한 벌크 또는 물리적 변화는 또한 시약을 방출하기 위한 캡슐의 설계에 많은 장점을 제공한다. 벌크 또는 물리적 변화는 거시적 규모로 일어나며, 여기에서 비드 파열은 자극에 의해 유도된 기계-물리적 힘의 결과이다. 이들 과정은 압력 유도된 파열, 비드 벽 용융, 또는 비드 벽의 다공성에서의 변화를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
생물학적 자극은 또한 비드의 붕괴, 용해 또는 분해의 촉발에 사용될 수 있다. 일반적으로, 생물학적 촉발제는 화학적 촉발제와 비슷하지만, 많은 예들은 생명 시스템에서 흔히 발견되는 생체분자 또는 분자, 예컨대 효소, 펩티드, 당류, 지방산, 핵산 등을 이용한다. 예를 들어, 비드는 특정 프로테아제에 의한 분할에 민감한 펩티드 가교결합을 갖는 중합체를 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 일 예는 GFLGK 펩티드 가교결합을 포함하는 마이크로캡슐을 포함할 수 있다. 생물학적 촉발제, 예컨대 프로테아제 카텝신 B의 첨가 시, 껍질의 펩티드 가교결합은 분할되고, 비드의 내용물이 방출된다. 다른 경우, 프로테아제는 열-활성화될 수 있다. 또 다른 예에서, 비드는 셀룰로스를 포함하는 껍질 벽을 포함한다. 가수분해성 효소 키토산의 첨가는 셀룰로스 결합의 분할, 껍질 벽의 해중합, 및 그 내부의 내용물의 방출에 대한 생물학적 촉발제로서의 역할을 한다.
비드는 또한 열 자극의 적용 시 그 내용물을 방출하도록 유도될 수 있다. 온도의 변화는 비드에 다양한 변화를 유발할 수 있다. 열의 변화는 비드를 용융시켜 비드 벽이 붕괴하도록 할 수 있다. 다른 경우, 열은 비드의 내부 성분의 내부 압력을 증가시켜서 비드가 파열되거나 폭발하도록 할 수 있다. 또 다른 경우에, 열은 비드를 줄어든 탈수 상태로 변형시킬 수 있다. 열은 또한 비드의 벽 내부의 열-민감성 중합체 상에 작용하여 비드의 붕괴를 유발할 수 있다.
자성 나노입자를 마이크로캡슐의 비드 벽에 포함하는 것은 비드의 촉발된 파열을 가능하게 할 뿐만 아니라, 비드를 어레이로 안내할 수 있다. 본 개시 내용의 디바이스는 어느 목적을 위해 자석 비드를 포함할 수 있다. 일 예에서, Fe3O4 나노입자를 비드를 함유하는 다가전해질 내로 혼입하는 것은 진동하는 자기장 자극의 존재 하에서 파열을 촉발시킨다.
비드는 또한, 전기 자극의 결과로서 붕괴, 용해 또는 분해될 수 있다. 이전의 섹션에 기재된 자석 입자와 유사하게, 전기적으로 민감성인 비드는 비드의 촉발된 파열 및 기타 기능, 예컨대 전기장, 전기 전도성 또는 산화환원 반응에서의 정렬 모두를 허용할 수 있다. 일 예에서, 전기적으로 민감성인 재료를 함유하는 비드는 전기장에서, 내부 시약의 방출이 제어될 수 있도록 정렬된다. 다른 예에서, 전기장은 다공성을 증가시킬 수 있는 비드 벽 그 자체 내에서 산화환원 반응을 유도할 수 있다.
광 자극은 또한 비드의 붕괴에 사용될 수 있다. 수많은 광 촉발제가 가능하며, 다양한 분자, 예컨대 특정 파장 범위의 광자를 흡수할 수 있는 나노 입자 및 발색단을 이용하는 시스템을 포함할 수 있다. 예를 들어, 금속 산화물 코팅이 캡슐 촉발제로 사용될 수 있다. SiO2로 코팅된 다가전해질 캡슐의 UV 조사는 비드 벽을 붕괴시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 광전환성 재료, 예컨대 아조벤젠 기가 비드 벽 내에 혼입될 수 있다. UV 또는 가시 광선의 적용 시, 이들과 같은 화학물질은 광자 흡수 시 가역적인 시스에서 트랜스형으로의 이성질화를 겪는다. 이러한 양태에서, 광자 스위치의 혼입은, 광 촉발제의 적용 시 분해되거나 더욱 다공성이 될 수 있는 비드 벽을 생성한다.
예를 들어, 도 2에 도시된 바코딩(예를 들어, 추계적 바코딩)의 비제한적인 예에서, 단일 세포와 같은 세포를 블록(208)에서 마이크로웰 어레이의 복수의 마이크로웰들 상으로 도입시킨 후, 비드는 블록(212)에서 마이크로웰 어레이의 복수의 마이크로웰들 상으로 도입될 수 있다. 각각의 마이크로웰은 하나의 비드를 포함할 수 있다. 비드는 복수의 바코드들을 포함할 수 있다. 바코드는 비드에 부착된 5' 아민 영역을 포함할 수 있다. 바코드는 범용 표지, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지), 표적-결합 영역, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 바코드는 고체 지지체(예를 들어, 비드)와 연결될(예를 들어, 부착될) 수 있다. 고체 지지체와 연결된 바코드는 고유 서열을 갖는 적어도 100 개 또는 1000 개의 바코드 서열을 포함하는 군으로부터 선택된 바코드 서열을 각각 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 고체 지지체와 연결된 상이한 바코드는 상이한 서열의 바코드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 고체 지지체와 연결된 바코드의 백분율은 동일한 세포 표지를 포함한다. 예를 들어, 백분율은 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 100%이거나, 대략 상기 백분율이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 다른 예로서, 백분율은 적어도, 또는 최대 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, 고체 지지체와 연결된 바코드는 동일한 세포 표지를 가질 수 있다. 상이한 고체 지지체와 연결된 바코드는 고유 서열을 갖는 적어도 100 개 또는 1000 개의 세포 표지를 포함하는 군으로부터 선택된 상이한 세포 표지를 가질 수 있다.
본 명세서에 개시된 바코드는 고체 지지체(예를 들어, 비드)에 연결될(예를 들어, 부착될) 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플에서 복수의 표적들의 추계적 바코딩은 복수의 바코드들과 연결된 복수의 합성 입자들을 포함하는 고체 지지체를 이용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 복수의 바코드들과 연결된 복수의 합성 입자들을 포함할 수 있다. 상이한 고체 지지체 상에서 복수의 바코드들의 공간 표지는 적어도 하나의 뉴클레오티드에 의해 상이할 수 있다. 고체 지지체는 예를 들어, 2차원 또는 3차원의 복수의 바코드들을 포함할 수 있다. 합성 입자는 비드일 수 있다. 비드는 실리카 겔 비드, 제어된 기공 유리 비드, 자성 비드, 다이나비드, 세파덱스/세파로스 비드, 셀룰로스 비드, 폴리스티렌 비드, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 고체 지지체는 중합체, 매트릭스, 하이드로겔, 니들 어레이 디바이스, 항체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 자유 유동할 수 있다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 반고체 또는 고체 어레이 내에 내장될 수 있다. 바코드는 고체 지지체와 연결되지 않을 수 있다. 바코드는 개별적인 뉴클레오티드일 수 있다. 바코드는 기재와 연결될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "연결된(tethered)", "부착된", 또는 "고정된"은 상호교환가능하게 사용되며, 바코드를 고체 지지체에 부착하기 위한 공유결합 또는 비-공유결합 수단을 지칭할 수 있다. 다양한 상이한 고체 지지체들 중 임의의 것이 미리 합성된 바코드를 부착하기 위한 또는 바코드의 원 위치(in situ) 고체-상 합성을 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 고체 지지체는 비드이다. 비드는 하나 이상의 유형의 고체, 다공성, 또는 중공 스피어, 볼, 베어링, 실린더, 또는 핵산이 (예를 들어, 공유결합적으로 또는 비-공유결합적으로) 고정될 수 있는 기타 유사한 구성을 포함할 수 있다. 비드는 예를 들어, 플라스틱, 세라믹, 금속, 다공성 재료, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 비드는 구형(예를 들어, 미소구체)이거나 비-구형 또는 불규칙한 형태, 예컨대 입방체, 직육면체, 피라미드형, 원통형, 원뿔형, 장타원형, 또는 원반형태 등을 가지는 별개의 입자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비드는 비-구형 형태일 수 있다.
비드는 다양한 재료, 예컨대 상자성체 재료(예를 들어, 마그네슘, 몰리브덴, 리튬 및 탄탈럼), 초상자성체 재료(예를 들어, 페라이트(Fe3O4; 자철석) 나노입자), 강자성 재료(예를 들어, 철, 니켈, 코발트, 이들의 일부 합금, 및 일부 희토류 금속 화합물), 세라믹, 플라스틱, 유리, 폴리스티렌, 실리카, 메틸스티렌, 아크릴성 중합체, 티타늄, 라텍스, 세파로스, 아가로스, 하이드로겔, 중합체, 셀룰로스, 나일론, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 비드(예를 들어, 표지가 그에 부착된 비드)는 하이드로겔 비드이다. 일부 구현예에서, 비드는 하이드로겔을 포함한다.
본 명세서에 개시된 일부 구현예는 하나 이상의 입자(예를 들어, 비드)를 포함한다. 각각의 입자는 복수의 올리고뉴클레오티드들(예를 들어, 바코드)를 포함할 수 있다. 복수의 올리고뉴클레오티드들의 각각은 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지), 세포 표지, 및 표적-결합 영역(예를 들어, 올리고(dT) 서열, 유전자-특이적 서열, 랜덤 다량체, 또는 이들의 조합)을 포함할 수 있다. 각각의 복수의 올리고뉴클레오티드들의 세포 표지 서열은 동일할 수 있다. 상이한 입자 상의 올리고뉴클레오티드의 세포 표지 서열은, 상이한 입자 상의 올리고뉴클레오티드가 식별될 수 있도록 상이할 수 있다. 상이한 세포 표지 서열의 수는 상이한 실시에서 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 표지 서열의 수는 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 106, 107, 108, 109 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 또는 그를 초과하는 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 표지 서열의 수는 적어도, 또는 최대 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 106, 107, 108, 또는 109 개일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 입자들 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 개, 또는 그 이상의 이하는 동일한 세포 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 동일한 세포 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 복수의 입자들은 최대 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 입자들 중 어느 것도 동일한 세포 표지 서열을 갖지 않는다.
각 입자 상의 복수의 올리고뉴클레오티드들은 상이한 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바코드 서열의 수는 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 106, 107, 108, 109 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 바코드 서열의 수는 적어도, 또는 최대 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 106, 107, 108, 또는 109 개일 수 있다. 예를 들어, 복수의 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 100 개는 상이한 바코드 서열을 포함한다. 또 다른 예로서, 단일 입자 내에, 복수의 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 100, 500, 1000, 5000, 10000, 15000, 20000, 50000 개, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위, 또는 그 이상은 상이한 바코드 서열을 포함한다. 일부 구현예는 바코드를 포함하는 복수의 입자들을 제공한다. 일부 구현예에서, 표지되는 표적의 출현(또는 복제물 또는 수)와 상이한 바코드 서열의 비는 적어도 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드들의 각각은 샘플 표지, 범용 표지, 또는 둘 모두를 추가로 포함한다. 입자는 예를 들어, 나노입자 또는 마이크로입자일 수 있다.
비드의 크기는 다양할 수 있다. 예를 들어, 비드의 직경은 0.1 마이크로미터 내지 50 마이크로미터의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 비드의 직경은 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 마이크로미터이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다.
비드의 직경은 기판의 웰의 직경에 관련될 수 있다. 일부 구현예에서, 비드의 직경은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%만큼, 대략 상기 값만큼, 또는 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위만큼, 웰의 직경보다 더 길거나 더 짧을 수 있다. 비드의 직경은 세포(예를 들어, 기판의 웰에 의해 포획된 단일 세포)의 직경에 관련될 수 있다. 일부 구현예에서, 비드의 직경은 적어도, 또는 최대 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%만큼 웰의 직경보다 더 길거나 짧을 수 있다. 비드의 직경은 세포(예를 들어, 기판의 웰에 의해 포획된 단일 세포)의 직경에 관련될 수 있다. 일부 구현예에서, 비드의 직경은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%만큼, 대략 상기 값만큼, 또는 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위만큼, 세포의 직경보다 더 길거나 더 짧을 수 있다. 일부 구현예에서, 비드의 직경은 적어도, 또는 최대 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 또는 300%만큼 웰의 직경보다 더 길거나 짧을 수 있다.
비드는 기재에 부착되고/되거나 기재 내에 내장될 수 있다. 비드는 겔, 하이드로겔, 중합체 및/또는 매트릭스에 부착되고/되거나 그 안에 내장될 수 있다. 기재(예를 들어, 겔, 매트릭스, 스캐폴드, 또는 중합체) 내 비드의 공간 위치는 위치 주소로서의 역할을 할 수 있는 비드 상의 바코드 상에 존재하는 공간 표지를 이용하여 식별될 수 있다.
비드의 예는 스트렙트아비딘 비드, 아가로스 비드, 자석 비드, 다이나비드®, MACS® 마이크로비드, 항체 컨쥬게이트된 비드(예를 들어, 항-면역글로불린 마이크로비드), 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 올리고(dT) 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 및 BcMagTM 카르복실레이트-말단화 자석 비드를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
비드는 양자점(quantum dot)또는 형광 염료와 연결되어(예를 들어, 함침되어) 하나의 형광 광학 채널 또는 다수의 광학 채널에서 이를 형광으로 만들 수 있다. 비드는 산화 철 또는 산화 크롬과 연결되어 이를 상자성 또는 강자성으로 만들 수 있다. 비드는 식별가능할 수 있다. 예를 들어, 비드는 카메라를 이용하여 이미지화될 수 있다. 비드는 비드와 연결된 검출가능한 코드를 가질 수 있다. 예를 들어, 비드는 바코드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유기 또는 무기 용액 내에서의 팽창으로 인해, 비드는 크기가 변할 수 있다. 비드는 소수성일 수 있다. 비드는 친수성일 수 있다. 비드는 생체에 적합할 수 있다.
고체 지지체(예를 들어, 비드)는 시각화될 수 있다. 고체 지지체는 시각화 태그(예를 들어, 형광 염료)를 포함할 수 있다. 고체 지지체(예를 들어, 비드)는 식별자(예를 들어, 숫자)로 에칭될 수 있다. 식별자는 비드를 이미지화함으로써 시각화될 수 있다.
고체 지지체는 불용성, 반-수용성, 또는 불용성 재료를 포함할 수 있다. 고체 지지체가 링커, 스캐폴드, 빌딩 블록, 또는 그에 부착된 기타 반응성 모이어티를 포함하는 경우, "작용화된" 것으로 지칭될 수 있는 반면, 고체 지지체가 그에 부착된 그러한 반응성 모이어티가 없는 경우 고체 지지체는 "비작용화될" 수 있다. 고체 지지체는, 예컨대 마이크로적정 웰 포맷으로; 플로-스루(flow-through) 포맷으로, 예컨대 컬럼으로; 또는 딥스틱(dipstick)으로, 용액 중에서 자유롭게 이용될 수 있다.
고체 지지체는 막, 종이, 플라스틱, 코팅된 표면, 평면, 유리, 슬라이드, 칩(chip) 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 고체 지지체는 수지, 겔, 미소구체, 또는 기타 기하학적 형태의 형태를 취할 수 있다. 고체 지지체는 실리카 칩, 마이크로입자, 나노입자, 플레이트, 어레이, 모세관, 평면 지지체, 예컨대 유리 섬유 필터, 유리 표면, 금속 표면(강철, 금은, 알루미늄, 규소 및 구리), 유리 지지체, 플라스틱 지지체, 규소 지지체, 칩, 필터, 막, 마이크로웰 플레이트, 슬라이드, 다중웰 플레이트 또는 막(예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리비닐리덴디플루오라이드로 제조됨), 및/또는 웨이퍼, 빗, 핀 또는 바늘(예를 들어, 조합 합성 또는 분석에 적합한 핀들의 어레이), 또는 웨이퍼(예를 들어, 규소 웨이퍼), 필터 바닥이 있거나 없는 피트(pit)를 가진 웨이퍼와 같은 평면의 피트 또는 나노리터 웰의 어레이 내 비드를 포함하는 플라스틱 재료를 포함할 수 있다.
고체 지지체는 중합체 매트릭스(예를 들어, 겔, 하이드로겔)을 포함할 수 있다. 중합체 매트릭스는 세포내 공간(예를 들어, 기관 주위)을 침투할 수 있다. 중합체 매트릭스는 순환계를 통해 펌프될 수 있다.
고체 지지체는 생물학적 분자일 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 핵산, 단백질, 항체, 히스톤, 세포 구획, 지질, 탄수화물 등일 수 있다. 고체 지지체는, 증폭, 번역, 전사, 분해, 및/또는 변형(예를 들어, 페길화, 수모일화, 아세틸화, 메틸화)될 수 있는 생물학적 분자이다. 생물학적 분자인 고체 지지체는, 생물학적 분자에 부착된 공간 표지에 추가하여 공간 및 시간 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 분자는 변형되지 않은 경우 제1 확인을 포함할 수 있지만, 변형된 경우 제2 확인으로 변경될 수 있다. 상이한 형태(conformation)는 본 개시 내용의 바코드(예를 들어, 추계적 바코드)를 표적에 노출시킬 수 있다. 예를 들어, 생물학적 분자는, 생물학적 분자의 접힘으로 인해, 접근불가능한 바코드를 포함할 수 있다. 생물학적 분자의 변형(예를 들어, 아세틸화) 시, 생물학적 분자는 바코드를 노출하기 위하여 형태를 변화시킬 수 있다. 변형의 타이밍은 본 개시 내용의 바코딩 방법에 또 다른 시간 치수를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용의 바코드 시약을 포함하는 생물학적 분자는 세포의 세포질 내에 위치될 수 있다. 활성화 시, 생물학적 분자는 핵으로 이동할 수 있으며, 그 결과 바코딩이 일어날 수 있다. 이러한 방식으로, 생물학적 분자의 변형은 바코드에 의해 식별된 표적에 대한 추가의 시간-공간 정보를 인코딩할 수 있다.
기판 및 마이크로웰 어레이
본 명세서에 사용된 바와 같은, 기판은 고체 지지체의 유형을 지칭할 수 있다. 기판은 본 개시 내용의 바코드 및 추계적 바코드를 포함할 수 있는 고체 지지체를 지칭할 수 있다. 기판은 예를 들어, 복수의 마이크로웰들을 포함한다. 예를 들어, 기판은 둘 이상의 마이크로웰을 포함하는 웰 어레이일 수 있다. 일부 구현예에서, 마이크로웰은 정의된 부피의 작은 반응 챔버를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 마이크로웰은 하나 이상의 세포를 포획할 수 있다. 일부 구현예에서, 마이크로웰은 하나의 세포만을 포획할 수 있다. 일부 구현예에서, 마이크로웰은 하나 이상의 고체 지지체를 포획할 수 있다. 일부 구현예에서, 마이크로웰은 하나의 고체 지지체만을 포획할 수 있다. 일부 구현예에서, 마이크로웰은 단일 세포 및 단일 고체 지지체(예를 들어, 비드)를 포획한다. 마이크로웰은 본 개시 내용의 조합 바코드 시약을 포함할 수 있다.
어레이의 마이크로웰은 다양한 형태 및 크기로 제작될 수 있다. 웰 기하학적 구조는, 원통, 원뿔, 반구, 직사각형 또는 다면체(예를 들어, 몇몇 편평한 면들로 구성된 3차원 기하학적 구조, 예를 들어, 6각 기둥, 8각 기둥, 역3각 피라미드, 역4각 피라미드, 역5각 피라미드, 역6각 피라미드, 또는 역 절단 피라미드)를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 마이크로웰은 이들 기하학적 구조의 둘 이상을 조합한 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, 마이크로웰은 부분적으로 원통형이고, 나머지 부분은 역원뿔 형태를 가질 수 있다. 마이크로웰은 2 개의 나란한 원통을 포함할 수 있는데, 하나의 원통의 직경(예를 들어, 비드의 직경과 거의 일치함)은 다른 하나의 직경(예를 들어, 세포의 직경과 거의 일치함)보다 크고, 원통의 전체 길이(깊이)를 연장하는 원통의 수직 채널에 의해 연결(즉, 원통 축에 평행함)된다. 마이크로웰의 개구는 기판의 상부 표면에 있을 수 있다. 마이크로웰의 개구는 기판의 하부 표면에 있을 수 있다. 마이크로웰의 폐쇄된 말단(또는 바닥)은 편평할 수 있다. 마이크로웰의 폐쇄된 말단(또는 바닥)은 곡면(예를 들어, 볼록 또는 오목)을 가질 수 있다. 마이크로웰의 형태 및/또는 크기는 마이크로웰 내에 포획된 세포 또는 고체 지지체의 유형을 기준으로 결정될 수 있다.
웰들 사이의 기판 부분은 위상배치(topology)를 가질 수 있다. 예를 들어, 웰들 사이의 기판 부분은 둥글게 될 수 있다. 웰들 사이에서 기판 부분은 뾰족할 수 있다. 웰들 사이의 기판의 간격 부분은 편평할 수 있다. 웰들 사이의 기판 부분은 편평하지 않을 수 있다. 일부 경우에서, 웰들 사이의 기판 부분은 둥글게 된다. 즉, 웰을 포함하지 않는 기판 부분은 곡면을 가질 수 있다. 곡면은, 곡면의 최고점(예를 들어, 정점)이 둘 이상의 웰의 가장자리 사이(예를 들어, 웰로부터 동일 거리)에서 가장 먼 지점에 존재할 수 있도록 제작될 수 있다. 곡면은, 곡면의 출발이 제1 마이크로웰의 에지에 존재하며, 제2 마이크로웰의 말단에서 끝나는 포물선을 생성하도록 제작될 수 있다. 이러한 포물선은 웰의 6각형 그리드 가까이에서 마이크로웰을 포획하도록 2차원으로 연장될 수 있다. 곡면은 웰들 사이의 표면이 웰의 개구 면보다 더 높고/높거나 구부러지도록 제작될 수 있다. 곡면의 높이는 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 또는 7, 또는 그 이상의 마이크로미터이거나, 적어도 상기 값일 수 있다. 일부 구현예에서, 곡면의 높이는 최대 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 또는 7, 또는 그 이상의 마이크로미터일 수 있다.
마이크로웰 치수는 웰의 직경 및 깊이 면에서 특성화될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 마이크로웰의 직경은 마이크로웰 기하학적 구조의 평면 단면 내에 내접할 수 있는 가장 큰 원을 지칭한다. 마이크로웰의 직경은 마이크로웰 내에 포획되는 세포 또는 고체 지지체의 직경의 약 1 배 내지 약 10 배의 범위일 수 있다. 마이크로웰 직경은, 마이크로웰 내에 포획되는 세포 또는 고체 지지체의 직경의 1 배, 적어도 1.5 배, 적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배, 적어도 5 배, 또는 적어도 10 배이거나, 적어도 상기 값일 수 있다. 일부 구현예에서, 마이크로웰 직경은 마이크로웰 내에 포획되는 세포 또는 고체 지지체의 직경의 최대 10 배, 최대 5 배, 최대 4 배, 최대 3 배, 최대 2 배, 최대 1.5 배, 또는 최대 1 배일 수 있다. 마이크로웰 직경은 마이크로웰 내에 포획되는 세포 또는 고체 지지체의 직경의 약 2.5 배일 수 있다.
마이크로웰의 직경은 절대 치수 면에서 특정될 수 있다. 마이크로웰의 직경은 약 5 내지 약 60 마이크로미터의 범위일 수 있다. 마이크로웰 직경은 5 마이크로미터, 적어도 10 마이크로미터, 적어도 15 마이크로미터, 적어도 20 마이크로미터, 적어도 25 마이크로미터, 적어도 30 마이크로미터, 적어도 35 마이크로미터, 적어도 40 마이크로미터, 적어도 45 마이크로미터, 적어도 50 마이크로미터, 또는 적어도 60 마이크로미터이거나, 적어도 상기 값일 수 있다. 마이크로웰 직경은 최대 60 마이크로미터, 최대 50 마이크로미터, 최대 45 마이크로미터, 최대 40 마이크로미터, 최대 35 마이크로미터, 최대 30 마이크로미터, 최대 25 마이크로미터, 최대 20 마이크로미터, 최대 15 마이크로미터, 최대 10 마이크로미터, 또는 최대 5 마이크로미터일 수 있다. 마이크로웰 직경은 약 30 마이크로미터일 수 있다.
마이크로웰 깊이는 세포 및 고체 지지체의 효율적인 포획을 제공하도록 선택될 수 있다. 마이크로웰 깊이는 웰 내에 함유된 분석 버퍼 및 기타 시약의 효율적인 교환을 제공하도록 선택될 수 있다. 직경 대 높이의 비율(즉, 종횡비)은, 일단 세포 및 고체 지지체가 마이크로웰 내부에 침전되면, 이들이 마이크로웰 위의 유체 운동에 의해 변위되지 않도록 선택될 수 있다. 마이크로웰의 치수는, 마이크로웰이 마이크로웰 위의 유체 운동에 의해 이탈되지 않고 다양한 크기의 고체 지지체 및 세포를 수용하기에 충분한 공간을 갖도록 선택될 수 있다. 마이크로웰의 깊이는, 마이크로웰 내에 포획되는 세포 또는 고체 지지체의 직경의 약 1 배 내지 약 10 배의 범위일 수 있다. 마이크로웰 깊이는, 마이크로웰 내에 포획되는 세포 또는 고체 지지체의 직경의 1 배, 적어도 1.5 배, 적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배, 적어도 5 배, 또는 적어도 10 배이거나, 적어도 상기 값일 수 있다. 마이크로웰 깊이는, 마이크로웰 내에 포획되는 세포 또는 고체 지지체의 직경의 최대 10 배, 최대 5 배, 최대 4 배, 최대 3 배, 최대 2 배, 최대 1.5 배, 또는 최대 1 배일 수 있다. 마이크로웰 깊이는 마이크로웰 내에 포획되는 세포 또는 고체 지지체의 직경의 약 2.5 배일 수 있다.
마이크로웰의 깊이는 절대 치수 면에서 특정될 수 있다. 마이크로웰의 깊이는 약 10 내지 약 60 마이크로미터의 범위일 수 있다. 마이크로웰 깊이는 10 마이크로미터, 적어도 20 마이크로미터, 적어도 25 마이크로미터, 적어도 30 마이크로미터, 적어도 35 마이크로미터, 적어도 40 마이크로미터, 적어도 50 마이크로미터, 또는 적어도 60 마이크로미터이거나, 적어도 상기 값일 수 있다. 마이크로웰 깊이는 최대 60 마이크로미터, 최대 50 마이크로미터, 최대 40 마이크로미터, 최대 35 마이크로미터, 최대 30 마이크로미터, 최대 25 마이크로미터, 최대 20 마이크로미터, 또는 최대 10 마이크로미터일 수 있다. 마이크로웰 깊이는 약 30 마이크로미터일 수 있다.
본 개시 내용의 방법, 디바이스, 및 시스템에 사용되는 마이크로웰의 부피는 약 200 ㎛3 내지 120,000 ㎛3의 범위일 수 있다. 마이크로웰 부피는 적어도 200 ㎛3, 적어도 500 ㎛3, 적어도 1,000 ㎛3, 적어도 10,000 ㎛3, 적어도 25,000 ㎛3, 적어도 50,000 ㎛3, 적어도 100,000 ㎛3, 또는 적어도 120,000 ㎛3일 수 있다. 마이크로웰 부피는 최대 120,000 ㎛3, 최대 100,000 ㎛3, 최대 50,000 ㎛3, 최대 25,000 ㎛3, 최대 10,000 ㎛3, 최대 1,000 ㎛3, 최대 500 ㎛3, 또는 최대 200 ㎛3일 수 있다. 마이크로웰 부피는 약 25,000 ㎛3일 수 있다. 마이크로웰 부피는 이들 중 임의의 값에 의해 한정되는 임의의 범위(예를 들어, 약 18,000 ㎛3 내지 약 30,000 ㎛3) 내에 속할 수 있다.
마이크로웰의 부피는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50, 또는 그 이상의 나노리터3이거나, 적어도 상기 값일 수 있다. 마이크로웰의 부피는 최대 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50, 또는 그 이상의 나노리터3일 수 있다. 마이크로웰 내에 적합할 수 있는 액체의 부피는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50, 또는 그 이상의 나노리터3일 수 있다. 마이크로웰 내에 적합할 수 있는 액체의 부피는 최대 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50, 또는 그 이상의 나노리터3일 수 있다. 마이크로웰의 부피는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50, 또는 그 이상의 피코리터3일 수 있거나, 적어도 상기 값일 수 있다. 마이크로웰의 부피는 최대 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50, 또는 그 이상의 피코리터3일 수 있다. 마이크로웰 내에 적합할 수 있는 액체의 부피는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50, 또는 그 이상의 피코리터3일 수 있다. 마이크로웰 내에 적합할 수 있는 액체의 부피는 최대 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50, 또는 그 이상의 피코리터3일 수 있다.
본 개시 내용의 방법, 디바이스, 및 시스템에 사용되는 마이크로웰의 부피는 하나의 마이크로웰에서 또 다른 하나까지 부피의 변동 면에서 추가로 특성화될 수 있다. 마이크로웰 부피에 대한 변동 계수(백분율로 표시됨)는 약 1% 내지 약 10%의 범위일 수 있다. 마이크로웰 부피에 대한 변동 계수는 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 또는 적어도 10%일 수 있다. 마이크로웰 부피에 대한 변동 계수는 최대 10%, 최대 9%, 최대 8%, 최대 7%, 최대 6%, 최대 5%, 최대 4%, 최대 3%, 최대 2%, 또는 최대 1%일 수 있다. 마이크로웰 부피에 대한 변동 계수는 이들 값들에 의해 포괄되는 범위 내의 임의의 값, 예를 들어, 약 1.5% 내지 약 6.5%일 수 있다. 일부 구현예에서, 마이크로웰 부피의 변동 계수는 약 2.5%일 수 있다.
본 개시 내용의 방법, 디바이스, 및 시스템에 사용되는 비드의 표면적(또는 부착될 수 있는 바코드 올리고뉴클레오티드에 대한 고체 지지체의 표면적)에 대한 마이크로웰의 부피의 비는 약 2.5 내지 약 1,520 마이크로미터의 범위일 수 있다. 이 비는 적어도 2.5, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 100, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,520일 수 있다. 이 비는 최대 1,520, 최대 1,000, 최대 750, 최대 500, 최대 100, 최대 10, 최대 5, 또는 최대 2.5일 수 있다. 이 비는 약 67.5일 수 있다. 비드(또는 고정에 사용된 고체 지지체)의 표면적에 대한 마이크로웰 부피의 비는 이들 중 임의의 값에 의해 한정되는 임의의 범위(예를 들어, 약 30 내지 약 120) 내에 속할 수 있다.
마이크로웰 어레이의 웰은 1차원, 2차원, 또는 3차원 어레이로 배열될 수 있다. 일부 구현예에서, 3차원 어레이는 예를 들어, 일련의 둘 이상의 2차원 어레이를 적층함으로써(즉, 마이크로웰 어레이를 포함하는 둘 이상의 기판을 적층함으로써) 달성될 수 있다.
마이크로웰 사이의 패턴 및 간격은 각 웰 내에서 단일 세포 및 단일 고체 지지체(예를 들어, 비드)를 포획하는 효율을 최적화할 뿐만 아니라, 어레이의 단위 면적 당 웰 수를 최대화하도록 선택될 수 있다. 마이크로웰은 다양한 랜덤 또는 비-랜덤 패턴에 따라 분포될 수 있다. 예를 들어, 이들은 어레이 기판의 표면에 걸쳐 전체적으로 랜덤하게 분포될 수 있거나, 정사각형 그리드, 직사각형 그리드, 육각형 그리드 등으로 배열될 수 있다. 일부 경우에서, 마이크로웰은 육각형 모양으로 배열된다. 웰들 사이의 중심에서 중심까지의 거리(또는 간격)는 약 5 마이크로미터 내지 약 75 마이크로미터에서 다양할 수 있다. 일부 경우에서, 마이크로웰들 사이의 간격은 약 10 마이크로미터이다. 다른 구현예에서, 웰들 사이의 간격은 적어도 5 마이크로미터, 적어도 10 마이크로미터, 적어도 15 마이크로미터, 적어도 20 마이크로미터, 적어도 25 마이크로미터, 적어도 30 마이크로미터, 적어도 35 마이크로미터, 적어도 40 마이크로미터, 적어도 45 마이크로미터, 적어도 50 마이크로미터, 적어도 55 마이크로미터, 적어도 60 마이크로미터, 적어도 65 마이크로미터, 적어도 70 마이크로미터, 또는 적어도 75 마이크로미터이다. 마이크로웰 간격은 최대 75 마이크로미터, 최대 70 마이크로미터, 최대 65 마이크로미터, 최대 60 마이크로미터, 최대 55 마이크로미터, 최대 50 마이크로미터, 최대 45 마이크로미터, 최대 40 마이크로미터, 최대 35 마이크로미터, 최대 30 마이크로미터, 최대 25 마이크로미터, 최대 20 마이크로미터, 최대 15 마이크로미터, 최대 10 마이크로미터, 최대 5 마이크로미터일 수 있다. 마이크로웰 간격은 약 55 마이크로미터일 수 있다. 마이크로웰 간격은 이들 중 임의의 값에 의해 한정되는 임의의 범위(예를 들어, 약 18 마이크로미터 내지 약 72 마이크로미터) 내일 수 있다.
마이크로웰 어레이는 세포 및 고체 지지체를 웰 내로 안내하는 것을 돕고/돕거나 이들이 웰들 사이의 표면 상에 침전하는 것을 방지하도록 설계된 마이크로웰들 사이의 표면 특징부를 포함할 수 있다. 적합한 표면 특징부의 예는, 웰을 둘러싸거나 웰들 사이의 표면을 가로지르는 돔 형태, 이랑 형태, 또는 돌출 형태의 표면 특징부들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
마이크로웰 어레이 내 웰의 총 수는 웰의 패턴 및 간격 및 어레이의 전체 치수에 의해 결정될 수 있다. 어레이 내 마이크로웰의 수는 약 96 내지 약 5,000,000 개 이상의 범위일 수 있다. 어레이 내 마이크로웰의 수는 적어도 96, 적어도 384, 적어도 1,536, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 25,000, 적어도 50,000, 적어도 75,000, 적어도 100,000, 적어도 500,000, 적어도 1,000,000, 또는 적어도 5,000,000일 수 있다. 어레이 내 마이크로웰의 수는 최대 5,000,000, 최대 1,000,000, 최대 75,000, 최대 50,000, 최대 25,000, 최대 10,000, 최대 5,000, 최대 1,536, 최대 384, 또는 최대 96 웰일 수 있다. 어레이 내 마이크로웰의 수는 약 96, 384, 및/또는 1536일 수 있다. 마이크로웰의 수는 약 150,000일 수 있다. 어레이 내 마이크로웰의 수는 이들 임의의 값에 의해 한정되는 임의의 범위(예를 들어, 약 100 내지 325,000) 내일 수 있다.
마이크로웰 어레이는 많은 제작 기술 중 임의의 것을 이용하여 제작될 수 있다. 포함될 수 있는 제작 방법의 예로는, 벌크 미세가공(bulk micromachining) 기술, 예컨대 포토리소그래피 및 습식 화학 에칭, 플라즈마 에칭 또는 심도반응성 이온 에칭; 마이크로-몰딩 및 마이크로-엠보싱; 레이저 미세가공; 3D 프린팅 또는 경화성 재료를 이용한 기타 직접 기록 제작 공정(direct write fabrication); 및 유사 기술을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
마이크로웰 어레이는 다수의 기판 재료 중 임의의 것으로부터 제작될 수 있다. 재료의 선택은 제작 기술의 선택에 따라 달라질 수 있으며, 그 역도 마찬가지이다. 적합한 재료의 예는 규소, 용융-실리카, 유리, 중합체(예를 들어, 아가로스, 젤라틴, 하이드로겔, 폴리디메틸실록산(PDMS; 탄성체), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 고밀도 폴리에틸렌(HDPE), 폴리이미드, 시클릭 올레핀 중합체(COP), 시클릭 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 에폭시 수지, 티올-엔계 수지, 금속 또는 금속 필름(예를 들어, 알루미늄, 스테인리스강, 구리, 니켈, 크롬 및 티타늄) 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에서, 마이크로웰은 광학 접착제를 포함한다. 일부 경우에서, 마이크로웰은 광학 접착제로 제조된다. 일부 경우에서, 마이크로웰 어레이는 PDMS를 포함하고/하거나 그로 제조된다. 일부 경우에서, 마이크로웰은 플라스틱으로 제조된다. 친수성 재료는 마이크로웰 어레이의 제작에 바람직할 수 있다(예를 들어, 세포 및 기타 생물 재료의 젖음성을 향상시키고, 비특이적 결합을 최소화함). (예를 들어, 산소 플라즈마 처리, 또는 폴리에틸렌 산화물 표면 층의 그래프팅에 의해) 처리되거나 코팅될 수 있는 소수성 재료 또한 사용될 수 있다. 마이크로웰 어레이의 제작을 위한 다공성, 친수성 재료의 이용은 디바이스에서 모세관성 위킹/포획된 공기 버블의 환기를 용이하게 하기 위해서 바람직할 수 있다. 마이크로웰 어레이는 단일 재료로 제작될 수 있다. 마이크로웰 어레이는 함께 결합되거나 기계적으로 접합된 둘 이상의 상이한 재료를 포함할 수 있다.
마이크로웰 어레이는 다양한 크기 및 형태 중 임의의 크기 및 형태의 기판을 이용하여 제작될 수 있다. 예를 들어, 그 안에 마이크로웰이 제작되는 기판의 형태(또는 차지하는 공간)는 정사각형, 직사각형, 원형 또는 불규칙한 형태일 수 있다. 마이크로웰 어레이 기판이 차지하는 공간은 마이크로적정 플레이트와 유사할 수 있다. 마이크로웰 어레이 기판이 차지하는 공간은 표준 현미경 슬라이드와 유사할 수 있고, 예를 들어, 약 75 mm 길이 x 25 mm 너비(약 3" 길이 x 1" 너비), 또는 약 75 mm 길이 x 50 mm 너비(약 3" 길이 x 2" 너비)일 수 있다. 그 안에 마이크로웰이 제작되는 기판의 두께는 약 0.1 mm 두께 내지 약 10 mm 두께, 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 마이크로웰 어레이 기판의 두께는 적어도 0.1 mm 두께, 적어도 0.5 mm 두께, 적어도 1 mm 두께, 적어도 2 mm 두께, 적어도 3 mm 두께, 적어도 4 mm 두께, 적어도 5 mm 두께, 적어도 6 mm 두께, 적어도 7 mm 두께, 적어도 8 mm 두께, 적어도 9 mm 두께, 또는 적어도 10 mm 두께일 수 있다. 마이크로웰 어레이 기판의 두께는 최대 10 mm 두께, 최대 9 mm 두께, 최대 8 mm 두께, 최대 7 mm 두께, 최대 6 mm 두께, 최대 5 mm 두께, 최대 4 mm 두께, 최대 3 mm 두께, 최대 2 mm 두께, 최대 1 mm 두께, 최대 0.5 mm 두께, 또는 최대 0.1 mm 두께일 수 있다. 마이크로웰 어레이 기판의 두께는 약 1 mm 두께일 수 있다. 마이크로웰 어레이 기판의 두께는 이들 범위 내의 임의의 값일 수 있으며, 예를 들어, 마이크로웰 어레이 기판의 두께는 약 0.2 mm 내지 약 9.5 mm일 수 있다. 마이크로웰 어레이 기판의 두께는 균일할 수 있다.
마이크로웰 어레이 표면의 특성을 변경하기 위해 다양한 표면 처리 및 표면 변형 기술이 사용될 수 있다. 예로는, 소수성 재료 표면을 더욱 친수성으로 만드는 산소 플라즈마 처리, 유리 및 규소 표면을 매끄럽게 (또는 거칠게) 만드는 습식 또는 건식 에칭 기술의 사용, 기판 표면을 더욱 친수성으로 만들고 생체분자 및 세포의 비-특이적 흡착을 덜 일으키게 하기 위한 기판 표면에 대한 폴리에틸렌 산화물 또는 기타 중합체 층(예컨대 플루로닉), 또는 소 혈청 알부민의 흡착 또는 그래프팅, 화학적으로 반응성인 작용기를 다르게는 불활성 규소 및 유리 표면에 그래프팅하기 위한 실란 반응의 사용 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 광탈보호화(Photodeprotection) 기술은 어레이 구조의 특정 위치에서 화학적으로 활성인 작용기를 선택적으로 활성화하기 위해 사용될 수 있으며, 예를 들어, 화학적으로 활성인 작용기, 예컨대 1차 아민 또는 카르복실 기를 마이크로웰의 내부 벽 상에 선택적으로 추가하거나 활성화하는 것이, 올리고뉴클레오티드 프로브, 펩티드, 단백질, 또는 기타 생체분자를 마이크로웰의 벽에 공유결합적으로 커플링하기 위해 사용될 수 있다. 사용되는 표면 처리 또는 표면 변형을 선택하는 것은 바람직한 표면 특성의 유형 및 마이크로웰 어레이를 형성하는 재료의 유형 중 어느 하나 또는 이들 모두에 따라 달라질 수 있다.
마이크로웰의 개구는, 예를 들어, 인접 마이크로웰들 사이에서 표적 핵산의 교차 혼성화를 방지하기 위해, 세포 용해 단계 동안 밀봉될 수 있다. 마이크로웰(또는 마이크로웰의 어레이)은 예를 들어, 마이크로웰 어레이 기판의 표면에 대해 클램핑되는 고체 재료(즉, 플레이트 또는 가압판)의 가요성 막 또는 시트, 또는 적합한 비드를 이용하여 밀봉 또는 캡핑될 수 있으며, 여기서 비드의 직경은 마이크로웰의 직경보다 더 크다.
고체 재료의 가요성 막 또는 시트를 이용하여 형성된 밀봉재는 예를 들어, 무기 나노기공막(예를 들어, 산화 알루미늄), 투석막, 유리 슬라이드, 커버슬립(coverslip), 탄성체성 필름(예를 들어, PDMS), 또는 친수성 중합체 필름(예를 들어, 용해 버퍼로 수화된 아가로스의 박막으로 코팅된 중합체 필름)을 포함할 수 있다.
마이크로웰을 캡핑하기 위해 사용되는 고체 지지체(예를 들어, 비드)는 본 개시 내용의 임의의 고체 지지체(예를 들어, 비드)를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 고체 지지체는 가교결합된 덱스트란 비드(예를 들어, 세파덱스)이다. 가교결합된 덱스트란은 약 10 마이크로미터 내지 약 80 마이크로미터의 범위일 수 있다. 캡핑에 사용되는 가교결합된 덱스트란 비드는 20 마이크로미터 내지 약 50 마이크로미터일 수 있다. 일부 구현예에서, 비드는 마이크로웰의 직경보다 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 더 클 수 있다. 캡핑에 사용되는 비드는 마이크로웰의 직경보다 최대 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 더 클 수 있다.
밀봉재 또는 캡은 버퍼가 마이크로웰 내로 그리고 밖으로 통과하는 것을 가능하게 하는 한편, 거대분자(예를 들어, 핵산)가 웰 밖으로 이동하는 것은 방지할 수 있다. 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 거대분자는 밀봉재 또는 캡에 의해 마이크로웰 내로 또는 밖으로 이동하는 것으로부터 차단될 수 있다. 최대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 거대분자는 밀봉재 또는 캡에 의해 마이크로웰 내로 또는 밖으로 이동하는 것으로부터 차단될 수 있다.
고체 지지체(예를 들어, 비드)는 기판 중에 분포될 수 있다. 고체 지지체(예를 들어, 비드)는 기판의 웰 중에 분포되거나, 기판의 웰로부터 제거되거나, 다르게는 원심분리 또는 기타 비-자성 수단을 통해 하나 이상의 마이크로웰 어레이를 포함하는 디바이스를 통해 운송될 수 있다. 기판의 마이크로웰은 고체 지지체로 미리 로딩될 수 있다. 기판의 마이크로웰은 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 개, 또는 그 이상의 고체 지지체를 수용할 수 있다. 기판의 마이크로웰은 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5 개, 또는 그 이상의 고체 지지체를 수용할 수 있다. 일부 경우에서, 기판의 마이크로웰은 하나의 고체 지지체를 수용할 수 있다.
각각의 세포 및 비드는 마이크로웰에 대한 대체물, 예를 들어, 단일 고체 지지체를 이용하여 구획화될 수 있으며, 단일 세포는 에멀션 내(예를 들어, 액적 디지털 마이크로유체 시스템 내)의 단일 액적 내에 가둘 수 있다.
세포는 잠재적으로 그 자체가 복수의 연결된 바코드들을 포함하는 다공성 비드 내에 가둬질 수 있다. 각각의 세포 및 고체 지지체는 임의의 유형의 용기, 마이크로용기, 반응 챔버, 반응 용기 등 내에 구획화될 수 있다.
단일 세포 또는 조합 바코딩은 마이크로웰을 이용하지 않고 수행될 수 있다. 단일 세포, 조합 바코딩 분석은 임의의 물리적 용기를 이용하지 않고 수행될 수 있다. 예를 들어, 물리적 용기가 없는 조합 바코딩 분석은, 상이한 세포/비드 쌍 사이에 확산 장벽을 생성하기 위해, 중합체 층 또는 겔 층 내에서 서로 근접하게 세포 및 비드를 내장함으로써 수행될 수 있다. 또 다른 예에서, 물리적 용기가 없는 조합 바코딩은 원 위치(in situ), 생체 내, 온전한 고체 조직 상, 온전한 세포 상, 및/또는 세포내에서 수행될 수 있다.
마이크로웰 어레이는 분석 시스템의 소모성 구성요소일 수 있다. 마이크로웰 어레이는 재사용할 수 있다. 마이크로웰 어레이는 수동으로 분석을 수행하기 위한 자립형 디바이스로 이용하기 위해 구성될 수 있거나, 분석 절차의 전체 또는 부분적인 자동화를 제공하는 기기 시스템의 고정된 또는 제거가능한 구성요소를 포함하도록 구성될 수 있다. 개시된 방법의 일부 구현예에서, 바코드(예를 들어, 추계적 바코드)의 비드-기재 라이브러리는 분석 절차의 일부로서 마이크로웰 어레이의 웰 내에 침착될 수 있다. 일부 구현예에서, 비드는 마이크로웰 어레이의 웰 내로 미리 로딩될 수 있고, 예를 들어, 핵산 표적의 바코딩(예를 들어, 추계적 바코딩) 및 디지털 계수를 수행하기 위한 키트의 일부로서 사용자에게 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 2 개의 짝지어진 마이크로웰 어레이가 제공되며, 하나는 제1 자석에 의해 공간에 고정되는 비드로 미리 로딩된 것이고, 다른 하나는 사용자가 개별 세포들을 로딩하는 데 이용하기 위한 것이다. 세포를 제2 마이크로웰 어레이 내로 분포시킨 후, 2 개의 어레이는 면대면으로 위치될 수 있고, 제2 자석을 이용하여 제1 어레이로부터 제2 어레이의 상응하는 마이크로웰 내로 비드를 인출하는 동안, 제1 자석은 제거됨으로써, 제2 마이크로웰 어레이의 세포들 위에 비드가 안착되는 것을 보장하여, 세포 용해 후 표적 분자의 확산 손실을 최소화하는 한편, 비드 상에서 바코드에 대한 표적 분자의 효율적인 부착을 최대화할 수 있다.
본 개시 내용의 마이크로웰 어레이는 고체 지지체(예를 들어, 비드)로 미리 로딩될 수 있다. 마이크로웰 어레이의 각 웰은 단일 고체 지지체를 포함할 수 있다. 마이크로웰 어레이 내 웰의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%는 단일 고체 지지체로 미리 로딩될 수 있다. 마이크로웰 어레이 내 웰의 최대 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%는 단일 고체 지지체로 미리 로딩될 수 있다. 고체 지지체는 본 개시 내용의 바코드(예를 들어, 추계적 바코드)를 포함할 수 있다. 상이한 고체 지지체 상에서의 바코드의 세포 표지는 상이할 수 있다. 동일한 고체 지지체 상에서의 바코드의 세포 표지는 동일할 수 있다.
바코딩 방법
본 개시 내용은 물리적 샘플(예를 들어, 조직, 기관, 종양, 세포) 내 별개의 위치에 별개의 표적의 수를 추산하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 바코드(예를 들어, 추계적 바코드)를 샘플과 근접하여 위치시키는 단계, 세포를 용해하는 단계, 별개의 표적을 바코드와 연결하는 단계, 표적을 증폭하는 단계 및/또는 표적을 디지털 계수하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 바코드 상에서 공간 표지로부터 수득된 정보를 분석하고/하거나 시각화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 샘플 내 복수의 표적들을 시각화하는 단계를 포함한다. 샘플의 맵 상에 복수의 표적들을 매핑하는 단계는 샘플의 2차원 맵 또는 3차원 맵을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 2차원 맵 및 3차원 맵은 샘플 내 복수의 표적들을 바코딩(예를 들어, 추계적 바코딩)하기 전 또는 후에 생성될 수 있다. 샘플 내 복수의 표적들을 시각화하는 단계는 샘플의 맵 상에 복수의 표적들을 매핑하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플의 맵 상에 복수의 표적들을 매핑하는 단계는 샘플의 2차원 맵 또는 3차원 맵을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 2차원 맵 및 3차원 맵은 샘플 내 복수의 표적들을 바코딩하기 전 또는 후에 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 2차원 맵 및 3차원 맵은 샘플을 용해시키기 전 또는 후에 생성될 수 있다. 2차원 맵 또는 3차원 맵의 생성 전 또는 후에 샘플을 용해하는 단계는 샘플을 가열하는 단계, 샘플을 세제와 접촉시키는 단계, 샘플의 pH를 변화시키는 단계, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 표적들을 바코딩하는 단계는 복수의 바코드들을 복수의 표적들과 혼성화하여 바코딩된 표적(예를 들어, 추계적으로 바코딩된 표적)을 생성하는 단계를 포함한다. 복수의 표적들을 바코딩하는 단계는 바코딩된 표적의 색인 라이브러리를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 바코딩된 표적의 색인 라이브러리를 생성하는 단계는 복수의 바코드들(예를 들어, 추계적 바코드)을 포함하는 고체 지지체를 이용하여 수행될 수 있다.
샘플과 바코드의 접촉
본 개시 내용은 샘플(예를 들어, 세포)을 본 개시 내용의 기재와 접촉시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 세포, 기관, 또는 조직 박편을 포함하는 샘플은 바코드(예를 들어, 추계적 바코드)에 접촉될 수 있다. 세포는, 예를 들어, 중력 흐름에 의해 접촉될 수 있으며, 세포가 침전되어 단일 층을 생성할 수 있다. 샘플은 조직 박편일 수 있다. 박편은 기재 상에 위치될 수 있다. 샘플은 1차원(예를 들어, 편평한 표면을 형성함)일 수 있다. 샘플(예를 들어, 세포)은 예를 들어, 기재 상에서 세포를 성장/배양시킴으로써 기재에 걸쳐 퍼질 수 있다.
바코드가 표적과 근접하여 있는 경우, 표적은 바코드에 혼성화될 수 있다. 바코드는 각각의 별개의 표적이 본 개시 내용의 별개의 바코드와 연결될 수 있도록 비-고갈성 비율로 접촉될 수 있다. 표적과 바코드 사이의 효율적인 연결을 보장하기 위하여, 표적은 바코드에 가교결합될 수 있다.
세포 용해
세포 및 바코드의 분포 후, 세포는 용해되어 표적 분자를 자유롭게 할 수 있다. 세포 용해는 다양한 수단 중 임의의 것에 의해, 예를 들어, 화학적 또는 생화학적 수단에 의해, 삼투압 충격에 의해, 또는 열 용해, 기계적 용해 또는 광학적 용해를 통해 달성될 수 있다. 세포는 세제(예를 들어, SDS, Li 도데실 설페이트, Triton X-100, Tween-20, 또는 NP-40), 유기 용매(예를 들어, 메탄올 또는 아세톤), 또는 소화 효소(예를 들어, 프로테이나제 K, 펩신, 또는 트립신), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 세포 용해 버퍼를 첨가함으로써 용해될 수 있다. 표적 및 바코드의 연결을 증가시키기 위하여, 표적 분자의 확산 속도는, 예를 들어, 온도를 감소시키고/감소시키거나 용해물의 점도를 증가시킴으로써 변경될 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플은 여과지를 이용하여 용해될 수 있다. 여과지는 여과지의 맨 위에서 용해 버퍼로 적실 수 있다. 여과지는 샘플의 용해 및 샘플의 표적을 기재로 혼성화하는 것을 용이하게 할 수 있는 압력으로 샘플에 적용될 수 있다.
일부 구현예에서, 용해는 기계적 용해, 열 용해, 광학 용해, 및/또는 화학적 용해에 의해 수행될 수 있다. 화학적 용해는 소화 효소, 예컨대 프로테이나제 K, 펩신, 및 트립신의 이용을 포함할 수 있다. 용해는 용해 버퍼를 기재에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 용해 버퍼는 Tris HCl을 포함할 수 있다. 용해 버퍼는 적어도 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 또는 1 M, 또는 그 이상의 Tris HCl을 포함할 수 있다. 용해 버퍼는 최대 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 또는 1 M, 또는 그 이상의 Tris HCL을 포함할 수 있다. 용해 버퍼는 약 0.1 M Tris HCl을 포함할 수 있다. 용해 버퍼의 pH는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10, 또는 그 이상일 수 있다. 용해 버퍼의 pH는 최대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 용해 버퍼의 pH는 약 7.5이다. 용해 버퍼는 염(예를 들어, LiCl)을 포함할 수 있다. 용해 버퍼 중 염의 농도는 적어도 약 0.1, 0.5, 또는 1 M, 또는 그 이상일 수 있다. 용해 버퍼 중 염의 농도는 최대 약 0.1, 0.5, 또는 1 M, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 용해 버퍼 중 염의 농도는 약 0.5M이다. 용해 버퍼는 세제(예를 들어, SDS, Li 도데실 설페이트, 트리톤 X, 트윈, NP-40)를 포함할 수 있다. 용해 버퍼 중 세제의 농도는 적어도 약 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 또는 7%, 또는 그 이상일 수 있다. 용해 버퍼 중 세제의 농도는 최대 약 0.0001%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 또는 7%, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 용해 버퍼 중 세제의 농도는 약 1% Li 도데실 설페이트이다. 용해 방법에 사용되는 시간은 사용되는 세제의 양에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 세제가 더 많이 사용될수록, 용해에 필요한 시간은 더욱 줄어든다. 용해 버퍼는 킬레이트화제(예를 들어, EDTA, EGTA)를 포함할 수 있다. 용해 버퍼 중 킬레이트화제의 농도는 적어도 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 또는 30 mM, 또는 그 이상일 수 있다. 용해 버퍼 중 킬레이트화제의 농도는 최대 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 또는 30mM, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 용해 버퍼 중 킬레이트화제의 농도는 약 10 mM이다. 용해 버퍼는 환원 시약(예를 들어, 베타-메르캅토에탄올, DTT)을 포함할 수 있다. 용해 버퍼 중 환원 시약의 농도는 적어도 약 1, 5, 10, 15, 또는 20 mM, 또는 그 이상일 수 있다. 용해 버퍼 중 환원 시약의 농도는 최대 약 1, 5, 10, 15, 또는 20 mM, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 용해 버퍼 중 환원 시약의 농도는 약 5 mM이다. 일부 구현예에서, 용해 버퍼는 약 0.1M TrisHCl, 약 pH 7.5, 약 0.5M LiCl, 약 1% 리튬 도데실 설페이트, 약 10mM EDTA, 및 약 5mM DTT를 포함할 수 있다.
용해는 약 4, 10, 15, 20, 25, 또는 30℃의 온도에서 수행될 수 있다. 용해는 약 1, 5, 10, 15, 또는 20 분, 또는 그 이상 동안 수행될 수 있다. 용해된 세포는 적어도 약 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 또는 700000 개, 또는 그 이상의 표적 핵산 분자를 포함할 수 있다. 용해된 세포는 최대 약 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 또는 700000 개, 또는 그 이상의 표적 핵산 분자를 포함할 수 있다.
표적 핵산 분자에 대한 바코드의 부착
세포의 용해 및 그로부터의 핵산 분자의 방출 후, 핵산 분자는 공동-국재화된 고체 지지체의 바코드와 랜덤으로 연결될 수 있다. 연결은, 바코드의 표적 인식 영역을 표적 핵산 분자의 상보적인 부분에 혼성화하는 것(예를 들어, 바코드의 올리고(dT)는 표적의 폴리(A) 테일과 상호작용할 수 있음)을 포함할 수 있다. 혼성화에 사용되는 분석 조건(예를 들어, 버퍼 pH, 이온 강도, 온도 등)은 특정 안정한 혼성화물의 형성을 촉진하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 용해된 세포로부터 방출된 핵산 분자는 기재 상에서 복수의 프로브들과 연결될 수 있다(예를 들어, 기재 상에서 프로브와 혼성화됨). 프로브가 올리고(dT)를 포함하는 경우, mRNA 분자는 프로브에 혼성화되고, 역전사될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 올리고(dT) 부분은 cDNA 분자의 제1 가닥 합성을 위한 프라이머로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 도 2에 도시된 바코딩의 비제한적인 예에 있어서, 블록(216)에서, mRNA 분자는 비드 상에서 바코드에 혼성화될 수 있다. 예를 들어, 단일가닥 뉴클레오티드 단편은 바코드의 표적-결합 영역에 혼성화될 수 있다.
부착은 바코드의 표적 인식 영역 및 표적 핵산 분자 부분의 배위를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적 결합 영역은 제한 부위 오버행(예를 들어, EcoRI 점착성-말단 오버행)에 특이적 혼성화가 가능할 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 분석 절차는 표적 핵산을 제한 효소(예를 들어, EcoRI)로 처리하여 제한 부위 오버행을 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이어서 바코드는 제한 부위 오버행에 상보적인 서열을 포함하는 임의의 핵산 분자에 배위될 수 있다. 2 개의 단편을 접합하기 위해 리가제(예를 들어, T4 DNA 리가제)가 사용될 수 있다.
예를 들어, 도 2에 도시된 바코딩의 비제한적인 예에서, 블록(220)에서, 복수의 세포들(또는 복수의 샘플들)로부터 표지된 표적(예를 들어, 표적-바코드 분자)은, 예를 들어, 튜브 내로 연속적으로 풀링될 수 있다. 표지된 표적은 예를 들어, 그 표적-바코드 분자가 부착된 바코드 및/또는 비드를 회수함으로써 풀링될 수 있다.
부착된 표적-바코드 분자의 고체 지지체-기반 컬렉션의 회수는 자석 비드 및 외부-인가 자기장을 이용하여 실행될 수 있다. 표적-바코드 분자가 일단 풀링되면, 모든 추가 공정은 단일 반응 용기에서 진행될 수 있다. 추가 공정은, 예를 들어, 역전사 반응, 증폭 반응, 분할 반응, 분해 반응, 및/또는 핵산 연장 반응을 포함할 수 있다. 추가 공정 반응은 마이크로 웰 내에서, 즉 표지된 표적 핵산 분자를 복수의 세포들로부터 먼저 풀링하지 않고, 수행될 수 있다.
역전사
본 개시 내용은 역전사를 이용하여 표적-바코드 컨쥬게이트를 생성하는 방법을 제공한다(예를 들어, 도 2의 블록(224)). 표적-바코드 컨쥬게이트는 표적 핵산(즉, 바코딩된 cDNA 분자, 예컨대 추계적으로 바코딩된 cDNA 분자)의 전부 또는 일부의 바코드 및 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 연결된 RNA 분자의 역전사는 역전사효소와 함께 역전사 프라이머의 첨가에 의해 일어날 수 있다. 역전사 프라이머는 올리고(dT) 프라이머, 랜덤 헥사뉴클레오티드 프라이머, 또는 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머일 수 있다. 올리고(dT) 프라이머는 12 내지 18 개이거나, 대략 상기 값의 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 포유동물 mRNA의 3' 말단에서 내인성 폴리(A) 테일에 결합한다. 랜덤 헥사뉴클레오티드 프라이머는 다양한 상보적인 부위에서 mRNA에 결합될 수 있다. 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머는 통상적으로 관심 대상의 mRNA를 선택적으로 프라이밍한다.
일부 구현예에서, 표지된-RNA 분자의 역전사는 역전사 프라이머의 추가에 의해 일어날 수 있다. 일부 구현예에서, 역전사 프라이머는 올리고(dT) 프라이머, 랜덤 헥사뉴클레오티드 프라이머, 또는 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머이다. 일반적으로, 올리고(dT) 프라이머는 12 내지 18 개의 뉴클레오티드 길이이고, 포유동물 mRNA의 3' 말단에서 내인성 폴리(A)+ 테일에 결합한다. 랜덤 헥사뉴클레오티드 프라이머는 다양한 상보적인 부위에서 mRNA에 결합될 수 있다. 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머는 통상적으로 관심 대상의 mRNA를 선택적으로 프라이밍한다.
역전사는 복수의 표지된-cDNA 분자를 생성하기 위해 반복적으로 일어날 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 회의 역전사 반응을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 적어도 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 회의 역전사 반응을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
증폭
표지된 표적 핵산 분자의 복수의 복제물을 생성하기 위해, 하나 이상의 핵산 증폭 반응(예를 들어, 도 2의 블록(228))이 수행될 수 있다. 증폭은 다중화된 방식으로 수행될 수 있으며, 다중 표적 핵산 서열은 동시에 증폭된다. 증폭 반응은 서열화 어댑터를 핵산 분자에 첨가하기 위해 사용될 수 있다. 증폭 반응은 존재하는 경우, 샘플 표지의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 증폭 반응은 세포 표지 및/또는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지)의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 증폭 반응은 샘플 태그, 세포 표지, 공간 표지, 바코드(예를 들어, 분자 표지), 표적 핵산, 또는 이들의 조합의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 증폭 반응은 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 100%, 또는 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위의 복수의 핵산을 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 하나 이상의 cDNA 합성 반응을 수행하여, 샘플 표지, 세포 표지, 공간 표지, 및/또는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지)을 포함하는 표적-바코드 분자의 하나 이상의 cDNA 복제물을 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 수행될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, PCR은 DNA의 상보적 가닥의 동시 프라이머 연장에 의해 특정 DNA 서열을 시험관 내 증폭하기 위한 반응을 지칭할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, PCR은 반응의 유도 형태들을 포괄할 수 있으며, RT-PCR, 실시간 PCR, 네스티드(nessted) PCR, 정량 PCR, 다중 PCR, 디지털 PCR, 및 어셈블리 PCR을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
표지된 핵산의 증폭은 비-PCR 기반 방법을 포함할 수 있다. 비-PCR 기반 방법의 예는 다중 전이 증폭(MDA), 전사-매개 증폭(TMA), 핵산 서열-기반 증폭(NASBA), 가닥 전이 증폭(SDA), 실시간 SDA, 회전 원형 증폭, 또는 써클-투-써클(circle-to-circle) 증폭을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 기타 비-PCR-기반 증폭 방법은, DNA 또는 RNA 표적을 증폭시키기 위한 DNA-의존성 RNA 중합효소-구동된 RNA 전사 증폭 또는 RNA-배향(directed) DNA 합성 및 전사의 다중 사이클, 리가제 사슬 반응(LCR), 및 Qβ 복제효소(Qβ) 방법, 회문식 프로브의 이용, 가닥 전이 증폭, 제한 엔도뉴클레아제를 이용하는 올리고뉴클레오티드-구동된 증폭, 프라이머가 핵산 서열에 혼성화되고 결과의 듀플렉스가 연장 반응 및 증폭 전에 분할되는 증폭 방법, 5' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 핵산 중합효소를 이용하는 가닥 전이 증폭, 회전 원형 증폭, 및 분지 연장 증폭(RAM)을 포함한다. 일부 구현예에서, 증폭은 원형화된 전사물을 생성하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 표지된 핵산(예를 들어, 표지된-RNA, 표지된-DNA, 표지된-cDNA) 상에서 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 표지된-암플리콘(예를 들어, 추계적으로 표지된-암플리콘)을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 표지된-암플리콘은 이중가닥 분자일 수 있다. 이중가닥 분자는 이중가닥 RNA 분자, 이중가닥 DNA 분자, 또는 DNA 분자에 혼성화된 RNA 분자를 포함할 수 있다. 이중가닥 분자 중 하나 또는 모두는 샘플 표지, 공간 표지, 세포 표지, 및/또는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지)을 포함할 수 있다. 표지된-암플리콘은 단일가닥 분자를 포함할 수 있다. 단일가닥 분자는 DNA, RNA, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 핵산은 합성 또는 변경된 핵산을 포함할 수 있다.
증폭은 하나 이상의 비-천연 뉴클레오티드의 이용을 포함할 수 있다. 비-천연 뉴클레오티드는 광불안정성 또는 촉발성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 비-천연 뉴클레오티드의 예는, 펩티드 핵산(PNA), 모르폴리노 및 고정 핵산(LNA)뿐만 아니라, 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오스 핵산(TNA)을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 비-천연 뉴클레오티드는 1회 이상의 사이클의 증폭 반응에 첨가될 수 있다. 비-천연 뉴클레오티드의 첨가는 증폭 반응에서 특정 사이클 또는 시점으로서 생성물을 식별하기 위해 사용될 수 있다.
하나 이상의 증폭 반응의 수행은 하나 이상의 프라이머의 이용을 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 12 내지 15 개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 복수의 표지된 표적들(예를 들어, 추계적으로 표지된 표적)의 적어도 일부에 어닐링될 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 복수의 표지된 표적들의 3' 말단 또는 5' 말단에 어닐링될 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 복수의 표지된 표적들의 내부 영역에 어닐링될 수 있다. 내부 영역은 복수의 표지된 표적들의 3' 말단으로부터 적어도 약 50, 100, 150, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 또는 1000 개의 뉴클레오티드일 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 프라이머의 고정된 패널을 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 적어도 하나 이상의 커스텀(custom) 프라이머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 적어도 하나 이상의 제어 프라이머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 적어도 하나 이상의 유전자-특이적 프라이머를 포함할 수 있다.
하나 이상의 프라이머는 범용 프라이머를 포함할 수 있다. 범용 프라이머는 범용 프라이머 결합 부위에 어닐링될 수 있다. 하나 이상의 커스텀 프라이머는 제1 샘플 표지, 제2 샘플 표지, 공간 표지, 세포 표지, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지), 표적, 또는 이들의 임의의 조합에 어닐링될 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 범용 프라이머와 커스텀 프라이머를 포함할 수 있다. 커스텀 프라이머는 하나 이상의 표적을 증폭시키도록 설계될 수 있다. 표적은 하나 이상의 샘플 중 총 핵산의 하위세트를 포함할 수 있다. 표적은 하나 이상의 샘플 중 총 표지된 표적의 하위세트를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 적어도 96 개 이상의 커스텀 프라이머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 적어도 960 개 이상의 커스텀 프라이머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 적어도 9600 개 이상의 커스텀 프라이머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 커스텀 프라이머는 둘 이상의 상이한 표지된 핵산에 어닐링될 수 있다. 둘 이상의 상이한 표지된 핵산은 하나 이상의 유전자에 상응할 수 있다.
임의의 증폭 체계가 본 개시 내용의 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 체계에서, PCR의 제1회차는 유전자 특이적 프라이머, 및 범용 일루미나(Illumina) 서열화 프라이머 1 서열에 대한 프라이머를 이용하여 비드에 부착된 분자를 증폭시킬 수 있다. PCR의 제2회차는, 일루미나 서열화 프라이머 2 서열에 의해 측면근접된(flanked) 네스티드 유전자 특이적 프라이머, 및 범용 일루미나 서열화 프라이머 1 서열에 대한 프라이머를 이용하여 제1 PCR 생성물을 증폭시킬 수 있다. PCR의 제3회차는 P5와 P7 및 샘플 색인을 추가하여 PCR 생성물을 일루미나 서열화 라이브러리로 변화시킨다. 150 bp x 2 서열화를 이용한 서열화는 판독 1 상에서 세포 표지 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지), 판독 2 상에서 유전자, 및 색인 1 판독 상에서 샘플 색인을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산은 화학적 분할을 이용하여 기재로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 핵산 내 존재하는 화학 기 또는 변경된 염기가 고체 지지체로부터 핵산의 제거를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 효소는 기재로부터 핵산을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 제한 엔도뉴클레아제 분해를 통해 기재로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 우라실-d-글리코실라제(UDG)로 dUTP 또는 ddUTP를 함유하는 핵산을 처리하는 것이 기재로부터 핵산을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 뉴클레오티드 절제를 수행하는 효소, 예컨대 염기 절제 복구 효소, 예컨대 아푸린/아피리미딘(apurinic/apyrimidinic)(AP) 엔도뉴클레아제를 이용하여 기재로부터 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 광분할성 기 및 광을 이용하여 기재로부터 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, 분할가능한 링커가 기재로부터 핵산을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 분할가능한 링커는 적어도 하나의 비오틴/아비딘, 비오틴/스트렙트아비딘, 비오틴/뉴트라비딘, Ig-단백질 A, 광불안정성 링커, 산 또는 염기 불안정성 링커 기, 또는 압타머를 포함할 수 있다.
프로브가 유전자-특이적인 경우, 분자는 프로브에 혼성화될 수 있고, 역전사되고/되거나 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 합성된(예를 들어, 역전사된) 후, 증폭될 수 있다. 증폭은 다중 방식으로 수행될 수 있으며, 다중 표적 핵산 서열은 동시에 증폭된다. 증폭은 서열화 어댑터를 핵산에 첨가할 수 있다.
일부 구현예에서, 증폭은 기재 상에서 예를 들어, 가교 증폭을 이용하여 수행될 수 있다. cDNA는 기재 상에서 올리고(dT) 프로브를 이용하여 가교 증폭에 상용가능한 말단을 생성하기 위한 테일이 있는 단일중합체일 수 있다. 가교 증폭에서, 주형 핵산의 3' 말단에 상보적인 프라이머는 고체 입자에 공유결합적으로 부착된 각 쌍의 제1 프라이머일 수 있다. 주형 핵산을 함유하는 샘플이 입자와 접촉되고 단일 열 사이클이 수행되는 경우, 주형 분자는 제1 프라이머에 어닐링될 수 있고, 제1 프라이머는 뉴클레오티드의 첨가에 의해 순방향으로 신장되어 주형 분자, 및 주형에 상보적인 새로 형성된 DNA 가닥으로 이루어지는 듀플렉스 분자를 형성한다. 다음 사이클의 가열 단계에서, 듀플렉스 분자는 변성되어, 입자로부터 주형 분자를 방출시키고, 제1 프라이머를 통해 입자에 부착된 상보적 DNA 가닥을 남긴다. 이어지는 어닐링 및 신장 단계의 어닐링 단계에서, 상보적 가닥은 제2 프라이머에 혼성화될 수 있으며, 여기서 제2 프라이머는 제1 프라이머로부터 제거된 위치에서 상보적 가닥의 절편에 대해 상보적이다. 이러한 혼성화는, 공유결합에 의해 제1 프라이머에, 그리고 혼성화에 의해 제2 프라이머에 고정되는, 제1 프라이머 및 제2 프라이머 사이의 가교를 형성하는 상보적 가닥을 발생시킬 수 있다. 신장 단계에서, 제2 프라이머는 동일한 반응 혼합물 내 뉴클레오티드의 첨가에 의해 역방향으로 신장됨으로써, 가교를 이중가닥 가교로 전환시킬 수 있다. 이어서 다음 사이클이 시작되고, 이중가닥 가교는 변성되어, 각각 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 통해 입자 표면에 부착된 한쪽 말단과, 미부착된 각각의 다른 말단을 각각 갖는, 2 개의 단일가닥 핵산 분자를 산출한다. 이 제2 사이클의 어닐링 및 신장 단계에서, 각각의 가닥은 동일 입자 상에서 이전에 사용되지 않은 추가의 상보적 프라이머에 혼성화되어, 신규의 단일 가닥 가교를 형성할 수 있다. 이제 혼성화되는 이전에 사용되지 않은 2 개의 프라이머는 신장되어, 2 개의 새로운 가교를 이중가닥 가교로 전환시킨다.
증폭 반응은 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 100%의 복수의 핵산들을 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다.
표지된 핵산의 증폭은 PCR-기반 방법 또는 비-PCR 기반 방법을 포함할 수 있다. 표지된 핵산의 증폭은 표지된 핵산의 지수적 증폭을 포함할 수 있다. 표지된 핵산의 증폭은 표지된 핵산의 선형 증폭을 포함할 수 있다. 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 수행될 수 있다. PCR은 DNA의 상보적 가닥의 동시 프라이머 연장에 의한 특정 DNA 서열의 시험관 내 증폭을 위한 반응을 지칭할 수 있다. PCR은 반응의 유도 형태들을 포괄할 수 있으며, RT-PCR, 실시간 PCR, 네스티드 PCR, 정량 PCR, 다중 PCR, 디지털 PCR, 억제 PCR, 반-억제성 PCR 및 어셈블리 PCR을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 표지된 핵산의 증폭은 비-PCR 기반 방법을 포함한다. 비-PCR 기반 방법의 예는 다중 전이 증폭(MDA), 전사-매개 증폭(TMA), 핵산 서열-기반 증폭(NASBA), 가닥 전이 증폭(SDA), 실시간 SDA, 회전 원형 증폭, 또는 써클-투-써클 증폭을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 기타 비-PCR-기반 증폭 방법은, DNA 또는 RNA 표적을 증폭시키기 위한 DNA-의존성 RNA 중합효소-구동된 RNA 전사 증폭 또는 RNA-배향 DNA 합성 및 전사의 다중 사이클, 리가제 사슬 반응(LCR), 및 Qβ 복제효소(Qβ), 회문식 프로브의 이용, 가닥 전이 증폭, 제한 엔도뉴클레아제를 이용하는 올리고뉴클레오티드-구동된 증폭, 프라이머가 핵산 서열에 혼성화되고 결과의 듀플렉스가 연장 반응 및 증폭 전에 분할되는 증폭 반응, 5' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 핵산 중합효소를 이용하는 가닥 전이 증폭, 회전 원형 증폭, 및 분지 연장 증폭(RAM)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 증폭된 암플리콘(예를 들어, 표적) 상에서 네스티드 중합효소 연쇄 반응을 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 암플리콘은 이중가닥 분자일 수 있다. 이중가닥 분자는 이중가닥 RNA 분자, 이중가닥 DNA 분자, 또는 DNA 분자에 혼성화된 RNA 분자를 포함할 수 있다. 이중가닥 분자의 가닥 하나 또는 둘 모두는 샘플 태그 또는 분자 식별자 표지를 포함할 수 있다. 대안적으로, 암플리콘은 단일가닥 분자일 수 있다. 단일 가닥 분자는 DNA, RNA, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 합성 또는 변경된 핵산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 표지된 핵산을 반복적으로 증폭시켜 다수의 암플리콘을 생성하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 개시된 방법은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개의 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로는, 방법은 적어도 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 개의 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함한다.
증폭은 하나 이상의 제어 핵산을, 복수의 핵산들을 포함하는 하나 이상의 샘플에 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 증폭은 하나 이상의 제어 핵산을 복수의 핵산들에 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 제어 핵산은 제어 표지를 포함할 수 있다.
증폭은 하나 이상의 비-천연 뉴클레오티드의 이용을 포함할 수 있다. 비-천연 뉴클레오티드는 광불안정성 및/또는 촉발성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 비-천연 뉴클레오티드의 예는, 펩티드 핵산(PNA), 모르폴리노 및 고정 핵산(LNA)뿐만 아니라, 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오스 핵산(TNA)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 비-천연 뉴클레오티드는 1회 이상의 사이클의 증폭 반응에 첨가될 수 있다. 비-천연 뉴클레오티드의 첨가는 증폭 반응에서 특정 사이클 또는 시점으로서 생성물을 식별하기 위해 사용될 수 있다.
하나 이상의 증폭 반응을 수행하는 단계는 하나 이상의 프라이머의 이용을 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 적어도 약 7 내지 9 개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 12 내지 15 개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 복수의 표지된 핵산들의 적어도 일부에 어닐링될 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 복수의 표지된 핵산들의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 어닐링될 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 복수의 표지된 핵산들의 내부 영역에 어닐링될 수 있다. 내부 영역은 복수의 표지된 핵산들의 3' 말단으로부터 적어도 약 50, 100, 150, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 또는 1000 개의 뉴클레오티드일 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 프라이머의 고정된 패널을 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 적어도 하나 이상의 커스텀 프라이머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 적어도 하나 이상의 제어 프라이머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 적어도 하나 이상의 하우스키핑(housekeeping) 유전자 프라이머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 범용 프라이머를 포함할 수 있다. 범용 프라이머는 범용 프라이머 결합 부위에 어닐링될 수 있다. 하나 이상의 커스텀 프라이머는 제1 샘플 태그, 제2 샘플 태그, 분자 식별자 표지, 핵산 또는 이의 생성물에 어닐링될 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 범용 프라이머 및 커스텀 프라이머를 포함할 수 있다. 커스텀 프라이머는 하나 이상의 표적 핵산을 증폭시키도록 설계될 수 있다. 표적 핵산은 하나 이상의 샘플 중 총 핵산의 하위세트를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 프라이머는 본 개시 내용의 어레이에 부착된 프로브이다.
일부 구현예에서, 샘플 내 복수의 표적들의 바코딩(예를 들어, 추계적 바코딩)은 바코딩된 단편의 색인 라이브러리를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 상이한 바코드의 바코드 서열(예를 들어, 상이한 추계적 바코드의 분자 표지)은 서로 상이할 수 있다. 바코딩된 표적(예를 들어, 추계적으로 바코딩된 표적)의 색인 라이브러리를 생성하는 단계는 샘플 내 복수의 표적들로부터 복수의 색인된 폴리뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 제1 색인된 표적 및 제2 색인된 표적을 포함하는 바코딩된 표적의 색인 라이브러리의 경우, 제1 색인된 폴리뉴클레오티드의 표지 영역은 제2 색인된 폴리뉴클레오티드의 표지 영역과, 약, 적어도 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 개, 또는 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위의 뉴클레오티드에 의해 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 바코딩된 표적의 색인 라이브러리를 생성하는 단계는, 복수의 표적들, 예를 들어, mRNA 분자를, 폴리(T) 영역 및 표지 영역을 포함하는 복수의 올리고뉴클레오티드들과 접촉시키는 단계; 및 역전사효소를 이용하여 제1 가닥 합성을 수행하여, cDNA 영역 및 표지 영역을 각각 포함하는 단일가닥 표지된 cDNA 분자를 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 복수의 표적들은 상이한 서열의 적어도 2 개의 mRNA 분자를 포함하고, 복수의 올리고뉴클레오티드들은 상이한 서열의 적어도 2 개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 바코딩된 표적의 색인 라이브러리를 생성하는 단계는, 단일 가닥 표지된 cDNA 분자를 증폭시켜 이중가닥 표지된 cDNA 분자를 생성하는 단계; 및 이중가닥 표지된 cDNA 분자 상에서 네스티드 PCR을 수행하여 표지된 암플리콘을 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 어댑터-표지된 암플리콘을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
추계적 바코딩은 개별적인 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 분자를 표지하기 위해 핵산 바코드 또는 태그를 이용할 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 바코드 또는 태그가 mRNA로부터 생성됨에 따라, 이들을 cDNA 분자에 첨가하는 단계를 포함한다. 네스티드 PCR이 PCR 증폭 편향을 최소화하기 위해 수행될 수 있다. 어댑터는 예를 들어, 차세대 서열화(NGS)를 이용하여 서열화하기 위해 첨가될 수 있다. 서열화 결과는 예를 들어, 도 2의 블록(232)에서, 세포 표지, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지), 및 표적의 하나 이상의 복제물의 뉴클레오티드 단편의 서열을 결정하는 데 사용될 수 있다.
도 3은 바코딩된 표적(예를 들어, 추계적으로 바코딩된 표적), 예를 들어, mRNA의 색인 라이브러리를 생성하는 비제한적인 예시적인 과정을 보여주는 개략도이다. 단계 1에 나타낸 바와 같이, 역전사 과정은 고유 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지), 세포 표지, 및 범용 PCR 부위를 갖는 mRNA 분자 각각을 인코딩할 수 있다. 구체적으로, RNA 분자(302)는 역전사되어 표지된 cDNA 분자(304)를 생성할 수 있으며, 여기서 표지된 cDNA 분자(304)는 바코드(예를 들어, 추계적 바코드)(310)의 세트를 RNA 분자(302)의 폴리(A) 테일 영역(308)에 혼성화(예를 들어, 추계적 혼성화)함으로써 cDNA 영역(306)을 포함한다. 바코드(310) 각각은 표적-결합 영역, 예를 들어, 폴리(dT) 영역(312), 바코드 서열 또는 분자 표지(314), 및 범용 PCR 영역(316)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 표지는 3 내지 20 개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지)은 3 내지 20 개의 뉴크레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 추계적 바코드들의 각각은 범용 표지 및 세포 표지 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 범용 표지는 고체 지지체 상에서 복수의 추계적 바코드들에 대해 동일하고, 세포 표지는 고체 지지체 상에서 복수의 추계적 바코드들에 대해 동일하다. 일부 구현예에서, 범용 표지는 3 내지 20 개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 표지는 3 내지 20 개의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 표지 영역(314)은 바코드 서열 또는 분자 표지(318) 및 세포 표지(320)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표지 영역(314)는 범용 표지, 치수 표지, 및 세포 표지 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바코드 서열 또는 분자 표지(318)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 개이거나, 약, 적어도, 또는 최대 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 세포 표지(320)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 개이거나, 약, 적어도, 또는 최대 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 범용 표지는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 개이거나, 약, 적어도, 또는 최대 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 범용 표지는 고체 지지체 상에서 복수의 추계적 바코드들에 대해 동일하며, 치수 표지는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 개이거나, 약, 적어도, 또는 최대 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
일부 구현예에서, 표지 영역(314)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 개이거나, 약, 적어도, 또는 최대 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위의 상이한 표지, 예컨대 바코드 서열 또는 분자 표지(318) 및 세포 표지(320)를 포함할 수 있다. 각 표지는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 개이거나, 약, 적어도, 또는 최대 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 바코드 또는 추계적 바코드(310)의 세트는 10, 20, 40, 50, 70, 80, 90, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1020 개이거나, 약, 적어도, 또는 최대 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위의 바코드 또는 추계적 바코드(310)를 함유할 수 있다. 바코드 또는 추계적 바코드(310)의 세트는 예를 들어, 고유 표지 영역(314)을 각각 함유할 수 있다. 표지된 cDNA 분자(304)는 과량의 바코드 또는 추계적 바코드(310)를 제거하기 위해 정제될 수 있다. 정제는 암퓨어(Ampure) 비드 정제를 포함할 수 있다.
단계 2에 나타낸 바와 같이, 단계 1에서 역전사 공정으로부터의 생성물은 1 개의 튜브 내로 풀링되고, 제1 PCR 프라이머 풀 및 제1 범용 PCR 프라이머를 이용하여 PCR 증폭될 수 있다. 고유 표지 영역(314) 때문에 풀링이 가능하다. 구체적으로, 표지된 cDNA 분자(304)는 증폭되어 네스티드 PCR 표지된 암플리콘(322)을 생성할 수 있다. 증폭은 다중 PCR 증폭을 포함할 수 있다. 증폭은 단일 반응 부피 내 96 개의 다중 프라이머를 이용한 다중 PCR 증폭을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중 PCR 증폭은 단일 반응 부피 내 10, 20, 40, 50, 70, 80, 90, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1020 개이거나, 약, 적어도, 또는 최대 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위의 다중 프라이머를 사용할 수 있다. 증폭은 특정 유전자를 표적화하는 커스텀 프라이머(326A~C) 및 범용 프라이머(328)의 제1 PCR 프라이머 풀(324)를 포함할 수 있다. 커스텀 프라이머(326)는 표지된 cDNA 분자(304)의 cDNA 부분(306') 내의 영역에 혼성화될 수 있다. 범용 프라이머(328)는 표지된 cDNA 분자(304)의 범용 PCR 영역(316)에 혼성화될 수 있다.
도 3의 단계 3에 나타낸 바와 같이, 단계 2에서 PCR 증폭으로부터의 생성물은 네스티드 PCR 프라이머 풀 및 제2 범용 PCR 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있다. 네스티드 PCR은 PCR 증폭 편향을 최소화할 수 있다. 구체적으로, 네스티드 PCR 표지된 암플리콘(322)는 네스티드 PCR에 의해 추가로 증폭될 수 있다. 네스티드 PCR은 단일 반응 부피 내에서 네스티드 PCR 프라이머(332a~c)의 네스티드 PCR 프라이머 풀(330) 및 제2 범용 PCR 프라이머(328')를 이용하는 다중 PCR을 포함할 수 있다. 네스티드 PCR 프라이머 풀(328)은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 개이거나, 약, 적어도, 또는 최대 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위의 상이한 네스트된 PCR 프라이머(330)를 함유할 수 있다. 네스티드 PCR 프라이머(332)는 어댑터(334)를 함유할 수 있고, 표지된 암플리콘(322)의 cDNA 부분(306") 내 영역에 혼성화될 수 있다. 범용 프라이머(328')는 어댑터(336)을 함유할 수 있고, 표지된 암플리콘(322)의 범용 PCR 영역(316)에 혼성화될 수 있다. 따라서, 단계 3은 어댑터-표지된 암플리콘(338)을 생성한다. 일부 구현예에서, 네스티드 PCR 프라이머(332) 및 제2 범용 PCR 프라이머(328')는 어댑터(334 및 336)를 함유할 수 없다. 대신에 어댑터(334 및 336)는 네스티드 PCR의 생성물에 배위되어 어댑터-표지된 암플리콘(338)을 생성할 수 있다.
단계 4에 나타낸 바와 같이, 단계 3으로부터의 PCR 생성물은 라이브러리 증폭 프라이머를 이용하는 서열화를 위해 PCR 증폭될 수 있다. 구체적으로, 어댑터(334 및 336)는 어댑터-표지된 암플리콘(338) 상에서 하나 이상의 추가 분석을 수행하는 데 사용될 수 있다. 어댑터(334 및 336)는 프라이머(340 및 342)에 혼성화될 수 있다. 프라이머(340 및 342) 중 하나 이상은 PCR 증폭 프라이머일 수 있다. 프라이머(340 및 342) 중 하나 이상은 서열화 프라이머일 수 있다. 어댑터(334 및 336) 중 하나 이상은 어댑터-표지된 암플리콘(338)의 추가의 증폭에 사용될 수 있다. 어댑터(334 및 336) 중 하나 이상은 어댑터-표지된 암플리콘(338)의 서열화에 사용될 수 있다. 프라이머(342)는 플레이트 색인(344)를 함유하여, 바코드 또는 추계적 바코드(310)의 동일한 세트를 이용하여 생성된 암플리콘이 차세대 서열화(NGS)를 이용하는 하나의 서열화 반응에서 서열화될 수 있도록 한다.
올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 세포 성분 결합 시약을 포함하는 조성물
본 명세서에 개시된 일부 구현예는 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 세포 성분 결합 시약(예를 들어, 단백질 결합 시약)을 각각 포함하는 복수의 조성물들을 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 컨쥬게이트되는 세포 성분 결합 시약에 대한 고유 식별자를 포함한다. 세포 성분 결합 시약의 결합 표적은 탄수화물, 지질, 단백질, 세포외 단백질, 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 인테그린, 세포내 단백질, 또는 이들의 임의의 조합이거나, 이들을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 성분 결합 시약(예를 들어, 단백질 결합 시약)은 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 바코드, 예컨대 추계적 바코드를 포함할 수 있다. 바코드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지), 세포 표지, 샘플 표지, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 각각은 링커를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 각각은 올리고뉴클레오티드 프로브, 예컨대 폴리(A) 테일에 대한 결합 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리(A) 테일은 예를 들어, 고체 지지체에 고정되지 않거나 고체 지지체에 고정될 수 있다. 폴리(A) 테일은 약 10 내지 50 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 18 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 이들 모두를 포함할 수 있다.
고유 식별자는, 예를 들어, 임의의 적합한 길이, 예를 들어, 약 4 개의 뉴클레오티드 내지 약 200 개의 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 25 개의 뉴클레오티드 내지 약 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 약 4 개의 뉴클레오티드, 5 개의 뉴클레오티드, 6 개의 뉴클레오티드, 7 개의 뉴클레오티드, 8 개의 뉴클레오티드, 9 개의 뉴클레오티드, 10 개의 뉴클레오티드, 15 개의 뉴클레오티드, 20 개의 뉴클레오티드, 25 개의 뉴클레오티드, 30 개의 뉴클레오티드, 35 개의 뉴클레오티드, 40 개의 뉴클레오티드, 45 개의 뉴클레오티드, 50 개의 뉴클레오티드, 55 개의 뉴클레오티드, 60 개의 뉴클레오티드, 70 개의 뉴클레오티드, 80 개의 뉴클레오티드, 90 개의 뉴클레오티드, 100 개의 뉴클레오티드, 200 개의 뉴클레오티드이거나, 대략 상기 값이거나, 상기 값 미만이거나, 상기 값 초과이거나, 상기 값들 중 임의의 두 값 사이의 범위의 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택된다. 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1,000, 적어도 2,000, 적어도 5,000 개, 또는 그 이상의 상이한 고유 식별자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 세트는 분석될 샘플의 DNA 또는 RNA 서열에 대해 최소 서열 상동성을 갖도록 설계된다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 세트의 서열은, 적어도 1 개의 뉴클레오티드, 적어도 2 개의 뉴클레오티드, 적어도 3 개의 뉴클레오티드, 적어도 4 개의 뉴클레오티드, 적어도 5 개의 뉴클레오티드, 적어도 6 개의 뉴클레오티드, 적어도 7 개의 뉴클레오티드, 적어도 8 개의 뉴클레오티드, 적어도 9 개의 뉴클레오티드, 적어도 10 개의 뉴클레오티드, 또는 그 이상에 의해, 서로 상이하거나, 그의 보체이다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 세트의 서열은 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 또는 그 이상에 의해, 서로 상이하거나, 그의 보체이다.
일부 구현예에서, 고유 식별자는 프라이머, 예컨대 범용 프라이머에 대한 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 프라이머, 예컨대 범용 프라이머에 대해 적어도 2 개의 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 프라이머, 예컨대 범용 프라이머에 대해 적어도 3 개의 결합 부위를 포함할 수 있다. 프라이머는 예를 들어, PCR 증폭에 의해, 고유 식별자들의 증폭에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 프라이머는 네스티드 PCR 반응에 사용될 수 있다.
임의의 적합한 단백질 결합 시약이 본 개시 내용에 고려되며, 예컨대 항체 또는 이들의 단편, 압타머, 소분자, 리간드, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 등, 또는 이들의 임의의 조합이 있다. 일부 구현예에서, 단백질 결합 시약은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 재조합 항체, 단일 사슬 항체(sc-Ab), 또는 이들의 단편, 예컨대 Fab, Fv 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 결합 시약들은 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1,000, 적어도 2,000, 적어도 5,000 개, 또는 그 이상의 상이한 단백질 결합 시약을 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 다양한 메커니즘을 통해 단백질 결합 시약과 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 단백질 결합 시약과 공유결합적으로 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 단백질 결합 시약과 비-공유결합적으로 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 단백질 결합 시약과 컨쥬게이트된다. 링커는 예를 들어, 단백질 결합 시약 및/또는 올리고뉴클레오티드로부터 분할가능하거나 분리가능할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 올리고뉴클레오티드를 단백질 결합 시약에 가역적으로 부착시키는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 예를 들어, 아민 기를 통해 링커에 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트된 또 다른 화학 기와 안정한 결합을 형성하는 화학 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 화학 기는 아미노산, 예컨대 리신 상의 1차 아민, 또는 N-말단을 통해 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트될 수 있다. 구매 가능한 컨쥬게이션 키트, 예컨대 단백질-올리고 컨쥬게이션 키트(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 Solulink, Inc.), Thunder-Link® 올리고 컨쥬게이션 시스템(영국 캠브리지 소재의 Innova Biosciences) 등이 올리고뉴클레오티드를 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트하는 데 사용될 수 있다.
세포 성분 결합 시약과 그의 세포 성분 표적 사이의 특이적 결합을 방해하지 않는 한, 올리고뉴클레오티드는 세포 성분 결합 시약(예를 들어, 단백질 결합 시약)의 임의의 적합한 부위에 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 성분 결합 시약은 단백질이다. 일부 구현예에서, 세포 성분 결합 시약은 항체가 아니다. 단백질 결합 시약이 항체인 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 항원-결합 부위 외 임의의 위치, 예를 들어, Fc 영역, CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, CL 도메인 등에서 항체에 컨쥬게이트될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 항체에 컨쥬게이트하는 방법은 이전에 예를 들어, 미국 특허 제6,531,283호에 개시되어 있으며, 이의 내용은 그 전체가 참고로서 본 명세서에 명시적으로 포함된다. 단백질 결합 시약에 대한 올리고뉴클레오티드의 화학량론은 변화될 수 있다. 서열화에서 단백질 결합 시약 특이적 올리고뉴클레오티드의 검출 감도를 증가시키기 위하여, 컨쥬게이션 동안 올리고뉴클레오티드 대 단백질 결합 시약의 비율을 증가시키는 것이 유리할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 단백질 결합 시약은 단일 올리고뉴클레오티드 분자와 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 단백질 결합 시약은 하나 초과의 올리고뉴클레오티드 분자, 예를 들어, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 1,000 개, 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 분자와 컨쥬게이션될 수 있으며, 여기서 각각의 올리고뉴클레오티드 분자는 동일한 고유 식별자를 포함한다.
도 4는 예시적인 단백질 결합 시약, 예를 들어, 항체의 개략도를 보여주며, 항체는 그 항체에 대한 고유 식별자 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된다. 항체와 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드, 항체와 컨쥬게이션하기 위한 올리고뉴클레오티드, 또는 항체와 미리 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드는 본 명세서에서 항체 올리고뉴클레오티드("AbOligo" 또는 "AbO"로서 약기됨)로 지칭될 수 있다. 또한 올리고뉴클레오티드는 추가의 성분을 포함할 수 있으며, 하나 이상의 링커, 항체에 대한 하나 이상의 고유 식별자, 선택적으로 하나 이상의 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지), 및 폴리(A) 테일을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는, 5' 에서 3'으로, 링커, 고유 식별자, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지), 및 폴리(A) 테일을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 세포 성분 결합 시약들은 샘플, 예컨대 단일 세포, 복수의 세포들, 조직 샘플, 종양 샘플, 혈액 샘플 등에서 복수의 세포 성분 표적들에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 성분 결합 시약은 단백질 결합 시약이고, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포내 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포내 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질들은, 생물 내 모든 인코딩된 단백질의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 1,000, 적어도 10,000 개, 또는 그 이상의 상이한 단백질 표적을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 항체 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지), 폴리(A) 테일, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 올리고뉴클레오티드는 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드의 포획 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 바코드의 표적 결합 영역은 포획 서열을 포함할 수 있다. 표적 결합 영역은, 예를 들어, 폴리(dT) 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바코드의 포획 서열에 상보적인 항체 올리고뉴클레오티드의 서열은 폴리(A) 테일을 포함할 수 있다. 항체 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 올리고뉴클레오티드 서열은 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 128, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 올리고뉴클레오티드 서열은 적어도, 또는 최대 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 128, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 또는 1000 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질 결합 시약은 항체, 테트라머, 압타머, 단백질 스캐폴드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 항체 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 링커를 통해 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트될 수 있다. 하나의 항체 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 단백질 결합 시약의 분자에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 결합 시약은 ADAM10, CD156c, ANO6, ATP1B2, ATP1B3, BSG, CD147, CD109, CD230, CD29, CD298, ATP1B3, CD44, CD45, CD47, CD51, CD59, CD63, CD97, CD98, SLC3A2, CLDND1, HLA-ABC, ICAM1, ITFG3, MPZL1, NA K ATP아제 알파1, ATP1A1, NPTN, PMCA ATPase, ATP2B1, SLC1A5, SLC29A1, SLC2A1, SLC44A2, 또는 이들의 임의의 조합에 결합될 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 표적은 세포외 단백질, 세포내 단백질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 표적은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 인테그린, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 단백질 표적은 지질, 탄수화물, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 단백질 표적은 다수의 단백질 표적을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 단백질 표적의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 단백질 표적의 수는 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10000 개일 수 있다.
단백질 결합 시약은 동일한 서열을 갖는 둘 이상의 항체 올리고뉴클레오티드와 연결될 수 있다. 단백질 결합 시약은 상이한 항체 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 둘 이상의 항체 올리고뉴클레오티드와 연결될 수 있다. 단백질 결합 시약과 연결된 항체 올리고뉴클레오티드의 수는 상이한 실시에서 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 올리고뉴클레오티드의 수는, 동일하거나 상이한 서열을 갖는지의 여부에 관계없이, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 올리고뉴클레오티드의 수는 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 개일 수 있다.
복수의 조성물들은 항체 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트되지 않은 하나 이상의 추가의 단백질 결합 시약(또한, 항체 올리고뉴클레오티드-자유 단백질 결합 시약으로서 본 명세서에서 지칭됨)을 포함할 수 있다. 복수의 조성물 중 추가의 단백질 결합 시약의 수는 상이한 실시에서 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 단백질 결합 시약의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 단백질 결합 시약의 수는 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 개일 수 있다. 단백질 결합 시약 및 임의의 추가의 단백질 결합 시약은, 일부 구현예에서 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 항체 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약(들) 및 항체 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트되지 않은 단백질 결합 시약(들)을 포함하는 혼합물이 제공된다. 혼합물은 본 명세서에 개시된 방법의 일부 구현예에서, 예를 들어, 샘플(들) 또는 세포(들)과 접촉시키는 데 사용될 수 있다. (1) 항체 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약의 수와 (2) 항체 올리고뉴클레오티드 또는 혼합물 내 다른 항체 올리고뉴클레오티드(들)과 컨쥬게이트되지 않은 또 다른 단백질 결합 시약(예를 들어, 동일한 단백질 결합 시약)의 수의 비는 상이한 실시에서 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 비는 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000, 1:6000, 1:7000, 1:8000, 1:9000, 1:10000이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 비는 적어도, 또는 최대 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000, 1:6000, 1:7000, 1:8000, 1:9000, 또는 1:10000일 수 있다.
일부 구현예에서, 비는 1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1, 48:1, 49:1, 50:1, 51:1, 52:1, 53:1, 54:1, 55:1, 56:1, 57:1, 58:1, 59:1, 60:1, 61:1, 62:1, 63:1, 64:1, 65:1, 66:1, 67:1, 68:1, 69:1, 70:1, 71:1, 72:1, 73:1, 74:1, 75:1, 76:1, 77:1, 78:1, 79:1, 80:1, 81:1, 82:1, 83:1, 84:1, 85:1, 86:1, 87:1, 88:1, 89:1, 90:1, 91:1, 92:1, 93:1, 94:1, 95:1, 96:1, 97:1, 98:1, 99:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1, 600:1, 700:1, 800:1, 900:1, 1000:1, 2000:1, 3000:1, 4000:1, 5000:1, 6000:1, 7000:1, 8000:1, 9000:1, 10000:1이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 비는 적어도, 또는 최대 1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1, 48:1, 49:1, 50:1, 51:1, 52:1, 53:1, 54:1, 55:1, 56:1, 57:1, 58:1, 59:1, 60:1, 61:1, 62:1, 63:1, 64:1, 65:1, 66:1, 67:1, 68:1, 69:1, 70:1, 71:1, 72:1, 73:1, 74:1, 75:1, 76:1, 77:1, 78:1, 79:1, 80:1, 81:1, 82:1, 83:1, 84:1, 85:1, 86:1, 87:1, 88:1, 89:1, 90:1, 91:1, 92:1, 93:1, 94:1, 95:1, 96:1, 97:1, 98:1, 99:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1, 600:1, 700:1, 800:1, 900:1, 1000:1, 2000:1, 3000:1, 4000:1, 5000:1, 6000:1, 7000:1, 8000:1, 9000:1, 또는 10000:1일 수 있다.
단백질 결합 시약은 항체 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이트되거나 컨쥬게이트되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약 및 항체 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트되지 않은 단백질 결합 시약(들)을 포함하는 혼합물에서 항체 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약의 백분율은 0.000000001%, 0.00000001%, 0.0000001%, 0.000001%, 0.00001%, 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 혼합물에서 항체 올리고뉴클레오티드컨쥬게이트된 단백질 결합 시약의 백분율은 적어도, 또는 최대 0.000000001%, 0.00000001%, 0.0000001%, 0.000001%, 0.00001%, 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약 및 항체 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트되지 않은 단백질 결합 시약(들)을 포함하는 혼합물에서 항체 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트되지 않은 단백질 결합 시약의 백분율은 0.000000001%, 0.00000001%, 0.0000001%, 0.000001%, 0.00001%, 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 혼합물 내에서 항체 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트되지 않은 단백질 결합 시약의 백분율은 적어도, 또는 최대 0.000000001%, 0.00000001%, 0.0000001%, 0.000001%, 0.00001%, 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다.
세포 성분 표적의 정량 분석 방법
본 명세서에 개시된 일부 구현예는, 본 명세서에 개시된 조성물, 및 세포 성분 결합 시약(예를 들어, 단백질 결합 시약)의 올리고뉴클레오티드에 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 연결할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 샘플 내 복수의 세포 성분 표적들(예를 들어, 단백질 표적들)의 정량 분석 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 샘플은 단일 세포, 복수의 세포들, 조직 샘플, 종양 샘플, 혈액 샘플 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 세포 유형들, 예컨대 정상 세포, 종양 세포, 혈액 세포, B 세포, T 세포, 모계 세포, 태아 세포 등의 혼합물, 또는 상이한 대상체로부터의 세포의 혼합물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플은 개별적인 구획들, 예컨대 마이크로웰 어레이의 마이크로웰 내에, 분리된 복수의 단일 세포들을 포함할 수 있다
세포 성분 결합 시약의 결합 표적(즉, 세포 성분 표적)은, 예를 들어, 탄수화물, 지질, 단백질, 세포외 단백질, 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 인테그린, 세포내 단백질, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있거나 이들을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 성분 표적은 단백질 표적이다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포내 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질들은, 생물 내 인코딩된 모든 단백질의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 1,000, 적어도 10,000 개, 또는 그 이상의 상이한 단백질 표적들을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 결합 시약들은 복수의 단백질 표적들과의 특이적 결합을 위해 샘플과 접촉된다. 미결합 단백질 결합 시약은 예를 들어, 세척에 의해 제거될 수 있다. 샘플이 세포를 포함하는 구현예에서, 세포에 특이적으로 결합되지 않은 임의의 단백질 결합 시약은 제거될 수 있다.
일부 경우에서, 세포들의 개체군으로부터의 세포는 본 개시 내용의 기판의 웰 내로 분리(예를 들어, 단리)될 수 있다. 세포들의 개체군은 분리 전에 희석될 수 있다. 세포들의 개체군은, 기판의 웰의 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%가 단일 세포를 수신하도록 희석될 수 있다. 세포들의 개체군은, 기판의 웰들의 최대 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%가 단일 세포를 수신하도록 희석될 수 있다. 세포들의 개체군은, 희석된 개체군에서 세포의 수가 기판 상의 웰의 수의 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%가 되거나, 적어도 상기 값이 되도록 희석될 수 있다. 세포들의 개체군은, 희석된 개체군에서 세포의 수가 기판 상의 웰의 수의 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%가 되거나, 적어도 상기 값이 되도록 희석될 수 있다. 일부 경우에서, 세포들의 개체군은 세포의 수가 기판 내 웰의 수의 약 10%가 되도록 희석된다.
단일 세포가 기판의 웰들 내로 분포되는 것은 푸와송 분포를 따를 수 있다. 예를 들어, 기판의 웰이 하나 초과의 세포를 갖는 확률은 적어도 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%, 또는 그 이상일 수 있다. 기판의 웰이 하나 초과의 세포를 갖는 확률은 적어도 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%, 또는 그 이상일 수 있다. 단일 세포가 기판의 웰들 내로 분포되는 것은 랜덤일 수 있다. 단일 세포가 기판의 웰들 내로 분포되는 것은 비-랜덤일 수 있다. 세포는 기판의 웰이 하나의 세포만 수신하도록 분리될 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 결합 시약은 형광 분자와 추가적으로 컨쥬게이트되어 개별적인 구획으로의 세포의 유동 분류를 가능하게 할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 복수의 조성물들을 복수의 단백질 표적들과 특이적으로 결합시키기 위해 샘플과 접촉시키는 단계를 제공한다. 사용되는 조건이 단백질 결합 시약, 예를 들어, 항체를 단백질 표적에 특이적으로 결합시킬 수 있음이 이해될 것이다. 접촉 단계 이후, 미결합된 조성물은 제거될 수 있다. 예를 들어, 샘플이 세포를 포함하고, 단백질 표적에 특이적으로 결합하는 조성물이 세포-표면 단백질인 구현예에서, 단백질 표적에 특이적으로 결합하는 조성물만이 세포와 함께 잔류하도록, 세포를 버퍼로 세척함으로써 미결합된 조성물이 제거될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 방법은 바코드 서열(예컨대 분자 표지), 세포 표지, 샘플 표지 등, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있는 바코드(예를 들어, 추계적 바코드)를 단백질 결합 시약의 복수의 올리고뉴클레오티드들에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 바코드를 포함하는 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들은 조성물을 복수의 올리고뉴클레오티드들에 혼성화하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들은 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 고체 지지체는 용액 내에서 자유롭게 부유하는 예를 들어, 비드일 수 있다. 고체 지지체는 반-고체 또는 고체 어레이에 내장될 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들은 고체 지지체 상에 고정될 수 없다. 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들이 단백질 결합 시약의 복수의 올리고뉴클레오티드들에 근접하여 있는 경우, 단백질 결합 시약의 복수의 올리고뉴클레오티드들은 올리고뉴클레오티드 프로브에 혼성화될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 단백질 결합 시약의 각각의 별개의 올리고뉴클레오티드가 본 개시 내용의 상이한 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지)을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브와 연결될 수 있도록 비-고갈성 비율로 접촉될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 단백질 표적에 특이적으로 결합된 단백질 결합 시약으로부터 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계를 제공한다. 분리는 단백질 결합 시약으로부터 화학 기를 분리하기 위한 다양한 방법, 예컨대 UV 광분할, 화학 처리(예를 들어, 디티오트레이톨), 가열, 효소 처리, 또는 이들의 임의의 조합으로 수행될 수 있다. 단백질 결합 시약으로부터 올리고뉴클레오티드의 분리는 조성물의 올리고뉴클레오티드들에 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들을 혼성화하는 단계 전, 후 또는 그 동안 중 어느 하나에서 수행될 수 있다.
단백질 및 핵산 표적의 동시 정량 분석 방법
본 명세서에 개시된 일부 구현예는, 본 명세서에 개시된 조성물, 및 단백질 결합 시약의 올리고뉴클레오티드와 핵산 표적 분자 모두에 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 연결할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여, 샘플에서 복수의 단백질 표적들 및 복수의 핵산 표적 분자들의 동시 정량 분석 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 샘플은 단일 세포, 복수의 세포들, 조직 샘플, 종양 샘플, 혈액 샘플 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 세포 유형들, 예컨대 정상 세포, 종양 세포, 혈액 세포, B 세포, T 세포, 모계 세포, 태아 세포 등의 혼합물, 또는 상이한 개체들로부터의 세포들의 혼합물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플은 개별적인 구획들, 예컨대 마이크로웰 어레이의 마이크로웰 내로 분리된 복수의 단일 세포들을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포내 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질들은 생물 내 인코딩된 모든 단백질의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 1,000, 적어도 10,000 개, 또는 그 이상의 상이한 단백질 표적을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 결합 시약들은 복수의 단백질 표적들과의 특이적 결합을 위해 샘플과 접촉된다. 미결합 단백질 결합 시약은, 예를 들어, 세척에 의해 제거될 수 있다. 샘플이 세포를 포함하는 구현예에서, 세포에 특이적으로 결합되지 않은 임의의 단백질 결합 시약은 제거될 수 있다.
일부 경우에서, 세포들의 개체군으로부터의 세포는 본 개시 내용의 기판의 웰 내로 분리(예를 들어, 단리)될 수 있다. 세포들의 개체군은 분리 전에 희석될 수 있다. 세포들의 개체군은, 기판의 웰의 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%가 단일 세포를 수신하도록 희석될 수 있다. 세포들의 개체군은 기판의 웰의 최대 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%가 단일 세포를 수신하도록 희석될 수 있다. 세포들의 개체군은, 희석된 개체군에서 세포의 수가 기판 상의 웰의 수의 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%가 되거나, 적어도 상기 값이 되도록 희석될 수 있다. 세포들의 개체군은, 희석된 개체군에서 세포의 수가 기판 상의 웰의 수의 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%가 되거나, 적어도 상기 값이 되도록 희석될 수 있다. 일부 경우에서, 세포들의 개체군은 세포의 수가 기판 내 웰의 수의 약 10%가 되도록 희석된다.
단일 세포가 기판의 웰들 내로 분포되는 것은 푸와송 분포를 따를 수 있다. 예를 들어, 기판의 웰이 하나 초과의 세포를 갖는 확률은 적어도 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%, 또는 그 이상일 수 있다. 기판의 웰이 하나 초과의 세포를 갖는 확률은 적어도 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%, 또는 그 이상일 수 있다. 단일 세포가 기판의 웰들 내로 분포되는 것은 랜덤일 수 있다. 단일 세포가 기판의 웰들 내로 분포되는 것은 비-랜덤일 수 있다. 세포는 기판의 웰이 하나의 세포만 수신하도록 분리될 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 결합 시약은 형광 분자와 추가적으로 컨쥬게이트되어 개별적인 구획으로의 세포의 유동 분류를 가능하게 할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 복수의 조성물들을 복수의 단백질 표적들과 특이적으로 결합시키기 위해 샘플과 접촉시키는 단계를 제공한다. 사용되는 조건이 단백질 결합 시약, 예를 들어, 항체를 단백질 표적에 특이적으로 결합시킬 수 있음이 이해될 것이다. 접촉 단계 이후, 미결합된 조성물은 제거될 수 있다. 예를 들어, 샘플이 세포를 포함하고, 단백질 표적에 특이적으로 결합하는 조성물이 세포-표면 단백질인 구현예에서, 단백질 표적에 특이적으로 결합하는 조성물만이 세포와 함께 잔류하도록, 세포를 버퍼로 세척함으로써 미결합된 조성물이 제거될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 샘플, 예를 들어, 세포로부터의 복수의 핵산 표적 분자들을 방출하는 단계를 제공할 수 있다. 예를 들어, 세포는 용해되어 복수의 핵산 표적 분자들을 방출할 수 있다. 세포 용해는 다양한 수단 중 임의의 것, 예를 들어, 화학 처리, 삼투압 충격, 열 처리, 기계적 처리, 광학 처리 또는 이들의 임의의 조합에 의해 달성될 수 있다. 세포는 세제(예를 들어, SDS, Li 도데실 설페이트, 트리톤 X-100, 트윈-20, 또는 NP-40), 유기 용매(예를 들어, 메탄올 또는 아세톤), 또는 소화 효소(예를 들어, 프로테이나제 K, 펩신, 또는 트립신), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 세포 용해 버퍼의 첨가에 의해 용해될 수 있다.
복수의 핵산 분자들이 다양한 핵산 분자를 포함할 수 있음은 본 기술분야의 당업자는 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 복수의 핵산 분자들은 DNA 분자, RNA 분자, 유전체 DNA 분자, mRNA 분자, rRNA 분자, siRNA 분자, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있고, 이중가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 핵산 분자들은 적어도 100, 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 20,000, 적어도 30,000, 적어도 40,000, 적어도 50,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 또는 그 이상의 화학종을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 핵산 분자들은 샘플, 예컨대 단일 세포, 또는 복수의 세포들로부터의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 핵산 분자들은 복수의 샘플들, 예컨대 복수의 단일 세포들로부터 풀링될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 방법은 바코드 서열(예컨대 분자 표지), 세포 표지, 샘플 표지 등 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있는 바코드(예를 들어, 추계적 바코드)를, 복수의 핵산 표적 분자들, 및 단백질 결합 시약의 복수의 올리고뉴클레오티드들에 연결하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 바코드를 포함하는 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들은, 복수의 핵산 표적 분자들 및 조성물의 복수의 올리고뉴클레오티드들에 혼성화하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들은 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 고체 지지체는 용액 내에서 자유롭게 부유하는 예를 들어, 비드일 수 있다. 고체 지지체는 반-고체 또는 고체 어레이에 내장될 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들은 고체 지지체 상에 고정될 수 없다. 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들이 복수의 핵산 표적 분자들 및 단백질 결합 시약의 복수의 올리고뉴클레오티드들과 근접하여 있는 경우, 복수의 핵산 표적 분자들 및 단백질 결합 시약의 복수의 올리고뉴클레오티드들은 올리고뉴클레오티드 프로브에 혼성화될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 각각의 별개의 핵산 표적 분자 및 단백질 결합 시약의 올리고뉴클레오티드가 본 개시 내용의 상이한 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지)을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브와 연결될 수 있도록 비-고갈성 비율로 접촉될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 단백질 표적에 특이적으로 결합된 단백질 결합 시약으로부터 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계를 제공한다. 분리는 단백질 결합 시약으로부터 화학 기를 분리하기 위한 다양한 방법, 예컨대 UV 광분할, 화학 처리(예를 들어, 디티오트레이톨), 가열, 효소 처리, 또는 이들의 임의의 조합으로 수행될 수 있다. 단백질 결합 시약으로부터 올리고뉴클레오티드의 분리는 조성물의 복수의 핵산 표적 분자들 및 올리고뉴클레오티드들에 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들을 혼성화하는 단계 전, 후 또는 그 동안 중 어느 하나에서 수행될 수 있다.
바코드의 연결
단백질 결합 시약의 올리고뉴클레오티드, 및/또는 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드 프로브에 랜덤으로 연결될 수 있다. 연결은, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브의 표적 결합 영역을, 표적 핵산 분자의 상보적 부분 및/또는 단백질 결합 시약의 올리고뉴클레오티드로 혼성화하는 것(예를 들어, 바코드의 올리고(dT)는 표적 핵산 분자의 폴리(A) 테일 및/또는 단백질 결합 시약의 올리고뉴클레오티드의 폴리(A) 테일과 상호작용할 수 있음)을 포함할 수 있다. 혼성화에 사용되는 분석 조건(예를 들어, 버퍼 pH, 이온 강도, 온도 등)은 특정 안정한 혼성화물의 형성을 촉진하도록 선택될 수 있다.
본 개시 내용은 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지)을, 역전사를 이용하여 표적 핵산 및/또는 단백질 결합 시약의 올리고뉴클레오티드와 연결하는 방법을 제공한다. 역전사효소는 주형으로서 RNA 및 DNA를 모두 사용할 수 있기 때문에, 단백질 결합 시약 상에 원래 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 염기 중 어느 하나, 또는 이들 모두로 구성될 수 있다. 단백질 결합 시약 특이적 올리고뉴클레오티드는 복제되어, 세포 mRNA 분자에 추가하여, 세포 표지 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지)에 공유결합적으로 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지)은 올리고뉴클레오티드 프로브 표적 결합 영역 및 표적 핵산 분자의 일부 및/또는 단백질 결합 시약의 올리고뉴클레오티드의 배위에 의해 첨가될 수 있다. 예를 들어, 표적 결합 영역은 제한 부위 오버행(예를 들어, EcoRI 점착성-말단 오버행)에 특이적 혼성화가 가능할 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 방법은 표적 핵산 및/또는 단백질 결합 시약의 올리고뉴클레오티드를 제한 효소(예를 들어, EcoRI)로 처리하여 제한 부위 오버행을 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 2 개의 단편을 접합하기 위해 리가제(예를 들어, T4 DN리가제)가 사용될 수 있다.
단백질 및 핵산 표적의 동시 정량 분석
도 5는 단일 세포 내에서 단백질 및 핵산 표적 모두의 동시 정량 분석의 예시적인 방법의 개략도를 보여준다. 일부 구현예에서, 단백질 결합 시약, 예컨대 항체를 각각 포함하는 복수의 조성물들(505, 505b, 505c 등)이 제공된다. 상이한 단백질 결합 시약, 예컨대 상이한 단백질 표적에 결합하는 항체는 상이한 고유 식별자와 컨쥬게이트된다. 그 다음, 단백질 결합 시약은 복수의 세포들을 함유하는 샘플(510)과 인큐베이션될 수 있다. 상이한 단백질 결합 시약은 세포 표면 상에서 단백질, 예컨대 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합에 특이적으로 결합할 수 있다. 미결합된 단백질 결합 시약은, 예를 들어, 세포를 버퍼로 세척함으로써 제거될 수 있다. 이어서, 단백질 결합 시약을 갖는 세포들은 복수의 구획들, 예컨대 마이크로웰 어레이 내로 분리될 수 있으며, 여기서 단일 구획(515)은 단일 세포 및 단일 비드(520)에 맞도록 크기조정된다. 각각의 비드는, 비드 상에서 모든 올리고뉴클레오티드 프로브에 일반적인 세포 표지를 포함할 수 있는 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들, 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브는 표적 결합 영역, 예를 들어, 폴리(dT) 서열을 포함할 수 있다. 항체에 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드(525)는 화학적, 광학적 또는 기타 수단을 이용하여 항체로부터 분리될 수 있다. 세포는 용해되어(535) 세포 내에 핵산, 예컨대 유전체 DNA 또는 세포성 mRNA(530)를 방출할 수 있다. 세포성 mRNA(530), 올리고뉴클레오티드(525) 또는 이들 모두는 비드(520) 상에서 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해, 예를 들어, 폴리(dT) 서열에 혼성화됨으로써 포획될 수 있다. 역전사효소는 세포성 mRNA(530) 및 올리고뉴클레오티드(525)를 주형으로서 이용하여 세포성 mRNA(530) 및 올리고뉴클레오티드(525)에 혼성화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 연장하는 데 사용될 수 있다. 역전사 효소에 의해 생성된 연장 생성물은 증폭 및 서열화될 수 있다. 서열화 판독은 세포 표지, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지), 유전자 식별, 항체 특이적 올리고 식별 등의 역다중화 처리될 수 있으며, 이는 샘플에서 각각의 단일 세포의 단백질 및 유전자 발현의 디지털 표시를 발생시킬 수 있다.
고유 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)의 수 결정
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 각각의 고유 식별자 및/또는 각각의 핵산 표적 분자에 대한 고유 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 서열화 판독은 각각의 고유 식별자 및/또는 각각의 핵산 표적 분자에 대한 고유 바코드 서열의 수를 결정하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 각각의 고유 식별자 및/또는 각각의 핵산 표적 분자에 대한 고유 바코드 서열의 수는 샘플에서 각각의 단백질 표적 및/또는 각각의 핵산 표적 분자의 양을 나타낸다. 일부 구현예에서, 단백질 표적의 양 및 그의 상응하는 핵산 표적 분자, 예를 들어, mRNA 분자의 양은 서로 비교될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 표적의 양과 그의 상응하는 핵산 표적 분자, 예를 들어, mRNA 분자의 양의 비율은 계산될 수 있다. 단백질 표적은 예를 들어, 세포 표면 단백질 마커일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 표면 단백질 마커의 단백질 수준과 세포 표면 단백질 마커의 mRNA의 수준 간의 비는 낮다.
본 명세서에 개시된 방법은 다양한 적용 분야에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 방법은 샘플의 단백질체 및/또는 전사체 분석에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 샘플에서 단백질 표적 및/또는 핵산 표적, 즉 바이오마커를 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 표적 및 핵산 표적은 서로 상응하며, 즉 핵산 표적은 단백질 표적을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 샘플, 예를 들어, mRNA 분자 내에서 단백질 표적의 양 및 그의 상응하는 핵산 표적 분자의 양의 바람직한 비를 갖는 단백질 표적을 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 비는 적어도 0.001, 적어도 0.01, 적어도 0.1, 적어도 1, 적어도 10, 적어도 100, 적어도 1000, 또는 그 이상, 또는 상기 값들 중 임의의 두 값 사이의 범위이다. 일부 구현예에서, 비는 최대 0.001, 최대 0.01, 최대 0.1, 최대 1, 최대 10, 최대 100, 최대 1000, 또는 그 미만 또는 상기 값들 중 임의의 두 값 사이의 범위이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은, 샘플에서 그의 상응하는 핵산 표적 분자의 양이 1000 미만, 100 미만, 10 미만, 5 미만, 2 미만, 1 미만, 또는 0인 샘플에서 단백질 표적을 식별하는 데 사용될 수 있다.
키트
본 명세서에 개시된 일부 구현예는 올리고뉴클레오티드와 각각 컨쥬게이트된 복수의 단백질 결합 시약들, 및 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들을 포함하는 샘플 중 복수의 단백질들 및 복수의 핵산 표적 분자들의 동시 정량 분석을 위한 키트를 제공하며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 단백질 결합 시약에 대한 고유 식별자를 포함하고, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들의 각각은 표적 결합 영역, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함하고, 바코드 서열은 고유 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)의 다양한 세트로부터 선택된다. 본 명세서의 개시는, 올리고뉴클레오티드와 각각 컨쥬게이트된 복수의 단백질 결합 시약들, 및 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들을 각각 포함하는 복수의 조성물들을 포함하는 샘플 중 복수의 단백질 표적들 및 복수의 핵산 표적 분자들의 동시 정량 분석을 위한 키트를 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 그와 컨쥬게이트된 복수의 단백질 결합 시약들 중 하나에 대한 고유 식별자를 포함하고, 단백질 결합 시약은 단백질 표적(예를 들어, 단백질 표적의 상이한 부분, 단백질 표적의 상이한 당편, 또는 단백질 표적의 상이한 동형단백질(isoform))에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 명세서의 개시는 올리고뉴클레오티드와 각각 컨쥬게이트된 복수의 단백질 결합 시약들, 및 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들을 각각 포함하는 복수의 조성물들을 포함하는 샘플 중 복수의 단백질 표적들 및 복수의 핵산 표적 분자들의 동시 정량 분석을 위한 키트를 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 그와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약에 대한 고유 식별자를 포함하고, 단백질 결합 시약은 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있다.
단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 복수의 단백질 결합 시약들 중 단백질 결합 시약의 수는 상이한 실시들에서 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결합 시약의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결합 시약의 수는 적어도 또는 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 개일 수 있다.
일부 구현예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지), 세포 표지, 샘플 표지, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 프로브, 예컨대 폴리(A) 테일에 대한 결합 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리(A) 테일은 예를 들어, 올리고dA18(고체 지지체에 고정되지 않음) 또는 올리고A18V(고체 지지체에 고정됨)일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 DNA 잔기, RNA 잔기 또는 이들 모두를 포함할 수 있다.
고유 식별자는 임의의 적합한 길이, 예를 들어, 약 25 개의 뉴클레오티드 내지 약 45 개의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 4 개의 뉴클레오티드, 5 개의 뉴클레오티드, 6 개의 뉴클레오티드, 7 개의 뉴클레오티드, 8 개의 뉴클레오티드, 9 개의 뉴클레오티드, 10 개의 뉴클레오티드, 15 개의 뉴클레오티드, 20 개의 뉴클레오티드, 25 개의 뉴클레오티드, 30 개의 뉴클레오티드, 35 개의 뉴클레오티드, 40 개의 뉴클레오티드, 45 개의 뉴클레오티드, 50 개의 뉴클레오티드, 55 개의 뉴클레오티드, 60 개의 뉴클레오티드, 70 개의 뉴클레오티드, 80 개의 뉴클레오티드, 90 개의 뉴클레오티드, 100 개의 뉴클레오티드, 200 개의 뉴클레오티드 길이, 대략 상기 길이, 상기 미만의 길이, 상기 초과의 길이, 또는 이들 중 임의의 두 값들 사이의 범위의 길이일 수 있다.
일부 구현예에서, 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택된다. 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1,000, 적어도 2,000, 적어도 5,000 개, 또는 그 이상의 상이한 고유 식별자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 고유 식별자들의 세트는 분석될 샘플의 DNA 또는 RNA 서열에 대한 최소 서열 상동성을 갖도록 설계된다. 일부 구현예에서, 고유 식별자의 세트의 서열은, 적어도 1 개의 뉴클레오티드, 적어도 2 개의 뉴클레오티드, 적어도 3 개의 뉴클레오티드, 적어도 4 개의 뉴클레오티드, 적어도 5 개의 뉴클레오티드, 적어도 6 개의 뉴클레오티드, 적어도 7 개의 뉴클레오티드, 적어도 8 개의 뉴클레오티드, 적어도 9 개의 뉴클레오티드, 적어도 10 개의 뉴클레오티드, 또는 그 이상에 의해, 서로 상이하거나, 그의 보체이다.
일부 구현예에서, 고유 식별자는 프라이머, 예컨대 범용 프라이머를 위한 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 프라이머, 예컨대 범용 프라이머를 위한 적어도 2 개의 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 고유 식별자는 프라이머, 예컨대 범용 프라이머를 위한 적어도 3 개의 결합 부위를 포함할 수 있다. 프라이머는 예를 들어, PCR 증폭에 의한 고유 식별자의 증폭을 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 프라이머는 네스티드 PCR 반응에 사용될 수 있다.
임의의 적합한 단백질 결합 시약이 본 개시 내용에서 고려되며, 예컨대 항체 또는 이들의 단편, 압타머, 소분자, 리간드, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 등 또는 이들의 임의의 조합이 있다. 일부 구현예에서, 단백질 결합 시약은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 재조합 항체, 단일-사슬 항체(SaBA), 재조합 항체, 단일-사슬(scAb), 또는 이들의 단편, 예컨대 Fab, Fv 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 결합 시약들은 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1,000, 적어도 2,000, 적어도 5,000, 또는 그 이상의 상이한 단백질 결합 시약을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 단백질 결합 시약과 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 단백질 결합 시약과 공유결합적으로 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 단백질 결합 시약과 비-공유결합적으로 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 올리고뉴클레오티드를 단백질 결합 시약에 가역적으로 부착시키는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 예를 들어, 아민 기를 통하여, 링커에 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트되는 또 다른 화학 기와 안정한 결합을 형성하는 화학 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 화학 기는 아미노산, 예컨대 리신 상에서 1차 아민, 또는 N-말단을 통해 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는, 단백질 결합 시약과 그의 단백질 표적 사이의 특이적 결합을 방해하지 않는 한, 단백질 결합 시약의 임의의 적합한 부위에 컨쥬게이트될 수 있다. 단백질 결합 시약이 항체인 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 항원 결합 부위 외의 임의의 위치, 예를 들어, Fc 영역, CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, CL 도메인 등에서 항체에 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 단백질 결합 시약은 단일 올리고뉴클레오티드 분자와 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 단백질 결합 시약은 1 개 초과의 올리고뉴클레오티드 분자, 예를 들어, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 1,000 개, 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 분자와 컨쥬게이트될 수 있으며, 여기서 각각의 올리고뉴클레오티드 분자는 동일한 고유 식별자를 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 결합 시약들은 샘플, 예컨대 단일 세포, 복수의 세포들, 조직 샘플, 종양 샘플, 혈액 샘플 등 내에서 복수의 단백질 표적들에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포내 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포내 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질들은 생물 내 인코딩된 단백질 모두의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 1,000, 적어도 10,000 개, 또는 그 이상의 상이한 단백질 표적을 포함할 수 있다.
단일 세포 서열화 제어 입자
본 명서세의 개시 내용은 예를 들어, 단일 세포 서열화 제어에 사용될 수 있는 제어 입자 조성물을 포함한다. 제어 입자 조성물은 본 명세서에 개시된 임의의 적합한 방법, 키트 및 시스템, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드와 연결된 세포 성분 결합 시약을 이용하여 세포 성분 발현 수준(예를 들어, 단백질 발현 수준)을 측정하기 위한 방법, 키트 및 시스템에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제어 입자 조성물은 제어 입자와 연결된 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 포함한다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들과 연결된 제어 입자는 또한 작용화된 제어 입자로서 본 명세서에서 지칭된다. 도 6a는 복수의 올리고뉴클레오티드들로 작용화된 입자의 비제한적인 예시적인 개략도이다. 도 6a는 제어 입자와 연결된 제어 입자 올리고뉴클레오티드가 제어 바코드 서열 및 폴리(dA) 영역을 포함하여, mRNA 폴리(A) 테일을 모방함을 보여준다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 범용 프라이머를 위한 결합 부위, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 제어 입자와 연결된 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 제어 입자와 연결된 적어도 2 개의 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 상이한 제어 바코드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 및 복수의 제2 제어 올리고뉴클레오티드들은 제어 입자와 연결되고, 제1 입자 올리고뉴클레오티드 및 제2 입자 올리고뉴클레오티드는 상이한 제어 바코드 서열을 갖는다.
비드, 예컨대 CompBeadTM Plus(BD(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크 소재))는 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 항체로 작용화될 수 있다. CompBeads Plus는 약 7.5 미크론 크기로, 면역 세포의 크기와 유사하다. 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 항체로 작용화된 경우, CompBead Plus는 단일 세포 작업흐름을 위한 제어 세포 또는 제어 입자로서 사용될 수 있다. AbO 작용화된 비드는 단일 세포 서열화 제어로서 임의의 단일 세포 작업흐름으로 사용될 수 있다.
제어 입자 올리고뉴클레오티드
제어 바코드 서열의 길이는 상이한 실시에서 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 제어 바코드 서열은 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 128, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 제어 바코드 서열은 적어도, 또는 최대 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 128, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 또는 1000 개의 뉴클레오티드 길이이다.
제어 입자 올리고뉴클레오티드의 길이는 상이한 실시에서 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 128, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 적어도 또는 최대 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 128, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 또는 1000 개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000 100000, 1000000, 10000000, 100000000, 1000000000 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값들 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수는 적어도 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000 100000, 1000000, 10000000, 100000000, 또는 1000000000 개일 수 있다.
복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 동일하거나 상이한 제어 바코드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 2 개는 상이한 제어 바코드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 적어도 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000 100000, 1000000, 10000000, 100000000, 또는 1000000000 개의 제어 바코드 서열은 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000 100000, 1000000, 10000000, 100000000, 1000000000 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값들 사이의 어떤 수 또는 범위의 제어 바코드 서열은 동일할 수 있다.
복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 적어도 또는 최대 0.000000001%, 0.00000001%, 0.0000001%, 0.000001%, 0.00001%, 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이들 중 임의의 두 값들 사이의 어떤 수 또는 범위의 제어 바코드 서열은 동일할 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 0.000000001%, 0.00000001%, 0.0000001%, 0.000001%, 0.00001%, 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값들 사이의 어떤 수 또는 범위의 제어 바코드 서열은 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 바코드 서열은 종의 유전체 서열에 대해 상동성이 아니다. 제어 바코드 서열은 종의 유전체 서열에 대해 상동성일 수 있다. 종은 비-포유동물 종일 수 있다. 비-포유동물 종은 파지 종일 수 있다. 파지 종은 T7 파지, PhiX 파지, 또는 이들의 조합일 수 있다.
제어 입자
일부 구현예에서, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나는 링커를 통해 제어 입자와 연결된다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나에 가역적으로 또는 비가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 디설피드 결합, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 이황화 결합, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
제어 입자의 직경은 1 내지 1000 마이크로미터, 예컨대 10 내지 100 마이크로미터 또는 7.5 마이크로미터 또는 대략 상기 직경일 수 있다. 일부 구현예에서, 제어 입자의 직경은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 마이크로미터 또는 대략 상기 직경, 또는 이들 중 임의의 두 값들 사이의 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 제어 입자의 직경은 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 마이크로미터일 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제어 입자 상에 고정될 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제어 입자 상에 부분적으로 고정될 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제어 입자 내에 봉입될 수 있다. 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제어 입자 내에 부분적으로 봉입될 수 있다. 제어 입자는 붕괴될 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 입자는 비드일 수 있다. 비드는 세파로스 비드, 스트렙트아비딘 비드, 아가로스 비드, 자석 비드, 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 올리고(dT) 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 제어 입자는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스티렌, 유리, 폴리프로필렌, 아가로스, 젤라틴, 하이드로겔, 상자성체, 세라믹, 플라스틱, 유리, 메틸스티렌, 아크릴성 중합체, 티타늄, 라텍스, 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 실리콘, 또는 이들의 임의의 조합의 재료를 포함할 수 있다. 제어 입자는 붕괴될 수 있는 하이드로겔 입자를 포함할 수 있다.
단백질 결합 시약
일부 구현예에서, 제어 입자는 복수의 제1 단백질 결합 시약들에 연결되고, 복수의 제1 단백질 결합 시약들 중 적어도 하나는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 하나와 연결된다. 도 6b는 올리고뉴클레오티드와 작용화된 다수의 항체와 코팅된 비제한적인 예시적인 입자를 보여준다. 제1 단백질 결합 시약은 제1 항체(예를 들어, 1차 항체, 또는 2차 항체)를 포함할 수 있다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 제1 단백질 결합 시약에 컨쥬게이트될 수 있다. 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 제1 단백질 결합 시약에 가역적으로 또는 비가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 디설피드 결합, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 이황화 결합, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 입자는 복수의 제2 단백질 결합 시약들에 연결된다. 복수의 제2 단백질 결합 시약들 중 적어도 하나는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 하나와 연결될 수 있다. 도 6c는 올리고뉴클레오티드로 작용화된 복수의 제1 항체들 및 올리고뉴클레오티드로 작용화되지 않은 복수의 제2 항체들로 코팅된 비제한적인 예시적인 입자를 보여준다. 제어 입자에 대한 항체는 (예를 들어, 제어 입자 올리고뉴클레오티드와 연결된) 고온 항체 및 (예를 들어, 제어 입자 올리고뉴클레오티드와 연결되지 않은) 저온 항체의 비로 적정되어 제어 입자로부터 수득된 서열화 판독의 양을 변경시킬 수 있다. 제1 항체 및 제2 항체는 동일하거나 상이할 수 있다.
도 6d는 상대적으로 높은 풍부도, 중간 풍부도 및 낮은 풍부도로, 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들, 복수의 제2 항체들에 컨쥬게이트된 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 및 제3 제어 입자 올리고뉴클레오티드들로 작용화된 입자의 비제한적인 예시적인 개략도이다. 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 복수의 제1 단백질 결합 시약들에 컨쥬게이트될 수 있다. 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 복수의 제2 단백질 결합 시약들에 컨쥬게이트될 수 있다. 복수의 제3 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 복수의 제3 단백질 결합 시약들에 컨쥬게이트될 수 있다.
제1, 제2 및 제3의 제어 입자 올리고뉴클레오티드의 상대적 풍부도는 상이한 발현 수준을 갖는 mRNA를 모방할 수 있다. 제1 단백질 결합 시약과 연결된 제어 입자 올리고뉴클레오티드와 제2 단백질 결합 시약과 연결된 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 상이한 제어 바코드 서열을 포함할 수 있다. 제어 입자 상에서 상이한 단백질 결합 시약, 예컨대 항체, 및 상이한 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 적정되어 표준 곡선을 생성할 수 있다. 제1 단백질 결합 시약, 제2 단백질 결합 시약, 또는 제3 단백질 결합 시약은 동일하거나 상이한 단백질 결합 시약일 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수와 제2 (또는 제3) 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수의 비는 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 수 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수와 제2 (또는 제3) 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수의 비는 적어도, 또는 최대 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 또는 1:100일 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 시약은 파트너 결합 시약(예를 들어, 2차 항체)과 연결될 수 있고, 제1 단백질 결합 시약은 파트너 결합 시약을 이용하여 제어 입자와 연결된다. 파트너 결합 시약은 파트너 항체를 포함할 수 있다. 파트너 항체는 항-고양이 항체, 항-닭 항체, 항-소 항체, 항-개 항체, 항-당나귀 항체, 항-염소 항체, 항-기니피그 항체, 항-햄스터 항체, 항-말 항체, 항-인간 항체, 항-라마 항체, 항-원숭이 항체, 항-마우스 항체, 항-돼지 항체, 항-토끼 항체, 항-래트 항체, 항-양 항체, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 파트너 항체는 면역글로불린 G(IgG), F(ab') 단편, F(ab')2 단편, 이들의 조합, 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 시약은 동일한 제어 바코드 서열을 갖는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 둘 이상과 연결된다. 제1 단백질 결합 시약은 상이한 제어 바코드 서열을 갖는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 둘 이상과 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 제1 단백질 결합 시약들 중 적어도 하나는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 어느 것과도 연결되지 않는다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드와 연결된 제1 단백질 결합 시약 및 임의의 제어 입자 올리고뉴클레오티드와 연결되지 않은 제1 단백질 결합 시약은 동일한 단백질 결합 시약일 수 있다.
제어 바코드의 다양성
하나의 제어 입자와 연결된 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 상이한 제어 바코드 서열을 갖는 다수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드가 갖는 제어 바코드 서열의 수는 다른 실시에서 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 제어 입자 올리고뉴클레오티드가 갖는 제어 바코드 서열의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000, 1000000 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값들 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 제어 입자 올리고뉴클레오티드가 갖는 제어 바코드 서열의 수는 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000, 또는 1000000 개일 수 있다.
일부 구현예에서, 동일한 제어 입자 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 제어 입자 올리고뉴클레오티드의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000, 1000000 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값들 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 제어 입자 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 제어 입자 올리고뉴클레오티드의 수는 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000, 또는 1000000 개일 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들은 제1 제어 바코드 서열을 각각 포함하는 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들, 및 제2 제어 바코드 서열을 각각 포함하는 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 포함하고, 제1 제어 바코드 서열 및 제2 제어 바코드 서열은 상이한 서열을 갖는다. 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수 및 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수는 대략 동일할 수 있다. 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수 및 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수는 상이할 수 있다. 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수는 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수의 적어도 2 배, 10 배, 100 배, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수와 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수의 비는 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000, 1:6000, 1:7000, 1:8000, 1:9000, 1:10000이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 제1 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수와 복수의 제2 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수의 비는 적어도, 또는 최대 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49, 1:50, 1:51, 1:52, 1:53, 1:54, 1:55, 1:56, 1:57, 1:58, 1:59, 1:60, 1:61, 1:62, 1:63, 1:64, 1:65, 1:66, 1:67, 1:68, 1:69, 1:70, 1:71, 1:72, 1:73, 1:74, 1:75, 1:76, 1:77, 1:78, 1:79, 1:80, 1:81, 1:82, 1:83, 1:84, 1:85, 1:86, 1:87, 1:88, 1:89, 1:90, 1:91, 1:92, 1:93, 1:94, 1:95, 1:96, 1:97, 1:98, 1:99, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000, 1:6000, 1:7000, 1:8000, 1:9000, 또는 1:10000일 수 있다.
검출가능한 모이어티
일부 구현예에서, 제어 입자는 검출가능한 모이어티, 예를 들어, 광학 모이어티, 예컨대 형광단 또는 발색단과 연결된다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티, 예를 들어, 광학 모이어티와 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 시약은 광학 모이어티와 연결될 수 있다(도 6e). 제2 단백질 결합 시약은 광학 모이어티와 연결될 수 있다. 광학 모이어티와 연결된 제어 입자(예를 들어, 형광 태그된 비드)는 또한 이미지화 및 유세포 분석에 사용될 수 있다.
검출가능한 모이어티는 스펙트럼상으로 구별가능한 검출가능한 모이어티의 군으로부터 선택될 수 있다. 스펙트럼상으로 구별가능한 검출가능한 모이어티는, 그의 방출 스펙트럼이 중복될 수 있다 하더라도, 구별가능한 방출 스펙트럼을 갖는 검출가능한 모이어티를 포함한다. 검출가능한 모이어티의 비제한적인 예는 잔텐 유도체: 플루오레세인, 로다민, 오레곤 그린, 에오신, 및 텍사스 레드; 시아닌 유도체: 시아닌, 인도카르보시아닌, 옥사카르보시아닌, 티아카르보시아닌, 및 메로시아닌; 세타(Seta), 세타우(SeTau) 및 스퀘어(Square) 염료를 포함하는 스쿠아레인 유도체 및 고리-치환된 스쿠아레인; 나프탈렌 유도체(단실 및 프로단 유도체); 쿠마린 유도체; 옥사디아졸 유도체: 피리딜옥사졸, 니트로벤즈옥사디아졸 및 벤즈옥사디아졸; 안트라센유도체: DRAQ5, DRAQ7 및 CyTRAK 오렌지를 포함하는 안트라퀴논; 피렌 유도체: 캐스캐이드 블루; 옥사진 유도체: 나일 레드, 나일 블루, 크레실 바이올렛, 옥사진 170; 아크리딘 유도체: 프로플라빈, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 옐로우; 아릴메틴 유도체: 아우라민, 크리스탈 바이올렛, 말라카이트 그린; 및 테트라피롤 유도체: 포르핀, 프탈로시아닌, 빌리루빈을 포함한다. 검출가능한 모이어티의 기타 비제한적인 예들은 히드록시쿠마린, 아미노쿠마린, 메톡시쿠마린, 캐스캐이드 블루, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), 퍼시픽 오렌지, 루시퍼(Lucifer) 옐로우, NBD, R-피코에리트린(PE), PE-Cy5 컨쥬게이트, PE-Cy7 컨쥬게이트, 레드 613, PerCP, TruRed, FluorX, 플루오레세인, BODIPY-FL, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, TRITC, X-로다민, 리사민 로다민 B, 텍사스 레드, 알로피코시아닌(APC), APC-Cy7 컨쥬게이트, 훽스트(Hoechst) 33342, DAPI, 훽스트 33258, 시톡스(SYTOX) 블루, 크로모마이신 A3, 미트라마이신, YOYO-1, 에티디움 브로마이드, 아크리딘 오렌지, SYTOX 그린, TOTO-1, TO-PRO-1, TO-PRO: 시아닌 모노머, 티아졸 오렌지, CyTRAK 오렌지, 프로피디움 요오디드(PI), LDS 751, 7-AAD, SYTOX 오렌지, TOTO-3, TO-PRO-3, DRAQ5, DRAQ7, Indo-1, Fluo-3, Fluo-4, DCFH, DHR, 및 SNARF를 포함한다.
검출가능한 모이어티의 여기 파장은 다양할 수 있으며, 예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 나노미터이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 검출가능한 모이어티의 방출 파장 또한 다양할 수 있으며, 예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 나노미터이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다.
검출가능한 모이어티의 분자량은 다양할 수 있으며, 예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 달톤(Da)이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 검출가능한 모이어티의 분자량은 또한 다양할 수 있으며, 예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 킬로달톤(kDa)이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다.
스펙트럼상으로 구별가능한 검출가능한 모이어티의 군은. 예를 들어, 5 개의 상이한 형광단, 5 개의 상이한 발색단, 5 개의 형광단 및 발색단의 조합, 4 개의 상이한 형광단 및 하나의 비-형광단의 조합, 4 개의 발색단 및 하나의 비-발색단의 조합, 또는 4 개의 형광단 및 발색단 및 하나의 비-형광단 비-발색단의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 스펙트럼상으로 구별가능한 모이어티 중 검출가능한 모이어티는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 개이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위의 검출가능한 모이어티일 수 있다.
제어 입자 작업흐름
AbO 작용화된 비드는 단일 세포 서열화 제어로서 임의의 단일 세포 작업흐름과 함께 사용될 수 있다. 단일 세포 작업흐름은 마이크로웰 어레이 또는 마이크로웰 카트리지(예를 들어, BD ResolveTM) 또는 마이크로유체학적 디바이스(예를 들어, 10X Genomics(미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재), Drop-seq(McCarroll Lab, Harvard Medical School(미국 매사추세츠주 캠브리지 소재); 그 내용이 본 명세서에 그 전체로 참고문헌으로 포함된 문헌[Macosko et al., Cell, 2015 May 21 16;5:1202]), 또는 Abseq(Mission Bio(미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재); 그 내용이 본 명세서에 그 전체로 참고문헌으로 포함된 문헌[Shahi et al., Sci Rep. 2017 Mar 14;7:44447])를, 추계적 바코드(예를 들어, BD Resolve, 또는 Drop-seq) 또는 방출가능한 추계적 바코드를 봉입하고 있는 붕괴될 수 있는 하이드로겔 입자(예를 들어, 10X Genomics, 또는 Abseq)와 연결된 고체 또는 준고체 입자와 함께 사용할 수 있다. 작용화된 비드는 단일 세포 작업흐름의 효율을 결정하기 위한 제어일 수 있으며, 이는 벌크 RNAseq 또는 마이크로어레이 연구에 사용되는 외부 RNA 제어 컨소시엄(ERCCs)과 유사하다.
복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 이용하여 표적의 수를 결정하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 표적(예를 들어, 유전자 발현)의 수의 결정 방법이 본 명세서에 개시된 기타 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 작업흐름은 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 이용하여 단백질 발현 및 유전자 발현을 결정하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은: 복수의 바코드들(예를 들어, 추계적 바코드)을 이용하여 복수의 세포들 중 하나의 세포의 복수의 표적들 및 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 바코딩(예를 들어, 추계적 바코딩)하여 복수의 바코딩된 표적들(예를 들어, 추계적으로 바코딩된 표적) 및 복수의 바코딩된 제어 입자 올리고뉴클레오티드들(예를 들어, 추계적으로 바코딩된 제어 입자 올리고뉴클레오티드들)을 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 복수의 바코드들의 각각은 세포 표지 서열, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지), 및 표적-결합 영역을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드들의 바코드 서열은 상이한 서열을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드들은 동일한 세포 표지 서열을 포함하고, 제어 입자 조성물은 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들과 연결된 제어 입자를 포함하고, 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 각각은 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 표적-결합 영역에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 제어 바코드 서열 및 의사-표적 영역을 포함한다. 방법은: 복수의 추계적으로 바코딩된 표적들 및 복수의 추계적으로 바코딩된 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계; 서열화 데이터 중, 제어 바코드 서열을 갖는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 계수하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은: 복수의 표적들 중 적어도 하나의 표적에 대하여: 서열화 데이터 중, 표적과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 계수하는 단계; 및 표적의 수를 예측하는 단계로서, 예측되는 표적의 수는 계수된 표적과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수와 상관되는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 의사-표적 영역은 폴리(dA) 영역을 포함한다. 의사-표적 영역은 표적의 하위서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 예측되는 표적의 수는 계수된 표적과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수, 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수, 및 제어 바코드 서열을 포함하는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수와 상관될 수 있다. 예측되는 표적의 수는 계수된 표적과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수, 및 제어 바코드 서열을 포함하는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들의 수와 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수의 비와 상관될 수 있다.
예를 들어, 제어 입자가 특정 제어 바코드 서열을 갖는 100 개의 제어 입자 올리고뉴클레오티드를 갖고, 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수(예를 들어, 라이브러리 제조 과정에서 견디는 제어 바코드 서열을 갖는 제어 입자 올리고뉴클레오티드의 수)가 80 개인 경우, 라이브러리 제조(예를 들어, 역전사, 증폭 등)의 효율은 80%이다. 따라서, 상이한 라이브러리 제조로부터의 데이터는 라이브러리 제조 효율을 이용하여 정규화함에 의해 비교될 수 있다.
또 다른 예로서, 제어 입자는 저발현 유전자를 모방하는 특정 제어 바코드 서열을 갖는 5 개의 제어 입자 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수가 5 개이고, 저발현 유전자가 검출되지 않는 경우, 저발현 유전자는 발현되지 않는다(또는 세포가 5 개 미만의 유전자의 mRNA를 갖는다)고 결론지을 수 있다. 그러나, 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열이 수가 0이고, 저발현 유전자가 검출되지 않는 경우, 저발현 유전자는 발현되지 않는다고 결론지을 수 없다.
포획 효율은 상이한 풍부도를 갖는 제어 입자 올리고뉴클레오티드에 대해 결정될 수 있다. 정규화는 둘 이상의 제어 바코드 서열을 갖는 제어 입자 올리고뉴클레오티드의 포획 효율을 기반으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 서열화 데이터 중, 제어 바코드 서열을 갖는 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수의 계수는: 서열화 데이터 중, 제1 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 계수하는 단계; 및 서열화 데이터 중, 제2 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 계수하는 단계를 포함한다. 예측되는 표적의 수는 계수된 표적과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수, 제1 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수, 및 제2 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수와 상관될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 복수의 표적들 및 제어 입자의 추계적 바코딩 전에 제어 입자로부터 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나, 및 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 방출하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들을 이용하여 복수의 표적들 및 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 바코딩(예를 들어, 추계적 바코딩)하는 단계는: 복수의 바코드들을 복수의 표적들, 및 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들 중의 제어 입자 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜 표적 및 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들에 혼성화된 바코드(예를 들어, 추계적 바코드)를 생성하는 단계; 및 표적 및 제어 입자 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드(예를 들어, 추계적 바코드)를 연장하여 복수의 추계적으로 바코딩된 표적들 및 복수의 추계적으로 바코딩된 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함한다. 바코드를 연장하는 단계는 DNA 중합효소, 역전사효소, 또는 이들의 조합을 이용하여 바코드를 연장하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 복수의 추계적으로 바코딩된 표적들 및 복수의 추계적으로 바코딩된 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 증폭시켜 복수의 암프리콘들을 생성하는 단계를 포함한다. 복수의 추계적으로 바코딩된 표적들 및 복수의 추계적으로 바코딩된 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 증폭시키는 단계는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여, 바코드 서열의 적어도 일부 및 제어 입자 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부 또는 바코드 서열의 적어도 일부 및 제어 입자 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 서열화 데이터를 수득하는 단계는 복수의 암프리콘들의 서열화 데이터를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 서열화 데이터를 수득하는 단계는 바코드 서열의 적어도 일부 및 제어 입자 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부, 또는 바코드 서열의 적어도 일부 및 제어 입자 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 서열화하는 단계를 포함할 수 있다.
마이크로웰 카트리지 또는 어레이 작업흐름
도 7은 단일 세포 서열화 제어를 위해 올리고뉴클레오티드로 작용화된 입자의 이용의 예시적인 작업 흐름의 개략도이다. 일부 구현예에서, 제어 입자 조성물은 제어 입자(704)와 연결된 복수의 제어 입자 올리고뉴클레오티드들을 포함한다. 예를 들어, 제어 입자(740)는 제어 입자(740)에 결합된 항체(705)에 컨쥬게이트된 제어 입자 올리고뉴클레오티드(725)와 연결될 수 있다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드(725)로 작용화된 복수의 제어 입자들(740)은 복수의 세포들 내에, 예를 들어, 5%로 스파이크될 수 있다. 제어 입자(740)는 이후의 작업흐름에서 "세포"로서 처리될 수 있다. 제어 입자(740)는 제어 세포 또는 제어 세포 입자로서 지칭될 수도 있다. 이어서, 세포(710) 및 제어 입자(740)는 복수의 구획들, 예컨대 마이크로웰 어레이의 웰들 내로 분리될 수 있으며, 여기서 단일 구획(715a, 715b)은 단일 세포 또는 제어 입자 및 단일 비드(720a, 720b)에 맞추어 크기조정된다. 비드(720a, 720b)는 구획(715a, 715b) 내로 로딩될 수 있다.
각각의 비드는, 비드 상에서 모든 올리고뉴클레오티드 프로브에 일반적인 세포 표지를 포함할 수 있는 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들, 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브는 표적 결합 영역, 예를 들어, 폴리(dT) 서열을 포함할 수 있다. 항체(705)에 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드(725)는 화학적, 광학적 또는 기타 수단을 이용하여 항체(705)로부터 분리될 수 있다. 세포(710)는 용해되어(735) 세포 내에 핵산, 예컨대 유전체 DNA 또는 세포성 mRNA(730)를 방출할 수 있다. 세포성 mRNA(530) 및 제어 입자 올리고뉴클레오티드(725)는 각각 비드(720a, 720b) 상에서 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해, 예를 들어, 폴리(dT) 서열에 혼성화됨으로써 포획될 수 있다. 비드는 회수될 수 있고, 포획된 세포성 mRNA(730) 및 제어 입자 올리고뉴클레오티드(725)(예를 들어, 총 약 5000 개의 세포에 상응함)는 풀링될 수 있다.
역전사효소를 이용하여 세포성 mRNA(730) 및 올리고뉴클레오티드(725)를 주형으로서 이용하여 세포성 mRNA(730) 및 올리고뉴클레오티드(725)에 혼성화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 연장할 수 있다. 역전사 효소에 의해 생성된 연장 생성물은 증폭 및 서열화될 수 있다. 서열화 판독은 세포 표지, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지), 유전자 식별, 제어 입자 올리고뉴클레오티드 서열 등의 역다중화 처리될 수 있으며, 단일 세포 유전자 발현 프로파일 및 작업흐름의 전체 또는 일부의 정량 효율(예를 들어, 세포 포획 효율)을 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 포획된 제어 입자의 수는 데이터 내에서 제어 바코드 서열에 연결된 세포 표지의 수에 기반하여 결정될 수 있다. 작업흐름의 효율은 포획된 제어 입자의 수와 스파이크된 제어 입자의 비율일 수 있다.
마이크로유체학적 작업흐름
도 8은 단일 세포 서열화 제어를 위해 올리고뉴클레오티드로 작용화된 입자를 이용하는 또 다른 예시적인 작업 흐름의 개략도이다. 제어 입자 올리고뉴클레오티드(725)로 작용화된 복수의 제어 입자들(740)은 복수의 세포들 내에 예를 들어, 5%로 스파이크될 수 있다. 제어 입자(740)는 이후의 작업흐름에서 "세포"로서 처리될 수 있다. 제어 입자(740)는 제어 세포 또는 제어 세포 입자로서 지칭될 수도 있다. 이어서, 세포(710) 및 제어 입자(740)는 마이크로유체학적 디바이스를 이용하여 복수의 구획들, 예컨대 액적들(745a, 745)로 분리될 수 있다. 각각의 액적(745a, 745b)은 하나의 세포(710) 또는 하나의 제어 입자(740) 및 하이드로겔 비드(720a, 720b)를 포함할 수 있다.
각각의 비드(720a, 720b)는, 비드 상에서 모든 올리고뉴클레오티드 프로브에 일반적인 세포 표지를 포함할 수 있는 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들, 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브는 표적 결합 영역, 예를 들어, 폴리(dT) 서열을 포함할 수 있다. 비드(720a, 720b)는 이후의 작업 흐름(예를 들어, 역전사)을 위한 시약을 포함할 수 있다. 항체(705)에 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드(725)는 화학적, 광학적 또는 기타 수단을 이용하여 항체(705)로부터 분리될 수 있다. 세포(710)는 용해되어(735) 세포 내에 핵산, 예컨대 유전체 DNA 또는 세포성 mRNA(730)를 방출할 수 있다. 세포성 mRNA(530) 및 제어 입자 올리고뉴클레오티드(725)는 각각 비드(720a, 720b)로부터 방출된 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해, 예를 들어, 폴리(dT) 서열에 혼성화됨으로써 포획될 수 있다. 역전사효소는 세포성 mRNA(730) 및 올리고뉴클레오티드(725)를 주형으로서 이용하여 세포성 mRNA(730) 및 올리고뉴클레오티드(725)에 혼성화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 연장하는 데 사용될 수 있다.
액적(745a, 745b)이 파괴된 후, 역전사 효소에 의해 생성된 연장 생성물은 풀링될 수 있고, 증폭 및 서열화될 수 있다. 서열화 판독은 세포 표지, 분자 표지, 유전자 식별, 제어 입자 올리고뉴클레오티드 서열 등의 역다중화 처리되어 단일 세포 유전자 발현 프로파일 및 작업흐름의 전체 또는 일부의 정량 효율을 결정할 수 있다.
단일 세포 서열화 효율을 결정하기 위한 제어 올리고뉴클레오티드
일부 구현예에서, 단일 세포를 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 항체로(예를 들어, 범용 항체 또는 바이오마커 항체로) 표지하고, 그와 함께 차세대 서열화 라이브러리를 생성함으로써, NGS 판독 내 올리고뉴클레오티드로부터의 신호는 단일 세포 NGS 효율을 결정하는 데 사용될 수 있다. 이는 상이한 단일 세포 서열화 플랫폼에 대한 효율에 대한 평가 도구 또는 QC 단계로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 제어 올리고뉴클레오티드는 본 명세서에 개시된 임의의 적합한 방법, 키트 및 시스템, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드와 연결된 세포 성분 결합 시약을 이용하여 세포 성분 발현 수준(예를 들어, 단백질 발현 수준)을 측정하기 위한 방법, 키트 및 시스템에서 사용될 수 있다.
올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 항체(본 명세서에서 "AbO"로 지칭됨)는 단일 세포 서열화 제어로서 임의의 단일 세포 작업흐름과 함께 사용될 수 있다. 단일 세포 작업흐름은 마이크로웰 어레이 또는 마이크로웰 카트리지(예를 들어, BD ResolveTM) 또는 마이크로유체학적 디바이스(예를 들어, 10X Genomics(미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재), Drop-seq(McCarroll Lab, Harvard Medical School(미국 매사추세츠주 캠브리지 소재); 그 내용이 본 명세서에 그 전체로 참고문헌으로 포함된 문헌[Macosko et al., Cell, 2015 May 21 16;5:1202]), 또는 Abseq(Mission Bio(미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재); 그 내용이 본 명세서에 그 전체로 참고문헌으로 포함된 문헌[Shahi et al., Sci Rep. 2017 Mar 14;7:44447])를, 바코드, 예컨대 추계적 바코드(예를 들어, BD Resolve, 또는 Drop-seq) 또는 방출가능한 바코드, 예컨대 추계적 바코드(예를 들어, 10X Genomics, 또는 Abseq)를 봉입하고 있는 붕괴될 수 있는 하이드로겔 입자와 연결된 고체 또는 준고체 입자와 함께 사용할 수 있다. AbO는 단일 세포 작업흐름의 효율을 결정하기 위한 제어일 수 있다. 예를 들어, 10X Genomics로부터의 단일 세포 서열화 플랫폼은 액적 내에 단일 세포를 캡슐화하기 위하여 에멀션을 이용하여 단일 세포 포획을 수행한다. 이들 액적은 쉽게 가시화될 수 없기 때문에, 단일 세포의 포획 효율은 쉽게 결정될 수 없다. 그러한 서열화 작업흐름의 업스트림에서 AbO의 이용은, 사용자가 서열화 후 단일 세포 포획 효율 및 더블렛 형성 속도를 평가할 수 있게 한다.
도 9는 단일 세포 서열화 효율의 결정을 위한 제어 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체의 이용의 예시적인 작업 흐름의 개략도를 보여준다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포(예를 들어, 5000)(900)은 마이크로웰 카트리지 또는 어레이의 마이크로웰(915) 상에 로딩되기 전에 제어 올리고뉴클레오티드(925)와 컨쥬게이트된 항체(905)로 염색될 수 있다. 이어서, 세포(910)는 복수의 구획들, 예컨대 마이크로웰 어레이의 웰 내로 분리될 수 있으며, 단일 구획(915)은 단일 세포 및 단일 비드(920)에 맞도록 크기조정된다.
비드는 예를 들어, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브들을 포함할 수 있으며, 이는 비드 상에서 모든 올리고뉴클레오티드 프로브에 공통적인 세포 표지 및 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브는 표적 결합 영역, 예를 들어, 폴리(dT) 서열을 포함할 수 있다. 항체(905)에 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드(925)는 화학적, 광학적 또는 기타 수단을 이용하여 항체(905)로부터 분리될 수 있다. 세포(910)는 용해되어(935) 세포 내에 핵산, 예컨대 유전체 DNA 또는 세포성 mRNA(930)를 방출할 수 있다. 세포성 mRNA(930), 제어 올리고뉴클레오티드(925)는 비드(920) 상에서 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해, 예를 들어, 폴리(dT) 서열에 혼성화됨으로써 포획될 수 있다. 비드는 회수될 수 있고, 포획된 세포성 mRNAs(930)(예를 들어, 총 약 5000 개의 세포에 상응함)는 풀링될 수 있다.
역전사효소는 세포성 mRNA(930) 및 올리고뉴클레오티드(925)를 주형으로서 이용하여 세포성 mRNA(930) 및 올리고뉴클레오티드(925)에 혼성화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 연장하는 데 사용될 수 있다. 역전사 효소에 의해 생성된 연장 생성물은 증폭 및 서열화될 수 있다. 서열화 판독은 세포 표지, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지), 유전자 식별, 제어 올리고뉴클레오티드 서열 등의 역다중화 처리되어 단일 세포 유전자 발현 프로파일 및 작업 흐름의 전체 또는 일부의 정량 효율(예를 들어, 세포 포획 효율)을 결정할 수 있다. 포획되고 라이브러리 제조를 성공적으로 통과한 세포의 수(예를 들어, 5000 개 미만의 세포)가 결정될 수 있다.
도 10은 단일 세포 서열화 효율을 결정하기 위한 제어 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체의 이용의 예시적인 작업 흐름의 또 다른 개략도를 보여준다. 도 10에서, 단일 세포(1010a, 1010b) 및 단일 입자(1020a, 1020b)를 함유하는 액적(1045a, 1045b)은 마이크로유체 디바이스를 이용하여 형성될 수 있다. 단일 세포(1010a, 1010b)는 제어 올리고뉴클레오티드(1025a, 1025b)와 컨쥬게이트된 항체(1005a, 1005b)에 결합될 수 있다. 액적(1045a, 1045b) 내 세포 용해 및 역전사 후, 액적은 파괴될 수 있으며, 내용물은 라이브러리 제조를 위해 풀링될 수 있다. 포획되고 라이브러리 제조를 성공적으로 통과한 세포들의 수가 결정될 수 있다.
도 11a 내지 도 11c는, 제어 올리고뉴클레오티드가 세포 계수에 사용될 수 있음을 보여주는 플롯이다. 도 11a 및 도 11b는, AbO의 제어 올리고뉴클레오티드가 세포 계수를 위한 제어로서 사용될 수 있음을 보여준다. mRNA 계수 플롯 및 제어 올리고뉴클레오티드 계수 플롯의 하락 지점들은 100% 포획 및 라이브러리 제조 효율이 달성된 경우와 일치할 수 있다. 도 11c는 종래의 mRNA-만의 세포 표지 호출(calling)의 이용이 전사적으로 높은 세포들의 안개 속에서 전사적으로 낮은 세포들을 놓칠 수 있음을 보여준다. 이 방법은 n 개의 세포 바코드들에서 컷오프를 호출할 수 있다. 이것은 활성화된 T 세포가 RNA 전사에서 몇 배로 더 높을 수 있는 활성화된 T 세포의 큰 개체군 내에서 휴지기 T 세포일 경우 일어날 수 있다. 이것은 또한 표적된 패널(예를 들어, 암 패널)에서, 표적된 유전자들의 발현이 낮은 비-표적된 세포(비-암 세포)가 감소되는 경우에 일어날 수 있다. 그러나, 단백질 발현이 훨씬 높기 때문에, 전사적으로 낮은 세포는 호출될 기회가 여전히 더 높다. 이러한 방법은 m>n인 경우, m 세포 바코드에서 컷오프를 호출한다.
본 명세서에는 서열화 제어 방법(예를 들어, 단일 세포 서열화 효율 결정)이 개시된다. 단일 세포 서열화 효율의 결정 방법은 본 명세서에서 개시된 다른 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 세포 서열화 효율에 사용된 방법은 단백질 발현의 결정 방법과 함께 사용될 수 있다. 다른 예로서, 작업흐름을 이용하여 단일 세포 서열화 효율, 단백질 발현, 및/또는 유전자 발현을 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은: 복수의 세포들 중 하나 이상의 세포를 복수의 제어 조성물들 중 하나의 제어 조성물과 접촉시키는 단계로서, 복수의 세포들 중 하나의 세포는 복수의 표적들 및 복수의 단백질 표적들을 포함하고, 복수의 제어 조성물들의 각각은 제어 올리고뉴클레오티드와 연결된 단백질 결합 시약을 포함하고, 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있고, 제어 올리고뉴클레오티드는 제어 바코드 서열, 및 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 표적-결합 영역에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 의사-표적 영역을 포함하는 단계; 복수의 바코드들을 이용하여 제어 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 세포 표지 서열, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 및 표적-결합 영역을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드의 바코드 서열은 상이한 서열을 포함하고, 복수의 바코드들의 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계; 서열화 데이터 중, 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들의 적어도 하나의 특성을 이용하여 하나 이상의 세포의 적어도 하나의 특성(예를 들어, 포획되고 라이브러리 제조를 성공적으로 통과한 세포들의 수)을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 의사-표적 영역은 폴리(dA) 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 세포의 적어도 하나의 특성을 결정하는 단계는: 서열화 데이터 중, 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들과 연결된 별개의 서열을 갖는 세포 표지 서열을 결정하는 단계; 및 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들과 연결된 별개의 서열을 갖는 세포 표지 서열의 수를 이용하여 하나 이상의 세포의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 방법은: 결정된 하나 이상의 세포의 수를 기준으로, 단일 세포 포획 효율을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은: 결정된 하나 이상의 세포의 수와 복수의 세포들의 수의 비를 기준으로 단일 세포 포획 효율을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 서열화 데이터 중, 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들의 특성을 이용하여 하나 이상의 세포의 적어도 하나의 특성을 결정하는 단계는: 서열화 데이터 중 각각의 세포 표지에 대하여, 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)의 수를 결정하는 단계; 및 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 이용하여 하나 이상의 세포의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 결정하는 단계는: 서열화 데이터 중 각각의 세포 표지에 대하여, 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 최대 수의 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 표지 및 제어 바코드 서열과 연결된 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수를 이용하여 하나 이상의 세포의 수를 결정하는 단계는: 최대 수의 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수와, 최대 수의 별개의 서열을 갖는 바코드 서열의 수와 연관된 서열화 데이터 중 세포 표지의 수의 플롯을 생성하는 단계; 및 플롯에서의 컷오프를 하나 이상의 세포의 수로서 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 제어 올리고뉴클레오티드를 바코딩하기 전에, 단백질 결합 시약으로부터 제어 올리고뉴클레오티드를 방출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 제어 조성물들 중 미결합된 제어 조성물을 제거하는 단계를 포함한다. 미결합된 제어 조성물을 제거하는 단계는 복수의 세포들 중 하나 이상의 세포를 세척 버퍼로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 미결합된 세포 식별 조성물을 제거하는 단계는 제어 조성물 중의 적어도 하나의 단백질 결합 시약에 결합된 세포들을 유세포 분석을 이용하여 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제어 올리고뉴클레오티드를 바코딩하는 단계는: 복수의 바코드들(예를 들어, 추계적 바코드)을 이용하여 제어 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 추계적으로 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 바코드들을 이용하여 복수의 제어 올리고뉴클레오티드들을 바코딩하는 단계는: 복수의 바코드들을 복수의 제어 조성물들의 제어 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜 제어 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 생성하는 단계; 및 제어 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함한다. 바코드를 연장하는 단계는 DNA 중합효소, 역전사효소, 또는 이들의 조합을 이용하여 바코드를 연장하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들을 증폭시켜 복수의 암프리콘들을 생성하는 단계를 포함한다. 복수의 바코딩된 제어 올리고뉴클레오티드들을 증폭시키는 단계는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여, 바코드 서열의 적어도 일부(예를 들어, 분자 표지 서열) 및 제어 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열화 데이터를 수득하는 단계는 복수의 암프리콘들의 서열화 데이터를 수득하는 단계를 포함한다. 서열화 데이터를 수득하는 단계는 분자 표지 서열의 적어도 일부 및 제어 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 서열화하는 단계를 포함할 수 있다.
세포 오버로딩(overloading) 및 멀티플렛 식별
세포 오버로딩 및 멀티플렛을 식별하기 위한 방법, 키트 및 시스템이 또한 본 명세서에 개시된다. 그러한 방법, 키트 및 시스템은 본 명세서에 개시된 임의의 적합한 방법, 키트 및 시스템, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드와 연결된 세포 성분 결합 시약을 이용하여 세포 성분 발현 수준(예를 들어, 단백질 발현 수준)을 측정하기 위한 방법, 키트 및 시스템과 조합되어 사용될 수 있다. 현재 세포-로딩 기술을 이용하여, 약 20000 개 세포가 약 60000 개의 마이크로웰을 갖는 마이크로웰 카트리지 또는 어레이 내로 로딩되는 경우, 둘 이상의 세포(더블렛 또는 멀티플렛으로 지칭됨)를 갖는 마이크로웰 또는 액적의 수는 최소일 수 있다. 그러나, 로딩된 세포의 수가 증가하는 경우, 다수의 세포를 갖는 마이크로웰 또는 액적의 수는 현저히 증가할 수 있다. 예를 들어, 약 50000 개의 세포가 마이크로웰 카트리지 또는 어레이의 약 60000 개의 마이크로웰 내로 로딩되는 경우, 다수의 세포를 갖는 마이크로웰의 백분율은 예컨대 11 내지 14%로 상당히 높을 수 있다. 많은 수의 세포들을 마이크로웰 내로 그렇게 로딩하는 것을 세포 오버로딩으로 지칭할 수 있다. 그러나, 별개의 세포 식별 서열을 갖는 세포 식별 올리고뉴클레오티드로 표지될 수 있는 다수의 군(예를 들어, 5)으로 세포들이 나누어지는 경우, 둘 이상의 세포 식별 서열과 연결된 세포 표지는 서열화 데이터 내에서 식별될 수 있고, 후속 공정에서 제거될 수 있다. 그러한 더 많은 수의 세포가, 마이크로웰 카트리지 또는 어레이 내 마이크로웰의 수에 비례하여, 마이크로웰 내로 로딩될 수 있다.
본 명세서의 개시 내용은 세포 또는 더블렛 식별 방법을 포함한다. 세포 식별 또는 더블렛 식별 방법은 본 명세서에 개시된 기타 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 더블렛 식별 방법은 단백질 발현을 결정하는 방법과 함께 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 작업흐름은 더블렛, 단백질 발현, 및/또는 단일 세포의 유전자 발현을 결정하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 또는 더블렛 식별 방법은: 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들을 2 개의 세포 식별 조성물과 각각 접촉시키는 단계로서, 제1 복수의 세포들의 각각 및 제2 복수의 세포들의 각각은 하나 이상의 항원 표적 또는 단백질 표적을 포함하고, 2 개의 세포 식별 조성물의 각각은 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 단백질 결합 시약을 포함하고, 단백질 결합 시약은 하나 이상의 항원 표적 또는 단백질 표적 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있고, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 세포 식별 서열을 포함하고, 2 개의 세포 식별 조성물의 세포 식별 서열은 상이한 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코드들을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 세포 표지 서열, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 및 표적-결합 영역을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드의 바코드 서열은 상이한 서열을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계; 및 수득된 서열화 데이터 중, 둘 이상의 세포 식별 서열과 각각 연결된 하나 이상의 세포 표지 서열을 식별하는 단계; 및 둘 이상의 세포 식별 서열과 각각 연결된 하나 이상의 세포 표지 서열과 연관된 서열화 데이터를 수득된 서열화 데이터로부터 제거하는 단계 및/또는 둘 이상의 세포 식별 서열과 각각 연결된 하나 이상의 세포 표지 서열과 연관된 서열화 데이터를 후속 분석(예를 들어, 단일 세포 mRNA 프로파일링, 또는 전체 전사체 분석)에서 제외하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 범용 프라이머를 위한 결합 부위, 또는 이들의 조합을 포함한다.
예를 들어, 방법은 세포 식별을 이용하여 50,000 개 이상의 세포(10,000 내지 20,000 개의 세포와 비교됨)를 로딩하는 데 사용될 수 있다. 세포 식별은 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 단백질 결합 시약(예를 들어, 항체) 또는 범용 단백질 마커에 대한 세포 성분 결합 시약을 이용하여, 고유 세포 성분 결합 시약으로 상이한 샘플로부터의 세포를 표지할 수 있다. 상이한 샘플로부터의 둘 이상의 세포 또는 샘플의 상이한 세포들의 개체군으로부터의 둘 이상의 세포가 동일한 마이크로웰 또는 액적 내에 포획된 경우, 조합된 "세포"(또는 둘 이상의 세포들의 내용물)는 상이한 세포 식별 서열을 갖는 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결될 수 있다. 상이한 세포들의 개체군의 수는 상이한 실시에서 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 상이한 개체군들의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 두 값 사이의 어떤 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 상이한 개체군의 수는 적어도, 또는 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 개일 수 있다. 샘플의 세포는 샘플의 세포들을 다수의 개체군으로 분취함으로써 다수의 개체군으로 나누어질 수 있다. 하나 초과의 세포 식별 서열과 연결된 세포는 서열화 데이터 중 하나의 세포 표지 서열과 연결된 둘 이상의 세포 식별 서열을 기준으로 "멀티플렛"으로서 식별될 수 있다. 조합된 "세포"의 서열화 데이터는 또한 본 명세서에서 멀티플렛으로 지칭된다. 멀티플렛은 더블렛, 트리플렛, 쿼텟, 퀸텟, 섹스텟, 셉텟, 옥텟, 노넷 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
더블렛은 상이한 세포 식별 서열을 갖는 2 개의 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 조합된 "세포"를 지칭할 수 있다. 더블렛은 또한 2 개의 세포 식별 서열을 갖는 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 조합된 "세포"를 지칭할 수 있다. 더블렛은 상이한 서열의 2 개의 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 2 개의 세포(또는 2 개의 상이한 세포 식별 서열을 갖는 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 둘 이상의 세포)가 동일한 마이크로웰 또는 액적 내에 포획되는 경우 더블렛이 발생할 수 있으며, 조합된 "세포"는 상이한 세포 식별 서열을 갖는 2 개의 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결될 수 있다. 트리플렛은 모두 상이한 세포 식별 서열을 갖는 3 개의 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 조합된 "세포", 또는 3 개의 상이한 세포 식별 서열을 갖는 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 조합된 "세포"를 지칭할 수 있다. 쿼텟은 모두 상이한 세포 식별 서열을 갖는 4 개의 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 조합된 "세포", 또는 4 개의 상이한 세포 식별 서열을 갖는 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 조합된 "세포"를 지칭할 수 있다. 퀸텟은 모두 상이한 세포 식별 서열을 갖는 5 개의 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 조합된 "세포", 또는 5 개의 상이한 세포 식별 서열을 갖는 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 조합된 "세포"를 지칭할 수 있다. 섹스텟은 모두 상이한 세포 식별 서열을 갖는 6 개의 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 조합된 "세포", 또는 6 개의 상이한 세포 식별 서열을 갖는 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 조합된 "세포"를 지칭할 수 있다. 셉텟은 모두 상이한 세포 식별 서열을 갖는 7 개의 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 조합된 "세포", 또는 7 개의 상이한 세포 식별 서열을 갖는 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 조합된 "세포"를 지칭할 수 있다. 옥텟은 모두 상이한 세포 식별 서열을 갖는 8 개의 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 조합된 "세포", 또는 8 개의 상이한 세포 식별 서열을 갖는 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 조합된 "세포"를 지칭할 수 있다. 노넷은 모두 상이한 세포 식별 서열을 갖는 9 개의 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 조합된 "세포", 또는 9 개의 상이한 세포 식별 서열을 갖는 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 조합된 "세포"를 지칭할 수 있다.
또 다른 예에서, 방법은 샘플 오버로딩의 맥락에서 또는 마이크로웰 어레이의 마이크로웰 상에 세포를 로딩하거나 세포를 함유하는 액적을 생성하는 맥락에서의 여부와 관계 없이, 멀티플렛 식별을 위해 사용될 수 있다. 둘 이상의 세포가 하나의 마이크로웰 내에 로딩되는 경우, 조합된 "세포"(또는 둘 이상의 세포들의 내용물)로부터의 결과 데이터는 이상 유전자 발현 프로파일을 갖는 멀티플렛이다. 세포 식별을 이용함으로써, 상이한 세포 식별 서열을 갖는 둘 이상의 세포 식별 올리고뉴클레오티드(또는 둘 이상의 세포 식별 서열을 갖는 세포 식별 올리고뉴클레오티드)와 각각 연결되거나 이에 부여된 세포 바코드를 찾음으로써 이들 멀티플렛들 중 일부를 인식할 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법은 세포 식별 서열을 이용하여, (샘플 오버로딩 여부의 맥락에서, 또는 마이크로웰 어레이의 마이크로웰 상에서 세포를 로딩하거나 세포를 함유하는 액적의 생성의 맥락에서의 여부에 관계없이) 멀티플렛 식별에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은: 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들을 각각 2 개의 세포 식별 조성물과 접촉시키는 단계로서, 제1 복수의 세포들의 각각 및 제2 복수의 세포들의 각각은 하나 이상의 단백질 표적을 포함하고, 2 개의 세포 식별 조성물의 각각은 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 연결된 단백질 결합 시약을 포함하고, 단백질 결합 시약은 하나 이상의 단백질 표적 중 적어도 하나에 특이적으로 결합될 수 있고, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 세포 식별 서열을 포함하고, 2 개의 세포 식별 조성물의 세포 식별 서열은 상이한 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코드들을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 세포 표지 서열, 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 및 표적-결합 영역을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드의 바코드 서열은 상이한 서열을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계; 및 수득된 서열화 데이터 중, 둘 이상의 세포 식별 서열과 각각 연결된 하나 이상의 다중 세포 표지 서열을 식별하는 단계를 포함한다.
마이크로웰 카트리지의 마이크로 웰 상으로 또는 마이크로유체학적 디바이스를 이용하여 생성된 액적 내로 로딩될 수 있는 세포들의 수는 멀티플렛 비율(rate)에 의해 제한될 수 있다. 더 많은 세포의 로딩은 더 많은 멀티플렛을 생성할 수 있으며, 단일 세포 데이터에서 노이즈를 식별하고 생성하는 것이 어려울 수 있다. 방법은 세포 식별을 이용하여, 멀티플렛을 더욱 정확하게 표지하거나 식별하고, 서열화 데이터 또는 후속 분석에서 멀티플렛을 제거하는 데 사용될 수 있다. 더 높은 신뢰도로 멀티플렛을 식별할 수 있다면, 멀티플렛 비율에 대한 사용자 허용치가 증가하고, 각각의 마이크로웰 카트리지 상에 더 많은 세포를 로딩하거나 각각 적어도 하나의 세포를 가진 액적을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들을 각각 2 개의 세포 식별 조성물과 접촉시키는 단계는: 제1 복수의 세포들을 2 개의 세포 식별 조성물 중 제1 세포 식별 조성물과 접촉시키는 단계; 및 제1 복수의 세포들을 2 개의 세포 식별 조성물 중 제2 세포 식별 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 복수의 세포들의 수와 복수의 세포 식별 조성물들의 수는 상이한 실시에서 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 세포들 및/또는 세포 식별 조성물의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000, 1000000 개이거나, 대략 상기 값이거나, 이들 중 임의의 2 개의 값들 사이의 수 또는 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 세포들 및/또는 세포 식별 조성물의 수는 적어도, 또는 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000, 100000, 또는 1000000 개일 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은: 2 개의 세포 식별 조성물 중 미결합된 세포 식별 조성물을 제거하는 단계를 포함한다. 미결합된 세포 식별 조성물을 제거하는 단계는 제1 복수의 세포들 및 제2 복수의 세포들의 세포를 세척 버퍼로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 미결합된 세포 식별 조성물을 제거하는 단계는 유세포 분석을 이용하여 2 개의 세포 식별 조성물 중 적어도 하나의 단백질 결합 시약에 결합된 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 샘플들의 각각으로부터 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 식별 올리고뉴클레오티드는 단백질 결합 시약으로부터 분리할 수 있거나 분리할 수 없도록 구성된다. 방법은 단백질 결합 시약으로부터 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계는 UV 광분할, 화학 처리(예를 들어, 디티오트레이톨과 같은 환원 시약을 이용), 가열, 효소 처리, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 단백질 결합 시약으로부터 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 바코딩하는 단계는: 복수의 바코드들을 세포 식별 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜 세포 식별 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 생성하는 단계; 및 세포 식별 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함한다. 바코드를 연장하는 단계는 DNA 중합효소를 이용하여 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 바코드를 연장하는 단계는 역전사효소를 이용하여 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은: 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 증폭시켜 복수의 암프리콘들을 생성하는 단계를 포함한다. 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 증폭시키는 단계는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여, 바코드 서열의 적어도 일부 및 세포 식별 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계는 복수의 암프리콘들의 서열화 데이터를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 서열화 데이터를 수득하는 단계는 바코드 서열의 적어도 일부 및 세포 식별 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 서열화하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 세포의 샘플 기원을 식별하는 단계는 적어도 하나의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드의 세포 식별 서열을 기준으로 복수의 바코딩된 표적들의 샘플 기원을 식별하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계는, 복수의 바코드들(예를 들어, 복수의 추계적 바코드들)을 이용하여 세포 식별 올리고뉴클레오티드를 바코딩(예를 들어, 추계적 바코딩)하여 복수의 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들(예를 들어, 복수의 추계적으로 바코딩된 세포 식별 올리고뉴클레오티드들)을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은: 복수의 바코드들을 이용하여 세포의 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 세포 표지 서열을 포함하고, 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함하는 단계; 및 바코딩된 표적의 서열화 데이터를 수득하는 단계를 포함한다. 복수의 바코드들을 이용하여 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는: 표적의 복제물을 바코드의 표적-결합 영역과 접촉시키는 단계; 및 복수의 바코드들을 이용하여 복수의 표적들을 역전사하여 복수의 역전사된 표적들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은: 복수의 바코딩된 표적들의 서열화 데이터를 수득하기 전에, 바코딩된 표적을 증폭시켜 복수의 증폭된 바코딩된 표적들을 생성하는 단계를 포함한다. 바코딩된 표적을 증폭시켜 복수의 증폭된 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는: 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 바코딩된 표적을 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 복수의 바코드들을 이용하여 세포의 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는 복수의 바코드들(예를 들어, 복수의 추계적 바코드들)을 이용하여 세포의 복수의 표적들을 바코딩(예를 들어, 추계적 바코딩)하여 복수의 바코딩된 표적들(예를 들어, 복수의 추계적으로 바코딩된 표적들)을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
세포 성분-세포 성분 상호작용의 결정
본 명세서는 단백질-단백질 상호작용의 결정 방법을 개시한다. 단백질-단백질 상호작용의 결정 방법은 본 명세서에 개시된 기타 방법을 이용하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질-단백질 상호작용의 결정 방법은 단백질 발현의 결정 방법을 이용하여 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 작업흐름은 단백질-단백질 상호작용, 단백질 발현, 및/또는 단일 세포의 유전자 발현을 결정하는 데 사용될 수 있다. 그러한 방법은 본 명세서에 개시된 임의의 적합한 방법, 키트 및 시스템, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드와 연결된 세포 성분 결합 시약을 이용하여 세포 성분 발현 수준(예를 들어, 단백질 발현 수준)을 측정하기 위한 방법, 키트 및 시스템과 조합되어 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질-단백질 상호작용의 결정 방법은: 세포를 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물과 접촉시키는 단계로서, 세포는 제1 세포 성분 표적 및 제2 세포 성분 표적을 포함하고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 각각은 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결된 세포 성분 결합 시약을 포함하고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 하나의 조성물의 세포 성분 결합 시약은 제1 세포 성분 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 다른 하나의 조성물의 세포 성분 결합 시약은 제2 세포 성분 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 상호작용 결정 서열 및 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역을 포함하고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 서열은 상이한 서열을 포함하는 단계; 가교 올리고뉴클레오티드를 이용하여 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 배위하여 배위된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계로서, 가교 올리고뉴클레오티드는 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 2 개의 혼성화 영역을 포함하는 단계; 복수의 바코드들을 이용하여 배위된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 바코드 서열 및 포획 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계; 및 수득된 서열화 데이터 중, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 서열의 연결을 기준으로, 제1 세포 성분 표적 및 제2 세포 성분 표적 사이의 상호작용을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 2 개의 세포 성분 결합 시약 중 적어도 하나는 단백질 결합 시약을 포함하고, 단백질 결합 시약은 2 개의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드 중 하나에 연결되고, 하나 이상의 세포 성분 표적은 적어도 하나의 단백질 표적을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은: 세포를 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 세포는 제1 단백질 표적 및 제2 단백질 표적을 포함하고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 각각은 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결된 단백질 결합 시약을 포함하고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 하나의 단백질 결합 시약은 제1 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 다른 하나의 단백질 결합 시약은 제2 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 상호작용 결정 서열 및 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역을 포함하고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 서열은 상이한 서열을 포함하는 단계; 가교 올리고뉴클레오티드를 이용하여 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 배위하여 배위된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계로서, 가교 올리고뉴클레오티드는 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 2 개의 혼성화 영역을 포함하는 단계; 복수의 바코드들을 이용하여 배위된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계로서, 복수의 바코드들의 각각은 바코드 서열 및 포획 서열을 포함하는 단계; 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계; 및 수득된 서열화 데이터 중, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 서열의 연결을 기준으로 제1 단백질 표적과 제2 단백질 표적 사이의 상호작용을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포를 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물과 접촉시키는 단계는: 세포를 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 각각과 순차적으로 또는 동시에 접촉시키는 단계를 포함한다. 제1 세포 성분 표적은 제2 세포 성분 표적과 동일할 수 있다. 제1 세포 성분 표적은 제2 세포 성분 표적과 상이할 수 있다.
일부 구현예에서, 상호작용 결정 서열은 적어도 6 개의 뉴클레오티드 길이, 25 내지 60 개의 뉴클레오티드 길이, 약 45 개의 뉴클레오티드 길이, 약 50 개의 뉴클레오티드 길이, 약 100 개의 뉴클레오티드 길이, 약 128 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 128 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 개의 뉴클레오티드 길이, 적어도 200 개의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 300 개 미만의 뉴클레오티드 길이, 약 200 내지 500 개의 뉴클레오티드 길이, 약 500 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구현예에서, 방법은 세포를 제2 쌍의 상호작용 결정 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 세포는 제3 세포 성분 표적 및 제4 세포 성분 표적을 포함하고, 제2 쌍의 상호작용 결정 조성물의 각각은 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결된 세포 성분 결합 시약을 포함하고, 제2 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 하나의 조성물의 세포 성분 결합 시약은 제3 세포 성분 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 다른 하나의 조성물의 세포 성분 결합 시약은 제4 세포 성분 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 제3 세포 성분 표적 및 제4의 세포 성분 표적 중 적어도 하나는 제1 세포 성분 표적 및 제2 세포 성분 표적 중 하나와 상이할 수 있다. 제3 세포 성분 표적 및 제4의 세포 성분 표적 중 적어도 하나와 제1 세포 성분 표적 및 제2 세포 성분 표적 중 적어도 하나는 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 세포를 3 쌍 이상의 상호작용 결정 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 적어도 10, 100, 1000 쌍, 또는 이들의 임의의 조합의 상호작용 결정 서열, 복수의 쌍의 상호작용 결정 조성물들 중 상호작용 결정 조성물은 상이한 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역은 상이한 서열을 포함한다. 적어도 하나의 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역은 가교 올리고뉴클레오티드의 2 개의 혼성화 영역 중 적어도 하나에 상보적일 수 있다.
일부 구현예에서, 가교 올리고뉴클레오티드를 이용하여 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 배위하는 단계는: 가교 올리고뉴클레오티드의 제1 혼성화 영역을 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드의 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역 중 제1 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역과 혼성화하는 단계; 가교 올리고뉴클레오티드의 제2 혼성화 영역을 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드의 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역 중 제2 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역과 혼성화하는 단계; 및 가교 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 배위하여 배위된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 성분 결합 시약은 항체, 테트라머, 압타머, 단백질 스캐폴드, 인테그린, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 세포 성분 결합 시약에 컨쥬게이트된다. 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 세포 성분 결합 시약에 가역적으로 또는 비가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 디설피드 결합, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 이황화 결합 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하나 이상의 세포 성분 표적들 중 적어도 하나는 세포 표면 상에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은: 세포를 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물과 접촉시키기 전에 세포를 고정하는 단계를 포함한다. 방법은: 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 미결합된 상호작용 결정 조성물을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 미결합된 상호작용 결정 조성물을 제거하는 단계는 세포를 세척 버퍼로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 미결합된 상호작용 결정 조성물을 제거하는 단계는 유세포 분석을 이용하여 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 세포를 용해시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 세포 성분 결합 시약으로부터 분리할 수 있거나 분리할 수 없도록 구성된다. 방법은 세포 성분 결합 시약으로부터 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계는 UV 광분할, 화학 처리, 가열, 효소 처리, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 세포 결합 시약으로부터 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 세포의 유전체 서열에 대해 상동성이 아니다. 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 종의 유전체 서열에 대해 상동성일 수 있다. 종은 비-포유동물 종일 수 있다. 비-포유동물 종은 파지 종일 수 있다. 파지 종은 T7 파지, PhiX 파지, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 종양 세포 또는 비-종양 세포를 포함한다. 세포는 포유동물 세포, 세균 세포, 바이러스 세포, 효모 세포, 균류 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은: 둘 이상의 세포를 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 둘 이상의 세포의 각각은 제1 세포 성분 표적 및 제2 세포 성분 표적을 포함한다. 둘 이상의 세포 중 적어도 하나는 단일 세포를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 바코드는 세포 표지 서열, 범용 프라이머를 위한 결합 부위, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 복수의 바코드들 중 적어도 2 개의 바코드는 동일한 세포 표지 서열을 포함할 수 있다. 제1 쌍의 상호작용 식별 조성물 중 하나의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 포획 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 포획 서열은 폴리(dT) 영역을 포함할 수 있다. 포획 서열에 상보적인 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드의 서열은 폴리(dA) 영역을 포함할 수 있다. 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 제2 바코드 서열을 포함할 수 있다. 제1 쌍의 상호작용 식별 조성물 중 다른 하나의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 범용 프라이머를 위한 결합 부위를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 성분 표적은 세포외 단백질, 세포내 단백질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 세포 성분 표적은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 인테그린, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 성분 표적은 지질, 탄수화물, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 세포 성분 표적은 10 내지 100 개의 상이한 세포 성분 표적을 포함하는 기로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 성분 결합 시약은 동일한 서열을 갖는 둘 이상의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결된다. 세포 성분 결합 시약은 상이한 상호작용 결정 서열을 갖는 둘 이상의 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 상호작용 결정 조성물들 중 하나는 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결되지 않은 제2 세포 성분 결합 시약을 포함한다. 세포 성분 결합 시약과 제2 세포 성분 결합 시약은 동일할 수 있다. 세포 성분 결합 시약은 검출가능한 모이어티와 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들은 입자와 연결된다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 상에 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 상에 부분적으로 고정될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 내에 봉입될 수 있다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 내에 부분적으로 봉입될 수 있다. 입자는 붕괴될 수 있다. 입자는 비드를 포함할 수 있다. 입자는 세파로스 비드, 스트렙트아비딘 비드, 아가로스 비드, 자석 비드, 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 올리고(dT) 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 입자는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스티렌, 유리, 폴리프로필렌, 아가로스, 젤라틴, 하이드로겔, 상자성체, 세라믹, 플라스틱, 유리, 메틸스티렌, 아크릴성 중합체, 티타늄, 라텍스, 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 실리콘, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 재료를 포함할 수 있다. 입자는 붕괴될 수 있는 하이드로겔 입자를 포함할 수 있다. 입자는 검출가능한 모이어티와 연결될 수 있다. 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티와 연결될 수 있다. 바코드 서열을 포함하는 입자의 바코드는 약, 적어도, 최대, 1000, 10000 개, 또는 이상, 또는 이하, 또는 이들의 임의의 조합의 상이한 바코드 서열로부터 선택될 수 있다. 바코드의 바코드 서열은 랜덤 서열을 포함할 수 있다. 입자는 적어도 10000 개의 바코드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들을 이용하여 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 바코딩하는 단계는: 복수의 바코드들을 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 생성하는 단계; 및 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함한다. 바코드를 연장하는 단계는 DNA 중합효소를 이용하여 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 바코드를 연장하는 단계는 역전사 효소를 이용하여 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 바코드를 연장하는 단계는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(M-MLV) 역전사효소 또는 Taq DNA 중합효소를 이용하여 바코드를 연장하여 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 바코드를 연장하는 단계는 배위된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드로부터 가교 올리고뉴클레오티드를 치환하는 것을 포함할 수 있다. 방법은: 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 증폭시켜 복수의 암프리콘들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 증폭시키는 단계는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여, 바코드 서열의 적어도 일부 및 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계는 복수의 암프리콘들의 서열화 데이터를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 서열화 데이터를 수득하는 단계는 바코드 서열의 적어도 일부 및 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부를 서열화하는 단계를 포함할 수 있다. 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들의 서열화 데이터를 수득하는 단계는 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들의 부분적인 및/또는 완전한 서열을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들은 복수의 추계적 바코드들을 포함하고, 복수의 추계적 바코드들의 각각의 바코드 서열은 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함하고, 복수의 추계적 바코드들 중 적어도 2 개의 추계적 바코드의 바코드 서열은 상이한 서열을 포함하고, 복수의 바코드들을 이용하여 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 바코딩하여 복수의 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계는 복수의 추계적 바코드들을 이용하여 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드를 추계적으로 바코딩하여 복수의 추계적으로 바코딩된 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 바코드들을 이용하여 세포의 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계; 및 바코딩된 표적의 서열화 데이터를 수득하는 단계. 복수의 바코드들을 이용하여 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는: 표적의 복제물을 바코드의 표적-결합 영역과 접촉시키는 단계; 및 복수의 바코드들을 이용하여 복수의 표적들을 역전사하여 복수의 역전사된 표적들을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은: 복수의 바코딩된 표적들의 서열화 데이터를 수득하기 전에, 바코딩된 표적을 증폭시켜 복수의 증폭된 바코딩된 표적들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 바코딩된 표적을 증폭시켜 복수의 증폭된 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는: 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 바코딩된 표적을 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 복수의 바코드들을 이용하여 세포의 복수의 표적들을 바코딩하여 복수의 바코딩된 표적들을 생성하는 단계는 복수의 추계적 바코드들을 이용하여 세포의 복수의 표적들을 추계적으로 바코딩하여 복수의 추계적으로 바코딩된 표적들을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 개시된 구현예는 세포 성분-세포 성분 상호작용(예를 들어, 단백질-단백질 상호작용)을 식별하기 위한 키트를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는: 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물을 포함하며, 여기서 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 각각은 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결된 세포 성분 결합 시약을 포함하고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 하나의 조성물의 세포 성분 결합 시약은 제1 세포 성분 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 다른 하나의 조성물의 세포 성분 결합 시약은 제2 세포 성분 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드는 상호작용 결정 서열 및 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역을 포함하고, 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 상호작용 결정 서열은 상이한 서열을 포함하고; 제1 쌍의 상호작용 결정 조성물의 가교 올리고뉴클레오티드 혼성화 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 2 개의 혼성화 영역을 각각 포함하는 복수의 가교 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는: 제2 쌍의 상호작용 결정 조성물을 포함하며, 여기서 제2 쌍의 상호작용 결정 조성물의 각각은 상호작용 결정 올리고뉴클레오티드와 연결된 세포 성분 결합 시약을 포함하고, 제2 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 하나의 조성물의 세포 성분 결합 시약은 제3 세포 성분 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 쌍의 상호작용 결정 조성물 중 다른 하나의 조성물의 세포 성분 결합 시약은 제4 세포 성분 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 상호작용 결정 조성물의 3 이상의 쌍을 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는: 복수의 바코드들을 포함하고, 복수의 바코드들의 각각은 바코드 서열 및 포획 서열을 포함한다. 복수의 바코드들은 추계적 바코드들을 포함할 수 있으며, 여기서 복수의 추계적 바코드들의 각각의 바코드 서열은 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)을 포함하고, 복수의 추계적 바코드들 중 적어도 2 개의 추계적 바코드의 바코드 서열은 상이한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 바코드들은 입자와 연결된다. 복수의 바코드들 중 적어도 하나의 바코드는 입자 상에 고정되거나, 입자 상에 부분적으로 고정되거나, 입자 내에 봉입되거나, 입자 내에 부분적으로 봉입되거나, 이들의 임의의 조합일 수 있다. 입자는 붕괴될 수 있다. 입자는 비드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는: DNA 중합효소를 포함한다. 키트는 역전사효소를 포함할 수 있다. 키트는: 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(M-MLV) 역전사효소 또는 Taq DNA 중합효소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 고정제(예를 들어, 포르말린, 파라포름알데히드, 글루타르알데히드/오스뮴 테트록시드, 알코올성 고정제, 헤페스-글루탐산 버퍼-매개 유기 용매 보호 효과(HOPE), 부인 용액, 또는 이들의 임의의 조합)를 포함한다.
표지된 생체분자 시약의 제조에 사용하기 위한 시스템
많은 피분석물 분석에 사용되는 표지된 생체분자 시약 조성물은 검출가능한 마커 화합물에 컨쥬게이트된 생체분자를 포함한다. 생체분자는, 생체분자의 주쇄 또는 측쇄로의 하나 이상의 공유결합에 의해 검출가능한 마커에 컨쥬게이트되거나, 이온 또는 기타 비-공유결합 상호작용에 의해 함께 커플링될 수 있다. 종종, 생체분자는 관심 대상의 피분석물에 대한 특이적 결합 영역을 갖는 프로브 화합물이고, 검출가능한 마커는, 예를 들어, 현미경 하에서 맨 눈으로 또는 광학 분광법(예를 들어, UV-가시광선, 형광 분광법 등)의 어떤 형태에 의해 시각화될 수 있는 화합물이다. 일부 구현예에서, 생체분자는 폴리펩티드, 핵산, 폴리사카라이드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 핵산은 올리고뉴클레오티드, DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리펩티드는 단백질, 효소 또는 단백질 결합 시약일 수 있다. 단백질 결합 시약은 항체, 압타머, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 표지와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 복수의 단백질 표적들은, 예를 들어, 10 내지 400 개의 상이한 단백질 표적을 포함할 수 있다. 생체분자는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 생체분자로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 생체분자에 대한 고유 식별자를 포함한다. 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택될 수 있다. 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 10, 100, 또는 1,000 개의 상이한 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)로부터 선택된 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 생체분자에 컨쥬게이트된다. 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 생체분자에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
고유 식별자는 샘플의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 샘플은 단일 세포, 복수의 세포들, 조직, 종양 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 샘플은 포유동물 샘플, 세균 샘플, 바이러스 샘플, 효모 샘플, 균류 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 폴리(A) 테일, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
생물학적 유체 내 피분석물의 존재 및 농도를 결정하는 분석은 종종 프로브 화합물의 특이적 결합에 의존한다. 관심 대상의 피분석물에 따라, 프로브 화합물은 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 이들의 각각은 특이적 결합 영역을 갖는다. 표적 피분석물의 결합을 검출하기 위하여, 시각화될 수 있는(예를 들어, 분광법에 의해 검출가능함) 마커는 프로브 화합물에 컨쥬게이트된다. 현재, 표지된 생체분자 시약을 제조하기 위하여, 각각의 생체분자(예를 들어, CD4-RPA-T4)는 개별적인 합성 프로토콜에 의해 검출가능한 표지(PE-Cy5)에 개별적으로 컨쥬게이트되고, 이어서 정제(예를 들어, 컬럼 크로마토그래피)된다. 각각의 표지된 생체분자 시약은 개별적으로 제조 및 정제되기 때문에, 분석-준비된 특이적 결합 프로브 조성물을 제공하는 공정은, 구체적으로 소규모의 주문자 요청인 경우, 비싸고 노동 집약적이다. 추가적으로, 표지된 생체분자의 합성 및 후속 정제에 필요한 조달 기간(lead time)의 양으로 인해, 성능 특이적이고 고품질의 프로브 조성물의 온-디맨드 제조는 가능하지 않다. 상업적으로, 일반적으로 사용된 표지된 생체분자 시약은 미리 제조 및 저장되고, 주문자는 미리합성된 표지된 생체분자 시약 조성물의 제한된 데이터베이스로부터만 선택할 수 있다.
도 12는 일 구현예에 따른 실험실 및 임상 분석을 위한 표지된 생체분자 시약 조성물을 제공하기 위해 사용되는 표지된 생체분자 시약의 제조 단계를 도시한다. 관심 대상의 생체분자(항체 프로브)는 먼저 정제되고(단계 1201), 이 생체분자는 5 개의 상이한 검출가능한 마커들과 컨쥬게이트되어 표지된 생체분자(1200a, 1200b, 1200c, 1200d 및 1200e)를 생성하기에 충분한 반응 조건(단계 1202) 처리된다. 이어서, 표지된 생체분자(1200a, 1200b, 1200c, 1200d 및 1200e)는 각각 정제되고(단계 1203) 저장된다. 주문자로부터 요청 시 표지된 생체분자(1200a, 1200b, 1200c, 1200d 및 1200e)는 표지된 생체분자 시약 조성물로 조제되고 주문자에게 전달하기 위해 포장된다.
일부 구현예에서, 생체분자는 폴리펩티드, 핵산, 폴리사카라이드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 핵산은 올리고뉴클레오티드, DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리펩티드는 단백질, 효소 또는 단백질 결합 시약일 수 있다. 단백질 결합 시약은 항체, 압타머, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 표지와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 복수의 단백질 표적들은 예를 들어, 10 내지 400 개의 상이한 단백질 표적을 포함할 수 있다. 생체분자는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 생체분자로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 생체분자에 대한 고유 식별자를 포함한다. 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택될 수 있다. 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 10, 100, 또는 1,000 개의 상이한 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)로부터 선택된 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 생체분자에 컨쥬게이트된다. 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 생체분자에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
고유 식별자는 샘플의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 샘플은 단일 세포, 복수의 세포들, 조직, 종양 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 샘플은 포유동물 샘플, 세균 샘플, 바이러스 샘플, 효모 샘플, 균류 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 폴리(A) 테일, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에는 고품질 및 성능 특이적 생성물을, 광범위한 생체 분자 및 검출가능한 표지 포트폴리오에 걸쳐, 빠르고 효율적이며 고도로 규모조절가능한 방식으로 전달하기 위한 시스템 및 방법이 개시된다. 본 발명의 구현예에서, 표지된 생체분자에 대한 요청이 이루어지고, 그 요청에 반응하여 표지된 생체분자는 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지의 기존 컬렉션으로부터 제조된다. 도 13은 본 발명의 구현예에 따른 방법의 예시를 제공한다. 도 13에서, 생체분자(1301a)의 컬렉션 및 검출가능한 표지 또는 마커(1301b)의 컬렉션은 먼저 정제된다(단계 1301). 이어서, 각각의 생체분자는 반응성 링커에 컨쥬게이트되어 반응성 모이어티를 갖는 생체분자를 작용화한다(즉, 반응성 링커 L1(1302a)로 생체분자를 활성화함). 이어서, 활성화된 생체분자의 컬렉션은 정제되고 저장된다. 검출가능한 마커의 컬렉션도 개별적으로 반응성 링커에 컨쥬게이트되어 검출가능한 마커의 컬렉션을 반응성 모이어티로 작용화한다(즉, 반응성 링커 L2(1302b)로 생체분자를 활성화함). 활성화된 표지의 컬렉션도 정제되고 저장된다(단계 1302). 주문자가 표지된 생체분자 시약을 요청할 시, 생체분자는 활성화된 생체분자(L1)를 활성화된 표지(L2)와 반응시켜(단계 1303) 표지에 컨쥬게이트되어, 표지된 생체분자(L1-L2 결합을 통해 결합됨)를 형성한다. 이러한 방식으로, 생체 분자 및 검출가능한 마커의 임의의 바람직한 조합은 활성화된 생체분자를 활성화된 표지와 간단히 혼합함으로써 온-디맨드 제조될 수 있다.
도 14는 온-디맨드 주문제작가능한 표지된 생체분자 시약을 제공하기 위한 본 발명의 개시 내용의 이러한 고유하고 신규한 방법을 도시한다. 관심 대상의 생체분자는 정제되고(단계 1401), 이어서 반응성 링커와 작용화되어(단계 1402), 활성화된 생체분자(1400a)를 생성할 수 있다. 활성화된 표지(1400b, 1400c, 1400d, 및 1400e)는 검출가능한 마커를 반응성 링커로 작용화함으로써 개별적으로 제조된다. 주문자로부터 요청의 수신 시, 활성화된 생체분자(1400a) 및 활성화된 표지(1400b, 1400c, 1400d 및 1400e)의 임의의 조합은, 활성화된 생체분자(500a)의 반응성 링커의 활성화된 표지(1400b, 1400c, 1400d 및 1400e)의 반응성 링커와의 반응에 의해 온-디맨드 제조될 수 있다. 일단 컨쥬게이트되면, 표지된 생체분자(1400a 및 1400b, 1400a 내지 1400c, 1400a 내지 1400d, 및 1400a 내지 1400e)는 표지된 생체분자 시약 조성물로 조제되고, 주문자에게 전달하기 위해 포장된다. 일부 구현예에서, 생체분자는 폴리펩티드, 핵산, 폴리사카라이드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 핵산은 올리고뉴클레오티드, DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리펩티드는 단백질, 효소, 또는 단백질 결합 시약일 수 있다. 단백질 결합 시약은 항체, 압타머, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 표지에 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 복수의 단백질 표적들은 예를 들어, 10 내지 400 개의 상이한 단백질 표적을 포함할 수 있다. 생체분자는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 생체분자로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 생체분자에 대한 고유 식별자를 포함한다. 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택될 수 있다. 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 10, 100, 또는 1,000 개의 상이한 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)로부터 선택된 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 생체분자에 컨쥬게이트된다. 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 생체분자에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
고유 식별자는 샘플의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 샘플은 단일 세포, 복수의 세포들, 조직, 종양 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 샘플은 포유동물 샘플, 세균 샘플, 바이러스 샘플, 효모 샘플, 균류 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 폴리(A) 테일, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시 내용은 표지된 생체분자 시약의 제조에 이용하기 위한 시스템을 제공한다. 본 개시 내용의 구현예의 추가 설명에 있어서, 표지된 생체분자 시약 요청을 수신하기 위한 입력 관리자 및 생체 분자 및 표지 저장 식별자를 제공하기 위한 출력 관리자를 갖는 시스템이 먼저 더욱 상세히 설명된다. 그 다음, 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지로부터 표지된 생체분자 시약을 제조하기 위한 시약 제조 장치가 설명된다. 표지된 생체분자 시약 요청을 통신 및 수신하고, 본 표지된 생체분자 시약을 제조하는 방법 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 생체분자는 폴리펩티드, 핵산, 폴리사카라이드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 핵산은 올리고뉴클레오티드, DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리펩티드는 단백질, 효소 또는 단백질 결합 시약일 수 있다. 단백질 결합 시약은 항체, 압타머, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 표지에 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 복수의 단백질 표적들은 예를 들어, 10 내지 400 개의 상이한 단백질 표적을 포함할 수 있다. 생체분자는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 생체분자로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 생체분자에 대한 고유 식별자를 포함할 수 있다. 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택될 수 있다. 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 10, 100, 또는 1,000 개의 상이한 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)로부터 선택된 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 생체분자에 컨쥬게이트될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 생체분자에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
고유 식별자는 샘플의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 샘플은 단일 세포, 복수의 세포들, 조직, 종양 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 샘플은 포유동물 샘플, 세균 샘플, 바이러스 샘플, 효모 샘플, 균류 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 폴리(A) 테일, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 양태는 표지된 생체분자 시약의 제조 방법에 이용하기 위한 시스템을 포함한다. 일부 구현예에 따른 시스템은 표지된 생체분자 시약에 대한 요청을 수신하기 위한 입력 관리자, 표지된 생체분자 시약 요청의 하나 이상의 구성요소(예를 들어, 생체분자, 표지 등)에 상응하는 복수의 저장 식별자들을 갖는 데이터세트를 저장하기 위한 메모리, 메모리에 통신가능하게 커플링되고, 표지된 생체분자 시약 요청의 구성요소에 상응하는 데이터세트로부터 저장 식별자를 식별하도록 구성된 프로세싱 모듈, 및 식별된 저장 식별자를 제공하기 위한 출력 관리자를 포함한다. 아래에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 용어 "표지된 생체분자" 시약은 검출가능한 마커에 (예를 들어, 공유결합을 통해) 커플링된 생물학적 거대분자를 지칭한다. 생물학적 거대분자는 생체고분자일 수 있다. "생체고분자"는 하나 이상의 유형의 반복 단위의 중합체이다. 생체고분자는 생물계에서 통상적으로 발견되며, 특히 폴리사카라이드(예컨대, 탄수화물), 및 펩티드(이 용어는 폴리사카라이드에의 부착 여부에 관계 없이 폴리펩티드 및 단백질을 포함하는 것으로 사용됨) 및 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 이들의 유사체, 예컨대 아미노산 유사체 또는 비-아미노산 기, 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 비-뉴클레오티드 기로 구성되거나 그를 함유하는 그러한 화합물을 포함한다. 이는 기존 주쇄가 비-천연 발생이거나 합성인 주쇄로 치환된 폴리뉴클레오티드, 및 하나 이상의 기존 염기가 왓슨-크릭 유형 수소 결합 상호작용에 참여할 수 있는 (천연 또는 합성) 기로 치환된 핵산(또는 합성 또는 천연 발생 유사체)을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단일 또는 다중 가닥 구성을 포함하며, 여기서 하나 이상의 가닥은 서로 완전히 정렬되거나 정렬되지 않을 수 있다. 특히, "생체고분자"는 그 출처(source)에 관계없이, DNA(cDNA 포함), RNA 및 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이에 따라, 생체분자는 폴리사카라이드, 핵산 및 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 올리고뉴클레오티드, 절단된 또는 전장의 DNA 또는 RNA일 수 있다. 구현예에서, 올리고뉴클레오티드, 절단된 및 전장의 DNA 또는 RNA는 10 개 이상의 뉴클레오티드 단량체, 예컨대 15 개 이상, 예컨대 25 개 이상, 예컨대 50 개 이상, 예컨대 100 개 이상, 예컨대 250 개 이상의 뉴클레오티드 단량체로 구성되며, 이는 500 개 이상의 뉴클레오티드 단량체를 포함한다. 예를 들어, 관심 대상의 절단된 및 전장의 DNA 또는 RNA인, 올리고뉴클레오티드는 10 개의 뉴클레오티드 내지 108 개의 뉴클레오티드, 예컨대 102 개의 뉴클레오티드 내지 107 개의 뉴클레오티드의 길이 범위일 수 있고, 이는 103 개의 뉴클레오티드 내지 106 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 구현예에서, 생체고분자는 단일 뉴클레오티드 또는 단쇄 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 10 개 미만의 뉴클레오티드)가 아니다. "전장"은 DNA 또는 RNA가 (예컨대, 자연에서 발견되는) 그의 완전한 서열의 70% 이상, 예컨대 75% 이상, 예컨대 80% 이상, 예컨대 85% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대 95% 이상, 예컨대 97% 이상, 예컨대 99% 이상을 갖고, (예컨대, 자연에서 발견되는) DNA 또는 RNA의 전장 서열의 100%를 포함하는 핵산 중합체임을 의미한다.
일부 구현예에서, 생체분자는 폴리펩티드, 핵산, 폴리사카라이드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 핵산은 올리고뉴클레오티드, DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리펩티드는 단백질, 효소 또는 단백질 결합 시약일 수 있다. 단백질 결합 시약은 항체, 압타머, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 표지와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 복수의 단백질 표적들은 예를 들어, 10 내지 400 개의 상이한 단백질 표적을 포함할 수 있다. 생체분자는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 생체분자로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 생체분자에 대한 고유 식별자를 포함한다. 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택될 수 있다. 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 10, 100, 또는 1,000 개의 상이한 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)로부터 선택된 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 생체분자에 컨쥬게이트된다. 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 생체분자에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
고유 식별자는 샘플의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 샘플은 단일 세포, 복수의 세포들, 조직, 종양 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 샘플은 포유동물 샘플, 세균 샘플, 바이러스 샘플, 효모 샘플, 균류 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 폴리(A) 테일, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
폴리펩티드는 일부 구현예에서, 절단된 또는 전장의 단백질, 효소 또는 항체일 수 있다. 구현예에서, 폴리펩티드, 절단된 또는 전장의 단백질, 효소 또는 항체는 10 개 이상의 아미노산 단량체, 예컨대 15 개 이상, 예컨대 25 개 이상, 예컨대 50 개 이상, 예컨대 100 개 이상, 예컨대 250 개 이상의 아미노산 단량체로 구성되고, 이는 500 개 이상의 아미노산 단량체를 포함한다. 예를 들어, 관심 대상의 폴리펩티드, 절단된 및 전장의 단백질, 효소 또는 항체는 10 개 내지 108 개 아미노산, 예컨대 102 개 내지 107 개 아미노산 길이의 범위일 수 있으며, 이는 103 개 내지 106 개의 아미노산을 포함한다. 구현예에서, 생체고분자는 단일 아미노산 또는 단쇄 폴리펩티드(예를 들어, 10 개 미만의 아미노산)이 아니다. "전장"이라 함은, 단백질, 효소 또는 항체가 (예컨대 자연에서 발견되는) 그의 전체 서열의 70% 이상, 예컨대 75% 이상, 예컨대 80% 이상, 예컨대 85% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대 95% 이상, 예컨대 97% 이상, 예컨대 99% 이상을 갖는 폴리펩티드 중합체를 의미하며, 이는 (예컨대 자연에서 발견되는) 단백질, 효소 또는 항체의 전장 서열의 100%를 포함한다. 본 발명의 개시 내용의 구현예에서, 표지는 검출가능한 모이어티, 또는 예를 들어, 형광 방출, 흡광도, 형광 분극화, 형광 수명, 형광 파장, 최대 흡광도, 흡광도 파장, 스토크스 시프트, 광 산란기, 질량, 분자 질량, 산화환원, 음향, 라만, 자성, 무선 주파수, 효소 반응(화학발광 및 전기-화학발광 포함) 또는 이들의 조합에 기반하여 검출가능한 마커 화합물이다. 예를 들어, 표지는 형광단, 발색단, 효소, 효소 기질, 촉매, 산화환원 표지, 방사성표지, 음향 표지, 라만(SERS) 태그, 질량 태그, 동위원소 태그(예를 들어, 동위원소적으로 순수한 희토류 원소), 자석 입자, 마이크로입자, 나노입자, 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본 명세서에 설명되는 시스템은 표지된 생체분자 시약 요청을 수신하기 위한 입력 관리자를 포함할 수 있다. 표지된 생체분자 시약 요청은 하나 이상의 구성요소들을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 표지된 생체분자 시약 요청은 단일 구성요소를 포함하고, 표지된 생체분자 요청(즉, 반응성 링커를 통해 표지에 공유결합적으로 결합된 생체분자에 대한 요청)이다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약 요청은 둘 이상의 구성요소를 포함한다. 예를 들어, 표지된 생체분자 시약 요청은 생체분자 요청 및 표지 요청을 포함한다. 일부 구현예에서, 생체분자 요청은 생체분자 및 반응성 링커를 포함하는 활성화된 생체분자 요청이고, 표지 요청은 표지 및 반응성 링커를 포함하는 활성화된 표지 요청이다. 일부 구현예에서, 표지 요청은 효소 요청 및 기질 요청을 포함한다.
일부 구현예에서, 생체분자는 폴리펩티드, 핵산, 폴리사카라이드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 핵산은 올리고뉴클레오티드, DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리펩티드는 단백질, 효소 또는 단백질 결합 시약일 수 있다. 단백질 결합 시약은 항체, 압타머, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 표지에 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 복수의 단백질 표적들은 예를 들어, 10 내지 400 개의 상이한 단백질 표적을 포함할 수 있다. 생체분자는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 생체분자로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 생체분자에 대한 고유 식별자를 포함한다. 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택될 수 있다. 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 10, 100, 또는 1,000 개의 상이한 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)로부터 선택된 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 생체분자에 컨쥬게이트될 수 있다 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 생체분자에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
고유 식별자는 샘플의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 샘플은 단일 세포, 복수의 세포들, 조직, 종양 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 샘플은 포유동물 샘플, 세균 샘플, 바이러스 샘플, 효모 샘플, 균류 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 폴리(A) 테일, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
구절 "표지된 생체분자 요청", "생체분자 요청" 및 "표지 요청"은 특정 표지된 생체분자, 생체분자 또는 표지와 각각 연결된 정보 또는 데이터를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 요청은 특정 표지된 생체분자, 생체분자, 표지, 활성화된 생체분자, 활성화된 표지 또는 반응성 링커와 연결된 일련의 하나 이상의 기호(예를 들어, 문자숫자(alphanumeric) 기호), 부호, 이미지 또는 기타 그래픽적 표현(들)을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 요청은 표지된 생체분자, 생체분자, 표지, 활성화된 생체분자, 활성화된 표지 또는 반응성 링커의 "약칭" 명칭이다. 예를 들어, 요청은 접수 번호(acession number) 또는 약기된 프로브 서열을 포함할 수 있다. 요청은 또한 설명적 정보, 예컨대 화학 구조 또는 반응성을 포함할 수 있다. 정보 또는 데이터는, 일부 구현예에서 표지된 생체분자, 생체분자 또는 표지의 임의의 적합한 식별자일 수 있고, 생체분자의 이름, 단량체 서열, 서열 식별 번호, 상승(ascension) 번호 또는 생물학적 출처뿐만 아니라, 표지의 이름, 화학 구조, 화학 초록 서비스(CAS) 등록 번호 또는 마커 부류(예를 들어, 형광, 자석)를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 생체분자는 관심 대상의 피분석물에 대한 생물학적 프로브이고, 생체분자 요청은 관심 대상의 피분석물에 결합하는 특이적 결합 도메인에 관한 정보 또는 데이터를 포함한다. 관심 대상의 특이적 결합 도메인은 항체 결합제, 단백질, 펩티드, 합텐, 핵산 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "항체 결합제"는 관심 대상의 피분석물에 결합하기에 충분한 다클론성 또는 단클론성 항체 또는 단편을 포함한다. 항체 단편은 예를 들어, 단량체성 Fab 단편, 단량체성 Fab' 단편, 또는 이량체성 F(ab)'2 단편일 수 있다. 또한, 용어 "항체 결합제"의 범주 내에는, 항체 엔지니어링에 의해 생성된 분자, 예컨대 키메라 항체를 생성하기 위하여 중쇄 및 경쇄의 불변 영역의 치환에 의한, 또는 인간화 항체를 생성하기 위하여 가변 영역의 불변 영역 및 프레임워크 부분 모두의 치환에 의한, 단일 사슬 항체 분자(scFv), 또는 단클론성 항체로부터 생성된 인간화 또는 키메라성 항체가 있다.
일부 경우에서, 생체분자는 폴리펩티드이고, 생체분자 요청은 정보, 예컨대 폴리펩티드명, 단백질명, 효소명, 항체명 또는 단백질, 효소 또는 그의 항체 단편의 이름, 특정 생물학적 유체로부터의 것인 폴리펩티드(예를 들어, 혈액, 점액, 림프액, 활액, 뇌척수액, 타액, 기관지폐포세척(bronchoalveolar lavage), 양수, 제대혈, 소변, 질액 및 정액), 특정 종으로부터의 것인 폴리펩티드(예를 들어, 마우스 단클론성 항체) 및 아미노산 서열 식별 번호를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 생체분자는 핵산이고, 생체분자 요청은 정보, 예컨대 올리고뉴클레오티드명, 유전자명에 의해 식별된 올리고뉴클레오티드, 접수 번호에 의해 식별된 올리고뉴클레오티드, 특정 종(예를 들어, 마우스, 인간)으로부터의 유전자의 올리고뉴클레오티드, 특정 조직(예를 들어, 간, 뇌, 심장)과 연관된 유전자의 올리고뉴클레오티드, 특정 생리학적 작용(예를 들어, 세포자멸, 스트레스 반응)과 연관된 유전자의 올리고뉴클레오티드, 특정 질병 상태(예를 들어, 암, 심혈관 질환)와 연관된 올리고뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 표지 요청은 효소 요청 및 기질 요청을 포함한다. 효소 요청은 효소명, 폴리펩티드 서열, 효소의 부류, EC 번호, 폴리펩티드 컨센서스 서열, 보존 도메인명 및/또는 서열 또는 복수의 관련 단백질들(예를 들어, 동일한 단백질 군에 속하는 단백질), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 기질 요청은 기질명, 기질의 작용기, 기질의 부류, 특정 EC 번호를 갖는 하나 이상의 효소에 대한 하나 이상의 기질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
상기 논의된 바와 같이, 표지는 검출가능한 모이어티, 또는 예를 들어, 형광 방출, 흡광도, 형광 분극화, 형광 수명, 형광 파장, 흡광도 파장, 스토크스 시프트, 광 산란기, 질량, 분자 질량, 산화환원, 음향, 라만, 자성, 무선 주파수, 효소 반응(화학발광 및 전기-화학발광 포함) 또는 이들의 조합에 기반하여 검출가능한 마커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표지는 형광단, 발색단, 효소, 효소 기질, 촉매, 산화환원 표지, 방사성 표지, 음향 표지, 라만(SERS) 태그, 질량 태그, 동위원소 태그(예를 들어, 동위원소적으로 순수한 희토류 원소), 자석 입자, 마이크로입자, 나노입자, 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 표지는 형광단(즉, 형광 표지, 형광 염료 등)이다. 관심 대상의 형광단은 분석적 적용(예를 들어, 유세포 분석, 이미징 등)에 이용하기에 적합한 염료, 예컨대 아크리딘 염료, 안트라퀴논 염료, 아릴메탄 염료, 디아릴메탄 염료(예를 들어, 디페닐 메탄 염료), 엽록소 함유 염료, 트리아릴메탄 염료(예를 들어, 트리페닐메탄 염료), 아조 염료, 디아조늄 염료, 니트로 염료, 니트로소 염료, 프탈로시아닌 염료, 시아닌 염료, 비대칭 시아닌 염료, 퀴논-이민 염료, 아진 염료, 유로딘 염료, 사프라닌 염료, 인다민, 인도페놀 염료, 플루오린 염료, 옥사진 염료, 옥사존 염료, 티아진 염료, 티아졸 염료, 잔텐 염료, 플루오렌 염료, 피로닌 염료, 플루오린 염료, 로다민 염료, 페난트리딘 염료뿐만 아니라, 상기 언급된 염료들 중 둘 이상을 (예를 들어, 나란히(in tandem)) 조합한 염료, 하나 이상의 단량체성 염료 단위를 갖는 중합체성 염료 및 상기 언급된 염료의 둘 이상의 혼합물을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 다수의 염료가 예를 들어, Molecular Probes(미국 오리건주 유진 소재), Dyomics GmbH(독일 제나 소재), Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스 소재), Sirigen, Inc.(미국 캘리포니아주 산타바바라 소재) 및 Exciton(미국 오하이오주 데이톤 소재)과 같은 다양한 공급원들로부터 구매 가능하다. 예를 들어, 형광단은 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'디설폰산; 아크리딘 및 유도체, 예컨대 아크리딘, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 옐로우, 아크리딘 레드, 및 아크리딘 이소티오시아네이트; 알로피코시아닌, 피코에리트린, 페리디닌-엽록소 단백질, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS); 4-아미노-N-[3-비닐설포닐)페닐]나프탈이미드-3,5 디설포네이트(루시퍼 옐로우 VS); N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드; 안트라닐아미드; 브릴리언트 옐로우; 쿠마린 및 유도체, 예컨대 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿨루아린(쿠마린 151); 시아닌 및 유도체, 예컨대 시아노신, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, 및 Cy7; 4',6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI); 5', 5"-디브로모피로갈롤-설포네프탈레인(브로모피로갈롤 레드); 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)-4-메틸쿠마린; 디에틸아미노쿠마린; 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트; 4,4'-디이소티오시아네이토디하이드로-스틸벤-2,2'-디설폰산; 4,4'-디이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디설폰산; 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-설포닐 클로라이드(DNS, 단실 클로라이드); 4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL); 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소티오시아네이트(DABITC); 에오신 및 유도체, 예컨대 에오신 및 에오신 이소티오시아네이트; 에리트로신 및 유도체, 예컨대 에리트로신 B 및 에리트로신 이소티오시아네이트; 에티디움; 플루오레세인 및 유도체, 예컨대 5-카르복시플루오레세인(FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인(DTAF), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인(JOE), 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레세인 클로로트리아지닐, 나프토플루오레세인, 및 QFITC(XRITC); 플루오레스카민; IR144; IR1446; 녹색 형광 단백질(GFP); 초산호 형광 단백질(RCFP); 리사민TM; 리사민 로다민, 루시퍼 옐로우; 말라카이트 그린 이소티오시아네이트; 4-메틸움벨리페론; 오르토 크레졸프탈레인; 니트로티로신; 파라로사닐린; 나일 레드; 오레곤 그린; 페놀 레드; B-피코에리트린; o-프탈디알데히드; 피렌 및 유도체, 예컨대 피렌, 피렌 부티레이트 및 석신이미딜 1-피렌 부티레이트; 리액티브 레드 4(CibacronTM 브릴리언트 레드 3B-A); 로다민 및 유도체, 예컨대 6-카르복시-X-로다민(ROX), 6-카르복시로다민(R6G), 4,7-디클로로로다민 리사민, 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민(Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체(텍사스 레드), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA), 테트라메틸 로다민, 및 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트(TRITC); 리보플라빈; 로졸산 및 터븀 킬레이트 유도체; 잔텐; 염료-컨쥬게이트된 중합체(즉, 중합체-부착된 염료), 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란뿐만 아니라, 둘 이상의 염료를 (예를 들어, 나란히) 조합한 염료, 하나 이상의 단량체성 염료 단위를 갖는 중합체성 염료 및 상기 언급된 염료의 둘 이상의 혼합물 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 형광단(즉, 염료)은 형광 중합체성 염료이다. 본 방법 및 시스템에 사용되는 형광 중합체성 염료는 다양할 수 있다. 방법의 일부 경우에서, 중합체성 염료는 컨쥬게이트된 중합체를 포함한다.
컨쥬게이트된 중합체(CP)는 비편재화된 전자 구조를 특징으로 하며, 이는 교대로 불포화 결합(예를 들어, 이중 및/또는 삼중 결합) 및 포화(예를 들어, 단일 결합) 결합의 주쇄를 포함하고, 여기서 π-전자는 하나의 결합에서 다른 하나로 이동할 수 있다. 이에 따라, 컨쥬게이트된 주쇄는, 중합체의 반복 단위 사이에서 제한된 결합 각으로, 연장된 선형 구조를 중합체성 염료에 부여할 수 있다. 예를 들어, 단백질 및 핵산은 또한 중합체성이기는 하지만, 일부 경우 연장된-막대 구조를 형성하기보다는 더욱 고차원의 삼차원 형태로 접힌다. 추가적으로, CP는 "단단한-막대" 중합체 주쇄를 형성할 수 있고, 중합체 주쇄 사슬을 따라 단량체 반복 단위 사이에 제한된 꼬임(예를 들어, 비틀림) 각을 겪을 수 있다. 일부 경우에서, 중합체성 염료는 단단한 막대 구조를 갖는 CP를 포함한다. 상기 요약된 바와 같이, 중합체성 염료의 구조적 특징은 분자의 형광 특성에 대한 영향을 미칠 수 있다.
임의의 편리한 중합체성 염료가 본 발명의 방법 및 시스템에 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 중합체성 염료는 형광단의 형광 출력을 증폭시키기 위해 집광할 수 있는 구조를 갖는 다중 발색단이다. 일부 경우에서, 중합체성 염료는 집광하여, 더 긴 파장에서 방출된 광으로 효율적으로 전환시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 에너지를 가까운 발광 종(예를 들어, "신호 발색단")으로 효율적으로 전달할 수 있는 집광 다중 발색단 시스템을 갖는다. 에너지 전달의 메커니즘은, 예를 들어, 공명 에너지 전달(예를 들어, 포스터(Forster) (또는 형광) 공명 에너지 전달, FRET), 양자 하전 교환(덱스터(Dexter) 에너지 전달) 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 에너지 전달 메커니즘은 상대적으로 짧은 범위이다; 즉, 집광 다중 발색단 시스템이 신호 발색단에 근접하여 효율적인 에너지 전달을 제공한다. 효율적인 에너지 전달을 위한 조건 하에서, 신호 발색단으로부터의 방출의 증폭은, 집광 다중 발색단 시스템에서 개별적인 발색단의 수가 큰 경우 일어난다; 즉, 신호 발색단으로부터의 방출은, 신호 발색단이 펌프 광에 의해 직접 여기된 경우보다 입사광("여기광")이 집광 다중 발색단 시스템에 의해 흡수된 파장에 있는 경우 더욱 강하다.
다중 발색단은 컨쥬게이트된 중합체일 수 있다. 컨쥬게이트된 중합체(CP)는 비편재화된 전자 구조를 특징으로 하며, 화학 및 생물학적 표적에 대한 고반응성 광학 리포터로서 사용될 수 있다. 효과적인 컨쥬게이션 길이는 중합체 사슬의 길이보다 실질적으로 짧기 때문에, 주쇄는 근접하여 있는 다수의 컨쥬게이트된 절편을 함유한다. 따라서, 컨쥬게이트된 중합체는 집광에 효율적이며, 에너지 전달을 통한 광학 증폭을 가능하게 한다.
일부 경우에, 중합체, 예를 들어, 높은 흡광 계수, 고휘도 등을 갖는 형광 중합체가 직접적인 형광 리포터로서 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 중합체는 색상 또는 색상 또는 광학 밀도가 지표로서 사용되는 경우 강한 발색단으로 사용될 수 있다.
관심 대상의 중합체성 염료는, 그 개시 내용이 전체로서 본 명세서에 참고문헌으로서 포함된, Gaylord 등의 US 특허 공개 20040142344, 20080293164, 20080064042, 20100136702, 20110256549, 20120028828, 20120252986, 20130190193 및 20160025735호에 기재된 염료들; 및 그 개시 내용이 전체로서 본 명세서에 참고문헌으로서 포함된, 문헌[Gaylord et al., J. Am. Chem. Soc., 2001, 123 (26), pp 6417-6418; Feng et al., Chem. Soc. Rev., 2010,39, 2411-2419]; 및 문헌[Traina et al., J. Am. Chem. Soc., 2011, 133(32), pp 12600-12607]을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 중합체성 염료는 제1 광학 활성 단위가 광을 흡수하여 여기 상태를 형성하는 제1 흡수 파장(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)을 갖는 컨쥬게이트된 시스템을 형성하는 복수의 제1 광학 활성 단위들을 포함하는 컨쥬게이트된 중합체를 포함한다. 컨쥬게이트된 중합체(CP)는 다중양이온성, 다중음이온성 및/또는 중성-하전 컨쥬게이트된 중합체일 수 있다.
CP는 생물학적 샘플에서 사용하기 위해 수용성일 수 있다. 증가된 수용성을 제공하기 위해, 임의의 편리한 치환기, 예컨대 친수성 치환기, 예를 들어, 친수성 중합체, 또는 예를 들어, 생리학적 조건 하에서 하전된 치환기, 예를 들어, 수용액에서 양으로 또는 음으로 하전된 기가 중합체성 염료 내에 포함될 수 있다. 임의의 편리한 수용성 기(WSG)가 본 발명의 집광 다중 발색단에 사용될 수 있다. 용어 "수용성 기"는 수성 환경에서 잘 용매화되고, 그가 부착되는 분자에 개선된 수용해도를 부여하는 작용기를 지칭한다. 일부 구현예에서, WSG는, WSG를 결여한 다중 발색단에 비해, 주로 수성인 용액(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)에서 다중 발색단의 용해도를 증가시킨다. 수용성 기는 수성 환경에서 잘 용매화되는 임의의 편리한 친수성 기일 수 있다. 일부 구현예에서, 친수성 수용성 기는 예를 들어, 양으로 또는 음으로 또는 양쪽성으로 하전된다. 일부 구현예에서, 친수성 수용성 기는 중성 친수성 기이다. 일부 구현예에서, WSG는 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 셀룰로스, 키토산, 또는 이들의 유도체이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리에틸렌 산화물", "PEO", "폴리에틸렌 글리콜" 및 "PEG"는 서로 교환가능하게 사용되고, 화학식 -(CH2-CH2-O-)n- 또는 이의 유도체로 설명되는 사슬을 포함하는 중합체를 지칭한다. 일부 구현예에서, "n"은 5000 이하, 예컨대 1000 이하, 500 이하, 200 이하, 100 이하, 50 이하, 40 이하, 30 이하, 20 이하, 15 이하, 예컨대 5 내지 15, 또는 10 내지 15이다. PEG 중합체는 임의의 편리한 길이일 수 있으며, 알킬, 아릴, 히드록실, 아미노, 아실, 아실옥시 및 아미도 말단 기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 다양한 말단기를 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 다중 발색단에서의 이용에 적합할 수 있는 작용화된 PEG는 문헌[S. Zalipsky in "Functionalized Poly(ethylene glycol) for preparation of biologically relevant conjugates", Bioconjugate Chemistry 1995, 6 (2), 150-165]에 의해 설명된 PEG들을 포함한다. 관심 대상의 수용성 기는, 카르복실레이트, 포스포네이트, 포스페이트, 설포네이트, 설페이트, 설피네이트, 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 변경된 PEG, 히드록실, 아민, 암모늄, 구아니디늄, 폴리아민 및 설포늄, 폴리알콜, 직쇄 또는 시클릭 당류, 1차, 2차, 3차, 또는 4차 아민 및 폴리아민, 포스포네이트 기, 포스피네이트 기, 아스코르베이트 기, 글리콜을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 이들 기는 폴리에테르, -COOM', -SO3M', -PO3M', -NR3 +, Y', (CH2CH2O)pR 및 이들의 혼합물을 포함하며, 여기서 Y'는 임의의 할로겐, 설페이트, 설포네이트, 또는 산소 함유 음이온일 수 있고, p는 1 내지 500일 수 있고, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 알킬(예컨대 메틸)일 수 있고, M'는 양이온 또는 수소, -(CH2CH2O)yyCH2CH2XRyy, -(CH2CH2O)yyCH2CH2X-, -X(CH2CH2O)yyCH2CH2-, 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜일 수 있으며, 식에서 yy는 1 내지 1000으로부터 선택되고, X는 O, S, 및 NRZZ으로부터 선택되고, RZZ 및 RYY는 H 및 C1-3 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
중합체성 염료는 임의의 편리한 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료의 단량체성 반복 단위 또는 절편의 구체적인 수는 2 내지 500,000, 예컨대 2 내지 100,000, 2 내지 30,000, 2 내지 10,000, 2 내지 3,000 또는 2 내지 1,000 단위 또는 절편, 또는 예컨대 100 내지 100,000, 200 내지 100,000, 또는 500 내지 50,000 단위 또는 절편의 범위 내에 속할 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료의 단량체성 반복 단위 또는 절편의 수는 2 내지 1000 단위 또는 절편, 예컨대 2 내지 750 단위 또는 절편, 예컨대 2 내지 500 단위 또는 절편, 예컨대 2 내지 250 단위 또는 절편, 예컨대 2 내지 150 단위 또는 절편, 예컨대 2 내지 100 단위 또는 절편, 예컨대 2 내지 75 단위 또는 절편, 예컨대 2 내지 50 단위 또는 절편의 범위 내에 있으며, 이는 2 내지 25 단위 또는 절편을 포함한다.
중합체성 염료는 임의의 편리한 분자량(MW)일 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료의 MW는 평균 분자량으로 표시될 수 있다. 일부 경우에서, 중합체성 염료는 500 내지 500,000, 예컨대 1,000 내지 100,000, 2,000 내지 100,000, 10,000 내지 100,000, 또는 심지어는 50,000 내지 100,000의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 70,000의 평균 분자량을 갖는다.
일부 구현예에서, 중합체성 염료는 하기 구조식을 포함한다:
Figure pat00001
식에서, CP1, CP2, CP3 및 CP4는 독립적으로 컨쥬게이트된 중합체 절편 또는 올리고머성 구조이고, 하나 이상의 CP1, CP2, CP3 및 CP4는 밴드갭-변경 n-컨쥬게이트된 반복 단위이다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트된 중합체는 컨쥬게이트된 중합체의 기타 유형 중, 폴리플루오렌 컨쥬게이트된 중합체, 폴리페닐렌 비닐렌 컨쥬게이트된 중합체, 폴리페닐렌 에테르 컨쥬게이트된 중합체, 폴리페닐렌 중합체이다.
일부 경우에서, 중합체성 염료는 하기 구조를 포함한다:
Figure pat00002
식에서, 각각의 R1은 독립적으로 가용화 기 또는 링커-염료이고; L1 및 L2는 광학 링커이고; 각각의 R2는 독립적으로 H 또는 아릴 치환기이고; 각각의 A1 및 A2는 독립적으로 H, 아릴 치환기 또는 형광단; G1 및 G2는 각각 말단 기, π컨쥬게이트된 절편, 링커 및 링크된 특이적 결합 원으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 각각의 n 및 각각의 m은 독립적으로 0 또는 1 내지 10,000의 정수이고; p는 1 내지 100,000의 정수이다. 관심 대상의 가용화 기는 수용성 작용기, 예컨대 친수성 중합체(예를 들어, 폴리알킬렌 산화물, 셀룰로스, 키토산 등)뿐만 아니라, 친수성 기로 추가로 치환된 알킬, 아릴 및 헤테로사이클 기, 예컨대 폴리알킬렌 산화물(예를 들어, 2 내지 20 단위의 PEG를 포함하는 폴리에틸글리콜), 암모늄, 설포늄, 포스포늄을 포함하지만, 이에 제한되지는 않으며, 또한 하전된 (양성, 음성 또는 양쪽 이온성) 친수성 수용성 기 등을 갖는다.
일부 구현예에서, 중합체성 염료는 중합체성 주쇄의 부분으로서, 하기 구조식들 중 하나를 갖는 컨쥬게이트된 절편을 포함한다:
Figure pat00003
식에서, 각각의 R3은 독립적으로 선택적으로 치환된 수용성 작용기, 예컨대 친수성 중합체(예를 들어, 폴리알킬렌 산화물, 셀룰로스, 키토산 등) 또는 친수성 기로 추가로 치환된 알킬 또는 아릴 기, 예컨대 폴리알킬렌 산화물(예를 들어, 2 내지 20 단위의 PEG를 포함하는 폴리에틸글리콜), 암모늄, 설포늄, 포스포늄이고, 또한 하전된 (양성, 음성 또는 양쪽 이온성) 친수성 수용성 기를 갖고; Ar은 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기이고; n은 1 내지 10000이다. 일부 구현예에서, R3은 선택적으로 치환된 알킬 기이다. 일부 구현예에서, R3은 선택적으로 치환된 아릴 기이다. 일부 구현예에서, R3은 폴리에틸렌글리콜, 염료, 화학선택적 작용기 또는 특이적 결합 모이어티로 치환된다. 일부 구현예에서, Ar은 폴리에틸렌글리콜, 염료, 화학선택적 작용기 또는 특이적 결합 모이어티로 치환된다.
일부 구현예에서, 중합체성 염료는 하기 구조식을 포함한다:
Figure pat00004
식에서, 각각의 R1은 가용화 기 또는 링커 염료 기이고; 각각의 R2는 독립적으로 H 또는 아릴 치환기이고; L1 및 L2는 선택적 링커이고; 각각의 A1 및 A3은 독립적으로 H, 형광단, 작용기 또는 특이적 결합 모이어티(예를 들어, 항체)이고; n 및 m은 각각 독립적으로 0 내지 10000이고, 여기서 n+m>1이다.
중합체성 염료는 하나 이상의 바람직한 분광학적 특성, 예컨대 특정 최대 흡수 파장, 특정 최대 방출 파장, 흡광 계수, 양자 수율 등(예를 들어, 문헌[Chattopadhyay et al., "Brilliant violet fluorophores: A new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments." Cytometry Part A, 81A(6), 456-466, 2012] 참조)을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 중합체성 염료는 280 내지 850 nm 사이의 흡수 곡선을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 280 내지 850 nm 범위 내 최대 흡수를 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 280 내지 850 nm 범위의 파장을 갖는 입사광을 흡수하고, 여기서 관심 대상의 최대 흡수의 특정 예는: 348 nm, 355 nm, 405 nm, 407 nm, 445 nm, 488 nm, 640 nm 및 652 nm를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 280 내지 310 nm, 305 내지 325 nm, 320 내지 350 nm, 340 내지 375 nm, 370 내지 425 nm, 400 내지 450 nm, 440 내지 500 nm, 475 내지 550 nm, 525 내지 625 nm, 625 내지 675 nm, 및 650 내지 750 nm로 이루어진 군으로부터 선택되는 범위 내에서 최대 흡수 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 348 nm의 최대 흡수 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 355 nm의 최대 흡수 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 405 nm의 최대 흡수 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 407 nm의 최대 흡수 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 445 nm의 최대 흡수 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 488 nm의 최대 흡수 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 640 nm의 최대 흡수 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 652 nm의 최대 흡수 파장을 갖는다.
일부 구현예에서, 중합체성 염료는 400 내지 850 nm, 예컨대 415 내지 800 nm 범위의 최대 방출 파장을 가지며, 여기서 관심 대상의 최대 방출 파장의 특정 예는: 395 nm, 421 nm, 445 nm, 448 nm, 452 nm, 478 nm, 480 nm, 485 nm, 491 nm, 496 nm, 500 nm, 510 nm, 515 nm, 519 nm, 520 nm, 563 nm, 570 nm, 578 nm, 602 nm, 612 nm, 650 nm, 661 nm, 667 nm, 668 nm, 678 nm, 695 nm, 702 nm, 711 nm, 719 nm, 737 nm, 785 nm, 786 nm, 805 nm를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 380 내지 400 nm, 410 내지 430 nm, 470 내지 490 nm, 490 내지 510 nm, 500 내지 520 nm, 560 내지 580 nm, 570 내지 595 nm, 590 내지 610 nm, 610 내지 650 nm, 640 내지 660 nm, 650 내지 700 nm, 700 내지 720 nm, 710 내지 750 nm, 740 내지 780 nm, 및 775 내지 795 nm로 이루어진 군으로부터 선택되는 범위의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 395 nm의 최대 방출을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 421 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 478 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 480 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 485 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 496 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 510 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 570 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 602 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 650 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 711 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 737 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 750 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 786 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 421 nm±5 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 510 nm±5 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 570 nm±5 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 602 nm±5 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 650 nm ± 5 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 711 nm±5 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 786 nm±5 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 421 nm, 510 nm, 570 nm, 602 nm, 650 nm, 711 nm 및 786 nm로 이루어진 군으로부터 선택되는 최대 방출 파장을 갖는다.
일부 구현예에서, 중합체성 염료는 1 x 106 cm-1M-1 이상, 예컨대 2 x 106 cm-1M-1 이상, 2.5 x 106 cm-1M-1 이상, 3 x 106 cm-1M-1 이상, 4 x 106 cm-1M-1 이상, 5 x 106 cm-1M-1 이상, 6 x 106 cm-1M-1 이상, 7 x 106 cm-1M-1 이상, 또는 8 x 106 cm-1M-1 이상의 흡광 계수를 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 0.05 이상, 예컨대 0.1 이상, 0.15 이상, 0.2 이상, 0.25 이상, 0.3 이상, 0.35 이상, 0.4 이상, 0.45 이상, 0.5 이상, 0.6 이상, 0.7 이상, 0.8 이상, 0.9 이상, 0.95 이상, 0.99 이상의 양자 수율을 갖고, 0.999 이상을 포함한다. 예를 들어, 관심 대상의 중합체성 염료의 양자 수율은 0.05 내지 1, 예컨대 0.1 내지 0.95, 예컨대 0.15 내지 0.9, 예컨대 0.2 내지 0.85, 예컨대 0.25 내지 0.75, 예컨대 0.3 내지 0.7의 범위일 수 있고, 0.4 내지 0.6의 양자 수율을 포함한다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 0.1 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 0.3 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 0.5 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 0.6 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 0.7 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 0.8 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 0.9 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 0.95 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 1 x 106 이상의 흡광 계수 및 0.3 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 2 x 106 이상의 흡광 계수 및 0.5 이상의 양자 수율을 갖는다.
일부 구현예에서, 표지는 효소, 효소 기질, 또는 이들의 조합을 포함한다. 효소는 상응하는 변형된 효소 기질로 효소 기질을 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 효소는 효소 위원회(EC) 1 산화환원효소(예를 들어, 탈수소화효소 또는 산화제); EC 2 전이 효소(예를 들어, 트랜스아미나제 또는 키나제); EC 3 가수분해 효소(예를 들어, 리파제, 아밀라제 또는 펩티다제); EC 4 리아제(예를 들어, 디카르복실라제); EC 5 이성화효소(예를 들어, 이성화효소 또는 뮤타제; 또는 EC 6 리가제(예를 들어, 신타제)일 수 있거나, 이들을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 효소는, 공여체의 CH-OH 기에 작용하는 EC 1.1 산화환원효소; 공여체의 알데히드 또는 옥소 기에 작용하는 EC 1.2 산화환원효소; 공여체의 CH-CH 기에 작용하는 EC 1.3 산화환원효소; 공여체의 CH-NH(2) 기에 작용하는 EC 1.4 산화환원효소; 공여체의 CH-NH 기에 작용하는 EC 1.5 산화환원효소; NADH 또는 NADPH에 작용하는 EC 1.6 산화환원효소; 공여체로서 기타 질소성 화합물에 작용하는 EC 1.7 산화환원효소; 공여체의 황 기에 작용하는 EC 1.8 산화환원효소; 공여체의 헴(heme) 기에 작용하는 EC 1.9 산화환원효소; 공여체로서 디페놀 및 관련 성분에 작용하는 EC 1.10 산화환원효소; 금속 이온을 산화시키는 EC 1.16 산화환원효소; CH 또는 CH(2) 기에 작용하는 EC 1.17 산화환원효소; 공여체로서 철-황 단백질에 작용하는 EC 1.18 산화환원효소; 공여체로서 환원된 플라보독신에 작용하는 EC 1.19 산화환원효소; 공여체에서 인 또는 비소에 작용하는 EC 1.20 산화환원효소; X-H + Y-H = 'X-Y' 반응을 촉매하는 EC 1.21 산화환원효소; 공여체에서 할로겐에 작용하는 EC 1.22 산화환원효소; 수용체(acceptor)로서 C-O-C 기를 환원시키는 EC 1.23 산화환원효소; 또는 기타 산화환원효소 EC 1.97일 수 있거나, 이들을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 효소는 기질을 이용하여 하나의 탄소 기를 전이시키는 EC 2.1 전이효소: DNA, RNA, 카테콜; 알데히드 또는 케톤 기를 전이시키는 EC 2.2 전이효소; EC 2.3 아실전이효소; EC 2.4 글리코실전이효소; 메틸 기 외에 알킬 또는 아릴 기를 전이시키는 EC 2.5 전이효소; 질소성 기를 전이시키는 EC 2.6 전이효소; 인-함유 기를 전이시키는 EC 2.7 전이효소; 황-함유 기를 전이시키는 EC 2.8 전이효소; 셀레늄-함유 기를 전이시키는 EC 2.9 전이효소; 또는 몰리브덴 함유 기 또는 텅스텐 함유 기를 전이시키는 EC 2.10 전이효소일 수 있거나, 이들을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 효소는 에스테르 결합에 작용하는 EC 3.1 가수분해 효소; EC 3.2 글리코실라제; 에테르 결합에 작용하는 EC 3.3 가수분해 효소; 펩티드 결합(펩티다제)에 작용하는 EC 3.4 가수분해 효소; 펩티드 결합 외에 탄소-질소 결합에 작용하는 EC 3.5 가수분해 효소; 산 무수물에 작용하는 EC 3.6 가수분해 효소; 탄소-탄소 결합에 작용하는 EC 3.7 가수분해 효소; 할라이드 결합에 작용하는 EC 3.8 가수분해 효소; 인-질소 결합에 작용하는 EC 3.9 가수분해 효소; 황-질소 결합에 작용하는 EC 3.10 가수분해 효소; 탄소-인 결합에 작용하는 EC 3.11 가수분해 효소; 황-황 결합에 작용하는 EC 3.12 가수분해 효소; 또는 탄소-황 결합에 작용하는 EC 3.13 가수분해 효소일 수 있거나, 이들을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 효소는 글리코실 가수분해 효소(바이오연료의 생산을 위해 식물 바이오매스를 분해하는 데 유용한 효소), 아미노전이효소(작은 유기 분자의 결합 및 운반에 관련된 단백질 또는 생물제조에 중요한 단백질), ATP-결합 카세트(ABC) 운반체 단백질의 용질 결합 단백질(생물적 환경정화에 잠재적인 영향을 미치는 토양 미생물의 대사에 관련된 단백질), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있거나, 이들을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 효소는 EC 4.1 탄소-탄소 리아제; EC 4.2 탄소-산소 리아제; EC 4.3 탄소-질소 리아제; EC 4.4 탄소-황 리아제; EC 4.5 탄소-할라이드 리아제; EC 4.6 인-산소 리아제; EC 4.7 탄소-인 리아제; 또는 EC 4.99 기타 리아제일 수 있거나, 이들을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 효소는 탄소-산소 결합을 형성하는 EC 6.1 리가제; 탄소-황 결합을 형성하는 EC 6.2 리가제; 탄소-질소 결합을 형성하는 EC 6.3 리가제; 탄소-탄소 결합을 형성하는 EC 6.4 리가제; 인산 에스테르 결합을 형성하는 EC 6.5 리가제; 또는 질소-금속 결합을 형성하는 EC 6.6 리가제일 수 있거나, 이들을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 효소 기질은 적어도 하나의 작용기에 의해 상응하는 변형된 효소 기질과 상응할 수 있다. 적어도 하나의 작용기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 페닐, 벤질, 할로, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 히드록실, 카르보닐, 알데히드, 할로포르밀, 카르보네이트 에스테르, 카르복실레이트, 카르복실, 에스테르, 메톡시, 히드로퍼옥시, 퍼옥시, 에테르, 헤미아세탈, 헤미케탈, 아세탈, 케탈, 아세탈, 오르토에스테르, 메틸렌디옥시, 오르토카르보네이트 에스테르, 카르복사미드, 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 4° 암모늄, 1차 케타민, 2차 케타민, 1차 알드이민, 2차 알드이민, 이미드, 아지드, 아조, 디이미드, 시아네이트, 이소시아네이트, 니트레이트, 니트릴, 이소니트릴, 니트로소옥시, 니트로, 니트로소, 피리딜, 설프히드릴, 설피드, 디설피드, 설피닐, 설포닐, 설피노, 설포, 티오시아네이트, 이소티오시아네이트, 카르보노티온, 카르보노티알, 포스피노, 포스포노, 포스페이트, 포스포디에스테르, 보로노, 보로네이트, 보리노, 보리네이트, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 효소는 메틸트랜스퍼라제, 글리코시드 히드롤라제, 아가라제, 아미니다제, 아밀라제, 바이오시다제, 카라기나제, 셀룰라제, 세라미다제, 키티나제, 키토사나제, 시트리나제, 덱스트라나제, 덱스트리나제, 프룩토시다제, 푸코이다나제, 푸코시다제, 푸라노시다제, 갈락토시다제, 갈락투로나제, 글루카나제, 글루코시다제, 글루쿠로니다제, 글루쿠로노시다제, 글리코히드롤라제, 글리코시다제, 헥사오시다제, 히드롤라제, 이두로니다제, 이노시다제, 이눌리나제, 락타제, 레바나제, 리케니나제, 리가제, 리아제, 리소자임, 말토시다제, 말토트리오시다제, 만노비오시다제, 만노시다제, 무라미다제, 옥툴로소나제, 옥툴로소니다제, 프리메베로시다제, 프로테아제, 풀룰라나제, 람노시다제, 사미니다제, 시알리다제, 신타제, 트랜스퍼라제, 트레할라제, 투로니다제, 투로노시다제, 자일라나제, 자일로시다제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 효소 기질은 6-메르캅토푸린, 셀로비오스, 셀로테트라오스, 자일로테트라오스, 이소프리메베로스, β-D-젠티오비오스, 자일로글루칸 및 만노트리오스, 아가로스, 아미닉산, 전분, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 셀룰로스, 세라마이드, 키틴, 키토산, 덱스트로스, 덱스트린, 프룩토스, 푸코이단, 푸코스, 푸라노시드, 갈락토시드, 글루칸, 글루코피라노시드, 글루코시드, 글루쿠론산, 글루쿠로노시드, 글리코스, 글리코시드, 글리코사미노글리칸, 헥사오시드, 이눌린, 락토스, 레바노스, 리포폴리사카라이드, 만노스, 말토시드, 말토트리오시드, 만노스, 옥툴로소네이트, 올리고사카라이드, 펙테이트, 펙틴, 펩티드, 폴리갈락투로니드, 폴리뉴클레오티드, 풀룰란, 람노시드, 자일란, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 표지 요청은 효소 요청 및 기질 요청을 포함할 수 있다.
표지된 생체분자 시약은 활성화된 생체분자를 활성화된 표지에 커플링함으로써 제조된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "활성화된"은 적절한 조건 하에서 실시되는 경우, 제2 반응성 링커 또는 제2 반응성 모이어티와 반응하여, 예를 들어, 이온결합(전하-전하 상호작용), 비-공유결합(예를 들어, 쌍극자-쌍극자 또는 전하-쌍극자) 또는 공유결합과 같은 화학적 결합을 형성하는 반응성 링커 또는 반응성 모이어티를 갖는 생체분자 또는 표지를 지칭한다. 일부 구현예에서, 활성화된 생체분자의 반응성 링커 또는 모이어티는 활성화된 표지의 반응성 링커 또는 모이어티와 반응하여 이온결합을 생성한다. 다른 구현예에서, 활성화된 생체분자의 반응성 링커 또는 모이어티는 활성화된 표지의 반응성 링커 또는 모이어티와 반응하여 비-공유결합을 생성한다. 또 다른 구현예에서, 활성화된 생체분자의 반응성 링커 또는 모이어티는 활성화된 표지의 반응성 링커 또는 모이어티와 반응하여 공유결합을 생성한다.
일부 구현예에서, 활성화된 생체분자의 반응성 링커 또는 모이어티는 활성화된 표지의 반응성 링커 또는 모이어티와 반응하여 공유결합을 생성한다. 활성화된 생체분자의 반응성 링커와 활성화된 표지의 반응성 링커 사이의 공유결합을 형성하기 위한 임의의 편리한 프로토콜이 사용될 수 있으며, 이는 결합 형성 반응의 기타 유형 중 특히, 첨가 반응, 제거 반응, 치환 반응, 페리시클릭(pericyclic) 반응, 광화학 반응, 산화환원 반응, 라디칼 반응, 카르벤 중간체를 통한 반응, 전이 반응을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 활성화된 생체분자는 반응성 연결 화학을 통해 활성화된 표지에 컨쥬게이트될 수 있으며, 예컨대 반응성 링커 쌍은: 말레이미드/티올; 티올/티올; 피리딜디티올/티올; 석시니미딜 요오도아세테이트/티올; N-석시니미딜에스테르(NHS 에스테르), 설포디클로로페놀 에스테르(SDP 에스테르), 또는 펜타플루오로페닐-에스테르(PFP 에스테르)/아민; 비스석시니미딜에스테르/아민; 이미도에스테르/아민; 히드라진 또는 아민/알데히드, 디알데히드 또는 벤즈알데히드; 이소시아네이트/히드록실 또는 아민; 탄수화물-페리오데이트/히드라진 또는 아민; 디아지린/아릴 아지드 화학; 피리딜디티올/아릴 아지드 화학; 알킨/아지드; 카르복시-카르보디이미드/아민; 아민/설포-SMCC(설포석시니미딜 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트)/티올 및 아민/BMPH(N-[β-말레이미도프로피온산]히드라지드.TFA)/티올; 아지드/트리아릴포스핀; 니트론/시클로옥틴; 아지드/테트라진 및 포르밀벤즈아미드/히드라지노-니코틴아미드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 활성화된 생체분자의 반응성 링커 및 활성화된 표지의 반응성 링커는 고리화 첨가 반응(cycloaddition reaction), 예컨대 [1+2]-고리화 첨가, [2+2]-고리화 첨가, [3+2]-고리화 첨가, [2+4]-고리화 첨가, [4+6]-고리화 첨가, 또는 켈레트로피 반응을 겪으며, 이는 1,3-쌍극자성 고리화 첨가(예를 들어, 아지드-알킨 휘스겐(Huisgen) 고리화 첨가), 딜스-알더(Diels-Alder) 반응, 역 전자 요구 딜스 알더 고리화 첨가, 엔(ene) 반응 또는 [2+2] 광화학 고리화 첨가 반응을 겪는 링커를 포함한다.
일부 구현예에서, 생체분자 요청 및 표지 요청은 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지의 반응성 링커에 관한 정보 또는 데이터를 포함한다. 예를 들어, 생체분자 요청 및 표지 요청은 반응성 링커명, 화학 구조, 반응성 링커의 구조 설명 또는 반응성 링커 CAS 번호에 관한 정보 또는 데이터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 생체분자 요청 및 표지 요청은 반응성 링커 쌍의 이름을 포함하며, 예컨대 여기서 반응성 링커 쌍은 말레이미드/티올; 티올/티올; 피리딜디티올/티올; 석시니미딜 요오도아세테이트/티올; N-석시니미딜에스테르(NHS 에스테르), 설포디클로로페놀 에스테르(SDP 에스테르), 또는 펜타플루오로페닐-에스테르(PFP 에스테르)/아민; 비스석시니미딜에스테르/아민; 이미도에스테르/아민; 히드라진 또는 아민/알데히드, 디알데히드 또는 벤즈알데히드; 이소시아네이트/히드록실 또는 아민; 탄수화물-페리오데이트/히드라진 또는 아민; 디아지린/아릴 아지드 화학; 피리딜디티올/아릴 아지드 화학; 알킨/아지드; 카르복시-카르보디이미드/아민; 아민/설포-SMCC(설포석시니미딜 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트)/티올 및 아민/BMPH(N-[β-말레이미도프로피온산]히드라지드.TFA)/티올; 아지드/트리아릴포스핀; 니트론/시클로옥틴; 아지드/테트라진 및 포르밀벤즈아미드/히드라지노-니코틴아미드; 디엔/친디엔체; 및 1,3-쌍극자/친쌍극자체로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 표지 요청은 효소 요청 및 기질 요청을 포함한다. 효소 요청은 효소명, 폴리펩티드 서열, 효소의 부류, EC 번호, 폴리펩티드 컨센서스 서열, 보존 도메인명 및/또는 서열 또는 복수의 관련 단백질들(예를 들어, 동일한 단백질 군에 속하는 단백질), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 기질 요청은 기질명, 기질의 작용기, 기질의 부류, 특정 EC 번호를 갖는 하나 이상의 효소에 대한 하나 이상의 기질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
입력 관리자는 표지된 생체분자에 대한 요청을 수신하도록 구성된다. 표지된 생체분자 시약 요청을 수신하기 위하여, 입력 관리자는 하나 이상의 표지된 생체분자 시약 요청이 입력되는 그래픽 사용자 인터페이스에 작동적으로 커플링된다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약 요청은 인터넷 또는 근거리통신망을 통해 (예를 들어, 원격 위치에서) 인터넷 웹사이트 메뉴 인터페이스 상에 입력되고 입력 관리자에 통신된다. 일부 구현예에서, 입력 관리자는 복수의 표지된 생체분자 시약 요청들을 수신하도록 구성된다. 예를 들어, 입력 관리자는 2 개 이상의 표지된 생체분자 시약 요청, 예컨대 5 개 이상, 예컨대 10 개 이상을 수신하도록 구성될 수 있고, 이는 25 개 이상의 표지된 생체분자 시약 요청을 포함한다.
표지된 생체분자 시약에 대한 요청이 단일 구성요소만을 포함하고, 표지된 생체분자 요청인 경우, 입력 관리자는 2 개 이상의 표지된 생체분자 요청, 예컨대 5 개 이상, 예컨대 10 개 이상을 수신하도록 구성될 수 있고, 이는 25 개 이상의 표지된 생체분자 요청을 포함한다. 표지된 생체분자 시약 요청이 2 개의 구성요소, 예컨대 생체분자 요청 및 표지 요청을 포함하는 경우, 입력 관리자는 2 개 이상의 생체분자 요청, 예컨대 5 개 이상, 예컨대 10 개 이상, 및 25 개 이상을 포함하는 생체분자 요청을 수신하도록 구성될 수 있고, 2 개 이상의 표지 요청, 예컨대 5 개 이상, 예컨대 10 개 이상, 및 25 개 이상을 포함하는 표지 요청을 수신하도록 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 입력 관리자는 단일 생체분자 요청 및 단일 표지 요청을 포함하는 표지된 생체분자 시약 요청을 수신하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 입력 관리자는 단일 생체분자 요청 및 복수의 상이한 표지 요청들을 포함하는 표지된 생체분자 시약 요청을 수신하도록 구성된다. 또 다른 일부 구현예에서, 입력 관리자는 복수의 상이한 생체분자 요청들 및 단일 표지 요청을 포함하는 표지된 생체분자 시약 요청을 수신하도록 구성된다. 또 다른 일부 구현예에서, 입력 관리자는 복수의 상이한 생체분자 요청들 및 복수의 상이한 표지 요청들을 포함하는 표지된 생체분자 시약 요청을 수신하도록 구성된다. 입력 관리자는 단일 사용자, 또는 복수의 상이한 사용자들, 예컨대 2 이상의 상이한 사용자, 예컨대 5 이상의 상이한 사용자, 예컨대 10 이상의 상이한 사용자, 예컨대 25 이상의 상이한 사용자 및 100 이상의 상이한 사용자를 포함하는 사용자들로부터, 표지된 생체분자 요청을 수신하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 표지 요청은 효소 요청 및 기질 요청을 포함한다.
구현예에서, 입력 관리자는 또한 요청된 표지된 생체분자 시약의 바람직한 양에 상응하는 분량 요청을 수신하도록 구성된다. 분량 요청은 수 및 단위(예를 들어, μg, μ몰, μM 등) 값을 문자열 상자에 타이핑하거나, 적절한 수 및 단위 값에 상응하는 체크박스를 선택하거나, 제1 드롭-다운(drop-down) 메뉴에서 수치 값 및 제2 드롭-다운 메뉴에서 단위 값을 선택함으로써 입력될 수 있다.
일부 구현예에서, 입력 관리자는 표지된 생체분자, 활성화된 생체분자, 생체분자, 활성화된 표지, 표지 및 반응성 링커의 하나 이상의 검색가능한 데이터베이스(예를 들어, 카달로그)에 작동적으로 커플링된다. 일부 구현예에서, 입력 관리자는 표지된 생체분자의 데이터베이스를 포함한다. 일부 구현예에서, 입력 관리자는 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지의 데이터베이스를 포함한다. 또 다른 일부 구현예에서, 입력 관리자는 생체분자, 표지 및 반응성 링커의 데이터베이스를 포함한다.
표지된 생체분자, 활성화된 생체분자, 생체분자, 활성화된 표지, 표지 및 반응성 링커 각각의 데이터베이스의 전부 또는 일부는 그래픽 사용자 인터페이스, 예컨대 리스트, 드롭-다운 메뉴 또는 기타 구성(예를 들어, 타일) 상에 디스플레이될 수 있다. 예를 들어, 그래픽 사용자 인터페이스는 각각의 표지된 생체분자, 활성화된 생체분자, 생체분자, 활성화된 표지, 표지 및 반응성 링커의 리스트를 동시에(즉, 단일 스크린 상에) 디스플레이할 수 있거나, 표지된 생체분자 시약 요청의 각각의 구성요소에 대한 드롭-다운 메뉴를 함유할 수 있다. 다른 구현예에서, 표지된 생체분자 시약 요청은 적절한 문자 필드 내로 정보를 입력하거나, 체크 박스를 선택하거나, 드롭-다운 메뉴로부터 하나 이상의 아이템을 선택하거나, 이들의 조합을 이용함으로써 제공된다.
일 예에서, 그래픽 사용자 인터페이스는 드롭-다운 메뉴에서 하나 이상의 표지된 생체분자를 선택함으로써, 표지된 생체분자 시약 요청을 입력하기 위한 드롭-다운 메뉴를 포함한다. 또 다른 예에서, 그래픽 사용자 인터페이스는, 제1 드롭-다운 메뉴 및 제2 다롭-다운 메뉴에서 하나 이상의 생체분자 및 하나 이상의 표지를 선택함으로써 하나 이상의 생체분자 및 하나 이상의 표지를 선택함으로써, 생체분자 요청을 입력하기 위한 제1 드롭-다운 메뉴 및 표지 요청을 입력하기 위한 제2 드롭-다운 메뉴를 포함한다. 또 다른 예에서, 그래픽 사용자 인터페이스는, 드롭-다운 메뉴에서 하나 이상의 생체분자, 하나 이상의 표지 및 하나 이상의 반응성 링커를 선택함으로써, 생체분자 요청을 입력하기 위한 제1 드롭-다운 메뉴, 표지 요청을 입력하기 위한 제2 드롭-다운 메뉴 및 반응성 링커 요청을 입력하기 위한 제3 드롭-다운 메뉴를 포함한다.
또 다른 예에서, 그래픽 사용자 인터페이스는 제1 드롭-다운 메뉴 및 제2 드롭-다운 메뉴에서 하나 이상의 활성화된 생체분자 및 하나 이상의 활성화된 링커를 선택함으로써, 활성화된 생체분자 요청을 입력하기 위한 제1 드롭 다운 메뉴 및 활성화된 표지 요청을 입력하기 위한 제2 드롭-다운 메뉴를 포함한다. 일부 구현예에서, 표지 요청은 효소 요청 및 기질 요청을 포함한다. 그래픽 사용자 인터페이스는 활성화된 생체분자 요청을 입력하기 위한 제1 드롭 다운 메뉴, 활성화된 효소 요청을 입력하기 위한 제2 드롭-다운 메뉴, 및 효소 기질을 입력하기 위한 제3 드롭-다운 메뉴를 포함할 수 있다. 그래픽 사용자 인터페이스는 활성화된 생체분자 요청을 입력하기 위한 제1 드롭 다운 메뉴, 활성화된 기질을 입력하기 위한 제2 드롭-다운 메뉴, 및 효소를 입력하기 위한 제3 드롭-다운 메뉴를 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 그래픽 사용자 인터페이스는 데이터베이스에서 이용가능한 표지된 생체분자, 활성화된 생체분자, 생체분자, 활성화된 표지, 표지 및 반응성 링커의 리스트를 포함한다. 예를 들어, 그래픽 사용자 인터페이스는 각각의 표지된 생체분자, 활성화된 생체분자, 생체분자, 활성화된 표지, 표지 및 반응성 링커의 리스트를 하나 이상의 스크린에 동시에 디스플레이할 수 있거나, 표지된 생체분자 시약 요청의 각각의 구성요소에 대한 드롭-다운 메뉴를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 모든 이용가능한 표지된 생체분자, 활성화된 생체분자, 생체분자, 활성화된 표지, 표지 및 반응성 링커의 리스트가 단일 페이지 상에 디스플레이된다. 일부 구현예에서, 모든 이용가능한 표지된 생체분자, 활성화된 생체분자, 생체분자, 활성화된 표지, 표지 및 반응성 링커의 리스트는 복수의 페이지들, 예컨대 2 이상의 페이지, 예컨대 3 이상의 페이지, 예컨대 5 이상의 페이지, 예컨대 10 이상의 페이지 및 25 이상을 포함하는 페이지들 상에 디스플레이된다. 다른 구현예에서, 모든 이용가능한 표지된 생체분자, 활성화된 생체분자, 생체분자, 활성화된 표지, 표지 및 반응성 링커의 리스트는 단일 페이지 상의 별개의 드롭-다운 메뉴에서 각각 디스플레이된다.
도 15는 일부 구현예에 따른 표지된 생체분자 시약에 대한 요청을 통신하기 위한 그래픽 사용자 인터페이스를 나타낸다. 표지된 생체분자 시약 요청을 통신하기 위하여, 사용자는 요청 폼(1500) 상에 생체분자 요청 및 표지 요청을 입력한다. 표지 요청은 드롭 다운 메뉴(1501a)에서 검출가능한 마커(예를 들어, 형광단)을 선택함으로써 입력되고, 생체분자 요청은 드롭 다운 메뉴(1501b)에서 생체분자(예를 들어, 항체 프로브)를 선택함으로써 입력된다. 요청 폼(1500)은 또한 마이크로그램 단위의 표지된 생체분자 시약의 바람직한 양에 상응하는 분량 요청(1502)을 입력하기 위한 문자열 상자를 포함한다. 일부 구현예에서, 표지 요청은 효소 요청 및 기질 요청을 포함한다.
일부 구현예에서, 생체분자는 폴리펩티드, 핵산, 폴리사카라이드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 핵산은 올리고뉴클레오티드, DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리펩티드는 단백질, 효소 또는 단백질 결합 시약일 수 있다. 단백질 결합 시약은 항체, 압타머, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 표지와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 복수의 단백질 표적들은 예를 들어, 10 내지 400 개의 상이한 단백질 표적을 포함할 수 있다. 생체분자는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 생체분자로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 생체분자용 고유 식별자를 포함한다. 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택될 수 있다. 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 10, 100, 또는 1,000 개의 상이한 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)로부터 선택된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 생체분자에 컨쥬게이트된다. 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 생체분자에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
고유 식별자는 샘플의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 샘플은 단일 세포, 복수의 세포들, 조직, 종양 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 샘플은 포유동물 샘플, 세균 샘플, 바이러스 샘플, 효모 샘플, 균류 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 폴리(A) 테일, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 입력 관리자는 표지된 생체분자 시약 요청을 검색하거나, 추가하거나 변형하고, 사용자 질의(예를 들어, 인터넷 또는 근거리통신망을 통해 근처 위치에서 또는 원격 위치에서 그래픽 사용자 인터페이스 내로 입력됨)에 응답하기 위한 검색 엔진을 포함한다. 일부 구현예에서, 시스템 메모리에서 각각의 영속 대상은 시스템 데이터베이스 내에 관련 테이블을 갖고 대상 속성은 테이블 열에 매핑된다. 추가의 양태에서, 각각의 대상은 그 대상을 데이터베이스 내 테이블에 결합하는 대상 관련 매핑 파일을 갖는다.
대상은 또한 서로 연결되며, 이러한 연결은 테이블들 간의 관계로서 매핑된다. 대상은 또한 1 대 1, 1 대 다수, 다수 대 1 및 다수 대 다수와 같은 많은 상이한 관계에 의해 서로 연결된다. 사용자 질의에 제공되는 검색 기준은 대상과 연관된 속성 또는 특성에 대한 설명, 또는 그러한 속성에 상응하는 값을 포함할 수 있다.
관계는 또한 검색 기준으로 사용될 수 있다. 기본 검색 기준은 대상의 속성에 따라 달라질 수 있으며, 고급 검색 기준은 예를 들어, 관련 대상의 특성을 검색함으로써, 대상과 다른 대상의 연관에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 대상의 검색 엔진은, 복수의 검색가능한 조건들(예를 들어, 모든 가능한 질의가능 조건)을 구축할 파인더(finder) 프레임워크를 포함한다. 사용자가 검색할 엔티티(entity) 또는 대상을 지정하면, 프레임워크는 그 대상을 위한 모든 가능한 검색 조건을 생성한 다음, 사용자가 선택한 조건에 따른 결과를 제공한다.
검색 엔진을 이용하여, 시스템 사용자는 이용가능한 표지된 생체분자, 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 및 반응성 링커를 검색할 수 있다. 검색 엔진은 또한 계류 중인 또는 완료된 표지된 생체분자 시약 요청을 검색하기 위해 구성된다. 추가적으로, 사용자는 검색 엔진을 이용하여, 관심 대상이 될 수 있는 표지된 생체분자, 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 및 반응성 링커를 질의하고 찾을 수 있다. 예를 들어, 사용자는 특정 항원 프로브로서 작용하는 특정 생체분자 또는 미리 결정된 파장의 광의 형광에 의해 검출가능한 표지를 검색할 수 있다. 검색 조건은 상이한 대상에 대해 상이할 수 있고, 일례로, 일반적인 파인더 프레임워크는 그러한 검색을 위한 일반적인 해법을 제공한다.
일부 구현예에서, 검색 엔진은 표지된 생체분자, 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 또는 반응성 링커를 식별하는 데 사용되는 질의를 구축하고/하거나, 질의를 저장하고/하거나, 질의를 수정하고/하거나, 질의를 업데이트할 수 있다. 일부 구현예에서, 검색 결과는 공유되거나, 비교되거나 수정될 수 있다. 일부 구현예에서, 시스템은 검색 기준에 맞는 검색 결과의 최대값을 설정하여 그래픽 사용자 인터페이스에 디스플레이되도록 구성된다. 일부 구현예에서, 검색 결과는 가능한 동작을 허용하는 기능을 포함하는 웹 페이지 상에 디스플레이된다. 그러한 기능은, 링크, 버튼, 드롭 다운 메뉴, 사용자로부터의 정보를 수신하기 위한 필드 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 시스템은 (예를 들어, 웹 페이지와 같은 적절한 사용자 인터페이스를 구축하기 위해, 동작(예를 들어, "삭제", "편집" 등)을 이미지, 텍스트, 하이퍼링크 및/또는 기타 디스플레이와 연결하기 위한 방법을 제공하는 링크를 지정하기 위해) 검색 결과 포맷하기 위한 결과 포매터(formatter)를 추가로 포함한다.
시스템은 또한 검색 중인 대상에 대한 검색 기준을 웹 페이지 상에 디스플레이할 수 있다. 일 양태에서, 시스템은 파인더 프레임워크로부터의 입력 데이터를 취하여, 그 대상에 대한 검색 기준을 동적으로 보여주는 웹 페이지를 생성한다. 또 다른 양태에서, 파인더 프레임워크는 검색 중인 대상에 대한 모든 가능한 질의가능 조건을 생성한다. 이들 조건은 상이한 필드로 검색 웹 페이지에 디스플레이된다. 사용자는 이들 필드(들)를 선택하거나 이들에 대한 값(들)을 지정할 수 있고, 검색을 실행할 수 있다. 디스플레이될 필드는 그의 표지를 국한된 형태로 갖는다. 필드는 "선택" 박스, 또는 텍스트 박스 또는 문자 입력을 위한 다른 영역의 형태일 수 있다. 예를 들어, 사용자는 생체분자에 대해 검색하고자 할 수 있다. 검색가능한 데이터베이스에서 생체분자는 질의가능 조건, 예컨대 화합물명 또는 서열번호(예를 들어, 접수 번호)를 포함한다.
일 구현예에서, 검색 엔진은 데이터베이스에서 각각의 표지된 생체분자, 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 및 반응성 링커에 대한 검색을 지원한다. 일부 구현예에서, 시스템은 검색 중인 대상에 대한 모든 질의가능 조건을 생성하기 위해 일반적인 파인더 프레임워크를 제공한다. 그러한 조건은 일반적으로 대상의 특성 및 그의 다른 대상과의 관계(들)에 의존할 것이다. 다른 구현예에서, 파인더 프레임워크는 이들 조건 및 그의 순서에 대한 국한된 필드명을 검색하고 시스템 메모리(예를 들어, objectdefinition.xml 파일 내에)에 이들을 저장한다. 일 예에서, 필드는, 사용자가 값을 선택하거나 입력할 수 있는 검색 파라미터의 세트로서 파일에 저장된 순서로 검색 페이지 상에 디스플레이된다. 검색 파라미터는 대상의 목록 형태일 수 있으며, 파라미터는 속성 카테고리에 관련될 수 있다. 예를 들어, 표지된 생체분자를 검색하는 사용자에 반응하여, 시스템은 다음 질의가능 조건을 디스플레이할 수 있다: "표지된 생체분자명", "검색에 사용된 키워드", "제조자", "수정자", "수정 일자", "주석" 등. 파인더 프레임워크는 질의가능 조건을 컬렉션의 형태로 회신할 수 있으며, 이는 속성 카테고리에 해당하는 다양한 검색 필드를 국한된 형태로 열거하거나 나타내는 검색 페이지 상에 디스플레이될 수 있다. 사용자는 이들 필드에 대한 값을 입력할 수 있으며, 예를 들어, 특정 이름, 구조, 등록 번호 등을 갖는 표지된 생체분자, 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 및 반응성 링커 중 하나 이상을 선택하고, 특정 키워드를 제공하고, 원하는 도메인, 생성자, 수정 일자, 주석을 식별하는 것 등을 수행할 수 있다. 그러면 시스템은 검색 조건을 충족시키는 표지된 생체분자, 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 또는 반응성 링커의 리스트를 디스플레이한다. 일부 구현예에서, 시스템은 검색을 수행하는 데 사용되는 기준에 관한 정보를 디스플레이한다.
일부 구현예에서, 입력 관리자는 하나 이상의 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 또는 반응성 링커를 선택하기 위한 추천을 제공하도록 구성되는 표지된 생체분자 설계 플랫폼을 포함한다. 일부 구현예에서, 설계 플랫폼은, 원하는 표지된 생체분자의 하나 이상의 파라미터의 사용자 입력을 기준으로 하나 이상의 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 또는 반응성 링커를 선택하기 위한 추천을 제공하도록 구성된다. 예를 들어, 사용자가 설계 플랫폼으로 입력할 수 있는 원하는 표지된 생체분자의 파라미터는, 표지된 생체분자의 원하는 물성(예를 들어, 분자 질량, 융점, 순도 등); 표지된 생체분자의 원하는 화학적 특성(예를 들어, 화학적 구조, 제2 표지된 생체분자에 대한 구조적 유사성, 이온화력, 용매화, 가수분해, 화학 반응성, 효소 반응성, 결합 친화도 등); 분광학적 특성(예를 들어, 흡광도 파장 범위, 최대 흡광도, 방출 파장 범위, 최대 방출 스토크스 시프트, 양자 수율, 몰 흡광 계수 등)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 설계 플랫폼은 표지된 생체분자의 적용을 기준으로, 하나 이상의 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 또는 반응성 링커의 선택에 대한 추천을 제공하도록 구성된다. 예를 들어, 설계 플랫폼은 사용될 기기(예를 들어, 유세포분석기, 형광 분광계 등), 기기 구성, 및 실험 파라미터(예를 들어, 세포 상에서의 항원 밀도와 같은 표적 풍부도)를 기준으로, 표지된 생체분자의 각각의 구성요소의 선택에 대한 추천을 제공하도록 구성될 수 있다. 사용자 그래픽 인터페이스는 하나 이상의 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 또는 반응성 링커의 선택에 대한 추천을 제공하기 위해, 설계 플랫폼에 의해 사용된 데이터를 입력하기 위한 하나 이상의 텍스트 입력 필드 또는 드롭-다운 메뉴를 포함할 수 있다.
표지된 생체분자 설계 플랫폼은 사용자에 의해 입력된 정보(예를 들어, 표지된 생체분자의 특성 또는 표지된 생체분자의 예측된 적용)를 기준으로, 복수의 상이한 생체분자들, 활성화된 생체분자들, 표지들, 활성화된 표지들 또는 반응성 링커들에 대한 추천을 제공하도록 구성될 수 있다.
예를 들어, 설계 플랫폼은 사용자에 의해 입력된 정보를 기준으로, 2 개 이상의 상이한 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 또는 반응성 링커, 예컨대 3 개 이상, 예컨대 4 개 이상, 예컨대 5 개 이상, 예컨대 10 개 이상 및 25 개 이상을 포함하는 상이한 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 또는 반응성 링커를 추천하도록 구성될 수 있다.
일부 구현예에서, 표지된 생체분자 설계 플랫폼은, 특정 적용(예를 들어, 유세포분석기의 구성)에 최적화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 또는 반응성 링커의 조합에 관해 추천을 제공하도록 구성된다. 예를 들어, 설계 플랫폼은 사용자가 하나 이상의 생체분자 및 하나 이상의 표지의 리스트뿐만 아니라, 적용 정보(예를 들어, 기기 구성, 표적 풍부도 등)를 입력하고, 설계 플랫폼이 언급된 적용에 최적화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 및 반응성 링커의 추천 조합을 출력하도록 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자, 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 또는 반응성 링커에 대한 추천이 디스플레이(예를 들어, 전자 디스플레이) 상에 디스플레이되거나, 프린터로, 예컨대 인간(종이) 판독가능 매체로 또는 기계 판독가능 포맷(예를 들어, 바코드로서)으로 프린트될 수 있다. 다른 구현예에서, 표지된 생체분자, 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 또는 반응성 링커에 대한 추천은 입력 관리자로 통신될 수 있고, 추천된 표지된 생체분자는 상기 설명된 것과 같이 제조될 수 있다.
본 개시 내용의 시스템은 또한 표지 생체분자 시약 요청의 구성요소에 상응하는 복수의 저장 식별자들을 갖는 데이터세트를 저장하기 위한 메모리를 포함한다. 용어 "메모리"는 프로세서에 의한 순차적인 검색을 위한 정보를 저장하고, 자석 또는 광학 디바이스(예컨대, 하드 디스크, 플로피 디스크, CD 또는 DVD), 또는 반도체 메모리 디바이스(예컨대, 휘발성 또는 비휘발성 RAM)를 포함할 수 있는 디바이스를 지칭하는 통상의 의미로 본 명세서에서 사용된다. 메모리 또는 메모리 단위는 동일하거나 상이한 유형의 하나 초과의 물리적 메모리 디바이스를 가질 수 있다(예를 들어, 메모리는 다중 메모리 디바이스, 예컨대 다중 하드 드라이브 또는 다중 반도체 메모리 디바이스, 또는 하드 드라이브와 반도체 메모리 디바이스의 일부 조합을 가질 수 있음). 메모리는 컴퓨터 판독가능 매체 또는 영구 메모리일 수 있다. 구현예에서, 메모리는 시스템 데이터베이스에서 각각의 표지된 생체분자, 생체분자, 표지, 활성화된 생체분자, 활성화된 표지 및 반응성 링커에 상응하는 복수의 저장 식별자들을 갖는 하나 이상의 데이터세트를 포함할 수 있다.
메모리에 저장된 데이터세트는 각각의 표지된 생체분자, 생체분자, 표지, 활성화된 생체분자, 활성화된 표지 또는 반응성 링커에 상응하는 저장 식별자를 포함한다. 저장 식별자는 특정 표지된 생체분자, 생체분자, 표지, 활성화된 생체분자, 활성화된 표지 또는 링커와 연관된 일련의 하나 이상의 기호(예를 들어, 문자숫자 기호), 부호, 이미지 또는 기타 그래픽적 표현(들)로서 데이터세트에 제시될 수 있다. 일부 구현예에서, 저장 식별자는 표지된 생체분자, 생체분자, 표지, 활성화된 생체분자, 활성화된 표지 또는 링커의 약기된 명칭이다. 예를 들어, 저장 식별자는 접수 번호, 서열 식별 번호, 식별가능한 프로브 서열, CAS 등록 번호에 대한 참조를 포함할 수 있거나, 주문자 식별 코드일 수 있다.
메모리에 저장된 각각의 데이터세트에서 저장 식별자의 수는 저장 식별자의 유형에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 복수의 표지된 생체분자 저장 식별자들을 갖는 메모리에 저장되는 데이터세트는 10 개 이상의 표지된 생체분자 저장 식별자, 예컨대 25 개 이상, 예컨대 50 개 이상, 예컨대 100 개 이상의 식별자, 예컨대 250 개 이상, 예컨대 500 개 이상 및 1000 개 이상을 포함하는 표지된 생체분자 저장 식별자를 포함할 수 있다. 복수의 생체분자들 또는 활성화된 생체분자들을 갖는 메모리에 저장되는 데이터세트는 25 개 이상의 생체분자 또는 활성화된 생체분자 저장 식별자, 예컨대 50 개 이상, 예컨대 100 개 이상, 예컨대 250 개 이상, 예컨대 500 개 이상, 및 1000 개 이상을 포함하는 생체분자 또는 활성화된 생체분자 저장 식별자를 포함할 수 있다. 복수의 표지들 또는 활성화된 표지들을 갖는 메모리에 저장된 데이터세트는 5 개 이상의 표지 또는 활성화된 표지 저장 식별자, 예컨대 10 개 이상, 예컨대 15 개 이상, 예컨대 25 개 이상 및 50 개 이상을 포함하는 표지 또는 활성화된 표지 저장 식별자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 반응성 링커들을 갖는 메모리에 저장된 데이터세트는 2 개 이상의 반응성 링커 저장 식별자, 예컨대 3 개 이상, 예컨대 5 개 이상, 예컨대 10 개 이상 및 15 개 이상을 포함하는 반응성 링커 저장 식별자를 포함할 수 있다.
메모리는 입력 관리자에 의해 수신된 요청에 상응하는 데이터세트로부터 하나 이상의 저장 식별자를 식별하는 프로세싱 모듈과 작동적으로 통신한다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약에 대한 요청은 표지된 생체분자 요청이고, 프로세싱 모듈은 복수의 표지된 생체분자 저장 식별자들을 갖는 메모리의 데이터세트로부터 표지된 생체분자 저장 식별자를 식별한다. 다른 구현예에서, 표지된 생체분자 시약에 대한 요청은 생체분자 요청 및 표지 요청을 포함하고, 프로세싱 모듈은: 1) 복수의 생체분자 저장 식별자들을 갖는 메모리 내 제1 데이터세트로부터의 생체분자 저장 식별자; 및 2) 복수의 표지 저장 식별자들을 갖는 메모리 내 제2 데이터세트로부터의 표지 저장 식별자를 식별한다. 또 다른 구현예에서, 표지된 생체분자 시약에 대한 요청은 생체분자 요청, 표지 요청 및 반응성 링커 요청을 포함하고, 프로세싱 모듈은: 1) 복수의 생체분자 저장 식별자들을 갖는 메모리 내 제1 데이터세트로부터의 생체분자 저장 식별자; 2) 복수의 표지 저장 식별자들을 갖는 메모리 내 제2 데이터 세트로부터 표지 저장 식별자; 및 3) 복수의 반응성 링커 저장 식별자들을 갖는 메모리 내 제3 데이터세트로부터의 반응성 링커 저장 식별자를 식별한다. 일부 구현예에서, 표지 요청은 효소 요청 및 기질 요청을 포함한다.
표지된 생체분자 요청, 생체분자 요청, 표지 요청, 활성화된 생체분자 요청, 활성화된 표지 요청 또는 반응성 링커 요청에 상응하는 특정 저장 식별자가 입수가능하지 않은 경우(즉, 메모리 내 임의의 데이터세트로부터의 프로세싱 모듈에 의해 식별될 수 없음), 메모리는 대안적인 표지된 생체분자, 생체분자, 표지, 활성화된 생체분자, 활성화된 표지 또는 반응성 링커에 대한 추천을 제공하기 위한 알고리즘을 포함할 수 있다. 요청된 표지된 생체분자, 생체분자, 표지, 활성화된 생체분자, 활성화된 표지 또는 반응성 링커에 대한 추천은 화학적 구조, 반응성, 프로브 표적, 결합 친화도, 표적 풍부도, 표적 밀도, 표지 혼선, 크기, 값 등에서의 유사성을 기준으로 할 수 있다. 메모리는 요청된 구성요소, 및 이용가능한 표지된 생체분자, 생체분자, 표지, 활성화된 생체분자, 활성화된 표지 또는 반응성 링커 사이의 유사성에 따라, 하나 이상의 대안들, 예컨대 2 이상의 대안, 예컨대 3 이상의 대안 및 5 이상을 포함하는 대안에 대한 추천을 제공하도록 구성될 수 있다.
프로세싱 모듈은 구매가능한 프로세서, 예컨대 Intel Corporation의 프로세서, Sun Microsystems의 SPARC® 프로세서를 포함할 수 있거나, 입수가능하거나 입수가능하게 될 기타 프로세서들 중 하나일 수 있다.
프로세서는 운영 체제를 실행하며, 이는 예를 들어, Microsoft Corporation의 WINDOWS®-형 운영 체제; Unix® 또는 Linux-형 운영 체제 또는 미래의 운영 체제; 또는 이들의 일부 조합일 수 있다. 운영 체제는 잘 알려진 방식으로 펌웨어 및 하드웨어와 인터페이스와 접속하여, 프로세서가 다양한 프로그래밍 언어, 예컨대 Java, Perl, C++, 기타 고수준 또는 저수준 언어, 및 이들의 조합으로 기록될 수 있는 다양한 컴퓨터 프로그램의 기능을 조정하고 실행하는 것을 용이하게 하며, 이는 당 기술분야에 알려진 바와 같다. 운영 체제는 통상적으로 프로세서와 협력하여, 컴퓨터의 다른 구성요소의 기능을 조정하고 실행한다. 운영 체제는 또한 일정관리, 입력-출력 제어, 파일 및 데이터 관리, 메모리 관리, 및 통신 제어 그리고 관련 서비스를, 모두 알려진 기술에 따라 제공한다.
본 시스템의 프로세싱 모듈은 하드웨어와 소프트웨어 구성요소 모두를 포함하며, 여기서 하드웨어 구성요소는 하나 이상의 플랫폼의 형태, 예를 들어, 서버 형태를 취할 수 있으며, 기능 요소, 즉 시스템의 대표적인 하나 이상의 컴퓨터 플랫폼 상의 응용 소프트웨어의 실행에 의해 수행될 수 있는 시스템의 특정 작업(예컨대 정보의 입력 및 출력 관리, 정보 처리 등)을 수행한다. 본 시스템에 존재하는 하나 이상의 플랫폼은, 임의의 유형의 알려진 컴퓨터 플랫폼이거나 미래에 개발될 유형일 수 있지만, 통상적으로 서버로 흔히 지칭되는 컴퓨터의 부류일 것이다.
그러나, 이들은 또한 메인-프레임 컴퓨터, 워크 스테이션 또는 기타 컴퓨터 유형일 수 있다. 이들은 임의의 알려진 또는 미래의 유형의 케이블 또는 무선 시스템을 포함하는 기타 통신 시스템을 통해, 네트워크되거나 다른 방식으로, 연결될 수 있다. 이들은 함께 위치하거나, 물리적으로 분리될 수 있다. 다양한 운영 체제는 임의의 컴퓨터 플랫폼에서 사용될 수 있으며, 가능하게는 선택된 컴퓨터 플랫폼의 유형 및/또는 제조사에 따라 달라질 수 있다. 적절한 운영 체제는 WINDOWS NUCLEOTIDES®, Sun Solaris, Linux, OS/400, Compaq Tru64 Unix, SGI IRIX, Siemens Reliant Unix 등을 포함한다. 다른 개발 제품, 예컨대 Sun Microsystems, Inc.의 JavaTM2 플랫폼이 본 시스템의 프로세서에서 특히 확장가능하고 안전한 구성요소의 구현을 향상시키는 응용 프로그램 인터페이스(API)의 세트를 제공할 수 있다. 다양한 기타 소프트웨어 개발 접근법 또는 아키텍쳐가 시스템의 작용 요소 및 상호접속을 실행하는 데 사용될 수 있으며, 이는 본 기술분야의 당업자에 의해 이해되는 바와 같을 것이다.
본 개시 내용의 시스템은 또한 프로세싱 모듈로부터 식별된 저장 식별자를 제공하는 출력 관리자를 포함한다. 일부 구현예에서, 출력 관리자는 전자 디스플레이를 포함하고, 식별된 저장 식별자는 전자 디스플레이 상에 출력된다. 하나 이상의 저장 식별자, 예컨대 2 개 이상, 예컨대 3 개 이상, 예컨대 5 개 이상, 예컨대 10 개 이상, 예컨대 25 개 이상, 예컨대 100 개 이상 및 500 개 이상을 포함하는 저장 식별자가 전자 디스플레이 상에 동시에 출력될 수 있다. 출력 관리자는 단일 사용자 또는 복수의 사용자들, 예컨대 2 명 이상의 사용자, 예컨대 5 명 이상의 사용자, 예컨대 10 명 이상의 사용자, 예컨대 25 명 이상의 사용자 및 100 명 이상을 포함하는 사용자로부터의 표지된 생체분자 시약 요청의 저장 식별자를 디스플레이할 수 있다. 출력 관리자는, 표지된 생체분자에 대한 각각의 요청에 따라 저장 식별자를, 사용자에 의해 또는 저장 식별자(예를 들어, 표지된 생체분자 저장 식별자, 생체분자 저장 식별자, 표지 저장 식별자, 반응성 링커 저장 식별자)의 유형에 의해 그룹화하는 것과 같이, 원하는 대로, 디스플레이된 저장 식별자를 조직화하도록 구성될 수 있다. 다른 구현예에서, 출력 관리자는 프린터를 포함하고, 식별된 저장 식별자는 인간(종이) 판독가능 매체로 또는 기계 판독가능 포맷(예를 들어, 바코드로서)으로 프린트된다.
일부 구현예에서, 출력 관리자는, 예컨대 근거리 통신망 또는 인터넷을 통해, 프로세싱 모듈, 예를 들어, 하나 이상의 표지된 생체분자 저장 식별자, 생체분자 저장 식별자, 표지 저장 식별자, 사용자에 대한 전자 포맷의 반응성 링커 저장 식별자에 의해 어셈블된 저장 식별자를 통신한다. 출력 관리자에 의한 데이터의 전자 통신은 편리한 프로토콜에 따라 실시될 수 있으며, 이는 SQL, HTML 또는 XML 문서, 이메일 또는 기타 파일, 또는 다른 형태의 데이터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
데이터는 또한 이용자가 원격 출처로부터의 추가의 SQL, HTML, XML, 기타 문서 또는 데이터를 검색할 수 있도록 인터넷 URL 주소를 포함할 수 있다.
표지된 생체분자 시약 요청의 입력, 표지 생체분자 시약 요청의 구성요소에 상응하는 복수의 저장 식별자들의 저장, 하나 이상의 저장 식별자의 식별 및 식별된 저장 식별자의 출력을 위한 본 개시 내용의 시스템은 컴퓨터를 포함한다. 일부 구현예에서, 범용 컴퓨터는 본 명세서에 개시된 방법 및 프로그램의 기능적 배열을 위해 구성될 수 있다. 그러한 컴퓨터의 하드웨어 아키텍쳐는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 하나 이상의 프로세서(CPU), 랜덤-액세스 메모리(RAM), 읽기 전용 메모리(ROM), 내부 또는 외부 데이터 저장 매체(예를 들어, 하드 디스크 드라이브)를 포함하는 하드웨어 구성요소를 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템은 또한 디스플레이 수단에 그래픽 정보를 처리하고 출력하기 위한 하나 이상의 그래픽 보드를 포함할 수 있다.
상기 구성요소는 컴퓨터 내부에서 버스를 통해 적합하게 상호연결될 수 있다. 컴퓨터는 모니터, 키보드, 마우스, 네트워크 등과 같은 범용의 외부 구성요소와 통신하는 데 적합한 인터페이스를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 컴퓨터는 병렬 처리가능할 수 있거나, 본 방법 및 프로그램을 위한 처리력을 증가시키기 위하여 병렬 또는 분산 컴퓨팅을 위해 구성된 네트워크의 일부일 수 있다. 일부 구현예에서, 저장 매체로부터의 프로그램 코드 판독은 컴퓨터에 삽입된 확장 보드 내에 제공된 메모리, 또는 컴퓨터에 연결된 확장 단위에 기재될 수 있고, 확장 보드 또는 확장 단위에 제공된 CPU 등은, 하기 기재된 기능들을 달성하기 위하여, 프로그램 코드의 설명서에 따른 작동의 일부 또는 전부를 실질적으로 수행할 수 있다. 다른 구현예에서, 방법은 클라우드 컴퓨팅 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 이들 구현예에서, 데이터 파일 및 프로그래밍은 프로그램을 구동시키고, 출력을 사용자에게 반환하는 클라우드 컴퓨터로 내보낼 수 있다.
일부 구현예에서, 시스템은: a) 중앙 처리 단위; b) 소프트웨어 및 데이터를 저장하기 위한 하나 이상의 하드 드라이브를 포함할 수 있고, 저장 드라이브가 디스크 컨트롤러에 의해 제어되는 주요 비휘발성 저장 드라이브; c) 비휘발성 저장 드라이브로부터 로딩된 프로그램과 데이터를 포함하는, 시스템 제어 프로그램, 데이터 및 응용프로그램을 저장하기 위한 시스템 메모리, 예를 들어, 고속 랜덤-액세스 메모리(RAM); 시스템 메모리는 읽기 전용 메모리(ROM)도 포함할 수 있음; d) 마우스, 키패드 및 디스플레이와 같은 하나 이상의 입력 또는 출력 디바이스를 포함하는, 사용자 인터페이스; e) 임의의 유선 또는 무선 통신망, 예를 들어, 프린터에 연결하기 위한 선택적인 통신망 인터페이스 카드; 및 f) 시스템의 상기 언급된 요소를 상호연결하기 위한 내부 버스를 포함하는 컴퓨터를 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템의 메모리는 프로세서에 의한 검색을 위한 정보를 저장할 수 있는 임의의 디바이스일 수 있으며, 자석 또는 광학 디바이스, 또는 반도체 메모리 디바이스(예컨대 휘발성 또는 비휘발성 RAM)을 포함할 수 있다. 메모리 또는 메모리 단위는 동일하거나 상이한 유형의 하나 초과의 물리적 메모리 디바이스를 가질 수 있다(예를 들어, 메모리는 다수의 드라이브, 카드 또는 다수의 반도체 메모리 디바이스 또는 이들의 일부 조합과 같은 다수의 메모리 디바이스를 가질 수 있음). 컴퓨터 판독가능 매체와 관련하여, "영구 메모리"는 영구적인 메모리를 지칭한다.
영구 메모리는 컴퓨터 또는 프로세서에 대한 전기 공급이 끊김에 의해 지워지지 않는다. 컴퓨터 하드 드라이브 ROM(즉, 가상 메모리로서 사용되지 않는 ROM), CD-ROM, 플로피 디스크 및 DVD는 영구 메모리의 모든 예이다. 랜덤-액세스 메모리(RAM)는 비영구(즉, 휘발성) 메모리의 예이다. 영구 메모리 내 파일은 편집가능하고 재기록 가능할 수 있다.
컴퓨터의 운영은 주로 운영 체제에 의해 제어되며, 이는 중앙 처리 단위에 의해 실행된다. 운영 체제는 시스템 메모리에 저장될 수 있다. 일부 구현예에서, 운영 체제는 파일 시스템을 포함한다. 운영 체제에 추가하여, 시스템 메모리의 가능한 일 실시는 하기 설명된 방법을 실시하기 위한 다양한 프로그래밍 파일 및 데이터 파일을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로그래밍은 프로그램을 함유할 수 있고, 프로그램은, 사용자가 프로그램에 대한 입력값 또는 프로그램에 의해 사용된 파라미터를 수동으로 선택 또는 변경하는 것을 허용하는 사용자 인터페이스 모듈 및 다양한 모듈로 구성될 수 있다. 데이터 파일은 프로그램에 대한 다양한 입력값을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따른 설명서는 "프로그래밍" 형태로 컴퓨터 판독가능 매체 상에 코딩될 수 있으며, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "컴퓨터 판독가능 매체"는 지시사항 및/또는 데이터를 실행 및/또는 처리를 위해 컴퓨터에 제공하는 데 참여하는 임의의 저장 또는 수송 매체를 지칭한다. 저장 매체의 예는 그러한 디바이스가 컴퓨터 내부 또는 외부에 존재하는지의 여부에 관계없이, 플로피 디스크, 하드 디스크, 광학 디스크, 광자기 디스크, CD-ROM, CD-R, 자석 테이프, 비휘발성 메모리 카드, ROM, DVD-ROM, 블루레이 디스크, 반도체 디스크 및 네트워크 결합 스토리지(NAS)를 포함한다. 정보를 포함하는 파일은 컴퓨터 판독가능 매체에 "저장"될 수 있으며, 여기서 "저장"은 컴퓨터에 의해 나중에 액세스 및 검색 가능하도록 정보를 기록하는 것을 의미한다.
본 명세서에 기재된 컴퓨터 실시된 방법은 하나 이상의 임의의 수의 컴퓨터 프로그래밍 언어로 기록될 수 있는 프로그램을 이용하여 실행될 수 있다. 그러한 언어는 예를 들어, Java(미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재, Sun Microsystems, Inc.), Visual Basic(미국 와이오밍주 레드몬드 소재, Microsoft Corp.), 및 C++(미국 뉴욕주 베드민스터 소재, AT&T Corp.)뿐만 아니라 임의의 많은 다른 것들을 포함한다.
임의의 구현예에서, 데이터는 "원격 위치"로 통신될 수 있으며, "원격 위치"는 프로그램이 실행되는 장소 외의 장소를 의미한다.
예를 들어, 원격 위치는 동일한 도시에서 다른 위치(예를 들어, 사무실, 실험실 등), 상이한 도시에서 다른 위치, 상이한 주에서 다른 위치, 상이한 국가에서 다른 위치 등일 수 있을 것이다. 따라서, 하나의 항목이 다른 곳으로부터 "원격"인 것으로 표시되는 경우, 그 의미하는 바는 두 가지 항목이 동일한 실내일 수 있지만 분리될 수 있거나, 적어도 다른 방 또는 다른 건물에 있을 수 있고, 적어도 1 마일, 10 마일 또는 적어도 100 마일 떨어져 있을 수 있다. 정보 "통신"은 적합한 통신 채널(예를 들어, 개인 또는 공공 통신망)을 통해, 그러한 정보를 나타내는 데이터를 전기 신호로서 전송하는 것을 말한다. 항목의 "전달"은, 항목 또는 (가능한 경우) 다른 것의 물리적 전달에 의한 것인지의 여부에 관계 없이, 일 위치로부터 다음으로 그 항목을 취하는 임의의 수단을 지칭하며, 적어도 데이터의 경우에는 데이터를 운반하거나 또는 데이터를 통신하는 매체를 물리적으로 수송하는 것을 포함한다. 통신 매체의 예는 라디오 또는 적외선 수송 채널뿐만 아니라 다른 컴퓨터 또는 통신망 디바이스, 및 인터넷에 대한 통신망 연결을 포함하며, 웹사이트 등에 기록된 정보 및 이메일 전송을 포함한다.
일부 구현예는 단일 컴퓨터 상에서 또는 컴퓨터들의 네트워크에 걸쳐, 또는 컴퓨터 네트워크의 네트워크들에 걸쳐, 예를 들어, 네트워크 클라우드에 걸쳐, 근거리 통신망에 걸쳐, 휴대용 컴퓨터 디바이스 등에서의 실시를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 단계들 중 하나 이상은 컴퓨터 프로그램(들) 상에서 실행된다. 그러한 컴퓨터 프로그램은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 단계들을 실행한다. 일부 구현예에서, 본 방법의 실행은 본 명세서에 기재된 다양한 데이터 구조, 카테고리 및 수정자를 포함하며, 컴퓨터 판독가능 매체(들) 상에 인코딩되고, 통신 네트워크(들)에 걸쳐 수송가능하다.
본 발명의 소프트웨어, 웹, 인터넷, 클라우드 또는 기타 저장 및 컴퓨터 네트워크 실시는 다양한 할당, 계산, 식별, 스코어링, 접근, 생성 또는 폐기 단계를 수행하기 위한 표준 프로그래밍 기술로 수행될 수 있을 것이다.
도 16은 일부 구현예에 따른 본 발명의 개시 내용의 컴퓨터 시스템(1600)을 도시한다. 컴퓨터 시스템은 표지된 생체분자 시약 요청의 입력을 위한 키보드(1601a), 마우스(1601b) 및 모니터(1601c)를 포함하는 사용자 인터페이스(1601)를 포함한다. 사용자 인터페이스(1601)는 운영 체제(1602a), 시스템 파일(1602b) 및 표지된 생체분자 시약 요청의 구성요소들: 1) 표지된 생체분자 요청(1602d); 2) 생체분자 요청(1602e); 3) 표지 요청(1602f); 4) 활성화된 생체분자 요청(1602g); 5) 활성화된 표지 요청(1602h); 및 6) 반응성 링커 요청(1602i)에 상응하는 복수의 저장 식별자들을 포함하는 데이터세트를 포함하는 메모리(1602)에 작동적으로 커플링된다. 메모리(1602)는 또한 표지된 생체분자(1602k), 생체분자(1602l), 표지(1602m) 및 반응성 링커(1602n)의 검색가능한 인벤토리 목록을 포함하는 데이터베이스(1602j)를 포함한다. 일부 구현예에서, 표지 요청은 효소 요청 및 기질 요청을 포함한다.
메모리 및 사용자 인터페이스는 디스크 컨트롤러(1605)에 의해 제어되는 저장 드라이브(1606)를 포함하는 접속부(1604)를 통해 프로세서(1603)에 작동적으로 커플링된다. 상술한 바와 같이, 프로세서는 입력 관리자에 의해 수신된 요청에 상응하는 데이터세트로부터 하나 이상의 저장 식별자를 식별한다
식별된 저장 식별자를 출력하기 위해, 이러한 구현예에 따른 관심 대상의 시스템은 저장 식별자를 출력하는 네트워크 인터페이스 컨트롤러(1607)를 포함한다. 네트워크 인터페이스 컨트롤러(1607)는 식별된 저장 식별자를 시각적으로 디스플레이하기 위해 전자 디스플레이와 인터페이스될 수 있거나, 인간(종이) 판독가능 매체 상에 또는 기계 판독가능 포맷으로서(예를 들어, 바코드로서) 식별된 저장 식별자를 제시하기 위한 프린터와 인터페이스될 수 있다. 일부 구현예에서, 네트워크 인터페이스 컨트롤러(1607)는 예컨대 근거리 통신망을 통해 또는 인터넷을 통해 저장 식별자를 전자 포맷으로 통신하며, 임의의 전자 포맷에 따라 실시될 수 있으며, 이는 SQL, HTML 또는 XML 문서, 이메일 또는 기타 파일, 또는 다른 형태의 데이터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
도 17은 일부 구현예에 따른 표지된 생체분자 시약 요청에 대한 수신, 처리 및 출력을 위한 흐름도(1700)를 도시한다. 요청의 수신 및 처리(1701)는 표지된 생체분자 시약 요청의 하나 이상의 구성요소를 입력하는 것으로 출발한다(1702). 상기 논의된 바와 같이, 표지된 생체분자 시약 요청은 1) 표지된 생체분자 요청; 및 2) 생체분자 요청 및 표지 요청 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 생체분자 요청은, 생체분자가 반응성 링커에 커플링된 활성화된 생체분자 요청이다. 일부 구현예에서, 표지 요청은 활성화된 표지 요청으로, 표지는 반응성 링커에 커플링된다. 일부 구현예에서, 표지 요청은 효소 요청 및 기질 요청을 포함한다.
일부 구현예에서, 생체분자는 폴리펩티드, 핵산, 폴리사카라이드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 핵산은 올리고뉴클레오티드, DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리펩티드는 단백질, 효소 또는 단백질 결합 시약일 수 있다. 단백질 결합 시약은 항체, 압타머, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 표지와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 복수의 단백질 표적들은 예를 들어, 10 내지 400 개의 상이한 단백질 표적을 포함할 수 있다. 생체분자는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 생체분자로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 생체분자에 대한 고유 식별자를 포함한다. 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택될 수 있다. 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 10, 100, 또는 1,000 개의 상이한 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)로부터 선택된 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 생체분자에 컨쥬게이트될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 생체분자에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
고유 식별자는 샘플의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 샘플은 단일 세포, 복수의 세포들, 조직, 종양 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 샘플은 포유동물 샘플, 세균 샘플, 바이러스 샘플, 효모 샘플, 균류 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 폴리(A) 테일, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
시스템이 표지된 생체분자 시약 요청을 수신한 후, 프로세서는 요청의 구성요소(즉, 표지된 생체분자 요청; 또는 생체분자 요청 및 표지 요청)를 결정하고, 시스템은 그 특정 요청에 상응하는 저장 식별자에 대한 메모리를 검색한다(1703). 적절한 데이터세트가 검색된 경우, 프로세싱 모듈은 표지된 생체분자 시약 요청의 구성요소에 상응하는 하나 이상의 저장 식별자를 식별한다(1704). 하나 초과의 표지된 생체분자 시약 요청이 단일 사용자에 의해 입력되는 경우, 시스템은, 사용자 요청으로부터의 모든 저장 식별자가 프로세서에 의해 위치되고 식별될 때까지 상기를 반복할 수 있다(1705).
일단 사용자로부터의 표지된 생체분자 시약 요청이 처리되면, 시스템은 식별된 저장 식별자를 출력하도록(1706) 구성된다. 출력 관리자는 전자 디스플레이 상에 저장 식별자를 디스플레이하거나 저장 식별자를 프린트할 수 있다(1707). 저장 식별자는, 또한 예컨대 시약 제조 장치로 또는 인터넷을 통해 제3자 제조자로, 전자적으로 통신할 수 있다(1708).
일부 구현예에서, 시스템은 입력 관리자에 의해 수신된 요청된 표지된 생체분자에 상응하는 표지된 생체분자 시약의 제조를 위한 시약 제조 장치를 포함한다. 시약 제조 장치는 출력 관리자에 작동적으로 커플링되고, 식별된 저장 식별자(예를 들어, 표지된 생체분자 저장 식별자, 생체분자 저장 식별자, 표지 저장 식별자, 반응성 링커 저장 식별자)를 수신하도록 구성되고, 수신된 저장 식별자에 따라 표지된 생체분자 시약을 생성한다. 이들 구현예에서, 시약 제조 장치는 예컨대 케이블이나 근거리 통신망을 통해 출력 관리자와 가까운 위치에서 통신할 수 있거나, 원격 위치에 있을 수 있으며, 광역 통신망 또는 인터넷을 통해 출력 관리자로 연결될 수 있다. 시약 제조 장치와 출력 관리자 사이의 연결을 용이하게 하기 위하여, 시스템은 임의의 적합한 연결 프로토콜, 예컨대 케이블, 송신기, 중계국, 네트워크 서버, 네트워크 인터페이스 카드, 이더넷 모뎀, 전화 통신망 연결뿐만 아니라 위성 통신망 연결을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 시약 제조 장치는, 출력 관리자로부터의 저장 식별자가 시약 제조 장치의 사용자 그래픽 인터페이스에 작동적으로 커플링된 입력 관리자로 수동으로 입력되는, 사용자 그래픽 인터페이스를 포함한다.
일부 구현예에서, 시약 제조 장치는 완전 자동화이다.
"완전 자동화"라 함은, 사람의 개입 또는 본 시스템 내로의 수동식 입력이 적거나 없이, 시약 제조 장치가 출력 관리자로부터 식별된 저장 식별자를 수신하고, 표지된 생체분자 시약을 준비, 제조 및 포장함을 의미한다. 일부 구현예에서, 본 시스템은 사람의 어떤 개입도 없이, 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지로부터 표지된 생체분자 시약을 제조, 정제 및 포장하도록 구성된다.
시약 제조 장치는 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지를 접촉 장치에 제공하는 샘플링 디바이스를 포함한다. 샘플링 디바이스는 예를 들어, 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지를 함유한 복수의 시약 바이알들을 갖는 고 처리량 샘플 교환기와 같이, 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지의 각각의 공급원과 유체 통신되는 임의의 편리한 디바이스일 수 있다. 샘플링 디바이스는 다른 샘플링 디바이스들 중, 마이크로유체 채널, 주사기, 바늘, 피펫, 흡인기도 포함할 수 있다. 접촉 장치는 활성화된 생체분자가 활성화된 표지와 접촉되도록 하는 임의의 적합한 장치일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 접촉 장치는 샘플 챔버이다(예를 들어, 봉입형, 밀봉형, 기밀, 개방형, 판형(plate) 등). 다른 구현예에서, 접촉 장치는 마이크로튜브이다. 다른 구현예에서, 접촉 장치는 시험관이다. 다른 구현예에서, 접촉 장치는 유리 플라스크(예를 들어, 비이커, 메스 플라스크, 삼각 플라스크 등)이다. 또 다른 구현예에서, 접촉 장치는 96-웰 플레이트이다. 일부 구현예에서, 본 시스템은 접촉 장치(예를 들어, 마이크로튜브, 시험관 등) 내에서 생성된 표지된 생체분자 시약을 밀봉하도록 구성된 포장 단위를 추가로 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 생성된 표지된 생체분자 시약은 먼저 특성화되고, 용기 내에서 밀봉되기 전에 추가로 정제, 희석, 농축 또는 재-조제되고, 포장 단위로 포장된다.
접촉 장치는 조합된 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지를 혼합하기 위한 교반기를 추가로 포함할 수 있다. 교반기는 대상 조성물의 혼합을 위해 충분한 임의의 교반기일 수 있으며, 기타 교반 프로토콜들 중, 와동기, 초음파분쇄기, 진탕기(예를 들어, 수동식, 기계식 또는 전동식 진탕기), 라커(rocker), 진동판, 자석 교반기, 정적 혼합기, 회전자, 블렌더, 혼합기, 텀블러, 궤도식 진탕기, 거품, 마이크로유체 흐름을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 시약 제조 장치는 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지의 출처를 또한 포함한다. 출처는 복수의 활성화된 생체분자들 및 활성화된 표지를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 시약 제조 장치는 5 개 이상, 예컨대 10 개 이상, 예컨대 100 개 이상, 예컨대 250 개 이상, 예컨대 500 개 이상의 상이한 유형의 활성화된 생체분자를 함유하는 출처를 포함하며, 1000 개 이상을 포함하는 상이한 유형의 활성화된 생체분자를 포함한다. 예를 들어, 시약 제조 장치는 5 이상의 상이한 유형의 활성화된 항체 프로브 또는 활성화된 올리고뉴클레오티드 프로브, 예컨대 10 개 이상, 예컨대 100 개 이상, 예컨대 250 개 이상, 예컨대 500 개 이상을 함유하는 출처를 포함할 수 있고, 이는 1000 개 이상의 상이한 유형의 활성화된 항체 프로브 또는 활성화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 시약 제조 장치는 5 개 이상, 예컨대 10 개 이상, 예컨대 15 개 이상, 예컨대 25 개 이상, 예컨대 50 개 이상의 상이한 유형의 활성화된 표지를 함유하는 출처를 포함하고, 이는 100 개 이상의 상이한 유형의 활성화된 표지를 포함한다. 예를 들어, 시약 제조 장치는 5 개 이상, 예컨대 10 개 이상, 예컨대 15 개 이상, 예컨대 25 개 이상, 예컨대 50 개 이상의 상이한 유형의 활성화된 형광단을 함유하는 출처를 포함할 수 있고, 이는 100 개 이상의 상이한 유형의 활성화된 형광단을 포함한다.
활성화된 생체분자 및 활성화된 표지의 출처는 하나 이상의 유형의 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지를 접촉 장치에 저장 및 제공할 수 있는 임의의 적합한 저장소일 수 있다. 일 예에서, 출처는 복수의 상이한 유형들의 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지를 별도로, 구분된 시약 챔버 내에 저장하는 단일의 고 처리량 저장소이다. 다른 예에서, 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지의 출처는 각각의 활성화된 생체분자 및 각각의 활성화된 표지의 복수의 개별적인 바이알들이다. 다른 예에서, 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지의 출처는 각각의 활성화된 생체분자 및 각각의 활성화된 표지의 미리 측정된 분취액을 담은 저장소이다. 예를 들어, 저장소는 하나 이상, 예컨대 2 개 이상, 예컨대 5 개 이상, 예컨대 10 개 이상, 예컨대 25 개 이상, 예컨대 100 개 이상, 예컨대 500 개 이상의 표지된 생체분자 및 1000 개 이상을 포함하는 표지된 생체분자를 제조하기에 충분한 각각의 활성화된 생체분자 및 각각의 활성화된 표지의 미리 측정된 분취액을 포함할 수 있다.
활성화된 생체분자 및 활성화된 표지를 함유하는 저장소의 특정 설계에 따라 달라지는, 시약 제조 장치는 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지를 접촉 장치로 전달하기 위한 하나 이상의 유입구를 추가로 포함할 수 있다.
시약 제조 장치는 하나 이상의 시약 정제기를 포함할 수도 있다. 관심 대상의 시약 정제 프로토콜은, 기타 정제 프로토콜들 중, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 여과(예를 들어, 막 필터, 컷 오프 여과), 액체-액체 추출, 수동 투석, 능동 투석, 원심분리, 침전을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
시약 제조 장치는 시약 분석기를 포함할 수도 있다. 일부 구현예에서, 샘플 분석기는 질량 세포분석기, 질량 분광분석(예를 들어, TOF 질량 분광분석, 유도결합 플라즈마 질량 분광분석), 흡광도 분광학, 형광 분광법, 부피 분석, 전도도 분석, 핵자기 공명분광법, 적외선 분광법, UV-가시광선 분광법, 색채계, 원소 분석, 액체 크로마토그래피-질량 분광분석 또는 가스 크로마토그래피-질량 분광분석 시스템일 수 있다. 예를 들어, 장치는 분석 분리 디바이스, 예컨대 액체 크로마토그래피(LC)를 포함할 수 있으며, 이에는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 신속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC), 마이크로- 또는 나노-액체 크로마토그래피 또는 초고압 액체 크로마토그래피(UHPLC) 디바이스, 모세관 전기영동(CE), 또는 모세관 전기영동 크로마토그래피(CEC) 장치가 있다. 그러나, 임의의 수동 또는 자동화된 주입 또는 분주(dispensing) 펌프 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 샘플은 일부 구현예에서 나노펌프 또는 마이크로펌프를 사용함으로써 LC-MS 시스템에 적용될 수 있다. 질량 분석계 시스템은 임의의 편리한 질량 분광분석 시스템일 수 있으며, 이는 일반적으로 샘플의 이온화를 위한 이온 공급원, 이온 분리를 위한 질량 분석기, 및 이온을 검출하기 위한 검출기를 함유한다. 일부 구현예에서, 질량 분석계는 전구체 이온을 단리하고, 전구체 이온을 단편화하고, 단편화된 전구체 이온을 분석할 수 있는 소위 "탠덤(tandem)" 질량 분석계일 수 있다. 이온 공급원은 임의의 유형의 이온화 방법에 따라 달라질 수 있으며, 전자분무 이온화(ESI), 대기압 화학 이온화(APCI), 전자 충격(EI), 대기압 광이온화(APPI), 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화(MALDI) 또는 유도결합 플라즈마(ICP) 이온화, 예를 들어, 또는 이들의 임의의 조합(소위 "다중모드" 이온화 공급원을 제공)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일 구현예에서, 전구체 이온은 EI, ESI 또는 MALDI에 의해 제조될 수 있으며, 선택된 전구체 이온은 충돌에 의해 또는 광자를 이용하여 단편화되어 이후에 분석되는 생성 이온을 생성할 수 있다. 이와같이, 임의의 다양한 상이한 질량 분석기들이 사용될 수 있으며, 이는 타임 오브 플라이트(time of flight: TOF), 푸리에 변환 이온 시클로트론 공명(Fourier transform ion cyclotron resonance: FTICR), 이온 포획, 사중극자 또는 쌍극자 포커싱 자석 전기 섹터(sector) 질량 분석기, 또는 이들의 임의의 혼성을 포함한다. 일 구현예에서, 질량 분석기는 섹터, 전송 사중극자, 또는 타임 오브 플라이트 분석기일 수 있다.
시약 제조 장치는 표지된 생체분자 시약을 하나 이상의 부형제, 예컨대 버퍼, 보존제, 건조제 등과 조제하도록 구성될 수도 있다. 일부 구현예에서, 시약 제조 장치는 표지된 생체분자 시약이 하나 이상의 버퍼와 조제되도록 구성된다.
예시적인 버퍼는, 기타 유형의 버퍼화 용액들 중, PBS(포스페이트) 버퍼, 아세테이트 버퍼, N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신(비신) 버퍼, 3-{[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}프로판설폰산(TAPS) 버퍼, 2-(N-모르폴린)에탄설폰산(MES) 버퍼, 시트레이트 버퍼, 트리스(히드록시메틸)메틸아민 (트리스) 버퍼, N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신 (트리신) 버퍼, 3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸아미노]-2-히드록시프로판설폰산(TAPSO) 버퍼, 4-2-히드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산(HEPES) 버퍼, 2-{[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산(TES) 버퍼, 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)(PIPES) 버퍼, 디메틸비산(카코딜레이트) 버퍼, 식염수 나트륨 시트레이트(SSC) 버퍼, 2(R)-2-(메틸아미노)석신산(석신산) 버퍼, 칼륨 포스페이트 버퍼, N-시클로헥실-2-아미노에탄설폰산(CHES) 버퍼를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
시약 제조 장치는 표지된 생체분자 시약을 포장하기 위한 패킹 단위를 포함할 수도 있다. 일부 구현예에서, 포장 단위는 제조된 표지된 생체분자 시약을 포장하고, 배송을 위해, 예컨대 우편에 의해표지된 생체분자 시약을 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 제조된 표지된 생체분자 시약은 용기 내로 분주되고 밀봉된다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약은 용기 내로 분주되고, 밀봉되고, 예컨대 파우치, 백, 튜브, 바이알, 마이크로튜브 또는 병 내에 추가로 포장된다. 바람직한 경우, 포장은 멸균될 수 있다.
일부 구현예에서, 관심 대상의 시스템은: 1) 표지된 생체분자 시약에 대한 하나 이상의 요청을 수신; 2) 요청된 표지된 생체분자 시약을 제조 및 3) 제조된 표지된 생체분자 시약을 요청자에게 전달(예를 들어, 주문자)에게 전달하도록 구성된, 온-디맨드 자립형 표지된 생체분자 시약 분주 스테이션을 포함한다. 예를 들어, 자립형 시약 분주 스테이션은 주문자로부터 하나 이상의 표지된 생체분자 시약 요청을 수신하고, 요청된 표지된 생체 분자를 제조하고, 제조된 표지된 생체분자를 요청에 따라 주문자에게 분주하도록 구성된 자동판매기일 수 있다. 표지된 생체분자 시약 요청의 수 및 요청된 각각의 표지된 생체분자 시약의 양에 따라 달라지는, 관심 대상의 자립형 시약 분주 스테이션은 요청에 따라, 표지된 생체분자 요청의 입력 후 10 초 이상, 예컨대 15 초 이상, 예컨대 30 초 이상, 예컨대 1 분 후, 예컨대 5 분 후, 예컨대 10 분 후, 예컨대 15 분 후, 예컨대 30 분 후, 및 60 분 이상을 포함하여, 예컨대 1.5 시간 이상, 예컨대 2 시간 이상, 예컨대 2.5 시간 이상, 예컨대 3 시간 이상, 예컨대 4 시간 이상, 예컨대 5 시간 이상, 예컨대 6 시간 이상, 예컨대 8 시간 이상, 예컨대 10 시간 이상, 예컨대 12 시간 이상, 예컨대 16 시간 이상, 예컨대 18 시간 이상 및 24 시간 이상을 포함하는 시간 후 요청자에게 표지된 생체분자를 제조 및 분주할 수 있다. 일부 구현예에서, 자립형 시약 분주 스테이션은 요청에 따라 표지된 생체 분자를 5 초 내지 60 초, 예컨대 10 초 내지 50 초 및 15 초 내지 45 초의 범위의 기간 후 요청자에게 제조 및 분주하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 자립형 시약 분주 스테이션은 요청에 따라 표지된 생체 분자를 1 분 내지 60 분, 예컨대 2 분 내지 55 분, 예컨대 5 분 내지 50 분, 예컨대 15 분 내지 45 분, 및 20 분 내지 40 분을 포함하는 범위의 기간 후 요청자에게 제조 및 분주하도록 구성되며, 예를 들어, 표지된 생체분자를 30분 후 요청자에게 제조 및 분주한다. 또 다른 일부 구현예에서, 자립형 시약 분주 스테이션은 요청에 따라 표지된 생체 분자를 0.5 시간 내지 24 시간, 예컨대 1 시간 내지 20 시간, 예컨대 1.5 시간 내지 18 시간, 예컨대 2 시간 내지 16 시간, 예컨대 2.5 시간 내지 12 시간, 예컨대 3 시간 내지 10 시간, 예컨대 3.5 시간 내지 8 시간 및 4 시간 내지 6 시간을 포함하는 범위의 기간 후 요청자에게 제조 및 분주하도록 구성된다.
이들 구현예에서, 본 자립형 시약 분주 스테이션은 상기 설명된 바와 같이, 표지된 생체분자 시약 요청을 수신하고 요청된 표지된 생체분자 시약 제조를 위한 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 자립형 표지된 생체분자 시약 분주 스테이션은 표지된 생체 분자에 대한 요청을 수신하기 위한 입력 모듈; 시약 제조 장치; 및 포장된 표지된 생체분자를 출력하기 위한 분주 모듈을 포함할 수 있다. 이들 구현예에서, 입력 모듈은 표지된 생체분자에 대한 요청을 수신하기 위한 입력 관리자, 표지된 생체분자 시약 요청의 하나 이상의 구성요소(예를 들어, 생체분자, 표지 등)에 상응하는 복수의 저장 식별자들을 갖는 데이터세트를 저장하기 위한 메모리, 표지된 생체분자 시약 요청의 구성요소에 상응하는 데이터세트로부터 저장 식별자를 식별하도록 구성되고, 메모리에 통신가능하게 커플링된 프로세싱 모듈 및 식별된 저장 식별자를 제공하기 위한 출력 관리자를 포함할 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 자립형 스테이션은 표지된 생체분자 요청을 자립형 분주 스테이션의 입력 관리자에 대해 통신하기 위하여 사용자 그래픽 인터페이스 및 사용자 입력 디바이스를 또한 포함한다.
구현예에서, 출력 관리자는 생체분자, 표지, 반응성 링커, 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지의 하나 이상의 출처로 구성되는 자립형 시약 분주 스테이션 및 활성화된 생체분자와 활성화된 표지를 커플링하여 요청된 표지된 생체분자를 생성하기 위한 접촉 스테이션 내 시약 제조 장치에 통신적으로 커플링된다. 일부 구현예에서, 자립형 시약 분주 스테이션은 복수의 미리 합성된 표지된 생체분자들을 포함하고, 자립형 시약 분주 스테이션은 미리 합성된 표지된 생체분자 시약의 양을 용기 내로 분취하고 표지된 생체분자 시약을 요청자에게로 분주하도록 구성된다.
자립형 표지된 생체분자 시약 분주 스테이션은 포장된 표지된 생체분자 시약을 제공하도록 분주 모듈을 또한 포함한다. 구현예에서, 분주 모듈은 제조된 표지된 생체분자 시약을 포장하기 위한 포장 단위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제조된 표지된 생체분자 시약은 용기 내로 분주되고 밀봉된다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약은 용기 내로 분주, 밀봉되고, 예컨대 파우치, 백, 튜브, 바이알, 마이크로튜브 또는 병 내로 추가로 포장된다. 원하는 경우, 포장은 멸균될 수 있다.
일부 구현예에서, 표지된 생체분자 요청이 수신되는 자립형 시약 분주 스테이션은 완전 자동화되며, 스테이션은 표지된 생체분자 요청을 떠나, 표지된 생체분자 시약을 본 시스템 내로의 사람의 개입 또는 수동적 입력이 거의 없거나 없이, 제조, 정제 및 포장한다.
표지된 생체분자 시약의 제조 방법
본 개시 내용의 양태는 표지된 생체분자 시약을 제조하는 방법을 또한 포함한다. 일부 구현예에 따른 방법은 표지된 생체분자 시약에 대한 요청을 수신하는 단계 및 표지된 생체분자를 제조하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 방법은 상기 기재된 바와 같이 하나 이상의 입력 관리자를 이용하여 표지된 생체분자 시약에 대한 요청을 수신하는 단계, 표지된 생체분자 시약 요청에 상응하는 저장 식별자를 식별하는 단계; 하나 이상의 식별된 저장 식별자를 출력하는 단계 및 식별된 저장 식별자로부터 표지된 생체분자를 제조하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 생체분자는 폴리펩티드, 핵산, 폴리사카라이드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 핵산은 올리고뉴클레오티드, DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리펩티드는 단백질, 효소 또는 단백질 결합 시약일 수 있다. 단백질 결합 시약은 항체, 압타머, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 표지와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 복수의 단백질 표적들은 예를 들어, 10 내지 400 개의 상이한 단백질 표적을 포함할 수 있다. 생체분자는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 생체분자로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 생체분자에 대한 고유 식별자를 포함한다. 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택될 수 있다. 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 10, 100, 또는 1,000 개의 상이한 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)로부터 선택된 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 생체분자에 컨쥬게이트된다. 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 생체분자에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
고유 식별자는 샘플의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 샘플은 단일 세포, 복수의 세포들, 조직, 종양 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 샘플은 포유동물 샘플, 세균 샘플, 바이러스 샘플, 효모 샘플, 균류 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 폴리(A) 테일, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 표지된 생체분자 시약은 검출가능한 마커에 커플링된(예를 들어, 공유결합됨) 생물학적 거대분자이다. 일부 구현예에서, 방법은 검출가능한 마커, 검출가능한 마커에 커플링된 핵산, 검출가능한 마커에 커플링된 폴리사카라이드 또는 이들의 조합을 제조하는 단계를 포함한다. 일 예에서, 생체분자는 올리고뉴클레오티드, 절단되거나 전장의 DNA 또는 RNA이다. 다른 예에서, 생체분자는 폴리펩티드, 단백질, 효소 또는 항체이다. 일부 구현예에서, 생체분자는 관심 대상의 분석물을 결합하기에 충분한 특정 결합 도메인을 갖는 생물학적 프로브이다. 관심 대상의 특정 결합 도메인은 항체 결합제, 단백질, 펩티드, 합텐, 핵산 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어 "항체 결합제"는 관심 대상의 분석물에 결합하기에 충분한 다클론성 또는 단클론성 항체 또는 단편을 포함한다. 항체 단편은 예를 들어, 단량체성 Fab 단편, 단량체성 Fab' 단편, 또는 이량체성 F(ab)'2 단편, 및 항체 엔지니어링에 의해 생성된 분자, 예컨대 키메라성 항체의 생성을 위해 중쇄 및 경쇄의 불변 영역의 치환에 의해 또는 인간화 항체의 생성을 위해 불변 영역과 가변 영역의 프레임워크 부분 모두의 치환에 의해 단클론성 항체로부터 생성된 단일-사슬 항체 분자(scFv) 또는 인간화 또는 키메라성 항체일 수 있다.
관심 대상의 표지는 예를 들어, 형광 방출, 형광 분극화, 형광 수명, 형광 파장, 최대 흡광도, 흡광도 파장, 스토크스 시프트, 광 산란기, 질량, 분자 질량, 산화환원, 음향, 라만, 자성, 무선 주파수, 효소 반응(화학발광 및 전기-화학발광 포함) 또는 이들의 조합에 기초하여 검출가능한 마커 화합물이다. 관심 대상의 표지는 형광단, 발색단, 효소, 효소 기질, 촉매, 산화환원 표지, 방사성표지, 음향 표지, 라만(SERS) 태그, 질량 태그, 동위원소 태그(예를 들어, 동위원소적으로 순수한 희토류 원소), 자석 입자, 마이크로입자, 나노입자, 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
방법은 표지된 생체분자 시약에 대한 요청을 수신하는 단계를 포함한다. 본 개시 내용의 구현예에서, 표지된 생체분자 시약 요청은: 1) 표지된 생체분자 요청; 및 2) 생체분자 요청 및 표지 요청 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 표지 요청은 효소 요청 및 기질 요청을 포함한다. 일부 구현예에서, 생체분자 요청은 생체분자는 반응성 링커에 커플링된 활성화된 생체분자 요청이다. 일부 구현예에서, 표지 요청은 표지가 반응성 링커에 커플링된 활성화된 표지 요청이다. 표지된 생체분자 시약 요청은, 전화, 팩시밀리, 전자 메일 또는 우편을 통해 표지된 생체분자 시약 요청을 수신하는 단계를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 편의의 통신 프로토콜에 의해 수신될 수 있다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약 요청은, 예컨대 인터넷 웹사이트를 통해 컴퓨터 상에서 사용자 그래픽 인터페이스 내로 표지된 생체분자 시약 요청을 입력함으로써 통신된다.
하나 이상의 표지된 생체분자 시약 요청은 (동시에 또는 순차적으로) 수신될 수 있으며, 예컨대 2 이상, 예컨대 5 이상, 예컨대 10 이상의 표지된 생체분자 시약 요청을 수신하고, 25 이상을 포함하는 표지된 생체분자 시약 요청을 수신한다. 표지된 생체분자 시약에 대한 요청은 단일한 구성요소만을 포함하며, 표지된 생체분자 요청이며, 방법은 2 이상, 예컨대 5 이상, 예컨대 10 이상의 표지된 생체분자 요청을 수신하고, 25 이상을 포함하는 표지된 생체분자 요청을 수신한다. 표지된 생체분자 시약 요청이 2 개의 구성요소, 예컨대 생체분자 요청 및 표지 요청을 포함하는 경우, 방법은 2 이상의 생체분자 요청, 예컨대 5 이상, 예컨대 10 이상의 생체분자 요청을 수신하는 단계를 포함할 수 있고, 25 이상을 포함하는 생체분자 요청을 포함할 수 있고, 2 이상의 표지 요청, 예컨대 5 이상, 예컨대 10 이상을 수신하고, 25 이상을 포함하는 표지 요청을 수신하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 단일 생체분자 요청 및 단일 표지 요청을 포함하는 표지된 생체분자 시약 요청의 수신을 포함하는 방법. 일부 구현예에서, 방법은 단일 생체분자 요청 및 복수의 상이한 표지 요청들을 포함하는 표지된 생체분자 시약 요청을 수신하는 단계를 포함한다. 또 다른 일부 구현예에서, 방법은 복수의 상이한 생체분자 요청들 및 단일 표지 요청을 포함하는 표지된 생체분자 시약 요청을 수신하는 단계를 포함한다. 또 다른 일부 구현예에서, 방법은 복수의 상이한 생체분자 요청들 및 복수의 상이한 표지 요청들을 포함하는 표지된 생체분자 시약 요청을 수신하는 단계를 포함한다.
표지된 생체분자 시약 요청은 단일 사용자 또는 복수의 사용자들, 예컨대 2 명 이상의 사용자, 예컨대 5 명 이상의 사용자, 예컨대 10 명 이상의 사용자, 예컨대 25 명 이상의 사용자로부터 수신될 수 있고, 100 명 이상을 포함하는 사용자로부터의 표지된 생체분자 요청의 수신을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 표지된 생체분자 시약에 대한 요청을 수신하는 단계 및 그를 통해 들어온 요청을 입력 관리자의 사용자 그래픽 인터페이스 내로 입력하는 단계(상기 설명된 바와 같음)를 포함한다. 다른 구현예에서, 표지된 생체분자 시약 요청을 만드는 사용자는 사용자 그래픽 인터페이스로 요청을 직접 입력한다. 이들 구현예에 있어서, 표지된 생체분자 요청은 사용자 그래픽 인터페이스로 입력될 수 있고, 표지된 생체분자의 일련의 하나 이상의 기호(예를 들어, 문자숫자 기호), 부호, 이미지 또는 기타 그래픽적 표현(들)로서 입력관리자로 통신될 수 있다. 일부 구현예에서, 요청은 표지된 생체분자, 생체분자, 표지, 활성화된 생체분자, 활성화된 표지 또는 반응성 링커의 "약칭" 명명 또는 기타 적합한 식별자이다. 예를 들어, 요청은 상승 번호, 생체분자 이름, 표지 이름, 상승 번호, 서열 식별 번호, 약기된 프로브 서열, 화학 구조 또는 화학 초록 서비스(CAS) 등록 번호를 포함할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 표지된 생체분자 요청이 입력 관리자에 의해 수신된 후, 본 시스템의 프로세싱 모듈은 수용된 표지된 생체분자 시약 요청의 구성요소들(예를 들어, 표지된 생체분자 저장 식별자, 생체분자 저장 식별자, 표지 저장 식별자, 반응성 링커 저장 식별자 등)에 상응하는 메모리 내 저장된 데이터세트로부터 하나 이상의 저장 식별자를 식별한다. 수신된 표지된 생체분자 시약 요청의 각각의 구성요소에 상응하는 저장 식별자는 출력 관리자에 의해 출력된다. 일부 구현예에서, 각각의 표지된 생체분자 저장 식별자는 모니터 상에 디스플레이된다. 일부 구현예에서, 저장 식별자는 기계(예를 들어, 바코드로서) 또는 인간 판독가능 포맷으로 프린팅함으로써 출력된다. 표지된 생체분자 시약이 컴퓨터 제어된 시약 제조 장치(아래에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같음)에 의해 제조되는 경우, 출력 관리자는 시약 제조 장치에 작동적으로 커플링되고, 각각의 저장 식별자는 예컨대 인터넷 프로토콜을 통해 시약 제조 장치에 전자적으로 통신될 수 있으며, SQL, HTML 또는 XML 문헌, 이메일 또는 기타 파일 또는 기타 포맷의 데이터를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
수신된 표지된 생체분자 요청의 수에 따라 달라지는, 하나 이상, 예컨대 2 개 이상, 예컨대 3 개 이상, 예컨대 5 개 이상, 예컨대 10 개 이상, 예컨대 25 개 이상, 예컨대 100 개 이상 및 500 개 이상을 포함하는 저장 식별자가 출력 관리자에 의해 동시에 출력될 수 있다. 출력된 저장 식별자의 각각의 세트는 단일 사용자로부터 또는 복수의 사용자들로부터의 표지된 생체분자 요청에 상응할 수 있다.
일부 구현예에서, 출력 관리자는 저장 식별자를 디스플레이 또는 인쇄하기 전에 예정된 기준을 기준으로 저장 식별자를 체계화(예를 들어, 분류화)한다. 일 예에서, 출력 관리자는 특정 사용자로부터의 모든 저장 식별자의 분류화한다. 또 다른 예에서, 출력 관리자는 모든 동일한 표지된 생체분자 저장 식별자를 분류화한다. 다른 예에서, 출력 관리자는 생체분자(예를 들어, 항체, 올리고뉴클레오티드)의 이름 또는 유형을 기준으로 저장 식별자를 체계화한다. 또 다른 예에서, 출력 관리자는 표지(예를 들어, 플루오레세인, 쿠마린)의 이름 또는 유형을 기준으로 저장 식별자를 체계화한다.
일부 구현예에서, 방법은 수신된 요청 및/또는 출력된 저장 식별자에 따른 표지된 생체분자 시약을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약의 제조는 복수의 활성화된 생체분자들 및 복수의 활성화된 표지들을 갖는 저장소로부터 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지를 선택하는 단계를 포함한다. 각각의 표지된 생체분자 시약은 하나 이상 개별적으로, 예컨대 실험실에서 수동으로 제조될 수 있거나, 상기 기재된 바와 같이, 컴퓨터-제어된 시약 제조 장치(예를 들어, 고 처리량 제조 시스템)를 이용하여 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 출력된 저장 식별자가 표지된 생체분자 저장 식별자인 경우, 방법은 출력된 표지된 생체분자 저장 식별자에 상응하는 저장소로부터의 표지된 생체분자를 회수하는 단계를 포함한다. 이들 경우에, 방법은 저장소로부터의 표지된 생체분자를 정제하거나, 또는 원하는 바에 따라 하나 이상의 추가 시약(예를 들어, 버퍼, 항산화제 등)을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 검색된 표지된 생체분자는 추가의 정제 또는 조성물에의 첨가 없이 포장되어 이용자에게 운송된다.
다른 구현예에서, 표지된 생체분자는 출력된 생체분자 저장 식별자에 상응하는 활성화된 생체분자를, 출력된 표지 저장 식별자와 상응하는 활성화된 표지와 접촉시키는 단계에 의해 제조된다. 임의의 편리한 반응 프로토콜은, 반응이 활성화된 생체분자의 반응성 링커 및 활성화된 표지의 반응성 링커 간의 공유결합을 형성하기에 충분한 한, 활성화된 생체분자를 활성화된 표지와 혼합하는데 사용될 수 있다. 혼합은, 일부 구현예에서, 혼합물을 자석 교반 막대로 교반 또는 혼합물을 수동으로 혼합, 및 혼합물을 수동으로(즉, 손으로) 또는 기계적으로(즉, 기계 동력 또는 전기 동력의 진탕 디바이스에 의해) 교반하는 와동을 포함할 수 있다. 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지는 활성화된 생체분자를 활성화된 표지에 커플링시키기에 충분한 기간 동안, 예컨대 1 분 이상 동안, 예컨대 5 분 이상 동안, 예컨대 10 분 이상 동안 및 30 분 이상 동안 접촉된다.
상기 논의된 바와 같이, 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지의 각각은 적절한 조건 하에서 실시되는 경우, 함께 반응하여 화학 결합, 예를 들어, 이온결합(전하-전하 상호작용), 비공유결합(예를 들어, 쌍극자-쌍극자 또는 전하-쌍극자) 또는 공유결합을 형성하는 반응성 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 활성화된 생체분자의 반응성 링커 또는 모이어티는 활성화된 표지의 반응성 링커 또는 모이어티와 반응하여 이온결합을 생성한다. 다른 구현예에서, 활성화된 생체분자의 반응성 링커 또는 모이어티는 활성화된 표지의 반응성 링커 또는 모이어티와 반응하여 비공유결합을 생성한다. 또 다른 구현예에서, 활성화된 생체분자의 반응성 링커 또는 모이어티는 활성화된 표지의 반응성 링커 또는 모이어티와 반응하여 공유결합을 생성한다. 일부 구현예에서, 활성화된 생체분자의 반응성 링커 및 활성화된 표지의 반응성 링커는 반응하여 공유결합을 생성한다. 활성화된 생체분자의 반응성 링커와 활성화된 표지의 반응성 링커간의 공유결합을 형성하기 위한 임의의 편리한 프로토콜이 사용될 수 있으며, 결합 형성 반응의 다른 유형들 중, 부가 반응, 제거 반응, 치환 반응, 페리시클릭 반응, 광화학 반응, 산화환원 반응, 라디칼 반응, 카빈 중간체를 통한 반응, 치환 반응이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 활성화된 생체분자는 반응성 연결 화학을 통해 활성화된 표지에 컨쥬게이트될 수 있으며, 예컨대 반응성 링커 쌍은: 말레이미드/티올; 티올/티올; 피리딜디티올/티올; 석시니미딜 요오도아세테이트/티올; N-석시니미딜에스테르(NHS 에스테르), 설포디클로로페놀 에스테르(SDP 에스테르), 또는 펜타플루오로페닐-에스테르(PFP 에스테르)/아민; 비스석시니미딜에스테르/아민; 이미도에스테르/아민; 히드라진 또는 아민/알데히드, 디알데히드 또는 벤즈알데히드; 이소시아네이트/히드록실 또는 아민; 탄수화물-페리오데이트/히드라진 또는 아민; 디아지린/아릴 아지드 화학; 피리딜디티올/아릴 아지드 화학; 알킨/아지드; 카르복시-카르보디이미드/아민; 아민/설포-SMCC(설포석시니미딜 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트)/티올 및 아민/BMPH(N-[β-말레이미도프로피온산]히드라지드.TFA)/티올; 아지드/트리아릴포스핀; 니트론/시클로옥틴; 아지드/테트라진 및 포르밀벤즈아미드/히드라지노-니코틴아미드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
활성화된 생체분자 및 활성화된 표지를 각각의 개별적인 반응성 링커 간에 화학적 연결(예를 들어, 공유결합)을 형성하기에 충분한 기간 동안 접촉시킨 후, 표지된 생체분자는 예컨대 미세추출, 겔 전기영동, 액체-액체 추출, 원심분리, 침전, 수동 또는 능동 투석, 또는 고체상 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있으며, 기타 정제 프로토콜들 중, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 정지상 컬럼, 크기 배제 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 및 제조용 박막 크로마토그래피, 한외여과(컷 오프를 갖는 막 필터)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
방법은 제조된 표지된 생체분자 시약의 분석을 또한 포함할 수 있다.
분석된다는 의미는 표지된 생체분자 시약의 화학 조성물을 특성화하는 것을 의미하며, 이는 제조된 시약 조성물 내 화합물 및 임의의 존재하는 불순물의 양 및 유형을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 제조된 표지된 생체분자 시약의 분석은, 예를 들어, 물리적 분석(예를 들어, 질량 분석, 밀도 분석, 부피 분석 등) 질량 분광분석(예를 들어, TOF 질량 분광분석, 유도결합 플라즈마 질량 분광분석), 질량 세포분석기, 흡광 분광법, 형광 분광법, 전도도 분석, 적외선 분광법, UV-가시광선 분광법, 색채계, 원소 분석 및 핵자기 공명 분광법과 같은 임의의 편리한 프로토콜을 이용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자의 분석은 질량 분광분석에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자의 분석은 형광 분광법에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자의 분석은 가스 크로마토그래피에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자의 분석은 액체 크로마토그래피에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자의 분석은 원소 분석에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약의 분석은 가스 크로마토그래피-질량 분광분석에 의해 수행된다. 다른 구현예에서, 표지된 생체분자 시약의 분석은 액체 크로마토그래피-질량 분광분석에 의해 수행된다. 예를 들어, 장치는 분석 분리 디바이스, 예컨대 액체 크로마토그래피(LC)를 포함할 수 있으며, 이에는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 신속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC), 마이크로- 또는 나노-액체 크로마토그래피 또는 초고압 액체 크로마토그래피(UHPLC) 디바이스, 모세관 전기영동(CE), 또는 모세관 전기영동 크로마토그래피(CEC) 장치가 있다. 그러나, 임의의 수동 또는 자동화된 주입 또는 분주 펌프 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 샘플은 일부 구현예에서 나노펌프 또는 마이크로펌프를 사용함으로써 LC-MS 시스템에 적용될 수 있다. 질량 분석계 시스템은 임의의 편리한 질량 분광분석 시스템일 수 있으며, 이는 일반적으로 샘플의 이온화를 위한 이온 공급원, 이온 분리를 위한 질량 분석기, 및 이온을 검출하기 위한 검출기를 함유한다. 일부 구현예에서, 질량 분석계는 전구체 이온을 단리하고, 전구체 이온을 단편화하고, 단편화된 전구체 이온을 분석할 수 있는 소위 "탠덤" 질량 분석계일 수 있다. 이온 공급원은 임의의 유형의 이온화 방법에 따라 달라질 수 있으며, 전자분무 이온화(ESI), 대기압 화학 이온화(APCI), 전자 충격(EI), 대기압 광이온화(APPI), 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화(MALDI) 또는 유도결합 플라즈마(ICP) 이온화, 예를 들어, 또는 이들의 임의의 조합(소위 "다중모드" 이온화 공급원을 제공)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일 구현예에서, 전구체 이온은 EI, ESI 또는 MALDI에 의해 제조될 수 있으며, 선택된 전구체 이온은 충돌에 의해 또는 광자를 이용하여 단편화되어 이후에 분석되는 생성 이온을 생성할 수 있다. 이와 같이, 임의의 다양한 상이한 질량 분석기들이 사용될 수 있으며, 이는 타임 오브 플라이트(TOF), 푸리에 변환 이온 시클로트론 공명(FTICR), 이온 포획, 사중극자 또는 쌍극자 포커싱 자석 전기 섹터 질량 분석기, 또는 이들의 임의의 혼성을 포함한다. 일 구현예에서, 질량 분석기는 섹터, 전송 사중극자, 또는 타임 오브 플라이트 분석기일 수 있다.
표지된 생체분자 시약의 제조(뿐만 아니라, 원하는 경우, 정제 및 분석) 후, 각각의 제조된 표지된 생체분자 시약은 표지된 생체분자 요청에 따른 포장 및 전달(즉, 표지된 생체분자 요청을 발생시킨 사용지에게로 수송)을 위해 용기 내로 로딩될 수 있다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약은 제조되고, 활성화된 생체분자를 활성화된 표지와 접촉시키는 데 사용되는 용기 내에서, 사용자에게 전달된다. 예를 들어, 표지된 생체분자 시약은 활성화된 생체분자를 활성화된 표지와 접촉하는 데 사용되는 마이크로튜브 내에 포장되고 전달될 수 있다. 방법은 포장된 표지된 생체분자 시약을 요청자에게, 예컨대 우편에 의해 전달하는 단계를 포함할 수도 있다.
제조된 표지된 생체분자 시약은 예컨대 표지된 생체분자 시약을 이용하거나 저장하기 위한 다른 구성요소들로 포장될 수 있으며, 이는 버퍼, 주사기, 바늘, 마이크로피펫, 유리 슬라이드, 건조제 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 추가적으로, 포장된 표지된 생체분자 시약은 표지된 생체분자 시약을 저장 및 이용하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 설명서는 적합한 기록 매체 상에 기록될 수 있으며, 예컨대 종이 또는 플라스틱 등 위에 인쇄될 수 있다. 설명서는 용기의 표지에서와 같이 포장 삽입물로 존재할 수 있다. 다른 구현예에서, 설명서는 적합한 컴퓨터 판독 저장 매체, 예를 들어, CD-ROM, SD 카드, USB 드라이브 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 제시될 수 있다. 또 다른 구현예에 있어서, 실질적인 설명서는 포장 내에 존재하지 않지만, 예를 들어, 인터넷을 통해, 원격 출처로부터 설명서를 수득하기 위한 수단이 제공된다. 이러한 구현예의 예는, 설명서가 나타날 수 있고/있거나 그로부터 설명서가 다운로드될 수 있는 웹 주소를 갖는 종이 또는 플라스틱 삽입물이다.
표지된 생체분자 시약의 요청 및 수신 방법
본 개시 내용의 양태는 표지된 생체분자 시약을 요청 및 수신하기 위한 방법을 또한 포함한다. 일부 구현예에 따른 방법은: 1) 표지된 생체분자 요청; 및 2) 생체분자 요청 및 표지 요청 중 하나 이상을 포함하는 표지된 생체분자 요청인, 표지된 생체분자 시약에 대한 요청을 전달하는 단계, 및 표지에 공유결합된 생체분자를 포함하는 표지된 생체분자 시약을 수신하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 표지 요청은 효소 요청 및 기질 요청을 포함한다. 본 방법의 실시에 있어서, 표지된 생체분자 요청은 임의의 편리한 통신 프로토콜에 의해 통신될 수 있으며, 이는 전화, 팩시밀리, 전자 메일 또는 우편을 통해 표지된 생체분자 요청을 통신하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 요청은 표지된 생체분자 시약 요청을 컴퓨터 상, 예컨대 인터넷 웹사이트 상에서 사용자 그래픽 인터페이스로 입력함으로써 통신된다.
일부 구현예에서, 생체분자는 폴리펩티드, 핵산, 폴리사카라이드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 핵산은 올리고뉴클레오티드, DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리펩티드는 단백질, 효소 또는 단백질 결합 시약일 수 있다. 단백질 결합 시약은 항체, 압타머, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 표지와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약은 복수의 단백질 표적들 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 단백질 표적들은 세포-표면 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 복수의 단백질 표적들은 예를 들어, 10 내지 400 개의 상이한 단백질 표적을 포함할 수 있다. 생체분자는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 생체분자로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 생체분자에 대한 고유 식별자를 포함한다. 고유 식별자는 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 고유 식별자는 고유 식별자의 다양한 세트로부터 선택될 수 있다. 고유 식별자의 다양한 세트는 적어도 100, 1,000, 또는 10,000 개의 상이한 고유 식별자를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 10, 100, 또는 1,000 개의 상이한 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열)로부터 선택된 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 생체분자에 컨쥬게이트된다. 올리고뉴클레오티드는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 기를 포함할 수 있다. 화학 기는 생체분자에 가역적으로 부착될 수 있다. 화학 기는 UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
고유 식별자는 샘플의 유전체 서열에 대해 상동성이 아닐 수 있다. 샘플은 단일 세포, 복수의 세포들, 조직, 종양 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 샘플은 포유동물 샘플, 세균 샘플, 바이러스 샘플, 효모 샘플, 균류 샘플, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열(예를 들어, 분자 표지 서열), 폴리(A) 테일, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
하나 이상의 표지된 생체분자 시약 요청은 통신될 수 있으며, 예컨대 2 이상의 표지된 생체분자 시약 요청, 예컨대 5 이상, 예컨대 10 이상, 및 25 이상을 포함하는 표지된 생체분자 시약 요청이 통신될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 단일 생체분자 요청 및 단일 표지 요청을 포함하는 표지된 생체분자 시약 요청의 통신을 포함한다. 다른 구현예에서, 표지된 생체분자 시약 요청은 단일한 생체분자 요청 및 복수의 표지 요청들을 포함한다. 다른 구현예에서, 표지된 생체분자 시약 요청은 복수의 생체분자 요청들 및 단일 표지 요청을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표지된 생체분자 요청은 복수의 생체분자 요청들 및 복수의 표지 요청들을 포함한다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약 요청은 하나 이상의 표지된 생체분자 요청을 포함한다. 일부 구현예에서, 표지 요청은 효소 요청 및 기질 요청이다.
일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약 요청은 사용자 그래픽 인터페이스 상에, 예컨대 인터넷 웹사이트 상에 요청을 입력함으로써 통신된다. 그래픽 사용자 인터페이스는 표지된 생체분자, 활성화된 생체분자, 생체분자, 활성화된 표지, 표지 및 반응성 링커 각각의 데이터베이스의 전부 또는 일부를(예를 들어, 카달로그) 디스플레이할 수 있다. 데이터베이스로부터의 각각의 카테고리는 리스트, 드롭-다운 메뉴 또는 기타 구성으로서 디스플레이될 수 있다. 표지된 생체분자 시약 요청은 생체분자 및 표지와 연관된 정보 또는 데이터를 적절한 문자 필드 내로 입력하거나, 체크 박스를 선택하거나 드롭-다운 메뉴로부터 하나 이상의 아이템을 선택하거나, 이들의 조합을 이용함으로써 도입될 수 있다.
일 예에서, 표지된 생체분자 시약 요청은 드롭-다운 메뉴로부터 표지된 생체분자를 선택함으로써 사용자 그래픽 인터페이스 내로 입력된다. 또 다른 예에서, 표지된 생체분자 시약 요청은 제1 드롭-다운 메뉴로부터 하나 이상의 생체분자 및 제2 드롭-다운 메뉴로부터 하나 이상의 표지를 선택함으로써 사용자 그래픽 인터페이스 내로 입력된다. 또 다른 예에서, 표지된 생체분자 시약 요청은 제1 드롭-다운 메뉴로부터 하나 이상의 생체분자, 제2 드롭-다운 메뉴로부터 하나 이상의 표지 및 제3 드롭-다운 메뉴로부터 하나 이상의 반응성 링커를 선택함으로써 사용자 그래픽 인터페이스 내로 입력된다.
표지된 생체분자 시약 요청을 입력하기 위해, 특정 표지된 생체분자, 생체분자, 또는 표지와 연관된 정보 또는 데이터를 사용자 그래픽 인터페이스 상에 도입한다. 입력된 정보 또는 데이터는 일련의 하나 이상의 기호(예를 들어, 문자숫자 기호), 부호, 이미지 또는 기타 그래픽적 표현(들)의 표지된 생체분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자, 생체분자, 표지, 활성화된 생체분자, 활성화된 표지 또는 반응성 링커의 "단축형" 명칭 또는 다른 적합한 식별자가 입력된다. 예를 들어, 생체분자의 이름, 표지 서열, 상승 번호, 서열 식별 번호, 약기된 프로브 서열, 화학 구조 또는 화학 초록 서비스(CAS) 등록 번호가 입력될 수 있다.
일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약은 폴리펩티드를 포함하고, 요청은 정보, 예컨대 폴리펩티드명, 단백질명, 효소명, 항체명 또는 단백질, 효소 또는 그의 항체 단편의 이름, 특정 생물학적 유체로부터의 것인 폴리펩티드(예를 들어, 혈액, 점액, 림프액, 활액, 뇌척수액, 타액, 기관지폐포세척, 양수, 제대혈, 소변, 질액 및 정액), 특정 종으로부터의 것인 폴리펩티드(예를 들어, 마우스 단클론성 항체) 및 아미노산 서열 식별 수를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약은 생물학적 프로브를 포함하고, 요청은 특정 결합 도메인과 연결된 정보 또는 데이터를 포함한다.
다른 구현예에서, 표지된 생체분자 시약은 핵산을 포함하고, 요청은 정보, 예컨대 올리고뉴클레오티드명, 유전자명에 의해 식별된 올리고뉴클레오티드, 접수 번호, 특정 종(예를 들어, 마우스, 인간)들로부터의 유전자의 올리고뉴클레오티드, 특정 조직(예를 들어, 간, 뇌, 심장)과 연관된 유전자의 올리고뉴클레오티드, 특정 생리학적 작용(예를 들어, 아포토시스, 스트레스 반응)과 연관된 유전자의 올리고뉴클레오티드, 특정 질병 상태(예를 들어, 암, 심혈관 질환)와 연관된 올리고뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 표지된 생체분자를 요청하는 방법은 추가로 표지된 생체분자 요청에 관련된 질문표 또는 조사를 완료하는 단계를 추가로 포함한다. 이들 구현예에서, 표지된 생체분자의 요청기는 일련의 질문으로 또는 표지된 생체분자 요청에 관련된 질문표 또는 조사의 형태로 자극된다. 예를 들어, 질문표 또는 조사는, 표지된 생체분자 요청과 관련된 하나의 질문, 예컨대 2 이상의 질문, 예컨대 3 이상의 질문, 예컨대 4 이상의 질문, 및 5 이상을 포함하는 질문을 포함할 수 있다. 질문표 또는 조사의 내용은 요구되는 정보에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 질문표 또는 조사에서의 질문은, 요청자의 시약 재고의 내용, 표지된 생체분자를 이용하여 수행된 실험유형 및 표지된 생체분자 시약의 이용의 타이밍을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 질문은 또한 입력을 위한 하나 이상의 열린 문자 필드도 포함할 수 있다. 예를 들어, 질문은 열린 문자 피드백 형태일 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 요청자가 표지된 생체분자 요청이 통신되기 전에 일련의 질문 또는 조사를 완료하도록 유도하는 단계(예를 들어, 사용자 그래픽 인터페이스 내로 입력함)를 포함한다. 다른 구현예에서, 방법은 요청자가 표지된 생체분자 요청이 완료된 후 일련의 질문 또는 조사를 완료하도록 유도하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 요청자는 표지된 생체분자 요청의 동시 통신과 함께, 표지된 생체분자 요청에 관련된 질문을 이용하여 유도될 수 있다. 예를 들어, 방법은 요청자를 표지된 생체분자 요청을 통신할 때, 표지된 생체분자의 특이적 용도(예를 들어, 수행되는 실험)에 대한 질문을 이용하여 유도하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 완료된 일련의 질문 또는 조사는 설계 플랫폼에 의해 사용되어 하나 이상의 표지된 생체분자, 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 또는 반응성 링커에 대한 추천을 제공할 수 있다. 예를 들어, 질문 또는 조사에 대한 답은 설계 플랫폼에 의해 사용되어, 특정 분석 기기(예를 들어, 유세포분석기, 형광 분광계)를 이용한 용도에 최적인, 또는 표지된 생체분자의 의도된 적용에 최적인 표지된 생체분자, 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 또는 반응성 링커를 추천할 수 있다. 설계 플랫폼은, 일부 구현예에서, 완전한 일련의 질문 또는 조사에 대한 답을 이용하여, 표적 밀도(예를 들어, 세포에 대한 항원 밀도)를 기준으로 한, 표지된 생체분자, 생체분자, 활성화된 생체분자, 표지, 활성화된 표지 또는 반응성 링커에 대한 추천을 제공하도록 구성된다.
일련의 질문 또는 조사에 대한 답은 표지된 생체분자 요청을 전달하는 데 사용되는 바와 같이 동일하거나 상이한 프로토콜(예를 들어, 전화, 팩스, 이메일, 자립 스테이션에서 사용자 그래픽 인터페이스, 인터넷을 통한 사용자 그래픽 인터페이스)을 이용하여 통신될 수 있다. 예를 들어, 표지된 생체분자인 경우, 요청은 인터넷을 통해 사용자 그래픽 인터페이스를 통해 통신되고, 일련의 질문에 대한 해답이 또한 사용자 그래픽 인터페이스를 통해, 예컨대 드롭 다운 메뉴 또는 문자 필드를 이용하여 입력될 수 있다.
본 개시 내용의 구현예에 따른 방법은 표지된 생체분자 시약를 수신하는 단계를 또한 포함한다. 표지된 생체분자 시약은, 예컨대 조성물을 이용 또는 저장하기 위하여, 용기 내에 수신되어 로딩될 수 있고, 하나 이상의 보조 구성요소와 함께 포장될 수 있다. 일부 구현예에서, 표지된 생체분자 시약은 버퍼, 주사기, 바늘, 마이크로피펫, 유리 슬라이드, 건조제 등과 함께 수신된다. 포장된 표지된 생체분자 시약은 표지된 생체분자 시약의 저장 및 이용에 대한 설명서, 예컨대 종이 상, 플라스틱 또는 컴퓨터 판독가능 매체(예를 들어, CD-ROM, SD-카드, USB 드라이버) 상에 인쇄된 설명서 또는 인터넷 상에서 원격 출처로부터 본 조성물의 저장 및 이용에 대한 설명서를 검색하기 위한 설명서를 제공하는 삽입물로서 함께 수신될 수도 있다.
복수의 활성화된 생체분자들 및 복수의 활성화된 표지들을 함유하는 저장소
본 개시 내용의 양태는 복수의 활성화된 생체분자들 및 복수의 활성화된 표지들을 함유하는 저장소를 또한 포함한다. 상기에서 상세히 논의된 바와 같이, 본 표지된 생체분자 시약은 활성화된 생체분자(예를 들어, 활성화된 단백질 결합 시약, 단백질 결합 시약은 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있음)를 활성화된 표지(예를 들어, 활성화된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드는 그와 컨쥬게이트된 단백질 결합 시약에 대한 고유 식별자를 포함함)과 접촉시킴으로써 제조된다. 일부 구현예에서, 저장소 내 활성화된 생체분자는 반응성 링커에 커플링된 폴리펩티드, 핵산, 폴리펩티드 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 저장소 내 활성화된 생체분자는, 프로브가 관심 대상의 피분석물에 대한 특이적 결합 도메인을 포함하는 반응성 링커에 커플링되는 생물학적 프로브로, 예컨대 항체 결합제, 단백질, 펩티드, 합텐, 핵산 등이다. 활성화된 표지는 예를 들어, 형광 방출 흡광도, 형광 분극화, 형광 수명, 형광 파장, 최대 흡광도, 흡광도 파장, 스토크스 시프트(Stokes shift), 광 산란기, 질량, 분자 질량, 산화환원, 음향, 라만, 자성, 무선 주파수, 효소 반응(화학발광 및 전기-화학발광 포함) 또는 이들의 조합에 기초하여 검출가능한 마커 화합물이다. 예를 들어, 표지는 형광단, 발색단, 효소, 효소 기질, 촉매, 산화환원 표지, 방사성표지, 음향 표지, 라만(SERS) 태그, 질량 태그, 동위원소 태그(예를 들어, 동위원소적으로 순수한 희토류 원소), 자석 입자, 마이크로입자, 나노입자, 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 저장소 내 활성화된 표지는 반응성 링커에 커플링된 형광단이다. 관심 대상의 형광단은 분석적 적용(예를 들어, 유세포 분석, 이미징 등)에서의 이용에 적합한 염료, 예컨대 아크리딘 염료, 안트라퀴논 염료, 아릴메탄 염료, 디아릴메탄 염료(예를 들어, 디페닐 메탄 염료), 엽록소 함유 염료, 트리아릴메탄 염료(예를 들어, 트리페닐메탄 염료), 아조 염료, 디아조늄 염료, 니트로 염료, 니트로소 염료, 프탈로시아닌 염료, 시아닌 염료, 비대칭 시아닌 염료, 퀴논-이민 염료, 아진 염료, 유로딘 염료, 사프라닌 염료, 인다민, 인도페놀 염료, 플루오린 염료, 옥사진 염료, 옥사존 염료, 티아진 염료, 티아졸 염료, 잔텐 염료, 플루오렌 염료, 피로닌 염료, 플루오린 염료, 로다민 염료, 페난트리딘 염료, 뿐 아니라 상기 언급된 염료들 중 둘 이상을 (예를 들어, 나란히) 조합한 염료, 및 하나 이상의 단량체성 염료 단위를 갖는 중합체성 염료 및 이들의 둘 이상의 혼합물을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 형광단은 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'디설폰산; 아크리딘 및 유도체, 예컨대 아크리딘, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 옐로우, 아크리딘 레드, 및 아크리딘 이소티오시아네이트; 알로피코시아닌, 피코에리트린, 페리디닌-엽록소 단백질, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS); 4-아미노-N-[3-비닐설포닐)페닐]나프탈이미드-3,5 디설포네이트(루시퍼 옐로우 VS); N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드; 안트라닐아미드; 브릴리언트 옐로우; 쿠마린 및 유도체 예컨대 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿨루아린(쿠마린 151); 시아닌 및 유도체 예컨대 시아노신, Cy3, Cy5, Cy5.5, 및 Cy7; 4',6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI); 5',5"-디브로모피로갈롤-설포네프탈레인(브로모피로갈롤 레드); 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)-4-메틸쿠마린; 디에틸아미노쿠마린; 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트; 4,4'-디이소티오시아네이토디하이드로-스틸벤-2,2'-디설폰산; 4,4'-디이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디설폰산; 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-설포닐 클로라이드(DNS, 단실 클로라이드); 4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL); 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소티오시아네이트(DABITC); 에오신 및 유도체, 예컨대 에오신 및 에오신 이소티오시아네이트; 에리트로신 및 유도체 예컨대 에리트로신 B 및 에리트로신 이소티오시아네이트; 에티디움; 플루오레세인 및 유도체 예컨대 5-카르복시플루오레세인(FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인(DTAF), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인(JOE), 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레세인 클로로트리아지닐, 나프토플루오레세인, 및 QFITC(XRITC); 플루오레스카민; IR144; IR1446; 녹색 형광 단백질(GFP); 초산호 형광 단백질(RCFP); 리사민TM; 리사민 로다민, 루시퍼 옐로우; 말라카이트 그린 이소티오시아네이트; 4-메틸움벨리페론; 오르토 크레졸프탈레인; 니트로티로신; 파라로사닐린; 나일 레드; 오레곤 그린; 페놀 레드; B-피코에리트린; o-프탈디알데히드; 피렌 및 유도체, 예컨대 피렌, 피렌 부티레이트 및 석신이미딜 1-피렌 부티레이트; 리액티브 레드 4(CibacronTM브릴리언트 레드 3B-A); 로다민 및 유도체, 예컨대 6-카르복시-X-로다민(ROX), 6-카르복시로다민(R6G), 4,7-디클로로로다민 리사민, 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민(Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체(텍사스 레드), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA), 테트라메틸 로다민, 및 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트(TRITC); 리보플라빈; 로졸산 및 터븀 킬레이트 유도체; 잔텐; 염료-컨쥬게이트된 중합체(즉, 중합체-부착된 염료), 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란 및 상기 언급된 둘 이상의 염료를 (예를 들어, 나란히) 조합한 염료, 하나 이상의 단량체성 염료 단위를 갖는 중합체성 염료 및 상기 언급된 염료의 둘 이상의 혼합물일 수 있다.
일부 구현예에서, 형광단(즉, 염료)은 형광 중합체성 염료이다. 방법 및 시스템에서의 용도를 갖는 형광 중합체성 염료는 다양하다. 방법의 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 컨쥬게이트된 중합체를 포함한다.
컨쥬게이트된 중합체(CP)는 비편재화된 전자 구조를 특징으로 하며, 교대로 불포화 결합(예를 들어, 이중 및/또는 삼중 결합) 및 포화 결합(예를 들어, 단일 결합)의 주쇄를 포함하고, 여기서 π-전자는 하나의 결합에서 다른 하나로 이동할 수 있다. 그와 같이, 컨쥬게이트된 주쇄는, 중합체의 반복 단위 사이에서 제한된 결합 각으로, 연장된 선형 구조를 중합체성 염료에 부여할 수 있다. 예를 들어, 중합체성이기는 하지만, 단백질 및 핵산은, 일부 경우 연장된-막대 구조를 형성하기보다는 더욱 고차원의 삼차원 형태로 접힌다. 추가적으로, CP는 "단단한-막대" 중합체 주쇄를 형성할 수 있고, 중합체 주쇄 사슬을 따라 단량체 반복 단위간에 제한된 꼬임(예를 들어, 비틀림)을 겪는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 단단한 막대 구조를 갖는 CP를 포함한다. 상기 요약된 바와 같이, 중합체성 염료의 구조적 특성은 분자의 형광 특성에 대한 영향을 미칠 수 있다.
임의의 편리한 중합체성 염료가 본 발명의 방법 및 시스템에서 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 중합체성 염료는 형광단의 형광 출력을 증폭시키기 위해 집광할 수 있는 구조를 갖는 다중 발색단이다. 일부 경우에서, 중합체성 염료는 집광가능하고, 이를 더욱 긴 파장에서 방사된 광으로 전환가능하다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 에너지를 가까운 발광 화학종(예를 들어, "신호 발색단")으로 효율적으로 전달할 수 있는 집광 다중 발색단을 갖는다. 에너지 전달의 메커니즘은, 예를 들어, 공명 에너지 전달(예를 들어, 포스터 (또는 형광) 공명 에너지 전달, FRET), 양자 하전 교환(덱스터 에너지 전달) 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 에너지 전달 메커니즘은 상대적으로 짧은 범위이다; 즉, 신호 발색단에 대한 집광 다중 발색단 시스템의 인접이 에너지 전달을 위해 제공된다. 효율적인 에너지 전달을 위한 조건 하에서, 신호 발색단으로부터의 방출의 증폭은, 집광 다중 발색단 시스템에서 개별적인 발색단의 수가 큰 경우 발생한다; 즉, 신호 발색단으로부터의 방출은, 입사광("여기광")이 집광 다중 발색단 시스템에 의해 흡수된 파장인 경우, 신호 발색단이 펌프 광에 의해 직접 여기된 경우보다 더욱 강하다.
다중 발색단은 컨쥬게이트된 중합체일 수 있다. 컨쥬게이트된 중합체(CP)는 비편재화된 전자 구조를 특징으로 하며, 화학 및 생물학적 표적에 대한 고반응성 광학 리포터로서 사용될 수 있다. 효과적인 컨쥬게이션 길이는 중합체 사슬의 길이보다 실질적으로 짧기 때문에, 주쇄는 근접하여 있는 다수의 컨쥬게이트된 절편을 함유한다. 이에 따라, 컨쥬게이트된 중합체는 집광에 효율적이며, 에너지 전달을 통한 광학 증폭을 가능하게 한다.
일부 경우에, 중합체, 예를 들어, 높은 흡광 계수, 고휘도 등을 갖는 형광 중합체가 직접적인 형광 리포터로서 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 중합체는 색상 또는 색상 또는 광학 밀도가 지표로서 사용되는 경우 강한 발색단으로서 사용될 수 있다.
관심 대상의 중합체성 염료는, 그 개시 내용이 전체로서 본 명세서에 참고문헌으로서 포함된, Gaylord 등의 US 특허 공개 20040142344, 20080293164, 20080064042, 20100136702, 20110256549, 20120028828, 20120252986, 및 20130190193호에 기재된 염료들; 및 그 개시 내용이 전체로서 본 명세서에 참고문헌으로서 포함된, 문헌[Gaylord et al., J. Am. Chem. Soc., 2001, 123 (26), pp 6417-6418; Feng et al., Chem. Soc. Rev., 2010,39, 2411-2419]; 및 문헌[Traina et al., J. Am. Chem. Soc., 2011, 133(32), pp 12600-12607]을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 중합체성 염료는 제1 광학 활성 단위가 광을 흡수하여 여기 상태를 형성하는 제1 흡수 파장(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)을 갖는 컨쥬게이트된 시스템을 형성하는 복수의 제1 광학 활성 단위들을 포함하는 컨쥬게이트된 중합체를 포함한다. 컨쥬게이트된 중합체(CP)는 다중 양이온성, 다중 음이온성 및/또는 중성-하전 컨쥬게이트된 중합체일 수 있다.
CP는 생물학적 샘플에서의 사용을 위해 수용성일 수 있다. 증가된 수용성을 제공하기 위해, 임의의 편리한 치환기, 예컨대 친수성 치환기, 예를 들어, 친수성 중합체, 또는 예를 들어, 생리학적 조건 하에서 하전된 치환기, 예를 들어, 수용액에서 양으로 또는 음으로 하전된 기가 중합체성 염료 내에 포함될 수 있다. 임의의 편리한 수용성 기(WSG)가 본 발명의 집광 다중 발색단에 사용될 수 있다. 용어 "수용성 기"는 수성 환경에서 잘 용매화되고, 그가 부착되는 분자에 개선된 수용해도를 부여하는 작용기를 지칭한다. 일부 구현예에서, WSG는, WSG를 결여한 다중 발색단에 비해, 주로 수성인 용액(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)에서 다중 발색단의 용해도를 증가시킨다. 수용성 기는 수성 환경 내에서 잘 용매화되는 임의의 편리한 친수성 기일 수 있다. 일부 구현예에서, 친수성 수용성 기는 예를 들어, 양으로 또는 음으로 또는 양쪽성으로 하전된다. 일부 구현예에서, 친수성 수용성 기는 중성 친수성 기이다. 일부 구현예에서, WSG는 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 셀룰로스, 키토산, 또는 이들의 유도체이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "폴리에틸렌 산화물", "PEO", "폴리에틸렌 글리콜" 및 "PEG"는 서로 교환가능하게 사용되고, 화학식 -(CH2-CH2-O-)n- 또는 이의 유도체로 설명되는 사슬을 포함하는 중합체를 지칭한다. 일부 구현예에서, "n"은 5000 이하, 예컨대 1000 이하, 500 이하, 200 이하, 100 이하, 50 이하, 40 이하, 30 이하, 20 이하, 15 이하, 예컨대 5 내지 15, 또는 10 내지 15이다. PEG 중합체는 임의의 편리한 길이일 수 있으며, 알킬, 아릴, 히드록실, 아미노, 아실, 아실옥시 및 아미도 말단 기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 다양한 말단기를 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 다중 발색단에서의 이용에 적합화될 수 있는 작용화된 PEG는 문헌[S. Zalipsky in "Functionalized Poly(ethylene glycol) for preparation of biologically relevant conjugates", Bioconjugate Chemistry 1995, 6 (2), 150-165]에 의해 설명된 PEG들을 포함한다. 관심 대상의 수용성 기는, 카르복실레이트, 포스포네이트, 포스페이트, 설포네이트, 설페이트, 설피네이트, 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 변경된 PEG, 히드록실, 아민, 암모늄, 구아니디늄, 폴리아민 및 설포늄, 폴리알콜, 직쇄 또는 시클릭 당류, 1차, 2차, 3차, 또는 4차 아민 및 폴리아민, 포스포네이트 기, 포스피네이트 기, 아스코르베이트 기, 글리콜을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 폴리에테르, -COOM', -SO3M', -PO3M', -NR3 +, Y', (CH2CH2O)pR 및 이들의 혼합물을 포함하며, 여기서 Y'는 임의의 할로겐, 설페이트, 설포네이트, 또는 산소 함유 음이온일 수 있고, p는 1 내지 500일 수 있고, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 알킬(예컨대 메틸)일 수 있고, M'는 양이온 또는 수소, -(CH2CH2O)yyCH2CH2XRyy, -(CH2CH2O)yyCH2CH2X-, -X(CH2CH2O)yyCH2CH2-, 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜일 수 있으며, 식에서 yy는 1 내지 1000으로부터 선택되고, X는 O, S, 및 NRZZ으로부터 선택되고, RZZ 및 RYY는 H 및 C1-3 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
중합체성 염료는 임의의 편리한 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료의 단량체성 반복 단위 또는 절편의 특정 수는 2 내지 500,000, 예컨대 2 내지 100,000, 2 내지 30,000, 2 내지 10,000, 2 내지 3,000 또는 2 내지 1,000 단위 또는 절편 또는 예컨대 100 내지 100,000, 200 내지 100,000, 또는 500 내지 50,000 단위 또는 절편의 범위 내에 속할 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료의 단량체성 반복 단위 또는 절편의 수는 2 내지 1000 단위 또는 절편, 예컨대 2 내지 750 단위 또는 절편, 예컨대 2 내지 500 단위 또는 절편, 예컨대 2 내지 250 단위 또는 절편, 예컨대 2 내지 150 단위 또는 절편, 예컨대 2 내지 100 단위 또는 절편, 예컨대 2 내지 75 단위 또는 절편, 예컨대 2 내지 50 단위 또는 절편의 범위 내에 있으며, 2 내지 25 단위 또는 절편을 포함한다.
중합체성 염료는 임의의 편리한 분자량(MW)일 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료의 MW는 평균 분자량으로 표시될 수 있다. 일부 경우에서, 중합체성 염료는 500 내지 500,000, 예컨대 1,000 내지 100,000, 2,000 내지 100,000, 10,000 내지 100,000의 평균 분자량을 갖거나, 심지어는 50,000 내지 100,000의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 70,000의 평균 분자량을 갖는다.
중합체성 염료는 하나 이상의 바람직한 분광학적 특성을 가질 수 있고, 예컨대 특정 최대 흡수 파장, 특정 최대 방출 파장, 흡광 계수, 양자 수율 등이 있다.
일부 구현예에서, 중합체성 염료는 280 내지 850 nm 사이에서 흡수 곡선을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 280 내지 850 nm 범위 내 최대 흡수를 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 280 내지 850 nm 범위의 파장을 갖는 입사광을 흡수하고, 관심 대상의 최대 흡수의 특정 예는: 348 nm, 355 nm, 405 nm, 407 nm, 445 nm, 488 nm, 640 nm 및 652 nm를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 280 내지 310 nm, 305 내지 325 nm, 320 내지 350 nm, 340 내지 375 nm, 370 내지 425 nm, 400 내지 450 nm, 440 내지 500 nm, 475 내지 550 nm, 525 내지 625 nm, 625 내지 675 nm, 및 650 내지 750 nm로 이루어진 군으로부터 선택되는 범위 내에서 최대 흡수 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 348 nm의 최대 흡수 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 355 nm의 최대 흡수 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 405 nm의 최대 흡수 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 407 nm의 최대 흡수 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 445 nm의 최대 흡수 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 488 nm의 최대 흡수 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 640 nm의 최대 흡수 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 652 nm의 최대 흡수 파장을 갖는다.
일부 구현예에서, 중합체성 염료는 400 내지 850 nm, 예컨대 415 내지 800 nm 범위의 최대 방출 파장을 갖고, 관심 대상의 최대 방출 파장의 특정 예는: 395 nm, 421 nm, 445 nm, 448 nm, 452 nm, 478 nm, 480 nm, 485 nm, 491 nm, 496 nm, 500 nm, 510 nm, 515 nm, 519 nm, 520 nm, 563 nm, 570 nm, 578 nm, 602 nm, 612 nm, 650 nm, 661 nm, 667 nm, 668 nm, 678 nm, 695 nm, 702 nm, 711 nm, 719 nm, 737 nm, 785 nm, 786 nm, 805 nm를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 380 내지 400 nm, 410 내지 430 nm, 470 내지 490 nm, 490 내지 510 nm, 500 내지 520 nm, 560 내지 580 nm, 570 내지 595 nm, 590 내지 610 nm, 610 내지 650 nm, 640 내지 660 nm, 650 내지 700 nm, 700 내지 720 nm, 710 내지 750 nm, 740 내지 780 nm, 및 775 내지 795 nm로 이루어진 군으로부터 선택되는 범위를 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 395 nm의 최대 방출을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 421 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 478 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 480 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 485 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 496 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 510 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 570 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 602 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 650 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 711 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 737 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 750 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 786 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 421 nm±5 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 510 nm±5 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 570 nm±5 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 602 nm±5 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 650 nm ± 5 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 711 nm±5 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 786 nm±5 nm의 최대 방출 파장을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 421 nm, 510 nm, 570 nm, 602 nm, 650 nm, 711 nm 및 786 nm로 이루어진 군으로부터 선택된 최대 방출 파장을 갖는다.
일부 구현예에서, 중합체성 염료는 1 x 106 cm-1M-1 이상, 예컨대 2 x 106 cm-1M-1 이상, 2.5 x 106 cm-1M-1 이상, 3 x 106 cm-1M-1 이상, 4 x 106 cm-1M-1 이상, 5 x 106 cm-1M-1 이상, 6 x 106 cm-1M-1 이상, 7 x 106 cm-1M-1 이상, 또는 8 x 106 cm-1M-1 이상의 흡광계수를 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 0.05 이상, 예컨대 0.1 이상, 0.15 이상, 이상, 0.25 이상, 0.3 이상, 0.35 이상, 0.4 이상, 0.45 이상, 0.5 이상, 0.6 이상, 0.7 이상, 0.8 이상, 0.9 이상, 0.95 이상, 0.99 이상, 0.999 이상을 포함하는 양자 수율을 갖는다. 예를 들어, 관심 대상의 중합체성 염료의 양자 수율은 0.05 내지 1, 예컨대 0.1 내지 0.95, 예컨대 0.15 내지 0.9, 예컨대 0.2 내지 0.85, 예컨대 0.25 내지 0.75, 예컨대 0.3 내지 0.7의 범위일 수 있고, 0.4 내지 0.6의 양자 수율을 포함한다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 0.1 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 0.5 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 0.6 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 0.7 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 0.8 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 0.9 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 0.95 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 1 x 106 이상의 흡광 계수 및 0.3 이상의 양자 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 중합체성 염료는 2 x 106 이상의 흡광 계수 및 0.5 이상의 양자 수율을 갖는다.
일부 구현예에서, 표지는 형광단, 발색단, 폴리펩티드, 단백질, 효소, 효소 기질, 촉매, 산화환원 표지, 방사성표지, 음향 표지, 라만(SERS) 태그, 질량 태그, 동위원소 태그, 자석 입자, 마이크로입자, 나노입자, 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 표지는 효소, 효소 기질, 또는 이들의 조합을 포함하고, 효소는 효소 기질을 상응하는 변경된 효소 기질로 변경시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 효소 기질은 적어도 하나의 작용기에 의해 상응하는 변경된 효소 기질과 상이하다. 적어도 하나의 작용기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 페닐, 벤질, 할로, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 히드록실, 카르보닐, 알데히드, 할로포르밀, 카르보네이트 에스테르, 카르복실레이트, 카르복실, 에스테르, 메톡시, 히드로퍼옥시, 퍼옥시, 에테르, 헤미아세탈, 헤미케탈, 아세탈, 케탈, 아세탈, 오르토에스테르, 메틸렌디옥시, 오르토카르보네이트 에스테르, 카르복사미드, 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 4° 암모늄, 1차 케타민, 2차 케타민, 1차 알드이민, 2차 알드이민, 이미드, 아지드, 아조, 디이미드, 시아네이트, 이소시아네이트, 니트레이트, 니트릴, 이소니트릴, 니트로소옥시, 니트로, 니트로소, 피리딜, 설프히드릴, 설피드, 디설피드, 설피닐, 설포닐, 설피노, 설포, 티오시아네이트, 이소티오시아네이트, 카르보노티온, 카르보노티알, 포스피노, 포스포노, 포스페이트, 포스포디에스테르, 보로노, 보로네이트, 보리노, 보리네이트, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 효소는 메틸트랜스퍼라제, 글리코시드 히드롤라제, 아가라제, 아미니다제, 아밀라제, 바이오시다제, 카라기나제, 셀룰라제, 세라미다제, 키티나제, 키토사나제, 시트리나제, 덱스트라나제, 덱스트리나제, 프룩토시다제, 푸코이다나제, 푸코시다제, 푸라노시다제, 갈락토시다제, 갈락투로나제, 글루카나제, 글루코시다제, 글루쿠로니다제, 글루쿠로노시다제, 글리코히드롤라제, 글리코시다제, 헥사오시다제, 히드롤라제, 이두로니다제, 이노시다제, 이눌리나제, 락타제, 레바나제, 리케니나제, 리가제, 리아제, 리소자임, 말토시다제, 말토트리오시다제, 만노비오시다제, 만노시다제, 무라미다제, 옥툴로소나제, 옥툴로소니다제, 프리메베로시다제, 프로테아제, 풀룰라나제, 람노시다제, 사미니다제, 시알리다제, 신타제, 트랜스퍼라제, 트레할라제, 투로니다제, 투로노시다제, 자일라나제, 자일로시다제, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 효소 기질은 6-메르캅토푸린, 셀로비오스, 셀로테트라오스, 자일로테트라오스, 이소프리메베로스, β-D-젠티오비오스, 자일로글루칸 및 만노트리오스, 아가로스, 아미닉산, 전분, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 셀룰로스, 세라마이드, 키틴, 키토산, 덱스트로스, 덱스트린, 프룩토스, 푸코이단, 푸코스, 푸라노시드, 갈락토시드, 글루칸, 글루코피라노시드, 글루코시드, 글루쿠론산, 글루쿠로노시드, 글리코스, 글리코시드, 글리코사미노글리칸, 헥사오시드, 이눌린, 락토스, 레바노스, 리포폴리사카라이드, 만노스, 말토시드, 말토트리오시드, 만노스, 옥툴로소네이트, 올리고사카라이드, 펙테이트, 펙틴, 펩티드, 폴리갈락투로니드, 폴리뉴클레오티드, 풀룰란, 람노시드, 자일란, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
구현예에서, 표지된 생체분자 시약 요청에 따라 표지된 생체분자 시약을 제조하기 위한 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지는 저장물로부터 수득된다. 저장물은 10 개 이상의 상이한 활성화된 생체분자, 예컨대 25 개 이상, 예컨대 50 개 이상, 예컨대 100 개 이상, 예컨대 250 개 이상, 예컨대 500 개 이상 및 1000 개 이상을 포함하는 활성화된 생체분자를 포함한다. 일 예에서, 저장물은 10 개 이상의 상이한 활성화된 올리고뉴클레오티드, 예컨대 25 개 이상, 예컨대 50 개 이상, 예컨대 100 개 이상, 예컨대 250 개 이상, 예컨대 500 개 이상 및 1000 이상을 포함하는 활성화된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 예에서, 저장소는 10 개 이상의 상이한 활성화된 폴리펩티드, 예컨대 25 개 이상, 예컨대 50 개 이상, 예컨대 100 개 이상, 예컨대 250 개 이상, 예컨대 500 개 이상 및 1000 개 이상을 포함하는 활성화된 폴리펩티드를 포함한다.
저장소는 10 개 이상의 상이한 활성화된 표지, 예컨대 15 개 이상, 예컨대 20 개 이상, 예컨대 30 개 이상, 예컨대 40 개 이상 및 50 개 이상을 포함하는 더욱 상이한 활성화된 표지를 또한 포함할 수 있다.
복수의 활성화된 생체분자들 및 활성화된 표지들의 각각은, 원하는 경우 활성화된 생체분자 또는 활성화된 표지를 저장 및 제공할 수 있는 임의의 적합한 용기 내에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 활성화된 생체분자들 및 복수의 상이한 활성화된 표지들은 별개의 시약 챔버들로 분리된 단일한 저장소 내에 저장된다. 다른 구현예에서, 복수의 상이한 활성화된 생체분자들 및 복수의 상이한 활성화된 표지들의 각각은 개별적인 용기(예를 들어, 병, 조그 등) 내에 저장된다. 또 다른 구현예에서, 복수의 상이한 활성화된 생체분자들 및 복수의 상이한 활성화된 표지들의 각각은 복수의 바이알들로 저장되고, 각각의 바이알의 활성화된 생체분자 및 각각의 활성화된 표지의 미리 측정된 분취액을 포함한다. 저장소 내의 각각의 용기는 활성화된 생체분자 또는 활성화된 표지의 구성요소(예를 들어, 생체분자, 표지 및 반응성 링커의 이름, 구조, CAS 등록 번호, 상승 번호, 프로브 서열 등)을 식별하는 표지를 포함할 수도 있다. 표지는 하나 이상의 기계 판독가능 구성요소, 예컨대 퀵 리스폰스(Quick Response: QR) 코드 또는 바코드를 포함할 수도 있다.
일부 구현예에서, 저장소는 이용가능한 활성화된 생체분자 및 활성화된 표지의 데이터베이스도 포함한다. 데이터베이스는 종이 또는 전자 형태의 인쇄된 카달로그일 수 있거나, 예컨대 키워드, 화학 구조, 상승 번호, 단량체 서열(예를 들어, 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열) 또는 CAS 화학 등록 번호에 의해 검색가능한 전자 데이터베이스일 수 있다.
이용성
본 시스템 및 방법은 복잡한 생물학적 시약(예를 들어, 검출가능한 마커에 커플링된 생물학적 거대분자)의 제조에서 용도가 있으며, 이는 일반적으로 시간 소모적이고 재정적으로 비효율적이며, 큰 규모로 수행되는 경우 이례적으로 노동 집약적인 공정. 개시 내용은 높은 품질 및 성능의 특정 생성물을 광범위한 생체 분자 및 검출가능한 표지 포트폴리오에 걸쳐 전달하는 빠르고, 효율적이며 고도로 크기조절가능한(scalable) 공정을 제공한다.
본 명세서에서 설명된 시스템 및 방법은 또한 맞춤화된 생물 시약을 요청하는 고유하고 새로운 방법을 제공한다. 광범위한 데이터베이스(예를 들어, 온라인 데이터베이스)로부터 미리 합성된 시약을 선택할 수 있음에 더하여, 본 시스템 및 방법은 사용자 맞춤화를 제공하며, 사용자는 온-디맨드로 임의의 바람직한 표지된 생체분자를 생성할 수 있다. 사용하기 쉬운 그래픽 인터페이스 상에서, 간단히 생물학적 거대분자 및 검출가능한 마커를 선택함으로써, 사용자는 다양한 상이한 연구 적용 및 의학 진단에서 사용되는, 임의의 표지된 생체분자를 요청할 수 있다.
본 개시 내용은 작은 규모의 합성에 의해 제조되는 경우, 가능하지 않은 복잡한 생물학적 시약의 큰 포트폴리오에 대한 접근을 또한 제공한다. 본 시스템 및 방법은 크기조절가능하여, 온-디맨드로, 생체분자 및 검출가능한 마커의 수천의 상이한 조합의 제조를 촉진한다. 일부 구현예에서, 본 시스템은 완전히 자동화된 프로토콜을 제공하여, 임의의 인간의 입력이 있다면, 맞춤화된 검출가능한 생체분자 프로브의 제조가 적을 것을 요구하도록 한다.
본 개시 내용은 생물학적 샘플로부터의 세포 분석이 연구, 실험실 시험 또는 또는 치료 용도에 적합할 수 있는 경우의 응용에서의 이용도 발견된다. 일부 구현예에서, 방법 및 시스템은, 암과 같이 질병에 대한 표본과 같이, 유체 또는 조직 샘플로부터 수득된 세포의 분석을 촉진할 수 있다. 본 개시 내용의 방법 및 시스템은 생물학적 샘플(예를 들어, 기관, 조직, 조직 단편, 유체)로부터의 세포를, 프로브 조성물을 이용하여 처음부터 합성하는 것에 비해, 증진된 효율 및 낮은 비용으로 분석하는 것을 또한 허용한다.
실시예
상기 논의된 구현예의 일부 양태들은 하기 실시예에서 더욱 상세히 개시되며, 이는 본 발명의 개시 내용의 범주를 어떤 방식으로든 제한하고자 하지 않는다.
실시예 1
단백질 결합 시약과의 컨쥬게이션을 위한 올리고뉴클레오티드
본 실시예는 단백질 결합 시약과 함께 컨쥬게이트될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 설계를 증명한다. 올리고뉴클레오티드는 단백질 발현 및 유전자 발현을 동시에 결정하는 데 사용될 수 있다.
95량체 올리고뉴클레오티드 설계
하기 방법을 이용하여 단백질 발현 및 유전자 발현의 동시 결정을 위한 후보 올리고뉴클레오티드 서열 및 상응하는 프라이머 서열을 생성하였다.
1. 서열 생성 및 제거
하기 방법을 이용하여 단백질 발현 및 유전자 발현의 동시 결정을 위해 후보 올리고뉴클레오티드를 생성하였다.
1a. 원하는 길이(45 bps)를 갖는 다수의 후보 서열(50,000 서열)을 랜덤 생성시킨다.
1b. 전사 조절제 LSRR 서열을 생성된 서열의 5' 말단에 첨부하고, 폴리(A) 서열을(25 bps) 생성된 서열의 3' 말단에 첨부시킨다.
1c. 40% 내지 50%의 범위에 있는 GC 함량을 갖지 않는 생성 및 첨부된 서열들은 제거한다.
1d. 각각 하나 이상의 헤어핀 구조를 갖는 잔류 서열을 제거한다.
잔류하는 후보 올리고뉴클레오티드 서열의 수는 423이었다.
2. 프라이머 설계
하기 방법을 이용하여 잔류하는 423 후보 올리고뉴클레오티드 서열에 대한 프라이머를 설계한다.
2.1 N1 프라이머: 범용 N1 서열을 사용: N1 프라이머로서GTTGTCAAGATGCTACCGTTCAGAG(LSRR 서열: 서열번호 5).
2.2 N2 프라이머(특이적 항체 올리고뉴클레오티드를 증폭을 위해; 예를 들어, 도 18에서 N2 프라이머):
2.2a. N1 서열의 하류에서 출발하지 않는 후보 N2 프라이머.
2.2b. 후보 올리고뉴클레오티드 서열의 최종 35 bps에서 중복되는 후보 N2 프라이머를 제거한다.
2.2c. 올리고뉴클레오티드를 이용하여 연구되는 세포들의 화학종의 전사체(예를 들어, 인간 전사체 또는 쥐 전사체)에 대해 정렬된 프라이머 후보를 제거한다.
2.2d. 프라이머-프라이머 상호작용을 최소화하거나 회피하기 위한 기본(default) 제어로서 ILR2 서열(ACACGACGCTCTTCCGATCT)을 이용한다.
423 개의 후보들 올리고뉴클레오티드 서열 중, 390 개의 후보에 대한 N2 프라이머가 설계되었다.
3. 필터링
하기 방법을 이용하여 잔류하는 390 개의 후보 프라이머 서열을 여과하였다.
3a. As(즉, 폴리(A) 서열의 효과적인 길이는 25 bps 초과)에서 랜덤 서열 말단을 이용하여 임의의 후보 올리고뉴클레오티드 서열을 제거하여, 폴리(A) 테일을 모든 바코드에 대해 동일한 길이로 유지한다.
3b. Gs의 구동의 올리고 합성에서 추가 비용 및 잠재적으로 더욱 낮은 수율로 인해, 4 이상의 연속 Gs(> 3Gs)를 갖는 임의의 후보 올리고뉴클레오티드 서열은 제거한다.
도 18의 패널 (a)는 상기 방법을 이용하여 생성된 비제한적인 예시적인 후보 올리고뉴클레오티드 서열을 보여준다.
200량체 올리고뉴클레오티드 설계
하기 방법은 후보 올리고뉴클레오티드 서열 및 단백질 발현 및 유전자 발현의 동시 결정을 위해 상응하는 프라이머 서열을 생성하기 위해 사용되었다.
1. 서열 생성 및 제거
하기를 이용하여 단백질 발현 및 유전자 발현의 동시 결정을 위한 후보 올리고뉴클레오티드 서열을 생성하였다.
1a. 바람직한 길이(128 bps)를 갖는 다수의 후보 서열(100,000 서열)을 랜덤으로 생성한다.
1b. 전사 조절자 LSRR 서열 및 비-인간, 비-마우스인 추가의 고정 서열을 생성된 서열의 5' 말단에 첨부하고, 폴리(A) 서열(25 bps)을 생성된 서열의 3' 말단에 첨부한다.
1c. 40% 내지 50%의 범위에 있는 GC 함량을 갖지 않는 생성 및 첨부된 서열들은 제거한다.
1d. 헤어핀 구조 점수를 기준으로 남아있는 후보 올리고뉴클레오티드 서열을 분류한다.
1e. 최저 헤어핀 점수를 갖는 1,000 개의 잔여 후보 올리고뉴클레오티드 서열을 선택한다.
2. 프라이머 설계
하기 방법은 최저 헤어핀 스코어를 갖는 400 명의 후보 올리고뉴클레오티드 서열에 대한 프라이머를 설계하는 데 사용되었다
2.1 N1 프라이머: N1 프라이머로서 범용 N1 서열의 이용: GTTGTCAAGATGCTACCGTTCAGAG(LSRR 서열: 서열번호 5).
2.2 N2 프라이머(특이적 항체 올리고뉴클레오티드를 증폭시키기 위함; 예를 들어, 도 18에서 N2 프라이머):
2.2a. N1 서열의 23 nt의 다운스트림은 출발하지 않는 후보 N2 프라이머를 제거한다(고정 서열은 모든 후보 올리고뉴클레오티드 서열에 걸쳐 보편적이었음).
2.2b. 표적 서열의 최종 100 bps에서 중복되는 후보 N2 프라이머를 제거한다. 결과의 프라이머 후보는 표적 서열의 48 번째 뉴클레오티드 및 100 번째 뉴클레오티드의 사이일 수 있다.
2.2c. 올리고뉴클레오티드를 이용하여 사용되는 세포의 종들의 전사체(예를 들어, 인간 전사체 또는 쥐 전사체)에 대해 정렬된 프라이머 후보를 제거한다.
2.2d. ILR2 서열을 프라이머-프라이머 상호작용을 최소화 또는 회피하기 위해 기본 제어(ACACGACGCTCTTCCGATCT)로서 사용한다.
2.2e. 표적 서열의 최종 100 bps에서 중복하는 N2 프라이머 후보를 제거한다.
400 개의 후보 올리고뉴클레오티드 서열들 중, 392 개 후보를 위한 N2 프라이머를 설계하였다.
3. 여과
하기는 잔류 392 개의 후보 프라이머 서열을 여과하는 데 사용되었다.
3a. 폴리(A) 테일을 모든 바코드에 대해 동일한 길이로 유지하기 위해 As(즉, 폴리(A) 서열의 효과적인 길이는 25bps 초과임)에서 랜덤 서열 말단을 갖는 임의의 후보 올리고뉴클레오티드 서열을 제거한다.
3b. Gs의 구동의 올리고 합성에서 추가 비용 및 잠재적으로 더욱 낮은 수율로 인해, 4 이상의 연속 Gs(> 3Gs)를 갖는 임의의 후보 올리고뉴클레오티드 서열은 제거한다.
도 18의 패널 (b)는 상기 방법을 이용하여 생성된 비제한적인 예시적인 후보 올리고뉴클레오티드 서열을 보여준다. 도 18 패널 (b)에 나타낸 네스트된 N2 프라이머는 표적된 증폭을 위해 항체 서열에 결합할 수 있다. 도 18 패널 (c)는 표적된 증폭을위한 고정 서열에 상응하는 네스트된 보편적인 N2 프라이머를 이용하여 동일한 비제한적인 예시적인 후보 올리고뉴클레오티드 서열을 보여준다.
전체적으로, 이들 데이터는 상이한 길이의 올리고뉴클레오티드 서열은 단백질 발현 및 유전자 발현의 동시 결정을 위해 설계될 수 있음이 표시된다. 올리고뉴클레오티드 서열은 범용 프라이머 서열, 항체 특이적 올리고뉴클레오티드 서열, 및 폴리(A) 서열을 포함할 수 있다.
실시예 2
상이한 항체: 올리고뉴클레오티드 비를 이용한 검출 감도의 비교
본 실시예는 1, 2, 또는 3 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트된 항-CD4 항체를 이용하여 CD4 단백질의 검출 감도를 예증한다.
대상의 냉동 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 해동시켰다. 해동된 PBMC를 실온에서 20 분 동안 0.06 ㎍/100 ㎕(올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체 스톡의 1:333 희석)에서 항-CD4 항체의 세 유형으로 염색하였다. 항-CD4 항체 유형들의 각각의 유형은 1, 2, 또는 3 올리고뉴클레오티드("항체 올리고뉴클레오티드")와 컨쥬게이트되었다. 항체 올리고뉴클레오티드의 서열은 도 19에 나타낸다. 세포를 세척하여 결합되지 않은 항-CD4 항체를 제거하였다. 살아있는 세포를 수득하기 위하여 유세포 분석을 이용하여 분류하기 위해 세포를 Calcein AM(BD(미국 뉴저지주, 프랭클린 레이크 소재)) 및 Draq7TM(Abcam(영국, 캠브리지 소재))로 염색하였다. 세포를 세척하여 과량의 Calcein AM 및 Draq7TM를 제거하였다. Calcein AM 으로 염색되고(살아있는 세포), Draq7TM로는 염색되지 않은(죽지 않거나 침투화된 세포) 단일 세포는 유세포 분석을 이용하여, BD ResolveTM 카트리지 내에서 분류되었다.
단일 세포 및 비드를 함유하는 웰들 중, 웰 내의 3500 개의 단일 세포를 5 mM DTT를 갖는 용해 버퍼 내에서 용해시켰다. CD4 mRNA 발현 프로파일은 BD ResolveTM 비드를 이용하여 결정되었다. CD4 단백질 발현 프로파일은 BD ResolveTM 비드 및 항체 올리고뉴클레오티드를 이용하여 결정되었다. 간략하게는, mRNA 분자는 세포 용해 후에 방출되었다. ResolveTM 비드는 분자 표지, 세포 표지, 및 폴리T 영역을 각각 함유하는 추계적 바코드와 연결되었다. mRNA 분자의 폴리(A) 영역은 추계적 바코드의 폴리T 영역에 혼성화된 용해된 세포들로부터 방출되었다. 올리고뉴클레오티드의 추계적 폴리(A) 영역은 추계적 바코드의 폴리T 영역에 혼성화되었다. mRNA 분자는 추계적 바코드를 이용하여 역전사되었다. 항체 올리고뉴클레오티드는 추계적 바코드를 이용하여 복제되었다. 역전사 및 복제는 하나의 샘플 분취액 내에서 동시에 발생되었다.
역전사된 생성물 및 복제된 생성물은, 60 도의 어닐링 온도에서, 488 혈액 패널 유전자의 mRNA 발현 프로파일을 결정하기 위한 프라이머를 이용하고, 혈액 패널 N1 프라이머를 이용하며, CD4 단백질의 발현 프로파일을 위해 항체 올리고뉴클레오티드 N1 프라이머("PCR 1")를 이용하여, 15 사이클 동안 PCR 증폭되었다. 과량의 추계적 바코드는 암퓨어 정제를 이용하여 제거하였다. PCR1로부터의 생성물은 2 개의 분취액으로 나누었으며, 하나는 혈액 패널 N2 프라이머를 이용하여, 488 혈액 패널 유전자의 mRNA 발현 프로파일을 결정하기 위한 분취액이고, 하나는 항체 올리고뉴클레오티드 N2 프라이머("PCR 2")를 이용하여, CD4 단백질의 발현 프로파일을 결정하기 위한 분취액이다. 두 분취액 모두 60도의 어닐링 온도에서 15 사이클 동안 PCR 증폭되었다. 용해된 세포 내 CD4 단백질의 발현은 도 19에 예시된 바와 같은 항체 올리고뉴클레오티드를 기준으로 결정되었다("PCR 2"). 서열화 어댑터 배위("PCR 3") 후, 서열화 데이터가 수득 및 분석되었다. 세포 유형은 488 개의 혈액 패널 유전자의 발현 프로파일을 기준으로 결정되었다.
도 20 패널 (a) 내지 (f)는 CD4 단백질 발현 및 유전자 발현을 동시에 고 처리량 방식으로 측정하기 위하여 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체 이용의, 비제한적인 예시적인 t-분포화 추계적 네이버 임베딩(Distributed Stochastic Neighbor Embedding: tSNE) 투사 플롯이다. CD4 단백질 발현은 1, 2 또는 3 항체 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이트된 항-CD4 항체를 이용하여 CD4 발현 세포 유형(예를 들어, CD4 T 세포) 내에서 명백하고 확실하게 검출되었다(도 20 패널 (b), (d), 및 (f), 각각). 도 21, 패널 (a) 내지 (f)은 CD4 mRNA 및 단백질의 CD4 T 세포에서(높은 CD4 발현), CD8 T 세포(최소 CD4 발현), 및 골수 세포(일부 CD4 발현)에서의 발현을 보여주는 비제한적인 예시적인 막대 차트이다. 유사한 서열화 깊이를 이용하여, CD4 단백질 수준에 대한 검출 감도는 더욱 높은 항체:올리고뉴클레오티드 비에서 증가되었으며, 1:3 비가 1:1 및 1:2 비보다 더욱 양호하게 수행된다(도 22). 유세포 분석을 이용하여 분류된 세포들의 세포 표면 상에서dml CD4 단백질의 발현은 도 23 패널 (a) 내지 (d)에 나타낸 바와 같이 FlowJo(FlowJo(미국 오레건주 애쉬랜드 소재))를 이용하여 확인되었다. 도 24 패널 (a) 내지 (f)는 두 샘플의 CD4 T 세포, CD8 T 세포, 및 골수 세포에서 CD4 mRNA 및 CD4 단백질의 발현을 보여주는 비제한적인 예시적인 막대 차트이다. 2 개의 상이한 샘플 제조 프로토콜을 이용하여 제2 샘플을 제조하였다. 도 25는 1:3의 항체:올리고뉴클레오티드 비를 갖는 상이한 샘플 제조 프로토콜을 이용하여 CD4 단백질 수준에 대한 검출 감도를 보여주는 비제한적인 예시적인 막대 차트이다.
전체적으로, 이들 데이터는 항-CD4 항체와 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드에 근거하여 CD4 단백질 발현이 명백하고 단단하게 검출될 수 있음을 나타낸다. CD4 단백질 수준에 대한 검출 감도는 더욱 높은 항체:올리고뉴클레오티드 비와 함께 증가될 수 있다.
실시예 3
고온:저온 항체 역가
본 실시예는, 항체 올리고뉴클레오티드가 서열화 데이터 중, 총 판독의 원하는 백분율(예를 들어, 2%)을 차지하도록 하는, 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체("고온 항체")와 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트되지 않은 항체("저온 항체")의 비의 결정을 예시한다.
항-CD147 항체 스톡은 PE 버퍼를 이용하여 1:20, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:600, 1:800, 및 1:1000 희석으로 희석되었다. 100 ㎕의 염색 버퍼(FBS)(BD(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크 소재)) 내 약 150,000 주르카트(Jurkat) 세포를 다양한 항체 희석으로, 실온에서 20분 동안 염색하였다. 염색 후, 세포를 500 ㎕의 염색 버퍼로 1회 세척하고, 형광 강도의 측정을 위해 200 ㎕에 재현탁시켰다. MuseTM Autophagy LC3-항체(EMD Millipore(미국 매사추세츠주 빌레리카 소재))를 이용하여 주르카트 세포에 결합된 항-CD147 항체를 검출하기 위해 사용되었다. 다양한 항-CD147 항체 희석으로 염색된 세포들로부터의 형광 강도 또는 염색되지 않은 세포들을 결정하고, 비교하여 항체에 대한 최적 희석을 결정하였다(도 26a 내지 도 26c). 형광 강도는 희석이 더 높아짐에 따라 감소되었다. 99% 초과의 세포가 1:800의 희석 비율로 염색되었다. 형광 신호는 1:800으로 떨어지기 시작했다. 세포를 희석 비율 1:200 이하까지 포화 염색시켰다. 세포를 희석 비율 1:400 이하까지 포화에 가깝게 염색시켰다.
도 27은 항체 올리고뉴클레오티드가 서열화 데이터 중, 원하는 백분율의 총 판독을 차지하도록 하는 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체의 염색 농도 결정을 위한 비제한적이고 예시적인 실험 설계를 보여준다. 항-CD147 항체는 분할가능한 95량체 항체 올리고뉴클레오티드와 1:3의 항체:올리고뉴클레오티드 비("고온 항체")로 컨쥬게이트되었다. 고온 항체는 pH 7.5 희석액을 이용하여 1:100 비 또는 1:800 비로 희석되었다. 10% 고온 항체:90% 저온 항체의 혼합물을 9 ㎕의 저온 항-CD147 항체 및 1 ㎕의 고온 항체를 이용하여 제조되었다. 1% 고온 항체:90% 저온 항체의 혼합물을 9 ㎕의 저온 항-CD147 항체 및 1 ㎕의 10% 고온 항체:90% 저온 항체의 혼합물을 이용하여 제조하였다.
약 5 십만 개의 세포를 갖는 용해된 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 100% 고온 항체로 1:100 희석된 스톡(1%의 스톡 고온 항체), 10% 고온 항체:90% 저온 항체의 혼합물(0.1%의 스톡 고온 항체), 1% 고온 항체:99% 저온 항체의 혼합물(0.01%의 스톡 고온 항체)으로 및 100% 고온 항체로 1:800 희석된 스톡(0.0125%의 스톡 고온 항체)를 이용하여, 100 ㎕의 염색 버퍼(FBS) 중에서 염색하였다. 염색 후, 세포를 세척하여 결합되지 않은 항체 분자를 제거하였다. 세포를 유세포 분석을 이용하여 분류하여 살아있는 세포를 수득하기 위해 Calcein AM 및 Draq7TM로 염색하였다. 세포를 세척하여 과량의 Calcein AM 및 Draq7TM을 제거하였다. Calcein AM 으로 염색되고(살아있는 세포), Draq7TM로는 염색되지 않은(죽지 않거나 침투화된 세포) 단일 세포는 유세포 분석을 이용하여, BD ResolveTM 카트리지 내에서 분류되었다.
단일 세포 및 비드를 함유하는 웰들 중, 웰들 내의 단일 세포 중 1000 개는 용해 버퍼 내에 용해되었다. 각각의 단일 세포의 경우, mRNA 분자는 역전사되었으며, 항체 올리고뉴클레오티드는 그 세포에 대한 비드와 컨쥬게이트된 추계적 바코드를 이용하여 복제되었다. 역전사 및 복제 후 샘플은, 488 개의 혈액 패널 유전자의 mRNA 발현 프로파일 결정을 위한 프라이머를 이용하고, 혈액 패널 N1 프라이머를 이용하고, CD147 단백질의 발현을 위해, 항체 올리고뉴클레오티드 N1 프라이머를 이용하여, 60 도 어닐링 온도에서 15 사이클 동안 PCR 증폭되었다("PCR 1"). 과량의 프라이머는 암퓨어 정제를 이용하여 제거하였다. PCR1로부터의 생성물은, 어댑터 배위를 위한 플랭킹 서열과 함께, 혈액 패널 N2 프라이머 및 항체 올리고뉴클레오티드 N1 프라이머를 이용하여 60도의 어닐링 온도에서 15 사이클 동안 추가로 PCR 증폭되었다("PCR 2"). 서열화 어댑터 배위("PCR 3") 후, 서열화 데이터가 수득 및 분석되었다.
도 28 패널 (a) 내지 (d)는 항체 올리고뉴클레오티드의 예측된 크기와 일치하는 피크(화살표로 표시됨)를 보여주는 비제한적이고 예시적인 생체분석자 기록이다. 항체 올리고뉴클레오티드 피크는, 고온 항체가 저온 항체로 적정됨에 따라 감소되었다.
표 1은 서열화 데이터 매트릭스의 요약이다. 1:100 희석된 스톡을 이용하여 제조된 1% 고온 항체:99% 저온 항체의 혼합물로 세포를 염색함으로써, 항체 올리고뉴클레오티드는 서열화 데이터 중, 총 원래 판독의 2.4%를 차지하였다. 그러나, 도 29 패널 (a) 내지 (f) 및 도 30b, 31b, 및 32b에 나타낸 바와 같이, 재귀 치환 오류 정정(RSEC) 또는 분포-기반 오류 정정(DBEC) 후 검출된 항체 올리고뉴클레오티드의 분자의 수의 분포 히스토그램은, 세포가 1:100 희석된 스톡을 이용하여 제조된 1% 고온 항체:99% 저온 항체의 혼합물을 이용하여 염색된 경우, 명확한 신호 피크를 포함하지 않았다. RSEC는 미국 특허 출원 제15/605874호(2017년 5월 25일)에 기재되어 있으며, 이의 함량은 본 명세서에 그 전체가 참고로서 포함된다.
도 30a 내지 도 30c는 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항-CD147 항체 분자가 다양한 세포 유형을 표지하는 데 사용될 수 있음을 보여주는 비제한적인 예시적인 플롯이다. 세포 유형은 혈액 패널 내 488 개의 유전자의 발현 프로파일을 이용하여 결정되었다(도 30a). 세포는 1:100 희석된 스톡을 이용하여 제조된 10% 고온 항체:90% 저온 항체의 혼합물로 염색하여, 검출된 항체 올리고뉴클레오티드의 분자의 수를 보여주는 히스토그램에서 명확한 신호를 결과로서 생성하지 않는다(도 30b). 항체 올리고뉴클레오티드에 의한 다양한 세포 유형의 표지는 도 30c에 나타낸다.
도 31a 내지 도 31c는 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항-CD147 항체가 다양한 세포 유형을 표지하는 데 사용될 수 있음을 보여주는 비제한적인 예시적인 플롯이다. 세포 유형은 혈액 패널에서 488 개의 유전자의 발현 프로파일을 이용하여 결정되었다(도 31a). 세포는 1:100 희석된 스톡을 이용하여 제조된 1% 고온 항체:99% 저온 항체의 혼합물로 염색하여, 검출된 항체 올리고뉴클레오티드의 분자의 수를 보여주는 히스토그램에서 명확한 신호를 결과로서 생성하지 않는다(도 31b). 항체 올리고뉴클레오티드에 의한 다양한 세포 유형의 표지는 도 31c에 나타낸다.
도 32a 내지 도 32c는 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항-CD147 항체 분자가 다양한 세포 유형을 표지하는 데 사용될 수 있음을 보여주는 비제한적인 예시적인 플롯이다. 세포 유형은 혈액 패널에서 488 개의 유전자의 발현 프로파일을 이용하여 결정되었다(도 32a). 세포는 1:800의 희석된 스톡을 이용하여 염색되었으며, 검출된 항체 올리고뉴클레오티드의 분자의 수를 보여주는 히스토그램에서 명확한 신호를 결과로서 생성하였다(도 32b). 항체 올리고뉴클레오티드에 의한 다양한 세포 유형의 표지는 도 32c에 나타낸다.
[표 1] 서열화 데이터 메트릭스의 요약
Figure pat00005
결국, 이들 데이터는, 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체("고온 항체") 및 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트되지 않은 항체("저온 항체")의 비는, 항체 올리고뉴클레오티드가 서열화 데이터 중의 총 판독의 바람직한 백분율을 설명하고, 데이타 제시 신호 항체 올리고뉴클레오티드는 데이터 표시 노이즈 항체 올리고뉴클레오티드로부터 명확히 분리되도록 조정될 수 있음을 보여준다.
실시예 4
정규화
이 예는 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체("고온 항체") 및 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트되지 않은 항체("저온 항체")의 혼합물을 이용하여, 어떻게 정규화가 항체의 단백질 표적의 풍부도에 관계 없이, 원하는 커버리지로 서열화 데이터 중, 총 판독의 원하는 백분율을 설명하는 항체 올리고뉴클레오티드를 결과로서 생성할 수 있는지를 예증한다.
표 2는 고온 항체를 이용하여 10,000 B 세포에서 가변하는 풍부도의 3 개의 세포 표면 마커들 중 정량의 비교를 보여준다. 3 개의 세포 표면 마커들의 상대적 발현 수준을 해결하는 데 요구되는 총 판독은 4752만 판독이었다.
[표 2] 고온 항체를 이용한 단백질 정량화 예
Figure pat00006
[표 3] 고온 및 저온 항체를 이용한 단백질 정량화의 예
Figure pat00007
표 3은 3 개 세포 표면 마커의 상대 발현 수준을 해결하는 데 요구된 판독의 총 수는, 고온 항체:저온 항체의 혼합물을 이용하여 백만 판독이었음을 보인다. 또한, 표 2에 나타낸 정량 결과(1 백만 판독 대 4752만 판독)와 비교하여, 세 개의 세포 표면 마커의 발현 수준을 정량하는 데 고온 항체:저온 항체의 혼합물이 사용된 경우, 3 개의 모든 단백질 마커 중 최적 커버리지(예를 들어, 서열화 깊이 4)를 달성하는 데 판독의 수의 단지 2%만이 필요하다. 저온 항체의 더욱 높은 퍼센트와의 혼합물을 이용하여, 고발현 단백질 분자의 정규화는 낮은 풍부도의 단백질의 검출, 파라미터 수, 및 서열화 비용 간의 상충을 감소시켜서, 분석을 더욱 매력적인 도구로 만든다.
전체적으로, 이들 데이터는 원하는 범위를 갖는 서열화 데이터 중, 총 판독의 바람직한 수는 고온 항체:저온 항체의 혼합물을 이용하여 상이한 풍부도의 단백질 표적(예를 들어, 항원)을 위해 달성될 수 있음을 표시한다.
실시예 5
T 세포 하위세트의 식별
이 실시예는 T 세포 하위세트를 더욱 잘 식별하기 위하여 초병렬 단일 세포 서열화에 의해 단백질 및 mRNA 함량의 동시 디지털 측정을 증명한다.
고 처리량의 단일 세포 RNA 서열화는 복잡하고 이종성인 세포 개체군 및 역학을 프로파일하는데 사용되었다. 그러나, 단백질 발현에 대한 정보의 부족은, mRNA와 단백질 발현이 밀접하게 상관되지 않을 수 있음에 따라, 세포 표면 마커에 의해 통상적으로 정의된 세포 유형을 식별하는 것을 어렵게 만들 수 있다. 특히 T 세포는 전사물의 상대적으로 낮은 풍부도를 함유하고, 상이한 T 세포 하위세트는 매우 유사한 전사 프로파일을 종종 나타낸다. 이 실시예는, 서열화에 의해 단백질 발현을 측정하기 위한 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체의 이용 방법을 예증하며, 이는 단일 세포에서 단백질 및 mRNA 발현의 동시 검출을 가능하게 한다.
항체 특이적 올리고는 BDTM Resolve, 초병렬 단일 세포 분석 시스템을 이용하여 단일 작업흐름에서 mRNA와 함께 포획, 증폭 및 서열화되었다. 이 방법의 힘을 예증하기 위해, 많은 일반 T 세포 마커를 포함하는 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체 패널이 생성되었다. 이 패널은 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)에 적용되었다. 패널은 인간 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)에 적용되었다. 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체에 의한 단백질 발현의 검출은 매우 민감하고 특이적이었다. 그리고, 단백질 마커 측정의 첨가는, 나이브 CD4 대 CD8 T 세포의 구분, 및 나이브 대 메모리 T 세포의 구분과 같이, 특히 T 세포 구획에서 단일 세포 발현 프로파일의 더욱 구별되며 단단한 클러스터링을 제공하였다. 구체적으로, 드물고 최근 설명된 T 세포 하위세트, 줄기(stem) 메모리 T 세포가 식별되었다. 줄기 메모리 T 세포는 줄기 세포-유사 특성을 갖는 장기 지속되는 메모리 T 세포 개체군을 구성한다.
전체적으로, 데이터는 초병렬 단일 세포 서열화에 의해 단백질 및 mRNA 함량의 동시적인 디지털 측정이 단일 세포 전사 프로파일링 및 높은 파라미터 단백질 유전정보학 모두를 복잡한 생물계의 해명, 질병 상태의 이해 및 더욱 효과적인 바이오마커 발견을 가능하게 하는 데 있어서의 추가의 노력으로 변형시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 6
제어 입자
본 실시예는 상이한 서열을 갖는 제어 입자 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제어 입자의 생성 및 포획 효율을 결정하기 위한 작용화된 제어 입자의 용도를 예증한다.
재료
BD CompBead Plus 항-마우스 Ig(7.5um) 입자 세트(51-9006274)
BD 염색 버퍼(FBS)
절차
1. BD CompBead Plus를 사용 전에 와동시킨다(적어도 1 분).
2. 800uL의 염색 버퍼를 튜브에 첨가(표 7은 상이한 풍부도로 5 개의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이트된 CD147을 갖는 염색 버퍼의 조성물을 보여준다. 도 33a는 염색 버퍼의 조성물을 보여주는 플롯이다.).
3. CompBead Plus의 항-마우스의 5 개의 충분한 액적(대략 300uL)을 첨가한다.
4. 20uL의 하기 염색 칵테일을 튜브에 첨가한다. 와동시킨다.
5. 광을 피하여 실온에서 30 분 인큐베이션한다.
6. 200g에서 10 분 동안 비드를 회전시킨다.
7. 상등액을 조심하여 제거하고, 1mL 염색 버퍼로 재현탁시킨다.
8. 200g에서 10 분 동안 회전시킨다.
9. 상등액을 조심하여 제거하고, 1mL 염색 버퍼로 재현탁시켜 작용화된 CompBead 스톡 용액을 생성한다.
10. 비드를 계수한다.
[표 7] 염색 칵테일 조성물
Figure pat00008
결과
도 34a 내지 도 34b는 혈구계에서 세포의 명시야 이미지(도 34a, 백색 원) 및 제어 입자(도 34b, 흑색 원)이다. 도 35a 내지 도 35b는 형광단과 연결된 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체에 결합된 제어 입자의 위상차(도 35a, 10X) 및 형광(도 35b, 10X) 이미지이다. 형광 현미경을 이용하여 5ul의 작용화된 CompBead 스톡 용액은 약 400000 개의 작용화된 제조된 CompBeads와 함께 약 2000 개의 세포(4%의 총 투입)를 함유하였음을 결정하였다.
도 36은 카트리지의 마이크로웰 내에 로딩되는 세포 및 입자를 보여주는 제어 입자의 이미지이다. CompBeads는 일반 해결 실험과 함께 사용될 수 있다. 522 개의 작용화된 CompBeads는 복수의 세포들 내로 첨가되었다. 20000 개의 세포(제어 입자 포함) 서열 중, 156 개는 20 개 초과의 모든 제어 입자 올리고뉴클레오티드의 합계를 가졌다. 이에 따라, 156 개의 제어 입자는 서열이었다. 도 33b는 염색 버퍼 내 이들의 풍부도와 상관된 5 개의 상이한 제어 바코드 서열(LZ15 내지 LZ19)을 갖는 제어 입자 올리고뉴클레오티드의 수를 보여주는 플롯이다.
전체적으로, 이들 데이터는 입자(예를 들어, CompBead Plus)가 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 제어 입자 올리고뉴클레오티드)로 작용화될 수 있음을 보여준다. 작용화된 입자는 단일 세포 서열화 작업흐름을 이용하여 포획되고 서열화된 입자의 수를 결정할 수 있다.
다양한 양태 및 구현예가 본 명세서에 개시되었지만, 다른 양태들 및 구현예는 당업자에게 명백할 것이다. 본 명세서에 개시된 다양한 양태 및 구현예는 예시 목적으로, 제한하고자 하는 것이 아니며, 진정한 범주 및 기술 사상은 하기 청구범위에 의해 표시된다.
당업자는, 본 명세서에 개시된 이러한 공정 및 방법 및 기타에 대해, 상기 공정 및 방법에서 수행된 작용이 상이한 순서로 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 추가로, 개관된 단계 및 조작은 단지 예로서만 제공되는 것이며, 단계 및 조작의 일부는 선택적일 수 있으며, 더 적은 단계 및 작동으로 조합될 수 있거나, 개시된 구현예의 본질을 손상시키지 않으면서, 추가의 단계 및 작동으로 확장될 수 있다.
본 명세서에서 실질적으로 임의의 복수 및/또는 단수 용어의 이용에 대하여, 당업자는, 문맥 및/또는 적용에 적절한 바에 따라 복수에서 단수 및/또는 단수에서 복수로 번역할 수 있다. 다양한 단수/복수 치환은 명확성을 위해 본 명세서에 명시적으로 설명될 수 있다.
일반적으로, 본 명세서 및 특히 첨부된 청구 범위(예를 들어, 첨부된 청구 범위의 본문)에서 사용된 용어는 일반적으로 "개방형" 용어(예를 들어, 용어 "포함하는"은 "포함하지만, 이에 제한되지 않는"으로서 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로 해석되어야 하며, 용어 "포함하다"는 "포함하지만, 이에 제한되지 않는" 등으로서 해석되어야 함)로서 의도됨은 당업자에 의해 이해될 것이다. 특정 수의 도입된 청구항 언급이 의도된 경우, 그러한 의도는 청구항에서 명시적으로 언급될 것이며, 그러한 언급 부재이 부재하면 그러한 의도는 없는 것으로 당업자는 추가로 이해할 것이다. 예를 들어, 이해에 대한 보조로서, 다음의 첨부된 청구범위는 도입 구절 "적어도 하나" 및 "하나 이상의"의 이용을 포함하여 청구 범위 언급을 도입할 수 있다. 그러나, 그러한 구절의 이용은, 동일한 청구항이 도입 구절인 "하나 이상의" 또는 "적어도 하나" 및 부정관사(예컨대 "a" 또는 "an")(예를 들어, "a" 및/또는 "an"은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상의"를 의미하는 것으로 해석되어야 한다)를 포함하는 경우라도, 부정관사("a" 또는 "an")에 의한 청구항 언급의 도입이, 그러한 도입된 청구항 언급을 포함하는 임의의 특정 청구항을 단지 하나의 그러한 언급만을 포함하는 구현예로 제한하는 것을 의미하는 것으로 해석되어서는 안 된다; 청구항 언급을 도입하는 데 사용된 정관사의 이용에 대해서도 동일하게 적용된다. 추가적으로, 도입된 청구항 언급의 특정 수가 명시적으로 언급된 경우라도, 당업자는 그러한 언급이 적어도 언급된 수(예를 들어, 다른 수식어 없이 "2 개의 언급"의 언급은 적어도 2 개의 언급, 또는 둘 이상의 언급을 의미함)를 의미하는 것으로 해석되어야 함을 인식할 것이다. 나아가, "A, B, 및 C 등"과 유사한 관례가 사용되는 경우에, 일반적으로 그러한 구조는 당업자가 그 관례를 이해하는 그러한 의미로 의도된다(예를 들어, "A, B, 및 C 중 적어도 하나를 갖는 계"는 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B를 함께, A와 C를 함께, B와 C를 함께 및/또는 A, B 및 C를 함께 갖는 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지 않을 것임). "A, B, 또는 C 등"과 유사한 관례가 사용되는 그러한 경우, 일반적으로 그러한 구조는 당업자가 그 관례를 이해하는 의미로 의도된다(예를 들어, "A, B, 또는 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B를 함께, A와 C를 함께, B와 C를 함께 및/또는 A, B 및 C를 함께 갖는 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지 않을 것임). 실질적으로 임의의 선언적 단어 및/또는 둘 이상의 대안적 용어를 나타내는 구절은, 설명, 청구범위 또는 도면 어디에 위치하든, 그 용어들 중 하나, 용어들 중 어느 하나 또는 두 용어 모두를 포함하는 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 함이 추가로 이해되어야 할 것이다. 예를 들어, 구절 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
추가적으로, 본 개시 내용의 특성 또는 양태가 마쿠쉬 그룹 방식으로 설명된 경우, 당업자는 본 개시 내용이 그에 따라 그 마쿠쉬 그룹원들 중 임의의 개별 원 또는 하위군에 관해서도 설명되는 것임을 이해할 것이다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 그리고 모든 목적을 위하여, 예컨대 기재된 설명의 제공과 관련하여, 본 명세서에 개시된 모든 범위는, 임의의 및 모든 가능한 하위 범위 및 그의 하위 범위의 조합을 포괄한다. 임의의 열거된 범위는 적어도 균등하게 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/10 등으로 분해되는 동일 범위를 충분히 설명 및 가능하게 하는 것으로서 쉽게 인식될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 명세서에서 논의된 각 범위는 아래 1/3, 중간 1/3 및 윗부분 1/3로 용이하게 분해될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 모든 언어 예컨대 "이하", "적어도" 등은 언급된 수를 포함하고, 상기 논의된 것과 같이 이후에 하위 범위로 분해될 수 있는 범위를 지칭한다. 마지막으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 범위는 각각의 개별적인 원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1 내지 3 개의 세포를 갖는 군은 1, 2, 또는 3 세포를 갖는 군을 지칭한다. 유사하게, 1 내지 5 개의 세포를 갖는 군은 1, 2, 3, 4, 또는 5 세포 등을 갖는 군을 지칭한다.
상기로부터, 본 개시 내용의 다양한 구현예는 예시 목적을 위해 본 명세서에 기재되었으며, 본 개시 내용의 범주 및 기술 사상으로부터 떠나지 않으면서 다양한 변형이 만들어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 다양한 구현예는 제한적인 것으로 의도되지 않으며, 본 발명의 진정한 범주 및 기술사상은 하기 청구범위에 의해 표시된다.
SEQUENCE LISTING <110> Cellular Research, Inc. Becton, Dickinson and Company Fan, Christina Chang, Christina Shum, Eleen Zoellner, Olaf Bansal, Nidhanjali Ghadiali, James Lam, Gretchen Yinbon Jensen, Eric Rohrer, Jurg Gaylord, Brent Martin, Jody Vidal, Jason G. <120> MEASUREMENT OF PROTEIN EXPRESSION USING REAGENTS WITH BARCODED OLIGONUCLEOTIDE SEQUENCES <130> BDCRI.025A <150> 62/399,795 <151> 2016-09-26 <150> 62/464279 <151> 2017-02-27 <150> 62/515,952 <151> 2017-06-06 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide" <400> 1 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide" <400> 2 tttttttttt tttttttttt 20 <210> 3 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide" <220> <221> 5AmMC6 <222> (1)..(1) <223> 5' Amino Modifier C6 <400> 3 gttgtcaaga tgctaccgtt cagagtacgt ggagttggtg gcccgacccc gagcgctacg 60 agccccccgg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 95 <210> 4 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide" <220> <221> 5AmMC6 <222> (1)..(1) <223> 5' Amino Modifier C6 <400> 4 gttgtcaaga tgctaccgtt cagagctact gtccgaagtt accgtgtatc taccacgggt 60 ggtttttcga atccggaaaa gatagtaata agtgttttag ttggaataag tcgcaacttt 120 tggagacggt tacctctcaa tttttctgat ccgtaggccc cccgatctcg gcctcaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 200 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide" <400> 5 gttgtcaaga tgctaccgtt cagag 25 <210> 6 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide" <400> 6 gttgtcaaga tgctaccgtt cagagcccca tgtctagtac ctattggtcc cctatcctca 60 gattcgttta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 95 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> note="Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide" <400> 7 tttttttttt tttttttttt tttttt 26

Claims (18)

  1. 조성물로서,
    단백질-결합 시약에 특이적인 올리고뉴클레오티드와 연관된 단백질-결합 시약을 각각 포함하는 복수의 올리고뉴클레오티드-연관된 단백질-결합 시약을 포함하고,
    단백질-결합 시약에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 표적 서열을 위한 결합 부위, 그와 연관되는 단백질-결합 시약에 대한 고유 식별자 서열 및 범용 프라이머를 위한 결합 부위를 포함하고,
    단백질-결합 시약은 복수의 단백질 표적 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있고,
    복수의 올리고뉴클레오티드-연관된 단백질-결합 시약 중 적어도 3개의 시약이 상이한 단백질-결합 시약을 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    고유 식별자 서열이 표적 서열을 위한 결합 부위와 범용 프라이머리를 위한 결합 부위 사이에 위치하고/거나 표적 서열을 위한 결합 부위가 단백질-결합 시약에 특이적인 올리고뉴클레오티드의 3' 영역에 있는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    고유 식별자 서열이 25 내지 45 개의 뉴클레오티드 길이인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    복수의 올리고뉴클레오티드-연관된 단백질-결합 시약 중 적어도 10개의 시약이 상이한 단백질-결합 시약, 상이한 고유 식별자 서열, 또는 둘 다를 포함하는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    단백질-결합 시약에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 (1) 링커를 통해 단백질-결합 시약과 연관되어 있거나, (2) 단백질-결합 시약과 가역적으로 연관되어 있거나, (3) UV 광분할성 기, 스트렙트아비딘, 비오틴, 아민 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 화학 기를 통해 단백질-결합 시약과 연관되어 있는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    단백질-결합 시약에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열, 폴리(A) 서열, 분자 표지 서열, 세포 표지 서열, 증폭 어댑터, 서열화 어댑터, 랜덤 다량체 서열, 또는 이들의 조합을 포함하는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    복수의 올리고뉴클레오티드-연관된 단백질-결합 시약의 적어도 10개의 올리고뉴클레오티드 각각은 상이한 바코드 서열을 포함하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드와 연관되지 않은 하나 이상의 제2 단백질-결합 시약을 더 포함하고, 선택적으로 복수의 올리고뉴클레오티드-연관된 단백질-결합 시약 내 올리고뉴클레오티드와 연관된 하나 이상의 단백질-결합 시약은 하나 이상의 제2 단백질-결합 시약과 동일한, 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    표적 서열은 비특이적 표적 핵산 서열, 올리고뉴클레오티드 프로브, 폴리(T) 영역, 또는 이들의 조합을 포함하거나; 표적 서열을 위한 결합 부위가 폴리(A) 서열을 포함하거나; 둘 다인, 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    단백질 표적이 세포-표면 단백질, 세포내 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합인, 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    범용 프라이머를 위한 결합 부위가 고-처리량 서열화 플랫폼과 연관된 서열화 프라이머를 위한 결합 부위 또는 PCR 프라이머를 위한 결합 부위인, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    단백질-결합 시약이 항체이고, 선택적으로 항체가 인간 항체 또는 쥐 항체이고, 더욱 선택적으로 항체가 CD21, HLA-DR, CD8, CD34, ADAM10, CD156c, ANO6, ATP1B2, ATP1B3, BSG, CD147, CD109, CD230, CD29, CD298, ATP1B3, CD44, CD45, CD47, CD51, CD59, CD63, CD97, CD98, SLC3A2, CLDND1, HLA-ABC, ICAM1, ITFG3, MPZL1, NA K ATPase alpha1, ATP1A1, NPTN, PMCA ATPase, ATP2B1, SLC1A5, SLC29A1, SLC2A1 및 SLC44A2로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 항체인, 조성물.
  13. 키트로서,
    제1 단백질-결합 시약에 특이적인 올리고뉴클레오티드와 연관된 제1 단백질-결합 시약을 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드-연관된 단백질-결합 시약으로서, 제1 단백질-결합 시약과 연관된 올리고뉴클레오티드는 표적 서열을 위한 결합 부위, 제1 단백질-결합 시약에 대한 고유 식별자 서열 및 범용 프라이머를 위한 결합 부위를 포함하고, 제1 단백질-결합 시약은 제1 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있는, 제1 올리고뉴클레오티드-연관된 단백질-결합 시약; 및
    제1 올리고뉴클레오티드-연관된 단백질-결합 시약을, 단백질-결합 시약에 특이적인 올리고뉴클레오티드와 연관된 단백질-결합 시약을 각각 포함하는 하나 이상의 추가 올리고뉴클레오티드-연관된 단백질-결합 시약과 사용하기 위한 설명서로서, 하나 이상의 추가 올리고뉴클레오티드-연관된 단백질-결합 시약 각각의 올리고뉴클레오티드는 표적 서열을 위한 결합 부위, 그와 연관되는 단백질-결합 시약에 대한 고유 식별자 서열 및 범용 프라이머를 위한 결합 부위를 포함하고, 하나 이상의 추가 올리고뉴클레오티드-연관된 단백질-결합 시약 각각의 단백질-결합 시약은 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있는, 설명서
    를 포함하는, 키트.
  14. 제13항에 있어서,
    제1 올리고뉴클레오티드-연관된 단백질-결합 시약을 하나 이상의 추가 올리고뉴클레오티드-연관된 단백질-결합 시약과 사용하기 위한 설명서는 제1 올리고뉴클레오티드-연관된 단백질-결합 시약을 제2 올리고뉴클레오티드-연관된 단백질-결합 시약과 사용하기 위한 설명서를 포함하고, 제2 올리고뉴클레오티드-연관된 단백질-결합 시약은 제2 단백질-결합 시약에 특이적인 올리고뉴클레오티드와 연관된 제2 단백질-결합 시약을 포함하고,
    제2 단백질-결합 시약과 연관된 올리고뉴클레오티드는 표적 서열을 위한 결합 부위, 제2 단백질-결합 시약에 대한 고유 식별자 서열 및 범용 프라이머를 위한 결합 부위를 포함하고,
    제2 단백질-결합 시약은 제2 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 선택적으로 제1 단백질 표적 및 제2 단백질 표적이 상이한, 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    제2 단백질-결합 시약과 연관된 올리고뉴클레오티드 내 표적 서열을 위한 결합 부위는 제1 단백질-결합 시약과 연관된 올리고뉴클레오티드 내 표적 서열을 위한 결합 부위와 동일한, 키트.
  16. 제13항에 있어서,
    하나 이상의 추가 올리고뉴클레오티드-연관된 단백질-결합 시약 각각의 단백질-결합 시약은 다른 단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있는, 키트.
  17. 제13항에 있어서,
    제1 단백질-결합 시약과 연관된 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열, 폴리(A) 서열, 또는 이들의 조합을 포함하는, 키트.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 단백질 표적이 세포-표면 단백질, 세포내 단백질, 세포 마커, B-세포 수용체, T-세포 수용체, 항체, 주요 조직적합 복합체, 종양 항원, 수용체, 또는 이들의 임의의 조합인, 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US9404864B2 (en) 2013-03-13 2016-08-02 Denovo Sciences, Inc. System for imaging captured cells
EP2739587B1 (en) 2011-08-01 2020-05-27 Denovo Sciences Cell capture system
US10466160B2 (en) 2011-08-01 2019-11-05 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for retrieving and analyzing particles
ES2663234T3 (es) 2012-02-27 2018-04-11 Cellular Research, Inc Composiciones y kits para recuento molecular
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CN114891871A (zh) 2012-08-14 2022-08-12 10X基因组学有限公司 微胶囊组合物及方法
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10584381B2 (en) 2012-08-14 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP2931919B1 (en) 2012-12-14 2019-02-20 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9752181B2 (en) 2013-01-26 2017-09-05 Denovo Sciences, Inc. System and method for capturing and analyzing cells
EP2954065B1 (en) 2013-02-08 2021-07-28 10X Genomics, Inc. Partitioning and processing of analytes and other species
US9707562B2 (en) 2013-03-13 2017-07-18 Denovo Sciences, Inc. System for capturing and analyzing cells
US10391490B2 (en) 2013-05-31 2019-08-27 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for isolating and analyzing cells
US9856535B2 (en) 2013-05-31 2018-01-02 Denovo Sciences, Inc. System for isolating cells
ES2857908T3 (es) 2013-08-28 2021-09-29 Becton Dickinson Co Análisis masivamente paralelo de células individuales
KR102596508B1 (ko) 2014-04-10 2023-10-30 10엑스 제노믹스, 인크. 시약을 캡슐화 및 구획화하기 위한 유체 디바이스, 시스템, 및 방법, 및 이의 응용
KR20230070325A (ko) 2014-06-26 2023-05-22 10엑스 제노믹스, 인크. 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법
WO2016114970A1 (en) 2015-01-12 2016-07-21 10X Genomics, Inc. Processes and systems for preparing nucleic acid sequencing libraries and libraries prepared using same
US10697000B2 (en) 2015-02-24 2020-06-30 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
US9727810B2 (en) 2015-02-27 2017-08-08 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
EP3835431B1 (en) 2015-03-30 2022-11-02 Becton, Dickinson and Company Methods for combinatorial barcoding
WO2016172373A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for whole transcriptome amplification
JP6940484B2 (ja) 2015-09-11 2021-09-29 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド ライブラリー正規化のための方法および組成物
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
CN109475327B (zh) * 2016-03-08 2023-01-24 达斯特一致有限责任公司 根据取向信息生成唯一码
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
ES2961743T3 (es) 2016-09-26 2024-03-13 Becton Dickinson Co Medición de la expresión de proteínas utilizando reactivos con secuencias de oligonucleótidos con código de barras
CN118086461A (zh) * 2016-12-16 2024-05-28 艾瑞特姆有限责任公司 使用连接扩增的分子检测
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP4310183A3 (en) 2017-01-30 2024-02-21 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
CN110382708A (zh) 2017-02-01 2019-10-25 赛卢拉研究公司 使用阻断性寡核苷酸进行选择性扩增
US10995333B2 (en) 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
CN110678558B (zh) * 2017-05-02 2023-06-02 国立大学法人东京大学 整体性检测单个细胞的非破坏性测量信息和基因组相关信息的方法
CN109526228B (zh) 2017-05-26 2022-11-25 10X基因组学有限公司 转座酶可接近性染色质的单细胞分析
US10844372B2 (en) 2017-05-26 2020-11-24 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
AU2018281745B2 (en) * 2017-06-05 2022-05-19 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
US10391492B2 (en) 2017-08-29 2019-08-27 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for isolating and analyzing cells
WO2019055852A1 (en) * 2017-09-15 2019-03-21 Apton Biosystems, Inc. PROFILING OF HETEROGENEOUS UNICELLULAR ORGANISMS USING MOLECULAR BARCODE CODING
EP3625361A1 (en) 2017-11-15 2020-03-25 10X Genomics, Inc. Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
US11946095B2 (en) 2017-12-19 2024-04-02 Becton, Dickinson And Company Particles associated with oligonucleotides
WO2019140432A1 (en) * 2018-01-15 2019-07-18 Hygieia Health Co., Limited Systems, methods, compositions and devices for personalized nutrition formulation and delivery system
CN112005115A (zh) 2018-02-12 2020-11-27 10X基因组学有限公司 表征来自单个细胞或细胞群体的多种分析物的方法
CN112262218A (zh) 2018-04-06 2021-01-22 10X基因组学有限公司 用于单细胞处理中的质量控制的系统和方法
CA3097976A1 (en) * 2018-05-03 2019-11-07 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
EP3788170A1 (en) 2018-05-03 2021-03-10 Becton, Dickinson and Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
GB201810571D0 (en) * 2018-06-27 2018-08-15 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for the analysis of circulating microparticles
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
WO2020028266A1 (en) 2018-08-03 2020-02-06 Cellular Research, Inc. Nuclei barcoding and capture in single cells
CN112912512A (zh) * 2018-08-17 2021-06-04 贝克顿迪金森公司 适配体条形码化
WO2020046833A1 (en) 2018-08-28 2020-03-05 Cellular Research, Inc. Sample multiplexing using carbohydrate-binding and membrane-permeable reagents
WO2020072380A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 Cellular Research, Inc. Determining 5' transcript sequences
US20210381025A1 (en) * 2018-10-31 2021-12-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and kits for detecting cells using oligonucleotide conjugated antibodies
EP3877520A1 (en) * 2018-11-08 2021-09-15 Becton Dickinson and Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
US11459607B1 (en) 2018-12-10 2022-10-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes
WO2020123384A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Cellular Research, Inc. Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
US11371076B2 (en) * 2019-01-16 2022-06-28 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
EP3914727A4 (en) * 2019-01-22 2022-11-30 Singular Genomics Systems, Inc. POLYNUCLEOTIDE BARCODES FOR MULTIPLEXED PROTEOMICS
EP3914728B1 (en) 2019-01-23 2023-04-05 Becton, Dickinson and Company Oligonucleotides associated with antibodies
US20220290262A1 (en) * 2019-01-25 2022-09-15 Psomagen Inc. Antibody-dna conjugates and hpv detection and treatment
US11834715B2 (en) 2019-01-28 2023-12-05 Becton, Dickinson And Company Oligonucleotide-comprising cellular component-binding reagents and methods of using the same
WO2020163789A1 (en) * 2019-02-08 2020-08-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Single cell/exosome/vesicle protein profiling
MX2021009640A (es) 2019-02-12 2021-10-13 Pact Pharma Inc Composiciones y metodos para la identificacion de celulas t especificas de antigenos.
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
CN113474657A (zh) * 2019-02-21 2021-10-01 丁勤学 使用微粒去除非特异性结合信号的方法
JP2022522220A (ja) * 2019-04-02 2022-04-14 ミッション バイオ インコーポレイテッド プロテオミクスプロファイリング及び特性決定のための方法及びシステム
US20200325522A1 (en) * 2019-04-02 2020-10-15 Mission Bio, Inc. Method and systems to characterize tumors and identify tumor heterogeneity
US10633693B1 (en) 2019-04-16 2020-04-28 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for leakage control in a particle capture system
US11965208B2 (en) 2019-04-19 2024-04-23 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
CN114072490A (zh) 2019-05-07 2022-02-18 伯乐实验室有限公司 用于自动化的单细胞加工的系统和方法
US11273439B2 (en) 2019-05-07 2022-03-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for target material retrieval from microwells
WO2020237222A1 (en) 2019-05-22 2020-11-26 Mission Bio, Inc. Method and apparatus for simultaneous targeted sequencing of dna, rna and protein
US10956806B2 (en) * 2019-06-10 2021-03-23 International Business Machines Corporation Efficient assembly of oligonucleotides for nucleic acid based data storage
US11724256B2 (en) 2019-06-14 2023-08-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for automated single cell processing and analyses
WO2021016239A1 (en) 2019-07-22 2021-01-28 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
MX2022001324A (es) * 2019-07-31 2022-05-19 Bioskryb Genomics Inc Análisis de células individuales.
EP4055160B1 (en) 2019-11-08 2024-04-10 Becton Dickinson and Company Using random priming to obtain full-length v(d)j information for immune repertoire sequencing
EP4065728A1 (en) 2019-11-25 2022-10-05 California Institute of Technology Quantitative analysis of single-cell proteins by identification and quantification separation (duet)
US20210171940A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Becton, Dickinson And Company Magnetic capture bead mediated molecular barcoding of nucleic acid targets in single particles and compositions for use in the same
WO2021146207A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
US20210214770A1 (en) 2020-01-13 2021-07-15 Becton, Dickinson And Company Cell capture using du-containing oligonucleotides
CN115427577A (zh) * 2020-01-15 2022-12-02 Absci公司 活性特异性细胞富集
CN115298322A (zh) 2020-01-17 2022-11-04 贝克顿迪金森公司 用于单细胞分泌组学的方法和组合物
WO2021155057A1 (en) 2020-01-29 2021-08-05 Becton, Dickinson And Company Barcoded wells for spatial mapping of single cells through sequencing
CN115427584A (zh) 2020-01-31 2022-12-02 贝克顿迪金森公司 嗜中温dna聚合酶延伸阻断物
EP4103744A2 (en) * 2020-02-12 2022-12-21 Becton, Dickinson and Company Intracellular abseq
US11504719B2 (en) 2020-03-12 2022-11-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for receiving and delivering a fluid for sample processing
WO2021188838A1 (en) * 2020-03-18 2021-09-23 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Single-cell combinatorial indexed cytometry sequencing
WO2021205453A1 (en) * 2020-04-07 2021-10-14 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Methods for nucleic acid detection
CN111471088B (zh) * 2020-04-21 2021-02-09 北京中科微盾生物科技有限责任公司 一种抑制sars-cov-2感染的多肽、组合物及其用途
EP4150118A1 (en) 2020-05-14 2023-03-22 Becton Dickinson and Company Primers for immune repertoire profiling
WO2021243285A1 (en) * 2020-05-29 2021-12-02 Seer, Inc. Systems and methods for rapid identification of proteins
CN115803445A (zh) 2020-06-02 2023-03-14 贝克顿迪金森公司 用于5撇基因表达测定的寡核苷酸和珠
WO2021254484A1 (en) * 2020-06-18 2021-12-23 The Chinese University Of Hong Kong Efficient antibody dna-barcoding reagents for multiplexed molecular imaging
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
WO2022026909A1 (en) 2020-07-31 2022-02-03 Becton, Dickinson And Company Single cell assay for transposase-accessible chromatin
US11492662B2 (en) * 2020-08-06 2022-11-08 Singular Genomics Systems, Inc. Methods for in situ transcriptomics and proteomics
EP4196581A4 (en) * 2020-08-19 2024-05-29 Encodia Inc SEQUENTIAL CODING METHODS AND RELATED KITS
US20240027433A1 (en) * 2020-09-15 2024-01-25 Somalogic Operating Co., Inc. Structure and methods for detection of sample analytes
WO2022108946A1 (en) 2020-11-17 2022-05-27 Becton, Dickinson And Company Combined analysis of cell-free nucleic acids and single cells for oncology diagnostics
EP4247967A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 Becton, Dickinson and Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
US20220162695A1 (en) 2020-11-20 2022-05-26 Becton, Dickinson And Company Use of dextramer in single cell analysis
US20220178909A1 (en) 2020-12-09 2022-06-09 Becton, Dickinson And Company Multiplexed single cell immunoassay
WO2022132206A1 (en) 2020-12-15 2022-06-23 Becton, Dickinson And Company Single cell secretome analysis
CN113322254B (zh) * 2021-01-06 2022-05-20 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 多靶点蛋白质-dna相互作用的研究方法和工具
CA3207486A1 (en) * 2021-01-08 2022-07-14 Cz Biohub Sf, Llc Bead-based assay for simultaneous detection of biomolecules
CN112725305B (zh) * 2021-01-13 2022-11-04 云南师范大学 热盐性敏感的菊粉酶突变体MutY119D及其制备方法
WO2022256345A1 (en) * 2021-06-01 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Methods and systems for engineering antibodies, and antigen-binding fragments thereof, to have altered characteristics
CN113340873B (zh) * 2021-08-09 2021-10-19 北京市疾病预防控制中心 一种同时检测多种有毒物质的sers体系
WO2023034739A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Becton, Dickinson And Company Template switch oligonucleotide (tso) for mrna 5' analysis
WO2023034794A1 (en) 2021-08-31 2023-03-09 Becton, Dickinson And Company Rna preservation and recovery from fixed cells
WO2023034789A1 (en) 2021-08-31 2023-03-09 Becton, Dickinson And Company Multiplexed proteomics analysis using oligonucleotide-conjugated antibodies
WO2023034790A1 (en) 2021-08-31 2023-03-09 Becton, Dickinson And Company Use of decoy polynucleotides in single cell multiomics
CN117916389A (zh) 2021-09-01 2024-04-19 贝克顿迪金森公司 使用原位逆转录的空间多组学
CN117999358A (zh) 2021-09-08 2024-05-07 贝克顿迪金森公司 用于检测抗体缀合的寡核苷酸的非测序的基于pcr的方法
CN117957330A (zh) 2021-09-14 2024-04-30 贝克顿迪金森公司 全长单细胞rna测序
WO2023150763A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Becton, Dickinson And Company Preparing nucleic acid for further analysis of their sequence
WO2023150764A1 (en) * 2022-02-07 2023-08-10 Becton, Dickinson And Company Sorting of mrna and abseq containing barcoded beads by flow
WO2023154694A1 (en) 2022-02-08 2023-08-17 Becton, Dickinson And Company Reference beads for linking imaging and sequencing readouts with single-cell resolution
WO2023172977A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Becton, Dickinson And Company Modified flow proxy assay prior to single-cell cite-seq
WO2023205018A1 (en) * 2022-04-18 2023-10-26 Becton, Dickinson And Company High-throughput flow cytometry analysis of highly multiplexed samples using sample indexing with specific binding member-fluor conjugates
WO2024017263A1 (en) * 2022-07-18 2024-01-25 Genans Biotechnology Co., Ltd Detection composition and use thereof
WO2024064962A2 (en) * 2022-09-23 2024-03-28 Slingshot Biosciences, Inc. Immuno-pcr and next generation sequencing for precise antigen quantitation
WO2024097263A1 (en) 2022-11-01 2024-05-10 Becton, Dickinson And Company Bead-based single cell secretome analysis
WO2024097718A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 Becton, Dickinson And Company Polymerase mediated end modification of abseq
WO2024097719A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 Becton, Dickinson And Company Application for peptide nucleic acid (pna) blocker
CN116949044B (zh) * 2023-09-20 2023-12-12 北京炫景瑞医药科技有限公司 一种双链寡链核苷酸、包含该双链寡核苷酸的缀合物以及它们的用途
CN117554601B (zh) * 2024-01-12 2024-03-15 杉木(深圳)生物科技有限公司 检测数据管理方法、装置、设备及存储介质

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014200767A1 (en) * 2013-06-12 2014-12-18 The General Hospital Corporation Methods, kits, and systems for multiplexed detection of target molecules and uses thereof
US20150133319A1 (en) * 2012-02-27 2015-05-14 Cellular Research, Inc. Compositions and kits for molecular counting
US20150299784A1 (en) * 2013-08-28 2015-10-22 Cellular Research, Inc. Massively parallel single cell analysis
KR20180085717A (ko) * 2015-09-24 2018-07-27 에이비비트로, 엘엘씨 친화성-올리고뉴클레오타이드 콘쥬게이트 및 그것의 사용

Family Cites Families (555)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4510244A (en) 1980-04-17 1985-04-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Cell labeling with antigen-coupled microspheres
US4725536A (en) 1985-09-19 1988-02-16 Genetics Institute, Inc. Reagent polynucleotide complex with multiple target binding regions, and kit and methods
US6150517A (en) 1986-11-24 2000-11-21 Gen-Probe Methods for making oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms
IE72468B1 (en) 1987-07-31 1997-04-09 Univ Leland Stanford Junior Selective amplification of target polynucleotide sequences
US5149625A (en) 1987-08-11 1992-09-22 President And Fellows Of Harvard College Multiplex analysis of DNA
US5656731A (en) 1987-10-15 1997-08-12 Chiron Corporation Nucleic acid-amplified immunoassay probes
US5124246A (en) 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
JPH04501353A (ja) 1988-07-26 1992-03-12 ジエネラブス・テクノロジーズ・インコーポレイテツド Ｒｎａ及びｄｎａ増幅法
US5925525A (en) 1989-06-07 1999-07-20 Affymetrix, Inc. Method of identifying nucleotide differences
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US6309822B1 (en) 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
US5871928A (en) 1989-06-07 1999-02-16 Fodor; Stephen P. A. Methods for nucleic acid analysis
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US6551784B2 (en) 1989-06-07 2003-04-22 Affymetrix Inc Method of comparing nucleic acid sequences
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5200314A (en) 1990-03-23 1993-04-06 Chiron Corporation Polynucleotide capture assay employing in vitro amplification
JP3164814B2 (ja) 1990-08-27 2001-05-14 科学技術振興事業団 均一化ｃＤＮＡライブラリーの作製法
DE69132843T2 (de) 1990-12-06 2002-09-12 Affymetrix Inc N D Ges D Staat Identifizierung von Nukleinsäuren in Proben
JPH04337446A (ja) 1991-05-15 1992-11-25 Hitachi Ltd 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置
US5981179A (en) 1991-11-14 1999-11-09 Digene Diagnostics, Inc. Continuous amplification reaction
US5424413A (en) 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5981176A (en) 1992-06-17 1999-11-09 City Of Hope Method of detecting and discriminating between nucleic acid sequences
EP0705271B1 (en) 1993-06-25 2002-11-13 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) Hybridization and sequencing of nucleic acids
US6087186A (en) 1993-07-16 2000-07-11 Irori Methods and apparatus for synthesizing labeled combinatorial chemistry libraries
US5500356A (en) 1993-08-10 1996-03-19 Life Technologies, Inc. Method of nucleic acid sequence selection
US6309823B1 (en) 1993-10-26 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes for analyzing biotransformation genes and methods of using the same
US5681697A (en) 1993-12-08 1997-10-28 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor
US5714330A (en) 1994-04-04 1998-02-03 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage
US6495518B1 (en) 1994-06-13 2002-12-17 Vanderbilt University Method for importing biologically active molecules into cells
GB2293238A (en) 1994-09-13 1996-03-20 Inceltec Ltd Primers for replication and/or amplification reactions
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
US6013445A (en) 1996-06-06 2000-01-11 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
US5604097A (en) 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
US5695934A (en) 1994-10-13 1997-12-09 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides
US6600996B2 (en) 1994-10-21 2003-07-29 Affymetrix, Inc. Computer-aided techniques for analyzing biological sequences
EP0709466B1 (en) 1994-10-28 2006-09-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for the simultaneous detection and quantification of multiple specific nucleic acid sequences
EP0822861B1 (en) 1995-04-25 2003-11-26 Discovery Partners International, Inc. Remotely programmable matrices with memories and uses thereof
US5648245A (en) 1995-05-09 1997-07-15 Carnegie Institution Of Washington Method for constructing an oligonucleotide concatamer library by rolling circle replication
US5968740A (en) 1995-07-24 1999-10-19 Affymetrix, Inc. Method of Identifying a Base in a Nucleic Acid
US5763175A (en) 1995-11-17 1998-06-09 Lynx Therapeutics, Inc. Simultaneous sequencing of tagged polynucleotides
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US6613544B1 (en) 1995-12-22 2003-09-02 Amgen Inc. Osteoprotegerin
US5962271A (en) 1996-01-03 1999-10-05 Cloutech Laboratories, Inc. Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end
US5830712A (en) 1996-02-06 1998-11-03 Allelix Biopharmaceuticals Inc. Selective template deletion method
US6458530B1 (en) 1996-04-04 2002-10-01 Affymetrix Inc. Selecting tag nucleic acids
AU730633B2 (en) 1996-05-29 2001-03-08 Phillip Belgrader Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
JPH1021373A (ja) 1996-07-05 1998-01-23 Fuji Photo Film Co Ltd 画像解析装置
US6984491B2 (en) 1996-07-29 2006-01-10 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US20020172953A1 (en) 1996-07-29 2002-11-21 Mirkin Chad A. Movement of biomolecule-coated nanoparticles in an electric field
US7169556B2 (en) 1996-07-29 2007-01-30 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6100029A (en) 1996-08-14 2000-08-08 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of chromosomal aberrations
WO1998015644A2 (en) 1996-09-27 1998-04-16 The Chinese University Of Hong Kong Parallel polynucleotide sequencing method
US6124092A (en) 1996-10-04 2000-09-26 The Perkin-Elmer Corporation Multiplex polynucleotide capture methods and compositions
US6117631A (en) 1996-10-29 2000-09-12 Polyprobe, Inc. Detection of antigens via oligonucleotide antibody conjugates
US6046005A (en) 1997-01-15 2000-04-04 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequencing with solid phase capturable terminators comprising a cleavable linking group
AU736321B2 (en) 1997-05-23 2001-07-26 Lynx Therapeutics, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
US6974669B2 (en) 2000-03-28 2005-12-13 Nanosphere, Inc. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles
US6399334B1 (en) 1997-09-24 2002-06-04 Invitrogen Corporation Normalized nucleic acid libraries and methods of production thereof
AU1603199A (en) 1997-12-03 1999-06-16 Curagen Corporation Methods and devices for measuring differential gene expression
US6265163B1 (en) 1998-01-09 2001-07-24 Lynx Therapeutics, Inc. Solid phase selection of differentially expressed genes
US6787308B2 (en) 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
US6653077B1 (en) 1998-09-04 2003-11-25 Lynx Therapeutics, Inc. Method of screening for genetic polymorphism
US6480791B1 (en) 1998-10-28 2002-11-12 Michael P. Strathmann Parallel methods for genomic analysis
US6197554B1 (en) 1998-11-20 2001-03-06 Shi-Lung Lin Method for generating full-length cDNA library from single cells
US6436675B1 (en) 1999-09-28 2002-08-20 Maxygen, Inc. Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling
US20020019005A1 (en) 1999-02-18 2002-02-14 Arcaris, Inc. Process for identification of genes encoding proteins having cell proliferation-promoting activity
US6629040B1 (en) 1999-03-19 2003-09-30 University Of Washington Isotope distribution encoded tags for protein identification
JP2002539849A (ja) 1999-03-26 2002-11-26 ホワイトヘッド インスチチュート フォアー バイオメディカル リサーチ ユニバーサルアレイ
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
US6699661B1 (en) 1999-04-20 2004-03-02 Kankyo Engineering Co., Ltd. Method for determining a concentration of target nucleic acid molecules, nucleic acid probes for the method, and method for analyzing data obtained by the method
US6372813B1 (en) 1999-06-25 2002-04-16 Motorola Methods and compositions for attachment of biomolecules to solid supports, hydrogels, and hydrogel arrays
US6326148B1 (en) 1999-07-12 2001-12-04 The Regents Of The University Of California Detection of copy number changes in colon cancer
US6440706B1 (en) 1999-08-02 2002-08-27 Johns Hopkins University Digital amplification
JP2001078768A (ja) 1999-09-16 2001-03-27 Otsuka Pharmaceut Co Ltd 遺伝子発現の測定法
SE9903988D0 (sv) 1999-11-03 1999-11-03 Amersham Pharm Biotech Ab Method of analysis
US6489114B2 (en) 1999-12-17 2002-12-03 Bio Merieux Process for labeling a ribonucleic acid, and labeled RNA fragments which are obtained thereby
JP4860869B2 (ja) 1999-12-29 2012-01-25 オックスフォード ジーン テクノロジー アイピー リミティド 固相支持体上の複数のポリヌクレオチドを増幅し、検出する方法
US7022479B2 (en) 2000-01-24 2006-04-04 Compound Therapeutics, Inc. Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis
US6489116B2 (en) 2000-01-24 2002-12-03 Phylos, Inc. Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis
US6235483B1 (en) 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
EP1990428B1 (en) 2000-02-07 2010-12-22 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US20050214825A1 (en) 2000-02-07 2005-09-29 John Stuelpnagel Multiplex sample analysis on universal arrays
GB2364054B (en) 2000-03-24 2002-05-29 Smithkline Beecham Corp Method of amplifying quinolone-resistance-determining-regions and identifying polymorphic variants thereof
ATE334228T1 (de) 2000-03-29 2006-08-15 Lgc Ltd Hybridisierungsprobe und methode zum schnellen nachweis und zur schnellen unterscheidung von sequenzen
DK2278030T3 (en) 2000-04-10 2017-07-24 Taxon Biosciences Inc METHODS OF RESEARCH AND GENETIC ANALYSIS OF POPULATIONS
US20030207300A1 (en) 2000-04-28 2003-11-06 Matray Tracy J. Multiplex analytical platform using molecular tags
US7630063B2 (en) 2000-08-02 2009-12-08 Honeywell International Inc. Miniaturized cytometer for detecting multiple species in a sample
US6511809B2 (en) 2000-06-13 2003-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter
US6531283B1 (en) 2000-06-20 2003-03-11 Molecular Staging, Inc. Protein expression profiling
DE60131194T2 (de) 2000-07-07 2008-08-07 Visigen Biotechnologies, Inc., Bellaire Sequenzbestimmung in echtzeit
EP1362121A2 (en) 2000-08-11 2003-11-19 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6934408B2 (en) 2000-08-25 2005-08-23 Amnis Corporation Method and apparatus for reading reporter labeled beads
DE60124363T2 (de) 2000-08-25 2007-09-06 Riken, Wako Methode zur Herstellung von genormten und/oder subtrahierten cDNA
DE60131903T2 (de) 2000-10-24 2008-11-27 The Board of Trustees of the Leland S. Stanford Junior University, Palo Alto Direkte multiplex charakterisierung von genomischer dna
EP1356109A2 (en) 2000-12-08 2003-10-29 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US20020142345A1 (en) 2000-12-22 2002-10-03 Nelsen Anita J. Methods for encoding and decoding complex mixtures in arrayed assays
US20030049616A1 (en) 2001-01-08 2003-03-13 Sydney Brenner Enzymatic synthesis of oligonucleotide tags
AU2002249116A1 (en) 2001-01-11 2002-09-19 Lion Bioscience Ag Gene library for screening methods
EP1364065B1 (en) 2001-01-25 2012-02-22 Luminex Molecular Diagnostics, Inc. Polynucleotides for use as tags and tag complements, manufacture and use thereof
EP1366197B1 (en) 2001-03-09 2007-05-09 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for amplification of rna sequences
JP2005233974A (ja) 2001-03-21 2005-09-02 Olympus Corp 生化学的検査方法
US7027932B2 (en) 2001-03-21 2006-04-11 Olympus Optical Co., Ltd. Biochemical examination method
ATE431853T1 (de) 2001-03-28 2009-06-15 Nanosphere Inc Auf oligonukleotid-modifizierten partikeln basierende bio-strichcodes
US20030170675A1 (en) 2001-04-11 2003-09-11 The Gov't Of The U.S Of America As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health & Human Serv. Methods of manipulating nucleic acids
EP1377683A4 (en) 2001-04-11 2004-09-08 Us Gov Health & Human Serv MODIFIED RANDOM SPRAYERS FOR PROBE MARKING
AUPR480901A0 (en) 2001-05-04 2001-05-31 Genomics Research Partners Pty Ltd Diagnostic method for assessing a condition of a performance animal
CA2344599C (en) 2001-05-07 2011-07-12 Bioneer Corporation Selective polymerase chain reaction of dna of which base sequence is completely unknown
US6905827B2 (en) 2001-06-08 2005-06-14 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases
EP1395805A4 (en) 2001-06-11 2005-03-09 Illumina Inc MULTIPLEXED DETECTION TECHNIQUES
JP4244534B2 (ja) 2001-06-12 2009-03-25 横河電機株式会社 バイオチップ
US7473767B2 (en) 2001-07-03 2009-01-06 The Institute For Systems Biology Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures
US6830931B2 (en) 2001-07-12 2004-12-14 Automated Cell, Inc. Method and apparatus for monitoring of proteins and cells
AU2002363062B2 (en) 2001-10-09 2007-03-22 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
WO2003031591A2 (en) 2001-10-10 2003-04-17 Superarray Bioscience Corporation Detecting targets by unique identifier nucleotide tags
US20030077611A1 (en) 2001-10-24 2003-04-24 Sention Methods and systems for dynamic gene expression profiling
CA2466821A1 (en) 2001-11-21 2003-06-05 Applera Corporation Digital assay
US20030175749A1 (en) 2001-12-08 2003-09-18 Jong-Yoon Chun Annealing control primer and its uses
WO2003062462A2 (en) 2002-01-16 2003-07-31 Dynal Biotech Asa Method for isolating nucleic acids and protein from a single sample
CA2474864A1 (en) 2002-01-29 2003-08-07 Patrik Ernfors Methods and means for amplifying nucleic acid
KR20040105717A (ko) 2002-02-14 2004-12-16 이뮤니베스트 코포레이션 저비용 세포 분석기에서의 세포 계산 방법 및 알고리즘
US20030186251A1 (en) 2002-04-01 2003-10-02 Brookhaven Science Associates, Llc Genome sequence tags
US20050175993A1 (en) 2002-04-12 2005-08-11 Chia-Lin Wei Method for making full-length coding sequence cDNA libraries
US6808906B2 (en) 2002-05-08 2004-10-26 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Directionally cloned random cDNA expression vector libraries, compositions and methods of use
US20070178478A1 (en) 2002-05-08 2007-08-02 Dhallan Ravinder S Methods for detection of genetic disorders
GB0212391D0 (en) 2002-05-29 2002-07-10 Axis Shield Asa Assay
US9371559B2 (en) 2002-06-20 2016-06-21 The Regents Of The University Of California Compositions for detection and analysis of polynucleotides using light harvesting multichromophores
US20050019776A1 (en) 2002-06-28 2005-01-27 Callow Matthew James Universal selective genome amplification and universal genotyping system
AU2003256285A1 (en) 2002-06-28 2004-01-19 Igen International, Inc. Improved assay systems and components
US7192700B2 (en) 2002-12-20 2007-03-20 Orchid Cellmark Inc. Methods and compositions for conducting primer extension and polymorphism detection reactions
JP4678516B2 (ja) 2002-08-16 2011-04-27 アヴァントラ バイオサイエンスィズ コーポレーション 材料の分離、反応、および顕微鏡分析のための基板
CN1694967B (zh) 2002-08-26 2010-12-15 加州大学评议会 利用集光多发色团的多核苷酸的检测和分析的方法以及组合物
ATE447040T1 (de) 2002-09-03 2009-11-15 Quanta Biosciences Inc Verbesserte zusammensetzungen und verfahren für die cdna-synthese
US7361821B2 (en) 2002-09-20 2008-04-22 Intel Corporation Controlled alignment of nanobarcodes encoding specific information for scanning probe microscopy (SPM) reading
WO2004031408A1 (en) 2002-09-30 2004-04-15 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for genotyping thymidylate synthase gene
JP5695287B2 (ja) 2002-10-02 2015-04-01 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー 微小流体の核酸解析
WO2004044225A2 (en) 2002-11-11 2004-05-27 Affymetrix, Inc. Methods for identifying dna copy number changes
US7822555B2 (en) 2002-11-11 2010-10-26 Affymetrix, Inc. Methods for identifying DNA copy number changes
US7704687B2 (en) 2002-11-15 2010-04-27 The Johns Hopkins University Digital karyotyping
CA2510166A1 (en) 2002-12-20 2004-09-30 Caliper Life Sciences, Inc. Single molecule amplification and detection of dna
WO2004066185A1 (en) 2003-01-23 2004-08-05 U.S. Genomics, Inc. Methods for analyzing polymer populations
US7575865B2 (en) 2003-01-29 2009-08-18 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
US8206913B1 (en) 2003-03-07 2012-06-26 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process
WO2004081225A2 (en) 2003-03-07 2004-09-23 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a dna polymerization process
US7269518B2 (en) 2003-04-30 2007-09-11 Agilent Technologies, Inc. Chemical array reading
US20040259118A1 (en) 2003-06-23 2004-12-23 Macevicz Stephen C. Methods and compositions for nucleic acid sequence analysis
CN101001960A (zh) * 2003-06-27 2007-07-18 西北大学 基于生物条形码检测靶分析物
WO2005010145A2 (en) 2003-07-05 2005-02-03 The Johns Hopkins University Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations
EP1651776A2 (de) 2003-07-24 2006-05-03 Qiagen GmbH Verfahren zur reversen transkription und/oder amplifikation von nukleinsäuren
JP2007502116A (ja) 2003-08-13 2007-02-08 アフィメトリックス インコーポレイテッド 核酸サンプルを調製するための方法およびキット
GB0319332D0 (en) 2003-08-16 2003-09-17 Astrazeneca Ab Amplification
US20050048498A1 (en) 2003-08-29 2005-03-03 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for assembling probes
US7341837B2 (en) 2003-09-02 2008-03-11 Lawton Robert L Soluble analyte detection and amplification
US7354706B2 (en) 2003-09-09 2008-04-08 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event
JP5171037B2 (ja) 2003-09-10 2013-03-27 アルセア・ディーエックス，インク． マイクロアレイを用いた発現プロファイリング
JP2007512811A (ja) 2003-11-10 2007-05-24 インベスチゲン， インコーポレイテッド 検出のための核酸を調製する方法
CA2552858A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Lingvitae As Improving polynucleotide ligation reactions
AU2005214329A1 (en) 2004-02-12 2005-09-01 Population Genetics Technologies Ltd Genetic analysis by sequence-specific sorting
US20100216153A1 (en) 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
US7432055B2 (en) 2004-03-05 2008-10-07 Uchicago Argonne Llc Dual phase multiplex polymerase chain reaction
ES2527426T3 (es) 2004-05-07 2015-01-23 Cepheid Detección combinada de agentes biológicos
WO2005111242A2 (en) 2004-05-10 2005-11-24 Parallele Bioscience, Inc. Digital profiling of polynucleotide populations
JP2008505345A (ja) 2004-06-07 2008-02-21 アイアールエム エルエルシー 分注システム、ソフトウェア、および関連する方法
US20060035258A1 (en) 2004-08-06 2006-02-16 Affymetrix, Inc. Methods for identifying DNA copy number changes
US20060041385A1 (en) 2004-08-18 2006-02-23 Bauer Kenneth D Method of quantitating proteins and genes in cells using a combination of immunohistochemistry and in situ hybridization
US7713697B2 (en) 2004-08-27 2010-05-11 Gen-Probe Incorporated Methods and kits for amplifying DNA
EP1794173B1 (en) 2004-09-10 2010-08-04 Human Genetic Signatures PTY Ltd Amplification blocker comprising intercalating nucleic acids (ina) containing intercalating pseudonucleotides (ipn)
EP1647600A3 (en) 2004-09-17 2006-06-28 Affymetrix, Inc. (A US Entity) Methods for identifying biological samples by addition of nucleic acid bar-code tags
US7435084B2 (en) 2004-12-14 2008-10-14 Align Technology, Inc. System and methods for casting physical tooth model
JP5188808B2 (ja) 2004-11-03 2013-04-24 アイリス モレキュラー ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 同種の分析物検出
WO2006071770A2 (en) 2004-12-23 2006-07-06 I-Stat Corporation Molecular diagnostics system and methods
DK1836302T3 (da) 2004-12-23 2010-08-02 Ge Healthcare Bio Sciences Ligeringsbaseret RNA-amplifikation
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
US7407757B2 (en) 2005-02-10 2008-08-05 Population Genetics Technologies Genetic analysis by sequence-specific sorting
EP1845160A4 (en) 2005-02-10 2009-07-01 Riken NUCLEOTIDE-amplification
EP1856293A2 (en) 2005-03-16 2007-11-21 Compass Genetics, Llc Methods and compositions for assay readouts on multiple analytical platforms
EP2518161A1 (en) 2005-03-18 2012-10-31 Fluidigm Corporation Method for detection of mutant alleles
US20090264635A1 (en) 2005-03-25 2009-10-22 Applera Corporation Methods and compositions for depleting abundant rna transcripts
US7695886B2 (en) 2005-05-19 2010-04-13 Fuji Xerox Co., Ltd. Process for producing resin particle liquid dispersion for electrostatic image developing toner, electrostatic image developing toner and production process thereof
US20060263789A1 (en) 2005-05-19 2006-11-23 Robert Kincaid Unique identifiers for indicating properties associated with entities to which they are attached, and methods for using
US8407013B2 (en) 2005-06-07 2013-03-26 Peter K. Rogan AB initio generation of single copy genomic probes
US20070065844A1 (en) 2005-06-08 2007-03-22 Massachusetts Institute Of Technology Solution-based methods for RNA expression profiling
US7796815B2 (en) 2005-06-10 2010-09-14 The Cleveland Clinic Foundation Image analysis of biological objects
US20070020640A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Mccloskey Megan L Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis
US8486621B2 (en) 2005-08-11 2013-07-16 Cornell Research Foundation, Inc. Nucleic acid-based matrixes
CA2620081A1 (en) 2005-09-16 2007-03-29 454 Life Sciences Corporation Cdna library preparation
US8831887B2 (en) 2005-10-12 2014-09-09 The Research Foundation For The State University Of New York Absolute PCR quantification
US8313711B2 (en) 2005-11-01 2012-11-20 Freeslate, Inc. Liquid dispensing for high-throughput experimentation
US7375211B2 (en) 2005-11-18 2008-05-20 Kou Zhong C Method for detection and quantification of T-cell receptor Vβ repertoire
US20080070303A1 (en) 2005-11-21 2008-03-20 West Michael D Methods to accelerate the isolation of novel cell strains from pluripotent stem cells and cells obtained thereby
US7636465B2 (en) 2005-12-09 2009-12-22 Cytyc Corporation Cross-frame object reconstruction for image-based cytology applications
US7544473B2 (en) 2006-01-23 2009-06-09 Population Genetics Technologies Ltd. Nucleic acid analysis using sequence tokens
US7537897B2 (en) 2006-01-23 2009-05-26 Population Genetics Technologies, Ltd. Molecular counting
US8492098B2 (en) 2006-02-21 2013-07-23 The Trustees Of Tufts College Methods and arrays for target analyte detection and determination of reaction components that affect a reaction
US20080038727A1 (en) 2006-03-10 2008-02-14 Applera Corporation MicroRNA and Messenger RNA Detection on Arrays
EP2002246A1 (en) 2006-04-04 2008-12-17 Sidec Technologies AB Extended electron tomography
US20080194414A1 (en) 2006-04-24 2008-08-14 Albert Thomas J Enrichment and sequence analysis of genomic regions
WO2007136874A2 (en) 2006-05-18 2007-11-29 President And Fellows Of Harvard College Genomic library construction
US7833716B2 (en) 2006-06-06 2010-11-16 Gen-Probe Incorporated Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods
CA2655272C (en) 2006-06-14 2017-04-18 Living Microsystems, Inc. Rare cell analysis using sample splitting and dna tags
WO2008021123A1 (en) 2006-08-07 2008-02-21 President And Fellows Of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
WO2008021290A2 (en) 2006-08-09 2008-02-21 Homestead Clinical Corporation Organ-specific proteins and methods of their use
US20100159590A1 (en) 2006-10-05 2010-06-24 Nanopoint, Inc. Systems and methods for active microfluidic cell handling
CN101553579B (zh) 2006-10-06 2016-01-20 赛里根有限公司 用于定向生物标志物信号放大的荧光方法和材料
WO2008057163A2 (en) 2006-10-09 2008-05-15 Carnegie Mellon University Preparation of functional gel particles with a dual crosslink network
CN101542298B (zh) 2006-10-18 2012-06-13 大崎电气工业株式会社 电子电度表
US20100184152A1 (en) 2006-10-23 2010-07-22 Vladislav Sandler Target-oriented whole genome amplification of nucleic acids
ES2679996T3 (es) 2006-11-15 2018-09-03 Biospherex Llc Secuenciación multi-etiqueta y análisis ecogenómico
US8050476B2 (en) 2006-11-22 2011-11-01 General Electric Company Heart rate demodulation of periodic movement in ultrasound data for object identification
EP2674751B1 (en) 2006-12-14 2017-02-01 Life Technologies Corporation Apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
WO2008087869A1 (ja) 2007-01-16 2008-07-24 Olympus Corporation 蛍光信号解析装置および蛍光信号解析方法
US9063133B2 (en) 2007-01-30 2015-06-23 The Regents Of The University Of California Methods and devices for biomolecular arrays
US20080269068A1 (en) 2007-02-06 2008-10-30 President And Fellows Of Harvard College Multiplex decoding of sequence tags in barcodes
WO2008096318A2 (en) 2007-02-09 2008-08-14 Koninklijke Philips Electronics N.V. Identification system
US8003312B2 (en) 2007-02-16 2011-08-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Multiplex cellular assays using detectable cell barcodes
WO2008104380A2 (en) 2007-02-27 2008-09-04 Sentoclone Ab Multiplex detection of tumour cells using a panel of agents binding to extracellular markers
US9029085B2 (en) 2007-03-07 2015-05-12 President And Fellows Of Harvard College Assays and other reactions involving droplets
KR100882711B1 (ko) 2007-03-12 2009-02-06 성균관대학교산학협력단 사이크로박터 스피시스 ｈｊ147 균주 유래의 우라실-ｄｎａ글리코실라제 및 이의 용도
JP2008256428A (ja) 2007-04-03 2008-10-23 Intec Systems Institute Inc マイクロアレイ画像のブロック位置検出方法
US20080268508A1 (en) 2007-04-30 2008-10-30 Sowlay Mohankumar R Methods and kits for negative selection of desired nucleic acid sequences
US20080274458A1 (en) 2007-05-01 2008-11-06 Latham Gary J Nucleic acid quantitation methods
US20090061513A1 (en) 2007-05-15 2009-03-05 Picovitro Ab Cell sorting and cell cultivation methods
US20090105959A1 (en) 2007-06-01 2009-04-23 Braverman Michael S System and method for identification of individual samples from a multiplex mixture
EP2395113A1 (en) 2007-06-29 2011-12-14 Population Genetics Technologies Ltd. Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants
ES2391906T3 (es) * 2007-09-12 2012-11-30 Institut Pasteur Polinucleótido apto para un ensayo indicador basado en una sola célula para controlar los patrones de expresión génica con una resolución espacio-temporal elevada
EP3136103B1 (en) 2007-10-05 2018-08-29 Affymetrix, Inc. Highly multiplexed assays
WO2009105670A2 (en) 2008-02-21 2009-08-27 Gentel Biosciences, Inc. Substrates for multiplexed assays and uses thereof
US8687189B2 (en) 2008-03-03 2014-04-01 Ajjer, Llc Analysis of arrays by laser induced breakdown spectroscopy
US8206925B2 (en) 2008-04-14 2012-06-26 Medical Diagnostic Laboratories, Llc Splice variants of human IL-23 receptor (IL-23R) mRNA and use of a delta 9 isoform in predicting inflammatory bowel diseases
US20090298709A1 (en) 2008-05-28 2009-12-03 Affymetrix, Inc. Assays for determining telomere length and repeated sequence copy number
DE102008025656B4 (de) 2008-05-28 2016-07-28 Genxpro Gmbh Verfahren zur quantitativen Analyse von Nukleinsäuren, Marker dafür und deren Verwendung
WO2009148560A2 (en) 2008-05-30 2009-12-10 Board Of Regents, The Universtiy Of Texas System Methods and compositions for nucleic acid sequencing
WO2010021936A1 (en) 2008-08-16 2010-02-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Digital pcr calibration for high throughput sequencing
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US8835110B2 (en) 2008-11-04 2014-09-16 The Johns Hopkins University DNA integrity assay (DIA) for cancer diagnostics, using confocal fluorescence spectroscopy
US8309306B2 (en) * 2008-11-12 2012-11-13 Nodality, Inc. Detection composition
CN102317779A (zh) 2008-11-21 2012-01-11 圣路易大学 检测目标物多个表位的生物感应器
US20100159533A1 (en) 2008-11-24 2010-06-24 Helicos Biosciences Corporation Simplified sample preparation for rna analysis
US8492096B2 (en) 2008-12-24 2013-07-23 Boris Pasche TGFBR1 expression modifies risk for colorectal cancer
KR20110138340A (ko) 2009-01-20 2011-12-27 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 약물 타겟을 진단, 예후 예측 및 동정하기 위한 단일 세포 유전자 발현
US20100323348A1 (en) 2009-01-31 2010-12-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods and Compositions for Using Error-Detecting and/or Error-Correcting Barcodes in Nucleic Acid Amplification Process
CN102341386A (zh) 2009-03-05 2012-02-01 第一三共株式会社 吡啶衍生物
EP2230312A1 (en) 2009-03-19 2010-09-22 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Probe compound for detecting and isolating enzymes and means and methods using the same
EP3495498B1 (en) 2009-03-30 2021-10-27 Illumina, Inc. Gene expression analysis in single cells
CA2757560C (en) 2009-04-02 2018-11-13 Fluidigm Corporation Multi-primer amplification method for barcoding of target nucleic acids
WO2010127186A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
WO2010131645A1 (ja) 2009-05-14 2010-11-18 和光純薬工業株式会社 Rnaに対応する二本鎖dnaの合成方法及び増幅方法
FR2945545B1 (fr) 2009-05-14 2011-08-05 Univ Aix Marseille Ii Methode de detection d'adn procaryote extrait d'un echantillon de selles
US8673627B2 (en) 2009-05-29 2014-03-18 Life Technologies Corporation Apparatus and methods for performing electrochemical reactions
GB0909923D0 (en) 2009-06-09 2009-07-22 Oxford Gene Tech Ip Ltd Picowell capture devices for analysing single cells or other particles
WO2010151807A1 (en) 2009-06-26 2010-12-29 Sirigen, Inc. Signal amplified biological detection with conjugated polymers
JP5785942B2 (ja) 2009-06-29 2015-09-30 ルミネックス コーポレーション ヘアピンコンフォメーションを有するキメラプライマーおよびその使用法
US8330957B2 (en) 2009-06-29 2012-12-11 Hager Enviromental and Atmospheric Technologies, LLC Device and method for quantification of gases in plumes by remote sensing
EP3029141A1 (en) 2009-08-20 2016-06-08 Population Genetics Technologies Ltd. Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement
WO2011028818A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Trustees Of Boston University High throughput multichannel reader and uses thereof
RU2552215C2 (ru) 2009-09-01 2015-06-10 Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. Устройство и способ отбора нуклеиновых кислот с помощью микроматриц
US9625454B2 (en) 2009-09-04 2017-04-18 The Research Foundation For The State University Of New York Rapid and continuous analyte processing in droplet microfluidic devices
WO2011041308A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Quest Diagnostics Investments Incorporated Bcr-abl truncation mutations
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
EP2513341B1 (en) 2010-01-19 2017-04-12 Verinata Health, Inc Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic dna by whole genome sequencing
CN103328532B (zh) 2010-01-19 2016-05-25 赛里根Ii有限公司 用于定向生物标志信号放大的试剂
EP3492601B1 (en) 2010-01-19 2022-01-05 Verinata Health, Inc. Novel protocol for preparing sequencing libraries
CN102725424B (zh) 2010-01-25 2014-07-09 Rd生物科技公司 靶核酸的自折叠扩增
EP2534267B1 (en) 2010-02-12 2018-04-11 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
JP5901046B2 (ja) 2010-02-19 2016-04-06 国立大学法人 千葉大学 ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント
WO2011106738A2 (en) 2010-02-25 2011-09-01 Fred Hutchinson Cancer Research Center Use of tcr clonotypes as biomarkers for disease
US8951940B2 (en) 2010-04-01 2015-02-10 Illumina, Inc. Solid-phase clonal amplification and related methods
JP5893607B2 (ja) 2010-04-05 2016-03-23 プログノシス バイオサイエンシズ インコーポレイテッドＰｒｏｇｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ． 空間コード化生物学的アッセイ
WO2011143659A2 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Fluidigm Corporation Nucleic acid isolation methods
US8828688B2 (en) 2010-05-27 2014-09-09 Affymetrix, Inc. Multiplex amplification methods
WO2011155833A2 (en) 2010-06-09 2011-12-15 Keygene N.V. Combinatorial sequence barcodes for high throughput screening
US20120004132A1 (en) 2010-07-02 2012-01-05 Affymetrix, Inc. Detection of Nucleic Acids and Proteins
WO2012004834A1 (ja) 2010-07-07 2012-01-12 株式会社アドバンテスト 試験装置および試験方法
EP2407242A1 (en) 2010-07-13 2012-01-18 Dublin City University Direct clone analysis and selection technology
GB201011971D0 (en) 2010-07-15 2010-09-01 Olink Ab Methods and product
US20120040843A1 (en) 2010-08-12 2012-02-16 Dublin City University Centrifugal capture system
WO2012027503A2 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of measuring adaptive immunity
CN110878345A (zh) 2010-09-21 2020-03-13 安捷伦科技有限公司 通过分子计数提高等位基因调用的置信度
EP2436766A1 (en) 2010-09-29 2012-04-04 Deutsches Krebsforschungszentrum Means and methods for improved protein interaction screening
WO2012042374A2 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Anssi Jussi Nikolai Taipale Method of determining number or concentration of molecules
CA2814049C (en) 2010-10-08 2021-07-13 President And Fellows Of Harvard College High-throughput single cell barcoding
US20120088691A1 (en) 2010-10-08 2012-04-12 Gao Chen Highly multiplexed real-time pcr using encoded microbeads
US20130225623A1 (en) 2010-10-27 2013-08-29 Mount Sinai School Of Medicine Methods of Treating Psychiatric or Neurological Disorders with MGLUR Antagonists
CN103649713B (zh) 2010-11-29 2017-03-01 丹麦达科有限公司 由可编程性定量检定所处理的样本的图像分析方法和体系
US9394511B2 (en) 2010-12-05 2016-07-19 Wenbin Jiang Rapid single cell based parallel biological cell sorter
CN103403545B (zh) 2010-12-09 2018-06-22 阿科尼生物系统公司 样本分析系统
US20140057799A1 (en) 2010-12-16 2014-02-27 Gigagen System and Methods for Massively Parallel Analysis of Nucleic Acids in Single Cells
CA2821906C (en) 2010-12-22 2020-08-25 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US10241075B2 (en) 2010-12-30 2019-03-26 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer readable media for nucleic acid sequencing
ES2632768T3 (es) 2011-01-17 2017-09-15 Life Technologies Corporation Flujo de trabajo para la detección de ligandos empleando ácidos nucleicos
WO2012103154A1 (en) 2011-01-24 2012-08-02 Nugen Technologies, Inc. Stem-loop composite rna-dna adaptor-primers: compositions and methods for library generation, amplification and other downstream manipulations
US20120190020A1 (en) 2011-01-25 2012-07-26 Aria Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
WO2012106385A2 (en) 2011-01-31 2012-08-09 Apprise Bio, Inc. Methods of identifying multiple epitopes in cells
US9365897B2 (en) 2011-02-08 2016-06-14 Illumina, Inc. Selective enrichment of nucleic acids
EP3736281A1 (en) 2011-02-18 2020-11-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
CA2827948C (en) 2011-02-23 2019-07-09 Board Of Regents, University Of Texas System Use of template switching for dna synthesis
WO2012129363A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
KR20120110431A (ko) 2011-03-29 2012-10-10 에스케이하이닉스 주식회사 반도체 메모리 장치
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
CN103748236B (zh) 2011-04-15 2018-12-25 约翰·霍普金斯大学 安全测序系统
US8946389B2 (en) 2011-04-25 2015-02-03 University Of Washington Compositions and methods for multiplex biomarker profiling
CN103717749A (zh) 2011-04-25 2014-04-09 伯乐生命医学产品有限公司 用于核酸分析的方法和组合物
SI3415619T1 (sl) 2011-04-28 2021-04-30 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Office of the General Counsel Building 170, Third Floor, Main Quad Identifikacija polinukleotidov, povezanih z vzorcem
GB201108259D0 (en) 2011-05-17 2011-06-29 Cambridge Entpr Ltd Gel beads in microfluidic droplets
WO2012162267A2 (en) 2011-05-20 2012-11-29 Fluidigm Corporation Nucleic acid encoding reactions
RS62497B1 (sr) 2011-05-24 2021-11-30 BioNTech SE Individualizovane vakcine protiv kancera
WO2012162621A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Brandeis University Methods for suppression pcr
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
US9752176B2 (en) 2011-06-15 2017-09-05 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods for preparative in vitro cloning
WO2012177639A2 (en) 2011-06-22 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bioprocessing and bioproduction using avian cell lines
US20140147860A1 (en) 2011-06-27 2014-05-29 Life Technologies Corporation Acoustic Cytometry Methods and Protocols
KR101454886B1 (ko) 2011-08-01 2014-11-03 주식회사 셀레믹스 핵산분자의 제조방법
US10364464B2 (en) 2011-08-08 2019-07-30 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for co-amplifying subsequences of a nucleic acid fragment sequence
JP5816486B2 (ja) 2011-08-18 2015-11-18 オリンパス株式会社 蛍光観察装置および蛍光観察システム並びに蛍光観察装置の蛍光画像処理方法
DK2756098T3 (en) 2011-09-16 2018-09-03 Lexogen Gmbh Process for Preparing a Library of Nucleic Acid Molecules
US9297047B2 (en) 2011-10-24 2016-03-29 Jennifer Furchak Molecular beacon based assay for the detection of biomarkers for breast cancer metastasis
EP2776833B1 (en) 2011-11-11 2018-09-05 Eli N. Glezer Co-binder assisted assay methods
KR101337094B1 (ko) 2011-11-30 2013-12-05 삼성에스디에스 주식회사 염기 서열 정렬 장치 및 그 방법
EP2794927B1 (en) 2011-12-22 2017-04-12 Ibis Biosciences, Inc. Amplification primers and methods
WO2013117595A2 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Illumina Cambridge Limited Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support
WO2013120089A1 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Raindance Technologies, Inc. Molecular diagnostic screening assay
WO2013123125A1 (en) 2012-02-17 2013-08-22 President And Fellows Of Harvard College Assembly of nucleic acid sequences in emulsions
US9176031B2 (en) 2012-02-24 2015-11-03 Raindance Technologies, Inc. Labeling and sample preparation for sequencing
ES2776673T3 (es) 2012-02-27 2020-07-31 Univ North Carolina Chapel Hill Métodos y usos para etiquetas moleculares
WO2013137737A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Flexgen B.V. Methods of creating and screening of dna encoded combinatorial libraries of chemical antibodies
US9803239B2 (en) 2012-03-29 2017-10-31 Complete Genomics, Inc. Flow cells for high density array chips
EP2831591B1 (en) * 2012-03-30 2019-05-08 GE Healthcare Bio-Sciences Corp. Immunoflu0rescence and fluorescent-based nucleic acid analysis on a single sample
EP2647426A1 (en) 2012-04-03 2013-10-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Replication of distributed nucleic acid molecules with preservation of their relative distribution through hybridization-based binding
SG10201507700VA (en) 2012-05-08 2015-10-29 Adaptive Biotechnologies Corp Compositions and method for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed pcr reactions
ES2899687T3 (es) 2012-05-14 2022-03-14 Irepertoire Inc Método para aumentar la precisión en la detección cuantitativa de polinucleótidos
SG11201407901PA (en) 2012-05-21 2015-01-29 Fluidigm Corp Single-particle analysis of particle populations
CN108587867B (zh) 2012-05-25 2021-12-17 北卡罗来纳-查佩尔山大学 微流体装置、用于试剂的固体支持体和相关方法
CA2876209A1 (en) 2012-06-15 2013-12-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Uniquely tagged rearranged adaptive immune receptor genes in a complex gene set
CN104619862B (zh) 2012-06-15 2017-10-31 得克萨斯系统大学董事会 单细胞的多转录物的高通量测序
WO2013191775A2 (en) 2012-06-18 2013-12-27 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
ES2637538T3 (es) 2012-07-17 2017-10-13 Counsyl, Inc. Sistema y métodos para la detección de una variación genética
WO2014015098A1 (en) 2012-07-18 2014-01-23 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. A method of normalizing biological samples
US20150247182A1 (en) 2012-07-24 2015-09-03 Adaptive Biotechnologies Corp. Single cell analysis using sequence tags
DK3428290T3 (da) 2012-07-26 2022-07-04 Illumina Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til amplifikation af nukleinsyrer
CN105264088B (zh) 2012-08-08 2018-12-28 豪夫迈·罗氏有限公司 提高鉴定细胞中的多个表位的动态范围
US10584381B2 (en) 2012-08-14 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CN114891871A (zh) 2012-08-14 2022-08-12 10X基因组学有限公司 微胶囊组合物及方法
US20140378349A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20150005199A1 (en) 2012-08-14 2015-01-01 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20150005200A1 (en) 2012-08-14 2015-01-01 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20140378322A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20140378345A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP4148118A1 (en) 2012-08-24 2023-03-15 Yale University System, device and method for high-throughput multi-plexed detection
EP2909337B1 (en) 2012-10-17 2019-01-09 Spatial Transcriptomics AB Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
WO2015160439A2 (en) 2014-04-17 2015-10-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
GB201218909D0 (en) * 2012-10-22 2012-12-05 Univ Singapore Assay for the parallel detection of biological material based on PCR
JP6454281B2 (ja) 2012-11-05 2019-01-16 タカラ バイオ ユーエスエー， インコーポレイテッド バーコード化する核酸
EP2931919B1 (en) 2012-12-14 2019-02-20 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014108850A2 (en) 2013-01-09 2014-07-17 Yeda Research And Development Co. Ltd. High throughput transcriptome analysis
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
WO2014116729A2 (en) 2013-01-22 2014-07-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Haplotying of hla loci with ultra-deep shotgun sequencing
CN104955576A (zh) 2013-01-24 2015-09-30 沙特基础全球技术有限公司 由聚酯-聚碳酸酯制成的微孔板
US10017761B2 (en) 2013-01-28 2018-07-10 Yale University Methods for preparing cDNA from low quantities of cells
EP2951557B1 (en) 2013-02-01 2022-10-05 Becton Dickinson and Company Methods and systems for assessing sample behavior in a flow cytometer
WO2014124046A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Affinity-based partition assay for detection of target molecules
EP2954065B1 (en) 2013-02-08 2021-07-28 10X Genomics, Inc. Partitioning and processing of analytes and other species
WO2014126937A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Suspension arrays and multiplexed assays based thereon
US9621600B2 (en) 2013-02-26 2017-04-11 PortAura Group Method and system for providing recommendations using location information
US20140274811A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Lyle J. Arnold Methods for Amplifying a Complete Genome or Transcriptome
US9255265B2 (en) 2013-03-15 2016-02-09 Illumina, Inc. Methods for producing stranded cDNA libraries
WO2014144495A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abvitro, Inc. Single cell bar-coding for antibody discovery
US9938523B2 (en) 2013-03-15 2018-04-10 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Nucleic acid-tagged compositions and methods for multiplexed protein-protein interaction profiling
US9328382B2 (en) 2013-03-15 2016-05-03 Complete Genomics, Inc. Multiple tagging of individual long DNA fragments
WO2014144822A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Immumetrix, Inc. Methods and compositions for tagging and analyzing samples
WO2014165762A1 (en) 2013-04-05 2014-10-09 Raindance Technologies, Inc. Rare cell analysis after negative selection
WO2014176575A1 (en) 2013-04-25 2014-10-30 Firefly Bioworks, Inc. Multiplexed analysis of target nucleic acids
US10822605B2 (en) 2013-05-03 2020-11-03 Gensinta, Inc. Method and apparatus for producing sequence verified DNA
EP2805769A1 (en) 2013-05-24 2014-11-26 European Molecular Biology Laboratory Methods for nano-scale single cell analysis
WO2014201273A1 (en) 2013-06-12 2014-12-18 The Broad Institute, Inc. High-throughput rna-seq
US20150011397A1 (en) 2013-06-17 2015-01-08 Kim Lewis Methods for quantitative determination of multiple proteins in complex mixtures
EP3013983B1 (en) 2013-06-25 2023-02-15 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays using a microfluidic device
KR102642680B1 (ko) 2013-06-27 2024-03-04 10엑스 제노믹스, 인크. 샘플 처리를 위한 조성물 및 방법
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
US20160153973A1 (en) 2013-07-09 2016-06-02 Lucas David Smith Device and method of rapid linker mediated label-based immunoassays
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
US20150132743A1 (en) 2013-09-04 2015-05-14 Fluidigm Corporation Proximity assays for detecting nucleic acids and proteins in a single cell
GB201317301D0 (en) 2013-09-30 2013-11-13 Linnarsson Sten Method for capturing and encoding nucleic acid from a plurality of single cells
ES2875998T3 (es) 2013-09-30 2021-11-11 Vesicode Ab Procedimientos de perfilado de complejos moleculares mediante el uso de códigos de barras dependientes de la proximidad
EP3055676A1 (en) 2013-10-07 2016-08-17 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
EP3058092B1 (en) 2013-10-17 2019-05-22 Illumina, Inc. Methods and compositions for preparing nucleic acid libraries
WO2015061719A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Massachusetts Institute Of Technology Method and apparatus for tracking cell identity
WO2015061844A1 (en) 2013-10-30 2015-05-07 The University Of Sydney Assay to stratify cancer patients
WO2015070037A2 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Prognosys Biosciences, Inc. Polynucleotide conjugates and methods for analyte detection
EP4094834A1 (en) 2013-12-30 2022-11-30 Atreca, Inc. Analysis of nucleic acids associated with single cells using nucleic acid barcodes
EP4219744A3 (en) 2014-01-27 2023-08-30 The General Hospital Corporation Methods of preparing nucleic acids for sequencing
WO2015117163A2 (en) 2014-02-03 2015-08-06 Integrated Dna Technologies, Inc. Methods to capture and/or remove highly abundant rnas from a heterogeneous rna sample
EP3126512B1 (en) 2014-02-26 2019-04-17 Ventana Medical Systems, Inc. Photo-selective method for biological sample analysis field
EP3114240B1 (en) 2014-03-05 2019-07-24 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
US20150298091A1 (en) 2014-04-21 2015-10-22 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for barcoding nucleic acids
US20170044525A1 (en) 2014-04-29 2017-02-16 Illumina, Inc. Multiplexed single cell gene expression analysis using template switch and tagmentation
US10975371B2 (en) 2014-04-29 2021-04-13 Illumina, Inc. Nucleic acid sequence analysis from single cells
RU2708992C2 (ru) 2014-05-19 2019-12-12 Уильям Марш Райс Юниверсити Аллель-специфическая амплификация с использованием композиции перекрывающихся олигонуклеотидов в качестве не являющегося аллель-специфическим праймера и аллель-специфического блокатора
CN105392902B (zh) 2014-06-24 2021-10-29 生物辐射实验室股份有限公司 数字式pcr条码化
KR20230070325A (ko) 2014-06-26 2023-05-22 10엑스 제노믹스, 인크. 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법
CA2953469A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 10X Genomics, Inc. Analysis of nucleic acid sequences
EP3626834B1 (en) 2014-07-15 2022-09-21 Qiagen Sciences, LLC Semi-random barcodes for nucleic acid analysis
WO2016040446A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Good Start Genetics, Inc. Methods for selectively suppressing non-target sequences
KR102541849B1 (ko) 2014-09-15 2023-06-09 에이비비트로, 엘엘씨 고-처리량 뉴클레오티드 라이브러리 서열결정
US9529672B2 (en) 2014-09-25 2016-12-27 Everspin Technologies Inc. ECC word configuration for system-level ECC compatibility
AU2015331739B2 (en) 2014-10-17 2021-12-02 Illumina Cambridge Limited Contiguity preserving transposition
CN107110849B (zh) 2014-12-19 2019-07-26 豪夫迈·罗氏有限公司 在选定的细胞亚群中鉴别多个表位的方法
WO2016118915A1 (en) 2015-01-22 2016-07-28 Becton, Dickinson And Company Devices and systems for molecular barcoding of nucleic acid targets in single cells
EP3247804B1 (en) 2015-01-23 2020-08-05 Qiagen Sciences, LLC High multiplex pcr with molecular barcoding
EP3253479B1 (en) 2015-02-04 2022-09-21 The Regents of The University of California Sequencing of nucleic acids via barcoding in discrete entities
EP3256606B1 (en) 2015-02-09 2019-05-22 10X Genomics, Inc. Systems and methods for determining structural variation
EP3259371B1 (en) 2015-02-19 2020-09-02 Becton, Dickinson and Company High-throughput single-cell analysis combining proteomic and genomic information
US9727810B2 (en) 2015-02-27 2017-08-08 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
ES2906221T3 (es) 2015-02-27 2022-04-13 Becton Dickinson Co Métodos para el marcado con códigos de barras de ácidos nucleicos para secuenciación
WO2016145409A1 (en) * 2015-03-11 2016-09-15 The Broad Institute, Inc. Genotype and phenotype coupling
US20160266094A1 (en) 2015-03-13 2016-09-15 University Of Iowa Research Foundation Cellular barcode
WO2016149418A1 (en) 2015-03-18 2016-09-22 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for labeling targets and haplotype phasing
EP3835431B1 (en) 2015-03-30 2022-11-02 Becton, Dickinson and Company Methods for combinatorial barcoding
US10301660B2 (en) 2015-03-30 2019-05-28 Takara Bio Usa, Inc. Methods and compositions for repair of DNA ends by multiple enzymatic activities
CN107636169A (zh) 2015-04-17 2018-01-26 生捷科技控股公司 对生物分子进行空间概况分析的方法
WO2016172373A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for whole transcriptome amplification
US9618871B2 (en) 2015-04-28 2017-04-11 Kyocera Document Solutions Inc. Image forming apparatus
JP2018516569A (ja) 2015-05-22 2018-06-28 シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， ＬＬＣ 次世代ゲノムウォーキングのための方法ならびに関連する組成物およびキット
US20180142290A1 (en) 2015-05-28 2018-05-24 Kaarel Krjutskov Blocking oligonucleotides
WO2016196229A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Cellular Research, Inc. Methods for rna quantification
CN107849561A (zh) 2015-08-24 2018-03-27 凯杰有限公司 产生rna测序文库的方法
EP4368715A2 (en) 2015-08-28 2024-05-15 Illumina, Inc. Nucleic acid sequence analysis from single cells
JP6940484B2 (ja) 2015-09-11 2021-09-29 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド ライブラリー正規化のための方法および組成物
WO2017075265A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute, Inc. Multiplex analysis of single cell constituents
AU2016348439B2 (en) 2015-11-04 2023-03-09 Atreca, Inc. Combinatorial sets of nucleic acid barcodes for analysis of nucleic acids associated with single cells
JP2019500856A (ja) 2015-11-18 2019-01-17 タカラ バイオ ユーエスエー， インコーポレイテッド マルチウェルデバイスから試料をプールするための装置及び方法
US20190040381A1 (en) 2015-12-04 2019-02-07 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Cloning and expression system for t-cell receptors
EP3397764A4 (en) 2015-12-30 2019-05-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. DIGITAL QUANTIFICATION OF PROTEINS
US20170205404A1 (en) 2016-01-19 2017-07-20 General Electric Company Multifunctional beads and methods of use for capturing rare cells
WO2017139690A1 (en) 2016-02-11 2017-08-17 10X Genomics, Inc. Cell population analysis using single nucleotide polymorphisms from single cell transcriptomes
WO2017164936A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 The Broad Institute, Inc. Methods for determining spatial and temporal gene expression dynamics in single cells
EP3436581B1 (en) 2016-04-01 2020-10-14 Baylor College of Medicine Methods of whole transcriptome amplification
JP7129343B2 (ja) 2016-05-02 2022-09-01 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 正確な分子バーコーディング
CA3022863A1 (en) * 2016-05-02 2017-11-09 Encodia, Inc. Macromolecule analysis employing nucleic acid encoding of molecular recognition events
WO2017196768A1 (en) 2016-05-09 2017-11-16 President And Fellows Of Harvard College Self-targeting guide rnas in crispr system
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
US11397882B2 (en) 2016-05-26 2022-07-26 Becton, Dickinson And Company Molecular label counting adjustment methods
TWI600309B (zh) 2016-05-28 2017-09-21 Hon Hai Prec Ind Co Ltd 角度調整機構
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
LT3263715T (lt) 2016-06-28 2020-06-25 Hifibio Pavienių ląstelių transkriptomo analizės būdas
US10809266B2 (en) 2016-07-22 2020-10-20 Verily Life Sciences Llc Quantitative massively parallel proteomics
US20190203270A1 (en) 2016-07-24 2019-07-04 Yeda Research And Development Co., Ltd. Methods and kits for analyzing dna binding moieties attached to dna
WO2018022809A1 (en) * 2016-07-27 2018-02-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Highly-multiplexed fluorescent imaging
US20180037942A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 Cellular Research, Inc. Enzyme-independent molecular indexing
RU2019106038A (ru) 2016-08-10 2020-09-17 Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж Способы de novo сборки баркодированных фрагментов геномной днк
ES2961743T3 (es) 2016-09-26 2024-03-13 Becton Dickinson Co Medición de la expresión de proteínas utilizando reactivos con secuencias de oligonucleótidos con código de barras
WO2018061695A1 (ja) 2016-09-29 2018-04-05 富士フイルム株式会社 マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法
JPWO2018061699A1 (ja) 2016-09-29 2019-06-24 富士フイルム株式会社 マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法
EP3519612B1 (en) 2016-10-01 2022-04-06 Berkeley Lights, Inc. Dna barcode compositions and methods of in situ identification in a microfluidic device
CN114875125A (zh) 2016-10-19 2022-08-09 10X基因组学有限公司 用于条形码化单个细胞或细胞群的核酸分子的方法和系统
CN114774520A (zh) 2016-11-17 2022-07-22 领星生物科技（上海）有限公司 检测肿瘤发展的系统和方法
EP3551768B1 (en) 2016-12-12 2024-03-06 Grail, LLC Methods for tagging and amplifying rna template molecules for preparing sequencing libraries
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20190177800A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for labeling cells
WO2019113533A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for labeling cells
IL302912A (en) 2016-12-22 2023-07-01 Guardant Health Inc Methods and systems for analyzing nucleic acid molecules
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
GB201622222D0 (en) 2016-12-23 2017-02-08 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for molecular barcoding of nucleic acids of single cells
CA3050127A1 (en) 2017-01-12 2018-07-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods for analyzing t cell receptors and b cell receptors
US20180208975A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Assay for simultaneous genomic and proteomic analysis
EP4310183A3 (en) 2017-01-30 2024-02-21 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
CN110382708A (zh) 2017-02-01 2019-10-25 赛卢拉研究公司 使用阻断性寡核苷酸进行选择性扩增
CN110475864B (zh) 2017-02-02 2024-01-12 纽约基因组研究中心公司 用于识别或量化在生物样品中的靶标的方法和组合物
US20200115753A1 (en) 2017-03-17 2020-04-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying and modulating co-occurant cellular phenotypes
CN110446789A (zh) 2017-03-24 2019-11-12 赛卢拉研究公司 用于多重态确定的合成多重态
KR20190133711A (ko) 2017-03-24 2019-12-03 싱가포르국립대학교 분자의 다중 검출 방법
MX2019013993A (es) 2017-05-23 2020-07-28 Harvard College Amplificación de etiquetado extremo múltiple de ácidos nucleicos.
EP3631001A4 (en) 2017-05-23 2021-01-20 Centrillion Technology Holdings Corporation PROCESSES FOR ESTABLISHING A SPATIAL PROFILE OF BIOLOGICAL MOLECULES
CN111148849A (zh) 2017-05-26 2020-05-12 阿布维托有限责任公司 高通量多核苷酸文库测序和转录组分析
US10844372B2 (en) 2017-05-26 2020-11-24 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
EP3631004A4 (en) 2017-05-29 2021-03-03 President and Fellows of Harvard College MONOCELLULAR TRANSCRIPTOME AMPLIFICATION PROCESS
AU2018281745B2 (en) 2017-06-05 2022-05-19 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
WO2019055852A1 (en) 2017-09-15 2019-03-21 Apton Biosystems, Inc. PROFILING OF HETEROGENEOUS UNICELLULAR ORGANISMS USING MOLECULAR BARCODE CODING
CN111247589A (zh) 2017-09-25 2020-06-05 贝克顿迪金森公司 免疫受体条形码错误校正
US11733248B2 (en) 2017-09-25 2023-08-22 Fred Hutchinson Cancer Center High efficiency targeted in situ genome-wide profiling
WO2019076768A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Tervisetehnoloogiate Arenduskeskus As METHOD AND KIT FOR PREPARING DNA BANK
US11702649B2 (en) 2017-10-23 2023-07-18 The Broad Institute, Inc. Single cell cellular component enrichment from barcoded sequencing libraries
WO2019099906A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods to measure functional heterogeneity among single cells
US11767557B2 (en) 2017-12-07 2023-09-26 Massachusetts Institute Of Technology Single cell analyses
US20200362334A1 (en) 2017-12-07 2020-11-19 The Broad Institute, Inc. High-throughput methods for identifying gene interactions and networks
US11332736B2 (en) 2017-12-07 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing
CN111699388A (zh) 2017-12-12 2020-09-22 10X基因组学有限公司 用于单细胞处理的系统和方法
CN111712579A (zh) 2017-12-22 2020-09-25 10X基因组学有限公司 用于处理来自一个或多个细胞的核酸分子的系统和方法
DK3735470T3 (da) 2018-01-05 2024-02-26 Billiontoone Inc Kvalitetskontroltemplates til sikring af validiteten af sekventeringsbaserede analyser
CN112004920A (zh) 2018-02-05 2020-11-27 斯坦福大学托管董事会 用于单细胞和集合细胞的多重测量的系统和方法
CN112005115A (zh) 2018-02-12 2020-11-27 10X基因组学有限公司 表征来自单个细胞或细胞群体的多种分析物的方法
WO2019178164A1 (en) 2018-03-12 2019-09-19 Silicon Valley Scientific, Inc. Method and apparatus for processing tissue and other samples encoding cellular spatial position information
US20210123044A1 (en) 2018-04-18 2021-04-29 The Regents Of The University Of California Method to Connect Chromatin Accessibility and Transcriptome
US20210230666A1 (en) 2018-04-27 2021-07-29 X Gen Us Co. Methods and compositions for preparing polynucleotides
EP3788170A1 (en) 2018-05-03 2021-03-10 Becton, Dickinson and Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
CA3097976A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
CN110499251A (zh) 2018-05-17 2019-11-26 中国科学院大连化学物理研究所 高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片及应用
DK3821011T3 (da) 2018-07-11 2023-07-24 Cygnus Biosciences Beijing Co Ltd Transposom-aktiveret dna/rna-sekventering (ted rna-seq)
WO2020028266A1 (en) 2018-08-03 2020-02-06 Cellular Research, Inc. Nuclei barcoding and capture in single cells
CA3108770A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Vanderbilt University Systems and methods for simultaneous detection of antigens and antigen specific antibodies
CN112912512A (zh) 2018-08-17 2021-06-04 贝克顿迪金森公司 适配体条形码化
WO2020046833A1 (en) 2018-08-28 2020-03-05 Cellular Research, Inc. Sample multiplexing using carbohydrate-binding and membrane-permeable reagents
WO2020072380A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 Cellular Research, Inc. Determining 5' transcript sequences
EP3877520A1 (en) 2018-11-08 2021-09-15 Becton Dickinson and Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
WO2020123384A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Cellular Research, Inc. Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
CN113330121A (zh) 2018-12-17 2021-08-31 纳特拉公司 用于循环细胞分析的方法
EP3914728B1 (en) 2019-01-23 2023-04-05 Becton, Dickinson and Company Oligonucleotides associated with antibodies
US11834715B2 (en) 2019-01-28 2023-12-05 Becton, Dickinson And Company Oligonucleotide-comprising cellular component-binding reagents and methods of using the same
CN113454234A (zh) 2019-02-14 2021-09-28 贝克顿迪金森公司 杂合体靶向和全转录物组扩增
US11965208B2 (en) 2019-04-19 2024-04-23 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
WO2020219721A1 (en) 2019-04-23 2020-10-29 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods characterizing metastasis
SG10201904897UA (en) 2019-05-30 2020-12-30 Nat Univ Singapore Method, structures and system for nucleic acid sequence topology assembly for multiplexed profiling of proteins.
EP3997217A4 (en) 2019-07-12 2023-06-28 New York Genome Center, Inc. Methods and compositions for scalable pooled rna screens with single cell chromatin accessibility profiling
US20210039582A1 (en) 2019-08-07 2021-02-11 ZF Passive Safety Systems US Inc. Airbag package with improved packaging
EP4055160B1 (en) 2019-11-08 2024-04-10 Becton Dickinson and Company Using random priming to obtain full-length v(d)j information for immune repertoire sequencing
EP4087945B1 (en) 2020-01-10 2024-03-06 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a target nucleic acid in a biological sample
WO2021146207A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
US20210214770A1 (en) 2020-01-13 2021-07-15 Becton, Dickinson And Company Cell capture using du-containing oligonucleotides
CN115298322A (zh) 2020-01-17 2022-11-04 贝克顿迪金森公司 用于单细胞分泌组学的方法和组合物
WO2021155057A1 (en) 2020-01-29 2021-08-05 Becton, Dickinson And Company Barcoded wells for spatial mapping of single cells through sequencing
CN115427584A (zh) 2020-01-31 2022-12-02 贝克顿迪金森公司 嗜中温dna聚合酶延伸阻断物
EP4103744A2 (en) 2020-02-12 2022-12-21 Becton, Dickinson and Company Intracellular abseq
CN115516109A (zh) 2020-02-17 2022-12-23 通用测序技术公司 条码化核酸用于检测和测序的方法
AU2021224760A1 (en) 2020-02-21 2022-09-15 10X Genomics, Inc. Capturing genetic targets using a hybridization approach
CN115151810A (zh) 2020-02-25 2022-10-04 贝克顿迪金森公司 实现使用单细胞样品作为单色补偿对照的双特异性探针
US20230193246A1 (en) 2020-03-05 2023-06-22 BioLegend, Inc. Methods and compositions for detecting targets
EP4150118A1 (en) 2020-05-14 2023-03-22 Becton Dickinson and Company Primers for immune repertoire profiling
CN115803445A (zh) 2020-06-02 2023-03-14 贝克顿迪金森公司 用于5撇基因表达测定的寡核苷酸和珠
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
EP4179110A1 (en) 2020-07-13 2023-05-17 Becton, Dickinson and Company Cdna spike-in control for single cell analysis
WO2022026909A1 (en) 2020-07-31 2022-02-03 Becton, Dickinson And Company Single cell assay for transposase-accessible chromatin
CN116529389A (zh) 2020-08-20 2023-08-01 贝克顿迪金森公司 用于从血培养物中分离细菌的血细胞裂解剂
WO2022108946A1 (en) 2020-11-17 2022-05-27 Becton, Dickinson And Company Combined analysis of cell-free nucleic acids and single cells for oncology diagnostics
US20220162695A1 (en) 2020-11-20 2022-05-26 Becton, Dickinson And Company Use of dextramer in single cell analysis
EP4247967A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 Becton, Dickinson and Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
US20220178909A1 (en) 2020-12-09 2022-06-09 Becton, Dickinson And Company Multiplexed single cell immunoassay
WO2022143221A1 (zh) 2020-12-31 2022-07-07 中国科学院北京基因组研究所(国家生物信息中心) 用于标记核酸分子的方法和试剂盒
EP4274907A1 (en) 2021-01-08 2023-11-15 Cellanome, Inc. Devices and methods for analyzing biological samples
US20220380838A1 (en) 2021-06-01 2022-12-01 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for analyte detection and probe resolution
WO2023034739A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Becton, Dickinson And Company Template switch oligonucleotide (tso) for mrna 5' analysis
WO2023034794A1 (en) 2021-08-31 2023-03-09 Becton, Dickinson And Company Rna preservation and recovery from fixed cells
WO2023034789A1 (en) 2021-08-31 2023-03-09 Becton, Dickinson And Company Multiplexed proteomics analysis using oligonucleotide-conjugated antibodies
WO2023034790A1 (en) 2021-08-31 2023-03-09 Becton, Dickinson And Company Use of decoy polynucleotides in single cell multiomics
CN117916389A (zh) 2021-09-01 2024-04-19 贝克顿迪金森公司 使用原位逆转录的空间多组学
CN117999358A (zh) 2021-09-08 2024-05-07 贝克顿迪金森公司 用于检测抗体缀合的寡核苷酸的非测序的基于pcr的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150133319A1 (en) * 2012-02-27 2015-05-14 Cellular Research, Inc. Compositions and kits for molecular counting
WO2014200767A1 (en) * 2013-06-12 2014-12-18 The General Hospital Corporation Methods, kits, and systems for multiplexed detection of target molecules and uses thereof
US20150299784A1 (en) * 2013-08-28 2015-10-22 Cellular Research, Inc. Massively parallel single cell analysis
KR20180085717A (ko) * 2015-09-24 2018-07-27 에이비비트로, 엘엘씨 친화성-올리고뉴클레오타이드 콘쥬게이트 및 그것의 사용

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Publication number Publication date
AU2017331459A1 (en) 2019-03-14
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