KR101454886B1 - 핵산분자의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

(a) 목적 핵산분자의 전체 서열의 적어도 일부를 구성하는 핵산 단편들을 제공하는 단계; (b) 상기 핵산 단편들을 바코드 서열들(barcode sequences)로 태깅(tagging)하는 단계; (c) 상기 바코드 서열들로 태깅된 핵산 단편들의 서열을 확인하는 단계; 및 (d) 상기 서열 확인된 핵산 단편들 중 소망하는 핵산 단편들을 상기 바코드 서열들을 이용하여 회수하는 단계를 포함하는 핵산분자의 제조방법이 제공된다.

Description

핵산분자의 제조방법{Method for synthesizing nucleic acid molecules}
본 명세서에 개시된 기술은 핵산분자의 제조방법으로서, 더욱 상세하게는 긴 핵산분자를 효율적으로 합성할 수 있는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 실시되는 DNA 합성 과정은 확장 가능한(scalable) DNA 구축을 위해 다음과 같은 난점을 가진다: (a) 고-비용의 올리고뉴클레오타이드; (b) 올리고뉴클레오타이드의 긴 DNA 서열로의 낮은 어셈블리 효율; (c) 시간을 요하는 클로닝 과정; 및 (d) 고-비용의 타겟 DNA 서열 확인 과정. 무엇보다도, 올리고뉴클레오타이드 및 시퀀싱 비용이 주요한 합성 비용이다. 따라서, 효과적으로 확장 가능한(highly scalable) DNA 합성을 실현하기 위해 합성 산물을 대량으로 병렬화(parallelize)시키는 방법(프로토콜)을 고안하는 것이 바람직하다. 이전까지, 확장 가능한 저-비용 DNA 합성을 위해 DNA 마이크로칩으로부터 유래된 DNA 올리고뉴클레오타이드가 이용되었다(Tian, J., et al., 2004). 하지만, 칩-유래된 올리고뉴클레오타이드의 낮은 어셈블리 효율이 타겟 유전자 구축을 방해하여 번거로운 DNA 어셈블리 최적화 과정이 종종 요구된다. 상기 칩-유래된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 DNA 어셈블리의 비효율성은 어셈블리 전 이중가닥(double strand, ds)-올리고뉴클레오타이드의 플랭킹 부위의 불완전한 제거 및 각각의 칩-절단된 올리고뉴클레오타이드의 상이한 농도와 밀접하게 연관되어 있다(Kim H., et al., 2011). 더욱이, DNA 어셈블리 풀에서 더 많은 수의 올리고들(즉, 높은 복잡성)은 비효율적인 DNA 어셈블리를 야기하는 것으로 관찰되었다(Kim H., et al., 2011; Borovkov A. Y., et al., 2010). 결과적으로, 많은 경우에서 작은 서브-풀의 올리고뉴클레오타이드들(즉, 20개 미만) 만이 높은 어셈블리 효율로 증폭된다. 초-저비용(ultra-low cost) DNA 마이크로칩 올리고뉴클레오타이드의 모든 장점을 얻기 위해, 풀 내에 존재하는 많은 수의 마이크로칩 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 고-효율 DNA 어셈블리 기법을 개발하는 것이 요구되고 있다.
확장 가능한 DNA 합성을 실시하기 위해, 타겟 DNA 유효화(확인, validation)를 위한 시퀀싱 비용을 절감하는 것이 바람직하다. 최근에 고속(high-throughput) 시퀀싱 기술을 위한 비용이 현저하게 감소되었기 때문에, 합성 DNA 서열 확인을 위한 고속 시퀀싱 기술을 이용하는 것은 초-저비용 DNA 합성을 위해 큰 장점을 가진다. 하지만, 콜로니-기반된 Sanger 시퀀싱 확인과는 달리, 고속 시퀀싱된 DNA 혼합물의 풀로부터 소망하는 DNA를 수득하는 것은 용이하지 않다. 최근 고속 DNA 시퀀싱 과정이 부분적으로 어드레스할 수 있는 스팟(예컨대, Roche-454, Illumina 및 SOLid 사의 클론성 스팟(clonal spots), 그리고 Helicos사 및 PacBio사의 단일 분자 스팟)에 적용될 수 있을 지라도, 고속 시퀀싱 플레이트로부터 소망하는 DNA를 수득하는 것과 관련된 어려움으로 인해 타겟 DNA의 분리는 쉽지 않다. 한 가지 흥미로운 보고(Matzas M., et al., 2010)로, 칩-절단된 올리고뉴클레오타이드들이 454 시퀀싱 기술로 시퀀싱되고, 비드 선택기 파이펫(bead picker pipette)을 이용하여 454 시퀀싱 플레이트로부터 직접 분리되었다. 이후, 상기 서열-확인된 ‘올리고뉴클레오타이드들’은 프로세싱되어 200 bp의 타겟 DNA 단편들의 어셈블리에 이용되었다. 상술한 연구는 DNA 합성 비용의 절감에 있어서 차세대(next-generation) 시퀀싱 기술 및 마이크로칩 올리고뉴클레오타이드의 융합 가능성을 증명한다. 하지만, 상기 연구는 어셈블리된 DNA 단편들이 아닌 칩 올리고뉴클레오타이드들의 고속 시퀀싱을 실시하였다. 따라서, 더 큰 서열로의 DNA 어셈블리와 관계된 도전은 이제 시작되는 단계이다. 더 나아가, 효과적인 오류없는 올리고뉴클레오타이드 선택(picking) 과정은 매우 정밀한(highly-tuned) 비드 선택 로보트(bead picking robot) 및 이미징 프로세스 기계를 필요로 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, (a) 목적 핵산분자의 전체 서열의 적어도 일부를 구성하는 핵산 단편들을 제공하는 단계; (b) 상기 핵산 단편들을 바코드 서열들(barcode sequences)로 태깅(tagging)하는 단계; (c) 상기 바코드 서열들로 태깅된 핵산 단편들의 서열을 확인하는 단계; 및 (d) 상기 서열 확인된 핵산 단편들 중 소망하는 핵산 단편들을 상기 바코드 서열들을 이용하여 회수하는 단계를 포함하는 핵산분자의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, (a) 목적 핵산분자의 전체 서열의 적어도 일부를 구성하는 핵산 단편들을 제공하는 단계; (b) 상기 핵산 단편들을 조립하여 병렬적 시퀀싱(parallel sequencing) 기술로 서열 확인 가능한 크기의 중간체들을 합성하는 단계; (c) 상기 중간체들을 바코드 서열들(barcode sequences)로 태깅(tagging)하는 단계; (d) 상기 바코드 서열들로 태깅된 중간체들의 서열을 확인하는 단계; (e) 상기 서열 확인된 중간체들 중 소망하는 중간체들을 상기 바코드 서열들을 이용하여 회수하는 단계; 및 (f) 상기 회수된 중간체들을 조립하여 긴 핵산분자들을 형성하는 단계를 포함하는 핵산분자의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, (a) 제한효소 절단 서열 및 공통적 플랭킹 서열을 구비한 올리고뉴클레오타이드들의 풀을 제공하는 단계; (b) 상기 제한효소 절단 서열 부분을 절단함으로써 상기 공통적 플랭킹 서열을 일 말단에 구비한 올리고뉴클레오타이드들과 상기 공통적 플랭킹 서열을 구비하지 않은 올리고뉴클레오타이드들을 포함하는 혼합물의 풀을 제공하는 단계; 및 (c) 상기 공통적 플랭킹 서열을 이용하여 상기 올리고뉴클레오타이드들을 어셈블리하여 임의적으로 핵산 단편들을 합성하는 단계를 포함하는 핵산분자의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, (a) 올리고뉴클레오타이드들의 풀을 제공하는 단계; (b) 상기 올리고뉴클레오타이드들을 어셈블리하여 임의적으로 핵산 단편들을 합성하는 단계; (c) 상기 임의적으로 합성된 핵산 단편들에 증폭용 염기 서열을 연결하는 단계; 및 (d) 증폭용 염기 서열에 결합하는 프라이머로 상기 핵산 단편들을 증폭하는 단계를 포함하는 핵산분자의 제조방법이 제공된다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 핵산분자의 제조방법을 나타낸 공정흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 임의적 유전자 합성 방식을 나타내는 공정흐름도이다.
도 3 및 도 4는 임의적 합성 방식에 의해 핵산 단편들을 합성하는 과정을 나타낸다.
도 5는 바코드 서열들로 핵산 단편들을 태깅하는 두 가지 과정을 나타낸 구현예들이다.
도 6은 바코드 태깅된 핵산 단편들의 풀로부터 소망하는 핵산 단편들을 회수하고 조립하여 긴 핵산분자를 형성하는 과정을 나타낸다.
도 7은 거대 목적 DNA 분자들을 얻기 위해 많은 올리고뉴클레오타이드들이 샷건 합성에 동시적으로 이용될 수 있음을 보여주는 개략도이다.
도 8은 각 단계에서 생산되는 PCR 산물을 보여주는 결과이다.
도 9는 샷건 합성에 대한 454 시퀀싱 데이터를 컴퓨터 프로그램을 이용하여 분석한 결과이다.
이하, 도면을 참조하여 본 발명의 구현예들에 대해 상세히 설명하고자 한다. 다음에 소개되는 구현예들은 당업자에게 개시된 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되어지는 것이다. 따라서 본 발명은 이하 설명된 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 그리고 도면들에 있어서, 구성요소의 폭, 길이, 두께 등은 편의를 위하여 과장되어 표현될 수도 있다. 제1 구성요소가 제2 구성요소에 연결되거나 부가될 경우 제1 구성요소가 제2 구성요소에 직접 연결되거나 부가되는 것뿐아니라 제3 구성요소가 제1 구성요소와 제2 구성요소 사이에 개재되는 것을 포함한다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 핵산분자의 제조방법을 나타낸 공정흐름도이다. 도 1을 참조하면, 단계 S110에서 목적 핵산분자의 전체 서열의 적어도 일부를 구성하는 핵산 단편들을 제공한다. 본 발명에 이용되는 핵산 단편들은 자연에서 유래하거나 합성된 것들이 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 핵산 단편들은 낮은 가격으로 수백만 종 이상의 염기서열을 제공하는 DNA 마이크로칩으로부터 유래하거나 합성 올리고뉴클레오타이드들의 풀로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 합성 올리고뉴클레오타이드들의 풀은 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 제조될 수 있으며, 예를 들어 레진(resin)-기반된 올리고뉴클레오타이드들로 제조될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 핵산 단편들은 DNA 마이크로칩으로부터 유래한 것일 수 있다.
거대 목적 핵산분자의 합성을 위해서는 상기 핵산 단편들은 삽입(insertion), 결실(deletion), 전이(transtion), 역전(transversion) 등과 같은 서열 오류들이 없는 것일 수 있다.
단계 S110의 (a)의 핵산 단편들은 올리고뉴클레오타이드들의 풀로부터 직접 추출한 것들이거나 일정 길이 이상을 갖도록 하기 위해 올리고뉴클레오타이드들을 증폭하고 조립한 것들일 수 있다. 긴 목적 핵산 분자를 합성할 경우, 상기 핵산 단편들은 계층적 유전자 합성 방식(Journal of Biotechnology 151 (2011) 319-324) 또는 후술할 임의적 유전자 합성 방식을 포함한 다양한 방식으로 만들어질 수 있다.
본 명세서에 있어서, 임의적 유전자 합성을 "샷건 합성"("Shotgun synthesis")으로 명명하며, 이러한 샷건 합성법으로 만들어진 핵산 단편들을 "샷건 산물"("Shotgun products")이라고 명명하기로 한다.
샷건 시퀀싱은 분석하고자 하는 DNA를 임의적으로 절편화하고 생성된 핵산 단편들에 시퀀싱 어댑터를 연결하여 고속 시퀀싱을 통해 분석하는 방식이다. 여기에는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 각 단편들을 배열하여 분석하고자 하는 최초의 DNA의 전체 서열을 동정하는 과정이 포함된다. 샷건 합성은 상술한 샷건 시퀀싱과 정확하게 역순으로 진행된다. 합성하고자 하는 핵산 분자의 일부 서열을 구성하는 올리고뉴클레오타이드들을 제작하고 이들을 임의적으로 조립하여 핵산 단편들을 만들어내고 이를 고속 시퀀싱을 통해 분석한다. 다음 분석된 핵산 단편들 중 소망하는 핵산 단편들을 회수하여 이를 이용하여 최종 핵산 분자를 만든다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 단계 S110의 (a)에서 제공되는 핵산 단편들은 샷건 합성법에 의해 제조된 샷건 산물일 수 있다. 샷건 산물을 만들기 위해 공통적 플랭킹 서열들(generic flanking sequences)을 포함하도록 디자인된 올리고뉴클레오타이드들이 사용될 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 임의적 유전자 합성 방식을 나타내는 공정흐름도이다. 도 2를 참조하면, 단계 S210에서 제한효소 절단 서열 및 공통적 플랭킹 서열을 적어도 일 말단에 구비한 올리고뉴클레오타이드들의 풀을 제공한다. 단계 S220에서 상기 제한효소 절단 서열 부분을 절단함으로써 상기 공통적 플랭킹 서열을 일 말단에 구비한 올리고뉴클레오타이드들과 상기 공통적 플랭킹 서열을 구비하지 않은 올리고뉴클레오타이드들을 포함하는 혼합물의 풀을 제공한다. 단계 S230에서 상기 공통적 플랭킹 서열을 이용하여 상기 혼합물 내의 상기 올리고뉴클레오타이드들을 어셈블리하여 핵산 단편들을 임의적으로 합성한다.
단계 S210에서, 상기 공통적 플랭킹 서열은 상기 올리고뉴클레오타이드의 일 말단 또는 양 말단에 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 임의적 유전자 합성(샷건 합성) 방식에 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 5' to 3' 방향으로 5'-말단 공통적 플랭킹 서열(generic flanking sequence), 상기 목적 핵산분자를 구성하는 올리고뉴클레오타이드 서열 및 3'-말단 공통적 플랭킹 서열을 포함할 수 있다.
상기 올리고뉴클레오타이드의 말단에 존재하는 5'-말단 공통적 플랭킹 서열 및 3'-말단 공통적 플랭킹 서열은 DNA 칩으로부터 유래된 올리고뉴클레오타이드의 양을 증폭하기 위한 프라이밍 위치로, 충분한 양의 올리고뉴클레오타이드들을 생산하기 위한 프라이머 세트의 어닐링 위치로 이용된다.
상기 올리고뉴클레오타이드는 제한효소 절단 서열을 포함할 수 있다. 상기 핵산 단편은 상기 5'-말단 공통적 플랭킹 서열과 함께 5'-제한효소 절단 서열을 포함하고, 상기 3'-말단 공통적 플랭킹 서열과 함께 3'-제한효소 절단 서열을 포함할 수 있다. 이때 상기 올리고뉴클레오타이드 내 5'-제한효소 절단 서열과 3'-제한효소 절단 서열은 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
상기 올리고뉴클레오타이드의 길이는 50-500 bp (base pair)이며, 보다 바람직하게는 100-300 bp이고, 보다 더 바람직하게는 120-200 bp이며, 가장 바람직하게는 약 150 bp이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 올리고뉴클레오타이드는 상기 목적 핵산분자의 일부 또는 전체의 서열을 구비할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드가 상기 목적 핵산분자의 일부 서열을 구비할 경우, 여러 크기를 갖는 상기 목적 올리고뉴클레오타이드들 간의 순차적인 조립(assembly)을 통해 전체 서열을 갖는 목적 핵산분자로 합성될 수 있다.
상기 올리고뉴클레오타이드들의 풀은 DNA 마이크로칩으로부터 절단된 것일 수 있다. 또는 상기 올리고뉴클레오타이드들의 풀은 고체상에서 합성된 올리고뉴클레오타이드들의 혼합물일 수있다. 긴 유전자 합성에 필요한 양을 확보하기 위해 절단된 상기 올리고뉴클레오타이드들은 증폭될 수 있다. 상기 증폭은 상기 공통적 플랭킹 서열을 이용한 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 수행될 수 있다.
다음 상기 증폭된 올리고뉴클레오타이드들 내의 제한효소 절단 서열을 인지하는 제한효소를 이용하여 공통적 플랭킹 서열을 절단해낸다. 이때 절단된 올리고뉴클레오타이드들의 풀은 양 말단 제한효소 절단 서열이 완벽히 절단되어 공통적 플랭킹 서열이 없는 올리고뉴클레오타이드들과 일 말단의 제한효소 절단 서열만 절단되어 공통적 플랭킹 서열이 일 말단에 남아있는 올리고뉴클레오타이드들을 함유하는 혼합물의 형태를 가질 수 있다.
상기 공통적 플랭킹 서열을 이용하여 상기 혼합물의 올리고뉴클레오타이드들을 PCR 어셈블리(polymerase chain reaction assembly, PCA)할 수 있다. 이때 올리고뉴클레오타이드들이 순차적으로 어셈블리되어 다양한 길이의 단편들을 만들어내며, 이러한 단편들 간에도 서로 임의적으로 어셈블리될 수 있다. 그리하여, PCR 용액 내의 다양한 위치에서 작은 또는 큰 단편들이 임의적 어셈블리를 통해 전체 목적 핵산분자들 또는 전체 목적 핵산분자의 일부 서열을 갖는 보다 긴 단편들로 합성될 수 있다. 상기 어셈블리는 일 말단에 공통적 플랭킹 서열이 구비된 올리고뉴클레오타이들이 서로 중첩되어 양 말단에 공통적 플랭킹 서열들을 구비한 핵산 단편이 만들어질 때까지 진행될 수 있다.
소망하는 샷건 산물들을 형성하기 위해, 단계 S210의 올리고뉴클레오타이드는 정교하게 디자인된다. 상기 올리고뉴클레오타이드 서열 중 일부의 상보적인 서열을 통해 여러 올리고뉴클레오타이드들이 서로 중첩되는 방식으로 어셈블리될 수 있다. 이때 상기 올리고뉴클레오타이드들은 임의적 어셈블리가 가능하도록 디자인되어 샷건 산물을 형성한다. 예를 들어, 상기 샷건 산물들 중 목적 핵산분자의 5'-말단 부위를 포함하는 샷건 산물이 5개의 목적 올리고뉴클레오타이드들로 구성되는 경우, 목적 핵산분자의 5'-말단 부위를 포함하는 샷건 산물은 다음과 같이 제한효소로 절단된 올리고뉴클레오타이드들 간의 순차적인 어셈블리를 통해 생성될 수 있다. 즉, 5' to 3' 방향으로, 5'-말단 부위를 생성시키기 위해 제한효소 절단 서열이 부분적으로 절단된 5'-말단 공통적 플랭킹 서열 및 목적 핵산분자의 일부 서열을 포함하는 제1 올리고뉴클레오타이드, 상기 제1 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단 부위에 중첩하는 부위(예컨대, 20-50 bp)를 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드, 상기 제2 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단 부위에 중첩하는 부위를 포함하는 제3 올리고뉴클레오타이드, 상기 제3 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단 부위에 중첩하는 부위를 포함하는 제4 올리고뉴클레오타이드, 그리고 상기 제4 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단 부위에 중첩하는 부위를 포함하는 서열 및 3'-말단 공통적 플랭킹 서열을 포함하는 제5 올리고뉴클레오타이드 간의 순차적인 어셈블리를 통해 상기 목적 핵산분자의 5'-말단 부위를 포함하는 샷건 산물(예컨대, 약 400 bp)이 생성될 수 있다. 도 3 및 도 4는 임의적 합성 방식에 의해 핵산 단편들을 합성하는 과정을 나타낸다.
변형된 구현예로서, 핵산 단편들은 이하의 방법으로 제조될 수 있다.
먼저 올리고뉴클레오타이드들의 풀을 제공한다. 다음 앞의 구현예와 달리 공통적 플랭킹 서열 등이 부가되지 않은 원료 올리고뉴클레오타이드들을 어셈블리하여 임의적으로 핵산 단편들을 합성한다. 그리고 상기 임의적으로 합성된 핵산 단편들에 증폭용 염기 서열을 연결한 다음 증폭용 염기 서열에 결합하는 프라이머로 상기 핵산 단편들을 증폭함으로써 증폭된 핵산 단편들을 얻을 수 있다.
상술한 바와 같이 임의적 합성 방식을 이용하여 핵산분자를 제조할 경우 여러 종류의 핵산 단편 라이브러리를 동시에 제조할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 S110의 (a)의 핵산 단편들은 목적 핵산분자의 전체 서열을 포함할 수 있다. 오류없는 긴 DNA를 합성을 위해 상기 핵산 단편들은 병렬적 시퀀싱 기기들로 서열확인될 수 있다. 상기 병렬적 시퀀싱 기기로 서열확인 가능한 핵산 단편의 길이를 고려할 때 바람직한 상기 핵산 단편의 길이는 20-3,000 bp이고, 보다 바람직하게는 200-1,000 bp이며, 보다 바람직하게는 300-500 bp이고, 보다 더 바람직하게는 350-450 bp이며, 가장 바람직하게는 380-420 bp이다. 또한, 상기 바람직한 수치 범위에 불구하고 병렬적 시퀀싱 기기의 성능향상에 의해 수천 bp가 넘는 DNA를 분석할 수 있을 경우, 상기 핵산 단편들의 크기는 수천 bp 이상의 크기를 가지는 DNA로 확대 적용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 명세서에서 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 올리고머, 폴리머 또는 이의 모방체를 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 증폭은 PCR에 의해 실시된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머(예컨대, 공통적 플랭킹 서열)는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다.
본 명세서에 기재된 용어 "증폭 반응(amplification reactions)"은 목적 핵산서열을 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 멀티플렉스 PCR(McPherson and Moller, 2000), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 목적 폴리뉴클레오타이드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; APPCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호) 및 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR에 따라 실시된다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 멀티플렉스 PCR, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 본 발명에서 이용될 수 있는 목적 핵산분자는 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 DNA(gDNA 또는 cDNA) 및 RNA를 포함하며, 보다 바람직하게는 DNA를 포함한다. 또한, 목적 핵산은 예컨대, 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소(polymerase)가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus(Pfu), Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus의 DNA 중합효소 및 Phusion 중합효소를 포함하며, 가장 바람직하게는 Pyrococcus furiosus(Pfu) 또는 Phusion High-Fidelity DNA 중합효소를 이용한다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 목적 올리고뉴클레오타이드의 공통적 플랭킹 서열)과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 이렇게 증폭된 올리고뉴클레오타이드 풀을 이용하여 제1차 증폭산물들을 생성시키고 이를 이용하여 제2차 증폭산물들을 제조하여 보다 더 큰 목적 핵산분자(예컨대, 10 kb 이상의 핵산분자)로 어셈블리시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는 중합제(예컨대, DNA 폴리머라제)의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일 부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화(hybridization)" 는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 명세서에서 언급되는 용어 "상보적(complementary)"은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
도 1을 재참조하면, 단계 S120에서 상기 핵산 단편들을 바코드 서열들(barcode sequences)로 태깅(tagging)한다. 상기 바코드 서열들은 전 단계에서 제공된 핵산 단편들 중에서 오류없는 단편들 또는 기타 소망하는 단편들을 회수하거나 이들을 선택적으로 증폭하고 어셈블리하여 목적 핵산분자를 합성하기 위해 상기 핵산 단편들에 도입된다. 상기 바코드 서열은 상기 핵산 단편의 말단에 존재하는 공통적 플랭킹 서열에 부가될 수 있다.
상기 바코드 서열들은 상기 핵산 단편들에 부가되어 서로 다른 핵산 단편들을 구분할 수 있도록 하는 물질이라면 특별히 그 종류가 제한되는 것은 아니다. 각 핵산 단편들간의 구분을 위해 상기 바코드 서열들의 종류의 수는 상기 핵산 단편들의 종류의 수보다 많은 것이 바람직하다. 예를 들어 상기 바코드 서열들은 임의 또는 계획적으로 설계된 2종 이상의 올리고뉴클레오타이이드들의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 바코드 서열 중에서 폴리 N(poly N)의 degenerate-바코드 서열은 폴리 N(poly N)의 degenerate DNA 이외에도 당업계에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램을 이용하여 임의적으로 만든 2개 이상의 다른 서열로 바코딩된 서열을 이용할 수도 있다.
또한, 상기 바코드 서열들의 태깅은 특별히 제한되지 않으나, PCR, 에멀젼 PCR 및 라이게이션(ligation)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 바코드 서열을 PCR을 이용하여 샷건 합성된 DNA 단편에 어셈블리시키는 방법이나, 폴리 N(poly N)의 degenerate-바코드 서열을 포함한 ds(double strand)-DNA를 라이게이션(ligation)하는 방법이 사용될 수 있다.
도 5는 바코드 서열들로 핵산 단편들을 태깅하는 두 가지 과정을 나타낸 구현예들이다. 도 5의 (a)는 PCR을 이용한 바코드 태깅 과정을 나타내고, 도 5의 (b)는 라이게이션을 이용한 바코드 태깅 과정을 나타낸다.
단계 S130에서 상기 바코드 서열들로 태깅된 핵산 단편들의 서열을 확인한다. 상기 태깅된 핵산 단편들의 서열의 확인은 바람직하게는 병렬적 시퀀싱(parallel sequencing) 방법에 의해 수행될 수 있다. 그 결과 상기 태깅된 핵산 단편들의 서열을 태깅된 바코드 서열과 함께 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 병렬적 시퀀싱 또는 고속 시퀀싱(high-throughput sequencing)은 당업계에 잘 알려진 고속 시퀀싱 방법에 의해 실시되며, 예를 들어 Roche-454 또는 기타 판독 길이가 100 bp 이상인 고속 시퀀싱 기기에 의해 실시될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 바코드 서열에는 시퀀싱 어댑터 서열이 더 부가될 수 있다. 본 명세서에서 핵산 단편에 부가되는 바코드 서열을 포함하는 서열을 편의상 "바코드 프라이머"라고 명명한다.
본 명세서의 용어 "어댑터 서열"은 상기 핵산 단편의 고속 시퀀싱 분석을 가능하게 하는 서열로, 예를 들어 본 발명에서 이용된 454-시퀀싱을 위해 상업적으로 이용가능한 모든 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 어댑터 서열은 Roche-454 시퀀싱 플랫폼의 어댑터 서열 및 다른 종류의 차세대 시퀀싱 기술의 어댑터 서열을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서의 용어 "공통적 플랭킹 서열"은 올리고뉴클레오타이드들의 풀에서 특정 올리고뉴클레오타이드들만을 선택적으로 증폭하기 위해 올리고뉴클레오타이드들의 양 말단에 부가된 염기서열이다. 목적 핵산분자로의 조립을 위해 필요한 서로 다른 올리고뉴클레오타이드들의 5'-말단에 부가된 염기서열들은 서로 동일하고, 서로 다른 올리고뉴클레오타이들의 3'-말단에 부가된 염기서열들은 서로 동일하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열확인을 위해 상기 태깅된 핵산 단편들을 템플레이트로 하여 상기 어댑터 서열에 결합하는 프라이머를 이용한 증폭 과정이 수행될 수 있다.
상기 바코드 서열의 길이는 특별히 제한되지 않으며, 핵산 단편을 포함한 전체 서열에 대한 시퀀싱 성능을 고려하여 예를 들어 5-300 bp, 바람직하게는 10-100 bp, 보다 바람직하게는 12-40 bp, 보다 더 바람직하게는 15-30 bp일 수 있다. 시퀀싱 기술의 발전에 따라 상기 수치 범위는 변경될 수 있다. 예를 들어 폴리 N degenerate-바코드 서열의 길이가 20 bp일 경우 가능한 바코드 서열의 종류는 420 개가 될 수 있다.
상기 바코드 프라이머는 예를 들어 5' to 3' 방향으로 454-어댑터 서열, 폴리 N(poly N)의 degenerate-바코드 서열, 제한효소 절단 서열 및 공통적 플랭킹 서열을 포함할 수 있다. 증폭을 위해 사용되는 프라이머는 상기 454-어댑터 서열에 결합하도록 디자인할 수 있다.
상기 서열확인을 통해 상기 핵산 단편들 중 오류없는 핵산 단편들 및 이에 부가된 바코드 서열을 동정할 수 있다.
한편, 상기 바코드 프라이머 내에 포함된 제한효소 절단 서열은 핵산 단편들의 시퀀싱 어댑터 서열을 제거시키기 위한 것이다. 상기 어댑터 서열의 존재는 이후의 핵산 단편들의 어셈블리에 방해(시퀀싱분석 시 결합된 비드로 인한 방해)가 되기 때문이다.
단계 S140에서 상기 서열 확인된 핵산 단편들 중 소망하는 핵산 단편들을 상기 바코드 서열들을 이용하여 회수한다. 전 단계의 시퀀싱을 통해 소망하는 핵산 단편들과 이에 태깅된 바코드 서열들의 서열이 확인되었으므로 상기 바코드 서열들을 이용하여 소망하는 핵산 단편들을 회수할 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 단계는 상기 바코드 서열들에 상응하는 프라이머들로 소망하는 상기 핵산 단편들을 선택적으로 증폭하여 회수하는 방식으로 수행될 수 있다. 또는 상기 회수 단계는 상기 바코드 서열들에 상응하는 올리고뉴클레오타이드들로 소망하는 상기 핵산 단편들을 선택적으로 혼성화하여 회수하는 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어 상기 소망하는 핵산 단편들은 오류없는 핵산 단편들일 수 있다.
소망하는 핵산 단편들의 회수를 위해 컴퓨터 프로그램이 이용될 수 있다. 구체적으로, 상기 핵산 단편들의 서열을 컴퓨터 프로그램을 이용하여 가상적으로 어셈블리시켜 소망하는 목적 핵산분자의 전체 서열과 비교한다. 이후, 가장 최적화된 DNA 단편에 플랭킹하는 서열 정보를 기반으로 합성한 프라이머 또는 이에 혼성화하는 프라이머를 이용함으로써 소망하는 핵산 단편들을 회수할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 프로그램은 당업계에 알려진 컴퓨터 프로그램을 포함하며, 보다 바람직하게는 자체-제작된 파이선 프로그램(in-house python program), 및 Perl, C, C++, 또는 다른 프로그램 언어를 이용하여 제작된 프로그램을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 선택된 바코드 서열에 상보적인 서열을 올리고로 합성한다. 다음 합성된 바코드 올리고를 이용한 증폭(PCR) 또는 혼성화(hybridization)를 통해 핵산 단편들(즉, 오류를 가진 단편들과 오류없는 단편들(error-free fragments)의 혼합물) 중, 목적 DNA의 합성을 최적화할 수 있는 오류없는 단편들만을 회수한다. 예를 들어, 상기 합성 바코드 서열을 이용한 오류없는 단편들을 획득하기 위한 방법은 PCR 이외에도, 마이크로 칩을 이용한 DNA 캡쳐 방법, 소망하는 바코드 서열을 바이오틴-비드(biotinylated beads), 또는 마그네틱 비드에 붙여서 소망하는 오류없는 단편들을 획득하는 방법 등과 같은 혼성화 방법을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 단편들이 샷건 어셈블리에 의해 제공될 경우 오류없는 바코딩된 핵산 단편들의 길이는 200 bp 이상일 수 있다. 또한, 차세대 시퀀싱의 길이가 1,000 bp가 넘는 DNA를 분석할 수 있는 기기를 사용한다면 오류없는 바코딩된 핵산 단편의 길이가 1,000 bp 이상이 될 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 오류없는 바코딩된 핵산 단편들의 길이는 200 bp 내지 약 10 kb, 또는 그 이상일 수 있다.
단계 S150에서 회수된 핵산 단편들을 조립하여 긴 핵산분자를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 목적 핵산분자(target nucleic acid molecule)는 목적 유전자(target gene), 목적 유전자 클러스터(target gene cluster), 타겟 유전체(target genome), 그리고 천연 또는 합성 핵산분자를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서의 용어 "목적 유전자 클러스터(target gene cluster)"또는 "목적 유전체(target genome)"는 소망하는 타겟(유전자)를 코딩하는 최소 2개 이상의 유전자를 포함하는 클러스터 또는 유전체를 의미하며, 상기 클러스터 또는 유전체는 2개 이상의 유전자 산물을 발생시킬 수 있는 클러스터 또는 게놈 부위(예컨대, 동일한 유전자의 최소 1개 이상의 다양한 스플라이싱 산물(multiple splicing products)을 포함하는 게놈 부위)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 합성될 수 있는 목적 유전자 클러스터 또는 목적 유전체는 약 10 kb, 또는 그 이상의 길이를 가질 수 있으며, 예를 들어 페니실린 크리소제늄(Penicillium chrysogenum)으로부터 페니실린 생합성 유전자 클러스터 DNA 서열(11, 376 bp)을 포함하고, 상기 페니실린 생합성 유전자 클러스터는 pcbAB, pcbC 및 penDE 유전자를 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "천연 또는 합성 핵산분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
도 6은 바코드 태깅된 핵산 단편들의 풀로부터 소망하는 핵산 단편들을 회수하고 조립하여 긴 핵산분자를 형성하는 과정을 나타낸다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 핵산분자는 이하의 방법으로 제조될 수 있다.
(a) 목적 핵산분자의 전체 서열의 적어도 일부를 구성하는 핵산 단편들을 제공한다. 이때 상기 (a) 단계의 핵산 단편들의 크기는 20 내지 300 bp일 수 있다.
(b) 상기 핵산 단편들을 조립하여 병렬적 시퀀싱(parallel sequencing) 기술로 서열 확인 가능한 크기의 중간체들을 합성한다. 상기 중간체들의 크기는 특별히 제한되는 것은 아니지만 예를 들어 상기 중간체들의 크기는 50 내지 3,000 bp일 수 있다. 차세대 시퀀싱 기술과 같은 병렬적 시퀀싱 기술의 발전에 따라 상기 크기는 얼마든지 증가할 수 있다.상기 중간체들의 합성은 계층적 합성 방식 또는 임의적 합성(샷건 합성) 방식을 포함한 다양한 합성 방식에 의해 수행될 수 있다.
(c) 상기 중간체들을 바코드 서열들(barcode sequences)로 태깅(tagging)한다. 바람직하게는 서열 확인을 위해 상기 바코드 서열에 시퀀싱 어댑터 서열이 부가될 수 있다.
(d) 상기 바코드 서열들로 태깅된 중간체들의 서열을 확인한다. 상기 (d) 단계의 태깅된 중간체들의 서열의 확인은 병렬적 시퀀싱 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 (c) 단계와 상기 (d) 단계 사이에 상기 시퀀싱 어댑터 서열을 이용하여 상기 태깅된 핵산 단편들을 증폭하는 단계를 더 포함할 수 있다.
(e) 상기 서열 확인된 중간체들 중 소망하는 중간체들을 상기 바코드 서열들을 이용하여 회수한다. 상기 (e) 단계의 소망하는 중간체들은 오류없는 서열을 가질 수 있다.
(f) 상기 회수된 중간체들을 조립하여 긴 핵산분자들을 형성한다. 이때 상기 긴 핵산분자들의 크기는 1,000 bp 이상일 수 있다.
도 7은 거대 목적 DNA 분자들을 얻기 위해 많은 올리고뉴클레오타이드들이 샷건 합성에 동시적으로 이용될 수 있음을 보여주는 개략도이다. 약 200개의 올리고뉴클레오타이드들을 이용한 샷건 합성은 100 bp(올리고뉴클레오타이드들의 모노머 형태) 내지 1,000 bp의 다양한 크기의 임의적인 단편들을 초래할 수 있다. 중간형태의 어셈블리 단편들은 고속 시퀀싱을 위한 degenerate 프라이머들에 의해 효과적으로 바코딩된다. 서열-확인된 단편들은 이후 어셈블리 과정에 이용된다.
도 7을 참조하면, 먼저 칩으로부터 올리고뉴클레오타이드를 제조한다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드들은 제IIS형 제한효소 위치(EarI 또는 BtsI)와 플랭킹 서열을 가지도록 디자인되어 DNA 마이크로어레이 칩 상에 합성된다. 칩으로부터 올리고뉴클레오타이드들을 절단한 후, 본 발명자들은 상기 올리고뉴클레오타이드들의 농도를 증가시키기 위해 PCR 증폭을 실시한다. 증폭된 올리고뉴클레오타이드들은 제IIS형 제한효소로 절단하여 플랭킹 서열을 제거한다. 상기 제한효소들의 효율이 100%가 아니기 때문에, 여전히 절단되지 않은 플랭킹 서열들이 존재한다. 상기 절단되지 않은 플랭킹 서열을 이용한 샷건 DNA 어셈블리 PCR을 실시하여 목적 유전자들의 임의적인 단편들을 합성한다. 합성된 임의적인 단편들에 대해 고속 시퀀싱 기술로 상기 서열을 분석하기 위해, 상기 바코드 프라이머를 이용한 PCR을 실시하여 합성된 단편들에 태깅한다. 상기 PCR 산물들은 454 고속 시퀀싱되어 자체-제작된 파이선 프로그램을 이용한 분석을 통해 오류없는 유전자 단편들 및 연결된 바코드 서열을 동정한다. 오류없는 유전자 단편을 회수하기 위해, 바코드 서열에 대한 프라이머를 이용하여 샷건 어셈블리된 유전자 단편들의 풀로부터 PCR을 실시한다. 제IIS형 제한효소 절단을 통해 회수된 단편들로부터 degenerate 바코드 서열 및 플랭킹 서열을 제거시킨 후, 상기 오류없는 유전자 단편들을 최종적으로 어셈블리시켜 완전한 길이의 목적 유전자를 합성한다.
도 8은 각 단계에서 생산되는 PCR 산물을 보여주는 결과이다. 도 8a는 칩 플랭킹 프라이머를 이용한 두 번째 라운드 PCR에 의해 생산된 PCR 산물을 나타낸다. 도 8b는 제IIS형 제한효소로 절단된 PCR 산물을 4% 아가로오스 젤에 전기영동한 결과이다. 지시된 2개의 밴드들이 절단되어 젤-정제되었다. 도 8c는 칩 플랭킹 프라이머에 의해 증폭된 도 8b의 Pen 유전자 클러스터 단편들을 이용하여 임의적으로 어셈블리된 PCR 산물의 퍼진 밴드(smear bands)를 보여준다. 상기 퍼진 밴드가 절단되어 젤-정제되었다. 도 8d는 칩 플랭킹 프라이머를 이용하여 도 8c의 흰색 박스 내 밴드들을 재-증폭한 PCR 산물을 나타낸다. 흰색 박스 내 밴드들이 절단되어 젤-정제되었다. 도 8e는 바코드 프라이머를 이용하여 실시한 PCR로부터 제조된 퍼진 밴드들을 보여준다. 흰색 박스 내 퍼진 밴드들이 절단되어 젤-정제되었다. 도 8f는 도 8e의 밴드로부터 얻어진 산물을 100배 희석한 후 454-어댑터 프라이머를 이용하여 증폭된 산물을 나타낸다. 이때, 도 8e의 밴드로부터 얻어진 산물의 농도가 너무 높으면 PCR이 제대로 이루어지지 않는다. 상기 증폭산물을 절단하여 정제한 후 농도를 희석하여, TOPO 벡터에 클로닝하고 Roche-454 시퀀싱을 의뢰하였다. 도 8g는 상기 PCR로부터 생산된 daughter 단편 11-d을 degenerate 서열을 포함하는 프라이머로 PCR 증폭한 산물을 나타내는 결과이다.
도 8h는 도 8g에서 보여지는 밴드들을 제IIS형 제한효소로 절단시켜 제조된 3개의 밴드들을 보여준다. 도 8i는 도 8h에 보여지는 밴드 및 다른 daughter 단편들을 어셈블리시켜 제조된 단편 11을 보여주는 결과이다(화살표). 도 8j는 11개의 단편을 어셈블리하여 최종적으로 유전자 클러스터 합성물을 보여주는 결과이다.
도 9는 샷건 합성에 대한 454 시퀀싱 데이터를 컴퓨터 프로그램을 이용하여 분석한 결과이다. 도 9a는 유전자 단편의 길이 증가에 따른 454 시퀀싱 판독(reads)의 수를 나타내는 결과이다. 검은색 및 빨간색 라인은 각각 총 454 시퀀싱 판독 및 오류없는 단편의 판독을 나타낸다. 가장 풍부한 판독 및 올바른 판독의 수는 바코딩 부위를 포함하는 약 400 bp(전형적으로, 바코딩 플랭킹 부위를 제외하면 약 300 bp)라는 것을 보여준다. 하지만, 도 9a의 안쪽 그래프는 유전자 단편의 길이가 증가할수록 오류없는 유전자 단편들의 퍼센트(%)가 감소하는 경향을 가진다는 것을 나타낸다. 도 9b는 두 개의 독립적인 실험(빨간색 및 파란색)에 대한 컴퓨터 분석 결과로, 플랭킹 서열을 제거한 후 도식적으로 정렬된 오류없는 유전자 단편들을 나타낸다. 그래프 위쪽의 녹색(아디페이트-활성화 도메인), 빨간색(시스테인- 활성화 도메인) 및 파란색(발린-활성화 도메인) 화살표는 유전자 클러스터를 나타낸다. Y축은 타겟 유전자의 일부에 상응하는 오류없는 유전자 단편의 수를 의미하며, 왼쪽 하단 및 오른쪽 상단의 막대 바(scale bar)는 각각 100 bp의 단편들 및 1,000 bp의 염기쌍을 나타낸다. 도 9c는 계층적 shotgun 합성 결과를 보여준다. 최적화하여 선택된 약 300 bp의 유전자 단편들(검은색)이 약 1,000 bp의 유전자 단편(분홍색)으로 어셈블리된 후, 타겟 유전자(페니실린 합성 유전자 클러스터(N-(5-amino-5-carboxypentanoyl)-L-cysteinyl-D-valine synthase); 약 11.4 kb)로 연속적으로 합성되었다.
지금까지 상술한 본 발명의 구현예들에 따르면 본 발명은 다음과 같은 이점들을 제공한다.
본 발명은 거대 목적 핵산분자를 보다 경제적이고 효율적으로 합성하는 확장가능한(scalable) 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 정교하게 디자인된 목적 올리고뉴클레오타이드 풀을 이용하여 목적 핵산서열을 포괄하는 증폭산물을 제조하고, 이를 바코드 서열로 선택적으로 300-500 bp의 오류없는(error-free) shotgun 어셈블리 단편들을 수득하여 이를 이용하여 보다 더 거대한 목적 핵산분자(예컨대, 약 10 kb 이상)를 합성할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법을 통한 유전자 합성 비용은 레진-기반된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 종래 방법에 비해 매우 저렴하다. 따라서, 본 발명은 거대 목적 핵산분자를 합성하는 신규한 방법으로서 적용될 수 있을 뿐 아니라, 이에 따른 유전자 합성 비용을 현저하게 감소시킬 수 있는 매우 우수한 수단을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료
DNA 정제 키트(AccuPrepTM gel purification kit) 및 플라스미드 추출 키트(AccuPrepTM plasmid extraction kit)는 바이오니아(한국)로부터 구매하였다. Pfu 및 Taq 폴리머라제 프리-믹스는 SolGent 사(한국)로부터 구매하였다. Phusion 폴리머라제 프리-믹스, 제한효소들[EarI(20,000 U/ml) 및 BtsI(10,000 U/ml], NEB 완충액 4(10) 및 컴피턴트 세포(C-2566)은 NEB(New England Biolabs, 미국)로부터 구매하였다. TOP ClonerTM Blunt core kits(6 TOP cloner buffer, sterile water, pTop blunt V2)는 Enzynomics(한국)으로부터 구매하였다. 마이크로칩 올리고뉴클레오타이드 및 프라이머들은 각각 Agilent 사(미국) 및 마크로젠(한국)로부터 구매하였다. Sanger 시퀀싱 및 Roche-454 시퀀싱은 Macrogene(한국)에 의뢰하여 실시하였다.
목적 페니실린 생합성 유전자 클러스터 서열 및 올리고뉴클레오타이드 서열 디자인
페니실린 크리소제늄(Penicillium chrysogenum)으로부터 페니실린 생합성 유전자 클러스터(N-(5-amino-5-carboxypentanoyl)-L-cysteinyl-D-valine synthase) DNA 서열(11, 376 bp)이 합성 모델로 선택되었다. 코돈-최적화된 페니실린 생합성 유전자 클러스터 서열이 웹-기반된 프로그램인 Optimizer(Puigb, P. et al ., 2007)를 이용하여 디자인되었다. 24개의 뉴클레오타이드 서열(5-GCAGAGTAAAGACCGTGCACTTAT-3)이 마이크로칩 올리고뉴클레오타이드에 첨가되었다.
Agilent 칩 올리고뉴클레오타이드의 길이는 플랭킹 서열 및 타겟 DNA 서열로 구성된 150개의 뉴클레오타이드였다. 각각 114개의 플러스(+) 및 마이너스(-) 가닥 올리고뉴클레오타이드들이 타겟 DNA 서열을 위해 어닐링 동안 DNA 어셈블리를 위한 중첩하는 부위를 포함하는 상보적인 올리고뉴클레오타이드들을 포함하도록 디자인되었다. 상기 228개의 올리고뉴클레오타이드 서열은 공통적 PCR 프라이머 서열에 의해 플랭킹되었다.
Agilent 마이크로칩 올리고뉴클레오타이드 서브-풀의 프로세싱
동결건조된 Agilent 마이크로칩 올리고뉴클레오타이드는 100 ㎕의 물에 현탁되었다. 본 발명자들은 플랭킹 프라이머를 이용한 PCR 증폭을 통해 더 높은 농도의 마이크로칩 올리고뉴클레오타이드 서브-풀(페니실린 생합성 유전자 클러스터를 타겟팅하는 228개의 올리고뉴클레오타이드들)을 제조하였다. 각 PCR 시약의 양은 다음과 같았다: 8 ㎕의 물, 10 ㎕의 2 Pfu 폴리머라제 프리-믹스, 0.5 ㎕의 절단된 올리고뉴클레오타이드 풀 및 1 ㎕의 정방향 및 역방향 프라이머(10 μM). 첫 번째 PCR 조건은 다음과 같이 실시하였다: (a) 전변성 단계, 95℃에서 3분; (b) 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분으로 이루어진 20 사이클 의 PCR 단계; 및 (c) 최종 연장 단계, 72℃에서 10분. 이후 올리고들을 증폭하기 위해, 본 발명자들은 첫 번째 PCR로 증폭된 PCR 산물을 템플레이트로 다시 PCR 반응을 실시하였다. 각 PCR 시약의 양은 다음과 같았다: 18 ㎕의 물, 25 ㎕의 2 Pfu 폴리머라제 프리-믹스, 3 ㎕의 첫 번째 PCR 산물 및 2 ㎕의 정방향 및 역방향 프라이머(10 μM). 2차 PCR 조건은 12 사이클의 PCR 단계를 이용하는 것을 제외하고 상술한 조건과 동일하였다. 소망하는 산물을 4% 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 후, 제한효소 절단을 다음과 같이 실시하였다: EarI을 이용하는 경우, 2.5 ㎕의 EarI, 5 ㎕의 NEB 완충액, 0.5 ㎕의 100× BSA 및 50 ㎕의 PCR 산물을 혼합하여 37 ℃에서 3시간 동안 절단; 및 BtsI을 이용하는 경우, 2.5 ㎕의 BtsI, 5 ㎕의 NEB 완충액, 0.5 ㎕의 100× BSA 및 50 ㎕의 PCR 산물을 혼합하여 55℃에서 3시간 동안 절단. 이후, 절단 산물은 4% 아가로오스 젤 전기영동하여 젤-정제되었다.
Shotgun 어셈블리
젤-정제된 산물들은 첫 번째 라운드 샷건 어셈블리 PCR을 이용하여 어셈블리하였다. 각 PCR 시약의 양은 다음과 같았다: 20 ㎕의 Pfu 폴리머라제 프리-믹스 및 20 ㎕의 정제된 산물(228개의 마이크로칩 올리고뉴클레오타이드들의 서브-풀). 이때, PCR 조건은 다음과 같았다: (a) 전변성 단계, 95℃에서 3분; (b) 95℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 1분으로 이루어진 36 사이클의 PCR 단계; 및 (c) 최종 연장 단계, 72℃에서 10분. 1.5% 아가로오스 젤 전기영동 후, 본 발명자들은 300 bp 내지 500 bp의 젤 부위(타겟 크기 = 약 350 bp)를 절단하였다.
바코딩 및 454 시퀀싱에 의한 shotgun 어셈블리 산물들의 프로세싱
상세 과정은 도 7에 예시되어 있다. 젤-정제된 shotgun 어셈블리 단편들은 PCR용 플랭킹 프라이머로 증폭하였다. 상기 PCR에 이용된 각 시약의 양은 다음과 같다: 10 ㎕의 물, 25 ㎕의 Pfu 폴리머라제 프리-믹스, 10 ㎕의 정제된 shotgun 어셈블리 단편 및 각각 2.5 ㎕의 정방향 및 역방향 프라이머. 상기 PCR 조건은 다음과 같았다: (a) 전변성 단계, 95℃에서 3분; (b) 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분으로 이루어진 18 사이클의 PCR 단계; 및 (c) 최종 연장 단계, 72℃에서 10분. 그 결과, 300 bp와 450 bp 사이의 밴드들이 절단되어 AccuPrepTM DNA 정제키트(바이오니아, 한국)를 이용하여 정제되었다.
각 단편들은 5' to 3' 방향으로 454 DNA 시퀀싱-어댑터 서열, 454 고속 시퀀싱 핵심 서열(high-throughput sequencing key sequence; 예컨대, 5-TCAG-3), 20 mer(폴리 N)의 degenerate 프라이머 위치, EcoP15I 제IIS형 효소 위치 및 플랭킹 프라이머 서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 바코딩되었다. 이때, EarI 또는 BtsI 위치는 칩 올리고뉴클레오타이드의 플랭킹 서열의 3' 말단에 위치하고 EcoP15I 위치는 바코딩된 프라이머를 이용한 단편들의 shotgun 어셈블리용 PCR 증폭과정에 도입되었다. PCR에 이용된 각 시약의 양은 다음과 같다: 6 ㎕의 물, 20 ㎕의 Pfu 폴리머라제 프리-믹스, 10 ㎕의 상기 어셈블리된 유전자 단편 풀 및 각각 2 ㎕의 정방향 및 역방향 바코드 프라이머. PCR 조건은 다음과 같았다: (a) 전변성 단계, 95℃에서 3분; (b) 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분으로 이루어진 18 사이클의 PCR 단계; 및 (c) 최종 연장 단계, 72℃에서 10분. 본 발명자들은 1.5% 아가로오스 젤 전기영동 후 젤을 절단하여 어셈블리된 단편들(450-600 bp)을 정제하였다. 상기 정제된 단편들을 100배 희석하여 454 DNA 시퀀싱-어댑터 프라이머(Macrogene, 한국)를 이용하여 최종적으로 PCR 증폭하였다. 상기 PCR에 이용된 각 시약의 양은 다음과 같다: 17.5 ㎕의 물, 25 ㎕의 Pfu, 2.5 ㎕의 100배-희석된 젤-정제된 산물 및 각각 2.5 ㎕의 정방향 및 역방향 프라이머. 상기 20 ㎕의 PCR 반응물은 서로 독립적으로 8개의 복제물(replicates)로 실시하였다. 상기 PCR 조건은 다음과 같았다: (a) 전변성 단계, 95℃에서 3분; (b) 95℃에서 30초, 71℃에서 30초 및 72℃에서 1분으로 이루어진 25 사이클의 PCR 단계; 및 (c) 최종 연장 단계, 72℃에서 10분. 이후, 1.5% 아가로오스 젤 전기영동 후 젤 정제(450-500 bp)되었다. 상기 복제물들은 454 시퀀싱 전에 서로 풀링되었다.
454 시퀀싱 전에, 본 발명자들은 바코딩된 타겟 유전자 단편들을 클로닝하여 다수의 콜로니들을 선택하여 Sanger 시퀀싱을 통해 확인하였다: 젤-정제된 바코딩된 산물들을 TOP ClonerTM Blunt core kits(Enzynomics, 한국)를 이용하여 TOPO 벡터에 클로닝하였다. 이후, 클론된 산물들을 대장균 스트레인인 NEB c-2566(New England Biolabs, 미국) 컴피턴트 세포로 형질전환시켜 아가 플레이트에서 하룻밤 동안 37℃에서 배양하였다. 본 발명자들은 성장한 콜로니를 여러 개 선택하여 M13F-pUC 및 M13R-pUC 유니버셜 프라이머 쌍을 이용하여 콜로니 PCR을 실시하였다. 인서트 DNA를 확인한 후, Roche-454 시퀀싱 전에 Sanger 시퀀싱을 의뢰하여 확인하였다. 이후, 본 발명자들은 Lasergene(DNAstar, Madison, WI)을 이용하여 유전자 단편 및 바코드 프라이머의 서열을 확인하였다. 상기 서열을 확인한 후, 본 발명자들은 Roche-454 고속 시퀀싱을 위해 어셈블리 PCR 산물의 풀을 선택하였다. 본 발명자들은 상기 시퀀싱 테이터를 자체-제작한 파이선 프로그램(in-house python program)을 통해 분석하여 오류없는(error-free) 유전자 단편들을 선택하였다.
454 고속 시퀀싱의 분석을 위한 자체-제작한 파이선 프로그램(inhouse python program)의 알고리즘
컴퓨터 프로그램의 주요 목적은 향후 어셈블리 과정에 이용될 수 있는 오류없는 shotgun 어셈블리 산물을 선택하는 것이다. 454 시퀀싱 판독 결과(454 reads)는 자체-제작한 파이선 프로그램밍 언어를 이용하여 목적(target) 유전자인 페니실린 생합성 유전자 클러스터 서열을 타겟하도록 정렬되었다. 시퀀싱 데이터의 높은 퀄리티 스코어(30 이상의 Phred-유사 일치도(consensus quality); 99.9% 이상의 베이스-콜 정확성)로 판독함으로써, 본 발명자들은 판독 단편의 양 말단에 존재하는 소망하는 제한효소 위치(즉, EcoP15I, EarI 및 BtsI 중 하나)를 포함하는 DNA 단편들을 선택하였다. 상기 프로세싱된 유전자 단편들로부터 제한효소 위치를 포함하는 플랭킹 서열을 제거하고 상기 플랭킹 서열-제거된 내부 서열을 타겟 페니실린 생합성 유전자 클러스터 서열과 정렬하였다. 상기 내부 서열이 레퍼런스 서열과 완벽하게 일치하는 경우에, 상기 내부 서열이 타겟 유전자 클러스터 서열에 도식적으로 나열되었다(도 9b). 이후, 상기 프로그램은 이후의 어셈블리 과정에 필요한 다른 단편들과 15 bp 이상 중첩되는 최적의 내부 서열 세트를 결정하여 준다.
상기 선택된 유전자 단편들은 완전한 타겟 유전자로 재결합된다(도 9c). 파이선 프로그램에 포함된 모든 분석 스크립트들은 요청에 따라 자유롭게 이용 가능하다.
타겟 어셈블리 산물로부터 타겟 유전자 클러스터의 합성
소망하는 shotgun 어셈블리 산물의 증폭 및 상기 shotgun 어셈블리 산물로부터 플랭킹 서열의 제거
상술한 바와 같이, 본 발명자들은 최적 세트의 shotgun 어셈블리 산물을 선택하기 위해 자체-제작된 파이선 프로그램을 이용하였다. 상기 중첩하는 오류없는 DNA 단편들이 선택된 바코딩된 프라이머 쌍을 이용하여 shotgun 어셈블리 DNA 혼합물로부터 선택적으로 증폭되었다. 상기 증폭에 이용된 각 시약의 양은 다음과 같다: 8 ㎕의 물, 10 ㎕의 Phusion 폴리머라제 프리-믹스, 1 ㎕의 정방향 및 역방향 바코드 프라이머, 그리고 1 ㎕의 shotgun 어셈블리 DNA 혼합물.
PCR 조건은 다음과 같았다: (a) 전변성 단계, 95℃에서 3분; (b) 95℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 1분으로 이루어진 30 사이클의 PCR 단계; 및 (c) 최종 연장 단계, 72℃에서 10분. 상기 바코드 프라이머는 하기 표 1 내지 표 7에 기재되어 있다.
오류없는 단편을 획득하기 위한 PCR에 이용된 degenerate 프라이머의 서열.
단편 daughter
단편		 CODE 이용된
제한효소		 프라이머 서열
(5-> 3)		 네스티드 PCR
프라이머 서열
(5-> 3)
1 1-a G2JQR9I07H3VM7 BtsI 풀로부터 EcoP15I 정방향 CTATTTGATGTTCGTAGTTCCAG 정방향
역방향 AGCCTTTTCAAAGCGAAAG 역방향
1-b G2JQR9I07H5WCJ EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 ATCTATTAGGTCATAGTAGGCAG 정방향
역방향 CATGCAGAGGAAACCATAAA 역방향
1-c G2JQR9I07H38JU EarI 정방향 GAATGTTTGTTGCGTTTCCA 정방향
역방향 TGCTATTCTTTCTGCCTTTTCAG 역방향
1-d G2JQR9I07IKM12 EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 TCGAGCTCAATAGTTTTTTCAG 정방향
역방향 TTTATGATTGCATTCAGCAGCAG 역방향
1-e G2JQR9I06HC8AH EarI 정방향 TTACTCCATTTTGCACTCTCAG 정방향
역방향 ATTCTTTGGCCTTTGTTGACAG 역방향
오류없는 단편을 획득하기 위한 PCR에 이용된 degenerate 프라이머의 서열.
단편 daughter
단편		 CODE 이용된
제한효소		 프라이머 서열
(5-> 3)		 네스티드 PCR
프라이머 서열
(5-> 3)
2 2-a G2JQR9I06HCZWA BtsI 풀로부터 네스티드 PCR 정방향 TTAGTTTCAACATGTATATACAGCAGC 정방향 GTGAATATCCGTCTAGCAAGC
역방향 ATGTGTATATTCGACACTTTCAGC 역방향 CAGTTCACGTTCGTCGCACACCAC
2-b G2JQR9I06GYZ2I EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 CTATTTTCAGTGTGCCTTT 정방향
역방향 TCCTAAGTTGATGAAACTTT 역방향
2-c G2JQR9I06GUX19 EarI 정방향 TAGAACTGGCAATGACGCTG 정방향
역방향 TATCTGGTAGGAGGGGTT 역방향
2-d G2JQR9I06G2U2M EarI 정방향 TTCTGTTTGTCTTAAATGCG 정방향
역방향 TACCGTTTTTAAGATTGCGT 역방향
2-e G2JQR9I07IH5UA BtsI 풀로부터 EcoP15I 정방향 CTGAAATTCATTTATGTTTG 정방향
역방향 CTATGGGGTACCTTTTTG 역방향
2-f G2JQR9I06G01OD EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 ATATTCGAGCGTATGTATTA 정방향
역방향 AAGTGATTGTTTACAGTCTC 역방향
2-g G2JQR9I07IKZ70 EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 GGGTTCTTTCCCTTATTTTG 정방향
역방향 TCATTTCGAGAAAAGGCCGA 역방향
3 3-a G2JQR9I06HH7SE EarI 정방향 AAGTGTTGAGAGTGGTATAT 정방향
역방향 AACGAGGATATACAAATATA 역방향
3-b G2JQR9I07H5FTG EarI 정방향 ATGGAGCTTTTATGTGGTTA 정방향
역방향 AATTGTCTAGTTTCGTTGTT 역방향
3-c G2JQR9I06GWSUY BtsI 풀로부터 EcoP15I 정방향 TGTTGGTTGTTCAATGGAGT 정방향
역방향 ATACTTGTTTCAATTTTGTCCAGC 역방향
오류없는 단편을 획득하기 위한 PCR에 이용된 degenerate 프라이머의 서열.
단편 daughter
단편		 CODE 이용된
제한효소		 프라이머 서열
(5-> 3)		 네스티드 PCR
프라이머 서열
(5-> 3)
4 4-a G2JQR9I06GX0BH EarI 풀로부터 네스티드 PCR 정방향 TATTTTTTTCCAATTTTTTACAGC 정방향 ACCTGCATCCAGCTGATTGCGCGTATCCGTCAGCGTCAGCGTTTGTCTGTGTCTATCTCTGTG
역방향 ATCCTCTGCTATTCTGTTGC 역방향 GGGAAAGGGTGGTGTTGTAA
4-b G2JQR9I07H7Z2P EarI 풀로부터 네스티드 PCR 정방향 CTAATTTGAATGCAGTCCGT 정방향 CATGGAACAAAGTGATGCTT
역방향 ACATTACCTTTGGAAAAAACC 역방향 TCCAGCAGCTGGAAGACTT
4-c G2JQR9I06HCPB7 EarI 풀로부터 네스티드 PCR 정방향 TTAAGTATGATTAATGCTGTCA 정방향 TCTGCGCTTCTCTTGGGAA
역방향 CGATATTGTTCATAATATGTCAG 역방향 GGCGTAAATCTTCCAGTTTA
4-d G2JQR9I06GS219 EarI 풀로부터 네스티드 PCR 정방향 GTGGTATGCACGTTGGTC 정방향 TGGTGCAGTAGAAGACCGTA
역방향 TATGTGAGTGATCNCCGTTTCAG 역방향 TTTTTCGAACAGAAGCGGTA
4-e G2JQR9I06HA06O BtsI 풀로부터 네스티드 PCR 정방향 ATTACTTAGGGTATTGCGTTC 정방향 CGTTTACCTGATCAAACACAGC
역방향 AGACCTTCAGTCTTTGCGAT 역방향 AGCTGCACTTTATAGCGG
4-f G2JQR9I07IGZCH EarI 풀로부터 네스티드 PCR 정방향 ATAGCGTTATTAATTTCTGTCAG 정방향 TGCTCTGTTAAACGAACGCA
역방향 ATAGTTATTCGGCTAGTCCT 역방향 TTGCGACCAGAAATAGTGGTG
오류없는 단편을 획득하기 위한 PCR에 이용된 degenerate 프라이머의 서열.
단편 daughter
단편		 CODE 이용된
제한효소		 프라이머 서열
(5-> 3)		 네스티드 PCR
프라이머 서열
(5-> 3)
5 5-a G2JQR9I07ILSL3 BtsI 풀로부터 EcoP15I 정방향 CGGATCGTTTATTGACTGTT 정방향
역방향 TCATAGAGGAGGTGCTATGG 역방향
5-b G2JQR9I07IMJ1B EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 GATATTTCGCGGTTCTGTTG 정방향
역방향 AGGTAAAGGTTACTTAAACTCAG 역방향
5-c G2JQR9I06GZ26W BtsI 풀로부터 EcoP15I 정방향 TAGTCTTTGCCGGTTTATTA 정방향
역방향 TTGCAAAGATTCTACAGA 역방향
5-d G2JQR9I07IQTYC EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 CTAAACTCTTTACTTCCTAT 정방향
역방향 AGCTCGTTATTATGTGGCTT 역방향
5-e G2JQR9I07IBIHM EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 TGGTTTCAAAATGATAAGTACAG 정방향
역방향 TGGCTCTCTTTTTGCTTATCAG 역방향
5-f G2JQR9I07IEGMC EarI 정방향 TTTGTAATTTGACTCTGATGCAG 정방향
역방향 TAGGAATCTTTTGACTTTTCACAG 역방향
6 6-a G2JQR9I07IQ369 EarI 풀로부터 네스티드 PCR 정방향 TACTGGGAGCAAACAATTCTCAG 정방향 CTAACTACGTTTTCGATCACTTCG
역방향 TTCGTCTGCTGTTTTCACTCAG 역방향 TTCACGGATTTTGTCGAAGAC
6-b G2JQR9I06HBBGB EarI 풀로부터 네스티드 PCR 정방향 GTGGGATGGAAGCTCCTC 정방향 GCTTTCAGCGAGCCGGTCTTCGACAAAATCCGTGAAACCTTCCACGGTTTGGTTATC
역방향 TGTATTATGTCCTTTTTGCCAGC 역방향 CAGGTACAGCTCACCCAC
6-c G2JQR9I07H1GGH EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 TGTTGGATATATAGGGTTAC 정방향
역방향 CATGGGGATGATGTGTACTT 역방향
6-d G2JQR9I07HZ198 EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 ATTTAGTTGGAATTAATCTC 정방향
역방향 AATTCACTCAGAATAATTTT 역방향
6-e G2JQR9I07IMS4O EarI 정방향 CTACTGTTCGTTCCCAATTA 정방향
역방향 TTGGTGTAAAACTGGGGGAA 역방향
오류없는 단편을 획득하기 위한 PCR에 이용된 degenerate 프라이머의 서열.
단편 daughter
단편		 CODE 이용된
제한효소		 프라이머 서열
(5-> 3)		 네스티드 PCR
프라이머 서열
(5-> 3)
7 7-a G2JQR9I07H02JG EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 ATGTGTTATAGAAGTTGTTG 정방향
역방향 TGACATGTGTTATCCCTGCT 역방향
7-b G2JQR9I07IMJ1B EarI 정방향 TTTCAGAAACTTAAACTTAC 정방향
역방향 TTATAAGAAGTAATAGGAAT 역방향
7-c G2JQR9I06GZ26W EarI 정방향 TATACAATCTATTGGTAATC 정방향
역방향 TGGAATACTTTAATCCTTTC 역방향
7-d G2JQR9I07IQTYC BtsI 풀로부터 EcoP15I 정방향 TGTATAGTGTGAGGATCTTT 정방향
역방향 TTACATGCTTTCGACACATA 역방향
7-e G2JQR9I07IBIHM BtsI 풀로부터 EcoP15I 정방향 GTTAATTTCTGGGGATACGT 정방향
역방향 TAACTCACGCTTTTTATAAG 역방향
7-f G2JQR9I07IEGMC EarI 정방향 TTCTTGTCACTCTCTTTATCCA 정방향
역방향 TCTATCGGTTTTCGGGTTT 역방향
8 8-a G2JQR9I07IQ369 BtsI 풀로부터 네스티드 PCR 정방향 GAAGCACCTGTCTTATTTAACAG 정방향 GGTCGTTCTGCGTGTAGATAT
역방향 TGATCTTCCCGGGTAGGC 역방향 CTGCAGCAGTTTCGTAACTTC
8-b G2JQR9I06HBBGB EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 GCGTTGGAAGCTTTTTATTG 정방향
역방향 TCATCCTATTACGATGCCCG 역방향
8-c G2JQR9I07H1GGH EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 ATTTATAAGGACGGGCCAGC 정방향
역방향 AAACGNTCCCCGTATTGGTA 역방향
8-d G2JQR9I07HZ198 BtsI 풀로부터 EcoP15I 정방향 TTTTGATTCAATCCTCCTAA 정방향
역방향 TAATCTGATCGATGCTAGGA 역방향
오류없는 단편을 획득하기 위한 PCR에 이용된 degenerate 프라이머의 서열.
단편 daughter
단편		 CODE 이용된
제한효소		 프라이머 서열
(5-> 3)		 네스티드 PCR
프라이머 서열
(5-> 3)
9 9-a G2JQR9I07IQ5TF EarI 정방향 TTGCGATGGTTTACTTTGAT 정방향
역방향 TTTCCTATTTCTTCATTGGCAG 역방향
9-b G2JQR9I07IK8X6 EarI 정방향 GGAAGGTTTTTTACTGATTT 정방향
역방향 ATCATTGCACTTGTTGTTCG 역방향
9-c G2JQR9I06HGDLG EarI 정방향 TTATTCGTGGATTGGTGTTC 정방향
역방향 ATTTTTCTAGGTTCTGATTA 역방향
9-d G2JQR9I06G8AYI EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 CCTCCTTTATTTCTCGTGC 정방향
역방향 TGATTTCACCACTAAGTCT 역방향
9-e G2JQR9I07ITPM8 EarI 정방향 TGTAAACCTATATTCATCTC 정방향
역방향 TAAAGTTATCATGTGCTACC 역방향
9-f G2JQR9I06HH6RD EarI 풀로부터 네스티드 PCR 정방향 GTTCATTGCATAATGCTTCTCAG 정방향 CTAACCCGTTCTGCAAGGAAG
역방향 TTAAAGCCCTTTACATCCAGCAGC 역방향 CGGCTGCTGCTGGCGG
9-g G2JQR9I07IAIBJ EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 AATAGGTACCATTTTCGTT 정방향
역방향 ATTGATATGTAAGAGATTTC 역방향
10 10-a G2JQR9I06G19MG EarI 풀로부터 네스티드 PCR 정방향 GATTACTACATTTTTCTCAACAG 정방향 CGTTTATGGGAAAGCGC
역방향 CTTTTGGGGGGGGTTGGGCC 역방향 GCTATCCTTCATGAAAACGTG
10-b G2JQR9I07IHPYZ EarI 정방향 CTCATACTGGGATCCGATTT 정방향
역방향 AATTGGTTACCTCTATCCCC 역방향
10-c G2JQR9I07H9H15 EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 GCATAAAGCGGGAGGCTTCT 정방향
역방향 CTGTGTCATAGAATAGTGC 역방향
10-d G2JQR9I07IS7M7 BtsI 풀로부터 네스티드 PCR 정방향 TTTTTTGACGGTAATTA 정방향
역방향 TTTCGACCGATTTCAGTCTG 역방향
10-e G2JQR9I07H9WDO EarI 정방향 TTTTACATCATTCGCGTATT 정방향
역방향 CTTCCTGTGGGTTTTCTA 역방향
10-f G2JQR9I07IA5L7 EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 TCAATACATTCTACTTT 정방향
역방향 TTTTTGAGCTACGCTTTCGG 역방향
오류없는 단편을 획득하기 위한 PCR에 이용된 degenerate 프라이머의 서열.
단편 daughter
단편		 CODE 이용된
제한효소		 프라이머 서열
(5-> 3)		 네스티드 PCR
프라이머 서열
(5-> 3)
11 11-a G2JQR9I06GX0BH EarI 풀로부터 EcoP15I 정방향 GTCAGTAGTATACCGTTCGT 정방향
역방향 CGATCTAAGATTGCCTTCCT 역방향
11-b G2JQR9I07H7Z2P EarI 정방향 TTTATGTTTTTGAATTAGCAGCA 정방향
역방향 TCTCATAATTGGGAATTGTACAG 역방향
11-c G2JQR9I06HCPB7 EarI 정방향 ATCTTTTATGTACTTTGTGA 정방향
역방향 TTTTTCAACACTTTTAGTGT 역방향
11-d G2JQR9I06GS219 EarI 정방향 TCTTGTTTATTTCTTTGGGT 정방향
역방향 TAATTTCCTGTGCAACT 역방향
11-e G2JQR9I06HA06O BtsI 풀로부터 네스티드 PCR 정방향 ATGTATCCTCGCTCTTTAACCAG 정방향 GGCATTCTGGCGATGGAGAT
역방향 CACCCGGTTTGATTATTACTCA 역방향 GTCGTAGTACTCATACAGGCG
11-f G2JQR9I07IGZCH BtsI 풀로부터 네스티드 PCR 정방향 CTAACGCATTGTCAGGTTTCC 정방향 GAATCAGAAAACCAGCGTCGCCTGTATGAGTACTACGACGCGTTAGATTCCAC
역방향 ACTCCGGATACCAGTGTAGAAC 역방향 TTACTTCCAACGACCGATGTACTGAGCCGCC
소망하는 PCR 증폭 산물 서열은 하기 표 8 내지 표 19에 기재되어 있다.
PCR 회수 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
1 1-a CTATTTGATGTTCGTAGTTCCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCAGTAATGACCCAATTGAAGCCGCCTAACGGGACCACTCCGATCGGCTTCAGCGCCACTACTAGCCTGAACGCTAGCGGCTCTTCCTCGGTTAAGAATGGTACCATCAAGCCTTCGAATGGTATCTTCAAACCTTCTACTCGTGACACCATGGACCCGTGCTCGGGCAACGCCGCTGACGGCTCCATTCGCGTACGTTTTCGCGGTGGCATCGAACGTTGGAAAGAGTGTGTAAACCAAGTGCCGGAGCGTTGCGACCTGTCTGGTCTGACCACGGACAGCACCCGCTACCAGCTGGCTTCCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGAGCCTTTTCAAAGCGAAAG 392
1-b ATCTATTAGGTCATAGTAGGCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTGGCTTCGGCGACGCGAGCGCGGCTTACCAGGAACGTCTGATGACTGTGCCGGTAGATGTTCATGCTGCGCTCCAGGAGCTGTGCCTGGAACGCCGCGTCTCTGTGGGTTCTGTGATCAACTTCAGCGTTCACCAGATGCTGAAGGGTTTTGGCAACGGTACTCACACTATCACCGCGAGCCTGCACCGCGAACAGAATCTGCAGAACTCCTCTCCGTCTTGGGTCGTTTCCCCTACTATCGTGACCCATGAAAACCGCGATGGCTGGTCAGTGGCGCAGGCAGTGGAGTCTATCGAGGCTAGAAGACCACACATGGCACCTTTGCTGCTGCATGCAGAGGAAACCATAAAT 402
1-c GAATGTTTGTTGCGTTTCCACAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTGCGCACAATAACAGCCAGCGGAAAGTCGAAGCAAGGGATACGCGCGTCATCCGCATCGACGAAGGAAACCAGCAGATCGAACAGACCCATTTTGACCAGGGAGGAGCCGGAATCAATCGCGGTCACAGATTCCTTTTCGGAGCCACGACCAGCCTCGATAGACTCCACTGCCTGCGCCACTGACCAGCCATCGCGGTTTTCATGGGTCACGATAGTAGGGGAAACGACCCAAGACGGAGAGGAGTTCTGCAGATTCTGTTCGCGGTGCAGGCTCGCGGTGATAGTGTGAGTACCGTTGCCAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGAAAAGGCAGAAAGAATAGCA 402
1-d TCGAGCTCAATAGTTTTTTCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCGTGATGACGCGCGTATCCCTTGCTTCGACTTTCCGCTGGCTGTTATTGTGCGCGAGTGCGATGCAAACCTGTCTCTCACCCTTCGCTTCTCGGACTGCCTGTTCAACGAGGAAACCATTTGTAATTTCACGGATGCCCTCAATATCCTGTTGGCTGAGGCAGTTATCGGTCGTGTAACTCCGGTAGCCGATATCGAGCTGCTGTCTGCAGAGCAGAAACAACAGCTGGAGGAATGGAACAACACCGATGGTGAATATCCGTCTAGCAAGCGTCTGCACCACCTGATTGAAGAGGTGGTGGAACCACTGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGCTGCTGAATGCAATCATAAA 400
1-e TTACTCCATTTTGCACTCTCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCATGATGACGCGCGTATCCCTTGCTTCGACTTTCCGCTGGCTGTTATTGTGCGCGAGTGCGATGCAAACCTGTCTCTCACCCTTCGCTTCTCTTCAACGAGGAAACCATTTGTAATTTCACGGATGCCCTCAATATCCTGTTGGCTGAGGCAGTTATCGGTCGTGTAACTCCGGTAGCCGATATCGAGCTGCTGTCTGCAGAGCAGAAACAACAGCTGGAGGAATGGAACAACACCGATGGTGAATATCCGTCTAGCAAGCGTCTGCACCACCTGATTGAAGAGGTGGTGGAACCACTACGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGTCAACAAAGGCCAAAGAAT 389
PCR 회수 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
2 2-a TTAGTTTCAACATGTATATACAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGAGTGCAACGAGGAAACCATTTGTAATTTCACGGATGCCCTCAATATCCTGTTGGCTGAGGCAGTTATCGGTCGTGTAACTCCGGTAGCCGATATCGAGCTGCTGTCTGCAGAGCAGAAACAACAGCTGGAGGAATGGAACAACACCGATGGTGAATATCCGTCTAGCAAGCGTCTGCACCACCTGATTGAAGAGGTGGTGGAACGTCACGAAGACAAAATCGCTGTGGTGTGCGACGAACGTGAACTGACTTACGGTGAACTCAATGCCCACGGCAACTCCCTGGCGCGTTACCTGCACAGCATCACTGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGAAAGTGTCGAATATACACAT 401
2-b CTATTTTCAGTGTGCCTTTCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGAGTGGTCACGAAGACAAAATCGCTGTGGTGTGCGACGAACGTGAACTGACTTACGGTGAACTCAATGCCCAGGGCAACTCCCTGGCGCGTTACCTGCGCAGCATTGGTATTCTGCCTGAACAGCTGGTTGCGCTGTTTCTGGACAAATCCGAAAAATTGATCGTAACCATCCTGGGCGTCTGGAAATCCGGTGCTGCTTACGTGCCAATTGACCCGACCTACCCTGACGAACGTGTTCGTTTCGTTCTGGACGACACGAAAGCCCGTGCGATTATCGCTTCCAATCAGCATGTTGAACGCCTCCCACTGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGAAAGTTTCATCAACTTAGGA 400
2-c TAGAACTGGCAATGACGCTGCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCACTCTTCTTGGTATAAGTAACGTACGCCAGCTGCTGGCTGGTCAGCGGCAAATCATCCAGGTTGTGGGCAGGGAATTTAGAAGAATCCTGCGCAAGGCTCGCCAGCAGTGGTTCGAGACGGATGATGCACAGGTTGCGATCACCGATTACTTCACGCTGGAGGCGTTCAACATGCTGATTGGAAGCGATAATCGCACGGGCTTTCGTGTCGTCCAGAACGAAACGAACACGTTCGTCAGGGTAGGTCGGGTCAATTGGCACGTAAGCAGCACCGGATTTCCAGACGCCCAGGATGGTTACGATCAATTAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGAACCCCTCCTACCAGATA 400
2-d TTCTGTTTGTCTTAAATGCGCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTAGCGTGAAGTAATCGGTGATCGCAACCTGTGCATCATCCGTCTCGAACCACTGCTGGCGAGCCTTGCGCAGGATTCTTCTAAATTCCCTGCCCACAACCTGGATGATTTGCCGCTGACCAGCCAGCAGCTGGCGTACGTTACTTATACCAGCGGTACCACCGGCTTTCCGAAAGGCATTTTCAAACAGCACACTAACGTTGTTAACTCCATCACAGACCTGTCCGCTCGTTACGGTGTTGCAGGTCAACACCATGAAGCTATCCTGCTCTTCAGTGCTTGCGTTTTCGAACCGTTCGTTCAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGACGCAATCTTAAAAACGGTA 402
2-e CTGAAATTCATTTATGTTTGCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCAGTGGTTAACTCCATCACAGACCTGTCCGCTCGTTACGGTGTTGCAGGTCAACACCATGAAGCTATCCTGCTCTTCAGTGCTTGCGTTTTCGAACCGTTCGTTCGTCAGACTCTGATGGCCCTGGTGAACGGTCACCTGCTCGCCGTGATTAACGATGTAGAAAAATATGACGCTGACACCCTCCTCCCATTTATCCGCCGTCACTCTATCACCTATCTGAACGGTACTGCGTCGGTTCTCCAAGAGTATGACTTCTCTGACTGTCCGAGCCTGAACCGTATCATCCTCTGCGAACACATCGACCCTGCGACCTGCTGCAAAAAGGTACCCCATAG 383
PCR 회수 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
2 2-f ATATTCGAGCGTATGTATTACAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCGTCTCTATCACCTATCTGAACGGTACTGCGTCGGTTCTCCAAGAGTATGACTTCTCTGACTGTCCGAGCCTGAACCGTATCATCCTGGTGGGCGAGAACCTGACCGAAGCACGTTACCTGGCACTGCGTCAGCGTTTCAAAAATCGTATTCTGAACGAGTACGGTTTCACCGAGTCTGCGTTCGTGACTGCGCTGAAAATTTTCGATCCGGAAAGCACCCGCAAAGATACCTCCCTGGGGCGTCCGGTGCGCAATGTTAAATGCTATATCTTGAACCCTAGCCTGAAACGCGTGCCAATTGGCATGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGGAGACTGTAAACAATCACTT 399
2-g GGGTTCTTTCCCTTATTTTGCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGACAGTGCCGGTTTTGTACATCAGAGAGTTGATACCCAGCTGTTTTTCGCAATCGGTCTGAAACGGGTTCGGGATGAAGCGGTGCGGCGTCAGTTCCGGACGATTCAAGTAACCCTTGGAGATACCCAGGCCGCCAATATGCAGCTCACCTGTAGCACCAATTGGCACGCGTTTCAGGCTAGGGTTCAAGATATAGCATTTAACATTGCGCACCGGACGCCCCAGGGAGGTATCTTTGCGGGTGCTTTCCGGATCGAAAATTTTCAGCGCAGTCACGAACGCAGACTCGGTGAAACCGTACTCGTTCCACTGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGTCGGCCTTTTCTCGAAATGA 402
3 3-a AAGTGTTGAGAGTGGTATATCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTCTACCAGGTGTTCGTTCGTTGTTTCTTCAGGACCGTTACGTAATTTCTTGGAAACCACCAGGGAGGTACGAACGCGCGGATACATCGCCAGCATAGTCTCGATTTCGCCCGGCTCAATACGAATACCGCGCAGTTTGATCTGGAAATCCGCACGGCCCAGGTATTCAACTTCACCGTTCGGGAGCCAGCGAGCCAGATCACCGGTTTTGTACATCAGAGAGTTGATACCCAGCTGTTTTTCGCAATCGGTCTGAAACGGGTTCGGGATGAAGCGGTGCGGCGTCAGTTCCGGACGATTCAAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGTATATTTGTATATCCTCGTT 402
3-b ATGGAGCTTTTATGTGGTTACAGCAGAGGACATCTTAGCGGTCGCTCTTCTCGGATTTCCAGATCAAACTGCGCGGTATTCGTATTGAGCCGGGCGAAATCGAGACTATGCTGGCGATGTATCCGCGCGTTCGTACCTCCCTGGTGGTTTCCAAGAAATTACGTAACGGTCCTGAAGAAACAACGAACGAACACCTGGTAGGCTACTACGTATGCGACTCCGCATCTGTTTCCGAAGCGGATCTGCTGTCCTTCCTGGAGAAGAAGCTGCCGCGTTATATGATTCCGACTCGTCTGGTACAGCTGAGCCAGATCCCGGTTAACGTCAACGGTAAAGCCGATCTGCGTGCTCAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGAACAACGAAACTAGACAATT 402
3-c TGATTATGGTGGTTGCGGTGCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCAGTGTTCCTGGAGAAGAAGCTGCCGCGTTATATGATTCCGACTCGTCTGGTACAGCTGAGCCAGATCCCGGTTAACGTCAACGGTAAAGCCGATCTGCGTGCTCTGCCGGCGGTTGATATCTCCAACAGCACCGAAGTTCGTTCTGATCTGCGTGGTGATACCGAAATTGCCCTCGGCGAAATCTGGGCGGACGTGCTGGGCGCGCGTCAGCGTTCGGTTAGCCGTAACGATAACTTTTTCCGCCTCGGTGGCCACTCTATCACCTGCATCCAGCTGATTGCGCGTATCCGTCAGCGTCAGCGTCACTGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGCAGAATAACTAAATTAGTAT 402
PCR 회수 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
4 4-a TATTTTTTTCCAATTTTTTACAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCAACCTGCATCCAGCTGATTGCGCGTATCCGTCAGCGTCAGCGTTTGTCTGTGTCTATCTCTGTGGAAGACGTGTTTGCTACACGCACTCTTGAGCGTATGGCCGACCTGTTGCAAAACAAACAGCAAGAGAAATGCGACAAACCACACGAAGCACCGACTGAACTGCTTGAAGAAAACGCTGCGACTGATAACATCTACCTGGCGAACAGCCTGCAGCAAGGTTTCGTCTACCATTACCTGAAAAGCATGGAACAAAGTGATGCTTATGTAATGCAGAGCGTTCTGCGTTACAACACCACCCTTTCCCGGATCTGTTCCAGCGTGCCTGGAAACACGCGCAGCCTGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGGCAACAGAATAGCAGAGGAT 399
4-b CTAATTTGAATGCAGTCCGTCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCAGTAAGCATGGAACAAAGTGATGCTTATGTAATGCAGAGCGTTCTGCGTTACAACACCACCCTTTCCCCGGATCTGTTCCAGCGTGCCTGGAAACACGCGCAGCAAAGCTTCCCGGCTCTGCGTCTGCGCTTCTCTTGGGAAAAAGAAGTCTTCCAGCTGCTGGGATCAGGACCCGCCTCTGGACTGGCGTTTCCTCTACTTCACTGATGTGGTGGCAGGTGCAGATCCCCGTTNTCAGTCGGGCGAACCAGTGACAGCTGGGTATCTTCGTTGATGCCTCAGCGCTCAGTTCGGACAGCTGACGCAGAAGGTACACTGCGAACACATGACCCTTCGACCTGCTTGGTTTTTTCCAAAGGTAATGT 413
4-c TTAAGTATGATTAATGCTGTCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCGTGCAAAGCTTCCCGGCTCTGCGTCTGCGCTTCTCTTGGGAAAAAGAAGTCTTCCAGCTGCTGGATCAGGACCCGCCTCTGGACTGGCGTTTCCTCTACTTCACTGATGTGGCGGCTGGTGCAGTAGAAGACCGTAAACTGGAAGATTTACGCCACCAGGACCTCACCGAGCGTTTTAAACTGGATGTGGGCCGTCTGTTTCGCGTTTACCTGATCAAACACAGCGAAAACCGTTTCACTTGTCTGTTCTCTTGTCACCCGCTATCCTGGACGGCTGGTCCTTACCGCTTCTGTTCGAAAACCCTGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGACATATTATGAACAATATCG 399
4-d GTGGTATGCACGTTGGTCCTCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCAGTCCAAAGCTTCCCGGCTCTGCGTCTGCGCTTCTCTTGGGAAAAAGAAGTCTTCCAGCTGCTGGATCAGGACCCGCCTCTGGACTGGCGTTTCCTCTACTTCACTGATGTGGCGCTGGTGCAGTAGAAGACCGTAAACTGGAAGATTTACGCCGCCAGGACCTCACCGAGCGTTTTAAACTGGATGTGGGCCGTCTGTTTCGCGTTTACCTGATCAAACACAGCGAAAACCGTTTCACTTGTCTGTTCTCTTGTCACCACGCTATCCTGGACGGCTGGTCCTTACCGCTTCTGTTCGAAAAACNCTGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGAAACGGNGATCACTCACATA 401
4-e ATTACTTAGGGTATTGCGTTCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCAGGCGTTTACCTGATCAAACACAGCGAAAACCGTTTCACTTGTCTGTTCTCTTGTCACCACGCTATCCTGGACGGCTGGTCCTTACCGCTTCTGTTCGAAAAAGTACACGAAACATACCTGCAACTGCTGCACGGCGATAACCTGACCTCCTCTATGGATGATCCATACACCCGTACCCAACGCTACCTGCATGCGCACCGCGAAGATCACCTCGACTTTTGGGCTGGCGTGGTGCAGAAAATCAACGAACGTTGCGATATGAATGCTCTGTTAAACGAACGCAGCCGCTATAAAGTGCAGCTCACTGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGATCGCAAAGACTGAAGGTCT 401
PCR 회수 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
4 4-f ATAGCGTTATTAATTTCTGTCAGCAGAGGGCATCTTAGGGGTCGCTCTTCTAAGATCACCTCGACTTTTGGGCTGGCGTGGTGCAGAAAATCAACGAACGTTGCGATATGATGCTCTGTTAAACGAACGCAGCCGCTATAAAGTGCAGCTGGCCGACTACGATCAGGTACAGGAACAGCGTCAGCTGACGATCGCTCTGAGCGGTGACGCGTGGCTGGCGGATCTGCGCCAGACATGCAGTGCGCAGGGCATCACGCTGCACTCTATCCTGCAATTTGTATGGCATGCAGTTCTGCATGCCTACGGTGGCGGTACTCACACTATCACTGGCACCACTATTTCTGGTCGCAAGAAGCGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGAGGACTAGCCGAATAACTAT 401
5 5-a CGGATCGTTTATTGACTGTTCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGATTTATCCAGGTTTGGATAGTTTTCCAGCACAAACAGAGAATCGAACAGGCCATGTTTCAGGTCGGTTTTGTGCAGGCGACCCAGTTCTACATTACCACGGGAGTTCATAACATTCACCTTCGCTTGGACGTCTTCAATAGCTTCCATGATCGTCTTGTCTTTAAAAGTAGAATGGTCCAACACTAACGGCAGGGTGTTAATGTACGGGCCTACCGCACGCTCGATACCCAGGATCGGGAGGTTGCGACCAGAAATAGTGGTGCCAGTGATAGTGTGAGTACCGCCACCGTAGCACTGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGCCATAGCACCTCCTCTATGA 390
5-b GATATTTCGCGGTTCTGTTGCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCAGTAGCTATTGAAGACGTCCAAGCGAAGGTGAATGTTATGAACTCCCGTGGTAATGTAGAACTGGGTCGCCTGCACAAAACCGACCTGAAACATGGCCTGTTCGATTCTCTGTTTGTGCTGGAAAACTATCCAAACCTGGATAAATCCCGTACTCTGGAGCACCAAACTGAACTGGGTTACTCCATCGAGGGTGGTACCGAAAAACTGAACTATCCGCTGGCGGTGATTGCTCGTGAGGTTGAGACCACTGGCGGCTTTACTGTTAGCATCTGCTATGCGAGCGAACTGTTTGAAGAGGTGATCACTGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGAGTTTAAGTAACCTTTACCT 401
5-c TAGTCTTTGCCGGTTTATTACAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCAGTGAACTGAACTATCCGCTGGCGGTGATTGCTCGTGAGGTTGAGACCACTGGCGGCTTTACTGTTAGCATCTGCTATGCGAGCGAACTGTTTGAAGAGGTGATGATCAGCGAGCTTCTCCATATGGTACAGGATACCCTGATGCAGGTTGCACGCGGGCTCAACGAACCTGTGGGCTCCCTGGAATACCTGTCTTCCATCCAGTTAGAGCAGCTGGCAGCGTGGAACGCCACCGAAGCGGAGTTCCCGGACACGACCCTGCATGAAATGTTCGAGAACGAAGCATCTCAAAAGCCGGATAAAACACTGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGTCTGTAGAATCTTTGCAA 400
5-d CTAAACTCTTTACTTCCTATCAGCAGAGGGAATCTTAGCGGTCGCTCTTCTTTAGAGCAGCTGGCAGCGTGGAACGCCACCGAAGCGGAGTTCCCGGACACGACCCTGCATGAAATGTTCGAGAACGAAGCATCTCAAAAGCCGGATAAAATTGCAGTCGTGTACGAAGAAACCTCTCTGACCTATCGCGAGCTGAACGAACGTGCCAATCGCATGGCGCACCAGCTGCGTTCCGACGTTTCTCCGAACCCGAACGAAGTGATCGCGCTGGTTATGGACAAGAGTGAACACATGATCGTAAATATCTTGGCTGTGTGGAAATCTGGTGGCGCATACGTGCCGATCGATCCGAGAAGATCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGAAGCCACATAATAACGAGCT 402
PCR 회수 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
5 5-e TGGTTTCAAAATGATAAGTACAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGGAACGAAGTGATCGCGCTGGTTATGGACAAGAGTGAACACATGATCGTAAATATCTTGGCTGTGTGGAAATCTGGTGGCGCATACGTGCCGATCGATCCGGGCTACCCGAATGACCGTATTCAGTATATCCTCGAGGACACTCAGGCGTTGGCTGTTATCGCAGATTCTTGTTACCTGCCTCGTATCAAAGGTATGGCCGCGTCTGGTACGCTGCTCTACCCGTCTGTCCTGCCGGCAAACCCAGACAGCAAATGGTCTGTGTCAAACCCGTCGCCGCTGTCTCGTAGCACCGACCTGGCAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGATAAGCAAAAAGAGAGCCA 394
5-f TTTGTAATTTGACTCTGATGCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTCGTCTGGTACGCTGCTCTACCCGTCTGTCCTGCCGGCAAACCCAGACAGCAAATGGTCTGTGTCAAACCCGTCGCCGCTGTCTCGTAGCACCGACCTGGCATACATCATCTACACCTCTGGCACCACCGGCCGCCCGAAAGGCGTGACTGTGGAGCATCACGGTGTGGTGAACCTGCAGGTATCCCTGAGCAAAGTTTTTGGTCTGCGTGACACCGACGACGAAGTCATCCTGTCTTTTTCTAACTACGTTTTCGATCACTTCGTAGAACAGATGACTGATGCTATCCTGAACGGGCAGAAGAAGAGCCACACAAGGCACCTTTGCTGCTGTGAAAAGTCAAAAGATTCCTA 403
6 6-a TACTGGGAGCAAACAATTCTCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCAGTAGGTCTGCGTGACACCGACGACGAAGTCATCCTGTCTTTTCTAACTACGTTTTCGATCACTTCGTAGAACAGATGACTGATGCTATCCTGAACGGGCAGACGCTGCTGGTTCTGAACGATGGTATGCGTGGTGACAAAGAACGCCTGTACCGCTACATCGAAAAGAACCGTGTAACTTATCTGTCTGGTACTCCATCTGTGGTGTCTATGTATGAGTTCAGCCGTTTCAAAGACCACCTGCGCCGCGTCGATTGCGTCGGTGAAGCTTTCAGCGAGCCGGTCTTCGACAAAATCCGTGAACACTACGAACACATGACCCAGCGACCTGCTGAGTGAAAACAGCAGACGAA 400
6-b GTGGGATGGAAGCTCCTCGACAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTCTACCTTCCACGGTTTGGTTATCAATGGTTATGGCCCAACTGAAGTTAGCATCACTACCCATAAGCGTTTATACCCTTTCCCAGAGCGCCGCATGGATAAGTCGATCGGCCAGCAGGTCCACAACTCTACTAGCTACGTACTGAATGAAGATATGAAGCGTACCCCGATCGGTGCTGTGGGTGAGCTGTACCTGGGCGGTGAAGGTGTTGTCCGCGGTTATCATAATCGTGCGGTGTTACCGCCGAGCGCTTCATCCCGAACCCGTTCCAGTCTGAGGAAGATAAACGTGAAGGCCGTAACAGAAGAACCACACATGGCACCTTTGCTGCTGGCAAAAAGGACATAATACA 399
6-c TTGTTGGATATATAGGGTTACAAAAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTCGATCGGCCAGCAGGTCCACAACTCTACTAGCTACGTACTGAATGAAGATATGAAGCGTACCCCGATCGGTGCTGTGGGTGAGCTGTACCTGGGCGGTGAAGGTGTTGTCCGCGGTTATCATAATCGTGCGGATGTTACCGCCGAGCGCTTCATCCCGAACCCGTTCCAGTCTGAGGAAGATAAACGTGAAGGCCGTAACAGTCGCCTGTACAAGACGGGTGATCTGGTTCGCTGGATCCCGGGTAGCTCCGGCGAAGTCGAATACCTGGGTCGCAATGACTTCCAGGTTAAGATTCGCGAGAAGAACCACACATGGCACCTTTGCTGCTGAAGTACACATCATCCCCATG 402
PCR 회수 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
6 6-d ATTTAGTTGGAATTAATCTCCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTTCCAGCTTCCCGGACGGAGTAACAGGGAATTTAGAAACCAGGATCAGACGGGACGGAACCATGTAACCCGGGAGGCGCGACTGCATGAAACGACGGATCGCTGCGGACGGCAGGGCAGCGTCTGCAACGTAATAGCCGACCAGGAATTTCTGTGCCCCCTCACGGCAGTCTTTTGCGATCACTACGCTCTGTTTAATGCCGTGGTAGCTGCTCAGGATCGCTTCGATTTCACCCAGCTCGATACGGAGGCCGCGAATCTTAACCTGGAAGTCATTGCGACCCAGGTATTCGACTTCGCCGAGAGAGCCACACAAGGCACCTTTGCTGCTGAAAATTATTCTGAGTGAATT 400
6-e CTACTGTTCGTTCCCAATTACAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTCGTCTGATCCTGGTTTCTAAATTCCCTGTTACTCCGTCCGGGAAGCTGGACACCAAAGCACTGCCGCCGGCGGAGGAAGAAAGCGAAATCGACGTTGTTCCACCGCGCTCCGAAATTGAGCGTTCTCTCTGCGACATCTGGGCTGAACTGCTGGAAATGCACCCGGAAGAAATCGGCATTTACTCTGACTTCTTCTCCTTGGGCGGCGACAGCCTGAAATCTACTAAGTTATCCTTCATGATCCATGAGTCCTTTAACCGTGCTGTGAGCGTTAGCGCGTTATTCTGCCATCGCACAGTTAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGTTCCCCCAGTTTTACACCAA 399
7 7-a ATGTGTTATAGAAGTTGTTGCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCCTAAGTTATCCTTCATGATCCATGAGTCCTTTAACCGTGCTGTGAGCGTTAGCGCGTTATTCTGCCATCGCACAGTTGAAGCTCAAACTCACCTGATCTTGAACGACGCAGCAGATGTACACGAAATTACCCCGATCGATTGCAACGACACCCAGATGATCCCGGTTTCCCGTGCACAGGAACGTCTGCTGTTCATTCATGAATTCGAAAACGGTTCTAACGCTTACAACATTGACGCGGCTTTCGAACTGCCAGGTTCTGTGGACGCGAGCCTGCTAGAAGAGCCACACATGGCACCTGTGCTGCTGAGCAGGGATAACACATGTCA 371
7-b TTTCAGAAACTTAAACTTACCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTGAAGCTCAAACTCACCTGATCTTGAACGACGCAGCAGATGTACACGAAATTACCCCGATCGATTGCAACGACACCCAGATGATCCCGGTTTCCCGTGCACAGGAACGTCTGCTGTTCATTCATGAATTCGAAAACGGTTCTAACGCTTACAACATTGACGCGGCTTTCGAACTGCCAGGTTCTGTGGACGCGAGCCTGCTGGAACAGGCCCTTCGTGGCAACCTGGCACGTCACGAAGCACTGCGCACCCTGCTGGTTAAAGATCACGCCACTGGTATTTACCTGCAGAAAGTACTGAATAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGATTCCTATTACTTCTTATAA 402
7-c TATACAATCTATTGGTAATCCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTAGGAACGTCTGCTGTTCATTCATGAATTCGAAAACGGTTCTAACGCTTACAACATTGACGCGGCTTTCGAACTGCCAGGTTCTGTGGACGCGAGCCTGCTGGAACAGGCCCTTCGTGGCAACCTGGCACGTCACGAAGCACTGCGCACCCTGCTGGTTAAAGATCACGCCACTGGTATTTACCTGCAGAAAGTACTGAGTCCGGACGAAGCGCAAGGTATGTTTTCTGTTAATGTAGATACTGCTAAACAGGTTGAACGTCTGGATCAGGAAATTGCTTCTCTGTCTCAGCACGTCTTCCAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGGAAAGGATTAAAGTATTCCA 402
PCR 회수 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
7 7-d TGTATAGTGTGAGGATCTTTCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCTGTGTTACGCATGCGGTCGCCGCTAAGCTGGCGGCGGTGGTACAGAGCGTATTCCTTATACTGTGCTTTTAATGCCGGTAAGTTCGCTGCAGATTTCGTTTTCTGAAGCGCTGCGTACAGCGCGCGCAGCTCCTGTTCGAAAACTTTCAGGCTCCATGCATCGAAGCAGGTGTGGTGGAAGGCCAAGATCAGGTACAGACCGCCAGATTCCAGTTTCAGGATGCGCGCCTCCCACGGCAGTTCGTCGTCCAGGCGGAAGACGTGCTGAGACAGAGAAGCAATTTCCTGATCCAGACGTTCAACCCACTGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGTATGTGTCGAAAGCATGTAA 402
7-e GTTAATTTCTGGGGATACGTCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGTTCTTCTGAATACGCTCTGTACCACCGCCGCCAGCTTAGCGGCGACCGCATGCGTAACCTGTCCGATTTCTGGTTACGTAAACTGATCGGTCTGGAACCACTGCAGCTGATCACCGATCGTCCGCGTCCGGTTCAGTTCAAATACGACGGTGACGATCTGAGCATCGAACTGTCCAAGAAAGAGACCGAAAACCTGCGCGGCGTTGCAAAACGTTGTAAGTCTTCCTTATATGTTGTACTGGTATCTGTTTACTGTGTCATGCTGGCAAGCTACGCCAACCAGAGCGATGTTAGCGTGGGCATCCCAAGAAGACCACACATGTCACCTTTGCTGCTGCTTATAAAAAGCGTGAGTTA 401
7-f TACCTGTGATCTGCGTCGTACAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTTGATCACCGATCGTCCGCGTCCGGTTCAGTTCAAATACGACGGTGACGATCTGAGCATCGAACTGTCCAAGAAAGAGACCGAAAACCTGCGCGGCGTTGCAAAACGTTGTAAGTCTTCCTTATATGTTGTACTGGTATCTGTTTACTGTGTCATGCTGGCAAGCTACGCCAACCAGAGCGATGTTAGCGTGGGCATCCCAGTATCACACCGTACGCACCCGCAGTTCCAGTCTGTTATCGGCTTTTTCGTTAACCTGGTCGTTCTGCGTGTAGATATCAGCCAGTCCGCTATTTGCGGTTAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGTCTTCATCGATAAATACAAA 402
8 8-a GAAGCACCTGTCTTATTTAACAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCATGAAAACGTTGTAAGTCTTCCTTATATGTTCTGGTATCTGTTTACTGTGTCATGCTGGCAAGCTACGCCACCAGAGCGATGTTAGCGTGGGCATCCCAGTATCACACCGTACGCACCCGCAGTTCCAGTCTGTTATCGGCTTTTTCGTTAACCTGGTCGTTCTGCGTGTAGATATCAGCCAGTCCGCTATTTGCGGTTTAATCCGTCGCGTCATGAAAGAACTGGTTGACGCGCAGCTGCACCAGGATATGCCGTTCCAGGAAGTTACGAAACTGCTGCAGGTGGATAACGATCCTAGCACTGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGAAGCCTACCCGGGAAGATCA 397
8-b GCGTTGGAAGCTTTTTATTGCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCCTCTTCTTTCATATGTGTGCAGGAAGCCCTGGATGGTGGATTTATTGAATAAGCTGGTCGCGTAGTTGAAATTAACACGCAGACCGGATTCCAGTTCGGTGACGGTGGCGTTCAGATCGAATTTGGCCACGCTGTCAACCGGCTGAACCGGACGGTACTGATTGAATGCAAGAGAGCCCTCGTCTTCAGAGCGGGCATCGTGTTCACCGTTCGCGCGAGACTCAAAGTTAAATACGTTCTGAACCAACGGGTGACGGCTAGGATCGTTATCCACCTGCAGCAGTTTCGTAACTTCCTGGAACGGCATAAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGCGGGCATCGTAATAGGATGA 400
PCR 회수 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
8 8-c ATTTATAAGGACGGGCCAGCCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTCCAGCTTATTCAATAAATCCACCATCCAGGGCTTCCTGCACACATATGAATACCTTCTGCGTCAGCTGTCCGAACTGAGCGCTGAAGGCATCAACGAAGATACCCAGCTGTCACTGGTTCGCCCGACTGAGAACGGGGATCTGCACCTGCCACTGGCCCAGTCTCCGCTCGCGACCACTGCAGAAGAACAGAAAGTTGCTTCCCTGAACCAGGCTTTCGAACGTGAAGCCTTCCTGGCGGCGGAAAAAATCGCCGTTGTTCAAGGGGACCGCGCTCTGTCGTATGCCGACCTGAACGGTCAGAAACCACACATGGCACCTTTGCTGCTGTACCAATACGGGGANCGTTT 400
8-d TTTTGATTCAATCCTCCTAACAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCAGTGGCACCGTGACGTTCACATTTAGAGGCGTGGGAAGAGTGTACCAGCACAGCTTTCGCTTTGATTTCCTCCAGGATCAGTTGTACACGGCCTGGTGGGTAGGTCGGATCCAGCGGCACATACGCGGCGCCTGCTTTCCAGATTGCCAGAATGCAGATGATAGTATCGATGCTCTTTTCCAGCATCAGGGCGATGCCGTCGTCGGCACCGATGCAGGAGACGGACTGGATATAACGCGCCAGTTGATTAGCCTGACCGTTCAGGTCGGCATACGACAGAGCGCGGTCCCCTTGAACAACGGCGCACTACGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGTCCTAGCATCGATCAGATTA 402
9 9-a TAGTTGTTCAACTCAGTCTACAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTCGAAGTAACGCTCACGCAGGGCGTCGCGCAGCAGCAGAACGGCTTTTTGCTCTACCAGAACGCCTTTCGGTTTGCCAGAAGTGCCGCTAGTAAAGATGATATATGCCAGATTACCCAGGCTAGCAATGGTCGGCAGATCAGCTGCAGACTGCTGGCTCACTGCCGTTTCAATAGCCGGAGAGTCTACTGCAATGACTTTGGCACCGTGACGTTCACATTTAGAGGCGTGGAAGAGTGTACCAGCACAGTTTCGCTTTGATTTCATCCAGGATCAGTTGTACACGGCCTGGTGGGTAGGAAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGATGCAAATACGAAAAGGGCTA 400
9-b GGAAGGTTTTTTACTGATTTCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTAAGCAGGCTCGGGGTGCCAGACAGGTAAGAAAGACCGTGGGTAGAGGCCATACGATAGAATTCGTCATCCGCCACAAACTCCGCCGGCGGGACAATCAGTTTGTGGCCTGAGAGTACAGACAGAACCAGCTGTTCTACGGAGAAGTCGAAAACGTAGTTGCTCAGGAACAGAACACCGTGATGTTTGGTACAATCACGACCGAAGTAACGCTCACGCAGGGCGTCGCGCAGCAGCAGAACGGCTTTTTGCTCTACCAGAACGCCTTTCGGTTTGCCAGAAGTGCCGCTAGTAAAGATGATAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGCGAACAACAAGTGCAATGAT 402
9-c TTATTCGTGGATTGGTGTTCCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTTTCGACTTCTCCGTAGAACAGCTGGTTCTGTCTGTACTCTCAGGCCACAAACTGATTGTCCCGCCGGCGGAGTTTGTGGCGGATGACGAATTCTATCGTATGGCCTCTACCCACGGTCTTTCTTACCTGTCTGGCACCCCGAGCCTGCTTCAAAAAATCGATCTGGCACGTCTGGATCACCTGCAGGTTGTAACCGCGGCGGGTGAGGAACTCCACGCGACCCAGTACGAAAAAATGCGTCGTCGTTTTAACGGTCCAATCTACAACGCTTATGGTGTTACCGAGACAACGGTGTACAACAGAAGAACCACACATGGCACCTTTGCTGCTGTAATCAGAACCTAGAAAAAT 402
PCR 회수 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
9 9-d CCTCCTTTATTTCTCGTGCCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCGTGACAGACGAGCGAAACGACCCATCGCGATGTCTTCTTCCTTGCAGAACGGGTTAGGGATGAAACGCTGATCGGTCAGCAACGGCTGGTTCAGGTAACCACGGGTTACGCTATCGCCGGCCAGATACAGTTCACCCACAGCGTCGAATGGAACCGGCTGCAGCGCCGCGTTCAGAACGTACGCACGGGTGCCCGGCAGGACTTCGCGTAATGCGTTTTCGAAGATGGAGTTGGTGGTGAATTCAGCGATGATGTTGTACACCGTTGTCTCGGTAACACCATAAGCGTTGTAGATTGGACCGTCACTGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGAGACTTAGTGGTGAAATCA 399
9-e TGTAAACCTATATTCATCTCCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCCTCTTCTTATAGGTCGGCAGACGCGCTTTCATGAAGGTGAGGATATCAGCTTCTGAAACTGTTTCGTTATCAGTGGTATAATAACCGACTAAGGAATGTGCAGTACGGCTATACGTGTCGTTGTTTTCATATTTAGCCACAACCGCACCTTCGCGTACGCCCGGGGAGGAGGTCAGCACGTTCTGTACTTCGCTAATTTCAATGCGGTAACCACGCATTTTAATCTGCAGGTCGCCACGGCCCAGGTATTCCAGCTGCGGCTGCTGCTGGCGGTTGAAGCGAGAGCGAACCAGGTCGCCGGTTTTGTAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGGGTAGCACATGATAACTTTA 401
9-f GTTCATTGCATAATGCTTCTCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGAGTGTTCCATTCGACGCTGTGGGTGAACTGTATCTGGCCGGCGATAGCGTAACCCGTGGTTACCTGAACCAGCCGTTGCTGACCGATCAGCGTTTCATAACTAACCCGTTCTGCAAGGAAGAAGACATCGCGATGGGTCGTTTCGCTCGTCTGTACAAAACCGGCGACCTGGTTCGCTCTCGCTTCAACCGCCAGCAGCAGCCGCAGCTGGAATACCTGGGCCGTGGCGACCTGCAGATTAAAATGCGTGGTTACCGCATTGAAATTAGCGAAGTACAGAACGTGCTGACCTCCTCCCGGGCGCATGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGCTGGATGTAAAGGGNTTTAA 399
9-g AATAGGTACCATTTTCGTTCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTGTCATCGTCAATACCGCAGCGTTCCATACCCAGCGCGCTTTCCCATAAACGGCACATTTTCGCTTCGATAATGTTGCGCGGCGGGGAATATGAGGATTGCGCACTGTCGTTGATAATTTCAGGCAGACGACGAACGTCCAGTTTACCGTTAATAGTGACTGGCAGAGCACCTTCCAGGCAGCACAGGTGAGAAGGCACCATATAGGTCGGCAGACGCGCTTTCATGAAGGTGAGGATATCAGCTTCTGAAACTGTTTCGTTATCAGTGGTATAATAACCGACTAAGGAATGTGCAGTACGATAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGGAAATCTCTTACATATCAAT 401
10 10-a GATTACTACATTTTTCTCAACAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCAGTGAACGGTAAACTGGACGTTCGTCGTCTGCCTGAAATTATCAACGACAGTGCGAATCCTCATATTCCCCGCCGCGCAACATTATCGAAGCGAAAATGTGCGTTTATGGGAAAGCGCGCTGGGTATGGAACGCTGCGGTATTGACGATGACCTCTTCAAGCTGGGGGGGGATTCTATCACCAGTCTGCACCTCGTCGCACAGATTCACAATCAGGTGGGCTGTAAGATTACCGTGCGCGATATTTTCGAACACCGTACCGCGCGTGCTCTCCACGATCACGTTTTCATGAAGGATAGCGATCATGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGGCCCAACCCCCCCCAAAAG 398
PCR 회수 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
10 10-b CTCATACTGGGATCCGATTTCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTCAAAGGACTGTACAAAGCCAACTTCTTCGCGTTTCAGGCGCATGCGGAAAACGTCGTGGTACTGCTGCAGGTCACGAACGGCCGCACTCAGGGAATCAACGTCCAGTTCCGGGGTACGTACGTAGAACGTGTGGTTCCAGTACATAGGGTGCTGCAGAGCTTTGCTCAAGAACCAATCCTGGATCGGCAGCAGCGGAGCTTCGCCAATGACCGGCCCCTGCTCGGTACGGAACTGGGTGACGTTAGAGCGATCGCTATCCTTCATGAAAACGTGATCGTGGAGAGCACGCGCGGTACGGTAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGGGGGATAGAGGTAACCAATT 402
10-c GCATAAAGCGGGAGGCTTCTCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTTTTCCGCATGCGCCTGAAACGCGAAGAAGTTGGCTTTGTACAGTCCTTTGCCGAAGACTTTTCCCCGGCGCAGCTGCGTGTACTGAACGTGAAGGACGTGGATGGTAGCGCGGCGGTTAACGAAATCCTGGACGGTTGGCAAAGCGGCTTCAACCTGGAAAACGGTCCGATCGGCTCGATCGGTTATCTGCATGGCTATGAAGACCGCTCCGCACGTGTGTGGTTTTCTGTACACCACATGGCCATTGACACTGTTTCCTGGCAGATCCTGGTTCGTGATCTGCAGACTCTGTACCGTAAAGAAGAACCACACATGGCACCTTTGCTGCTGGCACTATTCTATGACACAG 401
10-d TTTTTTGACGGTAATTACAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGTAGTGGAACCAGTGGAGGTCGGCAGCGCGCTGATCGACGATGCAGTTTCCATAACCAGCTTGTTCCAATGGTTACGTTCCGAGTCGCTCGCTTTGTAGTTTTGGATTGCCTCGGCCCATTGGCGAAATGAAGAACCTTTGGAACCCAGGGAACCGTTACGGTACAGAGTCTGCAGATCACGAACCAGGATCTGCCAGGAAACAGTGTCAATGGCCATGTGGTGTACAGAAAACCACACACGTGCGGAGCGGTCTTCATAGCCATGCAGATAACCGATCGAGCCGATCGGACCGTTTTCCAGGTTGCACTGCGAACACATAACCCTGCGACCTGCTGCAGACTGAAATCGGTCGAAA 399
10-e TTTTACATCATTCGCGTATTCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTCATCCAGGGTCTGGTCAACTTCTTCGCGGCCGTGACCCTCGATTGTAACCATAGACGGGCCAGTCGGCGCGATGTGTTGCAAAGCCAGGCCAACAGAAGTCAGCAGAGAATCGTATACGCTTACATCCTGACGATCGATGCCACCCTGGATCAGAGAAGCAGTTTTTTCAGGAGACAGAGAACGGGAGAGACGTACGCGAGAACCAGTGGAGGTCGGCAGCGCGCTGATCGACGATGCAGTTTCCATAACCAGCTTGTTCCAATGGTTACGTTCCGAGTCGCTCGCTTTGTAGTTTTGGAAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGTAGAAAACCCACAGGAAG 400
10-f TCAATACATTCTACTTTCAGCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCCTTCTCAGCTGGCCCAGGTAGTTAACAGTAACCTGCGGCAGAGGGTGCTGGGTGTAACCGTACAGAGTACCATAACCAACACCGCGAGCCGGAACTTGGCGGAAGCGTTCACTTACAGCAACAACACCCTGCACGATGTTTTCCGTCGACAGACGCGGGATTTCGAACGGATACATGGTAGTGAACCAGCCCATCGTACGAGAAACATCCAGGGTCTGGTCAACTTCTTCGCGGCCGTGACCCTCGATTGTAACCATAGACGGGCCAGTCGGCGCGATGTGTTGCAAAGCCAGGCCAACAGAAGTAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGCCGAAAGCGTAGCTCAAAAA 399
PCR 회수 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
11 11-a GTCAGTAGTATACCGTTCGTCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTACACCCAGCACCCTCTGCCGCAGGTTACTGTTAACTACCTGGGCCAGCTGGCTCGTAAACAGAGCAAGCCGAAAGAATGGGTTCTGGCAGTTGGTGATAACGAGTTCGAGTACGGTCTGATGACCTCCCCGGAGGATAAGGACCGTTCGAGCTCCGCAGTGGATGTTACGGCCGTCTGCATCGACGGGACGATGATCATCGATGTGGACTCGGCTTGGTCTTTGGAAGAATCTGAACAGTTCATCTCGTCAATTGAAGAAGGTCTGAACAAAATCCTGGACGGTCGTGCATCCCAGCAGAAGAAAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGAGGAAGGCAATCTTAGATCG 401
11-b CGACGGTATTATGGCCCATCCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCACTCTTCTGTATGGGGTGTAGGTCTCTGCTGGCTGCGGCACATCCGGAAAGCGGCTAGTCTGCTGGGATGCACGACCGTCCAGGATTTTGTTCAGACCTTCTTCAATTGACGAGATGAACTGTTCAGATTCTTCCAAAGACCAAGCCGAGTCCACATCGATGATCATCGTCCCGTCGATGCAGACGGCCGTAACATCCACTGCGGAGCTCGAACGGTCCTTATCCTCCGGGGAGGTCATCAGACCGTACTCGAACTCGTTATCACCAACTGCCAGAACCCATTCTTTCGGCTTGCTCTGTTTACGAGCAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGTTACAAAAACGTTCTGCAGAA 403
11-c ATCTTTTATGTACTTTGTGACAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTGATGTGGACTCGGCTTGGTCTTTGGAAGAATCTGAACAGTTCATCTCGTCAATTGAAGAAGGTCTGAACAAAATCCTGGACGGTCGTGCATCCCAGCAGACTAGCCGCTTTCCGGATGTGCCGCAGCCAGCAGAGACCTACACCCCATACTTCGAATATCTGGAACCGCCGCGCCAGGGCCCGACCCTGTTTCTGCTGCCACCGGGTGAAGGTGGTGCGGAATCTTACTTCAACAACATCGTCAAACGCTTGCGTCAAACTAACATGGTTGTCTTTAACAACTACTACCTGCACTCCAAAAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGACACTAAAAGTGTTGAAAAA 402
11-d TCTTGTTTATTTCTTTGGGTCAGCAGAGGGCATCTTAGCGGTCGCTCTTCTTTTTCGTCGCTCGCAACCAGACGACGGGACATCTCCATCGCCAGAATGCCCCCGAAGCTCCAGCCGATGAAGTGGTATGGACCGTGCGGTTGGATGCCGCGTACCTGGTCCAGATACATTTCAGCCAGTTCCTCGAAGGTGCGCAGACGTTTGGAGTGCAGGTAGTAGTTGTTAAAGACAACCATGTTAGTTTGACGCAAGCGTTTGACGATGTTGTTGAAGTAAGATTCCGCACCACCTTCACCCGGTGGCAGCAGAAACAGGGTCGGGCCCTGGCGCGGCGGTTCCAGATATTCGAAAGAAGAGCCACACATGGCACCTTTGCTGCTGAGTTGCACAGGAAATTA 398
11-e ATGTATCCTCGCTCTTTAACCAGCATCACCGACTAATGCAGGCTGGCAGTGGCATTCTGGCGATGGAGATGTCCCGTCGTCTGGTTGCGAGCGACGAAAAATTGGTTTCTGGGTATTATCGACACCTATTTCAACGTACGTGGTGCCACTCGCACCATTGGCCTTGGTGATACTGAAATCCTGGATCCGATCCACCACATCTATAACCCGGACCCGGCAAACTTTCAGCGTCTGCCGTCTGCCACCGACCGTATCGTCCTGTTTAAGGCCATGCGTCCGAATAATAAATATGAATCAGAAACCAGCGTCGCCTGTATGAGTACTACGACACTGCGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGAGTAATAATCAAACCGGGTG 379
11-f CTAACGCATTGTCAGGTTTCCAGCAGCACCGACTAATGCAGGCTGGCAGTGCGTATCGTCCTGTTTAAGGCCATGCGTCCGAATAATAAATATGAATCAGAAAACCAGCGTCGCCCTACGACGCGTTAGATTCCACGGACTGGACCGCATGTTACCAGGCGATCCCTACCTCCTCATGGTCGCGCCTGCGCACGATCCACACCTTCCCGGGTTCGGAAATCCACAACCGCTGGTCCCGTTGCGTTCGTCTGAGCCGTAACACCAGCCTTGCCATCGACCCGTCTCTGGCAGCTCAGTACATCGGTCGTTGGAAGTAAGCAGAGTAAAGACCGTGCACTTATCACTGGAACACATGACCCTGCGACCTGCTGTTCTACACTGGTATCCGGAGT 392
상기 소망하는 PCR 증폭 산물을 아가로오스 젤에 전기영동하여 소망하는 크기의 밴드를 절단하여 젤 정제 키트(AccuPrepTM gel purification kit; 바이오니아, 한국)로 DNA를 정제하였다. 약 1,000 bp의 DNA 서열을 구축하기 위해, 젤-정제된 3-8개의 유전자 단편들을 풀링(pool)하였다. 각 풀에서 제한효소 절단을 다음과 같이 실시하였다: EarI 또는 EcoP15I을 이용하는 경우, 2 ㎕의 EarI 또는 EcoP15I, 5 ㎕의 NEB 완충액, 0.5 ㎕의 100× BSA, 10 ㎕의 물 및 30 ㎕의 정제된(및 풀링된) DNA 단편을 혼합하여 37℃에서 3시간 동안 절단(EcoP15I의 경우, 10 ATP가 추가적으로 첨가되었음); 및 BtsI을 이용하는 경우, 2 ㎕의 BtsI, 5 의 NEB 완충액, 0.5 ㎕의 100× BSA, 10 ㎕의 물 및 30 ㎕의 PCR 산물을 혼합하여 55 ℃에서 3시간 동안 절단. 이후, 절단 산물은 1.5% 아가로오스 젤에 전기영동하여 예상된 밴드(daughter 단편, 300 bp; 도 8h)를 얻었다. 절단 후, 예상되는 DNA 단편 서열들(제IIS형 제한효소 절단 또는 오류-수정(error-correction) PCR로 생성된 결과물)은 표 20 내지 표 28에 기재되어 있다.
제IIS형 제한효소 절단 또는 네스티드 PCR 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
1 1-a ATGACCCAATTGAAGCCGCCTAACGGGACCACTCCGATCGGCTTCAGCGCCACTACTAGCCTGAACGCTAGCGGCTCTTCCTCGGTTAAGAATGGTACCATCAAGCCTTCGAATGGTATCTTCAAACCTTCTACTCGTGACACCATGGACCCGTGCTCGGGCAACGCCGCTGACGGCTCCATTCGCGTACGTTTTCGCGGTGGCATCGAACGTTGGAAAGAGTGTGTAAACCAAGTGCCGGAGCGTTGCGACCTGTCTGGTCTGACCACGGACAGCACCCGCTACCAGCTGGCTTCGA 298
1-b CTGTCTGGTCTGACCACGGACAGCACCCGCTACCAGCTGGCTTCGACCGGCTTCGGCGACGCGAGCGCGGCTTACCAGGAACGTCTGATGACTGTGCCGGTAGATGTTCATGCTGCGCTCCAGGAGCTGTGCCTGGAACGCCGCGTCTCTGTGGGTTCTGTGATCAACTTCAGCGTTCACCAGATGCTGAAGGGTTTTGGCAACGGTACTCACACTATCACCGCGAGCCTGCACCGCGAACAGAATCTGCAGAACTCCTCTCCGTCTTGGGTCGTTTCCCCTACTATCGTGACCCATG 298
1-c AACGGTACTCACACTATCACCGCGAGCCTGCACCGCGAACAGAATCTGCAGAACTCCTCTCCGTCTTGGGTCGTTTCCCCTACTATCGTGACCCATGAAAACCGCGATGGCTGGTCAGTGGCGCAGGCAGTGGAGTCTATCGAGGCTGGTCGTGGCTCCGAAAAGGAATCTGTGACCGCGATTGATTCCGGCTCCTCCCTGGTCAAAATGGGTCTGTTCGATCTGCTGGTTTCCTTCGTCGATGCGGATGACGCGCGTATCCCTTGCTTCGACTTTCCGCTGGCTGTTATTGTGCGC 297
1-d TGACGCGCGTATCCCTTGCTTCGACTTTCCGCTGGCTGTTATTGTGCGCGAGTGCGATGCAAACCTGTCTCTCACCCTTCGCTTCTCGGACTGCCTGTTCAACGAGGAAACCATTTGTAATTTCACGGATGCCCTCAATATCCTGTTGGCTGAGGCAGTTATCGGT 166
1-e
 ACGAGGAAACCATTTGTAATTTCACGGATGCCCTCAATATCCTGTTGGCTGAGGCAGTTATCGGTCGTGTAACTCCGGTAGCCGATATCGAGCTGCTGTCTGCAGAGCAGAAACAACAGCTGGAGGAATGGAACAACACCGATGGTGAATATCCGTCTAGCAAGCGTCTGCACCACCT 178
제IIS형 제한효소 절단 또는 네스티드 PCR 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
2 2-a GTGAATATCCGTCTAGCAAGCGTCTGCACCACCTGATTGAAGAGGTGGTGGAACGTCACGAAGACAAAATCGCTGTGGTGTGCGACGAACGTGAACTG 98
2-b TCACGAAGACAAAATCGCTGTGGTGTGCGACGAACGTGAACTGACTTACGGTGAACTCAATGCCCAGGGCAACTCCCTGGCGCGTTACCTGCGCAGCATTGGTATTCTGCCTGAACAGCTGGTTGCGCTGTTTCTGGACAAATCCGAAAAATTGATCGTAACCATCCTGGGCGTCTGGAAATCCGGTGCTGCTTACGTGCCAATTGACCCGACCTACCCTGACGAACGTGTTCGTTTCGTTCTGGACGACACGAAAGCCCGTGCGATTATCGCTTCCAATCAGCATGTTGAACGCCT 98
2-c TGATCGTAACCATCCTGGGCGTCTGGAAATCCGGTGCTGCTTACGTGCCAATTGACCCGACCTACCCTGACGAACGTGTTCGTTTCGTTCTGGACGACACGAAAGCCCGTGCGATTATCGCTTCCAATCAGCATGTTGAACGCCTCCAGCGTGAAGTAATCGGTGATCGCAACCTGTGCATCATCCGTCTCGAACCACTGCTGGCGAGCCTTGCGCAGGATTCTTCTAAATTCCCTGCCCACAACCTGGATGATTTGCCGCTGACCAGCCAGCAGCTGGCGTACGTTACTTATACCA 297
2-d AGCGTGAAGTAATCGGTGATCGCAACCTGTGCATCATCCGTCTCGAACCACTGCTGGCGAGCCTTGCGCAGGATTCTTCTAAATTCCCTGCCCACAACCTGGATGATTTGCCGCTGACCAGCCAGCAGCTGGCGTACGTTACTTATACCAGCGGTACCACCGGCTTTCCGAAAGGCATTTTCAAACAGCACACTAACGTTGTTAACTCCATCACAGACCTGTCCGCTCGTTACGGTGTTGCAGGTCAACACCATGAAGCTATCCTGCTCTTCAGTGCTTGCGTTTTCGAACCGTTCG 297
2-e
 GTTAACTCCATCACAGACCTGTCCGCTCGTTACGGTGTTGCAGGTCAACACCATGAAGCTATCCTGCTCTTCAGTGCTTGCGTTTTCGAACCGTTCGTTCGTCAGACTCTGATGGCCCTGGTGAACGGTCACCTGCTCGCCGTGATTAACGATGTAGAAAAATATGACGCTGACACCCTCCTCCCATTTATCCGCCGTCACTCTATCACCTATCTGAACGGTACTGCGTCGGTTCTCCAAGAGTATGACTTCTCTGACTGTCCGAGCCTGAACCGTATCAT 281
2-f CTATCACCTATCTGAACGGTACTGCGTCGGTTCTCCAAGAGTATGACTTCTCTGACTGTCCGAGCCTGAACCGTATCATCCTGGTGGGCGAGAACCTGACCGAAGCACGTTACCTGGCACTGCGTCAGCGTTTCAAAAATCGTATTCTGAACGAGTACGGTTTCACCGAGTCTGCGTTCGTGACTGCGCTGAAAATTTTCGATCCGGAAAGCACCCGCAAAGATACCTCCCTGGGGCGTCCGGTGCGCAATGTTAAATGCTATATCTTGAACCCTAGCCTGAAACGCGTGCCAAT 295
2-g ACGAGTACGGTTTCACCGAGTCTGCGTTCGTGACTGCGCTGAAAATTTTCGATCCGGAAAGCACCCGCAAAGATACCTCCCTGGGGCGTCCGGTGCGCAATGTTAAATGCTATATCTTGAACCCTAGCCTGAAACGCGTGCCAATTGGTGCTACAGGTGAGCTGCATATTGGCGGCCTGGGTATCTCCAAGGGTTACTTGAATCGTCCGGAACTGACGCCGCACCGCTTCATCCCGAACCCGTTTCAGACCGATTGCGAAAAACAGCTGGGTATCAACTCTCTGATGTACAAAACCG 297
제IIS형 제한효소 절단 또는 네스티드 PCR 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
3 3-a ATCGTCCGGAACTGACGCCGCACCGCTTCATCCCGAACCCGTTTCAGACCGATTGCGAAAAACAGCTGGGTATCAACTCTCTGATGTACAAAACCGGTGATCTGGCTCGCTGGCTCCCGAACGGTGAAGTTGAATACCTGGGCCGTGCGGATTTCCAGATCAAACTGCGCGGTATTCGTATTGAGCCGGGCGAAATCGAGACTATGCTGGCGATGTATCCGCGCGTTCGTACCTCCCTGGTGGTTTCCAAGAAATTACGTAACGGTCCTGAAGAAACAACGAACGAACACCTGGTAG 297
3-b CGGATTTCCAGATCAAACTGCGCGGTATTCGTATTGAGCCGGGCGAAATCGAGACTATGCTGGCGATGTATCCGCGCGTTCGTACCTCCCTGGTGGTTTCCAAGAAATTACGTAACGGTCCTGAAGAAACAACGAACGAACACCTGGTAGGCTACTACGTATGCGACTCCGCATCTGTTTCCGAAGCGGATCTGCTGTCCTTCCTGGAGAAGAAGCTGCCGCGTTATATGATTCCGACTCGTCTGGTACAGCTGAGCCAGATCCCGGTTAACGTCAACGGTAAAGCCGATCTGCGTG 297
3-c TTCCTGGAGAAGAAGCTGCCGCGTTATATGATTCCGACTCGTCTGGTACAGCTGAGCCAGATCCCGGTTAACGTCAACGGTAAAGCCGATCTGCGTGCTCTGCCGGCGGTTGATATCTCCAACAGCACCGAAGTTCGTTCTGATCTGCGTGGTGATACCGAAATTGCCCTCGGCGAAATCTGGGCGGACGTGCTGGGCGCGCGTCAGCGTTCGGTTAGCCGTAACGATAACTTTTTCCGCCTCGGTGGCCACTCTATCACCTGCATCCAGCTGATTGCGCGTATCCGTCAGCGTCAGC 298
4 4-a ACCTGCATCCAGCTGATTGCGCGTATCCGTCAGCGTCAGCGTTTGTCTGTGTCTATCTCTGTGGAAGACGTGTTTGCTACACGCACTCTTGAGCGTATGGCCGACCTGTTGCAAAACAAACAGCAAGAGAAATGCGACAAACCACACGAAGCACCGACTGAACTGCTTGAAGAAAACGCTGCGACTGATAACATCTACCTGGCGAACAGCCTGCAGCAAGGTTTCGTCTACCATTACCTGAAAAGCATGGAACAAAGTGATGCTTATGTAATGCAGAGCGTTCTGCGTTACAACACCACCCTTTCCC 297
4-b CATGGAACAAAGTGATGCTTATGTAATGCAGAGCGTTCTGCGTTACAACACCACCCTTTCCCCGGATCTGTTCCAGCGTGCCTGGAAACACGCGCAGCAAAGCTTCCCGGCTCTGCGTCTGCGCTTCTCTTGGGAAAAAGAAGTCTTCCAGCTGCTGGA 150
4-c AAAGCTTCCCGGCTCTGCGTCTGCGCTTCTCTTGGGAAAAAGAAGTCTTCCAGCTGCTGGATCAGGACCCGCCTCTGGACTGGCGTTTCCTCTACTTCACTGATGTGGCGGCTGGTGCAGTAGAAGACCGTAAACTGGAAGATTTACGCC 188
4-d CTGGTGCAGTAGAAGACCGTAAACTGGAAGATTTACGCCGCCAGGACCTCACCGAGCGTTTTAAACTGGATGTGGGCCGTCTGTTTCGCGTTTACCTGATCAAACACAGCGAAAACCGTTTCACTTGTCTGTTCTCTTGTCACCACGCTATCCTGGACGGCTGGTCCTTACCGCTTCTGTTCGAAAAA 300
4-e CGTTTACCTGATCAAACACAGCGAAAACCGTTTCACTTGTCTGTTCTCTTGTCACCACGCTATCCTGGACGGCTGGTCCTTACCGCTTCTGTTCGAAAAAGTACACGAAACATACCTGCAACTGCTGCACGGCGATAACCTGACCTCCTCTATGGATGATCCATACACCCGTACCCAACGCTACCTGCATGCGCACCGCGAAGATCACCTCGACTTTTGGGCTGGCGTGGTGCAGAAAATCAACGAACGTTGCGATATGAATGCTCTGTTAAACGAACGCAGCCGCTATAAAGTGCAGCT 297
제IIS형 제한효소 절단 또는 네스티드 PCR 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
4 4-f CGTCTGGTACGCTGCTCTACCCGTCTGTCCTGCCGGCAAACCCAGACAGCAAATGGTCTGTGTCAAACCCGTCGCCGCTGTCTCGTAGCACCGACCTGGCATACATCATCTACACCTCTGGCACCACCGGCCGCCCGAAAGGCGTGACTGTGGAGCATCACGGTGTGGTGAACCTGCAGGTATCCCTGAGCAAAGTTTTTGGTCTGCGTGACACCGACGACGAAGTCATCCTGTCTTTTTCTAACTACGTTTTCGATCACTTCGTAGAACAGATGACTGATGCTATCCTGAACGGGC 240
5 5-a ACGGTGGCGGTACTCACACTATCACTGGCACCACTATTTCTGGTCGCAACCTCCCGATCCTGGGTATCGAGCGTGCGGTAGGCCCGTACATTAACACCCTGCCGTTAGTGTTGGACCATTCTACTTTTAAAGACAAGACGATCATGGAAGCTATTGAAGACGTCCAAGCGAAGGTGAATGTTATGAACTCCCGTGGTAATGTAGAACTGGGTCGCCTGCACAAAACCGACCTGAAACATGGCCTGTTCGATTCTCTGTTTGTGCTGGAAAACTATCCAAACC 282
5-b GCTATTGAAGACGTCCAAGCGAAGGTGAATGTTATGAACTCCCGTGGTAATGTAGAACTGGGTCGCCTGCACAAAACCGACCTGAAACATGGCCTGTTCGATTCTCTGTTTGTGCTGGAAAACTATCCAAACCTGGATAAATCCCGTACTCTGGAGCACCAAACTGAACTGGGTTACTCCATCGAGGGTGGTACCGAAAAACTGAACTATCCGCTGGCGGTGATTGCTCGTGAGGTTGAGACCACTGGCGGCTTTACTGTTAGCATCTGCTATGCGAGCGAACTGTTTGAAGAGGTGA 298
5-c AACTGAACTATCCGCTGGCGGTGATTGCTCGTGAGGTTGAGACCACTGGCGGCTTTACTGTTAGCATCTGCTATGCGAGCGAACTGTTTGAAGAGGTGATGATCAGCGAGCTTCTCCATATGGTACAGGATACCCTGATGCAGGTTGCACGCGGGCTCAACGAACCTGTGGGCTCCCTGGAATACCTGTCTTCCATCCAGTTAGAGCAGCTGGCAGCGTGGAACGCCACCGAAGCGGAGTTCCCGGACACGACCCTGCATGAAATGTTCGAGAACGAAGCATCTCAAAAGCCGGATAA 298
5-d TTAGAGCAGCTGGCAGCGTGGAACGCCACCGAAGCGGAGTTCCCGGACACGACCCTGCATGAAATGTTCGAGAACGAAGCATCTCAAAAGCCGGATAAAATTGCAGTCGTGTACGAAGAAACCTCTCTGACCTATCGCGAGCTGAACGAACGTGCCAATCGCATGGCGCACCAGCTGCGTTCCGACGTTTCTCCGAACCCGAACGAAGTGATCGCGCTGGTTATGGACAAGAGTGAACACATGATCGTAAATATCTTGGCTGTGTGGAAATCTGGTGGCGCATACGTGCCGATCGATC 298
5-e GAGTGAACACATGATCGTAAATATCTTGGCTGTGTGGAAATCTGGTGGCGCATACGTGCCGATCGATCCGGGCTACCCGAATGACCGTATTCAGTATATCCTCGAGGACACTCAGGCGTTGGCTGTTATCGCAGATTCTTGTTACCTGCCTCGTATCAAAGGTATGGCCGCGTCTGGTACGCTGCTCTACCCGTCTGTCCTGCCGGCAAACCCAGACAGCAAATGGTCTGTGTCAAACCCGTCGCCGCTGTCTCGTAGCACCGACCTG 268
5-f CGTCTGGTACGCTGCTCTACCCGTCTGTCCTGCCGGCAAACCCAGACAGCAAATGGTCTGTGTCAAACCCGTCGCCGCTGTCTCGTAGCACCGACCTGGCATACATCATCTACACCTCTGGCACCACCGGCCGCCCGAAAGGCGTGACTGTGGAGCATCACGGTGTGGTGAACCTGCAGGTATCCCTGAGCAAAGTTTTTGGTCTGCGTGACACCGACGACGAAGTCATCCTGTCTTTTTCTAACTACGTTTTCGATCACTTCGTAGAACAGATGACTGATGCTATCCTGAACGGGC 297
제IIS형 제한효소 절단 또는 네스티드 PCR 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
6 6-a CTAACTACGTTTTCGATCACTTCGTAGAACAGATGACTGATGCTATCCTGAACGGGCAGACGCTGCTGGTTCTGAACGATGGTATGCGTGGTGACAAAGAACGCCTGTACCGCTACATCGAAAAGAACCGTGTAACTTATCTGTCTGGTACTCCATCTGTGGTGTCTATGTATGAGTTCAGCCGTTTCAAAGACCACCTGCGCCGCGTCGATTGCGTCGGTGAAGCTTTCAGCGAGCCGGTCTTCGACAAAATCCGTGAA 260
6-b ACCTTCCACGGTTTGGTTATCAATGGTTATGGCCCAACTGAAGTTAGCATCACTACCCATAAGCGTTTATACCCTTTCCCAGAGCGCCGCATGGATAAGTCGATCGGCCAGCAGGTCCACAACTCTACTAGCTACGTACTGAATGAAGATATGAAGCGTACCCCGATCGGTGCTGTGGGTGAGCTGTACCTG 192
6-c TGAATGAAGATATGAAGCGTACCCCGATCGGTGCTGTGGGTGAGCTGTACCTGGGCGGTGAAGGTGTTGTCCGCGGTTATCATAATCGTGCGGATGTTACCGCCGAGCGCTTCATCCCGAACCCGTTCCAGTCTGAGGAAGATAAACGTGAAGGCCGTAACAGTCGCCTGTACAAGACGGGTGATCTGGTTCGCTGGATCCCGGGTAGCTCCGGCGAAGTCGAATACCTGGGTCGCAATGACTTCCAGGTTAAGATTCG 259
6-d CGAAGTCGAATACCTGGGTCGCAATGACTTCCAGGTTAAGATTCGCGGCCTCCGTATCGAGCTGGGTGAAATCGAAGCGATCCTGAGCAGCTACCACGGCATTAAACAGAGCGTAGTGATCGCAAAAGACTGCCGTGAGGGGGCACAGAAATTCCTGGTCGGCTATTACGTTGCAGACGCTGCCCTGCCGTCCGCAGCGATCCGTCGTTTCATGCAGTCGCGCCTCCCGGGTTACATGGTTCCGTCCCGTCTGATCCTGGTTTCTAAATTCCCTGTTACTCCGTCCGGGAAGCTGGA 297
6-e CGTCTGATCCTGGTTTCTAAATTCCCTGTTACTCCGTCCGGGAAGCTGGACACCAAAGCACTGCCGCCGGCGGAGGAAGAAAGCGAAATCGACGTTGTTCCACCGCGCTCCGAAATTGAGCGTTCTCTCTGCGACATCTGGGCTGAACTGCTGGAAATGCACCCGGAAGAAATCGGCATTTACTCTGACTTCTTCTCCTTGGGCGGCGACAGCCTGAAATCTACTAAGTTATCCTTCATGATCCATGAGTCCTTTAACCGTGCTGTGAGCGTTAGCGCGTTATTCTGCCATCGCACA 297
7

 7-a TCCTTCATGATCCATGAGTCCTTTAACCGTGCTGTGAGCGTTAGCGCGTTATTCTGCCATCGCACAGTTGAAGCTCAAACTCACCTGATCTTGAACGACGCAGCAGATGTACACGAAATTACCCCGATCGATTGCAACGACACCCAGATG 150
7-b GAAGCTCAAACTCACCTGATCTTGAACGACGCAGCAGATGTACACGAAATTACCCCGATCGATTGCAACGACACCCAGATGATCCCGGTTTCCCGTGCACAGGAACGTCTGCTGTTCATTCATGAATTCGAAAACGGTTCTAACGCTTACAACATTGACGCGGCTTTCGAACTGCCAGGTTCTGTGGACGCGAGCCTGCTGGAACAGGCCCTTCGTGGCAACCTGGCACGTCACGAAGCACTGCGCACCCTGCTGGTTAAAGATCACGCCACTGGTATTTACCTGCAGAAAGTACTG 297
7-c AGGAACGTCTGCTGTTCATTCATGAATTCGAAAACGGTTCTAACGCTTACAACATTGACGCGGCTTTCGAACTGCCAGGTTCTGTGGACGCGAGCCTGCTGGAACAGGCCCTTCGTGGCAACCTGGCACGTCACGAAGCACTGCGCACCCTGCTGGTTAAAGATCACGCCACTGGTATTTACCTGCAGAAAGTACTGAGTCCGGACGAAGCGCAAGGTATGTTTTCTGTTAATGTAGATACTGCTAAACAGGTTGAACGTCTGGATCAGGAAATTGCTTCTCTGTCTCAGCACGTCT 297
제IIS형 제한효소 절단 또는 네스티드 PCR 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
7 7-d TTGAACGTCTGGATCAGGAAATTGCTTCTCTGTCTCAGCACGTCTTCCGCCTGGACGACGAACTGCCGTGGGAGGCGCGCATCCTGAAACTGGAATCTGGCGGTCTGTACCTGATCTTGGCCTTCCACCACACCTGCTTCGATGCATGGAGCCTGAAAGTTTTCGAACAGGAGCTGCGCGCGCTGTACGCAGCGCTTCAGAAAACGAAATCTGCAGCGAACTTACCGGCATTAAAAGCACAGTATAAGGAATACGCTCTGTACCACCGCCGCCAGCTTAGCGGCGACCGCATGCGTAA 298
7-e AATACGCTCTGTACCACCGCCGCCAGCTTAGCGGCGACCGCATGCGTAACCTGTCCGATTTCTGGTTACGTAAACTGATCGGTCTGGAACCACTGCAGCTGATCACCGATCGTCCGCGTCCGGTTCAGTTCAAATACGACGGTGACGATCTGAGCATCGAACTGTCCAAGAAAGAGACCGAAAACCTGCGCGGCGTTGCAAAACGTTGTAAGTCTTCCTTATATGTTGTACTGGTATCTGTTTACTGTGTCATGCTGGCAAGCTACGCCAACCAGAGCGATGTTAGCGTGGGCAT 295
7-f TGATCACCGATCGTCCGCGTCCGGTTCAGTTCAAATACGACGGTGACGATCTGAGCATCGAACTGTCCAAGAAAGAGACCGAAAACCTGCGCGGCGTTGCAAAACGTTGTAAGTCTTCCTTATATGTTGTACTGGTATCTGTTTACTGTGTCATGCTGGCAAGCTACGCCAACCAGAGCGATGTTAGCGTGGGCATCCCAGTATCACACCGTACGCACCCGCAGTTCCAGTCTGTTATCGGCTTTTTCGTTAACCTGGTCGTTCTGCGTGTAGATATCAGCCAGTCCGCTATTTGCG 297
8 8-a GGTCGTTCTGCGTGTAGATATCAGCCAGTCCGCTATTTGCGGTTTAATCCGTCGCGTCATGAAAGAACTGGTTGACGCGCAGCTGCACCAGGATATGCCGTTCCAGGAAGTTACGAAACTGCTGCAG 127
8-b GCCGTTCCAGGAAGTTACGAAACTGCTGCAGGTGGATAACGATCCTAGCCGTCACCCGTTGGTTCAGAACGTATTTAACTTTGAGTCTCGCGCGAACGGTGAACACGATGCCCGCTCTGAAGACGAGGGCTCTCTTGCATTCAATCAGTACCGTCCGGTTCAGCCGGTTGACAGCGTGGCCAAATTCGATCTGAACGCCACCGTCACCGAACTGGAATCCGGTCTGCGTGTTAATTTCAACTACGCGACCAGCTTATTCAATAAATCCACCATCCAGGGCTTCCTGCACACATATGAA 298
8-c CCAGCTTATTCAATAAATCCACCATCCAGGGCTTCCTGCACACATATGAATACCTTCTGCGTCAGCTGTCCGAACTGAGCGCTGAAGGCATCAACGAAGATACCCAGCTGTCACTGGTTCGCCCGACTGAGAACGGGGATCTGCACCTGCCACTGGCCCAGTCTCCGCTCGCGACCACTGCAGAAGAACAGAAAGTTGCTTCCCTGAACCAGGCTTTCGAACGTGAAGCCTTCCTGGCGGCGGAAAAAATCGCCGTTGTTCAAGGGGACCGCGCTCTGTCGTATGCCGACCTGAAC 296
8-d GCCGTTGTTCAAGGGGACCGCGCTCTGTCGTATGCCGACCTGAACGGTCAGGCTAATCAACTGGCGCGTTATATCCAGTCCGTCTCCTGCATCGGTGCCGACGACGGCATCGCCCTGATGCTGGAAAAGAGCATCGATACTATCATCTGCATTCTGGCAATCTGGAAAGCAGGCGCCGCGTATGTGCCGCTGGATCCGACCTACCCACCAGGCCGTGTACAACTGATCCTGGAGGAAATCAAAGCGAAAGCTGTGCTGGTACACTCTTCCCACGCCTCTAAATGTGAACGTCACGGTGC 299
제IIS형 제한효소 절단 또는 네스티드 PCR 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
9 9-a CCTCTAAATGTGAACGTCACGGTGCCAAAGTCATTGCAGTAGACTCTCCGGCTATTGAAACGGCAGTGAGCCAGCAGTCTGCAGCTGATCTGCCGACCATTGCTAGCCTGGGTAATCTGGCATATATCATCTTTACTAGCGGCACTTCTGGCAAACCGAAAGGCGTTCTGGTAGAGCAAAAAGCCGTTCTGCTGCTGCGCGACGCCCTGCGTGAGCGTTACTTCG 225
9-b ATCTTTACTAGCGGCACTTCTGGCAAACCGAAAGGCGTTCTGGTAGAGCAAAAAGCCGTTCTGCTGCTGCGCGACGCCCTGCGTGAGCGTTACTTCGGTCGTGATTGTACCAAACATCACGGTGTTCTGTTCCTGAGCAACTACGTTTTCGACTTCTCCGTAGAACAGCTGGTTCTGTCTGTACTCTCAGGCCACAAACTGATTGTCCCGCCGGCGGAGTTTGTGGCGGATGACGAATTCTATCGTATGGCCTCTACCCACGGTCTTTCTTACCTGTCTGGCACCCCGAGCCTGCTT 297
9-c TTCGACTTCTCCGTAGAACAGCTGGTTCTGTCTGTACTCTCAGGCCACAAACTGATTGTCCCGCCGGCGGAGTTTGTGGCGGATGACGAATTCTATCGTATGGCCTCTACCCACGGTCTTTCTTACCTGTCTGGCACCCCGAGCCTGCTTCAAAAAATCGATCTGGCACGTCTGGATCACCTGCAGGTTGTAACCGCGGCGGGTGAGGAACTCCACGCGACCCAGTACGAAAAAATGCGTCGTCGTTTTAACGGTCCAATCTACAACGCTTATGGTGTTACCGAGACAACGGTGTAC 297
9-d GGTCCAATCTACAACGCTTATGGTGTTACCGAGACAACGGTGTACAACATCATCGCTGAATTCACCACCAACTCCATCTTCGAAAACGCATTACGCGAAGTCCTGCCGGGCACCCGTGCGTACGTTCTGAACGCGGCGCTGCAGCCGGTTCCATTCGACGCTGTGGGTGAACTGTATCTGGCCGGCGATAGCGTAACCCGTGGTTACCTGAACCAGCCGTTGCTGACCGATCAGCGTTTCATCCCTAACCCGTTCTGCAAGGAAGAAGACATCGCGATGGGTCGTTTCGCTCGTCTGT 298
9-e AAACCGGCGACCTGGTTCGCTCTCGCTTCAACCGCCAGCAGCAGCCGCAGCTGGAATACCTGGGCCGTGGCGACCTGCAGATTAAAATGCGTGGTTACCGCATTGAAATTAGCGAAGTACAGAACGTGCTGACCTCCTCCCCGGGCGTACGCGAAGGTGCGGTTGTGGCTAAATATGAAAACAACGACACGTATAGCCGTACTGCACATTCCTTAGTCGGTTATTATACCACTGATAACGAAACAGTTTCAGAAGCTGATATCCTCACCTTCATGAAAGCGCGTCTGCCGACCTATA 297
9-f CTAACCCGTTCTGCAAGGAAGAAGACATCGCGATGGGTCGTTTCGCTCGTCTGTACAAAACCGGCGACCTGGTTCGCTCTCGCTTCAACCGCCAGCAGCAGCCG 104
9-g TACTGCACATTCCTTAGTCGGTTATTATACCACTGATAACGAAACAGTTTCAGAAGCTGATATCCTCACCTTCATGAAAGCGCGTCTGCCGACCTATATGGTGCCTTCTCACCTGTGCTGCCTGGAAGGTGCTCTGCCAGTCACTATTAACGGTAAACTGGACGTTCGTCGTCTGCCTGAAATTATCAACGACAGTGCGCAATCCTCATATTCCCCGCCGCGCAACATTATCGAAGCGAAAATGTGCCGTTTATGGGAAAGCGCGCTGGGTATGGAACGCTGCGGTATTGACGATGAC 298
제IIS형 제한효소 절단 또는 네스티드 PCR 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
10 10-a CGTTTATGGGAAAGCGCGCTGGGTATGGAACGCTGCGGTATTGACGATGACCTCTTCAAGCTGGGGGGGGATTCTATCACCAGTCTGCACCTCGTCGCACAGATTCACAATCAGGTGGGCTGTAAGATTACCGTGCGCGATATTTTCGAACACCGTACCGCGCGTGCTCTCCACGATCACGTTTTCATGAAGGATAGC 198
10-b GTACCGCGCGTGCTCTCCACGATCACGTTTTCATGAAGGATAGCGATCGCTCTAACGTCACCCAGTTCCGTACCGAGCAGGGGCCGGTCATTGGCGAAGCTCCGCTGCTGCCGATCCAGGATTGGTTCTTGAGCAAAGCTCTGCAGCACCCTATGTACTGGAACCACACGTTCTACGTACGTACCCCGGAACTGGACGTTGATTCCCTGAGTGCGGCCGTTCGTGACCTGCAGCAGTACCACGACGTTTTCCGCATGCGCCTGAAACGCGAAGAAGTTGGCTTTGTACAGTCCTTTG 297
10-c TTTCCGCATGCGCCTGAAACGCGAAGAAGTTGGCTTTGTACAGTCCTTTGCCGAAGACTTTTCCCCGGCGCAGCTGCGTGTACTGAACGTGAAGGACGTGGATGGTAGCGCGGCGGTTAACGAAATCCTGGACGGTTGGCAAAGCGGCTTCAACCTGGAAAACGGTCCGATCGGCTCGATCGGTTATCTGCATGGCTATGAAGACCGCTCCGCACGTGTGTGGTTTTCTGTACACCACATGGCCATTGACACTGTTTCCTGGCAGATCCTGGTTCGTGATCTGCAGACTCTGTACCGT 298
10-d ACCTGGAAAACGGTCCGATCGGCTCGATCGGTTATCTGCATGGCTATGAAGACCGCTCCGCACGTGTGTGGTTTTCTGTACACCACATGGCCATTGACACTGTTTCCTGGCAGATCCTGGTTCGTGATCTGCAGACTCTGTACCGTAACGGTTCCCTGGGTTCCAAAGGTTCTTCATTTCGCCAATGGGCCGAGGCAATCCAAAACTACAAAGCGAGCGACTCGGAACGTAACCATTGGAACAAGCTGGTTATGGAAACTGCATCGTCGATCAGCGCGCTGCCGACCTCCACTGGTTC 298
10-e AAAACTACAAAGCGAGCGACTCGGAACGTAACCATTGGAACAAGCTGGTTATGGAAACTGCATCGTCGATCAGCGCGCTGCCGACCTCCACTGGTTCTCGCGTACGTCTCTCCCGTTCTCTGTCTCCTGAAAAAACTGCTTCTCTGATCCAGGGTGGCATCGATCGTCAGGATGTAAGCGTATACGATTCTCTGCTGACTTCTGTTGGCCTGGCTTTGCAACACATCGCGCCGACTGGCCCGTCTATGGTTACAATCGAGGGTCACGGCCGCGAAGAAGTTGACCAGACCCTGGATG 297
10-f TTCTGTTGGCCTGGCTTTGCAACACATCGCGCCGACTGGCCCGTCTATGGTTACAATCGAGGGTCACGGCCGCGAAGAAGTTGACCAGACCCTGGATGTTTCTCGTACGATGGGCTGGTTCACTACCATGTATCCGTTCGAAATCCCGCGTCTGTCGACGGAAAACATCGTGCAGGGTGTTGTTGCTGTAAGTGAACGCTTCCGCCAAGTTCCGGCTCGCGGTGTTGGTTATGGTACTCTGTACGGTTACACCCAGCACCCTCTGCCGCAGGTTACTGTTAACTACCTGGGCCAGCTG 298
제IIS형 제한효소 절단 또는 네스티드 PCR 후 얻어진 daughter 단편들의 서열.
단편 daughter
단편		 서열(5’-> 3’) 예상 크기(bp)
11 11-a GTACCGCGCGTGCTCTCCACGATCACGTTTTCATGAAGGATAGCGATCGCTCTAACGTCACCCAGTTCCGTACCGAGCAGGGGCCGGTCATTGGCGAAGCTCCGCTGCTGCCGATCCAGGATTGGTTCTTGAGCAAAGCTCTGCAGCACCCTATGTACTGGAACCACACGTTCTACGTACGTACCCCGGAACTGGACGTTGATTCCCTGAGTGCGGCCGTTCGTGACCTGCAGCAGTACCACGACGTTTTCCGCATGCGCCTGAAACGCGAAGAAGTTGGCTTTGTACAGTCCTTTG 297
11-b TTTCCGCATGCGCCTGAAACGCGAAGAAGTTGGCTTTGTACAGTCCTTTGCCGAAGACTTTTCCCCGGCGCAGCTGCGTGTACTGAACGTGAAGGACGTGGATGGTAGCGCGGCGGTTAACGAAATCCTGGACGGTTGGCAAAGCGGCTTCAACCTGGAAAACGGTCCGATCGGCTCGATCGGTTATCTGCATGGCTATGAAGACCGCTCCGCACGTGTGTGGTTTTCTGTACACCACATGGCCATTGACACTGTTTCCTGGCAGATCCTGGTTCGTGATCTGCAGACTCTGTACCGT 297
11-c ACCTGGAAAACGGTCCGATCGGCTCGATCGGTTATCTGCATGGCTATGAAGACCGCTCCGCACGTGTGTGGTTTTCTGTACACCACATGGCCATTGACACTGTTTCCTGGCAGATCCTGGTTCGTGATCTGCAGACTCTGTACCGTAACGGTTCCCTGGGTTCCAAAGGTTCTTCATTTCGCCAATGGGCCGAGGCAATCCAAAACTACAAAGCGAGCGACTCGGAACGTAACCATTGGAACAAGCTGGTTATGGAAACTGCATCGTCGATCAGCGCGCTGCCGACCTCCACTGGTTC 297
11-d AAAACTACAAAGCGAGCGACTCGGAACGTAACCATTGGAACAAGCTGGTTATGGAAACTGCATCGTCGATCAGCGCGCTGCCGACCTCCACTGGTTCTCGCGTACGTCTCTCCCGTTCTCTGTCTCCTGAAAAAACTGCTTCTCTGATCCAGGGTGGCATCGATCGTCAGGATGTAAGCGTATACGATTCTCTGCTGACTTCTGTTGGCCTGGCTTTGCAACACATCGCGCCGACTGGCCCGTCTATGGTTACAATCGAGGGTCACGGCCGCGAAGAAGTTGACCAGACCCTGGATG 296
11-e TTCTGTTGGCCTGGCTTTGCAACACATCGCGCCGACTGGCCCGTCTATGGTTACAATCGAGGGTCACGGCCGCGAAGAAGTTGACCAGACCCTGGATGTTTCTCGTACGATGGGCTGGTTCACTACCATGTATCCGTTCGAAATCCCGCGTCTGTCGACGGAAAACATCGTGCAGGGTGTTGTTGCTGTAAGTGAACGCTTCCGCCAAGTTCCGGCTCGCGGTGTTGGTTATGGTACTCTGTACGGTTACACCCAGCACCCTCTGCCGCAGGTTACTGTTAACTACCTGGGCCAGCTG 282
11-f CTACGACGCGTTAGATTCCACGGACTGGACCGCATGTTACCAGGCGATCCCTACCTCCTCATGGTCGCGCCTGCGCACGATCCACACCTTCCCGGGTTCGGAAATCCACAACCGCTGGTCCCGTTGCGTTCGTCTGAGCCGTAACACCAGCCTTGCCATCGACCCGTCTCTGGCAGCTCAGTACATCGGTCGTTGGAAGTAA 392
플랭킹 서열-제거된 shotgun 어셈블리 산물을 이용한 1 kb DNA 합성을 위한 네스티드 PCR
본 발명자들은 플랭킹 서열-제거된 shotgun 어셈블리 산물들을 어셈블리시켜 11개의 유전자 클러스터 단편들(645-1,325 bp)을 제조하였다. 타겟 DNA 서열들은 표 29 내지 표 31에 기재되어 있다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 11개의 유전자 클러스터 단편들의 서열.
단편 제한효소 또는 네스티드 PCR 후 타겟된 서열
(5’-> 3’)		 예상 크기
(bp)
1 ATGACCCAATTGAAGCCGCCTAACGGGACCACTCCGATCGGCTTCAGCGCCACTACTAGCCTGAACGCTAGCGGCTCTTCCTCGGTTAAGAATGGTACCATCAAGCCTTCGAATGGTATCTTCAAACCTTCTACTCGTGACACCATGGACCCGTGCTCGGGCAACGCCGCTGACGGCTCCATTCGCGTACGTTTTCGCGGTGGCATCGAACGTTGGAAAGAGTGTGTAAACCAAGTGCCGGAGCGTTGCGACCTGTCTGGTCTGACCACGGACAGCACCCGCTACCAGCTGGCTTCGACCGGCTTCGGCGACGCGAGCGCGGCTTACCAGGAACGTCTGATGACTGTGCCGGTAGATGTTCATGCTGCGCTCCAGGAGCTGTGCCTGGAACGCCGCGTCTCTGTGGGTTCTGTGATCAACTTCAGCGTTCACCAGATGCTGAAGGGTTTTGGCAACGGTACTCACACTATCACCGCGAGCCTGCACCGCGAACAGAATCTGCAGAACTCCTCTCCGTCTTGGGTCGTTTCCCCTACTATCGTGACCCATGAAAACCGCGATGGCTGGTCAGTGGCGCAGGCAGTGGAGTCTATCGAGGCTGGTCGTGGCTCCGAAAAGGAATCTGTGACCGCGATTGATTCCGGCTCCTCCCTGGTCAAAATGGGTCTGTTCGATCTGCTGGTTTCCTTCGTCGATGCGGATGACGCGCGTATCCCTTGCTTCGACTTTCCGCTGGCTGTTATTGTGCGCGAGTGCGATGCAAACCTGTCTCTCACCCTTCGCTTCTCGGACTGCCTGTTCAACGAGGAAACCATTTGTAATTTCACGGATGCCCTCAATATCCTGTTGGCTGAGGCAGTTATCGGTCGTGTAACTCCGGTAGCCGATATCGAGCTGCTGTCTGCAGAGCAGAAACAACAGCTGGAGGAATGGAACAACACCGATGGTGAATATCCGTCTAGCAAGCGTCTGCACCACCT 980
2 AACCCTAGCCTGAAACGCGTGCCAATTGGTGCTACAGGTGAGCTGCATATTGGCGGCCTGGGTATCTCCAAGGGTTACTTGAATCGTCCGGAACTGACGCCGCACCGCTTCATCCCGAACCCGTTTCAGACCGATTGCGAAAAACAGCTGGGTATCAACTCTCTGATGTACAAAACCG 1,203
3 ATCGTCCGGAACTGACGCCGCACCGCTTCATCCCGAACCCGTTTCAGACCGATTGCGAAAAACAGCTGGGTATCAACTCTCTGATGTACAAAACCGGTGATCTGGCTCGCTGGCTCCCGAACGGTGAAGTTGAATACCTGGGCCGTGCGGATTTCCAGATCAAACTGCGCGGTATTCGTATTGAGCCGGGCGAAATCGAGACTATGCTGGCGATGTATCCGCGCGTTCGTACCTCCCTGGTGGTTTCCAAGAAATTACGTAACGGTCCTGAAGAAACAACGAACGAACACCTGGTAGGCTACTACGTATGCGACTCCGCATCTGTTTCCGAAGCGGATCTGCTGTCCTTCCTGGAGAAGAAGCTGCCGCGTTATATGATTCCGACTCGTCTGGTACAGCTGAGCCAGATCCCGGTTAACGTCAACGGTAAAGCCGATCTGCGTGCTCTGCCGGCGGTTGATATCTCCAACAGCACCGAAGTTCGTTCTGATCTGCGTGGTGATACCGAAATTGCCCTCGGCGAAATCTGGGCGGACGTGCTGGGCGCGCGTCAGCGTTCGGTTAGCCGTAACGATAACTTTTTCCGCCTCGGTGGCCACTCTATCACCTGCATCCAGCTGATTGCGCGTATCCGTCAGCGTCAGC 645
4 CACTATTTCTGGTCGCAA 1,003
본 발명의 방법에 따라 제조된 11개의 유전자 클러스터 단편들의 서열.
단편 제한효소 또는 네스티드 PCR 후 타겟된 서열
(5’-> 3’)		 예상 크기
(bp)
5 CTGTCTCGTAGCACCGACCTGGCATACATCATCTACACCTCTGGCACCACCGGCCGCCCGAAAGGCGTGACTGTGGAGCATCACGGTGTGGTGAACCTGCAGGTATCCCTGAGCAAAGTTTTTGGTCTGCGTGACACCGACGACGAAGTCATCCTGTCTTTTTCTAACTACGTTTTCGATCACTTCGTAGAACAGATGACTGATGCTATCCTGAACGGGC 1,245
6 GAAGAAATCGGCATTTACTCTGACTTCTTCTCCTTGGGCGGCGACAGCCTGAAATCTACTAAGTTATCCTTCATGATCCATGAGTCCTTTAACCGTGCTGTGAGCGTTAGCGCGTTATTCTGCCATCGCACA 1,157
7 GGTCGTTCTGCGTGTAGATATCAGCCAGTCCGCTATTTGCG 1,066
8 GGTCGTTCTGCGTGTAGATATCAGCCAGTCCGCTATTTGCGGTTTAATCCGTCGCGTCATGAAAGAACTGGTTGACGCGCAGCTGCACCAGGATATGCCGTTCCAGGAAGTTACGAAACTGCTGCAGGTGGATAACGATCCTAGCCGTCACCCGTTGGTTCAGAACGTATTTAACTTTGAGTCTCGCGCGAACGGTGAACACGATGCCCGCTCTGAAGACGAGGGCTCTCTTGCATTCAATCAGTACCGTCCGGTTCAGCCGGTTGACAGCGTGGCCAAATTCGATCTGAACGCCACCGTCACCGAACTGGAATCCGGTCTGCGTGTTAATTTCAACTACGCGACCAGCTTATTCAATAAATCCACCATCCAGGGCTTCCTGCACACATATGAATACCTTCTGCGTCAGCTGTCCGAACTGAGCGCTGAAGGCATCAACGAAGATACCCAGCTGTCACTGGTTCGCCCGACTGAGAACGGGGATCTGCACCTGCCACTGGCCCAGTCTCCGCTCGCGACCACTGCAGAAGAACAGAAAGTTGCTTCCCTGAACCAGGCTTTCGAACGTGAAGCCTTCCTGGCGGCGGAAAAAATCGCCGTTGTTCAAGGGGACCGCGCTCTGTCGTATGCCGACCTGAACGGTCAGGCTAATCAACTGGCGCGTTATATCCAGTCCGTCTCCTGCATCGGTGCCGACGACGGCATCGCCCTGATGCTGGAAAAGAGCATCGATACTATCATCTGCATTCTGGCAATCTGGAAAGCAGGCGCCGCGTATGTGCCGCTGGATCCGACCTACCCACCAGGCCGTGTACAACTGATCCTGGAGGAAATCAAAGCGAAAGCTGTGCTGGTACACTCTTCCCACGCCTCTAAATGTGAACGTCACGGTGC 894
9 CGTACTGCACATTCCTTAGTCGGTTATTATACCACTGATAACGAAACAGTTTCAGAAGCTGATATCCTCACCTTCATGAAAGCGCGTCTGCCGACCTATATGGTGCCTTCTCACCTGTGCTGCCTGGAAGGTGCTCTGCCAGTCACTATTAACGGTAAACTGGACGTTCGTCGTCTGCCTGAAATTATCAACGACAGTGCGCAATCCTCATATTCCCCGCCGCGCAACATTATCGAAGCGAAAATGTGCCGTTTATGGGAAAGCGCGCTGGGTATGGAACGCTGCGGTATTGACGATGAC 1,325
본 발명의 방법에 따라 제조된 11개의 유전자 클러스터 단편들의 서열.
단편 제한효소 또는 네스티드 PCR 후 타겟된 서열
(5’-> 3’)		 예상 크기
(bp)
10 CGAAGAAGTTGACCAGACCCTGGATGTTTCTCGTACGATGGGCTGGTTCACTACCATGTATCCGTTCGAAATCCCGCGTCTGTCGACGGAAAACATCGTGCAGGGTGTTGTTGCTGTAAGTGAACGCTTCCGCCAAGTTCCGGCTCGCGGTGTTGGTTATGGTACTCTGTACGGTTACACCCAGCACCCTCTGCCGCAGGTTACTGTTAACTACCTGGGCCAGCTG 1,251
11 CTTGCCATCGACCCGTCTCTGGCGGCTCAGTACATCGGTCGTTGGAAGTAA 1,076
상기 11개의 유전자 클러스터 단편들은 다음을 이용하여 구축되었다(도 8i): 3 ㎕의 물, 10 ㎕의 Phusion 폴리머라제 프리-믹스(NEB, MA), 1 ㎕의 정방향 및 역방향 프라이머, 그리고 5 ㎕의 플랭킹 서열-절단된 shotgun 어셈블리 DNA 단편. 상기 약 1 kb DNA 단편들은 TOP ClonerTM Blunt core kits(Enzynomics, 한국)를 이용하여 TOPO 벡터에 클로닝되어 Sanger 시퀀싱하였다. 본 발명자들은 몇 개의 콜로니를 선택하여 M13 프라이머 쌍(M13F-pUC 및 M13R-pUC 유니버셜 프라이머 쌍)을 이용하여 콜로니 PCR을 실시하였다. 본 발명자들은 Lasergene(DNAstar, Madison, WI) 프로그램을 이용하여 DNA 시퀀싱 데이터를 분석하였다.
플랭킹 서열-제거된 shotgun 어셈블리 산물을 이용한 11.4 kb 유전자 클러스터의 네스티드 PCR 어셈블리
본 발명자들은 11개의 약 1 kb 단편들을 이용한 네스티드 PCR 방법을 이용하여 타겟 페니실린 생합성 유전자 클러스터의 전장 길이를 제조하였다.
상기 PCR은 프라이머를 포함하지 않고 11개의 약 1 kb 단편들(각 1 ㎕) 및 15 ㎕의 Phusion 폴리머라제 프리-믹스(NEB, MA)를 이용하여 다음과 같이 실시하였다: (a) 전변성 단계, 95℃에서 3분; (b) 95℃에서 30초, 70℃에서 30초 및 72℃에서 3분 30초로 이루어진 10 사이클의 PCR 단계; 및 (c) 최종 연장 단계, 72℃에서 5분.
또한, 상기 혼합물(약 1 kb 단편들(각 1 ㎕) 및 15 ㎕의 Phusion 폴리머라제 프리-믹스)에 제한효소 절단 서열(BglII 또는 NotI)을 포함하는 프라이머 쌍(각 1 ㎕)을 첨가하여 PCR(25 사이클 이상)을 실시하여 그 산물을 클로닝에 이용하였다.
젤 전기영동 후, 본 발명자들은 소망하는 크기의 밴드를 절단하여 DNA를 정제하였다. 본 발명자들은 BglII 및 NotI 제한효소를 이용하여 상기 산물들을 pBK3 벡터(Kim, H., et al., 2010)에 클로닝하여 대장균 스트레인인 C2566 컴피턴트 세포에 형질전환시켰다. 하룻밤 동안 37℃에서 배양시킨 후, 수 개의 콜로니들을 선택하여 콜로니 PCR을 실시하여 소망하는 DNA 인서트 크기가 삽입된 pBK3 벡터를 포함하는 콜로니를 스크리닝하였다. 몇 개의 콜로니들을 LB 배지에서 배양하여 플라스미드 추출 키트(AccuPrepTM plasmid extraction kit; 바이오니아, 한국)를 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 추출된 플라스미드를 시퀀싱 의뢰하였다. 본 발명자들은 Lasergene 프로그램(DNAstar, Madison, WI, 미국)을 이용하여 시퀀싱 데이터를 분석하였다.
실험결과 및 논의
고속 DNA 구축을 위한 일련의 장애들(challenges)을 해결하기 위해, 본 발명자들은 shotgun DNA 합성 기술을 개발하였다. 본 발명자들은 페니실린 생합성 유전자 클러스터[N-(5-amino-5-carboxypentanoyl)-L-cysteinyl-D-valine synthase; 11,376bp]를 위한 228개의 올리고뉴클레오타이드를 디자인하였다. 칩 올리고뉴클레오타이드들은 공통적인 플랭킹 서열을 포함하도록 디자인되어 55 K Agilent DNA 마이크로칩으로부터 절단되었다. 본 발명자들은 플랭킹 서열을 이용하여 선택적 증폭을 실시하고 제IIS형 제한효소를 이용하여 증폭 프라이머 서열을 제거하여 칩 올리고뉴클레오타이드의 서브-풀을 얻었다(도 8a 및 8b).
본 발명의 방법의 성공에 있어서 중요 포인트는 이질적인 어셈블리 산물을 생산하기 위해 올리고뉴클레오타이드 풀이 one-pot에서 shotgun 어셈블리될 수 있으며, 상기 산물들이 고속 시퀀싱에 의해 동정될 수 있다는 예측에 기반한다. 이에, 본 발명자들은 shotgun DNA 합성을 위해 적어도 일 말단이 절단된 올리고 뉴클레오타이드들을 이용하였다. 예상한 바와 같이, 100-1,000 bp 길이의 매우 이질적인(heterogeneous) DNA 단편들을 생산하였다(도 8c). 본 발명자들은 아가로오스 젤 전기영동을 통해 매우 이질적인 DNA 단편들로부터 300-500 bp 부위에 상응하는 DNA를 분리하였다. 상술한 DNA 단편들의 크기 범위는 현재 454 고속 시퀀싱 판독 길이(read length)의 한계(약 400-500 bp)를 고려하여 결정되었다.
다음으로, 본 발명자들은 고속 시퀀싱 기술을 이용하여 임의적 단편 조성물의 동정방법 및 전체 DNA 단편 풀로부터 서열-검증된 오류없는 단편(sequence validated error-free fragments)을 얻기 위한 방법을 개발하는 데 주안점을 두었다(도 7). 상술한 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 바코드 프라이머 서열을 이용한 증폭을 통해 바코드 태깅된 DNA 단편을 젤 정제하였다(도 8). 본 발명자들은 상기 DNA 단편들이 양 말단에 공통적인 플랭킹 서열을 포함할 것으로 추측하였다. 그 이유는 다음과 같다: 증폭된 칩 올리고뉴클레오타이드들의 플랭킹 서열 절단의 효율은 100%에 이를 수 없다. 그 결과, 양 말단이 모두 절단되지 않은 칩 올리고뉴클레오타이드에서 플랭킹 서열은 DNA 어셈블리 과정의 종결을 야기한다. 상기 종결은 양 말단에 공통적인 플랭킹 서열을 가진 중간체들(intermediates)을 생산한다. 비록 이전까지 상기 전-종결이 칩 DNA 합성 기술의 개발에서 해로운 것으로 고려되었을지라도, 본 발명자들은 단편에 포함된 플랭킹 서열들이 (단편에 포함된 플랭킹 서열과 degenerate 바코딩 서열을 연결한) 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해 degenerate 바코딩 서열을 가지는 시퀀스를 임의적으로 어셈블리된 산물에 대해 태깅하는 데 큰 도움을 줄 것으로 예상하였다.
상기 태깅 바코드 프라이머 서열은 DNA 칩의 증폭에 이용된 원형(original) 프라이머 서열을 포함하는 세 부분으로 구성된다: (a) 올리고뉴클레오타이드를 디자인할 때 사용한 공통 프라이머 서열; (b) 20 bp degenerate-바코드 서열; 및 (c) 454 프라이머 서열. 바코드 서열-부착된 shotgun 어셈블리 단편들은 454 프라이머 서열로 추가적으로 증폭되어 바코딩된 어셈블리 산물의 농도를 증가시켰다.
shotgun 어셈블리 단편들의 454 시퀀싱 분석을 통해, 본 발명자들은 3%의 DNA 단편들(약 400 bp)이 오류없는 DNA 단편들을 포함한다는 것을 확인하였다(도 9a). 본 발명자들은 이후의 어셈블리 과정에 이용될 수 있는 오류없는 서열을 결정하기 위해 자체-제작된 파이선 컴퓨터 프로그램(in-house python computer program)을 개발하였다(도 9a 및 도 9b). 간략하게는, 상기 프로그램은 시퀀싱 데이터에서 제IIS형 효소 위치를 포함하는 플랭킹 서열을 스캔하여 내부 서열(internal sequences)을 타겟 레퍼런스 서열(target reference sequences)과 정렬(align)시킨다. 상기 내부 서열들(300 bp 미만의 크기)이 레퍼런스 서열과 완전하게 일치하는 경우, 상기 프로그램은 다른 단편들과 20-50 bp의 중첩 서열(overlapping sequences)을 가지는 최적 세트의 내부 서열을 알려줌으로써, 이후 어셈블리 과정의 다음 라운드에 적용시킨다(도 8g).
상기 파이선 프로그램을 실시한 후, 본 발명자들은 타겟 서열(총 11,376 bp)의 88%를 포괄하는 오류없는 shotgun 어셈블리된 DNA 단편들(약 300 bp)을 얻었다. 나머지 약 12%의 DNA 서열들의 경우, 본 발명자들은 오류를 포함하는 각 서열들을 분석하여 프라이머를 이용한 재-증폭을 통해 결정하였다. 61개의 PCR 바코드 프라이머 쌍이 임의적인 어셈블리 산물들의 풀로부터 선택되었다.
본 발명자들은 degenerate-바코드 프라이머 서열을 이용하여 DNA 혼합물로부터 소망하는 shotgun 어셈블리 단편들을 선택적으로 증폭하였다. 젤 데이터(약 400 bp)에 기반하여, 77%(61개의 증폭물 중 47개)의 선택적 증폭물이 소망하는 서열을 포함하였다. 비증폭된 타겟 서열들은 파이선 프로그램을 통해 다시 평가되어 또 다른 올리고뉴클레오타이드 서열이 주문되었다. 본 발명자들은 재-주문된 프라이머 서열을 이용하여 타겟 DNA 합성에 이용될 수 있는 100%의 서열을 얻을 수 있었다. 본 발명자들은 상기 서열들(약 10%)을 TOPO 클로닝하여 Sanger DNA 시퀀싱을 실시함으로써 그 유효성을 평가하였다. Sanger 시퀀싱-평가된 서열들의 약 99.98 %가 타겟 레퍼런스 서열과 일치하였다.
선택된 DNA를 이용한 앰플리콘들(amplicons)은 칩 올리고뉴클레오타이드의 프로세싱 과정에 이용된 제IIS형 제한효소 인지서열을 포함하는 플랭킹 서열들을 포함한다. 따라서, 증폭된 오류없는 단편들을 이용한 타겟 DNA의 어셈블리 과정 전에, 상기 증폭된 단편들의 바코드 서열이 제II형 제한효소(TypeIIS 제한 효소, EarI, BtsI 또는 EcoP15I)로 절단되었다(도 7). 두 번째 라운드의 DNA 어셈블리를 위해, 본 발명자들은 3-7개의 플랭킹 서열-절단된 단편들(각각, 약 300 bp)을 혼합하여 11개의 단편들(각각 단편의 길이는 약 1 kb)의 구축을 위한 네스티드(nested) PCR을 실시하였다(도 8i). DNA 어셈블리를 위해, 본 발명자들은 도 7에 예시된 바와 같이 타겟 유전자 조각과 동일한 염기 서열을 갖는, 각각 11개 유전자 조각의 5-말단 및 3-말단의 프라이머 세트를 이용하여 어셈블리를 진행하였다. 화학적으로 합성된 상기 1 kb DNA 단편들의 서열을 확인하기 위해, 본 발명자들은 TOPO 클로닝하여 Sanger 시퀀싱을 의뢰하였다. 요약하면, 본 발명자들은 상기 11개의 컨스트럭트들 중에서 각각 1-3개의 콜로니들을 선택하여 시퀀싱하였는데, 9개의 컨스트럭트들이 최소 1개 이상의 소망하는 DNA 서열을 포함한다(21개 중 16개가 오류없는 컨스트럭트였음)는 것을 확인하였다(오차율 - 0.022%; 22,903 bp 당 5 bp 오류). 본 발명자들은 페니실린 생합성 유전자 클러스터의 구축을 위해 서열-확인된 11개의 DNA 단편들을 이용하여 최종 네스티드 PCR 어셈블리(도 8j)를 실시하고 그 산물을 클로닝하여 시퀀싱한 결과, 성공적으로 소망하는 페니실린 유전자 클러스터를 얻었다(11,400 bp 당 0개의 오류).
본 발명의 독창적 특징을 예증하기 위해 여러 가지 포인트가 추가적으로 논의될 가치가 있다. 첫째로, 본 발명자들의 shotgun 합성방법은 낮은 DNA 합성 효율과 관계된 내적 어려움(intrinsic challenges)에 대한 해법을 제공할 수 있다. DNA 어셈블리 과정은 서브-풀 내에 증가된 수의 올리고뉴클레오타이드들(즉, 낮은 올리고뉴클레오타이드 농도를 야기함) 및 상기 올리고뉴클레오타이드 내에 존재하는 부분적으로 제거된 플랭킹 서열의 존재로 인해 덜 효율적으로 일어난다. 예를 들어, 타겟 유전자 클러스터들의 어셈블리를 위한 실시과정 동안 본 발명자들은 작은 크기의 DNA 단편들에 상응하는 약 100-500 bp의 매우 이질적인 부산물(by-products)을 끊임없이 관찰하였다. 하지만 본 발명을 이용하면, 상기 이질적인 산물들이 다음 단계의 DNA 어셈블리 과정에 이용될 수 있기 때문에, 본 발명자들의 shotgun DNA 합성방법은 종래에 실시된 유전자 합성방법보다 더 큰 장점을 가진다.
둘째로, 많은 수의 임의적인 어셈블리 (shotgun assembly) 산물들로부터 오류없는 DNA 단편들의 동정 및 분리를 위한 방법이 성공적으로 개발되었다. 합성 DNA 서열의 바코딩된-프라이머 서열은 고속 시퀀싱에 의해 유효화되었으며, 상기 바코드 서열은 DNA 분자의 풀로부터 소망하는 DNA 분자의 선택적 PCR 증폭에 이용될 수 있었다. 선택적으로 증폭된 타겟 DNA 단편들에서 증폭 프라이머 서열이 제거된 후, 상기 단편들이 타겟 서열의 어셈블리에 계층적으로 이용되었다. 또한, 타겟 DNA 분자들의 크기가 차세대 시퀀싱에 의해 단번에 시퀀싱되기에 충분한 경우 첫 번째 라운드의 shotgun 합성 단계에서 얻어진 산물들이 바로 이용될 수 있음은 자명하다.
셋째로, Agilent 칩-올리고뉴클레오타이드를 이용한 DNA 합성 및 고속 시퀀싱의 비용 평가는 다음과 같다. 거대 DNA 합성에 대한 비용은 주로 올리고뉴클레오타이드 및 시퀀싱에 소요된다. 칩 올리고뉴클레오타이드의 합성 비용은 레진-기반된 올리고뉴클레오타이드보다 100배 이상 저렴한 $0.00085/nt로 예상된다(Kim et al., 2011). 또한, 시퀀싱 비용-분석을 위해 본 발명자들이 실시한 454 시퀀싱 판독의 컴퓨터 분석 결과, shotgun 합성의 첫 번째 라운드에서 제조된 300 bp의 DNA 단편들 중 약 3%가 오류없는 DNA 단편이라는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 Roche-454 시퀀싱 시퀀싱 1/8 레인을 사용하여 시퀀싱 판독을 수행하였고, 그 비용은 약 $1,500였다. 즉, 10 kb 유전자 클러스터의 합성 비용은 약 $3,000이었다(올리고뉴클레오타이드 합성 비용 = $0.00085/nt * 2 * 228 * 150nt = $60; 및 각종 프라이머 비용 = $0.1/nt * 200개 * 20nt = $400; Sanger 시퀀싱 비용 = $3 * 100 reaction = $300; Roche-454 시퀀싱 비용 = $1,500; 각종 정제 키트 및 효소 비용 = $800). 현재 DNA 합성 회사들이 $0.5/bp의 비용을 청구하고 있는 것을 고려해 볼 때, 본 발명자들의 합성 방법은 DNA 합성 비용을 최소 5 배 이상 절감시킨다. 본 발명자들의 접근방식의 중요성은 DNA 어셈블리 단편들의 균일하지 않은 적용범위(uneven coverage)이다. 반복된 어셈블리 실험들로부터, 본 발명자들은 DNA 어셈블리 과정으로부터 특정 부위의 적용이 DNA 서열에 의존적이라는 것을 발견하였다. 따라서, 보다 균일한 어셈블리 과정을 위한 shotgun 어셈블리 방법을 개발하는 것이 바람직할 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Matzas M., et al., High-fidelity gene synthesis by retrieval of sequence-verified DNA identified using high-throughput pyrosequencing. Nature biotechnology. 28, 1291-1294(2010).

Claims (21)

  1. (a) 목적 핵산분자의 전체 서열의 적어도 일부를 구성하는 핵산 단편들을 제공하는 단계;
    (b) 상기 핵산 단편들을 바코드 서열들로 태깅하는 단계;
    (c) 상기 바코드 서열들로 태깅된 핵산 단편들의 서열을 확인하는 단계; 및
    (d) 상기 서열 확인된 핵산 단편들 중 소망하는 핵산 단편들을 상기 바코드 서열들을 이용하여 회수하는 단계를 포함하는 핵산 단편들의 회수방법.
  2. (a) 목적 핵산분자의 전체 서열의 적어도 일부를 구성하는 핵산 단편들을 제공하는 단계;
    (b) 상기 핵산 단편들을 바코드 서열들로 태깅하는 단계;
    (c) 상기 바코드 서열들로 태깅된 핵산 단편들의 서열을 확인하는 단계;
    (d) 상기 서열 확인된 핵산 단편들 중 소망하는 핵산 단편들을 상기 바코드 서열들을 이용하여 회수하는 단계; 및
    (e) 상기 회수된 핵산 단편들을 조립하여 긴 핵산분자를 형성하는 단계를 포함하는 핵산분자의 제조방법.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 (a) 단계는
    (a-1) 제한효소 절단 서열 및 공통적 플랭킹 서열을 적어도 일 말단에 구비한 올리고뉴클레오타이드들의 풀을 제공하는 단계;
    (a-2) 상기 제한효소 절단 서열 부분을 절단함으로써 상기 공통적 플랭킹 서열을 일 말단에 구비한 올리고뉴클레오타이드들과 상기 공통적 플랭킹 서열을 구비하지 않은 올리고뉴클레오타이드들을 포함하는 혼합물의 풀을 제공하는 단계; 및
    (a-3) 상기 공통적 플랭킹 서열을 이용하여 상기 혼합물 내의 상기 올리고뉴클레오타이드들을 어셈블리하여 핵산 단편들을 합성하는 단계를 포함하는 핵산 단편들의 회수방법.
  4. 제3 항에 있어서,
    상기 (a-3)의 합성된 더 긴 핵산 단편들의 적어도 일 말단이 상기 공통적 플랭킹 서열을 구비하는 핵산 단편들의 회수방법.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 핵산 단편들이 DNA 마이크로어레이로부터 유래된 경우, 상기 핵산 단편들의 추가적인 증폭 단계를 더 포함하는 핵산 단편들의 회수방법.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 핵산 단편들의 크기는 20 내지 3,000 bp인 핵산 단편들의 회수방법.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 바코드 서열들은 2종 이상의 올리고뉴클레오타이드들의 혼합물인 핵산 단편들의 회수방법.
  8. 제1 항에 있어서,
    상기 바코드 서열의 길이는 5 내지 300 bp인 핵산 단편들의 회수방법.
  9. 제1 항에 있어서,
    상기 바코드 서열들의 태깅은 PCR, 에멀젼 PCR 및 라이게이션(ligation)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 수행되는 핵산 단편들의 회수방법.
  10. 제1 항에 있어서,
    상기 바코드 서열에 시퀀싱 어댑터 서열이 부가된 핵산 단편들의 회수방법.
  11. 제1 항에 있어서,
    상기 태깅된 핵산 단편들의 서열의 확인은 병렬적 시퀀싱 방법에 의해 수행되는 핵산 단편들의 회수방법.
  12. 제1 항에 있어서,
    상기 (d) 단계는 상기 바코드 서열들에 상응하는 프라이머들로 소망하는 상기 핵산 단편들을 선택적으로 증폭하여 회수하는 방식으로 수행되는 핵산 단편들의 회수방법.
  13. 제1 항에 있어서,
    상기 (d) 단계는 상기 바코드 서열들에 상응하는 올리고뉴클레오타이드들로 소망하는 상기 핵산 단편들을 선택적으로 혼성화하여 회수하는 방식으로 수행되는 핵산 단편들의 회수방법.
  14. (a) 목적 핵산분자의 전체 서열의 적어도 일부를 구성하는 핵산 단편들을 제공하는 단계;
    (b) 상기 핵산 단편들을 조립하여 병렬적 시퀀싱 기술로 중간체들을 합성하는 단계;
    (c) 상기 중간체들을 바코드 서열들로 태깅하는 단계;
    (d) 상기 바코드 서열들로 태깅된 중간체들의 서열을 확인하는 단계;
    (e) 상기 서열 확인된 중간체들 중 소망하는 중간체들을 상기 바코드 서열들을 이용하여 회수하는 단계; 및
    (f) 상기 회수된 중간체들을 조립하여 긴 핵산분자들을 형성하는 단계를 포함하는 핵산분자의 제조방법.
  15. 제14 항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 핵산 단편들의 크기는 20 내지 300 bp인 핵산분자의 제조방법.
  16. 제14 항에 있어서,
    상기 바코드 서열에 시퀀싱 어댑터 서열이 부가된 핵산분자의 제조방법.
  17. 제16 항에 있어서,
    상기 (c) 단계와 상기 (d) 단계 사이에 상기 시퀀싱 어댑터 서열에 결합하는 프라이머를 이용하여 상기 태깅된 핵산 단편들을 증폭하는 단계를 더 포함하는 핵산분자의 제조방법.
  18. 제14 항에 있어서,
    상기 (d) 단계의 태깅된 중간체들의 서열의 확인은 병렬적 시퀀싱 기술에 의해 수행되는 핵산분자의 제조방법.
  19. 제14 항에 있어서,
    상기 (e) 단계의 소망하는 중간체들은 오류없는 서열을 갖는 핵산분자의 제조방법.
  20. 제14 항에 있어서,
    상기 중간체들의 크기는 50 내지 3,000 bp인 핵산분자의 제조방법.
  21. 제14 항에 있어서,
    상기 긴 핵산분자들의 크기는 1,000 bp 이상인 핵산분자의 제조방법.
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