CN111471088B - 一种抑制sars-cov-2感染的多肽、组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抑制SARS‑COV‑2感染的多肽，属于生物医药领域，所述多肽为VDP‑4，具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；所述多肽还可以为VDP‑4的修饰产物，或者VDP‑4在药学上可接受的盐、酯和前药中的一种。该多肽能够与SARS‑COV‑2的S蛋白RBD区特异性结合，阻断病毒与细胞受体的结合，进而从源头上有效抑制病毒的感染。本发明还提供一种抑制SARS‑COV‑2的组合物及其用途。

Description

一种抑制SARS-COV-2感染的多肽、组合物及其用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种抑制SARS-COV-2感染的多肽、组合物，以及多肽、组合物在制备预防和/或治疗SARS-COV-2感染的药物中的用途。
背景技术
2019年底以来，全球范围内相继爆发了SARS-COV-2疫情，由于该病毒属于全新的病毒，且主要通过飞沫和接触传播，病毒短时间内迅速扩散，给世界造成巨大影响。由于针对SARS-COV-2的疫苗尚处于研究阶段，短期内难以大规模应用，且其保护效率，安全性等都需要经过大量的试验才能予以验证。此外，病毒变异等原因，可能进一步增加SARS-COV-2的预防和治疗难度。因此，亟待开发出新的抗SARS-COV-2药物或预防性制剂，以此治疗或预防病毒的感染。
病毒感染宿主细胞的第一步是病毒与宿主细胞受体间的结合，这个步骤对于病毒能否有效的侵入宿主细胞起到至关重要的作用。病毒受体指位于宿主细胞表面，负责结合病毒并介导病毒侵入的具有正常生理功能的蛋白质，糖及脂类分子。病毒表面的囊膜蛋白或外壳蛋白与宿主细胞受体结合后，通过细胞内吞或膜融合的方式，进入细胞，释放遗传物质并最终完成病毒的复制过程。因此，从病毒与受体结合这个角度来开发抑制病毒侵入的手段，能够在源头上有效的抑制和控制病毒的感染。
目前，基于病毒侵入的抑制类药物主要应用于艾滋病病毒的治疗和预防。恩夫韦肽即是通过抑制艾滋病病毒囊膜蛋白与其宿主细胞受体结合后的变构，来抑制病毒与宿主细胞膜间的膜融合，来达到抑制病毒复制的效果。针对SARS-COV-2，目前尚无有效特异性治疗药物及疫苗，亦无临床使用或防护类的侵入抑制类药物或制剂。
发明内容
为了解决SARS-COV-2的预防和治疗难度大的问题，本发明提供了一种抑制SARS-COV-2的多肽，该多肽能够与SARS-COV-2的S蛋白RBD区特异性结合，阻断病毒与细胞受体的结合，进而从源头上有效抑制病毒的感染。
本发明还提供一种抑制SARS-COV-2的组合物及其用途。
本发明通过以下技术方案实现：
一种抑制SARS-COV-2感染的多肽，所述多肽包括(1)、(2)和(3)中至少一种：
(1)具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
(2)序列SEQ ID NO：1的修饰产物；
(3)序列SEQ ID NO：1在药学上可接受的盐或酯或前药。
其中，所述多肽能够与SARS-COV-2的S蛋白RBD区特异性结合。
其中，序列SEQ ID NO：1的修饰产物可以为加一个肽的N端乙酰化或C端酰胺，或者N端和C端的PEG修饰的要求。
进一步的，所述多肽通过Fmoc多肽合成法制备。
为了便于说明，本发明将上述多肽命名为VDP-4。
其中，Fmoc多肽合成法制备为本领域技术人员制备多肽的常规方法。在本领域技术人员知道要制备的多肽需要包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的情况下，再结合现有Fmoc多肽合成法，就可得到本发明要保护的多肽。
一种抑制SARS-COV-2感染的组合物，包括岩藻多糖和所述多肽。
岩藻多糖是一种独特的结合有硫酸基团的水溶性多糖，也称岩藻聚糖或褐藻多糖硫酸酯褐藻糖胶。
进一步的，所述岩藻多糖的摩尔浓度为45.53-182.26μM/L，所述多肽的摩尔浓度为5-20μM/L。
优选的，所述岩藻多糖的摩尔浓度为45.53-182.26μM/L，所述多肽的摩尔浓度为5-20μM/L。
进一步的，所述组合物包括包括如下组合中的一种：
10μM/L的多肽和91.06μM/L的岩藻多糖，
10μM/L的多肽和136.59μM/L的岩藻多糖，
10μM/L的多肽和182.26μM/L的岩藻多糖，
5μM/L的多肽和182.26μM/L的岩藻多糖，
20μM/L的多肽和91.06μM/L的岩藻多糖，
20μM/L的多肽和136.59μM/L的岩藻多糖，
20μM/L的多肽和182.26μM/L的岩藻多糖。
进一步的，所述岩藻多糖的分子量为685.91道尔顿，所述多肽的分子量为1815道尔顿。
一种抑制SARS-COV-2感染的药物，所述药物的药效成分包含所述多肽；或者包含所述多肽及岩藻多糖组成的组合物。
进一步的，所述药物还包含药学上可接受的载体和赋形剂，药物剂型为口服制剂、注射制剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、乳剂、溶液剂和混悬剂中任意一种。
该混合物可以为口服制剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、经消化道与病毒结合，抑制病毒通过肠道传播。注射制剂可直接通过血液到达感染组织，阻止病毒扩散。乳剂、溶液剂和混悬剂可于粘膜部位抑制病毒的侵入。
一种抑制SARS-COV-2感染的多肽在制备预防和/或治疗SARS-COV-2感染的药物中的用途。
一种抑制SARS-COV-2感染的组合物在制备预防和/或治疗SARS-COV-2感染的药物中的用途。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
1.本发明一种抑制SARS-COV-2感染的多肽，该多肽能够与新型冠状病毒SARS-COV-2的S蛋白RBD区特异性结合，阻断病毒与细胞受体ACE-2的结合，从源头上有效抑制病毒的感染。
2.本发明一种抑制SARS-COV-2感染的组合物，包括多肽VDP-4和岩藻多糖，通过VDP-4及岩藻多糖对新型冠状病毒与宿主细胞结合的抑制的协同放大作用，来达到抑制病毒侵入的效果，且使用安全，无毒副作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是VDP-4与SARS-COV-2的S蛋白的RBD区结合示意图；
图2是VDP-4及组合物与SARS-COV-2的混合物对新型冠状病毒假病毒与细胞的结合的影响；
图3是VDP-4及组合物与SARS-COV-2的混合物对新型冠状病毒假病毒侵入的影响；
图4是VDP-4及组合物与SARS-COV-2的混合物的细胞毒性测试图：其中，纵坐标表示细胞活性，横坐标代表岩藻多糖浓度；
图5是PSV图谱。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
硫酸乙酰肝素是人体细胞表面的一种多糖成分，硫酸乙酰肝素(HS)在动物组织中分布广泛，是一种天然的线性多糖，在细胞表面和细胞外基质中表达丰富。研究发现，硫酸乙酰肝素作为一种细胞表面的分子，参与并介导了多种病毒与细胞间的黏附及侵入。HS在生长发育、炎症反应、肿瘤的发生发展等不同病生理过程中发挥作用。囊膜病毒的囊膜蛋白及非囊膜病毒的外壳蛋白首先与细胞表面的硫酸乙酰肝素结合，实现了病毒与细胞间的最初相互作用，病毒随之与其它辅助受体或功能性受体进一步结合，从而实现侵入的过程。
申请人发现，游离的HS或其天然类似物分子能够与病毒表面结合及变构，进而阻止病毒与细胞表面宿主细胞受体的结合，从而达到抑制病毒感染的效果。本发明采用岩藻多糖作为HS类似物，游离的岩藻多糖表面带有负电荷的硫酸基团能够与病毒外壳蛋白或囊膜蛋白结合，起到固定SARS-COV-2病毒的作用，降低病毒与细胞的接触并感染的能力。
研究显示，SARS-COV-2与SARS病毒使用同一种细胞受体ACE-2，其S囊膜蛋白与宿主细胞的ACE-2受体结合后，通过内吞的方式，侵入细胞，释放遗传物质并最终完成病毒的复制过程。
申请人从SARS-COV-2病毒与受体结合这个角度出发，开发出一种多肽VDP-4，VDP-4序列为FLKDENHEAEDLLDK，能够特异性的结合到SARS-COV-2病毒表面S蛋白的RBD区(受体结合区)。发明人通过PRE-FLOD预测了VDP-4的结构为一个标准的螺旋结构，由protein-dock计算了SARS-COV-2的S蛋白的RBD区与VDP-4的结合，如图1所示。可见VDP-4能够结合到RBD区的ACE-2与RBD结合面的侧方，S蛋白在该位点与VDP-4的结合可能会影响ACE-2与S蛋白的结合。
本发明缩写名词一般解释如下：
SARS-COV-2：新型冠状病毒及其变异；
BRD：受体结合区；
PRE-FLOD：一款计算多肽结构的软件；
protein-dock：蛋白与蛋白分子对接软件；
PSV：pcDNA3.1-SARS-COV-2-S，其中S蛋白去掉C末端19个氨基酸；
DMEM：含各种氨基酸和葡萄糖的培养基；
FBS：胎牛血清。下面将结合实施例及实验数据对本申请的VDP-4多肽、组合物及其对SARS-COV-2病毒抑制效果进行详细说明。
实施例1
1.假病毒包装
1.1质粒提取
假病毒体系质粒构建，将全长SARS-COV-2的S蛋白构建到PSV(pcDNA3.1-SARS-COV-2-S，其中S蛋白去掉C末端19个氨基酸)的多克隆位点中，与骨架质粒pNL-LUC-E-(该质粒为通用假病毒包装质粒)同时转化DH5-a感受态细胞。42摄氏度，热激90秒后，涂布LB平板，氨苄青霉素浓度5微克每毫升。37℃培养箱培养过夜。
PSV图谱如图5所示。
挑单菌落，接种LB液体培养基，氨苄青霉素浓度5微克每毫升。37℃摇床摇菌过夜。
12000离心10分钟，收集菌体，以天根质粒大提试剂盒提取质粒。Nanodrop测量DNA浓度。
1.2包装
观察293T细胞的细胞状态，胰酶消化对数生长期细胞至30厘米皿，细胞数为3×106个每皿。加入10％FBS DMEM细胞培养基培养。37℃过夜培养。
转染前，以无血清DMEM洗细胞两至三次。加入20毫升DMEM。以30微克pNL-LUR-E-和30微克PSV-S介入到生理盐水中，加入500微升PEI水溶液。剧烈混匀，室温放置15分钟。加入细胞上清中。37℃培养箱培养。
48小时后，收集上清，以0.45微米滤膜过滤上清，去除细胞及碎片。以浓缩管浓缩上清液至适当体积。病毒分装-80°冻存。
1.3假病毒的感染效果验证
取对数生长期的Hun-7细胞，分细胞至96孔板，每孔5000个细胞，10％FBS DMEM培养基培养过夜。第二天，取出细胞，以无血清DMEM培养基洗细胞三次，每次200微升。加入以DMEM稀释的不同稀释度(母液按1∶10；1∶100∶1∶1000；1∶10000；1∶100000)的病毒液100微升，每个浓度设置10个重复。感染48小时后，加入细胞裂解液，检测到荧光值，说明假病毒具有与真病毒相同的感染效果。
2.细胞培养
本实施例使用Vero-E6细胞，具体培养方法如下：
细胞生长至对数生长期，显微镜观察细胞状态，吸去细胞上清；灭菌PBS洗细胞两次；胰蛋白酶使用浓度为百分之0.25-1％。显微镜观察细胞脱落情况；消化时间7分钟；显微镜观察细胞；1000转离心10分钟；弃掉上清，加入适量10％血清DMEM培养基重悬，细胞计数板计数；如果分96孔板，则每孔加入5000个细胞。如果分至10cm培养皿，则每皿加入10毫升培养基。加入10％血清DMEM培养基；37摄氏度，百分之五二氧化碳培养。
3.SARS-COV-2假病毒感染抑制实验
由于真病毒操作的法律法规，生物危险性的因素，在研究病毒侵入时，人们大都选择假病毒体系。假病毒体系是一种模拟真病毒侵入细胞的病毒体系，是成熟的用来研究和模拟病毒侵入过程的体系，已被广泛应用于筛选目标病毒的侵入抑制类小分子、多肽、抗体或蛋白质大分子等。本研究中，我们构建了SARS-COV-2的假病毒体系，以此来评价所述多肽对SARS-COV-2侵入的抑制效果。
具体如下：
3.1 10％FBS+DMEM培养Vero-E6细胞，37℃，百分之五二氧化碳。对数生长期时，胰酶消化细胞，细胞计数，按60％的比例将细胞接种于96孔板。
3.2培养细胞过夜后，显微观察细胞状态及汇合度，弃细胞上清，以DMEM洗细胞两次，每次200微升。
3.3将组合物按不同浓度与病毒液共孵育，注意：所加入的组合物以不同浓度配制，以保证加入的溶液为等体积。
3.4按MOI＝10感染细胞，每孔加入10微升孵育后的病毒液。
3.5冰上感染1小时，弃上清，以冷DMEM洗两次，加入DMEM培养基100微升，至37℃培养。
3.6培养48小时后，弃上清，以冰PBS洗细胞两次，每次200微升。加入细胞裂解液。
3.7测量荧光素酶强度。
VDP-4与岩藻多糖组合物的配制配比如下：
以不同浓度的VDP-4和岩藻多糖进行配比：VDP-4配制成10mM/L的母液，岩藻多糖配制成30.35mM/L的母液。按照表格1中的浓度进行配比。配制成100倍的母液。
表1中，第一列表示VDP-4的浓度(μM/L，本实验中VDP-4分子量为1815道尔顿)，第一行为岩藻多糖浓度(μM/L，本实验中岩藻多糖分子量为658.91道尔顿)，其余数值为酶标仪测得的荧光素酶强度。SARS-COV-2病毒加入DMEM培养基稀释，稀释滴度为MOI＝10，病毒分别与VDP-4、岩藻多糖、VDP-4和盐藻多糖的组合物在不同浓度下于37℃混合孵育1小时。然后加入到Vero-E6细胞中(病毒加入前，弃掉上清，细胞以无血清DMEM洗两次，每次100微升)，37℃培养箱孵育45分钟，弃上清，以冷无血清DMEM洗两次，加入2％血清的DMEM培养基200微升，37℃培养。培养48小时后，以裂解液裂解，进行荧光素酶含量测定，结果如表1所示。
表1 VDP-4与岩藻多糖的配比及荧光素酶强度
0 15.18 45.53 91.06 136.59 182.26
0 31435 30672 25348 21645 20063 17035
1 28923 14527 12960 8750 5320 1023
5 19053 6826 524 327 469 -
10 17458 4253 981 - - -
20 13908 5374 427 - - -
由表1可知：
单独的岩藻多糖或VDP-4多肽均能够抑制病毒的感染。但当VDP-4与岩藻多糖分别以10μM/L、91.06μM/L的配比混合时，检测不到荧光素酶的表达，即无病毒的侵入。
当岩藻多糖的摩尔浓度为45.53-182.26μM/L，同时多肽的摩尔浓度为5-20μM/L时，检测到的荧光素酶强度低于981，显著低于未添加组合物时的荧光素酶强度(31435)，即该浓度范围内的组合物具有显著抑制SARS-COV-2入侵细胞的效果。
当岩藻多糖的摩尔浓度为91.06-182.26μM/L，同时多肽的摩尔浓度为10-20μM/L时，检测到的荧光素酶强度为0。即上述浓度的组合物能够完全抑制SARS-COV-2入侵细胞。
当组合物浓度为如下组合时：
10μM/L的多肽和91.06μM/L的岩藻多糖；
10μM/L的多肽和136.59μM/L的岩藻多糖；
10μM/L的多肽和182.26μM/L的岩藻多糖；
5μM/L的多肽和182.26μM/L的岩藻多糖；
20μM/L的多肽和91.06μM/L的岩藻多糖；
20μM/L的多肽和136.59μM/L的岩藻多糖；
20μM/L的多肽和182.26μM/L的岩藻多糖。
检测到的荧光素酶强度为0。即上述浓度的组合物能够完全抑制SARS-COV-2入侵细胞。
实施例2
多肽、岩藻多糖与组合物对假病毒感染抑制效果验证：
将SARS-COV-2假病毒分别与91.06μM/L的岩藻多糖和10μM/L的VDP-4单独孵育，或病毒与91.06μM/L岩藻多糖及10mM/L的VDP-4共同孵育，并设置对照组。病毒与上述成分混合孵育后，加入到Vero-E6细胞中，冰上孵育45分钟后，以无血清DMEM洗细胞两次，以Trizol试剂裂解细胞，提取总RNA，分析假病毒拷贝数，结果如图2所示。
由图2可知：
VDP-4单独与病毒混合孵育后，病毒与细胞结合效率降低至80％；岩藻多糖单独与病毒混合孵育后，病毒与细胞结合效率降低至77％；VDP-4与岩藻多糖共同存在的组合物与病毒混合孵育后，病毒与细胞结合效率降低至12％，这不仅远高于岩藻多糖或VDP-4单独对病毒的抑制效果，也明显高于二者单独对病毒抑制效果的总和。
可见：在VDP-4与岩藻多糖共同存在的情况下，较岩藻多糖或VDP-4单独存在，对病毒与宿主细胞的结合抑制效果具有显著的协同放大作用。
实施例3
VDP-4以不同浓度与岩藻多糖(91.06μM/L)混合后抑制SARS-COV-2假病毒侵入的效果。
将SARS-COV-2假病毒按MOI＝10的剂量与上述不同浓度的混合物(DMEM稀释)混合孵育，将孵育后的病毒加入到细胞中，感染一小时，弃上清，以DMEM洗两次，加入含血清培养基，37度培养。另外一组细胞直接与上述不同浓度的混合物进行孵育1小时后，弃掉上清，以DMEM洗两次，以MOI＝10感染病毒，48小时后，进行荧光素酶报告基因检测。检测结果如图3所示。
由图3可知：SARS-COV-2病毒与组合物分开处理细胞，不会对病毒感染造成显著影响。但在感染前将SARS-COV-2病毒与组合物混合，则能显著抑制病毒的侵入。
实施例4
CCK-8检测组合物细胞毒性
分对数生长期Vero-E6细胞至96孔板，每孔4000个细胞。37度二氧化碳培养24小时，以DMEM洗细胞两次，每次100微升，加入不同浓度DMEM稀释的组合物(VDP-4 10μm/L；岩藻多糖按15.18，45.53，91.06，136.59，182.26μm/L或VDP-420μm/L；岩藻多糖按15.18，45.53，91.06，136.59，182.26μm/L)100微升，放置培养箱培养48小时，以DMEM洗细胞两次，加入100微升DMEM，加入10微升CCK-8溶液，培养1小时，测量450纳米吸收峰，630纳米吸收为参比波长。结果如图4所示。由图4可知，本发明组合物对细胞无显著毒性。
综上所述，本发明的多肽和组合物可以有效抑制SARS-COV-2的感染，且不引起细胞的毒副作用。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 北京中科微盾生物科技有限责任公司
<120> 一种抑制SARS-COV-2感染的多肽、组合物及其用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> VDP-4(1)
<400> 1
Phe Leu Lys Asp Glu Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Leu Asp Lys
1 5 10 15

Claims (9)

1.一种抑制SARS-COV-2感染的多肽，其特征在于，所述多肽为(1)和(3)中至少一种：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
(3)序列SEQ ID NO:1在药学上可接受的盐。
2.一种如权利要求1所述的抑制SARS-COV-2感染的多肽制备方法，其特征在于，所述多肽通过Fmoc多肽合成法制备。
3.一种抑制SARS-COV-2感染的组合物，其特征在于，所述组合物包括岩藻多糖和如权利要求1所述的多肽。
4.根据权利要求3所述的一种抑制SARS-COV-2感染的组合物，其特征在于，所述岩藻多糖的摩尔浓度为45.53-182.26μmol /L，所述多肽的摩尔浓度为5-20μmol /L。
5.根据权利要求3所述的一种抑制SARS-COV-2感染的组合物，其特征在于，所述岩藻多糖的摩尔浓度为91.06-182.26μmol /L，所述多肽的摩尔浓度为10-20μmol /L。
6.根据权利要求3所述的一种抑制SARS-COV-2感染的组合物，其特征在于，所述组合物包括如下组合中的一种：
10μmol /L的多肽和91.06μmol /L的岩藻多糖；
10μmol /L的多肽和136.59μmol /L的岩藻多糖；
10μmol /L的多肽和182.26μmol /L的岩藻多糖；
5μmol /L的多肽和182.26μmol /L的岩藻多糖；
20μmol /L的多肽和91.06μmol /L的岩藻多糖；
20μmol /L的多肽和136.59μmol /L的岩藻多糖；
20μmol /L的多肽和182.26μmol /L的岩藻多糖。
7.根据权利要求3所述的一种抑制SARS-COV-2感染的组合物，其特征在于，所述岩藻多糖的分子量为685.91道尔顿。
8.一种抑制SARS-COV-2感染的药物，其特征在于，所述药物的药效成分包含权利要求1所述的多肽；或者包含权利要求3-7中任意一项所述的组合物。
9.根据权利要求8所述的一种抑制SARS-COV-2感染的药物，其特征在于，所述药物还包含药学上可接受的载体和赋形剂。
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